MX2013003482A - Polipeptidos manipulados que tienen duracion de accion incrementada. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan compuestos que tienen entre otras cosas buena duración de acción, alta potencia y/o regímenes de dosificación convenientes incluyendo la administración una vez por semana. Los compuestos son polipéptidos manipulados que incorporan un dominio de unión a albúmina en combinación con uno o más polipéptidos biológicamente activos. También se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento de enfermedades y trastornos, incluyendo lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad de hígado graso o diabetes (incluyendo tipo I y tipo II). Las enfermedades y trastornos adicionales que se pueden tratar por los compuestos y métodos descritos aquí incluyen esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), síndrome metabólico X y enfermedad de Huntington.

Description

POLIPEPTIDOS MANIPULADOS QUE TIENEN DURACION DÉ ACCION INCREMENTADA Campo de la Invención La presente solicitud se refiere a compuestos que tienen buena duración de acción, alta presencia y/o regímenes de dosificación convenientes incluyendo administración oral, y a un método de uso de los mismos. En la presente se proporcionan polipéptidos manipulados que incorporan un dominio de unión a albúmina en combinación con un péptido biológicamente activo. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que debido a que los polipéptidos manipulados descritos en la presénte pueden unirse a albúmina, los compuestos pueden ser secuestrados (por ejemplo, unidos a albúmina) mientras están en la 'circulación • llevando a una duración de acción incrementada, 'debido por ejemplo a una depuración y/o degradación renal reducida. Las enfermedades que pueden recibir este tratamiento incluyen lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de lectina, enfermedad de hígado graso, diabetes (incluyendo tipo I y tipo II), esteatohepatitis no alcohólica (NASH, por sus siglas en inglés), enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD, por sus siglas en inglés) , síndrome metabólico X y enfermedad de Huntington, o combinaciones de las mismas.

Antecedentes de la Invención Sigue habiendo una necesidad por desarrollar REFi. : 240145 polipéptidos útiles en las enfermedades, afecciones y trastornos metabólicos descritos arriba. En consecuencia, un objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos manipulados con vidas medias extendidas útiles para tratar las afecciones anteriores y métodos para producirlos y usarlos.

Cada patente, solicitud de patente y publicación citada en la presente se incorpora aquí a manera de referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan compuestos y polipéptidos manipulados que tienen afinidad de unión para albúmina y una utilidad terapéutica adicional. Los compuestos son polipéptidos manipulados que incluyen un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD, por sus siglas en inglés) capaz de unirse a albúmina y un polipéptido de dominio de hormona (HD, por sus siglas en inglés) , polipéptidos HD que pueden ser biológicamente activos y pueden provocar una respuesta biológica benéfica, en enlace covalente con el ABD. Cualquiera de los polipéptidos ABD o HD unidos aquí pueden ser unidos covalentemente en forma opcional en el polipéptido manipulado a través de un enlazador L, por ejemplo Ll como el descrito en la presente. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que debido a que los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden unirse a albúmina, los compuestos pueden ser secuestrados en un sujeto llevando a duración de acción incrementada en el sujeto.

En un primer aspecto, se proporciona un polipéptido manipulado como el descrito en la presente. El polipéptido manipulado incluye un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) y un dominio de hormona (HD1) . El dominio de hormona incluye un polipéptido que es una leptina, un análogo de una leptina o un fragmento activo de la misma.

En otro aspecto, se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto que requiera tratamiento. El método incluye administrar un polipéptido manipulado como el descrito en la presente al sujeto.

En otro aspecto más, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un compuesto de polipéptido manipulado descrito en la presente en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto más, se proporcionan polinucleótidos que codifican para el polipéptido manipulado y sus intermediarios, vectores de expresión que portan estos polinucleótidos, células hospederas que expresan a los polinucleótidos y medios para su expresión, síntesis, modificación post-traduccional y aislamiento.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1B ilustran los efectos de una sola administración de polipéptidos manipulados como los descritos en la presente en el consumo de alimento y peso corporal después de administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 3". La figura 1A muestra el consumo de alimento. La figura IB muestra el cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) .

Simbología: Vehículo (cuadro); Comp 1 en 2.6 mg/kg (triángulo con punta hacia arriba); Comp 2 a 2.7 mg/kg (triángulo con punta hacia abajo); Comp 4 a 2.7 mg/kg (diamante) ; Comp C2 a 10 mg/kg (círculo) .

Las figuras 2A-2B ilustran los efectos de una sola administración de polipéptidos manipulados como los descritos en la presente en consumo de alimento y peso corporal después de la administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 4. Figura 2A: Consumo de alimento. Figura 2B: Cambio en peso corporal (% corregido por vehículo). Simbología: Vehículo (cuadrado); Comp 2 a 0.3 mg/kg (triángulo con punta hacia arriba); Comp 2 a 1.0 mg/kg (triángulo con punta hacia • abajo); Comp 2 a 3.0 mg/kg (diamante).

Las figuras 3A-3B ilustra los efectos de una sola administración de polipéptidos manipulados como los descritos en la presente en consumo de alimento y peso corporal después de su administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 5. Figura 3A: Consumo de alimento. Figura 3B: Cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) . Simbología: Vehículo (cuadrado); Comp C2 a 1.1 mg/kg (círculo); Comp C2 a 3.3 mg/kg (cuadrado); Comp C2 a 11.1 rag/kg (triángulo con punta hacia arriba) .

Las figuras 4A-4B ilustran los efectos de una sola administración de polipéptidos manipulados descritos en la presente, y de un compuesto de control, en el consumo de alimento y peso corporal después de su administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 6. Figura 4A: Consumo de alimento. Figura 4B: Cambio en peso corporal (% corregido por vehículo). Simbología: Vehículo (cuadrado); Comp C6 a 2.2 mg/kg (triángulo con punta hacia abajo) .

La figura 5 ilustra los efectos de la administración una vez por semana de SEQ ID NO: 54 en peso corporal (% de línea de base) después de la administración a ratas DIO como se describe en el ejemplo 7. Simbología: Vehículo (cuadrado); Comp 2 a 1.3 mg/kg por inyección (triángulo con punta hacia arriba) .

Las figuras 6A-6B ilustran la detección y cuantificación de los niveles en plasma de SEQ ID NO: 33 (figura 6A) después de su administración a ratas DIO como se describe en el ejemplo 8.

La figura 7 ilustra los efectos de una sola administración de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente en el cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) después de su administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 9.

La figura 8 ilustra los efectos de una sola administración de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente en el cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) después de su administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 10.

Las figuras 9A-9B ilustran los efectos de una sola administración de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente en el consumo de alimento y cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) después de su administración a ratas como se describe en el ejemplo 11. Figura 9A: Consumo de alimento. Figura 4B: Cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) .

La figura 10 ilustra los efectos de una sola administración de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente en el consumo de alimento y cambio en peso corporal ( corregido por vehículo) después de su administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 12.

Las figuras 11A a 11C ilustran los efectos de una sola administración de los polipéptidos manipulados indicados descri8tos en la presente en el consumo de alimento acumulativo (figura 11A) y cambio porcentual de un peso corporal (figuras 11B y 11C) después de su administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 13.

La figura 12 ilustra la actividad funcional de leptina generada por el compuesto en presencia de albúmina, como se describe en el ejemplo 15.

La figura 13 ilustra un perfil de concentración en plasma contra tiempo prolongada del compuesto 2 en ratas después de una inyección subcutánea de acuerdo con el ejemplo 16.

La figura 14 muestra un perfil de concentración en plasma contra tiempo prolongada del compuesto 15 en ratas después de una inyección subcutánea de acuerdo con el ejemplo 16.

Las figuras 15A-15B ilustran los efectos de una sola administración de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente en el cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) después de su administración a ratas magras (figura 15A) y ratas ZDF (figura 15B) como se describe en el ejemplo 17.

La figura 16 ilustra los efectos de reducción de dosis de la administración una vez por semana del compuesto 2 en el peso corporal (% de línea de base) después de su administración a ratas magras como se describe en el ejemplo 18.

La figura 17 es una gráfica que ilustra el efecto en el peso corporal de la administración de leptina (125 pg/kg/día) y amilina (1500 pg/kg/día) , ya sea solas o en combinación, en dos grupos de ratas: un grupo de ratas muy obesas y otro grupo que fue restringido en calorías hasta el intervalo de obesidad moderada.

La figura 18A es una gráfica que ilustra un efecto en el peso corporal de la administración del compuesto 2 (120 mmol/kg) y amilina infundida en rata (50 µg/kg/día) , ya sea sola o en combinación durante cuatro semanas. La figura 18B es una gráfica que ilustra un efecto en el peso corporal de la administración del compuesto 2 (120 mmoles/kg) y PEG-amilina de rata (Des-Lysl- [Lys26 (mPEG40K) ] -Amilina de Rata (SEQ. NO: 148) (125 mmoles/kg) , ya sea sola o en combinación durante cuatro semanas.

Las figuras 19A-19B ilustran un efecto en el consumo de alimento (figura 19A) y peso corporal (figura 19B) de la administración del compuesto 15 (120 nmol/kg) y amilina (50 pg/kg/día) , ya sea sola o en combinación durante cuatro semanas .

La figura 20 es una gráfica que ilustra un efecto en el peso corporal de la administración del compuesto 15 (120 nmol/kg) y PEG-amilina de rata (Des-Lysl- [Lys26 (mPEG40K) ] -Amilina de Rata (SEQ ID NO:148) (125 nmol/kg) , ya sea solas o en combinación durante cuatro semanas .

La figura 21A ilustra un efecto en el peso corporal de la administración de leptina y amilina, ya sea sola o en combinación durante cuatro semanas, en ratas moderadamente obesas. La figura 21B ilustra la falta.de un efecto en el peso corporal de la administración de leptina y amilina, ya sea solas o en combinación durante cuatro semanas, en ratas severamente obesas. La figura 21C ilustra un efecto en el peso corporal de la administración del compuesto 2 (120 nmol/kg) y PEG-amilina de rata (Des-Lysl- [Lys26 (mPEG40K) ] -Amilina de Rata (SEQ. ID NO:148) (125 nmol/kg), ya sea solas o en combinación durante cuatro semanas, en ratas severamente obesas .

Las figuras 22A-22B ilustran un efecto en el peso corporal de la administración de: (Figura 22A) Compuesto 15 (120 nmol/kg) o (Figura 22B) Compuesto 2 (120 nmol/kg) y amilina (50 g/kg/día) , ya sea solas o en combinación durante cuatro semanas en ratas severamente obesas.

Las figuras 23A-23B ilustran los efectos de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente en la glucosa en sangre después de la administración a ratones TIDM inducidos por STZ como se describe en el ejemplo 30.

Las figuras 24A-24B ilustran los efectos de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente en hemoglobina A1C después de la administración 1 a ratones TIDM inducidos por STZ como se describe en el ejemplo 30.

Las figuras 25A-25B ilustran los efectos de los polipéptidos manipulados e indicados descritos en la presente en el consumo de alimento y peso corporal después de la administración a ratones TIDM inducidos por STZ como se describe en el ejemplo 30. , Las figuras 26A-26B ilustran los efeqtos de los polipéptidos manipulados indicados descritos aquí con y sin una dosis baja de insulina, en glucosa en sangre< después de administración .a ratones TIDM inducidos por STZ como se describe en el ejemplo 30.

Las figuras 27A-27B ilustran los efectos de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente, con y sin una dosis baja de insulina, en hemoglobina A1C después de su administración a ratones TIDM inducidos por STZ como se describe en el ejemplo 30. , Las figuras 28A-28B ilustran los efectos de los polipéptidos manipulados indicados descritos en la presente, con y sin una dosis baja de insulina, en consumo de alimento (% corregido por vehículo) y cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) después de su administración a ratones TIDM inducidos por STZ como se describe en -el ejemplo 30. j Descripción Detallada de la Invención I. Definiciones "Obesidad" y "sobrepeso" se refieren a mamíferos que tienen un peso mayor que el esperado normalmente, y se puede determinar mediante, por ejemplo, apariencia física, índice de masa corporal (BM, por sus siglas en inglés I) como se conoce en la técnica, relaciones de circunferencia de cintura a cadera, grosor de pliegues de la piel, circunferencia de la cintura y similares. Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) definen el sobrepeso como un humano adulto que tiene un BMI de 25 a 29.9; y definen obeso como un humano adulto que tiene un BMI de 30 o más alto. La métrica adicional para la determinación de obesidad existe. Por ejemplo, el CDC indica que una persona con una relación de cintura a cadera de más de 1.0 tiene sobrepeso.

"Masa corporal magra" se refiere a la masa del cuerpo libre de grasa, es decir, peso corporal total menos peso de grasa corporal es una masa corporal magra. La masa corporal magra puede medirse mediante métodos tales como pesado hidrostático, cámaras computarizadas , absorciometría por rayos X de doble energía, calibres de piel, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) y análisis de impedancia bioeléctrica (BIÁ, por sus siglas en inglés) como se conoce en la técnica.

"Mamífero" se refiere a animales de sangre caliente que generalmente tienen pelaje o pelo, que dan nacimiento vivo a su progenie, y que alimentan a su progenie con leche. Los mamíferos incluyen humanos; animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos) ; animales de granja (por ejemplo, vacas, caballos, borregos, cerdos, cabras) ; animales salvajes y similares. En una modalidad, el mamífero es una hembra. En una modalidad, el mamífero es un humano femenino. En una modalidad, el mamífero es un gato o perro. En una modalidad, el mamífero es un mamífero diabético, por ejemplo, un humano que tiene diabetes tipo 2. En una modalidad, el mamífero es un mamífero diabético obeso, por ejemplo, un mamífero obeso que tiene diabetes tipo 2. El término "sujeto" en el contexto de los métodos descritos en la presente se refiere a un mamífero .

"Fragmento" en el contexto de polipéptidos se refiere aquí en el sentido químico común a una porción de un polipéptido. Por ejemplo, un fragmento puede ser el resultado de una supresión N-terminal o supresión C-terminal de uno o más residuos de un polipéptido progenitor, y/o un fragmento puede resultar de la supresión interna de uno o más residuos de un polipéptido progenitor. "Fragmento" en el contexto de un anticuerpo se refiere a una porción de un anticuerpo que puede ser enlazada a una molécula biológicamente activa para modular la solubilidad, distribución dentro de un sujeto y similares. Por ejemplo, la leptina A200 descrita en la presente es un conjugado de un fragmento de anticuerpo Fe con una leptina, como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, WO 98/28427 y US2007/002084. El término "progenitor" en el contexto de polipéptidos se refiere, en el sentido común, a un polipéptido que sirve como una estructura de referencia antes de la modificación, por ejemplo, inserción, supresión y/o sustitución. El término "conjugado" ' en el contexto de polipéptidos manipulados descritos en ,1a presente se refiere a enlace covalente entre polipéptidos componentes, por ejemplo, ABD, HD1 y similares. El término "fusión" en el contexto de polipéptidos manipulados descritos en la presente se refiere a un enlace covalente entre polipéptidos componentes, por ejemplo, ABD, HD1 y similares, <ya sea por i medio de un grupo funcional tanto de terminal ,amino como carboxi del esqueleto del péptido. Los polipéptidos manipulados pueden hacerse sintética o recombihantemente . Típicamente, las fusiones se hacen usando biotecnología recombinante, sin embargo, también se pueden hacér mediante síntesis química y métodos de conjugación conocidos en la técnica. ' "Análogo" según se usa en la presente en el contexto de polipéptidos se refiere a un compuesto que tiene inserciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos con relación a un compuesto de origen. Un análogo puede tener estabilidad, solubilidad, eficacia, vida media superiores y similares. En algunas modalidades, un análogo es uri compuesto que tiene al menos 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%,; 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o todavía más, de identidad de secuencia con el compuesto de origen. '¦ "Identidad", "identidad de secuencia" y similares en el contexto de comparar dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos , se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que · son iguales o tienen un porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos específicos que son iguales (es decir, aproximadamente 50% de identidad, de preferencia 50%, 55%, 60%, 65%, 70%> 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o identidad más alta sobre una región especificada,1 cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima , sobre una ventana de comparación o región designada) según se mide usando algoritmos de comparación de secuencias como se conoce en la técnica, por ejemplo BLAST o BLAST 2.0. Esta : definición incluye secuencias que tienen supresiones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones, así como variantes de origen natural, por ejemplo, variantes polimórficas o alélicas y variantes hechas por el- hombre. En ;algoritmos preferidos, se tienen en cuenta espacios y similares, como se conoce en la técnica. Para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencias son ingresadas en una computadora, coordenadas de subsecuencias son designadas si es necesario, y se diseñan parámetros de programa de algoritmos de secuencia. De preferencia, los parámetros de programa preestablecidos pueden ser usados, o pueden designarse parámetros' alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula después las identidades de secuencia porcentuales para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa. La alineación opcional de secuencias para comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biól. 48:443, por la búsqueda para método de similitud de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. E.U.A. 85:2444, por medio de implementaciones computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science, Dr., Madison, Wis.), o por alineación manual e inspección visual. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds . 1995 suplemento)) . Ejemplos preferidos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia incluyen los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et a.., 1977, Nucí, Acids. Res. 25:3389-3402 y Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol . 215:403-410. BLAST y BLAST 2.0 Se usan, como se conoce en la técnica, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible públicamente a través del sitio web del Centro Nacional para Información de Biotecnología. Este algoritmo incluye identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSPs, por sus siglas en inglés) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, las cuales ya sea coincidan o satisfagan alguna puntuación T de umbral de valor positivo cuando se alineen con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T Se conoce como el umbral de puntuación de palabra adyacente (Altschul et al., Id.) Estos aciertos de palabra adyacente inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que las contengan. Los aciertos de palabras son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para tanto como la puntuación de alineación acumulativa pueda ser incrementada. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, por ejemplo, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalidad para residuos no coincidentes; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se resalta cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por la cantidad X a partir de su valor logrado máximo; la puntuación acumulativa baja a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o el final de cada secuencia es alcanzado. Los parámetros del algoritmo BLAST , T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como parámetros preestablecidos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros preestablecidos una longitud de palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. E.Ü.A. 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras.

El término "aproximadamente" en el contexto de un valor numérico se refiere a +/- 10% del valor numérico, a menos que se indique expresamente lo contrario.

Los términos "péptido" y "polipéptido" en el contexto de componentes de los polipéptidos manipulados descritos en la presente son sinónimos.

II. Compuestos En un primer aspecto, se proporcionan compuestos de polipéptidos manipulados que incluyen un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) y al menos un dominio de hormona de polipéptido (HD1) . Los términos "dominio de unión a albúmina", "ABD"- y similares se refieren a polipéptidos capaces de unirse a albúmina como se describe en la presente. Los términos "dominio de hormona", "polipéptido de dominio de hormona" y similares se refieren a un polipéptido capaz de provocar una respuesta biológica en un sujeto. Ejemplos de dominios de hormona incluyen, pero no están limitados a, una leptina, un análogo de una leptina o un fragmento activo de la misma, pero podrían ser un derivado de leptina tal como un derivado PEGilado.

Se encontró sorprendentemente que una leptina, un análogo de leptina, un fragmento de leptina activo o un derivado de leptina del mismo puede fusionarse a un dominio de unión a albúmina (ABD) de muy alta afinidad derivado de los dominios de unión a albúmina de proteínas bacterianas como las descritas aquí, mientras que conserva su eficiente actividad biológica de leptina y tiene una duración de acción extendida, por ejemplo de al menos 3 días e incluso 5 días en un roedor, lo cual se traduce en por lo menos una semana de duración o más en un sujeto humano. Esto fue sorprendentemente en parte debido a que estos péptidos ABD no se ha demostrado extensamente que sean una plataforma robusta como un portador de proteínas terapéutico, que sean relativamente hidrófobos . que pudieran interactuar adversamente con un péptido terapéutico unido, y no fueron capaces de actuar como un portador para al menos una familia de hormonas de péptidos. Por ejemplo, compuestos de amilina de rata (por ejemplo, SEQ ID NO: 108), cuando se' conjugan o fusionan a los ABDs descritos en la presente, no presentaron ninguna actividad in vivo significativa o de larga duración en los mismos modelos de roedor en los cuales varias construcciones de polipéptidos manipulados con leptina de la invención se encontró que eran activas y con una duración de acción larga.

Componentes biológicamente activos. Los componentes de compuesto biológicamente activos contemplados para usarse en los compuestos y métodos descritos en la presente incluyen leptinas. Los términos "compuesto biológicamente ' activo" y similares se refieren en el sentido común a compuestos, por ejemplo, polipéptidos y similares, que pueden provocar una respuesta biológica.

Leptinas. "Leptinas" y "una leptina" ¡significa: leptinas, fragmentos activos de leptina, análogos de leptina y derivados de leptina; y una leptina, un fragmento, activo de leptina, un análogo de leptina y un derivado de leptina; respectivamente. En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, la referencia a "leptinas" intenta incluir leptinas, fragmentos activos de leptina, análogos de leptina y derivados de leptina, como se describe en la 'presente.

Similarmente, a menos que se indique lo contrario, la referencia a "una leptina" intenta abarcar una leptina, un fragmento activo de leptina, un análogo de leptina y un derivado de leptina como los descritos aquí. Ejemplos de estas leptinas que pueden emplearse en el diseño, preparación y uso de los polipéptidos manipulados descritos en la presente incluyen aquellos que provocan una o más respuestas biológicas conocidas en la técnica como provocadas cuando leptinas se administran a sujetos (véase, por ejemplo, solicitudes de patente de' E.U.A. publicadas Nos. US 2007/0020284 y US .2008/0207512, patentes de E.U.A. Nos. 6,309,853 y US 7,183,254 y solicitudes de PCT publicadas Nos. WO 96/005309, O 98/28427 y WO 2009/064298), tales como: reducción de consumo de alimento, reducción de peso corporal, reducción de ganancia de peso corporal, inducción de saciedad, reducción de disponibilidad calórica, reducción de eficiencia calórica, reducción de planicie metabólica, incremento a sensibilidad a insulina, reducción de hiperlipidemia, corrección de dislipidemia, reducción de hpertrigliceridamia, reducción de obesidad, reducción de sobrepeso, reducción de diabetes mellitus (incluyendo diabetes tipo I, diabetes tipo II y diabetes gestacional ) , reducción de resistencia a insulina, reducción de condiciones de lipodistrofia asociadas con la misma, asi como otras respuestas biológicas conocidas en la técnica como provocadas después de la administración de una leptina (véase, por ejemplo, solicitudes de patente de E.U.A. publicadas Nos. US 2007/0020284 y US 2008/0207512, patentes de E.U.A. Nos. 6,309,53 y US 7,183,254, y solicitudes de PCT publicadas Nos. WO 96/005309, WO 98/28427 y WO 2009/064298.

Ejemplos de leptinas adecuadas para el diseño, preparación y uso de los polipéptidos manipulados descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, los compuestos descritos en las patentes de E,. U.A. Nos. US 5, 594, 101, US 5,851, 995., US 5, 691,309, US 5, 580, 954, US 5,554,727, US 5,552,523, US 5,559,208, US 5,756,461, US 6,309,853, solicitud de patente de E.U.A. publicada No. US 2007/0020284 y solicitudes de PCT publicadas Nos. WO 96/23517, WO 96/005309, WO 98/28427, WO 2004/039832, WO 98/55139, WO 98/12224 y WO 97/02004, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad par todos los propósitos. Los métodos para ensayar actividades de leptina y respuestas biológicas in vitro e in vivo, 'incluyendo saciedad, actividad de inhibición de consumo de alimento y actividad de pérdida de peso, se conocen en la técnica y se describen aquí y también en las referencias anteriores y otras referencias mencionadas en la presente.

Cualquier leptina, análogo de leptina, fragmento activo de leptina o derivado de leptina conocido en la técnica puede emplearse para preparar y usar pólipétidos manipulados como los descritos en la presente a lo largo. Las leptinas, análogos de leptina, fragmentos activos de leptina y derivados de leptina representativos contemplados para usarse en los polipéptidos manipulados y métodos descritos en la presente también incluyen las siguientes: Leptinas de murino maduras : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHV LAFSKSCHIPQASGLETLESI . GGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC , en donde Xaa en la posición 28 es Q o está ausente (SEQ ID NO: 1) .

Leptina de murino madura forma 1 : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFI PGLHPILSLSKMDQTLAVY QQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 143) .

Leptina de murino madura forma 2 : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQ QVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 144) .

Leptinas de murino maduras con metionina N-terminal : VPIQKVQDDTKTLIK IVTRINDISH -Xaa- SVSS QKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHV LAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC, en donde Xaa en la posición 29 es Q o está ausente (SEQ ID NO: 2) .

Leptina de murino madura forma 1 con metionina N-terminal : MVPIQKVQDDT TLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAV YQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 145) .

Leptina de murino madura forma 2 con metionina N-terminal : MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY QQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 146) .

Leptina de porcino madura: VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAIY QQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTE VVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO:3).

Leptina de porcino madura con metionina N-terminal: VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSiMDQTLAI YQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYST E V VALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO:4).

Leptinas de bovino maduras : VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQIL SLPSRNVVQISNDLENLRDLLHL LAASSCPLPQVRALESLESLGWLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC, en donde Xaa en la posición 28 es Q o está ausente (SEQ ID NO: 5)..

Leptinas de bovino maduras con metionina N-terminal : MVPICKVQDDTKTLI TIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHL LAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC, en donde Xaa en la posición 29 es Q o está ausente (SEQ ID NO: 6) .

Leptina humana de longitud completa no procesada (es decir, incluye secuencia de señal N-terminal de 21 residuos) : MHWGTLCGFL LWPYLFYVQAVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDF IPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSSCHLPWASG LETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 7) Leptinas humanas maduras (con secuencia de señal de 21 aminoácidos N-terminal eliminada) : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHV LAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC, en donde Xaa en la posición 27 es T o A; y Xaa en la- posición 28 es Q o está ausente (SEQ ID NO: 8) .

Leptinas humanas maduras con metionina N- erminal : MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHV LAFS SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC, en donde Xaa en la posición 28 es T o A; y Xaa en la posición 29 es Q o está ausente (SEQ ID NO: 9) .

Leptina de Rhesus madura: VPIQKVQSDTKTLITIVTRINDISHTQSVSSQRVTGLDFIPGLHPVLTLSiQ DQTLAIYQQ ILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTEVV ALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 10) .

Leptina de Rhesus madura con metionina N-terminal : MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRFDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAIY QQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 11) .

Leptina de rata madura: VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSK DQTLAVY QQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEV VALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 12) . 1 i Leptina de rata madura con metionina N-terminal : MVPIHKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY QQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYST E VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 13) .

Leptina de ornitorrinco madura: La secuencia de leptina de ornitorrinco madura es la siguiente: ISIEKIQADTKTLTTI ITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQ QILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEV VTLDRLR SLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO : 14) .' [ Leptina de ornitorrinco de longitud completa no procesada (es decir, incluye secuencia de señal N- erminal de 21 residuos) : A continuación se muestra una secuencia de longitud completa de leptina de ornitorrinco, incluyendo una secuencia de señal N-terminal de 21 residuos: MRCILLYGFLCV QHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLD FIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLÁTLKNCPFTRS DGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO: 15) .

Leptina humana madura forma 1 : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 16) .

Leptina humana madura forma 2 : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAVY QQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 17) .

Leptina humana madura forma 3 : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ ' QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 18) .

Leptina humana madura forma 4 : VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSQKVTGLDFIPGLHPILTLSKD¾DQTLAVYQQ ILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVV ALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 19) .

Leptina humana madura forma 1 con metionina N-terminal (también conocida como metreleptina, o A100) : VPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL^KMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGViLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDML QLDLSPGC (SEQ ID NO:20).

Leptina humana madura forma 2 con metionina N-terminal : MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHAQSVSSQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID N0:21).

Leptina humana madura forma 3 con metionina N-terminal : MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:22).

Leptina humana madura forma 4 con metionina N-terminal : MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSiMDQTLAVYQ QILTSMPSRVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVV ALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC ( SEQ ID NO:23).

Leptina de foca: PIQRVQDDT TLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ QILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASASCPVPRARGSDTIGLGNVLRASVHSTEVVA LSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:24).

Leptina de foca con aminoácidos 71-92 reemplazados con aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreletina , respectivamente : PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEV VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 25) .

Leptina de foca con aminoácidos 30 y 71-92 reemplazados con aminoácidos 32 y 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVV ALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 26).

Leptina de foca con metionina N- erminal: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATY QQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:27).

Leptina de foca con metionina N-terminal, y con aminoácidos 71-92 reemplazados con aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTI ITRI DISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATY QQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:28).

Leptina de foca con metionina N-terminal, y con aminoácidos 30 y 71-92 reemplazados con aminoácidos 32 y 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTTLIKTI ITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEV VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:29).

Leptina A200: La leptina A200 es un producto de condensación de fragmento de anticuerpo Fe con leptina, como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Lo et al., 2005, Protein Eng. Design & Selection, 18: 1-10. La secuencia de aminoácidos de A200 es la siguiente: MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNiALPAPIETISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVPIQKVQDDTKTLITIVTR INDISHTQSVSSQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLEN LRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQD LWQLDLS PGC (SEQ ID NO:30) Leptina A300: La leptina A300 es metreleptina con sustituciones W101Q y 139Q (1Met N-terminal contada como residuo 1) : MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAVY QQILTSMPSRVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:31).

Leptina A400:. La leptina A400 es metreleptina con el residuo de serina en la posición 78 reemplazada con un residuo cisteina, como se muestra a continuación: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFI PGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 32); al cual se le ha fijado una porción de PEG de 20 kilodaltones (kDa) por medio del residuo de cisteina en la posición 78.

Leptina A500: La investigación por un número de investigadores incluyendo los inventores se ha enfocado en los efectos de la agregación' de una sustitución de residuo en leptina. Véase, por ejemplo, Ricci et al., 2006. " utational app'roach to improve physical stability of protein therapeutics susceptible to aggregation: Role of altered conformation in irreversible precipitation, " Book Chapter. En: MISBEHAVING PROTEINS: PROTEIN (MIS) FOLDING, AGGREGATION, AND STABILITY, Murphy RM, Tsai AM, Ediciones., Nueva York. Springer, págs. 331-350, que se incorpora en la presente por referencia y para todos los propósitos. En consecuencia, la leptina A500 con la siguiente secuencia ha sido usada en ciertos compuestos y métodos descritos aquí: VPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 33).

Variantes de leptina A100: Se muestran las variantes de leptina A100 con las siguientes sustituciones de residuo: D41E, H98S, W101Q, D109E, G113E, MI 371, W139Q y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 664) .

H98S, 101Q, A102T, G113E, M137I, W139Q, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC ( SEQ ID NO: 665) .

H98S, W101Q, G113E, M137I, W139Q, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 666) .

W101Q, G113E, M137I, W139Q, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 667) .

H98S, W101Q, M137I, W139Q, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRI DISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHP'ILTLjSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 668) .

W101Q, Gl 13E, 137I, W139Q, L143V, y G146E: MVPIQ VQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 669) .

H98S, W101Q, A102T, M137I, W139Q, y G146E: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 670) .

H98S, W101Q, D109E, Gl 13E, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC (SEQ ID NO: 671) .

W101Q, M137I, 139Q, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 672) .

W101Q, M137I, W139Q, L143V, y G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 673) .

H98S, W101Q, A102T, M137I, W139Q, L143V, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRI DISHTQSVSSKQKVTGLDFI PGLHPILTLSKMDQTLAVY i QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ'lD NO: 674).

H98S, W101Q, A102T, Gl 13E, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLÍSK DQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGEVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDML QLDLSPEC (SEQ ID NO: 675) . ; W101Q, G113E, y W139Q: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 676) .

W101Q, Gl 13E, W139Q, y G146E: MVPIQKVQDDTTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIGLHPILTLSKMDQTLAVYQ QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 677) .

Cúalquiera de las leptinas anteriores, análogos de leptina o sus fragmentos activos, asi como leptinas como las descritas abajo, son adecuadas para usarse en los presentes polipéptidos manipulados, con o sin un enlazador al ABD.

Péptidos de dominio de unión a albúmina (ABD) . Los péptidos de dominio de unión a albúmina (ABD) para usarse en la invención son aquellos con afinidad comparablemente alta para albúmina y se derivan de dominios de unión a albúmina de proteina G bacteriana de la cepa G148 de estreptococo. De esta manera, los péptidos ABD contemplados para los polipéptidos manipulados descritos en la presente incluyen aquellos que tienen los motivos de unión a albúmina como los descritos por Jonsson et al. (Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527) asi como los péptidos ABD descritos ahi, y aquellos motivos y péptidos ABD descritos además en la solicitud de PCT publicada No. WO2009/016043, asi como análogos de los mismos, particularmente aquellos que tienen al menos 85% de identidad de aminoácidos. En una modalidad el péptido ABD puede comprender un motivo de unión a albúmina ("ABM", por sus siglas en inglés) que consista en la secuencia de aminoácidos: GVSD X5YKX8X91 X X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 24 X25 1 (SEQ ID NO: 34) en donde, independientemente uno de otro, X5 se selecciona de Y y F; Xs se selecciona de N, R y S; Xg se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xii se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R, K y N; Xi4 se selecciona de K y R; X2o se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D.

En ciertas modalidades, X5 es Y: En ciertas modalidades, X8 es N. En ciertas modalidades, X23 es T. En ciertas modalidades, X23 es I. En ciertas modalidades, X2 es S. En ciertas modalidades, X2 es L. En ciertas modalidades, X25 es E. En ciertas modalidades, X25 es H. En ciertas modalidades, independientemente unos de otros, X5 es Y y/o XQ es N, y/o X23 es T o I, y/o X24 es S o L, y/o X25 es E. En ciertas modalidades, el motivo de unión a albúmina ("ABM") es GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO: 114). En ciertas modalidades, el motivo de unión a albúmina ("ABM") es GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO: 115).

De preferencia, el péptido ABD se une a albúmina con un valor K de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10~6 M, y todavía más preferiblemente cuando mucho 1 x 10"9 M (afinidad incluso más estrecha) . Más preferiblemente el valor K de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10"10 M, todavía más preferiblemente es de cuando mucho 1 x 10"11 M, aún más preferiblemente es de cuando mucho 1 x 10"12 M, e incluso además es de cuando mucho 1 x 10"13 M. Por ejemplo, un valor KD de 1 x 10~14 M es un valor K de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10"13 M. Los valores K pueden determinarse como se describe en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, de preferencia albúmina de suero humano. En una modalidad se contempla el género anterior, con la condición de que la secuencia de aminoácidos no sea GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 35) .

Como se demuestra aquí y en las referencias citadas, la capacidad de unión a albúmina del péptido ABD puede conservarse a pesar de los cambios de aminoácido siempre y cuando estos cambios conserven suficiente estructura terciaria del polipéptido ABD. Estos cambios incluyen, por ejemplo, una sustitución en donde un residuo de aminoácido que pertenece a cierto grupo funcional de residuos de aminoácido (por ejemplo, hidrófobos, hidrófilos, polares, etc.) es intercambiado por otro residuo de aminoácido del mismo grupo funcional. En consecuencia, en una modalidad de este tipo del polipéptido ABD, el motivo X5 es Y. En una modalidad del ABD Xe se selecciona de N y R, y puede ser en particular R. En una modalidad, X9 es L. En una modalidad, Xn se selecciona de N y S, y en particular puede ser N. En una modalidad, Xi2 se selecciona de R y K, tal como Xi2 siendo R o Xi2 siendo K. En una modalidad, Xi es K. en una modalidad, X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S y R, y puede ser en particular E. En una modalidad, X23 se selecciona de K e I, y puede ser en particular K. En una modalidad, X24 se selecciona de A, S, T, G, H y L. En una modalidad más especifica, X24 es L. En una modalidad incluso más especifica, "X23 X24" es KL. En otra modalidad aún más especifica, "X23 X24" es TL. En una modalidad, X24 se selecciona de A, S, T, G y H. En una modalidad más especifica, X24 se selecciona de A, S, T, G y H y X23 es I. En una modalidad, X25 es H.

Las secuencias de motivos de unión a albúmina individuales dentro de la fórmula anterior incluyen aquellas presentadas como SEQ ID NOS: 1-257 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, incorporada en la presente por referencia. En ciertas modalidades del polipéptido de unión a albúmina el motivo de unión a albúmina consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-257. En una modalidad más especifica de este aspecto de la invención, la secuencia de motivo se selecciona de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244 y SEQ ID. NO: 245 de la solicitud de PCT publicada NO. WO 2009/016043. En modalidades aún más especificas de este aspecto de la invención, la secuencia del motivo se selecciona de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 239 de la solicitud de PCT publicada NO. WO 2009/016043. Los polipéptidos de unión a albúmina que contienen ! motivos de i unión a albúmina, y aquellos adecuados para conjugación o fusión a un dominio de hormona como el descrito en la presente, se describen además en la presente y abajo y se ejemplifican en la tabla 1 y los ejemplos. Sin ser limitados por teoría se cree que el motivo de unión a albúmina puede formar parte de un dominio de proteína de grupo de tres hélices. Por ejemplo, el . motivo puede 1 constituir esencialmente o formar parte de dos hélices alfa - con un asa interconectora, dentro del dominio de proteína del grupo de tres hélices. En consecuencia, en modalidades particulares de la invención, este dominio de proteína de grupo de tres hélices se selecciona del grupo que consiste en dominios de tres hélices de proteína G de receptor bacteriano :de la cepa G148 de estreptococo. En diferentes variantes de esta modalidad, el dominio de proteína de grupo de tres hélices del cual el motivo forma parte se selecciona del grupo que consiste en dominio GA1, dominio GA2 y dominio GA3 de proteína G de la cepa G148 de estreptococo, en particular dominio GA3.

En modalidades de la presente invención en las que el motivo "forma parte" de un dominio de proteína de grupo de tres hélices", esto se entiende que significa que la secuencia del motivo de unión a albúmina es "insertada" en o "injertada" sobre o "fusionada" a la secuencia del dominio de grupo de tres hélices de origen natural (o de otra manera original) , de tal manera que el motivo reemplace un motivo estructural similar en el dominio original. Por ejemplo y sin desear ser limitados por teoría, se cree que 1 el motivo constituye dos de las tres hélices de un grupo de tres hélices, y puede reemplazar este motivo de dos hélices dentro de cualquier grupo de tres hélices. El reemplazo de dos hélices del dominio de grupo de tres hélices por las hélices de dos motivos descritas en la presente se lleva a cabo para no afectar de esta manera la estructura básica del polipéptido. Es decir, el doblez total del esqueleto del polipéptido de acuerdo con esta modalidad de la¡ invención será sustancialmente igual al del dominio de proteína de grupo de tres hélices del cual forma parte, por ejemplo, que tiene los mismos elementos de estructura secundaria en el mismo orden etc. Así, un motivo útil para los polipéptidos manipulados de la presente puede formar parte de un dominio de grupo de tres hélices si el polipéptido de acuerdo con esta modalidad tiene el mismo doblez que el dominio, original, implicando que las propiedades estructurales básicas son compartidas, aquellas propiedades por ejemplo resultando en espectros CD similares.

En consecuencia, en una modalidad el polipéptido de dominio de unión a albúmina es un dominio de proteína de grupo de tres hélices, el cual comprende el motivo de unión a albúmina como el definido arriba y secuencias adicionales que constituyen el resto de la configuración de tres hélices. A este polipéptido de dominio de unión a albúmina se le puede fusionar una leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina o un derivado de leptina del mismo para crear los polipéptidos manipulados como los descritos en la presente. Un polipéptido de dominio de unión a albúmina adecuado para su conjugación o fusión a una leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina o un derivado de leptina del mismo puede comprender la secuencia de aminoácidos : LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY- [ABM] -LAALP (SEQ ID NO: 36) en donde [ABM] es un motivo de unión a albúmina como el definido arriba, y, Independientemente unos de otros, Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L e I; Xd se selecciona de R y K; y Xe se selecciona de D y K.

En . ciertas modalidades, Xa es E. En ciertas modalidades, Xb es D. En ciertas modalidades, Xc es I. En ciertas modalidades, Xd es K. En ciertas modalidades, Xa es independientemente E y/o independientemente Xb es D y/o independientemente Xc es I, y/o independientemente Xd es K. En ciertas modalidades, la leucina en la posición 45 está presente o ausente. En ciertas modalidades, la prolina en la posición 46 está ausente. En ciertas modalidades, el polipéptido de dominio de unión a albúmina es LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50) .

En ciertas modalidades, el polipéptido de dominio de unión a albúmina es LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO: 51) .

En una modalidad más, el ABD comprende uno o más aminoácidos de tapa de hélice N-terminal, y en una modalidad más el aminoácido de tapa de hélice puede ser serina, o puede ser glicina-serina . En consecuencia para cada secuencia de dominio de unión a albúmina descrita en la presente, incluyendo aquellas en las figuras y listado de secuencias, también contemplada específicamente para todos los aspectos como los descritos en la presente del polipéptido manipulado, son dominios de unión a albúmina, sus secuencias Ser-ABD, Gly-Ser-ABD, Gly-ABD, Ala-ABD y sus secuencias de prolina des-C-terminal .

