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MX2013001875A - Sustancias en particulas que comprenden particulas de ceramica para la entrega de biomoleculas. - Google Patents

Sustancias en particulas que comprenden particulas de ceramica para la entrega de biomoleculas.

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Publication number
MX2013001875A
MX2013001875A MX2013001875A MX2013001875A MX2013001875A MX 2013001875 A MX2013001875 A MX 2013001875A MX 2013001875 A MX2013001875 A MX 2013001875A MX 2013001875 A MX2013001875 A MX 2013001875A MX 2013001875 A MX2013001875 A MX 2013001875A
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MX
Mexico
Prior art keywords
particles
biomolecule
ceramic precursor
substance
ceramic
Prior art date
Application number
MX2013001875A
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English (en)
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MX373889B (es
Inventor
Christophe Jean Alexandre Barbe
Kim Suzanne Finnie
Toby Johnston Passioura
Samuel Knight
Original Assignee
Australian Nuclear Science Tec
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2010903683A external-priority patent/AU2010903683A0/en
Application filed by Australian Nuclear Science Tec filed Critical Australian Nuclear Science Tec
Publication of MX2013001875A publication Critical patent/MX2013001875A/es
Publication of MX373889B publication Critical patent/MX373889B/es

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Abstract

Una sustancia de partículas compuestas por partículas de una matriz cerámica que tiene un grupo funcional, el grupo funcional capaz de promover la penetración de las partículas en las células y una biomolécula de las partículas por la disolución de la matriz cerámica.

Description

SUSTANCIAS EN PARTÍCULAS QUE COMPRENDEN PARTÍCULAS DE CERÁMICA PARA LA ENTREGA DE BIOMOLÉCULAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a sustancias de partículas que comprenden partículas de cerámicas para la entrega de biomoléculas y métodos para hacerlas. Más particularmente, la invención se refiere a sustancias de partículas que comprenden partículas de una matriz cerámica que tienen un grupo funcional que tienen biomoléculas liberables dispuestas dentro de los poros de las partículas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso de la terapia genética de ARNip (Ácido ribonucleico de interferencia pequeña) representa un gran avance potencial en salud. Muestra el potencial para tratar una variedad de enfermedades actualmente no curables como la fibrosis quística, algunos tipos de cáncer y enfermedades inmunes tales como diabetes Tipo 1, esclerosis múltiple, etc.. Sin embargo, hay una necesidad de proteger los ARNip de la degradación enzimática en vivo hasta la entrega al sitio de acción con el fin de proporcionar terapia eficaz.
En la actualidad, el tratamiento de ARNip es costoso. Los principales mercados para tales terapias costosas son principalmente el de los países más desarrollados. El mercado global para la terapia genética se estima que sea mayor a 5B de US$.
Grandes retos en el desarrollo de la terapia de ARNip para uso clínico incluyen: • protección del material activo de la degradación enzimática; • permitir al material activo entrar en las células objetivo (buena penetración); • liberación de la materia activa de un encapsulante en el citoplasma (escape endosomal); · asegurar la capacidad de derribar genes (preferiblemente con eficacia a concentración nM); y • logro de baja toxicidad (gran ventana terapéutica).
Los ARNips son moléculas cargadas fuertemente negativas, hidrofílicas, de tamaños intermedios (aproximadamente de 14kDa, 3nm de diámetro, 10nm de longitud). Son tanto químicamente y biológicamente lábiles a menos que sean modificadas para mejorar la estabilidad. Con el fin de lograr un efecto clínico, los ARNips deben ser capaces de atravesar la membrana celular y estar presentes en el citoplasma de la población celular objetivo.
En el pasado, los vectores virales han sido explorados con el fin de entregar ARN o ADN. Sin embargo éstos sufren el riesgo de reacciones inmunológicas y son difíciles de poner en práctica. Varios vectores no-virales (por ejemplo, complejos de lípidos, complejos de polímero catiónico, liposomas, dendrímeros, nanopartículas poliméricas) también han sido explorados. Éstos ofrecen una gama de problemas, incluyendo dificultad en implementacion con ARNip, interacciones entre el ARNip y el vector, y exponer el ARNip a degradación en vivo. En particular, varios sistemas han sido concebidos para la adsorción de ADN o ARN en la superficie de nanopartículas. Sin embargo éstos generalmente sufren de la desventaja de que la biomolécula adsorbida está sujeta a ataque enzimático antes de la entrega al sitio de acción, reduciendo así la efectividad del tratamiento.
Mientras que la discusión anterior se refiere principalmente a ARNip y ADN, los problemas discutidos no se limitan al ARNip y al ADN. Potencialmente se aplican a una amplia gama de biomoléculas, incluyendo por ejemplo péptidos, proteínas y así sucesivamente, para el cual se desea entrega intracelular. Así una solución a estos problemas puede ser más ampliamente aplicable. La aplicación de la invención no debe por lo tanto considerarse limitada al ARNip.
Ventajosamente, la presente invención supera sustancialmente o mejora por lo menos uno o más de las desventajas arriba mencionadas y satisface al menos en parte la necesidad anterior.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de la invención se provee una sustancia de partículas que comprende: partículas de una matriz cerámica que tiene un grupo funcional, siendo capaz el grupo funcional de promover la penetración de las partículas en las células; y una biomolecula dispuesta dentro de los poros de las partículas, siendo liberable la biomolécula de las partículas por la disolución de la matriz cerámica.
Como se utiliza en este documento, en referencia a la biomolécula "dispuesta dentro de los poros de las partículas" pretende incluir dentro de su alcance modalidades donde la matriz cerámica, que efectivamente forma partículas porosas sólidas, tiene biomoléculas dispersas a lo largo o dispuestas en los poros de la matriz cerámica. Esto no pretende abarcar situaciones donde la biomolécula se adjunta o se une a la superficie exterior de las partículas.
