MX2014006369A - Proteina de fusion anticancerigena. - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un dominio (a) que es un fragmento funcional de la secuencia de proteínas hTRAIL, dicho fragmento inicia con un aminoácido en una posición no inferior que hTRAIL95, o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia, preferiblemente 85 % de identidad y termina con el aminoácido hTRAIL281; y un dominio (b) que es una secuencia de un péptido efector que inhibe la síntesis de proteínas, en donde la secuencia del dominio (b) está unida al C-terminal o al N-terminal del dominio (a); la proteína de fusión se puede usar para el tratamiento de enfermedades cancerosas.

Description

PROTEÍNA DE FUSIÓN ANTICANCERÍGENA La invención se refiere al campo de las proteínas de fusión terapéuticas, especialmente proteínas de fusión recombinante. Más concretamente, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden el fragmento de una secuencia de la proteína soluble humana TRAIL y una secuencia de una toxina de péptido que inhibe la síntesis de proteínas, composiciones farmacéuticas que los contienen, su uso en terapia, especialmente como agentes anticancerígenos y a las secuencias de polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión, vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos y las células hospederas que contienen estos vectores de expresión.

La proteína TRAIL, un miembro de la familia de las citocíhas (Ligando de inducción de apóptosis relacionada con el Factor de Necrosis Tumoral), también conocido como Apo2L (Apo2-ligando), es un potente activador de la apóptosis en las células tumorales y en células infectadas por un virus. TRAIL es un ligando que se presenta naturalmente en el cuerpo. La proteína TRAIL, su secuencia de aminoácidos, secuencias de codificación de ADN y sistemas de expresión de proteínas se describieron por primera vez en EP0835305A1.

La proteína TRAIL ejerce su actividad anticancerígena mediante la unión a los receptores 1 y 2 TRAIL de la superficie pro-apoptótica (TRAIL-R1/R2) y activación posterior de estos receptores. Estos receptores, también conocidos como DR4 y DR5 (receptor 4 de muerte y receptor 5 de muerte), son miembros de la familia del receptor TNF y se sobreexpresan por diferentes tipos de células cancerígenas. La activación de estos receptores puede inducir la trayectoria de señalización externa de la apóptosis independiente del gen p53 supresor, que por la caspasa-8 activada lleva a la activación de caspasas ejecutivas y así a la degradación de ácidos nucleicos. La caspasa-8 liberada con la activación de TRAIL también puede causar la liberación de la proteína Bid truncada, que es trasladada a la mitocondria, donde estimula la liberación del citocromo C, así amplificando indirectamente la señal apoptótica de los receptores de muerte.

La TRAIL actúa selectivamente en células de tumor esencialmente sin inducir apóptosis en las células sanas que muestran resistencia a esta proteína. Por lo tanto, el enorme potencial de TRAIL se reconoció como un agente anticancerígeno que actúa en un amplio intervalo de diferentes tipos de células tumorales, incluyendo malignidades hematológicas y tumores sólidos, mientras deteriora las células normales y ejerce efectos secundarios potencialmente de manera relativa menores.

La proteína TRAIL es una proteína de membrana de tipo II con la longitud de 281 aminoácidos y su región extracelular compuesta por residuos de aminoácidos 114-281 en una disociación por proteasas forma una molécula sTRAIL soluble de tamaño de 20 kDa, que también es biológicamente activa. Ambas formas TRAIL y sTRAIL son capaces de activar la apóptosis a través de la interacción con los receptores de TRAIL presentes en las células objetivo. La fuerte actividad antitumor y muy baja toxicidad sistémica de la parte soluble de la molécula de TRAIL fue demostrada utilizando pruebas de líneas celulares. También, estudios clínicos humanos preliminares con la TRAIL soluble, humana, recombinante (rhTRAIL) que tiene la secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 114-281 de hTRAIL, conocido bajo el nombre de INN dulanermina, mostró también su buena tolerancia y ausencia de toxicidad limitante de dosis.

Los fragmentos de TRAIL más cortos que 114-281 son también capaces de unirse a los receptores de muerte de membrana e inducir la apóptosis a través de estos receptores, como fue reportado recientemente para el muíante permutado circularmente recombinante de 122-281 hTRAIL por ejemplo en EP 1 688 498.

Los efectos tóxicos de la proteína TRAIL recombinante en células de hígado reportados a la fecha parecieron estar asociados con la presencia de modificación, es decir etiquetas de polihistidina, mientras el TRAIL sin etiqueta no mostró toxicidad sistémica.

Sin embargo, en ensayos clínicos adicionales en pacientes la eficacia real de TRAIL como una monoterapia demostró ser baja. También problemática fue la resistencia primaria o adquirida al TRAIL mostrada por muchas células de cáncer (véase, por ejemplo, WO2007/022214). La resistencia puede ser debida a varios mecanismos y puede ser específica para un tipo de cáncer o dependiente del paciente (Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutícs: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11 : 17-24). Esta resistencia limita la utilidad de TRAIL como un agente contra el cáncer. Aunque el mecanismo de resistencia de la TRAIL no ha sido comprendido completamente, se cree que puede manifestarse a sí mismo en niveles diferentes de la trayectoria de apóptosis inducida por la TRAIL, variando del nivel de los receptores de superficie celular a las caspasas ejecutivas dentro de la trayectoria de señalización.

Para superar esta baja eficiencia y la resistencia de los tumores a la TRAIL, varias terapias de combinación con agentes de radio- y quimioterapéuticos fueron diseñadas, lo que tuvo como resultado un efecto apoptótico sinérgico (WO2009/002947; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14 (2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No.6, 2001 , 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No. 9 (2010), p. 1527-1533). El uso de rhTRAIL para el tratamiento de cáncer en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales seleccionados (paclitaxel, carboplatino) y anticuerpos monoclonales anti-VEGF se describen en WO2009/140469. Sin embargo, tal combinación implica necesariamente deficiencias bien conocidas de radioterapia o quimioterapia convencional. Sin embargo, la técnica previa no menciona nada acerca de cualquier dato que sugiera la abolición de la resistencia de las célula al TRAIL obtenido al fusionar la proteína TRAIL con otras proteínas o fragmentos de la misma.

Más aún, el problema relacionado con la terapia TRAIL parece ser su baja estabilidad y eliminación rápida del cuerpo después de la administración.

Las terapias anticáncer pueden también ser dirigidas a la inhibición de la síntesis de proteínas de las células de tumor. Se conoce el efecto benéfico de inhibir la proliferación de las células de tumor al inhibir la síntesis de proteína intracelular. Se están haciendo intentos de uso clínico de sustancias que inhiben o regulan el proceso de la síntesis de proteínas, ambos como terapia anticáncer y terapia de cáncer complementaria.

Las sustancias que inhiben la síntesis de proteína celular son péptidos catalíticos o toxinas de proteína de origen bacteriano, micótico o vegetal. Las toxinas de una sola cadena (también conocidas como hemitoxinas), que poseen sólo un dominio catalítico y que carecen de un dominio de unión están en su forma nativa libre prácticamente no tóxica para las células. Las toxinas que consisten en dos o más cadenas (también conocidas como holotoxinas) poseen además del dominio catalítico también el dominio de unión, pero carecen de selectividad celular y por lo tanto después de la administración sistémica exhiben una toxicidad indeseable contra los tejidos sanos y efectos secundarios extensos.

Para lograr una mayor especificidad, las toxinas o dominios catalíticos de toxinas de proteína son conjugados a ligandos de portador que se unen selectivamente a los marcadores presentes en la célula de tumor. El uso de un dominio o proteína dirigida a ligando permite el suministro específico del dominio tóxico de una proteína en una célula. Las inmunotoxinas son proteínas conjugadas o de fusión, en las que una toxina está ligada a un ligando de unión, que es una proteína del sistema inmune, tal como anticuerpos, factores de crecimiento, interleucinas, y factor de necrosis de tumor. Hay conjugados conocidos de factores de crecimiento VEGF, FGF, y PDGF con las toxinas formando el grupo de proteína desactivante de ribosoma (toxinas RIP), conjugados de TNF con toxinas RIP, conjugados de IL-2 con exotoxina de Pseudomonas, conjugados de IL-13 con exotoxina de Psuedomonas así como usado en la preparación del tratamiento Ontake® que contiene el conjugado IL2-toxina de la difteria. Otros ejemplos son conjugados de toxinas tales como gelonina y abrina con integrina, fibronectina, l-CAM y granzima B, así como conjugado de ebulina con transferrina (Hall, W.A. Targeted toxin therapy for malignant astrocytoma. Neurosurgery 2000, 46, 544-551). En WO 2002/069886 y US 2003176331 se menciona la posibilidad de conjugación de la toxina RIP de gelonina con un segundo polipéptido para el suministro dirigido de la toxina. Entre muchos tipos posibles de tales polipéptidos secundarios la proteína TRAIL es mencionada, sin embargo, no se describe algún detalle relacionado con la estructura y propiedades de este tipo de quimeras.

En WO 2008052322 se menciona la posibilidad de usar polipéptidos de no-inmunoglobulina que se unen a las estrucuras de las superficies celulares como portadores de toxinas RIP. En WO2008080218 se indica que una citocina, incluida como una de las muchas TRAIL listadas, puede actuar como un portador para las toxinas modificadas, la descripción carece de cualquier información que pueda permitir definir una molécula terapéuticamente eficaz que comprenda TRAIL y su toxina y sus propiedades.

La U.S. 6,627,197 describe una construcción que comprende una síntesis de proteína activadora de toxina, una proteasa de VIH disociable por un péptido, un elemento lectinasa que se une a la superficie celular, un fragmento direcclonable y el agente hidrofóbico, a ser aplicado como un agente antiviral.

En la técnica previa también se conoce el uso en proteínas quiméricas de sitios de disociación reconocidos por proteasas específicas que habilitan la liberación de toxinas en el entorno del tumor y en consecuencia su internalización en la célula de tumor. Por ejemplo, la US 7,252,993 revela proteínas quiméricas que contienen un fragmento tóxico de ricino y una quimiocina DP178-péptido de direccionamiento, conectada vía un enlazador reconocido por una proteasa de VIH. Esta descripción, sin embargo, no proporciona información detallada de la estructura, propiedades y aplicación de las quimeras de la toxina de TRAIL.

La invención presente proporciona unas proteínas novedosas de fusión que combinan propiedades tóxicas de toxinas peptídicas como péptidos efectores y propiedades pro-apoptótlcas y direccionamiento específico a las estructuras presentes en la célula de cáncer de la proteína de TRAIL. Las proteínas de la fusión de la invención comprenden un dominio de unión derivado de TRAIL y un dominio peptídico de toxina como un péptido efector con propiedades de inhibición de síntesis de proteínas.

Debido a la presencia de un dominio derivado de hTRAIL, las proteínas según la invención se dirigen selectivamente a las células de cáncer, en donde los elementos de la proteína ejercen sus efectos.

En particular, las toxinas peptídicas como los péptidos efectores inhiben el proceso de síntesis de proteínas en la célula de cáncer. El suministro de la proteína de la invención dentro del entorno del tumor permite la minimización de la toxicidad y los efectos secundarios contra las células sanas en el cuerpo, así como la reducción de la frecuencia de administración. Además, la terapia dirigida con el uso de las proteínas de acuerdo con la invención permite evitar el problema de baja eficiencia de terapias no específicas de baja eficiencia basadas en la síntesis de proteínas causada por una alta toxicidad y por la necesidad de administrar altas dosis.

Resultó que en muchos casos las proteínas de fusión de la invención son más potentes que el hTRAIL soluble y sus variantes incluyendo el fragmento de una secuencia. Hasta ahora, los péptidos efectores conocidos utilizados en la proteína de fusión de la invención no se han utilizado en la medicina como tal por la cinética desfavorable, rápida degradación por proteasas no específicas o acumulación en el cuerpo causada por la falta de secuencia apropiada de activación de las rutas, que es necesario para permitir la correcta acción del péptido efector en el sitio objetivo. La incorporación de los péptidos efectores en la proteína de fusión permite su entrega selectiva al sitio donde su acción es deseable. Además, la unión del péptido efector aumenta la masa de la proteína, resultando en la vida media prolongada y mayor retención de proteína en el tumor y su mayor eficacia. Además, en muchos casos, las proteínas de fusión novedosas también superan la resistencia natural o inducida a TRAIL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención ahora se describirá en detalle con referencia a las figuras de los dibujos, en donde: La figura 1 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones nin HsdCpb:NMRI-Foxn1 cargados con cáncer de colon Coló 205 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a, Ej. 25a, Ej. 37a y Ej. 42a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 2 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (%TGI) en ratones nin HsdCpb:NMRI-Foxn1 cargados con cáncer de colon Coló 205 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a, Ej. 25a, Ej. 37a y Ej. 42a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 3 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a, y Ej. 35a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 4 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (%TGI) en ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a, y Ej. 35a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 5 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a, y Ej. 50a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 6 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a, y Ej. 50a en comparación con rhTRAIL114-281; La figura 7 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones CrLSHO-Prkdc^Hr^cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 2a, Ej. 18a y Ej. 44a en comparación con rhTRAIL114-281; La figura 8 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones CrLSHO-Prkdc^Hr*1' cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 2a, Ej. 18a, y Ej. 44a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 9 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones CrLSHO-Prkdc^Hr^cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 20a, Ej. 26a, Ej. 43a y Ej. 47a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 10 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 20a, Ej. 26a, Ej. 43a, y Ej. 47a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 11 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de páncreas PANC-1 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 20a, Ej. 51a y Ej. 52a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 12 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones CrLSHO-Prkdc^Hr*" cargados con cáncer de páncreas PANC-1 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 20a, Ej. 51a y Ej. 52a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 13 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones CrLSHO-Prkdc^Hr^ cargados con cáncer de páncreas PANC-1 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a y Ej. 44a en comparación con rhTRAIL1 4-281 ; La figura 14 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscidHrhr cargados con cáncer de páncreas PANC-1 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a y Ej. 44a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 15 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Cby.Cg-foxn1 (nu)/J cargados con cáncer de próstata PC3 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a; La figura 16 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Cby.Cg-foxn1 (nu)/J cargados con cáncer de próstata PC3 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18a; La figura 17 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones CrliSHO-Prkdc^H^ cargados con cáncer de hígado PCL/PRF/5 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 51a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 18 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones CrLSHO-Prkdc^Hr1" cargados con cáncer de hígado PCL/PRF/5 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 51a en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 19 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon HCT116 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b, y Ej. 2 en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 19A presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones CrhSHO-Prkdc50"1!-!^1^ cargados con cáncer de colon HCT116 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 20 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon HCT116 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b, y Ej. 2b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 20A presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (%TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon HCT116 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 21 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones CrliSHO-Prkdc^Hr*1' cargados con cáncer de colon SW620 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b, Ej. 2b y Ej. 54b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 21A presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon SW620 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 22 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl:SHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con cáncer de colon HCT116 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b, Ej. 2b y Ej. 54b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 22A presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (%TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon HCT116 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18 en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 23 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de colon HT-29 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b y Ej. 51 b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 24 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl:SHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con cáncer de colon HT-29 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b y Ej. 51 b en comparación con rhTRAIL.114-281 ; La figura 25 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de hígado HepG2 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 26 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl!SHO-Prkdc^H^ cargados con cáncer de hígado HepG2 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18 en comparación con rhTRAIL114-281; La figura 27 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b y Ej. 2b en comparación con rhTRAIL 114-281; La figura 28 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con cáncer de pulmón A549 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b y Ej. 2b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 29 presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con sarcoma uterino ES-SA/Dx5 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 29A presenta cambios en el volumen del tumor (% de la fase inicial) en ratones Crl:SHO-PrkdcscldHrhr cargados con sarcoma uterino MES-SA/Dx5 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b, Ej. 2b y Ej. 51 b en comparación con rhTRAIL114-281 ; La figura 30 presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones Crl:SHO-Prkdcsc,dHrhr cargados con sarcoma uterino MES-SA/Dx5 tratados con proteína de fusión de la invención del Ej. 18b en comparación con rhTRAIL114-281 ; y La figura 30A presenta valores de inhibición de crecimiento de tumor (% TGI) en ratones CrliSHO-Prkdc^Hr1" cargados con sarcoma uterino MES-SA/Dx5 tratados con proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b, Ej. 2 y Ej. 51b en comparación con rhTRAIL114-281.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una proteína de fusión que comprende: - El dominio (a) que es un fragmento funcional de la secuencia de la proteína hTRAIL soluble, fragmento que comienza con un aminoácido en una posición no menor que hTRAIL95 o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia, preferiblemente 85% de identidad y terminando con el aminoácido hTRAIL281 , y - por lo menos un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector que inhibe la síntesis de proteínas, en donde la secuencia del dominio (b) está unida al C-terminal y/o N-terminal del dominio (a), y en donde la proteína de fusión no contiene un dominio de unión a los receptores del carbohidrato en la superficie celular.

El término "el fragmento soluble funcional de una secuencia de hTRAIL soluble" debe ser comprendido como denotando cualquiera de tal fragmento de hTRAIL soluble, es decir que es capaz de inducir la señal apoptótica en células mamíferas con la unión a sus receptores en la superficie de las células.

También será apreciado por una persona experta que la existencia de por lo menos 70 % de homología de la secuencia de TRAIL es conocida en la técnica.

Debe ser comprendido que el dominio (b) del péptido efector en la proteína de fusión de la invención no es ni la proteína hTRAIL ni una parte o fragmento de proteína hTRAIL.

El término "péptido" de acuerdo con la invención debe ser comprendido como una molécula construida de la pluralidad de aminoácidos enlazados por medio de un enlace peptídico. Así, el término "péptido" según la invención incluye oligopéptidos, polipéptidos y proteínas.

En la presente invención se presentarán las secuencias de aminoácidos de los péptidos de una manera convencional adoptada en la técnica en la dirección del N-terminal (N-terminal) del péptido hacia su C-terminal (C-terminal). Cualquier secuencia así tendrá su N-terminal en el lado izquierdo y el C-terminal en el lado derecho de su presentación lineal.

El término TRAIL precedido por un número es utilizado en la especificación presente para denotar un aminoácido que tiene este número en la secuencia conocida de hTRAIL.

La proteína de fusión de la invención incorpora al menos un dominio (b) del péptido efector, unido en el C-terminal y/o en el extremo N-terminal de dominio (a).

En una modalidad particular, el dominio (a) es el fragmento de la secuencia hTRAIL, comenzando con un aminoácido del intervalo de hTRAIL95 a hTRAIL121 , inclusivo y terminando con el aminoácido hTRAIL 281.

En particular, el dominio (a) puede ser seleccionado del grupo que consiste de secuencias correspondientes a hTRAIL95-281, hTRAIL114-281 , hTRAIL119-281 , hTRAIL120-281 y hTRAIL121-281. Será evidente para los expertos en la técnica que hTRAIL95-281 , hTRAIL114-281 , hTRAIL116-281 , hTRAIL119-281 , hTRAILI 20-281 y hTRAIL121-281 representan un fragmento de proteína TRAIL humana comenzando con el aminoácido marcado con el número 95, 114, 116, 119, 120 y 121 , respectivamente, y terminando con el último aminoácido 281 , en la secuencia conocida de hTRAIL publicada en GenBank bajo el Acceso No. P50591 y presentado en el Listado de Secuencias de la presente invención como SEQ ID NO: 141.

En otra modalidad particular, el dominio (a) es un homólogo del fragmento funcional de la secuencia de proteína soluble hTRAIL iniciando en la posición del aminoácido no inferior a hTRAIL95 y terminando en el aminoácido hTRAIL281 , la secuencia de la cual es al menos en 70 %, preferiblemente en un 85 %, idéntica a la secuencia original.

En variantes específicas de esta modalidad el dominio (a) es un homólogo del fragmento seleccionado del grupo que consiste de secuencias correspondientes a hTRAIL95-281 , hTRAIL114-281 , hTRAIL 116-281 , hTRAILI 20-281 y hTRAIL121-281.

Debe entenderse que un homólogo del fragmento hTRAIL es una variación/modificación de la secuencia de aminoácidos de este fragmento, en donde al menos un aminoácido es cambiante, incluyendo 1 aminoácido, 2 aminoácidos, 3 aminoácidos, 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos y no más de 15 % de los aminoácidos, y en donde un fragmento de la secuencia modificada ha preservado la funcionalidad de la secuencia hTRAIL, es decir, la capacidad de unión a los receptores celulares de superficie de muerte e induciendo apóptosis en células de mamíferos. Modificación de la secuencia del aminoácido puede incluir, por ejemplo, sustitución, supresión o adición de aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos puede incluir, por ejemplo, la sustitución, la supresión, y/o la adición de aminoácidos.

Preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada muestra afinidad modificada a los receptores DR4 de muerte (TRAIL-R1) o DR5 (TRAIL-R2) en comparación con el fragmento nativo de hTRAIL.

El término "afinidad modificada" se refiere a la afinidad aumentada y/o la afinidad con selectividad alterada del receptor.

Preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada muestra una secuencia de afinidad aumentada a los receptores DR4 de muerte y DR5 comparado al fragmento nativo de hTRAIL.

Especialmente preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada muestra una afinidad aumentada al receptor DR5 de muerte en comparación con el receptor DR4 de muerte, es decir una selectividad DR5/DR4 aumentada.

También preferiblemente, el homólogo del fragmento de hTRAIL que tiene la secuencia modificada muestra una selectividad aumentada hacia los receptores DR4 de muerte y/o DR5 en relación con la afinidad hacia los receptores DR1 (TRAIL-R3) y/o DR2 (TRAIL-R4).

Las modificaciones de hTRAIL que tienen como resultado una afinidad y/o selectividad aumentada hacia los receptores de muerte DR4 y DR5 son conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo de la publicación Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apóptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8, que describe la mutación de D218H que tiene selectividad aumentada hacia DR4, o Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apóptosis. 2009 Jun;14(6):778-87, que describe la mutación de D269H que tiene una afinidad reducida hacia DR4. Los mutantes de hTRAIL que tienen como resultado una afinidad aumentada hacia un receptor seleccionado de DR4 y DR5 comparado con los receptores DR1 y DR2 y una afinidad aumentada hacia el receptor DR5 en comparación con DR4 también son descritos en WO2009077857 y WO2009066174.

Las mutaciones adecuadas son una o más mutaciones en las posiciones de hTRAL nativo seleccionado del grupo formado por aminoácidos 131, 149, 159, 193, 199, 201 , 204, 204, 212, 215, 218 y 251 , en particular, las mutaciones que implican la sustitución de un aminoácido con un aminoácido básico como la lisina, histidina o arginina o aminoácidos como el ácido aspargico o ácido glutámico. Particularmente una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en G131 R, G131 K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201 H, K201 R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251 D, K251 E y K251Q, como se describe en WO2009066174, pueden ser especificadas.

Las mutaciones adecuadas son también una o más mutaciones en las posiciones de hTRAIL nativo seleccionado del grupo formado por aminoácidos 195, 269 y 214, particularmente las mutaciones que implican la sustitución de un aminoácido con un aminoácido básico como la lisina, histidina o arginina. Especialmente una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en D269H, E195R, y T214R, como es descrito en WO2009077857, pueden ser especificadas.

En una modalidad particular, se selecciona el dominio (a) que es un homólogo del fragmento de hTRAIL de mutante D218H de la secuencia nativa TRAIL, como se describe en WO2009066174, o el mutante Y189N R191 K-Q193R-H264R-I266R-D269H de la secuencia nativa TRAIL, tal como se describe en Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apóptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87.

El dominio (a), es decir el fragmento de TRAIL, es un dominio responsable de la unión de la construcción de la proteína de fusión a receptores de muerte en la superficie de una célula. Además, el dominio (a) con la unión ejercerá su actividad agonística conocida, es decir la activación de la ruta extrínseca de apóptosis.

La proteína de fusión de la invención no comprende secuencias de dominios capaces de unirse a receptores de carbohidratos en la superficie celular. La unión a receptores de carbohidratos en la superficie celular es una unión no específica.

En particular, la proteína de fusión de la invención no comprende secuencias de dominios de lectinas (glicoproteínas) capaces de unirse a receptores de azúcar en la superficie celular. Mediante el dominio de lectina capaz de unirse a los receptores de carbohidratos en la superficie celular debe entenderse, en particular, tanto las subunidades (cadenas) A de toxinas de proteínas y fragmentos de las mismas, así como proteínas lectina que existen solas no acompañadas por dominios de una funcionalidad diferente, incluyendo la funcionalidad enzimática.

En otra modalidad, la proteína de fusión de la invención, excepto por el dominio(a), no incluye ningún otro dominio que se una a los receptores en la superficie celular.

El dominio (b) de la proteína de fusión de la invención es un dominio de un péptido efector- una toxina de péptido que inhibe el proceso de síntesis deproteínas dentro de la célula.

El péptido efector del dominio (b) de la proteína de fusión de la invención puede ser una toxina que inhibe la síntesis de proteínas por inhibición de la etapa de traducción del proceso de la síntesis de proteínas en la célula.

El péptido efector del dominio (b) de la proteína de fusión de la invención puede ser una toxina que inhibe la síntesis de proteínas por inhibición de la transcripción y la producción de ARN del proceso de la síntesis de proteínas en la célula.

En una modalidad la toxina de péptido es un péptido que inhibe enzimáticamente la traducción de la protelna al nivel del ribosoma. En esta modalidad de la invención, en una variante la toxina de péptido posee la actividad enzimática catalítica seleccionada de la actividad de N-glicosidasa, ribonucleasa y ADP-ribosiltransferasa.

Debe entenderse, como será evidente para los expertos en la técnica, que la toxina de péptido, además de su actividad principal como un péptido efector, puede poseer una o más de otras actividades que pueden resultar en la inhibición de la síntesis de proteínas en las células, como se describe por ejemplo en W. J. Pneumans et al., The FASEB Journal, 2001 , Vol. 15, str. 1493-1506.

Los péptidos efectores con actividad de N-glicosidasa realizan la modificación (depurinación) de ribosomas por el truncamiento de un residuo de adenina específico en la subunidad 60 de 28S rRNA. Esta modificación es irreversible y previene la unión del ribosoma con un factor de traducción EF, bloqueando así la traducción.

Los péptidos efectores que tienen actividad catalítica de N-glicosidasa pueden ser seleccionados del grupo de toxinas que consiste en la proteína inactivante de ribosoma de tipo 1 (RIP) (hemitoxinas), subunidades catalíticas (cadenas) Ade proteínas RIP de tipo 2 (holotoxinas), y su modificación con la actividad conservada de N-glicosidasa de por lo menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia original.

Las toxinas RIP tipo 1 con actividad de N-glicosidasa son proteínas monocatenadas que tienen un solo dominio catalítico.

Las siguientes toxinas de origen vegetal conocidas pueden ser mencionadas como péptidos efectores específicos del grupo de toxinas RIP de tipo 1 monocatenadas: gelonina (de Gelonium multiflorum), momordina (proteína aislada de plantas del género Momordica), saponaria (de Saponaria Offícinalis), dodecandrina (de Phytolacca dodecandra), bouganina (de Bougainvillea spectabilis), proteína PAP de hierba carmín (Phytolacca Americana), tricosantina (de Trichosanthes kirilowii), tricoanguina (de Trichosanthes anguina), agrostina (de Agrostemma githago), diantrina, P1 luffina (de Luffa cylindrica), momorcharina (de Momordica charantia) y tritina.

Secuencias ejemplares del péptido efector en esta modalidad se designan como SEQ ID NO: 55 (bouganina), SEQ ID NO: 58 (homólogo de la toxina PAP), SEQ ID NO: 59 (fragmento de saporina), SEQ ID NO: 60 (tricosantina), SEQ ID NO: 61 (trichoanguina), SEQ ID NO: 65 (luffina P1 ), SEQ ID NO: 67 (momorcharina), y SEQ ID NO: 78 (dominio catalítico de gelonina).

Ejemplos adicionales del péptido efector en esta modalidad son análogos de gelonina (SEQ ID NO: 198) y análogos de tricosantina con secuencia nativa modificada (SEQ ID NO: 199 y SEQ ID NO: 200).

Un ejemplo de tricosantina modificada es SEQ ID NO: 199, en donde la secuencia conocida de tricosantina fue modificada para disminuir la ¡nmunogenicidad de la toxina. A saber, en la secuencia conocida de tricosantina "YFF" 81-83 el motivo fue reemplazado por "ACS", análogamente "KR" los aminoácidos 173-174 fueron reemplazados por residuos "CG" (los números de los residuos de aminoácidos son consistentes con la secuencia publicada en GenBank: AAB22585.1) (An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep;13(5):637-43)).

Un ejemplo adicional de tricosantina modificada es SEQ ID NO: 200, en donde la secuencia conocida de tricosantina fue modificada de la siguiente manera. A saber, el motivo "YFF" 81-83 fue reemplazado por "ACS" para disminuir la inmunogenicidad de la toxina, los aminoácidos "KR" 173-174 fueron reemplazados por residuos "CG" (An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep;13(5):637-43) para reducir el problema de VLS (síndrome de filtración vascular), los residuos valina - 2 y 66 fueron reemplazados por alanina; y la leucina 132 fue reemplazada por glicina (los números de los residuos de aminoácidos son consistentes con la secuencia publicada en GenBank: AAB22585.1) (Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES.. Proc Nati Acad Sci U S A. 1999 Mar 30;96(7):3957-62)).

El análogo de Gelonina con mutación V70A de SEQ ID NO: 198 es conocido y descrito en la literatura (Baluna et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999).

El análogo de tricosantina diseñado como SEQ ID NO: 199 es conocido y descrito en la literatura (An Q, et al. J Biomed Sci. 2006 Sep;13(5):637-43).

El análogo de tricosantina designado como SEQ ID NO: 200 es novedoso y no fue descrito en la literatura.

Las toxinas RIP tipo 2 con actividad de N-glicosidasa son proteínas bicatenadas que tienen dominio catalítico (subunidad A) y dominio de unión de lectinas (subunidad B) capaz de unirse a los receptores de carbohidrato (azúcar) presentes en la superficie celular. De acuerdo con la invención, las subunidades catalíticas A de las toxinas RIP de tipo 2, desprovistas del dominio de unión de lectina, pueden usarse como péptidos efectores.

Como péptidos efectores de subunidades catalíticas de este tipo pueden mencionarse las siguientes toxinas vegetales: ricina (de Ricinnus communis), abrina (de Abbrus precatrius), modeccina (de Adenia digitata), viscumina (una toxina de muérdago Viscumalbum), volkensina (de Adenia volkensii), ebulina 1 (de Sambucus ebulus), nigrinab (de Sambucus nigra) y toxina bacteriana Shiga (de Shigella dysenteríae), o modificaciones de las mismas con actividad conservada de N-glicosidasa de por lo menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia original.

Secuencias ejemplares de efectores de péptido en esta modalidad se designan como SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 (subunidad A de ricina); y una variante de la subunidad A de ricina), SEQ ID NO: 195 (subunidad modificada A de ricina); SEQ ID NO: 62 (subunidad A de toxina de muérdago), SEQ ID NO: 63 (subunidad A de ebulina 1 ), SEQ ID NO: 64 (subunidad A de nigrina b), SEQ ID NO: 66 (subunidad A de volkensina), SEQ ID NO: 70 (una variante de la subunidad A de la toxina Shiga), y SEQ ID NO: 82 (subunidad A de abrina); SEQ ID NO: 194 (subunidad A modificada de abrina como se describe en Baluna et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999 con mutaciones V71A, G1 15A y S232Q, los números de los residuos de aminoácidos son consistentes con la secuencia publicada en GenBank CAA38655.1 ).

Secuencias ejemplares de efectores de péptido en esta modalidad se designan como SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57 (subunidad A de ricina y una variante de la subunidad A de ricina), SEQ ID NO: 195 (subunidad modificada A de ricina como se describe en Baluna et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999, con deleción de 78 LDV 80, los números de los residuos de aminoácidos son consistentes con la secuencia publicada en GenBank ABG65738.1 ); SEQ ID NO: 62 (subunidad A de toxina de muérdago), SEQ ID NO: 63 (subunidad A de ebulina 1), SEQ ID NO: 64 (subunidad A de nigrina b), SEQ ID NO: 66 (subunidad A de volkensina), SEQ ID NO: 70 (una variante de la subunidad A de la toxina Shiga), y SEQ ID NO: 82 (subunidad A de abrina); SEQ ID NO: 194 (subunidad A modificada de abrina como se describe en Baluna et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999; con mutaciones V71A, G1 15A y S233Q, los números de los residuos de aminoácidos son consistentes con la secuencia publicada en GenBank CAA38655.1 Los péptidos efectores con actividad catalítica de ribonucleasa (también llamados ribotoxinas) pertenecen a las endonucleasas y disocian a los enlaces de fosfodiéster en 28SrARN, así llevando a la inhibición del ribosoma y deteniendo la traducción. Como péptidos efectores de este grupo pueden ser mencionados toxinas de hongos alfa-sacrina, mitogillina, restrictocina de Aspergillus restrictos, e hirsutelina (de Hirsutella thompsonii).

Secuencias ejemplares del péptido efector en esta modalidad se designan como SEQ ID NO: 71 (restrictocina) y SEQ ID NO: 72 (hirsutelina).

Los péptidos efectores con actividad catalítica deADP-ribosiltransferasa causan ADP-ribosilación y así la inactivación de los componentes de la maquinaria de la síntesis de proteínas, principalmente el factor de alargamiento/traducción EF-2, y la inhibición de la traducción. A este grupo de péptidos efectores pertenecen los dominios catalíticos de la toxina de la difteria de Corynebacterium diphtheriae, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, y modificaciones de las mismas con actividad conservada de ADP-ribosiltransferasa de por lo menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia original.

Las modificaciones del dominio catalítico de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa y la toxina de la difteria pueden ejemplarmente comprender el truncamiento del fragmento terminal del péptido, así como sustituciones o deleciones en el dominio catalítico o fragmentos de los mismos. Algunas sustituciones y deleciones adecuadas se revelan en Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800; Onda M et al.. Proc Nati Acad Sci U S A. 201 1 Apr 5;108(14):5742-7.

Secuencias ejemplares de efectores de péptido en esta modalidad son las conocidas del dominio catalítico A de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa designada como SEQ ID NO: 69 (secuencia nativa del dominio catalítico A), y sus análogos mutados designados como SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 201 ; SEQ ID NO: 202; SEQ ID NO: 203; SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207.

Secuencias ejemplares de efectores de péptido en esta modalidad es la conocida exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa designada como SEQ ID NO: 68, y sus análogos designados como SEQ ID NO: 69; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 201 ; SEQ ID NO: 202; SEQ ID NO: 203; SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207.

Análogos de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa designada como SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO; 84, SEQ ID NO: 203 y SEQ ID NO: 206 son conocidos y descritos en la literatura.

Análogos de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa designada como SEQ ID NO: 201 ; SEQ ID NO: 202; SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 205; y SEQ ID NO: 207 son novedosos y no se describen en la literatura.

La SEQ ID NO. 203 conocida es una varainte de HA22-LR- 8 de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa como se describe en Onda et al.. Proc Nati Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7 con 8 mutaciones que reducen la inmunogenicidad.

La SEQ ID NO. 206 conocida es una variante de deleción de HA22 -LR de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa como se describe en Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800.

La SEQ ID NO: 201 novedosa es un análogo del dominio catalítico de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, en donde mutaciones de tres puntos de R318K, N441Q y R601 K fueron introducidas en la secuencia conocida para reducir la inmunogenicidad (los números de los residuos de aminoácidos son consistentes con la secuencia publicada en GenBank AAB59097.1) La SEQ ID NO: 202 novedosa es una variante de deleción de A2 -LR del dominio catalítico de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa como se describe en Weldon JE et al., Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800, con mutaciones adicionales introducidas disminuyendo la inmunogenicidad como se describe en Choe , Webber KO, Pastan I. Cáncer Res. 1994 Jul 1 ; 54(13): 3460-7 y otras mutaciones como se describe en WO 2007/016150.

La SEQ ID NO: 204 novedosa es una variante del dominio catalítico de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, que es una combinación de variantes de HA22 M3 (deleción y mutación C312S) como se describe en Weldon JE et al. Blood. 2009 Apr 16;1 13(16):3792-800 y variante de HA22 8M con 8 mutaciones que reducen la inmunogenicidad descrita en Onda M et al. Proc Nati Acad Sci U S A. 2011 Apr 5;108(14):5742-7).

La SEQ ID NO: 205 novedosa es una variante del dominio catalítico de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa que es una combinación de la variante de HA22 M3 como se describe en Weldon JE et al. Blood. 2009 Apr 16;113(16):3792-800, es decir con deleción y mutación C312S, 8 mutaciones que reducen la inmunogenicidad como se describe en Onda M et al. Proc Nati Acad Sci U S A. 201 1 Apr 5;108(14):5742-7, con deleción adicional de una región de sitio de disociación reconocida por la furina presente en la toxina nativa de Pseudomonas aeruginosa.

La SEQ ID NO: 207 novedosa es una variante del dominio catalítico de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa que es una combinación de la variante HA22 M3 descrita en Weldon JE et al. Blood. 2009 Apr 16;1 3(16):3792-800, es decir deleción y mutación C312S, variante de HA22 8M descrita en Onda M et al. Proc Nati Acad Sci U S A. 201 1 Apr 5¡ 108(14):5742-7, es decir 8 mutaciones que reducen la inmunogenicidad, y con mutación adicional de R601 K.

Otras secuencias ejemplares de efectores de péptido en esta modalidad son la conocida subunidad A de la toxina de difteria (dominio catalítico) y sus fragmentos activos conocidos designados como SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, y SEQ ID NO: 81 , SEQ ID NO: 196 (subunidad A de la toxina de difteria modificada al introducir dos mutaciones V7A y V27A. Las modificaciones se eligieron para eliminar el VLS (síndrome de filtración vascular) debido a Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc Nati Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3957-62) y SEQ ID NO: 197 (toxina de la difteria fue modificada al introducir la deleción de tres aminoácidos 6VDS9 y mutación V29A. para eliminar el VLS (síndrome de filtración vascular) debido a Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc. Nati. Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3957-62).

El péptido efector del dominio (b) de la proteína de fusión de la invención puede ser una toxina de péptido que inhibe la síntesis de proteínas perteneciente al sistema de toxina-antitoxina, conocido por ejemplo en bacterias. Tales toxinas pueden bloquear la síntesis de proteínas actuando vía diferentes mecanismos: uniéndose con una membrana celular y llevando así a un rápido colapso del potencial de la membrana y un concomitante paro de la respiración; la inhibición de las polimerasas (ADN y ARN) para unirse a la topoisomerasa; o actuar como endoribonucleasa (ARNasa).

Ejemplos de toxinas que son componentes de un sistema de toxina-antitoxina con actividad de mRNasa son: Proteína StaB con actividad de RNasa (Szymanik M., Tesis doctoral. 2006. Warsaw University, Warsaw) designada como SEQ ID NO: 77; Toxina Kid de Salmonella typhi (Bravo A, de Torrontegui G, Díaz R. Identification of components of a new stability system of plasmid R1, ParD, that is cióse to the orígin of replication of this plasmid. Mol Gen Genet. 1987 Nov; 210(1):101-10), y RelE toxina de Escherichia coli (Gotfredsen M, Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a New toxin-antitoxin gene family. Mol Microbiol. 1998 Agosto;29(4): 1065-76) designada como SEQ ID NO: 73 (proteína Kid) y SEQ ID NO: 76 (proteína RelE).

Ejemplos de toxinas que son constituyentes de un sistema de toxina-antitoxina que inhibe las polimerasas al unirse a topoisomerasas son toxinas de la familia de CcdB Escherichia coli proteínas y variantes de las mismas con actividad conservada de degradación de ADN e inhibición de RNApolimerasa, por ejemplo toxina CcdBET2 (E. Trovatti et al, Bioorg Med Chem Lett. 2008 Dec 1 ;18(23):6161-4). Secuencias ejemplares del péptido efector en esta modalidad se designan como SEQ ID NO: 74 (proteína CcdB) y SEQ ID NO: 75 (variante de proteína CcdB).

Ejemplos de toxinas que son constituyentes de un sistema de toxina-antitoxina que se unen con una membana celular y llevan así a un rápido colapso del potencial de membrana y un concomitante paro de la respiración son proteínas básicas, pequeñas que contienen tramos largos de residuos hidrofóbicos que se insertan en TisB y Hok de la membrana citoplasmática. La inserción en la membrana de Hok o TisB causa pérdida del potencial electroquímico, que cuenta para una disminución en el ATP intracelular. Entonces, ambos de TisB y Hok pueden matar células por daño de la membrana bacteriana (Unoson C, Wagner EG. A small SOS-induced toxin is targeted against the inner membrane in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2008 Oct;70(1 ):258-70. Epub 2008 Aug 29). Una secuencia ejemplar del péptido efector en esta modalidad es designada como SEQ ID NO: 208).

Como se mencionó antes, algunos péptidos efectores son novedosos y no fueron descritos antes.