Debido a la presencia de un motivo de unión a albúmina, el polipéptido ABD se une a albúmina con un valor K de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10"6 M y todavía más preferiblemente cuando mucho 1 x 10"9 M (afinidad todavía más estrecha) . Muy preferiblemente el valor K de la interacción que es de cuando mucho 1 x 10~10 M, todavía más preferiblemente es de cuando mucho 1 x 10"11 M, aún más preferiblemente es de cuando mucho 1 x 10~12 M, y todavía más es de cuando mucho 1 x 10"13 M.

En una modalidad de este polipéptido de unión a albúmina, Xa es V. En una modalidad de este polipéptido Xb es L. En una modalidad de este polipéptido Xc es N. En una modalidad de este polipéptido Xd es R. En una modalidad de este polipéptido Xe es D.

Las secuencias de los polipéptidos de dominio de unión a albúmina individuales adecuados para su fusión con los péptidos de dominio de hormona activos como los descritos en la presente se presentan en Jonsson et al. (Id.) y como SEQ ID NOS: 258-514 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, incorporada en la presente por referencia. Los compuestos seleccionados se describen en la siguiente tabla 1. La presente invención también abarca un polipéptido de unión a albúmina que tiene una secuencia de aminoácidos con 85% o mayor identidad con una secuencia seleccionada de SEQ ID NOS: 258-514. En modalidades particulares, la secuencia del polipéptido de unión a albúmina se selecciona de SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501 y SEQ ID NO: 502 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, y secuencias que tienen 85% o mayor identidad con las mismas. En modalidades adicionales, la secuencia del polipéptido de unión a albúmina se selecciona de SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO:' 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 y SEQ ID NO: 490 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, y secuencias que tienen 85% o mayor identidad con la misma. En modalidades todavía adicionales, la secuencia del polipéptido de unión a albúmina se selecciona de" SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 496 y SEQ ID NO: 511 en la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043 y secuencias que tienen 85% o mayor identidad con las mismas.

En una modalidad, el polipéptido de unión a albúmina comprende además uno o más residuos de aminoácido adicionales colocados en el N-terminal y/o C de la secuencia definida en SEQ ID NO: 36. Estos residuos de aminoácido adicionales pueden jugar un papel en incrementar la unión de albúmina por el polipéptido, y mejorar la estabilidad conformacional del dominio de unión a albúmina doblado, pero igualmente pueden servir también para otros propósitos, relacionados por ejemplo con uno o más de producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento, marcado o detección del polipéptido, asi como cualquier combinación de los mismos. Estos residuos de aminoácido adicionales pueden comprender uno o más residuos de aminoácido añadidos para efectos de acoplamiento químico, por ejemplo, a un HD1.

Los aminoácidos que preceden o siguen directamente la hélice alfa en la N-terminal o C-terminalde la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 36 pueden entonces en una modalidad afectar la estabilidad conformacional . Un ejemplo de un residuo de aminoácido que puede contribuir a estabilidad conformacional mejorada es un residuo de serina colocado en el N-terminal de SEQ ID NO: 36 como se definió arriba. El residuo de serina N-terminal puede en algunos casos formar una caja de tapado S-X-X-E canónica, al implicar unión a hidrógeno entre el oxígeno gama de la cadena lateral de serina y el esqueleto de polipéptido NH del residuo de ácido glutámico. Este tapado N-terminal puede contribuir a la estabilización de la primera hélice alfa del dominio de tres hélices que constituye el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Así, en una modalidad, los aminoácidos adicionales comprenden por lo menos un residuo de serina en el N-terminal del polipéptido. La secuencia de aminoácidos es en otras palabras precedida por uno o más residuos de serina. En otra modalidad del polipéptido de unión a albúmina, los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de glicina en el N-terminal del polipéptido. Se entiende que la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 puede ser precedida por uno, dos, tres, cuatro o cualquier número adecuado de residuos de aminoácido. Así, la secuencia de aminoácidos puede ser precedida por un solo residuo de serina, un solo residuo de glicina o una combinación de los dos, tal . como una combinación glicina-serina (GS) o una combinación glicina-serina-serina (GSS) . En otra modalidad más, los residuos de aminoácido adicionales comprenden un ácido glutámico en el N-terminal del polipéptido como el definido por la secuencia de SEQ ID NO: 36.

Ejemplos de especies ABD incluyen, pero no están limitados a, los compuestos mostrados en la siguiente tabla 1 y los ejemplos. Véase también la solicitud de PCT publicada No. WO 2009/016043, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Un péptido ABD útil en los compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas descritas en la presente puede ser un fragmento o análogo de un péptido -ABD descrito en la presente o conocido en la técnica siempre y cuando contenga un motivo de unión a albúmina y se una a albúmina con la afinidad descrita en la presente.

Tabla 1 Péptidos ABD seleccionados Unión a albúmina. La albúmina sérica es la proteina más abundante en sueros de mamífero (40 g/L; aproximadamente 0.7 mM en humanos) en donde se une a una variedad de moléculas que incluyen pero no están limitadas a lípidos y bilirrubina (Peters T, 1985, Advances in Protein Chemistry 37: 161). Se ha observado que la vida media de albúmina sérica es directamente proporcional al tamaño del animal, en donde por ejemplo la albúmina sérica humana (HSA) tiene una vida media de 19 días y la albúmina sérica de conejo tiene una vida media de aproximadamente 5 días (McCurdy TR et al., J. Lab. Clin. Med. 143: 115, 2004). La albúmina sérica humana está distribuida ampliamente a lo largo del cuerpo, en particular en los compartimientos intestinales y , hemáticos, en donde está principalmente implicada en el mantenimiento de osmolaridad. Estructuralmente , las albúminas son proteínas de cadena lateral que comprenden tres dominios homólogos y totalizan 584 ó 585 aminoácidos (Dugaiczyk L et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sci, E.U.A. 79:71). Las albúminas contienen 17 puentes de disulfuro y un solo tiol reactivo, C34, pero carecen de porciones de carbohidrato N-enlazadas u 0-enlazadas (Peters, 1985, Id.; Nicholson JP et al., 2000, Br J Anaesth 85:599). La falta de glicosilación simplifica la expresión recombinante de albúmina. Esta propiedad de la albúmina, junto con el hecho de que su estructura tridimensional se conoce (véase, por ejemplo, He XM & Cárter DC, 1992, Nature 358:209), la ha hecho un candidato atractivo para usarse en proteínas de fusión recombinante . Estas proteínas de fusión combinan generalmente una proteína terapéutica (la cual podría ser rápidamente depurada del cuerpo después de la administración de la propia proteína) y una proteína de plasma (la cual exhibe una depuración lenta natural) en una sola cadena de polipéptidos . Véase, por ejemplo, Sheffield WP, 2001, Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol . Disord. 1:1). Estas proteínas pueden proporcionar beneficios clínicos al requerir una inyección menos frecuente y niveles más altos de proteína terapéutica ir¡( vivo. Sin embargo, los polipéptidos manipulados de la presente no son conjugados a albúmina, sino que en su lugar contienen motivos que permiten unión no covalente a albúmina.

Modalidades adicionales. Se entiende que cada uno de los polipéptidos descritos en la presente también se contempla que incluyen (opcionalmente) una metionina en el N-terminal en cuadro con el primer aminoácido de origen natural del mismo. Por ejemplo, metreleptina (leptina A100) consiste en leptina humana madura a la cual se ha añadido una metionina N-terminal, como se describe en SEQ ID NO: 20. En forma similar, un residuo de metionina puede ser incluido en el N-terminal de cualquiera de las secuencias de aminoácidos y fórmulas descritas en la presente a lo largo. Se entiende además que cuando una Gly C-terminal aparece en una secuencia de polipéptidos manipulada mostrada en la presente, el residuo puede perderse durante amidación subsecuente.

En algunas modalidades, una leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina o un derivado de leptina puede tener al menos 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, identidad de secuencia con relación a una leptina progenitora. En algunas modalidades, la leptina progenitora es una leptina mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146. En consecuencia, en algunas modalidades, una leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina o un derivado de leptina puede tener al menos 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, identidad de secuencia con relación a cualquier leptina seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. En algunas modalidades, una leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina, o un derivado de leptina puede tener al menos 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en 50%, por ejemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o' SEQ ID NO: 29. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 90% identidad de secuencia con relación a' la leptina mostrada en SEQ ID NO: 20. En algunas modalidades,1 un análogo de leptina puede tener al menos 50% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO:¡ 1, SEQ ID NO: 2, ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 146. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 90% de identidad de secuencia con 'relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, o SEQ ID NO: 146. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 50% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 90% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15. En algunas modalidades , un análogo de leptina puede tener al menos 50% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 32. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 90% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 33. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 50% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 90% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 50% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13. En algunas modalidades, un análogo de leptina puede tener al menos 90% de identidad de secuencia con relación a la leptina mostrada en SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13. Además, las leptinas pueden ser diseñadas, preparadas y usadas de acuerdo con la invención en la cual 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,^9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso 21 aminoácidos de una leptina seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; es/son sustituidas con otro aminoácido, tal como un aminoácido conservador o un aminoácido no conservador, o es/son alteradas de otra manera. Como es común en la técnica, el término "conservador" en el contexto de sustituciones de aminoácido se refiere a sustitución que mantiene propiedades tipo carga (por ejemplo, aniónicas, catiónicas, neutras, polares y similares), hidrofobicidad o hidrofilicidad, global (por ejemplo, contactos de van der Waals y similares) , y/o funcionalidad (por ejemplo, hidroxi, amina, sulfhidrilo y similares) . El término "no conservadora" se refiere a una sustitución de aminoácido que no es conservadora.

Además, como se entiende, en la técnica, por ejemplo, las leptinas de murino, leptinas de rata, leptinas de bovino, leptinas de porcino y leptinas de mono Rhesus, tales como aquellas descritas en la presnte, son cada una sustancialmente homologas a leptinas humanas; en particular, las formas maduras de estas leptinas son sustancialmente homologas a leptinas maduras, y además, particularmente cerca de la porción N-terminal de la proteina. Se pueden preparar análogos de estas leptinas, tales como la leptina humana madura forma 1 (SEQ ID NO: 16) y metreleptina (SEQ ID NO: 20), tal como al sustituir o de otra manera alterar residuos de aminoácido en una o más posiciones en estas secuencias en donde se observe divergencia con una leptina de ratón, rata, bovino, porcino o mono Rhesus madura correspondiente. Por ejemplo, las leptinas humanas maduras (por ejemplo, SEQ ID NO: 20) provocan respuestas biológicas en, por ejemplo, ratones, rata y mono) . Véase, por ejemplo, WO 98/28427, WO 2009/064298, US2007/002028 , US2008/0207512 y Murakami et al., 1995, Biochem. Biophys . Res. Comm. 209: 944-952. Debido a que las leptinas humanas maduras tienen actividad biológica en, por ejemplo, estas especies, las leptinas pueden ser diseñadas y preparadas en las cuales uno o más aminoácidos en las posiciones que sean divergentes en las posiciones correspondientes en una leptina de una o más de estas especies sean sustituidos con los aminoácidos en estas posiciones divergentes correspondientes.

Por ejemplo, usando una proteina leptina madura humana de acuerdo con SEQ ID NO: 16 en la que el primer aminoácido es válida y el aminoácido en la posición 146 es cisteina, se puede sustituir con otro aminoácido en uno o más de los aminoácidos en las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 con los aminoácidos correspondientes encontrados en las posiciones correspondientes en SEQ ID NO: 143) para de esta manera diseñar, preparar y usar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención. Además, • también se puede sustituir otro aminoácido, tal como un aminoácido conservador o un aminoácido no conservador, en una o más de las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 de, por ejemplo, SEQ ID NO: 16 para de esta forma diseñar, preparar y usar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención.

Además se pueden preparar leptinas adicionales con base en la secuencia de proteína leptina de rata madura (SEQ ID NO: 12). Véase, por ejemplo, WO 98/28427, US2007/0020284 , y Murakami et al., 1995, Id., incorporada en la presente por referencia en sus totalidades y para todos los propósitos. La leptina de rata madura difiere de la leptina humana madura forma 1 (SEQ ID ÑO: 16) en las siguientes posiciones: 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 y 145. En consecuencia, en una o más de estas posiciones en SEQ ID NO: 16, se puede sustituir el aminoácido encontrado en las posiciones correspondientes encontradas en leptina de rata madura (SEQ ID NO: 12) para de esta forma diseñar, preparar y usar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención. Además, también se puede sustituir otro aminoácido, tal como un ' aminoácido conservador o un aminoácido no conservador, en una o más de las posiciones 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 y 145 de, por ejemplo, SEQ ID NO: 16, para de esta forma diseñar, preparar y usar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención.

Las posiciones tanto de leptina de rata madura (SEQ ID NO: 12) como de leptina de murino madura forma 1 (SEQ ID NO: 143) que divergen de la leptina humana madura forma 1 (SEQ ID NO: 16) son: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. En consecuencia, en una o más de estas posiciones en SEQ ID NO: 16, se puede sustituir el aminoácido encontrado en las posiciones correspondientes encontradas en la secuencia de leptina de rata madura (SEQ ID ??:· 12) o secuencia de leptina murina madura forma 1 (SEQ ID NO: 143) para de esta manera diseñar, preparar y usar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención. Además, también se puede sustituir- otro aminoácido, tal como un aminoácido conservador o un aminoácido no conservador, en una o más de las posiciones 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 para de esta manera diseñar, preparar y usar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención.

Además, los aminoácidos encontrados en la leptina madura de mono rhesus (SEQ ID NO: 10) que divergen de la leptina humana madura forma 1 (SEQ ID NO: 16) son (con los residuos de aminoácido indicados entre paréntesis en abreviatura de aminoácido de una letra) : 8 (S) , 35 (R) , 48(V), 53(Q), 60(1), 66(1), 67 (N) , 68 (L) , 89 (L) , 100 (L) , 108(E), 112(D) y 118 (L) . Ya que las leptinas maduras humanas provocan respuestas biológicas en monos, una leptina, tal como leptina humana madura forma 1 (SEQ ID NO: 161) que tenga uno o más de los aminoácidos divergentes de mono rhesus reemplazado con otro aminoácido, tal como los aminoácidos entre paréntesis, puede emplearse para diseñar, preparar y usar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención. Se debe notar que ciertos aminoácidos divergentes ' de rhesus también son aquellos encontrados en, por ejemplo, ¡ la leptina de murino madura forma 1 anterior (posiciones 35, 68, 89, 100 y 112) . Asi, se pueden preparar leptinas en las cuales uno o más aminoácidos en las posiciones 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97/ 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 ! y 145 de, por ejemplo, leptina humana madura forma 1 (SEQ ID NO: 16) sean reemplazados por los aminoácidos correspondientes en tales posiciones en leptinas de murino o mono rhesus (por ejemplo, SEQ ID NO: 143 y/o SEQ ID NO: 10) .

Otras leptinas. pueden prepararse al suprimir una parte de una secuencia de aminoácidos de leptina, 1 siempre y cuando esta secuencia de aminoácidos de leptina pueda provocar una respuesta biológica. Estas secuencias de aminoácidos de leptina son fragmentos activos de leptina. Por ejemplo, leptinas de murino maduras, leptinas de mono rhesus maduras, leptinas humanas maduras, y leptina;s de rata maduras, y otras leptinas carecen todas de la secuencia de señal de 21 aminoácidos N-terminal que está presente en las formas de longitud completa y no procesadas de esa leptina.

Se pueden preparar los siguientes fragmentos de leptina activos de estas leptinas maduras: (a) aminoácidos 98-146 (b) aminoácidos 1-32 (c) aminoácidos 40-116 (d) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146 (e) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146 que tiene uno o más de los aminoácidos 100-111 puestos entre los aminoácidos 99 y 112.

Además, estos fragmentos de leptina activos también pueden prepararse en los cuales uno o más de los aminoácidos en las posiciones en, por ejemplo, leptina humana madura forma 1 que sean sustituidos con los aminoácidos encontrados en las posiciones correspondientes encontradas' en, por ejemplo, leptinas maduras de rata, murino, mono, porcino y/o bovino como se describió arriba. Más aún, cualesquiera sustituciones o alteraciones pueden estar en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos.

Además, la presente invención abarca polipéptidos manipulados que comprenden una leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina o un derivado de leptina como el descrito arriba, en donde la leptina, análogo de leptina, fragmento activo de leptina o derivado de leptina se selecciona de: (a) la secuencia de aminoácidos 1-146 de una leptina seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 144, en la cual un aminoácido diferente es sustituido en una o más de las siguientes posiciones y conservan la misma numeración (incluso en ausencia de un residuo de glutaminilo en la posición 28) : 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145;. (b) la secuencia de aminoácidos de la subparte (a) en la cual el residuo de glutaminilo en la posición 28 está ausente; (c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) en las cuales un residuo de metionilo se añade en el N-terminal; (d) una leptina que consiste en un fragmento de la secuencia de aminoácidos de (a) , (b) o (c) selecciona del grupo que consiste en: (i) aminoácidos 98-146 (ii) aminoácidos 1-32 (iii) aminoácidos 40-116 (iv) aminoácidos 1-99 y 112-146 (v) aminoácidos 1-99 y 112-146 en los cuales uno o más de los aminoácidos 100-111 se pone entre los aminoácidos 99 y 112; y (vi) la secuencia de aminoácidos de la subparte (i) en la que uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 es sustituido con otro aminoácido; (vii) la secuencia de aminoácidos de la subparte (ii) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 8 y 32 es sustituido con otro aminoácido; (viii) la secuencia de aminoácidos de la subparte (iii) en donde uno o más de los aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 es reemplazado con otro aminoácido; (ix) la secuencia de aminoácidos de la subparte (iv) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 es reemplazado con otro aminoácido; y (x) la secuencia de aminoácidos de la subparte (v) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 es reemplazado con otro aminoácido; (xi) la leptina de cualquiera de las subpartes (i)-(x) en donde una metiónina ha sido añadida en el N-terminal; y (e) la leptina de cualquiera de las subpartes (a) a (e) , a la cual se le une una porción química; (f) la leptina de la subparte (g) donde la porción química es una porción de polímero soluble en agua; (g) una leptina de la subparte (f) en donde la porción de polímero soluble en agua es polietilenglicol ; (h) una leptina de la subparte (f) en donde la porción de polímero soluble en agua es una porción de poliaminoácido; y (i) una leptina de cualquiera de las subpartes (e) a (h) en donde la porción es unida únicamente en el N-terminal de la porción de proteína.

Con respecto a lo anterior, las leptinas en las cuales se une una porción química son derivados de leptina. La derivación de leptinas mediante la fijación de una o más porciones químicas se ha encontrado que proporciona cierta ventaja bajo ciertas circunstancias, tales como incrementar la estabilidad y tiempo de circulación de la proteína terapéutica y reducir la inmunogenicidad y propensidad a, por ejemplo, generación de anticuerpos neutralizantes y/o incidencia de reacciones en sitio de inyección.' Véase, por ejemplo, O 98/28427, US2007/0020284, patente de E.U.A. No. 4,179,337, Davis et al., expedida el 18 de diciembre de 1979. Para una revisión, véase Abuchowski et al., en ENZYMES AS DRUGS. (J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds . pp. 367-383 (1981)); Francis et al., Id. En consecuencia, cuando se emplea una leptina derivada y un ABM o un ABD, se puede generar adecuadamente polipéptidos manipulados de la invención que posean ventajas provistas por ambas entidades.

Los derivados de leptina pueden constituir leptinas a las cuales se haya hecho una modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácido, átomos de carbono a, grupo amino terminal o grupo ácido carboxílico terminal. Una modificación química incluye, pero no está limitada a, fijar una o más porciones químicas, crear nuevos enlaces y remover una o más porciones químicas. Las modificaciones en grupos laterales de aminoácidos incluyen, sin limitación, alquilación, acilación, formación de éster, formación de amida, acoplamiento de maleimida, acilación de grupos e-amino de lisina, N-alquilación de arginina, histidina o lisina, alquilación de grupos de ácido carboxílico glutámico o aspártico, y desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del amino terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones desamino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo. Las modificaciones de la terminal amino incluyen, sin limitación, las modificaciones desamino, N-alquilo inferior, N-dialquilo inferior y N-acilo, tales como alquiladlos, alquiladlos ramificados, alquilaril-acilos . Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de amida, alquilamida inferior, dialquilamida, arilamida, alquilarilamida y éster alquilico inferior. El alquilo inferior es alquilo de C1-C4. Además, uno o más grupos laterales, o grupos terminales, pueden ser protegidos por grupos protectores conocidos por el químico sintético de capacidad ordinaria. El carbono a de un aminoácido puede ser mono- o dimetilado.

Estos derivados incluyen leptinas conjugadas a una o más moléculas de polímero soluble en agua, tales como polietilenglicol ("PEG") o cadenas de ácido graso de varias longitudes (por ejemplo, estearilo, . palmitoilo, octanoilo) , mediante la adición de poliaminoácidos , tales como poli-his, poli-arg, poli-lys y poli-ala, o mediante la adición de sustituyentes de molécula pequeña que incluyen alquilos cortos y alquilos restringidos (por ejemplo, ramificados, cíclicos, fusionados, adamantilo) , y grupos aromáticos. En algunas modalidades, . las moléculas de polímero soluble en agua tendrán un peso molecular que varíe de aproximadamente 500 Daltones a alrededor de 60,000 Daltones.

Estas conjugaciones de polímero pueden presentarse de manera individual en el N-terminal o C-terminál o en las cadenas laterales de residuos de aminoácido dentro de la secuencia de una leptina como la descrita en la presente. Como alternativa, puede haber varios sitios de derivación a lo largo de la secuencia de aminoácidos de esta leptina. La sustitución de uno o más aminoácidos con lisina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína puede proporcionar sitios de derivación adicionales. Véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 5,824,784 y 5,824,778. En algunas modalidades, una leptina puede ser conjugada a una, dos o tres moléculas de polímero.

En algunas modalidades, las moléculas de polímero solubles en agua son enlazadas a un grupo amino, carboxilo o tiol, y pueden ser enlazadas por extremos N o C, o en las cadenas laterales de lisina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína. Como alternativa, las moléculas de polímero solubles en agua pueden ser enlazadas con grupos diamina y dicarboxílicos . En algunas modalidades, una leptina conjugada a una, dos o tres moléculas de PEG a través de un grupo amino épsilon en un aminoácido de lisina.

Los derivados de leptina también incluyen leptinas con alteraciones químicas en uno o más residuos de aminoácido. Estas alteraciones químicas incluyen amidación, glucosilación, acilación, sulfatación, fosforilación, acetilación y ciclización. Las alteraciones químicas pueden presentarse individualmente en el N-terminal o C-terminal o en las cadenas laterales de residuos de aminoácido dentro de la secuencia de una leptina. En una modalidad, la C-terminal de estos péptidos puede tener un grupo -OH o -NH2 libre. En otra modalidad, el N-terminal puede ser tapado con un grupo isobutiloxicarbonilo, un grupo isopropiloxicarbonilo, un grupo n-butiloxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, un grupo isocaproilo ("isocap"), un grupo octanilo, un grupo octil glicina (indicado como G(Oct)" o "octilGly") , un grupo 8-aminooctanoico, un dansilo y/o un grupo Fmoc. En algunas modalidades, la ciclización se puede hacer a través de la formación de puentes de disulfuro. Como alternativa, puede haber varios sitios de alteración química a lo largo de la' secuencia de aminoácidos de leptina.

En ciertas modalidades, las leptinas son químicamente alteradas para incluir un grupo de Bolton-Hunter. Los reactivos de Bolton-Hunter se conocen en la técnica ("Radioimmunoassay and related methods", A. E. Bolton and W. M. Hunter, capítulo 26 de HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, volumen I, IMMUNOCHE ISTRY, editado por D. M. Weir, Blackwell Scientific Publications , 1986), y se puede usar para introducir porciones tipo tirosina con un enlace natural, a través de grupos a-amino amino-terminales o grupos e-amino de lisina.. En algunas modalidades, el N-terminal de una leptina es modificado con un grupo de Bolton-Hunter. En algunas modalidades, un residuo de lisina interno se modifica con un grupo de Bolton-Hunter. En algunas modalidades, puede haber varios sitios de modificación de Bolton-Hunter a lo largo de la secuencia de aminoácidos de leptina. Los reactivos de Bolton-Hunter usados para modificación de polipéptidos están disponibles comercialmente, y pueden incluir, pero no están limitados a, reactivo de Bolton-Hunter hidrosoluble, sulfosuccinimidil-3- [4-hidrofenil] propionato (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) y reactivo de Bolton-Hunter-2 , 3- (4-hidroxi-3-yodofenil) propionato de N-succinimidilo (Wako Puré Chemical Industries, Ltd., Japón, # de catálogo 199-09341) . Un grupo- de Bolton-Hunter ejemplar conjugado a través de un enlace de amida a una leptina se ilustra a continuación, en donde la linea punteada pasa a través del enlace de amida: Las leptinas pueden ser yodadas (tales como marcadas radioactivamente con 125I) antes o después de la modificación de Bolton-Hunter.

Para preparar polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención, un derivado de leptina para usarse en la preparación de ellos puede incluir una o más modificaciones de un residuo de aminoácido "no esencial". En el contexto de la invención, un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado, por ejemplo, derivado, sin detener o reducir sustancialmente la actividad (por ejemplo, la actividad agonista) de la leptina. Los polipéptidos manipulados de la invención pueden incluir derivaciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos de aminoácido de la porción de leptina; de éstos, uno o más residuos de aminoácido pueden ser residuos de aminoácido no esenciales. Además, los polipéptidos de la invención pueden ser derivados de tal manera que incluyan adiciones de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos de la porción de leptina sin detener o reducir sustancialmente la actividad del polipéptido. Además, estos residuos de aminoácido no esenciales pueden ser sustituidos con un residuo de aminoácido que sea propenso a derivación como se describe aquí a lo largo.

Según se usa en la presente, "aminoácido", "residuo de aminoácido" y similares se refieren a aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y aminoácidos modificados. A menos que se indique lo contrario, cualquier referencia a un aminoácido, generalmente o específicamente por nombre, incluye referencia a los estereoisómeros tanto D como L si su estructura permite estas formas estereoisoméricas . Los aminoácidos naturales incluyen (Ala), arginina (Arg) , asparagina (Asn) , ácido aspártico (Asp) , cisteina (Cys), glutamina (Gln) , ácido glutámico (Glu) , glicina (Gly) , histidina (His), isoleucina (lie), leucina (Leu), lisina (Lys) , metionina (Met), fenilalanina (Phe), "prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr) , triptófano (Trp) , tirosina (Tyr) y valina (Val). Los aminoácidos no naturales incluyen, pero no están limitados a, homolisina, homoarginina, homoserina, ácido azetidincarboxilico, ácido 2- aminoadipico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina , ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutirico, ácido 4- aminobutirico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2- aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutirico, ácido 3- aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciaria, ácido 2 , -diaminoisobutirico, desmosina, ácido 2 , 2 ' -diaminopimélico, ácido 2 , 3-diaminopropiónico, N- etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina , alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina , naftalanina, norvalina, morleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico y tioprolina. Los aminoácidos no naturales adicionales incluyen residuos de aminoácido modificados que son bloqueados químicamente, de manera reversible o irreversible, o modificados químicamente en su grupo amino N-terminal o sus grupos de cadena lateral, tales como por ejemplo, D y L aminoácidos N-metilados o residuos en los que los grupos funcionales de la cadena lateral son 'modificados químicamente a otro grupo funcional. Por ejemplo, los aminoácidos modificados incluyen sulfóxido de metionina; sulfona de metionina; ácido aspártico- (éster beta-metílico), un aminoácido modificado de ácido aspártico; N-etilglicina, un aminoácido modificado de glicina; o alanina carboxamida, un aminoácido modificado de alanina. Los residuos adicionales que pueden ser incorporados se describen en Sandbérg et al., J. Med. Chem. 41:2481-91, 1998.

Como se mencionó arriba, las porciones químicas adecuadas para esta derivación de leptinas y otros polipéptidos incluyen, por ejemplo, varios ' polímeros hidrosolubles . De preferencia, para uso terapéutico de la preparación producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado con base en consideraciones tales como si el conjugado o polímero/proteína se usará terapéuticamente, y si es así, la dosis, tiempo de circulación, resistencia a proteólisis deseadas y otras consideraciones. Para los polipéptidos y leptinas manipulados, la efectividad de la derivación puede evaluarse al administrar la leptina derivada o el pólipéptido manipulado derivado, en forma deseada (es decir, mediante bomba osmótica, o, muy preferiblemente, mediante inyección o infusión, o, formulada además para suministro oral, pulmonar o nasal,- por ejemplo), y observando efectos biológicos y respuestas biológicas como se describe en la presente.

Este polímero soluble en agua puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propalenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1 , 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido ', maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas de fabricación gracias a su estabilidad en agua.1 Asimismo, succinato y estireno también pueden ser usados.

Los derivados de leptina usados en el ' diseño y preparación de los polipéptidos manipulados de acuerdo con la invención pueden prepararse al unir poliaminoácidos o aminoácidos de punto de ramificación a la porción de leptina. Por ejemplo, el poliaminoácido puede ser una proteína portadora adicional, tal como una porción Fe,' que puede servir también para incrementar la vida media en circulación de la leptina o el polipéptido manipulado, además de las ventajas logradas mediante la fijación de un ABM o un ABD. Además, estos poliaminoácidos pueden seleccionarse del grupo que consiste en albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano) , un anticuerpo adicional o porción del mismo (por ejemplo, la región Fe), u otros poliaminoácidos, por ejemplo, polilisinas. Como se ubica abajo, la ubicación de la fijación del poliaminoácido puede ser en el N-terminal de la porción de leptina, o extremo C-terminal, u otros lugares entre ellos, y también puede conectarse mediante una porción "enlazadora" química a la leptina, tal como un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico.

El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Para polietilenglicol, el peso molecular que se prefiere es de entre aproximadamente 2 kilodaltones (kDa) y alrededor de 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilidad de manejo y fabricación. En ciertas modalidades, el polietilenglicol mide entre aproximadamente 2 kDa y alrededor de 60 kDa. En ciertas modalidades, el polietilenglicol mide entre aproximadamente 2 kDa y alrededor de 40 kDa. En ciertas modalidades, el polietilenglicol mide entre aproximadamente 5 kDa y alrededor de 40 kDa. En ciertas modalidades, el polietilenglicol mide entre aproximadamente 10 kDa y alrededor de 40 kDa. En ciertas modalidades, el polietilenglicol mide entre aproximadamente 5 kDa y alrededor de 30 kDa. En ciertas modalidades, el polietilenglicol mide entre aproximadamente 5 kDa y alrededor de 20 kDa. En ciertas modalidades, el polietilenglicol mide entre aproximadamente 10 kDa y alrededor de 20 kDa. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de liberación prolongada deseada, características de solubilidad, los efectos, si los hay, en la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol unido a una leptina y/o a un polipéptido manipulado de la invención) . Consideraciones adicionales que pueden influenciar la selección de un PEG de un peso molecular particular que puede ser fijado a una leptina para generar un derivado de leptina de acuerdo con la invención, incluyen el grado al cual este PEG de peso molecular puede: Mitigar la agregación y/o incrementar la solubilidad de la leptina y/o el polipéptido manipulado, cuando esté presente en una composición o formulación farmacéuticamente aceptable, o cuando sea expuesto a fluidos o tejidos fisiológicos después de su administración a un sujeto (tal como mediante inyección) ; mitigar la incidencia de reacciones en sitio de inyección causadas por la administración de la leptina o el polipéptido manipulado después de su administración a un sujeto por inyección; mitigar la generación de anticuerpos neutralizantes que puedan ser desarrollados contra la leptina o el polipéptido manipulado como resultado de la administración de esta leptina o un polipéptido manipulado a un sujeto; y similares.

El número de moléculas de polímero fijadas de esta manera puede variar, y un experto en la técnica será capaz de evaluar el efecto resultante en la función. Se puede mono-derivar, o se puede proporcionar una derivación di, tri o tetra o alguna otra combinación, con la misma o diferentes porciones químicas (por ejemplo, polímeros, tales como diferentes pesos de polietilenglicoles) . La proporción de moléculas de polímero a moléculas de leptina o moléculas de polipéptido manipulado que serán derivadas variará, al igual que sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima, en términos de eficiencia de reacción ya que no hay exceso de leptina no reaccionada (o polipéptido manipulado, según sea el caso) o polímero, se determinará por factores tales como el grado de derivación deseado (por ejemplo, mono, di, tri, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado, si el polímero es ramificado o no ramificado, y las condiciones de reacción.

Las porciones químicas deben ser fijadas a la leptina y/o el polipéptido manipulado tomando en cuenta los efectos en los dominios funcionales antigénicos de la leptina y/o el polipéptido manipulado. Existe un número de métodos de fijación disponibles para aquellos expertos en la técnica. Por. ejemplo, EP 0 401 384 incorporado en la presente por referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF) , véase también Malik et al., 1992, Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (que reporta la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo) . Por ejemplo, polietilenglicol puede ser unido covalentemente a través de residuos de aminoácido por medio de un grupo reactivo, tal como, un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los cuales se le puede unir una molécula de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoácido que tiene un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y el residuo de aminoácido N-terminal. Aquellos que tengan un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido C-terminal. Grupos sulfhidrilo también pueden ser usados como un grupo reactivo para fijar las moléculas de polietilenglicol. Para propósitos terapéuticos se prefiere la fijación en un grupo amino, tal como fijación en el N-terminal o grupo lisina. La fijación de residuos importantes para la unión al receptor debe evitarse, si la unión a receptor se desea.

Puede desearse específicamente diseñar y preparar una leptina modificada químicamente en el N-terminal para usarse en la preparación de polipéptidos manipulados de la invención. Usando polieitilenglicol como una ilustración de las presentes composiciones, se puede seleccionar a partir de una variedad de moléculas de polietilenglicol (mediante peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilenglicol a- leptina o moléculas de polipéptido manipulado, según sea el caso, en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se llevará a cabo y el método para obtener la proteína pegilada N-terminalmente (es decir, separar esta porción de otras porciones monopegiladas si es necesario) puede ser mediante purificación del material pegilado N-terminalmente a partir de una población de moléculas de proteína pegiladas. La modificación química N-terminal selectiva puede lograrse mediante alquilación reductiva que explote la actividad diferencial de diferentes tipos de' grupos amino primarios (lisina contra el N-terminal) disponibles para derivación en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción adecuadas, una derivación sustáncialmente selectiva de la proteína en el N-terminal con un grupo carbonilo que contenga polímero es lograda. Por ejemplo, se puede pegilar N-terminalmente de manera ' selectiva la proteína al llevar a cabo la reacción a un pH que permita tomar ventaja de las diferentes de pKa entre el grupo e-amino de los residuos de Usina y aquella del grupo a-amino del residuo N-terminal de la proteina. Mediante esta derivación selectiva, la fijación de un polímero insolüble a una proteína es controlada: la conjugación con el polímero tiene lugar principalmente en el N-terminal de la proteína y no se presenta ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos los grupos amino de cadena lateral de lisina. Usando alquilación reductiva, el polímero hidrosoluble puede ser del tipo descrito arriba, y debe tener un solo aldehido reactivo para acoplamiento a la proteína. Propionaldehído de polietilenglicol , que contiene un solo aldehido reactivo, puede ser usado.

En algunas modalidades, se proporcionan compuestos que tienen un enlazador, por ejemplo Ll, como el descrito en la presente, que enlaza covalentemente un dominio de hormona de polipéptido con un péptido ABD. En algunas modalidades, un primer enlazador (Ll) enlaza covalentemente HD1 dentro del péptido manipulado. En algunas modalidades, el dominio de hormona de polipéptido (por ejemplo, HD1 como el descrito en la presente) puede ser enlazado covalentemente al péptido ABD por medio de un enlazador de péptidos. Cualquier enlazador es opcional, es decir, cualquier enlazador puede ser simplemente un enlace. Cuando está presente la estructura química de un enlazador no es crítica toda vez que sirve principalmente como una función espadadora. En una modalidad el , enlazador comprende de 1 a 30 o menos aminoácidos enlazados por enlaces péptidos. Los aminoácidos pueden seleccionarse de los 20 aminoácidos de origen natural. Como alternativa, los aminoácidos no naturales pueden ser incorporados ya sea mediante síntesis química, modificación química después de traducción o por incorporación in vivo mediante expresión recombinante en una célula hospedera. Algunos de estos aminoácidos pueden ser glicosilados.

En ciertas modalidades, el 1 a 30 o menos aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, lisina, aspartato y glutamato. En una modalidad adicional el enlazador está formado de una mayoría de aminoácidos que son estéricamente no impedidos, tales como glicina, alanina y/o serina. Las poliglicinas son particularmente útiles, por ejemplo, (Gly)3, (Gly)4 (SEQ ID NO: 116), (Gly)5 (SEQ ID NO: 117), al igual que las polialaninas, poli (Gly-Ala) , poli (Glyn-Ser ) , poli (Glyn-Glu) , poli (Glya-Lys) , poli (Glyn-Asp) , y los motivos poli (Glyn-Arg) . Otros ejemplos específicos de enlazadores son (Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 118); (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID NO: 119); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 120); y GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 121). Son particularmente útiles las combinaciones de Gly y Ala al igual que la combinación de Gly y Ser. Así, en una modalidad adicional el enlazador péptido se selecciona del grupo que consiste en un péptido rico en glicina, por ejemplo, Gly-Gly-Gly; las secuencias [Gly-Ser]n (SEQ ID NO: 122), [Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO: 123), [Gly-GlyGly-Ser] n (SEQ ID NO: 124) y [Gly-Gly-GlyGly-Ser] n (SEQ ID NO: 125), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, por ejemplo, (SEQ. ID NO. : 149) [Gly-Gly-Gly Serh, (SEQ. ID NO: 150) [Gly-Gly-Gly-Ser]i, (SEQ. ID NO: 151) [Gly-Gly-Gly Ser] o (SEQ. ID NO: 152) [Gly-Gly-Gly Ser]3.

En ciertas modalidades, se pueden usar enlazadores cargados. Estos enlazadores cargados pueden contener un número significativo de residuos ácidos (por ejemplo, Asp, Glu y similares) , o pueden contener un número significativo de residuos de base (por ejemplo, Lys, Arg y similares), de tal manera que el enlazador tenga una pl inferior a 7 o mayor que 7, respectivamente. Como se entiende por el experto, y todo lo demás en igualdad de condiciones, entre más grande sea la cantidad de residuos ácidos o básicos en un enlazador dado, más alta o más baja, respectivamente, será la pl del enlazador. Estos enlazadores pueden impartir ventajas a los polipéptidos manipulados descritos en la presente, tales como mejorar las características de solubilidad y/o estabilidad de estos polipéptidos a un pH particular, tal como un pH fisiológico (por ejemplo, entre pH 7.2 y pH 7.6, inclusive), o un pH de una composición farmacéutica que comprende estos polipéptidos .

Por ejemplo, un "enlazador ácido" es un enlazador que tiene una pl de menos de 7; entre 6 y 7, inclusive; entre 5 y 6, inclusive; entre 4 y 5, inclusive; entre 3 y 4, inclusive; entre 2 y 3, inclusive; o entre 1 y 2, inclusive. Similarmente, un "enlazador básico" es un enlazador que tiene un pl de más de 7; entre 7 y 8, inclusive; entre 8 y 9, inclusive; entre 9 y 10, inclusive; entre 10 y 11, inclusive; entre 11 y 12, inclusive, o entre 12 y 13, inclusive. En ciertas modalidades, un enlazador ácido contendrá una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en [Gly-Glu]n (SEQ ID NO: 126); [Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 127); [Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO: 128); [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 129), [Gly-Asp]„ (SEQ ID NO: 130); [Gly-Gly-Asp]„ (SEQ ID NO: 131); [Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 132); [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO: 133) en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más; por ejemplo, (SEQ ID NO: 154) [Gly-Gly-Glu] 6. En ciertas modalidades, un enlazador básico contendrá una secuencia que se seleccione del grupo que consiste en [Gly-Lys]n (SEQ ID NO: 134); [Gly-Gly-Lys ]„ (SEQ ID NO: 135); [Gly-Gly-Gly-Lys]n (SEQ ID NO: 136); [Gly-Gly-Gly-Gly-Lys ] n (SEQ ID NO: 137), [Gly-Arg]n (SEQ ID NO: 138); [Gly-Gly-Arg] n (SEQ ID NO: 139); [Gly-Gly-Gly-Arg] n (SEQ ID NO: 140); [Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n (SEQ ID NO: 141) en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más; por ejemplo, (SEQ ID NO: 125) [Gly-Gly-Lys] 6.

Además, se pueden preparar enlazadores que posean ciertos motivos o caracteristicas estructurales, tales como una hélice a. Por ejemplo, este enlazador puede contener una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys] n (SEQ ID NO: 142), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más; por ejemplo, (SEQ ID NO: 155) [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys] 3, (SEQ ID NO: 156) [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys ] 4, o (SEQ ID NO: 187) [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys ] 5.

