MX2014006850A

MX2014006850A - Metodos y composiciones para tratar enfermedades virales.

Info

Publication number: MX2014006850A
Application number: MX2014006850A
Authority: MX
Inventors: Shirit Einav; Rina Barouchbentov; Gregory Neveu; Amotz Zivav
Original assignee: Univ Leland Stanford Junior
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2014-11-25
Also published as: CN104066432A; PH12014501268A1; BR112014013649A2; PE20142102A1; AU2012347785A1; CO7230337A2; MY171759A; PH12014501268B1; US20170000802A1; AU2012347785B2; SG11201402899TA; US20150057267A1; US10869873B2; MX349036B; US9364484B2; EP2787999A4; EP2787999A1; CR20140291A; WO2013086133A1; CN104066432B

Abstract

La invención proporciona un método para tratar infecciones virales y coinfecciones a través del uso de agentes inhibitorios que previenen que motivos de proteína estructural viral únicos se unan a proteínas de huésped a partir de la familia de proteínas adaptadoras de clatrina y subsecuentemente prevenir la replicación viral.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA TRATAR ENFERMEDADES VIRALES Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud estadounidense provisional ser. No. 61/567,491, presentada el 6 de diciembre de 2011, cuya descripción completa es incorporada en la presente por referencia.

Declaración con respecto a investigación patrocinada por el gobierno federal Esta invención fue hecha con apoyo gubernamental bajo el contrato AI079406 otorgado por los National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Campo de la invención La presente invención se refiere a virología. De manera más específica, la invención se refiere a tratamiento de enfermedades virales a través de la inhibición de interacciones de proteínas adaptadoras de clatrina celular de huésped y motivos de dileucina o ???F virales o su regulación.

Antecedentes de la invención Las infecciones humanas con Lentiviridae, tal como HIV, y Flaviviridae, tal como HCV, plantean retos significativos a la salud global. Aunque potentes medicamentos anti-HCV están en desarrollo clínico y las tasas de respuesta a reg ímenes basados en interferones han mejorado con la inclusión de inhibidores de proteasa (Pl), la resistencia, interacciones medicamento-medicamento y toxicidad acumulada continúan planteando retos. Por lo tanto, todavía se necesitan estrategias antivirales más efectivas para combatir las pandemias de HCV. Además, se necesitan novedosas estrategias antivirales para inclusión en reg ímenes de salvamento para tratar HIV en pacientes en quienes falla la terapia anti-retroviral altamente activa (HAART) debido al virus resistente.

Breve descripción de la invención Brevemente descritas, las modalidades de esta descripción incluyen compuestos, composiciones, composiciones farmacéuticas y métodos para tratar un huésped con una infección viral. En una modalidad, los virus susceptibles de acuerdo con la presente descripción incluyen virus comprendiendo al menos una proteína comprendiendo un motivo ???F o un motivo de dileucina, referidos en la presente como "virus de unión de clatrina AP", Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flavivirdae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae o virus de unión de Clatrina AP diferentes de HCV, métodos para tratar la replicación de tal virus en un huésped, métodos para inhibir la unión de una proteína estructural viral comprendiendo los motivos de ???F o dileucina a subunidades de µ de huésped de complejos de clatrina AP 1 -AP4, tales como AP2M 1 , AP1 M 1 , AP3M 1 o AP4 1 , métodos para tratar fibrosis de hígado relacionada con hepatitis en un huésped y similares.

Un método ejemplar para tratar un huésped con una infección viral de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, entre otros, pueden incluir: administrar al huésped una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente inhibidor para reducir la carga viral en el huésped. En una modalidad, el agente inhibidor es seleccionado del grupo que consiste de agentes q ue inhiben competitivamente la unión entre una proteína viral comprendiendo los motivos de ???F o dileucina y una proteína huésped seleccionada del grupo que consiste de las subunidades de µ de clatrina AP 1 -AP4; y agentes que inhiben la actividad de proteína cinasa de huésped de cinasas que modulan la actividad de proteínas de huésped seleccionadas del grupo que consiste de subunidades de µ de clatrina AP1 -AP4. Un método ejemplar para tratar la infección viral de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, en un huésped, entre otros, pueden incluir: administrar un agente inhibidor al huésped teniendo tal o tales infecciones virales. En una modalidad , el agente inhibidor es seleccionado del grupo que consiste de agentes que inhiben competitivamente la unión entre una proteína estructural viral comprendiendo los motivos de ???F o dileucina y una proteína huésped seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 , y agentes que inhiben la actividad de proteína cinasa huésped de cinasas que modulan la actividad de proteínas huésped seleccionadas del grupo que consiste de AP2M 1 y oras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. En algunas modalidades, estos inhibidores inhiben GAK (cinasa asociada a ciclina G) o AAK1 (cinasa asociada a adaptador 1 ), los cuales incluyen compuestos tales como erlotinib, sunitinib o PKC-412. Así, los agentes inhibidores son de dos clases. (1 ) inhibidores competitivos de unión; y (2) agentes que inhiben la actividad de proteína cinasa huésped de cinasas que modulan la actividad de proteínas huésped, tal como AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP.

Un método ejemplar para inhibir la unión de los motivos de ???F o dileucina para polipéptidos huésped, entre otro, incluye administrar un agente inhibidor al huésped que tiene una infección viral. En una modalidad, el gente inhibidor es seleccionado del grupo que consiste de agentes que inhiben competitivamente la unión entre una proteína estructural viral comprendiendo los motivos de ???F o dileucina y una proteína huésped seleccionada de AP2 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, y agentes que inhiben la actividad de proteína cinasa de cinasas que modulan la actividad de proteínas huésped seleccionadas del grupo que consiste de AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP.

Una composición farmacéutica ejemplar para tratar un huésped teniendo una infección viral de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, co-infecciones, tales como coinfecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, entre otros, pueden incluir un agente inhibidor. En una modalidad, el agente inhibidor es seleccionado el grupo que consiste de agentes que inhiben competitivamente la unión entre una proteína estructural viral comprendiendo los motivos de ???F o dileucina y una proteína huésped seleccionada de AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, y agentes que inhiben la actividad de proteína cinasa de cinasas que modulan la actividad de proteínas secretadas a partir del grupo que consiste de AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP.

Una composición ejemplar, entre otras, incluye un agente inhibidor. En una modalidad, el agent inhibidor es seleccionado del grupo que consiste de agentes que inhiben competitivamente la unión entre una proteína viral comprendiendo el motivo de ???F o dileucina y una proteína huésped seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, y agentes que inhiben la actividad de proteína cinasa de cinasas que modulan la actividad de proteínas huésped seleccionadas del grupo que consiste de AP21 M1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar co-infección de HCV-HIV a través de la administración de una cantidad efectiva de un agente que inhibe la unión de HCV y H IV a proteínas huésped seleccionadas del grupo que consiste de AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. En una modalidad, el agente inhibidor inhibe AAK1 o GAK. En otra modalidad, el agente es seleccionado del grupo que consiste de erlotinib, sunitinib y PKC-412. En otra modalidad, el agente previene la unión de una proteína estructural de Lentiviridae o Flaviviridae conteniendo un motivo de ???F o dileucina a una proteína huésped seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. Todavía en otra modalidad, el agente inhibe AAK.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir infecciones por al menos un primer virus diferente de HCV, otro miembro de Flaviviridae, o un miembro de Lentiviridae, o combinaciones de los mismos, a través de la administración a un paciente en necesidad de una cantidad efectiva de un agente que inhibe la unión de una proteína estructural a partir de un virus que contiene un motivo de ???F o dileucina a una proteína huésped seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. En una modalidad, el agente inhibe AAK1 o GAK. En otra modalidad, el agente es seleccionado del grupo que consiste de erlotinib, sunitinib y PKC-412.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para clasificar agentes antivirales a través de contactar un virus susceptible como se describe en la presente o proteína viral con un agente candidato y una proteína seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 y/u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, y determinar el efecto del agente candidato en ensamble viral o florecimiento de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Faviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flavivirdae, o virus de unión de clatrina AP diferente de HCV, en una célula huésped a través de contactar la célula huésped con un agente que previene la unión de una proteína estructural viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a una proteína huésped seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. En una modalidad, el agente bloquea la unión de la proteína estructural viral a la proteína huésped. En otra modalidad, el agente compite con la proteína estructural viral para unión a la proteína huésped. En otra modalidad, el agente compite con la proteína huésped para unión a la proteína estructural viral . Todavía en otra modalidad, el método involucra la clasificación de inhibidores de AAK1 y GAK para virus no de Flaviviridae.

Breve descri pción de los d ibujos Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y son incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la invención. La invención pueden ser mejor entendidos por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas aquí: FIGS. 1 A-F: Muestran un núcleo viral con un motivo de ???F que se une AP2M 1 . FIG. 1 A: Esquemas de núcleo. La ubicación del motivo identificado es indicada. FIGS. 1B-C: Secuencias de consenso de motivos de ???F de proteínas humana (FIG. 1B) y virales (FIG. 1C). FIG. 1D: La secuencia de consenso de todos los aislados de HCV, los clones usados en este estudio y mutantes de núcleo diseñados. FIG. 1E: Imágenes fluorescentes de un chip microfluídico y esquemas. Izquierda: AP2M1 -V5-His fue anclado a la superficie del dispositivo vía su interacción con anticuerpos anti-His y etiquetados con anticuerpos anti-V5-FIT. Centro: núcleo T7-etiquetado o NS3 fueron incubaos con AP2M1 unido a superficie y etiquetado con anticuerpos anti-T7-Cy3. Las interacciones fueron atrapadas mecánicamente por MITOMI. La señal Cy3 que representa la proteína viral unida es mostrada siguiendo un lavado. Derecha: una superposición de las señales de Cy3 y FITC, que representan proporción de presa viral unida a cebo humano. FIG. 1F. Curvas de unión in vitro de de núcleo-T7 y NS3-T7 a AP2M1 unido a superficie. El eje Y representa la proporción de proteína viral unida a AP2M1 unido a superficie.

FIGS. 2A-E: Muestran un AP2M1 de unión a núcleo viral en células y en el contexto de infección de HCV. FIG. 2A: Esquema del formato de PCAs. FIGS. 2A-B representan proteínas de presa y cebo, y GLuc1/2 son fragmentos de luciferasa de Gaussia. FIG. 2B: Las células fueron cotransfectadas con combinaciones de plásmidos indicados debajo de la gráfica con aquéllos indicados en la leyenda. El eje Y representa luminiscencia en relación a la señal de núcleo-AP2M1. La barra con bandas a la derecha representa la unión de AP2M1 a la proteína de carga de huésped TFR. FIG. 2C: La unión de núcleo-AP2M1 en la presencia de AP2M 1 libre, núcleo o NESI . El eje Y representa la proporción de luminiscencia (la señal de luminiscencia promedio detectad en células transfectadas con Glud -AP2M 1 y Gluc2-núcleo dividida por el promedio de luminiscencia medida en cavidades de control transfectadas con Glud -AP2M 1 y un vector de Gluc2 vacío con aquéllas transfectadas con Gluc2-núcleo y un vector de Glud vacío en relación a la unión de núcleo-AP2M 1 en la presencia de PUC 1 9 vacío. FIG 2D: I nmunoprecipitaciones (I Ps) en membranas de células infectadas con HCV. Paneles de la izquierda: Anticuerpos anti-AP2M 1 o IgG fueron usados para I P. Las membranas fueron inmunomanchadas con anticuerpos anti-fosfo-AP2M 1 , anti-AP2M 1 , anti-núcleo y anti-actina. Cal-A representa caliculina-A. Paneles de la derecha: anticuerpos antinúcleo o IgG fueron usados para I P. Las membranas fueron inmunomanchadas con anticuerpos anti-núcleo, anti-AP2M1 y anti-actina. FIG. 2E: Imágenes de microscopía I F confocal representativas de AP2M 1 y núcleo en células Huh-7.5 3 días post-electroporación con J6/JFH HCV RNA. Los daos representan promedios ± desviación estándar (s.d . ) (barras de error) de tres experimentos independientes por triplicado (n>20 en FIG. 2E) . * p < 0.05, ** p < 0.01 , *** p < 0.001 .

FIGS. 3A-H . Muestran un motivo de ???F de núcleo que media la unión de AP2M 1 y montaje viral, funcionalmente intercambiable con otras señales de ???F. FIG. 3A: Unión de mutantes tipo natural (WT) y núcleo para AP2M 1 por PCAs. El eje Y representa la proporción de luminiscencia (la señal de lum iniscencia promedio detectada en células transfectadas con Gluc1 -AP2M1 y las diversas formas de Gluc2-núcleo divididas por el promedio de luminiscencia medido en cavidades de control transfectadas con Gluc1 -AP2M 1 y un vector de Gluc2 vacío con aquéllos transfectados con Gluc2-núcleo respectivo y un vector de Glud vacio) en relación a unión natural de núcleo-AP2M 1 . FIG 3B: Replicación de RNA de HCV por ensayos de luciferasa de Renilla a 6 h (blanco) y 72 h (negro) post-electroporación con J6/JFH/p7-Rluc2A) alojando las mutaciones correspondientes. ?? 1 -?2 es un control defectuoso de montaje. GNN es un muíante de polimerasa defectuoso de replicación. FIG. 3C: I nfectividad extracelular por ensayos de luciferasa en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes derivados de las células electroporadas. FIG. 3D: I nfectividad intracelular por ensayos de luciferasa en células Huh-7.5 naturales infectadas con Usados celulares clarificados derivados de las células electroporadas. FIG . 3E: títulos de infectividad intra-y extra-celulares medidos por ensayos de dilución limitantes. TCI D50 es una dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50%. FIG. 3F: Liberación de RNA viral en el sobrenadante de cultivo a 72 h post-electroporación medida mediante qRT-PCR. FIG. 3G: Liberación de proteína de núcleo de HCV en el sobrenadante de cultivo a 72 h post-electroporación determinada mediante ELISA en relación al control WT. FIG 3H: Niveles de proteína de núcleo mediante análisis western en lisados preparados a partir de células infectadas con virus que alojan las mutaciones correspondientes. Se muestran promedios y s.d . (barras de error) de resultados de al menos tres experimentos independientes por triplicado. Las líneas horizontales interrumpidas representan niveles de soporte de actividad de lucifersasa. RLU es unidades de luz relativa. * p <0.05, ** p <0.01 , *** p<0.001 .

FIGS. 4A-I : Muestran la inhibición del montaje de HCV mediante supresión de AP2M 1 . FIG. 4A: Niveles de proteína de AP2M 1 mediante análisis western cuantitativo en clones estables que alojan constructos lentivirales de shRNA que enfocan el gene AP2M 1 y una secuencia no enfocadora (NT). Una membrana representativa y datos combinados de tres mediciones independientes son mostrados. El eje Y representa una proporción de AP2M 1 a proteína de actina en relación al control NT. FIG 4B: Una proporción de AP2M 1 /S18 RNA mediante qRT-PCR en clones estables seleccionados en relación al control NT. FIG. 4C: Los clones indicados fueron electroporados con J6/JFH(p7-Rluc2A). La replicación de RNA de HCV en estos clones mediante ensayos de luciferasa a 9 h (blanco) y 72 h (negro) post-electroporación. FIG. 4D: Infectividad extracelular medida mediante ensayos de luciferasa en células naturales inoculadas con sobrenadantes derivados de los diversos clones de células estables. FIG. 4E: Infectividad intracelular mediante ensayos de luciferasa en células Huh-7.5 naturales infectadcas con lisados de células clarificadas derivados de las células electroporadas. FIG. 4F: Títulos de infectividad intra- y extracelular medidos mediante ensayos de dilución limitantes. TCI D5o es una dosis infecciosa de cultivo de tejido. FIG 4G: Liberación de RNA viral en el sobrenadante de cultivo a 72 h post-electroporación medida mediante qRT-PCR. FIG 4H : Liberación de proteína de núcleo de HCV en el sobrenadante de cultivo a 72 h post-electroporación, como es determinado mediante ELISA. Fig. 41 : Producción de virus infecciosa en relación a control NT (panel superior) y niveles de proteína AP2M1 mediante un análisis western blot (panel inferior) en células concurrentemente transducidas con lentivirus que expresan cDNA de AP2M 1 WT resistente a shAP2M 1 y shRNA (AP2M 1 -WT). Se muestran promedios y s.d. (barras de error) de resultados de al menos tres experimentos independientes. RLU es unidades de luz relativa. * p <0.05, ** p <0.01 , *** p<0.001 .

FIGS. 5A-P: Muestran que la interrupción de unión de nucléoAP2M 1 elimina el reclutamiento de AP2M 1 a LDS y altera la localización sub-celular de núcleo y su colocalización con E2. El análisis de inmunofluorescencia confocal cuantitativo (IF) de la localización sub-celular de núcleo y AP2M 1 y colocalización de núcleo-E2 en células Huh-7.5. FIG. 5A: Una imagen fusionada representativa de AP2M 1 endógena (azul) y el marcador LD, Bodipy (verde), en células Huh-7.5 naturales. FIGS. 5B-D: I mágenes fusionadas de células Huh-7.5 infectadas con J6/JFH HCV manchado para núcleo (rojo), el marcador LD; Bodipy (verde) y AP2M 1 (azul) . FIG. 5E. Porcentaje de colocalización de las señales indicadas en células naturales (blanco) o infectadas (negro) por un análisis de colocalización cuantitativo de FIGS. 5A-D. FIG. 5F: Una imagen fusionada de cuatro canales. Las flechas amarillas en la inserción indican colocalización de núcleo y AP2M 1 a LD. FIG. 5G-J : Imágenes fusionadas representativas y análisis de colocalización cuantitativo de AP2M 1 (rojo) y el marcador de lípidos, LipidTOX (azul), en células Huh-7.5 transfectadas con plásmidos que expresan AP2M1 -mCherry solo (FIG . 5G) o AP2M 1 -mCherry con núcleo WT (FIG. 5H) o muíante Y1 36A de núcleo (FIG. 51). La expresión de núcleo (verde) en las células mostradas en los paneles FIG. 5H y 51 es demostrada en los paneles inferiores respectivos. FIGS. 5K-P. Imágenes fusionadas representativas y análisis de colocalización cuantitativo de núcleo (rojo) y (FIG. 5K) Bodipy (verde), demostrando la localización incrementada de núcleo para LD en células Hu -7.5 electroporadas con J6/JFH HCV RNA que aloja la mutación de núcleo Y1 36A (panel derecho) comparado con núcleo WT (panel izquierdo). FIG 5L: Bodipy (verde) en células de control (NT) (panel izquierdo) o células Huh-7.5 de AP2M 1 suprimido (panel derecho) electroporadas con J6/JFH HCV RNA, mostrando una localización dramática de núcleo a LD en células de AP2M 1 suprimido. FIG. 5M: TGN46 (verde), demostrando localización disminuida de núcleo para TGN en células Huh-7.5 electroporadas con J6/JFH RNA que aloja la mutación de núcleo Y136A (panel derecho) comparado con núcleo WT (panel izquierdo). FIG. 5N: TGN46 (verde) en células de control (NT) (panel izquierdo) o Huh-7.5 de AP2M 1 suprimido (panel derecho) electroporado con J6/JFH HCV RNA, que muestra la localización disminu ía de núcleo para TGN en células de AP2M 1 suprimido. FIG. 50: E2 (verde, demostrando la colocalización disminuida de núcleo y E2 en células Huh-7.5 electroporadas con J6/J FH RNA que aloja la mutación de núcleo Y136A (panel derecho) comparada con núcleo WT (panel izquierdo). FIG 5P: E2 (verde) en células de control (NT) (panel izquierdo) o Huh-7.5 de AP2M 1 suprimido (panel derecho) electroporadas con J6/JFH HCV RNA, mostrando colocalización disminuida de núcleo y E2 en células de AP2M 1 suprimido. Las imágenes representativas a aumento de x60 son mostradas. Las gráficas representan análisis de colocalización cuantitativa de pilas Z usando coeficientes de Mander. Los valores indican valores M2 promedio representados como porcentaje de colocalización (la fracción de intensidad de verde que coincide con la intensidad de rojo o en el caso de FIGS. 5G-I , la fracción de intensidad de azul que coincide con la intensidad de rojo) ± s.d. (barras de error); n = 1 0-15. * p <0.05, ** p <0.01 , *** p<0.001 .

FIGS. 6A-L. Muestran que AAK1 y GAK regulan la unión de núcleo-AP2M 1 y están involucradas en el montaje de HCV. FIG. 6A: Mecanismos de regulación de unión de AP2M 1 a proteínas de carga de huésped que alojan señales de ???F. FIG. 6B: unión de núcleo a AP2M 1 tipo natural y T1 56A mediante PCAs (negro) y microfluido (blanco). FIGS. 6C-E: Huh-7.5 fueron transfectadas con plásmidos que codifican mutante AP2M WT o T156A y electroporados con J6/JFH(p7-Rluc2A) 48 h post-transfección. FIG . 6C: Viabilidad celular mediante ensayos basados en alamarBIue a 48 h post-transfección en relación a control WT AP2M 1 . FIG. 6D: Replicación de RNA de HCV en células que sobre-expresan mutante AP2M 1 WT O T156a mediante ensayos de luciferasa a 6 h (negro) y 72 h (blanco) post-electroporación con J6/JFH(p7-Rluc2A). FIG. 6E: Infectividad extracelular (negro) e intracelular (blanco) mediante ensayos de luciferasa en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes o lisados celulares derivados de las células indicadas, respectivamente, en relación a control WT. FIGS.