En general, excepto posiblemente bajo condiciones relativamente extremas, la biomolécula es substancialmente no-libeable de las partículas por lixiviación en ausencia de disolución de la matriz cerámica. En ese sentido, como es usado en la presente, referente a la biomolécula que es "sustancialmente no-liberable por lixiviación en ausencia de disolución" pretende incluir dentro de su alcance lixiviación bajo las condiciones propuestas de almacenamiento y uso de la sustancia de partículas. Preferentemente, el grupo funcional interactúa con la biomolécula para prevenir substancialmente la lixiviación.
Preferentemente, el grupo funcional se distribuye homogéneamente a través de las partículas.
De conformidad con una modalidad de la invención, la matriz cerámica que tiene un grupo funcional comprende una matriz de dióxido de silicio o sílica funcionalizada. Sin embargo, una gama de óxidos metálicos, incluyendo óxidos metálicos mixtos puede ser adecuada, por ejemplo, titania, alúmina, circonio, óxido de hierro, ceria, óxido de zinc y así sucesivamente. El grupo funcional también puede ser proporcionado ya sea por un órganotitatnia o por un órgano- alúmina o por un órgano-silano que se co-condense con otro precursor de metal formando un órgano titania sílica u órgano-alumino-sílica. Modalidades adicionales se apreciarán de las discusiones referentes a la preparación de las partículas que siguen.
El grupo funcional de la matriz cerámica puede comprender cualquier grupo que efectivamente promueva la penetración de las partículas en las células. Por ejemplo, esto puede incluir un grupo amino. En una modalidad preferida el grupo funcional comprende un grupo de aminoalquilamino, un grupo alquilamino primario, un grupo alquilamino secundario y un grupo alquilamino terciario, un grupo de alquilimidazola, un grupo alquilamida o un grupo ácido alquilamino. Se apreciarán modalidades adicionales de las discusiones referentes a la preparación de las partículas que siguen.
La presente invención se refiere a una sustancia de partículas que comprende una biomolecula. En este contexto, el término "biomolecula" puede referirse a una sustancia de origen o naturaleza biológico y que tiene actividad biológica. El término incluye dentro de su ámbito una sustancia que comprende una o más moléculas incluyendo una mezcla de diferentes moléculas. La biomolécula puede ser una macromolécula. Puede tener un peso molecular de aproximadamente de 1 a aproximadamente 1000kDa, o más, o aproximadamente de 1 a aproximadamente 100, 1 a 50, 1 a 20, 1 a 10, 5 a 1000, 10 a 1000, 100 a 1000, 500 y 1000, 5 a 100, 5 a 50, 5 a 20 ó 10 a 20kDa, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000kDa. En algunos casos puede tener un peso molecular menor que 1 kDa o mayor que 1000kDa. Puede tener un diámetro de aproximadamente 0.5-20 nm, o aproximadamente de 1 a 20, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 0.5 a 10, 0.5 a 5, 0.5 a 2, 0.5 a 1 , 1 a 10, 2 a 10, 1 a 5, 5 a 10 ó 10 a 20 nm, por ejemplo aproximadamente 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 78, 9, 10, 15 ó 20nm.
La biomolécula puede seleccionarse dependiendo de la aplicación particular en cuestión. Para lograr la retención de la biomolécula en y/o sobre las partículas, puede ser cargada negativamente. Esto puede capacitar a la biomolécula para enlazarse a un grupo funcional en la matriz cerámica, por ejemplo a grupos de amina protonada en una matriz cerámica amino funcional. Alternativamente o adicionalmente la biomolécula puede tener otra funcionalidad que le permita enlazarse a los grupos funcionales de la matriz cerámica. Alternativamente o adicionalmente la biomolécula puede ser suficientemente grande (es decir, que tiene un peso molecular o volumen molecular suficientemente grande) que sea físicamente atrapada en las partículas. Puede ser lo suficientemente grande que sea incapaz de atravesar los poros de las partículas.
En ciertas modalidades la biomolécula puede ser ácido nucleico como un ARN, por ejemplo un ARNip (ARN interferente pequeño), ARNmi (ARNmicro) o un ribozima, un ASODN (nucleótido antisentido o ARN antisentido), una molécula de ADN, un aptámero, una proteína que incluye polipéptidos, péptidos, glicoproteínas, lipoproteínas, inmunoglobulinas (por ejemplo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos), un carbohidrato, un lípido o una mezcla o aducción de cualquiera dos o más de estas. En una modalidad particular la biomolécula es un ARNip. La biomolécula se puede indicar para tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad, trastorno o condición.
En algunas modalidades será ventajoso enlazar un agente de tratamiento de superficie a la superficie de las partículas. En una modalidad preferida, cadenas de polietilenglicol o glicol de polietileno (PEG) están acopladas a la superficie de las partículas. Alternativa o adicionalmente, un grupo objetivo puede ser acoplado a la superficie de las partículas para facilitar la orientación de las partículas a un objetivo, por ejemplo un tumor u órgano particular u otro objetivo, en uso. En ciertas modalidades, cadenas de PEG que tienen grupos objetivo en sus extremos distales pueden ser acopladas a las partículas.
En ciertas modalidades, puede preferirse que las partículas de la sustancia de partículas tengan un tamaño medio de partícula de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 miera. Sin embargo, pueden tener un tamaño medio de partícula de aproximadamente 0.1 a 10 mieras, o aproximadamente 0.1 a 5, 0.1 a 2, 0.1 a 1, 0.1 a 0.5, 0.2 a 10, 0.5 a 10, 1 a 10, 2 a 10, 5 a 10, 0.2 a 2, 0,2 a 1 , 0.2 a 0.5, 0.5 a 2 ó 0.5 a 1 miera, por ejemplo aproximadamente 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mieras.
En algunas modalidades, puede ser preferido que el tamaño medio de partícula sea menor a 0.1 mieras. Por ejemplo, puede ser de aproximadamente 20 a 100nm (0.1 mieras), o aproximadamente de 20 a 50nm, o aproximadamente de 50 a 100nm, por ejemplo aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 nm.
Cabe señalar que las partículas por encima de aproximadamente 1-2 mieras de tamaño pueden ser inadecuadas para el transporte intracelular. Sin embargo, se considera que pueden ser útiles para la entrega de proteínas más grandes en otros lugares en el cuerpo. En ese sentido, se pueden internalizar partículas de hasta varias mieras, particularmente por las células fagocitóticas especializadas.