Además, se puede emplear un enlazador no peptidico para servir como la porción Ll de un polipéptido manipulado descrito en la presente. Por ejemplo, como se entiende en la técnica, un ejemplo de enlazador no péptido tal como un enlazador de PEG puede ser empleado de esta manéra. Véase, por ejemplo, W0200002 782. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene un peso molecular de 100 Da a 1000 kDa. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene un peso molecular de 100 Ka a 500 kDa. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene un peso molecular de 100 Da a 100 kDa. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene un peso molecular de 100 Da a 50 kDa. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene un peso molecular de 100 Da a 10 'kDa. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene un peso molecular de 100 Da a 5 kDa. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene un peso molecular de 100 Da a 1 kDa. En ciertas modalidades, ese enlazador de PEG tiene; un peso molecular de 100 Da a 500 Da.

También se debe entender que los enlazadores adecuados para usarse de acuerdo con la invención pueden poseer una o más de las características y motivos descritos arriba. Por ejemplo, un enlazador puede comprender un enlazador ácido así como un motivo estructural, tal como una hélice alfa: En forma similar, un enlazador puede comprender un enlazador básico y un motivo estructural, tal como ulna hélice alfa. Un enlazador puede comprender un ¡enlazador ácido, un enlazador básico y un motivo estructural, tal como una hélice a. Además, se debe , entender también que los polipéptidos manipulados dé acuerdo con la invención pueden poseer más de un enlazador, y cada uno de estos enlazadores puede poseer una o más de las caracte ísticas descritas arriba.

Los enlazadores descritos en la presente son ejemplos, y los enlazadores dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos. En una modalidad, se excluyen expresamente los polipéptidos manipulados ' en los cuales el compuesto de leptina es enlazado directamente al ABD sin un enlazador.

En algunas modalidades, el pol ipépt ido manipulado incluye un ABD en el N-terminal, y un HD1 en el extremo C-terminal. De manera inversa, en algunas modalidades, el polipéptido manipulado incluye un ABD en el extremo C-terminal, y un HD1 en el N-terminal. En algunas modalidades, ya sea el N-terminal o el extremo C-terminal es una leptina, un fragmento de leptina o un análogo de leptina. De preferencia, el ABD está en el N-terminal de un compuesto de leptina. Además de las modalidades que incluyen un ABD y un HDl, el polipéptido manipulado puede tener la estructura ABD-HD1 o HDl -ABD (ambas leídas en la orientación del N-terminal al extremo C-terminal ) .

Se entiende que si está ausénte una indicación expresa del N-terminal y/o extremo C-terminal de un polipéptido manipulado mostrado en la presente, el polipéptido manipulado debe ser: leído en la orientación del N-terminal al extremo C-terminal. Por ejemplo, cuando HDl sea una leptina o análogo de la misma, los término.s HD1-ABD, HD1-L1-ABD, ¡HD1-ABD, y similares significan, en ausencia de una indicación expresa del N-terminal y/o el extremo C-terminal, que el compuesto de leptina reside en el N-terminal del polipéptido manipulado, y el ABD reside en el extremo i .

C-terminal. A la inversa, si el N-terminal y/,? extremo C-terminal se indica expresamente, entonces el polipéptido manipulado debe ser leído de acuerdo con la indicación expresa de los extremos. Por ejemplo, los términos HDlc-term- ABD, HDl-Ll-ABDN_ter y similares significan que el ABD reside en el N-terminal del polipéptido manipulado, y HD1 reside en el extremo C-terminal.

En algunas modalidades de los polipéptidos manipulados descritos arriba, HD1 es una leptina o metreleptina humana. En algunas modalidades adiciónales, HD1 es un análogo de leptina como el descrito en la presente. En algunas modalidades, el análogo de leptina es leptina A100, A300 o A500.

En algunas modalidades, el polipéptido manipulado descrito en la presente tiene una afinidad para albúmina de suero que es diferente a la afinidad del polipéptido ABD solo, es decir, en ausencia de un dominio de hormona conjugada. Para obtener asociación efectiva, el polipéptido manipulado puede tener una afinidad de unión para albúmina de suero tal que la constante de disociación KD sea, por ejemplo, menor que aproximadamente 1CT6 M, 10~7 M, 10"8 M, 10"9 M, 10"10 M, 10"11 M, 10'12 M, 10"13 M, 10~14 M o incluso 10"15 M. En algunas modalidades, la afinidad no es excesivamente estrecha por lo que polipéptido manipulado puede disociarse de la albúmina y provocar una respuesta biológica, por ejemplo, uniéndose a un receptor, por ejemplo, un receptor de leptina. La afinidad puede medirse como se describe en la solicitud de PCT publicada No. O 2009/016043, de preferencia a albúmina de suero humano.

En algunas modalidades, un polipéptido manipulado descrito en la presente es superior a un compuesto correspondiente que tiene una porción diferente que puede extender la vida media en plasma (por ejemplo, PEG o de Fe o albúmina) conjugada con uno varios dominios de hormona. En este contexto, el término "superior" se refiere a una variedad de propiedades funcionales que podrían ser ponderadas en la evaluación de un tratamiento para una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, el polipéptido manipulado descrito en la presente podría requerir un componente menos biológicamente activo (dominio dé hormona) , por ejemplo IX, 2X, 3X, 4X, 5X, o incluso menos, que el compuesto correspondiente que tenga una porción diferente conjugada con el dominio o dominios de hormona. Para un ejemplo más, el polipéptido manipulado descrito en la presente podría tener una potencia más alta, por ejemplo, 1.5X, 2X, 3X, 4X, 5X, 10X, 20X, 50X, o una potencia todavía más alta.

Los compuestos de polipéptidos manipulados contemplados en la presente incluyen los compuestos mostrados en la siguiente tabla 2.

Tabla 2 Polipéptidos manipulados seleccionados 5 Se contemplan específicamente los compuestos de las secuencias anteriores en los cuales la metionina N-terminal está ausente, por ejemplo, en donde el N-términal comienza con (SEQ ID NO: 158)VPIQKV o (SEQ ID NO: 159) LAEAK por ejemplo, para compuestos de leptina. La metionina N-terminal está presente como una conveniencia para 1 expresión bacteriana. Sin embargo, los péptidos conjugados de la presente invención pueden ser expresados en una célula hospedera o eucariótica (por ejemplo, levadura (por ejemplo, Pichia) , mamifera, baculovirus) u otra célula hospedera que tenga procesamiento proteolitico N-terminal después d'e traducción para producir un aminoácido N-terminal como se encuentra en una contraparte de péptido maduro 1 de origen natural de la hormona o secuencia ABD deseada. Como alternativa, una secuencia N-terminal usada para expresión y/o secreción puede ser una que pueda ser removida 1 después de la traducción, por. ejemplo, mediante el uso de una proteasa tal como TEV.

III. Métodos de diseño y producción Diseño de construcciones. Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden ser diseñados a nivel de aminoácidos. Estas secuencias pueden ser después traducidas de nuevo" usando una variedad de productos de software conocidos en la técnica de tal manera que la secuencia de nucleótidos sea optimizada para el anfitrión de expresión deseado, por ejemplo, con base en la expresión de proteínas, optimización de codones, contenido de sitios de restricción. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede ser optimizada para la expresión de proteínas a base de E. coli y para el contenido de sitios de restricción ., Con base en la secuencia de nucleótidos de interés, se puede proporcionar oligonucleotidos superpuestos para PCR de varias etapas, como se conoce en la técnica. Estos oligonucleotidos pueden usarse en varias reacciones de PCR bajo condiciones bien conocidas en la técnica para construir el ADNc que codifique para la proteina de interés. Un ejemplo es regulador de pH IX Amplitaq, 1.3 mM de gCl2, 200 uM de dNTPs, 4 U Amplitaq Gold, 0.2 uM de cada cebador (AmpliTaq Gold, ABI), con parámetros de ciclo: (94C:30s, 58C:1 min, 72C:lmin), 35 ciclos.

Se pueden añadir sitios de restricción a los extremos de los productos de PCR para usarse en ligación de vectores como se conoce en la técnica. Los sitios específicos pueden incluir Ndel y Xhol, de tal manera que el ADNc pueda estar luego en el marco de lectura adecuado en un vector de expresión pET45b (Novage'n) . Usando estos sitios, cualquier marcador His N-terminal que esté en este vector puede ser iluminado toda vez que el sitio de inicio de traducción estaría entonces hacia la dirección 3' del marcador. Una vez que se completan las construcciones de expresión, se puede llevar a cabo una verificación mediante secuenciación usando, por ejemplo, cebador del promotor T7, cebador terminador T7 y protocolos ABI BxgDye Term v3.1 estándares como se conoce en la técnica. La información de secuencia puede obtenerse de, por ejemplo, un analizador de ADN ABI 3730 y se puede analizar usando el software Vector NTI v.10 (Invitrogen) . Las construcciones de expresión pueden diseñarse de una manera modular de tal manera que las secuencias enlazadoras puedan ser fácilmente cortadas y cambiadas, como se conoce en la técnica .

Los sitios de reconocimiento de.proteasa, conocidos en la técnica o descritos en la presente, pueden ser incorporados en construcciones útiles para el diseño, construcción, manipulación y producción de polipéptidos de manipulación recombinantes descritos en la presente.

Métodos de producción generales. Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden prepararse usando técnicas de ADN biológicas, químicas y/o recombinantes que se conocen en la técnica. Ejemplos de métodos se describen en la presente y en la patente de E.U.A. No. 6,872,700; O 2007/139941; WO 2007/140284; WO 2008/082274; WO 2009/011544; y publicación de E.U.A. No. 2007/0238669, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en sus totalidades y para todos los propósitos. Otros métodos para preparar los compuestos se muestran en la presente.

Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden prepararse usando técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida estándares, tales como un sintetizador de péptidos automático o semiautomático . Típicamente, usando estas técnicas, un aminoácido protegido con alfa-N-carbamoilo y un aminoácido unido a la cadena de péptido en crecimiento en una resina son acoplados a temperatura ambiente en un solvente inerte (por ejemplo, dimetilformamida, N-metilpirrolidinona, cloruro de metileno, y similares) en presencia de agentes de acoplamiento (por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida., 1-hidroxibenzo-triazol, y similares) en presencia de una base (por ejemplo, diisopropiletilamina, y similares) . El grupo protector alfa-N-carbamoilo es eliminado de la resina de péptidos resultante usando un reactivo (por ejemplo, ácido trifluoroacético, piperidina y similares) y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N-protegido deseado que se añadirá a la cadena de péptido. Los grupos N-protectores adecuados se conocen bien en la técnica, tales como t-butiloxicarbonilo (tBoc) , fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), y similares. Los solventes, derivados de aminoácido y resina de 4-metilbenzhidril-amina usados en el sintetizador de péptidos pueden ser comprados de Applied Biosystems Inc. (Foster City, California) .

Para la síntesis química, puede usarse síntesis de péptidos en fase sólida para los polipéptidos manipulados, toda vez que en general la síntesis en fase sólida es un enfoque directo con excelente escalabilidad a escala comercial, y es generalmente compatible con polipéptidos manipulados relativamente largos. La síntesis de péptidos en fase sólida se puede llevar a cabo con un sintetizador de péptidos automático (modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, California) usando el sistema NMP/HOBt (opción 1) y química de tBoc o Fmoc (véase Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, versión 1.3B, julio 1, 1988, sección 6, pp. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) con tapado. Las resinas de Boc-péptido pueden ser cortadas con HF (-5°C a 0°C, 1 hora) . El péptido puede ser extraído de la resina con agua y ácido acético alternantes, y los filtrados liofilizados . Las resinas de Fmoc-péptido pueden ser cortadas de acuerdo con métodos estándares (por ejemplo, Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pp. 6-12). Los péptidos también pueden ser ensamblados usando un Advanced Chem Tech Synthesizer (modelo MPS 350, Louisville, Ky. ) .

Los compuestos descritos en la presente también se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinantes , mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como. Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición, Cold Spring Harbor. Los compuestos no péptidos pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, aminoácidos que contengan fosfato y ¦ péptidos¦ que contengan estos aminoácidos, pueden prepararse usando métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Barlett et al, 1986, Biorg. Chem. 14:356-377.

Los polipéptidos manipulados pueden producirse como alternativa mediante técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 (Id.). Estos polipéptidos manipulados producidos mediante tecnologías recombinantes pueden ser expresados a partir de un polinucleótido . Un experto en la técnica apreciará que los polinucleótidos, incluyendo ADN y ARN, que codifican para estos polipéptidos manipulados pueden obtenerse del ADNc tipo silvestre, por ejemplo, leptina humana, tomando en consideración la degeneración del uso de codones, y se pueden manipular además según se desee para incorporar las sustituciones indicadas. Estas secuencias de polinucleótidos pueden incorporar codones que faciliten la transcripción y traducción de ARNm en anfitriones microbianos. Estas secuencias de fabricación pueden construirse fácilmente de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, WO 83/04053, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. Los polinucleótidos anteriores también pueden codificar opcionalmente para un residuo de metionilo N-terminal. Los compuestos no péptidos útiles en la presente invención pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, aminoácidos que contengan fosfatos y péptidos que contengan estos aminoácidos pueden ser preparados usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Barlett y Landen, 1986, Bioorg. Chem. 14:356-77. ?na variedad de sistemas de (vector de expresión/anfitrión pueden utilizarse ¦ para contener y expresar una secuencia de codificación de pjolipéptidos manipulados. Estas incluyen pero no están limitadas a microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, vectores de expresión de ADN plásmidos o cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura, sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus) ; sistemas de células vegetales transfretados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322) ; o sistemas de células animales. Las células de mamífero que son útiles en las producciones de proteínas recombinantes incluyen pero no están limitadas a células VERO, células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus' siglas en inglés), células COS (tales como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293. Ejemplos de protocolos para la expresión recombinante de la proteína se describen aquí y/o se conocen en la técnica.

De esta forma, las secuencias de polinucleótidos son útiles para generar vectores de ADN virales y de plásmidos nuevos y útiles, células hospederas procarióticas y eucarióticas transformadas y transíectadas nuevas y útiles (incluyendo células bacterianas, de levadura y de mamífero cultivadas en cultivo) y métodos nuevos y útiles para el crecimiento cultivado de estas células hospederas capaces de expresión de los presentes polipéptidos manipulados. Las secuencias de polinucleótidos que codifican para polipéptidos manipulados de la presente pueden ser útiles para terapia génica en casos en los que una subproducción de polipéptidos manipulados sería aliviada, o la necesidad de niveles incrementados de éstos pudiera ser satisfecha.

La presente invención también proporciona procesos para la producción de ADN recombinante de los presentes polipéptidos manipulados. Se proporciona un proceso para producir los polipéptidos manipulados a partir de una célula hospedera que contiene ácidos nucleicos que codifican para el polipéptido manipulado que comprenden: (a) cultivar la célula hospedera que contenga los polinucleótidos que codifiquen para el polipéptido manipulado bajo condiciones que faciliten la expresión de la molécula de ADN; y (b) obtener el polipéptido manipulado.

Las células hospederas pueden ser procarióticas o eucarióticas e incluir bacterias, células de mamífero (tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , células de mono, células de riñon de hámster bebé, células de cáncer u otras células), células de levadura y células de insecto.

Los sistemas anfitriones de mamífero para la expresión de la proteina recombinante también se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Las cepas de células hospederas pueden seleccionarse para una capacidad particular para procesar la proteína expresada o producir .ciertas modificaciones después de traducción que serán útiles para proporcionar actividad de proteína. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento después de traducción, el cual corta una forma "prepro" de la proteína, también puede ser importante para una correcta inserción, doblez y/o función. Diferentes células hospederas, tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138 y similares, tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para estas actividades después de traducción, y se pueden seleccionar para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteina extraña introducida .

Como alternativa, se puede emplear un sistema de levadura para generar los polipéptidos manipulados de la presente invención. La región- de codificación del ADN de los polipéptidos manipulados es amplificado mediante PCR. Un ADN que codifica para la secuencia líder de levadura pre-pro-alfa se amplifica a partir de ADN genómico de levadura en una reacción de PCR usando un cebador que contiene nucleótidos 1-20 del gen del factor de acoplamiento alfa y otro cebador complementario a los nucleótidos 255-235 de este gen (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell, 30:933-43). La secuencia de codificación del líder pre-pro-alfa y fragmentos de secuencia de codificación de polipéptido manipulado son ligados en un plásmido que contiene el promotor de alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH2), de tal manera que el promotor dirija la expresión de una proteína de fusión que consista en el factor pre-pro-alfa fusionado al polipéptido manipulado maduro. Como se enseña por Rose y Broach, Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990), el vector incluye además un terminador de transcripción ADH2 hacia el extremo 3' del sitio de clonación, el origen de replicación de "2 mieras" de levadura, el gen leu-2d de levadura, los genes REP1 y REP2 de levadura, el gen de beta-lactamasa de E. coli, y un origen de replicación de E. coli. Los genes de beta-lactamasa y leu-2d proporcionan la selección en bacterias y levaduras, respectivamente. El gen leu-2d también facilita un número de copias incrementado del plásmido en levadura para inducir niveles más altos de expresión. Los genes REP1 y REP2 codifican para proteínas implicadas en la regulación del número de copias de plásmidos.

La construcción de ADN descrita en el párrafo anterior es transformada en células de levadura usando el método conocido, por ejemplo, tratamiento con acetato de litio (Stearns et al., 1990., Meth. Enz . , 185: 280-297) . El promotor ADH2 es inducido después del agotamiento de glucosa en los medios de crecimiento (Price et al., 1987, Gene 55:287) . La secuencia pre-pro-alfa lleva a cabo la secreción de la proteina de fusión de las células. De manera concomitante, la proteina KEX2 de levadura corta la secuencia pre-pro a partir de los polipéptidos manipulados maduros (Bitter et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 81:5330-5334) .

Los polipéptidos manipulados de la invención también pueden ser expresados en forma recombinante en levadura, por ejemplo, Pichia, usando sistemas de expresión disponibles comercialmente , por ejemplo, el sistema de expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, California), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se basa en la secuencia pre-pro-alfa para dirigir la secreción, pero la transcripción del inserto es conducida por el promotor dé alcohol oxidasa (AOXl) después de la inducción por metanol. El polipéptido manipulado secretado es purificado a partir del medio de crecimiento de levadura mediante, por ejemplo, los métodos usados para purificar al polipéptido manipulado a partir de sobrenadantes de células bacterianas y de mamífero.

Como alternativa, el ADN que codifica para un polipéptido manipulado puede ser clonado en un vector de expresión de baculovirus, por ejemplo, pVL1393 (PharMingen, San Diego, California) . Este vector de codificación de polipéptido manipulado se usa después de acuerdo con las direcciones del fabricante (PharMingen) o técnicas conocidas para infectar células de Spodoptera frugiperda , cultivadas por ejemplo en medios libres de proteina sF9, y para producir proteina recombinante . La proteina es purificada y concentrada a partir de los medios usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, una columna de heparina-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) y columnas de dimensionamiento molecular secuencial (Amicon, Beverly, Massachusetts ) , y se resuspende en solución adecuada, por ejemplo, PBS. Se puede usar análisis SDS-PAGE para caracterizar la proteina, por ejemplo al mostrar una sola banda, que confirme el tamaño del polipéptido manipulado deseado, al igual que un análisis de secuencia de aminoácidos completo, por ejemplo, secuenciación Edman en un Protón 29090 Peptide Sequencer, o confirmación de su secuencia N-terminal.

Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido manipulado maduro predicho puede ser clonada en un plásmido que contenga un promotor deseado y, opcionalmente, una secuencia líder (véase, por ejemplo, Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043). La secuencia de esta construcción puede confirmarse mediante secuenciación automática. El plásmido es luego transformado en E. coli, cepa MC1061, usando procedimientos estándares, empleando incubación en CaC12 y tratamiento por choque térmico de las bacterias (Sambrook et al., Id.). Las bacterias transformadas se cultivan en medio LB complementado con carbenicilina, y la producción de la proteina expresada es inducida por crecimiento en un medio adecuado. Si está presente, la secuencia ' líder afectará . la secreción del polipéptido manipulado maduro y puede ser cortada mediante la secreción.

I El polipéptido manipulado recombinante secretado se purifica de los medios de cultivo bacteriano mediante ' el método i descrito en la presente.

Como alternativa, los polipéptidos manipulados pueden ser expresados en un sistema de insecto. Los sistemas de insecto para expresión de proteínas se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. En un sistema de este tipo, virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia . La secuencia de codificación de polipéptidos manipulados es clonada en la región no esencial del virus, tal como el gen de poliedrina, y puesto bajo el control del promotor de poliedrina. Una inserción exitosa de un polipéptido manipulado hará al gen de poliedrina inactivo y i producirá virus recombinantes que carezcan de cápside de proteina. Los virus recombinantes se usan, después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las cuales el polipéptido manipulado de la presente invención sea expresado (Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Engelhard et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 91:3224-3227).

En otro ejemplo, la secuencia de ADN que codifica para los polipéptidos manipulados puede ser amplificada por PCR y clonada en un vector adecuado, por ejemplo, pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). El vector pGEX está diseñado para producir una proteina de fusión que comprende glutationa-S-transferasa (GST) , codificada por el vector, y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los cebadores para la PCR pueden ser generados para incluir, por ejemplo, un sitio de corte adecuado. La proteina de fusión recombinante puede ser después cortada de la porción GST de la proteína de fusión. La construcción pGEX-3X/polipéptido manipulado se transforma en células XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, La Jolla, California) , y los transformantes individuales se aislan y cultivan a 37 °C en medio LB (complementado con carbenicilina ) hasta una densidad óptica a longitud de onda 600 nm de 0.4, seguida por incubación adicional durante 4 horas en presencia de 0.5 mM de beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (Sigma Chemical Co., St . Louis, Missouri). ADN Plasmídico de transformantes individuales se purifica y secuencia parcialmente usando un secuenciador automático para confirmar la presencia del inserto de gen de codificación de polipéptido manipulado deseado en la orientación adecuada.

La proteina de fusión, cuando se espera que sea producida como un cuerpo de inclusión insoluble en las bacterias, puede ser purificada como se describe arriba como sigue. Las células son cosechadas por centrifugación; lavadas en NaCl 0.15 M, 10 mM de Tris, pH 8, 1 mM de EDTA; y tratadas con 0.1 mg/mL de lisozima (Sigma Chemical Co. ) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El lisado se limpia por sonicación, y los restos celulares se sedimentan por centrifugación durante 10 minutos a 12,000 xg. El sedimento que contiene proteina de fusión es resuspendido en 50 mM de Tris, pH 8, y 10 mM de EDTA, estratificado sobre 50% de glicerol y centrifugado durante 30 minutos a 6, 000 xg . El sedimento se resuspende en solución salina de pH regulado con fosfato estándar (PBS) libre de Mg++ y Ca++. La proteina de fusión se purifica más al fraccionar el sedimento resuspendido en un gel de poliacrilamida , SDS de desnaturalización (Sambrook et al;, citado arriba) . El gel es sumergido en KC1 0.4 M para visualizar la proteina, la cual es extirpada y electroeluida en regulador de pH de activación con gel que carece de SDS. Si la proteina de fusión de GST/polipéptido manipulado se producen bacterias como una proteina soluble, puede ser purificado usando el GST Purification Module (Pharmacia Biotech) .

La proteina de fusión puede ser sujeta a digestión para cortar el GST del polipéptido manipulado maduro. La reacción de digestión (20-40 µg de proteina de fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg (Sigma) en 0.5 mL de PBS) es incubada 16-48 horas a temperatura ambiente y cargada en un gel SDS-PAGE de desnaturalización para fraccionar los productos de reacción. El gel es sumergido en KC1 0.4 M para visualizar las bandas de proteínas. La identidad de la banda de proteínas que corresponde al peso molecular esperado del polipéptido manipulado puede confirmarse mediante análisis de secuencia de aminoácidos parcial usando un secuenciador automático (Applied Biosystems modelo 473A, Foster City, California) .

En un método particularmente ejemplar de1 expresión recombinante de los polipéptidos manipulados de la presente invención, 293 células pueden ser co-transfectadas con plásmidos que contengan el ADNc de los polipéptidos manipulados en el vector pCMV (promotor CMV 5' , secuencia poli A HGH 3' ) y pSV2neo (que contiene el gen de resistencia neo) mediante el método de fosfato de calcio. En una modalidad, los vectores podrían ser linearizados con Seal antes de la transíección . De manera similar, se puede usar una construcción alternativa que use un vector pCMV similar al gen neo incorporado. Las lineas de células estables se seleccionan de clones unicelulares por dilución limitante en medios de crecimiento que contienen 0.5 mg/mL G418 (antibiótico tipo neomicina) durante 10-14 días. Las lineas celulares son tamizadas para la expresión de polipéptidos manipulados por ELIS o Wester blot, y las lineas celulares de alta expresión son expandidas para crecimiento a gran escala.

Es preferible que las células transformadas se usen para producción de proteínas de alto rendimiento a largo plazo y de esta manera la expresión estable es deseable. Una vez que estas células son transformadas con vectores que contienen marcadores seleccionables junto con el cásete de expresión deseado, las células pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que sean cambiadas por medio selectivo. El marcador seleccionable se diseña para conferir resistencia a selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Grupos resistentes de células establemente transformadas pueden ser proliferados usando técnicas de cultivo de tejidos adecuados para la célula.

Un número de sistemas de selección pueden usarse para recuperar las células que hayan sido transformadas para traducción de proteínas recombinantes . Estos sistemas de selección incluyen, pero no están limitados a, HSV timidina cinasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y genes de adenina fosforribosiltransferasa, en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Asimismo, resistencia anti- metabolitos puede ser usada como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; gpt, ¦ que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglicósido, G418; también, que confiere resistencia a clorosulfurón; e hygro, que confiere resistencia a higromicina. Genes seleccionables adicionales que pueden ser útiles incluyen trpB, el cual permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, el • cual permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Los marcadores que dan una indicación visual para la identificación de transformantes incluyen antocianinas , beta-glucuronidasa y su substrato, GUS, y luciferasa en su substrato, luciferina.

Los polipéptidos manipulados de la presente invención pueden producirse usando una combinación de técnicas de síntesis de péptidos tanto automáticas como recombinantes . Por ejemplo, cualquiera o ambos de: la leptina; un análogo de leptina, un fragmento de leptina activo o derivado de leptina; y un ABD; y opcionalmente un enlazador; empleado en la preparación de los polipéptidos manipulados como los descritos en la presente, se puede hacer sintéticamente o en forma recombinante y luego ligarse juntos usando métodos conocidos en la técnica, tales como "ligación química nativa" y variaciones conocidas de la misma en las cuales un enlace de amida se forma que une los compuestos de origen. Véase, por ejemplo, patente de Estados ; Unidos No. 6,326,468, la cual se incorpora en la presente por referencia para todos los propósitos. Como alternativa, por ejemplo, un polipéptido manipulado de la presente invención puede contener una combinación de modificaciones que incluyan supresión, sustitución, inserción y derivación mediante PEGilación (u otra porción, por ejemplo, polímero, cadena acilo grasa, amidación C-terminal) . Este polipéptido manipulado puede ser producido por etapas. En la primera etapa, un polipéptido manipulado intermedio que contenga las-modificaciones de supresión, sustitución, inserción y cualquier combinación de las mismas, se puede producir mediante técnicas recombinantes como las descritas. Luego, después de una etapa de purificación opcional' como la descrita en la presente, el polipéptido manipulado intermedio es PEGilado (o sometido a otra derivación química, por ejemplo, acilación, amidación C-terminal) a través de modificación química con un reactivo de PEGilación adecuado (por ejemplo, de NeKtar Transforming Therapeutics, San Carlos, California) para producir el derivado de polipéptido manipulado deseado. Un experto en la técnica apreciará que el procedimiento descrito arriba puede generalizarse para aplicar a un polipéptido manipulado que contenga una combinación de modificaciones seleccionadas de ' selección, sustitución, inserción, derivación y otros medios de modificación bien conocidos en la técnica y contemplados por la presente invención.

La amidación C-terminal puede lograrse mediante el uso de un precursor extendido C-terminalmente del 1 aminoácido glicina, sintetizado por ejemplo en levadura (por ejemplo, Pichia) como proteina de fusión de factor alfa que será secretada en medio de cultivo. Después de la purificación, la glicina C-terminal del precursor de polipéptido manipulado puede convertirse en amida mediante amidación enzimática, por ejemplo, monooxigenasa de alfa-amidación de peptidilglicina (PA ). Véase, por ejemplo, Cooper et al., 1989, Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258. Véase también la patente de Estados Unidos 6319683, la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos, que enseña métodos para amidación enzimática, incluyendo una enzima de alfa-amidación de rata que es suficientemente pura en enzima de alfa-amidación como para exhibir una . actividad especifica de por lo menos aproximadamente 25 mU por mg de proteina, y que está suficientemente libre de : impurezas proteoliticas como para ser adecuada para usarse con substratos purificados a partir de fuentes naturales o producirse mediante técnicas de ADN recombinante .

Los péptidos pueden ser purificados mediante cualquier número de métodos conocidos en la técnica, incluyendo como los descritos en la presente. En un método se purifican péptidos mediante RP-HPLC (preparativa y analítica) usando un sistema Waters Delta^ Prep 3000. Una columna preparativa de C4, C8 o C18 (10 µ, 2.2X25 cm; Vydac, Hesperia, California) se puede usar para aislar péptidos, y la pureza se puede determinar usando una columna analítica de C4, C8 o C18 (5µ, 0.46X25 cm; Vydac). Los solventes (A=0'.1% de TFA/agua y B=0.1% de TFA/CH3CN) pueden ser suministrados a la columna analítica a una velocidad de flujo de 1.0 ml/min y a la columna preparativa a 15 ml/min. Análisis de aminoácidos pueden llevarse a cabo en el sistema Waters Pico Tag y procesarse usando el programa Máxima. Los péptidos pueden ser hidrolizados mediante hidrólisis ácida en fase de vapor (115°C, 20-24 h) . Los hidrolizados pueden derivarse y analizarse mediante métodos estándares (Cohén et al., THE PICO TAG METHOD: A MANUAL OF ADVANCED TECHNIQUES FDR AMINO ACID ANALYSIS, pp. 11-52, Millipore Corporation, Milford, Mass. (1989)). Puede llevarse a cabo análisis de bombardeo de átomos rápido mediante M-Scan, Incorporated (West Chester, Pa . ) . La calibración de masa se puede llevar a cabo usando yoduro de cesio o yoduro de cesio/glicerol . Análisis de ionización por desorción de plasma usando detección de tiempo de vuelo puede llevarse a cabo en un espectrómetro de masas Applied Biosystems Bio-Ion 20.

Ensayo de expresión de polipéptidos manipulados.

Están disponibles métodos para ensayar el nivel de expresión de proteínas por una célula hospedera. Los procedimientos útiles para ensayar el nivel de expresión de proteína por una célula hospedera se ejemplifican en el siguiente protocolo típico. Aproximadamente 25 µ? de células de E. coli BL21 se transforman con 2 ul de ADN plasmídico (vector de expresión para el polinucleótido manipulado) . Las células pueden ser colocadas en placas e incubadas durante la noche a 37 °C a temperatura ambiente (RT) durante un periodo de 48 horas. Una sola colonia puede seleccionarse y usarse para cultivar- un cultivo de partida en 4 mi de medio LB con antibiótico adecuado durante ~ 6 horas. Soluciones de glicerol pueden prepararse al añadir 100 ul de glicerol estéril al 80% a una solución de 900 ul, la cual puede ser luego mezclada suavemente y almacenada a -80°C. Puede retirarse una muestra de 250 µ? para una muestra no inducida de TCP. Una alícuota, por ejemplo, 2 mi de medio Magic que contenga antibiótico adecuado puede ser inoculada con 5 µ? de cultivo de partida, la cual puede ser luego incubada durante la noche (hasta 24 horas) a 37°C, 300 rpm. Como se conoce en la técnica, Magic Media es autoinductor . Como alternativa, 60 mi de Magic Media que contiene antibiótico adecuado pueden inocularse con 60 µ? de cultivo de partida en un matraz Thompson de 250 mi o 125 mi, del cual puede ser después incubado durante la noche (hasta 24 horas) a 30°C, 300 rpm. Después de la incubación, 250 µ? de cultivo pueden ser removidos de cada tubo · y las células sedimentarse. Las células pueden ser resuspendidas en 1 mi de Tris 50 mM pH 8 , 150 mM de NaCl, al cual se le pueden añadir 0.1 volúmenes (100 ul) de reactivo de cultivo POP y µ? de r-lisozima (dilución 1:750 en regulador de pH de r-lisozima) . La mezcla puede ser luego mezclada bien e incubada al menos 10 minutos a temperatura ambiente. La preparación puede ser centrifugada después 10 minutos a 14,000 x G. El sobrenadante (fracción soluble) puede ser removido y retenido, y las muestran pueden prepararse para análisis en gel (15 µ? + 5 µ? de LDS) . El sedimento de cuerpos de inclusión restante puede ser resuspendido en 1 mi de SDS al 1% con sonicación. La muestra puede prepararse para análisis de gel (15 ul + 5 µ? de LDS). Para muestras no inducidas, 1.0 volúmenes de reactivo de cultivo POP y 1 µ? de r-lisozima (dilución 1:750 en regulador de pH de r-lisozima) pueden ser añadidos. La mezcla puede mezclarse bien e incubarse al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Estas muestras pueden no tener que ser centrifugadas. La muestra puede ser después preparada para análisis en gel (15 µ? + 5 µ? LDS) . Geles NU-PAGE (4-12%) no reducidos en regulador de pH IXMES pueden ser corridos y teñidos con un protocolo de microondas SimplyBlue. La des-tinción puede llevarse a cabo durante la noche, como se conoce en la técnica. Puede conservarse una imagen en gel,' y analizarse para determinar los niveles de expresión de proteínas.

Preparación de cuerpos de inclusión. Para polipéptidos manipulados que se encuentran en la fracción de cuerpos de inclusión, puede ser benéfico el siguiente procedimiento. El sedimento celular puede ser resuspendido en un mínimo de 100 mi de regulador de pH de lisis para cada cultivo de 50 mi. Después de la adición de 30 mi, se puede usar una pipeta de 10 mi para resuspender, luego el tubo puede ser lavado con 70 mi adicionales. La solución de células resuspendidas puede ser corrida varias veces, por ejemplo, 4 pasadas, a través de un microfluidizador a 100 PSI (7.03 kg/cm2) (min) teniendo cuidado de mantener la cámara en agua helada a lo largo del proceso completo. La suspensión fluidizada puede ser centrifugada a 14, 000 x g, 20 min (por ejemplo, JLA 10.5, 10,000 rpm, usando botellas Nalgene® de 250 mi). EL sedimento de cuerpos de inclusión puede ser resuspendido en hielo en regulador de pH de lisis enfriado con barra de agitación y placa de agitación durante 1 hora a 4°C después de la ruptura con la punta de la pipeta. El sedimento puede ser resuspendido una segunda vez en ??0 destilada con barra de agitación y placa de agitación durante 1 hora y 4°C después de la interrupción con punto de pipeta, seguido . por centrifugación a 14,000 x g, 15 min. El sobrenadante puede ser removido y descartado. E¡1 resultado puede ser almacenado a -80 °C.

Purificación de proteínas. Como se describe en la presente, se conocen numerosos métodos para aislamiento de polipéptidos expresados. El siguiente es un ejemplo. Sedimentos de cuerpos de inclusión pueden solubilizarse en un volumen adecuado de regulador de pH de solubilización (urea 8M o guanidina 8M, 50 mM de Tris, 10 mM de DTT, pH 7.75) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los , sedimentos solubilizados pueden ser centrifugados durante 20 minutos a 27,000 g. Sobrenadante filtrado (por ejemplo, 0.4 um) puede ser transferido gota a gota en un volumen adecuado de regulador de pH de redoblamiento (50 mM de Tris-HCl, 1 M de urea, 0.8 M de arginina, 4 mM de cisteina, 1 mM de cistamina; pH 8 ) a temperatura ambiente. El resultado puede ser luego puesto a 4°C durante la noche o más con mezclado suave. Las muestras pueden ser concentradas y corridas en una columna de filtración en gel (Superdex™ 75 26/60) a 1-2 ml/min en ambiente a 4°C usando un GE Healthsciences AKTAFPLC™. Las fracciones que contengan proteina adecuadas pueden ser identi icadas mediante SDS-PAGE, agrupadas y corridas a través de una segunda columna de filtración en gel. Las proteínas agrupadas pueden ser . luego concentradas en un filtro Amicon hasta concentración adecuada y ensayadas para niveles de endotoxinas usando, por ejemplo, Endósafe® PTS Reader (Charles River) , como se conoce en la técnica. Una vez que una muestra de proteínas haya pasado los criterios de endotoxina, puede ser filtrada estéril, colocada en alícuotas y corrida a través de ensayos de control de calidad. Los ensayos de control de calidad pueden incluir HPLC-SEC, analítica, SDS-PAGE no reductora y RP HPLC - MS para obtener masa aproximada. Las proteínas pueden obtenerse en lxPBS (137 m de cloruro de sodio, 2.7 mM de cloruro de potasio, 4.3 mM de fosfato disódico, 1. ¦ mM de fosfato de monopotasio, pH 7.2), distribuidas en alícuotas y congeladas rápidamente para su almacenamiento a -70 a -80°C.

IV. Métodos de uso y tratamiento de enfermedades Indicaciones. Una variedad de enfermedades y trastornos se contemplan para ser tratados benéficamente por los compuestos de polipéptidos y métodos descritos en la' presente.

Obesidad y sobrepeso. La obesidad y sus ¡trastornos asociados incluyendo sobrepeso son problemas de salud¦ pública comunes y serios en los Estados Unidos y a lo largo del mundo. La obesidad de cuerpo superior es el factor de riesgo más fuerte conocido para diabetes mellitus tipo 2 y es un fuerte factor de riesgo para enfermedad cardiovascular. La obesidad es un factor de riesgo reconocido para hipertensión, aterosclerosis, insuficiencia cardiaca congestiva, apoplejía, enfermedad de vesícula biliar, osteoartritis , . ápnea del sueño, trastornos reproductivos tales como síndrome de ovarios, poliquísticos, cánceres de seno, próstata y colon, e incidencia incrementada de complicaciones de anestesia general. Véase, por ejemplo, Kopelman, 2000, Nature 404: 635-43.

La obesidad reduce la expectativa de vida y porta un serio riesgo de las co-morbidades listadas arriba, así como trastornos tales como infecciones, venas varicosas, acantosis negra, eczema, intolerancia al ejercicio, resistencia a insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis, lesiones ortopédicas y enfermedad tromboembólica . Véase, por ejemplo, Rissanen et al., 1990, Br. Med. J. , 301: 835-7. La obesidad es también un factor de riesgo para el grupo de condiciones llamadas síndrome de resistencia a insulina, o "síndrome X" y síndrome metabólico. El costo médico mundial para tratamiento de obesidad y trastornos asociados es enorme.

Se cree que la patogénesis de la obesidad es multifactorial . Un problema es que, en sujetos obesos, la disponibilidad de nutrientes y gasto de energía no entran en equilibrio hasta que existe un exceso de tejido adiposo. El sistema nervioso central (SNC) controla el equilibrio de energía y coordina una variedad de actividades de comportamiento, autonómicas y endocrinas adecuadas para el estado metabólico del animal. Los mecanismos o sistemas que controlan estas actividades están ampliamente distribuidos a través del cerebro delantero (por ejemplo, hipotálamo) , cerebro trasero (por ejemplo, tallo cerebral) y médula espinal. Finalmente, información metabólica (es decir, disponibilidad de combustible y cognitiva (es decir, preferencias aprendidas) de estos sistemas se integra y la decisión para involucrarse en comportamientos de apetito (búsqueda de alimento) y consumismo (ingestión) es ya sea activada (procuración inicio de alimentación) o apagada (conclusión de alimentación) . Se cree que el hipotálamo es principalmente responsable de integrar estas señales y luego emitir comandos al tallo cerebral. Los núcleos del tallo cerebral que controlan los elementos del sistema de control motor de consumo (por ejemplo, músculos responsables de masticación y deglución) . Asi, estos núcleos del SNC literalmente han . sido conocidos como constituyendo la "vía común final" para el comportamiento de ingestión.

Evidencia neuroanatómica y farmacológica soporta que las señales de energía y homeostasis nutricional se integran en los núcleos del cerebro frontal y que el sistema de control motor de consumo reside en los núcleos del tallo celular, probablemente en regiones que rodean el núcleo motor trigeminal. Existe -una extensa conexión recíproca entre el hipotálamo y el tallo cerebral. Una variedad de terapéuticos antiobesidad dirigidos al SCN (por ejemplo, moléculas pequeñas y péptidos) se enfocan principalmente en substratos del cerebro frontal que residen en el hipotálamo y/o en substratos del cerebro posterior que residen en el tallo cerebral.

