MX2014002260A - Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para tratar trastornos y enfermedades metabólicas usando un polipéptido FGF21. En varias modalidades el trastorno o enfermedad metabólica es Diabetes Tipo 1, obesidad, dislipidemia, niveles de glucosa elevados, niveles de insulina elevados, nefropatía diabética, neuropatía, retinopatía, enfermedad del corazón isquémica, enfermedad vascular periférica y enfermedad cerebrovascular.

Description

FACTOR DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTO 21 PARA USAR EN EL TRATAMIENTO DE DIABETES TIPO 1 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención descrita se refiere al tratamiento o aminoración de Diabetes Tipo 1 al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 a un sujeto que necesita del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Factor del Crecimiento de Fibroblasto 21 (FGF21) es un polipéptido secretado que pertenece a una subfamilia de Factores del Crecimiento de Fibroblasto (FGFs) que incluye FGF19, FGF21, y FGF23 (Itoh et al., (2004) Trend Genet. 20:563-69). FGF21 es un FGF atipico en que es independiente de la heparina y funciona como una hormona en la regulación de glucosa, lipido, y metabolismo energético.

Se expresa altamente en hígado y páncreas y es el único miembro de la familia FGF que se expresa principalmente en el hígado. Los ratones transgénicos que sobreexpresan FGF21 exhiben fenotipos metabólicos de velocidad de crecimiento lenta, nivel de glucosa en plasma y niveles de triglicéridos bajos, y una ausencia de diabetes tipo 2 asociada con la edad, hiperplasia del islote, y obesidad. La administración farmacológica de proteina FGF21 recombinante en modelos de roedores y primates resulta en niveles normalizados de glucosa en plasma, niveles · de triglicéridos y colesterol reducidos, y tolerancia a la glucosa mejorada y sensibilidad a la insulina. Además, FGF21 el reduce peso corporal y grasa corporal al incrementar gasto de energía, actividad física, y velocidad metabólica. La investigación experimental proporciona soporte para la administración farmacológica de FGF21 para el tratamiento de diabetes, obesidad, dislipidemia, y otras afecciones metaból'icas o trastornos en humanos .

Se han definidos los dos principales tipos de diabetes, tipo 1 y tipo 2. En la diabetes, tipo 1, también llamada diabetes mellitus dependiente de. la insulina (IDDM, por sus siglas en inglés), el páncreas produce niveles insuficientes de insulina. Los pacientes que padecen de diabetes tipo 1 deben depender de administrarse insulina para subrevivir. Los pacientes que padecen de diabetes de tipo 2, también referida como diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM, por sus siglas en inglés) , todavía pueden producir insulina, pero en una manera relativamente inadecuada. En muchos casos, el páncreas producice cantidades más grandes de insulina que las normales. Una característica distintiva de la diabetes tipo 2 es la carencia de sensibilidad a- la insulina por las células del cuerpo (particularmente células de grasa y músculo) .

Además de los problemas de resistencia a la insulina incrementada, la liberación de insulina por el páncreas también puede ser defectuosa y subóptima en pacientes que padecen de diabetes tipos 2. De hecho, se conoce que hay una disminución continua en la producción de células beta de insulina en diabetes tipo 2 lo que contribuye a empeorar el control de glucosa; este es un factor principal para que muchos pacientes con diabetes tipo 2 finalmente requieran terapia de insulina. Adicionalmente, los h+igados de pacientes con diabetes tipo 2 continúan produciendo glucosa a través de la gluconeogénesis , a pesar de los niveles elevados de glucosa. De esta manera, en los pacientes con diabetes tipos 2, el control de gluconeogénesis puede comprometerse.

Un paciente que padece de Diabetes Tipo 1 necesita insulina para sobrevivir (ver, por ejemplo, Falorni et al., (1995) Bailliere's Clin. Endocrinol. Met . 9:25-46). La insulina puede usarse para tratar diabetes tanto de tipo 1 como tipo 2 pero ningún otro compuesto actual en el mercado usado para tratar diabetes tipo 2 puede usarse para tratar diabetes tipo 1 (Raslova, (2010) Vasc. Health Risk Manag. 6:399-410). En contraste a la terapia de insulina establecida, la descripción actual proporciona un método para tratar Diabetes Tipo 1 usando FGF21, y de esta manera una alternativa terapéutica para profesionales del cuidado de la salud en el tratamiento de pacientes con Diabetes Tipo 1.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto se. proporciona un método para tratar un trastorno metabólico. En una modalidad el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un polipéptido FGF21 humano; o (b) un polipéptido FGF21 variante. En una modalidad adicional el trastorno metabólico es Diabetes Tipo 1. En una modalidad adicional el trastorno metabólico es dislipidemia . En una modalidad adicional el trastorno metabólico es obesidad. En una modalidad adicional el trastorno metabólico es nefropatia diabética. En una modalidad adicional el trastorno metabólico comprende una afección en la cual el sujeto tiene un nivel de glucosa en la sangre en ayuno de más de o igual a 100 mg/dL. En una modalidad el sujeto en el cual el método se . realiza es un mamífero y en otro el mamífero es un humano. En una modalidad específica el polipéptido FGF21 humano comprende una de las SEQ ID NOs : y 8 y en otra modalidad el polipéptido FGF21 humano se codifica por una de las SEQ ID NOs : 3 y 7. Todavía en una modalidad adicional el FGF21. variante comprende una o más mutaciones en la. secuencia FGF21 madura de una de las SEQ ID NOs : 4 y 8 seleccionada de las mutaciones presentadas en las Tablas 1-13. En otra modalidad, el polipéptido FGF21 se administra en la forma de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido FGF21 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Aún en una modalidad adicional el método descrito comprende además la etapa de determinar el nivel de glucosa en la sangre del sujeto en un punto de tiempo posterior a la administración. En otra modalidad el método comprende además la etapa de determinar el nivel de insulina en suero del sujeto en un punto de tiempo posterior a la administración. Todavía en otra modalidad el polipéptido FGF21 humano o polipéptido variante FGF21 humano comprende además uno o más de (a) una o más moléculas PEG; y (b) un polipéptido Fe. En una modalidad particular el polipéptido. FGF21 humano aislado o polipéptido FGF21 variante comprende una de las SEQ ID NGs:10 y 12 y en otra modalidad el polipéptido FGF21 humano aislado; o polipéptido FGF21 variante comprende una de las SEQ ID NOs:39 y 41.

También se proporciona en la presente otro método para tratar un trastorno metabólico. . En una modalidad el método comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de . un polipéptido FGF21 humano que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NOs : 4 y 8. En una modalidad adicional el trastorno metabólico es Diabetes Tipo 1. En una modalidad adicional el trastorno metabólico es dislipidemia . En una modalidad adicional el trastorno metabólico es obesidad. En una modalidad adicional el trastorno metabólico es nefropatia diabética. En una modalidad adicional el trastorno metabólico comprende una afección en la cual el sujeto tiene un nivel de glucosa en la sangre en ayuno de más de o igual a 100 mg/dL. En una modalidad el sujeto en el cual el método se realiza es un mamífero y en otro el mamífero es un humano. En una modalidad específica el polipéptido FGF21 humano comprende una de las SEQ ID NOs : 4 y 8 y en otra modalidad el polipéptido FGF21 humano se codifica por una de las SEQ ID NOs : 3 y 7. Todavía en una modalidad adicional el FGF21 variante comprende una o más mutaciones en la secuencia FGF21 madura de SEQ ID 'NO: 4 o. SEQ ID N0:8 seleccionada de las mutaciones presentadas en las Tablas 1-13. En otra modalidad el polipéptido FGF21 se administra en la forma de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido FGF21 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Aún en una modalidad adicional el método descrito comprende además la etapa de determinar el nivel de glucosa en la sangre del sujeto en un punto de tiempo posterior a la administración. En otra modalidad el método comprende . además la etapa de . determinar el nivel de insulina en suero del sujeto en un punto de . tiempo posterior a la administración. Todavía en otra modalidad el polipéptido FGF21 humano o polipéptido variante FGF21 humano comprende además uno o más de (a) una o más moléculas PEG; y (b) un polipéptido Fe.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que muestra los niveles de glucosa en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo, insulina (5 IU/kg), FGF21 humano (1 mg/kg) , o un tratamiento de combinación de insulina (5 IU/kg) y FGF21 humano (1 mg/kg); se midió la glucosa en la sangre el día 3 después del inicio del tratamiento, y a 1 hora y 4 horas después de la inyección de la mañana y el día 5, a l hora después de la inyección de la mañana.

La Figura 2 es una gráfica en barras que muestra el análisis de química clínica de niveles de glucosa en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo, insulina (5 IU/kg), FGF21 humano (1 mg/kg), o un tratamiento de combinación de insulina (5IU/kg) y FGF21 humano (1 mg/kg); se colectó el plasma de las muestras de sangre antes, del tratamiento (Día 0) y aproximadamente 2 horas posterior a la inyección de la mañana (Día 5) se probaron.

La Figura 3 es una gráfica en barras que muestra el análisis de química clínica de niveles de triglicéridos en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1. inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo, insulina (5 IU/kg), FGF21 humano (1 mg/kg), o un tratamiento de combinación de insulina (5 IU/kg) y FGF21 humano (1 mg/kg) ; el plasma de las muestras ' de sangre colectado antes del tratamiento (Día 0) y aproximadamente 2 horas posterior a la inyección de la mañana (Día 5) se probaron.

La Figura 4 es una gráfica en barras que muestra el análisis de química clínica de niveles de colesterol total en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo, insulina (5 IU/kg), FGF21 humano (1 mg/kg), o un tratamiento de combinación de insulina (5 IU/kg) y FGF21 humano (1 mg/kg); se colectó el plasma de las muestras de sangre antes del tratamiento (Día 0) y aproximadamente 2 horas posterior a la inyección de la mañana (Día 5) se probaron.

La Figura 5 es una . gráfica en barras que muestra el análisis de química clínica de niveles de ácido graso libre en plasma (NEFA) medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo, insulina (5 _ IU/kg) , FGF21 humano (1 mg/kg), o un tratamiento de combinación de insulina . (5 IU/kg) y FGF21 humano (1 mg/kg) ; se colectó el plasma de las muestras de sangre antes del tratamiento (Día 0) y aproximadamente 2 horas posterior la inyección de la mañana (Día 5) se probaron.

La Figura 6 es una gráfica en barras que muestra los niveles de insulina medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo, insulina (5 IU/kg), FGF21 humano (1 mg/kg), o un tratamiento de combinación de insulina (5 IU/kg) y FGF21 humano (1 mg/kg); se colectó el plasma de las muestras de sangre antes del tratamiento (Día 0) y aproximadamente 2 horas posterior a la inyección de la mañana (Día 5) se probaron.

La Figura 7 es una gráfica en barras que muestra los niveles de glucagón medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina administrada con vehículo, insulina (5 IU/kg), FGF21 humano (1 mg/kg), o un tratamiento de combinación de insulina (5 IU/kg) y FGF21 humano (1 mg/kg); se colectó el plasma de las muestras de sangre antes del tratamiento (Día 0) y aproximadamente 2 horas posterior a la inyección de la mañana (Día 5) se probaron.

La Figura 8 es una gráfica que muestra niveles de glucosa en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 y 5 mg/kg) ; se midió la glucosa en la sangre el día 0 previo a la inyección y en los días 1, 3, 5, y 7.

La Figura 9 es una gráfica que muestra niveles de glucosa en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo 0 la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble. (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg); se midió la glucosa en la sangre el día 0 previo a la inyección y en los días 2, 6, 10, 14, 18 y 22.

La Figura 10 es una gráfica en barras que muestra niveles de glucosa en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día 0 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 27 (siete días posteriores a la última inyección de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C,. R77C, P171G) ) .

La Figura 11 es una gráfica en barras que muestra niveles de triglicéridos medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día 0 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 27 (siete días posteriores a la última inyección de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) ) .

La Figura 12 es una gráfica en barras que muestra niveles de colesterol medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día 0 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 27 (siete días posteriores a la última inyección de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) ) .

La Figura 13 es una gráfica en barras que muestra niveles de HDL medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día 0 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 27 (siete días posteriores a la última inyección de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) ) .

La Figura 14 es' una gráfica en barras que muestra Niveles de NEFA medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día 0 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 27 (siete días posteriores a la última inyección de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) ) .

La Figura 15 es una gráfica en barras que muestra niveles de insulina medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo 0 la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día 0 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 27 (siete días posteriores a la última inyección de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) ) .

La Figura 16 es una gráfica' que muestra el cambio en el peso corporal medido en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina, que se les administró vehículo o la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) ; se obtuvieron las mediciones el día 0 (72 horas posterior a la quinta .inyección de STZ) y en los días 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22.

La Figura 17 es una gráfica que muestra niveles de glucosa en plasma medidos en ratones con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina con dosis baja múltiple (MLD) que se les administró vehículo ó la variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) · (1 mg/kg); se midió la glucosa en la sangre previo a la inyección el día -2, y en los días 2, 6, 10 y 14.

La Figura 18 es una gráfica en barras que ; muestra niveles de insulina medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día -20 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) el día 18) .

La Figura 19 es una gráfica en barras que muestra niveles de triglicéridos medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día -20 (posterior a . la quinta inyección de STZ) y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) el día 18) .

La Figura 20 es una gráfica en barras que muestra niveles de colesterol¦ medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día -20 (posterior a la quinta inyección de STZ). y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) el día 18) .

La Figura 21 es una gráfica en barras que muestra niveles de HDL medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 'PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día -20 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) el día 18).

La Figura 22 es una gráfica en barras que muestra Niveles de NEFA medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día -20 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) el día 18) .

La Figura 23 es una gráfica en barras que muestra niveles de insulina medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día -20 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) el día 18) .

La Figura 24 es una gráfica en barras que muestra niveles de AST medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 PEGilada de 20kd doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el¦ día -20 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P1.71G) el día 18).

La Figura 25 es una gráfica en barras que muestra niveles de ALT medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina que se les administró vehículo o la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) el día -20 (posterior a la quinta inyección de STZ) y el día 18 (dos días después de la última inyección de variante FGF21 PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) el día 18) .

La Figura 26 es una gráfica que muestra el cambio en el peso corporal medidos en ratones MLD con diabetes tipo 1 inducidos con esterptozotocina, que se les administró vehículo o la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) ; se obtuvieron las mediciones el día 0 (23 días posteriores a la quinta inyección de STZ) y en los días 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18.

La Figura 27 es una fotomicrografía que muestra inmunoreactividad a la insulina en isletas de ratones tratados con estreptozotocina; los paneles superiores son isletas de ratones tratados con vehículo (A3) y los paneles inferiores de ratones tratados con FGF21 (B3) . La magnificación original fue ~25x.

La Figura 28 es una tabla que resume la inmunoreactividad a la insulina y hallazgos morfométricos de cada ratón tratado con vehículo y PEG-FGF21; los ratones tratados con vehículo se indican Al hasta A5, mientras que los ratones tratados con PEG-FGF21 se indican como Bl hasta B5.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción actual proporciona un método para tratar Diabetes Tipo 1 al administrar a un sujeto que necesita del mismo una cantidad ' terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21 humano aislado. También se proporcionan métodos de administración y suministro.

Los métodos de ácido nucleico y polipéptido recombinantes usados en la presente, incluyendo en los Ejemplos, son generalmente aquellos establecidos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds . , Green Publishers Inc. y Wiley and Sons 1994), ambos de los cuales se incorporan en la presente para referencia para cualquier propósito.

I . Definiciones Generales Como es costumbre, como se usa en la presente "el/la" y "un/una" significa "uno o más" a menos que se indique específicamente lo contrario.

Como se usa en la presente, los términos "aminoácidos" y "residuo" son intercambiables y, cuando se usan en el contexto de un péptido o polipéptido, se refiere a aminoácidos tanto que se presentan naturalmente como sintéticos, así como análogos de aminoácidos, miméticos de aminoácidos y aminoácidos que no se presentan naturalmente que son químicamente similares a los aminoácidos que se presentan naturalmente.

Un "aminoácido que se presenta naturalmente" es un aminoácido que se codifica por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se codifican por el código genético que se modifican después de la síntesis, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, y 0-fosfoserina . Un análogo de aminoácidos es un compuesto que tiene la misma estructura química básica como los aminoácidos que se presentan naturalmente, es decir, un carbono a que se enlaza a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfóxido de metil metionina. Tales análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o columnas de péptido modificadas, pero mantendrán la misma estructura química básica como los aminoácidos que se presentan naturalmente.

Un "mimético de aminoácidos" es un compuesto químico que tiene una estructura que es diferente de la estructura química general de aminoácidos, pero que funciona en una manera similar a los aminoácidos que se presentan naturalmente. Los ejemplos incluyen un derivado de metacriloilo o derivado de acriloilo de una amida, ácidos ß-, ?-, d-imino (tal como ácido piperidin-4-carboxílico acid) y similares.

Los "aminoácidos que no se presentan naturalmente" o "aminoácidos que no se codifican naturalmente," cuyos términos pueden usarse intercambiablemente en la descripción actual, es un compuesto que tiene la misma estructura química básica como los aminoácidos que se presentan naturalmente, pero no se incorporan en una cadena de polipéptido de crecimiento por el complejo de traducción in vivo. "Aminoácidos que no se presentan naturalmente" también incluye, pero no se. limita a, aminoácidos que se presentan por modificación (por ejemplo, modificaciones posteriores a la traducción) de un aminoácido codificado naturalmente (incluyendo pero no limitado a, los 20 aminoácidos comunes) pero por sí mismos no se incorporan naturalmente en una cadena de polipéptido de crecimiento por el complejo de traducción. Una lista de ejemplos no limitantes de aminoácidos que no se presentan naturalmente que puede insertarse en una secuencia de polipéptido o sustituirse por un residuo de tipo natural en la secuencia de polipéptido incluyen aminoácidos ß, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivadas. Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma D; abreviaturas como entre paréntesis): citrulina (City, homocitrulina (hCit) , Na-metilcitrulina (NMeCit) , N -metilhomocitrulina (?a- eHoCit ) , ornitina (Orn) , Na-Metilornitina (?a-MeOrn o NMeOrn) , sarcosina (Sar) , homolisina (hLys o hK) , homoarginina (hArg o hR) , homoglutamina (hQ) , ? -metilarginina (NMeR) , No¡-metilleucina (? -MeL o NMeL) , N-metilhomolisina (NMeHoK) , N -metilglutamina (NMeQ) , norleucina (Nle) , norvalina (Nva) , 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindol-2-carboxílico (Oic) , 3- ( 1-naftil ) alanina (1-Nal), 3- (2-naftil) alanina (2-Nal) , 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-yodofenilalanina (pl-Phe) , para-aminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Phe) , 4-guanidino fenilalanina (Guf ) , glicillisina (abreviado "K (?e-glicil ) " o "K(glicil)" o "K(gly)"), nitrofenilalanina (nitrofe), aminofenilalanina (aminofe o Amino-Phe) , bencilfenilalanina (bencilfe) , ácido ?-carboxiglutámico (?-carboxiglu) , hidroxiprolina (hidroxipro) , p-carboxil-fenilalanina (Cpa) , ácido a-aminoadípico (Aad) , ? -metil valina (NMeVal) , N-a- metil leucina (NMeLeu) , ?a-metilnorleucina (NMeNle) , ciclopentilglicina (Cpg) , ciclohexilglicina (Chg) , acetilarginina (acetilarg) , ácido a, ß-diaminopropionoico (Dpr) , ácido a, ?-diaminobutirico (Dab) , ácido diaminopropiónico (Dap) , ciclohexilalanina (Cha), 4-metil-fenilalanina (MePhe) , ß, ß-difenil-alanina (BiPhA) , ácido aminobutirico (Abu) , 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina ; 4Bip) , ácido -amino-isobutirico (Aib) , beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido piperidinico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, allo-hidroxilisina, isodesmosina, allo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp) , ?-carboxiglutamato, e-?, N, -trimetillisina, e-?-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, ?-metilarginina, ácido 4-amino-O-ftálico (4APA), y otros aminoácidos similares, y formas derivadas de cualquiera de aquellos enlistados específicamente.