Las partículas pueden ser substancialmente monodispersadas o puede haber alguna agregación para formar un segundo pico en la curva de distribución de tamaño de partícula. La curva de distribución puede ser normal, Gaussiana o alguna otra distribución. Las partículas pueden tener una distribución de tamaño de partícula amplia o una distribución de tamaño de partícula media o estrecha. Las partículas pueden ser esféricas, o aproximadamente esféricas, o pueden ser ovoides u oblatas esféricas o poliédrica (teniendo por ejemplo de 8 a aproximadamente 60 lados) o pueden ser de alguna otra forma. Puede ser de formas irregulares.
Las partículas pueden ser mesoporosas (es decir de tamaño del poro < 100nm). Pueden ser microporosas (es decir, de tamaño del poro < 1.7nm). Preferentemente, las partículas tienen un tamaño medio del poro de aproximadamente 1 a aproximadamente 50nm. Por ejemplo, el tamaño medio del poro puede ser aproximadamente de 1 a 20, 1 a 10, 5 a 50, 10 a 50, 20 y 50, 5 a 20, 5 a 10 ó 10 a 20 nm, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 50nm.
La estructura del poro puede comprender poros interconectados o puede comprender vacíos unidos por canales de interconexión relativamente pequeños. El tamaño del poro puede ser lo suficientemente pequeño para evitar la liberación de la biomolécula substancialmente por la difusión de los poros. Alternativamente, si el tamaño del poro es tal que la biomolécula puede escapar, la biomolécula puede retenerse por atracción a grupos funcionales en las superficies del poro.
Los grupos funcionales pueden ser los mismas o diferentes a aquellos que promueven la penetración de las partículas en las células.
Las partículas pueden tener una carga de biomoléculas de alrededor de 1 a aproximadamente el 20% peso/peso, por ejemplo de 1 a 10, 1 a 5, 1 a 2, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 2 a 10, 2 a 5 ó 5 a 10%, por ejemplo sobre 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20%, aunque en algunos casos puede ser menos del 1% o puede ser mayor al 20%.
En uso, la biomolécula es liberable ventajosamente por la disolución de las partículas bajo condiciones que no degradan substancialmente la biomolécula. Por ejemplo, puede ser liberable por disolución de las partículas por un medio biológico que no degrade substancialmente la biomolécula. Como alternativa puede ser liberable cuando se diluya en un líquido de liberación adecuado.
Generalmente, la biomolécula es liberable (es decir, completamente substancialmente liberable) sobre un período de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 horas. Por ejemplo, aproximadamente de 0.5 a 20, 0.5 a 10, 0.5 a 5, 0.5 a 2, 1 a 50, 5 a 50, 10 a 50, 1 a 20, 1 a 10, 2 a 10 ó 5 a 10 horas, por ejemplo de aproximadamente 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 horas. Mientras que la tasa de disolución puede ser dependiente del tamaño de las partículas, esta relación puede ser ajustada ajustando el tamaño de las partículas, como se explica en la siguiente descripción.
Más ventajosamente, la biomolécula está protegida de la degradación antes de su liberación de las partículas cuando las partículas están expuestas a un agente de degradación, por ejemplo una enzima, que de otra forma sería capaz de degradar la biomolécula. Es decir, la biomolécula está protegida contra la degradación por la matriz cerámica.
En algunas modalidades, está previsto que un polímero o un agente de complejos pueda estar dispuesto en los poros de las partículas con la biomolécula para facilitar el escape endosomal. Típicamente, el polímero podría ser una polietilinamina, una polilisina, o una polihistidina o cualquier sustancia que proporcione un efecto de esponja de protones.
Formación de micro - partículas (> 100nm) En algunas modalidades, puede ser ventajoso formar partículas en la escala micro. Es decir, para el propósito de esta descripción, partículas de más de 100nm en tamaño medio de partícula.
De conformidad con otro aspecto de la invención, se provee un proceso para la fabricación de partículas que comprende una biomolécula dispersa en sus poros, comprendiendo dicho proceso: a) combinar: una fase hidrofóbica que comprende un líquido hidrofóbico, un primer precursor cerámico y un surfactante; y una fase hidrofílica que comprende un líquido hidrofílico, un segundo precursor cerámico y la biomolécula, con el fin de formar una emulsión que comprende gotas de la fase hidrofílica dispersas en la fase hidrofóbica; y b) agitar la emulsión mientras las partículas se forman dentro de las gotas; en donde el primer precursor cerámico comprende un grupo funcional que es capaz de promover la penetración de las partículas en las células.
En este documento el término "agitación" incluye dentro de su alcance cualquier forma de agitación, incluyendo pero no limitado a revolver, agitar, girar, sonicar, cizallamiento y así sucesivamente y cualquier combinación de éstos.
En la fabricación de las partículas, se forma una emulsión mediante la combinación de una fase hidrofóbica con una fase hidrofílica. Esto puede ser una emulsión de agua-en-aceite (a/a), en la cual la fase hidrofóbica representa la fase continua y la fase hidrofílica representa la fase dispersa o discontinua.
La fase hidrofóbica puede ser una fase oleofílica o una fase lipofílica. La fase hidrofóbica puede hacerse combinando el surfactante con el líquido hidrofóbico y añadiendo el primer precursor cerámico a fin de formar la fase hidrofóbica, o se puede hacer mediante la combinación de los tres componentes, o se puede hacer mediante la combinación del primer precursor cerámico con ya sea el líquido hidrofóbico o el surfactante y luego agregando el otro. Estos pasos se llevan a cabo preferentemente antes de combinar las fases hidrofílicas e hidrofóbicas. Cada paso de la combinación puede comprender agitar los componentes que se han combinado. La agitación puede comprender revolver, agitar, girar, sonicar, cizallar o una combinación de éstos. Puede ser suficiente para los componentes formar una solución. Así la fase hidrofóbíca puede representar una solución del primer precursor cerámico y el surfactante en el líquido hidrofóbico.