La obesidad sigue siendo un trastorno metabólico esencialmente intratable, crónico y deficientemente tratable. En consecuencia, existe la necesidad por nuevas terapias útiles en la reducción de peso y/o mantenimiento de peso en un sujeto. Estas terapias llevarían a un profundo efecto benéfico en la salud del sujeto. Métodos y terapias que emplean los péptidos manipulados descritos en la presente, ya sea solos o en combinación con otros agentes antiobesidad (véase, por ejemplo, WO 2009064298 y US 20080207,512 pueden proporcionar estos efectos benéficos.

Deficiencia de leptina. La deficiencia de leptina ha mostrado traducirse en obesidad. Una forma de deficiencia de leptina es deficiencia de leptina congénita, un trastorno genético raro. Véase Montaque et al., 1997, Nature 387: 903-908. Una deficiencia de leptina severa puede ser el resultado de diabetes mellitus insulino-deficiente descontrolada que resulta de la destrucción de células ß secretoras de insulina. Se crea. la teoría de que la falta de insulina lleva a síntesis y almacenamiento de triglicéridos en tejido adiposo, lo cual impide ganancia de peso y a su vez reduce dramáticamente los niveles de leptina en plasma toda vez que la leptina es sintetizada en tejido adiposo. Estas y otras deficiencias de leptina, y enfermedades y trastornos que resultan de estas deficiencias, pueden ser tratadas con terapia de reemplazo de leptina, tal como por medio de leptina diariamente o inyecciones de agonistas de leptina. Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden proporcionar un tratamiento terapéutico más conveniente y adecuado de estas enfermedades y trastornos.

Diabetes y enfermedad cardiovascular. La diabetes mellitus se reconoce como una enfermedad crónica y compleja en la cual 60% a 70% de todas las muertes causales entre pacientes diabéticos son resultado de complicaciones cardiovasculares. La diabetes no sólo se considera un equivalente de riesgo de enfermedad cardiaca coronaria sino que también se define como un predictor independiente de eventos adversos, incluyendo infarto de miocardio recurrente, insuficiencia cardiaca congestiva y muerte después de un incidente cardiovascular. La adopción de un control de glucosa más estrecho y tratamiento agresivo de factores de riesgo cardiovasculares se esperaría que redujera el riesgo de complicaciones de enfermedad cardiaca coronaria y mejorará la supervivencia total entre los pacientes diabéticos. No obstante, los pacientes diabéticos son dos a 3 veces más propensos a experimentar un infarto de miocardio agudo que los pacientes no diabéticos, y los pacientes diabéticos viven ocho a treinta años menos que los pacientes no diabéticos.

Para entender la naturaleza de alto riesgo de los pacientes diabéticos/de infarto de miocardio agudo, los lineamientos de la práctica clínica del Colegio Norteamericano de Cardiología/Asociación Norteamericana Cardiaca ("ACC, por sus siglas en inglés/AHA") para el manejo de pacientes hospitalizados con angina inestable o, infarto de miocardio sin elevación de ST (colectivamente conocidos como "ACS") recientemente reconocieron que los 1 pacientes diabéticos hospitalizados son una población especial que requiere el manejo agresivo de hipérglucemia .

Específicamente, los lineamientos indican que la terapia de reducción de glucosa para pacientes diabéticos/ACS hospitalizados debería enfocarse en lograr glucosa preprandial de menos de 10 mg/dL, un objetivo diario máximo que 180 mg/dL, y una hemoglobina de post-descarga Ale inferior a 7%. . , En una muestra a nivel nacional de pacientes de ACS de edad avanzada, se demostró que un incremento ' en la mortalidad a 30 días en pacientes diabéticos correspondía con los pacientes que tenían valores de glucosa más altos después de su admisión en el hospital. Véase "Diabetic Coronary Artery Disease & Intervention", Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, septiembre 20, 2002. Existe cada vez más evidencia de que hipérglucemia prolongada en lugar de glucosa elevada transitoria después de admisión en hospital está relacionada con eventos adversos serios. Aunque la métrica ideal para hiperglucemia y riesgo bascular en pacientes no se conoce fácilmente, parece que el valor de glucosa promedio durante la hospitalización es más predictiva de mortalidad. En un estudio separado de pacientes de ACS de más de 40 hospitales en los Estados Unidos, se encontró que hiperglucemia persistente, a diferencia de valores de glucosa aleatorios después de admisión en el hospital1, era más predictiva de mortalidad en hospital. Véase Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, septiembre 21, 2002. En comparación con los valores de glucosa después de la admisión, un modelo de 1 regresión logística del control de glucosa sobre la hospitalización completa fue más predictivo de mortalidad. Hubo un riesgo incrementado casi dos veces de mortalidad durante hospitalización para cada incremento de 10 mg/dL en glucosa sobre 120 mg/dL. En una cohorte más pequeña de 1 pacientes diabéticos/ACS consecutivos, hubo un incremento gradado en la mortalidad a un año con niveles de glucosa cada vez más altos después de admisión en hospital. En el escenario de. hospital, los lineamientos de ACC/AHA sugieren el inicio de una terapia con insulina agresiva para lograr glucosa en sangré más baja durante la hospitalización.

Se ha reportado ' que la leptina pue(de tener beneficio directo para tratar diabetes, particularmente en diabetes tipo I y diabetes tipo II, con o sin la presencia de obesidad, y más particularmente en condiciones de baja leptina en suero. Se ha reportado que el reabastecimiento de leptina redujo o previno hiperinsulinemia , resistencia a insulina e hiperglucemia en varios modelos animales de diabetes tipo 1 y 2 con o sin obesidad inherente. Por ejemplo, altos niveles de leptina en plasma generados ya sea por administración farmacológica de leptina o con terapia génica adenoviral redujo hiperglucemia y los incrementos asociados de los niveles de glucagón en plasma en diabetes inducida por STZ, a pesar de niveles de insulina persistentemente bajos.

Enfermedades de regulación de lipidos . Como se conoce en la técnica, la lipodistrofia se caracteriza por condiciones anormales o degenerativas del tejido adiposo del cuerpo. La dislipidemia es una interrupción del componente lipido normal en la sangre. Se cree que la elevación prolongada de los niveles de insulina puede llevar a dislipidemia. La hiperlipidemia es la presencia de niveles elevados o anormales de lipidos y/o lipoproteinas en la sangre. La amenorrea hipotalámica es una condición en la cual la menstruación se detiene durante varios meses debido a un problema que implica el hipotálamo. Se ha encontrado que la terapia de reemplazo de leptina en mujeres con amenorrea hipotalámica mejora los ejes marcadores reproductivos, de tiroides y de hormona de crecimiento de formación de hueso sin causar efectos adversos. Véase, por ejemplo, Oral et al., N Engl J Med. 2004, 351: 959-962, 987-997. La enfermedad del hígado graso, por ejemplo, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD) se refiere a un amplio espectro de enfermedades hepáticas que varían desde hígado graso simple (esteatosis ) , a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), a cirrosis (irreversible, cicatrización avanzada del hígado) . Todas las etapas de NAFLD tienen en común la acumulación de grasa (infiltración grasa) en las células hepáticas (hepatocitos ) . Se cree que la leptina es uno de los reguladores clave para la inflamación y progresión de fibrosis en varias enfermedades y prácticas crónicas incluyendo NASH. Véase, por ejemplo, Ikejima et al., Hepatology Res. 33: 151-154.

Además, sin desear .ser limitados por ninguna teoría, se cree que una deficiencia de insulina relativa en diabetes tipo 2, toxicidad de glucosa y carga de ácidos grasos libres hepáticos incrementada a través de un suministro elevado a partir de tejido adiposo intra-abdominal por medio de la vena portal, están implicados como posibles causas en trastornos de hígado graso. De hecho, se ha creado la hipótesis de que el comportamiento alimenticio es el factor clave que conduce el síndrome metabólico de obesidad con sus muchos corolarios, incluyendo NASH. En consecuencia, ¦los tratamientos enfocados a reducir el consumo de alimento e incrementar el número de comidas pequeñas, comq ya se ha demostrado en diabetes tipo 2, puede tratar y prevenir de manera efectiva NASH. Los fármacos que promueven la secreción de insulina y cantidad de peso, y retrasan el vaciado gástrico también son efectivos para mejorar la tolerancia a ¦glucosa y de esta manera puede mejorar hígado graso con su hiperinsulinemia inherente. Así, él uso de una leptina, análogo de leptina, por ejemplo, metreleptina o un fragmento activo de la misma, puede ser muy adecuado como una modalidad de tratamiento para esta condición. En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en la presente que incluyen una leptina, análogo de leptina o un fragmento activo de la misma, pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos de hígado graso.

Enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés), como se conoce en la técnica, está asociada con placas y marañas en el cerebro que incluyen la desregulación de la proteína A-beta. Se creei que los lípidos cerebrales están implicados intricadamente en las vías patogénicas relacionadas con A-beta, y que un modulador importante de la homeostasis de lípidos es leptina. En consecuencia, la leptina puede modular la cinesis A-beta bidireccional , reduciendo sus niveles extracelularmente . De hecho, se ha demostrado que la administración crónica de leptina a animales transgénicos AD redujo la carga de A-beta en el cerebro, que subyace a su potencial terapéutico. Véase Fewlass et al., 2004, FASEB J. , 18:1870-1878. Además, la diabetes mellitus tipo 2 y AD comparten características epidemiológicas y bioquímicas ya que ambas se caracterizan por agregados de proteínas insolubles con una conformación fibrilar - amilina en isletas pancreáticas D tipo 2 y ?ß en cerebro AD. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que los mecanismos tóxicos similares pueden caracterizar DM tipo 2 y AD. Véase Lim et al., FEBS Lett., 582:2188-2194.

• Síndrome metabólico X. El síndrome metabólico X se caracteriza por resistencia a insulina, dislipidemia, hipertensión y distribución visceral de tejido adiposo, y juega un papel central en la patofisiología de diabetes tipo 2. También se ha encontrado que está fuertemente correlacionado con NASH, fibrosis y cirrosis del hígado. En consecuencia, los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden ser útiles en el tratamiento de síndrome metabólico X.

Enfermedad de Huntington. La enfermedad de Huntington es una enfermedad neurodegenerativa autosómica y dominante. Las características de la enfermedad incluyen alteraciones motrices, demencia, problemas psiquiátricos y pérdida de peso no deseada. Los polipéptidos quiméricos descritos en la presente pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedad de Huntington.

En consecuencia, en un aspecto, se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en, un sujeto. El sujeto está en necesidad de tratamiento para la, enfermedad o trastorno. La enfermedad o trastorno puede ser lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, 1 sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica, enfermedad de 1 Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad de hígado graso' o diabetes (incluyendo tipo I y tipo II). Enfermedades y 'trastornos adicionales que pueden ser tratados por los compuestos y métodos descritos en la presente incluyen esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD) , síndrome metabólico X y enfermedad de Huntington. El método de tratamiento incluye la administración al1 sujeto de un polipéptido manipulado como el descrito en la presente en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad o 'trastorno. El polipéptido manipulado incluirá como HD1 una leptina, un fragmento de leptina o un análogo de leptina. En consecuencia, el polipéptido manipulado puede tener una de • las siguientes estructuras: ABD-HD1, HD1-ABD, ABD-L1-HD1 o HD1-L1-ABD .· En todas las modalidades de tratamiento ; descritas en la presente, la leptina puede ser leptina 1 humana o metreleptina . En algunas modalidades, el análogo de leptina tiene por lo menos 50%, por ejemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, de identidad con leptina humana. En algunas modalidades, el análogo, de leptina tiene por lo menos 50%, por ejemplo, 50%, 55%, 60%!, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, de identidad con leptina de ratón. En algunas modalidades, el análogo de leptina tiene al menos 50%, por ejemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, dé identidad con leptina de rata. En algunas modalidades, el ^nálogo de leptina tiene al menos 50%, por ejemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o todavía más, de identidad con leptina de ornitorrinco. En algunas modalidades, el análogo de leptina tiene al menos 50%, por ejemplo,! 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,.98% o todavía más, de identidad con leptina de foca. En algunas modalidades, el análogo de leptina es leptina A100, A300 o A500.

V. Ensayos Los métodos para la producción y ensayo de polipéptidos manipulados descritos en la presente están generalmente disponibles para el experto en la técnica. Además, métodos específicos se describen aquí. así como en las publicaciones de patente y otras referencias citadas en la presente, las cuales se incorporan por referencia para este propósito adicional.

Consumo de alimento. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que el consumo de alimento es útil en la evaluación de la utilidad de un compuesto como el descrito en la presente. Por ejemplo, se sabe que un número de patologías metabólicas están relacionadas con consumo de alimento (por ejemplo, diabetes, obesidad) . En consecuencia, se puede llevar a cabo un análisis inicial para determinar el grado al cual el consumo de alimento es modulado por la administración de compuestos descritos en la presente, y un análisis inicial positivo puede ser útil en el desarrollo subsecuente de un compuesto.

Una variedad de ensayos de consumo de alimento están disponibles para alguien de capacidad en la técnica. Por ejemplo, en el llamado "modelo de jaula doméstica" de consumo de alimento, sujetos (por ejemplo, ratas) se mantienen en su jaula doméstica, y el consumo de alimento junto con el peso total del sujeto se mide después de la inyección del compuesto de prueba. En el llamado "modelo de patrones de alimentación" del ensayo de consumo de alimento, sujetos (por ejemplo, ratas) son habituados a una cámara de alimentación y a inyecciones antes de la prueba. Después de la administración del compuesto de prueba, los sujetos son inmediatamente puestos en la cámara de alimentación, y el consumo de alimentos se determina automáticamente como una función de tiempo (por ejemplo, intervalos de 1 minuto) . Para ambas pruebas, el elemento es alimento para animales estándar o cualquiera de una variedad de alimentos para animales (por ejemplo, de alto contenido de grasa) conocidos en la técnica. En el llamado ensayo de "consumo de alimento de ratón", un compuesto de prueba puede ser probado para supresión de apetito, o para un efecto en la ganancia de peso corporal en ratones de obesidad inducida por dieta (DIO, por sus siglas en inglés) . En un ensayo de consumo de alimento de ratón típico, ratones NIH/Swiss hembra (8-24 semanas de edad) son alojados por grupos con un ciclo de luz : oscuridad de 12:12 horas con luces encendidas a 0600. Agua y dieta de alimento para ratones granulado estándar están disponibles ad libitu , excepto según se indique. Los animales son sometidos a ayunas iniciando a aproximadamente 1,500 horas, 1 día antes del experimento. La mañana del experimento, . los animales se dividen en grupos experimentales. En un estudio típico, n = 4 jaulas con 3 ratones/j aula . En tiempo = 0 min, todos los animales son administrados con una inyección intraperitoneal de vehículo o compuesto, típicamente en una' cantidad que varía de aproximadamente 10 nmol/kg a 75 nmol/kg, y se les da inmediatamente una cantidad pre-pesada (10-15 g) del alimento estándar. El alimento se retira y se pesan varias veces, típicamente 30, 60 y 120 minutos, para determinar la cantidad de alimento consumida. Véase, por ejemplo, Morley et al., 1994, Am. J. Physiol. 267 : R178-R184 ) . El consumo de alimento se calcula al restar el peso del alimento que permanece en el punto de tiempo de por ejemplo 30, 60, 120, 180 y/o 240 minutos, a partir del peso del alimento proporcionado inicialmente en tiempo = 0. Efectos de tratamientos significativos son identificados por ANOVA (p<0.05). Cuando existe una diferencia significativa, los medios de prueba se comparan con la media de control usando la prueba de Dunnett (Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, California) . Para cualquier prueba descrita en la presente, la administración del compuesto de prueba puede ser por cualquier medio, incluyendo inyección (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal y similares) , oral u otros métodos de administración conocidos en la técnica.

Ensayos in vitro. Sin desear ser limitados por ninguna teoría o mecanismo de acción, se cree que existen correlaciones entre los resultados de ensayos in vitro (por ejemplo, receptor) , y la actividad de agentes para el tratamiento de enfermedades y trastornos metabólicos. En consecuencia, los ensayos in vitro (por ejemplo, ensayos a base de células) son útiles como una estrategia de análisis para agentes metabólicos potenciales, tales como los descritos en la presente. Una variedad de ensayos in vitro se conocen en la técnica, ¦ incluyendo aquellos descritos a continuación .

Ensayo de unión a leptina. La unión a leptina puede medirse por la potencia de un compuesto de prueba para desplazar leptina recombinante I (murino) de la membrana superficial que expresa al receptor quimérico de Leptina (Hu)-EPO (Mu) presentada por la linea de células 32D OBECA (J Biol Chem 1998; 273(29): 18365-18373). Las membranas celulares purificadas pueden ser preparadas mediante homogeneización a partir de cultivos de células confluentes cosechados de células 32D OBECA. Las membranas pueden ser incubadas con 125I-rec-leptina de murino y concentraciones cada vez más altas de compuesto de prueba durante 3 horas a temperatura ambiente en placas de poliestireno de 96 pocilios. Las fracciones de ligando unidas y no unidas pueden ser luego separadas mediante filtración rápida en placas GF/B de 96 pocilios pre-bloqueadas durante al menos 60' en 0.5% de PEI (polietilenimina ) . Placas de fibra de vidrio pueden ser luego secadas, se les puede añadir agente de centelleo, y CPM determinarse por lectura en un contador por centelleo de varios pocilios capaz de leer yodo marcado radiactivamente.

Ensayo funcional de leptina. Niveles incrementados de STAT5 fosforilado (Transductor de señal y activador de transcripción 5) se puede añadir después del tratamiento de células 32D-Keptin que expresan ectópicamente al receptor de Hu-leptina/Mu-EPO quimérico con un compuesto de prueba. Las células 32D-Keptin (idénticas a las células 32 D-OBECA pero mantenidas en cultivo con leptina) pueden ser privadas de leptina durante la noche y luego tratadas con compuestos de prueba en ratas de 96 pocilios durante 30 minutos a 3 °C seguidas por extracción de células. Los niveles de pSTAT5 en los lisados celulares pueden ser determinados usando el kit de ensayo Perkin Elmer AlphaScreen® SureFire® pSTAT5 en un formato de 384 pocilios (Proxiplate™ 384 Plus). La eficacia de los compuestos de prueba puede determinarse con- relación a la señal máxima en lisados celulares de células tratadas con leptina humana.

VI Composiciones farmacéuticas En un aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos descritos en la presente en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, portador) . El término ' "portador farmacéuticamente aceptable", según se usa en la presente, se refiere a excipientes ' farmacéuticos , por ejemplo, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéutica y fisiológicamente aceptables- adecuadas para aplicación enteral o parenteral que no reaccionan de forma dañina con, el agente activo. Los portadores farmacéuticamente aceptables1 adecuados incluyen agua, soluciones de sal , (por ejemplo, solución de Ringer y similares), alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácido graso, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidina . Estas preparaciones pueden ser esterilizadas y, si se desea, mezcladas con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influenciar la presión osmótica, reguladores de pH, sustancias colorantes y/o aromáticas y similares que no reaccionan en forma dañina con los compuestos de la invención.

En¦ un aspecto más, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un polipéptido manipulado como el descrito · en la presente en combinación con un ' excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica oral como la descrita aqui . En algunas modalidades, la composición' farmacéutica es una composición farmacéutica , de larga duración. El término "larga duración" en el contexto de la administración de una composición farmacéutica se refiere a la duración de acción. En consecuencia, una composición farmacéutica de larga duración puede administrarse a intervalos de, por ejemplo, 1 hora, 2 horas, 41 horas, 8 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes o incluso más. En una modalidad preferida, la administración es una vez al dia (es decir, "una vez diariamente") . En modalidades que más se prefieren, la administración es una vez a la semana (es decir, "una vez semanalmente" ) .

?. Métodos 1 Los polipéptidos manipulados descritos en la presente pueden administrarse solos o pueden ser coadministrados a un sujeto. Por co-administración se intenta incluir administración simultánea o secuencial de los compuestos individualmente o en combinación (más de un compuesto). Por ejemplo, se ha encontrado que la obesidad puede ser tratada benéficamente con una terapia de combinación que incluya una leptina (por ejemplo, metreleptina) y ciertos otros compuestos antiobesidad. Véase, por ejemplo, solicitud de E.U.A. publicada No. 2008/0207512. En consecuencia, un polipéptido manipulado descrito en la presente que comprende un ABD y una leptina podría ser útil para el tratamiento de obesidad. Como alternativa, los polipéptidos manipulados individuales pueden ser coadministrados con otros agentes antiobesidad, tales como exenatida o liraglutida.

Las preparaciones también pueden ser coadministradas, cuando se desee, con otras sustancias activas (por ejemplo, para reducir degradación metabólica) como se conoce en la técnica u otros agentes terapéuticamente activos .

Amilinas. La amilina es una hormona péptida sintetizada por células ß pancreáticas que es co-secretada con insulina en respuesta al consumo de nutrientes. La secuencia de anilina es altamente conservada a través de especies de mamíferos, con similitudes estructurales a péptido relacionado con gen de calcitonina (CGRP) , las calcitoninas , las intermedinas y adrenomedulina , como se conoce en la técnica. Las acciones glucorreguladoras de amilina complementan aquellas de insulina al regular la velocidad de aparición de glucosa en la circulación mediante la supresión de la secreción de glucagón estimulada por nutrientes y reducción del vaciado gástrico. En pacientes tratados con insulina que tienen diabetes, la pramlintida, un análogo sintético y equipotente de amilina humana, reduce las excursiones de glucosa postprandial al suprimir la secreción de glucagón postprandial elevada inadecuadamente y hacer más lento el vaciado gástrico. Las secuencias de amilina de rata, amilina humana y prmlintida se muestran a continuación: amilina de rata: KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 108) ; amilina humana: KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO: 109); pramlintida: KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 110) .

Davalintida. La davalintida, también conocida como "AC-2307" es un potente agonista de amilina útil en el tratamiento de una variedad de indicaciones de enfermedad. Véase, WO 2006/083254 y WO 2007/114838, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente en su totalidad para todos los propósitos. La davalintida es un péptido quimérico, que tiene una región de asa N-terminal de amilina o calcitonina de análogos de la misma, una región alfa-helicoidal de al menos una porción de una región alfa-helicoidal de calcitonina o análogos de la misma o una región alfa-helicoidal que tiene una porción de una región alfa-helicoidal de amilina y una región .alfa-helicoidal de calcitonina o análogo de la misma, y una región de cola C-terminal de amilina o calcitonina. Las secuencias de calcitonina humana, calcitonina de salmón y davalintida son las siguientes: calcitonina humana: CGNLSTC LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO: 111); calcitonina de salmón: CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO: 112) ; davalintida: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 113) .

Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que las amilinas y davalintida, y fragmentos análogos de las mismas, pueden requerir amidación C-terminal para provocar una respuesta biológica completa. Se entiende que los compuestos de amilina tales como aquellos descritos en la presente que incluyen amilinas y/o davalintida, y fragmentos y análogos de las mismas, pueden ser amidados en el extremo C-terminal .

Los "compuestos agonistas de amilina" incluyen péptidos de amilina nativos, péptidos análogos de amilina y otros compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas) que tienen actividad agonista de amilina. Los "compuestos agonistas de amilina" pueden ser derivados de fuentes naturales, pueden ser sintéticos o pueden ser derivados de técnicas de ADN recombinantes . Los compuestos agonistas de amilina tienen actividad de unión al receptor de agonista de amilina y pueden comprender aminoácidos (por ejemplo, naturales, no naturales o una combinación de los mismos) , péptido miméticos, porciones químicas y similares. El experto en la técnica reconocerá compuestos agonistas de amilina usando ensayos dé unión a receptor de amilina o al medir la actividad agonista de amilina en ensayos de músculo soleo. En una modalidad, compuestos agonistas de amilina tendrán una IC50 de aproximadamente 200 nM o menos, alrededor de 100 nM o menos o aproximadamente 50 nM o menos, en un ensayo de unión a receptor de amilina, tal como aquél descrito en la presente, en la patente de E.U.A. No. 5,686,411, y publicación de E.U.A. No. 2008/0176804, cuyas descripciones se incorporan por referencia en la presente en sus totalidades y para todos los propósitos. En una modalidad, los compuestos agonistas de amilina tendrán una IC50 de aproximadamente 20 nM o menos, alrededor de 15 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos o aproximadamente 5 nM o menos en un ensayo de músculo soleo, tal como aquél descrito en la presente y en la patente de E.U.A. No. 5, 686,411. En una modalidad, el compuesto agonista de amilina tiene un porcentaje de identidad de secuencia de al menos, 90% o 100% con 25,28,29Pro-amilina humana. En una modalidad, el compuesto agonista de amilina es una quimera péptida de amilina (por ejemplo, amilina humana, amilina de rata y similares) y calcitonina (por ejemplo calcitonina humana, calcitonina de salmón y similares). Compuestos agonistas de amilina adecuados y ejemplares también se describen en la publicación de E.U.A. No. 2008/0274952, cuya descripción se incorpora por referencia en la presente en su totalidad y par todos los propósitos. ' Por "análogo de amilina" según se usa en la presente se intenta decir un agonista de amilina que tiene al menos 50% de identidad de secuencia, de preferencia al menos 70% de identidad¦ de secuencia, con una forma 'de origen natural de amilina, ya sea de rata o humana o de cualquier otra especie, y se deriva de ellas por modificaciones que incluyen inserciones, sustituciones, extensiones y/o supresiones de la secuencia de aminoácidos de referencia.

La secuencia de análogos de amilina puede tener al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la amilina de referencia. En un aspecto el análogo tiene 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o incluso 16 sustituciones de aminoácido, inserciones, extensiones, y/o supresiones con relación al compuesto de referencia. En una modalidad, el análogo de amilina puede comprender sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras (incluyendo aminoácidos no naturales y formas L y D) . Estos análogos son de preferencia péptidos, . derivados de péptidos o peptidomiméticos . Los análosos de amilina típicos serán péptidos, especialmente de 32-37 aminoácidos, por ejemplo, 27 a 45, especialmente 28 a 38, e incluso 31-36.

Los análogos de amilina con identidad con amilina de rata y humana incluyen 25,28,29Pro-h-amilina (pramlintida.) (SEQ ID NO: 110); des^Lys-h-amilina (SEQ ID NO: 161); 25Pro, 26Val, 28'29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 162); 18Arg, 25'28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 163); des_1Lys, 18Arg25,28 Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 164); 18Arg, 25' 28' 29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 165); des-lLys, 18Arg, 25'28'29Pro-h-hamilina (SEQ ID NO: 166) des-1Lys2 ,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 167); 25Pro, 26Val, ^'^Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 168); 28Pro-h-amilina, 2,7-ciclo-[ Asp,7Lys] -h-amilina (SEQ ID NO: 169); 2_37h-amilina (SEQ ID NO: 170); ^la-h-amilina (SEQ ID NO: 171); 2Ala-h-amilina ( SEQ ID NO: 172); 2'7Ala-h-amilina (SEQ ID NO: 173); 1Ser-h-amilina (SEQ ID NO: 174); 29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 175); 25'28Pro-h-amilina(SEQ ID NO: 176); des^Lys, 25,28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 177); 23Leu, 25Pro, 26Val, 8'29Pro-h-amilina ( SÉQ ID NO: 178); 23Leu25Pro 6Val28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 179); des-^ys, "Leu, ¿sPro, ¿bVal, Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 180); 8Arg, 23Leu, 25Pro, 26Val, 28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 181); 18Arg, 23Leu, 25,28'29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 182); 18Arg23Leu, 25, 28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 183); 17Ile, 23Leu, 25'28'29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 184); 17Ile, 25'28'29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: : 185); des- ^ys, 17Ile, 23Leu, 25'28'29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 186) ; 17Ile, 18Arg, 23Leu-h-amilina (SEQ ID NO: 187); 17Ile, 18Arg, 23Leu, 26Val, 29Pro-h -amilina (SEQ ID NO: 188); 1Ile, 18Arg, 23Leu, 25Pro, 26Val, 28,29pro -h-amilina (SEQ ID NO: 189); 13Thr, 21His, 23Leu, 26Ala, 28Leu, 29Pro, 31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 190); 13Thr, 21His, 23Leu, 26Ala, 29Pro, 31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 191); des -xLys, 13Thr, 21His, 23Leu, 26Ala, 28Pro, 31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 193) ; 13Thr, 18Arg, 21His, 23Leu, 26Ala, 29Pro, 31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 193) ; 1JThr, iaArg, 2iHis, 2JLeu, 2a'2aPro, Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 194); y 13Thr, 18Arg, 21His, 23Leu, 25Pro, 26Ala, 28'29Pro, 31Asp-h-amilina(SEQ ID NO: 195).

Los compuestos agonistas de amilina adecuados ejemplares también se describen en la publicación de patente de PCT WO2010/085700.

Análogos de amilina incluyen secuencias de aminoácidos de residuos 1-37 de la fórmula (I) siguiente, en donde hasta 25% de los aminoácidos mostrados en la fórmula (I) pueden ser eliminados' o sustituidos con un aminoácido diferente: X' -Xaa1-Cys2-Asn3-Thr -Ala5-Thr6-Cys7-Ala8-Thr9-Gln10-Arg11-Leu12- Ala13-Asn14-Phe15-Leu16-Val17-His18-Ser19-Ser20-Xaa21-Asn22-Phe23- Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Thr30-Xaa31-Val32-Gly33-Ser34- Asn35-Thr36-Tyr37-X (SEQ ID NO: 800) (I).

En la fórmula (I), X' es hidrógeno, un grupo de tapado N-terminal, o un enlazador a una porción de incremento de duración. Xaa1 es Lys o un enlace, Xaa21 es Lys, Cys o Asn, Xaa24 es Lys, Cys o Gly, Xaa25 es Lys, Cys o Pro, Xaa26 es Lys, Cys o lie, Xaa27 es Lys, Cys o Leu, Xaa28 es Lys, Cys o Pro, Xaa29 es Lys, Cys o Pro y Xaa31 es Lys, Cys o Asn. Además, con respecto a la fórmula (I), la variable X representa una funcionalidad C-terminal (por ejemplo, una tapa C-terminal) . X es amino sustituido o no sustituido, alquilamino sustituido o no sustituido, dialquilamino sustituido o no sustituido, cicloalquilamino ¦ sustituido o no sustituido, arilamino sustituido o no sustituido, aralquilamino sustituido o no sustituido, alquiloxi sustituido o no sustituido, ariloxi sustituido o no sustituido, aralquiloxi sustituido o no sustituido, o hidroxilo. Si el extremo C-terminal del componente polipéptido con la secuencia de residuos 1-37 de la fórmula (I) es tapado con una funcionalidad X, entonces X es de preferencia amina formando entonces una amida C-terminal. En algunas modalidades, hasta 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o incluso 50% de los aminoácidos de los residuos 1-37 de la fórmula (I) son eliminados o sustituidos en un componente de polipéptido de acuerdo con la fórmula (I) . En algunas modalidades, el componente de análogo de amilina tiene 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o incluso 16 sustituciones de aminoácido con relación a la secuencia de aminoácidos mostrada en la fórmula (I) . En algunas modalidades, el análogo de amilina tiene una secuencia que tiene una identidad de secuencia definida con respecto a los residµos 1-37 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la fórmula (I). En algunas modalidades, la identidad de secuencia entre un análogo de amilina descrito en la presente y los residuos 1-37 de la fórmula (I) es 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o todavía más alta. En algunas modalidades, hasta 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o todavía menos de los aminoácidos mostrados en los residuos 1-37 de la fórmula (I) pueden ser suprimidas o sustituidas con un aminoácido diferente. En algunas modalidades, la identidad de secuencia está dentro del intervalo de 75%-100%. En algunas modalidades, la identidad de secuencia está dentro del intervalo de 75%-90%. En algunas modalidades, la identidad de secuencia está dentro del intervalo de 80%-90%. En algunas modalidades, la identidad de secuencia es de al menos 75%. En algunas modalidades, el análogo de amilina tiene la secuencia de residuos 1-37 de la fórmula (I) .

En algunas modalidades, los análogos de amilina que incluyen aquellos de la fórmula (I) , forman la base de un componente de polipéptido al cual se enlazan una o más porciones de incremento de duración. Opcionalmente a través de un enlazador, para formar un conjugado de polipéptido de amilina. Asi, el componente de polipéptido sirve como una plantilla ("plantilla de polipéptido") al cual se fija, de preferencia por fijación covalente, una o más porciones de incremento de duración. El enlace de la porción de incremento de duración al componente polipéptido puede ser a través de un enlazador como el descrito en la presente. Como alternativa, el enlace de la porción de incremento de duración al componente de polipéptido puede ser por medio de un enlace covalente directo. La porción de incremento de duración puede ser un polímero hidrosoluble como el descrito en la presente. En algunas modalidades, una pluralidad de porciones de incremento de duración son fijadas al componente polipéptido, en cuyo caso cada enlazador a cada porción de incremento de duración se selecciona independientemente de los enlazadores descritos en la presente.

Los análogos de amilina útiles como componentes de polipéptido descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, los compuestos mostrados en los residuos 1-37 de la fórmula (I) provista en la siguiente tabla 3. A menos que se indique lo contrario, todos los péptidos descritos en la presente, incluyendo péptidos que tienen una secuencia expresamente proporcionada, se contemplan en formas tanto carboxilato libre como amidada.

Tabla 3 Polipéptidos componentes útiles en los compuestos descritos en la presente Los términos "enlazador" y similares^ en el contexto de fijación de porciones de incremento de duración a un componente polipéptido en un conjugado de polipéptido de amilina descrito en la presente, significan una especie divalente (-L-) unida covalentemente a su vez a un componente polipéptido que tiene una valencia disponible para unión y a una porción de incremento de duración que tiene una valencia disponible para unión. El sitio de unión disponible en el componente polipéptido es convenientemente un residuo de cadena lateral (por ejemplo, lisina, cisteina, ácido aspártico y homólogos de los mismos) . En algunas modalidades, el sitio de unión disponible en el componente polipéptido es la cadena lateral de un residuo de lisina o cisteina. En algunas modalidades, el sitio de unión disponible en el componente polipéptido es la amina N-terminal. En algunas modalidades, el sitio de unión disponible en el componente polipéptido es el c.arboxilo C-terminal. En algunas modalidades, el sitio de unión disponible en el componente polipéptido es un átomo de esqueleto del mismo. Según se usa en la presente, el término "residuo de aminoácido de enlace" significa un aminoácido dentro de los residuos 1-37 de la fórmula (I) a la cual se fija una porción de incremento de duración, opcionalmente a través de un enlazador.

En algunas modalidades, se proporcionan compuestos que tienen un enlazador que enlaza covalentemente un componente péptido con una porción de incremento de duración.

El enlazador es opcional, es decir, cualquier enlazador puede ser simplemente un enlace. En algunas modalidades, el enlazador es fijado en una cadena lateral del componente polipéptido. En algunas modalidades, el enlazador es fijado a un átomo de esqueleto del componente polipéptido.

En otro aspecto, se proporciona un conjugado de polipéptido de amilina, el cual es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110, o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y el residuo de aminoácido en la posición 2 a 37 ha sido sustituido con un residuo de lisina o residuo de cisteina y en donde el residuo de lisina o residuo de cisteina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador, en donde la numeración de aminoácidos se conforma a la numeración de aminoácidos en SEQ ID NO: 110.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina, el cual es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde el residuo de aminoácido en cualquiera de la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1'4, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 38, 29, 30, 31, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ó 37 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde un residuo de aminoácido en cualquiera de las posiciones 21, 24-29 ó 31 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y n donde un residuo de aminoácido en la posición 21 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde un residuo de aminoácido en la posición 24 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol , opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el- residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde un residuo de aminoácido en la posición 25 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde un residuo de aminoácido en la posición 26 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

' En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde un residuo de aminoácido en la posición 27 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde un residuo de aminoácido en la posición 28 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y. en donde un residuo de aminoácido en la posición 29 es sustituido con un residuo de lisina y .en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de polipéptido de amilina que es un derivado de pramlintida con SEQ ID NO: 110 o un análogo del mismo, en donde el residuo de aminoácido en la posición 1 está ausente (es decir, des-Lys1) y en donde un residuo de aminoácido en la posición 31 es sustituido con un residuo de lisina y en donde el residuo de lisina está enlazado a un polímero de polietilenglicol, opcionalmente por medio de un enlazador.

En algunas modalidades, la porción de incremento de duración es un polímero hidrosoluble. Un ¡ "polímero hidrosoluble" significa un polímero que es suficientemente soluble en agua bajo condiciones fisiológicas de, por ejemplo, temperatura, concentración iónica y similares, como se conoce en la técnica, como para ser útil para los métodos descritos en la presente. Un polímero hidrosoluble puede incrementar la solubilidad de un péptido u otra bipmolécula a la cual este polímero hidrosoluble sea unido. De hecho, esta fijación se ha propuesto como un medio para mejorar la vida circulante, solubilidad en agua y/o antigenicidad de las proteínas administradas, in vivo. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,179,337; solicitud de E.U.A. publicada No. 2008/0032408. Muchos polímeros hidrosolubles diferentes y químicas de unión han sido usadas hacia esta meta, tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), y similares. ' En algunas modalidades, la porción de incremento de duración enlazada incluye un polietilenglicol. Polietilenglicol ("PEG") ha sido usado en esfuerzos por obtener polipéptidos terapéuticamente útiles. Véase, por ejemplo, Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6: 150-165; Mehvar, R., 2000, J. Pharm. Pharmaceut. Sci . , 3:125-136. Como se aprecia por alguien de capacidad en la técnica, el esqueleto de PEG [ (CH2CH2-0-) n, n: número de monómeros de repetición] es flexible y anfifílico. Sin desear ser limitados por ninguna teoría o mecanismo de acción, se cree que la molécula o porción de PEG tipo cadena larga es fuertemente hidratada y en rápido movimiento cuando está en un medio acuoso. Este movimiento rápido se cree qué causa que el PEG sea barrido a un gran volumen e impida el acercamiento e interferencia de otras moléculas. Como resultado,, cuando se fija a otra entidad química (tal como un 'péptido), las cadenas del polímero PEG pueden proteger esta entidad química contra la respuesta inmune y otros mecanismos de depuración. Como resultado, la pegilación puede llevar a eficacia de fármaco mejorada y seguridad al optimizar la farmacocinética, incrementar la biodisponibilidad y reducir la inmunogenicidad y frecuencia de dosificación. "Pegilación" se refiere en el sentido común a la conjugación de una porción PEG con otro compuesto. Por ejemplo, la fijación de PEG ha mostrado proteger a las proteínas contra proteólisis. Véase, por ejemplo, Blomhoff, H. K. et al., 1983, Biochim Biophys Acta, 757: 202-208. A menos que se indique expresamente lo contrario, los términos "PEG", "polímero de polietilenglicol" y similares se refieren a polímero de polietilenglicol y derivados de los mismos, incluyendo metoxi-PEG (mPEG) .

Se ha usado una variedad de medios para fijar porciones de polímero tales como PEG y polímeros relacionados con grupos reactivos encontrados en la proteína. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,179,337; patente de E.U.A. NO. 4,002,531; Abuchowski et al., 1981, en "Enzymes as Drugs", J. S. Holcerberg and J. Roberts, (Eds.), pp. 367-383, Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6: 150-165. El uso de PEG y otros polímeros para modificar proteínas ha sido descrito. Véase, por ejemplo, Cheng, T.-L. et al., 1999m, Bioconjugate Chem. , 10:520-528; Belcheva, N. et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:932-937; Bettinger, T. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9:842-846; Huang, S.-Y. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9:612-617; Xu, B. et al. 1998, Langmuir, 13:2447-2456; Schwarz, J. B. et al., 1999, J. ñmer. Chem. Soc, 121: 2662-2673; Reuter, J. D. et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:271-278; Chan, T.-H. et al., 1997, J. Org. Chem., 62:3500-3504. Los sitios de fijación típicos en las proteínas incluyen grupos amino primarios, tales como aquellos en residuos de lisina o en el N-terminál, grupos tiol, tales como aquellos en cadenas laterales de cisteína, y grupos carboxilo, tales como aquellos en residuos de glutamato o aspartato o en el extremo C. Los sitios de fijación comunes son a los residuos de azúcar de glicoproteínas , cisteínas o al N-terminal y lisinas del polipéptido objetivo. Los términos "pegilado" y similares se refieren a la fijación covalente de polietilenglicol a un polipéptido u otra biomolécula, opcionalmente a través de un enlazador como el descrito en la presente y/o como se conoce en la técnica.

En algunas modalidades, una porción de PEG en un conjugado de polipéptido de amilina descrito en la presente tiene un peso molecular nominal dentro de un intervalo especificado. Como es común en la técnica, el tamaño de una porción de · PEG es indicado por referencia al pesó molecular nominal, provisto típicamente en kilodaltones (kD). El peso molecular se calcula de una variedad de maneras conocidas en la técnica, incluyendo el número, peso, viscosidad y peso molecular promedio "Z". Se entiende que los polímeros, tales como PEG y similares, existen como una distribución de pesos moleculares alrededor de un valor promedio nominal.