El término "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a un polímero de hebra, doble o hebra sencilla de bases desoxiribonucleótido o ribonucleótido leído desde el extremo 5' al 3' (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico FGF21 variante o nativa proporcionada en la presente) , o un análogo del mismo, que se ha separado de al menos alrededor del 50 por ciento de polipéptidos , péptidos, lípidos, carbohidratos, polinucleótidos u otros materiales con los cuales el ácido nucleico se encuentra naturalmente cuando el ácido nucleico total está aislado de las células fuente. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada está sustancialmente libre de cualquier otras moléculas de ácido nucleico contaminantes u otras moléculas que se encuentran en el ambiente natural del ácido nucleico que interferirían con su uso en la producción del polipéptido o su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.

El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido FGF21 o polipéptido FGF21 variante proporcionada en la presente) que se ha separado de al menos alrededor de 50 por ciento de polipéptidos, péptidos, lípidos, carbohidratos, polinucleótidos, u otros materiales con los cuales el polipéptido se encuentra naturalmente cuando se aisla de una célula fuente. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquier otro de los polipéptidos contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que podrían interferir : con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.

El término "que codifica" se refiere a una secuencia de polinucleótido que codifica uno o más aminoácidos. El término no requiere un codon de inicio o paro. Una secuencia de aminoácidos puede codificarse en cualquiera de seis diferentes marcos de. lectura proporcionados por una secuencia de polinucleótido .

Los términos "identical" y porcentaje de "identidad," en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos , se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula con base en el tqamaño de la más pequeña de las moléculas a compararse. Para. estos cálculos, los espacios en las alineaciones (si los hay) pueden dirigirse por un modelo matemático particular o programa de computadora (es decir, un "algoritmo"). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen aquellos descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M. , ed. ) , (1988) Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W. , ed. ) , 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin, A. . , and Griffin, H. G., eds . ) , 1994, Nueva Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J. , eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073.

Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias a compararse se alinean de manera que da el emparejado más grande entre las secuencias. El programa de computadora usado para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al., (1984) Nucí. Acid Res. 12^:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo de computadora GAP se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para emparejado óptimo de sus respectivos aminoácidos o nucleótido (el "periodo emparejado", como se determina por el algoritmo). Una penalización de abertura de espacio (que se calcula como 3x la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación a usarse; la "diagonal" es el registro o número asignado a cada uno de los aminoácidos perfectos emparejados por la matriz de comparación particular) y una penalización de extensión de espacio (que es usualmente 1/10 veces la penalización de abertura de espacio) , asi como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan en conjunto con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver, Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se usa por el algoritmo.

Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótido usando el programa GAP son los siguientes: Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol . 48:443- 453; Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra; Penalización de espacio: 12 (pero sin penalización para espacios finales) Penalización de longitud de espacio: 4 Umbral de similitud: 0 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en el acoplamiento de únicamente una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede teenr identidad de secuencia muy alta aunque no haya relación importante entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método seleccionado de alineación (por ejemplo, el programa GAP) puede ajustarse si se desea para resultar en una alineación que expande al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo.

Los términos "polipéptido FGF21" y "proteína FGE21" se usan intercambiablemente y se refieren a un polipéptido de tipo natural que aparece naturalmente expresado en un mamífero, tal como un humano o un ratón. Para propósitos de esta descripción, el término "polipéptido FGF21" puede usarse intercambiablemente para referirse a cualquier polipéptido de longitud completa FGF21, por ejemplo, SEQ ID NOs : 2 y 4, que consisten de 209 residuos de aminoácidos y que son codificados por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NOs:l y 3; y cualquier forma que comprende la forma madura del polipéptido, por ejemplo, SEQ ID NOs: 4 y 8, ~que consisten de 181 residuos de aminoácidos y que son codificados por las secuencias de nucleótido SEQ ID NOs : 3 y 5, y en las que 28 residuos de aminoácidos en el extremo de terminal amino del polipéptido de longitud completa FGF21 (es decir, que constituyen el péptido de señal) se han removido. Los polipéptidos FGF21 puede pero necesita no comprender una metionina de terminal amino, que puede ser introducida por ingeniería o como resultado de un proceso de expresión bacterial.

El término "polipéptido FGF21" también abarca un polipéptido FGF21 en el que una secuencia de polipéptido FGF21 que aparece de manera natural (por ejemplo, SEQ ID N0s:2, 4, 6 y 8) ha sido modificada, de este modo generando una "variante FGF21". Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, una o más sustituciones de aminoácidos, incluyendo sustituciones con aminoácidos que no se presentan naturalmente análogos de aminoácidos que no se presentan naturalmente y miméticos de aminoácidos, y truncaciones . Por ejemplo, se sabe que FGF21 humano retiene actividad cuando se trunca en la terminal N por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 residuos y en la terminal C por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 residuos (que presumiblemente comprenden receptor y sitios de enlace. ß-Klotho, respectivamente; ver, por ejemplo, WO2009/149171) . Por consiguiente, las variaciones truncadas de la secuencia de residuo 181 de SEQ ID NOs : 2 o 4 puede emplearse en la invención. El término "polipéptido FGF21" abarca mutantes de punto que pueden introducirse en un polipéptido FGF21, por ejemplo aquellos en las Tablas 1-13. Además, se sabe que FGF21 existe en naturaleza en al menos dos isoformas; una isoforma comprende un residuo Prolina en posición 174 de la proteína de longitud completa (SEQ ID N0:2) (posición 146 de la forma madura de la proteina (SEQ ID N0:4)), mientras que otra comprende un residuo Leucina en esta posición (mostrada en SEQ ID N0s:6 y 8, formas de longitud completa , y madura, respectivamente). Cualquiera de estas isoformas puede emplearse en las composiciones descritas y métodos y son abarcadas por los términos "polipéptido FGF21," "proteina FGF21," y "variante FGF21" .

En varias modalidades, un polipéptido FGF21 o variante FGF21 comprende una secuencia de - aminoácidos que es al menos alrededor de 85 por ciento idéntica a un polipéptido FGF21 que aparece de manera natural (por ejemplo, SEQ ID N0s:2, 4, 6 y 8). En otras modalidades, un polipéptido FGF21 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 90 por ciento, o alrededor de 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácido de polipéptido FGF21 que aparece de manera natural (por ejemplo, SEQ ID N0s:2, 4, 6 y 8). Tales polipéptidos FGF21 preferiblemente, pero no necesariamente, poseen al menos una actividad de un polipéptido FGF21 de tipo natural, tal como la capacidad para disminuir la glucosa, insulina, triglicérido, o niveles de colesterol en la sangre; la capacidad para reducir peso corporal; o la capacidad para mejorar tolerancia a la glucosa, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina. La presente invención también abarca moléculas de ácido nucleico que codifican tales secuencias de polipéptido FGF21 y variante FGF21.

. Como se señaló, un polipéptido FGF21 humano o variante FGF21 puede comprender una secuencia de señal (residuos 1-28 de SEQ ID N0s:2 o 6) o puede tener la secuencia de señal removida (proporcionando la secuencia de residuo 181 de SEQ ID N0s:4 u 8), que es la forma activa de FGF21 in vivo. En algunos ejemplos, un polipéptido FGF21 o variante FGF21 puede usarse para tratar .o aliviar un trastorno metabólico en un sujeto es una forma madura de polipéptido FGF21 o variante FGF21 que se deriva de la misma especie como el sujeto.

Un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es preferiblemente biológicamente activo. En varias modalidades respectivas, un polipéptido FGF21 o variante FGF21 tiene una actividad biológica que es equivalente a, mayor o menor que la forma que se presenta de manera natural del polipéptido FGF21 o variante FGF21 madura de la cual la signal péptido ha sido removida de la terminal N de la secuencia de polipéptido FGF21 o variante FGF21 de longitud completa. Los ejemplos de actividades biológicas incluyen la capacidad de disminuir glucosa, insulina, triglicéridos , o niveles de colesterol en la sangre; la capacidad para reducir peso corporal; o la capacidad para mejorar la tolerancia a la glucosa, tolerenacia a lipidos, o sensibilidad a la insulina; la capacidad para disminuir glucosa en la orina y excreción de proteína.

Los términos "dosis terapéuticamente efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva", como se usan en la presente, se refieren a una cantidad de polipéptido FGF21 o variante FGF21 que eluye una respuesta biológica o. medicinal en un sistema de tejido, animal, o humano siendo buscado por un investigador, médico, u otro clínico, que incluye alivio o mejora de los síntomas de la enfermedad o trastorno siendo tratado, es decir, na cantidad de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 que respalda un nivel observable de una o más respuestas biológcas o medicinales más deseadas, por ejemplo disminución de glucosa, insulina, triglicéridos, o niveles de colesterol en la sa gre; reducción de peso corporal; o mejora de tolerancia a la glucosa, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina a un nivel deseado (por ejemplo, fisiológicamente normal para un humano) según se determina usando ensayos estándar conocidos para aquellas personas expertas en la técnica. Los ejempos de ensayos idóneos para determinar se proporcionan en la presente y pueden realizarse en una manera automatizada usando instrumentos comercialmente disponibles, tal como un Analizador de Química Olympus AU400e (Olympus America, Inc; Center Valley, PA) o un Kit de Endocrina ultiplex Humana (HENDO-75K, Millipore Corp., Billerica, MA) .

II. Polipéptidos FGF21, variantes FGF21 y ácido nucleicos que pueden emplearse en los métodos descritos Los varios métodos proporcionados en la presente pueden emplear algún polipéptido FGF21 o variante FGF21 descrito por la descripción. Estos polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 pueden producirse por ingeniería y/o producirse usando metodología estándar de biología molecular. En varios ejemplos, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido FGF21 o variante FGF21, que puede comprender toda o una porción de SEQ ID N0s:l, 3, 5 y 7 puede aislarse y/o amplificarse de AD ¦ genómico, o cADN usando usando cebadores oligonucleótidos apropiados. Los cebadores pueden diseñarse basándose en las secuencias nucleica y de aminoácidos proporcionadas en la presente de acuerdo a las técncias de amplificación estándar (RT)-PCR. El ácido nucleico FGF21 amplificado puede entonces clonarse en un vector, idóneo y caracterizarse por análisis de secuencia de ADN.

Los oligonucleótidos para su uso como sondas para aislar o amplificar toda o una porción de los polipéptidos FGF21 o variantes FGF21 proporcionadas en la presente pueden diseñarse y generarse usando técnicas sintéticas estándar, or ejemplo, aparato autónomo de síntesis de ADN, o pueden aislarse de una secuencia más larga de ADN.

II. A. Secuencias de variante de polipéptido FGF21 y Polinucleótido que se presentan de manera natural In vivo, FGF21 se expresa como una secuencia contigua de aminoácidos que comprende una secuencia de señal.

La secuencia de 209 aminoácidos de longitud completa FGF21 humana (forma Pro 174/146) es: MDSDETGFEHSGLWVSVLAGLLLGACQAHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQ TEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYG SLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:l) y se codifica por -la secuencia de ADN atggactcggacgagaccgggttcgagcactcaggactgtgggtttctgtgctggc tggtcttctgctgggagcctgccaggcacaccccatccctgactccagtcctctcc tgcaattcgggggccaagtccggcagcggtacctctacacagatgatgcccagcag acagaagcccacctggagatcagggaggatgggacggtggggggcgctgctgacca gagccccgaaagtctcctgcagctgaaagccttgaagccgggagttattcaaatct tgggagtcaagacatccaggttcctgtgccagcggccagatggggccctgtatgga tcgctccactttgáccctgaggcctgcagcttccgggagctgettcttgaggacgg atacaatgtttaccagtccgaagcccacggcctcccgctgcacctgccagggaaca agtccccacaccgggaccctgcaccccgaggaccagctcgcttcctgccactacca ggcctgccccccgcacccccggagccacccggaatcctggccccccagccccccga tgtgggctcctcggaccctctgagcatggtgggaccttcccagggccgaagcccca gctacgcttcc (SEQ ID NO:2).

La secuencia de aminoácidos de FGF21 humano seguida de la escisión de la secuencia de señal de 28 residuos es: HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLK ALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAH GLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSM VGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 3) y se codifica por la secuencia ADN caccccatccctgactccagtcctctcctgcaattcgggggccaagtccggcagcg gtacctctacacagatgatgcccagcagacagaagcccacctggagatcagggagg atgggac'ggtggggggcgctg'ctgaccagagccccgaaagtctcctgcagctgaaa gccttgaagccgggagttattcaaatcttgggagtcaagacatccaggttcctgtg ccagcggccagatggggccctgtatggatcgctccactttgaccctgaggcctgca gcttccgggagctgcttcttgaggacggatacaatgtttaccagtccgaagcccac ggcctcccgctgcacctgccagggaacaagtccccacaccgggaccctgcaccccg aggaccagctcgcttcctgccactaccaggcctgccccccgcacccccggagccac ccggaatcctggccccccagccccccgatgtgggctcctcggaccctctgagcatg gtgggaccttcccagggccgaagccccagctacgcttcc (SEQ ID NO: 4). Como se ha señalado en la presente, FGF 21 humano también puede existir en una isofoma gue se presenta de manera natural en la gue la Prolina en la posición 174 de SEQ ID NO:2 (posición 146 en SEQ ID NO: 4) se remplaza con una Leucina . Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico asociadas con esta forma de FGF21 se proporcionan en la presente como SEQ ID NOs:5-8.

Como se señala en la presente, el término "polipéptido FGF21" se refiere a un polipéptido FGF21 que comprende las secuencias de aminoácidos humanos SEQ ID N0s:2, 4, 6 y 8. El término "polipéptido FGF21," sin embargo, también abarca polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de una secuencia FGF21 de polipéptido que aparece de manera natural, por ejemplo, SEQ ID N0s:2, 4, 6 y 8, por uno o más aminoácidos de manera que la secuencia es al menos 85% idéntica a SEQ ID N0s:2, 4, 6 y 8; tales polipéptidos son referidos generalmente en la descripción como "variantes FGF21". y se describen además en la presente. Los polipéptidos FGF21 puede generarse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos, ya sea conservadoras o no conservadoras y usando aminoácidos que se presentan naturalmente o que no se presentan naturalmente, en psoiciones particulares del polipéptido FGF21. Los ejemplos de sustituciones que pueden introducirse en un polipéptido FGF21 se muestran en las Tablas 1-13 y se describen en la presente.

Una "sustitución de aminoácidos, conservadora" puede implicar una sustitución de un residuo nativo de aminoácidos (es decir, un residuo encontrado en una posición dada de la secuencia FGF21 de polipéptido tipo natural) con un residuo no nativo (es decir, un. residuo que no se encuntra en una psoición dada de la secuencia FGF21 de polipéptido de tipo natural) de manera que hay poco o nada de efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácidos en esa posición. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos también abarcan residuos de aminoácidos que no se presentan naturalmente que se incorporan típicamente por síntesis de péptido química más que por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos, y otras formas invertidas o inversas de porciones de aminoácidos .

Los residuos que se presentan de manera natural pueden dividirse en clases basándose en las propieades de cadena lateral común, como se muestra en la Tabla 1: Tabla 1 Sustituciones conservadoras Los grupos adicionales de aminoácidos también pueden formularse usando los principios descritos en, por ejemplo, Creighton (1984) PRÓTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2a Ed. 1993), W.H. Freeman and Company. En algunos ejemplos puede ser útil además caracterizar sustituciones basadas en dos o más de tales características (por ejemplo, sustitución con un residuo "polar pequeño", tal como un residuo Thr, puede representar una sustitución latamente conservadora en un contexto apropiado).

Las sustituciones conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.

Los residuos sintéticos, raros, o modificados de aminoácidos que tienen propieades fisioquímicas similares conocidas a aquellas de una agrupación anteriormente descrita pueden usarse como un sustituto "conservador" para un residuo de aminoácidos particular en una secuencia. Por ejemplo, un residuo D-Arg puede servir como un sustituto para un residuo L-Arg típico. También puede ser el caso que una sustitución particular pueda describirse en términos de dos o más de las clases anteriormente descritas (por ejemplo, una sustitución con un resiudo pequeño e hidrofóbico se refiere a sustituir un aminoácido con un residuo (s) que se encuentra tanto en clases descritas anteriormente como en otros residuos sintéticos, raros, o modificados que se conocen en la técnica por tener propiedades fisicoquímicas similares a tales residuos cumpliendo ambas definiciones) .

Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido FGF21 proporcionadas en la presente, incluyen aquellas degeneradas para SEQ ID NOs:l, 3, 5 y 7, y aquéllas que codifican variantes de polipéptido de SEQ ID NOs:l, 3, 5 y 7 tal como aquellas que- comprenden las mutaciones de Tablas 1-13, forman otros aspectos de la descripción.

II. B. Vectores FGF21 Con la finalidad de expresar las secuencias de ácido nucleico FGF21 proporcionadas en la presente, de este modo generando un polipéptido FGF21 o variante FGF2.1 para su uso en el método descrito, las secuencias de codificación apropiadas, por ejemplo, SEQ ID NOs:l, 3, 5 y 7 o una secuencia que codifica uno o más imitantes de las Tablas 1-13, pueden clonarse en un vector idóneo y, después de introducir en un hospedero idóneo, la secuencia puede expresarse para producir el polipéptido codificado de acuerdo a teécncias de clonación y expresión estándar, (como se describe en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . La descripción también se refiere a tales vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico proporcionada en la presente (por ejemplo, una secuencia que codifica . un polipéptido FGF21 o variante FGF21) .