La fase hidrofóbíca consta de 3 componentes: Líquido hidrofóbico - esto puede ser, por ejemplo, un aceite vegetal, aceite de parafina, aceite mineral o algún otro líquido hidrofóbico adecuado. Puede comprender una mezcla de componentes hidrofóbicos, por ejemplo una mezcla de aceites vegetales o una mezcla de aceite vegetal y aceite de parafina. Es comúnmente de viscosidad moderada, por ejemplo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1500 mPa.s, o aproximadamente de 0.5 a 1000, 0.5 a 500, 0.5 a 250, 0.5 a 100, 0.5 a 50, 0.5 a 20, 0.5 a 10, 0.5 a 5, 0,5 a 1 , 1 a 1500, 10 a 1500, 100 a 1500, 250 a 1500, 500 a 1500, 1000 a 1500, 10 a 1000, 10 a 200, 200 a 1000 ó 200 a 500mPa.s, por ejemplo aproximadamente 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 100, 1200, 1300, 1400 ó 1500mPa.s, o, en algunas ocasiones, más de 1500mPa.s. La viscosidad del líquido hidrofóbico puede utilizarse para controlar el tamaño de partícula de las partículas producidas por el proceso. Así un líquido hidrofóbico más viscoso generalmente proporcionará una fase hidrofóbica más viscosa, que a su vez proporcionará generalmente un tamaño de partícula más pequeño.
Surfactante - este puede ser un surfactante adecuado para soportar una emulsión de agua en aceite. Puede ser soluble en, o miscible con, el líquido hidrofóbico. Puede ser un surfactante no iónico o puede ser un surfactante aniónico o puede ser un surfactante zwitteriónico. Puede tener un HLB de aproximadamente 8 a aproximadamente 16, o de aproximadamente 8 a 12, 10 a 16 u 8 a 10, por ejemplo aproximadamente 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ó 16. Surfactantes adecuados incluyen Span ® 20 (monolaurato de sorbitan), Aerosol ® OT (sulfosuccinato de sodio bis(2 - etilhexil)), mezclas de Span ® 20/Tween ® 80 y mezclas de Span ® 20/Brij ® 35. El uso de los surfactantes mezclados comúnmente proporciona una emulsión muy fina, pero el tamaño de partícula final es generalmente sin cambios.
Primer precursor cerámico - Este componente incluye un grupo funcional capaz de promover la penetración de las partículas resultantes en las células. En ciertas modalidades, el grupo funcional del primer precursor cerámico es capaz de interactuar químicamente con, por ejemplo electrostáticamente interactuar con, la biomolécula.
Este componente puede ser por ejemplo amino funcional. Alternativamente, pueden utilizarse otros grupos cargados positivamente o grupos que pueden volverse positivamente cargados. Puede ser un compuesto que tenga al menos un grupo amino por molécula y que sea capaz de ser convertido en una matriz cerámica amino funcional. Puede ser soluble en el líquido hidrofóbico, o en una mezcla (opcionalmente una solución) del surfactante en el líquido hidrofóbico.
Precursores de cerámicas convenientes incluyen silanos aminofuncionales, en particular alcoxisilanos aminofuncionales. Los grupos alcoxi de estos silanos pueden ser por ejemplo grupos alcoxi C1 a C6 (que pueden ser ramificados si C3 o mayor), comúnmente alcoxi C1 a C4, por ejemplo, grupos metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi o butoxi. En algunos casos pueden utilizarse otros grupos idrolizables, e.g. acetoxy, ketoximo, enoloxy etc.. El precursor de cerámica aminofuncional puede tener más de un grupo amino por molécula, por ejemplo 2, 3, 4 ó 5 grupos amino por molécula. Los inventores han encontrado que los precursores diamino y triamino cerámicos comúnmente producen partículas que son más eficaces en el enlace de biomoléculas adecuadas que los correspondientes precursores monoamino cerámicos. Cada grupo amina puede, independientemente, ser primario, secundario o terciario. En precursores preferidos, los grupos amino están separados por grupos de enlace, comúnmente cadenas alquileno cortas tales como etileno (- CH2CH2-), propileno (- CH2CH2CH2-) o cadenas de butileno (-CH2CH2CH2CH2-). Los inventores consideran que el grupo de butileno puede ser particularmente útil porque este grupo se produce en forma natural en ligandos de polinucleótido de poliamina como putrescina (N- 4-N), espermidina (N-3-N-4-N) y espermina (N-3-N-4-N-3-N). Varias combinaciones que inluyen pentileno y hexileno también pueden ser útiles, sin embargo, grupos que son demasiado diferentes a la configuración biogénica pueden ser potencialmente tóxicos. En particular, los inventores consideran que los espaciadores de etileno proporcionan una distancia entre los grupos amino que es aceptablemente cercana a los espaciamientos de cargas en ARNip y está presente en productos comercialmente disponibles, haciendo este espaciador adecuado para su uso cuando la biomolécula es un ARNip. Así los precursores adecuados incluyen 3-(2-aminoetilamino) propil trimetoxisilano, 3-[2-(2-aminoetilamino) etilamino] propil trimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino) propil trietoxisilano o 3-[2-(2-aminoetilamino) etilamino] propil trietoxisilano y mezclas de dos o más de ellos. Otros compuestos que pueden utilizarse como el primer precursor cerámico son ureapropil trialcoxisilano, alcoxisilanos funcionales de isocianato, alcoxisilanos funcionales carboxílicos, alcoxisilanos mercaptofunctionales (por ejemplo, trialcoxisilanos de mercaptopropylo), péptidos catiónicos o carbohidratos o lípidos injertados a alcoxisilanos etc.. También se pueden utilizar mezclas de dos o más de estos, o de cualquier otro primer precursor cerámico adecuado.
En algunos casos el primer precursor cerámico puede ser una mezcla. Puede ser una mezcla de precursores de cerámica de silano. Además, puede comprender adicionalmente uno o más precursores cerámicos no de silano, por ejemplo un precursor de circonia, un precursor de alúmina o un precursor de titania. Estos pueden ser por ejemplo alcóxidos de circonio, alcóxidos de aluminio y alcóxidos de titanio respectivamente.