Ejemplos de la terminología para peso molecular para PEGs, el término "mPEG40KD" se refiere a un polímero de metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular nominal de 40 kilodaltones. La referencia a PEGs de otros pesos moleculares sigue esta convención. En algunas modalidades, la porción de PEG tiene un peso molecular nominal en el intervalo de 10-100 KD, 20-80 KD, 20-60 KD o 20-40 KD. En algunas modalidades, la porción de PEG tiene un peso molecular nominal de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o incluso 100 KD. De preferencia, la porción de PEG tiene un peso molecular de 20, 25, 30, 40, 60 u 80 KD.

Las moléculas de PEG útiles para derivación de polipéptidos se clasifican típicamente en lineales, ramificadas y las clases Warwick (es decir, polyPEG®) de PEGs, como se conoce en la técnica. A menos que se indique expresamente lo contrario, las porciones de PEG descritas aquí son PEGs lineales. Además, los términos "ramificado de dos brazos", "en forma de Y" y similares se refieren a porciones de PEG ramificadas, como se conoce en la técnica. El término "Warwick" en el contexto de PEGs, también conocido como PEGs de "peine" o "tipo peine" se refiere á una variedad de PEGs de varios brazos unidos a un esqueleto, típicamente poli (metacrilato) , como se conoce en la técnica. Con respecto a la nomenclatura que incluye las convenciones empleadas en la tabla provista en la presente, ausente una indicación de lo contrario, una porción de PEG está unida al esqueleto del péptido. Por ejemplo, Comp 119 es el resultado de la conjugación de mPEG40KD al nitrógeno N-terminal de Comp 101. En forma similar, Comp 120 es el resultado de la conjugación de mPEG4 OKD al nitrógeno N-terminal de Comp 102. Las abreviaturas de una sola letra estándares para aminoácidos pueden ser usados, al igual que las abreviaturas de tres letras estándares. Por ejemplo, Comp 124 es un análogo de Comp 110 en donde el residuo en la posición 26 de Comp 109 es sustituido por lisina, y la funcionalidad amina pendiente de lisina 26 (es decir, K26) se conjuga con una porción PEG40KD. Compuestos ejemplares se proporcionan en la siguiente tabla 4.

Tabla 4 Compuestos pegilados Las amilinas y análogos de amilina a los cuales se fija una porción química son derivados de amilina. Los derivados de amilina pueden constituir amilinas a las cuales una modificación química haya sido hecha de uno o más de sus grupos laterales de aminoácido, átomos de carbono a, grupo amino terminal o grupo ácido carboxilico terminal. Una modificación química incluye, pero no está limitada a, fijar una o más porciones químicas, crear nuevos enlaces y retirar una o más porciones químicas. Las modificaciones en los grupos laterales de aminoácido incluyen, sin , limitación, alquilación, acilación, formación de éster, formación de amida, acoplamiento de maleimida, acilación de grúpos e-amino de lisina, N-alquilación de arginina, histidina' o lisina, alquilación de grupos de ácido carboxilico glutámico o aspártico, y desamidación de glutamina o aspa agina. Las modificaciones de la terminal amino incluyen, sin ^limitación, las modificaciones desamino, N-alquilo inferior, Ni-di-alquilo . inferior y N-acilo. Las modificaciones de la terminal amino incluyen, sin limitación, las modificaciones desamino, realquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo, tales como alquiladlos, alquilacilos ramificados, alquilaril-acilos . ¦ Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de amida, álquilamida inferior, dialquilamida, arilamida, alquilarilamida y éster alquílico inferior. Alquilo inferior es alquilo, de C1-C4. Además, - uno o más grupos laterales, o grupos terminales, pueden ser protegidos por grupos protectores conocidos por el químico sintético de capacidad ordinaria. El carbono a de un aminoácido puede ser mono- o dimetilado.

Los derivados de amilina incluyen amilinas y análogos de amilina conjugados a una o más moléculas de polímero hidrosoluble, tales como polietilenglicol ("PEG"), como las descritas arriba, o cadenas de ácido graso de varias longitudes (por ejemplo, estearilo, palmitoilo, octanoilo) , mediante la adición de poliaminoácidos , tales como poli-his, poli-arg, poli-lys, y poli-ala,, o mediante la adición de sustituyentes de molécula pequeña incluyen alquilos cortos y alquilos restringidos (por ejemplo, ramificados, cíclicos, fusionados, adamantilo) , y grupos aromáticos. En algunas modalidades, las moléculas de polímero hidrosoluble tendrán un peso molecular que varíe de aproximadamente 500 Daltones a alrededor de 60,000 Daltones. Véase, por ejemplo, publicaciones de patente de PCT WO 2007/104789, WO 2009/034119 y WO 2010/046357 para derivados de amilina adecuados para usarse como agentes antiobesidad en combinación con los polipéptidos manipulados de la invención.

Estas conjugaciones de polímero' se pueden presentar singularmente en la N-terminal o C-terminal o en las cadenas laterales de residuos de aminoácido dentro de la secuencia de una amilina o análogo de amilina como el descrito en la presente. Como alternativa, puede haber varios sitios de derivación a lo largo de la secuencia de aminoácidos de esta amilina o análogo de amilina. La sustitución de uno o más aminoácidos con lisina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteina puede proporcionar sitios de derivación adicionales. En algunas modalidades, una anilina o análogo de anilina puede ser conjugado a una, dos o tres moléculas de polímero.

En algunas modalidades, las moléculas de polímero hidrosoluble son enlazadas a un grupo amino, carboxilo o tiol, y pueden ser enlazadas' por extremos N o C, o en las cadenas laterales de lisina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteina. Como alternativa, las moléculas de polímero hidrosoluble pueden ser enlazadas con grupos de diamina o dicarboxílieos . En algunas modalidades, una amilina o análogo de amilina se conjuga a una, dos o tres moléculas de PEG a través de un grupo épsilon amino en un aminoácido de lisina.

Se ha descubierto sorprendentemente que los polipéptidos manipulados de la invención proporcionan efectos antiobesidad sinérgicos benéficos tanto a sujetos moderadamente obesos (B I igual a o mayor que 30) como severamente obesos (BMI igual a o mayor que 35) cuando se administran en combinación con ciertos otros compuestos antiobesidad. Como se describió anteriormente en, por ejemplo, solicitud de E.U.A. publicada No. 2008/0207512, se ha encontrado que un estado de resistencia a leptina existe en sujetos obesos. Véase también, por ejemplo, Tenenbaum, D., HHMI Bulletin, pp. 25-27 (marzo de 2003); Chicurel, M . , Nature, vol. 404, pp. 538-540 (2000); Scarpace et al., Diabetalogia, vol. 48, pp. 1075-1083 (2005); y Bays et al., Obesity Research, vol. 12(8), pp. 1197-1211 (2004).. Esta resistencia a leptina, caracterizada al menos en parte por la presencia de niveles de leptina en suero anormalmente altos en sujetos obesos, hace a estos sujetos incapaces de responder efectivamente a leptina, ya sea administrada endógena o exógenamente . Se había encontrado previamente que esta resistencia a leptina podría ser superada en sujetos moderadamente obesos, con una terapia de combinación que incluía una leptina (por ejemplo, metreleptina ) y ciertos otros compuestos antiobesidad. Véase, por ejemplo, solicitud de E.U.A. publicada No. 2008/0207512. Se había encontrado además que los efectos de antiobesidad sinérgicos de la terapia de combinación de leptina están ausentes en sujetos de alto BMI severamente obesos, presuntamente debido a una severa resistencia a leptina. Los inventores han descubierto sorprendentemente que los compuestos manipulados de la invención son capaces de superar una resistencia a leptina incluso severa cuando se administran en combinación con ciertos otros compuestos antiobesidad. En consecuencia, la invención también proporciona métodos para tratar obesidad y condiciones, trastornos y enfermedades relacionados con obesidad en sujetos, incluyendo sujetos de alto BMI, mediante la administración de al menos dos agentes antiobesidad diferentes, en donde un agente antiobesidad es un polipéptido manipulado de la invención y otro agente antiobesidad es una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina o un derivado de amilina (es decir, un agente de amilina) .

En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar obesidad en sujetos que lo requieran,, que comprenden la administración de un primer agente ant obesidad seleccionado de un polipéptido manipulado de la invención en combinación con un segundo agente antiobesi'dad seleccionado de una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina o un derivado de amilina en donde la administración de los agentes se traduce en un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente solo.

En un aspecto, los métodos de la invención proporcionan un efecto antiobesidad sinérgico entre los agentes administrados. En consecuencia, en ciertas modalidades, la administración de una combinación de agentes antiobesidad se traduce en un efecto, por ejemplo, una reducción en la disponibilidad de nutrientes, reducción en peso corporal, reducción en consumo de alimento, incremento en metabolismo, que es mayor que la combinación de los resultados de la administración del agente antiobesidad solo (monoterapia) .

La "disponibilidad de nutrientes reducida" intenta incluir cualquier medio mediante el cual el cuerpo reduce los nutrientes disponibles para que el cuerpo los almacene como grasa. En otras palabras, reducir la disponibilidad de nutrientes puede ser por medios que incluyan, pero no estén limitados a, reducir apetito, incrementar saciedad, afectar la elección de alimentos/aversión de sabor, incrementar metabolismo y/o reducir o inhibir la absorción de alimento. Ejemplos de mecanismos que pueden ser afectados incluyen vaciado gástrico retrasado o absorción reducida de alimento en los intestinos.

Según se usa en la presente, un "sujeto que lo requiera" incluye sujetos que tienen sobrepeso, obesos o que desean perder peso. Los sujetos obesos incluyen tanto los moderadamente obesos, población de bajo BMI como los severamente obesos, población de alto BMI. Además, los sujetos que son resistentes a insulina, intolerantes a glucosa o tienen cualquier forma de diabetes mellitus (por ejemplo, tipo 1, 2 o diabetes gestacional) pueden beneficiarse de los métodos de la invención.

Por "tasa metabólica" se intenta decir la cantidad de energía liberada/gastada por unidad de tiempo. El metabolismo por unidad de tiempo puede ser estimado a partir del consumo de alimento, la energía liberada como calor u oxígeno usado en los procesos metabólicos. Generalmente es deseable tener una tasa metabólica más alta cuando se desee perder peso. Por ejemplo, una persona con un alto índice metabólico puede ser capaz de gastar más energía (por ejemplo, el cuerpo quema más calorías) para llevar a cabo una actividad que una persona con una tasa metabólica baja para esa actividad.

Según se usa en la presente, "masa magra", o "masa corporal magra" se refiere a músculo y huesoj. La masa corporal magra no necesariamente indica masa libre de grasa. La masa corporal magra contiene un pequeño porcentaje de grasa (casi 3%) dentro del sistema nervioso central (cerebro y médula espinal), médula ósea y órganos internos. La masa corporal magra se mide en términos de densidad. Los métodos para medir la masa grasa y la masa magra incluyen, pero no están . limitados a, pesado bajo el agua, pletismógrafo de desplazamiento de aire, rayos x, barridos DEX, MRIs y barridos CT. En ciertas modalidades, la masa grasa y masa magra se miden usando pesado subacuático como se conoce en la técnica.

Por "distribución de grasa" se intenta decir la ubicación de los depósitos de grasa en el cuerpo. Estas ubicaciones de deposición de grasa incluyen, por ejemplo, depósitos de grasa subcutáneos, viscerales y ectópicos.

Por "grasa subcutánea" se intenta decir el depósito de lípidos justo debajo de la superficie de la ' piel. La cantidad de ' grasa subcutánea en un sujeto puede medirse usando cualquier método disponible para la medición de grasa subcutánea. Los métodos para medir la grasa subcutánea se conocen en la técnica, por ejemplo, aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. 6,530,886, la totalidad de ,1a cual se incorpora en la presente por referencia.

Por "grasa visceral" se intenta decir el depósito de grasa como tejido adiposo intra-abdominal . La grasa visceral rodea órganos vitales y puede ser metabolizada por el hígado para producir colesterol en sangre. La grasa visceral ha estado asociada con riesgos incrementados de afecciones tales como síndrome de ovarios poliquísticos , síndrome metabólico y enfermedades cardiovasculares.

Por "almacenamiento de grasa ectópico" se intenta decir depósitos lípidos dentro y alrededor de tejidos y órganos' que constituyen la masa corporal magra (por ejemplo, músculo esquelético, corazón, hígado, páncreas, ríñones, vasos sanguíneos) . Generalmente, el almacenamiento de grasa ectópico es una acumulación de lípidos fuera de depósitos de tejido adiposo clásicos en el cuerpo.

Según se -usa en la presente, y como sé entiende bien en la técnica, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados benéficos o deseados, incluyendo resultados clínicos. ' "Tratar" o "paliar" una enfermedad, trastorno o afección significa que el grado y/o manifestaciones clínicas indeseables de una afección, trastorno o un estado de enfermedad se reducen y/o el curso de tiempo de la progresión se hace más lento o se aligera, en comparación con ¡no tratar el trastorno. Por ejemplo, para tratar obesidad, una reducción en el peso corporal, por ejemplo, una reducción de al menos 5% en el peso corporal, es un ejemplo de un resultado de tratamiento deseable. Para los efectos de esta invención, los resultados clínicos benéficos ?· deseados incluyen, pero no están limitados a, alivio o reducción de uno o más síntomas, disminución del grado de enfermedad, estado de enfermedad estabilizado (es decir, gue no empeora) , retraso o hacer más lenta la progresión de la enfermedad, disminución o paliación del estado de enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable . "Tratamiento" también puede significar . prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Además, el tratamiento no necesariamente se presenta por la administración de una dosis, sino gue · comúnmente se presenta después de la administración de una serie de dosis. Así, una cantidad terapéuticamente efectiva, una cantidad suficiente para paliar, o una cantidad suficiente para tratar una enfermedad, trastorno o afección puede administrarse en una o más administraciones.

Según se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad de los compuestos activos en la composición que provocará la respuesta biológica o médica en un tejido, sistema, sujeto o humano que se esté buscando por el investigador, veterinario, doctor médico u otro clínico, que incluye el alivio de los síntomas del trastorno que esté siendo tratado. Los novedosos métodos de tratamiento de esta invención son para trastornos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Según se usa en la presente, el término "cantidad profilácticamente efectiva" significa la cantidad de los compuestos activos en la composición que provocará la respuesta biológica o médica en un tejido, sistema, sujeto o humano que se esté buscando por el investigador, veterinario, doctor médico u otro clínico, para evitar el inicio de obesidad o un trastorno, afección o enfermedad relacionado con obesidad en sujetos en riesgo de obesidad o del trastorno, afección o enfermedad relacionado con obesidad.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para reducir el riesgo de desarrollar trastornos metabólicos, en donde los métodos comprenden administrar al sujeto una combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para reducir el peso de un sujeto.

En algunas modalidades de la invención, los métodos de la invención se usan para incrementar la tasa metabólica de un sujeto, disminuir una reducción en la tasa metabólica de un sujeto, o conservar la tasa metabólica en un sujeto. En ciertas modalidades, la tasa metabólica puede implicar el uso preferencial de la grasa del cuerpo como una fuente de energía sobre tejido corporal magro. En un aspecto, la masa corporal magra no se reduce después de la administración de agentes antiobesidad. En otro aspecto, una reducción en la masa corporal magra se reduce o previene después de la administración de la combinación de agentes antiobesidad. En otro aspecto más, la masa corporal magra se incrementa después de la administración de la combinación de agentes antiobesidad. Esta preferencia para grasa como la fuente de energía puede determinarse al comparar la cantidad de tejido graso con tejido corporal magro, evaluada al medir el peso corporal total y contenido de grasa al inicio y fin del periodo de tratamiento. Un incremento en la tasa metabólica es un nivel más alto del uso de calorías u otra fuente de energía por un · sujeto sobre un periodo de tiempo en comparación con el nivel de uso de calorías u otra fuente de energía por el sujeto sobre otro periodo de tiempo bajo condiciones sustancialmente similares o idénticas sin la administración de la combinación de agentes antiobesidad. En ciertas modalidades, · la tasa metabólica se incrementa al menos aproximadamente 5% en un sujeto, en otras modalidades, la tasa metabólica se incrementa al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o 35% en un sujeto en comparación con el nivel de uso de calorías u otra fuente de energía por el sujeto sobre otro periodo de tiempo bajo condiciones sustancialmente similares o idénticas sin la administración de la combinación de agentes antiobesidad. El incremento en la tasa metabolica puede ser medido usando un calorímetro respiratorio, por ejemplo. Una cantidad efectiva de los agentes antiobesidad usados en estas modalidades es una cantidad de cada agente efectiva para incrementar la tasa metabolica en un sujeto cuando se administre en combinación en comparación con un sujeto que no reciba los agentes o sólo uno de los agentes.

En otra modalidad, se proporciona un método para reducir una disminución en la tasa metabolica en un sujeto. Esta disminución en la tasa metabolica puede ser el resultado de cualquier condición o régimen nutricional o físico que lleve a una reducción en la tasa metabolica, por ejemplo, debido a una dieta de calorías reducida, una dieta restringida o pérdida de peso. Una dieta restringida incluye tolerancias o prohibiciones, o ambas en los tipos de alimento o las cantidades de alimento o ambos permitidos en una dieta, no necesariamente a base de calorías. Por ejemplo, como en las dietas individuales, el cuerpo se compensa con una tasa metabolica reducida con base en el consumo calórico más bajo. En esencia, el cuerpo sub-regula la necesidad de alimento, subsistiendo de esta manera con menos alimento. Al continuar la dieta, el umbral para el consumo calórico es reducido. Cuando se ha concluido la dieta, el individuo típicamente gana peso mientras come una dieta normal debido al umbral de consumo calórico reducido y tasa metabólica bas'al inferior (NIH Technology Assessment Conference Panel (1992) Ann. Intern. Med. 116:942-949; Wadden (1993) Ann. Intern. Med. 119:688-693). En un aspecto, se proporciona un método para reducir la pérdida de tasa . metabólica en un sujetjo, en donde la pérdida de tasa metabólica es el resultado de una dieta baja en calorías o pérdida de peso. Al usar este método, la reducción del sujeto de la tasa metabólica se reduce en al menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en un sujeto. Por estos métodos, puede ser deseable administrar la combinación de agentes antiobesidad en el momento en que la condición1 o régimen nutricional o físico se inicie lo cual lleve a una pérdida o reducción en la tasa metabólica. Sin embargo, también se contempla que la administración de los agentes 1 se inicia antes de que se inicie la condición o régimen nutricional o físico. En un caso, la tasa metabólica se mide ! usando un calorímetro respiratorio. Una cantidad efectiva de los agentes antiobesidad usados en esta modalidad es una cantidad de cada agente efectiva para disminuir la reducción de la tasa metabólica en un sujeto cuando se administre en combinación.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para inducir mesetas metabólicas, en donde un método , comprende administrar cantidades efectivas de agentes antiobesidad en combinación a un sujeto. En ciertas modalidades; el sujeto está perdiendo peso, o ha perdido peso, por ejemplo, debido a una dieta de calorías reducidas, incremento de ejercicio o una combinación de los mismos. Por "meseta metabólica" se intenta decir intervalos de tiempo de tasa metabólica uniforme mientras el cuerpo se ajusta a cambios en' la entrada calórica o de energía. Los cambios en la entrada , calórica o gasto pueden ser el resultado de, por ejemplo,' dietas de calorías reducidas o actividad física incrementada.- Estas mesetas pueden observarse, por ejemplo, durante un régimen de pérdida de peso cuando la pérdida de peso se haga más lenta o se detenga. En ciertas modalidades, un método de la presente invención reduce la duración de una meseta metabólica en un sujeto en comparación con la duración de mesetas metabólicas en un sujeto de otra manera idéntico durante el mismo periodo de tiempo bajo condiciones sustancialmente similares o idénticas sin la administración de la combinación de los agentes antiobesidad. En otras .modalidades, un método de la presente invención reduce la frecuencia de mesetas metabólicas en comparación con la frecuencia de mesetas metabólicas en un sujeto de otra manera idéntico durante el mismo periodo de tiempo bajo sustancialmente condiciones similares o idénticas sin la administración de la combinación de agentes antiobesidad. En otras modalidades más, ,un método de la presente invención retrasa el inicio de una meseta metabólica en comparación con el inicio de una meseta metabólica en un sujeto de otra manera idéntico durante el mismo periodo de tiempo bajo condiciones .sustancialmente similares o idénticas sin la administración de la combinación de agentes antiobesidad. En ciertas modalidades, las mesetas metabólicas se identifican por periodos gráficos de pérdida de peso reducida o ninguna. En ciertas modalidades, al menos una meseta metabólica es reducida. En otras modalidades, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez mesetas metabólicas son reducidas. En otro aspecto, las mesetas metabólicas se retrasan un día en comparación con un sujeto a quien no se le administró la combinación de agentes antiobesidad bajo condiciones idénticas o similares. En otros aspectos, las mesetas metabólicas se retrasan 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 10 días, 2 semanas o 3 semanas en un sujeto.

En otras modalidades más, se proporciona un método para preservar la tasa metabólica en un sujeto. En ciertas modalidades, el sujeto puede estar en riesgo de perder la tasa metabólica, por- ejemplo, debido al inicio de una dieta reducida en calorías, dieta restringida o pérdida de peso anticipada. Una conservación de la tasa metabólica es un mantenimiento del nivel del uso de calorías u otra fuente de energía por un sujeto durante un periodo de tiempo en comparación con el nivel de uso de calorías u otra fuente de energía por un sujeto de otra manera idéntico durante el mismo periodo de tiempo bajo condiciones sustancialmente similares o idénticas sin la administración de la combinación de agentes antiobesidad. En un aspecto, la tasa metabólica se mantiene dentro de 15% de la tasa metabólica del sujeto antes del inicio del evento que resulta en la reducción de tasa metabólica. En otros aspectos, la tasa metabólica se mantiene dentro de 10%, dentro de 7%, dentro de 5%, dentro de 3% o menos de la tasa metabólica del sujeto. En un aspecto, la combinación de agentes antiobesidad se administra al inicio de una dieta de calorías reducidas, dieta restringida o régimen de ejercicio.

Las tasas metabólicas pueden ser evaluadas usando cualquier método adecuado para determinar estas velocidades, por ejemplo al usar un calorímetro respiratorio. Estos métodos y dispositivos para ensayar tasas metabólicas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,572,208, 4,856,531, 6,468,222, 6,616,615, 6,013,009 y 6,475,158. Como alternativa, la tasa metabólica de un animal puede ser evaluada al medir la cantidad de tejido magro contra tejido graso catabolizado por el animal después del periodo de dieta. Así, el peso corporal total y contenido de grasa pueden medirse al final del periodo dietario. En ratas, un método frecuentemente usado para determinar la grasa corporal total es retirar quirúrgicamente y pesar la almohadilla de grasa retroperitoneal, un cuerpo de grasa ubicado en el retroperitoneo, el área entre la pared abdominal posterior y el peritoneo parietal posterior. El peso de la almohadilla se considera directamente relacionado con el porcentaje de grasa corporal del animal. Ya que la relación entre el peso corporal y grasa corporal en ratas es lineal, animales obesos tienen un porcentaje de grasa corporal correspondientemente más alto y peso de almohadilla de grasa retroperitoneal.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para reducir la masa de grasa al incrementar la tasa metabólica de un sujeto, en donde los métodos comprenden administrar una combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para reducir la masa de grasa e incrementar la tasa metabólica del sujeto. La masa de grasa puede expresarse como un porcentaje de la masa corporal total. En algunos aspectos, la masa de grasa se reduce en al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20% o al menos' 25% durante el curso del tratamiento. En un aspecto, la masa magra del sujeto no se reduce durante el curso del tratamiento. En otro aspecto, la masa magra del 'sujeto se mantiene o incrementa durante el curso del tratamiento. En otro aspecto, el sujeto está en una dieta de calorías reducidas o dieta restringida. Por "dieta de calorías reducida" se intenta decir que el sujeto está ingiriendo menos calorías al día que cuando se compara con la dieta normal del _ mismo sujeto. En un caso, el sujeto está consumiendo al menos 50 menos calorías al día. En otros casos, el sujeto está consumiendo al menos 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1,000 menos calorías al día.

En ciertas modalidades de la presente invención, se proporciona un método para alterar la distribución de grasa en un sujeto en donde el método comprende administrar una combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para alterar la distribución de grasa del sujeto. En un aspecto, la alteración es un resultado de un metabolismo incrementado de grasa visceral o ectópica, o ambas en el sujeto. En algunas modalidades, el método incluye el metabolismo de grasa visceral o ectópica o ambas a una velocidad de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% o 50% mayor que para grasa subcutánea. En un aspecto, los métodos se traducen en una distribución de grasa favorable. En ciertas modalidades, la distribución de grasa favorable es una relación incrementada de grasa subcutánea a grasa visceral, grasa ectópica o ambas. En un aspecto, el método incluye un incremento en masa corporal magra, por ejemplo, como resultado de un incremento en la masa de células musculares.

En otras modalidades, se proporcionan métodos para reducir la cantidad de grasa subcutánea en un sujeto, en donde el método comprende administrar, -a un sujeto que lo requiera, una combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para reducir la cantidad de grasa subcutánea en el sujeto. En un caso, la cantidad de grasa subcutánea se reduce en un sujeto en al menos aproximadamente 5%. En otros casos, la cantidad de grasa subcutánea se reduce en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% o 50% en comparación con el sujeto antes de la administración de los agentes antiobesidad.

Los métodos descritos en la presente pueden usarse para reducir la cantidad de grasa visceral en un sujeto. En un caso, la grasa visceral se reduce en un sujeto en al menos aproximadamente 5%. En otros casos, la grasa visceral se reduce en el sujeto en al menos aproximadamente , 10%, 15%, 20%, 25%, 30%,, 40% o 50% en comparación con el suljeto antes de la administración de la combinación dé agentes antiobesidad. La gras visceral puede ser medida a ' través de cualquier medio disponible para determinar la cantidad de grasa visceral en un sujeto. Estos métodos incluyen, por ejemplo, tomografia abdominal por medio de barrido CT y MRI. Otros métodos para determinar la grasa visceral.se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 6,864,415, 6,850,797 y 6,487,445.

En ciertas modalidades, se proporciona un método para prevenir la acumulación de grasa ectópica o' reducir la cantidad de grasa ectópica en un sujeto, en donde el método comprende administrar, a un sujeto que lo requiera, una combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para prevenir la acumulación de grasa ectópica o para reducir la cantidad de grasa ectópica en un sujeto. En ún caso, la cantidad de grasa ectópica se reduce en un sujeto en al menos aproximadamente 5% en comparación con el sujeto antes de la administración de la combinación de agentes antiobesidad. En otros casos, la cantidad de grasa ectópica se reduce en un sujeto en al menos aproximadamente 10%, o en al menos aproximadamente 15%, 20%, 25%, 30%, 40% o 50%. Como alternativa, la cantidad de grasa ectópica se reduce proporcionalmente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%,; 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con grasa subcutánea en un sujeto. La grasa ectópica puede ser medida en un sujeto usando cualquier método disponible para medir grasa ' ectópica .

En otras modalidades, se proporcionan métodos para producir una distribución de grasa más favorable en un sujeto, en donde el método comprende administrar a un sujeto una combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para producir una distribución de grasa favorable. En ciertas modalidades, la administración de una combinación de agentes antiobesidad reduce la cantidad de grasa visceral o grasa ectópica, o ambas, en un sujeto. Por ejemplo, la i administración de una combinación de agentes antiobesidad, en donde al menos un agente antiobesidad que actúa · en las estructuras del cerebro frontal implicadas en el consumo de alimento o modulación del peso corporal o ambas en combinación con la administración de al menos un agente antiobesidad que actúa en las estructuras del cerebro posterior implicadas en el consumo de alimento o modulación de peso corporal o ambas. En ciertas modalidades, los métodos reducen de preferencia la cantidad de grasa visceral o ectópica, o una combinación de ambas, sobre la reducción en grasa subcutánea. Estos métodos se traducen en una relación más alta de grasa subcutánea a grasa visceral o grasa ectópica. Estas relaciones mejoradas pueden resultar en un riesgo reducido del desarrollo de enfermedades cardiovasculares, síndrome de ovarios poliquísticos , síndrome metabólico o cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, la grasa ectópica o visceral es metabolizada a una velocidad 5% mayor que la grasa subcutánea. En otras modalidades, la grasa ectópica o visceral es metabolizada a una velocidad al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% mayor que la grasa subcutánea.

En otro aspecto, los métodos de la invención incluyen el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de agentes antiobesidad administrada en combinación con glucocorticosteroides . Los glucocorticosteroides tienen el efecto adverso de incrementar la masa de grasa y reducir la grasa magra. En consecuencia, se contempla que la combinación de agentes antiobesidad puede usarse en conjunto con glucocorticosteroides bajo condiciones en las que el uso de glucocorticosteroides sea benéfico.

En otro aspecto más, los métodos de la invención incluyen el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente antiobesidad, o una combinación de agentes antiobesidad administrada en combinación con un agente terapéutico seleccionado de orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE y QNEXA. En algunas modalidades, los métodos de la invención incluyen el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido manipulado de la invención en combinación con un agente terapéutico seleccionado de orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE y QNEXA. En otras modalidades, los métodos de la invención incluyen el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina o un derivado de amilina en combinación con un agente terapéutico seleccionado de orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE y QNEXA. En otras modalidades, los métodos de la invención incluyen el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto manipulado de la invención en combinación con una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina o un derivado de amilina y un agente terapéutico seleccionado de orlistat, fentermina, topiramato, CONTRAVE y QNEXA.

También se proporcionan métodos para reducir el peso en un sujeto mórbidamente obeso al reducir primero el peso del sujeto a un nivel por debajo de aquél de estar mórbidamente obeso, y luego administrando al sujeto en combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para reducir más el peso del sujeto. Los métodos para reducir el peso de un sujeto a debajo de aquél de obesidad mórbida incluye reducir el consumo calórico, incrementar la actividad física, terapia de fármacos, cirugía bariátrica, tal como cirugía de derivación gástrica, o cualquier combinación de los métodos anteriores. En un aspecto, administrar la combinación de agentes antiobesidad reduce más el peso del sujeto. En otras modalidades, se proporcionan métodos para reducir el índice de masa corporal en un sujeto que tiene un índice de masa corporal de 40 o menos al administrar una combinación de agentes antiobesidad en cantidades efectivas para reducir más el peso del sujeto.

Por reducir el peso se intenta decir que el sujeto pierde una porción de su peso corporal total durante el' curso del tratamiento, ya sea que el curso de tratamiento sean días, semanas, meses o años. Como alternativa, reducir el peso puede definirse como una reducción en la proporción de masa de grasa a masa magra (en otras palabras, el sujeto ha perdido masa de grasa, pero mantenido o ganado masa magra, sin necesariamente una pérdida correspondiente en el peso corporal total) . Una cantidad efectiva de los agentes antiobesidad administrada en combinación en estas modalidades es una cantidad efectiva para reducir el peso corporal del sujeto durante el curso del tratamiento, o como alternativa una cantidad efectiva para reducir el porcentaje de masa de grasa del sujeto durante el curso del- tratamiento. En ciertas modalidades, el peso corporal del sujeto se reduce, durante el curso del tratamiento, en al menos aproximadamente 1%, en al menos aproximadamente 5%, en al menos aproximadamente 10%, en al menos aproximadamente 15%, o en al menos aproximadamente 20%. Como alternativa, el porcentaje de masa de grasa del sujeto se reduce, durante el curso del tratamiento, en al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20% o al menos 25%.

En ciertas modalidades, los métodos para reducir el peso incluyen adherencia mejorada al mantenimiento de peso. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, el restablecimiento de la sensibilidad a leptina logrado por la administración de agentes antiobesidad como los descritos en la presente supera un reto crítico para sujetos obesos. Los métodos de pérdida de peso anteriores, los niveles de leptina pueden aún ser más altos que los normales incluso con un peso corporal reducido, haciendo difícil que los sujetos mantengan la pérdida de peso. Los métodos descritos en la presente incluyen no sólo métodos para reducir el peso, sino también el componente de adherencia mejorado a mantenimiento de peso.

En ciertas modalidades, los métodos para, reducir la disponibi81idad de nutrientes, por ejemplo, reducir peso, en un sujeto comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de los agentes antiobesidad en una dosis de bolo una o más veces al día. Una dosis de bolo es una dosis intermitente de medicina (a diferencia de una infusión continua). A un sujeto se le puede administrar ;una o más dosis de bolo al día. La dosis de bolo puede ser igual no obstante de si se administra al sujeto, o puede aj'ustarse de tal manera que al sujeto se le administre una dosis de bolo más grande en ciertos momentos del día en comparación con otros. La administración de un agente en1 ciertas formulaciones, por ejemplo, formulaciones de liberación prolongada, una dosis de bolo puede administrarse menos frecuentemente, por ejemplo, una vez cada tres días, una vez por semana, dos veces al mes, una vez cada mes. Además, el tiempo entre las dosis de bolo es de preferencia lo suficientemente largo como para permitir que el fármaco administrado en la dosis de bolo anterior se depure del torrente sanguíneo del sujeto.

En otras modalidades, los métodos para r,educir la disponibilidad de nutrientes, por ejemplo, reducir, el peso, en un sujeto, comprenden administrar al sujeto una cantidad efectiva de los agentes antiobesidad en dosis continuas. Por dosis continuas se intenta decir la infusión continua de fármaco mediante, por ejemplo, inyección intravenosa o parche transdérmico . Como alternativa, una dosis continua puede administrarse oralmente en forma de una cápsula o 'tableta de liberación controlada que libera el fármaco en el sistema del sujeto durante un periodo de tiempo. Cuando se administra por una dosis continua, el fármaco se libera durante un periodo de aproximadamente 1 hora, en algunos casos el fármaco se libera durante un periodo de aproximadamente 2, 3^ 4, 5, 6, i 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 ó 24 horas.

Por "administrado en combinación" se intenta decir que los agentes antiobesidad son administrados como una sola i administración, simultáneamente como dosis separadas, o se administran secuencialmente . La administración secüencial se refiere a administrar uno de los agentes antiobesidad ya sea antes o después de un agente antiobesidad. En ciertas modalidades, el primer agente antiobesidad se administra aproximadamente 30 minutos antes o después del por lo menos otro agente antiobesidad, en otras modalidades aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 horas antes o después del por lo menos otro agente antiobesidad. Cualquiera de los agentes antiobesidad administrados puede administrarse como una dosis de bolo o como una dosis continua. 1 I Además, en ciertas modalidades, la administración de los agentes inductores de peso en combinación se traduce en un efecto sinérgico en cualquiera de los aspectos de la invención. Además, en ciertas modalidades, la administración de los agentes inductores de peso en combinación se traduce en una necesidad de dosis más baja por al menos uno de los agentes, con el mismo efecto.

En consecuencia, en una modalidad se describe un método para tratar obesidad o reducir peso corporal en un sujeto que lo requiera, que comprende administrar periféricamente cantidades terapéuticamente efectivas de al menos dos agentes antiobesidad diferentes, en donde al menos un agente antiobesidad es una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina o un derivado de amilina y por lo menos un agente antiobesidad es un polipéptido manipulado que comprende: un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) ; y un primer dominio de hormona de péptido (HD1) seleccionado de una leptina, un análogo de leptina o un fragmento activo del mismo, y el sujeto reduce el peso corporal en al menos 10%, 12%, 15%, 20%, 30%, 40%, , o incluso 50%.

Modalidades adicionales incluyen las siguientes.

Modalidad 1. Un método para tratar obesidad en un sujeto que comprende administrar periféricamente cantidades terapéuticamente efectivas de al menos dos agentes antiobesidad diferentes, en donde al menos un agente antiobesidad es una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina o un derivado de amilina (es decir, un agente de amilina) y por lo menos un agente antiobesidad es un polipéptido manipulado que comprende: un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) y un primer dominio de hormona péptida (HD1) seleccionado de una leptina, : un análogo de leptina o un fragmento del mismo.

Modalidad 2. Un método para reducir peso corporal en un sujeto que comprende administrar periféricamente cantidades terapéuticamente efectivas de al menos dos agentes antiobesidad diferentes, en donde al menos un agente antiobesidad es una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina o un derivado de amilina (es ' decir, un agente de amilina) y por lo menos un agente antiobesidad es un polipéptido manipulado que comprende: un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) y un primer dominio de hormona péptida (HD1) seleccionado de una leptina, un análogo de leptina o un fragmento del mismo.

Modalidad 3. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 ó 2 en donde el por lo menos un f agente de amilina antiobesidad es un agonista de amilina.

Modalidad 4. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 3 en donde el agonista de amilina comprende un análogo o derivado de amilina.

Modalidad 5. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 4 en donde el análogo o derivado de amilina comprende pramlintida. , Modalidad 6. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 5 en donde el análogo o derivado de amilina comprende un compuesto descrito en la tabla 4.

Modalidad 7. El método de acuerdo con cuálquiera de las modalidades 1 a 6 en donde el análogo derivado 'de amilina comprende Des-Lysl- [Lys26 (mPEG40K) ] -pramlintida (SEQ. ID NO: 214) .

Modalidad 8. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 7 en donde el ABD comprende cualquiera de los péptidos seleccionados del grupo que consiste en: LAEAVLANRELDKYGVSDFYSYINRATVEGVHTLIGHILAALP (SEQ ID| NO:38) , LAEA VLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP (SEQ ID NO: 39), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO: 0) , LAEAVLANRELDKYGVSDYYKNI INRATVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO:41), LAEAVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP (SEQ ID NO:42), LAEAVLANRELDKYGVSDYYKLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 3), LAEAVLANRELDKYGVSDFYKLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO :44), LAEAVLANRELDKYGVSDFYSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP (SEQ ID NO: 45), LAEAVLANRELDKYGVSDFYiNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP (SEQ ID NO: 46), LAEAVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP (SEQ ID NO: 7), LAEAVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP (SEQ ID NO: 48), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 49), LAEAKEDAI ELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP ¡(SEQ ID NO: 50), LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISElLAALP ;(SEQ ID NO: 51), y LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO:52) .

Modalidad 9. El método de acuerdo con cualquiera de i las modalidades 1 a 8 en donde el HD1 comprende, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ , ID NO:30, SEQ ID NO:31 , SEQ ID 0:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO:664, SEQ ID NO:665, SEQ ID NO:666, SEQ ID NO:667, SEQ ID NO:668, SEQ ID NO:669, SEQ ID NO:670, SEQ ID NO:671, SEQ ID NO:672, SEQ ID NO:673, SEQ ID NO:674, SEQ ID NO:675, SEQ ID NO:676, y SEQ ID NO: 677. ': Modalidad 10. El método de acuerdo con, cualquiera de las modalidades 1 a 9, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 29.

Modalidad 11. El método de acuerdo con ( cualquiera de las modalidades 1 a 10, en donde el polipéptido manipulado comprende un compuesto descrito en la tabla 2.

Modalidad 12. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11, en donde el polipéptido 1 manipulado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ; ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID 'NO:59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, , SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID ??:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81 , SEQ ID NO:82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID ¦ NO:84, SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91 , SEQ ID NO:92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 , SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, y SEQ ID NO: 107.' Modalidad 13. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 12, en donde el polipéptido manipulado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. 14. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 12, en donde el polipéptido manipulado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.

Modalidad 15. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 14, en donde la cantidad efectiva del agente de amilina y la cantidad efectiva del polipéptido manipulado comprende una cantidad tal que una cantidad más grande de pérdida de peso se logra cuando el agente de amilina se administra en combinación con el polipéptido manipulado al sujeto que la cantidad de pérdida de peso lograda cuando cualquier agente se administra solo.

Modalidad 16. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 15, en donde los dos agentes se administran al mismo tiempo.

Modalidad 17. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 16, en donde los dos agentes se mezclan juntos.

Modalidad 18. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 17, en donde el BMI del sujeto es mayor que 25.

Modalidad 19. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18, en donde el BMI del sujeto es 25 a 35.

Modalidad 20. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 19, en donde el BMI del sujeto es 25 a 40.

Modalidad 21. El método de acuerdo con j cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el BMI del sujeto es 25 a 45. , Modalidad 22. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 21, en donde el BMI del sujeto es 35 a 45.

Modalidad 23. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 22, en donde el BMI del sujeto se reduce a menos de 30.

Modalidad 24. El método de acuerdo con 'cualquiera de las modalidades 1 a 23, en donde el BMI del sujeto se reduce a menos de 25. [ Modalidad 25. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 24, en' donde el BMI del sujeto se reduce a normal.

Modalidad 26. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 25, en donde la pérdida de peso se logra dentro de 4 semanas de tratamiento.

Modalidad 27. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 26, en donde la pérdida de peso se logra dentro de 8 semanas de tratamiento.

Modalidad 28. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 27, en donde la pérdida de peso se logra dentro de 12 semanas de tratamiento.

Modalidad 29. El método de acuerdo con' cualquiera de las modalidades 1 a 28, en donde la pérdida de peso se logra dentro de 20 semanas de tratamiento. \ Modalidad 30. El método de acuerdo con ' cualquiera de las modalidades 1 a 29, en donde la pérdida de peso se logra dentro de 24 semanas de tratamiento.

Modalidad 31. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 30, en donde el sujeto es humano.