Asi, la invención se refiere a péptidos novedosos seleccionados del grupo que consiste en una variante mutada de tricosantina de SEQ ID NO: 200, una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 201 , una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 202, una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 204, una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 205, y una variante mutada de la subunidad A catalítica de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 207.

Estos péptidos novedosos encuentran utilidad en particular como péptido efector del dominio (b) de la proteína de fusión anticancerígena de la invención.

Estos péptidos novedosos son diseñados específicamente para disminuir la inmunogenicidad del péptido parental.

Así, la característica específica de éstos péptidos novedosos es una baja inmunogenicidad.

Ventajosos son los péptidos seleccionados del grupo que consiste en una variante mutada de tricosantina de SEQ ID NO: 200.

También ventajosos son los péptidos seleccionados del grupo que consiste en una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 201.

También ventajosos son los péptidos seleccionados del grupo que consiste en una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 202.

También ventajosos son los péptidos seleccionados del grupo que consiste en una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 204, una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 205, y una variante mutada de la subunidad A catalítica de la toxina de Pseudomonas aeruginosa de SEQ ID NO: 207.

Tras la unión a receptores TRAIL presentes en la superficie de las células cancerígenas, la proteína de fusión ejercerá un efecto doble. El dominio (a), que es un fragmento funcional de TRAIL o su homólogo con funcionalidad conservada, ejercerá su actividad agonística conocida, es decir, la unión a los receptores de muerte sobre la superficie celular y la activación de la vía extrínseca de la apóptosis. El péptido efector del dominio (b) de la proteína de fusión será capaz potencialmente de ejercer su acción intracelular en paralelo a la actividad del dominio TRAIL por inhibición de la síntesis de proteínas en las células tumorales.

La activación del péptido efector - dominio funcional (b) después de la internalizacion de la proteína de fusión en la célula puede ocurrir no específicamente por una disociación del dominio (a) del dominio (b) de la proteína de fusión de la invención por enzimas lisosomales (proteasas no específicas).

Preferiblemente, sin embargo, la proteína de fusión comprende el dominio de un sitio de disociación reconocido por proteasas presentes en el ambiente de la célula.

Así, en modalidades preferidas de la invención, el dominio (a) y el dominio (b) están enlazados por lo menos por un dominio (c) que comprende la secuencia de un sitio de disociación reconocido por proteasas presentes en el ambiente de la célula, especialmente en el ambiente de la célula de tumor, por ejemplo tal como metaloproteasa, urocinasa o furina.

Las secuencias reconocidas por la proteasa pueden ser seleccionadas de: - una secuencia reconocida por la metaloproteasa MMP Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP,o fragmento del mismo que con el último aminoácido de la secuencia a la que está unida forma una secuencia reconocida por la metaloproteasa MMP, una secuencia reconocida por urocinasa uPA Arg Val Val Arg/RWR, o fragmento del mismo, que con el último aminoácido de la secuencia a la que está unida forma una secuencia reconocida por urocinasa, y combinaciones de las mismas, o - una secuencia reconocida por furina Arg Gln Pro Arg/RQPR, Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG, Arg Lys Lys Arg/RKKR) u otras secuencias atípicas reconocidas por la furina revelada por M. Gordon et all. Inlnf. y lmmun,1995, 63, No. 1 ,p. 82-87 o secuencia nativa reconocida por la furina Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu (RHRQPRGWEQL).

En una de las modalidades de la invención, el sitio de disociación de proteasa es una combinación de la secuencia reconocida por la metaloproteasa MMP y/o una secuencia reconocida por la urocinasa uPA y/o una secuencia reconocida por la furina localizada una a lado de la otra en cualquier orden.

Preferiblemente, en una de las modalidades el dominio (c) es una secuencia reconocida por la furina seleccionada de Arg Gln Pro Arg/RQPR, Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG, Arg Val Lys Arg/RVKR y Arg Lys Lys Arg/RKKR.

Las proteasas metaloproteasa MMP, urocinasa uPA y furina se sobreexpresan en el ambiente del tumor. La presencia de la secuencia reconocida por la proteasa permite la disociación del dominio (a) del dominio (b), es decir la liberación del dominio funcional (b) y así su activación acelerada.

La presencia del sitio de disociación de proteasa, al permitir una rápida liberación del péptido efector, aumenta las oportunidades de transportar el péptido al lugar de su acción como resultado del corte del fragmento hTRAIL por medio de la proteasa sobreexpresada en el ambiente del tumor antes de que ocurra la degradación aleatoria de la proteína de fusión por proteasas no específicas.

En este aspecto, los péptidos efectores preferidos son la toxina de la difteria y la exotoxina de Pseudomonas, que contienen secuencias naturales del sitio de disociación reconocido por la furina Arg Val Arg Arg/RVRR (toxina de la difteria) y Arg Gln Pro Arg Gly/RQPRG (exotoxina de Pseudomonas).

Además, se puede conectar un dominio de transporte (d) a un dominio (b) del péptido efector de la proteína de fusión de la invención.

El dominio (d) puede ser seleccionado del grupo que consiste en: - (d1) un dominio que transporta a través de la membrana celular derivada de Pseudomonas aeruginosa, - (d2) un dominio que transporta a través de la membrana apuntando al retículo endoplasmático, y - (d3) una secuencia de poliarginina que transporta a través de la membrana celular, que consiste en los residuos 6, 7, 8, 9, 10 ú 11 (Arg/R), o fragmentos de los mismos, que con el último aminoácido de la secuencia a la que están unidos, forman secuencias de transporte de los dominios (d1), (d2) o (d3), y - combinaciones de las mismas.

La combinación de dominios (d1) (d2) y (d3) puede comprender, en particular, la combinación de (d1)/(d2), (d1)/(d3) o (d1)/(d2)/(d3).

Además, la combinación de los dominios (d1), (d2) y (d3) puede incluir los dominios localizados uno enseguida del otro y conectados a un extremo del dominio (b) y/o dominios enlazados a diferentes extremos del dominio (b).

Debe entenderse que en el caso cuando la proteína de fusión tiene tanto el dominio de transporte (d) unido al dominio (b) y dominio (c) del sitio de disociación entre dominios (a) y (b), entonces el dominio (c) se encuentra de tal manera que después de la disociación del dominio de transporte de construcción (d) permanece unido al dominio (b). En otras palabras, si la proteína de fusión contiene el dominio de transporte (d) y el dominio de sitio de disociación (c), entonces el dominio (d) se encuentra entre el dominio (b) y dominio (c), o se encuentra en el extremo del dominio (b) opuesto al lugar de unión de dominio (d).

La invención comprende también una variante, en la que el dominio (d), preferiblemente el dominio de traslocacion de Pseudomonas aeruginosa, está ubicado entre dos dominios (c), es decir la variante en donde después de la disociación de la construcción del dominio de transporte, preferiblemente la traslocacion del dominio de Pseudomonas aeruginosa, no se fija a ninguno del dominio TRAIL ni al dominio del péptido efector.

La invención no comprende tal variante en la que el dominio (d) se encuentra entre el dominio (c) y el dominio (a), esta es la variante en donde después de la disociación de la construcción el dominio de transporte permanece unido al dominio TRAIL.

El dominio de transporte que es un dominio de traslocacion de una toxina de Pseudomonas aeruginosa u otro fragmento de un dominio que transporta a través de las membranas lisosomales derivadas de la toxina de Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de traslocarse a través de la membrana celular y puede ser usado para introducir el péptido efector a los compartimientos de las células de tumor. La secuencia del dominio" de traslocacion de Pseudomonas aeruginosa es bien conocida y se designa por la SEQ ID NO: 139.

Preferiblemente, el dominio de traslocacion de Pseudomonas aeruginosa se localiza entre los dominios (a) y (b) y además separado por los dominios (c).

También preferiblemente, el dominio (d2) que transporta al retículo endoplasmático está unido al C-terminal del péptido efector y localizado en el C-terminal de la proteína de fusión de la invención.

También preferiblemente, la secuencia de poliarginina que transporta a través de la membrana celular está unida al C-terminal del péptido efector y localizada entre el péptido efector y el dominio (a); preferiblemente, está además separada del dominio (d) por medio del dominio (c).

La secuencia (d2) que dirige al retículo endoplasmático puede ser cualquier secuencia de señal conocida en la técnica que dirige al retículo endoplasmático, tal como por ejemplo y no limitado a Lys Asp Glu Leu/KDEL, His Asp Glu Leu/HDEL, Arg Asp Glu Leu/RDEL, Asp Asp Glu Leu/DDEL, Ala Asp Glu Leu/ADEL, Ser Asp Glu Leu/SDEL, y Lys Glu Asp Leu/KEDL.

El dominio (d2) es preferiblemente seleccionado de Lys Asp Glu Leu/KDEL y Lys Glu Asp Leu/KEDL.

Preferiblemente, la secuencia de transporte (d2) se localiza en el C-terminal de la proteína de fusión de la invención.

En otra modalidad, entre el dominio (a) y el dominio (b) está además localizado un dominio (e) que comprende una secuencia apropiada para la unión de una molécula PEG a la proteína de fusión (enlazador de pegilación). Tal enlazador puede ser la secuencia conocida Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE. El enlazador de pegilación puede ser también seleccionado del grupo siguiente: Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA, Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS, y Ser Gly Cys Gly Ser/SGCGS.

Preferiblemente, la secuencia del enlazador de pegilación es Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE.

Aparte de los elementos funcionales principales de la proteína de fusión y el dominio(s) del sitio de disociación, la proteína de fusión de la invención puede contener una secuencia/secuencias neutras de un enlazador estérico flexible. Tales enlazadores esféricos son bien conocidos y descritos en la literatura. Su incorporación en la secuencia de la proteína de fusión pretende proporcionar el plegado correcto de las proteínas producidas por el proceso de su sobreexpresión en las células hospederas, el enlazador estérico puede ser un enlazador de glicina, glicina-serina o glicina-cisteína-alanina.

En particular, el enlazador estérico puede ser una combinación de residuos de glicina y serina, tal como por ejemplo Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS o cualquier fragmento de los mismos que actúa como enlazador estérico, por ejemplo un fragmento Gly Gly Gly Ser/GGGS, Gly Gly Gly/GGG o Gly Gly Gly Gly/GGGG. En otra modalidad, el enlazador estérico puede ser cualquier combinación de residuos de glicina, serina y alanina, tal como por ejemplo Ala Ser Gly Gly/ASGG o cualquier fragmento de los mismos, que actúa como enlazador estérico, por ejemplo AlaSerGIy/ASG. Es también posible usar la combinación de enlazadores estéricos, por ejemplo la secuencia GlyGlyGlySerGIy/ GGGGS o cualquier fragmento del mismo que actúa como enlazador estérico, por ejemplo un fragmento Gly Gly Gly/GGG, con otro fragmento que actúa como enlazador estérico. En tal caso el enlazador estérico puede ser una combinación de residuos de glicina, serina y alanina, tal como por ejemplo Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG. En incluso otra modalidad, el enlazador estérico puede ser una combinación de residuos de serina e histidina Ser His His Ser/SHHS o Ser His His Ala Ser/SHHAS.

En otra modalidad, el enlazador estérico puede ser una combinación de residuos de alanina y cisteína, tal como por ejemplo CAAACAAC (Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys), CAACAAAC (Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys) o fragmentos de los mismos.

En otra modalidad, los enlazadores estéricos adecuados se forman por combinación de cualquier tipo de enlazadores estéricos como se mencionó antes. Ejemplos de tales combinaciones se representan por: Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (GGGGGSGGGGS), Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys (GGGCAAACAAC) , y Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys (GGGGSGGGCAAACAAC).

En una modalidad, el enlazador estérico puede ser también seleccionado de un solo residuo de aminoácido, tal como un solo residuo de cisteína.

Además, el enlazador estérico puede también ser útil para la activación del dominio funcional (b), que existe en una manera no específica. La activación del dominio (b) en una manera no específica puede ser realizada cortando el dominio (a) del dominio (b) de la proteína de fusión de acuerdo con la invención, debido a la hidrólisis dependiente del pH del enlazador estérico.

Además, la proteína de fusión de la invención puede comprender un enlazador que contiene un motivo que se une a integrinas. Tal enlazador proporciona una unión adicional a la superficie celular y puede reducir la toxicidad sistémica.

Las integrinas son heterodímeros alfa-beta presentes en la superficie de muchos tipos de células. Los ligandos para las integrinas son proteínas de adhesión de matriz celular tales como fibronectina, colágenos, y laminina. En el caso de fibronectina y algunos otros ligandos, un motivo RGD es responsable de la interacción con las integrinas. Los péptidos que contienen este motivo específicamente reconocen a la integrina alfa 5 beta 1 y tienen un efecto inhibidor en la invasión de las células de tumor al limitar su capacidad de formar metástasis (Ghelsen et al., (1988) J. Cell Biol. 106 925-930). Usando un método de despliegue de fago de la biblioteca de péptidos de 6-aminoácidos se aisló una secuencia que comprende el motivo NGR, que se une y reconoce específicamente a la integrina alfa 5 beta 1 (Koivunen et al.., J Biol Chem. 1993 Sep 25;268(27):20205-10). También se demostró que dos motivos (NGR y RGD) se unen como antagonistas a otros factores involucrados en la angiogénesis. El RGD interactúa también con las integrinas específicamente sobre-presentadas en el proceso de neovascularización (Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct av integríns. Science (Washington DC), 270:1500-1502, 1995), mientras que el NGR interactúa con la aminopeptidasa N, una proteína también implicada en la invasión del cáncer, particularmente fuertemente expuesto en los vasos sanguíneos de tumores y otras células sometidas a angiogénesis intensa (Pasqualini et al., Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogénesis. Cáncer Res. 2000 Feb 1 ;60(3):722-7).

El enlazador de la proteína de fusión de la invención capaz de unirse con las integrinas comprende el motivo Asn GIy Arg (NGR), Asp Gly Arg (DGR) o Arg Gly Asp (RGD).

En una modalidad preferida de la proteína de la invención, un enlazador que comprende una unión de motivo con integrinas es designado por SEQ ID NO: 140.

La SEQ ID NO: 140 (Cys Phe Cys Asp Gly Arg Cys Asp Cys Ala/CFCDGRCDCA) comprende el motivo Asp Gly Arg (DGR) estabilizado por secuencias de cisteína y es conocido y descrito en Wang H, Yan Z, Shi J, Han W, Zhang Y protein Expr Purif. 2006 Jan; 45(1 ): 60-5.

Modalidades particulares de la proteína de fusión de la invención son proteínas de fusión que comprenden un péptido que actúa intracelularmente por la inhibición del proceso de traducción, seleccionado del grupo de péptidos designado por: SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 , SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 , SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166; SEQ ID NO: 167, y SEQ ID NO: 168.

La actividad anticáncer de TRAIL en la proteína de fusión de acuerdo con la invención puede potencialmente aumentar por la activación de otros componentes tales como por ejemplo depurinación de adenina en 28SrRNA, ADP-ribosilación del factor EF2, N-glicosilación de adenina en 28SRNA, disociación de 28SRNA, disociación de ARNm o degradación de ADN, resultando en la inhibición de la síntesis de proteínas y así las reacciones de bloqueo de las células al nivel del proteoma, que reducen la sobreproducción de proteínas que bloquean la ruta de la apóptosis y finalmente reestablecen la ruta de la apóptosis. Además, el bloqueo del proceso de la síntesis de proteínas en las células se puede activar por puntos de control del ciclo celular (tal como las cinasas dependientes de ciclina) internalmente inducen apóptosis, en sinergia con la señal que resulta de la unión de TRAIL a los receptores funcionales celulares de la serie DR.

Se encontró que las proteínas de fusión de la invención exhiben en muchos casos una actividad más potente que el TRAIL soluble y sus variantes incluyendo fragmentos de la secuencia. Asimismo, entre los péptidos conocidos efectores usados en la proteína de fusión de la invención, sólo la toxina de la difteria fusionada a interleucina-2 (Ontake®) ha sido usada en medicina. Otros péptidos efectores usados en la proteína de fusión de la invención no han sido aplicados en medicina como tal, debido a la cinética desfavorable, rápida degradación por proteasas no específicas, y acumulación en el cuerpo causada por la falta de ruta de secuencia de activación adecuada necesaria para permitir el funcionamiento del péptido efector en el sitio objetivo. La incorporación de la proteína de fusión habilita su suministro selectivo al lugar donde su acción es deseada.

Además, la unión del péptido efector aumenta el peso de la proteína, que resulta en una vida media prolongada y aumento en la retención de la proteína en el tumor y en consecuencia aumenta su eficiencia. Además, en muchos casos, la nueva proteína de fusión supera una resistencia natural o inducida a TRAIL, probablemente a través de la desestabilización de la maquinaria celular responsable de la síntesis de proteínas. Ya que las células de cáncer pueden adquirir resistencia a la actividad citotóxica de TRAIL, entre otros por la sobreproducción de proteínas que bloquean la ruta de apóptosis (Bcl-2, IAP, XIAP o cFLIP), parece que el bloqueo del mecanismo celular de la síntesis de proteínas puede llevar al bloqueo de la reacción de las células al nivel del proteoma y así desbloquear la ruta de la apóptosis.

Una descripción detallada de la estructura de proteínas de fusión representativas mencionadas antes se muestra en los Ejemplos que se presentan posteriormente.

De acuerdo con la presente invención, la proteína de fusión significa una molécula de proteína única que contiene dos o más proteínas o sus fragmentos, covalentemente enlazadas a través del enlace de péptido dentro de sus cadenas de péptido respectivas, sin enlazadores químicos adicionales.

La proteína de fusión también puede ser descrita alternativamente como una construcción de proteína o una proteína quimérica. De acuerdo con la presente invención, los términos "construcción" o "proteína quimérica", si se utilizan, deben entenderse como refiriéndose a la proteína de fusión, como se define anteriormente.

Para una persona con experiencia en la técnica será evidente que la proteína de fusión así definida puede ser sintetizada por métodos conocidos de la síntesis química de péptidos y proteínas.

La proteína de fusión puede ser sintetizada por métodos de síntesis de péptido químico, especialmente usando las técnicas de síntesis de péptido en fase sólida usando resinas adecuadas como portadores. Tales técnicas son convencionales y son conocidas en la técnica, y descritas entre otros en las monografías, tales como por ejemplo Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer- Verlag, New York, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company.

La proteína de fusión puede ser sintetizada por los métodos de síntesis química de péptidos como una proteína continua. Alternativamente, los fragmentos individuales (dominios) de proteína pueden ser sintetizados por separado y luego combinados junto con un péptido continuo a través de un enlace de péptido, por condensación del término amino de un fragmento de péptido del término carboxilo del segundo péptido. Dichas técnicas son convencionales y bien conocidas.

Preferiblemente, sin embargo, la proteína de fusión de la invención es una proteína recombinante, generada por métodos de expresión génica de una secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de fusión en las células hospederas.

Para la verificación de la estructura del péptido resultante, métodos conocidos del análisis de la composición de aminoácido de los péptidos pueden utilizarse, como la técnica de espectrometría de masas de alta resolución para determinar el peso molecular del péptido. Para confirmar la secuencia de péptidos los secuenciadores de proteína también pueden ser utilizados, los cuales secuencialmente degradan el péptido e identifican la secuencia de aminoácidos.

Un aspecto adicional de la invención es la secuencia de polinucleótido, especialmente la secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión como se define anteriormente.

Preferiblemente, la secuencia de polinucleótido, particularmente ADN, de acuerdo con la invención, que codifica la proteína de fusión como se define anteriormente, es una secuencia optimizada para expresión en E. coli.

Otro aspecto de la invención también es un vector de expresión que contiene la secuencia de polinucleotido, particularmente la secuencia de ADN de la invención como se define anteriormente.

Otro aspecto de la invención es también una célula hospedera que comprende un vector de expresión como se define anteriormente.

Una célula hospedera preferida para la expresión de proteínas de fusión de la invención es una célula de E. coli.

Métodos para la generación de proteínas recombinantes, incluyendo proteínas de fusión, son bien conocidos. En resumen, esta técnica consiste en la generación de la molécula de polinucleotido, por ejemplo molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácido de la proteína objetivo y dirige la expresión de la proteína objetivo en el hospedero. Entonces, la proteína objetivo que codifica la molécula de polinucleotido se incorpora en un vector de expresión adecuado, lo que asegura una eficiente expresión del polipéptido. El vector de expresión recombinante después se introduce en las células hospederas para la transfección/transformación, y como un resultado se produce una célula hospedera transformada. Esto es seguido por un cultivo de células transformadas para sobre-expresar la proteína objetivo, la purificación de proteínas obtenidas y, opcionalmente corte por la disociación de secuencias de etiqueta utilizadas para la expresión o purificación de la proteína.