Comúnmente la proporción del surfactante al líquido hidrofóbico es de 5 a aproximadamente 25% p/v (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 gr de surfactante a 100 mi de líquido hidrofóbico) o aproximadamente 5 a 20, 5 a 15, 10 a 25, 15 a 25 ó 10 a 20%, por ejemplo aproximadamente 5, 10, 15, 20 ó 25%.
Comúnmente la relación entre el primer precursor de cerámica al líquido hidrofóbico es aproximadamente de 10 a aproximadamente 1000 ppm en una base de v/v (volumen/ volumen), o aproximadamente de 10 a 500, 10 a 200, 10 a 100, de 10 a 50, 20 a 1000, 50 a 1000, 100 a 1000, 200 a 1000, 500 a 1000, 20 a 500, 50 a 500, 50 a 200, 200 a 500 ó 50 a 200 ppm, por ejemplo aproximadamente 10, 20, 304, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 ppm.
La fase hidrofílica puede ser una fase lipofóbica. Puede ser una fase acuosa. La fase hidrofílica consta de tres componentes: Líquido hidrofílico - este puede ser lipofóbico. Es comúnmente acuoso, por ejemplo puede ser agua, incluyendo agua pura, o una solución acuosa. También puede contener sales disueltas.
Segundo precursor cerámico - esto puede ser un silicato soluble en agua, particularmente metasilicato. Puede ser el mismo silicato (por ejemplo, por la hidrólisis de un tetraalquilsilicato tal como tetrametilortosilicato o tetraetilortosilicato), o puede ser una especie de fórmula RSi(OR')xOHySi2 donde x + y + z = 3 (referidos en la presente como un alquilsilicato, generado por ejemplo por la hidrólisis de un alquiltrialcoxisilano, por ejemplo metiltrimetoxisilano o etiltrimetoxisilano). En el caso de un alquilsilicato, el grupo alquilo R debe ser lo suficientemente pequeño o suficientemente hidrofílico que el segundo precursor de cerámica sea soluble en agua. Se entenderá que esto puede lograrse por ejemplo con grupos R pequeños tales como metilo o etilo, o con grupos R más grandes que tengan sustituyentes hidrofílicos o polares como hidroxilo, nitro, sulfato, etc..
El segundo precursor de cerámica puede ser, por ejemplo, vidrio soluble. El vidrio soluble es un material de silicato oligomérico o poliméricos con fórmula empírica aproximadamente Na2Si03, con diversos grados de hidratación, comúnmente en solución acuosa. El vidrio soluble puede tener un contenido de sólidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20%, o aproximadamente de 1 a 10, 1 a 5, 1 a 2, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 2 a 10, 2 a 5 ó 5 a 10%, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20%. Esto puede tener aproximadamente de 25 a aproximadamente el 30% de sílica y alrededor de 1 a aproximadamente 20% de hidróxido de sodio en agua. Se puede diluir en un factor de aproximadamente 1 :2 a aproximadamente 1 :10 en agua, o aproximadamente 1 :2 a 1 :5, 1 :5, a 1 :10 ó 1 :3 hasta 1:8, por ejemplo aproximadamente 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8, 1 :9 ó 1 :10.
El segundo precursor cerámico puede ser también un alcóxido de titanio (por ejemplo etóxido, iso y n propóxido, butóxido n, secundario y terciario) o un alcóxido de aluminio o un alcóxido de circonio o un alcóxido de metal modificado (por ejemplo modificado con acetil acetona o ácido acético). También podría ser un alcóxido de metal mezclado. También podría ser otra sal de metal como sal de magnesio, sal de circonio o sal de aluminio para formar silicato de magnesio, silicato de aluminio y así sucesivamente. Puede ser un alcóxido de silicio prehidrolizado.
El segundo precursor cerámico puede abarcar un coloide cerámico, por ejemplo sílica coloidal. El coloide cerámico puede tener un diámetro de partícula por debajo de 50 nm, o por debajo de 40, 30, 20 ó 10 nm, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 5 a 20, 5 a 10, 10 a 50, 20 a 50 ó 10 a 20 nm. Puede tener un diámetro de partícula (comúnmente diámetro de partícula medio pero opcionalmente diámetro de partícula máximo) de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50nm.
En algunos casos el segundo precursor cerámico puede abarcar una combinación de dos o más de las opciones anteriores, por ejemplo puede abarcar una mezcla de un silicato de agua con sílica coloidal.
Biomolécula - diversas opciones para la biomolécula son mencionadas anteriormente. Como se ha señalado, esta puede ser cargada negativamente o puede ser cargada neutralmente. Puede ser cargada negativamente lo suficientemente para ser atraídas a, opcionalmente unida a, el grupo funcional de las partículas (derivado del primer precursor cerámico). Puede ser, o puede comprender, un ARN, por ejemplo un ARNip (ARN interferente pequeño), ARNmi (microARN), ASODN (nucleótido antisentido o ARN antisentido), un aptámero, un ADN, una proteína, una glicoproteína, un polipéptido, un carbohidrato o una mezcla o aducción de cualquiera dos o más de estas.
Además un agente de polímero o complexante podría añadirse de tal forma que sea dispuesto dentro de los poros de las partículas con la biomolécula para facilitar el escape endosomal. Típicamente el polímero podría ser una polietilinamina, una polilisina, o una polihistidina o cualquier sustancia que proporciona un efecto de esponja de protones.
La fase hidrofílica puede ser ácida. Puede tener un pH por debajo de pKa del primer precursor cerámico (o de su ácido conjugado si el precursor cerámico es una base, por ejemplo en un precursor de cerámica aminofuncional). La fase hidrofílica puede tener un pH de menos de 10.5, o menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5.5, 5, 4.5 ó 4 o entre aproximadamente 3 y 10.5, 5 y 10.5, 7 y 10.5, 9 y 10.5, 7 y 10, 9 y 4, 7 y 4, 9 y 7, 5 y 7, 3 y 6 o aproximadamente 3 a 5, 3 a 4, 4 a 6, 4 a 5 ó 3.5 a 4.5, por ejemplo aproximadamente 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 ó 6.