Modalidad 32. El método de acuerdo con .cualquiera de las modalidades 1 a 31, en donde el sujeto , es humano obeso. ' Modalidad 33. El método de acuerdo con 'cualquiera de las modalidades 1 a 32, en donde la pérdida de peso se reduce en al menos 10%.

Modalidad 34. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 33, en donde la pérdida de peso se reduce por al menos 12%.

Modalidad 35. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 34, en donde la pérdida de peso se reduce en al menos 15%.

B . Formulaciones Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden formularse con portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables asi como cualesquiera otros adyuvantes y excipientes conocidos de acuerdo con técnicas convencionales tales como aquellas descritas en Remington' s Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Véase también Wang et ;al. (1988) J. oí Parenteral Sci. y Tech., Technical Report No 10, supp. 42:2 S.

En general, los polipéptidos manipulados pueden formularse en una composición farmacéutica estable y segura para su administración a un paciente. Las formulaciones farmacéuticas contempladas para usarse en los métodos de la invención pueden comprender 0.01 a 1.0% (p/v) , en ciertos casos 0.05 a 1.0%, del polipéptido manipulado, aproximadamente 0.02 a 0.5% (p/v) de un regulador de pH de acetato, fosfato, citrato o glutamato que permita u'n pH de la composición final de aproximadamente 3.0 a alrededor de 7.0; aproximadamente 1.0 a 10% (p/v) de un tonificador de carbohidrato o alcohol polihidrico y, opcionalmente, aproximadamente 0.005 a 1.0% (?/v)· de un cpn-servador seleccionado del grupo que consiste en m-cresol, alcohol bencílico, metil, etil, propil y butilparabenos y fenol. Este conservador se incluye generalmente si el péptido formulado va a ser incluido en un producto de usos múltiples. ' En modalidades particulares, una formulación farmacéutica de los presentes polipéptidos manipulados puede contener una gama de concentraciones de los compuestos, por ejemplo, entre aproximadamente 0.01% a alrededor de: 98% p/p, i o entre alrededor de 1 a aproximadamente 98% p'/p, o de I preferencia entre 80% y 90% p/p, o de preferencia entre aproximadamente 0.01% a alrededor de 50% p/p, o más preferiblemente entre alrededor de 10% a aproximadamente 25% p/p en estas modalidades. Una cantidad suficiente de agua para inyección puede usarse para obtener la concentración de solución deseada.

Los agentes tonificadores adicionales tales como cloruro de sodio, asi como otros excipientes 'conocidos, también pueden estar presentes, si se desea. En algunos casos, estos excipientes son útiles en el mantenimiento de la tonicidad total del compuesto. Un excipiente puede ser incluido en las formulaciones actualmente descritas' en varias concentraciones. Por ejemplo, un excipiente puede ser incluido en la escala de concentración de 0.02% a alrededor de 20% p/p, de preferencia entre alrededor de 0.02% y 0.5% p/p, aproximadamente 0.02% a alrededor de 10% p/v, o aproximadamente 1% a alrededor de 20% p/p. Además, de manera similar a las propias formulaciones presentes, un excipiente i puede ser incluido en forma sólida (incluyendo en polvo) , liquida, semisólida o gel.

Las formulaciones farmacéuticas pueden estar compuestas en varias formas, por ejemplo, sólido,1 liquido, I semisólido o liquido. El término "sólido", según seiusa en la presente, intenta abarcar todos los usos normales de este término incluyendo, por ejemplo, polvos y formulaciones liofilizadas . Las formulaciones actualmente descritas pueden ser liofilizadas .

Los términos regulador de pH, solución reguladora de pH y solución de pH regulado, cuando se usan con referencia a concentración de iones de hidrógeno o pH, se refieren a la capacidad de un sistema, particularmente una solución acuosa, para resistir un cambio de pH después de añadir ácido o álcali, o después de la dilución con un solvente. Característica de las soluciones de pH regulado, las cuales sufren pequeños cambios de pH después de la adición de ácido o base, es la presencia ya sea de un ácido débil y una sal del ácido débil, o una base débil , y una sal de la base débil. Un ejemplo del primer sistema es ácido acético y acetato dé sodio. El cambio de pH es ligero siempre y cuando la cantidad de ión de hidronio o hidroxilo añadida no exceda la capacidad del sistema regulador dé pH para neutralizarla.

Como se describe en la presente, una variedad de vehículos líquidos son adecuados para usarse en las formulaciones de polipéptidos manipulados, por ejemplo, agua o una mezcla de solventes acuosos/orgánicos o suspensión.

La estabilidad de una formulación de polipéptidos manipulados para usarse como se describe en la presente es incrementada al mantener el pH de la formulación en un intervalo determinado por métodos conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, el pH de la formulación se mantiene en el intervalo de aproximadamente 3.5 a 5.0, o aproximadamente 3.5 a 6.5, en algunas modalidades alrededor de 3.Í7 a 4.3, o alrededor de 3.8 a 4.2. En algunas modalidades, él pH puede ser de 4.0, alrededor de 5.0, aproximadamente 6.0, alrededor de 7.0, aproximadamente 8.0, alrededor de 9.0 o todavía más alto. En algunas modalidades, el ¦ pH puede estar en el intervalo fisiológico, pH 6-8, de preferencia pH 7-7.6.

En ciertas modalidades, el regulador de ' pH con el polipéptido manipulado es un regulador de pH de acetato (de preferencia a una concentración de formulación ' final de aproximadamente 1-5 a alrededor de 60 mM) , regulador de pH de fosfato (preferiblemente a una concentración de formulación final de aproximadamente 1-5 a alrededor de 30 mM) o regulador de pH de glutamato (de preferencia a una concentración de formulación final de aproximadamente 1-5 a alrededor de 60 mM) . En algunas modalidades, el regulador de pH es acetato (de preferencia a una concentración de formulación final de aproximadamente 5 a alrededor de 30 mM) .

Un estabilizador puede ser incluido 1 en las formulaciones pero no necesariamente se requiere. Sin embargo, si se incluye, un estabilizador útil en la práctica de la presente invención es un carbohidrato o un alcohol polihídrico. Un estabilizador adecuado útil en la práctica de la presente invención es de aproximadamente 1.0 a '10% (p/v) de un carbohidrato o alcohol polihidrico. Los, alcoholes polihidricos y carbohidratos comparten la misma característica en sus esqueletos, es decir, -CHOH-CHOH- , que es responsable de estabilizar las proteínas. Los alcoholes polihidricos incluyen compuestos tales como ' sorbitol, manitol, glicerol y polietilenglicoles (PEGs) . Estos compuestos son moléculas de cadena recta. Los carbohidratos, tales como mañosa, ribosa, sacarosa, fructosa, 'trehalosa, maltosa, inositol y lactosa, por otro lado, soni moléculas cíclicas que pueden contener un grupo ceto o aldehido. Estas dos clases de compuestos han demostrado ser efectivas para estabilizar proteínas contra desnaturalización causada por temperatura elevada y por procesos de congelación-descongelación o liofilización . Los carbohidratos' adecuados incluyen: galactosa, arabinosa, lactosa o cualquier otro l carbohidrato que no tenga un efecto adverso en un paciente diabético, es decir, el carbohidrato no sea metabolízado para formar concentraciones inaceptablemente grandes de glucosa en la sangre. Estos carbohidratos se conocen bien en la técnica como adecuados para diabéticos. Sacarosa y fructosa son adecuados para usarse con el compuesto en aplicaciones no diabéticas (por ejemplo, tratar obesidad) .

En ciertas modalidades, si se incluye un estabilizador, el compuesto se estabiliza con un alcohol polihidrico tal como sorbitol, manitol, inositol, 'glicerol, xilitol, y copolímero de polipropileno/etilenglicol , asi como varios polietilenglicoles (PEG) de peso molecular 200, 400, 1450, 3350, 4000, 6000, 8000 y todavía más altos). anitol es el alcohol polihídrico que se prefiere en algunas modalidades. Otra característica útil de las formulaciones liofilizadas de la presente invención es el mantenimiento de la tonicidad de las formulaciones liofilizadas descritas en la presente con el mismo componente de formulación que sirve para mantener su estabilidad. En algunas modalidades, manitol es el alcohol polihídrico preferido que se usa para este propósito .

La Farmacopea de los Estados Unidos (USP, por sus siglas en inglés) indica que los agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas deben ser añadidos a preparaciones contenidas en recipientes de varias dosis. Deben estar presentes en concentración adecuada en el momento de uso para evitar la multiplicación de microorganismos inadvertidamente introducidos en la preparación mientras se retira una porción de los contenidos con una aguja y jeringa hipodérmica, o usando otros medios invasivos para suministro, tales como inyectores de pluma. Los agentes antimicrobianos deben ser evaluados para asegurar la compatibilidad con todos los demás componentes de la fórmula, y su actividad debe ser evaluada en la fórmula total para asegurar que un agente particular que sea efectivo en una formulación no sea inefectivo en otra. No es poco común encontrar que un agente antimicrobiano particular sea efectivo en una formulación pero no efectivo en otra formulación. 1 Un conservador es, en el sentido farmacéutico o común, una sustancia que previene o inhibe el crecimiento microbiano y puede ser añadida a formulaciones farmacéuticas para este fin para evitar una pudrición consecuente de la formulación por microorganismos. Aunque la cantidad del conservador no es grande, puede no obstante áfectar la estabilidad general del polipéptido. 1 Aunque el conservador para usarse 1 en las composiciones farmacéuticas puede variar de 0.005 a 1.0% (p/v) , en algunas modalidades el intervalo para cada conservador, solo o en combinación con otros, es: alcohol bencílico (0.1-1.0%), o m-cresol (0.1-0.6%), o fenol (0.1- i 0.8%) o combinación de metil (0.05-0.25%) y etil o propil o butil (0.005%-0.03%) parabenos. Los parabenos son ésteres alquílicos inferiores de ácido para-hidroxibenzpico . Una descripción detallada de cada conservador se muestra en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Id.) .

Los polipéptidos manipulados pueden no tener una tendencia a adsorberse sobre el vidrio en un recipiente de vidrio cuando estén en una forma líquida, por lo tanto, podría no requerirse un tensioactivo para estabilizar más la formulación f rmacéutica. Sin embargo, con respecto a compuestos que si tienen esta tendencia cuando están en forma liquida, un tensioactivo debe ser usado en su formulación. Estas formulaciones pueden ser después liofilizadas . Los tensioactivos causan frecuentemente desnaturalización de la proteina, tanto de interrupción hidrófoba como por la separación de puentes de sal. Concentraciones relativamente bajas de tensioactivo pueden ejercer una potente actividad desnaturalizante, debido a las fuertes interacciones entre las porciones tensioactivas y los sitios reactivos en proteínas. Sin embargo, un uso juicioso de esta interacción puede estabilizar las proteínas contra desnaturalización interfacial o superficial. Los tensioactivos que podrían estabilizar más el polippéptido manipulado pueden estar presentes opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 0.001 a 0.3% (p/v) de la formulación total e incluyen polisorbato 80 (es decir, monooleato de polioxietilen (20) sorbitan) , CHAPS® (es decir, 3-[(3-clolamidopropil) dimetilamonio] -1-propansulfonato) , Brij® (por ejemplo, Brij® 35, el cual es éter laurílico de polioxietilen ( 23 )) , poloxámero u otro tensioactivo no iónico.

También puede ser deseable añadir cloruro de sodio u otra sal para ajusfar la tonicidad de la formulación farmacéutica, dependiendo del tonificador seleccionado. Sin embargo, esto es opcional y depende de la formulación particular seleccionada. Las formulaciones pareñterales de preferencia pueden ser isotónicas o sust'ancialmente isotónicas.

Un vehículo preferido para productos pareñterales es agua. Agua de calidad adecuada para administración parenteral puede prepararse ya sea por destilación' o mediante osmosis inversa. Agua para inyección es el vehículo acuoso i preferido para usarse en las formulaciones farmacéuticas.

Es posible que otros ingredientes puedan estar presentes en las formulaciones farmacéuticas. Estos ingredientes adicionales pueden incluir, por ejemplo, agentes humectantes, emulsionantes, aceites, antioxidantes, agentes de volumen, modificadores de tonicidad, agentes 'quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano, gelatina o proteínas) y un zwitterión (por ejemplo, un aminoácido tal comó betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina)'. Además, i soluciones poliméricas, o mezclas con polímeros proporcionan la oportunidad de una liberación controlada del péptido. Estos ingredientes adicionales, por supuesto, no deben afectar adversamente la estabilidad total de la formulación farmacéutica de la presente invención.

Los recipientes también son una parte integral de la formulación de una inyección y pueden considerarse un componente, toda vez que no hay recipiente que sea totalmente inerte, o de alguna manera afecta el liquido qué contiene, particularmente si el liquido es acuoso. Por lo, tanto, la selección de un recipiente para una inyección particular debe basarse en una consideración de la composición del recipiente, asi como de la solución, y el tratamiento al cual será sometido. La adsorción del péptido a la superficie de vidrio del frasco también puede minimizarse, si es ! necesario, mediante el uso de vidrio de borosilicato, por ejemplo, vidrio de borosilicato Wheaton tipo I #33 (Wheaton ,tipo 1-33) o su equivalente (Wheaton Glass Co.) . Otros vendedores de frascos de vidrio de borosilicato y cartuchos similares aceptables para fabricación incluyen Kimbel Glass < Co., West Co., Bunder Glas GMBH y Form a Vitrum. Las propiedades biológicas y químicas del compuesto pueden ser estabilizadas mediante formulación y liofilización en un frasco de suero de borosilicato Wheaton tipo 1-33 hasta una concentración final de 0.1 mg/ml y 10 mg/ml del compuesto en presencia de 5% de manitol, y 0.02% de Tween 80.

Para formulaciones que serán suministradas por inyección, para poder permitir la introducción de una aguja desde una jeringa hipodérmica en un frasco de variás dosis y proporcionar resellado tan pronto como la aguja sea retirada , el extremo abierto de cada frasco se sella de preferencia con un cierre de tapón de caucho mantenido en su lugar por una banda de aluminio.

I I Los tapones para frascos de vidrio, tíales corno, West 4416/50, 4416/50 (cara de teflón) y 4406/40, Abbott 5139 o cualquier tapón equivalente pueden usarse como el cierre para farmacéutico para inyección. Para formulaciones que comprendan agentes antiobesidad peptidicos, estos tapones son compatibles con el péptido asi como con los demás componentes de la formulación. Los inventores también han descubierto que estos tapones pasan la prueba de integridad de tapón cuando se prueban usando patrones de uso en pacientes, por ejemplo, el patrón puede soportar al menos aproximadamente 100 inyecciones. Como alternativa, el péptido puede ser liofilizado en frascos, jeringas o cartuchos para reconstitución subsecuente. Las formulaciones liquidas de la presente invención pueden ser llenadas en cartuchos de una o dos cámaras, o jeringas de una o dos cámaras.

Cada uno de los componentes de la formulación farmacéutica descrita arriba se conoce en la técnica y se describe en PHAR ACEUTICAL DOSAGE FORMS : PARENTERAL MEDICATIONS, vol . 1, 2a edición, Avis et al. Ed., Mercel Dekker, Nueva York, N.Y. 1992, el cual se incorpora por referencia en su totalidad en la presente y para todos los propósitos.

El proceso de fabricación de las formulaciones liquidas anteriores implica generalmente etapas de mezclado, filtración estéril y llenado. El procedimiento de mezclado incluye disolución de ingredientes en un orden especifico (conservador seguido por estabilizador/agentes de tonicidad, reguladores de pH y péptidos) o disolución al mismo tiempo.

Las formulaciones alternativas, por ejemplo, no parenterales, pueden no requerir esterilización. Sin embargo, si se desea o es necesaria la esterilización, puede usarse cualquier proceso de esterilización adecuado en el ' desarrollo de la formulación farmacéutica péptida de la presente invención. Los procesos de esterilización típicos incluyen filtración, vapor (calor húmedo) , calor seco, gases (por ejemplo, óxido de etileno, formaldehido, dióxido i de cloro, óxido de propileno, beta-propiolactona, ozono, cloropicrina, ácido peracético, cloruro de bromuro de metilo y similares) , exposición a una fuente de radiación y manejo aséptico. La filtración es el método de esterilización preferido para formulaciones líquidas de la presente invención. La filtración estéril incluye la filtración a través de 0.45 um y 0.22 um (1 ó 2) que puede conectarse en serie. Después de la filtración, la solución se llena en frascos o recipientes adecuados.

En ciertas modalidades, los polipéptidos manipulados descritos en la presente se administran periféricamente en los sujetos. En algunas modalidades, las formulaciones farmacéuticas líquidas de la presente invención están diseñadas para administración parenteral. LaS| rutas de I administración adecuadas incluyen intramuscular, intravenosa, subcutánea, intradérmica, intraarticular , intratecal y similares. En algunas modalidades, la ruta de administración subcutánea es la que se prefiere. En ciertas modalidades, se prefiere también un suministro mucosal. Estas rutas incluyen, pero no están limitadas a, las rutas oral, nasal, sublingual, pulmonar y bucal que pueden incluir la administración del péptido en forma liquida, semisólida o sólida. Para formulaciones que comprendan polipéptidos manipulados, la administración por medio de estas rutas puede requerir sustancialmente más compuesto para obtener los efectos biológicos deseados debido a una biodisponibilidad reducida en comparación con el suministro parenteral. Además, el suministro de liberación controlada parenteral puede lograrse al formar microcápsulas poliméricas, matrices, soluciones, implantes y dispositivos y administrándolos parenteralmente o por medios quirúrgicos. Ejemplos de formulaciones de liberación controlada se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,368,630, 6,379,704 y 5,766,627, las cuales se incorporan en la presente por referencia. Estas formas de dosificación pueden tener una biodisponibilidad más baja debido al atrapamiento de una parte del péptido en la matriz polimérica o dispositivo. Véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 6,379,704, 6,379,703 y 6,296,842, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos.

Los compuestos pueden ser provistos eñ forma de dosis única que contenga una cantidad del polipéptido manipulado que será efectiva en una o varias dosis.' Como se reconocerá por aquellos en el (campo, una cantidad efectiva del polipéptido manipulado variará con muchos factores incluyendo la edad y peso del 'Sujeto, la condición física del sujeto, la afección que será tratada, y otros factores conocidos en la técnica. Una cantidad efectiva de los polipéptidos manipulados también variará con la combinación particular administrada. Como se describe en la presente, la administración de los polipéptidos manipulados en combinación puede permitir que una cantidad reducida de cualquiera de los polipéptidos manipulados administrados sea una cantidad efectiva.

La larga duración de acción del polipéptido manipulado puede proporcionar la duración de acción extendida deseada, tal como administración una vez al día o una vez por semana. La duración de acción puede seleccionarse, por ejemplo, mediante la elección de ABD y su afinidad para albúmina. Aunque no se desea ser limitados por teoría, se cree que la afinidad más alta para albúmina producirá tiempos de circulación más largos proporcionando duración de acción más larga. Cualquiera o ambas farmacodinámica 1 (efectos terapéuticos) y farmacocinética (propiedades del : fármaco) pueden medirse con el tiempo después del suministrp, tal como niveles de fármaco en plasma, glucosa aguda o crónica y/o reducción de HbAlc, niveles de insulina en plasma, ¡ inhibición de consumo de alimento o pérdida de peso.

C . Dosis efectivas Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente incluyen composiciones en las que el ingrediente activo está contenido en una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, en una cantidad efectiva para; lograr su propósito deseado. La cantidad efectiva real ; para una | aplicación particular dependerá, entre otros, de la afección que esté siendo tratada. Por ejemplo, cuando se administran i en métodos para tratar diabetes, estas composiciones contendrán una cantidad de ingrediente activo efeptiva para lograr el resultado deseado (por ejemplo, reducir la glucosa en sangre en ayunas en un sujeto) . Cuando se administran en métodos para tratar obesidad, estas composiciones 'contendrán una cantidad de ingrediente activo efectiva para 1 lograr el resultado deseado (por ejemplo, reducir la masa corporal) .

La dosis y frecuencia (dosis individuales o múltiples) del compuesto administrado pueden variar dependiendo de una variedad de factores, incluyendo ruta de administración; talla, edad, sexo, salud, peso corporal, índice de masa corporal y dieta del receptor; naturaleza y grado de síntomas de la enfermedad que esté siendo tratada I (por ejemplo, la enfermedad que responda a compuestos descritos en la presente) ; presencia de otras enfermedades u otros problemas relacionados con salud; tipo de tratamiento concurrente y complicaciones de cualquier enfermedad o régimen de tratamiento. Otros regímenes o agentes terapéuticos pueden usarse en conjunto con los : métodos y compuestos de la invención.

Las cantidades terapéuticamente efectivas para usarse en humanos pueden determinarse a partir de modelos animales. Por ejemplo, una dosis para humanos puede formularse para lograr una concentración que1 se haya encontrado efectiva en animales. La dosis en humanos puede ajustarse al monitorear uno o más parámetros fisiológicos, incluyendo pero no limitados a azúcar en sangre y masa corporal, y ajusfando la dosis hacia arriba o hacia abajo, como se describió arriba y se conoce en la técnica.' Las dosis pueden ser variadas dependiendo de las necesidades del paciente y del compuesto que! se esté empleando. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para llevar a cabo una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo. El tamaño de la dosis también será determinado por la existencia, naturaleza y grado de cualesquiera efectos secundarios adversos. Generalmente, el tratamiento es iniciado con dosis más pequeñas, las cuales i son menores que la dosis óptima del , compuesto. Posteriormente, la dosis se incrementa por incrementos pequeños hasta que se alcance el efecto óptimo bajo las circunstancias. En una modalidad de la invención, el intervalo de dosificación es 0.001% a 10% p/v. En otra modalidad, el intervalo de dosificación es 0.1% a 5% p/v. i Sin embargo, las dosis típicas pueden contener desde un límite inferior de aproximadamente 0.1 mg hasta un límite superior de aproximadamente 200 mg del compuesto farmacéutico al día. También se contemplan otros intervalos de dosis tales como 1 mg a l'OO mg del compuesto por dosis, y 3 mg a 70 mg por dosis. Típicamente, la dosis de polipéptidos manipulados con larga duración de acción se administra, po ejemplo, diariamente e incluso una vez por semana. Las [ dosis al día pueden ser suministradas en unidades de dosis individuales, provistas continuamente en un peri'odo de 24 horas o cualquier porción de las 24 horas.

Las cantidades e intervalos de dosificación pueden ser ajustadas individualmente para proporcionar niveles del compuesto administrado efectivos para la indicación clínica particular que se esté tratando. Esto proporcionará un régimen terapéutico que sea conmensurado con la severidad del estado de enfermedad del individuo.

Utilizando las enseñanzas provistas en la presente, un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico efectivo puede ser planeado que no cause toxicidad sustancial y no obstante sea completamente efectivo para tratar los síntomas clínicos demostrados por el paciente particular. Esta planeación debe implicar la elección cuidadosa de compuesto activo al considerar factores tales como potencia del compuesto, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, presencia y severidad de efectos secundarios adversos, modo de administración preferido y el perfil de toxicidad del agente seleccionado.

La sorprendente propiedad de reducción de dosis de los polipéptidos manipulados descritos en la presente, junto con sus sorprendentemente largas vida media en plasma y duración de acción farmacológica, proporciona un agente farmacéutico superior. Las propiedades superiores incluyendo reducción de dosis, permiten dosificación más baja, de esta manera menos efectos secundarios severos y costo de bienes mejorado, y/o formulaciones más económicas y simples para administración una vez al día o una vez por semana no logradas actualmente por los compuestos de origen solos.

D . Toxicidad La relación entre toxicidad y efecto terapéutico para un compuesto particular es su índice terapéutico y se puede expresar como la relación entre LD50 (la cantidad de compuesto total en 50% de la población) y ED50 (la .cantidad de compuesto efectiva en 50% de la población). Los compuestos que exhiben altos índices terapéuticos se prefieren. Los datos de índices terapéuticos obtenidos de ensayos de I cultivos de células y/o estudios en animales pueden usarse para formular una gama de dosis para usarse en humanos. La dosis de estos compuestos descansa preferiblemente dentro i de un intervalo de concentraciones en plasma que incluye la ED5o con poca o ninguna toxicidad. La dosis pu'ede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. Véase, por ejemplo, Fingí et al., En: THE PHARMACOLOGÍCAL BASIS OF THERAPEUTICS, Ch.l, p.l, 1975. La formulación exacta, ruta de administración y dosis pueden seleccionarse por el médico individual en vista de la condición del paciente y el método particular en el cual se usa la composición.

Sin desear ser limitados por ninguna teoría, se cree que la conjugación de un dominio de unión a albúmina ABD con un dominio de hormona como el descrito en la presente, puede proporcionar inmunogenicidad reducida según se juzga por una reducción en la respuesta inmune con relación al dominio de hormona sin conjugación a ABD. Véase, por ejemplo, WO 2009/016043, incorporada en la presente por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. 1 ¡ VII. Ejemplos Ejemplo 1 Recuperación de polipéptido manipulado , Secuencias de proteínas fueron diseñadas y vueltas a traducir usando software comercial para secuencia de ADN para clonación en un vector de éxpresión en E. coli. Las secuencias fueron ya sea obtenidas como oligonuCleótidos y cosidas juntas usando técnicas de amplificación por PCR estándares, o fueron digeridas a partir de construcciones de expresión existentes usando enzimas de restricción i estándares y luego ligadas de nuevo juntas. Las secuencias que i expresaban la proteína de interés fueron puestas en pET45 con I un promotor T7 para expresión inducible. Una ve,z que las construcciones fueron verificadas por secuenciación, el ADN de vector se purificó y transformó en un anfitrión de expresión, típicamente BL21(DE3). Una sola colonia fue seleccionada para crecer un cultivo de partida en 4 mi de medio LB durante ~ 6 horas. Las soluciones de glicerol se prepararon al añadir 100 ul de glicerolf al 80% a ; 900 ul de solución y almacenada a -80°C. Opcionalmente, 500 ul de muestra no inducida se retuvieron para análisis en gel. Un cultivo de 60 mi (medio mágico) se inoculó usando; 60 ul de cultivo de partida en un matraz Thompson de 125 mi y se incubó a 30°C durante la noche. Se removieron 2i50 ul de muestra para análisis. Se centrifugó y se congeló el I I I sedimento celular para procesamiento posterior.

Las células bacterianas fueron cosechadas y posteriormente lisadas para aislar cuerpos de inclusión. Ya que la proteina estaba presente en los cuerpos de' inclusión, éstos fueron solubilizados y la proteina se volvió a doblar a 4C. las proteínas fueron luego separadas usando cromatografía de exclusión de tamaño hasta que sólo una sola banda permaneciera y los niveles de endotoxina fueron aceptables para pruebas in vivo. HPLC Analítica, RP-LC-MS y gél SDS-PAGE se corrieron como medidas de control de calidad en la proteína final. La proteína se distribuyó a 1 alícuotas predeterminadas y se almacenó a -80°C.

Las recuperaciones típicas de pjolipéptido manipulado para los métodos descritos en la presente se proporcionan en la siguiente tabla 5. Sorprendentemente, las recuperaciones observadas para los compuestos y métodos de producción descritos arriba pueden ser significativamente más altas que las recuperaciones observadas con ' especies conjugadas previamente reportadas, por ejemplo, Fc^leptina y similares. Además, el dominio' ABD extraño no afectó adversamente la expresión, recuperación, redoblamiento, producción o solubilidad de los polipéptidos manipulados recuperados, particularmente para los conjugados de -leptina a pesar de las dificultades generalmente recono'cidas en recuperar y manejar leptina. i Tabla 5 Recuperaciones de polipéptidos manipulados Ejemplo 2 Actividad funcional de leptina in vitro Método. Este ensayo mide la señalización de receptor después del tratamiento de células que expresan un receptor de leptina modificado. Muestras de prueba se asumieron a 100% de pureza y se volvieron a solvátar hasta una concentración de ensayo de 10X en regulador 1 de pH de estimulación. Un total de 90 ul de cada compuesto 10X se transfirieron a una placa pp de pocilios profundos y se diluyeron en serie (series de 3 veces) con regulador de pH de estimulación usando el Perkin Elmer Multiprobe® II y programa "MSV_Lep_Func_3-Fold_Dil-Deepwell_96.MPT" . La placa diluida en serie se mezcló en la placa de estimulación de 96 pocilios que contenia 2.5 x 10?5 sedimentos celulares de células Keptin privadas de leptina durante 18 horas, como se conoce en la técnica, usando el programa de prueba MultiMek "MSV_Lep_Func_200ul_Transfer" que transfiere 200 ul de cada uno de los compuestos diluidos y mezcla de las células. En este momento, la placa se selló con una cubierta de placa adhesiva y se puso a 37C durante 30 minutos para permitir la estimulación de pSTAT5. Véase, por- ejemplo, Crouse et al., 1998, J. Biol. Chem., 273:18365-18373. Después de la incubación, la placa de estimulación se centrifugó para volver a sedimentar las células, el sobrenadante se retiró y los sedimentos celulares restantes fueron congelados a -80C (>30 minutos) . Los Usados celulares se hicieron mediante la adición de 100 ul de lx de lisado a los sedimentos celulares descongelados (kit de ensayo de pSTAT5 de Perkin Elmer) con rotación a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los Usados fueron aclarados a 2, 500 rpm durante 20 minutos y examinados en el kit de ensayo de pSTAT5 como 4ul/pocillo en una Proxiplate™ de 384 pocilios de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal dé PSTAT5 (RFU) se determinó usando un lector de placa Packard Fusión a-FP HT puesto en parámetros de lectura alfa. El ensayo se completó en placas Proxiplate™ de 384 pocilios a un volumen total de 11 µ? con valores que representaban la media de n4 pocilios de ensayo por punto de dosis.

Con referencia a la siguiente tabla 6, Cmpds C1-C6 son leptinas ejemplares, análogos de leptina y derivados de leptina, como los descritos en la presente. Específicamente, Comp Cl es SEQ ID NO: 20 como se describe en la presente, Comp C2 es SEQ ID NO: 30 (es decir, A200) . Comp C3 es SEQ ID NO: 32, al cual se le ha fijado una sola porción de polietilenglicol (PEG) de 20 kDa por medio del residuo de cisteína en la posición 78. Los métodos para la conjugación de péptidos y proteínas con PEG como se conocen en la técnica. Comp C4 es un derivado PEGilado de SEQ ID NO: 20, en el cual un solo PEG de 20 kDa ha sido fijado por medio del N-terminal de SEQ ID NO:20. Comp C5 es un derivado de PEG de doble PEGilación de SEQ ID NO: 32, en el cual una sola porción de PEG de 20 kDa ha sido fijada por medio del residuo de cisteína en la posición 78 y una sola porción de PEG de 20 kDa ha sido fijada por medio del N-terminal. Comp C6 es un derivado PEGilado en el cual un solo PEG de 40 kDa ha sido fijado por medio del N-terminal .

Resultados. Como se muestra en la siguiente tabla 6, los polipéptidos manipulados descritos en la presente (por ejemplo, Cmpds 1-4) tienen actividad funcional comparable e incluso superior en el ensayo Obeca STAT5, en comparación con una variedad de leptinas conjugadas.

Tabla 6 Actividad funcional in vitro para leptinas Ejemplo 3 Cambio en peso corporal después de administiración individual Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta de baja grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue de 319 gramos al principio del estudio. Los animales fueron divididos en seis grupos (n=6/grupo) . Cada grupo fue asignado para recibir uno de los siguientes: vehículo; Comp 1 a 2.6 mg/kg en vehículo; Comp 2 a 2.7 mg/kg en vehículo; Comp 4 a 2.7 mg/kg en vehículo; Comp 2 a 10 mg/kg en vehículo. Cada '.animal de prueba recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. El consumo de alimento y cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) se monitorearon durante 14 días, i y los resultados se registraron como se muestra (figuras 1A a IB). Compuestos administrados: Vehículo (cuadro) ; Comp 1 a 2.6 mg/kg (triángulo con punta hacia arriba); Comp 2 a 2.7 mg/kg (triángulo con punta hacia abajo); Comp 4 a 2.7 mg/kg (diamante); Comp C2 a 10 mg/kg ( círculo ) .

Resultados. Como se ilustra en las fig ras 1A a IB, la administración de cada polipéptido manipulado dio como resultado un consumo de alimento y peso corporal reducidos. Todos los compuestos fueron administrados a una dosis equimolar por peso de compuesto total; los compuestos se dieron todos a 120 nmol/kg (es decir, Comp 1 a 2.6 mg/kg; Comp 2 y Comp 4 a 2.7 mg/kg; Comp C2 a 10 mg/kg) . Debe notarse que Comp C2 (es decir, A200) es un dimero de dos porciones, cada porción consistiendo en la región FC de Ig.Gl fusionada a leptina humana. Comp 1 y Comp 2 tienen una actividad similar a Comp C2 que, debido a que es un dimero, realmente tiene dos leptinas por molécula. Aunque la eficacia (peso corporal más bajo) parece ser similar, es claro que la tendencia favorece ambos polipéptidos manipulados sobre Comp C2. Cuando se ve sobre una base por mol de leptina, los polipéptidos manipulados son superior tanto para inhibición ¿le consumo de alimento como para peso corporal, toda vez que Comp C2 tiene 2 moles de leptina para cada complejo dimérico Fc-leptina, mientras que cada mol de porción de ABD-leptina tiene sólo 1 mol de leptina.

Resultados anteriores han demostrado que se requiere aproximadamente 500 ug/kg/dia de un compuesto A500 para llevar a cabo una pérdida de peso de 9-10% después de 7 días cuando se administra mediante' infusión continua a una rata magra. Esto se traduce en 2.5 mg de compuesto de leptina A500 a 5 días y 3.5 mg de compuesto 7 días después. Ya que un compuesto A500 propio es 16067.68 gm/mol y el peso molecular de Comp 2 es -22,510 gm/mol, se anticiparía que se requiere 1.4X mas de la proteína de fusión ABD sobre los 5 días. En su lugar, sólo 1. Ox (2.7 mg/2.5 mg) más de compuesto se dio lo cual indica una propiedad de reducción de dosis sorprendente.

Ejemplo 4 Cambio en peso corporal después de administración individual de Comp 2 Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta baja en grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue 324 gramos al principio del estudio. Los animales fueron divididos en cuatro grupos (n=6/grupo) . Cada grupo fue asignado para recibir uno de los siguientes: vehículo; Comp 2 a 0.3 mg/kg en vehículo; Comp 2 a 1.0 mg/kg en vehículo; Comp 2 a 3.0 mg/kg en vehículo. Cada animal de prueba recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. El consumo de alimento y cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) se monitorearon durante 14 días, y los resultados se registraron como se muestra (figuras 2A a 2B) . Compuestos administrados: vehículo (cuadro); Comp 2 a 0.3 mg/kg (triángulo con punta hacia arriba); Comp 2 a 1.0 mg/kg (triángulo con punta hacia abajo); Comp 2 a 3.0 mg/kg (diamante).

Resultados. Como se ilustra en las figuras 2A a 2B, la administración a cada concentración de polipéptido manipulado Comp 2 dio como resultado consumo de alimento y peso corporal reducidos. Una respuesta de dosis se observa en la figura 2B.

Ejemplo 5 Cambio en peso corporal después de administración , individual de Comp C2 Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una rieta de baja grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue de 324 gramos al principio del estudio. Los animales se dividieron en cuatro grupos (n=6/grupo) . Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes: vehículo; Comp C2 a 1.1 mg/kg en vehículo; Comp C2 a 3.3 mg/kg en vehículo; Comp C2 a 11.1 mg/kg en vehículo. Cada animal de prueba recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. El consumo de alimento y cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) se monitorearon durante 14 días, y los resultados se · registraron como sigue (figuras 3A a 3B) . Compuestos administrados: Vehículo (cuadro); Comp C2 a 1.1 mg/kg (círculo); Comp C2 a 3.3 mg/kg (cuadro); Comp C2 a 11.1 mg/kg (triángulo con punta hacia arriba).1 Resultados. Como se ilustra en las figuras 3A a 3B, la administración a cada concentración del control Comp C2 se tradujo en consumo de alimento y peso corporal reducidos.

Ejemplo 6 Cambio en peso corporal después de administración individual de Comp C6 Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta baja en grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue de 324 gramos al principio del estudio. Los animales fueron divididos en dos grupos (n=6/grupo) . Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes: vehículo; Comp C6 a 2.2 mg/kg en vehículo. Cada animal de prueba recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. El consumo de alimento y cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) fueron monitoreados , y los resultados se registraron como sigue (figuras 4A a 4B) ) . Compuestos administrados: Vehículo (cuadro); Comp C6 a 2.2 mg/kg (triángulo con punta hacia abajo) . 1 Resultados. Como se ilustra en las figuras 4A a 4B, la administración a cada concentración del control Comp C6 se tradujo en consumo de alimento y peso corporal reducidos.

Ejemplo 7 Cambio en peso corporal en ratas DIO Método. Ratas Sprague Dawley propensas a obesidad inducida por dieta (DIO) que promediaban aproximadamente 500 gramos fueron inyectadas IP con compuestos de prueba y control el día 0 y día 7 (n=6 por compuesto) . El compuesto de prueba fue SEQ ID NO: 54 dado a 1.3 mg/kg/semana en, vehículo. El peso corporal y consumo de alimento se midieron - en varios puntos (días 0, 4, 7, 12 y 14 d) durante el periodo de estudio. Compuestos administrados: Vehículo (cuadro,); SEQ ID NO: 54 a 1.3 mg/kg en vehículo (triángulo con punta hacia arriba) .

Resultados. Los resultados, ilustrados en la figura 5, demuestran que la inyección IP a intervalo de una vez por semana se traduce en una pérdida de peso de 3% después de 7 días como se vio previamente a esta dosis. Después de una segunda inyección, las ratas continuaron perdiendo' peso dando como resultado una pérdida de peso corporal corregida por vehículo acumulativa de ~7-8% después de 14 - días. En contraste y sorprendentemente, estudios previos con FC-leptina (leptina A200) sólo han dado como resultado aproximadamente 4% de pérdida de peso 14 días después de una dosis de 5 mg/kg/semana con inyecciones el día 0 y día 7 en un modelo DIO similar. ¡ Ejemplo 8 Detección de polipeptidos manipulados en plasma Método. Ratas Sprague Dawley obesas inducidas por dieta (DIO) que promediaban aproximadamente 483 gramos fueron divididas en cinco grupos, dos de los cuales fueron implantados con bombas osmóticas. Uno de los dos grupos con i bombas osmóticas recibió una infusión subcutánea1 continua (CSI) de vehículo solo; el otro recibió una CSI de SEQ ID NO: 33 (es decir, A500) en vehículo a una dosis de 250 µg/kg/día. Los otros tres grupos fueron tratados como sigue: un grupo recibió inyecciones subcutáneas una vez por semana de vehículo solo los días 0, 7, 14 y 21 del estudio; otro grupo recibió inyecciones subcutáneas una vez por semana de SEQ ID NO: 54 (un polipéptido manipulado con ABD-A500) a una dosis de 1.3 mg/kg en vehículo en los días 0, 7, 14 y 21 del estudio; el grupo restante recibió inyecciones subcutáneas una vez por semana de SEQ ID NO: 54 a una dosis de 3.0 mg/kg en vehículo los días 0, 7, 14 y 21 del estudio. Se tomaron muestras de sangre de cada animal el día 27, que fue el día en que el estudio fue terminado.

Resultados. Los resultados, ilustrados en la figura 6, demuestran que las inyecciones una vez por semana de SEQ ID NO: 54 a 1.3 mg/kg dieron como resultado niveles en plasma que fueron ligeramente más bajos a aquellos logrados mediante infusión continua de SEQ ID NO: 33, y las inyecciones una vez por semana de SEQ ID NO: 54 a 3.0 mg/kg dieron como resultado niveles en plasma que fueron significativamente mayores que aquellos logrados con infusión continua de SEQ ID NO: 33 (compare panel izquierdo con panel derecho; nótese la diferencia en escalas del eje Y de cada panel) .

Ejemplo 9 Cambio en peso corporal después de administración individual de polipéptidos manipulados Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta baja en grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue 330 gramos al principio del estudio. Cada animal de prueba (n=5/grupo) recibió una sola ' inyección subcutánea en tiempo = 0. Los animales fueron divididos en cinco grupos. Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes: vehículo; SEQ ID NO: 54 en vehículo; SEQ ID NO: 56 en vehículo; SEQ ID NO: 58 en vehículo; SEQ ID NO: 59 en vehículo. SEQ ID NOS; 54, 56, 58 y 59 se suministraron cada uno a una dosis de 120 nmol/kg. El porcentaje de cambio en peso corporal para cada grupo se monitoreó durante 14 días, y los resultados se registraron como se muestra (figúra 7).

Resultados. Como se ilustra en la figura 7, cada grupo de animales que recibió una sola inyección de uno de los SEQ ID NOS probados exhibió una pérdida de peso significativa y prolongada a través de la longitud de 14 días del estudio con relación al grupo que recibió vehículo solo.