Técnicas adecuadas de expresión y purificación se describen, por ejemplo en la monografía Goeddel, Gene Expression Technology, ethods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), y A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995.

Cósmidos, plásmidos o virus modificados pueden ser utilizados como vectores de expresión para la introducción y la réplica de secuencias de ADN en células hospederas. Normalmente se utilizan plásmidos como vectores de expresión. Plásmidos adecuados son bien conocidos y comercialmente disponibles.

El vector de expresión de la invención comprende una molécula de polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención y las secuencias de regulación necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación incorporada en una célula hospedera adecuada. La selección de secuencias reguladoras es dependiente del tipo de células hospederas y puede realizarse fácilmente por una persona con experiencia en la técnica. Ejemplos de dichas secuencias reguladoras son promotores transcripcionales y potenciadores o secuencia de unión de polimerasa de ARN, secuencia de unión de ribosoma, que contiene la señal de inicio de transcripción, insertada antes de la secuencia de codificación, y secuencia terminadora de transcripción, insertada después de la secuencia de codificación. Además, dependiendo de la célula hospedera y el vector utilizado, otras secuencias pueden ser introducidas en el vector de expresión, tal como el origen de replicación, sitios de restricción de ADN adicionales, potenciadores y secuencias que permiten la inducción de transcripción.

El vector de expresión también comprenderá una secuencia del gen marcador, que confiere el fenotipo definido a la célula transformada y permite la selección específica de las células transformadas. Además, el vector también puede contener una segunda secuencia marcadora que permite distinguir las células transformadas con un plásmido recombinante que contiene secuencia de codificación insertada de la proteína objetivo de aquellas que han tomado el plásmido sin inserto. Más frecuentemente, se usan marcadores de resistencia a antibióticos usuales, sin embargo, cualquiera de otros genes reporteros conocidos en el campo se pueden usar, cuya presencia en una célula (in vivo) puede determinarse fácilmente usando técnicas de auto-radiografía, espectrofotometría o bio y quimioluminiscencia. Por ejemplo, dependiendo de la célula hospedera, pueden ser utilizados los genes reporteros tales como ß-galactosidasa, ß-glucuronidasa, luciferasa, cloramfenicol acetiltransferasa o proteína fluorescente verde.

Además, el vector de expresión puede contener la secuencia de señal, proteínas de transportación al compartimiento celular apropiado, por ejemplo periplasma, donde se facilita el plegamiento. Adicionalmente una secuencia de codificación de una marca/etiqueta, tal como HisTag unida al N-terminal o GST unida al C-terminal, puede estar presente, lo que facilita la purificación posterior de la proteína producida utilizando el principio de afinidad, a través de la cromatografía de afinidad en una columna de níquel. Secuencias adicionales que protegen la proteína contra la degradación proteolítica en las células hospederas, así como secuencias que aumentan su solubilidad también pueden estar presentes.

El elemento auxiliar unido a la secuencia de la proteína objetivo puede bloquear su actividad, o ser perjudicial por otra razón, como por ejemplo debido a su toxicidad. Dicho elemento debe ser removido, lo que puede lograrse mediante disociación enzimática o química. En particular, una etiqueta HisTag de seis histidinas u otros marcadores de este tipo unidos para permitir la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad deben removerse, debido a su efecto descrito en la toxicidad hepática de la proteína TRAIL soluble. Los sistemas de expresión heterologos basados en varias células hospederas bien conocidas pueden ser utilizados, incluyendo células procarióticas: bacterianas, tales como Escherichia coli o Bacillus subtilis, levaduras tales como Saccharomyces cervisiae o Pichia pastoris, y líneas celulares eucarióticas (insectos, mamíferos, plantas).

Preferiblemente, debido a la facilidad de cultivo y manipulación genética, y una cantidad grande de producto obtenido, el sistema de expresión de E. coli es utilizado. En consecuencia, la secuencia de polinucleótidos que contiene la secuencia objetivo que codifica la proteína de fusión de la invención será optimizada para la expresión en E. coli, es decir, contendrá en la secuencia codones óptimos para la expresión en E.coli, seleccionados de las posibles variantes de secuencia conocidas en el estado de la técnica. Además, el vector de expresión contendrá los elementos descritos antes convenientes para E. coli unidos a la secuencia de codificación.

Por consiguiente, en una modalidad preferida de la invención una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión de la invención, optimizada para la expresión en E. coli es seleccionada del grupo de secuencias de polinucleótido que consiste en: SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO:86; SEQ ID NO:87; SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; SEQ ID NO:90; SEQ ID NO:91 ; SEQ ID NO:92; SEQ ID NO:93; SEQ ID NO:94; SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; SEQ ID NO:97; SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 101 ; SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:104; SEQ ID NO:105; SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO:107; SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 1 1 1 ; SEQ ID NO: 1 12; SEQ ID NO: 1 13; SEQ ID NO: 1 14; SEQ ID NO: 1 15; SEQ ID NO: 1 16; SEQ ID NO: 1 17; SEQ ID NO: 1 18; SEQ ID NO: 1 19; SEQ ID NO: 1 20; SEQ ID NO: 121 ; SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 123; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127; SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; SEQ ID NO:130; SEQ ID NO: 131 ; SEQ ID NO:132; SEQ ID NO: 1 33; SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO:136;SEQ ID NO: 1 37;SEQ ID NO: 138.SEQ ID NO: 169; SEQ ID NO: 170; SEQ ID NO: 171 ; SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 174; SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO: 177; SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; SEQ ID NO: 1 80; SEQ ID NO: 181 ; SEQ ID NO: 182; SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 184; SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; SEQ ID NO: 187; SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; SEQ ID NO: 190; SEQ ID NO: 191 ; SEQ ID NO: 192 y SEQ ID NO: 193; que codifican una proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos, respectivamente: SEQ ID NO: 1 ; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 ; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 ; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51 ; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54144; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; SEQ ID NO: 147; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151 ; SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 153; SEQ ID NO: 154; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 157; SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 161 ; SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 163; SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 168.

En una modalidad preferida, la invención proporciona también un vector de expresión adecuado para la transformación de E. coli, que comprende la secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo de secuencias de polinucleótidos SEQ ID NO: 85 a SEQ ID NO: 138 y de SEQ ID NO: 169 a SEQ ID NO: 193 indicado antes, así como células de E. coli transformadas con tal vector de expresión.

La transformación, es decir, la introducción de una secuencia de ADN en las células hospederas bacterianas, particularmente E. coli, generalmente se realiza en las células competentes, preparadas para tomar el ADN por ejemplo por el tratamiento con iones de calcio a baja temperatura (4°C) y luego se somete a la descarga de calor (a 37-42°C) o por electroporación. Tales técnicas son bien conocidas y determinadas generalmente por el fabricante del sistema de expresión o son descritas en la literatura y manuales para trabajo de laboratorio, como Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982).

El procedimiento de sobreexpresión de las proteínas de fusión de la invención en el sistema de expresión de E.coli será descrito posteriormente.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que contiene la proteína de fusión de la invención como se define anteriormente como un ingrediente activo y un portador farmacéuticamente aceptable adecuado, diluyente y componentes auxiliares convencionales. La composición farmacéutica contendrá una cantidad efectiva de la proteína de fusión de la invención y componentes auxiliares farmacéuticamente aceptables disueltos o dispersados en un portador o diluyente, y estará preferiblemente en forma de una composición farmacéutica formulada en una forma de dosis unitaria o formulación que contiene una pluralidad de dosis. Formas farmacéuticas y métodos de su formulación, así como otros componentes, portadores y diluyentes son conocidos para la persona con experiencia y se describen en la literatura. Por ejemplo, se describen en la monografía Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA.

Los términos "portador farmacéuticamente aceptable, diluyente, e ingrediente auxiliar" comprenden cualquier solvente, medio de dispersión, agentes tensoactivos, antioxidantes, estabilizadores, conservadores (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotonizantes, conocidos en la técnica. La composición farmacéutica de la invención puede contener varios tipos de portadores, diluyentes y excipientes, dependiendo de la ruta elegida de la administración y forma de dosificación deseada, como formas líquida, sólida y aerosol para oral, parenteral, inhalada, tópica, y si la forma debe ser estéril para la ruta de administración tal como por inyección. La ruta preferida de administración de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es parenteral, incluyendo las rutas de inyección tales como intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intratumoral, o por infusiones intravenosas sencillas o continuas.

En una modalidad, la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada por inyección directamente al tumor. En otra modalidad, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse por vía intravenosa. En aún otra modalidad, la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada por vía subcutánea o intraperitoneal. Una composición farmacéutica para la administración parenteral puede ser una solución o dispersión en un medio acuoso o no acuoso farmacéuticamente aceptable, regulada de pH a un pH adecuado e iso-osmótico con fluidos del cuerpo, si es necesario, y también puede contener antioxidantes, reguladores de pH, agentes bacteriostáticos y sustancias solubles, que hacen la composición compatible con los tejidos o sangre del destinatario. Otros componentes, que pueden incluirse en la composición, son por ejemplo agua, alcoholes tal como etanol, polioles tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido, lípidos tal como triglicéridos, aceites vegetales, liposomas. Fluidez adecuada y el tamaño de partículas de la sustancia pueden proporcionarse por sustancias de recubrimiento, tal como lecitina y agentes tensoactivos, tal como polisorbatos de hidroxipropilcelulosa y lo similar.

Los agentes de isotonización adecuados para las composiciones parenterales líquidas son, por ejemplo, azúcares tales como glucosa, y cloruro de sodio, y sus combinaciones.

Alternativamente, la composición farmacéutica para la administración por inyección o infusión puede ser en una forma de polvo, como un polvo liofilizado para reconstitución inmediatamente antes de usarlo en un portador adecuado como, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos.

La composición farmacéutica de la invención para la administración parenteral también puede tener la forma de administración nasal, incluyendo soluciones, rociadores o aerosoles. Preferentemente, la forma para administración intranasal será una solución acuosa y será isotónica o regulada de pH o mantenida con el pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, con el fin de mantener un carácter similar a las secreciones nasales. Además, contendrá conservadores o estabilizadores, tal como en las preparaciones intranasales bien conocidas.

La composición puede contener varios antioxidantes que retrasan la oxidación de uno o más componentes. Además, para prevenir la acción de los microorganismos, la composición puede contener varios agentes antibacterianos y antimicóticos, incluyendo, por ejemplo, y no limitado a, parabenos, clorobutanol, timerosal, ácido sórbico, y sustancias conocidas semejantes de este tipo. En general, la composición farmacéutica de la invención puede incluir, por ejemplo al menos aproximadamente 0.01 % en peso del ingrediente activo. Más particularmente, la composición puede contener el ingrediente activo en la cantidad de 1 % a 75 % en peso de la unidad de composición, o por ejemplo del 25 % al 60 % del peso, pero no limitado a los valores indicados. La cantidad real de la dosis de la composición de acuerdo con la presente invención administrada a los pacientes, incluyendo al hombre, será determinada por factores físicos y fisiológicos, tal como el peso corporal, la severidad de la condición, el tipo de enfermedad a ser tratada, intervenciones terapéuticas previas o concomitantes, el paciente y la ruta de administración. Una dosis unitaria adecuada, la dosis total y la concentración del ingrediente activo en la composición son para ser determinadas por el médico tratante.

La composición, por ejemplo, puede ser administrada en una dosis de aproximadamente 1 microgramo/kg de peso corporal a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del paciente, por ejemplo en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal o en el intervalo de 5 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal. La proteína de fusión y las composiciones que la contienen exhiben anticancerígenos o antitumorales y pueden ser utilizadas para el tratamiento de enfermedades cancerígenas. La invención también proporciona el uso de la proteína de fusión de la invención como fue definido antes para tratar enfermedades de cáncer en mamíferos, incluyendo humanos. La invención también proporciona un método para el tratamiento de enfermedades neoplásicas/cáncer en mamíferos, incluyendo los humanos, que comprende la administración a un sujeto que necesita de dicho tratamiento una cantidad efectiva anti-neoplásica/anticancerígina de la proteína de fusión de la invención como se define antes, opcionalmente en la forma de la composición farmacéutica.

La proteína de fusión de la invención puede ser utilizada para el tratamiento de las malignidades hematológicas, tal como leucemia, granulomatosis, mieloma y otras malignidades hematológicas. La proteína de fusión también puede ser utilizada para el tratamiento de tumores sólidos, tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer ovárico, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de riñon, cáncer de cerebro, y similares. La ruta de administración apropiada de la proteína de fusión en el tratamiento del cáncer en particular será la ruta parenteral, que consiste en la administración de la proteína de fusión de la invención en la forma de inyecciones o infusiones, en la composición y forma apropiada para esta ruta de administración. La invención se describirá con más detalle en los siguientes procedimientos generales y ejemplos de proteínas de fusión específica.

Procedimiento general para la sobre-expresión de la proteína de fusión Preparación de un plásmido La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión objetivo se utiliza como una plantilla para generar una secuencia de ADN que la codifica, que comprende codones optimizados para expresión en Escherichia coli. Este procedimiento permite aumentar la eficiencia de un paso adicional de la síntesis de proteínas objetivo en Escherichia coli. La secuencia de nucleótido resultante después se sintetiza automáticamente. Adicionalmente, los sitios de disociación de enzimas de restricción Ndel (en los extremos 5' de la cadena principal) y Xhol (en el extremo 3' de la cadena principal) se agregan al gen resultante que codifica la proteína objetivo. Estos se utilizan para clonar el gen en el vector pET28a (Novagen). También se pueden utilizar para clonar el gen que codifica la proteína a otros vectores. La proteína objetivo expresada de esta construcción puede ser equipada opcionalmente en el N-terminal con una etiqueta de polihistidina (seis histidinas), precedida por un sitio reconocido por trombina, que sirvió posteriormente a su purificación a través de cromatografía de afinidad. Algunos objetivos se expresaron sin alguna etiqueta, en particular sin la etiqueta histidina, y aquellos fueron purificados posteriormente en sefarosa SP. La exactitud de la construcción resultante se confirma en primer lugar por análisis de restricción de plásmidos aislados utilizando las enzimas Ndel y Xhol, seguido por secuenciado automático del marco de lectura completa de la proteína objetivo. Los iniciadores utilizados para el secuenciamiento fueron complementarios a las secuencias de promotor 11 (5 - TAATACGACTCACTATAGG-3') y terminador T7 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 ') presente en el vector. El plásmido resultante fue utilizado para la sobreexpresión de la proteína de fusión objetivo en una cepa comercial de E.coli, que fue transformada según las recomendaciones del fabricante. Las colonias obtenidas en el medio de selección (LB agar, canamicina 50 µg/ml, 1% de glucosa) se utilizan para la preparación de un cultivo de toda la noche en medio líquido LB complementado con canamicina (50 µg/ml) y 1 % de glucosa. Después de aproximadamente 15 horas de crecimiento en la incubadora de agitación, los cultivos se utilizan para inocular el cultivo adecuado.

Sobreexpresión y purificación de proteínas de fusión -procedimiento general A Medio LB con canamicina (30 µg/ml) y 100 µ? de sulfato de zinc se inoculan con el cultivo durante la noche. El cultivo se incuba a 37 °C hasta la densidad óptica (OD) de 600 nm alcanzada 0.60-0.80. Luego se agregó IPTG a la concentración final en el intervalo de 0.25 -1mM. Después de la incubación (3.5 - 20h) con agitación a 25 °C el cultivo fue centrifugado por 25 min a 6,000 g. Las perlas bacterianas fueron resuspendidas en un regulador de pH que contenía KH2P04 50 mM, NaCI 0.5 M, imidazol 10 mM, pH 7.4. La suspensión se sónica en hielo durante 8 minutos (40 % de amplitud, pulso de 1 5 segundos, intervalo de 10 s). El extracto resultante se clarifica por centrifugación durante 40 minutos a 20000 g, 4 °C. La resina de Ni-Sefarosa (GE Healthcare) se pre-trata por el equilibrio con regulador de pH, que se utiliza para la preparación del extracto de células bacterianas. La resina después se incuba durante la noche a 4 °C con el sobrenadante obtenido después de la centrifugación del extracto. Después se carga en columna de cromatografía y se lava con 15 a 50 volúmenes de regulador de pH de 50 mM KH2P04, NaCI 0.5 M, imidazol 20 mM, pH 7.4. La proteína obtenida fue eluida de la columna utilizando gradiente de imidazol en regulador de pH de KH2PO4 50 mM con NaCI 0.5 M, pH 7.4. Se analizan las fracciones obtenidas por SDS-PAGE. Las fracciones adecuadas fueron combinadas y dializadas durante la noche a 4°C contra regulador de pH de Tris 50 mM, pH 7.2, NaCI 150 m , L-arginina 500 mM, ZnS04 0.1 mM, Tween 20 al 0.01 %, y al mismo tiempo 10 Histag, en caso de estar presente, fue disociado con trombina (1 :50). Después de la disociación, la trombina se separó de la proteína de fusión objetivo expresada con la etiqueta His por medio de la purificación usando una resina benzamidina sefarosaTM. La purificación de las proteínas de fusión objetivo expresadas sin Histag fue realizada en SP Sepharosa La pureza del producto se analiza mediante electroforesis de SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982).

Sobreexpresión y purificación de proteínas de fusión -procedimiento general B El medio de LB con kanamicina (30 pg/ml) y sulfato de zinc 100 µ? fue inoculado con cultivo durante la noche. Los cultivos se incuban a 37 °C hasta la densidad óptica (OD) de 600 nm alcanzada 0.60-0.80. Después IPTG se agrega a la concentración final en el intervalo de 0.5-1 mM. Después de incubación por 20 h con agitación a 25 °C el cultivo fue centrifugado por 25 min a 6000 g. Las células bacterianas después de la sobreexpresión fueron interrumpidas en una Prensa francesa en un regulador de pH que contenía 2P04 50 mM, NaCI 0.5 M, imidazol 10 mM, betamercaptoetanol 0.5 mMM, PMSF 0.5 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), pH 7.8. El extracto resultante se clarifica por centrifugación durante 50 minutos a 8000 g. La resina de Ni-sefarosa se incuba durante toda la noche con el sobrenadante obtenido.

Después la resina con proteína unida se empaca en la columna de cromatografía. Para lavar las fracciones que contenían proteínas de no unión, la columna fue lavada con 15 a 50 volúmenes de regulador de pH KH2P04 50 mM, NaCI 0.5 M, imidazol 10 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, PMSF 0.5 mM (fluoruro fenilmetilsulfonilo), pH 7.8. Entonces, para lavar la mayoría de las proteínas que se unen específicamente con el lecho, la columna se lava con un regulador de pH que contiene 50 mM KH2P04, NaCI 0.5 M, 500 mM imidazol, glicerol al 10 %, 0.5 mM PMSF, pH 7.5. Se analizan las fracciones obtenidas por SDS-PAGE (Maniatis et al, Molecular Cloning. Coid Spring Harbor, NY, 1982). Las fracciones que contenían la proteína objetivo fueron combinadas y, si la proteína fue expresada con etiqueta de histidina, disociadas con trombina (11) por 4 mg de proteína, 8h a 16 °C) para remover la etiqueta de polihistidina. Entonces las fracciones se dializan contra regulador de pH de formulación (500 mM L-arginina, 50 mM Tris, 2.5 mM ZnS04, pH 7.4).

En estos Ejemplos de descripción de proteínas expresadas originalmente con etiqueta de histidina que fue quitada subsiguientemente son designadas con superíndice a) junto al número de Ejemplo. Las proteínas que se expresaron originalmente sin la etiqueta de histidina son designadas con el superíndice b) junto al número de Ejemplo.

Caracterización de las proteínas de fusión por Electroforesis 2-D A fin de caracterizar además las proteínas obtenidas y seleccionar condiciones cromatográficas precisamente, se determinan los puntos isoeléctricos de las proteínas. Para este propósito, se utiliza el método de electroforesis bidimensional (2D), en dos etapas de acuerdo con el siguiente programa.

Paso 1. Isoelectro-enfoque de proteínas en un gradiente de pH y condiciones de desnaturalización.