F-G: Células Huh7.5 fueron transfectadas con los siRNAs correspondientes. FIG 6F: Proporción de AAK1 (izquierda) o GAK (derecha) a S18 RNA en estas células en relación a secuencias NT mediante qRT-PCR. FIG. 6G: Análisis western cuantitativo. Los números representan proporciones de AAK1 (superior) o GAK (inferior) a proteína de actina en relación a control NT. FIG 6H: unión de núcleo-AP2M 1 mediante PCAs en células H uh-7.5 suprimidas para AAK1 o GAK por siRNAs. El Eje Y representa la proporción de luminiscencia (la señal de luminiscencia promedio detectada en células transfectadas con Gluc1 -AP2M 1 y Gluc2-núcleo divididas por el promedio de luminiscencia medida en células NT transfectadas con Glud -AP2M 1 y un vector Gluc2 vacío con aquéllos transfectadas con Gluc2-núcleo y un vector Glud vacío) en relación a control NT. FIGS. 6I-K: Células suprimidas de AAK1 o GAK fueron electroporadas con J6/JFH(p7-Rluc2A) . FIG. 61: Viabilidad celular mediante ensayos basados en alamarBIue en células suprimidas en relación a control NT. FIG . 6J: Replicación de RNA de HCV en estas células mediante ensayos de luciferasa a 6 h (negro) y 72 h (blanco) post-electroporación. FIG. 6K. Infectividad extracelular (negro) e intracelular (blanco) mediante ensayos de luciferasa en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes o Usados celulares derivados de las células indicadas, respectivamente, en relación a control NT. FIG. 6L: Unión de núcleo a AAK1 y GAK por PCAs. El eje Y representa la proporción de luminiscencia en relación a la unión de núcleo-AP2M 1 . Los datos representan medios y s.d. (barras de error) a partir de al menos dos experimentos por triplicado. RLU es unidades de luz relativa. * p <0.0.5, **p < 0.01 , *** p<0.001 .

FIGS. 7A-I : Inhibición farmacológica de unión de núcleo-AP2M 1 y montaje de HCV. FIG. 7A: Reguladores de AP2M 1 y los inhibidores descubiertos. FIG. 7B: Las Kds de unión de los inhibidores para AAK1 o GAK (Karaman et al. , Nat Biotechnol. 26: 127-1 32, 2008). Las IC50s para estos compuestos afectan la unión de núcleo-AP2M 1 y las EC50s para su efecto sobre infectividad extracelular, infectividad intracelular e infección viral son HCV cultivado en cultivo celular (HCVcc). FIG. 7C: Inhibición de unión de núcleo-AP2M 1 por los compuestos medidos por PCAs. FIGS. 7D-G: Células Huh-7.5 electroporadas con J6/JFH(p7-Rluc2A) fueron tratadas diariamente con ya sea erlotinib, sunitinib o PKC-4121 durante 3 días. Los sobrenadantes y lisados celulares fueron recolectados a 72 h y usados para inocular las células Huh-7.5 naturales. Las curvas de respuesta de dosis de los efectos de inhibidores sobre infectividad extracelular (FIG . 7D) e intracelular (FIG. 7E) en relación a controles sin tratar. Estos compuestos no tuvieron efecto sobre la replicación de RNA de HCV (FIG. 7F) o viabilidad celular (FIG. 7G) mediante ensayos de luciferasa y basados en AlamarBIue, respectivamente (GNN es un mutante de polimerasa de replicación-defectuosa) . FIG . 7H : El efecto de los inhibidores sobre fosforilación de AP2M 1 mediante análisis western de lisados celulares recolectados siguiendo la electroporacion con J6/JFH(p7-Rluc2A) y tratamiento con los compuestos en la presencia de Caliculina A (Cal-A). Se muestran membranas representativas manchadas con anticuerpos anti-fosfo-AP2M 1 (p-AP2M 1 ) y anti-actina y análisis cuantitativo de 3 experimentos. El eje Y representa una proporción de proteína pAP2M 1 /actina en relación a controles sin tratar. FIG. 71 : El efecto de los inhibidores sobre la infección viral (negro) y viabilidad celular (gris) en células infectadas con HCVcc siguiendo 72 h de tratamiento diario en relación a controles sin tratar. Los datos representan medios y s.d. (barras de error) a partir de al menos tres experimentos por triplicado. RLU es unidades de luz relativa: * p <0.05, ** p <0.01 , ***0.001 .

FIGS. 8A-G: Supresión transiente de AP2M 1 mediante siRNAs depositados inhibe el montaje de HCV. FIG. 8A: Proporción de AP2M 1/S 18 RNA medida por qRT-PCR en células Huh-7.5 transfectadas con un depósito para cuatro siRNAs (ON-TARGETplus SMARTpools, Dharmacon) que enfocan AP2M 1 o un depósito de secuencias no enfocadoras (NT) a 48 h post-transfección en relación a controles NT. FIG. 8B: Niveles de proteína AP2M 1 mediante análisis western cuantitativo en células 48 h post-transfección con los siRNAs depositados correspondientes. Los números representan la proporción de proteína AP2M 1 a actina en relación al control NT. FIG. 8C: Viabilidad celular mediante ensayos alamarBIue 48 h post-transfecciones de siRNAs en relación al control NT. FIG. 8D: se electroporaron células con J6/JFH(p7-Rluc2A) a 48 h siguiendo la transfección con los siRNAs depositados indicados. La replicación de RNA de HCV en estas células mediante ensayos de luciferasa a 6 h (negro) y 72 h (blanco) post-electroporación. FIG. 8E: Midió la infectividad extracelular (negro) e intracelular (blanco) en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes o Usados de células clarificados derivados de células electroporadas que alojan los siRNAs indicados mediante ensayos de luciferasa, respectivamente. FIG. 8F: Producción de virus infeccioso medida mediante ensayos de dilución limitante. FIG. 8G: I nfectividad extracelular (negro) e intracelular (blanco) medida mediante ensayos de formación de foco en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes o Usados de células clarificados derivados de células Huh-7.5 suprimidos transientemente para AP2M 1 mediante siRNAs e infectados con virus J6/JFH cultivado en cultivo (título: 1 .2x1 05 TCI Dso/ml). Los resultados son relativos a controles NT. Se muestran los promedios ± s.d. (barras de error) de resultados a partir de al menos dos experimentos independientes. RLU son unidades de luz relativa. TC I D50 es 50% de dosis infecciosa de cultivo de tejido.

FIGS. 9A-B: Muestran que la supresión de AAK1 y GAK o inhibición farmacológica deroga la replicación de HIV- en células TZM-b1 (células HeLa CXCR4-positivas que expresan CD4 y CCR5 y también contienen genes reportadores integrados para luciferasa y ß-galactosidasa, ambos bajo el control de una secuencia de repetición de terminal larga de H IV (gene tat)). FIG. 9A: Replicación de H IV en células suprimidas de AAK1 o GAK en relación a control NT. FIG. 9B: El efecto antiviral de inhibidores de AAK1 y GAK sobre replicación de HIV en relación a control sin tratar.

FIGS. 1 0A-C: Muestra ensayo de unión proteína-proteína basada en microfluido. Tres células unitarias individuales (de cientos en un dispositivo de microfluido) son mostradas en este esquema.

FIG. 1 0A: Compartimentos y válvulas micromecánicas. Una válvula es creada donde un canal de control cruza un canal de flujo. La membrana delgada resultante en la unión entre los dos canales puede desviarse mediante accionamiento hidráulico. Usar sistemas de válvula multiplexados permite que un gran número de microválvulas elastoméricas realicen manipulaciones de fluidos complejas dentro de estos dispositivos.

FIGS. 1 0B 1 -1 0B7: Protocolo experimental. · Representa anticuerpos anti-histidina biotinilados unidos a superficie (mostrados en 10B1 y 10B2). @ representa proteína humana de cebo FITC-etiquetada unida a superficie (mostrada en 1 0B3). · representa proteína viral de presa Cy3-etiquetada (mostrada en 1 0B4 y 10B5). FIG. 10B1 ) El dispositivo de mícrofluido fue unido a un portaobjetos de vidrio y sometido a obtención de patrones que resultó en un área circular recubierta con anticuerpos anti-histidina biotinilados dentro de cada célula unitaria (ver FIG. 10C 1 -7). FIG. 10B2) Las proteínas humanas de cebo V5-his-etiquetadas fueron expresadas del chip usando mezcla in vitro de transcripción/traslación (TNT) y se cargaron en el dispositivo. FIG. 10B3) Estas proteínas unidas a los anticuerpos anti-his de superficie. FIG. 10B4) Las proteínas virales T7-etiquetadas fueron expresadas del chip mediante la misma mezcla de TNT in vitro de mam ífero en la presencia de membranas de microsoma y se cargaron en el dispositivo junto con los anticuerpos anti-V5 FITC-etiquetados y anti-T7 Cy3-etiquetados. FIG. 10B5) Las "válvulas de emparedado" fueron cerradas para permitir la incubación de la proteína viral con las proteínas humanas y su etiquetado con los anticuerpos fluorescentes respectivos. FIG. 10B6) Se realizó entonces MITOMI mediante accionamiento de la "membrana de botón" que facilita la captura de complejos unidos a superficie mientras que expulsa cualquier molécula de fase de solución. Las "válvulas de emparedado" fueron abiertas seguido por un breve lavado para remover material no unido no atrapado. FIG. 10B7) El dispositivo fue explorado por un explorador de arreglo. La proteína viral atrapada y proteínas humanas unidas a superficie fueron detectadas. La proporción de proteína viral unida a proteína humana expresada fue calculada para cada punto de datos al medir la señal mediana de Cy3 a señal media de FITC (representada por O , mostrada en FIG. 10B7).

FIGS. 10C1-7: Obtención de patrones de superficie. FIG. 10C1) El área de superficie accesible fue derivada al hacer fluir una solución de BSA biotinilado ( É ) a través de todos los canales de flujo. FIG. 10C2) Una solución de Neutravidina ( ) fue cargada. FIG. 10C3) La membrana de "botón" fue activada. FIG. 10C4) Toda el área de superficie accesible restante excepto por un área circular de 60 pm enmascarada por el botón fue pasivado con solución biotinilada ( i ). FIG. 10C5) La membrana de "botón" fue abierta. FIG. 10C6) Una solución de anticuerpos anti-his biotinilados ( ?"> ) fue cargada permitiendo la funcionalización específica del área circular previamente enmascarada. FIG. 10C7) Proteína humana expresada in vitro ( «s» ) unida a los anticuerpos biotinilados que recubren el área circular discreta. Cada uno de los pasos descritos fue seguido por un lavado de PBS.

FIG. 1 1 : Muestra que las mutaciones ???F de núcleo no afectan replicación de RNA de HCV por ensayos qRT-PCR. La replicación de RNA de HCV, por qRT-PCR en células Huh-7.5 72 h siguiendo la electroporacion con J6/JFH(p7-Rluc2A) que alojan las mutaciones de ???F del núcleo correspondiente en relación a control WT. ??1 -?2 es un control defectuoso de montaje. GN N es un mutante de polimerasa defectuoso de replicación . Se muestran promedios y s.d . (barras de error) de resultados a partir de dos experimentos independientes por triplicado.

FIG. 12: Muestra que la supresión de AP2M 1 no tiene efecto sobre la replicación de RNA de HCV por ensayos qRT-PCR. La replicación de RNA de HCV, por qRT-PCR en células Huh-7.5 que alojan los shRNAs correspondientes 72 h siguiendo la electroporacion con J6/JFH(p7-Rluc2A) en relación a control NT. Se muestran promedios y s.d. (barras de error) de resultados de dos experimentos independientes por triplicado.

FIGS. 1 3A-G: Muestran la supresión transiente de AP2M 1 por siRNAs depositados inhibe montaje de HCV. FIG . 1 3A: La proporción de AP2M 1 /S 18 RNA midió por qRT-PCR en células Huh-7.5 transfectadas con un depósito de cuatro siRNAs (ON-TARGETplus SMARTpools, Dharmacon) que enfocan AP2M 1 o un depósito de secuencias no enfocadoras (NT) a 48 h post-transfección en relación a controles de NT. FIG. 1 3B: Niveles de proteína de AP2M 1 mediante análisis Wester cuantitativo en células 48 h post-transfección con los siRNAs depositados correspondientes. Los números representan la proporción de proteína AP2M 1 a actina en relación al control NT. FIG. 1 3C: la Viabilidad celular mediante ensayos de alamarBIue 48 h post-transfecciones de siRNAs en relación a control NT. FIG. 1 3D: Las células fueron electroporadas con J6/J FH(p7-Rluc2A) a 48 h siguiendo la transfección con los siRNAs depositados indicados. La replicación de RNA de HCV en estas células mediante ensayos de luciferasa a 6 h (negro) y 72 h (blanco) post-electroporación. FIG. 13E: se midió la infectividad extracelular (negro) e intracelular (blanco) en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes o lisados de células clarificados derivados de células electroporadas que alojan los siRNAs indicados por ensayos de luciferasa, respectivamente. FIG. 13F: La producción de virus infeccioso se midió mediante ensayos de dilución limitante. FIG. 1 3G: Se midió la infectividad extracelular (negro) e intracelular (blanco) mediante ensayos de formación de foco en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes o lisados de células clarificadas derivados de células Huh-7.5 suprimidos transientemente para AP2M 1 por siRNAs e infectados con virus J6/JFH cultivado en cultivo (título: 1 .2x1 05 TCID5o/ml). Los resultados son relativos a controles NT. Se muestran los promedios ± s.d. (barras de error) de resultados de al menos dos experimentos independientes. RLU son unidades de luz relativa. TCI D50 es 50% de dosis infecciosa de cultivo de tejido.

FIGS. 14A-C: Muestran que una mutación de núcleo Y1 36A no parecen afectar la localización de núcleo a membranas ER en células infectadas de HCV. FIG. 14A: Análisis de inmunofluorescencia confocal cuantitativa (I F) para localización de núcleo a la membrana ER en células Huh-7.5 infectadas con HCV cultivado en cultivo. Las FIGS. 14A-B son imágenes fusionadas representativas de núcleo (rojo) y el marcador ER, calreticulina (verde), que demuestran una localización parcial comparable de núcleo a la membrana ER en células Huh-7.5 infectadas con virus WT (FIG. 14A) o con virus que aloja la mutación de núcleo Y1 36A (FIG. 14B). Se muestran imágenes representativas a aumento de x60. FIG. 14C: Análisis de colocalización de pilas Z usando coeficientes de Mander (con un mayor valor representando más colocalización). Los valores indican valores M2 promedio representados como porcentaje de colocalización (la fracción de intensidad verde que coincide con intensidad roja ± s.d. (barras de error); n = 1 0- 15.

Descripción detallada Antes de que la presente divulgación se describa con mayor detalle, se entenderá que esta divulgación no está limitada a modalidades particulares descritas, y la modalidad de la invención como tal puede variar, por supuesto. También se entenderá que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende limitar, ya que el alcance de la presente divulgación será limitada solo por las reivindicaciones anexas.

Como es evidente para aquéllos de habilidad en la técnica a partir d lea lectura de esta descripción, cada una de las modalidades individuales descritas e ilustradas en la presente tiene componentes discretos y características que pueden ser separadas fácilmente de o combinadas con las características de cualquiera de las otras diversas modalidades sin apartarse del alcance o espíritu de la presente divulgación . Cualquier método declarado puede ser realizado en el orden de eventos declarado o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

Antes de que se describan las modalidades de la presente descripción en detalle, se entenderá que, a menos que se indique de otra manera, la presente descripción no está limitada a materiales particulares, reactivos, materiales de reacción, procesos de fabricación o similares, ya que tales pueden variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente es para fines de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende que sean limitantes. También es posible en la presente descripción que puedan ejecutarse pasos en diferentes secuencias donde es lógicamente posible. Como se usa en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" , "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un compuesto" incluye una pluralidad de compuestos. En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una variedad de términos que deberá definirse para tener los siguientes significados a menos que sea evidente una intención contraria.

Definiciones Para describir y reclamar la materia en cuestión descrita, la siguiente terminología será usada de acuerdo con las definiciones expuestas a continuación.

Por "virus Flaviviridae" se quiere decir cualquier virus de la familia Flaviviridae, incluyendo aquéllos virus que infectan humanos y animales no humanos. Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que codifican estos virus son bien conocidas en la técnica y pueden encontrarse en la base de datos NCBI 's GenBank, por ejemplo, Genbank Acceso números NC_004102, AB031663, D1 1 355, D1 1 168, AJ238800, NC_001 809, NC_001437, NC_004355, NC_0041 1 19, NC_003996, NC_003690, NC_003687, NC_003675, NC_003676, NC_003218, NC_001 563, NC_000943, NC_003679, NBC_003678, NC_003677, NC_002657, N_002032, y NC_001461 , los contenidos de dichas entradas de bases de datos son incorporados por referencia en presente en su totalidad.

Como se usa en la presente, los términos "tratamiento", "tratando" y "tratar" son definidos como que actúan sobre una enfermedad, desorden o condición con un agente para reducir o mejorar los efectos farmacológicos y/o fisiológicos de la enfermedad, desorden o condición y/o sus síntomas. "Tratamiento", como se usa en la presente, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un huésped (por ejemplo, un mam ífero, normalmente un humano o animal no humano de interés veterinario) e incluye: (a) reducir el riesgo de ocurrencia de la enfermedad en un sujeto determinado por estar predispuesto a la enfermedad pero todavía no diagnosticado como infectado con la enfermedad, (b) impedir el desarrollo de la enfermedad, y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o aliviar uno o más síntomas de enfermedad . "Tratamiento" también quiere decir abarcar la entrega de un agente inhibidor para proporcionar un efecto farmacológico, incluso en la ausencia de una enfermedad o condición. Por ejemplo, "tratamiento" abarca la entrega de un agente inhibidor de enfermedad o patógeno que proporciona efectos mejorados o deseables en el sujeto (por ejemplo, la reducción de carga de patógenos, reducción de síntomas de enfermedad, etc.).

Como se usa en la presente, los términos "tratar profilácticamente" o "que trata profilácticamente" se refieren a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma del mismo y/o pueden ser terapéuticos en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad.

Como se usa en la presente, el término "huésped", "sujeto", "paciente" u "organismo" incluye humanos y mam íferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, gatos, perros y caballos). Los huéspedes típicos a los cuales los compuestos de la presente descripción pueden ser administrados serán mam íferos, en particular, primates, especialmente humanos. Para aplicaciones veterinarias, una amplia variedad de sujetos será adecuada, por ejemplo, ganadería tal como, reses, borregos, cabras, vacas, cerdos y similares; aves de corral, tales como pollos, patos, gansos, pavos y similares; y animales domesticados, en particular mascotas tales como perros y gatos. Para aplicaciones diagnósticas o de investigación, una amplia variedad de mam íferos pueden ser sujetos adecuados, incluyendo roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres), conejos, primates y cerdos, tales como cerdos endogámicos y similares. El término "huésped vivo" se refiere a un huésped como es notado antes u otro organismo que está vivo. El término "huésped vivo" se refiere al huésped u organismo entero y no solo a una parte cortada (por ejemplo, un hígado u otro órgano) del huésped vivo.

El término "compuesto aislado" significa un compuesto que ha sido substancialmente separado de, o enriquecido en relación a, otros compuestos con los cuales ocurre en la naturaleza. Los compuestos aislados son usualmente al menos aproximadamente 80% , al menos 90% puro, al menos 98% puro, o al menos aproximadamente 99% puro, en peso. La presente descripción quiere decir que incluye diastereómeros, así como sus formas enantioméricamente puras, racémicas y resueltas y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas.

El término "forma de dosificación unitaria", como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y/o animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un compuesto (por ejemplo, un compuesto antiviral, como se describe en la presente), calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para formas de dosificación unitaria dependen del compuesto particular empleado, la ruta y frecuencia de administración, el efecto a ser lograd y la farmacodinámica asociada con cada compuesto en el huésped.

Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" , "diluyente farmacéuticamente aceptable", "portador farmacéuticamente aceptable" o "auxiliar farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente, diluyente, portador y/o auxiliar que es útil para preparar una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y ni biológicamente ni de otra manera indeseable, e incluye un excipiente, diluyente, portador y auxiliar que son aceptables para uso veterinario y/o uso farmacéutico humano. "Un excipiente, diluyente, portador y/o auxiliar farmacéuticamente aceptable" como es usado en la especificación y reivindicaciones incluye uno o más de tales excipientes, diluyentes, portadores y auxiliares.

Como se usa en la presente, una "composición farmacéutica" quiere decir que abarca una composición adecuada para administración a un sujeto, tal como un mamífero, especialmente un humano. En general, una "composición farmacéutica" es estéril, y de preferencia está libre de contaminantes que son capaces de provocar una respuesta no deseada dentro del sujeto (por ejemplo, el o los compuestos en la composición farmacéutica es grado farmacéutico). Las composiciones farmacéuticas pueden ser diseñadas para administración a sujetos o pacientes en necesidad de lo mismo vía una variedad de rutas diferentes de administración incluyendo oral, intravenosa, bucal , rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, intraqueal, intramuscular, subcutánea, por inhalación y similares.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en al presente se refiere a esa cantidad de una modalidad del agente (la cual puede ser referida como un compuesto, un agente inhibidor y/o un medicamento) siendo administrado que aliviará en algún grado uno o más de los síntomas de la enfermedad, es decir, infección, siendo tratada, y/o esa cantidad que prevendrá, en algún grado, uno o más de los síntomas de la enfermedad, es decir, infección, que el huésped siendo tratado tiene o está en riesgo de desarrollar.

Los virus son agentes infecciosos intracelulares pequeños que replican vía uso de la maquinaría de células huésped. El montaje de virus y florecimiento de Flaviviridae sigue siendo pobremente entendido, aunque datos recientes sugieren que puede estar involucrada la ruta endocítica, tal como con el Virus de Hepatitis C (HCV). Las proteínas huésped están involucradas en estos procesos, aunque antes de la presente descripción, las proteínas huésped involucradas en mediar el montaje final y florecimiento no eran enfocadas como agentes antivirales. Sin embargo, la presente descripción proporciona métodos antivirales y composiciones que enfocan proteínas huésped para montaje final y florecimiento. En particular, las proteínas adaptadores de clatrina de huésped y sus reguladores involucrados en las rutas endocíticas o secretoras son objetivos efectivos. El papel de las proteínas adaptadores de clatrina y sus reguladores en la producción de Flaviviridae infecciosos era previamente desconocido. La presente descripción demuestra que las proteínas adaptadoras de clatrina huésped, tales como AP2M 1 , AP1 M 1 , AP3 1 y AP4M 1 y sus proteínas reguladoras, tales como pero no limitadas a AAK1 y GAK son objetivos adecuados para terapias antivirales. Además, la presente descripción proporciona un motivo de aminoácido viral novedoso que media la interacción con una proteína huésped.