Ejemplo 10 Cambio en peso corporal después de administración individual de polipéptidos manipulados Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta baja en grasa durante el estudio. El peso corporal promedio fue 330 gramos al principio del estudio. Los animales fueron divididos en seis grupos (n=5/grupo) . Cada animal de prueba recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes: vehículo; SEQ ID NO: 54 en vehículo; SEQ ID NO: 57 en vehículo; SEQ ID NO: 60 en vehículo; SEQ ID NO: 61 en vehículo; SEQ ID NO: 62 en vehículo. SEQ ID NOS; 54, 57, 60, 61 y 62 se suministraron cada uno a una dosis de 120 nmol/kg. El porcentaje de cambio en peso corporal para cada grupo se monitoreó durante 14 días, y los résultados se registraron como se muestra (figura 8) .

Resultados. Como se ilustra en la figura 8, cada grupo de animales que recibió una sola inyección1 de uno de los SEQ ID NOS probados exhibieron reducción significativa y prolongada en peso corporal con relación al grupo que recibió vehículo solo.

Ejemplo 11 Cambio en peso corporal y consumo de alimento después de administración individual de polipeptidos manipulados i Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta baja en grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue de 317 gramos al principio del estudio. Cada animal de prueba (n=7/grupo) recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. Los animales fueron divididos en cuatro grupos. Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes: vehículo; SEQ ID NO: 54 en( vehículo; SEQ ID NO: 63 en vehículo; SEQ ID NO: 64 en vehículo. SEQ ID NOS; 54, 63 y 64 fueron cada uno suministrados a una dosis de 120 nmol/kg. El consumo de alimento y porcentaje de¡ cambio en peso corporal para cada grupo se monitorearon durante 14 días, y los resultados se registraron como se muestra (figuras 9A y 9B, respectivamente) . .

Resultados. Como se ilustra en las figuras 9A y 9B, cada grupo de animales que recibió una sola inyección de uno de los SEQ ID NOS probados exhibió! reducción significativa y prolongada en el consumo dé alimento (figura 9A) y peso corporal (figura 9B) con relación al vehículo solo.

Ejemplo 12 Cambio en peso corporal después de administración individual de polipeptidos manipulados Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta baja en grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue 330 g al principio del estudio. Los animales fueron divididos en seis grupos. Cada -animal de prueba (n = 5/grupo) recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes: vehículo; SEQ ID NO: 54 en vehículo; SEQ ID NO: 67 en vehículo; SEQ ID NO: 68 en vehículo; y SEQ ID NO: 69 en vehículo. SEQ ID NOS; 54, 67, 68 y 69 se suministraron cada uno a una dosis de 120 nmol/kg. El porcentaje de , cambio en peso corporal para cada grupo se monitoreó durante 10 días, y los resultados se registraron como se muestra (figura 10) .

Resultados. Como se ilustra en la figura, 10, cada grupo de animales que recibió una sola inyección de uno de los SEQ ID NOS probados exhibió reducción significativa y prolongada en peso corporal con relación al grupo que recibió vehículo solo.

Ejemplo 13 Cambio en peso corporal de administración individual de polipéptidos manipulados Método. Ratas Sprague Dawley magras fueron mantenidas en una dieta baja en grasa durante el estudio. El peso corporal medio fue 320 gramos al principio del estudio. Los 'animales se dividieron en seis grupos. Cada animal de prueba, (n5/grupo) recibió una sola inyección subcutánea en tiempo = 0. Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes: vehículo; SEQ ID NO: 54 en vehículo; SEQ ID NO: 104 en vehículo; SEQ ID NO: 105 en vehículo; SEQ ID NO: 106 en vehículo; y SEQ ID NO: 107 en vehículo. SEQ ID NOS; 54, 104, 105, 106 y 107 se suministraron cada uno a una dosis de 120 nmol/kg. El cambio en peso corporal para cada grupo se monitoreó durante 9 días, y los resultados se registraron como se muestra (figuras 11A a 11C) .

Resultados. Como se ilustra en las figuras 11A a 11C, cada grupo de animales que recibió una sola inyección de uno de los SEQ ID NOS probados exhibió 1 reducción significativa y prolongada en consumo de alimento (figura 11A) y peso corporal (figuras 11B y 11C) con relación al vehículo solo.

Ejemplo 14 Determinación de la afinidad para polipéptidos de unión a albúmina En este ejemplo, compuesto 2 y compuesto .15 fueron caracterizados para afinidad a diferentes variables de albúmina.

Materiales y métodos i Todos los estudios se llevaron a cabo en1 un sistema i BioRad ProteOn XPR36 usando un chip sensor GLC a 25 grados C. Para acoplamiento de amina el chip GLC fue activado durante 5 minutos usando una mezcla 1:1 de sulfo-NHS/EDC |diluida 30 veces a partir de la solución inicial en agua como1 se muestra a continuación. Cada muestra de albúmina se diluyó a 25 ug/ml en 10 mM de acetato de sodio pH 5.0 y se inyectó durante 5 minutos sobre superficies sensoras separadas. Cada : superficie se bloqueó después con etanolamina 1 M, pH 8.5. Cada albúmina fue acoplada a una densidad de 2000-5000 en unidades de resonancia.

La unión de un polipéptido manipulado, se probó usando 5 nM como la concentración más alta en una serie de I diluciones de tres veces. El regulador de pH de corrida contenia 10 mM de HEPES pH 7.4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA y 0.005% de tween-20. Todas las muestras se probaron usando una serie de diluciones de 3 veces. Cada serie de concentraciones se probó por duplicado. La fase de disociación para la concentración más alta se monitoreó durante 3 horas.

Resultados La KD relativa medida para los polipéptidos manipulados se presenta en la tabla 7 abajo. Los resultados muestran que los polipéptidos de unión a albúmina se asocian con albúminas de suero (SA) con alta afinidad.

Tabla 7 KD de polipéptidos de unión a albúmina a variantes de albúmina Ejemplo 15 Actividad funcional in vitro de leptina en presencia de albúmina En este ensayo, se usó el método descrito en el ejemplo 2, excepto que se añadió albúmina al regulador de pH de estimulación para probar la función de leptina del compuesto 2 en presencia de albúmina. Las albúminas probadas incluyeron 0.1% o 1% de albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés), 1% de albúmina de suero de rata (RSA, por sus siglas en inglés) o 1% de albúmina de suero humana (HSA, por sus siglas en inglés) . La muestra de control fue leptina AIOO con 0.1% de BSA.

Resultados. Como se muestra en la figura 12, no hubo efectos de 1% de albúmina de bovino/rata/humano en la actividad EC50 generada por el compuesto 2 en el ensayo de función de leptina. Los resultados son sorprendentes y muestran que los compuestos terapéuticos son activos incluso cuando se unen a albúmina.

Ejemplo 16 Perfiles farmacocineticos prolongados suministrados por polipéptidos manipulados después de inyección subcutánea en ratas Este estudio se llevó a cabo para evaluar compuesto 2 y compuesto 15 en ratas al comparar su concen ración en sangre contra perfiles en tiempo, es decir, perfiles farmacocinéticos .

Las ratas fueron puestas en grupos de tratamiento. El compuesto 2 se administró subcutáneamente a 30 nmol/kg, 60 nmol/kg, o 120 nmol/kg. Muestras de sangre se tomaron en pre, i 12, 24, 48, 96 y 144 horas post-administración a partir de la vena de la cola lateral. La concentración de compuesto 2 en plasma se midió mediante un método de ensayo inmunoenzimétrico .

El compuesto 15 se administró subcutáneamente a 120 nmol/kg. Se tomaron muestras de sangre en pre, 0.5, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, 102 y 144 horas post-administración a partir de la vena de la cola lateral. La concentración de compuesto 15 en plasma se midió por un método: de ensayo inmunoenzimétrico . i Tanto el compuesto 2 (figura 13) como el compuesto 15 (figura 14) exhibieron perfiles de plasma contra tiempo prolongados.

Ejemplo 17 Efecto de polipéptidos manipulados mediado por receptores de leptina Método. Ratas Sprague Dawley magras y1 ratas ZDF fueron usadas para este estudio. Las ratas ZDF tienen una mutación (fa) que se traduce en un receptor de leptina acortado que no interactúa efectivamente con leptina. El peso corporal medio fue 225 gramos al principio del estudio. Los I animales fueron divididos en dos grupos (n=5/grupo) . Cada grupo fue asignado a recibir uno de los siguientes:' vehículo; Comp 2 a 2.57 mg/kg en vehículo. Cada animal 1 de prueba recibió una sola inyección subcutánea en tiempo 0.; El cambio en peso corporal (% corregido por vehículo) se monitoreó, y los resultados se registraron como se muestra (figuras 15A, 15B) ) . Compuestos administrados: vehículo (círculo ! relleno) ; Comp 2 a 2.7 mg/kg (cuadro lleno) . , Resultados. Como se ilustra en las figuras 15A y 15B, el compuesto 2 no es tan eficaz en ratas ZDF, indicando que sus efectos son mediados por medio de receptores de leptina.

Ejemplo 18 Reducción de dosis con polipeptldos manipulados Este estudio comparó dosis de A500 (¡SEQ ID NO: 33) y compuesto 2 (SEQ ID NO: 54) requeridos para lograr una cantidad similar de pérdida de peso 1 en ratas sensibles a leptina magras. Los resultados se muestran en la figura 16. El compuesto 2 dosificado a 120 nmol/kg/ semana logra -18% de pérdida de peso; corregido por vehículo. Para lograr la misma cantidad de pérdida de peso con ?500 se requirió una dosis de BID de 120 nmol/kg/d o 1680 nmol/kg (120 por inyección x 2 para BID x 7 días) durante el curso de una semana. Sin desear ser limitados por ninguna teoría, esta "reducción 'de dosis" puede ser al menos parcialmente atribuible al 'perfil PK mejorado del compuesto 2 sobre A-500.

Ejemplo 19 Solubilidad de polipéptidos manipulados Como se indica en la siguiente tabla 8, los polipéptidos manipulados descritos en la presente tienen solubilidad sorprendentemente alta a pH neutro.

La solubilidad se midió con el siguiente ensayo: 6-10 mg de proteínas purificadas fueron concentradas a 4°C con unidades de filtro centrífugo (Amicon Ultra-15 o Ultra-4, con límite de peso molecular de 3Kda; Millipore) hasta un volumen de menos de 0.5 mi. Fueron centrifugadas a 14,000 rpm durante 10 minutos a 4°C para remover precipitados y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Las proteínas se dejaron equilibrar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad, luego fueron filtradas con filtros de jeringa de 0.22 mieras (Milex GV; Millipóre) para remover precipitados. La absorbancia a OD280 se midió con un espectrofotómetro NanoDrop y la concentración se calculó usando el coeficiente de extensión molar teórico de la proteína.

Tabla 8 Solubilidad de polipéptidos manipulados Ejemplo 20 Estabilidad de polipéptidos manipulados Como se indica en la siguiente tabla 9, los polipéptidos manipulados descritos en la presente son químicamente estables. Los compuestos se formularon a 1 mg/mL en reguladores de pH de diferente pH. Como se muestra en la tabla 9, los polipéptidos quiméricos tienen buena potencia (tabla 9A) y pureza (tabla 9B) después de dos semanas a 40°C, según se determina por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (HPLC, por sus siglas en inglés) .

Tabla 9A Potencia de polipéptidos manipulados Potencia = Area pico principal de área std Tabla 9B Pureza de polipéptidos manipulados Ejemplo 21 Estabilidad de polipéptidos manipulados Como se muestra en la siguiente tabla 10, los polipéptidos manipulados descritos en la presente son químicamente estables. El compuesto 15 fue formulado a tres concentraciones diferentes en el siguiente regulador de pH: 10 mM de ácido glutámico, 2% de glicina, 1% de sucrosa, 0.01% de Tween 20, pH 4.25 y almacenados a 5°C, 15°C, o 25°C. Como se muestra en la tabla 10, el compuesto 15 es químicamente estable a 10, 20 y 30 mg/mL durante al menos 1 mes a 5-25°C, según se determina por HPLC.

Tabla 10 Estabilidad de polipeptidos manipulados I Ejemplo 22 Estabilidad de polipéptidos manipulados , Como se indica en la siguiente tabla! 11, los polipéptidos manipulados descritos en la presente son físicamente estables. El compuesto 15 se formuló a tres concentraciones diferentes en el siguiente regulador de pH: 10 mM de ácido glutámico, 2% de glicina, 1% de sucrosa, 0.01% de Tween 20, pH 4.25 y se almacenó a 37 °C. Como se muestra en la tabla 11, el compuesto 15 es físicamente estable; a 10, 20 y 30 mg/mL al menos durante 1 mes, según se determina por análisis visual.

Tabla 11 Estabilidad de polipeptidos manipulados, Ejemplo 23 Estabilidad de polipéptidos manipulados < Los polipéptidos manipulados descritos presente son físicamente estables. La tabla 12 muestra lo resultados de la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC por sus siglas en inglés) llevada a cabo en A100, ABD1 HuSeal, y ABD1-A500. Los polipéptidos manipulados muestran muy poca a ninguna auto-asociación a dímero/oligómero, en comparación con A100.

Tabla 12 Estabilidad de polipéptidos manipulados Monómero Dimero Oligómero (Trímero/Tetrámero) Método SEC: Columna - Tosoh TSK Gel G3000 SWxl 7.8 mm x 30 cm (#08541) Fase móvil - 10 m de fosfato de sodio, pH 7.4 + 238 mM de NaCl + 2.7 mM de KC1 Tiempo de corrida - 22 min Velocidad de flujo - 0.8 mL/min Temperatura de columna - 25 °C Temperatura de muestra - 5°C Carga de muestra - 40 ug Detección - 214 nm Ejemplo 24 Sinergia de amilina y leptina está ausente en sujetos de alto BMI Estudios anteriores han descrito que la 'sinergia de I amilina/leptina en ratas que pesaban 500-550 gramos. Después de que se notó una relación inversa de eficacia, y BMI, se probaron los efectos de la combinación en ratas muy obesas (750 gramos) y en ratas muy obesas que fueron restringidas en alimento al intervalo moderadamente obeso (500-550 g) antes de iniciar el tratamiento con fármaco.

En este estudio un grupo de ratas muy obesas (750 g) se dejaron alimentar ad libitum y se trataron con amilina, leptina o la combinación de amilina+leptina . Aunque la amilina fue efectiva, no hubo sinergia evidente con la adición de leptina. Un segundo grupo de ratas muy qbesas (750 g) fue restringida en calorías hasta el intervalo de 500-550 I g en el cual la sinergia fue demostrada previamente . Estos animales empezaron después el tratamiento con amilina/leptina y se dejaron alimentar ad libitum. La figura 17 muestra los resultados del estudio. Una reganancia de peso rápida fue evidente en las ratas tratadas con monoterapia de leptina y vehículo. Cierto mantenimiento de peso se logró con monoterapia de amilina. Ningún mantenimiento de peso adicional se logró con la combinación. Estos descubrimientos sugieren que la falta de sinergia en roedores de "alto BMI" simplemente no puede ser rescatada por una inducción de dieta .

Ejemplo 25 Sinergia de polipéptidos manipulados con agonistas de amilina Este estudio examinó si la administración una vez por semana de amilina de rata PEG (Des-Lysl- [Lys26 (mPEG40K) ] , compuesto 124) seria suficiente para sinergia cuando se coadministraba con ABD1-A500 (compuesto 2). Para comparación, ABD1-A500 también fue co-administrado con amilina de rata infundida (figura 18A) . La figura 18B muestra que aunque la amilina de PEG-rata indujo peso corporal de una manera un poco más lenta y de magnitud más pequeña, la cantidad total de pérdida de peso (y sinergia) es cualitativamente similar a aquella lograda por amilina de rata infundida. La amilina fue administrada a 50 µg/kg/d mediante una minibomba osmótica SC, amilina de PEG-rata fue administrada a 125 nmol/kg una vez por semana y ABD1-A500 se administró a 120 nmol/kg una vez por semana a ratas Sprague Dawley Harían (HSD) obesas inducidas por dieta (DIO) macho de 500 g de peso promedio.

Ejemplo 26 Sinergia de polipéptidos manipulados con agonistas de amilina Este estudio demuestra que una administración una vez por semana de ABDl-HuSeal (compuesto 15) es suficiente para sinergia cuando se co-administra con amilina de rata infundida. Las figuras 19A-19B muestra que la combinación del polipéptido manipulado de amilina infundida ', dio como resultado consumo de alimento más bajo (figura 19A) y pérdida de peso mayor (figura 19B) que los resultados observados para cada agente solo. ABDI-HuSeal se administró a 120 nmol/kg y amilina se administró a 50 ug/kg/d mediante una minibomba osmótica SC a ratas DIO HSD macho de 500 g de peso1 promedio .

Ejemplo 27 Sinergia de polipéptidos manipulados con agonistas de amilina Este estudio muestra que una administración una vez por semana de ABDI-HuSeal (compuesto 15) es suficiente para sinergia cuando se co-administra con una administración de dos veces por semana de amilina de PEG-rata ! (Des-Lysl-[Lys26 (mPEG40K) ] (SEQ. ID NO: 148) , compuesto 124).: La figura 20 muestra que la combinación del polipéptido manipulado y amilina de PEG-rata dio como resultado en mayor pérdida de peso que los resultados observados para cada agente solo. ABDI-HuSeal se administró a 120 nmol/kg y PEG-amilina se administró a 125 nmol/kg a ratas DIO HSD macho de 500 g de peso promedio.

Ejemplo 28 Sinergia de polipéptidos manipulados con agonistas de amilina en una población de alto DMI La figura 21A muestra los resultados de! estudios previos, que describen la sinergia de amilina/leptina en ratas que pesan 500-550 gramos. La figura 21B muestra que esta sinergia no se observa en una población de ratas de alto BMI (peso promedio de 700 g) . La figura 21C muestra que la administración una vez por semana de ABD1-A500 (compuesto 15) es suficiente para sinergia cuando se co-administra con una administración dos veces por semana de amilina de PEG-rata (Des-Lysl- [Lys26 (mPEG40K) ] (SEQ. ID NO:148), compuesto 124) en ratas de alto BMI. ABD1-A500 Se administró a 120 nmol/kg y PEG-amilina se administró a 120 nmol/kg a ratas DIO HSD macho de peso promedio de 700 gramos.

Ejemplo 29 Sinergia de polipéptidos manipulados con agonistas \d& amilina en una población de alto BMI \ Este estudio demuestra que una administración una vez por semana de ABDl-HuSeal (compuesto 15) o: ABD1-A500 (compuesto 2) es suficiente para sinergia cuando se coadministra con amilina de rata infundida a ratas de: alto BMI. ABDl-HuSeal (figura 22A) o ABD1-A500 (figura 22B) se administraron a 120 nmol/kg y la amilina se administró a 50 µg/kg/d mediante minibomba osmótica SC a ratas DIO' HSD macho de 700 g de peso promedio.

Ejemplo 30 Efectos antidiabéticos de polipéptidos manipulados en ratas diabéticas tipo 1 no obesas El propósito de este estudio fue evaluar los efectos in vivo de polipéptidos manipulados en criterios diabéticos y metabólicos clave en modelo de ratones STZ de alta dosis de diabetes mellitus tipo 1 (T1DM, por sus siglas en inglés). Ratones macho C57 BL/6 fueron administrados con una sola inyección intraperitoneal de STZ a 200 mg/kg para inducir diabetes tipo 1. Los compuestos fueron administrados dos veces por semana subcutáneamente a 120 nmol/kg durante dos semanas. Los criterios medidos incluyeron los , niveles de HbAlc, niveles de glucosa, peso corporal y consumo de alimento.

La figura 23 muestra que tanto compuesto 15 como compuesto 2 normalizaron glucosa en sangre en ratones diabéticos inducidos por STZ. Ambos polipéptidos manipulados también redujeron los niveles de hemoglobina Ale, como se muestra en la figura 24, y redujeron el peso corporal y consumo de alimento acumulativo, como se muestra en la figura 25.

Para poder asegurar que los efectos reductores de glucosa de terapia no se deben a efectos de insulina, se llevó a cabo otro l estudio para combinar la terapia de leptina con una baja dosis de insulina. El compuesto 15 se administró con o sin la adición de una dosis de 0.05 U/dia de insulina en un modelo de ratón STZ dé alta dosis de T1DM. Ratones macho C57 BL/6 fueron administrados con una sola inyección intraperitoneal de STZ a 175 mg/kg para inducir diabetes tipo 1. Los compuestos fueron administrados dos veces a i la semana subcutáneamente a 60 nmol/kg durante dos semanas. Los criterios medidos incluyeron niveles de HbAlc, niveles de glucosa, peso corporal y consumo de alimento.

La figura 26 muestra un efecto reductor' de glucosa potencial o con baja dosis de insulina en una forma aditiva para compuesto 15. También redujo los niveles de hemoglobina 'Ale, como se muestra en la figura 27, y redujo peso corporal y consumó de alimento acumulativo, como se muestra en la figura 28.

VIII. Modalidades Se muestran a continuación las modalidades adicionales de los polipéptidos manipulados, el método de uso de los mismos, y composiciones farmacéuticas descritas en la presente: Modalidad 1. Un polipéptido manipulado que comprende: un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) , y un primer dominio de hormona péptida (HD1) seleccionado de una leptina, un análogo de leptina o un fragmento activo de la misma.

Modalidad 2. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 1, que comprende además un primer' enlazador (Ll) enlazado covalentemente al HD1.

Modalidad 3. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 1 o 2, en donde el polipéptido manipulado comprende el ABD como una porción N-terminal y el HD1 como una porción C-terminal.

Modalidad 4. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 1 o 2, en donde el polipéptido manipulado comprende el ABD como una porción C-terminal y el HD1 como una porción N-terminal.

Modalidad 5. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 3, que comprende la estructura: ABD-HD1.

Modalidad 6. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 3, que comprende la estructura: ABD-L1-HD1.

Modalidad 7. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 4, que comprende la estructura: HD1-ABD.

Modalidad 8. El polipéptido manipulado de acuerdo con la modalidad 4, que comprende la estructura: HD1-L1-ABD.

Modalidad 9. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 8, en donde el HD1 es la leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina, o un derivado de leptina.

Modalidad 10. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 9, en donde el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12, SEQ: ID NO 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID NO: 146. , Modalidad 11. El polipéptido manipulado' de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 10, en dónde el HD1 tiene al menos 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: , ' SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12, SEQ : ID NO 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ¡ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ¡ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ¡ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ;ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y 'SEQ ID NO: 146.

Modalidad 12. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 11, en donde el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una leptina humana.

Modalidad 13. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 12, en donde el HD1 tiene al menos 90% de identidad con una leptina humána .

Modalidad 14. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 13, en donde el HD1 tiene al menos 50% de identidad con SEQ ID NO: 20., Modalidad 15. El polipéptido manipulado1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 14, en donde el HD1 tiene al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 20.

Modalidad 16. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 15, en dónde el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una leptina de ornitorrinco.

Modalidad 17. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 16, en donde el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una leptina de ¡foca.

Modalidad 18. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 17, en donde el HD1 tiene de 1 a 5 modificaciones de aminoácidos seleccionadas independientemente de cualquiera o una combinación de una inserción, supresión, adición y sustitución.

Modalidad 19. El polipéptido manipulado ¡de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ 1 ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID. NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID ??:· 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30/ SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143,· SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID NO: 146.

Modalidad 20. El polipéptido manipulado1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 19, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID O: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID NO: 146. I Modalidad 21. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en dondei el HD1 es SEQ ID NO: 1. ', Modalidad 22. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 2.

Modalidad 23. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 3.

Modalidad 24. El polipéptido manipulado; de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 4.

Modalidad 25. El polipéptido manipulado^ de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es: SEQ ID NO: 5.

Modalidad 26. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 6.

Modalidad 27. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 7.

Modalidad 28. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 8.

Modalidad 29. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde: el HD1 es SEQ ID NO: 9.

Modalidad 30. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde . el HD1 es SEQ ID NO: 10.

Modalidad 31. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 11.

Modalidad 32. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 12.

Modalidad 33. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 13.

Modalidad 34. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 14.

Modalidad 35. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 15.

Modalidad 36. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 16.

Modalidad 37. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 17.

Modalidad 38. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 18.

Modalidad 39. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 19.

Modalidad 40. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 20.

Modalidad 41. El polipéptido manipulado1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 21.

Modalidad 42. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 22.

Modalidad 43. El polipéptido manipulado' de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 23. i Modalidad 44. El polipéptido manipulado ! de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 24.

Modalidad 45. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 25. 1 Modalidad 46. El polipéptido manipulado de acuerdo i con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es i SEQ ID NO: 26.

Modalidad 47. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 27.

Modalidad 48. El polipéptido manipulado 'de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20,ven donde! el HD1 es SEQ ID NO: 28.

Modalidad 49. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 29. '.

Modalidad 50. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 30.

Modalidad 51. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 31.

Modalidad 52. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 32. j Modalidad 53. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en dondé el HD1 es SEQ ID NO: 33.

Modalidad 54. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 53, en donde el ABD comprende un motivo de unión a albúmina (ABM) que( consta de la secuencia de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X9 I Xn Xi2 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 25 I (SEQ ID NO: 34) en donde, independientemente uno de otro, , X5 se selecciona de Y y F; Xe se selecciona de N, R y S; Xg se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xn se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R, K y N; Xi4 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, ' H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D.

Modalidad 55. El polipéptido manipulado , de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 54, en donde, independientemente uno de otro, X5 es Y; X8 es N; ; X23 es T o I; X2 es S o L; y X25 es E o H.

Modalidad 56. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 55, en dond el motivo de unión a albúmina comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO: ', 114) y GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO: 115) .

Modalidad 57. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 56, en donde el ABD comprende un motivo de unión a albúmina (ABM) que no es GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 35) .

Modalidad 58. El polipéptido manipuladq de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 57, en donde el ABD comprende un ABM descrito en la Tabla 1. ' Modalidad 59. El polipéptido manipulado! de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 58, en dónde el ABD comprende la secuencia de aminoácidos : LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY - [ABM] - LAALP (SEQ ID NO: 36) en donde [ABM] es un motivo de unión a albúmina, y, independientemente uno de otro, Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; 1 Xc se selecciona de N, L y I; Xd se selecciona de R y K; Xe se selecciona de D y K; la leucina en la posición 45 está presente o ausente; y la prolina en la posición 46 está presente o ausente.

Modalidad 60. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 59, ,en donde, independientemente uno de otro, Xa es E; Xb es D; Xc es I; y Xd es K.

Modalidad 61. El polipéptido manipulado^ de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 60, en donde el polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50), , y LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO: 51) .

Modalidad 62. El polipéptido manipulado ( de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 61, en donde el ABD comprende la secuencia de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd Xe EL KY - [ABM] - LAALP (SEQ ID NO: 36) en donde [ABM] es un motivo de unión a albúmina, y, independientemente uno de otro, ' Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L y I; Xd se selecciona de R y K; Xe se selecciona de D y K; la leucina en la posición 45 está presente o ausente; la prolina en la posición 46 está presente o ausente; y en donde ABM consiste en la secuencia de aminoácidos : GVSD X5 YK X8 X9 I Xn X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO: 34) en donde, independientemente uno de otro, X5 se selecciona de Y y F; Xs se selecciona de N, R y S; Xg se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xn se selecciona de N, S, E y D; Xi2 se selecciona de R, K y N; 14 se selecciona de K y R; X2o se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D.

Modalidad 63. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 62, en donde el ABD comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO:; 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52. , Modalidad 64. El polipéptido manipulado! de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 63, en donde el ABD comprende cualquiera de los péptidos seleccionados del grupo que consiste en: ' LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTLIGHILAALP (SEQ ID NO: 38) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP ( SEQ ID NO: 39), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO: 40) , , | ID NO: LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP (SEQ ID NO: 42) , ! LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 43) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO: 44), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP (SEQ ID NO: 45) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP (SEQ ID NO: 46) , LAEA VLANRELDKYGVSDFY NVINKAKTVEGVEALIADILAALP (SEQ ID NO: 47) , LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP (SEQ ID NO: 48) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 49), 1 LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50) , LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO: 51) , y LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO: i 52) . ' Modalidad 65. El polipéptido manipulado; de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 64, en donde el enlazador Ll es un péptido de 1 a 30 aminoácidos 1 o menos de 30 aminoácidos.

Modalidad 66. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 65, en donde el i enlazador Ll se selecciona de los 20 aminoácido^ de origen natural.

Modalidad 67. El polipéptido manipulado : de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 66, en donde el enlazador Ll es un aminoácido no natural incorporado mediante síntesis química, modificación química post-trad ccional o por incorporación in vivo mediante expresión recombinante en una célula hospedera.

I Modalidad 68. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 67, en donde los aminoácidos del enlazador Ll se seleccionan de serina, glicina, alanina, asparagina prolina, glutamina,, glutamato, aspartato, y lisina. , Modalidad 69. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 68, en donde el I enlazador Ll comprende una mayoría de aminoácidos que son estéricamente impedidos.

Modalidad 70. El polipéptido manipulado' de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 69, en donde el enlazador Ll comprende uno o más de los siguientes: un enlazador ácido, un enlazador básico y un motivo estructural.

Modalidad 71. El polipéptido manipulado ! de acuerdo i con cualquiera de las modalidades 1 a 70, en donde el enlazador Ll comprende poliglicina, polialaninas, poli (Gly- Ala), o poli (GlySer) .

Modalidad 72. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 71, en donde el enlazador Ll comprende una poliglicina de (Gly) 3, (Gly) 4 (SEQ ID NO: 116), o (Gly)5 (SEQ. ID NO:117). 1 Modalidad 73. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 72, en donde el enlazador Ll comprende (Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID, NO: 118); (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ. ID NO: 119); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 120), y GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 121).

Modalidad 74. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 73, en donde el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Ala.

Modalidad 75. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 74, en donde el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Ser.

Modalidad 76. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 75, en donde el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Glu.

Modalidad 77. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 76, en donde el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Lys .

Modalidad 78. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 77, en donde el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [GlySer]n (SEQ ID NO: 122), [Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO: 123), [Gly-Gly-Gly-Ser ] n (SEQ ID NO: 124) y [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]h (SEQ ID NO: 125); en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10.

Modalidad 79. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 78, en donde el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: [GlyGlu]n (SEQ ID NO: 126); [Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 127); [Gly-Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 128); [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 129); [Gly-Asp] n ( SEQ ID NO: 130); [Gly-GlyAsp]n(SEQ ID NO: 131); [Gly-Gly-GlyJAsp] n ( SEQ ID NO: 132); [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 133) en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Modalidad 80. El polipéptido manipuladd de acuerdo i con cualquiera de las modalidades 1 a 79, en donde el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [Gly-Glu] n ( SEQ ID NO: 126); [Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 127); [Gly-Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 128); [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 129); [Gly-Asp] n ( SEQ ID NO: 130); [GlyGly-Asp]n(SEQ ID NO: 131); [Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 132); [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp] n ( SEQ ID NO: 133), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Modalidad 81. El polipéptido manipulado, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 80, en donde el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [Gly-Lys]n (SEQ ID NO: 134), [Gly-Gly-Lys] n (SEQ ID NO: 135); [Gly-Gly-Gly-Lys ] n (SEQ ID NO: 136); [Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n (SEQ ID NO: 137); [Gly-Arg] n( SEQ ID NO: 138); [GlyGly-Arg]n (SEQ ID NO: 139); [Gly-Gly-Gly-Arg] n (SEQ ID NO: 140); [Gly-Gly-Gly-Gly-Arg] n (SEQ ID NO: 141), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Modalidad 82. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 81, en, donde el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: ^ [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n(SEQ ID NO: 142) , | en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

Modalidad 83. El polipéptido manipulado; de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 81, en donde el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [Gly-Gly-Glu] 6 (SEQ ID NO: 153) [ Gly-Gly-Lys ] 6 ( SEQ ID NO: 154). [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys ] 3 (SEQ ID NO: 155), [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys] 4 (SEQ ID NO: 156), o [Glu-AlaAla-Ala-Lys ] 5 (SEQ ID NO: 157) . 1 Modalidad 84. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 83, en donde el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal.1 Modalidad 85. El polipéptido manipulado ' de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 84, en donde el enlazador Ll comprende un dipéptido AS C-terminal.

Modalidad 86. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 85, en¡ donde el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal y un dipéptido AS C-terminal.

Modalidad 87. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 86, en, donde el enlazador Ll comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de TG-(GGGS) (SEQ ID NO: 215)!, TG- (GGGS) 2 (SEQ ID NO: 216), TG- (GGGS) 3 (SEQ Í.D NO: 217), TG- (GGGS ) ( SEQ ID NO: 218), TG- (GGGS) 5 (SEQ I D ' NO: 219), (GGGS) i-AS (SEQ ID NO: 220), (GGGS ) 2-AS ( SEQ ID, NO: 221), (GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 222), (GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 223), (GGGS) 5-AS (SEQ ID NO : 224), TG- (GGGS ) i-AS (SEQ ID NO: 225), TG- (GGGS) 2-AS (SEQ ID NO: 226), TG- (GGGS) 3-AS (SEQ ID NO: 227), TG- (GGGS) -AS (SEQ ID NO: 228), y TG- ( GGGS ) 5-AS (SEQ ID NO: 229) .

Modalidad 88. El polipéptido manipulado1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 87, en donde el dipéptido TG y/o el dipéptido AS están ausentes o son sustituidos por un par de aminoácidos seleccionados de T, A, S, y G. 1 Modalidad 89. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 88, en donde el polipéptido comprende además uno o más enlazadores adicionales.

Modalidad 90. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 89, en¡ donde el polipéptido manipulado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ! ID NO: 97, i SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ.ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 y SEQ ID NO: 107.

Modalidad 91. El polipéptido manipulado: de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de jaminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 53. ! Modalidad 92. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de 'aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 54. , Modalidad 93. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 55.

Modalidad 94. El polipéptido manipulado ; de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en1 donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 56.

Modalidad 95. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 57.

Modalidad 96. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 58.

Modalidad 97. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 59.

Modalidad 98. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 60.

Modalidad 99. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 61.

Modalidad 100. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 62.

Modalidad 101. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de | aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 63.

Modalidad 102. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 64.

Modalidad 103. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 65.

Modalidad 104. El polipéptido manipulado, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 66.

Modalidad 105. El polipéptido manipulado' de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 67.

Modalidad 106. El polipéptido manipulado ( de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en1 donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 68. ¡ Modalidad 107. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de , aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 69.

Modalidad 108. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de ' aminoácidos I seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 70.

Modalidad 109. El polipéptido manipulado de acuerdo I con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de j aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 71. ; Modalidad 110. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos i seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 72.

Modalidad 111. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de ^aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 73.

Modalidad 112. El polipéptido manipulado! de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 74. i Modalidad 113. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el i i polipéptido manipulado comprende la secuencia de 1 aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 75.

Modalidad 114. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 76.

Modalidad 115. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 77.

Modalidad 116. El polipéptido manipulado de acuerdo i con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de ¡aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 78. ¡ Modalidad 117. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de 'aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 79.

Modalidad 118. El polipéptido manipulado1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 80.

Modalidad 119. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 81.

Modalidad 120. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de ' aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 82.

Modalidad 121. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 83.

Modalidad 122. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 á 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de 'aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 84.

Modalidad 123. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 85. 1 i Modalidad 124. El polipéptido manipulado ' de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 86.

Modalidad 125. El polipéptido manipulado 'de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 87.

Modalidad 126. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 88.

Modalidad 127. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 89.

Modalidad 128. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 90.

Modalidad 129. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 91.

Modalidad 130. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 92.

Modalidad 131. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 93.

Modalidad 132. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, én donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 94.

Modalidad 133. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 95. 1 Modalidad 134. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 96.

Modalidad 135. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 97.

Modalidad 136. El polipéptido manipulado' de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 98.

Modalidad 137. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 99.

Modalidad 138. El polipéptido manipulado 1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de 1 aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 100. i Modalidad 139. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de ; aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 101.

Modalidad 140. El polipéptido manipuladd de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de ¡aminoácidos i seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 102. i Modalidad 141. El polipéptido manipulado1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 103. · .

Modalidad 142. El polipéptido manipulado i de acuerdo I con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 104. i Modalidad 143. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en, donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 105.

Modalidad 144. El polipéptido manipulado (de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en, donde el polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 106.

Modalidad 145. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 90, en donde el i polipéptido manipulado comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 107.

Modalidad 146. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 145, que tiene una i afinidad para albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 10"6 mol/L.

Modalidad 147. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 146, que tiene una afinidad para albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 10"9 mol/L. ' Modalidad 148. El polipéptido manipulado1 de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 147, qué tiene una afinidad para albúmina de suero con una constante de disociación inferior a aproximadamente 10"12 mol/L.

Modalidad 149. El polipéptido manipulado; de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 148, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 1 día.

Modalidad 150. El polipéptido manipulado, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 149, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 3 días.

Modalidad 151. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 150, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 5 días.

Modalidad 152. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 151, en donde el polipéptido tiene una duración de acción de al menos 5 días en un sujeto humano.

Modalidad 153. Un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, que comprende administrar un polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 152 y 170 a 192 a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno .

Modalidad 154. El método de acuerdo con la modalidad 153, en donde la enfermedad o trastornó puede ser lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica , enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad del hígado graso, diabetes (incluyendo el tipo I y tipo II), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA, por sus siglas en inglés) , enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) y síndrome metabólico X.

Modalidad 155. El método de acuerdo con la modalidad 153 o modalidad 154, en donde la enfermedad o trastorno es lipodistrofia, obesidad dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad de hígado graso o diabetes.

Modalidad 156. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 153 a 155, en donde la enfermedad o trastorno es diabetes tipo I o diabetes tipo II.

Modalidad 157. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 153 a 155, en donde la enfermedad o trastorno es obesidad.

Modalidad 158. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 153 a 155, en donde la enfermedad o trastorno es lipodistrofia o deficiencia de leptina.

Modalidad 159. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 152 y un excipiente farmacéuticamente aceptable .

Modalidad 160. La composición farmacéutica de acuerdo con la modalidad 159, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica inyectable.

Modalidad 161. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 159 a 160, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de liberación sostenida o de larga duración.

Modalidad 162. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 159 a 161, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de una vez al día.

Modalidad 163. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 159 a 161, en donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de una vez por semana.

Modalidad 164. Una composición farmacéutica de cualquiera de las modalidades 159 a 163 para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto.

Modalidad 165. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las modalidades 159 a 164 en donde la enfermedad o trastorno es lipodistrofia , dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad del hígado graso, diabetes (incluyendo el tipo I y tipo II), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) , enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) y síndrome metabólico X.

Modalidad 166. La composición farmacéutica de la modalidad 164 o modalidad 165 en donde la enfermedad o trastorno es lipodistrofia, obesidad dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad de hígado graso o diabetes.

Modalidad 167. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 164 a 166, en donde la enfermedad o trastorno es diabetes tipo I o diabetes tipo II.

Modalidad 168. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 164 a 166, en donde la enfermedad o trastorno es obesidad. ! Modalidad 169. El método de acuerdo con cualquiera de las modalidades 164 a 166, en donde la enfermedad o trastorno es lipodistrofia o deficiencia de leptina.

Modalidad 170. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18, en donde el HD1 se selecciona del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos 1-146 de una leptina seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO : 144 SEQ ID NO 145 y SEQ ID NO: 146; en la cual un aminoácido diferente es sustituido en una o más de las siguientes posiciones y mantiene la misma numeración (incluso en ausencia de un residuo de glutaminilo en la posición 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, >138, 142, y 145; ¡ (b) . la secuencia de aminoácidos de la subparte (a) i en la que el residuo de glutaminilo en la posición 28 está ausente; (c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) en la que un residuo de metionilo se añade en el N-terminal; . 1 (d) una leptina que consiste en un fragmento de la secuencia de aminoácidos de (a) , (b) , o (c) seleccionado del grupo que consiste en: (i) los aminoácidos 98-146; (ii) los aminoácidos 1-32; (iii) los aminoácidos 40-116; (iv) los aminoácidos 1-99 y 112-146; (v) los aminoácidos 1-99 y 112-146 en donde uno o más de los aminoácidos 100-111 se coloca! entre los aminoácidos 99 y 112; (vi) la secuencia de aminoácidos de la subparte (i) en donde uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, y 145 está 1 sustituido con otro aminoácido; (vii) la secuencia de aminoácidos de la i subparte (ii) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 8 y 32 está sustituido con otro aminoácido; (viii) la secuencia de aminoácidos de la subparte (iii) en donde uno o más de los aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 se sustituye por otro aminoácido; (ix) la secuencia de aminoácidos de la subparte (iv) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, ;77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142, y 145 se sustituye por otro aminoácido; y (x) la secuencia de aminoácidos deila subparte (v) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 32, !33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, y 145 se sustituye por otro aminoácido; ¡ (xi) la secuencia de aminoácidos dé cualquiera de las subpartes (i)-(x) en la que una metionina se ha añadido en el N-terminal; (e) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las subpartes (a) a (d) en donde la secuencia de ^aminoácidos está unida a una porción química; (f) la secuencia de aminoácidos de la subparte (e) en donde la porción química es una porción polimérjica soluble en agua; (g) la secuencia de aminoácidos de la subparte (f) en la que la porción polimérica soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol , un copolímero de etilenglicol/propilenglicol, una carboximetilcelulosa, un dextrano, un alcohol polivinílico, una polivinilpirrolidona, un poli-1, 3-dioxolano, un poli-1,3,6 trioxano, un copolímero de etileno/anhídrido maleico, un homopolímero de poliaminoácido, un copolímero aleatorio de poliaminoácido, una albúmina, una protelna Fe, un poli (N-vinil-pirrolidona) polietilenglicol, un homopolímero de propilenglicol , un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un alcohol polivinílico, un propionaldehído de polietilenglicol, un succinato y un estireno; (h) la secuencia de aminoácidos de la subparte (g) en la que la porción polimérica soluble en agua es un polietilenglicol; y (i) la secuencia de aminoácidos de la subparte (g) en donde el polímero soluble en agua es un poliaminoácido seleccionado del grupo que consiste en: una albúmina, un anticuerpo, una proteína Fe, y una porción de polilisina.