Las preparaciones de proteínas en concentraciones de 1-2 mg/ml se precipitan por la mezcla en una relación 1 :1 con una solución de precipitación que contiene 10 % de ácido tricloroacético y 0.07 % de beta-mercaptoetanol en acetona. La mezcla se incuba durante 30 minutos a -20 °C y después se centrifuga durante 25 minutos a 15,000 g y 4 °C. Se remueve el sobrenadante y la pella se lava dos veces con acetona fría con 0.07 % de beta-mercaptoetanol. Después los residuos de acetona se evaporan hasta no detectar olor. La pella de proteína se suspende en 250 mi de regulador de pH de rehidratación urea 8M, 1 % de CHAPS, 15 mM DTT, 0.5 % de anfolita (GE Healthcare) con un perfil de pH 3-11 ó 6-11 , dependiendo de la tira posteriormente utilizada. La solución de proteína se coloca en una cámara de cerámica para isoelectro-enfoque, seguido por 13 cm de DryStrip (GE Healthcare) con perfil de pH adecuado (3-11 ó 6-11). Todo se cubre con una capa de aceite mineral. Las cámaras se colocan en el aparato Ettan IPGphor III, donde el isoelectroenfoque se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente programa asignado a las dimensiones de la tira y el perfil de pH: Deshidratación de 16 horas a 20 °C.

Enfoque en el campo eléctrico en un gradiente de pH fijado Después, la tira que contiene las proteínas enfocadas se lava por 1 min en agua desionizada, manchada con Coomassie brillante y después se decolora y archiva como una imagen para marcar la ubicación de las proteínas. La tira decolorada se equilibra 2 x 15 minutos con un regulador de pH de la composición siguiente: 50 mM Tris-HCI pH 8.8, urea 6 M, 1 % de DTT, 2 % de SDS, 30 % de glicerol.

Paso 2. Separación en una segunda dirección por medio de SDS-PAGE La tira se coloca sobre 12.5 % de gel de poliacrilamida que contiene un pozo sencillo por tamaño estándar y después se realiza la separación en un aparato para SDS-PAGE, en un voltaje de 200 V durante 3 horas. El gel se tiñe con Coomassie brillante, después se archiva con la escala aplicada. Las proteínas se identifican para determinar su peso en base del estándar de tamaño, y su Pl se lee para la escala de 6-1 1 , en base a las curvas proporcionadas por el fabricante (GE Healthcare) (relación de pH a % de la longitud de la tira desde el extremo marcado como ánodo) o una escala de 3-11 , en base a la curva determinada experimentalmente por medio del kit de calibración de isoelectroenfoque (GE Healthcare).

EJEMPLOS Los ejemplos representativos de la proteína de fusión de la invención se muestran en los siguientes ejemplos.

Se usan las siguientes designaciones de los componentes de las secuencias de aminoácidos: ENLAZADOR1 : secuencia del enlazador estérico (Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS) ENLAZADOR2: secuencia del enlazador estérico (Gly Gly Gly Gly / GGGG) ENLAZADOR3: secuencia del enlazador estérico (Ala Ser Gly Gly/ASGG) ENLAZADOR4: secuencia del enlazador estérico (Gly Gly Gly Ser/GGGS) ENLAZADOR5: secuencia del enlazador estérico (Ser His Ala Ser/SHAS) FURINA: secuencia disociada por furina (Arg Lys Lys Arg / RKKR) UROKINA: secuencia disociada por urocinasa (Arg Val Val Arg / RWR) PEG: secuencia del enlazador de pegilación (Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE) TRANSI : secuencia de transporte (Lys Asp Glu Leu / KDEL) TRANS2: secuencia de transporte (ArgArg Arg Arg Arg Arg Arg Arg/RRRRRRRR) TRANS3: (Lys Glu Asp Leu /KEDL) ENLAZADOR6: (Cys Ala Ala Ala Cys AlaAla Cys/CAAACAAC) ENLAZADOR7: (Gly Gly Gly/ GGG) MMP: (Pro Leu Gly Leu Ala Gly /PLGLAG) FURIN.NAT: (Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu/RHRQPRGWEQL) EJEMPLO 1 Proteína de fusión de SEQ ID NO: 1 La proteína de SEQ ID NO: 1 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 430 aminoácidos y la masa de 48.3 kDa, en donde el dominio (a) está formado por una secuencia de TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es un dominio A de boguanina de 248 aminoácidos (SEQ ID NO: 55), y está unido al N-terminal del dominio (a).

Además, entre el dominio (a) y el dominio (b) hay secuencialmente incorporadas secuencias de enlazador estérico (GGGGS), secuencia disociada por furina (RKKR), secuencia de enlazador de pegilacion (ASGCGPE) y secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Asi, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 55)-ENLAZADOR1 -FURINA-PEG-ENLAZADOR1 -(TRAIL121 -281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 85 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 85. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 2 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 2 La proteína de SEQ ID NO: 2 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 267 aminoácidos y la masa de 50.8 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio de ricina A de y 267 aminoácidos (SEQ ID NO: 56), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, el dominio (a) está separado del dominio (b) por la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), secuencia de pegilación (ASGCGPE) y una secuencia del sitio de disociación reconocida por furina (RKKR). Además, en el C-terminal del dominio (b) está unida una secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la construcción completa.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 121 -281 )-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 56)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 86 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 86. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 2a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 2b).

EJEMPLO 3 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 3 La proteína de SEQ ID NO: 3 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 378 aminoácidos y la masa de 42 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante del dominio de ricina A de 267 aminoácidos (SEQ ID NO: 57), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, el dominio (a) está separado del dominio (b) al secuenciar la secuencia del enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de pegilación (ASGCGPE), la secuencia del sitio de disociación reconocida por furina (RKKR) y la secuencia del enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida una secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de construcción completa.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 121-281 )-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 57)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 87 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 87. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 4 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 4 La proteína de SEQ ID NO: 4 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 473 aminoácidos y la masa de 53.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es un homólogo de la toxina PAP de 290 aminoácidos (SEQ ID NO: 58), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, el dominio (a) está separado del dominio (b) al secuenciar la secuencia del enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de pegilación (ASGCGPE) y secuencia de enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida una secuencia de transporte (KDEL), que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de construcción completa.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 121-281 )-ENLAZADOR1-PEG-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO: 58)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 88 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 4 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 88. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 5 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 5 La proteína de SEQ ID NO: 5 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 430 aminoácidos y la masa de 48.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es un fragmento de saporina de 252 aminoácidos (SEQ ID NO: 59), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, el dominio (a) está separado del dominio (b) al secuenciar la secuencia del enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de pegilación (ASGCGPE) y secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR1 -PEG-ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 59) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 89 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 89. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 6 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 6 La proteína de SEQ ID NO: 6 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 442 aminoácidos y la masa de 49.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es un fragmento de saporina de 252 aminoácidos (SEQ ID NO: 59), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS) y una secuencia disociada por furina (RKKR).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAI L121 -281 )-PEG-EN LAZADOR 1 -EN LAZADOR 1 -FU Rl NA-(SEQ ID NO: 59) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 90 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 90. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 7 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 7 La proteína de SEQ ID NO: 7 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 429 aminoácidos y la masa de 47.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y dominio (b) del péptido efector es péptido de tricosantina de 247 aminoácidos (SEQ ID NO: 60), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente secuencia de enlazador estérico (GGGGS), secuencia disociada por furina (RKKR), secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 60)-ENLAZADOR1 -FURINA-PEG-ENLAZADOR1 - (TRAIL121-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 91 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 91. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 8 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 8 La proteína de SEQ ID NO: 8 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 427 aminoácidos y la masa de 47.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121 -281 , y dominio (b) del péptido efector péptido de tricoanguina de 247 aminoácidos (SEQ ID NO: 61), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 61)-ENLAZADOR1-FURINA-PEG-ENLAZADOR1- (TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 92 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 92. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 9 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 9 La proteína de SEQ ID NO: 9 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 427 aminoácidos y la masa de 47.7 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es lectina A de muérdago de cadena de 249 aminoácidos (SEQ ID NO: 62), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 62)-ENLAZADOR1 -PEG-ENLAZADOR1-(TRAIL121-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 93 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 93. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 10 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 10 La proteína de SEQ ID NO: 10 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 462 aminoácidos y la masa de 51.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL1 14-281 , y dominio (b) del péptido efector es la subunidad A de ebulina de 273 aminoácidos (SEQ ID NO: 63), y está unida al N-terminal de! dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador esférico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador esférico (GGGG).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 63)-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-ENLACE2- (TRAIL1 14-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 94 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 94. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 11 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 11 La proteína de SEQ ID NO: 1 1 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 454 aminoácidos y la masa de 50.7 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es la subunidad A de nigrina de 272 aminoácidos (SEQ ID NO: 64), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 64)-ENLAZADOR1-FURINA-PEG-ENLAZADOR1- (TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 1 1 y SEQ ID NO: 95 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 1 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 95. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 12 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 12 La proteína de SEQ ID NO: 12 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 221 aminoácidos y la masa de 25.7 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es péptido P1 de luffina de 47 aminoácidos (SEQ ID NO: 65), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS) y la secuencia disociada por furina (RKKR).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 121-281 )-ENLAZADOR1-FURINA-(SEQ ID NO: 65) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 96 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 96. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 13 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 13 La proteína de SEQ ID NO: 13 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 221 aminoácidos y la masa de 26 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es péptido P1 de luffina de 47 aminoácidos (SEQ ID NO: 65), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las secuencias de los enlazadores estéricos (ASGG) y (GGGS), la secuencia del enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (ASGG).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281 )-ENLAZADOR4-PEG-FURINA-ENLAZADOR3- (SEQ ID NO: 65) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 97 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 97. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de hístidina.

EJEMPLO 14 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 14 La proteína de SEQ ID NO: 14 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 254 aminoácidos y la masa de 29.2 kDa, en donde el dominio (a) es una secuencia TRAIL 95-281 , y el dominio (b) del péptido efector es péptido P1 de luffina de 47 aminoácidos (SEQ ID NO: 65), y está unido al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia disociada por furina (RKKR). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida una secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de construcción completa.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 95-281 )-ENLAZADOR1 -PEG-FURINA-(SEQ ID NO: 65)- TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 98 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 98. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 1 a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 14b).

EJEMPLO 15 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 15 La proteína de SEQ ID NO: 15 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 438 aminoácidos y la masa de 49 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una subunidad A de volkensina de 244 aminoácidos (SEQ ID NO: 66), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia del enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 66)-ENLAZADOR1 -FURINA-PEG-enlazador1 -(TRAIL121-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 99 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 99. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 15a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 15b).

EJEMPLO 16 La proteina de fusión de SEQ ID NO: 16 La proteína de SEQ ID NO: 16 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 431 aminoácidos y la masa de 48.3 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una subunidad A de volkensina de 244 aminoácidos (SEQ ID NO: 66), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de construcción completa.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 121-281)-ENLA27\DOR1-PEG-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO: 66)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 100. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 17 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 17 La proteína de SEQ ID NO: 17 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 428 aminoácidos y la masa de 47.8 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121-281 secuencia, y dominio (b) del péptido efector es una subunidad A de volkensina de 246 aminoácidos (SEQ ID NO: 67), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 67)-ENLAZADOR1 -FURINA-PEG-ENLAZADOR1 -(TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 101 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 101. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 18 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 18 La proteína de SEQ ID NO: 18 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 515 aminoácidos y la masa de 55.9 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es un homólogo de 342 aminoácidos de un fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO. 68), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGS) y la secuencia de enlazador estérico (ASGG). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida una secuencia de transporte (KDEL), que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de construcción completa.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281)-ENLAZADOR4-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 68)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 102 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 102. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 1 8a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 18b).

EJEMPLO 19 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 19 La proteína de SEQ ID NO: 19 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 526 aminoácidos y la masa de 57.1 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 119-281 , y el dominio (b) del péptido efector es un homólogo de 342 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxína de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 68), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (ASGG). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte (KDEL), que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL1 19-281 )-ENLAZADOR4-PEG-FURINA-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 68)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 103 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 103. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 20 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 20 La proteína de SEQ ID NO: 20 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 526 aminoácidos y la masa de 57.2 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el homólogo de 354 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 84), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (ASGG).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENU\ZADOR4-PEG-FURINA-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 84)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 104 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 104. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 20a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 20b).

EJEMPLO 21 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 21 La proteína de SEQ ID NO: 21 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 534 aminoácidos y la masa de 58.5 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el homólogo de 354 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 69), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (ASGG).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281)-ENLAZADOR4-PEG-FURINA-ENI_AZADOR3-(SEQ ID NO: 69) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 105 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 105. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realiza de acuerdo ai procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 22 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 22 La proteína de SEQ ID NO: 22 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 534 aminoácidos y la masa de 56.1 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el homólogo de 342 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 83), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) una secuencia de enlazador estérico (GGGS) está incorporada. Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR4-(SEQ ID NO: 83) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 106 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 106, Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando cepas de E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 23 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 23 La proteína de SEQ ID NO: 23 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 526 aminoácidos y la masa de 57.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 119-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el homólogo de 342 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 83), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (ASGG).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL119-281 )-ENLAZADOR4-PEG-FURINA-ENLAZADOR3- (SEQ ID NO: 83)-T ANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 107 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 107. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa de E. coli BL21 (DE3) o E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 24 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 24 La proteína de SEQ ID NO: 24 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 526 aminoácidos y la masa de 57.2 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el fragmento de 342 aminoácidos de la secuencia modificada del fragmento de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 83), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (ASGG).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL1 19-281 )-ENLAZADOR4-PEG-FURINA-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 83)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 108 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 108. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 25 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 25 La proteína de SEQ ID NO: 25 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 423 aminoácidos y la masa de 47.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de la toxina stx Shiga de 239 aminoácidos (SEQ ID NO: 70), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (SHHAS), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 70)-ENLAZADOR5-FURINA-ENLAZADOR1-(TRAIL114-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 109 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 109. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 26 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 26 La proteína de SEQ ID NO: 26 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 432 aminoácidos y la masa de 47.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 120-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de la toxina stx Shiga de 239 aminoácidos (SEQ ID NO: 70), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador esférico (GGGS), la secuencia de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (GGGS).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 120-281)-ENLAZADOR4-PEG-FURINA-ENLAZADOR4-(SEQ ID NO: 70)-TRANS1.

La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 110 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 110. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 26a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 26b).

EJEMPLO 27 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 27 La proteína de SEQ ID NO: 27 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 526 aminoácidos y la masa de 38 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 4-281 , y dominio (b) del péptido efector es el péptido de restrictocina de 149 aminoácidos (SEQ ID NO: 71 ), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 71)-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-FURINA-PEG-(TRAIL114-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 1 11 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 11 1. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando cepas de E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histídina (Ej. 27a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 27 ).

EJEMPLO 28 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 28 La proteína de SEQ ID NO: 28 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 335 aminoácidos y la masa de 37.7 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el péptido de restrictocina de 149 aminoácidos (SEQ ID NO: 71 ), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281 )-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO: 71)-TR2 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 1 12 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 112. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 28a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 28b).

EJEMPLO 29 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 29 La proteína de SEQ ID NO: 29 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 319 aminoácidos y la masa de 35.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el péptido de 130 aminoácidos de hirsutellina (SEQ ID NO: 72), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 72)-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-FURINA-PEG-(TRAIL1 14-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 1 13 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 29 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 1 13. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 29a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 29b).

EJEMPLO 30 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 30 La proteína de SEQ ID NO: 30 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 290 aminoácidos y la masa de 32.3 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es la proteína Kid de 109 aminoácidos (SEQ ID NO: 73), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador esférico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia disociada por furina (RKKR).

Además, al C-terminaf del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-(SEQ ID NO: 73)- TRANSI La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO. 30 y SEQ ID NO: 1 14 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 114. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 31 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 31 La proteína de SEQ ID NO: 31 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 277 aminoácidos y la masa de 31.7 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es la proteína Ccdb de 100 aminoácidos (SEQ ID NO: 74), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia disociada por furina (RKKR).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281)-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-(SEQ ID NO:74) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 1 15 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 115. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 32 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 32 La proteína de SEQ ID NO: 32 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 228 aminoácidos y la masa de 25.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de la proteína Ccdb de 47 aminoácidos (SEQ ID NO: 75), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador esférico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia disociada por furina (RKKR).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281)-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-(SEQ ID NO: 75)- TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 1 16 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 116. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 32a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 32b).

EJEMPLO 33 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 33 La proteína de SEQ ID NO: 33 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 275 aminoácidos y la masa de 31.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es la proteína RelE de 94 aminoácidos (SEQ ID NO: 76), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia disociada por furina (RKKR).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281)-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-(SEQ ID NO: 76)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 1 17 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 117. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 34 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 34 La proteína de SEQ ID NO: 34 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 271 aminoácidos y la masa de 30.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es la proteína RelE de 90 aminoácidos (SEQ ID NO: 77), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia disociada por furina (RKKR).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-(SEQ ID NO: 77)- TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 1 18 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 118. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 35 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 35 La proteína de SEQ ID NO: 35 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 429 aminoácidos y la masa de 48.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el péptido gelonina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 78), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias del enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 78)-ENLAZADOR1 -ENLAZADOR1-(TRAIL 114- 281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 1 19 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 1 19. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 36 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 36 La proteína de SEQ ID NO: 36 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 434 aminoácidos y la masa de 48.6 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 120-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el péptido gelonina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 78), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 78)-ENLAZADOR1-FURINA-PEG-ENLAZADOR1-(TRAIL 120-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 120 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 120. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 37 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 37 La proteína de SEQ ID NO: 37 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 427 aminoácidos y la masa de 48 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el péptido gelonina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 78), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281)-PEG-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO: 78)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 121 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 121. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 38 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 38 La proteína de SEQ ID NO: 38 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 433 aminoácidos y la masa de 48.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es el péptido gelonina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 78), y está unida al N-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 78)-ENLAZADOR1-FURINA-PEG-ENLAZADOR1 -(TRAIL121 -281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 122 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 122. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 39 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 39 La proteína de SEQ ID NO: 39 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 558 aminoácidos y la masa de 61.4 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es la subunidad A de la toxina de la difteria de 387 aminoácidos (SEQ ID NO: 79), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias del enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 79)-ENI^ZADOR1-ENLAZADOR1 -(TRAIL121 -281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. cotí son, respectivamente, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 123 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 123. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 40 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 40 La proteína de SEQ ID NO: 40 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 481 aminoácidos y la masa de 53.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio catalítico de la toxina de difteria de 193 aminoácidos (SEQ ID NO: 80), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia del dominio de transporte derivado de la toxina de Pseudomonas (SEQ ID NO: 139), y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR1-FURINA-(SEQ ID NO: 139)-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO: 80) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 124 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 124. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 40a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 40b).

EJEMPLO 41 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 41 La proteína de SEQ ID NO: 41 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 481 aminoácidos y la masa de 53.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio catalítico de la toxina de difteria de 189 aminoácidos (SEQ ID NO: 81 ), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia disociada por furina (RKKR), la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia del dominio de transporte derivado de la toxina de Pseudomonas (SEQ ID NO: 139), la secuencia disociada por furina (RKKR), y dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 81 )-FURINA-ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 139)-FURINA-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-(TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 125 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 41 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 125. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 42 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 42 La proteína de SEQ ID NO: 42 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 432 aminoácidos y la masa de 48.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias del enlazador esférico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 82)-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-(TRAIL114- 281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 126 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 126. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 42a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 42b).

EJEMPLO 43 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 43 La proteína de SEQ ID NO: 43 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 443 aminoácidos y la masa de 49.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de ligando de integrina (SEQ ID NO: 140), la secuencia disociada por urocinasa (RWR), y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS) Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 82)-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO: 140)-UROKINA- ENLAZADOR1 -(TRAIL1 14-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 127 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 127. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 43a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 43b).

EJEMPLO 44 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 44 La proteína de SEQ ID NO: 44 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 433 aminoácidos y la masa de 48.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 114-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS) y la secuencia disociada por urocinasa (RWR).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 82)-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1 -UROKINA- (TRAIL1 14-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 128 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 128. Se genera un plásmido que coñSene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de hístidina (Ej. 44a) y sin etiqueta de hístidina (Ej. 44b).

EJEMPLO 45 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 45 La proteína de SEQ ID NO: 45 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 441 aminoácidos y la masa de 50 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de transporte que consiste en 8 residuos de arginina (RRRRRRRR), la secuencia disociada por urocinasa (RWR), y secuencialmente dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 82)-TRANS2-UROKINA-ENLAZADOR1 -ENLAZADOR1 -(TRAIL114-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 129 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 129. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 46 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 46 La proteína de SEQ ID NO: 46 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 550 aminoácidos y la masa de 61.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por urocinasa (RWR), la secuencia del dominio de transporte derivada de Pseudomonas (SEQ ID NO: 139), la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), y la secuencia disociada por urocinasa (RWR).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL1 14-281 )-ENLAZADOR1-UROKINA-(SEQ ID NO: 139)-E NLAZADOR1 -UROKINA-(SEQ ID NO: 82) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 130 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 46 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 130. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando cepas E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 46a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 46b).