Un motivo ???F conservado fue descubierto dentro de la proteína de núcleo de HCV, una proteína de membrana de 191 -aminoácidos que forma la cápside viral (FIGs. 1 A-F). Este motivo ???F es conservado a través de todos los aislados de HCV disponibles en las bases de datos a la fecha. Este motivo también fue descubierto en proteínas estructurales de otros Flaviviridae y otros virus. Este motivo ???F se conforma con la señal de clasificación de consenso ???F dentro de las proteínas de carga de huésped de membrana, reconocidas por la subunidad de µ de los complejos de proteína adaptadora de clatrina (AP) (FIG. 1 A). AP2M 1 media la endocitosis dependiente de clatrina, el proceso mediante el cual las proteínas de carga son clasificadas en pozos recubiertos de clatrina destinados para fusión con endosomas tempranos. El reconocimiento de los motivos de ???F o dileucina dentro de las proteínas retrovirales por AP2M 1 o AP1 M 1 ha mostrado estar involucrado en mediar el montaje y florecimiento de retroviruses (FIG . 1 B) (Batonick et al. , Virology 342: 1 90-20?, 2005; Camus et al. , olec Biol Cell 18:3193-3203, 2007; Berlioz-Torrent et al. , J Virol 73: 1 350-1 361 , 1 999; Byland et al. , Molec Biol Cell 18:414-1425, 2007; Wyss et al. , J Virol 75:2982-2992, 2001 ; Ohno et al. , Virology 238:305-31 5, 1997; Bote et al . , J Biol Chem 273: 1 5773-1 5778, 1998; Egan et al. , J Virol 70:6547-6556, 1996; Rovwell et al. , J I mmunol 1 55:473-488, 1995; Lodge et al. , EMBO J 16:695-705, 1997; Deschambeault et al . , J Virol 73:501 0-501 7, 1999). Sin embargo, el papel de AAK1 y GAK en infección de H IV no ha sido estudiado, y estos mecanismos no han sido enfocados farmacológicamente. De acuerdo con esto, la presente descripción proporciona métodos y composiciones para tratar o prevenir infección viral de HCV, Flaviviridae, Flaviviridae diferentes de HCV, H IV, Lentiviridae diferentes de HIV, virus de unión de clatrina AP, unión de clatrina AP diferente de Flaviviridae, virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, o co-infecciones tales como co-infecciones de HCV/HIV.

La inhibición de la interacción entre el motivo ???F viral y proteínas adaptadoras de huésped, tales como pero no limitadas a AP2M 1 , resulta en la producción de virus infeccioso reducida de HCV, Flaviviridae, Flaviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP, virus de unión de clatrina AO diferentes de Flaviviridae, virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, o co-infecciones tales como coinfecciones de HCV/HIV. Además, la inhibición de la actividad de proteínas que regulan las proteínas adaptadoras de clatrina puede resultar en la producción de virus infecciosos reducida de HCV, Flaviviridae, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV; o co-infecciones tales como coinfecciones de HCV/H IV. Así, las aproximaciones diseñadas para romper la interacción de motivo ???F viral con proteínas adaptadoras de clatrina, tal como AP2M 1 y similares, puede ser útil para inhibir la producción de virus infecciosos.

La regulación de la actividad de muchas proteínas ocurre a través de la acción de proteína cinasas y proteína fosfatasas. GAK y AAK1 son dos proteína cinasas que modulan la actividad de AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, indicando que la administración de inhibidores de proteína cinasa, tales como erlotinib, sunitinib, o PKC-412 puede eliminar la interacción de AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP con motivos virales de ??? o dileucina, inhibiendo por ello la infección viral de HC, Flaviviridae, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, H IV, Lentiviridae diferentes de HIV, o co-infecciones tales como co-infecciones de HCV/HIV, como se describe con más detalle más adelante.

Por lo tanto, las modalidades de la presente descripción proporcionan métodos para tratar una infección viral de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecciones, tales como co-infecciones de HCV/H IV, Flaviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, o cualquier otro virus envuelto que secuestra AP2M 1 otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP/AAK1 /GAK, composiciones (incluyendo agentes inhibidores y combinaciones de tales agentes con otras terapias antivirales) para tratar una infección por tales virus, y similares. En particular, las modalidades de la presente invención proporcionan métodos para tratar infecciones provocadas por virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, y composiciones para tratar estas infecciones o cualquier otro virus envuelto que une proteínas adaptadores de clatrina, tal como AP2M 1 , o es regulada por AAK1 o GAK.

Las modalidades de la presente descripción proporcionan métodos para tratar profilácticamente una infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecciones, tales como co-infecciones de HCV/H IV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, composiciones (incluyendo agentes inhibidores y combinaciones de tales agentes con otras terapias antivirales) para tratar profilácticamente una infección por tales virus y similares. En particular, las modalidades de la presente invención proporcionan métodos para tratar profilácticamente HCV y/o HIV, y composiciones para tratar HCV y/o H IV. En una modalidad alternativa, la presente invención proporciona métodos para tratar infección de HCV/H IV o Flaviviridae diferente de HCV. Aunque la discusión en la presente puede describir la invención con respecto a HCV, se debería notar que la descripción se refiere no solo a HCV, sino también a virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HIV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, y composiciones para tratar estas infecciones o cualquier otro virus envuelto que une AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP o es regulado por AAK1 o GAK, o cualquier otro virus envuelto que une proteínas adaptadoras de clatrina, tal como AP2M 1 y similares, u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP y su interacción es regulada por AAK1 /GAK.

En vista del reconocimiento de que las proteínas virales comprendiendo un motivo de ???F o dileucina pueden mediar la interacción con proteínas huésped, las modalidades de la presente invención proporcionan composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) incluyendo un agente inhibidor que puede ser usado para tratar un huésped infectado por un virus de la familia Flaviviridae de virus. En particular, el agente inhibidor puede ser usado para tratar huéspedes infectados con infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, o pacientes que sufren de coinfecciones, en particular HCV y H IV o Flaviviridae diferentes de HCV. De acuerdo con esto, dos tipos de agentes inhibidores encuentran uso en la presente: (1 ) aquéllos que inhiben la interacción entre una proteína viral comprendiendo el motivo de ???F o dileucina y proteínas adaptadoras de clatrina huésped , tal como AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP; y (2) aquéllos que inhiben la actividad de cinasa que regula las proteínas huésped. En algunas modalidades, el agente inhibidor inhibe AAK1 o GAK.

Como se describe en los Ejemplos, se ha observado que el motivo ???F de HCV en una proteína estructural se une a la proteína huésped AP2M 1 . Esta interacción ha sido usada para identificar los agentes inhibidores que interfieren con la interacción y así pueden ser candidatos para desarrollo clínico como medicamentos para tratar infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV.

Agentes inhibidores descritos en la presente son útiles en el tratamiento de infecciones virales, donde el virus es un virus conteniendo el motivo ???F, y Y es un residuo de tirosina, X es cualquier aminoácido y F es un residuo hidrofobico voluminoso. Estos pueden incluir, pero o están limitados a, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina y valina. Los agentes inhibidores descritos en la presente son útiles en el tratamiento de infecciones virales, donde el virus comprende un virus conteniendo motivo de dileucina. Los motivos de dileucina pueden incluir, pero no están limitados a, leucina-leucina, isoleucina-leucina, leucina-isoleucina, [D/E]XXXL[L/I], o DXXLL (donde X es cualquier aminoácido). Virus conteniendo motivos de ???F o dileucina incluyen, entre otros, virus de familias Lentiviridae, tal como HIV, y Flaviviridae. Ejemplos de Flaviviridae incluyen, pero no están limitados a, flavivirus, pestivirus y virus de hepatitis C. otros virus conteniendo motivos de ???F o dileucina incluyen virus de fiebre amarilla (YFV); virus de dengue, incluyendo Dengue tipos 1 -4; virus de encefalitis japonesa; virus de encefalitis del Valle de Murray; virus de encefalitis de St. Louis; virus del Nilo occidental; virus de encefalitis portado por garrapata; virus de hepatitis C (HCV); virus Kunjin; virus de encefalitis de Europa Central; virus de encefalitis de primavera-verano rusa; virus Powassan; virus de enfermedad de Kyasanur Forest; virus l lheus; virus Apoi; virus GB A y G ; virus de enfermedad de Louping y virus de fiebre hemorrágica de Omsk.

En una modalidad, los agentes inhibidores (por ejemplo, agentes anti-HCV) para uso para inhibir la replicacion de HCV y tratar infección de HCV, son de particular interés. Los Flaviviridae diferentes de HCV y virus envueltos diferentes de Flaviviridae también son de interés. El HCV contemplado por la descripción puede ser de cualquier genotipo (genotipo 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y similares), así como subtipos de un genotipo de HCV (por ejemplo, 1 a, 1 b, 2a, 2b, 3a, etc.). Debido a que el genotipo HCV 1 es normalmente el más difícil de tratar, los métodos y composiciones de la invención para tratar infecciones por HCB genotipo 1 y subtipos de genotipo 1 son de particular interés. En una modalidad, las co-infecciones de HCV son de interés. En particular, las coinfecciones de HCV/HIV son de interés.

Aunque la especificación a continuación se refiere a HCV, tal referencia es solo para claridad y no pretende limitar la descripción como se describe con más detalle más adelante para HCV. Como se nota antes, los métodos y composiciones de la invención pueden ser aplicados a cualquier virus que posee un motivo de ???F o dileucina en una proteína estructural (por ejemplo, la infección viral de HCV, Flaviviridae, Flaviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, co-infecciones tales como coinfecciones de HCV/IH IV), Lentiviridae o HIV. Las composiciones y métodos también pueden ser aplicados a co-infecciones, e infecciones con Flaviviridae diferentes de HCV, y virus envueltos diferentes de Flaviviridae.

La presente descripción también describe métodos libres de células in vitro para identificar agentes (agentes inhibidores) que modulan la unión entre una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina y una proteína adaptadora de clatrina huésped, tal como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. Un agente de prueba que inhibe la unión de proteínas virales conteniendo motivo ???F o dileucina a proteínas huésped incluyendo proteínas adaptadores de clatrina, tales como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, puede ser probado adicionalmente por su capacidad para inhibir la replicacion viral en un ensayo basado en células. Por ejemplo, un agente de prueba de interés puede ser contactado con una célula mamífera que aloja todo o parte de un genoma y el efecto del agente de prueba sobre la replicacion de HCV puede ser determinado. Las células adecuadas incluyen células de hígado de mamífero que son permisivas para replicación de HCV, por ejemplo, una línea de células de hepatocitos humana inmortalizada que es permisiva para HCV. Por ejemplo, una célula de mam ífero adecuada es hepatocito Huh7 o un subclon de hepatocito Huh7, por ejemplo, Huh-7.5. Las l íneas de células adecuadas son descritas en , por ejemplo, Blight et al. (J Virol 76: 1 3001 , 2002) y Zhang et al . (J Virol. 78: 1448, 2004). En una modalidad, el genoma de HCV en la célula comprende un reportador, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica luciferasa, una proteína fluorescente, u otra proteína que proporciona una señal detectable; y determinar el efecto, si lo hay, del agente de prueba sobre la replicación de HCV es logrado por la detección de una señal del reportador. Otros sistemas de ensayo virales son conocidos en la técnica.

En una modalidad , los agentes de prueba son porciones orgánicas. En esta modalidad, como se describe de manera general en WO 94/24314, la cual es incorporada en la presente por referencia, los agentes de prueba son sintetizados a partir de una serie de substratos que pueden ser modificados químicamente. "Químicamente modificados" en la presente incluye reacciones químicas tradicionales, así como reacciones enzimáticas. Estos substratos generalmente incluyen, pero no están limitados a, grupos alquilo (incluyendo aléanos, alquenos, alquinos y heteroalquilo), grupos arilo (incluyendo árenos y heteroarilo), alcoholes, éteres, aminas, aldehidos, cetonas, ácidos, esteres, amidas, compuestos cíclicos, compuestos heterocíclicos (incluyendo purinas, pirimidinas, benzodiacepinas, beta-lactamas, tetraciclinas, cefalosporinas y carbohidratos), esteroides (incluyendo estrógenos, andrógenos, cortisona, ecodisona, etc.) , alcaloides (incluyendo ergots, vinca, curare, pirolizdina y mitomicinas), compuestos organometálicos, compuestos que portan heteroátomos, aminoácidos y nucleósidos. Las reacciones químicas (incluyendo enzimáticas) pueden hacerse en las porciones para formar nuevos substratos o agentes candidatos, los cuales pueden ser probados entonces usando los presentes métodos.

Así, en modalidades específicas, un agente de prueba de interés (por ejemplo, un agente inhibidor de la invención) inhibe la replicacion viral por al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10% , al menos aproximadamente 1 5%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%; al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% , o más, comparados con el nivel de replicacion de HCV en la ausencia del agente de prueba.

En particular, las modalidades de la presente invención incluyen agentes inhibidores que inhiben la unión de proteínas virales conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas adaptadoras de clatrina huésped, tal como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP por al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 1 0%, al menos aproximadamente 1 5% , al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%; al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, o más, comparadas con la unión de proteínas virales conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas adaptadoras de clatrina huésped, tal como AP2M1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP en la ausencia del agente de prueba.

Todavía en otra modalidad, el agente inhibidor es uno que inhibe la unión de una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas adaptadoras de clatrina huésped, tal como AP2M1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP con una concentración inhibidora de 50% (IC5o) de aproximadamente 100 µ? a 50 µ?, aproximadamente 50 µ? a 25 µ?, aproximadamente 25 µ? a 10 µ?, aproximadamente 10 µ? a 5 µ?, aproximadamente 5 µ? a 1 µ?, ø aproximadamente 1 µ? a 500 nM, aproximadamente 500 nM a 400 nM, aproximadamente 400 nM a 300 nM, aproximadamente 300 nM a 250 nM, aproximadamente 250 nM a 200 nM, aproximadamente 200 nM a 150 nM, aproximadamente 150 nM a 100 nM, aproximadamente 100 nM a 50 nM, aproximadamente 50 nM a 30 nM, aproximadamente 30 nM a 25 nM, aproximadamente 25 nM a 20 nM, aproximadamente 20 nM a 15 nM, aproximadamente 15 nM a 10 nM, aproximadamente 10 nM a 5 nM, o menos de aproximadamente 5 nM.

Todavía en otra modalidad, el agente inhibidor inhibe la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas adaptadores de clatrina huésped, tal como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. En una modalidad, el agente inhibidor inhibe la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped, tal como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP con una IC50 de menos de aproixmadamente 500 nM, por ejemplo, en algunas modalidades, el agente inhibidor inhibe la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas estructurales huésped , tal como AP2M1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP con una I C50 de aproximadamente 500 nM a 400 nM , aproximadamente 400 nM a 300 nM, aproximadamente 300 nM a 250 nM , aproximadamente 250 nM a 200 nM, aproximadamente 200 nM a 150 nM, aproximadamente 1 50 nM a 100 nM, aproximadamente 100 nM a 50 nM , aproximadamente 50 nM a 30 nM , aproximadamente 30 nM a 25 nM , aproximadamente 25 nM a 20 nM, aproximadamente 20 nM a 1 5 nM, aproximadamente 1 5 nM a 10 nM , aproximadamente 10 nM a 5 nM o menos de aproximadamente 5 nM .

Todavía en otra modalidad, el agente inhibidor, cuando se contacta con una célula infectada con virus (por ejemplo, una célula de hígado infectada con HCV), inhibe la replicación viral en la célula por al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 1 0%, al menos aproximadamente 1 5%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25% , al menos aproximadamente 30% , al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, o más, comparado con el nivel de replicación viral en una célula infectada con virus no contactada con el agente inhibidor.

Todavía en otra modalidad, el agente inhibidor, cuando se contacta con una célula infectada con virus (por ejemplo, una célula de hígado infectada con HCV), reduce la cantidad de partículas virales infecciosas producidas por la célula infectada por al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 1 5%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25% , al menos aproximadamente 30%, a menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60% , la menos aproximadamente 70% , al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% , o más, comparada con el número de partículas virales infecciosas producidas por la célula no contactada con el agente inhibidor.

Todavía en otra modalidad, además de determinar el efecto de un agente de prueba sobre la inhibición de proteínas virales conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas adaptadores de clatrina huésped , tal como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, los agentes de prueba son valorados para cualquier actividad citotóxica que puedan exhibir hacia una célula eucariocítica viva, usando ensayos bien conocidos, tales como exclusión de tinte azul tripano, un ensayo de MTT (3-(4, 5-dimetilt¡azol-2-il)-2, 5-difen¡l-2H-tetrazolio) y similares. Los agentes que no exhiben actividad citotóxica significativa pueden ser considerados agentes preferidos para desarrollo adicional como medicamentos.

Todavía en otra modalidad, el agente inhibidor, cuando se administra en una o más dosis a un individuo infectado con un virus como se describe en la presente (por ejemplo, un humano), reduce la carga viral den el individuo por al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 1 0%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30% , al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60% , al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% o más, comparado con la carga viral en el individuo no tratado con el agente inhibidor.

Agentes inhibidores Las modalidades de la presente descripción proporcionan agentes inhibidores que pueden ser usados para tratar un huésped infectado por un virus de la familia de virus Flaviviridae. En particular, Flaviviridae diferentes de HCV. En particular, el agente inhibidor puede ser usado para tratar huéspedes infectados con virus de Hepatitis C o coinfecciones, en particular HCV + HIV. El agente inhibidor puede estar en uno o más de los siguientes grupos: inhibidores de proteína cinasas AAK1 o GAK, las cuales regulan el adaptador de proteína-clatrina viral, tal como AP2M 1 (u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP), unen y median el montaje de virus y/o florecimiento. Debido a que AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP median varias etapas en los ciclos de vida de múltiples virus, la inhibición de AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, tal como mediante inhibición de sus proteína cinasas o fosfatasas reguladoras, pueden afectar o inhibir múltiples virus. De acuerdo con esto, las proteínas cinasas que regulan estas proteínas huésped pueden ser funcionalmente relevantes en otras familias virales. Aunque no exclusivamente específicas (como muchos compuestos), los inhibidores de proteína cinasa descubiertos se unen a AAK1 o GAK con altas afinidades en comparación con sus otros objetivos y no tienen efecto sobre la replicación de RNA de HCV, demostrando una selectividad relativamente buena.

Otros agentes que encuentran uso como inhibidores de GAK y AAK1 incluyen, pero no están limitados a, RNAi, antisentido, ribozimas, o moléculas pequeñas que compiten con erlotinib, sunitinib, o PKC-412 para unión a GAK o AAK1 . Además, los inhibidores que son capaces de competir con motivos de ???F o dileucina para unión a proteínas huésped incluyen, pero no están limitados a, agentes de unión tales como anticuerpos dirigidos a ???F o dileucina o contra AP2M 1 u otras subunidades µ de complejos de clatrina AP. Además, las proteínas de unión negativa dominante o aptámeros pueden inhibir GAK o AAK1 . En otra modalidad, los receptores o polipéptidos de señuelo correspondientes al sitio de unión de ???F o dileucina a partir de AP2M 1 y otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP pueden inhibir GAK o AAK1 .

Las modalidades de la presente invención incluyen sales de los agentes inhibidores. Las modalidades de la presente invención incluyen promedicamentos de los agentes inhibidores. Las modalidades de la invención incluyen en composiciones, composiciones farmacéuticas, composiciones líquidas, composiciones de gel y similares, conteniendo cada una un agente inhibidor identificado en la presente, y cada una de estas composiciones, en una modalidad, pueden estar en la forma de una formulación de liberación controlada o de liberación sostenida. En una modalidad, el agente inhibidor puede ser usado en combinación con otro agente usado para tratar una infección viral de la familia Flaviviridae, y como se nota previamente, cualquiera de los agentes (el agente inhibidor y el otro agente) o ambos agentes pueden estar e la forma de una liberación controlada o una liberación sostenida. En algunos casos, el término "agente inhibidor" puede ser referido como un agente activo o medicamento.

Formulaciones farmacéuticas y rutas de administración Las modalidades de la presente descripción incluyen uno o más agentes inhibidores identificados en la presente y formulados con uno o más excipientes, diluyentes, portadores y/o adjuvantes farmacéuticamente aceptables. Además, las modalidades de la presente invención incluyen tales agentes inhibidores formulados con una o más substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables. En particular, uno o más agentes inhibidores pueden ser formulados con uno o más excipientes, diluyentes, portadores y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para proporcionar una modalidad de una composición de la invención.

En una modalidad, el agente inhibidor puede combinarse con otro agente antiviral para preparar una composición de la invención, y la composición puede incluir uno o más excipientes, diluyentes, portadores y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

En una modalidad, una gente inhibidor que inhibe la unión de una protelna conteniendo un motivo de ???F o dileucina a una proteína adaptadora de clatrina huésped, tal como AP2M1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP (referidos a continuación como "un agente activo objeto" o "medicamento") puede ser formulado con uno o más excipientes, diluyentes, portadores y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Una amplia variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica. Los excipientes farmacéuticamente aceptables han sido ampliamente descritos en una variedad de publicaciones, incluyendo, por ejemplo, Gennaro (2000), "Remington: The Science and Practice of Pharmacy"; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1 999); y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000).

Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, son fácilmente disponibles para el público. Más aún, las substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes amortiguadores y ajustadores de pH, agentes ajustadores de tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares, están fácilmente disponibles para el público.

En una modalidad de la presente descripción, el agente inhibidor es administrado al huésped usando cualquier medio capaz de resultar en el efecto deseado (por ejemplo, reducción en carga viral, reducción en fibrosis de hígado, aumento en función de h ígado y similares). Así, el agente inhibidor puede ser incorporado en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. Por ejemplo, el agente inhibidor puede ser formulado en composiciones farmacéuticas mediante combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables, apropiados, y pueden ser formulados en preparaciones en formas sólidas, semi-sólidas, líquidas o gaseosas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles.

En formas de dosificación farmacéutica, el agente inhibidor puede ser administrado en la forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o un agente activo objeto puede ser usado solo o en asociación apropiada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ejemplares y no son limitantes en forma alguna.