Modalidad 171. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 170, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, . SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han hecho una o más sustituciones de aminoácido.

Modalidad 172. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se ha hecho una sustitución de aminoácido.

Modalidad 173. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID( NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID j NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID, O: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID ¡NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ : 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se hecho dos sustituciones de aminoácido.

Modalidad 174. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ IDINO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID !NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID ¡NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID '??: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han hecho tres sustituciones de aminoácido.

Modalidad 175. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID ,NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID |NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho cuatro sustituciones de aminoácido.

Modalidad 176. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID iNO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID i NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho cinco sustituciones de aminoácido.

Modalidad 177. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HDl comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID-NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han hecho seis sustituciones de aminoácido.

Modalidad 178. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HDl comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho siete sustituciones de aminoácido.

Modalidad 179. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho ocho sustituciones de aminoácido.

Modalidad 180. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HDl comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ IDjNO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID, NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han ¡ hecho nueve sustituciones de aminoácido.

Modalidad 181. El polipéptido manipuladó de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, 1 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID; NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID ¡NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID |NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 'NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID 'NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID 'NO: 31, SEQ 1 ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho diez sustituciones de aminoácido.

Modalidad 182. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, ,en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: I 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ IDi NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID'NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID ;NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID ÍNO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 11 sustituciones de aminoácido. ' Modalidad 183. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, 'en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID 'NO: 11, SEQ i ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han hecho 12 sustituciones de aminoácido.

Modalidad 184. El polipéptido manipulado i de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, 1 en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID' NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID ¡NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID!NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 13 sustituciones de aminoácido.

Modalidad 185. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ i ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID (NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID ,NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 'NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 14 I sustituciones de aminoácido.

Modalidad 186. El polipéptido manipuladp de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del i grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID'NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID ¡NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID 'NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID :NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID (NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han hecho 15 sustituciones de aminoácido.

Modalidad 187. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID ÑO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ i ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID; NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 16 sustituciones de aminoácido.

Modalidad 188. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID 'NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 17 sustituciones -de aminoácido.

Modalidad 189. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han hecho 18 sustituciones de aminoácido.

Modalidad 190. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del qrupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 19 sustituciones de aminoácido.

Modalidad 191. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, en donde el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ * ID NO: 12, SEQ JD NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID! NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID' NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID1 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 20 sustituciones de aminoácido. i Modalidad 192. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 18 y 171, 'en donde el HDl comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: i 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID; NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID ¡NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID INO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID !NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID !NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, y SEQ ID N NO: 146; en donde se han hecho 21 sustituciones de aminoácido.

Modalidad 193. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 143. ¡ Modalidad 194. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 144.

Modalidad 195. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 145.

Modalidad 196. El polipéptido manipulado de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1 a 20, en donde el HD1 es SEQ ID NO: 146.

Aunque la descripción anterior describe! la presente invención, con ejemplos proporcionados para el propósito de ilustración, se entenderá que la práctica de la presente invención abarca todas las variaciones, adaptaciones o modificaciones habituales que estén dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, las descripciones y los ejemplos no deben interpretarse como limitantes ¡del alcance de la invención, que está definido por las reivindicaciones adj untas .

IX. Listado de secuencias informal A continuación se da un listado de secuencias informal: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SV S SKQKVTGLDFI GLHPILTLSKM DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGG VLEASGYSTEVVALSRLQGSLQD LQQLDLSPGC, en donde 'Xaa en la posición 28 es Q o está ausente (SEQ ID N0:1); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQIS DLENLRDLLHV LAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC, en donde Xaa en la posición 29 es Q o está ausente (SEQ ID NO : 2 ) ; VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSK DQTLAIY QQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTE VVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO:3); MVPI RVQDDTKTLIKTIVTRISDISH QSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAI YQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLY STEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO:4); VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- i SVSS QRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHL LAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC , en donde Xaa en la posición 28 es Q o está ausente (SEQ ID NO : 5 ) ; MVPICKVQDDT TLIKTIVTRI DISHT-Xaa- SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHL LAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC , en i donde Xaa en la posición 29 es Q o está ausente (SEQ ID NO : 6 ) ; : MH GTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQ VTGLD FIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGY STEWALSRLQGSLQD LWQLDLSPGC (SEQ ID NO : 7 ) ; VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHV LAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC, en donde: Xaa en la posición 27 es T o A; y Xaa en la posición 28 es Q o está ausente (SEQ ID N0:8); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSR VIQISNDLENLRDLLHV LAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC, en donde: Xaa en la posición 28 es T o A, y Xaa en: la posición 29 es Q o está ausente (SEQ ID NO:9); VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQ DQTLAIY QQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:10); MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAI YQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID N0:11); VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY QQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:12); MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFI PGLHPILSLS MDQTLAV YQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 13); ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVY QQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYST EVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID N0:14); MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLD FIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLP PDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRS DGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID N0:15); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID N0:16); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO.17); VPIQ VQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQ VTGLDFI PGLHPILTLSKMDQTLAVYQ QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:18); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:19); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:20); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:21); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFI PGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:22); ; MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL LSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTE i VVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:23); i PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ QILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEV VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:24); PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEV VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:25); ' PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQ I QILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTI GLGNVLRASVHSTEV VALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:26); : MPIQRVQDDTKTLIK I ITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFI PRVQSVR LSGMDQILA Y QQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:27); j MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSG DQILATY QQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:28); ! MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATY QQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTE VVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:29); MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEOPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVPIQKVQDDTKTLIKT IVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQIS NDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLW QLDLSPGC (SEQ ID NO:30); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID N0:31); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQD LWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 32); a la que se le ha i fijado una porción de PEG de 20 kilodaltones (kDa) a través del residuo de cisteina en la posición 78; MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:33); GVSD X5 YK X8 X9 I Xn Xi2 A Xi4 TVEGV X20 AL X23 X24 25 I (SEQ ID NO:34), en donde X5, Xs, X9, X11, 12 Xi4, X2o, X23, 24 y X25 son como se describe en la presente; GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO:35); LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY - [ABM] - LAALP (SEQ ID NO:36), en donde ABM, Xa, Xb, Xc, Xd y Xe son como se describe en la presente; ' LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP ; (SEQ ID NO: 37); LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTLIGHILAALP (SEQ ID NO: 38); LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP , (SEQ ID NO:39); LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP , (SEQ ID NO : 40 ) ; LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNI INRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO : 41 ) ; LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP ' (SEQ ID NO:42); LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP ¦ (SEQ ID NO : 3 ) ; ; LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP ( SEQ ID NO: 44) ; LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP (SEQ ID NO : 45 ) ; LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP (SEQ ID NO : 46 ) ; LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP ,(SEQ ID NO:47); LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP ( SEQ ID NO : 48 ) ; LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP ,(SEQ ID NO : 49 ) ; LAEA EDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP ,(SEQ ID NO: 50); LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALP (SEQ ID NO:51); LAEAKEDAI ELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO:52); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGASV PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQ QILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:53); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSK D QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:54); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSASLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKA KTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:55); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEA VLANRELDKYG VSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:56); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFI PGNQQFQNLADMD QTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEI GGIVEE SLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC (SEQ ID NO:57); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:58); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIÍLTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP ASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKVLANRELDKYG VSDFYKRLI KAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO:59); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQ i ILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRAS I VHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:60); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQ SVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSGPVPRARGSDTI KGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID N0:61); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTG IQRVQDDTKTL IKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSG DQILATYQQILTSLQSRNVIQ ISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDM LRQLDRNPGC (SEQ ID NO:62); MLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLÉTLDSLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:63); MLAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:64); ' MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK D QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLÉTLDS LGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:65); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGLAEAAAKEAAAK EAAAKEAAAKEAAAKAAAASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEF I PGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQAS GLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:66); MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGEGGEGGEGGEG GEGGEASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIP'GLHPILTLSKM DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLE ASGYSTEVVALSRLQGSLQD LQQLDLSPGC (SEQ ID NO:67); LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGKGGKGGKGGKG GKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKM DQTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLE ASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID O:68); LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:69); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGASVPIQKVQ DDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRL QGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:70); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:71); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSASLAEAKEDAIKELDKYGVSDY YKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:72); VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKEDAIKELDKYG VSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO:73); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASISIEKIQADTKTLTK I ITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLAD D QTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDT EIWGGIVEE SLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC ( SEQ ID NO:74); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:75); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQ VTGLDFIPGLHPILTLS DQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKEDAIKELDKYG VSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 76); LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASPIQRVQDDTKTLIKTI ITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQ ILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRAS VHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 77 ) ; i MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQ ILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRAS VHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID O:78); : MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGPIQRVQDDTKTL IKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQ ISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDM LRQLDRNPGC (SEQ ID NO:79); 1 MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP ASGLETLDSLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLS PGC (SEQ ID NO:80); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:81); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:82); ? MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGLAEAAAKEAAAK EAAAKEAAAKEAAAKAAAASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEF IPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQAS GLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ.ID NO:83); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGEGGEGGEGGEG GEGGEASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRI DISHTQSVSSKQKVTGLEFI PGLHPILTLSKM DQTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLE ASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:84); LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGKGGKGGKGGKG GKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKM DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLE ASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:85); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:86) MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGAS VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRI DISHTQSVSSKQKVTGLEFI PGLHPILTLSKMDQTLAVY QQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTE VVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:87); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFI PGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLE LESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:88); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSASLAEAKEDAIKELDKYGVSDY YKNLINKAKTVEGVEALiselLAALP (SEQ ID NO:89); MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYST E VALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKEDAIKELDKYG VSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALP (SEQ ID NO:90); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALPTGÓGGSGGGSGGGS GGGSASISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMD QTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEE SLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQGC (SEQ ID NO:91); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGSGGGSGGGS i GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDML QLDLSPGC (SEQ ID NO:92); ' MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGCTGGGGSGGGSGGGSGGGSASLAEAKEDAIKELDKYG VSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALP (SEQ ID NO: 93); j MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGSGGGSGGGS VHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 94);: MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQ ILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRAS VHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO:95); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGPIQRVQDDTKTL IKTIITRINDISPPQGVCSPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQ QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:98); ! MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLÉTLDSL GGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:99); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGLAEAAAKEAAAK EAAAKEAAAKEAAAKAAAASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEF IPGLHPILTLSK DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQAS GLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ:ID NO:100); LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGEGGEGGEGGEG ASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 101); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGKGGKGGKGGKG GKGGKASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKM DQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLE ASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:102); ' MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO:103); .

LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLÉTLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:104); ' MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO:105); , MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALPTGQGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 106); MLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGS SVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFI PGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 107); ¡ KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:108); KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO: 109); KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY ( SEQ ID NO:110). CGNLSTC LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO:lll); CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO: 112); KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 113).

GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO:114); ' GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO: 115); GGGG (SEQ ID NO: 116) ; GGGGG (SEQ ID NO: 117); GGGKGGGG (SEQ ID NO:118); GGGNGSGG (SEQ ID N0.119); GGGCGGGG (SEQ ID NO:120); 1 GPNGG (SEQ ID NO: 121) ; [GS]n, (SEQ ID NO:122), en donde n es 1-10; [-GGS] n, (SEQ ID NO: 123), en donde n es 1-10; [GGGS] n, (SEQ ID NO: 124), en donde n es 1-10; [GGGGS ] n, (SEQ ID NO: 125), en donde n es 1-10; [GE] n, (SEQ ID N0.126), en donde n es 1-10; ¡ [GGE] n, (SEQ ID NO: 127), en donde n es 1-10; [GGGE] n, (SEQ ID NO:128), en donde n es 1-10; [GGGGE] n, (SEQ ID NO: 129), en donde n es 1-10; [GD]n, (SEQ ID NO:130), en donde n es 1-10; [GGD] n, (SEQ ID NO: 131), en donde n es 1-10; ¡ [GGGD] n, (SEQ ID NO: 132), en donde n es 1-10; ; I GGGGD] n, (SEQ ID NO:133), en donde n es 1-10; GK] n, (SEQ ID NO:134), en donde n es 1- 10; GGK] n, (SEQ ID NO:135), en donde n es 1 -10; GGGK] n , (SEQ ID NO: 136), en donde n es 1-10; GGGGK] n, (SEQ ID NO: 137), en donde n es 1-10; GR] nr (SEQ ID NO:138), en donde n es 1- 10; GGR] n, (SEQ ID NO: 139), en donde n es 1 -10; GGGR] n , (SEQ ID NO: 140), en donde n es 1-10; GGGGR] n, (SEQ ID NO: 141), en donde n es 1-10; GAAAK] n, (SEQ ID NO: 142), en donde n es 1-10; VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY i QQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 143); : I VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSK DQTLAVYQ QVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEV VALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO:144); ! MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAV YQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 145); y MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVY QQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQ PESLDGVLEASLYSTE VVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 146) .

MLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPTGGGGSGGGSGGGS GGGSASVPIQKVQDDT TLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEA i i SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO:147) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO : 664) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 665) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 666) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 667) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTS PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 668) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 669) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS'KMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 670) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC (SEQ ID NO: 671) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFS SCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 672) . , MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 673) . ¡ MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 674) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSK DQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDML QLDLS PEC (SEQ ID NO: 675) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 676) .

MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAV YQQILTSMPSR VIQIS DLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYST EVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 677) .

X' -Xaa^Cys^Asn^Thr^Ala^Thr^Cys^Ala^Thr^Gln^ Arg^-Leu12-Ala13-Asn1 -Phe15-Leu16-Val1 -His18-Ser19-Ser20-Xaa21-Asn22-Phe23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Thr30-Xaa31-Val32-Gly33-Ser34-Asn35-Thr36-Tyr37-X (SEQ ID NO: 800) : CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID O: 801) KCNTATCATQRLANFLVRSSKNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 802) CNTATCATQRLA FLVRSSKNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 803) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO : 804) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 805) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ I D!NO:806) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ I D NO: 807) KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ I D ' NO:808) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 809) CNTATCATQRLANFLVHSSKNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 810) CNTATCATQRLA FLVHSSNNFGPKLPPTNVGSNTY-NH2 ( SEQ ID NO: 811) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 812) CNTATCATQRLA FLVHSSNNFKPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NjO:813) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGKILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 814) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPIKPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 815) I CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILKPTNVGSNTY-NH2 ( SEQ ID NO: 816) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPKTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 817) Se hace constar que con relación a est'a fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta : claro de la presente descripción de la invención.

Claims (231)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las, siguientes reivindicaciones: 1

1. Un polipéptido manipulado caracterizado porque comprende: un polipéptido de dominio de unión, a albúmina (ABD) y un primer dominio de hormona péptida (HD1) seleccionado de una leptina, un análogo de leptina o un fragmento activo de la misma. 1

2. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprendé además un primer enlazador (Ll) enlazado covalentemente al HD1.

3. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende el ABD como una porción N-terminal y el HD1 como una ' porción C-terminal.

4. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende el ABD como una porción C-terminal y el HD1 como una ; porción N-terminal.

5. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende la estructura: ABD-HD1.

6. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende la estructura: ABD-L 1-HD 1.

7. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende la estructura: HD1-ABD.

8. El polipéptido manipulado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende la estructura: HD 1-L 1-ABD.

9. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el HD1 es la leptina, un análogo de leptina, un fragmento activo de leptina, o un derivado de leptina.

10. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SÉQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33.

11. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el HD1 tiene al menos 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33.

12. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una leptina humana .

13. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el HDl tiene al menos 90% de identidad con una leptina humana .

14. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el HDl tiene al menos 50% de identidad con SEQ ID NO: 20.

15. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el HD1 tiene al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 20.

16. El polipeptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una leptina de ornitorrinco.

17. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el HD1 tiene al menos 50% de identidad con una leptina de foca.

18. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el HD1 tiene de 1 a 5 modificaciones de aminoácido seleccionadas independientemente de cualquiera o una combinación de una inserción, supresión, : adición y sustitución.

19. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de j aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, I SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33. j

· 20. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado i porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NC : 4, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO: 29, SEQ1 ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.

21. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 1. I

22. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 2.

23. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 3. i 319

24. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 4.

25. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado i porque el HD1 es: SEQ ID NO: 5.

26. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 6.

27. El polipéptido manipulado de conf'ormidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 7. i

28. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 8.

29. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 9. :

30. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 10. ,

31. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 11. 1

32. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 12.

33. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 13.

34. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 14.

35. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 15.

36. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 16.

37. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 17.

38. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 18.

39. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 19.

40. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 20.

41. El polipeptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 21. ;

42. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 22.

43. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 23.

44. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 24. :

45. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 25.

46. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 26. ;

47. El polipéptido manipulado de conformidad con i cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 27. i

48. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 28.

49. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 29. ; i

50. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HD1 es SEQ ID NO: 30.

51. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 31.

52. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 32. '

53. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 33.

54. El polipéptido manipulado de confprmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 53, caracterizado porque el ABD comprende un motivo de unión a albúmina (ABM) que consta de la secuencia de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X9 I Xn Xi2 A Xi4 TVEGV X20 AL X23 X24 25 I (SEQ ID NO: 34) en donde, independientemente uno de otro, X5 se selecciona de Y y F; X3 se selecciona de N, R y S; Xg se selecciona de V, I, L, M, F y Y; , Xii se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R, K y N; Xi4 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D.

55. El polipéptido manipulado de confprmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, caracterizado porque, independientemente uno de otro, X5 es Y; X8 es N; i X23 es T o I; ! X24 es S o L; y ' X25 es E o H.

56. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55, caracterizado porque el motivo de unión a albúmina comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO: , 114) y GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO: 115) .

57. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 56, caracterizado porque el ABD comprende un motivo de unión a albúmina (ABM) que no es GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 35) .

58. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 57, caracterizado porque el ABD comprende un ABM descrito en la Tabla 1.

59. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 58, caracterizado porque el ABD comprende la secuencia de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY - [ABM] - LAALP (SEQ ID NO: 36) en donde [ABM] es un motivo de unión a albúmina, y, independientemente uno de otro, ( Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L y I; Xd se selecciona de R y K; Xe se selecciona de D y K; la leucina en la posición 45 está presente o ausente; y la prolina en la posición 46 está presente o ausente.

60. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 59, caracterizado porque, independientemente uno de otro, Xa es E; X es D; ' Xc es I, y Xd es K.

61. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 60, caracterizado porque el polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en: LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50), y LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO: 51) .

62. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 61, caracterizado porque el ABD comprende la secuencia de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd Xe EL KY - [ABM] - LAALP (SEQ ID NO: 36) en donde [ABM] es un motivo de unión a albúmina, y, independientemente uno de otro, Xa se selecciona de V y E Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L y I; Xd se selecciona de R y K; Xe se selecciona de D y K; la leucina en la posición 45 está presente o ausente; la prolina en la posición 46 está presente o ausente; y en donde ABM consiste en la secuencia de aminoácidos: i GVSD X5 YK X8 Xg I Xn X12 A Xi4 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO: 34) en donde, independientemente uno de otro, X5 se selecciona de Y y F; Xg se selecciona de N, R y S; í Xg se selecciona de V, I, L, M, F y Y; Xn se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R, K y N; X14 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 se selecciona de K, I y T; ! X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D.

63. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 62, caracterizado porque el ABD comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO 46, SEQ ID NO 47, SEQ IDj NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID O: 52.

64. El polipéptido manipulado de conf|Ormidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 63, caracterizado porque el ABD comprende cualquiera de lds péptidos seleccionados del grupo que consiste en: LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTLIGHILAALP (SEQ ID NO: 38) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP (SEQ ID NO: 39) , j LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO: 40) , 1 LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO: 41) , ! LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP (SEQ ID NO: I 42), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 43) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO: 44) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP (SEQ ID NO: 45) , j LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP (SEQ ID NO: 46) , ' LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP (i SEQ ID NO: 47), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP (SEQ ID NO: 48) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 49) , LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50 ) , LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiselLAALP (SEQ ID NO: 51 ) , y · LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO: 52 ) . !

65 . El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 64 , caracterizado porque el enlazador Ll es un péptido de 1 a 30 aminoácidos o menos de 30 aminoácidos.

66 . El polipéptido manipulado de conformidad con í cualquiera de las reivindicaciones 1 a 65 , caracterizado i porque el enlazador Ll se selecciona de los 20 aminoácidos de origen natural. !

67 . El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66 , caracterizado i porque el enlazador Ll es un aminoácido no natural incorporado mediante síntesis química, modificación química post-traduccional o por incorporación in vivo mediante expresión recombinante en una célula hospedera. !

68. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67, caracterizado porque los aminoácidos del enlazador Ll se seleccionan de serina, glicina, alanina, asparagina prolina, ; glutamina, glutamato, aspartato, y lisina.

69. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 68, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una mayoría de ; aminoácidos que son estéricamente impedidos.

70. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 69, caracterizado porque el enlazador Ll comprende uno o más de los siguientes: un enlazador ácido, un enlazador básico, yi un motivo estructural. 1

71. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 70, caracterizado porque el enlazador Ll comprende poliglicina, polialaninas, poli (Gly-Ala) , o poli (GlySer) . ,

72. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 71, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una poliglicina de (Gly) (Gly)4 (SEQ ID NO: 116), o (Gly)5(SEQ ID NO: 117).1

73. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 72, caracterizado porque el enlazador Ll comprende (Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 118); (Gly) 3AsnGlySer (Gly) (SEQ ID N,0: 119); (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID NO: 120), y GlyProAsnGlyGly ( SEQ ID NO: 121) .

74. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 73, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Ala .

75. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 74, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Ser.

76. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 75, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Glu.

77. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 76, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una combinación de Gly y Lys .

78. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 77, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [GlySer] n ( SEQ ID NO: 122), [Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO: 123), [Gly-Gly-Gly-Ser ] n (SEQ ID NO: 124) y [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO: 125); en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10.

79. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 78, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: [GlyGlu] n (SEQ ID NO: jl26) ; [Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 127); [Gly-Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 128); [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 129); [Gly-Asp]„ ( SEQ ID NO: 130); [Gly-GlyAsp]n(SEQ ID NO: 131); [Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 132); [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 133) j en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. ¦

80. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 79, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [Gly-Glu] n (SEQ ID NO: ¡134); [Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 135); [Gly-Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 136); [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n(SEQ ID NO: 137); [Gly-Asp]„ (SEQ ID NO: 138); [GlyGly-Asp]n(SEQ ID NO: 139); [Gly-Gly-Gly-Asp]„ ( SEQ ID NO: 140); [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp] n ( SEQ ID NO: 141), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. ;

81. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 80, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [Gly-Lys]n; [Gly-Gly-Lys ] n; [Gly-Gly-Gly-Lys]n; [Gly-Gly-Gly-Gly-Lys ] n; [Gly-Arg]n; [GlyGly-Arg]n; [Gly-Gly-Gly-Arg] n; [Gly-Gly-Gly-Gly-Arg] n en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. j ¡ I I 332

82. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 81, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys] n en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

83. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 81, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: [Gly-Gly-Glu] 6 (SEQ ID NO: 153) [Gly-Gly-Lys] 6 (SEQ ID NO: 154) . [Glu-Ala-Ala-Ala-íys] 3 (SEQ ID NO: 155), [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys] 4 (SEQ ID NO: 156-) , o [Glu-AlaAla-Ala-Lys]5(SEQ ID NO: 157) . ;

84. El polipéptido. manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 83, caracterizado porque el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal.

85. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 84, caracterizado porque el enlazador Ll comprende un dipéptido AS C-terminal.

86. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 85, caracterizado porque el enlazador Ll comprende un dipéptido TG N-terminal y un dipéptido AS C-terminal. ¡

87. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 86, caracterizado porque el enlazador Ll comprende una secuencia de . aminoácidos ? 333 que se selecciona del grupo que consiste de TG- (GGGS) i (SEQ ID NO: ,215), TG- (GGGS) 2 (SEQ ID NO: 216), TG- (GGGS) 3 '(SEQ ID NO: 217), TG- (GGGS) 4 (SEQ ID NO: 218), TG- (GGGS ) 5 ( SEQ ID NO: 219), i (GGGS) i-AS (SEQ ID NO: 220), (GGGS ) 2-AS ( SEQ ID NO: 221), I (GGGS) 3-AS (SEQ ID NO: 222), (GGGS ) 4-AS ( SEQ Iü' NO: 223), (GGGS) 5-AS (SEQ ID NO: 224), TG- ( GGGS ) i-AS ( SEQ ID NO : 225), TG-(GGGS) 2-AS (SEQ ID NO: 226), TG- (GGGS ) 3-AS ( SEQ ID NO: 227), TG- (GGGS) 4-AS (SEQ ID NO: 228), y TG- (GGGS) 5- S (SEQ ID NO: 229).

88. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 87, caracterizado porque el dipéptido TG y/o el dipéptido AS están ausentes o son sustituidos por un par de aminoácidos seleccionados de T, A, S, y G.

89. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 88, caracterizado porque el polipéptido comprende además uno o más enlazadores adicionales.

90. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 89, caracterizado porque el polipéptido manipulado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID1 NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID; NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID, NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 y SEQ ID NO: 107.

91. El polipéptido manipulado de conformidad con I cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 53.

92. El polipéptido manipulado de conformidad con i cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 54.

93. El polipéptido manipulado de conformidad con i cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 55.

94. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, carácterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 56.

95. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NOr 57. i

96. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado ¡ i porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 58.

97. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 59.

98. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 60.

99. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 61.

100. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 62.

101. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 63.

102. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 64.

103. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 65.

104. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de- las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 66.

105. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 67.

106. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 68.

107. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 69. ¡ i I

108. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 70.

109. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 71.

110. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 72. i

111. El polipéptido manipulado de conformidad con i cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 73.

112. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 74.

113. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado I I porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 75. ¡

114. El polipéptido manipulado de con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90 zado porque comprende la secuencia de aminoácid nada expuesta en SEQ ID NO: 76. j

115. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos eccionada expuesta en SEQ ID NO: 77. ¡

116. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 78.

117. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 79. j i

118. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, porque comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 80. j

119. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 81.

120. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado i porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 82.

121. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 83. j

122. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 84. '

123. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 85.

124. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 86.

125. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 87. ;

126. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 88.

127. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 89.

128. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 90.

129. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 91.

130. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 92.

131. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 93.

132. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 94.

133. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 95.

134. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 96.

135. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 97.

136. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 98.

137. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 99.

138. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 100.

139. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada i expuesta en SEQ ID NO: 102.

140. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 102. :

141. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 103. j

142. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 104. j

143. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 105. ]

144. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 106.

145. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 90, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en SEQ ID NO: 107.

146. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 145, caracterizado porque tiene afinidad para albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 1Ó"6 mol/L.

147. El polipéptido manipulado de conformidad con I cualquiera de las reivindicaciones 1 a 146, caracterizado porque tiene una afinidad para albúmina de suero con una constante de disociación menor de aproximadamente 10"9 mol/L.

148. El polipéptido manipulado de conformidad con i cualquiera de las reivindicaciones 1 a 147, caracterizado porque tiene una afinidad para albúmina de suero con una constante de disociación menor que alrededor de 10"12 mol/L.

149. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 148, caracterizado porque tiene una duración de acción de al menos 1 día.

150. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 149, caracterizado porque tiene una duración de acción de al menos 3 días.

151. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 150, caracterizado I 344 porque tiene una duración de acción de al menos 5 días.

152. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 151, caracterizado porque tiene una duración de acción de al menos 5 días en un sujeto humano. 1

153. Un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar el polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 152, a un j sujeto en necesidad del mismo en una cantidad eficaz para ;tratar la enfermedad o trastorno. ¡

154. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque la enfermedad o trastorno ¡ puede ser i lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad del hígado graso, diabetes (incluyendo el tipo I y tipo II) , esteatohepatitis .no alcohólica (EHNA) , enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) , síndrome metabólico X y enfermedad de Huntington.

155. El método de conformidad con la reivindicación 153 o la reivindicación 154, caracterizado p'orque la enfermedad o trastorno es lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad de hígado graso o diabetes. '

156. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 153 a 155, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es diabetes tipo I o diabetes tipo II.

157. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 153 a 155, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es obesidad.

158. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 153 a 155, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es lipodistrofia o deficiencia de leptina.

159. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 152, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

160. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 159, caracterizada porque es una composición farmacéutica inyectable.

161. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 159 a 160, caracterizada porque es de liberación sostenida o de larga duración.

162. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 159 a 161, caracterizada porque es de una vez al día.

163. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 159 a 161, caracterizada porque es de una vez por semana. :

164. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 159 a 163, caracterizada 1 porque es para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto.

165. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 159 a 164, caracterizada porque la enfermedad o trastorno es lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, amenorrea hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad del hígado graso, diabetes (incluyendo el tipo I y el tipo II) , esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) , enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) y síndrome metabólico X.

166. La composición farmacéutica de la i reivindicación 164 o la reivindicación 165, caracterizada porque la enfermedad o trastorno es lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, sobrepeso, obesidad, , amenorrea i hipotalámica, enfermedad de Alzheimer, deficiencia de leptina, enfermedad de hígado graso o diabetes.

167. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 164 a 166, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es diabetes tipo I o diabetes tipo II.

168. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 164 a 166, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es obesidad.

169. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 164 a 166, caracterizado porque la i enfermedad o trastorno es lipodistrofia o deficiencia de leptina. j

170. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el HD1 se selecciona del grupo que consiste en: i (a) la secuencia de aminoácidos 1-146 de una leptina seleccionado del grupo que consiste en: SEQj ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO : 144 , SEQ ID NO 145 y SEQ ID NÓ: 146; en la cual un aminoácido diferente es sustituido en un o más de las siguientes posiciones y mantiene la misma numeración (incluso en ausencia de un residuo de glutaminilo en la posición 28) : 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, i 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, y 145; ! (b) la secuencia de aminoácidos de la subparte (a) en la que el residuo de glutaminilo en la posición 28 está ausente; (c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) en la que un residuo de metionilo se añade en el N-terminal; (d) una leptina que consiste en un fragmento de la secuencia de aminoácidos de (a) , (b) , o (c) seleccionado del grupo que consiste en: , (i) los aminoácidos 98-146; (ii) los aminoácidos 1-32; (iii) los aminoácidos 40-116; ¡ (iv) los aminoácidos 1-99 y 112-146; (v) los aminoácidos 1-99 y 112-146: en donde uno o más de los aminoácidos 100-111 se coloca entre los aminoácidos 99 y 112; < (vi) la secuencia de aminoácidos de la subparte (i) en donde uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, y' 145 está sustituido con otro aminoácido; (vii) la secuencia de aminoácidos de la i subparte (ii) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 8 y 32 está sustituido con otro aminoácido; (viii) la secuencia de aminoácidos de la subparte (iii) en donde uno o más de los aminoácidos 50, 53, I 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, ¡ 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 se sustituye por otro aminoácido; (ix) la secuencia de aminoácidos de la i subparte (iv) en donde uno o más de los aminoácidos1 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 11, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142, y 145 se sustituye por otro aminoácido; y (x) la secuencia de aminoácidos de la subparte (v) en donde uno o más de los aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, , 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, y 145 se sustituye por otro aminoácido; I (xi) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las subpartes (i)-(x) en la que una metionina se ha añadido en el N-terminal; (e) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las subpartes (a) a (d) en donde la secuencia de aminoácidos está unida a una porción química; (f) la secuencia de aminoácidos de la subparte (e) en donde la porción química es una porción polimérica soluble en agua; (g) la secuencia de aminoácidos de la subparte (f) i en la que la porción polimérica soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en: polietilenglicol , un copolímero de etilenglicol/propilenglicol, una carboximetilcelulosa, un i i dextrano, un alcohol polivinílico, una polivinilpirrolidona, un poli-1 , 3-dioxolano, un poli-1,3,6 trioxano, un copolímero de etileno/anhídrido maleico, un homopolimero de poliaminoácido, un copolímero aleatorio de poliaminoácido, una albúmina, una proteína Fe, un poli (N-vinil-pirrolidona ) polietilenglicol , un homopolimero de propilenglicol , un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un alcohol polivinílico, un propionaldehído de polietilenglicol, un succinato y un estireno; (h) la secuencia de aminoácidos de la subparte (g) en la que la porción polimérica soluble en agua es un polietilenglicol; y (i) la secuencia de aminoácidos de la subparte (g) en donde el polímero soluble en agua es un poliaminoácido seleccionado del grupo que consiste en: una albúmina, un anticuerpo, una proteína Fe, y una porción de polilisina.

171. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 170, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, 351 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ 'ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: i 146; en donde se han hecho una o más sustituciones de aminoácido. 1

172. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18; y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ÍD NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se ha hecho una sustitución de aminoáqido.

173. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secúencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID 352 NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ1 ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho dos sustituciones de aminoácido.

174. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 181 y 171, caracterizado porque el HDl comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ;ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ÍD NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho tres sustituciones de aminoácido.

175. El polipéptido manipulado de conformidad con I cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 'SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQi ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ;ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ÍD NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho cuatro sustituciones de aminoácido. 1 I

176. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ !ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ I(D NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ i'D NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ (ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho cinco sustituciones de aminoácido.

177. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO : 8, SEQ : ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ÍD NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID 1 NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ÍD NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho seis sustituciones de aminoácido.

178. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 : y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: i 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID -NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho siete sustituciones de aminoácido.

179. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ÍD NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ÍD NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho ocho sustituciones de aminoácido.

180. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEO ID NO SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ 'ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ -ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ JD NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143·, SEQ ID NO: 144, SEQ ED NO : 145 y 'SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho nueve sustituciones de aminoácido.

181. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18¡ y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: ( 5, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ÍD NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho diez sustituciones de aminoácido.

182. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 1 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NC : 3, SEQ ID NO: 4, 'SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ;ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ I 1D NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO : 145 y SEQ •ID NO: 146; en donde se han hecho 11 sustituciones de aminoácido.

183. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 181 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, i SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO: 28, SEQ I'D NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144 , SEQ ED NO : 145 y SEQ ID NO: I 358 146; en donde se han hecho 12 sustituciones de aminoácido.

184. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ¡SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ' ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ÍD NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 13 sustituciones de aminóácido.

185. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 \ y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ 'iD NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, i SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ I;D NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ 'ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y |SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 14 sustituciones de amirioácido .

186. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 181 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste én: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: I 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, 1 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ I 1D NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, 1 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 15 sustituciones de aminoácido.

187. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 i y 171, i caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste eñ: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ LD NO: 13, I SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ IC NO: 144 , SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 16 sustituciones de aminoácido.

188. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143 , SEQ ID NO : 144, SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 17 sustituciones de aminoácido.

189. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ,ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ¦ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ÍD I NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ IC NO: 144 , SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 18 sustituciones de aminoácido.

190. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18( y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste én: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO : 8, SEQ :ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ÍD NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ÍD NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ÍD NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144 , SEQ ID NO : 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho .19. sustituciones de aminoácido.

191. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 171, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ1 ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ 'ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ 'ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ I D NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146/ en donde se han hecho 20 sustituciones de aminoácido.

192. El polipéptido manipulado de conformidad con i cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 i y 171, I caracterizado porque el HD1 comprende una 5ß?µe???3 de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ 'ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ÍT> NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; en donde se han hecho 21 sustituciones de aminoácido.

193. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 143. '

194. El polipéptido manipulado de confo'rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 144.

195. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 145.

196. El polipéptido manipulado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el HDl es SEQ ID NO: 146.

197. Un método para tratar obesidad en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar periféricamente cantidades terapéuticamente eficaces de al menos dos agentes antiobesidad diferentes, en donde al menos ún agente antiobesidad es una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina, o un derivado de amilina (es decir, un agente de amilina) y al menos un agente antiobesidad es un polipéptido manipulado que comprende: un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) , y un primer dominio de hormona péptida (HDl) seleccionado de una leptina, ün análogo de leptina o un fragmento activo de la misma. ,

198. Un método de reducir el peso corporal en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar periféricamente cantidades terapéuticamente eficaces de al menos dos agentes antiobesidad diferentes, en donde al menos un agente antiobesidad es una amilina, un análogo de amilina, un agonista de amilina, o un derivado de amilina (es decir, un agente de amilina) y al menos un agente antiobesidad es un polipéptido manipulado que comprende: un polipéptido de dominio de unión a albúmina (ABD) , y un primer dominio de hormona péptida (HD1) seleccionado de una leptina, un análogo de leptina o un fragmento activo de la misma.

199. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 o 198, caracterizado porque el al menos un agente antiobesidad de amilina es un agonista de amilina.

200. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 199, caracterizado porque el agonista de amilina comprende un análogo o derivado de amilina.

201. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 200, caracterizado porque el análogo o derivado de amilina incluye pramlintida.

202. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 201, caracterizado porque el análogo o derivado de amilina comprende un compuesto descrito en la Tabla 4.

203. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 202, caracterizado porque el análogo o derivado de amilina incluye Des-Lysl- [Lys26 (mPEG40K) ] -pramlintida (SEQ ID NO: 214).

204. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 203, caracterizado porque el ABD comprende cualquiera de los péptidos seleccionados del grupo que consiste en: LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTLIGHILAALP (SEQ ID NO: 38) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP (SEQ ID, NO: 39) , LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO: 40) , LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO: 41) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP (SEQ ID NO: 42) , LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLI KAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 43) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO: 44) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP (SEQ ID NO: 45) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP (SEQ ID NO: 46) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP (SEQ ID NO: 47) , LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP (SEQ ID NO: 48) , LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID 'NO : 49) , LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50) , LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO : 51), y LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO: 52) .

205. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 204, caracterizado porque el HD1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 1 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ' ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: ,24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO; 145 y SEQ i ID NO: 146. 1

206. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 205, caracterizado porque el HD1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29;

207. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 206, caracterizado porque el polipéptido manipulado comprende un compuesto descrito en la Tabla 2.

208. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 207, caracterizado porque el polipéptido manipulado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ1 ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92,; SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ, ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 y SEQ ID NO: 107. !

209. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 208, caracterizado porque el polipéptido manipulado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.

210. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 208, caracterizado porque el polipéptido manipulado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: i 61. ¡

211. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 210, caracterizado porque lá cantidad eficaz del agente de amilina y la cantidad eficaz del polipéptido manipulado comprende una cantidad tal qué se logra una cantidad mayor de pérdida de peso cuando el (agente de amilina se administra en combinación con el polipéptido manipulado al sujeto, que la cantidad de pérdida de peso lograda cuando cualquiera de los agentes se administra solo.

212. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 211, caracterizado porque los dos agentes se administran al mismo tiempo. '

213. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 212, caracterizado porque los dos agentes se mezclan entre si.

214. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 213, caracterizado porque el BMI del sujeto es mayor que 25. <¦

215. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 214, caracterizado porque el BMI del sujeto es de 25 a 35. ;

216. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 215, caracterizado porque el BMI del sujeto es de 25 a 40.

217. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 216, caracterizado porque el BMI del sujeto es de 25 a 45.

218. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 217, caracterizado porque el BMI del sujeto es de 35 a 45.

219. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 218, caracterizado porque el BMI del sujeto se reduce a menos de 30.

220. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 219, caracterizado porque el BMI del sujeto se reduce a menos de 25.

221. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 220, caracterizado porque él BMI del I sujeto se reduce a la normalidad. ¡

222. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 221, caracterizado porque la 1 pérdida de peso se logra dentro de las 4 semanas de tratamiento. 1

223. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 222, caracterizado porque la ipérdida de peso se logra dentro de las 8 semanas de tratamiento. > i

224. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 223, caracterizado porque la Ipérdida de peso se logra dentro de las 12 semanas de tratamiento. i i

225. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 224, caracterizado porque la pérdida de peso se logra dentro de 20 semanas de tratamiento. >,

226. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 225, caracterizado porque la pérdida de peso se logra dentro de las 24 semanas de tratamiento. ¦

227. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 226, caracterizado porque el sujeto es humano . ,

228. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 227, caracterizado porque el sujeto es un humano obeso.

229. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 228, caracterizado porque la pérdida de peso se reduce en al menos 10%.

230. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 229, caracterizado porque la pérdida de peso se reduce en al menos 12%.

231. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 197 a 230, caracterizado porque la pérdida de peso se reduce en al menos 15%.