Un "vector" se refiere a un vehículo de entrega que (a) promueve la expresión de un polipéptido que codifica secuencia de ácido nucleico;, (b) promueve la producción del polipéptido de ahí; (c) promueve la transfección/transformación de células objetivo con eso; (d) promueve la replicación de la secuencia de ácido nucleico; (e) promueve la estabilidad del ácido nucleico; (f) promueve la detección de ácido nucleico y/o células transformadas/transfectadas; y/o (g) de otro modo imparte la función ventajosa biológica y/o fisicoquímica al ácido nucleico que codifica al polipéptido. Un vector puede ser cualquier vector idóneo, incluyendo vectores de . ácido nucleico cromosómico, no cromosómico, y sintético (una secuencia de ácido nucleico que comprende un conjunto idóneo de elementos de control de expresión) . Los ejemplos de tales vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y fago ADN, y vectores de ácido nucleico víricos (ARN o ADN) .

Un vector de expresión recombinante puede designarse para expresión de una proteína FGF21 en células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células de insectos, usando vectores de expresión de baculovirus, células de levadura, o células de mamífero) . Las células hospederas representativas incluyen aquellos hospederos típicamente usados para clonación y expresión, incluyendo cepas Escherichia coli TOP10F', TOP10, DH10B, DH5a, HB101, W3110, BL2KDE3) y BL21 (DE3)pLysS, BLUESCRIPT (Stratagene) , líneas de células de mamífero CHO, CH0-K1, HEK293, 293-EBNA vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989)); vectores pET (Novagen, Madison Wis.). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y trasladarse in vitro, por ejemplo usando secuencias regulatorias de promotor T7 y polimerasa T7 y un sistema de traslado in vitro. Preferiblemente, el vector contiene una corriente arriba de promotor del sitio de clonación que confien la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Los ejemplos de promotores, que pueden encenderse y apagarse, incluyen el promotor lac, el promotor T7, el promotor trc, el promotor tac y el promotor trp.

De este modo, se porporcionan en la presente los vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido FGF21 o una variante FGF21, que facilita la expresión de polipéptidos FGF21 recombinantes que pueden emplearse en los métodos descritos.; En varias modalidades, los vectores comprenden una secuencia de nucleotido operablemente ligada que regula la expresión de un polipéptido o variante FGF21. Un vector puede comprender o asociarse con cualquier promotor idóneo, potenciador, y otros elementos que facilitan la expresión. Los ejemplos de tales elementos incluyen promotores de expresión fuerte (por ejemplo, un CMV.-IE promotor/potenciador humano, un promotor RSV, promotor SV40, promotor promotor SL3-3, MMTV, o promotor HIV LTR, promotor^ EFlalpha, promotor CAG) , secuencias efectivas de terminación poli (A) , un origen de replicación para producto de plásmido en E. coli, un gen de resistencia al antibiótico como un marcador seleccionable, y/o un sitio de clonación conveniente (por ejemplo, un poliligador) . Los vectores también comprenden un promotor inducible contrario a un promotor constitutivo tal como CMV IE. En un aspecto, un ácido nucleico qüe comprende una secuencia que codifica un polipéptido FGF21 o variante FGF21 que está operativamente ligada a un promotor especifico de tejido que promueve la expresión de la secuencia- en un tejido metabólicamente relevante, tal como hígado o tejido pancreático se proporciona.

II . C. Células hospederas En otro aspecto de la descripción, las células hospederas que comprenden .los FGF21 ácido nucleicos y vectores descritos en la presente se proporcionan. En varias modalidades, el vector o ácido nucleico está integrado en el genoma de célula hospedera, que en otras modalidades el vector o ácido nucleico es extra-cromosomal .

Las células recombinantes, tal como levadura, células bacterianas (por ejemplo, E. coli) , y de mamífero (por ejemplo, células inmortalizadas de mamífero) que comprenden tal ácido nucleico, vector, o combinaciones de cualquiera o ambos de los mismos, se proporcionan. En varias modalidades las células que comprenden un ácido nucleico no integrado, tal como un plásmido, cósmido, fagémido, o elemento de expresión lineal, que comprende una secuencia de codificación para expresión de un polipéptido o variante FGF21 para su uso en el método descrito, se proporcionan.

Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o variante FGF21 proporcionada en la presente puede introducirse en una célula hospedera por transformación o transíección . Los métodos de transformación de una célula con un vector de expresión son bien conocidos.

Un polipéptido FGF21 o variante FGF21 que codifica ácido nucleico puede posicionarse en y/o entregarse a una célula hospedera o animal hospedero por medio de un vector viral. Cualquier vector viral idóneo puede usarse en esta capacidad. Un vector viral puede comprender cualquier número de polinucleótidos virales, solos o en combinación con una o más proteínas virales, que facilitan la entrega, replicación, y/o expresión del ácido nucleico de. la invención en una célula hospedera deseada. El vector viral puede ser un polinucleótido que comprende todo o parte de un genoma viral, un conjugado de proteína viral/ácido nucleico, una partícula similar a virus (VLP) , o una partícula de virus intacto que comprende ácido nucleicos virales y un polipéptido FGF21 o variante que codifica ácido nucleico. Un vector viral de partícula viral puede comprender una partícula viral de tipo natural o una partícula viral modificada. El vector viral puede ser un vector que requiere la presencia de otro vector o virus de tipo natural para replicación y/o expresión (por ejemplo, un vector viral puede ser un virus dependiente del auxiliar), tal como ¦ un amplicon de virus adenoviral. Típicamente, tales vectores virales consisten de una partícula viral de tipo natural, o una partícula viral modificada en su contenido de proteína y/o ácido nucleico para incrementar la capacidad transgen o ayudar en la transfección y/o expresión del ácido nucleico (los ejemplos de tales vectores incluyen el virus herpes/amplicones AAV) .

Típicamente, un vector viral es similar a y/o derivado de un virus que normalmente infecta humanos. Las partículas idóneas de vector viral a este respecto, incluyen, por ejemplo, partículas vector adenovirales (incluyendo cualquier virus de o derivado de un virus de los adenovirus) , partículas de vector viral asociadas a adeno (partículas vector AAV) u otros parvóvirus y partículas de vector parvoviral, partículas de vector papilomaviral , vectores flaviviral, vectores alphaviral, vectores herpes viral, vectores de virus de viruela, vectores retroviral, incluyendo vectores lentivirales .

II . D. Aislamiento de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 Un polipéptido FGF21 o variante FGF21 expresado como se describe en la presente puede asilarse usando métodos de purifiación de proteína estándar. Un polipéptido o variante FGF21 puede aislarse de una célula en la que está naturalmente expresada o puede aislarse de una célula que ha sido producida por ingeniería para expresar un polipéptido FGF21 o variante FGF21, por ejemplo una célula que no expresa naturalmente alguna forma de polipéptido FGF21.

Los métodos de puerificación de proteína que pueden emplearse para aislar un polipéptido o variante FGF21, así como materiales y reactivos asociados, se conocen en la técnica. Los métodos de e emplifiación de purificación de un polipéptido FGF21 se porporciona en los Ejemplos presentados en la presente y en WO2009/149171 y WO2010/129503.

III. Variantes FGF21 específicas Como se señala en la presente, el término "polipéptido FGF21" ábaraca varias fromas imitantes de FGF21 humano. Las mutaciones descritas pueden impartir una variedad de propiedades a un polipéptido ' FGF21. Por ejemplo, algunas de las mutaciones descritas pueden potenciar la vida media de un polipéptido FGF21, y por .lo tanto potenciar sus propiedades terapéuticas. Tales mejoras pueden ser deseables cuando se realizan los métodos descritos.

En una modalidad, se ha determinado que la mutación A180E minimiza la degradación de la terminal C de FGF21 maduro humano (SEQ ID NO:4 u 8). Por consiguiente, la mutación A180E puede formar un elemento de una secuencia FGF21 variante ya sea como una mutación sencilla o en combinación con otras mutaciones, como se describe en la presente.

En otra modalidad, se ha determinado que la mutación L98R minimiza la agregación y mejora la solubilidad de FGF21 maduro humano (SEQ ID NO:4 u 8). Por consiguiente, la mutación L98R puede formar un elemento de una secuencia FGF21 variante ya sea como una mutación sencilla o en combinación con otras mutaciones, como se describe en la presente.

En otra modalidad, se ha determinado que la mutación P171G minimiza la escisión proteolitica de FGF21 maduro humano (SEQ ID N0:4 u 8). Por consiguiente, la mutación P171G puede formar un elemento de una secuencia FGF21 variante ya sea como una mutación sencilla o en combinación con otras mutaciones, como se describe en la presente.

Las mutaciones descritas en la presente pueden impartir varias propiedades a un polipéptido FGF21 que comprende SEQ ID NO: 4 u 8; por ejemplo algunas de las mutaciones descritas pueden mejorar la estabilidad de FGF21 proporcionando los sitios para la formación de enlaces disulfuro, de este modo se proporciona estabilidad proteolitica mejorada, por ejemplo cuando FGF21 se dispone en una formulación. Aún en otras mutaciones descritas se pueden proporcionar niveles incrementados o disminuidos de glicosilación O cuando FGF21 se expresa en levadura. Aún otras mutaciones pueden interrumpir puntos en los cuales las proteasas u otros ataques químicos pueden actuar en FGF21 para degradar, incluyendo la terminal C de FGF21. Otras mutaciones pueden impartir desamidación disminuida. Aún otras mutaciones pueden reducir los niveles de agregación de FGF21 y consecuentemente mejoran su solubilidad. Las mutaciones también pueden introducirse para servir como puntos de enlace para porciones de extensión de vida media, tal como albúmina de suero humano, polietilen glicol (PEG) o una región constante IgG, como se describe en la presente. De varios modos, estas mutaciones pueden mejorar la actividad in vivo o in. vitro de FGF21 sobre FGF21 nativo. Como se describe en la presente, una o más mutaciones que imparten una o más propiedades deseadas pueden introducirse en una secuencia FGF21 para proporcionar una mejora acumulativa de propiedades . deseadas, incluyendo propiedades que proporcionan un perfil terapéutico mejorado de un polipéptido FGF21 o variante FGF21. Tales mejoras pueden hacer un polipéptido FGF21 o variante FGF21 dado más preferida para su uso en los métodos descritos.

En un ejemplo, los residuos de cisteina pares o sencillos pueden introducirse en varios puntos en una secuencia FGF21 humano maduro (SEQ ID NO: 4 u 8) para facilitar la formación de enlace de disulfuro. Los residuos de cisteina introducidos también pueden servir como sitios para PEGilación. El enlace de disulfuro que se presenta de manera natural entre C75 y C93 puede mantenerse intacto, o interrumpirse y formarse un nuevo enlace de disulfuro entre C75 o C93 e introducir un residuo de cisteina. Los ejemplos de posiciones en las cuales la cisteina puede sustituirse por un resiudo de tipo natural se resumen en la Tabla 2: Tabla 2 Mutaciones de cisteina Los residuos de cisteina introducidos pueden facilitar la formación de enlaces de disulfuro producidos por ingeniería. Tales enlaces de disulfuro pueden mejorar la estabilidad de un polipéptido FGF21 o variante FGF21, incluyendo la estabilidad de la molécula bajo condiciones concentradas, tal como, en una formulación terapéutica. Los ejemplos de pares de enlace de disulfuro producidos por ingeniería incluyen aquellos mostrados en la Tabla 3 (las posiciones se refieren al polipéptido FGF21 humano maduro de SEQ ID NO: 4 u 8) : Tabla 3 Enlaces de disulfuro producidos por ingeniería La selección de uno ó más pares de residuos para mutación para residuos de cisteina con la meta de producir por ingeniería un enlace de disulfuro que no se encuntra en el FGF21 tipo natural puede basarse en un análisis de un modelo tridimensional de FGF21. Por ejemplo, el enfoque de ingeniería de una proteína racional puede usarse para identificar residuos idóneos en FGF21 para mutación. Esto puede alcanzarse por inspección de una resolución alta (1.3 Á) estructura de cristal de rayos x de FGF19 obtenido de Protein Databank ( " PDB" ; por ejemplo, estructura 1PWA) , que puede usarse para crear un modelo, de homología 3D de FGF21 usando, por ejemplo, el software - de modelado MOE (Entorno de Operación Molecular; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canadá) . FGF19 es una plantilla útil, ya que entre las proteínas depositadas en el PDB, FGF19 es una proteína cercanamente relacionada a FGF21 en términos de homología de secuencia de aminoácidos.

En otro aspecto, las mutaciones adicionales pueden introducirse en una secuencia FGF21 madura para mejorar la estabilidad de FGF21 bajo condiciones de soluciones altamente concentradas o componentes de formulación común tal como fenol, m-cresol, metilparaben, resorcinol y alcohol bencílico. Los ejemplos de mutaciones que pueden proporcionar la propiedad de estabilidad mejorada incluyen aquellas mostradas en la Tabla 4 (las posiciones se refieren al polipéptido FGF21 humano maduro de SEQ ID N0:4 u 8): Tabla 4 Mutaciones que mejoran la estabilidad Ver, por ejemplo, WO 2009/149171 y WO2010/12950.3, incorporado en la presente como referencia.

La selección de uno o más pares de residuos para mutación para una mutación de mejoría de estabilidad puede basarse en un análsiis de un modelo tridimensional de FGF21. Por ejemplo, un enfoque de ingeniería de proteína racional puede usarse para identificar residuos idóneos en FGF21 para mutación. Esto puede alcanzarse por la inspección de una alta resolución (1.3 Á) estructura de cristal de rayos x de FGF19 (1PWA) obtenido de Protein Databank ( PDB) , que puede usarse para crear un modelo de homología 3D de FGF21 usando, por ejemplo, el software de modelado MOE (Entorno de Operación Molecular; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canadá) . FGF19 es una plantilla útil, ya que entre las proteínas depositadas en el PDB, FGF19 es proteína relacionada a FGF21 en términos de homolía de secuencia de aminoácidos .

En otro aspecto, las mutaciones adicionales pueden introducirse en la secuencia FGF21 para reducir el grado de escisión proteolítica de un polipéptido FGF21 bajo algunas condiciones. Los ejemplos de mutaciones que pueden proporcionar la propiedad de resistencia a escisión proteolítica incluyen aquellos mostrados en la tabla 5 (las posiciones se refieren al polipéptido FGF21 humano maduro de SEQ ID NO: 4 u 8) : Tabla 5 Mutaciones de resistencia a la proteolsiis ejemplo, WO 2009/149171 y WO2010/129503, incorporados en la presente como referencia.

En un aspecto adicional, las mutaciones adicionales pueden introducirse en una secuencia FGF21 madura para inhibir la agregación de un polipéptido FGF21 bajo algunas condiciones, tal como alta concentración. Los ejemplos de las mutaciones que pueden proporcionar la propiedad de inhibir la agregación de FGF21 incluyen aquellos mostrados en la Tabla 6 (las posiciones se refieren al polipéptido FGF21 humano maduro de SEQ ID NO: u 8): Tabla 6 Mutaciones que reducen la agregación Ver, por ejemplo, WO 2009/149171 y O2010/129503, rporados en la presente como referencia.

En otra modalidad, la presente invención está dirigida a variantes de polipéptido FGF21¦ que comprenden uno o más sitios de enlace de polímero que no se presenta de manera natural que han sido cubiertos por la adición de otros uno o más residuos a la terminal C del polipéptido, extendiendo la secuencia de aminoácidos más allá de la proteína de tipo natural. Aún en otra modalidad, la presente descripción está dirigida a las variantes de polipéptido FGF21 que comprenden uno o más sitios de enlace de polímero que no se presentan de manera natural que además comprenden una o más mutaciones de terminal C. Tales polipéptidos mutantes FGF21 terminalmente C y cubiertos pueden, pero no necesitan, ser químicamente modificados.

Como se usa en la presente, el término "polipéptido variante FGF21 cubierto" se refiere a un polipéptido FGF21 o variante FGF21, o a un polipéptido FGF21 o polipéptido FGF21 variante químicamente , modificado en el cual uno o más residuos de aminoácidos han sido agregados a la terminal C del polipéptido FGF21 variante o polipéptido FGF21 variante químicamente modificado. Cualquier aminoácidos que se presenta naturalmente o no naturalmente pueden usarse para cubrir un polipéptido mutante FGF21, incluyendo uno o más residuos de prolina y uno o más residuos de glicina. Aunque la secuencia FGF21 madura de tipo natural es de 181 residuos de largo (SEQ ID NO: 4 u 8), un polipéptido FGF21 o FGF21 variante cubierto extiende la longitud del polipéptido un residuo para cada residuo de cubierta agregado; consistente con el esquema de numeración de la presente descripción, los residuos de cubierta se numeran comenzando con 182. De este modo, un residuo de cubierta de prolina se indica cerno P182. Las cubiertas más largas son posibles y están numeradas por consiguiente (por ejemplo, X182, Y183, Z184, donde X, Y y Z son aminoácidos que se presentan naturalmente o que no se presentan naturalmente) . Los residuos de cubierta pueden agregarse a un polipéptido FGF21 mutante usando cualquier método conveniente,, tal como químicamente, en el cual un aminoácido es covalentemente enlazado a la terminal C del polipéptido por una reacción química. Alternativamente, un codon que codifica un residuo de cubierta puede agrergarse a la secuencia de codificación de polipéptido FGF21 mutante usando técncias estándar de biología molecular. Cualquiera de los polipéptidos FGF21 mutantes descritos en la presente pueden cubrirse con uno o más residuos, según se desee.

Las mutaciones de terminal C forman otro aspecto de la presente invención. Como se usa en la presente, el término "mutación de terminal C" se refiere a uno o más cambios en la región de residuos 91-181 (o más largo si el polipéptido está cubierto) de un polipéptido FGF21 o variante FGF21. Una mutación de terminal C introducida en una secuencia polipéptido FGF21 o variante FGF21 será adicional a una o más mutaciones que introducen un sitio de enlace de polímero que no se presenta de manera natural. Aunque las mutaciones de terminal C pueden introducirse en algún punto en la región de 91-181 de la secuencia polipéptido FGF21 o variante FGF21, las posiciones de ej emplificación para mutaciones de terminal C incluyen posiicones 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 y 181. Las. mutaciones de terminal C pueden introducirse usando técncias estándar de biología molecular, tales como aquellas descritas en la presente. Cualquiera de los polipéptidos FGF21 o variantes FGF21 descritos en la presente pueden comprender una mutación de terminal C.

Los ejemplos de posiciones e identidades para mutaciones de terminal C y/o cubiertas se muestran . en la Tabla 7: Tabla 7 Ejemplos de posiciones cubiertas y/o mutaciones de terminal C La actividad de polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de terminal C y/o cubiertos, asi como formas químicamente modificadas de estos mutantes, pueden evaluarse en una variedad de modos, -por ejemplo, usando un ensayo de luciferasa ELK in vitro.

La actividad de polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de terminal C y/o cubiertos, y la actividad de polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de terminal C y/o cubiertos químicamente modificados, de la presente invención también puede evaluarse en un ensayo in vivo, tal como un ratón ob/ob. Generalmente, para evaluar la actividad in vivo de uno o más de estos polipéptidos, el polipéptido puede administrarse para probar un animal intraperitonalmente . Después de uno o más- periodos de tiempo deseados, puede extraerse una muestra de sangre, y los niveles, de glucosa en la sangre pueden medirse.