Para preparaciones orales, el agente inhibidor puede ser usado solo o en combinación con aditivos apropiados para hacer tabletas, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de papa; con ligantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegradores, tales como almidón de maíz, almidón de papa o carboximetilcelulosa de sodio; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, conservadores y agentes saborizantes.

Las modalidades del agente inhibidor pueden ser formuladas en preparaciones para inyección al disolverlos, suspenderlos o emulsificarlos en un solvente acuoso o no acuoso, tales como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos mayores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsificantes, estabilizantes y conservadores.

Las modalidades del agente inhibidor pueden ser utilizadas en formulación de aerosol para ser administradas vía inhalación. Las modalidades del agente inhibidor pueden ser formuladas en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Adicionalmente, las modalidades del agente inhibidor pueden hacerse en supositorios al mezclarse con una variedad de bases, tales como bases emulsificantes o bases solubles en agua . Las modalidades del agente inhibidor pueden ser administradas de manera rectal vía un supositorio. El supositorio puede incluir veh ículos tales como manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, los cuales se funden a temperatura corporal, aunque todavía son solidificados a temperatura ambiente.

Las formas de osificación unitaria para administración oral o rectal, tales como jarabes, elíxires y suspensiones, pueden ser provistas en donde cada unidad de dosificación , por ejemplo, cucharita, cuchara, tableta o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición conteniendo uno o más agentes inhibidores. De manera similar, las formas de dosificación unitaria para inyección o administración intravenosa pueden comprender el agente inhibidor en una composición como una solución en agua estéril, solución normal u otro portador farmacéuticamente aceptable.

Las modalidades del agente inhibidor pueden ser formuladas en una composición inyectable de acuerdo con la invención. Normalmente, las composiciones inyectables son preparadas como soluciones o suspensiones liquidas; las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos l íquidos antes de la inyección también pueden ser preparados. La preparación también puede ser emulsificada o el ingrediente activo (agente inhibidor) encapsulado en vehículos de liposoma de acuerdo con la invención.

En una modalidad, el agente inhibidor es formulado para entrega mediante un sistema de entrega continuo. El término "sistema de entrega continuo" es usado de manera intercambiable en la presente con "sistema de entrega controlado" y abarca dispositivos de entrega continua (por ejemplo, controlada) (por ejemplo, bombas) en combinación con catéteres, dispositivos de inyección y similares, una amplia variedad de los cuales son conocidos en la técnica.

Las bombas de infusión mecánica o electromecánica también pueden ser adecuadas para uso con la presente descripción. Ejemplos de tales dispositivos incluyen aquéllos descritos en, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 4,692, 147; 4,360,01 9; 4,487,603; 4,360,019; 4,725, 852; 5,820,589; 5,643, 207; 6, 1 98,966; y similares. En general, la entrega del agente inhibidor puede ser lograda usando cualquiera de una variedad de sistemas de bomba rellenables. Las bombas proporcionan liberación consistente, controlada en el tiempo. En algunas modalidades, el agente inhibidor está en una formulación líquida en un depósito impermeable al medicamento, y es entregado en una manera continua al individuo.

En una modalidad, el sistema de entrega de medicamento es un dispositivo al menos parcialmente implantable. El dispositivo implantable puede ser implantado en cualquier sitio de implantación adecuado usando métodos y dispositivo bien conocidos en la técnica, un sitio de implantación es un sitio dentro del cuerpo de un sujeto en el cual un dispositivo de entrega de medicamento es introducido y posicionado. Los sitios de implantación incluyen , pero no necesariamente están limitados a, un sitio subdérmico, subcutáneo, intramuscular, u otro sitio adecuado dentro del cuerpo del sujeto. Los sitios de implantación subcutánea son usados en algunas modalidades debido a la conveniencia en la implantación y remoción del dispositivo de entrega de medicamento.

Los dispositivos de liberación de medicamento adecuados para uso en la descripción pueden basarse en cualquiera de una variedad de modos de operación. Por ejemplo, el dispositivo de liberación de medicamento puede basarse en un sistema difusivo, un sistema convectivo o un sistema erosionable (por ejemplo, un sistema basado en la erosión) . Por ejemplo, el dispositivo de liberación de medicamento puede ser una bomba electroquímica, bomba osmótica, una bomba electrosmótica, una bomba de presión de vapor, o matriz de estallido osmótica, por ejemplo, donde el medicamento es incorporado en un polímero y el pol ímero proporciona para liberación de concomitante de formulación de medicamento con degradación de un material polimérico impregnado en medicamento (por ejemplo, un material polimérico impregnado con medicamento, biodegradable). En otras modalidades, el dispositivo de liberación de medicamento es basado en un sistema de electrodifusión, una bomba electrocítica, una bomba efervescente, una bomba piezoeléctrica, un sistema hidrolítico, etc.

Los dispositivos de liberación de medicamento basados en una bomba de infusión mecánica o electromecánica también pueden ser adecuados para uso con la presente descripción. Ejemplos de tales dispositivos incluyen aquéllos descritos en , por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 4,692, 147; 4,360,01 9; 4,487,603; 4,360,01 9; 4,725,852 y similares. En general, un método de tratamiento objeto puede ser logrado usando cualquiera de una variedad de sistemas de bomba no intercambiables, rellenables. Las bombas u otros sistemas convectivos son generalmente preferidos debido a su liberación controlada, generalmente más consistente, durante el tiempo. Las bombas osmóticas son usadas en algunas modalidades debido a sus ventajas combinadas de liberación controlada más consistente y tamaño relativamente pequeño (ver, por ejemplo, la solicitud publicada de PCT no. WO 97/27840 y patentes estadounidenses nos. 5,985, 305 y 5,728,396) . Los dispositivos osmóticamente impulsados de manera ejemplar adecuados para uso en la descripción incluyen, pero no están necesariamente limitados a, aquéllos descritos en las patentes estadounidenses nos. 3,760,984; 3,845,770; 3,916,899; 3,923,426; 3,987,790; 3,995,631 ; 3,916,899; 4,01 6,880; 4,036,228; 4, 1 1 1 ,202; 4, 1 1 1 ,203; 4,203,440; 4,203,442; 4,21 0, 139; 4,327,725; 4,627,850; 4,865,845; 5,057, 318; 5,050,423; 5, 1 12,614; 5, 137,727; 5,234,692; 5,234,693; 5, 728,396; y similares.

En algunas modalidades, el dispositivo de entrega de medicamento es un dispositivo implantable. El dispositivo de entrega de medicamento puede ser implantado en cualquier sito de implantación adecuado usando métodos y dispositivos bien conocidos en la técnica. Como se nota en la presente, un sitio de implantación es un sitio dentro del cuerpo de un sujeto en el cual un dispositivo de entrega de medicamento es introducido y posicionado. Los sitios de implantación incluyen, pero no necesariamente están limitados a un sitio subdérmico, subcutáneo, intramuscular u otro sitio adecuado dentro del cuerpo del sujeto.

En algunas modalidades, un agente activo es entregado usando un sistema de entrega de medicamento implantable, por ejemplo, un sistema que es programable para proporcionar administración del agente. Sistemas implantables programables ejemplares incluyen bombas de infusión implantables. Las bombas de infusión implantables ejemplares o dispositivos útiles en conexión con tales bombas son descritos en, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 4,350, 1 55; 5,443,450; 5,814,019; 5,976, 1 09; 6,017,328; 6, 171 ,276; 6,241 ,704; 6,464,687; 6,475, 180; y 6,51 2,954. Un dispositivo ejemplar adicional que puede ser adaptado para la presente descripción es la bomba Synchromed Infusión (Medtronic).

Vehículos de excipientes adecuados para el agente inhibidor son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes o agentes amortiguadores de pH. Los métodos para preparar tales formas de solidificación son conocidos, o serán evidentes sobre consideración de esta descripción, a aquéllos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1 7a edición, 1985. La composición o formulación a ser administrada contendrá, en cualquier caso, una cantidad del agente inhibidor adecuado para alcanzar el estado deseado en el sujeto siendo tratado.

Las composiciones de la presente invención incluyen aquéllas que comprenden una matriz de liberación sostenida o liberación controlada. Además, las modalidades de la presente invención pueden ser usadas en conjunción con otros tratamientos que usan formulaciones de liberación sostenida. Como se usa en la presente, una matriz de liberación sostenía es una matriz hecha de materiales, usualmente polímeros, los cuales son degradables mediante hidrólisis enzimática o basada en ácido o mediante disolución. Una vez insertada en el cuerpo, la matriz es accionada mediante enzimas y fluidos corporales. Una matriz de liberación sostenida deseablemente es elegida a partir de materiales biocompatibles, tales como liposomas, poliláctidos (ácido poliláctido), poliglicolido (polímero de ácido glicólico), co-glicólido de poliláctido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) , polianhídridos, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucléotidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicón. Las matrices biodegradables ilustrativas incluyen una matriz de poliláctido, una matriz de poliglicolido, y una matriz de poliláctico co-glicólido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico).

En otra modalidad, la composición farmacéutica de la presente descripción (así como composiciones de combinación) es entregada en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el agente inhibidor puede ser administrado usando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración . En una modalidad, puede usarse una bomba (Sefton 1987; Buchwald et al . 1980; Saudek et al 1 989). En otra modalidad, los materiales poliméricos son usados. Todavía en otra modalidad, un sistema de liberación controlada es colocado en proximidad del objetivo terapéutico, es decir, el h ígado, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica. Todavía en otra modalidad, un sistema de liberación controlada es colocado en proximidad del objetivo terapéutico, requiriendo así solo una fracción del sistémico. Otros sistemas de liberación controlada son discutidos en la revisión por Langer ( 1990).

En otra modalidad, las composiciones de la presente invención (así como composiciones de combinación por separadas o juntas) incluyen aquéllas formadas mediante impregnación de un agente inhibidor descrito en la presente en materiales de absorción , tales como suturas, vendas y gasa, o recubiertos sobre la superficie de materiales de fase sólida, tales como grapas quirúrgicas cierres y catéteres para entregar las composiciones. Otros sistemas de entrega de este tipo serán fácilmente evidentes para aquéllos expertos en la técnica en vista de la presente descripción.

Métodos de tratamiento Las modalidades de la presente invención incluyen métodos para tratar una infección mediante infección viral de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentíviridae, HCV, H IV, co-infecciones, tales como coinfecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV. En particular, agentes inhibidores descritos en la presente pueden ser usados para tratar una infección mediante un virus de la familia de virus Flaviviridae. En una modalidad, la presente descripción proporciona un método para tratar un huésped infectado con un virus como se describe antes al administrar al huésped una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente inhibidor en una o más dosis, para reducir la carga viral en el huésped.

Las modalidades de la presente invención incluyen métodos para tratar profilácticamente una infección por una infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecciones, tales como co-infecciones de HCV/H IV, Flaviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV. En particular, los agentes inhibidores descritos en la presente pueden ser usados para tratar profilácticamente una infección por un virus de la familia Flaviridae de virus. En una modalidad, la presente descripción proporciona un método para tratar profilácticamente un huésped infectado con un virus de la familia Flaviviridae de virus al administrar al huésped una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente inhibidor en una o más dosis, para reducir la carga viral en el huésped. En una modalidad, un método para tratar profilácticamente un huésped infectado con un virus de la familia de virus Flaviviridae, comprendiendo el método administrar al huésped una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente inhibidor para reducir la carga viral en el huésped. Detalles adicionales con respecto a clemizol y dosificación de clemizol se describen antes.

En una modalidad, los agentes inhibidores descritos en la presente son usados en combinación con otro agente (por ejemplo, un agente antiviral) para tratar una infección con infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV; coinfecciones, tales como co-infecciones de HCV/H IV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV. En una modalidad, los agentes inhibidores descritos en la presente son usados en combinación con otro agente (por ejemplo, un agente antiviral) para tratar profilácticamente una infección con un virus de la familia de virus Flaviviridae. Las modalidades del método involucran administrar a un individuo en necesidad de lo mismo uno o más agentes inhibidores que inhiben la unión de proteínas virales conteniendo un motivo de ???F o dileucina para proteínas adaptadores de clatrina huésped, tal como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para tratar una infección de flavivirus, por ejemplo, una infección de HCV, y métodos para reducir la fibrosis de h ígado que puede ocurrir como secuelas de una infección de HCV.

En una modalidad, el agente inhibidor incluye uno o más agentes inhibidores descritos antes. En varias modalidades, el agente inhibidor es un inhibidor de proteína cinasa, tales como inhibidores de AAK1 o GAK, el cual regula la unión de proteína viral-AP2M 1 o unión de una proteína viral a otras subunidades de µ complejos de clatrina AP y media el montaje de virus y/o florecimiento, o variantes de estas proteínas de las mismas.

En una modalidad, una cantidad efectiva del agente inhibidor es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un huésped (por ejemplo, un humano) en necesidad de lo mismo, reduce la carga viral en el individuo por al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 1 5% , al menos aproximadamente 20% , al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65% , al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75% , al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 85% , o al menos aproximadamente 90%, o más, comparado con la carga viral en el individuo no tratado con el agente inhibidor.

La carga viral puede medirse al medir el titulo o nivel de virus en suero. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, una prueba cuantitativa reacción en cadena de polimerasa (PCR) y DNA ramificada (bDNA). Los ensayos cuantitativos para medir la carga viral (título) de RNA de HCV han sido desarrollados. Muchos de tales ensayos están comercialmente disponibles, incluyendo una PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) (Amplicor HCV Monitor. TM. , Roche Molecular Systems, New Jersey); y un ensayo de amplificación de señal de DNA ramificado [ensayo QuantiplexMR HCV RNA (bDNA), Chiron Corporation , Emeryville, CA.] . Ver, por ejemplo, Gretch et al ( 1995). También es de interés una prueba de ácido nucleico (NAT) vendida por Chiron Corporation bajo el nombre comercial ProcleixM R, la cual prueba simultáneamente NAT por la presencia de H IV-1 y HCV (Vargo et al. 2002).

En algunas modalidades, una cantidad efectiva del agente inhibidor es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un huésped (por ejemplo, humano) en necesidad de lo mismo, aumenta la función de hígado en el individuo por al menos aproximadamente 1 0%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20% , al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35% , al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60% , al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70% al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o más, comparado con la función de h ígado en el individuo no tratado con el agente inhibidor.

En algunas modalidades, una cantidad efectiva del agente inhibidor es una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un huésped (por ejemplo, un humano) en necesidad de lo mismo, reduce la fibrosis de hígado en el huésped por al menos aproximadamente 1 0% , al menos aproximadamente 1 5% , al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55% , al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70% , al menos aproximadamente 75% , al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o más, comparado con el grado de fibrosis de hígado en el individuo no tratado con el agente inhibidor.

Las modalidades de la presente descripción proporcionan métodos, agentes inhibidores y formulaciones farmacéuticas útiles en el tratamiento de pacientes que sufren de una infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, coinfecciones, tales como co-infecciones de HCV/H IV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV. En una modalidad, el paciente es co-infectado con Flaviviridae diferente de HCV. En una modalidad, el paciente es infectado con HCV pero no es sabido que sea infectado con otro virus, incluyendo, pero no limitando a, HIV. En otra modalidad, el paciente es infectado con HCV y uno o más virus adicionales, incluyendo, pero no limitando a, HIV. En una modalidad, el paciente es tratado por una infección viral al administrar solo un agente inhibidor único como se describe en la presente como útil en el tratamiento de infección de HCV. En otra modalidad, el paciente es tratado para una infección viral al administrar tato un agente inhibidor descrito en la presente como útil en el tratamiento de infección de HCV así como uno o más agentes adicionales conocidos por ser útiles en el tratamiento de infección viral, incluyendo pero no limitando a medicamentos para el tratamiento de HIV, tales como Atripla, Complera, Combivir, Retrovir, Truvada, Viracept, Fuzeon, Selzentry, Isentress o similares. En una modalidad, el uno o más agentes adicionales no incluyen un antagonista de CCR-5. En otra modalidad, el uno o más agentes adicionales incluye un antagonista de CCR-5, y el paciente es infectado con HCV pero no es sabido que esté infectado (o no está infectado) con H IV.

Dosificaciones Las modalidades del agente inhibidor pueden ser administradas a un huésped en una o más dosis. En una modalidad, el agente inhibidor puede ser administrado en una cantidad de aproximadamente 10 mg hasta 1000 mg por dosis, por ejemplo, aproximadamente 10 mg hasta 20 mg, aproximadamente 20 mg hasta 25 mg , aproximadamente 25 mg hasta 50 mg, aproximadamente 50 mg hasta 75 mg , aproximadamente 75 mg hasta 1 00 mg, aproximadamente 1 00 mg hasta 125 mg , aproximadamente 1 25 mg hasta 1 50 mg, aproximadamente 1 50 mg hasta 175 mg , aproximadamente 175 mg hasta 200 mg, aproximadamente 200 mg hasta 225 mg, aproximadamente 225 mg hasta 250 mg, aproximadamente 250 mg hasta 300 mg , aproximadamente 300 mg hasta 350 mg , aproximadamente 350 mg hasta 400 mg, aproximadamente 400 mg hasta 450 mg, aproximadamente 450 mg hasta 500 mg, aproximadamente 500 mg hasta 750 mg, o aproximadamente 750 mg hasta 1000 mg por dosis.

En una modalidad, la cantidad del agente inhibidor por dosis es determinada en una base de peso corporal. Por ejemplo, en una modalidad, el agente inhibidor puede ser administrada en una cantidad de aproximadamente 0.5 mg/kg hasta 100 mg/kg , por ejemplo aproximadamente 0.5 mg/kg hasta 1 mg/kg , aproximadamente 1 mg/kg hasta 2 mg/kg , aproximadamente 2 mg/kg hasta 3 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg hasta 5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg hasta 7 mg/kg , aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg , aproximadamente 1 0 mg/kg hasta 1 5 mg/kg , aproximadamente 15 mg/kg hasta 20 mg/kg , aproximadamente 20 mg/kg hasta 25 mg/kg , aproximadamente 25 mg/kg hasta 30 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg hasta 40 mg/kg , aproximadamente 40 mg/kg hasta 50 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg hasta 60 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg hasta 70 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg hasta 80 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg hasta 90 mg/kg, o aproximadamente 90 mg/kg hasta 1 00 mg/kg , o más de aproximadamente 1 00 mg/kg .

Aquéllos de habilidad apreciarán fácilmente que los niveles de dosis pueden variar como una función del agente inhibidor específico administrado, la severidad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a efectos laterales. Las dosificaciones preferidas para un compuesto dado son fácilmente determinables por aquéllos de habilidad en la técnica por una variedad de medios.

En una modalidad, las dosis múltiples del agente inhibidor son administradas. La frecuencia de administración del agente inhibidor puede variar dependiendo de cualquiera de una variedad de factores, por ejemplo, severidad de los síntomas y similares. Por ejemplo, en una modalidad el agente inhibidor es administrado una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, cada dos semanas (qow), una vez por semana (qw), dos veces a la semana (biw), tres veces a la semana (tiw), cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, cada dos días (qod), diario (qd), dos veces al d ía (qid), o tres veces al día (tid). Como se discutió antes, en una modalidad, el agente inhibidor es administrado continuamente.

La duración de administración del agente inhibidor, por ejemplo, el periodo durante el cual el agente inhibidor es administrado, puede variar dependiendo de cualquiera de una variedad de factores, por ejemplo, respuesta del paciente, etc. Por ejemplo, el agente inhibidor puede ser administrado durante un periodo de aproximadamente un día a una semana, aproximadamente dos semanas a cuatro semanas, aproximadamente un mes a dos meses, aproximadamente dos meses a cuatro meses, aproximadamente cuatro meses a seis meses, aproximadamente seis meses a ocho meses, aproximadamente ocho meses a 1 año, aproximadamente 1 año a 2 años, o aproximadamente 2 años a 4 años, o más.

Rutas de administración Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos y composiciones para la administración del agente inhibidor a un huésped (por ejemplo, un humano) usando cualquier método disponible y ruta adecuada para entrega de medicamento, incluyendo métodos in vivo y ex vivo, así como rutas de administración sistémicas y localizadas.

Las rutas de administración incluyen intranasal, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intradérmica, aplicación tópica, intravenosa, rectal, nasal, oral y otras rutas de administración enteral y parenteral. Las rutas de administración pueden ser combinadas, si se desea, o ajustadas dependiendo del agente y/o el efecto deseado. Un agente activo puede ser administrado en una dosis simple o en múltiples dosis.

Las modalidades del agente inhibidor pueden administrarse a un huésped usando métodos convencionales disponibles y rutas adecuadas para entrega de medicamentos convencionales, incluyendo rutas sistémicas o localizadas. En general, las rutas de administración contempladas por la descripción incluyen, pero no están limitadas a, rutas enteral, parenteral o de inhalación.

Las rutas parenterales de administración diferentes de administración por inhalación incluyen, pero no están limitadas a, tópica, transdérmíca, subcutánea, intramuscular, intraorbital, intracapsular, intraspinal, intrasternal y rutas intravenosas, es decir, cualquier ruta de administración diferente de a través del canal alimentario. La administración parenteral puede ser conducida para efectuar una entrega sistémica o local del agente inhibidor. Donde se desea una entrega sistémica , la administración normalmente involucra administración típica o por mucosa invasiva o sistémicamente absorbida de preparaciones farmacéuticas.

El agente inhibidor también puede ser entregado al sujeto mediante administración enteral. Las rutas de administración entérales incluyen, pero no están limitadas a, entrega oral y rectal (por ejemplo, usando un supositorio).

Los métodos de administración del agente inhibidor a través de la piel o mucosa incluyen , pero no están limitadas a, aplicación tópica de una preparación farmacéutica adecuada, transmisión transdérmica, inyección y administración epidérmica. Para transmisión transdérmica, los promotores de absorción o iontoforesis son métodos adecuados. La transmisión iontoforética puede ser lograda usando "parches" comercialmente disponibles que entregan su producto continuamente vía pulsos eléctricos a través de piel sin romper durante periodos de varios días o más.