EJEMPLO 47 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 47 La proteína de SEQ ID NO: 47 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 459 aminoácidos y la masa de 51.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 95-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de enlazador esférico (GGGGS), la secuencia disociada por urocinasa (RWR), y la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 82)-ENLAZADOR1 -ENLAZADOR1 -UROKINA-PEG-(TRAIL95- 281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 131 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 131. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 47a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 47b).

EJEMPLO 48 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 48 La proteína de SEQ ID NO: 48 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 443 aminoácidos y la masa de 49.7 kDa, en donde el dominio (a) es la secuencia TRAIL 121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por urocinasa (RWR) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281 )-ENLAZADOR1 -PEG-UROKINA-ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 82) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 132 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 132. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 49 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 49 La proteína de SEQ ID NO: 49 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 447 aminoácidos y la masa de 50.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia disociada por urocinasa (RWR), y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS). Además, en el C-terminal del dominio (b) está la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL 121 -281 )-ENLAZAD0R1 -PEG-UROKINA- E N LAZADO R1 -(SEQ ID NO: 82)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 133 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 133. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 49a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 49b).

EJEMPLO 50 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 50 La proteína de SEQ ID NO: 50 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 441 aminoácidos y la masa de 49.4 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 1 14-281 , y el dominio (b) del péptido efector es el dominio A de abrina de 251 aminoácidos (SEQ ID NO: 82), y está unida al N-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias del enlazador estérico (GGGGS), la secuencia disociada por urocinasa (RWR), y la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 82)-ENLAZADOR1- ENLAZADOR1 -UROKINA-PEG-(TRAIL114-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 134 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 50 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 134. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 50a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 50b).

EJEMPLO 51 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 51 La proteína de SEQ ID NO: 51 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 515 aminoácidos y la masa de 55.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 que contiene la mutación de D218H (SEQ ID NO: 142), y el dominio (b) del péptido efector es un homólogo de 342 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 68), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las secuencias de enlazador estérico (GGGS) y (ASGG). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 142)-ENLAZADOR4-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 68)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 135 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 51 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 135. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 51a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 51 b).

EJEMPLO 52 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 52 La proteína de SEQ ID NO: 52 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 515 aminoácidos y la masa de 55.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121 -281 que contiene mutaciones Y189N/R191 K/Q193R/H264R/I266R/D269H (SEQ ID NO: 143), y dominio (b) del péptido efector es un homólogo de 342 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 68), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las secuencias de enlazador estérico (GGGS) y (ASGG). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 143)-ENLAZADOR4-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 68)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 136 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 136. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión se realiza de acuerdo al procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 53 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 53 La proteína de SEQ ID NO: 53 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 515 aminoácidos y la masa de 55.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121 -281 que contiene la mutación D218H (SEQ ID NO: 142), y dominio (b) del péptido efector es un homólogo de 342 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 83), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGS) y la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 142)-ENLAZADOR4-PEG-(SEQ ID NO: 83)- TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 137 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 53 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 137. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general A, usando la cepa E. coli Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada con etiqueta de histidina.

EJEMPLO 54 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 54 La proteína de SEQ ID NO: 54 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 515 aminoácidos y la masa de 55.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 que contiene mutaciones Y189N/R 91 K/Q193R/H264R/I266R/D269H (SEQ ID NO: 143), y dominio (b) del péptido efector es un homólogo de 342 aminoácidos del fragmento de la secuencia modificada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 83), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las secuencias de enlazador estérico (GGGS) y (ASGG). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 143)-ENI_AZADOR4-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 83)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 138 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 54 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 138. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 54a) y sin la etiqueta de histidina (Ej. 54b).

EJEMPLO 55 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 144 La proteína de SEQ ID NO: 144 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 433 aminoácidos y la masa de 48.8 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL114-281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido al N-terminal del dominio (a) y es una variante de 251 aminoácidos del dominio de abrina A (SEQ ID NO: 194). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias del enlazador estérico (GGGGS), y el sitio de disociación reconocido por furina (RKKR). Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 194)-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-FURINA-(TRAIL1 14-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 144 y SEQ ID NO: 169 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 144 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 169. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 56 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 145 La proteína de SEQ ID NO: 145 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 450 aminoácidos y la masa de 50.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido al C-terminal del dominio (a) y es una variante delecional de 264 aminoácidos del dominio de ricina A (SEQ ID NO: 195).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia de enlazador de pegilación (ASGCGPE), la secuencia reconocida por furina y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281)-ENLAZADOR1-PEG-FURINA-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO; 195)-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 170 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 145 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 170. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 57 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 146 La proteína de SEQ ID NO: 146 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 481 aminoácidos y la masa de 53 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido al N-terminal del dominio (a) y es un dominio activo mutado de 189 aminoácidos de la toxina de difteria (SEQ ID NO: 196).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente el sitio de disociación de la secuencia reconocida por furina (RKKR), la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), la secuencia del dominio de transporte derivado de la toxina de Pseudomonas (SEQ ID NO: 139), otro sitio de disociación de la secuencia reconocida por furina (RKKR) seguido por dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 196)-FURINA-ENLAZADOR1-SEQ ID NO: 139-FURINA-ENLAZADOR1 - ENLAZADOR1-(TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 171 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 146 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 171. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína fue separada por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 58 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 147 La proteína de SEQ ID NO: 147 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 478 aminoácidos y la masa de 52.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido al N-terminal del dominio (a) y es un dominio activo mutado de 186 aminoácidos de la toxina de difteria (SEQ ID NO: 197).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente el sitio de disociación de la secuencia reconocida por furina (RKKR), la secuencia de enlazador esférico (GGGGS), la secuencia del dominio de transporte derivado de la toxina de Pseudomonas (SEQ ID NO: 139), otro sitio de disociación de la secuencia reconocida por furina (RKKR) seguido por dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO:197)-FURINA-ENLAZADOR1-SEQ ID NO:139-FURINA-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-(TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 147 y SEQ ID NO: 172 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 147 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 172. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína fue separada por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 59 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 148 La proteína de SEQ ID NO: 148 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 433 aminoácidos y la masa de 48.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido en el N-terminal del dominio (a) y es una variante mutada de 251 aminoácidos de gelonina (SEQ ID NO: 198).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS), sitio de disociación de la secuencia reconocida por furina (RKKR), enlazador de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ. No 198)- ENLAZADOR1 -FURINA-PEG-ENLAZADOR1 -(TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 148 y SEQ ID NO: 173 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 148 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 173. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína fue separada por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 59a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 59b).

EJEMPLO 60 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 149 La proteína de SEQ ID NO: 149 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 258 aminoácidos y la masa de 29.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL95-281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido al C-terminal del dominio (a) y es un péptido de luffina P1 de 47 aminoácidos (SEQ ID NO: 65).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las tres secuencias de los enlazadores esféricos (GGGGS), (GGG) y (CAAACAAC) seguido por la secuencia del sitio de disociación reconocido por furina (RKKR). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL95-281 )-ENLAZADOR1-ENLAZADOR7-ENLAZADOR6-FURINA-(SEQ ID NO: 65)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 174 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 149 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 174. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína fue separada por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 61 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 150 La proteína de SEQ ID NO: 150 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 253 aminoácidos y la masa de 29.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL95-281 , y dominio (b) del péptido efector está unido al N-terminal del dominio (a) y es un péptido luffina P1 de 47 aminoácidos (SEQ ID NO: 65).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia del sitio de disociación reconocido por furina (RKKR) y las secuencias de enlazadores esféricos (GGG) y (CAAACAAC). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 65)-TRANS1-FURINA-ENI_AZADOR7- E N LAZADOR6-(TRAI L95-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 150 y SEQ ID NO: 175 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 150 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 175. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 62 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 151 La proteína de SEQ ID NO: 151 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 539 aminoácidos y la masa de 59.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido al N-terminal del dominio (a) y es una variante mutada de 247 aminoácidos de tricosantina (SEQ ID NO: 199).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia del sitio de disociación reconocido por furina (RKKR) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS) seguido por la secuencia del dominio de transporte derivado de la toxina de Pseudomonas (SEQ ID NO: 139), otro sitio de disociación reconocido por furina (RKKR) y dos secuencias de enlazadores estéricos (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 199)-FURINA-ENLAZADOR1-SEQ ID NO: 139-F U Rl NA-EN LAZADOR 1 -EN LAZADOR 1 -(TRAI L 121 -281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 176 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 151 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 176. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 63 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 152 La proteína de SEQ ID NO: 152 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 429 aminoácidos y la masa de 47.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector está unido al N-terminal del dominio (a) y es una variante mutada de 247 aminoácidos de tricosantina (SEQ ID NO: 200).

Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente la secuencia de enlazador estérico (GGGGS) y la secuencia del sitio de disociación reconocido por furina (RKKR) seguido por la secuencia de pegilación (ASGCGPE) y la secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 200)-ENLAZADOR1 -FURINA-PEG-ENLAZADOR1 -(TRAIL121-281) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 177 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 152 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 177. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 64 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 153 La proteína de SEQ ID NO: 153 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 515 aminoácidos y la masa de 55.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es la secuencia modificada de la exotoxina de 342 aminoácidos de Pseudomonas aeruginosa con mutaciones puntuales R318K, N441Q y R601 K (SEQ ID NO: 201 ), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de los enlazadores estéricos (GGGS) y (ASGG). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281 )-ENI_AZADOR4-ENI_AZADOR3-SEQ ID NO: 201 -(TRANSI ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 153 y SEQ ID NO: 178 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 153 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 178. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 65 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 154 La proteína de SEQ ID NO: 154 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 402 aminoácidos y la masa de 43.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción de 225 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 202), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de enlazadores esféricos (GGGS) y (GGGG) y la secuencia del sitio de disociación reconocido por furina (RKKR). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR4-ENLAZADOR2-FURINA-(SEQ ID NO: 202)-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 154 y SEQ ID NO: 179 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 154 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 179. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo - con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo-- con el procedimiento general descrito antes.

. La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 65a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 65b).

EJEMPLO 66 La proteína de fusión de SEQ ID NO; 155 La proteína de SEQ ID NO: 155 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 403 aminoácidos y la masa de 44.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL 21 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción de 226 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con mutaciones de varios puntos (SEQ ID NO: 203), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de los enlazadores estéricos (GGGGS) y (GGGG) y la secuencia del sitio de disociación reconocido por furina (RKKR). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: TRAIL121-281-ENLAZADOR1 -ENLAZADOR2-FURINA-SEQ ID NO. 203-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 155 y SEQ ID NO: 180 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 155 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 180. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 66a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 66b).

EJEMPLO 67 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 156 La proteína de SEQ ID NO: 156 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 470 aminoácidos y la masa de 51.5 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 204), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente una secuencia de enlazador estérico (GGGGS) y el enlazador de pegilación (ASGCGPE) seguido por una secuencia reconocida por furina (RKKR) y la secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR1 -PEG-FURINA-FURIN.NAT-(SEQ ID NO: 204)-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 181 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 156 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 181. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 67a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 67b).

EJEMPLO 68 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 157 La proteína de SEQ ID NO: 157 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 478 aminoácidos y la masa de 51.8 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 205), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS) seguida por el sitio de disociación reconocido por furina (RKKR), la secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL) y la secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -28 )-ENLAZADOR 1 -ENLAZADOR 1 -FURINA-FURIN. NAT- ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-(SEQ ID NO:205)-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 182 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 157 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 182. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 68a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 68b).

EJEMPLO 69 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 158 La proteína de SEQ ID NO: 158 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 402 aminoácidos y la masa de 44.7 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción mutada de 214 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO: 206), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente una secuencia de enlazador estérico (GGGGS), seguida por una secuencia de enlazador estérico (GGGG), el sitio de disociación reconocido por furina (RKKR) y la secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281 )-ENLAZADOR1-ENLAZADOR2-FURINA-FURIN.NAT-(SEQ ID NO: 206)-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 83 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 158 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 183. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 70 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 159 La proteína de SEQ ID NO: 159 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 467 aminoácidos y la masa de 50.4 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción mutada de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 205), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS) seguida por el sitio de disociación reconocido por furina (RKKR) y otra secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281 )-ENLAZADOR1 -ENLAZADOR1 -FURINA- ENLAZADOR1 - ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 205)-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 184 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 159 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 184. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 71 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 160 La proteína de SEQ ID NO: 160 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 474 aminoácidos y la masa de 51.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción mutada de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 205), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia repetida de enlazador estérico (GGGGS) seguida por la secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL) y otra secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: TRAIL121 -281 -ENLAZADOR1-ENLAZADOR1 -FURINA. NAT-ENLAZADOR1 - ENLAZADOR1 -SEQ ID NO:205-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 185 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 160 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 185. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 71 a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 71 b).

EJEMPLO 72 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 161 La proteína de SEQ ID NO: 161 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 474 aminoácidos y la masa de 51.3 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción mutada de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 205), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia repetida de enlazador estérico (GGGGS) seguida por la secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL) y otra secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR1-ENI_AZADOR1-FURINA.NAT-ENLAZADOR1 - ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO:205)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 161 y SEQ ID NO: 186 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 161 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 186. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 73 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 162 La proteína de SEQ ID NO: 162 es una proteina de fusión que tiene la longitud de 474 aminoácidos y la masa de 51.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Psewdomonas aeruginosa con mutaciones (SEQ ID NO: 207), y está unida al C-terminal del dominio (a).

Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia repetida de enlazador estérico (GGGGS) seguida por la secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL) y otra secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121 -281)-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-FURINA.NAT-ENLAZADOR1 - ENLAZADOR1-(SEQ ID NO: 207)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 162 y SEQ ID NO: 187 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 162 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 187. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 74 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 163 La proteína de SEQ ID NO: 163 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 515 aminoácidos y la masa de 55.9 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 que contiene la mutación D218H (SEQ ID NO: 1 2), y el dominio (b) del péptido efector es una secuencia modificada de 342 aminoácidos de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con tres mutaciones de punto R318K, N441 Q y R601 K (SEQ ID NO: 201 ), y está unida al C-term¡nal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las secuencias de enlazador esférico (GGGS) y (ASGG). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 142)-ENLAZADOR4-ENLAZADOR3-(SEQ ID NO: 201 )-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. col/ son, respectivamente, SEQ ID NO: 163 y SEQ ID NO: 188 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 163 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 188. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 75 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 164 La proteína de SEQ ID NO: 164 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 475 aminoácidos y la masa de 51.4 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 que contiene la mutación D218H (SEQ ID NO: 142), y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción mutada de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 205), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente la secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS), seguido por una secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL) y otra secuencia repetida del enlazador estérico (GGGGS). Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 142)-ENLAZADOR1 -ENLAZADOR1-FURINA.NAT- ENLAZADOR1 -ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO:205)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 164 y SEQ ID NO: 189 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 164 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 189. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 76 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 165 La proteína de SEQ ID NO: 165 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 463 aminoácidos y la masa de 50.6 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 que contiene la mutación D218H (SEQ ID NO: 1 2), y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 204), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias del enlazador estérico (GGGS) seguidas por una secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 142)- ENLAZADOR4-ENLA2ADOR4-FURINA.NAT-(SEQ ID NO: 204)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: 190 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 165 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 190. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 77 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 166 La proteína de SEQ ID NO: 166 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 475 aminoácidos y la masa de 51.4 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121 -281 que contiene mutaciones Y189N/R191 K/Q193R/H264R/I266R/D269H (SEQ ID NO: 143), y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción mutada de 279 aminoácidos de la secuencia de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa con varias mutaciones de punto (SEQ ID NO: 205), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS) seguida por una secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL) y dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KDEL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 143)-ENLAZADOR1-ENLAZADOR1-FURINA.NAT- ENLAZADOR1-ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 205)-TRANS1 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 191 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 166 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 191. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada sin la etiqueta de histidina.

EJEMPLO 78 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 167 La proteína de SEQ ID NO: 167 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 474 aminoácidos y la masa de 51.24 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121 -281 , y el dominio (b) del péptido efector es una variante de deleción de 279 aminoácidos de la secuencia de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa con mutaciones (SEQ ID NO: 207), y está unida al C-ternninal del dominio (a). Además, entre los dominios (a) y (b) están incorporadas secuencialmente las dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS) seguidas por una secuencia nativa del sitio de disociación reconocido por furina (RHRQPRGWEQL) y dos secuencias de enlazador estérico (GGGGS).

Además, al C-terminal del dominio (b) está unida la secuencia de transporte KEDL, que dirige el péptido efector al retículo endoplasmático, formando el fragmento de C-terminal de la proteína de fusión entera.

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (TRAIL121-281 )-ENLAZADOR1 -ENLAZADOR1 -FURINA.NAT-ENLAZADOR1 - ENLAZADOR1 -(SEQ ID NO: 207)-TRANS3 La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 192 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 167 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 192. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresion de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresion fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

La proteína fue expresada tanto con etiqueta de histidina (Ej. 78a) y sin etiqueta de histidina (Ej. 78b).

EJEMPLO 79 La proteína de fusión de SEQ ID NO: 168 La proteína de SEQ ID NO: 168 es una proteína de fusión que tiene la longitud de 232 aminoácidos y la masa de 26.2 kDa, en donde el dominio (a) es TRAIL121-281 , y el dominio (b) del péptido efector es la secuencia de la proteína Hok de 51 aminoácidos (SEQ ID NO: 208), y está unida al C-terminal del dominio (a). Además, entre los dominios (b) y (a) están incorporadas secuencialmente una secuencia de enlazador estérico (GGGGS) seguida por secuencias de sitio de disociación reconocido por urocinasa (RWR) y metaloproteasa MMP (PLGLAG) y una secuencia de enlazador estérico (GGGGS).

Así, la estructura de la proteína de fusión de la invención es como sigue: (SEQ ID NO: 208)-ENI_AZADOR1-UROKINA-MMP-ENLAZADOR1- (TRAIL121-281 ) La secuencia de aminoácidos y la secuencia que codifica a ADN que comprende los codones optimizados para la expresión en E. coli son, respectivamente, SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 193 como es mostrado en el Listado de Secuencias adjunto.

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 168 de la estructura descrita antes fue utilizada como una plantilla para generar su secuencia de ADN de codificación SEQ ID NO: 193. Se genera un plásmido que contiene la secuencia codificante de ADN y la sobreexpresión de la proteína de fusión se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos generales descritos anteriormente. La sobreexpresión fue realizada de acuerdo con el procedimiento general B, usando la cepa E. coli BL21 (DE3) o Tuner (DE3) de Novagen. La proteína se separa por electroforesis de acuerdo con el procedimiento general descrito antes.

EJEMPLO 80 Examen de actividad anti-tumor de tas proteínas de fusión El examen de actividad anti-tumor de las proteínas de fusión fue llevado a cabo in vitro en un ensayo de citotoxicidad en líneas celulares de tumor y en ratones in vivo. Para propósitos de comparación, la proteína rhTRAIL1 14-281 y placebo fueron utilizados. 1. Medición de dicroísmo circular: determinación de la composición de las estructuras secundarias de las proteínas obtenidas La calidad de las preparaciones de las proteínas de fusión en términos de sus estructuras se determinó por dicroísmo circular para las proteínas de fusión del Ej. 2a, Ej. 1 1a, Ej. 12a, Ej. 13a, Ej. 14a, Ej. 15a, Ej. 18a, Ej. 20a, Ej. 26a, Ej. 29a, Ej. 42a, Ej. 43a, Ej. 44a, Ej. 50a, Ej. 51 a, y Ej. 52a. El dicroísmo circular es usado para la determinación de estructuras secundarias y la conformación de proteínas. El método de CD utiliza la actividad óptica de las estructuras de proteína, manifestado en la rotación del plano de polarización de luz y la aparición de polarización elíptica. El espectro de CD de las proteínas en el ultravioleta (UV) lejano proporciona datos precisos en la conformación de la cadena de polipéptido principal.

Muestras de la proteína a ser analizada, después de la formulación en un regulador de pH que consiste en 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 100 mM NaCI, 10 % glicerol, 0.1 mM ZnCI2, 80 mM sacarosa, 5mM DTT, se dializaron en bolsas (Sigma-Aldrich) con corte de 12 kDa. La diálisis fue realizada contra un exceso de 100 veces (v/v) de regulador de pH con respecto a las preparaciones de la proteína, con agitación por varias horas a 4 °C. Después de terminar la diálisis, cada preparación fue centrifugada (25 000 rpm., 10 min., 4 °C) y se recolectaron los sobrenadantes.

La concentración de la proteína en las muestras así obtenida fue determinada por el método de Bradford.