En cuanto a todos los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de la presente invención, los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de terminal C y/o cubiertos, y los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de terminal C y/o cubiertos químicamente modificados, pueden opcionalmente comprender un residuo metionina de terminal amino, que puede introducirse por mutación directa o como resultado de un proceso de expresión bacterial.

Los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de terminal C ylo cubiertos de la presente invención pueden preparse usando técncias de laboratorio estándar. Aquellas personas expertas en la técnica, familiarizadas con técnicas estándar de biología molecular, pueden emplear ese conocimiento, acoplados con la descripción, para hacer y usar los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de terminal C y/o cubiertos de la presente invención. Las técncias estándar pueden usarse para ADN recombinante, síntesis oligonucleótido, cultivo de tejido, y transformación {por ejemplo, electroporación, lipofección) . Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Clonihg: A Laboratory Manual, incorporados en la presente como referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden relaizarse.de acuerdo a las instrucciones del fabricante, como comunmente se aplica en la técnica, o se describe en la presente. A menos que se proporcionen definiciones especificas, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedmientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comunmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar pueden usarse para síntesis químicas; análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.

Seguido de la preparación de un polipéptido mutante FGF21 mutado de terminal C y/o cubierto, el polipéptido puede ser químicamente modificado por el enlace de un polímero, como se describe en la presente. Ver, por ejemplo, WO2010/042747 , incorporado en la presente como referencia.

En un aspecto adicional de la presente invención, los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 pueden preparse en los cuales ambos residuos de cisteína en una secuencia de polipéptido FGF21 de tipo natural (SEQ ID NO: 4 u 8) se remplazan con residuos que no forman enlaces de disulfuro y no sirven como sitios de enlace de polímero, tal como alanina o serina. Subsecuentemente, pueden hacerse sustituciones en la secuencia de polipéptido mutante FGF21 que introduce sitios de enlace de polímero que no ocurre de manera natural, en la forma de residuos que contiene tiol (por ejemplo, residuos de cisteina o aminoácidos que no se presentan naturalmente que tiene qrupos tiol) o grupos amino libres (por ejemplo, residuos de lisina o arginina o aminoácidos que no se presentan naturalmente que tiene grupos amino libres) . Los polímeros que se basan en tiol o grupos amino libres para enlace, tal como PEG, pueden entonces ser objetivos para residuos de cisteina, , lisina o arginina que se han introducido en la secuencia de polipéptido mutante FGF21 en posiciones conocidas. Esta estrategia puede facilitar la colocación del polímero más eficiente y controlada.

En un enfoque, los dos residuos de cisteina que se presentan de manera natural en el polipéptido FGF21 de tipo natural, que se ubican en las posiciones 75 y 93, pueden sustituirse con residuos que no contiene tiol. Subsecuentemente, un residuo de cisteina puede intrducirse en una ubicación conocida. El polipéptido FGF21 mutante también puede comprender otras mutaciones, que aún pueden introducir más sitios de enlace de polímero (por ejemplo, residuos cisteina) o pueden diseñarse para alcanzar alguna otra propiedad deseada. Los ejemplos de tales polipéptidos FGF21 mutantes incluyen C75A/E91C/C93A/H125C/P171G y C75S/E91C/C93S/H125C/P171G. En estos ejemplos, las cisteínas que se presentan de manera natural en las posiciones 75 y 93 han sido mutadas a residuos de alanina o serina, los sitios de enlace de polímero han sido introducidos en las posiciones 91 y 125 (en este caso para un polímero reactivo de tiol tal como PEG) y una mutación adicional se ha realizado en la posición 171, a saber la sustitución de prolina 171 con un residuo de glicina (las posiciones recitadas son relativas a SEQ ID NO: 4 u 8) .

Como todos de los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 descritos en la presente, la actividad de polipéptidos que no contiene ninguna de las cisteínas encontradas en la secuencia FGF21 polipéptido maduro de tipo natural pero en su lugar comprenden un sitio de enlace de polímero introducido y opcionalmente una o más mutaciones adicionales, así como formas químicamente modificadas de estos mutantes, pueden evaluarse de una variedad de modos, por ejemplo, usando un ensayo de luciferasa ELK (ver, por ejemplo, WO2010/042747 , que describe un ensayo in vitro idóneo para evaluar la actividad de cualquiera de los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 descritos en la presente). La actividad in vivo de estos polipéptidos puede evaluarse en un ensayo in vivo, tal como usando ratones ob/ob (de nuevo, ver, por ejemplo, O2010/042747 , que describe un ensayo in vivo idóneo para ensayar la actividad de cualquiera de los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 descritos en la presente) .

Como con todos los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 de la presente invención, la actividad de los polipéptidos FGF21 variantes que no contienen ninguna de las cisteinas encontradas en la secuencia FGF21 de polipéptido maduro de tipo natural pero en su lugar comprenden un sitio de enlace de polímero introducido y opcionalmente una o más mutaciones adicionales y formas químicamente modificadas de estos polipéptidos FGF21 variantes, pueden opcionalmente comprender un residuo metionina de terminal amino, que puede introducirse por mutación dirigida o como resultado de un proceso de expresión bacterial.

Las variantes FGF21 que no contienen ninguna de las cisteinas encontradas en la secuencia FGF21 de polipéptido de tipo natural pero en su lugar comprenden un sitio de enlace de polímero introducido y opcionalmente una o más mutaciones adicionales pueden prepararse usando metodología estándar. Aquellas personas expertas en la técnica, familiarizadas con técnicas estándar de biología molecular, pueden emplear ese conocmiento, acoplado con la descripción, para hacer y usar estos polipéptidos variantes FGF21. Las técnicas estándar pueden usarse para ADN recobinante, síntesis oligonucleótido, cultivo de tejido, y transformación [por ejemplo, electroporaciónn, lipofección) . Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, incorporado en la presente como referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante, como comunmente se aplica en la técnica, o se describe en la presente. ? menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedmientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacútica descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comunmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar pueden usarse para síntesis químicas; análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.

Seguido de una preparación de variante FGF21 que no contiene ninguna de las cisteínas encontradas en la secuencia FGF21 de polipéptido tipo natural pero en su lugar comprende un sitio de enlace de polímero introducido y opcionalmente una o más mutaciones adicionales, el polipéptido puede modificarse químicamente por el enlace de un polímero usando metodología estándar conocida para aquellas personas expertas en la técnica, que dependerá de la naturaleza del polímero a enlazarse. Ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337.

En un aspecto adicional, las mutaciones adicionales pueden introducirse en una secuencia FGF21 madura que puede proporcionar un sitio para glicosilación mediada por transferasa GalNAc en la cual un GalNAc se agrega y sirve como un punto para glicosilación 0. La siguiente lista de mutaciones incluye ambos mutantes de punto asi como secuencias de mutaciones consecutivas y no consecutivas, y un GalNAc se agregará a un residuo S o un residuo T. Los ejemplos de mutaciones que pueden proprocionar un sitio para glicosilación mediada por ' transferasa GalNAc de FGF21 incluyen aquellos mostrados en la Tabla 8; en la Tabla 8, cuando las secuencias . de aminoácidos múltiples se proporcionan, los mutantes de punto se resaltan en negritas y se subrayan (las posiciones se refieren al polipéptido maduro FGF21 de SEQ ID NO: 4 u 8) : Tabla 8 Mutantes de glicosilación que median la transferasa GalNAc En contraste a la Tabla 8, las mutaciones adicionales pueden introducirse en una secuencia FGF21 madura que puede proporcionar una capacidad reducida para glicosilación 0, relativa a la secuencia FGF21 tipo natural, cuando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 se expresa en levadura.

La lista de mutaciones en la Tabla 9 incluye ambos mutantes de punto así como secuencia de mutaciones consecutivas y no consecutivas (las posiciones se refieren a polipéptido FGF21 maduro de SEQ ID NO : 4 u 8).. Los ejemplos de mutaciones que pueden proporcionarse para glicosilación 0 reducida, relativa a la secuencia de FGF21 tipo natural, cuando la secuencia FGF21 se expresa en levadura incluye S167A, S167E, S167D, S167N, S167Q, S167G, S167V, S167H, S167K y S167Y.

Tabla 9 Mutantes de resistencia a la glicosilacion O En otro aspecto de la descripción, las propiedades deseables de muchas variantes FGF21 descritas en la presente pueden combinarse en una tendencia aditiva o sinérgica para generar una variante FGF21 exhibiendo propiedades farmacéuticas mejoradas. Asi, en otra modalidad, las mutaciones punto proporcionadas en las Tablas 1-13 pueden combinarse para proprocionar un perfil deseado para una secuencia FGF21 variante.

Para todos los mutantes FGF21 de la presente invención, las variantes FGF21 que comprenden dos o más mutaciones de la presente invención pueden preparse como se describe en la presente. Aquellas personas expertas en la técnica, familiarizadas con técnicas estándar de biología molecular, pueden emplear ese conocimiento, acoplados con la descripción, para hacer' y usar las variantes FGF21 que comprenden dos o más mutaciones de la presente invención. Las técncias estándar pueden usarse para ADN recombinante , síntesis oligonucleót ido, cultivo de tejido, y transformación (por ejemplo, electroporación , lipofección) ·. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, incorporados en la' presente. como referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimát icas y técnicas de purificación pueden relaizarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante, como comunmente se aplica en la técnica, o se describe en la presente. A menos que se proporcionen definiciones especificas, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedmientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica' sintética, y química medicinal y farmacútica descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comunmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar pueden usarse para síntesis químicas; análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.

Las variantes FGF21 que comprenden dos o más mutaciones de la presente invención pueden fusionarse para otra entidad, que puede impartir propiedades adicionales a una variante FGF21 que comprende dos o más mutaciones. En una modalidad de la presente invención, una variante FGF21 que comprende dos o más mutaciones puede fusionarse a una secuencia IgG Fe. Tal fusión puede lograrse usando métodos cnocidos de biología molecular y/o la guía proporcionada en la presente. Los beneficíeos de tales polipéptidos de fusión, así como los métodos para hacer tales polipéptidos de fusión, se discuten a mayor detalle en la presente.

Los ejemplos de mutaciones que pueden introducirse en una secuencia FGF21 ya sea como una mutación de punto o como una combinación de dos o más mutantes de punto se proporcionan en las Tablas 1-13, los ejemplos específicos los cuales se proporciona en la Tabla 10 a continuación (las posiciones se. refieren al polipéptido FGF21 maduro de SEQ ID NO: 4 u 8) : .

Tabla 10 Mutaciones de Punto FGF21 Resumidas En una modalidad particular un polipéptido FGF21 variante comprende la mutación L98R y la mutación P171G introducida en FGF21 maduro que comprende SEQ ID NO: 4 u 8, proporcionada en la presente como SEQ ID NO: 10. Un ejemplo especifico de tal variante incluye la fusión Fe de SEQ ID NO: 39, en donde la secuencia FGF21 de SEQ ID NO: 10 se une a la secuencia Fe de SEQ ID NO: 47 por medio del ligador de SEQ ID NO: 33.

En otra modalidad especifica un polipéptido FGF21 variante comprende la mutación L98R, la mutación P171G y el a mutación A180E introducida en el FGF21 maduro que comprende SEQ ID NO: 4 u 8, proporcionada en la presente como SEQ ID NO: 12. Un ejemplo especifico de tal variante incluye la fusión Fe de SEQ ID NO:41, en donde la secuencia FGF21 de SEQ ID NO: 12 se une a la secuencia Fe de SEQ ID NO: 47 por medio del ligador de SEQ ID NO: 33.

Los polipéptidos variantes FGF21 específicos adicionales que pueden emplearse en el método descrito se describen en, por ejemplo, WO 2010/042747,· O 2009/149171, WO 2010129503, incorporada en la presente como referencia.

IV. "Moléculas Atadas" En todavía otro aspecto de la presente invención, una "Molécula Atada" puede emplearse en los métodos descritos.

Tales "Moléculas Atadas" puede prepararse como se describe en la presente. Una "molécula atada" es una molécula que comprende dos polipéptidos FGF21 de tipo natural atados a los mismos (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 u 8 o una combinación de los mismos) por una molécula ligadora. Al unir dos polipéptidos FGF21 o dos variantes FGF21 o un polipéptido FGF21 de tipo natural y una variante FGF21 juntos, la potencia y vida media y efectiva de una Molécula atada puede extenderse más allá de la vida media y potencia de una variante o polipéptido FGF21 sencillo.

Una molécula atada de la presente invención comprende un ligador y dos polipéptidos FGF21 tipo natural o variantes FGF21 o una combinación de los mismos, y puede comprender dos polipéptidos polipéptido FGF21 que se presentan naturalmente en las cuales no se han introducido mutaciones, dos polipéptidos mutantes FGF21 que tienen un sitio de unión ligador introducido en los polipéptidos FGF21 o una combinación de un polipéptido FGF21 que se presenta naturalmente y una variante FGF21. Las moléculas atadas que comprenden al menos un polipéptido FGF21 o variante FGF21 que tienen un sitio de unión ligador que se presenta naturalmente y una o más mutaciones adicionales también se contemplan y forman otro aspecto de la invención. Tales moléculas atadas luego pueden de esta manera comprender una mutación que forma un sitio para la unión de una molécula ligadora así como otra mutación para impartir otra propiedad deseable a la molécula atada .

Como se usa en la presente,' el término "sitio de unión ligador" significa los¦ aminoácidos que s presentan naturalmente o que no se presentan naturalmente que tienen un grupo funcional con el cual un ligador puede asociarse. En un ejemplo, un sitio de unión ligador es un residuo que contiene un grupo tiol, que puede asociarse con una molécula PEG.

IV. A. Polipéptidos FGF21 y Variantes FGF21 en una Molécula Atada Cuando una molécula atada comprende dos variantes FGF21, las variantes FGF21 pueden comprender una o más mutaciones introducidas en la secuencia, pero las mutaciones no necesitan estar en la misma posición de aminoácidos en cada uno de los polipéptidos variantes FGF21. A manera de ejemplo, si una molécula atada comprende dos polipéptidos variantes FGF21, un polipéptido mutante FGF21 puede contener una mutación H125C, que puede formar un punto de unión para una molécula ligadora. En contraste, el otro polipéptido FGF21 variante puede contener una mutación en una posición diferente de H125 que puede servir como un punto de unión para el ligador que ata los dos polipéptidos variantes FGF21 juntos. Aún si se emplean uno o dos polipéptidos variantes FGF21, el ligador puede unirse al extremo de terminal N del polipéptido FGF21 variante; no necesariamente necesitan usarse puntos de unión 'introducidos .

Cuando una molécula atada comprende dos o más polipéptidos FGF21 de tipo natural que se presentan naturalmente (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 u 8 o una combinación de los mismos) el ligador puede unirse en un punto en el polipéptido FGF21 que es sensible a la química de unión. Por ejemplo, los enlaces de disulfuro que se presentan naturalmente pueden leerse y los residuos de cisteina pueden servir como puntos de unión para un ligador, tal como PEG. En otra modalidad, un ligador puede unirse a un polipéptido FGF21 en la terminal N ? en cadenas laterales de lisina.

Uno o ambos de los polipéptidos variantes FGF21 de una molécula atada pueden comprenden un polipéptido FGF21 variante truncado. Como se describe en la presente, un polipéptido FGF21 variante truncado puede prepararse al remover cualquier número de residuos en ya sea la terminal N, la terminal C o ambas de las terminales N y C.

Las moléculas atadas también pueden comprender uno o ambos polipéptidos FGF21- que comprenden una mutación en la secuencia de polipéptido que no puede preferirse como un sitio de unión ligador, pero mejor puede impartir alguna otra propiedad deseable para la molécula atada (por ejemplo, aquellas mutaciones descritas en las Tablas 1-13) . De esta manera, las molécula atadas que comprenden uno o más polipéptidos variantes FGF21 en los cuales una mutación que imparte una propiedad deseable a la molécula atada forma un aspecto adicional de la presente invención.

La actividad de moléculas atadas puede evaluarse en una variedad de formas, por ejemplo, usando un enayo ELK-luciferasa in vitro como se describe en la presente.

La actividad de todas de las variantes FGF21 y polipéptido FGF21 descritos en la presente, incluyendo las moléculas atadas descritas, también pueden evaluarse en un ensayo in vivo, tal como con ratones ob/ob. Generalmente, para evaluar la actividad in vivo de uno o más de estos polipéptidos, el polipéptido puede administrarse a un animal de prueba intraperitonealmente . Después de uno o más periodos de tiempo deseados, puede extraerse una muestra de sangre, y un biomarcador, tal como el nivel de insulina, colesterol, lípido o glucosa en la sangre, pueden medirse.

Como es el caso para todos el polipéptido FGF21 y variantes FGF21 de la, presente invención, los polipéptidos FGF21 que comprenden una molécula atada, que pueden ser polipéptidos variantes FGF21, polipéptidos FGF21 de tipo natural o una combinación de ambos, puede opcionalmente comprender un residuo de metionina de terminal amino, que puede introducirse por mutación directa o como un resultado de un proceso de expresión bacteriano.

Aquellos de experiencia ordinaria en el arte, familiarizados con técnicas de biología estándares, pueden emplear tal conocimiento,' acoplado con la descripción actual, para hacer y usar las moléculas atadas (y todos de los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21) proporcionadas en la presente. Las técnicas estándares pueden usarse para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, cultivo de tejido, y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, que se incorpora en la presente como referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo a las especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en el arte, o como se describe en la presente. Los procesos para asociar ligadores con polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 dependerán de la naturaleza del ligado, pero son conocidos para aquellos de experiencia en el arte. Los ejemplos de químicas de unión ligadoras se describen en la presente.

A menos que las definiciones específicas se proporcionen, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y medicinal y química farmacéutica descritos en la presente son aquellos bien conocidos y comúnmente usados en el arte. Las técnicas estándares pueden usarse para síntesis química; análisis químico; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.

IV. B. Ligadores Útiles para Formar Moléculas Atadas Cualquier ligador puede emplearse en una molécula atada para atar dos polipéptidos FGF21 o polipéptidos variantes FGF21 juntos. Las moléculas ligadoras pueden estar ramificadas o no ramificadas y pueden unirse a un polipéptido FGF21 variante usando varias químicas conocidas, tal como aquellos descritos en la presente. La estructura química de un ligador no es crítica, ya que sirve principalmente como un espaciador. El ligador puede ser independientemente el mismo o diferente de cualquier otro ligador, o ligadores, que pueden presentarse en una molécula atada (por ejemplo, una molécula atada que comprende tres o más variantes FGF21 o polipéptidos FGF21) . En una modalidad, un ligador puede hacerse de aminoácidos ligados juntos por enlaces de péptido. Algunos de estos aminoácidos pueden glicosilarse, como es bien entendido por aquellos expertos en el arte. Por ejemplo, una secuencia ligadora útil que constituye un sitio de sialilacion es X1X2NX3X4G (SEQ ID NO:46, en donde Xi, X2, X4 y X5 son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácidos. En otra modalidad una molécula ligadora puede ser una molécula PEG de cualquier tamaño, tal como 20kDa, 30 kDa o 40 kDa.