Comúnmente al preparar la fase hidrofílica el líquido hidrofílico y el segundo precursor cerámico son combinados, opcionalmente el segundo precursor cerámico es disuelto en el líquido hidrofílico. El proceso puede abarcar posteriormente ajustar el pH a un pH por debajo de pKa del primer precursor cerámico, por ejemplo un pH menor de aproximadamente10.5, o a un pH ácido, por ejemplo a un pH de menos de aproximadamente 7, o menos de aproximadamente 5 o menos de aproximadamente 4 y añadir la biomolécula para así formar la fase hidrofílica. Por ejemplo, en caso de que el segundo precursor cerámico es silicato sódico o sílica coloidal, esto frecuentemente resulta en una solución básica. Por lo tanto, el proceso puede abarcar acidificar esta solución.
La acidificación puede lograrse convenientemente al exponer la solución a una resina de intercambio catiónico en la que, antes de dicha exposición, la resina está en su forma de ácido (protonada). La exposición puede abarcar combinar la resina y la solución, opcionalmente agitar la mezcla resultante y luego separar la resina de la solución acidificada (por ejemplo, por filtración, decantación, centrifugación, etc.), o puede abarcar pasar la solución a través de un lecho de la resina. La proporción de resina al segundo precursor cerámico puede ser tal que se logra el pH deseado (como se describió anteriormente). Alternativamente el segundo precursor cerámico puede ser acidificado por adición de un agente de acidificación (por ejemplo un ácido) o de un tampón adecuado.
Comúnmente la biomolécula se añadirá a la solución acidificada, poco antes de que la fase hidrofílica y la fase hidrofóbica son combinadas. Se puede agregar inmediatamente antes de que se combinen. Se pueden añadir menos de 2 minutos antes de que se combinen, o menos de aproximadamente 1 minuto, o menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 15 ó 10 segundos antes de que se combinen, por ejemplo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ó 120 segundos antes de que se combinen. Esto reduce la posibilidad de reacciones químicas adversas de la ocurrencia de la biomolécula.
La biomolécula puede estar presente en la fase hidrofílica en cantidad suficiente para lograr la carga deseada en las partículas finales. Una concentración típica de biomolécula en la fase hidrofílica es de alrededor de 1 a aproximadamente 10 mg/ml, o aproximadamente 1 a 5, 5 a 10 ó 2 a 8, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mg/ml. La biomolécula puede añadirse al líquido hidrofílico combinado / segundo precursor cerámico en forma de una solución. El solvente para esta solución debe ser miscible con el líquido hidrofílico, y comúnmente es el mismo que el líquido hidrofílico. La biomolécula puede añadirse en solución acuosa.
En la formación de la emulsión, las fases hidrofílicas e hidrofóbicas se combinan, opcionalmente con agitación. La agitación puede abarcar uno o más de revolver, agitar, girar y sonicar. Una manera eficaz para hacer la emulsión es preparar la fase hidrofóbica como se describe anteriormente y someterla a agitación y sonicación simultáneamente en preparación para la adición de la fase hidrofílica. La fase hidrofílica entonces se prepara combinando la biomolécula con el segundo precursor de cerámica y el líquido hidrofílico combinados (por ejemplo solución de silicato sódico acuosa acidificada), y la fase hidrofílica resultante se agrega lo más rápidamente posible a la fase hidrofóbica sonicada y agitada manteniendo la sonicación. La sonicación puede continuarse por un corto tiempo después de la adición, por ejemplo aproximadamente de 10 a aproximadamente e 120 segundos, o aproximadamente 10 a 60, 10 a 30, 20 a 120, 60 a 120, 20 a 60 ó 20 a 40 segundos, por ejemplo aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 ó 120 segundos. El sonicado comúnmente se desactiva tras un período adecuado con el fin de evitar el sobrecalentamiento de la emulsión. Tal recalentamiento podría por ejemplo afectar adversamente la biomolécula. La sonicación puede llevarse a cabo en una potencia de aproximadamente 200 a 2000W, o aproximadamente 200 a 1000, 200 a 500, 500 a 2000, 1000 a 2000, 500 a 1000 ó 600 a 800W, por ejemplo aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 Ó 2000W.
La proporción de fase hidrofóbica a fase hidrofílica puede ser de aproximadamente 10 a 50 (es decir, aproximadamente 10:1 a aproximadamente 50:1 ), o aproximadamente 10 a 40, 10 a 30, 10 a 20, 20 a 50, 30 a 50, 40 a 50, 20 a 40 ó 25 a 25, por ejemplo aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50.
Puede ser suficiente para la relación molar del primer precursor cerámico a el segundo precursor cerámico que sea aproximadamente 0.2 a aproximadamente 20% mol, o aproximadamente de 0.5 a 20, 1 a 20, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 0.2 a 10, 0.2 a 5, 0.2 a 2, 0,2 a 1 , 1 a 10, 1 a 5 ó 5 a 10, por ejemplo aproximadamente 0.5, 1 , 1 .5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19 ó 20 %mol. En el caso de que el primer precursor cerámico es, o comprende, un silano aminofuncional, la relación del primer precursor cerámico al segundo precursor cerámico puede variarse con el fin de variar la carga en las partículas. Por lo tanto si la cantidad es baja (por ejemplo aproximadamente 1 % mol en relación al segundo precursor cerámico), las partículas serán aproximadamente de carga neutra, mientras que si la cantidad es mayor (alrededor de 10 % mol) se cargará positivamente. Si no se añade ningún silano aminofuncional (o cantidades muy bajas, por ejemplo menos de aproximadamente 0.5 %mol) las partículas pueden cargarse negativamente.
En la emulsión preparada como se describió anteriormente, las gotas de la fase hidrofílica pueden tener un diámetro promedio de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 micrones, o aproximadamente de 0.1 a 5, 0.1 a 2, 0.1 a 1 , 0.1 a 0.5, 0.2 a 10, 0.5 a 10, 1 a 10, 2 a 10, 5 a 10, 0.2 a 2, 0.2 a 1 , 0.2 a 0.5, 0.5 a 2 ó 0.5 a 1 micrón, por ejemplo aproximadamente 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 micrones. La media puede ser un número promedio o un diámetro promedio de peso. Las gotas pueden ser substancialmente monodispersadas o puede haber alguna agregación para formar un segundo pico en la curva de distribución. Las gotas pueden tener una distribución de tamaño de partícula amplio o una distribución de tamaño de partícula medio o estrecho.