La medición del dicroísmo circular para las proteínas en el intervalo de concentración de 0.1-2.7 mg/ml fue realizada en un espectropolarímetro Jasco J-710, en una cubeta de cuarzo con camino óptico de 0.2 mm ó 1 mm. La medición fue realizada bajo flujo de nitrógeno a 7 l/min, lo que permitió realizar la medición en el intervalo de longitud de onda de 195 a 250 nm. Los parámetros de la medición: resolución espectral de - 1 nm; ancho medio del haz de luz 1 nm; sensibilidad 20 mdeg, el tiempo que promedia para una longitud de onda - 8 s, velocidad de escáner 10 nm/min.

Los espectros obtenidos fueron analizados numéricamente en el intervalo de 193-250 nm utilizando software de CDPro. Los puntos para los que el voltaje en el fotomultiplicador excedió 700 V fueron omitidos, debido a la muy baja relación de señal a ruido en este intervalo de longitud de onda.

Los datos obtenidos sirvieron para cálculos de contenido de estructuras secundarias particulares en las proteínas analizadas con el uso del software de CDPro (Cuadro 1).

CUADRO 1 Contenido de estructuras secundarias en las proteínas analizadas * Valor obtenido en la base de la estructura cristalina 1 D4V " valores obtenidos con base en las estructuras cristalinas 1 IKQ, 1 R4Q, 1ABR, 3PX8 La molécula de control (rhTRAIL114-281) muestra las características del espectro de CD para las proteínas predominantemente con estructuras de lámina tipo ß (mínima eiipcidad delineada fuertemente en la longitud de onda de 220 nm). Esto confirma el cálculo de los componentes de la estructura secundaria, sugiriendo un número marginal de elementos de hélice a.

El resultado obtenido es también consistente con los datos de la estructura cristalina de la proteína hTRAIL, y característica para las proteínas de fusión de la invención (Ej. 12a, Ej. 13a, Ej. 14a y Ej. 29a), en donde los elementos beta constituyen 32-44% de su estructura. Para todos los ejemplos, el espectro de dicroísmo se caracteriza por un mínimo en la longitud de onda de 220 nm. Ya que los péptidos pequeños unidos a TRAIL constituyen una pequeña porción de la proteína y no requieren crear una estructura secundaria definida, las proteínas analizadas no deben diferir significativamente de la proteína de partida.

En el caso de las construcciones del Ej. 2a, Ej. 11a, Ej. 15a, Ej. 20a, Ej. 26a, Ej. 42a, Ej. 43a, Ej. 44a, Ej. 50a, Ej. 51a y Ej. 52a, el contenido mixto de las estructuras secundarias alfa/beta fue observado, lo que es consistente con las expectativas basadas en la estructura cristalina conocida de los dominios de los péptidos efectores. El contenido de las estructuras alfa a nivel de 50 % en el caso de estos dominios voluminosos tiene un impacto significativo en la estructura de la proteína de fusión.

Sólo la proteína del Ej. 18a tiene sobre 70 % de contenido de alfa-hélice y bajo contenido de estructuras beta. 2. Pruebas en líneas celulares ¡n vitro Líneas celulares Las líneas celulares fueron obtenidas de ATCC y CLS, y luego propagadas y depositadas en el Laboratorio de Biología del Banco de línea Celular de Adamed. Durante el experimento, las células fueron revisadas rutinariamente para la presencia de Micoplasma por la técnica de PCR usando el kit Venor®GeM Mycoplasma PCR Detection Kit (Minerva Biolabs, Berlín, Alemania). Los cultivos se mantuvieron a condiciones estándar: 37 °C, 5 % C02 (en el caso de DMEM - 10 % C02), y 85 % de humedad relativa. Las líneas celulares particulares se cultivaron en un medio adecuado como lo recomienda ATCC.

CUADRO 2 Líneas celulares adherentes CUADRO 3 Células no adherentes Prueba de citotoxicidad MTT El ensayo de MTT es un ensayo colorimétrico que es utilizado para medir la proliferación, viabilidad y citotoxicidad de células. Consiste en la descomposición de una sal de amarillo de tetrazolio MTT (bromuro de 4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolio) al tinte púrpura insoluble en agua formazan por reductasa 1 de succionato-tetrazolio de enzima mitocondrial. La reducción de MTT se produce solamente en las células vivas. El análisis de los datos consiste en determinar la concentración de CI50 de la proteína (en ng/MI) en la que ocurre 50 % de reducción en el número de células en la población tratada comparada con las células de control. Los resultados fueron analizados utilizando el software GraphPad Prims 5.0. La prueba se realiza de acuerdo con las descripciones de la literatura (Cell's, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y. , Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cáncer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183).

El medio de cultivo celular fue diluido hasta una densidad definida (104 - 105 células por 100 µ?). Entonces 100 µ? de suspensión celular apropiadamente diluida fue aplicada a una placa de 98 pozos por triplicado. Las células así preparadas fueron incubadas por 24 h a 37 °C en 5 % o 10 % de CO2, dependiendo del medio utilizado, y luego a las células (en 100 µ? de medio) otros 100 µ? del medio que contenía varias concentraciones de las proteínas probadas fueron agregados. Después de la incubación de las células con las proteínas probadas durante el período de las siguientes 72 horas, que equivale a 3-4 veces la división celular, el medio con la proteína de prueba fue agregado con 20 mi de solución de trabajo de MTT [5 mg/ml] y la incubación fue continuada por 3 h a 37 °C en 5 % de C02. Entonces el medio con solución de MTT fue removido, y los cristales de formazan fueron disueltos agregando 100 µ? de DMSO. Después de agitación, la absorbancia fue medida a 570 nm (filtro de referencia de 690 nm).

Prueba de citotoxicidad EZ4U Fue utilizada la prueba de EZ4U (Biomedica) para probar la actividad citotóxica de las proteínas en líneas celulares no adherentes. La prueba es una modificación del método MTT, en donde el formazan formado en la reducción de sal de tetrazolio es soluble en agua. El estudio de viabilidad celular fue llevado a cabo después de incubación de 72 horas continuas de las células con proteína (siete concentraciones de proteína, cada una por triplicado). En esta base fueron determinados los valores de Cl50 (como un promedio de dos experimentos independientes) utilizando el software de GraphPad Prism 5. Las células de control se incubaron con solvente solamente.

Los resultados de las pruebas de citotoxicidad in vitro se resumieron como valores CI50 (ng/ml), que corresponde a la concentración de la proteína en donde el efecto citotóxico de las proteínas de fusión se observa en el nivel del 50 % con respecto a las células de control tratadas solamente con solvente. Cada experimento representa el valor promedio de por lo menos dos experimentos independientes realizados por triplicado. Como un criterio de falta de actividad de preparaciones en el límite del Cl50 de 2000 ng/ml fue adoptado. Las proteínas de fusión con un valor de CI50 por encima de 2000 se consideran inactivas.

Las células seleccionadas para esta prueba incluyen las líneas celulares tumorales que son resistentes naturalmente a la proteína TRAIL (el criterio de la resistencia natural a TRAIL: CI50 para la proteína TRAIL > 2000), así como líneas celulares tumorales sensibles a la proteína TRAIL y resistente a la línea de doxorrubicina MES-SA DX5 como una línea resistente a los medicamentos anticancerígenos convencionales.

La línea celular indiferenciada de HUVEC fue utilizada como una línea de célula de control de salud para la evaluación del efecto/toxicidad de las proteínas de fusión en células no de cáncer.

Los resultados obtenidos confirman la posibilidad de superar la resistencia de las líneas celulares a TRAIL por administración de ciertas proteínas de fusión de la invención a células naturalmente resistentes a TRAIL. Cuando las proteínas de fusión de la invención se administraron a las células sensibles a TRAIL, en algunos casos una potenciación clara y fuerte de la potencia de acción se observó, que se manifestó en valores reducidos de CI5o de la proteína de fusión en comparación con CI50 para el TRAIL solamente. Además, la actividad citotóxica de la proteína de fusión de la invención en las células resistentes al medicamento doxorrubicina anticancerígeno clásico se obtuvo, y en algunos casos es más fuerte que la actividad de TRAIL solamente.

Los valores de Cl50 sobre 2000 obtenidos para las líneas celulares no cancerígenas muestran la ausencia de efectos tóxicos asociados con el uso de proteínas de la invención para las células saludables, lo que indica la toxicidad sistémica baja potencial de la proteína.

Determinación de la actividad citotóxica de las preparaciones de la proteína seleccionada contra el panel extendido de las líneas celulares tumorales El Cuadro 4 presenta los resultados de las pruebas de la actividad citotóxica in vitro para las proteínas de fusión seleccionadas de la invención contra un amplio panel de células tumorales de diferentes órganos, correspondientes al amplio intervalo de cánceres más comunes.

Los resultados experimentales se presentan como un valor medio ± desviación estándar (SD). Todos los cálculos y las gráficas fueron preparados utilizando el software GraphPad Prism 5.0.

Los valores de CI50 obtenidos confirman la alta actividad citotóxica de las proteínas de fusión y así su utilidad potencial en el tratamiento de cáncer.

CUADRO 4 Actividad citotoxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4a Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4b Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4c Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4d Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4e Actividad citotoxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4f Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4q Actividad citotóxi'ca de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4h Actividad cítotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4i Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4i Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4k Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 41 Actividad citotoxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4m Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4n Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4o Actividad citotóxica de las proteínas de fusión de la invención CUADRO 4P Actividad citotoxica de las proteínas de fusión de la invención 3.- Efectividad antitumoral de proteínas de fusión in vivo en xenoinjertos La actividad antitumor de las preparaciones de proteínas se probó en un modelo de ratón de cáncer de colon humano Coló 205 y HCT-1 16, SW620, cáncer de pulmón humano A549, cáncer de próstata humano PC-3, cáncer de páncreas humano Panc-1 , cáncer de hígado humano PCL/PRF/5.HT-29, HepG2, y sarcoma uterino humano MES-SA.Dx5.

Células Las células de cáncer de colon humano Coló 205 fueron mantenidas en medio RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, EUA) (opcionalmente mezcladas en la proporción de 1 :1 con Opto-MEM (Invitrogen, Cat. No. 22600-134)) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 2 mM de glutamina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Las células de cáncer de pulmón humano A549 fueron mantenidas en medio RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado con 10 % suero bovino fetal y 2 mM de glutamina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Las células de cáncer de próstata humano PC3 fueron mantenidas en medio RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 2 mM de glutamina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Las células de cáncer de páncreas humano PANC-1 fueron mantenidas en medio DMEM (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 2 mM de glutamina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Las células de cáncer de hígado humano/PRF/5 (CLS) y cáncer de colon humano SW-620 fueron mantenidas en medio DMEM (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 2 mM glutamina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Las células de cáncer de colon humano HCT-1 6 y HT-29 fueron mantenidas en medio de McCoy (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 2 mM de glutamina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Las células de cáncer de hígado humano HepG2 fueron mantenidas en medio MEM (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 2 mM de glutamina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Las células de sarcoma uterino humano resistentes a multifármacos MES-SA.Dx5 fueron mantenidas en medio de cCoy (HyClone, Logan, UT, EUA) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y 2 mM de glutamina, y 1 µ? clorhidrato de doxorubicina (Sigma, Cat. No. D1515-10MG).

Tres días antes de la implantación de las células, las células fueron cultivadas en medio sin doxorubicina. En el día del injerto de ratones, las células se desprenden del soporte al lavar las células con tripsina (Invitrogen), después las células se centrifugan a 1300 rpm, 4 °C, 8 minutos, se suspenden en regulador de pH HBSS (medio Hanks).

Ratones El examen de la actividad antitumor de las proteínas de la invención se realizó en ratones desnudos de CD de 7-9 semanas de edad (Crl:CD1 -Foxn1nu 1) obtenidos del Centrum Medycyny Doswiadczalnej en Biatystok, 7-8 semanas de edad Hsd:Athymic-Nude-Foxn1nu (hembras) obtenidas de Harían UK, ratones de 8-10 semanas de edad HsdCpb:NMRI- Foxn1nu obtenidos de Harían UK, ratones de 8-10 semanas de edad hembras Cby.Cg-foxn1(nu)/J obtenidos del Centrum Medycyny Doswiadczalnej en Biatystok y ratones de 4-5 semanas de edad hembras CrliSHO-Prkdc^H^ obtenidos de Charles River Germany. Los ratones se mantienen bajo condiciones libres de patógenos específicas con libre acceso a los alimentos y agua desmineralizada (ad libitum). Todos los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las líneas guía: "Interdisciplinary Principies and Guidelines for the Use of Animáis in Research, Marketing and Education" expedida por la Academia de Ciencias de Nueva York Ad Hoc Comité de Investigación Animal y fueron aprobadas por el IV Comité de Ética Local en Experimentación Animal en Varsovia (No. 71/2009).

Transcurso v evaluación de los experimentos El tamaño del tumor se mide usando un calibrador electrónico, el volumen de tumor se calcula usando la fórmula: (a2 x b)/2, donde a = diagonal más corta del tumor (mm) y b = diagonal más larga del tumor (mm). La inhibición del crecimiento tumorai se calcula mediante la fórmula: TGI [%] (inhibición del crecimiento tumorai) = (WT/WC) x 100-100 % en donde WT se refiere al volumen promedio del tumor en el grupo de tratamiento, WC se refiere al volumen tumorai promedio en el grupo control.

Los resultados experimentales se presentan como un valor medio ± desviación estándar (SD). Todos los cálculos y gráficos se preparan usando el programa GraphPad Prism 5.0.

Modelo de cáncer de colon humano A. Colo205 En el día 0 los ratones fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células de Colo205 suspendidas en 0.15 mi de medio RPMI1640 por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). En el día 10° del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de tumores en el grupo de ~ 100 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 18a (3 mg/kg), Ej. 25a (3 mg/kg), Ej. 37a (5 mg/kg), y Ej. 42a (10 mg/kg), rhTRAIL1 14-281 (10 mg/kg) como comparación e inyecciones de agua como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) 6 veces una vez diariamente cada segundo día. En el 27° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 1 y la Fig. 2, como un diagrama de cambios en el volumen del tumor (Fig. 1) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control (Fig. 2).

Los resultados experimentales presentados en la Fig. 1 y Fig. 2 mostraron que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 18a, Ej. 25a, Ej. 37a y Ej. 42a causó inhibición del crecimiento del tumor Coló 205, con TGI 30.5%, 37%.29% y 60.2%, respectivamente, con respecto al control en el 27° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 usado como la referencia comparativa, un efecto ligeramente inhibidor en el crecimiento de la célula de tumor se obtuvo con respecto al control, con TGI al nivel de 12 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

B. HCT-116 En el día 0 ratones Cr\ SHO-Prkdcsc'dHi*r fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 5x106 de células HCT1 16 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3:1 de regulador de pH de HBSS:Matrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 71-432 mm3 (día 13), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de - 180 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del Ej.18b (3 mg/kg), Ej.2 (5 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (65 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 mM Trizma Base, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2, 10 % glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0) como un control. rhTRAIL1 14-281 y Ej. 2b fueron administrados intravenosamente (i. v.) seis veces cada segundo día, Ej.18b fue administrado intravenosamente (i. v.) en 13, 15, 21 , 24° día del experimento. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación. En el 24° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Fig. 19 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 20 que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las Figuras 1 y 2 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej.18b y Ej.2b causó la inhibición del crecimiento del tumor HCT1 16, respectivamente con TGI 81 % y 67 % con respecto al control en el 24° día del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 38 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TFÍAIL sola.

B1. HCT 16 En el día O ratones Cri:SHO-PrtatescWHf/"r fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 5x106 de células HCT1 16 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3: 1 de regulador de pH de HBSS:Matrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 63-370 mm3 (día 17), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 190 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de las proteínas de fusión de la invención del Ej.18b (3 mg/kg) y rhTRAIL1 14-281 (70 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 mM Trizma Base, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2, 10 % glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0) como un control. rhTRAIL 14-281 fue administrado intravenosamente (i. v.) seis veces cada segundo día y el Ej.18b fue administrado intravenosamente (i.v.) seis veces cada cuarto día. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación. En el 47° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Fig. 19A como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 20A que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en la Fig. 9A y 20A muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej.18b causó la inhibición del crecimiento del tumor HCT116 con TGI 85 % con respecto al control en el 47° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 37 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

C. SW620 TAZD En el día 0 ratones CrlS O-Prkdc^H^ fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 5x106 de células SW620 suspendidas en 0.1 mi mezcla 3:1 de regulador de pH HBSS:Matrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 92-348 mm3 (día 13), los ratones fueron aieatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 207 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del Ej.2b (5 mg/kg), Ej.18b (3 mg/kg) y Ej.51b (5 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (50 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 mM Trizma Base, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2, 10 % glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0) como un control. Las preparaciones fueron administrados intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día, el grupo de control recibió regulador de pH de formulación [f25].

En el 26° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Fig. 21 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 22 que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las Fig. 21 y 22 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej.18b, Ej. 51b, y Ej.2b causó la inhibición del crecimiento del tumor SW620, respectivamente con TGI 62.6 %, 39 % y 54 % con respecto al control en el 34' día del experimento. Para rhTF¾AIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 23 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

C1 SW620 En el día 0 ratones C&.SHO-Prkdc^H^ fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 5x106 de células SW620 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3:1 de regulador de pH HBSS:Matrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 126-300 mm3 (día 11), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de - 210 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de las proteínas de fusión de la invención del Ej.18b (5 mg/kg), y rhTRAIL1 14-281 (50 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 mM Trizma Base, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCb, 10 % glicerol, 80 mM sacarosa, pH 8.0) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) cinco veces cada tercer día. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación [f25].

En el 31 ° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Fig. 21 A como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 22A que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en la Figuras 21 A y 22A muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej.18b causó la inhibición del crecimiento del tumor SW620 con TGI 73 % con respecto al control en el 31 ° día del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 27.6 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

D. HT-29 En el día 0 ratones Cri:S O-Prkdc?ck,Hihr fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 5x106 de células HT-29 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3:1 de regulador de pH HBSS: atrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 80-348 mm3 (día 12), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 188 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de las proteínas de fusión de la invención del Ej.18b (4 dosis de 3 mg/kg, quedando 2 dosis de 6 mg/kg), Ej. 51b (5 mg/kg) y rhTRAIL1 14-281 (50 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación [f25]. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación (50 mM Trizma Base, 200 mM NaCI, 5 mM glutationa, 0.1 mM ZnCI2l 10 % glicerol, 80 mM de sacarosa, pH 8.0) como un control. En el 26° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 23 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 24 que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (%TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en la Figuras 23 y 24 muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 18b y Ej. 51 b causó la inhibición del crecimiento del tumor HT- 29, respectivamente con TGI 53 % y 67 % con respecto al control en el 26° día del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 17.5 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Modelo de cáncer de pulmón A. En el día 0 ratones Cby.Cg-foxn1 (nu)/J fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células A549 suspendidas en 0.15 mi medio HBSS por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x25 mm (Bogmark). En el día 20° del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 45 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 18a (5 mg/kg) y Ej. 35a (5 mg/kg), rhTRAIL1 14-281 (15 mg/kg) como una comparación y agua para las inyecciones como un control. Las preparaciones fueron administrados intravenosamente {i. v.) como sigue: administración (día 1 ), un día de pausa, administración diaria en los días 3o, 4o, 5o, un día de pausa, administración (día 7o), un día de pausa, administración (día 9o). En el 38° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 3 y Fig. 4, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 3) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control (Fig. 4).

Los resultados de los experimentos presentados en la Fig. 3 y Fig. 4 muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 18a y Ej. 35a causó la inhibición del crecimiento del tumor, con TGI 73.3 % y 20.7 %, respectivamente, con respecto al control en el 38° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 16 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Las proteínas de fusión probadas no causaron efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

B. En el día 0 ratones Cby.Cg-foxn1(nu)/J fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células A549 suspendidas en 0.10 mi de mezcla de medio HBSS y Matrigel (4:1) por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x25 mm (Bogmark). En el 19° día del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 75 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 18a (5 mg/kg) y Ej. 50a (20 mg/kg), rhTRAIU 14-281 (15 mg/kg) como una comparación y agua para inyecciones como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. En el 35° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 5 y Fig. 6, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 5) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control (Fig. 6).

Los resultados de los experimentos muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 18a y Ej. 50a causó la inhibición del crecimiento del tumor A549, con TGI 26 % y 45 %, respectivamente, con respecto al control en el 35° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, ningún efecto inhibitorio en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 0 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

C. En el día 0 ratones fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células A549 suspendidas en 0.10 mi de mezcla de medio HBSS y Matrigel (3:1) por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). En el 17° día del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~100-120 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 2a (5 mg/kg), Ej. 18a (3 mg/kg) y Ej. 44a (20 mg/kg), rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como una comparación y regulador de pH de formulación (19mM NaH2P04, 81 mM Na2HP04> 50mM NaCI, 5 mM glutation, 0.1 mM ZnC^, 10 % glicerol, pH 7.4) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. En el 34° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 7 y Fig. 8, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 7) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control (Fig. 8).