En modalidades en las cuales se presenta un ligador de peptidilo (es decir, hecho de aminoácidos: ligados juntos por enlaces de péptido) que se hace en longitud, preferiblemente, desde 1 hasta alrededor de 40 residuos de aminoácidos, más preferiblemente, desde 1' hasta alrededor de 20 residuos de aminoácidos, y lo más preferiblemente desde 1 hasta alrededor de 10 residuos de aminoácidos. En una modalidad, los residuos de aminoácidos en el ligador se seleccionan de cualquiera de los veinte aminoácidos canónicos. En otra modalidad los residuos de . aminoácidos en el ligador se seleccionan de cisterna, glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, y/o serina. Aún en otra modalidad, un ligador de peptidilo se hace de una mayoría de aminoácidos que son impedidos esféricamente, tal como glicina, serina, y alanina ligador por un ' enlace de péptido. A menudo es deseable que, si se presenta, un ligador de peptidilo se selecciona para evitar volumen proteolítico rápido en circulación in vivo. De esta manera, los ligadores de peptidilo preferidos incluyen poliglicinas, particularmente (Gly)4 (SEQ ID NO: 13); (Gly) 5 (SEQ ID NO: 14); poli (Gly-Ala) ; y polialaninas . Otros ligadores de peptidilo preferidos incluyen GGGGS (SEQ ID NO: 15); GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 16); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17) y cualquiera de los ligadores usados en los Ejemplos proporcionados en la presente. Los ligadores descritos en la presente, sin embargo, son ejemplares; los · ligadores dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más grandes y pueden incluir otros residuos.

En modalidades de una molécula atada que comprende una porción ligadora de péptido, residuos ácidos, por ejemplo, glutamato o residuos de aspartato, se colocan en la secuencia de aminoácidos de la porción ligadora. Los ejemplos incluyen la siguiente secuencia ligadora de péptido: GGEGGG (SEQ ID NO: 18); GGEEEGGG (SEQ ID NO: 19); GEEEG (SEQ ID NO:20) ; GEEE (SEQ ID NO: 21) ; GGDGGG (SEQ ID NO:22); GGDDDGG (SEQ ID NO:23); GDDDG (SEQ ID NO: 24) ; GDDD (SEQ ID NO: 25) ; GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO:26); WEWEW (SEQ ID NO : 27 ) ; FEFEF (SEQ ID NO: 28) ; EEEWWW (SEQ ID NO: 29) ; EEEFFF (SEQ ID NO: 30); WEEEWW (SEQ ID NO: 31); o FFEEEFF (SEQ ID NO:32) .

En otras modalidades, un ligador de peptidilo constituye un sitio de fosforilación, por ejemplo, X1X2YX3X4G (SEQ ID NO: 43), en donde Xlr X2,X3 y X4 son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácidos; X1X2SX3X4G (SEQ ID NO:44), en donde Xi, X2,X3 y son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácidos; o X!X2TX3X4G (SEQ ID NO: 45), en donde Xi, X2,X3 y X4 son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácidos.

Los ligadores no de péptido también pueden usarse en una molécula atada. Por ejemplo, podrían usarse ligadores de alquilo tal como -NH- (CH2) S_C (O) -, en donde s = 2 hasta 20. Estos ligadores alquilo pueden además sustituirse por cualquier grupo dificultado no esféricamente tal como alquilo inferior (por ejemplo, Ci-Ce) acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2, fenilo, etc.

Cualquier ligador adecuado puede emplearse en la presente invención para formar moléculas atadas. En un ejemplo, el ligador usado para producir moléculas atadas descritas en la presente fueron moléculas PEG bis-maleimida homobifuncionales que tienen la estructura general: X- ( CH2CH20 )„CH2CH2 -X donde X es un grupo maleimida . En otras modalidades, X puede ser un ortopiridil-disulfuro, una yodoacetamida, una vinilsulfona o cualquier otra porción reactiva conocida en el arte para ser especifica para grupos tiol. Aún en otra modalidad X puede ser una porción reactiva especifica de amino usada para atar dos polipéptidos mutantes hasta ya sea la terminal N o un grupo lisilo preparado por ingeniería. {Ver, por ejemplo, Pasut and Veronese, 2006, "PEGylation of Proteins as Tailored Chemistry fo Optimized Bioconj ugates , " Adv. Polym. Sci. 192:95-134).

Todavía en otra modalidad, un ligador puede tener la estructura general: X- ( CH2CH20 ) nCH2CH2 -Y donde X e Y son porciones reactivas diferentes seleccionadas de los grupos dé arriba. Tal ligador debería permitir la conjugación de diferentes polipéptidos mutante para generar heterodímeros o hetero-oligómeros atados.

En una modalidad adicional, un ligador puede ser una molécula PEG, que puede tener un peso molecular de 1 hasta 100 kDa, Preferiblemente 10 hasta 50 kDa (por ejemplo, 10, 20, 30 o 40 kDa) y more Preferiblemente 20 kDa. Los ligadores de péptido pueden alterarse para formar derivados de la misma manera como se describen arriba.

Otros ejemplos de ligadores útiles incluyen ligadores aminoetiloxietiloxi-acetilo ' como se describen en la Publicación International No. WO. 2006/042151, incorporada en la presente como referencia en su totalidad.

Cuando se forma una molécula atada de la presente invención, pueden emplearse químicas estándares para asociar un ligador con un polipéptido FGF21 o polipéptido FGF21 variante. El método preciso de asociación dependerá del sitio de unión (por ejemplo, que son cadenas laterales de aminoácidos) y la naturaleza del ligador. Cuando un ligador es una molécula PEG, la unión puede lograrse al emplear química estándar y un grupo' amina o sulfhidrilo libre, tal como aquellos encontrados en residuos de cisteína (que pueden introducirse en el polipéptido FGF21 o secuencia de polipéptido FGF21 variante por mutación o pueden presentarse naturalmente) o en lisina (que puede introducirse en la secuencia FGF21 por mutación o puede presentarse naturalmente) o grupos amino de terminal N.

V. Mutantes FGF21 químicamente modificados Las formas químicamente modificadas de los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 descritos en la presente, que incluyen las formas truncadas- de las moléculas FGF21 descritas en la presente, pueden prepararse por alguien experimentado en el arte, dadas las descripciones descritas en la presente. Tales polipéptidos y variantes FGF21 químicamente modificados se alteran de manera que el polipéptido FGF21 o variante FGF21 químicamente modificado es diferente del polipéptido FGF21 no modificado, ya sea en el tipo o ubicación de las. moléculas naturalmente unidas al FGF21 variante. Los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 químicamente modificados pueden incluir moléculas formadas por la eliminación de uno o más grupos químicos naturalmente unidos.

Las variantes FGF21 adicionales que pueden ser adecuadas para modificación química incluyen aquellas de la Tabla 11, que proporcionan mutaciones de punto individuales que pueden servir como puntos de unión/reacción para modificación química. Los números de residuo proporcionados son relativos a un polipéptido FGF21 maduro (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 u 8).

Tabla 11 Polipéptidos Variantes FGF21 que Coinprenden una Mutación Sencilla Aunque la Tabla 11 describe varias mutaciones de punto sencillo, múltiples mutaciones de punto pueden introducirse en una secuencia FGF21 para generar múltiples sitios para modificación química, incluyendo aquellas descritas en la Tabla 11. De esta manera, las variantes FGF21 adicionales que pueden ser adecuadas para modificación química incluyen aquellas de la Tabla 12, que proporcionan combinaciones de mutaciones de punto que pueden servir como puntos de unión/reacción para modificación química. Los números de residuo proporcionados son relativos a un polipéptido FGF21 maduro, (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 u 8) .

Tabla 12 Polipeptidos Variantes F6F21 que Comprenden Dos Mutaciones La Tabla 11 describe varias mutaciones de punto sencillo, múltiples mutaciones de punto pueden introducirse en una secuencia FGF21 para generar múltiples sitios para modificación quimica, y la Tabla 12, . proporciona combinaciones de dos mutaciones de punto que pueden servir como puntos de unión/reacción para modificación quimica. La Tabla 13 proporcionada a continuación proporciona combinaciones de tres . mutaciones de punto que pueden servir como puntos de unión/reacción para modificación quimica. Los números de residuo proporcionados son relativos a un polipéptido FGF21 maduro, (por ejemplo, SEQ ID NO: u 8).

Tabla 13 Polipóptidos Variantes F6F21 qué Comprenden Tres Mutaciones En una modalidad, los polipéptidos variantes FGF21 de la presente invención pueden modificarse por la unión covalente de uno o más polímeros. Por ejemplo, el polímero seleccionado es típicamente soluble en agua de manera que la proteína al cual se une no se precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Incluida dentro del alcance de los polímeros adecuados está una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Los polímeros solubles no en agua conjugados para polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 proporcionados en la presente también forman un aspecto de la descripción.

Los polímeros ejemplares cada uno pueden ser de cualquier peso molecular y pueden ser ramificados o no ramificados. Los polímeros cada uno típicamente tiene un peso molecular promedio de entre alrededor de 2 kDa hasta alrededor de 100 kDa (el término "alrededor" indica que en preparaciones de polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más y algunas menos que el peso molecular establecido) . El peso molecular promedio de cada polímero está preferiblemente entre alrededor de 5 kDa y alrededor de 50 kDa, más preferiblemente entre alrededor de 12 kDa y alrededor de 40 kDa, y lo más preferiblemente entre alrededor de 20 kDa y alrededor de 35 kDa.

Los polímeros solubles en agua adecuados o mezclas de los mismos incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos ligados a 0, o ligados a N, azúcares, fosfatos, polietilen glicol (PEG) (incluyendo las formas de PEG que se han usado para derivar proteínas, incluyen mono- (Ci-Cio) , alcoxi-, o ariloxi-polietilen glicol), monometoxi-polietilen glicol, dextrano (tal como dextrano de peso molecular bajo de, por ejemplo, alrededor de 6 kD) , celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato, poli- (N-vinil pirrolidona) polietilen glicol, homopolímeros de propilen glicol, co- polímeros de óxido de polipropilen/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , y alcohol polivinílico . También abarcados por la presente invención son moléculas reticuladas bifuncionales que pueden usarse para preparar multímeros mutantes de polipéptido FGF21 covalentemente unidos. También abarcados por la presente invención son mutantes FGF21 covalentemente unidos a ácido polisiálico.

En algunas modalidades de la descripción actual, una variante FGF21 se modifica covalentemente, o químicamente para incluir uno o más ' polímeros solubles en agua, incluyendo, pero no limitado a, polietilen glicol (PEG) , polioxietilen glicol, o polipropilen glicol. Ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337 y los Ejemplos proporcionados en la presente. En algunas modalidades de la presente invención, un mutante FGF21 comprende uno o más polímeros, incluyendo, pero no limitado a, monometoxi-polietilene glicol, dextrano, celulosa, otro polímero basado en carbohidrato, poli- (N-vinil pirrolidona) -polietilen glicol, homopolímeros de propilen glicol, un co-polímero de óxido de polipropileno/óxido- de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico, o mezclas de tales polímeros.

En algunas modalidades de la descripción actual, un polipéptido FGF21 o variante FGF21 se modifica covalentemente con subunidades PEG. En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se enlazan en una o más posiciones específicas (por ejemplo, en la terminal N) del polipéptido o variante FGF21. En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se unen aleatoriamente a una o más cadenas laterales de un polipéptido FGF21 o variante FGF21. En algunas modalidades, PEG se usa para mejorar la capacidad terapéutica de un polipéptido FGF21 o variante FGF21, que puede ser deseable cuando se practican los métodos descritos. Ciertos métodos se discuten, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,133,426, que' se incorpora por ello como referencia para cualquier propósito.

En modalidades de la descripción actual en donde el polímero es PEG, el grupo PEG puede ser cualquier peso molécula conveniente, y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del grupo PEG preferiblemente estará en el intervalo desde alrededor de 2 kD hasta alrededor de 100 kDa, y más preferiblemente desde alrededor de 5 kDa hasta alrededor de 50 kDa, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, o 50 kDa. Los grupos PEG generalmente se unirán al mutante FGF21 por medio de acilación o alquilación reductiva hasta un grupo reactivo en la porción PEG (por .ejemplo, un aldehido, amino, tiol, o grupo éster) a un grupo reactivo en el polipéptido FGF21 o variante FGF21 (por ejemplo, un aldehido, amino, o grupo éster) .

La PEGilación de un polipéptido, incluyendo el polipéptidos FGF21 y variantes FGF231 de la descripción actual, pueden llevarse a cabo específicamente usando cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en el arte. Tales reacciones se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4.-10; Patentes Europeas Nos. 0 154 316 y 0 401 384; y Patente de E.U.A. No. 4,179,337. Por ejemplo, la PEGilación puede llevarse a cabo por medio de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilene glicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe en la presente. Para las reacciones de acilación, un polímero seleccionado deberá tener un grupo éster reactivo sencillo. Para alquilación reductiva, un polímero seleccionado deberá tener un grupo aldehido reactivo sencillo. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, polietilen glicol propionaldehído, que está estable en agua, o mono alcoxi Ci-Cio o derivados ariloxi de los mismos {ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,252,714).

En algunas modalidades de la descripción actual, una estrategia útil para la unión del grupo PEG para un polipéptido involucra combinar, hasta la formación de una ligadura de conjugado en solución, un péptido y una porción PEG, cada una que porta una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva hacia la otra. Los péptidos pueden prepararse fácilmente con síntesis de fase sólida convencional. Los péptidos están "preactivados" con un grupo funcional apropiado en un sitio especifico. Los precursores se purifican y caracterizan completamente antes de reaccionar con la porción PEG. La ligación del péptido con PEG usualmente toma lugar en la fase acuosa y puede monitorearse fácilmente por HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden purificarse fácilmente por HPLC preparativa y caracterizarse por HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masa de desorción láser.

Los polímeros de polisacárido son otro tipo de polímero soluble en agua que puede usarse para modificación de proteína. Por lo tanto, los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 descritos en la presente fusionados a un polímero de polisacárido forman modalidades adicionales de polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 que pueden emplearse en los métodos descritos. Los dextranos son polímeros de polisacárido comprendidos de subunidades individuales de glucosa predominantemente ligadas por ligaduras alfa 1-6. El dextrano por sí mismo está disponible en muchos intervalos de peso molecular, y ya está disponible en pesos moleculares desde alrededor de 1 kD hasta alrededor de 70 kD. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para uso como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe) . Ver, por ejemplo, Publicación International No. WO 96/11953. El uso de dextrano conjugado con inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico se han reportado. Ver, por ejemplo, Publicación de Patente Europea No. 0 315 456, que se incorpora por ello como referencia. La presente invención también abarca el uso de dextrano de alrededor de 1 kD hasta alrededor de 20 kD.

En general, la modificación química puede realizarse bajo cualquier condición adecuada usada para reaccionar una proteína con una molécula de polímero activada. Los métodos para preparar polipéptidos químicamente modificados generalmente comprenderán las etapas de: (a) hacer reaccionar el polipéptido con la molécula de polímero activada (tal como un éster reactivo o derivado aldehido de la molécula de polímero) bajo condiciones por las cuales un polipéptido FGF21 o variante FGF21 se une a una o más moléculas polímero, y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán con base en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, entre más grande la relación de las moléculas de polímero para la proteina, mayor el porcentaje de molécula de polímero unido. En una modalidad de la presente' invención, los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 químicamente modificados pueden tener una porción de molécula de polímero sencillo en la terminal amino (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,234,784).

En otra modalidad de la presente invención, un polipéptido o variante. FGF21 puede acoplarse químicamente a biotina. La biotina/polipéptido o variante FGF21 luego se permite enlazar a avidina, resultando en una avidina/biotina/variante de polipéptido FGF21 tetravalente. Los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 también pueden acoplarse covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los conjugados resultantes precipitados con anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugados decaméricos con una valencia de 10.

Generalmente, las condiciones que pueden aliviarse o modularse por la administración de los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 químicamente modificados descritos incluyen aquellos descritos en la presente, por ejemplo, Diabetes Tipo 1, y de esta manera pueden emplearse en los métodos descritos. Sin embargo, las variantes FGF21 químicamente modificadas descritas en la presente también pueden tener actividades adicionales, ' actividad biológica aumentada o reducida, u otras características, tal como vida medía incrementada o disminuida, como se compara con las variantes FGF21 no modificadas.

VI. Moléculas que Exhiben Señalización tipo FGF21 Se nota que mientras un intervalo de polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 que puede -ser útil al llevar a cabo el método descrito se ha proporcionado en las Tablas 1-13, se señala que estas moléculas no forman una lista exclusiva. Como se demuestra en la presente, se ha determinado que FGF21 y variantes del mismo puede ser de uso cuando se tratan varias afecciones metabólicas, tal como diabetes Tipo I. De esta manera, cualquier molécula que induce señalización tipo FGF21 puede emplearse en los métodos descritos. Los términos "señalización tipo FGF21" e "induce señalización tipo FGF21," cuando se aplican a moléculas contempladas para uso en los métodos de la presente descripción, significa que la molécula imita, o modula, un efecto biológico in vivo inducido por el enlace (i) -Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4 ; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 e induce una respuesta biológica que de otra manera deberá resultar de FGF21 enlazado a (i) ß-Klotho; (ii) FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c o FGFR4; o (iii) un complejo que comprende ß-Klotho y uno de FGFRlc, FGFR2c, FGFR3c, y FGFR4 in vivo. Al identificar moléculas para uso en los métodos descritos, una molécula se considera para inducir una respuesta biológica cuando la respuesta es igual a o mayor que 5%, y preferiblemente igual a o mayor que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, de la actividad de un FGF21 de tipo natural estándar que comprende la forma madura de SEQ ID NO: 4 u 8 (es decir, una forma madura de la secuencia de FGF21 humano) y tiene las siguientes propiedades: exhibir un nivel de eficacia de igual a o mayor que 5% de un estándar FGF21 (por ejemplo, SEQ ID NOs : 4 y 8), con un EC50 de igual a menor que ?????, por ejemplo, 90 nM, 80 nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM o 10 nM' en (1) un ensayo celular reportero de luciferasa mediado por el receptor FGF21 recombinante tal como aquel descrito en la WO 2011/071783; (2) fosforilación ERK en un ensayo celular mediado por el receptor FGF21 recombinante tal como aquel descrito en la WO 2011/071783; y (3) fosforilación ERK en adipocitos humanos como se describe en la WO 2011/071783. La "potencia" de una molécula candidata se define ya que exhibe un EC50 de igual a o menor que ?????, por ejemplo, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10 nM y preferiblemente menor que ???? de la molécula en los siguientes ensayos: (1) el receptor FGF21 recombinante mediado por ensayo celular reportero de luciferasa descrito en la WO 2011/071783; (2) la fosforilación ERK en el ensayo celular mediado por el receptor FGF21 recombinante descrito en la WO 2011/071783; y (3) fosforilación ERK en adipocitos humanos como se describe en la WO 2011/071783.