Terapias de combinación Las modalidades de la presente invención incluyen métodos, agentes inhibidores y formulaciones farmacéuticas para el tratamiento de infección viral. Las modalidades de los agentes inhibidores y formulaciones farmacéuticas útiles en los métodos de la presente descripción pueden emplearse en combinación con otros agentes antivirales para tratar infección viral. En una modalidad, de acuerdo con los métodos de la presente invención, un agente inhibidor que es usado para tratar un huésped infectado por infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, coinfecciones, tales como co-infecciones de HCV/H IV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, se usa en combinación con uno o más agentes antivirales para tratar la infección. En una modalidad, de acuerdo con los métodos de la presente invención, un agente inhibidor que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina para proteínas huésped, tales como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP (también referido como antagonista de dileucina o ???F de HCV") puede ser usado en combinación con uno o más agentes antivirales diferentes para tratar infección viral.

Por ejemplo, la práctica médica actual para tratar infección de HCV normalmente emplea la terapia de combinación con ribavirina (tal como Rebetol o Coipegus), ya sea un interferón-alfa (tal como interferón alfa 2b) o interferón pegilado (tal como Pegasys, comercializado por Roche, o PEG-I ntron, comercializado por Schering Plough), y un inhibidor de proteasa. De acuerdo con los métodos de la presente descripción, un compuesto inhibidor puede ser usado en combinación con estas terapias estándares para tratar infección con HCV.

Una variedad de inhibidores de polimerasa y proteasa de HCV son ya sea aprobados o en desarrollo para el tratamiento de infección de HCV, y de acuerdo con los métodos de la presente descripción, la coadministración de un agente inhibidor que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped, tales como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP y un inhibidor de proteasa de HCV puede ser eficaz en el tratamiento de HCV. En una modalidad, un interferón alfa y/o un análogo de nucleósido, tal como ribavirina es/son también empleado(s) en esta terapia de combinación. Los inhibidores de proteasa de HCV adecuados incluyen, pero no están limitados a, telaprevir (VX-950, Vértex), BI LN 2061 y BI 1 2202 (Boehringer Ingelheim), boceprevir (SCH 503034, Schering Plough), ITMN 191 (Roche/I nterMune/Array BioPharma), MK-7009 (Merck), TMC435350 (Tibotec/Medivir), ACH-1095 y ACH-806 (Achillion/Gilead), y otros inhibidores de proteasa NS3/NS4A, incluyendo pero no limitando a, compuestos en desarrollo por Presidio.

De acuerdo con los métodos de la presente descripción, la coadministración de un agente inhibidor que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped, tales como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP y un inhibidor de RNA polimerasa de HCV puede ser eficaz en el tratamiento de HCV. En una modalidad, un interferón alfa y/o un análogo de nucleósido, tal como ribavirina y/o un inhibidor de proteasa de HCV es/son también empleado(s) en esta terapia de combinación . Los inhibidores de RNA polimerasa de HCV adecuados incluyen, pero no están limitados a, valopicitabina (NM283, Idenix/Novartis), HCV-796 (Wyeth/ViroPhama), R 1626 (Roche), R71 28 (Roche/Pharmasset) , GS-91 90 (Gilead) , MK-0608 (Merck), PSI-61 30 (Pharmasset) y PFE-868,554 (PFE). En una modalidad , el método proporciona tratamientos de combinación con agentes que inhiben AAK1 y GAK.

Una variedad de agonistas de receptor tipo toll (TLR) están en desarrollo para el tratamiento de infección de HCV, y de acuerdo con los métodos de la presente descripción, la co-administración de un antagonista de ???F o dileucina que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo o un motivo de ???F o dileucina que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped, tales como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP y un agonista de TLR puede ser eficaz en el tratamiento de HCV. En una modalidad, un interferón alfa y/o un análogo de nucleósido, tal como ribavirina y/o un inhibidor de proteasa de HCV y/o un inhibidor de RNA polimerasa de HCV es/son también empleado(s) en esta terapia de combinación . Los agonistas de TLR adecuados incluyen , pero no están limitados a, agonistas de TLR7 [es decir, ANA245 y ANA975 (Anadys/Novartis)] y agonistas de TLR9 [es decir, Actilon (COley) e I MO-2125 (Idera)].

Una variedad de derivados de tiazolida están en desarrollo para el tratamiento de infección de HCV, y de acuerdo con los métodos de la presente descripción, la co-administración de un antagonista que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped tales como AP2M 1 u otras subunidades µ de complejos de clatrina AP, y una tiazolida, incluyendo pero no limitando a, Nitazoxanida (Alinia, u otras formulaciones de liberación sostenida de nitazoxanida u otras tiazolidas, Romark Laboratories) puede ser eficaz en el tratamiento de HCV. En una modalidad, un interferón alfa y/o un análogo de nucleósido, tal como ribavirina y/o un inhibidor de proteasa de HCV y/o un inhibidor de RNA polimerasa de HCV y/o un agonista de TLR es/son también empleado(s) en esta terapia de combinación.

En otra modalidad de los métodos de la presente descripción, la co-administración de un agente inhibidor que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped, tal como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP, y un inhibidor de ciclofilina [es decir, NI M-81 1 (Novartis) y DEBIO-025 (Debiopharm)] y/o un inhibidor de alfa-glucosidasa [es decir, Celgosivir (Migenix)] y/o uno más agentes de una o más de las otras clases de agentes terapéuticos de HCV discutidas en la presente se usan para tratar infección de HCV.

Otros agentes que pueden ser usados en combinación con agentes inhibidores de la presente descripción que previenen la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped, tales como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP incluyen (i) agentes que enfocan NS5A, incluyendo pero no limitando a, A-831 (Arrow Therapeutics), AZD2836 (Astra Zeneca), y agentes en desarrollo por XTL/Presidio o BMS (ver publicaciones de PCT WO 2006/1 3326 y WO 2008/021928, incorporadas en la presente por referencia); (ii) agentes que enfocan TBC1 D20 y/o interacción de NS5A con TBC 1 D20 (ver publicación de PCT WO 2007/018692 y la solicitud de patente estadounidense ser. No. 1 1 (744,993, incorporada en la presente por referencia) , (iii) agentes que enfocan actividad de GTPasa de NS4B (ver publicación de PCT WO 2005/032329 y publicación de solicitud de patente estadounidense 2006/0199174, incorporada en la presente por referencia); (iv) agentes que inhiben la asociación de membrana mediada por hélices anfipáticas de HCV, tales como aquéllos encontrados en NS5A, NS4B y NS5B (ver publicación de PCTR WO 2002/089731 , supra), (v) agentes que enfocan dominios PI P2 o BAAPP en proteínas de HCV, tales como aquéllos encontrados en NS4B y NS5A (ver solicitud de patente estadounidense provisional 60/057, 1 88, supra); (vi) agentes que enfocan entrada de HCV, montaje o liberación , incluyendo anticuerpos a co-receptores; (vii) agentes que enfocan HCV NS3 helicasa; (viii) siRNAs, sh RNAs, RNAs antisentido u otras moléculas basadas en RNA que enfocan secuencias en HCV; (ix) agentes que enfocan microRNA1 22 u otros microRNAs que modulan la replicación de HCV; (x) agentes que enfocan interacciones de PD-1 , PD-L1 o PD-L2 o trayectorias (ver las publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses 2008/01 1851 1 , 2007/0065427, 2007/0122378, incorporadas en la presente por referencia), y (xi) agentes que enfocan la función de hélice anfipática de HCV, tales como inhibidores de AH2.

En otra modalidad de la presente descripción, un agente inhibidor que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped tales como AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP es usado en combinación con uno o más medicamentos capaces de tratar una infección de HIV para tratar un paciente que está co-infectado con HIV y HCV. En otra modalidad de la presente descripción , un agente inhibidor que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped tales como AP2M1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP es usado en combinación con uno o más medicamentos capaces de tratar una infección de HBV para tratar un paciente que está co-infectado con HBV y HCV. En una modalidad, un agente inhibidor que previene la unión de al menos una proteína viral conteniendo un motivo de un motivo de ???F o dileucina a proteínas huésped tales como AP2M1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP es usado en combinación con un inhibidor de PD-L1 para tratar una infección viral.

Como se menciona antes, las modalidades de la presente descripción incluyen la administración de un agente inhibidor identificado en la presente (o al usar una modalidad de la clasificación de la invención) en conjunción con al menos un agente terapéutico adicional para tratar una infección viral. Los agentes terapéuticos adicionales adecuados incluyen, pero no están limitados a, ribavirina; un análogo de nucleósido (por ejemplo, levovirina, viramidina, etc.); un inhibidor de NS3; un inhibidor de NS5; un interferón; y un agente de manejo de efectos laterales.

En una modalidad, el al menos un agente terapéutico adecuado adicional incluye ribavirina. La ribavirina, ?-ß-D-ribofuranosil-l H-1 ,2-4-triazol-3-carboxiamida, disponible de ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Cal if . , se describe en el Merck Index, compuesto No. 8199, Décimo primera edición. Su fabricación y formulación se describe en la patente estadounidense no. 4,211,771. La descripción también contempla el uso de derivados de ribavirina (ver, por ejemplo, la patente estadounidense no. 6,277,830).

En una modalidad, el al menos un agente terapéutico adecuado adicional incluye levovirina. La levovirina es el enantiómero L de ribavirina, y exhibe la propiedad de intensificar una respuesta inmune Th 1 sobre una respuesta inmune Th2. La levovirina es fabricada por ICN Pharmaceuticals.

En una modalidad, el al menos un agente terapéutico adecuado adicional incluye viramidina. La viramidina es un derivado de 3-carboxamida de ribavirina, y actúa como un promedicamento de ribavirina. Es convertida eficientemente a ribavirina mediante adenosin deaminasas.

Los análogos de nucleósidos que son adecuados para uso en una terapia de combinación incluyen, pero no están limitados a, ribavirina, levovirina, viramidina, isatoribina, un nucleósido de L-ribofuranosilo como se describe en la patente estadounidense no. 5,559, 1 01 y abarcado por la Fórmula I de la patente estadounidense no. 5,559, 1 01 (por ejemplo, 1 -ß-L-ribofuranosiluracilo, 1 - -L-ribofuranosil-5-fluorouracilo, 1 - ß-L-ribofuranosilcitosina, 9- ß-L-ribofuranosiladenina, 9-ß-L-ribofuranosilhipoxantina, 9- ß-L-ribofuranosilguanina, 9- ß-L-ribofuranosil-6-tioguanina, 2-amino-a-L-ribofuranil[1 '2, ':4, 5]oxazolina, 0202-anhidro-1 -a-L-ribofuranosiluracilo, 1 - a-L-ribofuranosiluracilo, 1 -(2,3,5-tri-0-benzoil-a-ribofuranosil)-4-tiouracilo, 1 -a-L-ribofuranosilcitosina, 1 -a-L-ribofuranosil-4-tiouracilo, 1 -a-L-ribofuranosil-5-fluorouracilo, 2-amino^-L-arabinofurano[1 ' ,2':4,5]oxazolina, 02 , 02-anhidro^-L-arabinofuranosiluracilo, 2'-deoxi^-L-uridina, 3'5'-di-0- benzoil-2'deoxi-4-tio ß-L-uridina, 2'-deoxi-p-L-citidina, 2'-deoxi-p-L-4-tiouridina, 2'-deoxi-3-L-timidina, 2'-deoxi-3-L-5-fluorouridina, 2',3'-dideoxi-p-L-uridina, 2'-deoxi-p-L-5-fluorouridina y 2'-deoxi-p-L-inosina); un compuesto como se describe en la patente estadounidense no. 6,423,695 y abarcado por la Fórmula I de la patente estadounidense no. 6,423,695; un compuesto como se describe en la publicación de patente estadounidense no. 202/0058635 y abarcado por la fórmula 1 de la publicación de patente estadounidense no. 2002/0058635; un análogo de nucleósido como se describe en WO 01 /90121 A2 (Idenix); un análogo de nucleósido como se describe en WO 02/069903 A2 (Blocryst Pharmaceuticals I Nc ); un análogo de nucleósido como se describe en WO 02/057287 A2 o WO 02/057425 A2 (ambas Merck/lsis); y similares.

En una modalidad, el al menos un agente terapéutico adecuado adicional puede incluir inhibidores de NS3 de HCV. Los inhibidores de proteína no estructural 3 (NS3) de HCV incluyen, pero no están limitados a, un tripéptido como se describe en las patentes estadounidenses nos. 6,642,204; 6,534,523;6,420,380; 6,41 0, 531 ; 6,329,417; 6,329, 379; y 6,323, 1 80 (Boehringer-l ngelheim); un compuesto como se describe en la patente estadounidense no. 6, 143,71 5 (Boehringer-l ngelheim); un compuesto macrocíclico como se describe en la patente estadounidense no. 6,608,027 (Boehringer-lngelheim); un inhibidor de NS3 como se describe en las patentes estadounidenses nos. 6,61 8,309; 6,608, 067; y 6,265,380 (Vértex Pharmaceuticals); un compuesto de azapéptido como se describe en la patente estadounidense no. 6,624,290 (Schering); un compuesto como se describe en la patente estadounidense no. 5,990,276 (Schering); un compuesto como se describe en Pause et al . (2003); un inhibidor de NS3 BI LN 2061 (Boehringer-l ngelheim; Lamarre et al. (2002), y Lamarre et al. (2003); inhibidor NS3 VX-950 (Vértex Pharmaceuticals), Kwong et al (2003); inhibidor NS3 SCH6 (Abib et al. (2003); Programa y síntesis de la 54a Reunión Anual de la American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD, 2003); cualquiera de los inhibidores de NS3 proteasa descritos en WO 99/07733, WO 99/07734, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 00/59929, o WO 02/060926 (por ejemplo, los compuestos 2, 3, 5, 6, 8, 10, 1 1 , 18, 19, 29, 30, 31 , 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71 , 91 , 103, 1 04, 1 05, 1 1 2, 1 1 3, 1 14, 1 15, 1 16, 1 20, 122, 123, 1 24, 1 25, 126 y 127 descritos en la tabla de las páginas 224-226 en WO 02/060926); un inhibidor de proteasa de NS3 como se describe en cualquiera de las publicaciones de patentes estadounidenses nos. 2003/019067, 2003/01 87018 y 2003/01 86895; y similares.

En una modalidad, el inhibidor de NS3 usado en una terapia de combinación de la invención es un miembro de la clase de inhibidores de NS3 específico, por ejemplo, los inhibidores de NS3 que inhiben la actividad de NS3 serina proteasa y que no muestran actividad inhibidora significativa contra otras serina proteasas tales como elastasa de leucocito humana, elastasa pancreática porcina, o quimiotripsina pancreática bovina, o cisteína proteasas, tal como catepsina de hígado humana B.

En una modalidad, el al menos un agente terapéutico adecuado adicional incluye inhibidores de NS5B. Inhibidores de proteína no estructural 5 de HCV (NS5; RNA polimerasa dependiente de RNA) incluyen, pero no están limitados a, un compuesto como se describe en la patente estadounidense no. 6,479, 508 (Boehringer-l ngelheim); un compuesto como se describe en cualquiera de las solicitudes de patentes internacionales nos. PCT/CA02/01 1 27, PCT/CA02/01 128, y PCT/CA02/01 129, presentadas el 18 de julio de 2002 por Boehringer Ingelheim; un compuesto como se describe en la patente estadounidense no. 6,440,985 (ViroPharma) ; un compuesto como se describe en Zhong et al. (2003); un compuesto de benzotiadiazina como se describe en Dhanak et a. (2002); un inhibidor de NS5B como se describe en WO 02/100846 A1 o WO 02/100851 A2 (ambos de Shire); un inhibidor de NS5B como se describe en WO 01 /851 72 A1 o WO 02/098424 A1 (ambos Glaxo SmithKIine); un inhibidor de NS5B como se describe en WO 00/06529 o WO 02/06246 A1 (ambos Merck); un inhibidor de NS5B como se describe en WO 03/000254 (Japan Tobacco) ; un inhibidor de NS5B como se describe en EP 1 256,628 A2 (Agouron); JTK-002 (Japan Tobacco); JTK-1 09 (Japan Tobacco); y similares.

En una modalidad , el inhibidor de NS5 usado en las terapias de combinación de la invención es un miembro de la clase de inhibidores de NS5 específicos, por ejemplo, inhibidores de NS5 que inhiben RNA polimerasa dependiente de RNA de NS5 y que carecen de efectos inhibidores significativos hacia otras RNA polimerasas dependientes de RNA y hacia RNA polimerasas dependientes de DNA.

En una modalidad, el al menos un agente terapéutico adicional es un interferón, por ejemplo, interferón-alfa (I FN-a). Cualquier IFN-a conocido puede ser usado en los métodos de tratamiento de la invención . El término "interferón-alfa" como se usa en la presente se refiere a una familia de polipéptidos relacionados que inhiben la replicación viral y proliferación celular y modulan la respuesta inmune. El término "IFN-a" incluye I FN-a que ocurre de manera natural; I FN-a sintético; I FN-a derivado (por ejemplo, I FN-a PEGilado, I FN-a glicosilado y similares); y análogos de IFN-a que ocurre de manera natural o sintético; esencialmente cualquier IFN-a que tiene propiedades antivirales, como se describe para IFN-a que ocurre de manera natural.

Los interferones a adecuados incluyen, pero no están limitados a, IFN-a que ocurre de manera natural (incluyendo pero no limitando a, IFN-a2a, I FN-a2b que ocurren de manera natural); interferón a-2b recombinante, tal como interferón I ntron-A disponible de Schering Corporation, Kenilworth, N.J. ; interferón a-2a recombinante, tal como interferón Roferon disponible de Hoffmann-La Roche, Nutley, N .J . ; interferón a-2C recombinante, tal como interferón a2 Berofor disponible de Boehringer I ngelheim Pharmaceutical, Inc. , Ridgefield, Conn. ; interferón a-n1 , una mezcla purificada de interferones a naturales tal como Sumifero disponible de Sumitomo, Jaón o como interferón a-n1 Wellferon (I NS) disponible de Glaxo-Wellcome Ltd. , Londres, Gran Bretaña; e interferón a-n3 una mezcla de interferones a naturales hecha por Interferón Sciences y disponible de Purdue Frederick Co. , Norwalk, Conn. , bajo el nombre comercial Alferon.

El término "I FN-a" también abarca I FN-a de consenso. IFN-a de consenso (también referido como "CI FN" e "IFN-con" e "interferón de consenso") abarca, pero no está limitado a, las secuencias de aminoácidos designadas IFN-coni , INF-con2 e I FN-con3 los cuales se describen en las patentes estadounidenses nos. 4,695,623 y 4,897,471 ; e interferon de consenso como es definido por determinación de una secuencia de consenso de interferon alfas que ocurren de manera natural (por ejemplo, I nfergen.TRM. , I nterMune, I nc. , Brisbane, CA.). I FN-coni es el agente de interferon de consenso en el producto lnfergenMR alfacon-1 . El producto de interferon de consenso lnfergenM R es referido en la presente por su nombre comercial (lnfergenMR) o por su nombre genérico (inteferón alfacon-1 ). Las secuencias de DNA que codifican I FN-con pueden ser sintetizadas como se describe en las patentes antes mencionadas u otros métodos estándares. En una modalidad, el al menos un agente terapéutico adicional es CI FN.

En una modalidad, los polipéptidos de fusión comprendiendo un IFN-a y un polipéptido heterologo también pueden ser usados en las terapias de combinación de la invención. Los polipéptidos de fusión de I FN-a adecuados incluyen, pero no están limitados a, Albuferon-alfaMR [un producto de fusión de albúmina humana e IFN-a; Human Genome Sciences; ver, por ejemplo, Osborn et al. (2002)] . También son adecuadas para uso en la presente descripción las formas de genes revueltos de IFN-a. Ver, por ejemplo, Masci et al (2003). Otros inteferones adecuados incluyen, Multiferon (Viragen), Medusa Interferon (Flamel Technology) , Locteron (Octopus), y Omega I nterferon (Intarcia/Boehringer I ngelheim).

El término "I FN-a" también abarca derivados de I FN-a que son derivados (por ejemplo, son químicamente modificados en relación al péptido de manera natural) a alterar ciertas propiedades, tal como vida media de suero. Como tal , el término "IFN-a" incluye IFN-a glicosilado; IFN-a derivado con polietílenglicol ("IFN-a PEGilado"); y similares. I FN-a PEGilado, y métodos para hacer el mismo, se discuten en, por ejemplo, las patentes estadounidenses nos. 5,382,657; 5, 981 ,709; y 5,951 ,974. I FN-a PEGilado abarca conjugados de PEG y cualquiera de las moléculas de I FN-a antes descritas, incluyendo pero no limitadas a, PEG conjugado a interferón alfa-2a (Roferon, Hoffman La-Roche, Nutley, N.J.), interferón alfa 2b (Intron, Schering-Plough, Madison, N.J.), interferón alfa-2c (Berofor Alpha, Boehringer I ngelheim , Ingelheim, Alemania); e interferón de consenso como es definido por determinación de una secuencia de consenso de interferón alfas que ocurren de manera natural (l nfergenMR, I nterMune, Inc. , Brisbane, CA).

En una modalidad , los polipéptidos de I FN-a pueden ser modificados con una o más porciones de polietílenglicol , es decir, PEGilados. La molécula de PEG de un polipéptido de I FN-a PEGilado es conjugado a una o más cadenas laterales de aminoácidos del polipéptido de I FN-a. En una modalidad , el I FN-a PEG-ilado contiene una porción de PEG en solo un aminoácido. En otra modalidad, el IFN-a PEGilado contiene una porción de PEG en dos o más aminoácidos, por ejemplo, el IFN-a contiene una porción de PEG unida a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos de aminoácidos diferentes. I FN-a puede ser acoplado directamente a PEG (es decir, sin un grupo enlazador) a través de un grupo amino, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo.

Para determinar la combinación óptima de un agente inhibidor, tal como PKC-41 2, erlotinib, sunitinib y similares, con otros agentes anti-HCV, pueden realizarse ensayos de replicación de HCV y/o estudios animales en la presencia de varias combinaciones de los diversos agentes antí-HCV. La inhibición incrementada de replicación en la presencia de una gente adicional (antes que se observara con monoterapia) es evidencia para el beneficio potencial de la terapia de combinación.

Por ejemplo, los ensayos e replicación de HCV que emplean un genoma de HCV enlazado a reportador de luciferasa en la presencia de varias combinaciones de PKC-412, erlotinib, sunitinib y similares. En tales ensayos, la actividad de lucifersa es directamente proporcional a la replicación de genoma de RNA de HCV.