Los resultados de los experimentos muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 2a, Ej. 18a y del Ej. 44a causó la inhibición del crecimiento del tumor A549, con TGI 83.5 %, 80 % y 47 %, respectivamente, con respecto al control en el día 34° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 21.8 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

D. En el día 0 ratones fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 7x106 de células A549 suspendidas en 0.10 mi de mezcla de medio HBSS y Matrigel (3:1) por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). En el 21° día del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de -160-180 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 20a (15 mg/kg), Ej. 26a (6 mg/kg), Ej. 43a (10 mg/kg) y Ej. 47a (5 mg/kg), rhTRAIL114-281 (40 mg/kg) como una comparación y regulador de pH de formulación (5mM de NaH2P04, 95mM de Na2HP04, 200 mM de NaCI, 5 mM de glutation, 0.1 mM de ZnCI2, 10 % glicerol, 80mM de sacarosa, pH 7.4) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. En el 35° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 9 y Fig. 10, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 9) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control (Fig. 10).

Los resultados de los experimentos muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 20a, Ej. 26a, Ej. 43a y Ej. 47a causó la inhibición del crecimiento del tumor A549, con TGI 49.5 %, 64 %, 40.2 % y 49.5 %, respectivamente, con respecto al control en el 35° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 15 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

E. Recrecimiento del tumor A549 En el día 0 ratones Crl:SHO-Pr(dcsc'W fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 7x106 de células A549 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3:1 de HBSS buffer:Matrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 85-302 mm3 (día 17), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 77 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de las proteínas de fusión de la invención del Ej.2b (5 mg/kg), Ej.18b (3 mg/kg) y rhTRAIL1 14-281 (90 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 m de Trizma Base, 200 mM de NaCI, 5 mM de glutationa, 0.1 mM de ZnCI2, 10 % glicerol, 80 mM de sacarosa, pH 8.0) como un control. rhTRAIL1 14-281 fue administrado intravenosamente (i. v.) doce veces cada segundo día, el Ej.2b fue administrado intravenosamente (i. v.) siete veces cada segundo día y el Ej.18b fue administrado intravenosamente (i. v.) en el 17, 20, 25, y 29° día del experimento. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación. En el 45' día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 27 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 28 que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las Fig. 27 y 28 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej.18b y Ej.2b causó la inhibición del crecimiento del tumor A549 con TGI 71 % y 44%, respectivamente, con respecto al control en el 45° día del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 10.6 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Modelo de cáncer de páncreas En el día 0 ratones fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 7x106 de células PANC-1 suspendidas en 0.10 mi de mezcla de medio HBSS y Matrigel (3:1) por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). En el 27° día del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de -95 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 20a (5 mg/kg), Ej. 51a (10 mg/kg) y Ej. 52a (10 mg/kg), rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como una comparación y regulador de pH de formulación (5mM NaH2P0 , 95 mM de Na2HP04, 200 mM de NaCI, 5 mM de glutation, 0.1 mM de ZnCb, 10 % de glicerol, 80 mM de sacarosa, pH 7,4) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. En el 40° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 11 y Fig. 12, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 11) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control (Fig. 12).

Los resultados de los experimentos muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 20a, Ej. 51a y Ej. 52a causó la inhibición del crecimiento del tumor PANC-1 , con TGI 19 %, 38 y 34%, respectivamente, con respecto al control en el 40° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 12 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

B. En el día 0 ratones fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células PANC-1 suspendidas en 0.10 mi mezcla de medio HBSS y Matrigel (3:1) por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). En el 31° día del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~110 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 18a (3 mg kg) y Ej. 44a (20 mg/kg), rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) como una comparación y regulador de pH de formulación (19 mM de NaH2P0 , 81 mM de Na2HP0 , 50 mM de NaCI, 5 mM de glutation, 0.1 mM de ZnC , 10 % de glicerol, pH 7.4) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. En el 42° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en Fig. 13 y Fig. 14, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 13) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control (Fig. 1 ).

Los resultados de los experimentos muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 18a y Ej. 44a causó la inhibición del crecimiento del tumor PANC-1 , con TGI 56 % y 43 %, respectivamente, con respecto al control en el 42° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 27.5 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

Modelo de cáncer de próstata En el día 0 ratones fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 5x106 de células PC3 suspendidas en 0.20 mi de mezcla de medio HBSS y Matrigel (9:1) por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). En el 29° día del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~90 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 18a (5 mg/kg) y agua para inyección como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. En el 60° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 15 y Fig. 16, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 15) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control y (Fig. 16).

Los resultados de los experimentos muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej. 18a causó la inhibición del crecimiento del tumor PC3, con TGI 30.8 % con respecto al control en el 60° día del experimento.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

Modelo de cáncer de hígado A. PCL/PRF/5 En el día 0 ratones CrLSHO-Prkdc^Hr^ fueron injertados subcutáneamente (se) en el lado derecho con 7x106 de células PCL/PRF/5 suspendidas en 0.10 mi de mezcla de medio HBSS y Matrigel (3:1) por medio de una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). En el 31° día del experimento los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~200 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteínas de fusión de la invención del ejemplo 51a (10 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) como una comparación y regulador de pH de formulación (5 mM de NaH2P04l 95 mM de Na2HP04, 200 m de NaCI, 5 mM de glutation, 0.1 mM de ZnC , 10 % de glicerol, 80 mM de sacarosa, pH 7.4) como un control. Las preparaciones fueron administradas intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día. En el 49° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 17 y Fig. 18, como un diagrama de cambios del volumen del tumor (Fig. 17) y la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control y (Fig. 18).

Los resultados de los experimentos muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej. 51a causó la inhibición del crecimiento del tumor PCL/PRF/5, con TGI 88.5 % con respecto al control en el 49° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 usado como una referencia comparativa, un efecto ligeramente inhibidor en el crecimiento de la célula de tumor se obtuvo con respecto al control, con TGI al nivel de 18 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

B.HepG2 En el día 0 ratones C l.SHO-Prkdc^H^ fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 7x106 de células HepG2 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3:1 de HBSS buffer:Matrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 64-530 mm3 (día 25), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 228 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteína de fusión de la invención del Ej.18b (5 mg/kg suplementado con 10 mg kg HSA) y rhTRAIL1 14-281 (50 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 mM de Trizma Base, 200 mM de NaCI, 5 mM de glutationa, 0.1 mM de ZnCI2, 10 % de glicerol, 80 mM de sacarosa, pH 8.0) como un control y el compuesto de referencia 5FU (20 mg/kg). rhTRAIL1 14-281 fue administrado intravenosamente (i.v.) seis veces cada segundo día, el Ej.18b fue administrado intravenosamente {i.v.) en el 25, 27, 29, 37, y 42° día del experimento. 5FU (20 mg/kg) fue administrado ¡ntraperitonealmente (i.p.) seis veces cada segundo día. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación. En el 49° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Fig. 25 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 26 que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en la Figuras 25 y 26 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej. 18b causó la inhibición del crecimiento del tumor HepG2 con TGI 82.5 % con respecto al control en el 49° día del experimento. Para rhTFxAIL1 14-281 y 5FU usado como una referencia comparativa, un efecto ligeramente inhibidor en el crecimiento de la célula de tumor se obtuvo con respecto al control, con TGI al nivel de 31 % y -4.7 %, respectivamente. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparado al TFÍAIL solo y quimioterapia estándar.

Las proteínas de fusión probadas no causan efectos secundarios significantes que se manifiestan por una disminución del peso corporal de los ratones (es decir, menos del 10 % del peso corporal de línea de base). Esto muestra baja toxicidad sistémica de la proteína.

Modelo de sarcoma uterino resistente a multifármacos MES-SA.Dx5 En el día 0 ratones Crl.SHO-Prkdc^Hi* fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 7x106 de células MES-SA.Dx5 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3: 1 de regulador de pH HBSS: atrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 64-323 mm3 (día 13), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 180 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de proteína de fusión de la invención del Ej.18b (5 mg/kg) y rhTRAIL114-281 (50 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 mM de Trizma Base, 200 mM de NaCI, 5 mM de glutationa, 0.1 mM de ZnCI2, 10 % glicerol, 80 mM de sacarosa, pH 8.0) como un control y compuesto de referencia CPT-1 1 (camptotecina, Pfeizer) (30 mg/kg). rhTRAIL1 14-281 y Ej. 18 fueron administrados intravenosamente (i. v.) seis veces cada segundo día. CPT-1 1 fue administrado intraperitonealmente (i.p.) seis veces cada segundo día. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación. En el 34° día del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la columna vertebral.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Fig. 29 como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 30 que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las Fig. 29 y 30 muestran que la administración de la proteína de fusión de la invención del Ej. 18b causó la inhibición del crecimiento del tumor MES-SA/Dx5 con TGI 85 % con respecto al control en el 34° día del experimento. Para rhTRAIL1 14-281 y CPT-1 1 usado como la referencia comparativa, un efecto ligeramente inhibidor en el crecimiento de la célula de tumor se obtuvo con respecto al control, con TGI al nivel de 51 % y 57 %, respectivamente. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparado al TRAIL solo y quimioterapia estándar.

MES-SA Dx5 En el día 0 ratones Crl:SHO-P^ dcs 'W fueron injertados subcutáneamente (s.c.) en el lado derecho con 7x106 de células MES-SA.Dx5 suspendidas en 0.1 mi de mezcla 3:1 de regulador de pH HBSS:Matrigel usando una jeringa con una aguja de 0.5 x 25 mm (Bogmark). Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 26-61 1 mm3 (día 19), los ratones fueron aleatorizados para obtener el tamaño promedio de los tumores en el grupo de ~ 180 mm3 y se asignaron a grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron administrados con las preparaciones de la proteína de fusión de la invención del Ej. 2b (3 mg/kg), Ej. 18 (3 mg/kg), Ej. 51 b (7.5 mg/kg) y rhTRAIL 1 14-281 (60 mg/kg) como una comparación contra regulador de pH de formulación (50 mM Trizma Base, 200 mM de NaCI, 5 mM de glutationa, 0.1 mM de ZnCI2l 10 % de glicerol, 80 mM de sacarosa, pH 8.0). rhTRAIL 1 14-281 , Ej. 2b y Ej. 51b fueron administradas intravenosamente (i. v.) seis veces cada segundo día. Ej. 18b fueron administradas intravenosamente (i. v.) cuatro veces cada segundo día. El grupo de control recibió regulador de pH de formulación.

En el día 33° del experimento los ratones fueron sacrificados por interrupción de la médula espinal.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 29A como un diagrama de cambios del volumen del tumor y en la Figura 30A que muestra la inhibición del crecimiento del tumor (% TGI) como el porcentaje de control.

Los resultados de los experimentos presentados en las gráficas en las Figuras 29A y 30A muestran que la administración de las proteínas de fusión de la invención del Ej. 2b, Ej. 18b y Ej. 51 b causó la inhibición del crecimiento del tumor MES-SA/Dx5 con TGI 84 %, 67.5 % y 58.6 %, respectivamente, con respecto al control en el 33° día del experimento. Para rhTRAIL114-281 utilizado como la referencia comparativa, un efecto inhibitorio leve en el crecimiento de las células de tumor fue obtenido con respecto al control, con TGI en el nivel de 25.8 %. Así, las proteínas de fusión de la invención ejercen un efecto mucho más fuerte comparadas con la TRAIL sola.

Claims (39)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína de fusión que comprende: - el dominio (a) que es un fragmento funcional de la secuencia de la proteína hTRAIL soluble, fragmento que comienza con un aminoácido en una posición no menor que hTRAIL95 o un homólogo de dicho fragmento funcional que tiene por lo menos 70 % de identidad de secuencia, preferiblemente 85 % de identidad y termina con el aminoácido hTRAIL281 , y - por lo menos un dominio (b) que es la secuencia de un péptido efector que inhibe la síntesis de proteínas, en donde la secuencia del dominio (b) está unida al C-terminal y/o N-terminal del dominio (a), y en donde la proteína de fusión no contiene una unión de dominio a receptores de carbohidrato en la superficie de la célula.

2.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el dominio (a) comprende un fragmento de la secuencia de proteína soluble hTRAIL, que comienza con un aminoácido en el intervalo de hTRAIL95 a hTRAIL121 , inclusive y termina con el aminoácido 281.

3.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque el dominio (a) se selecciona del grupo que consiste en hTRAIL95-281 , hTRAIL1 14-281 , hTRAIL116-281 , hTRAIL1 19-281 , hTRAIL! 20-281 , y hTRAIL121-281.

4.- La proteína de fusión de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque el dominio (a) es un homólogo de dicho fragmento funcional de hTRAIL con afinidad modificada a los receptores DR4 y/o DR5.

5.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicho homólogo se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143.

6. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 a 5, caracterizada además porque el péptido efector del dominio (b) es un péptido que inhibe enzimáticamente la traducción de proteínas en el nivel de ribosoma.

7. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el péptido efector es un péptido con actividad enzimática de N-glicosidasa.

8.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el péptido efector se selecciona del grupo que consiste en ribosomas inactivantes de toxina de proteínas RIP tipo 1 y subunidades catalíticas A de ribosomas inactivantes de toxinas de proteínas RIP tipo 2 o modificaciones de los mismos con actividad conservada de N-glicosidasa de por lo menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia original.

9.- La proteína de fusión de conformidad con la reiivndicación 8, caracterizada además porque el péptido efector es seleccionado del grupo de toxinas de RIP tipo 1 que comprenden gelonia (de Gelonium multiflorum), gelonina mutada, momordina, saporina, briodina I, dodekandrina, bouganina (de Bougainvillea spectabilis), proteína PAP de hierba carmín (Phytolacca Americana), o del grupo de subunidades A catalíticas de toxinas RIP tipo 2 que comprenden subunidades A de ricina, variante mutada de ricina, abrina (de Abbrus precatrius), variante mutada de abrina, modeccina (de Adenia digitata), viscumina (toxina MLI de Viscum álbum), volkensina (de Adenia volkensii), toxina Shiga (de Shigella dysenteriae), tricosantina, variantes mutadas de tricosantina, o modificaciones de los mismos con actividad conservada de N-glicosidasa de por lo menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia original.

10.- La proteína de fusión de conformidad con las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada además porque el péptido efector se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 y SEQ ID NO: 200.

11.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el péptido efector es un péptido con actividad enzimática de ribonucleasa.

12.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque el péptido efector es seleccionado de toxinas de proteína alfa-sacrina, mitogilina, hirsutelina (de Hirsutella thompsonii), restrictocina (de Aspergillus restrictos), y las modificaciones de los mismos con actividad conservada de ribonucleasa de por lo menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia original.

13. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque el péptido efector se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72.

14. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el péptido efector es un péptido con actividad enzimática de ADP-ribosiltransferasa.

15 - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el péptido efector es seleccionado del grupo que consiste en subunidades catalíticas A de Pseudomonas aeruginosa o subunidades A catalíticas mutadas de la toxina de Pseudomonas aeruginosa y toxina de difteria de Corynebacterium diphteriae o toxina mutada de difteria de Corynebacterium diphteriae y modificaciones de los mismos con actividad conservada de ADP-ribosiltransferasa de por lo menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia original.

16.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el péptido efector se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 , SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197 , SEQ ID NO: 201 , SEQ ID NO: 202 , SEQ ID NO: 203 , SEQ ID NO: 204 , SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206 y SEQ ID NO: 207.

17. - La proteína de fusión de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque el péptido efector del dominio (b) es una toxina que inhibe la síntesis de proteínas que pertenece a un sistema de toxina-antitoxina.

18. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el péptido efector es un péptido con actividad de topoisomerasa, actividad de ARNmasa o se une con una membrana celular.

19. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el péptido efector se selecciona del grupo que consiste en proteína Ccdb de SEQ ID NO: 74, proteína CcdB de SEQ ID NO: 75, proteína Kid de SEQ ID NO: 73, proteína RelE de SEQ ID NO: 76 proteína StaB de SEQ ID NO: 77 y proteína Hok de SEQ ID NO: 208, y modificaciones de las mismas con actividad de topoisomerasa conservada, actividad de ARNmasa o unión con una actividad de membrana celular de por lo menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia original .

20. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada además porque entre el dominio (a) y el dominio (b) o entre los dominios (b) contiene el dominio (c) que contiene el sitio de disociación de proteasa.

21. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el dominio (c) contiene el sitio de disociación de proteasa reconocido por la proteasa presente en el ambiente de tumor.

22. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el péptido efector del dominio (b) está conectado adicionalmente con el dominio de transporte (d), seleccionado del grupo que consiste en: - (d1) un dominio de transporte a través de una membrana celular derivada de Pseudomonas de SEQ ID NO: 139; - (d2) un transporte de dominio a través de una membrana que dirige al retículo endoplasmático seleccionado de Lys Asp Glu Leu/KDEL, His Asp Glu Leu/HDEL, Arg Asp Glu Leu/RDEL, Asp Asp Glu Leu/DDEL, Ala Asp Glu Leu/ADEL, Ser Asp Glu Leu/SDEL, y Glu Asp Leu/KEDL; - (d3) secuencia de poliarginina de transporte a través de una membrana celular, que consta de 6, 7, 8, 9, 10 u 11 residuos de Arg, y combinaciones de los mismos, en donde el dominio de transporte (d) está situado en el C-terminal y/o el N-terminal del dominio del péptido efector (b).

23. - La proteína de la fusión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el dominio de transporte (d) está situado entre el dominio (b) y el dominio (c), o entre el dominio (a) y el dominio (c), o entre dos dominios (c).

24. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque la secuencia (d) se localiza en el C-terminal de la proteína de fusión.

25.- La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, caracterizada además porque comprende adicionalmente un enlazador estérico flexible entre los dominios (a), (b), (c) y/o (d).

26.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el enlazador estérico es seleccionado de Gly Gly Gly Gly Ser/GGGGS, Gly Gly Gly Ser/GGGS o Gly Gly Gly/GGG, Gly Gly Gly Gly/GGGG, Ala Ser Gly Gly/ASGG, Ala Ser Gly/ASG, Gly Gly Gly Ser Gly/GGGSG, Gly Gly Gly/GGG, Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gly Gly/GGGSASGG, Ser His His Ser/SHHS, CAAACAAC (Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys), CAACAAAC (Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys) y combinaciones de los mismos.

27. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizada además porque entre los dominios (a), (b) y/o (c) contiene el dominio (e) que es un enlazador para la fijación de molécula de PEG, seleccionado de Ala Ser Gly Cys Gly Pro Glu/ASGCGPE, Ala Ala Cys Ala Ala/AACAA, Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser/SGGCGGS o Ser Gly Cys Gly Ser /SGCGS.

28. - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, caracterizada además porque entre el dominio (b) y el dominio (c) contiene adicionalmente un motivo de unión con las integrinas seleccionadas del grupo que consiste en Asn Gly Arg/NGR, Asp Gly Arg/DGR o Arg Gly Asp/RGD.

29.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 1 ; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 1 1 ; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21 ; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 ; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41 ; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 51 ; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; SEQ ID NO: 147; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151 ; SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 153; SEQ ID NO: 154; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 157; SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 161 ; SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 163; SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 168.

30 - La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque es una proteína recombinante.

31. - Una secuencia de polinucleótidos, que codifica la proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.

32. - La secuencia de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque se optimiza para la expresión genética en E. coli.

33. - La secuencia de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91 ; SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 1 10, SEQ ID NO: 11 1 ; SEQ ID NO: 1 12; SEQ ID NO: 113; SEQ ID NO: 114; SEQ ID NO: 1 15; SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 117; SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 121 ; SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 123; SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127; SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131 ; SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 133; SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; SEQ ID NO: 137; SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO:169; SEQ ID NO: 170; SEQ ID NO: 171 ; SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 174; SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO: 177; SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 181; SEQ ID NO: 182; SEQ ID NO. 183; SEQ ID NO. 184; SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; SEQ ID NO: 187; SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; SEQ ID NO: 190; SEQ ID NO: 191 ; SEQ ID NO: 192, y SEQ ID NO: 193.

34.- Un vector de expresión, que comprende la secuencia de polinucléotidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33.

35.- Una célula hospedera, que comprende el vector de expresión tal como se define en la reivindicación 34.

36. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque es una célula de E. coli.

37. - Una composición farmacéutica, que comprende como un ingrediente activo la proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

38. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque está en una forma para la administración parenteral.

39. - La proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 para usarse en el tratamiento de enfermedades neoplásicas en mamíferos, incluyendo humanos.