Por consiguiente, los métodos descritos pueden realizarse usando miméticos FGF21, o moléculas que imitan la actividad FGF21 pero que a su vez comprenden un grado relativamente bajo de homología de secuencia con una secuencia de polipéptido FGF21 (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 u 8) o secuencia variante FGF21, o en algunos casos no tiene homología en todo con FGF21. Tales moléculas se describen en WO 2011/071783, WO 2011/068893, WO 2011/130417 y WO 2010/148142.

VII . Composiciones Farmacéuticas que Comprenden un Polipéptido o Variante FGF21 Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido FGF21 o variante FGF21 para uso en los métodos descritos. Tales composiciones farmacéuticas de polipéptido FGF21 o variante FGF21 pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 en mezcla con un agente de formulación farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable seleccionado para idoneidad con el' modo de administración. Una composición farmacéutica adecuada para uso en los métodos descritos puede comprender un polipéptido FGF21 o variante FGF21 descrito en la presente.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" como se usa en la presente se refiere a uno- o más agentes de formulación adecuados para realizar o mejorar el suministro de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 en el cuerpo de un sujeto humano o no humano, y para uso en los métodos descritos en la presente. El término incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes que retrasan la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución amortiguadora salina de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asi como combinaciones de los mismos. En algunos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en una composición farmacéutica. Las sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , conservadores o soluciones amortiguadoras, que mejoran la vida de anaquel o eficacia del polipéptido FGF21 o variante FGF21 también pueden actuar como, o formar un componente de, un portador. Los portadores farmacéuticamente aceptables son preferiblemente no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas.

Una composición farmacéutica para uso en los métodos descritos en la presente pueden contener agentes de formulación para modificar, mantener, o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, tasa de disolución o liberación, adsorción, o penetración de la composición. Los agentes de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina,¦ o lisina) , antimicrobianos, antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o sulfito ácido de sodio) , soluciones amortiguadoras (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos) , . agentes de volumen (tal como manitol o glicina) , agentes quelantes (tal como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) ) , agentes de complejo (tal como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina, o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) , rellenadores, monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos (tal como glucosa, mañosa, o dextrinas) , proteínas (tal ¦ como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas) , agentes colorantes, saborizantes y diluyentes, agentes emulsificantes , polímero hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona) , polipéptidos de peso molecular bajo, contraiones que forman sales (tal como sodio) , conservadores (tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparaben, propilparaben, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno) , solventes (tal como glicerina, propilen glicol, o polietilene glicol), alcoholes de azúcar (tal como manitol o sorbitol) , agentes de suspensión, tensoactivos o agentes humectantes (tal como plurónicos; PEG; ésteres de sorbitan; polisorbatos tal como Polisorbato 20 o Polisorbato 80; Tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal) , agentes que aumentan la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol), agentes que aumentan la tonicidad (tal como haluros de metal alcalino,, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, o manitol sorbitol) , vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (ver, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE y PRACTICE OF PHARMACY, 19a edición, (1995); Berge et al., J. Pharm. Sci . , 6661), 1-19 (1977). Los principios, métodos, y agentes relevantes adicionales se describen en, por ejemplo, Lieberman et al.., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS (2 a ed., vol . 3, 1998); Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS & DRUG DELIVERY SYSTEMS (7a ed. 2000); Martindale, THE EXTRA PHARMACOPEIA (31a edición), Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES (16a-20a y ediciones posteriores) ; The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Goodman and Gilman, Eds . (9a ed.—1996); Wilson and Gisvolds' TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado and Remers, Eds. (10a ed., 1998); los principios para formular composiciones farmacéuticamente aceptables también se describen en, por ejemplo,. Aulton, PHARMACEUTICS : THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN, Churchill Livingstone (Nueva York) (1988), EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS , CSHP (1998), todas de las cuales de las referencias se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito) .

La composición farmacéutica óptima para uso en los métodos descritos en la presente se determinarán por un técnico experimentado dependiendo de, por ejemplo, la ruta pretendida de administración, formato de suministro, y dosificación deseada (ver, por ejemplo, Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) . Tales composiciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, tas de liberación in vivo, y tasa de aclaramiento in vivo de un polipéptido FGF21.

El portador . o vehículo primario en una composición farmacéutica para uso en los métodos descritos en la presente puede ser ya sea acuoso, o no acuoso en naturaleza. Por ejemplo, un portador o vehículo adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica, o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente complementado con otros materiales, comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina o solución salina amortiguada neutra mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden una solución amortiguadora Tris de alrededor de pH 7.0-8.5, o una solución amortiguadora de acetato de alrededor de pH 4.0-5.5, que puede incluir además sorbitol o un sustituyente adecuado. En una modalidad de la presente invención, las composiciones de polipéptido FGF21 o variante FGF21 pueden prepararse para almacenaje al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES , supra) en la forma de una torta liofilizada o una. solución acuosa. Adicionalmente, el producto de polipéptido FGF21 puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tal como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas de polipéptido FGF21 o variante FGF21 pueden seleccionarse para suministro parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para suministro hasta el tracto digestivo, tal como oralmente.

Los componentes de la formulación pueden presentarse en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, las soluciones amortiguadoras pueden usarse para mantener la composición en pH fisiológico o en un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un intervalo de pH desde alrededor de 5 hasta alrededor de 8.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en los métodos descritos pueden estar en ¦ la forma de una solución acuosa, parenteralmente aceptable, libre de pirógeno que comprende el polipéptido FGF21 deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo adecuado particularmente para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual un polipéptido FGF21 o variante FGF21 se formula como una solución isotónica, estéril, apropiadamente conservados. Aún otra preparación puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosinables , compuestos poliméricos (tal ¦ como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas, o liposomas, que se proporcionan para la liberación sostenida o controlada del producto que luego puede suministrarse por medio de una inyección de depósito. También puede usarse ácido hialurónico, y esto puede tener el efecto de promover duración sostenida en la circulación. Otro medio adecuado para la introducción de la molécula deseada incluye dispositivos de suministro de fármaco implantable.

En una modalidad, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. Por ejemplo, un polipéptido FGF21 o variante FGF21 puede formularse como un polvo seco para inhalación. Las soluciones de inhalación de polipéptido FGF21 o variante FGF21 también pueden formularse con un propulsor para suministro en aerosol. Aún en otra modalidad, las soluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe además en la Publicación Internacional No. O 94/20069.

También se contempla que ciertas formulaciones pueden administrarse oralmente dentro del contexto de los métodos descritos en la presente. En una modalidad de este método, los polipéptidos FGF21 ?· variantes FGF21 que se administran en esta forma pueden formularse con o sin aquellos portadores habitualmente usados en la formación de compuestos de las formas de dosificación sólidas tal como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Los agentes adicionales pueden incluirse para facilitar la absorción del polipéptido FGF21 o variante FGF21. Los diluyentes, saborizantes , ceras de punto de fusión bajo, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de comprimido, y aglutinantes también pueden emplearse.

Una composición farmacéutica alternativa puede comprender una cantidad efectiva de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones pueden prepararse en forma de dosificación unitaria. Los excipientes adecuados, incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; o agente de enlace, tal como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco.

Las composiciones farmacéuticas de polipéptido FGF21 o variante FGF21 adicionales que pueden ser de uso en los métodos descritos en la presente serán evidentes para aquellos experimentados en el arte, incluyendo formulaciones que involucran polipéptidos FGF21 o variantes FGF21 en formulaciones de suministro controlado o sostenido. Las técnicas para formular ¦ una variedad de otros medios de suministro controlado o sostenido, tal como portadores de liposoma, microparticulas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen para aquellos experimentados en el arte (ver, por ejemplo, Publicación Internacional No. WO 93/15722, que describe la liberación controlada de microparticulas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas, y Wischke & Schwendeman, (2008) Int. J. Pharm. 364:298-327, y Freiberg & Zhu, (2004) Int. J. Pharm. 282: 1-18, que discuten la preparación de microesfera/microparticula y uso) . Como se describe en la presente, un hidrogel es un ejemplo de una formulación de suministro controlado o sostenido.

Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo películas, o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilacturos (Patente de E.U.A. No. 3,773,919 y Patente Europea No. 0 058 481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., (1983) Biopolymers 22:547-56), poli (2-hidroxietil-metacrilato) . (Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, (1982) Chem. Tech. 12:98-105), acetato etilen vinilo (Langer et al., supra) o ácido poli-D (-) -3-hidroxibutírico (Patente Europea No. 0 133 988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de los diversos métodos conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Epstein et al., (1985) 'Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82:3688-92; y Patentes Europeas Nos. 0 036 676, 0 088 046, y 0 143 949.

Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido FGF21 o variante FGF21 a usarse para administración in vivo en los métodos descritos en la presente típicamente deberán estar estériles. Esto puede realizarse por filtración hasta membranas de filtración estériles. Donde la composición está liofilizada, la esterilización usando este método puede conducirse ya sea antes de, o después dé, liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Una vez que la composición farmacéutica se ha encontrado, puede almacenarse en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo liofilizado o deshidratado. Tales formulaciones pueden almacenarse ya sea en una forma lista para uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de la administración.

En una modalidad especifica, la presente invención se dirige a kits para producir una unidad de administración de dosis sencilla. Los kits pueden cada uno contener tanto un primer recipiente que tiene una proteina seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. También se describen kits que contienen jeringas pre-rellenas de cámara sencilla y múltiple [por ejemplo, jeringas liquidas y liojeringas) .

La cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido FGF21 o variante FGF21 a emplearse terapéuticamente en los métodos descritos en la presente dependerán, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Una persona experimentada en el arte apreciará que los niveles de dosificación apropiados para tratamiento de esta manera variará dependiendo, en parte, de la molécula suministrada, la indicación para la cual un polipéptido FGF21 o variante FGF21 se está usando, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal, o tamaño de órgano) y afección (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el método puede valorar la dosis y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede estar en el intervalo desde alrededor de 0.1 pg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba .

La frecuencia de dosificación empleada en los métodos descritos en la presente dependerá de los parámetros farmacocinéticos del polipéptido FGF21 o variante FGF21 en la formulación que se usa. Típicamente, un médico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. La composición por lo tanto puede administrarse como una dosis- sencilla, como dos o más dosis (que pueden o no pueden contener la misma cantidad de la molécula deseada) con el paso del tiempo, o como una infusión continúa por medio de un catéter o dispositivo de implante. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace de manera rutinaria por aquellos de . experiencia ordinaria en el arte y está dentro del ámbito de tareas realizadas de manera rutinaria por ellos. Las dosificaciones apropiadas pueden cerciorarse hasta el uso de datos de respuesta de dosis apropiados, tal como datos obtenidos de una prueba clínica que involucra el tratamiento de una afección o trastorno metabólico, incluyendo Diabetes Tipo 1, con un polipéptido FGF21 o variante FGF21.

La ruta de administración de la composición farmacéutica es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente; hasta inyección por rutas intravenosa, intraperitoneal , intracerebral (intraparenquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, infraocular, intraarterial, intraportal, o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida (que también pueden inyectarse); o por dispositivos de implante. Donde se desee, las composiciones pueden administrarse por inyección por bolo o continuamente por infusión, o por dispositivo de implante.

Alternativamente o adicionalmente, la composición puede administrarse localmente por medio de implante de una membrana, esponja, u otro material apropiado en el cual la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Donde se usa un dispositivo de implante, el dispositivo puede implantarse en cualquier órgano o tejido adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser por medio de difusión, bolo de liberación con tiempo, o administración continúa.

Cuando se practican los métodos descritos, con objeto de suministrar un fármaco, por ejemplo, un polipéptido FGF21 o variante FGF21, en una tasa predeterminada de manera la concentración de fármaco puede mantenerse en un nivel terapéuticamente efectivo deseado durante un periodo extendido, una variedad de enfoques diferentes puede emplearse. Tales enfoques pueden ser útiles cuando se practican los métodos , descritos en la presente. En un ejemplo, puede emplearse un hidrogel que comprende un polímero tal como una gelatina (por ejemplo, gelatina de bovino, gelatina humana, o gelatina de otra fuente) o un polímero generado sintéticamente o que se presenta naturalmente. Cualquier porcentaje de polímero (por ejemplo, gelatina) puede emplearse en un hidrogel, tal como 5, 10, 15 o 20%. La selección de una concentración apropiada puede depender de una variedad de factores, tal como el perfil terapéutico deseado y el perfil farmacocinético de la molécula terapéutica.

Los ejemplos de polímeros que pueden incorporarse en un hidrogel incluyen polietilene glicol ("PEG") , óxido de polietileno, óxido de polietileno-óxido de co-polipropileno, bloque de óxido de co-polietileno o copolímeros aleatorios, alcohol polivinílico, poli (vinil pirrolidinona) , poli (aminoácidos ) , dextrano, heparina, polisacáridos, poliéteres y similares.' Otro factor que puede considerarse cuando se genera una formulación de hidrogel es el grado de reticülado en el hidrogel y el agente reticülado. En una modalidad, el reticülado puede lograrse por medio de una reacción de metacrilación que involucra anhídrido metacrílico. En algunas situaciones, un grado alto de reticulado puede ser deseable mientras que en otras situaciones un grado inferior se reticulado se prefiere. En algunos casos un grado superior de reticulado. proporciona una liberación sostenida más grande. Un grado superior de reticulado puede proporcionar un hidrogel más firme y un periodo más grande sobre el cual el fármaco se suministra.

Cualquier relación de polímero a agente reticulado (por ejemplo, anhídrido metacrílico) puede emplearse para generar un hidrogel con propiedades deseadas. Por ejemplo, la relación de polímero a reticulador puede ser, por ejemplo, 8:1, 16:1, 24:1, o 32:1. Por ejemplo, cuando el polímero de hidrogel es gelatina y el reticulador es metacrilato, pueden emplearse las relaciones de 8:1, 16:1, 24:1, o 32:1 anhídrido metilacrílico : gelatina .

VIII . Métodos para Tratar Trastorno o Afección Metabolica usando los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 y ácidos nucleicos descritos Los polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 pueden usarse para tratar, diagnosticar o aliviar, un trastorno o afección metabolica cuando se emplea en los métodos descritos en la presente. En una modalidad, el trastorno metabólico a tratarse es diabetes, por ejemplo, Diabetes Tipo 1. En otra modalidad, el trastorno o afección metabólica es obesidad. En otras modalidades el trastorno o afección metabólica es dislipidemia, niveles de glucosa elevados, niveles de insulina elevados o nefropatia diabética. Los polipéptidos FGF21 pueden proporcionarse a un sujeto en la forma de una composición farmacéutica.

En un. ejemplo, un trastorno o afección metabólica que puede tratarse o aliviarse usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es un estado en el cual un sujeto humano tiene un nivel de glucosa en la sangre en ayuno de 125 mg/dL o mayor, por ejemplo 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 o mayor que 200 mg/dL. En una modalidad de los métodos descritos que logran un nivel de glucosa en la sangre en ayuno de 70-100 mg/dL pueden ser un meta objetivo, por ejemplo, administrar suficiente polipéptido o variante ' FGF21 a un paciente humano con objeto de lograr un nivel de glucosa en la sangre en ayuno de 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/dL. Las mediciones de nivel de glucosa en ayuno pueden obtenerse usando cualquiera de una variedad de métodos o aparatos bien conocidos. Por ejemplo, puede emplearse en una modalidad un Analizador Químico Olympus AU400e (Olympus America, Inc., Center Valley, PA) .

Los niveles de glucosa en la sangre pueden determinarse en el estado de alimentación o ayuno, o en aleatorio. En otra modalidad un trastorno o afección metabolica que puede tratarse o aliviarse usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es un estado en el cual un sujeto humano tiene un nivel de glucosa en la sangre con alimentos (no postpriandial) de mayor que 120 mg/dL. Para el estado de alimentación (no postprandial ) , los métodos descritos pueden emplearse para lograr un nivel de glucosa en la sangre objetivo en un paciente humano, tal como 80-120 mg/dL. por ejemplo, 80, 85, 90, 95, 100, 105,' 110, 115 o 120 mg/dL. Las mediciones de nivel de glucosa en la sangre en el estado de alimentación (no postprandial) pueden obtenerse usando cualquiera de una variedad de aparatos o métodos bien conocidos. Por ejemplo, puede emplearse en una modalidad un Analizador Químico Olympus AU400e (Olympus America, Inc., Center Valley, PA) .

En otra modalidad un trastorno o afección metabolica que puede tratarse o aliviarse usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es un estado en el cual un sujeto humano tiene un nivel de triglicéridos en ayunas de mayor que 150 mg/dL. Un nivel de triglicéridos en ayunas objetivo ejemplar es menor que 150 mg/dL y un método ejemplar comprende administrar suficiente polipéptido o variante FGF21 a un paciente humano con objeto de lograr un nivel de triglicéridos en ayunas de 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 o 10 mg/dL. Las mediciones del nivel de triglicéridos en ayunas pueden obtenerse usando cualquiera de una variedad de aparatos o métodos bien conocidos. Por ejemplo, puede emplearse en una modalidad un Analizador Químico Olympus AU400e (Olympus America, Inc., Center Valley, PA) .

En otra modalidad un trastorno o afección metabólica que puede tratarse o aliviarse usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es un estado en el cual un sujeto humano tiene un nivel de colesterol total en ayunas de mayor que 200 mg/dL. Un nivel de colesterol total objetivo ejemplar es menor que 200 mg/dL y un método ejemplar comprende administrar suficiente polipéptido o variante FGF21 a un paciente humano con objeto de lograr un nivel de colesterol total en ayunas de 200, 195, 190, 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 o 10 mg/dL. Las · mediciones del nivel de colesterol total en ayunas pueden obtenerse usando cualquiera de una variedad de aparatos o métodos bien conocidos. Por ejemplo, puede emplearse en una modalidad un Analizador Químico Olympus AU400e (Olympus America, Inc., Center Valley, PA) .

En otra modalidad un trastorno o afección metabólica que puede tratarse o aliviarse usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es un estado en el cual un sujeto humano tiene un nivel de glucosa en la sangre de mayor gue 140 mg/dL dos horas después de la administración de glucosa (es decir, una prueba de tolerancia a la glucosa oral, "OGTT") . Para una OGTT, una nivel de glucosa en el plasma objetivo ejemplar es menor que 140 mg/dL y un método ejemplar comprende administrar suficiente polipéptido o variante FGF21 a un paciente humano con objeto de lograr un nivel de glucosa en el plasma 2 horas después de la . administración de glucosa a un paciente humano de 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 o 50 mg/dL. Las mediciones de nivel de glucosa en el plasma pueden obtenerse usando cualquiera de una variedad de aparatos o métodos bien conocidos. Por ejemplo, puede emplearse en una modalidad un Analizador Químico Olympus AU400e (Olympus America, Inc. , Center Valley, PA) .