En una modalidad, los agentes de manejo de efecto lateral pueden ser usados en los métodos de tratamiento de la invención, y estos incluyen agentes que son efectivos en el manejo de dolor; agentes que mejoran el malestar gastrointestinal; analgésicos, anti-inflamatorios, antipsicóticos, antineuróticos, ansiolíticos y agentes hematopoyéticos. Además, las modalidades de la invención contemplan el uso de cualquier compuesto para cuidado paliativo de pacientes que sufren de dolor o cualquier otro efecto lateral en el curso de tratamiento con una terapia objeto. Agentes paliativos ejemplares incluyen acetaminofeno, ibuprofeno, otros NSAI Ds, bloqueadores de H2 y antiácidos. En una modalidad, la descripción proporciona un método de tratamiento con agentes que inhiben GAK y agentes que inhiben AAK1 . En una modalidad , tal co-tratamiento proporciona efectos sinérgicos, tales como efectos antivirales.

Huéspedes adecuados para tratamiento Los huéspedes adecuados para tratamiento con una modalidad del agente inhibidor o una modalidad del método incluyen huéspedes que son infectados con infección viral a partir de virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, co-infecciones, tales como co-infecciones de HCV/HIV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV. Como se usa en la presente, el término Flaviviridae incluye cualquier miembro de la familia Flaviviridae, incluyendo, pero no limitando a, virus de Dengue, incluyendo virus de Dengue 1 , virus de Dengue 2, virus de Dengue 3, virus de Dengue 4 (ver, por ejemplo, GenBank acceso nos. M23027, M 1 9197 , A34774 y M 14931 ); virus de fiebre amarilla; virus de Nilo de Occidente; virus de encefalitis japonesa; virus de encefalitis de San Luis, virus de diarrea viral bovina (BVDV); y virus de hepatitis C (HCV); y cualquier serotipo, cepa, genotipo, subtipo, cuasiespecie, o aislado de cualquiera de los anteriores. Donde el Flaviviridae es HCV, el HCV es cualquiera de una variedad de genotipos, subtipos o cuasiespecies, incluyendo, por ejemplo, genotipo 1 , incluyendo 1 a y 1 b, 2, 3, 4, 6, etc. y subtipos (por ejemplo, 2a, 2b, 3a, 4a, 4c, etc.) y cuasiespecies.

Los huéspedes adecuados para tratamiento con modalidades de la presente invención incluyen pacientes de falla de tratamiento. El término "pacientes de falla de tratamiento" (o "fallas de tratamiento") como se usa en la presente, se refiere de manera general a pacientes infectados con HCV quienes fallaron en responder a la terapia previa para HCV (referida como "no respondedores") o quienes respondieron inicialmente a terapia previa, pero en quienes la respuesta terapéutica no fue mantenida (referida como "pacientes con recaídas") . La terapia previa generalmente puede incluir tratamiento con cualquier agente antiviral diferente de un agente inhibidor de la presente descripción.

Los huéspedes adecuados para tratamiento con modalidades de la presente descripción incluyen individuos quienes han sido diagnosticados clínicamente como infectados con HCV. Los individuos quienes son infectados con HCV pueden ser identificados al detectar RNA de HCV en su sangre y/o teniendo un anticuerpo anti-HCV en su suero.

Los individuos quienes son diagnosticados cínicamente como infectados con HCV incluyen individuos naturales (por ejemplo, individuos no previamente tratados para HCV).

Los huéspedes adecuados para tratamiento con modalidades de la presente descripción incluyen individuos quienes tienen cualquier titulo de HCV detectable. El paciente puede ser infectado con cualquier genotipo de HCV (genotipo 1 , incluyendo 1 a y 1 b, 2, 3, 4, 6, etc. y subtipos (por ejemplo, 2a, 2b, 3a, etc.)), en particular una dificultad para tratar genotipo tal como HCV genotipo 1 y en particular subtipos de HCV y cuasiespecies.

También son adecuados para tratamiento los huéspedes HCV-positivos (como se describe antes) quienes exhiben fibrosis severa o cirrosis temprana (no descompensada, clase B o C de Child-Pugh) debido a infección de HCV crónica y quienes son virémicos a pesar de tratamiento antiviral anterior, o quienes tiene una contraindicación a terapia con un agente antiviral conocido.

En una modalidad, los huéspedes HCV-positivos con fibrosis de hígado etapa 3 o 4 de acuerdo con el sistema de calificación de METAVI R, el cual es conocido en la técnica, son adecuados para tratamiento con los métodos de la presente descripción. En otra modalidad, los huéspedes adecuados para tratamiento con modalidades de la presente descripción son pacientes con cirrosis descompensada con manifestaciones cl ínicas, incluyendo pacientes con cirrosis de hígado muy avanzada, incluyendo aquéllos que esperan trasplante de hígado. Todavía en otra modalidad, los huéspedes adecuados para tratamiento con modalidades de la presente descripción incluyen pacientes con grados más suaves de fibrosis incluyendo aquéllos con fibrosis temprana (etapas 1 y 2 en los sistemas de clasificación de METAVIR, Ludwig y Scheuer; o etapas 1 , 2 o 3 en el sistema de clasificación de Ishak, todos los cuales son conocidos en la técnica). En una modalidad , el método encuentra uso en el tratamiento de HCV posttrasplante de hígado para carcinoma hepatocelular inducido por HCV. En una modalidad, esto sirve para prevenir la re-infección del injerto.

En una modalidad de la presente descripción, para ayudar a seleccionar de manera óptima pacientes que muy probablemente se beneficiarán de la terapia, así como para monitorear la eficacia de terapia - especialmente en el cuadrante de virus mutantes resistentes a medicamento potencial - el uso de pruebas diagnósticas apropiadas provistas por la presente invención pueden ser de gran beneficio. Por ejemplo, valorar la sensibilidad del virus específico encontrado en un paciente dado a la terapia contemplada puede ayudar a identificar el mejor partido entre paciente candidato y la terapia apropiada correspondiente.

En una modalidad, el método proporciona tratar pacientes infectados con virus como se describe en la presente, en particular aquéllos infectados con HCV quienes también son afligidos con cáncer, tal como cáncer hepático.

Ensayos La presente descripción también proporciona métodos in vitro y basados en células para clasificar agentes antivirales. En una modalidad, la descripción proporciona métodos para detectar la interacción entre el motivo de ???F y proteínas huésped. En una modalidad, la presente descripción proporciona un ensayo de unión para detectar proteínas o agentes que inhiben la unión de motivos de ???F o dileucina a AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. Por ejemplo, la descripción proporciona un método en el cual los agentes candidatos como se describe en la presente son contactados con un Flaviviridae y AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. La unión de Flaviviridae a las proteínas es detectada como es conocido en la técnica. La actividad reducida en la presencia de un agente candidato en relación a controles indica la identificación de un inhibidor de unión. En otra modalidad, los ensayos de unión basados en células son usaos. E otra modalidad, los ensayos celulares son usados para clasificar los efectos sobre el montaje viral o florecimiento. En esta modalidad, los agentes candidatos son contactados con un Flaviviridae y una célula que expresa AP2M 1 u otras subunidades de µ de complejos de clatrina AP. Los efectos celulares, tales como florecimiento o montaje viral, o unión entre el Flaviviridae y la célula puede ensayarse mediante métodos conocidos en la técnica. En una modalidad , se usa un ensayo de replicacion. Un ejemplo de un ensayo de replicacion es señalado en la publicación de solicitud de patente estadounidense 201 1 /0052536 A1 , la cual es incorporada expresamente en la presente por referencia. Unión reducida, florecimiento o montaje y similares, del virus en la presencia del agente candidato en relación a los controles indica la identificación de un inhibidor de unión o agente antiviral. En algunas modalidades, un ensayo de afinidad de microfluido in vitro, como es conocido en la técnica, también es usado para permitir la detección de interacciones de proteína débiles y transientes.

En una modalidad , los ensayos de complementación proteína-fragmento, como se describe en la presente y como son conocidos en la técnica, son usados para validar la interacción entre núcleo y AP2M 1 . En otra modalidad, un ensayo de co-inmunoprecipitación es usado para identificar la interacción entre las proteínas.

Ejemplos Los siguientes ejemplos son incluidos para demostrar modalidades preferías de la invención y para exponer un claro entendimiento de los principios de la descripción. Se debería apreciar por aquéllos de habilidad en el área que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención, y así pueden considerarse como que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquéllos de habilidad en la técnica deberían apreciar, a la luz de la presente descripción, que muchos cambios pueden hacerse en las modalidades específicas, las cuales son descritas y todavía obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. De manera más específica, será evidente que ciertos agentes, los cuales son tanto química como fisiológicamente relacionados, pueden ser substituidos por los agentes descritos en la presente mientras se alcancen los mismos resultados o unos similares. Todos esos substitutos y modificaciones similares evidentes para aquéllos expertos en la técnica son considerados como dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas.

Muchas variaciones y modificaciones pueden hacerse a las modalidades antes descritas de la descripción sin apartarse substancialmente del espíritu y principios de la descripción. Se pretende que todas esas modificaciones y variaciones sean incluidas en la presente dentro del alcance de esta descripción.

Ejemplo 1 Identificación de un motivo de ???F dentro del núcleo de HCV La inspección de la secuencia primaria de la proteína de núcleo de HCV revela un motivo YIP/V/L) conservado dentro del segundo dominio (D2) de la proteína (FIGs. 1 A, 1 D). Este motivo se conforma al consenso de señal de clasificación de ???F reconocido por AP2M 1 (Ohno, J Cell Sci 1 1 9: 3719-3721 , 2006; Nakatsu et al. , Cell Struct Funct 28:419-429, 2003; Owen et al. , Ann Rev Cell Devel Biol 20: 153-191 , 2004).

El núcleo se une a AP2M 1 Las interacciones de señales de clasificación con adaptadores de clatrina y componentes endocíticos son normalmente débiles (Kd de unión a un rango de µ?), transiente (Nakatsu et al. , Cell Struct Funct 28:419-429, 2003; Aguilar et al, J Biol Chem 276: 1 3145-1 31 52, 2001 ) e involucran proteínas de membrana, siendo así difíciles de estudiar mediante tecnolog ías estándares (Cusick et al . , Hum Mol Genet 2005; Bailer Curr Opin Microbiol 12:453-459, 2009) . Para determinar si el núcleo de HCV se une a AP21 M 1 , las plataformas proteómicas que superan estos retos fueron usadas. Los ensayos de afinidad de microfluido in vitro se basan en la captura mecánica de interacciones moleculares (MITOM I), lo cual elimina el problema de disociación que enfrentan las plataformas actuales, y así permite estudiar interacciones débiles y transientes, con consumo de proteínas de nanolitros (MaerkI et al. , Science 315:233-237, 2007; Einav et al. , Nat Biotech 26: 1 019-1027, 2008; Gerber et al. , Nat Meth 6: 71 -74, 2009). Un formato de microfluido que permite un análisis de alta fidelidad de interacciones de proteína-proteína (P-Pis) se usó (Gerber et al. , Nat Meth 6:71 -74, 200). La expresión de proteína in vitro en la presencia de membranas de microsoma y experimentos de unión con MITOMI fueron realizados esencialmente como se describe (Maerkl et al. , Science 315:233-237, 2007; Einav et al . , Nat Biotech 26: 101 9-1 027, 2008; Gerber et al. , Nat Meth 6:71 -74, 2009) (FIGS. 9A-B). Estos ensayos detectaron unión de AP2M 1 a núcleo. El grado de unión correlacionado con la concentración de núcleo creciente (FIG. 1 F). La unión de soporte de AP2M 1 a una proteína de HCV de control, NS3, fue 4-20 veces menor y no aumentó significativamente con la concentración de proteína incrementada.

Para determinar si la interacción núcleo-AP2M 1 ocurre en células, se usaron ensayos de complementacion de proteína-fragmento (PCAs) basados en la reconstitución reversible de reportador de luciferasa de Gaussia Princeps (FIG . 2A). El formato actual fue optimizado para señal mejorada, proporcionando así un medio altamente sensible para medir P-Pis retadores (Cassonnet et al. , Nat Meth 8:990-992, 201 1 ). La señal de luciferasa significativa fue detectada en células Huh-7.5 cotransfectada con plásmidos que codifican los dos fragmentos reportadores fusionados a las proteínas de presa y cebo (GLuc1 -AP2M1 y GLuc2-núcleo). Los niveles de soporte de unión fueron detectados en células cotransfectadas con ya sea los constructos GLuc1 -AP2M 1 o GLuc2-núcleo y el vector recíproco vacío, los dos vectores GLuc vacíos, o GLud fusionado a tres proteínas no relacionadas (SPI RE; RAC1 y ARPC). La afinidad aparente de AP2M 1 a núcleo fue mayor que a receptor de transferrina (TFR) , una proteína de carga de huésped que aloja una señal ???F, conocida por ser reconocida por AP2M 1 (Gminard et al. , Traffic 5, 181 -193, 2004) (FIG. 2B). La unión no fue específica de genotipo, ya que proteínas de núcleo derivadas de ya sea genotipos 2a (Lindenbach et al. , Science 309:623-626, 205) o 1 b (Lohmann et al. , Science 285: 1 10-1 1 3, 1999) demostraron niveles comparables de unión de AP2M 1 . Adicionalmente, no hubo diferencias significativas en la unión de núcleo a las dos isoformas de AP2M 1 (a/b) (FIG. 2B). Los resultados comparables fueron demostrados en células Huh-7.5 (derivadas de hepatoma humano), representando el modelo celular más relevante (FIG. 2B) y células 293T (datos no mostrados). La unión pareció específica, como concentraciones crecientes de núcleo libre o AP2M1 , pero no proteína de interacción de señal de exportación nuclear (NESI), una proteína de control involucrada en mediar el montaje de virus de hepatitis D (Wang et al. , J Virol 79:81 1 3-81 20, 2005), disminuyó progresivamente la unión de núcleo-AP2M 1 (FIG. 2C).

Para determinar si el núcleo une AP2M 1 en el contexto de infección de HCV auténtica, ensayos de co-inmunoprecipitación en fracciones de membrana preparadas de células Huh-7.5 infectadas con HCV cultivado en cultivo celular (J6/J FH) fueron realizados (Lindenbach et al. , Science 309:623-626, 2005) . AP2M 1 podría derribar el núcleo cuando anticuerpos anti-AP2M 1 pero no controles de IgG fueron adicionados a los Usados de membrana. La unión fue aumentada significativamente mediante caliculina A [un inhibidor de defosforilación de AP2M 1 , que "asegura" AP2M 1 en su conformación activa de unión de ???F (Ricotta et al. , J Biol Chem 283: 551 0-551 7, 2008)] (FIG. 2D). La unión en condiciones recíprocas fue demostrada de manera similar (FIG. 2D). La colocalización de núcleo con AP2M 1 en células H uh-7.5 72 h siguiendo la electroporación con J6/JFH HCV RNA también se investigó. El análisis de inmunofluorescencia confocal cuantitativo (I F) reveló colocalización extensa de núcleo y AP2M 1 en estas células (con 67±6% de puncta manchada AP2M 1 con núcleo) (FIG. 2E).

Motivo ???F de núcleo en unión de AP2M 1 y montaje de HCV Usando una serie de mutaciones puntuales (FIG. 1 D) , se probó si la unión de AP2M 1 es mediada por el motivo ???F del núcleo. Una mutación de núcleo Y1 36A redujo la unión de AP2M 1 medida por PCAs por ~10 veces comparado con el núcleo tipo natural (Wt), mientras que la mutación V(0) 1 39A provocó menos inhibición de unión (FIG. 3A). Para estudiar el papel del motivo ???F de núcleo en infección de HCV, estas mutaciones fueron introducidas en el genoma de HCV J6/JFH(p7-Rluc2A) - un virus reportador conteniendo luciferasa de Renilla que replica y produce altos títulos de virus en células Huh-7.5 (Murray et al. , J Virol 81 : 1 0220-1 0231 , 2007). Las células fueron electroporadas con RNA transcrito in vitro generado a partir de cada constructo. La replicación de RNA de HCV de estos mutantes virales fue comparable con aquélla del virus WT, como se midió mediante ensayos enlazados a gene reportador de luciferasa (FIG. 3B) y qRT-PCR (FIG. 1 1 y 12). En contraste, un muíante defectuoso de polimerasa, J6/JFH(p7-Rluc2A)- GNN, no replica. Los ensayos de luciferasa en células naturales inoculadas con sobrenadantes derivados de células electroporadas con genoma viral que aloja la mutación de núcleo Y1 36A midió niveles indetectables de infectividad extracelular. La mutación V1 39A disminuyó la infectividad por -1 .5 logs comparada con virus WT (FIG. 3C). La infectividad intracelular, medida en célulaas naturales infectadas con sobrenadantes clarificados derivados de células electroporadas Usadas, reflejaron la infectividad extracelular disminuida (FIG. 3D), sugiriendo que el motivo ???F de núcleo media el montaje de viriones y no liberación. Esencialmente no se produjo virus infecciones ya sea de manera intra- o extracelularmente mediante controles defectuosos de montaje (??1 -?2) o replicación (GNN). Los títulos de infectividad de virus WT medidos mediante ensayos de dilución limitante fueron comparables con aquéllos reportados previamente con este sistema reportador (Kopp et a. , J Virol. 84: 1666-1673, 2010). Consistente con los ensayos de luciferasa descritos antes, mientras que la mutación de núcleo V139A disminuyó los títulos de infectividad extra- e intracelular por—1 -1 .5 log comparado con virus WT, un nivel indetectable de títulos de infectividad fue medido con virus que alojan la mutación de núcleo Y1 36A o supresión E1 -E2 (FI G . 3E) . El efecto de mutaciones de núcleo o infectividad correlacionada con su efecto sobre unión AP2M 1 . Para excluir la posibilidad de que las mutaciones de núcleo afectaran la infectividad al provocar desmontaje de partícula o producción de partículas conteniendo proteína y RNA de núcleo defectuosas, la producción de partículas no infecciosas fue determinada. Niveles detectables de liberación de proteína de núcleo y RNA de HCV fueron medidos en sobrenadantes de células que alojan genomas replicantes mediante ensayos ELISA y qRT-PCR, respectivamente, como se describe (Murray et al . , J Virol . 81 : 10220-10231 , 2007; Kopp J Virol 84: 1666-1 673, 201 0) (FIG. 3F, 3G). No obstante, los niveles liberados por los mutantes de núcleo Y1 36A y V139A no fueron significativamente mayores que aquéllos liberados por el mutante ?? 1 -?2 de montaje defectuoso, sugiriendo que las partículas no infecciosas no fueron producidas. La expresión de núcleo no fue afectada por las mutaciones, como un análisis western (FIG. 3H) y microscopía de fluorescencia (datos no mostrados) demostraron expresión de proteína a niveles WT. La reversión del fenotipo de infectividad fue detectado por ensayos de luciferasa en células Huh-7.5 infectadas con HCV que alojan las mutaciones de núcleo Y136A y V1 39A siguiendo dos semanas de pases. Esta reversión coincidió con la emergencia de reversores de sitio primario mediante análisis de secuenciación. Estos resultados proporcionan evidencia adicional para el requerimiento de mantener un motivo ???F funcional para soportar la replicación de HCV. Juntos, estos datos sugieren que el motivo de unión de AP2M 1 dentro del núcleo es requerido para montaje viral in vitro.

Motivo ???F de núcleo es funcionalmente intercambiable con otras señales de clasificación de ???F Para determinar si el motivo ???F de núcleo es funcionalmente intercambiable con señales homologas, fue introducida una mutación V1 39L, que "intercambia" así la secuencia de núcleo de genotipo 2a con aquélla de genotipo 1 b. De manera similar, las secuencias TYPL y RYYL, conocidas por mediar la unión de HLA-DM (Ohno et al. , J Biol Chem 273:2591 5-25921 , 1998) y receptor de trombopoyetina (Hitchcock et al. , Blood 1 12:2222-2231 , 2008) a AP2M 1 , respectivamente, se usaron para substituir la secuencia de ???F de núcleo (FIG. 1 D). La unión de núcleo que aloja estas secuencias a AP2M 1 fue ya sea comparable a o mayor que aquélla de núcleo WT, como es determinado por PCAs (FIG. 3A). Estas mutaciones no tuvieron efecto sobre la replicación de RNA de HCV (FIG. 3B) . En correlación con su fenotipo bioquímico, la infectividad intracelular y extracelular de los mutantes de núcleo V139L y TYPL fueron comparables con aquélla de virus WT (FIG. 3C, 3D). Esta intercambiabilidad funcional soporta que los motivos ???F de núcleo ejercen su función vía interacciones con proteínas de célula huésped. A pesar de su unión eficiente a AP2M 1 (FIG. 3A) y estabilidad por análisis western (FIG. 3H), el mutante YRRL no produjo niveles detectables de virus infeccioso (FIG. 3C, 3D). De manera interesante, este mutante liberó RNA de HCV y proteína de núcleo hacia sobrenadantes de células electroporadas a niveles comparables con aquéllos de núcleo WT, reflejando probablemente la producción de partículas no infecciosas (FIG. 3F, 3G). El mutante YRRL puede impactar así otra función de núcleo en producción de virus infeccioso que es independiente de su unión a AP2M 1 .