Se piensa que las partículas se forman dentro de las gotitas por la interacción del primer y segundo precursores cerámicos. La condensación de los precursores para formar las partículas es comúnmente muy rápida (milisegundos a segundos). La interacción puede ser una reacción. Puede ser una condensación. Pueden abarcar la hidrólisis del primer precursor cerámico. Se ha observado que si el primer precursor cerámico es aminofuncional y se agrega a la fase hidrofílica directamente, rápida gelificación ocurre de modo que se evita la formación de partículas de tamaños adecuadamente.
Las fases hidrofílicas e hidrofóbicas combinadas pueden ser revueltas o agitadas de otra forma por tiempo suficiente para la formación de las partículas. Esto puede depender al menos en parte de la temperatura de la reacción. La formación de partículas puede realizarse a cualquier temperatura adecuada, por ejemplo, a temperatura ambiente, o a aproximadamente de 10 a aproximadamente 35°C, o aproximadamente 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20, 15 a 35, 20 a 35, 25 a 35, 15 a 30, 15 a 20 o de 20 a 25°C, por ejemplo aproximadamente 15, 20, 25, 30 ó 35°C. Puede ser realizado a una temperatura inferior a la temperatura de desnaturalización de la biomolécula. La formación de las partículas puede tardar aproximadamente unos 10 a aproximadamente 120 minutos, aunque las fases combinadas pueden ser revueltas o agitadas de otra forma durante más de esto, si lo desea. Tiempos adecuados son de aproximadamente 10 a 100, 10 a 60, 10 a 30, 20 a 120, 30 a 120, 60 a 120, 30 a 90 o 45 a 75 minutos, por ejemplo aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75. 80, 85, 90, 95, 100, 05, 110, 115 ó 120 minutos.
Una vez que se han formado las partículas, pueden ser funcionalizadas de la superficie. Esto puede ser alcanzado in situ, es decir, sin separación o aislamiento de las partículas. Puede abarcar añadir un agente de tratamiento de superficie a la emulsión tras la formación de las partículas de manera que se trate la superficie de las partículas. La funcionalización de la superficie puede ser una PEGilación (es decir, agregar cadenas de polietilenglicol a la superficie). El agente de tratamiento de superficie puede abarcar una cadena de polietilenglicol (PEG) acoplada a un grupo de enlace. La cadena de PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 1 a 20kDa, o aproximadamente 1 a 10, 1 a 5, 1 a 2, 2 a 20, 5 a 20, 10 a 20, 2 a 10, 2 a 5 ó 5 a 10kDa, por ejemplo aproximadamente 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20kDa. El grupo de enlace puede ser un trialkoxisilano, es decir, el agente de tratamiento de superficie puede ser un PEG de trialkoxisililo. Grupos alcoxi adecualdos incluyen metoxi, etoxi o propoxy. Otros grupos de sililo hidrolizable también pueden utilizarse, por ejemplo triacetoxi, trioximo, trienoloxi, triamido etc.. La superficie de las partículas puede ser funcionalizada mediante hacer reaccionar la superficie con un PEG (u otra molécula adecuada) que tiene un grupo funcional que reacciona ya sea con el OH de la superficie o con los grupos amino incorporados dentro y en la superficie de las partículas. Por ejemplo un agente de tratamiento de superficie PEG de carboxilo funcional puede utilizarse para formar una amida con grupos amina de superficie en las partículas, o los grupos amina de superficie pueden ser activados (por ejemplo, mediante la formación de grupos de succinimidilo o de grupos de isotiocianato) y luego reaccionados con agentes de tratamiento de superficie PEG aminofuncionales.
Los grupos de PEG son generalmente grandes (típicamente > 1 KDa) de manera que ellos no penetrarán dentro de la esfera, sino que mas bien se injertarán principalmente sobre la superficie de las partículas. Una gama de PEGs funcionales está disponible en el mercado que son adecuados para este injerto, por ejemplo PEG-isotiocianato modificado y PEG-carboxy-modificado, que ambos producirán uniones amida cuando reaccionen con aminas en la superficie de las partículas.
La funcionalización de la superficie posterior, por ejemplo la PEGilación, con el fin de functionalizar la superficie de las partículas, puede ser limitada pero adecuada en condiciones básicas. En condiciones básicas el primer precursor cerámico (por ejemplo, un aminosilano como aminoetilaminopropiltrietoxisilano) puede añadirse en algunos casos directamente al segundo precursor cerámico (por ejemplo silicato sódico o sílica coloidal). En algunos casos el pH de la fase hidrofílica no está por debajo de pKg del primer precursor de cerámica. En tales casos, la suspensión inicialmente formada de partículas (hechas bajo condiciones básicas) puede ser posteriormente acidificada. Esto puede servir para promover la unión de la biomolécula a las partículas si la biomolécula se carga negativamente. Si las partículas son posteriormente tratadas de la superficie, la acidificación puede realizarse antes o durante el tratamiento superficial posterior para facilitar la unión del PEG-silano. Sin la presencia de cargas positivas en las partículas, la liberación de la biomolécula puede ser muy rápida (del orden de minutos) a menos que sea suficientemente grande para evitar su fuga a través de los poros de las partículas.