En otra modalidad un trastorno o afección metabólica que puede tratarse o aliviarse ' usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es un estado en el cual un sujeto humano tiene un nivel de insulina que no se considera fisiológicamente aconsejable como se determina por un médico o profesional del cuidado de la salud entrenado. Los niveles de insulina pueden obtenerse usando cualquiera de una variedad de aparatos o métodos bien conocidos. Por ejemplo, puede emplearse en una modalidad un ' Kit de Endocrina Múltiple Humano (HENDO-75K, Millipore Corp., Billerica, MA) .

En otra modalidad un trastorno o afección metabólica que puede tratarse o aliviarse usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 es un estado en el cual un sujeto humano tiene un índice de Masa Corporal ("BMI") de mayor que 25 kg/m2. Un BMI ejemplar dentro del intervalo de 18.5-25 kg/m2 y un método ejemplar comprende administrar suficiente polipéptido o variante FGF21 a un paciente humano con objeto de lograr a BMI de 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 20.5, 21.0, 21.5, 22.0, 22.5, 23.0, 23.5, 24.0, 24.5 o 25.0 kg/m2. Las mediciones de BMI pueden obtenerse al determinar la altura y peso del paciente.

En varias modalidades, un sujeto es un humano que tiene un nivel de glucosa en la sangre de 100 mg/dL o mayor puede tratarse con un polipéptido FGF21 o variante FGF21.

El trastorno o afección metabólica que puede tratarse o aliviarse usando un polipéptido FGF21 o variante FGF21 también puede comprender una afección en la cual un sujeto está en riesgo incrementado de desarrollar una afección metabólica. Para un sujeto humano, tales afecciones incluyen un nivel de glucosa en la sangre en ayuno de alrededor de 100 mg/dL. Las afecciones ¦ que pueden tratarse usando una composición farmacéutica que comprende un polipéptido FGF21 o variante FGF21 también pueden encontrarse en la American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes Care-2011, American Diabetes Association, Diabetes Care Vol . 34, No. de Complemento 1, S11-S61, 2010, incorporada en la presente como referencia.

En aplicación, una afección o trastorno metabólico, tal como Diabetes Tipo 1, los niveles de glucosa en ayunas elevados, niveles de insulina elevados, dislipidemia , obesidad, niveles de- glucosa en plasma con alimentos elevados, niveles de triglicéridos en ayunas elevados, niveles de colesterol totales en ayunas elevados, niveles de glucosa en plasma elevados segudio en OGTT, y complicaciones de diabetes, tal como . nefropatia, neuropatía, retinopatía, enfermedad cardiaca isquémica, enfermedad vascular periférica y enfermedad cerebrovascular pueden tratarse al administrar una dosis terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21, por ejemplo, un polipéptido FGF21 humano tal como aquel de SEQ ID NOs:2, 4, 6 o 8, o una variante FGF21 proporcionada en la presente, tal como una variante descrita en las Tablas 1-13 y aquellos recitados en el Listado de Secuencias asociado con la descripción actual, para un paciente que necesita del mismo. La administración puede realizarse como se describe en la presente, tal como por inyección IV, inyección intraperitoneal (IP) , inyección subcutánea, inyección intramuscular, u otralmente en la forma de un comprimido o formación liquida. En algunas situaciones, una dosis preferida o terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 puede determinarse por un médico. Una dosis terapéuticamente efectiva de polipéptido FGF21 o variante FGF21 dependerá, ínter alia, del programa de administración, la dosis unitaria de agentes administrados, si el polipéptido FGF21 o variante FGF21 se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, el. estado inmunitario y la salud del receptor. El término "dosis terapéuticamente efectiva," como se usa en la presente,' signficia una cantidad de polipéptido FGF21 o variante FGF21 que produce una respuesta medicinal o biológica en un sistema de tejido, animal, o ser humano buscada por un investigador, doctor en medicina, u otro médico, que incluye alivio o mejora de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata, es decir, una cantidad de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 que soporta un nivel observable de una o más respuestas medicinales o biológicas deseadas, por ejemplo disminución de glucosa en la sangre, insulina, triglicérido, o niveles de colesterol; peso corporal reducido; o tolerancia a la glucosa mejorada, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina.

Se señala que una dosis terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 también puede variar con el resultado deseado. De esta manera, por ejemplo, en situaciones en las cuales un nivel inferior de glucosa en la sangre se indica una dosis de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 correspondientemente será mayor que una dosis en la cual un nivel comparativamente inferior de glucosa en la sangre se desea. A la inversa, en situaciones en las cuales un nivel superior de glucosa en la sangre está indicada una dosis de un polipéptido FGF21 o variante FGF21 correspondientemente será menor que una dosis en la cual un nivel comparativamente superior de glucosa en la sangre se desea.

En una modalidad, un método de la descripción actual comprende primero medir un nivel de linea base de uno o más compuestos metabólicamente relevantes tal como glucosa, insulina, colesterol, lipido en un sujeto. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido FGF21 o variante FGF21 luego se administra al sujeto. Después de un periodo de tiempo deseado, el nivel de uno o más compuestos o biomarcadores metabólicamente relevantes (por ejemplo, niveles de glucosa en la sangre, insulina, colesterol y/o lipido) en el sujeto se mide de nuevo. Los dos niveles luego pueden compararse con objeto de determinar el cambio relativo en el compuesto metabólicamente relevante en el sujeto. Dependiendo de las conclusiones de tal comparación, otra dosis de la composición farmacéutica que comprende un polipéptido FGF21 o variante FGF21 puede administrarse para lograr un nivel deseado de uno o más compuestos metabólicamente relevantes. De nuevo, los niveles de biomarcadores o compuestos relevantes pueden evaluarse y una determinación hecha como la siguiente etapa en el régimen terapéutico del sujeto (por ejemplo, una o más administraciones adicionales¦ o la composición farmacéutica, otra forma de terapia, una combinación de la composición farmacéutica con otra molécula terapéutica, etc) .

Se señala que en varias modalidades de los métodos descritos una composición farmacéutica que comprende un polipéptido FGF21 o variante FGF21 puede co-administrarse con otro compuesto. La identidad y propiedades del compuesto coadministrado con el polipéptido FGF21 o variante FGF21 dependerán de la naturaleza de la afección a tratarse o aliviarse. Una lista no limitante de ejemplos de compuestos que pueden administrarse en combinación con una composición farmacéutica que comprende un polipéptido FGF21 o variante FGF21 incluye rosiqlitizona, pioglitizona, repaglinida, nateglitinida, metformina, exenatida, estiagliptina, pramlintida, glipizida, glimeprirideacarbosa, y miglitol.

IX. Kits También se proporcionan kits para practicar los métodos descritos. Tales kits ueden comprender una composición farmacéutica tal como aquellos polipéptidos FGF21 y variantes FGF21 descritos en la presente, incluyendo ácidos nucleicos que codifican los péptidos o proteínas proporcionadas en la presente, vectores y células que comprenden tales ácidos nucleicos, y composiciones farmacéuticas que comprenden tales compuestos que contienen ácido nucleico, que puede proporcionarse en un recipiente estéril. Opcionalmente, las instrucciones de cómo emplear la composición farmacéutica proporcionada en el tratamiento' de un trastorno, metabólico también puede incluirse o hacerse disponiboe para un paciente o un proveedor de servicio médico.

En un aspecto, un kit comprende (a) una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21 o variante FGF21; y (b) uno o más recipientes para almacenamiento de forma estéril la composición f rmacéutica. Tal kit también puede comprender instrucciones para el uso de las mismas; las instrucciones pueden hacerse a la. medida para el trastorno metabólico preciso a tratarse. Las instrucciones pueden describir el uso y naturaleza de los materiales proporcionados en el kit. En ciertas modalidades, los kits incluyen instrucciones para un paciente para llevar a cabo la administración para tratar un trastorno metabólico, tal como niveles de glucosa elevados, niveles de insulina elevados, obesidad, Diabetes Tipo 1, dislipidemia, nefropatiá diabética y complicaciones de diabetes, tal como nefropatiá, neuropatía, retinopatía, enfermedad cardiaca isquémica, enfermedad vascular periférica y enfermedad cerebrovascular .

Las instrucciones pueden imprimrise en un sustrato, tal como papel plástico, . etc, y puede presentarse en los kits como un inserto de empaque, en el etiquetado del recipiente del kit o componentes de los mismos (por ejemplo, asociado con el empaquetado), etc. En otras modalidades, las instrucciones se presentan como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento legible en- computadora adecuado, por ejemplo un CD-ROM, disquete, etc. Aún en otras modalidades, las instrucciones actuales no se presentan en el kit, pero los medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, tal como a través de internet, se proporcionan. Un ejemplo de esta modalidad es un kit que incluye una dirección web donde las instrucciones pueden visualizarse y/o de las cuales las instrucciones pueden descargarse.

A menudo será deseable que algunos o todos los componentes de un kit se empacan en empaque adecuado para mantener la esterilidad. ' Los componentes de un kit pueden empacarse en un elemento de que contiene el kit para hacer una unidad de fácil manejo, sencilla, donde el elemento que contiene el kit, por ejemplo, cuadro o estructura análoga, puede o no puede ser un recipiente hermético, por ejemplo, para conservar además la esterilidad de algunos o todos de los componentes del kit.

A lo largo de la descripción actual se han proporcionado las referecias a los documentos publicados. Todos los documentos recitados en la descripción accual se incorporan como referencia en la- presente en sus totalidades y para cualquier propósito.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y resultados logrados, se proporcionan para propósitos ilustrativos únicamente y no son para construirse como que limitan la presente invención.

Introducción Estudios farmacológicos previos con FGF21 recombinante han demostrado sus efectos que disminuyen la glucosa potentes en una variedad de modelos primates y roedores diabéticos tipo 2. Las acciones metabólicas de FGF21 se han establecido bien en estos modelos resistentes a la insulina y se resalta su potencial como un terapéutico para diabetes melitus no dependiente de insulina (NIDDM) . Sin embargo, ningún estudio hasta ahora ha sido de esta manera documentado para examinar el potencial que disminuye la glucosa de FGF21 en Diabetes Tipo 1, también referida como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM). Los siguientes Ejemplos demuestran varios efectos terapéuticamente relevantes, incluyendo efectos protectores de célula beta y que disminuyen la glucosa, de FGF21 cuando se administra a un modelo roedor Diabetes Tipo 1.

Ejemplo 1 Efecto de FGF21 humano en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por estreptozoocina de dosis alta (STZ) Este estudio se condujo para evaluar la disminución de glucosa y otro efecto metabólico de FGF21 humano (SEQ ID NO: 4), insulina humana y su combinación en ratones diabéticos tipo 1 inducidos con STZ.

Los ratones C57BL6 macho se obtuvieron de Harían Laboratories y suministran a 7 semanas de edad. A su llegada, los ratones se alojaron individualmente y mantuvieron en condiciones ambientales controladas con ciclos de 12 horas de luz (6:30 A - 6:30 PM) y de oscuridad (6:30 PM - 6:30 AM) . Los ratones se alimentaron con una dieta de comida para roedores estándar (2020x Harían Teklad) con acceso libre al agua potable.

Después de una semana de aclimatación, se hicieron mediciones de la glucosa en el plasma y/o peso corporal. Los ratones se mantuvieron en ayunas posteriormente durante cuatro horas al colocarlos en una jaula fresca sin comida. Los ratones se les permitieron acceso libre al agua potable. Una inyección intraperitoneal (IP) sencilla de STZ (Streptozotocin, Sigma S-1030) en 180 mg/kg se administró en estos ratones para perjudicar las células beta gue producen insulina dentro del páncreas e inducir un fenotipo similar a Diabetes Tipo 1 deficiente de insulina. La comida para los roedores luego se colocó de nuevo en las jaulas y los ratones se mantuvieron en agua con sacarosa al 10% durante 48 horas para prevenir hipoglicemia aguda. El agua potable regular se dio 48 horas después. Se midieron los pesos corporales diario en la manñana durante. el proceso de inducción. En 72 horas después de la. inyección STZ (Día 0) , peso corporal y niveles de glucosa en plasma se midieron y las muestras de sangre se recolectaron de todos los ratones. Los ratones que demuestran pérdida de peso corporal desde 1.2g hasta .3g y los niveles de glucosa en' plasma > 410 mg/dL se seleccionaron para el estudio. Los ratones luego se asignaron en grupos de vehículo o tratamiento usando glucosa en el- plasma y los valores de peso corporal como criterios de aleat.orización .

Se inyectaron IP vehículo (KP04 lOmM, Sorbitol al 5%, pH8.0), insulina (Humulin R, 5IU/kg) , FGF21 humano recombinante (1 mg/kg) , o tanto insulina (Humulin R, 5IU/kg) como FGF21 humano recombinante (1 mg/kg) en ratones dos veces diariamente en dosis indicadas. Se midió la glucosa en la sangre el día 3 después del inicio del tratamiento, en 1 hora y 4 horas después de la inyección de la mañana y el día 5, en 1 hora después de la inyección de la mañana. El día 5, después de la medición de 1 hora de glucosa en la sangre, los ratones se les aplicó la eutanasia y las muestras de sangre terminales se recolectaron. El peso corporal se midió diariamente durante el periodo del estudio.

Se preparó el plasma de muestras sanguíneas recolectadas en la línea bas y terminal para la química clínica y análisis de la hormona endocrina. Los parámetros de química clínica, incluyendo glucosa en el plasma, colesterol total, triglicéridos, y ácidos grasos no esterificados (NEFA) , se midieron usando el Analizador de Química Olympus AU400e (Olympus America, Inc; Center Valley, PA) . Se determinaron los niveles de glucagón e insulina por un kit de endocrina de murino múltiple (MENDO-75K, Millipore Corp., Billerica, MA) .

Efecto de F6F21 en la Glucosa en Plasma: Como se muestra en la Figura 1, después de la inyección STZ, los niveles de glucosa en la sangre en todos los grupos incrementan desde niveles normales hasta medios en el intervalo desde 601 hasta 630 mg/dL. Los niveles de glucosa en la sangre continúan incrementándose en el grupo de vehículo hasta > 700 mg/dL durante el perioo de tratamiento de cinco días. El tratamiento con FGF21 humano recombinante (1 mg/kg) o niveles de glucosa en la sangre reducida por insulina (5 IU/kg) por 16% y 42%, respectivamente, el día 3. Una reducción al 54% aditiva de los niveles de glucosa en la sangre se observó en el grupo de combinación de FGF21 e insulina. Los niveles de glucosa en la sangre para el valor de referencia 4 horas después de la inyección de todos los compuestos. El día 5, se observaron hallazgos similares. Las reducciones en el nivel de glucosa en la sangre para FGF21 humano recombinante, insulina, y tratamiento de combinación fueron 15%, 31%, y 58%, respectivamente, con relación al grupo de vehículo.

El plasma de las muestras de sangre recolectado en el valor de referencia (Día 0) y aproximadamente 2 horas posteriores a la inyección de la mañana el día 5 se corrió en un analizador químico clínico para una medición de glucosa en el plasma más preciso. Los resultados se muestran en la Figura 2. Similares a las mediciones de glucosa en la sangre obtenidas del glucómetro mostradas en la Figura 1, FGF21 humano, insulina, y tratamiento de combinación resultan en las reducciones en el nivel de glucosa al 20%, 32%, y 62% con relación al grupo de vehículo, respectivamente.

Efecto de F6F21 en niveles de lípido: Las muestras de sangre recolectadas en el valor de referencia (Día 0) y aproximadamente dos horas posteriores a la inyección de la mañana el día 5 se ejecutaron en un analizador químico clínico para medir los niveles de lípido en el plasma. Desde el día 0 hasta el día 5, el triglicérido en el plasma, colesterol total, y los niveles de NEFA en ratones tratados con vehículo incrementan 2-3 veces ya que la Diabetes Tipo 1 empeora progresivamente. El tratamiento de FGF21 humano (1 mg/kg) solo disminuye niveles de triglicéridos en plasma, similares a los niveles obsevados en animales tratados con insulina (Humulin R, 5 IU/kg) (Figura 3) . Un efecto que disminuye el triglicérido en el plasma adicional se obervó . para el grupo de tratamiento de combinación. Con relación al grupo de vehículo, las reducciones en el nivel de triglicéridos en el plasma para FGF21 humana, insulina, y tratamiento de combinación, fueron 57%, 53%, y 70%, respectivamente (Figura 3) .

El tratamiento con FGF21 también disminuye los niveles de colesterol total y de- NEFA. Con relación al grupo de vehículo, las reducciones en el nivel de colesterol total para FGF21 humano, insulina, y tratamiento de combinación, fueron 57%, 53%, y 70%, respectivamente (Figura 4). Los niveles de NEFA se redujeron en FGF21 humano, insulina, yratones tratados con combinación al 18%, 50%, y 65% con relación a los ratones tratados con vehículo, respectivamente (Figura 5) .

Efecto de F6F21 én los niveles de insulina: Los niveles de insulina se evaluaron en ratones tratados con STZ inyectados dos veces diarias con vehículo, FGF21 humano recombinante (1 mg/kg), insulina (Humulin R, 5 IU/kg) , o combinación de insulina (Humulin R, 5 IU/kg) y FGF21 (1 mg/kg) . El tratamiento con FGF21 solo no restaura el nivel de insulina en el plasma en ratones tratados con STZ (Figura 6) . Sin embargo, los niveles de insulina en el plasma fueron superiores en FGF21 y grupo de tratamiento de combinación de insulina que en el grupo solo de tratamiento de insulina, sugiere un efecto de estabilización de insulina posible de FGF21 (Figura 6) . .

Efecto de FGF21 en los Niveles de glucagón: La Figura 7 demuestra la capacidad de FGF21 para disminuir niveles de glucagón en el plasma en un modelo roedor diabético tipo 1 inducido por STZ. Los niveles inferiores de gluoagón.se presentaron en todos los grupos de tratamiento como se. compara con el grupo de vehículo. El tratamiento de FGF21 humano recombinante (1 mg/kg), insulina (Humulin R, 5 IU/kg)., o combinación de insulina (Humulin R, 5 IU/kg) y FGF21 humano recombinante (1 mg/kg) reduce los niveles de glucagón al 27%, 43%, y 30% con relación al tratamiento de vehículo, respectivamente.