AP2M 1 en montaje de HCV La importancia funcional de AP2M 1 al ciclo de vida de HCV fue determinada. Los clones de Huh-7.5 estables que alojan constructos lentivirales de RNA de horquilla corta (shRNA) que enfocan distintas regiones en el gene de AP2M 1 o una secuencia no enfocadora (NT) fueron estabilizados. La supresión efectiva de niveles de AP2M 1 fue lograda (FIGS. 4A, 4B), sin efectos citostáticos o citotóxicos aparentes. El efecto de supresión de AP2M 1 sobre producción de virus infeccioso fue estudiado en estos clones siguiendo la electroporación con J6/JFH(p7-Rluc2A) RNA. El derribo de AP2M1 no tuvo efecto sobre la replicacion de RNA de HCV como se midió en estos clones estables mediante ensayos de luciferasa (FIG. 4C) y qRT-PCR de 72 h siguiendo la electroporación (datos no mostrados). Los sobrenadantes recolectados a 72 h post-electroporación fueron usados para inocular células Huh-7.5 naturales seguido por ensayos de luciferasa a 72 h post-inoculación. Como se muestra en la FIG . 4D, la supresión de AP2M redujo la infectividad extracelular reducida por >2 logs comparado con el control NT. La infectividad intracelular, medida en células naturales infectada con sobrenadantes clarificados derivados de células electroporadas Usadas, reflejó la infectividad extracelular disminuida (FIG. 4E) y correlacionada con el grado de supresión de AP2M 1 . Las mediciones de títulos de infectividad intra- o extracelular al limitar los ensayos de dilución demostraron resultados consistentes (FIG. 4F). La supresión de AP2M 1 no aumentó la producción de partículas no infecciosas, como es sugerido por los niveles de RNA de HCV y liberación de proteína de núcleo medidos en sobrenadantes de células por ensayos qRT-PCR y ELISA, respectivamente (FIGS. 4G, 4H). Efectos similares sobre producción de virus infeccioso fueron demostrados en células Huh-7.5 suprimidas transientemente por AP2M 1 por siRNAs y ya sea electroporados con J6/U JFH(p7-Rluc2A) RNA o infectados con virus J6/JFH cultivado en cultivo (título: 1 .2x105 TCID5o/ml) (Lindenbach et al. , Science 309:623-626, 2005). Los efectos de silenciar AP2M 1 endógeno en la producción de virus infeccioso fueron rescatados por la expresión ectópica de AP2M 1 WT shRNA-resistente que aloja una mutación oscilante dentro del sitio enfocado por shRNA, exlcuyendo mayormente la posibilidad de efectos fuera del ojbetivo provocando el fenotipo observado (FIG. 41). Ambas aproximaciones de RNAi sugieren entonces que AP2M 1 es importante para el montaje de HCV eficiente.

Ruptura de unión núcleo-AP2M1 elimina el recluatamiento de AP2M 1 a LD, altera la localización sub-celular de núcleo y la colocalización de núcleo con E2 Para probar la hipótesis de que el defecto en montaje de HCV que resulta de mutaciones de núcleo de ???F o silenciamiento de AP2M1 se correlaciona con alteraciones en la localización sub-celular de AP2M 1 y/o núcleo, un análisis de inmunofluorescencia confocal cuantitativo (I F) fue realizado. 1 0-1 5 células elegidas aleatoriamente fueron analizadas para cada categoría para el grado de localización de núcleo o AP2M 1 a varios compartimentos intracelulares usando el programa de cómputo I mageJ (JACoP) y Coeficientes de Colocalización de Mander (MCC). Los últimos fueron elegidos, ya que miden estrictamente la coocurrencia independiente de proporcionalidad de señal (Dunn et al. , Am J Physiol-Cell Physiol 300:C723-C742, 201 1 ). AP2M 1 endógeno se colocalizó m ínimamente con el marcador LD, Bodipy, en células Huh-7.5 naturales, con 8.2% de manchado LD positivo para AP2M 1 (FIG. 5A, 5E). En contraste, la infección con virus J6/JFH pareció aumentar significativamente la localización de AP2M 1 a LD, con 40±8% de LD siendo AP2M 1 positivo (FIG. 5B, 5E) (valor p=0.0006). De manera similar, y como se describió previamente (Kopp et a, J. Virol. 84: 1666-1673, 201 0; Boulant et al. , Journal o General Virology 88:2204-2213, 2007; Coller et al. , PloS pathogens 8:e1002466-e1002466, 2012), el núcleo fue localizado parcialmente a LD (37±14% de ID positivo de núcleo) (FIG . 5C, 5E) . Adicionalmente, la colocalización parcial de núcleo con AP2M 1 ocurrió en parte en LD (FIG. 5D, 5F).

Para probar si el núcleo es involucrado en mediar la localización incrementada de AP2M 1 a LD medida en células infectadas de HCV, AP2M 1 -mCherry se sobre-expresión ya sea solo o en combinación con núcleo WT o núcleo Y1 36A muíante al transfectar células Huh-7.5. Se etiquetaron LD con HCS LipidTOX (Invitrogen). De manera similar a células naturales, AP2M 1 se localizó m ínimamente a LD en células Huh-7.5 sobre-expresando AP2M 1 solo (8±2% de LD positivo para AP2M 1 ) (FIG. 5G, 5J). En contraste, como en células infectadas, cuando se coexpresa con núcleo WT, AP2M1 pareció acumular significativamente en LD, con 51 .8±20% de LD siendo AP2M 1 positivo (valor p=4.8x10"5) (FIG. 5H , 5J). Ninguno de tales aumentos en la colocalización fue demostrado, sin embargo, cuando AP2M 1 fue co-expresado con núcleo que aloja la mutación Y1 36A (con 1 0% LD AP2M 1 positivo) (valor p=0.001 ) (FIG . 51 , 5J), sugiriendo que el motivo ???F de núcleo puede mediar el reclutamiento de AP2M 1 a LD.

El efecto de ruptura de la interacción de núcleo-AP2M 1 en localización de núcleo a LD, ER, y TGN y su colocalización con la proteína de envoltura E2 en células electroporadas con J6/JFH HCV RNA se probó. Como se muestra previamente, el núcleo localizado para todos estos compartimientos intracelulares (Kopp et al. , J. Virol. 84, 1666-1673, 2010; Boulant et al. , Journal of General Viroloy 88, 2204-2213, 2007) (con porcentaje de colocalización que varía de 30 a 45%) . De manera interesante, la localización de núcleo que aloja la mutación Y1 36A a LD fue significativamente mayor que aquélla del núcleo WT (78±13% vs. 32±1 6%), respectivamente, valor p=2.7x1 0 6) (FIG. 5K). De manera similar, el porcentaje de colocalización de núcleo con el marcador LD fue aumentada dramáticamente desde 25± 1 0% en células NT hasta 87±6.6% siguiendo el silenciamiento de AP2M 1 (valor p=1 .55x1 0"8) (FIG. 5L). Aunque ni la mutación de núcleo Y1 36A ni la supresión de AP2M 1 tuvieron un efecto aparente en la colocalización de núcleo con el marcador Er, la calreticulina (FIGS. 14A-C), ambas fueron asociadas con una disminución significativa en la colocalización de núcleo con el marcador TGN, TGN46 (FG. 5M, 5N) y la proteína de envoltura E2 (FIG. 50, 5P).

Juntos, estos resultados sugieren que la interacción de núcleo con AP2M 1 facilita el reclutamiento de AP2M 1 a LD y que el defecto observado en el montaje HCV siguiendo la ruptura de la interacción de núcleo-AP2 1 es asociada con la acumulación de núcleo en LD, colocalización de núcleo disminuida con E2 y tráfico de núcleo deteriorado para TGN .

AAK1 y GAK regulan la unión núcleo-AP2M 1 y están involucradas en el montaje de HCV La fosforilación de T156 dentro de AP2M 1 por las serina/treonina cinasas AAK1 y GAK (Ricotta et al. , Journal of Cell Biology 1 56, 791 -795, 2002; Korolchuk et al. , Traffic 3, 428-439, 2002; Zhang et al. , Traffic 6, 1 103-1 1 13, 2005); Korolchuk et al. , Traffic 3, 428-439, 2002; Zhang et al. , Traffic 6, 1 1 03-1 1 13, 2005) estimula la unión de AP2M 1 a señales de tirosina de proteína de carga y es transiente debido a la desforsforilación por PP2A (Ricotta et al. , Journal of Biological Chemistry 283, 551 0-5517, 2008 (FIG. 6A). En realidad, la caliculina A (un inhibidor de PP2A) aumentó la unión de núcleo a AP2M 1 (FIG. 2D) y una mutación de AP2M 1 T1 56A la deterioró (FIG. 6B). Para estudiar el efecto de la sobre-expresión de AP2M 1 que aloja la mutación T156A en la producción de HCV infeccioso, células Huh-7.5 fueron transfectadas con plásmidos que codifican ya sea WT o AP2M 1 T156A mutante. 48 h post-transfección, las células fueron electroporadas con J6/JFH(p7-Rluc2A) HCV RNA y se sometieron a ensayos de replicación e infectividad de HCV RNA, como se describió antes. La sobre-expresión de T1 56A AP2M1 mutante no tuvo efecto sobre la viabilidad celular y fue dispensable para la replicación de RNA de HCV, aunque redujo significativamente la infectividad extra- e intracelular comparada con WT AP2M 1 (FIG. 6C-E), consistente con un efecto negativo dominante en el montaje de HCV.

Para estudiar la hipótesis de que AAK1 y GAK están involucradas en regular la interacción de AP2M 1 con núcleo, los experimentos de unión fueron realizados en células Huh-7.5 suprimidas para AAK1 o GAK por siRNAs (FIG. 6F, 6G). La supresión de ya sea AAK1 o GAK disminuyó significativamente la unión de núcleo-AP2M 1 comparada con NT, como se midió por PCAs (FIG. 6H) , sin efecto citotóxico aparente (datos no mostrados). Células suprimidas de AAK1 y GAK fueron electroporadas entonces con J6/JFH(p7-Rluc2A) HCV RNA. Aunque la supresión de ya sea AAK1 o GAK no tuvieron efecto citotóxico y fue dispensable para replicación de RNA de HCV, redujo significativamente la infectividad intracelular y extracelular (FIG . 61-K). El efecto de AAK1 y GAK sobre montaje de HCV no resultó de su unión directa a núcleo (FIG. 6L) . Estos resultados proporcionan evidencia para el involucramiento de AAK1 y GAK en la regulación de unión de núcleo-AP2M 1 y en mediar el montaje de HCV. Más aún, validan la importancia de AP2M 1 para montaje de HCV eficiente por una aproximación de interferencia dominante, soportando así los datos de RNAi.

I nhibidores farmacológicos de AAK1 y GAK romper la unión de núcleo-AP2M 1 y montaje de HCV El análisis de mapas de calor y ensayos de afinidad de inhibidores de cinasas (Karaman et al. , Nat Biotech 26, 127-1 32, 2008) revelaron compuestos, tales como sunitinib y PKC-412, los cuales unen AAK1 , y erlotinib que une GAK, con altas afinidades (rango de nM) (Karaman et al. , Nat Biotech 26, 127-132, 2008) (FIGS. 7A, 7B). Estos compuestos inhibieron la unión de núcleo-AP2M 1 en una manera dependiente de la dosis, como es determinado por PCAs (FIG. 7C), con concentraciones inhibitorias máximas medias (IC50s) de ~0.04-0.2µ?. Cuando se usan para tratar células Huh-7.5 electroporadas con el genoma J6/JFH(p7-Rluc2A) HCV, estos compuestos tuvieron un efecto dependiente de la dosis dramático sobre infectividad extra- (FIG. 7D) e intracelular (FIG: 7E) a 72 h (con concentración efectiva máxima media (EC50s) de 0. 1 5-1 .8µ?) (FIG. 7B). No hubo efecto sobre la replicación de RNA de HCV y ninguna toxicidad celular aparente (FIG. 7F, 7G). En realidad, el efecto inhibitorio sobre la unión de núcleo-AP2M 1 e infectividad fue asociada con reducciones en los niveles de fosfo-AP2M 1 en las células relevantes por análisis western (FIG. 7H). Por último, estos compuestos inhibieron significativamente la infección viral en células Huh-7.5 infectadas con HCV cultivado en cultivo de tejido (título: 6.3x1 05 TCI D50/ml) (FIG. 71, 7B). Estos resultados proporcionan la validación farmacológica para el involucramiento de AAK1 y GAK para regular la interacción de núcleo-AP2M 1 para el papel de AP2M 1 en el montaje de HCV. Adicionalmente, proporcionan compuestos candidatos que enfocan el montaje.

Ejemplo 2 Inhibición farmacológica o supresión de AAK1 y GAK derogan la replicacion de HIV-1 Existe un cuerpo substancial de evidencia para soportar que las interacciones de AP1M1 y AP2M1 con Gag y Env de HIV (gp41) median varios pasos críticos junto con el ruta de montaje/liberación (Batonick et al., Virology 342:190-200, 2005; Camus et al., Molec Biol Cell 18:3193-3203, 2007; Berlioz-Torrent et al., J Virol. 73:1350-1361, 1999; Byland et al., Molec Biol Cell 18:414-425, 2007; Wyss et al., J Virol 75:2982-2992, 2001; Ohno et al., Virology 238:305-315, 197; Boge et al., J Biol Chem 273:15773-15778, 198; Egan et al., J Virol 70:6547-6556, 1996; Rowell et al., J Immunol 155:473-488, 1995; Lodge et al., EMBO J 16:695-705, 1997; Deschambeault et al., J Virol 73:5010-5017, 1999). De manera muy importante, un motivo de tirosina dentro de Env media el esparcimiento célula-a-célula (Gminard et al., Taffic 5, 181-193, 2004; Lindenbach et a., Science 309, 623-626, 2005), un mecanismo pensado por responder a la replicacion de HIV en curso a pesar de ART (Sigal et al., Nature 477, 95-98, 2001), posiblemente vía AP1M1, que clasifica a membranas basolaterales. Sin embargo, el papel de AAK1 y GAK en infección de HIV no ha sido estudiado, y estos mecanismos no han sido enfocados farmacológicamente.

Para probar la hipótesis de que AAK1 y GAK son importantes para la infección de HIV, se usaron células TZM-b1 HeLa-derivadas, las cuales expresan CD4, CCR5 y CXCR4, así como ß-galactosidasa y genes reportadores de luciferasa de luciérnaga que responden a transcripción de HIV (Wei et a., Antimicrobiol agents and chemotherapy 46:1896-1905 2002). Las células fueron transfectadas con siRNAs que enfocan AAK1 , GAK o una secuencia NT seguida por infección con el clon NL4-3 de H IV-1 infeccioso (Adachi et al , J Virol. 59:284-291 , 1 986), como se describe (Zhou et al. , Cell Host & Microbe 4:495-504, 2008). La actividad de luciferasa fue medida a 96 h post-infección. La supresión de AAK1 y GAK inhibió significativamente la replicacion de HIV (Figs. 1 0A-C). Para probar el efecto de inhibidores farmacológicos de AAK1 y GAK contra HIV- se trataron diariamente células TZM-b1 HeLa-derivadas infectadas con H IV-1 con diluciones seriales de sunitinib, erlotinib o PKC-41 2 durante 4 días seguido por ensayos de luciferasa. Se observó un efecto antiviral de respuesta de dosis significativo sin efecto alguno sobre la viabilidad (Figs. 10A-C). EC50 de erlotinib fue 1 .4±0.3 (valor P - 0.0058), sunitinib - 0.8±0.4 (valor P -0.1 ), y PKC-412 - 8.5±4 (valor P - 0. |). Debido a que estos estudios fueron conducidos 96 h post-infección , valoraron todas las etapas de infección desde la entrada a liberación y esparcimiento (Zhou et al. , Cell Host & Microbe 4:495-504, 2008) y por lo tanto sugieren que AAK1 y GAK son importantes para replicacion de H IV global.

Métodos Plásmidos. ORFs que codifican AP2M 1 , GAK, AAK1 , TFR, SPIRE, RAC1 , ARPC, y NESI fueron escogidos de la genoteca Human ORFeome de clones de cDNA (Rual et al . , Genome research 14, 2128-21 35, 2004) (Open biosystems) y se recombinaron en ya sea vectores pcDNA-Dest40 (para etiquetado V5-his C-terminal) , pGLuc (para etiquetado de fragmento de luciferasa de Gaussia Princeps (Gluc) (Cassonnet et al. , Nat ethods 8, 990-992, 201 1 ), y/o pCherry (para etiquetado de proteína de fluorescencia mCherry) usando tecnolog ía de puerta de enlace (Invitrogen). ORFs que codifican núcleo de longitud completa T7-etiquetado y NS3 fueron amplificados a partir de los vectores descritos (Blight et a. , Science 290, 1972-1 974, 2000) y se ligaron en pcDNA3.1 (Invitrogen). pFL-J6/JFH(p7-Rluc2A) (Murray et al. , J Virol 81 , 1 0220-1 0231 , 2007) fue un regalo del Dr. C. M. Rice (Tscherne et al. , J Virol 80, 1 734-1 741 , 2006) . Las mutaciones de núcleo ???F y mutaciones AP2M 1 fueron introducidas en estos plásm idos mediante mutagénesis de sitio-dirigido (usando el kit QuikChange (Stratagene)).

Anticuerpos y compuestos. Ver Tablas 1 y 2.

RNAi y rescate de silenciamiento de gene. 40-1 00 nM de siRNAs individuales o depositados (FIGS. 8A-G) fueron transfectados en células usando silMPORTER (Uptsate, Millipore) 48 h antes de electroporación de RNA de hCV. Cinco MISSION Lentiviral Transduction Particles (Sigma) individuales que alojan RNAs de horquilla corta (shRNAs) que enfocan varios sitios en el RNA de AP2M 1 y un sh RNA de control se usaron para transducir células Huh-7.5 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los reactivos de RNAi usados en este estudio son resumidos en la Tabla 3. El rescate de AP2M 1 se realizó mediante transduccion de células Huh-7.5 suprimidas de manera estable para AP2M 1 con lentivirus expresando AP2M 1 shRNA-resistente 48 h antes de la electroporación con genoma de HCV.

Ensayos de afinidad de microfluido. La fabricación y diseño de dispositivos se hicieron esencialmente como se describió ( aerkl et al. , Science 315, 233-237, 2007). Proteínas humanas V5-his-etiquetadas y proteínas virales T7-etiquetadas fueron expresadas del chip mediante mezcla de transcripción/traslación de mam ífero invitro (TNT) (Promega) (en la presencia de membranas microsomales). El dispositivo fue sometido a elaboración de patrones de superficie, resultando en un área circular recubierta con anticuerpos anti-his biotinilados dentro de cada célula unitaria (Einav et al. , Nature Biotechnology 26, 1019-1027, 208; Gerber et al. , Nature methods 6, 71 -74, 2009). Se realizaron experimentos de unión de proteína-proteína como se describe (Gerber et al. , Nature methods, 6, 71 -74, 2009) . Brevemente, las proteínas de cebo humanas fueron cargadas en el dispositivo y unidas a los anticuerpos anti-his de superficie. Las proteínas virales y humanas fueron incubadas en el chip y etiquetadas con anticuerpos anti-T7-Cy3 y anti-V5-FITC, respectivamente. Las interacciones fueron atrapadas mecánicamente por MITOMI (Maerkl et al. , Science 31 5, 233-237, 2007; Einav et al. , Naure Biotechnology 26, 1 019-1027, 2008; Gerber et al. , Nature methods 6, 71 -74, 2009). Después de un breve lavado para remover material no unido no atrapado, los complejos de proteína atrapados fueron detectados por un explorador de arreglo (Tecan). La proporción de presa viral unida a proteína de cebo humana expresada fue calculada para cada punto de datos al medir la proporción de señal mediana de Cy3 a señal mediana de FITC. La concentración de proteína en lisados fue determinada mediante análisis western cuantitativo contra curvas estándares de proteínas T7-etiquetadas. Los experimentos fueron conducidos al menos tres veces, cada vez con >20 réplicas. Ver FIGS. 10A-C para un protocolo detallado.

Cultivos celulares. Las células Huh-7.5 y células 293T fueron mantenidas en medio esencial mínimo modificado de Dulbecco (Gibco) complementado con 1 % L-glutamina (Gibco), 1 % penicilina, 1 % estreptomicina (Gibco), 1 X aminoácidos no esenciales (Gibco) y 10% suero bovino fetal (Omega Scientific). Las líneas celulares fueron pasadas tres veces una semana después de tratamiento con 0.05% tripsina-0.02% EDTA y sembradas a una dilución de 1 :4.

Ensayos de complementación de proteína-fragmento. Los ensayos de unión fueron realizados esencialmente como se describió (Cassonnet et al. , Nat Methods, 8, 990-992, 201 1 ). Las combinaciones de plásmidos que codifican proteínas de presa (A) y cebo (B), fusionadas cada una a un fragmento de los vectores de proteína luciferasa de Gaussia Princeps (Glud y Gluc2) o de control, fueron cotransfectadas en células 293T o Huh-7.5 platinadas en placas de 96 cavidades por triplicado. A 24 h post-transfección, las células fueron Usadas y sometidas a ensayos de gene reportador de luciferasa estándar usando sistema de ensayos de luciferasa de Renilla (Promega). Los resultados fueron expresados ya sea como luminscencia o proporción de luminiscencia. La última representa la señal de luminiscencia promedio detectada en células transfectadas con Gluc1 -A y Gluc2-B dividida por el promedio de luminiscencia medida en cavidades de control transfectadas con Gluc1 -A y un vector Gluc2 vacío con aquéllas transfectadas con Gluc2-B y un vector Glud vacío. Los ensayos y estudios de competencia diseñados para determinar el efecto inhibidor de compuestos o siRNAs fueron realizados como antes, excepto que la unión fue medida en la presencia de proteínas libres en exceso, los inhibidores o siRNAs, respectivamente. Los experimentos fueron conducidos al menos tres veces por triplicado.