Ejemplo 2 Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ de dosis alta En el Ejemplo 1, se demostró que el tratamiento de FGF21 humano nativo es capaz de disminuir niveles de glucosa en plasma en un modelo roedor diabético tipo 1 inducido por STZ. Sin embargo, este efecto es de corta duración, ya que niveles de glucosa en plasma regresan dentro de cuatro horas después de la inyección (Figura 1) . Con objeto de evaluar los efectos que disminuyen la glucosa en el plasma durante un cuadro de tiempo prolongado, dos moléculas de polietilen glicol (PEG) (20kD) ¦ se fusionaron químicamente en las posiciones 37 y 77, para una variante FGF21 humana (E37C, R77C, P171G; las posiciones de las mutaciones son relativas a SEQ ID N0:4). Esta variante FGF21 humana PEGilada doble se ha demostrado que exhibe eficacia que disminuye la glucosa superior para FGF21 humano nativo en estudios de roedores previos, posiblemente como un resultado de farmaco'cinéticos mejorados. El estudio actual se condujo para evaluar si esta variante FGF21 humana PEGilada doble podría producir un efecto que disminuye la glucosa sostenida en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ seguido de una administración sencilla.

El modelo de ratón diabético tipo 1 inducido por STZ de dosis alta (180mg/kg) se generó como se describe en el Ejemplo 1. En 72 horas después de la inyección STZ (Día 0) , los ratones que demuestran la pérdida de peso corporal de 1.2g hasta 3.3g y los niveles de glucosa en plasma en el intervalo de 367 hasta 652 mg/dL se seleccionaron para el estudio y asignaron en los grupos de tratamiento respectivos o vehículo. Una inyección IP sencilla de vehículo (Tris-HCl lOmM, NaCl 150mM, pH 8.5) o variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en 1 y 5 mg/kg se administró en ratones. Se midió la glucosa en la sangre en los días 1, 3, 5, y 7, seguido de administración de vehículo o variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) . El peso corporal se midió diariamente durante el periodo de estudio completo.

Como se muestra en la Figura 8, por el Día 1, los niveles de glucosa en plasma en la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 y 5 mg/kg) se redujeron por 20% y 15% con reláción a los niveles del vehículo, respectivamente. Estos niveles se mantuvieron para ambos grupos de dosis en el día 3 con reducciones de glucosa al 20% y 12% con relación al vehículo, respectivamente. La dosis alta de la variante FGF21 humana PEGilada doble (5 mg/kg) continúa para mostrar la eficacia en el Día 5 y Día 7 con la reducción en la glucosa de plasma por alrededor de 15% con relación al vehículo. La eficacia disminuye para la variante FGF21 humana PEGilada doble de dosis inferior (1 mg/kg) por el día 5.

Ejemplo 3 Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ de dosis baja múltiple (prevención) Se generó un modelo de .ratón diabético tipo 1 inducido por STZ de dosis baja múltiple (MLD) . El modelo MLD-STZ imita más cercanamente el desarrollo de Diabetes Tipo 1 en humanos que el modelo STZ de dosis alta sencillo mencionado en los estudios previos. El método MLD provoca pérdida gradual de células beta del páncreas como cada inyección STZ de dosis baja sucesiva. Esto genera una respuesta inflamatoria inicial hacia las células beta del páncreas. Durante el curso de 2-3 semanas, esta respuesta inmunológica innata incrmenta y destruye las células beta que producen la insulina del páncreas que lleva a T1DM. En contraste, el método STZ de dosis alta sencilla (180 mg/kg) rápidamente destruye las células beta en el páncreas con las primeras 24 hasta 48 horas seguido de inyección STZ. Aunque ambos métodos últimamente resultan en ratones diabéticos tipo 1 deficientes de insulina, el método MLD se conduce predominantemente por una respueta inmunológica, mientras que el método dedosis alto sencillo se conduce en gran parte por los efectos tóxicos de STZ. En este estdio, se ha evaluado los efectos de la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en el progreso T1DM en ratones inducidos por MLD STZ.

Los ratones C57BL6 macho se obtuvieron de Harían Laboratories y suministraron a 7 semanas de edad. Durante el la llegada, los ratones se alojaron individualmente y mantuvieron en condiciones ambientales controlados. Después de 5 dias de aclimatación, los ratones de arriba de 20g de peso corporal se les administraron cinco inyecciones intraperitoneal (IP) diariamente consecutivas de STZ (estreptozotocina, Sigma S-1030) en 40 mg/kg/dia. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante cuatro horas antes de recibir la inyección STZ cada día. Los pesos corporales diario en la mañana se vigilaron durante el proceso de inducción. En 72 horas después de la quinta inyección STZ (Día 0), el peso corporal y mediciones de la glucosa en el plasma se hicieron y el plasma se recolectó de todos los ratones. Los ratones con valores de glucosa en plasma > 200 mg/dL luego se asiganaron aleatoriamente en grupo de tratamiento o vehículo,' con base en la glucosa en la sangre y peso corporal como criterios de asignación.

El vehículo (Tris-HCl lOmM, NaCl 150mM, pH 8.5) o variante FGF21 humana 20 kd PEGilada doble (E37C, R77C, P171G)-(1 mg/kg) se inyectó IP en ratones cada cuatro horas, iniciando el día 0. Se midió la glucosa en la sangre el día 2, 6, 10, 14, 18 y 22 después del inicio del tratamiento. El día 27, siete días desues de la última inyección, los ratones se les aplicó la eutanasia y se recolectaron muestras de sangre terminales. El peso corporal se midió cada dia diferente durante el pe'riodo de estudio.

Efecto de la Variante F6F21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en Glucosa en Plasma: En 72 horas después de la quinta inyección STZ (Día 0) , el valor de referencia significa glucosa en la sangre para el vehículo y grupo de tratamiento fue 253 mg/dL y 256 mg/dL, respectivamente. El nivel de glucosa en el plasma incrementa con el curso del estudio en el grupo vehículo, mientras que se redujo en el grupo de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) por 8% (Día 2), 26% (Día 6), 40% (Día 10), 48% (Día 14), 58% (Día 18), y 54% (Día 22), con relación al vehículo (Figura 9) .

El plasma de las muestras de sangre colectado el día 0 y Día 27 (siete días después de la última inyección) se corrieron en un analizador químico clínico para una medición de glucosa en el plasma más precisa. Similar a las reducciones de glucosa en la sangre que se muestra en la Figura 9, el tratamiento con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) previene la elevación de glucosa en el plasma y reduce los niveles de glucosa en plasma hasta niveles normoglicémicos (Figura 10). Con relación al grupo de vehículo, la reducción de glucosa en el plasma para la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) fue 51%.

Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en Niveles de lipido: Desde el Día 0 hasta el Día 27, los niveles de triglicéridos en plasma en ratones tratados con vehículo permanecen estables, mientras que se reducen en ratones tratados con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) por 47% (Figura 11) . El tratamiento con FGF21 también disminuye el colesterol total por 25% (Figura 12), HDL-colesterol por 18% (Figura 13), y Niveles de NEFA por 35% (Figura 14), con relación al grupo de vehículo, respectivamente.

Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble en niveles de glucagón e insulina: En comparación con la dosis alta sencilla del modelo STZ, es evidente que el método MLD STZ no se produce como un estado deficiente de insulina severo pero fue adecuado para producir la hiperglicemia (Figura 9, Figura 10 y Figura 15) . El tratamiento con variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) reduce los niveles de insulina por 60% con relación al tratamiento de vehículo (Figura 15) mientras que mantiene los niveles de glucosa en normales, sugiriendo la administración de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) que mejora la sensibilidad de insulina en los ratones tratados con MLD STZ.

Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en Peso corporal: El tratamiento con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) provoca una reducción sostenida de ganancia de peso corporal en ratones diabéticos tipo 1 inducidos en MDL STZ (Figura 16) . El cambio en el peso corporal del día 0 se traza. En el dia 22, el peso corporal en ratones tratados con variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) fue 17% menor que los ratones tratados con vehículo.

Ejemplo 4 Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en ratones diabéticos tipo 1 inducidos con STZ de dosis baja múltiple (Tratamiento) Se ha demostrado que. la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) previene la elevación del nivel de glucosa en la sangre durante el progreso de la enfermedad T1DM durante el periodo de estudio de 22 días (Ejemplo 3) . En tal estudio, la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) se administró tres días después de la quinta dosis baja de inyección STZ antes los ratones han desarrollado Diabetes Tipo 1 abierta e hiperglicemia . En el estudio actual, se ha evaluado si FGF21 podría revertir la hiperglicemia una vez que los ratones se han vuelto hiperglicémicos después de la inyección MLD STZ. La variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) se administró 23 días después de la quinta dosis de inyección STZ.

El modelo de ratón MLD STZ se generó como se describe en el Ejemplo 3. Brevemente, ratones C57BL6 machos de 7 semanas de edad reciben cinco inyecciones intraperitoneales (IP) diarias consecutivas de STZ (estreptozotocina, Sigma S-1030) en 40 mg/kg/dia. El día 21 después de la quinta dosis de STZ (tratamiento dia -2), los niveles de glucosa en la sangre y el peso corporal se midieron y los ratones se colocaron aleatoriamente en los .grupos de tratamiento o vehículo. El vehículo (Tris-HCl lOmM, NaCl 150mM, pH 8.5) o la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) se inyectaron IP en ratones el día 23 después de la quinta dosis de STZ (tratamiento día 0) . Los compuestos se dieron cada 4 días y un total de cinco inyecciones IP se administraron. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron en el tratamiento el día 2, 6, 10, 14, y 18. El peso corporal se midió 2-3 veces por semana durante la fase de inducción de la enfermedad y cada otro día durante el periodo del estudio. En el tratamiento el -día 18, 2 días después de la última inyección, a los ratones se les aplicó la eutanasia y las muestras de sangre terminal se recolectaron.

El páncreas de cinco ratones en cada grupo se recolectó. La evaluación de histología e inmunohistoquímica para insulina y glucagón se condujo. Las secciones del páncreas de 5 µ?? se desparafini-zaron e hidrataron en H20 desionizada. Las secciones se bloquearon con CAS BLOCK (Invitrogen, # 00-8120; Camarillo, CA) y se incuban con anti-glucagon policlonal de conejo (DAKO #A0565, Carpenteria, CA) . Los portaobjetos se apagaron con H202 al 3% y seguido por EnvisionHRP de cortejo (DAKO #K4003, Carpenteria, CA) .. Los sitios de reacción se visualizaron con diaminobenzadina (DAB; DAKO #K3468 Carpentaria, CA) . Las secciones luego se bloquearon de nuevo con CAS BLOCK e incubaron con anti-insulina policlonal de conejillo de indias (DAKO #A0564, Carpenteria, CA) . Los portaobjetos se incubaron con IgG anti-conej illo de indias de cabra biotinilado (Vector #BA7000, Burlingame, CA) seguido por Vectastain AP-ABC (Vector #AK5000, Burlingame, CA) . Los sitios de reacción se visualizaron con AP-Red (Vector #SK5100). Los portaobjetos luego se evaluaron microscópicamente por. un patólogo.

Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P1716) en la Glucosa en el Plasma: En este estudio, se ha investigado los efectos que disminuyen la glucosa en el plasma de la administración FGF21 después de que los ratones se han convertido a T1DM, 23 dias después de la inducción de MLD STZ. Previo al inicio del tratamiento en 21 dias después de la inducción MLD STZ, la glucosa en la sangre media de linea base para ambos grupos estuvo en un intervalo de. 438 hasta 455 mg/dL (tratamiento en el día -2) . El vehículo y la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (1 mg/kg) se administró a ratones Q4D. La glucosa en el plasma se midió posteriormente cada 4 días en los días 2, 6, 10,. 14, y 18. La variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) disminuye la glucosa en el plasma y últimamente invierte la hiperglicemia en este modelo de animal (Figura 17). Los niveles de glucosa en plasma en el grupo de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) se redujeron por 46% (Día 2), 56% (Día 6), y 69% (Día 10, día 14). Por el estudio en el día 10, los niveles de glucosa en plasma han regresado al nivel normoglicémico .

El plasma de las muestras de sangre recolectado el día -20 y 2 días posteriores de la última inyección en el día 18 se ejecutaron en un analizador químico clínico para una medición de glucosa en el plamsa más preciso. Similar a las reducciones de glucosa en la sangre mostradas en la Figura 17, el tratamiento con el variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) reduce los niveles de glucosa en plasma a niveles normoglicémicos . Con relación al grupo de vehículo, la reducción de glucosa en el plasma para el grupo de variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) fue 70% (Figura 18) . . ' Efeco de la Variante F6F21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en niveles de lipido: Desde el día -20 hasta el día 18, los niveles de triglicéridos en ratones tratados con vehículo se elvaron, mientras que los ratones tratados con PEG-FGF21 demuestran una reducción en los niveles' de triglicéridos. Con relación al grupo de vehículo, los niveles de triglicéridos en plasma en ratones tratados con variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) se redujeron al 53% (Figura 19) . El tratamiento con FGF21 también disminuye el colesterol total, colesterol HDL, y Niveles de NEFA al 21%, 14% y 42%, respectivamente (Figuras 20, 21, y 22) .

Efecto de la Variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) en los niveles de insulina: El tratamiento con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) reduce niveles de insulina al 55% con relación al tratamiento de vehículo (Figura 23) mientras que los niveles de glucosa normalizados en plasma (Figura 17 y 18), sugiere que la administración de la variante FGF21 humana PEGilada doble . (E37C, R77C, P171G) mejora la sensibilidad a la insulina en estos ratones.

Efecto de la Variante FGF21 PEGilada doble en niveles de la enzdLma del hígado: Se observaron los niveles de ALT y AST elevados en ratones tratados con MLD STZ el día 18 (Figuras 24 y 25) . Los ratones tratados con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) que muestra 40% de niveles de ALT inferiores que los ratones tratados con el vehículo (Figura 25) .

Efecto de la Variante FGF21 PEGilada doble en Pesos corporales : En este estudio, se redujo progresivamente el peso corporal por la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) (Figura 26) . El día 18, el peso corporal en ratones tratados con la variante FGF21 humana . PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) fue 6% menor que. en los ratones tratados con vehículo.

Efecto de la Variante FGF21 PEGilada doble la prevención de célula Beta : Para mejorar el entendimentd de los efectos benéficos de la administración FGF21 es ratones T1DM inducidos por STZ, se ha conducido la tinción inmunohistoquímica para análisis de insulina y glucagón e histomorfometrico para el páncreas.

Específicamente, la atrofia/hipertrofia de célula B, degeneración de células de isleta, infiltración mononuclear, y atrofia y fibrosis de tejidos rodeados se analizaron. La inmunoreactividad a la insulina de las celias beta se ilustra en la Figura 27. Los paneles speriores son imágenes de un ratón tratado con vehículo (ratón A3) y los paneles inferiores son de un ratón tratado con la variante FGF21 humana PEGilada doble '(E37C, R77C, P171G) (ratón B3). Como se ilustra, existe intensidad incrementada y uniformidad de la inmunoreactividad a la insulina en el ratón tratado con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) . La Figura 28 resmen la inmunoreactividad a la insulina y los hallazgos morfométricos de cada vehículo y el ratón tratado con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) . Los ratones tratados con vehículo se indican Al hasta A5, mientras que los ratones tratados con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) se indican como Bl hasta B5. 'En resumen, casi todos los ratones tratados con vehículo demuestran alguna atrofia/hipertrofia de célula de isleta y degeneración, mientras que únicamente 1-2 ratones en el grupo tratado con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) demuestran estos efectos. El hecho de que la inmunoreactividad a la insulina se disminuyó profundamente en ratones tratados con vehículo también sugiere que un porcentaje mayor de células beta se destruyeron en ratones tratados con vehículo que aquellos tratados con la variante FGF21 humana PEGilada doble (E37C, R77C, P171G) . En general, estos resultados morfornétrieos confirman que el tratamiento FGF21 no sólo disminuye los niveles de glucosa y lipido, sino también demuestran algunos efectos protectores en células beta de progreso y destrucción inmunológica adicional de. T1DM.

Conclusiones Colectivamente, los datos presentados en los Ejemplos 1-4 indican que FGF21 presenta una nueva opción terapéutica para pacientes con Diabetes Tipo 1. El tratamiento FGF21 solo es suficiente para reducir los niveles de lípidos y glucosa en el plasma en tanto modelos de roedores diabéticos tipo 1 inducitos por STZ de dosis baja . como alta. Además, el tratamiento FGF21 en conjunto con el tratamiento de insulina proporciona efecto que dismminuye la glucosa en el plasama aditivo. La PEGilación de la variante FGF21 humana (E37.C, R77C, P171G) dramáticamente extiene el efecto que disminuye la glucosa en el plasma hasta 7 días después de una inyección sencilla. La administración crónica de esta molécula no solamente previene el progreso de T1DM sino también invierte las elevaciones del nivel de lipido y glucosa en el plasma en ratones TlDM. De nuestro análisis morfométrico, se ha demostrado además que la administración FGF21 incrementa los contenidos de insulina de isleta y protege las células beta de destrucción. Esto puede ofrecer una explicación mecánica para el efecto benéfico de FGF21 observado en el modelo animal TlDM. En general, se ha proporcionado evidencia de que FGF21 tiene potential para el tratamiento de Diabetes Tipo 1.

Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un polipéptido FGF21 humano aislado; o (b) un polipéptido variante FGF21 en la producción de un medicamento para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que necesita del mismo.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el trastorno metabólico es diabetes tipo 1.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el trastorno metabólico es dislipidemia .

4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el trastorno metabólico es obesidad.

5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el trastorno metabólico es nefropatia diabética.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el trastorno metabólico comprende una afección en la cual el sujeto tiene un nivel de glucosa en la sangre en ayunas mayor que o igual a 100 mg/dL.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el sujeto es un mamífero.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde el mamífero es un humano.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el polipétido FGF21 humano comprende uno de SEQ ID Nos. 4 y 8.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el polipéptido FGF21 humano se codifica por uno de SEQ Id Nos. 3 y 7.

11. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el polipéptido FGF21 se adapta para administrarse, en una forma de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido FGF21 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el polipéptido FGF21 humano o polipéptido variante FGF21 humuno comprende además uno o más de (a) uno o más de moléculas PEG; y (b) un polipéptido Fe.

13. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF21 humano,' que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 9Q% identidad de secuencia con uno de SEQ ID Nos. 4 y 8, en la producción de un medicamento para tratar un trastorno metabólico en un sujeto que necesita del mismo.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el trastorno metabólico' es diabetes tipo 1.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el trastorno metabólico es dislipidemia .

16. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el trastorno metabólico es obesidad.

17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el trastorno metabólico es nefropatia diabética.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el trastorno metabólico comprende una afección en la cual el sujeto tiene un nivel de glucosa en la sangre en ayunas mayor que o igual a 100 mg/dL.

19. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el sujeto es un mami.fero.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el mamífero es un humano.

21. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el polipéptido FGF21 se adapta para administrarse, en una forma de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido FGF21 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.

22. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el polipéptido FGF21 comprende además uno o más de (a) una o más moléculas PEG; y. (b) un polipéptido Fe.

23. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el polipéptido variante FGF21 o polipéptido FGF21 humano aislado comprende uno de SEQ ID NOs: 10 y 12.

24. El uso de conformidad con la reivindicación 27, "en donde el polipéptido FGF21 humano aislado; o polipéptido variante FGF21 comprende uno de SEQ ID NOs: 39 y 41.