Co-inmunoprecipitaciones. Las membranas fueron preparadas a partir de ~20x1 06 células Huh-7.5 infectadas con HCV (J6/JFH) (Lindenbach , et al . , Science 309, 623-626, 2005), como se describe previamente (Einav et al. , J Virol 78, 1 1 288-1 1 295, 2004). Brevemente, las células fueron recolectadas mediante tripsinización, lavadas una vez con PBS y resuspendidas en amortiguador de HME (20 mM HEPES [pH 7.4], 1 mM EDTA 2 mM MgCI2), complementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo a una concentración final de 1 mM y un coctel de inhibidores de proteasa (Sigma). Las células fueron Usadas por dos ciclos de congelación-descongelación en etanol helado y se pasaron entonces a través de una aguja calibre 27.5 1 0 veces. Los núcleos fueron removidos mediante centrifugación a 250 xg durante 10 min, y el sobrenadante post-nuclear fue sometido a ultracentrifugación a 10,000 xg durante 30 min para obtener la preparación de membrana. Todos los pasos fueron hechos a 4°C. Las proteínas de membrana total fueron diluidas en 1 mi de amortiguador de TDB (2.5% Tritón X-100, 25 mM trietanolamina-CI [pH 8.6], 20 mM NaCI, 5 mM EDTA, 0.2% NaN3) (Einav et al, J Viro 78, 1 1288-1 1295, 2004) e incubados durante 30 min a 37°C con 100 nM caliculina-A o DMSO. Debido a la naturaleza débil y transiente de las interacciones, 25 mM de reticulador ditiobis-succinimidil-propionato (DSP) (Pierce) fue adicionado para permitir la unoin covalente de las proteínas de interacción ya unidas. Las muestras fueron incubadas durante 2 h en hielo. Tris 1 M se adicionó para detener la actividad de DSP. Los lisados fueron entonces clarificados mediante 10 min de centrifugación a 1 000xg, seguido por 30 min de ultracentrifugación de los sobrenadantes a 100,000xg. Las pellas de membrana fueron resuspendidas en 1 00 I de amortiguador HME (20mM NaHEpes (pH 74), 1 mM EDTA (pH 8), 2mM gCI2) y el amortiguador TDB fue adicionado para un volumen final de 1 ml. Las muestras fueron incubadas durante la noche con ya sea anticuerpos anti-AP2M 1 , anticuerpos anti-núcleo o controles de IgG, y perlas magnéticas de proteína G ( illipore). Los inmunoprecipitados fueron analizados mediante western blotting. Los experimentos fueron conducidos dos veces por duplicado.

Transcripción in vitro de RNA viral y transfección. Se generó RNA de HCV y se entregó en células Huh-7.5, como se describe previamente (Lindenbach et al. , Science 309, 623-626, 2005; Murray et a. , J Virol 81 , 10220-10231 , 2007) . Brevemente, RNA fue sintetizado a partir de plantilla de J6/JFH(p7-Rluc2A) linealizada de Xbal usando el kit T7 MEGAscript de acuerdo con el protocolo del fabricante (Ambion) . Las mezclas de reacción fueron incubadas durante 3 h a 37°C y entonces se sometieron a tratamiento de DNasa durante 1 5 min a 37°C. El RNA viral fue purificado usando el kit RNeasy (Qiagen). El RNA fue cuantificado por absorbancia a 260 nm , y su calidad fue verificada mediante electroforesis de gel de agarosa. Células Huh-7.5 subconfluentes fueron tripsinizadas y recolectadas mediante centrifugación a 700 g durante 5 min. Las células fueron lavadas entonces tres veces en PBS RNAsa-libre helado (BioWhittaker) y resuspendidas a 1.5* 107 células/ml en PBS. 5 \¡g del RNA tipo natural transcrito in vitro o muíante J6/JFH(p7-Rluc2A) se mezclaron con 400 µ? de células Huh-7.5 lavadas en una probeta de 2mm-de abertura (BTX) y se pulsaron inmediatamente (0.82 kV, cinco pulsos de 99 s) con un electroporador BTX-830. Después de una recuperación de 15 min a 25°C, las células fueron diluidas en 30 mi de medio de cultivo precalentado y platinadas en placas de cultivo de 96, 24, 6 cavidades y de tejido P100.

Replicación de RNA de HCV por ensayos de luciferasa. La replicación de RNA de HCV fue medida a 6-9 h, y 72 h post-electroporacion, como se describió (Murray et a., J Virol 81, 10220-10231, 2007). Las células electroporadas platinadas por cuadruplicado en placas de 96 cavidades fueron lavadas dos veces con PBS y Usadas con 30 µ? de amortiguador de lisis de Renilla (Promega). Siguiendo 15 min de agitación a RT, la actividad de luciferasa fue cuantificada usando un substrato de luciferasa de Renilla (Promega) y un luminómetro Tecan (Tecan) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.

Ensayos de replicación de HIV. Las células TZM-b1 HeLa-derivadas, las cuales expresan CD4, CCR5 y CXCR4, así como genes reportadores de luciferasa de luciérnaga y ß-galactosidasa que responden a transcripción de HIV (Wei et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 46, 1896-1905, 2002) fueron usados en estos ensayos.

Las células fueron transfectadas con siRNAs que enfocan AAK1 , GAK o una secuencia NT seguido por infección con el clon NL4-3 de HIV-1 infeccioso (Adachi et a. , J Virol 5, 284-291 , 1 986), como se describió (Zhou et al. , Cell Host & Microbe 4, 495-504, 2008). La actividad de luciferasa fue medida a 96 h post-infección. Para probar el efecto de inhibidores farmacológicos de AAK1 y GAK entra HIV, las células TZM-b1 HeLa-derivadas infectadas de H IV-1 fueron tratadas diariamente con diluciones eriales de sunitinib, erlotinib o PKC-41 2 durante 4 días seguido por ensayos de luciferasa.

Infectividad extracelular. Los sobrenadantes de cultivo de células Huh-7.5 electroporadas con RNA de J6/JFH(p7-Rluc2A) y platinados en placas P100 fueron recolectados a 72 h post-electroporación, clarificados (con un filtro de tamaño de poro de 0.22 pm) y usados para infectar células Huh-7.5 naturales durante 72 h por triplicado antes de la lisis en amortiguador de lisis de Renilla (Promega) . La actividad de luciferasa en 20 µ? de Usados celulares fue cuantificada como se describió antes. Para determinar el efecto de erlotinib, sunitinib y PKC-412 sobre la producción de virus infeccioso, se cultivaron células electroporadas en la presencia de los inhibidores con cambios medios diarios durante 72 h antes de la recolección de sobrenadantes o Usados celulares. Los resultados representan valores de Iog 10 RLU por 10 cm de placa de cultivo de tejido. Los experimentos fueron repetidos tres veces, cada vez con cuadruplicados.

Ensayos de infectividad intracelular. Como se describe por Murray et al. (J Virol 81 , 1 0229-10231 , 2007) , 72 h post-electroporación con células de RNA de J6/JFH(p7-Rluc2A) fueron tripsinizadas, recolectadas por centrifugación, resuspendidas en 500 µ? de medio, Usadas por ciclos de congelación-descongelación y pelletizadas dos veces a 3,650xg . Los sobrenadantes clarificados diluidos en medio completo fueron usados para inocular células Huh-7.5 naturales por triplicado, seguido por lisis y ensayos de luciferasa a 72 h. Los resultados representan valores de Iog 10 RLU por 10 cm de placa de cultivo de tejido. Los experimentos fueron repetidos tres veces, cada vez con cuadruplicados.

Titulación de virus. Títulos extracelulares e intracelulares fueron determinados al limitar los ensayos de dilución basados en manchado inmunohistoquímico para núcleo. La dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50% (TCID5o) fue calculada, como se describió (Lindenbach et al. , Science 309, 623-626, 2005). Los resultados son expresados como TC I D5o/ml. Títulos mínimos medidos con el mutante ?? 1 -?2 fueron usados para substracción de soporte.

ELISA de núcleo. La concentración de proteína de núcleo liberada se midió en sobrenadantes de cultivo celular clarificado recolectados a 72 h post-electroporación por ELISA (Cell Biolabs) contra curvas estándares de antígeno de núcleo recombinante, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayos de viabilidad. Siguiendo 24, 48 y 72 h de tratamiento con compuestos inhibitorios o silenciamiento con siRNAs, las células fueron incubadas durante 2-4 h a 37°C en la presencia de 1 0% reactivo AlamarBIue (TREK Diagnostic Systems), como se describió (Einav et al. , Nature Biotechoogy 26, 101 9-1 027, 2008) . Las placas fueron exploradas entonces y la fluorescencia fue detectada al usar FLEXstation II 384 (Molecular Devices, I Nc ).

Estudios de infección. 6x1 03 células Huh-7.5 sembradas en placas de 96 cavidades fueron infectadas por triplicado en J6/JFH de HCV cultivado en cultivo celular (título: 1 .2x1 05 TCID50/ml). La infectividad extracelular e intracelular fue medida mediante ensayos de formación de foco (Lindenbach et al. , Science 309, 623-626, 2005) en células Huh-7.5 naturales infectadas con sobrenadantes o Usados celulares clarificados derivados de las células infectadas a 72 h postinfección.

Para determinar el efecto antiviral de erlotinib, sunitinib y PKC-412, 6x1 03 células Huh-7.5 sembradas en placas de 96 cavidades fueron infectadas por triplicado con HCV cultivado en cultivo celular (J6/JFH(p7-Rluc2A)) (título: 6.3x105 TCI Dso/ml) con MOI (multiplicidad de infección) de 0.1 . Seis horas después de la infección y diariamente después, las células fueron lavadas y medio fue reemplazado con medio conteniendo diluciones eriales de los compuestos inhibidores. A 72 h, las muestras fueron sometidas a ensayos de viabilidad, seguido por ensayos de luciferasa estándares (Promega).

Análisis de reversores. Las células Huh-7.5 electroporadas con J6/JFH(p7-Rluc2A) que alojan las mutaciones Y1 36A o V1 39A fueron propagadas. Los sobrenadantes de cultivo fueron recolectados cada pocos días y usados para inocular células Huh-7.5 naturales para determinación de infectividad extracelular por ensayos de luciferasa 72 h siguiendo la inoculación. El RNA celular total fue extraído de clones que demuestran la reversión del fenotipo de infectividad (en la post-electroporación de día 8 para clones Y136A y día 14 para clones mutantes de V139A) usando reactivo TRIzol (Invitrogen). La reacción de transcripción inversa y amplificación de PCR fueron realizadas usando kit de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) Superscript One-Step (Invitrogen). Un segmento de ~1 -kb que aloja la secuencia de codificación de núcleo fue amplificado. Los productos de PCR fueron purificados a partir de geles de agarosa mediante el kit de purificación de DNA Ultra Celan 15 (MoBio) y sometidos a secuenciación automática en un secuenciador de DNA ABI Prism 377 (Sequetech). La presencia de reversión de sitio primario fue confirmada por dos secuencias independientes usando oligos hacia adelante e inversos.

Extracción de RNA y qRT-PCR. El RNA total fue aislado a partir de células o 1 mi de sobrenadantes de cultivo celular usando TRIzol (Invitrogen) o kit QiaAmp UltraSens (Qiagen), respectivamente. Las mezclas de qRT-PCRs fueron montados por triplicado usando 0.5Mg o 4µ? de RNA y High-Capacity RNA-a-cDNA (APplied Biosystems). Los reactivos TAqMan son listados en la Tabla 4. La amplificación y análisis fueron realizados usando el sistema StepOnePlus Real-Time-PCR (Applied Biosystems). Se usó S1 8 como un control.

Western blot. Los Usados celulares fueron sometidos análisis western usando anticuerpos primarios seguido por anticuerpos secundarios HRP-conjugados. La intensidad de bandas fue cuantificada usando NIH Image.

Microscopía confocal de inmunofluorescencia cuantitativa. Las células Huh-.5 fueron electroporadas con J6/JFH HCV RIMA o infectados con virus J6/JFH cultivado de cultivo, sembradas sobre cubreobjetos, y se incubaron durante 72 h a 37°C. Las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído en PBS, se lavaron con PBS, permeabilizadas con 0.1 % Tritón X-100 en PBS durante 5 min, y bloqueados durante 1 h en PBS conteniendo 1 % BSA. Las células fijas fueron incubadas con anticuerpos primarios contra ya sea la proteína de núcleo, AP2M 1 , TGN46, calreticulina o E2 a temperatura ambiente durante 1 h (ver Tabla 1 ). Los anticuerpos secundarios (anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488, anti-ratón de cabra Alexa Fluor 594, IgG anti-cabra de pollo Alexa Fuor 647, un anti-humano de cabra Alexa Fluor 647) (Invitrogen) fueron incubados durante 1 h a temperatura ambiente. El manchado de LD con Bodipy-488/503 (Invitrogen) se realizó como se describió (Kopp et al. , J Virol 84, 1666-1673, 2010). Los cubreobjetos fueron lavados entonces tres veces en PBS, y se montaron con reactivo antidecoloración ProLong Gold (I nvitrogen) . De manera alternativa, células Huh-7.5 fueron cotransfectadas con plásmidos que expresan AP2M 1 -YFP y/o Core-mCherry. LD fueron manchados con HCS LipidTOX (Invitrogen). Todos los portaobjetos fueron analizados usando microscopio confocal Zeiss LS 510. La colocalización fue cuantificada en 10-1 5 células elegidas aleatoriamente de cada muestra usando programa de cómputo de colocalización ImageJ (JACoP) y Coeficientes de Colocalización de Manders (MCC). Los valores de umbral fueron determinados usando auto-umbral (Plugin , I MageJ). Solo pixeles cuyos valores de intensidad rojo y verde estuvieron ambos por arriba de umbrales respectivos fueron considerados como pixeles con sondas colocalizadas. Los MCCs fueron entonces calculados con las fracciones de fluorescencia total en la región de interés que ocurre en estos pixeles "colocales" (con un valor mayor representando más colocalización). Los valores de coeficiente M2 representados como porcentaje promedio de colocalización son mostrados.

Análisis estadístico. IC50s y EC50s fueron medidos al ajusfar datos a una curva logística de tres parámetros, como se describió (Einav et al. , Nature Biotechnology 26, 101 9-1 027, 2008). Los valores P fueron calculados usando prueba de Student no emparejada de una cola.

Ejemplo 3 El efecto de erlotinib, sunitinib y PKC-41 2 sobre fosforilación de AP2M 1 .

Para determinar el efecto de los compuestos inhibidores sobre fosforilación de AP2M1 , células Huh-7.5 que alojan RNA de J6/JFH(p7-Rluc2A fueron tratados diariamente con varias concentraciones de los compuestos o con DSO. Debido a la fosforilación de AP2M 1 es transiente (debido a la actividad de la fosfatasa PP2A (Ricotta et al. , J Biol Chem 283:5510-551 7, 2008), para permitir la captura del estado de AP2M1 fosforilado, se prepararon lisados a 27 siguiendo una incubación de 30 min de las células con 100 n del inhibidor PP2A, caliculina A (Cal-A) o un control de DMSO. Las muestras fueron sometidas entonces a SDS-PAGE y manchado con anticuerpos que enfocan ya sea la forma AP2M 1 fosforilada o actina. En realidad, proporciones significativamente menores de AP2M 1 fosforilada a actina fueron medidas en Usados preparadas a partir de células tratadas con ya sea sunitinib, erlotinib o PKC-412, comparadas con el control de DMSO (FIG. 6H). Las proporciones de fosfo-AP2M 1 a actina fueron disminuidas progresivamente al incrementar las concentraciones de sunitinib y erlotinib en una manera dependiente de la dosis. Estos resultados sugieren que AAK1 o GKA son potentemente inhibidos por estos compuestos en células Huh-7.5 que alojan HCV infeccioso.

El efecto de los compuestos sobre replicación de RNA de HCV; infectividad intracelular, infectividad extracelular y replicación de HCV.

Para determinar el efecto de erlotinib, sunitinib y PKC-412 sobre producción de virus infeccioso, las células Huh-7.5 fueron electroporadas con genoma de HCV de J6/JFH(p/-Rluc2A) (Murray et al. , J Virol 81 : 1 0220-1 0231 , 2007), platinadas en placas de 6 cavidades, y tratadas diariamente con diluciones seriales de los compuestos o DMSO. A 72 h post-electroporación, la viabilidad celular fue medida por ensayos basados en AlamarBIue seguido por ensayos de luciferasa para determinación de replicación de RNA de HCV. Los sobrenadantes de cultivo celular y lisados fueron recolectados a 72 h de muestras paralelas y usadas para inocular células Huh-7.5 naturales para determinación de infectividad extracelular e intracelular, respectivamente. Los ensayos de luciferasa fueron realizados en estas células a 72 h post-inoculación.

Para determinar el efecto de estos compuestos sobre replicación de HCV, 6x103 células Huh-7.5 sembradas en placas de 96 cavidades, fueron infectadas por triplicado con HCV cultivada en cultivo celular (J6/JFH(p7-Rluc2A)) tituladas a 6.3x105 TCID50/ml con MOI (multiplicidad de infección) de 0. 1 . A 6 h post-electroporación, las células fueron lavadas y medio fue reemplazado con diluciones seriales de los compuestos inhibidores. Las células fueron tratadas diariamente durante 72 h y entonces se sometieron a ensayos de viabilidad seguido por ensayos de luciferasa estándares.

De manera alternativa, 6x1 03 células Huh-7.5 sembradas en placas de 96 cavidades fueron infectadas por triplicado con J6/J FH de HCV cultivada de cultivo celular (título: 1 .2x105 TC I Dso/ml con un MOI de 0.1 , y sometidos a ensayos de formación de foco, como se describió (Lindenbach et al. , Science 309:623-626, 2005). Siguiendo 72 h de tratamiento diario con los compuestos, las células fueron fijadas en 4% de formaldehido y permeabilizadas con saponina. La proteína de núcleo de HCV fue detectada con anticuerpos Alexa 594-conjugados anti-ratón de cabra secundario y monoclonal anti-núcleo primario. Los focos fueron contados bajo un microscopio invertido.

Los experimentos fueron repetidos dos veces, cada uno con 4 réplicas. La señal fue normalizada a muestras cultivadas en la presencia de la concentración correspondiente de DMSO. Las EC50s fueron medidas al ajustar los datos a una curva logística de tres parámetros usando la fórmula Y=a+(b-a)/(1 + 10A(X-c)) (a, b y c representan unión m ínima, unión máxima y logEC50, respectivamente)(BioDataFit, Chang Bioscience, I nc) .

Tabla 1 . Anticuerpos usados en este estudio Anticuerpos Fuente Anti-penta-his biotinilado Qiagen Anti-V5 FITC-conjugado I nvitrogen Etiqueta anti-T7 ficoeritrina-conjugado Abcam Anti-AAK1 de conejo Abcam Anti-AP2M 1 de conejo Santa Cruz Biotechnology Anti-AP2M 1 de cabra Santa Cruz Biotechnology Anti-fosfo-AP2M 1 de conejo (T156) Cell signaling Anti-TGN46 de ocnejo Abcam Anti-calreticulina de conejo Enzo Life Sciences Anti-GAK de conejo MBL international Corporati on Anti-núcleo de ratón Austral Biologicals Anti-E2 humano (CBH5) Dr. Steven K Foung Anti-actina de ratón Sigma IgG anti-ratón HRP-conjugada Cell signaling IgG anti-conejo HRP-conjugada Cell signaling Tabla 2. Compuestos usados en este estudio Compuesto PKC-412 Sigma Malato de sunitinib Sigma Erlotinib LC Laboratories Caliculina A Cell Signaling Tabla 3. RNAi usado en este estudio Tabla 4. Sondas Taqman y cebadores usados en este estudio Todos los reactivos listados en esta tabla fueron comprados de Applied Biosystems, Inc. (ABI).

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un método para tratar coinfección de HCV-HIV comprendiendo administrar a un paciente en necesidad de lo mismo una cantidad efectiva de un agente que inhibe la unión de dichos virus HCV y HIV a una subunidad de µ de huésped de complejos de proteína adaptadora de clatrina (AP).

2. El método de la reivindicación 1 , en donde la subunidad de µ es seleccionada del grupo que consiste de subunidades de µ de complejos de clatrina AP, AP2, AP3 y AP4.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dicha subunidad de µ es seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 , AP1 M 1 , AP3M1 y AP4M 1 .

4. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho agente inhibe AAK1 o GAK.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho agente es seleccionado del grupo que consiste de erlotinib, sunitinib y PKC-412.

6. Un método para inhibir infecciones por un Lentiviridae, H IV, coinfección de HCV/HIV, Flaviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV, comprendiendo el método administrar a un paciente en necesidad de lo mismo una cantidad efectiva de un agente que inhibe la unión de una proteína estructural de dicho virus comprendiendo un motivo de ???F o dileucina a una subunidad de µ de huésped de complejos de proteína adaptadora (AP) de clatrina.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha subunidad de µ es seleccionada del grupo que consiste de subunidades de µ de complejos de clatrina AP1 , AP2, AP3 y AP4.

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicha subunidad de µ es seleccionada del grupo que consiste de AP2M 1 , AP1 M 1 , AP3M1 y AP4M 1 .

9. El método de la reivindicación 6, en donde dicho agente inhibe AAK1 o GAK.

10. El método de la reivindicación 6, en donde dicho agente es seleccionado del grupo que consiste de erlotinib, sunitinib y PKC-412.

1 1 . Un método para clasificar agentes antivirales comprendiendo: contactar un virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, Flaviviridae diferentes de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV o proteína de los mismos con un agente candidato y una subunidad de µ de huésped de complejos de proteína adaptadora (AP) de clatrina, y determinar un efecto de dicho agente candidato sobre la unión de dicho virus de unió de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, HIV, Flaviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferentes de HCV a dicha proteína.

12. Un método para clasificar agentes antivirales comprendiendo: contactar un virus de unión de clatrina AP, Flaviviridae, Lentiviridae, HCV, H IV, Flaviviridae diferente de HCV, virus de unión de clatrina AP diferentes de Flaviviridae, o virus de unión de clatrina AP diferente de virus de HCV con un agente candidato y una célula que expresa una subunidad de µ de huésped de complejos de proteína adaptadora (AP) de clatrina y determinar el efecto de dicho agente candidato sobre montaje o florecimiento viral.

1 3. El método de la reivindicación 1 1 , en donde dicho agente candidato inhibe la actividad de AAK1 o GAK.

14. Un método para inhibir el montaje o florecimiento de un Flaviviridae, un virus diferente de Flaviviridae, o un virus diferente de HCV en una célula huésped que comprende contactar dicha célula huésped con un agente que previene la unión de una proteína estructural viral comprendiendo un motivo de ???F o dileucina a una subunidad de µ de huésped de complejos de proteína adaptadora (p) de clatrina, en donde dicho montaje o florecimiento es inhibido.

15. El método de la reivindicación 14, en donde dicho agente bloquea la unión de dicha proteína estructural a dicha proteína huésped.

16. E método de la reivindicación 14, en donde dicho agente compite con dicha proteína estructural para unió a dicha proteína huésped.

17. El método de la reivindicación 14, en donde dicho agente compite con dicha proteína huésped para unión a dicha proteína estructural.