En algunos casos el agente dé tratamiento de superficie puede comprender un grupo objetivo para apuntar a un objetivo en un paciente. Por ejemplo, el agente de tratamiento de superficie puede comprender un PEG-trialcoxisilil que tenga el grupo objetivo en el extremo distal del PEG, es decir, puede tener la estructura de trialcoxisilil - PEG - grupo objetivo. El objetivo puede ser por ejemplo un tumor o un órgano particular o algún otro objetivo. El grupo objetivo puede ser por ejemplo un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo un Fab). Ejemplos de grupos objetivos adecuados incluyen anticuerpos, citoquinas peptídicas, hormonas peptídicas, proteínas de matriz, células - receptoras de superficie, proteínas implicadas en la adhesión celular, las proteínas implicadas en el reconocimiento celular, proteínas involucradas en la motilidad celular, las proteínas implicadas en el reclutamiento celular, las proteínas implicadas en la diferenciación celular, proteínas implicadas en el reconocimiento de la enfermedad, carbohidratos biológicamente activos tales como la heparina y sustancias relacionadas, glicoproteínas biológicamente activas incluyendo pero no limitadas a aquellas que caen dentro de las clases mencionadas anteriormente, ligandos de cualquier miembro de las clases anteriores, fragmentos de cualquier miembro de las clases anteriores, homólogos de cualquier miembro de las clases anteriores, sustancias de bajo peso molecular que comparten la afinidad o la función de cualquier miembro de las clases anteriores, otras biomoléculas de bajo peso molecular tales como hormonas, nutrientes, drogas, toxinas, neurotransmisores, transmisores endocrinos, transmisores de autocrina y paracrina, pigmentos, lípidos, aceites, ligandos de ion, metabolitos, catabolitos, etc..
El agente de tratamiento de superficie puede añadirse directamente a la suspensión de partículas en la fase hidrofóbica. La reacción puede realizarse adecuadamente a alrededor de la temperatura ambiente, por ejemplo revolviendo durante un tiempo adecuado para lograr la reacción. Tiempos adecuados son de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 8 a 16, 8 a 12, 12 a 24, 18 a 24 ó 12 a 18 horas, por ejemplo aproximadamente 8, 12, 16, 20 ó 24 horas. Se puede utilizar suficiente agente de tratamiento de superficie para lograr un nivel adecuado de funcionalización superficial, por ejemplo, suficiente para evitar la agregación de las partículas excesiva o suficiente para proporcionar orientación aceptable de las partículas a el objetivo en uso.
Una vez que las partículas se han formado, es común que no estén completamente secas. Esto inhibe la agregación de las partículas, que, si ésta hubiera ocurrido, sería necesario resuspensión que en algunas circunstancias puede ser difícil. Comúnmente las partículas son separadas de la solución por centrifugación. Las condiciones adecuadas son de aproximadamente 10000 a 50000rpm, o aproximadamente de 10000 a 30000, 30000 a 50000 ó de 20000 a 30000rpm, por ejemplo aproximadamente 10000, 20000, 30000, 40000 ó 50000rpm. La separación adecuada se logra comúnmente en aproximadamente 5 a 15 minutos, aunque a veces puede utilizarse una centrifugación mayor.
Las partículas resultantes pueden lavarse con el fin de eliminar las impurezas. El proceso de lavado puede implicar resuspender las partículas en un solvente, permitiendo a las partículas que al menos se separen parcialmente del solvente (por ejemplo, mediante ajuste y/o mediante centrifugación) y decantar el solvente de las partículas. Es importante que el solvente sea uno que no desnaturalice la biomolécula. Esto puede ser específico a la biomolécula particular utilizada. Por ejemplo etanol no afecta a la estructura del ADN o ARN pero puede desnaturalizar las proteínas más grandes. Solventes adecuados para lavado incluyen hidrocarburos tales como hexano, ciclohexano, tolueno, etc. y alcoholes como el etanol o isopropanol. Las partículas pueden lavarse varias veces (por ejemplo 2, 3, 4 ó 5 o más veces), ya sea con el mismo solvente o con diferentes solventes.
Las partículas resultantes pueden ser resuspendidas en un solvente adecuado y almacenadas como una suspensión en ese solvente para su uso posterior. Este solvente puede ser un solvente clínicamente aceptable si las partículas han de ser entregados a un paciente. Un solvente adecuado para el almacenamiento es etanol. Comúnmente se almacenarán las partículas a una temperatura de aproximadamente -210 a aproximadamente +10°C, o aproximadamente -210 a 0, -90 a 0, -210 a -100,-210 a -65, -90 a -30, -30 a 0, -30 a,-10, -20 a +10, -10 a +10, 0 a 10 ó de 0 a 5°C, por ejemplo aproximadamente - 210, -200, -180, -160, -140, -120, -100, -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -25, -20, - 15, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10°C. Se pueden almacenar a aproximadamente la temperatura del nitrógeno líquido. Se puede almacenar a temperatura del hielo seco. Se puede almacenar en un congelador o en un - refrigerador.
En el pasaje anterior, donde se hace referencia al etanol, el etanol puede comprender hasta un 30% de agua. Así, el etanol puede ser aproximadamente 70 a aproximadamente 100% etanol, siendo el resto agua, o aproximadamente 80 a 100, 90 a 100, 70 a 90 ó 80 a 90%, por ejemplo aproximadamente 70, 80, 90 ó 100% de etanol. También se puede sustituir el isopropanol, n-propanol o n-butanol para el etanol, con restricciones similares en el contenido de agua. Una ventaja del uso de etanol o propanol es que proporciona un ambiente estéril para las partículas para la entrega a un paciente o para otras aplicaciones en las que la esterilidad es un beneficio. En algunos casos puede utilizarse metanol.
La eficacia de encapsulación (EE) del proceso con respecto a la biomolécula es preferiblemente alta, ya que la biomolécula es típicamente cara. La EE dependerá de la naturaleza precisa del proceso, incluyendo por ejemplo, el tipo y cantidad del primer precursor de cerámica, la proporción de biomolécula a los precursores cerámicos utilizados etc.. Comúnmente el proceso entregará EE mayor de aproximadamente 40%, o mayor de aproximadamente 50, 60, 70 ó el 80%. La EE puede ser por ejemplo de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ó 95%.
En una modalidad particular se provee un proceso para la fabricación de partículas que comprenden una biomolécula, el proceso comprende: a) combinar: una fase hidrofóbica que comprende un líquido hidrofóbico, un trialcoxisilano de aminoalquilamino funcional y un surfactante que tiene HLB entre aproximadamente 8 y aproximadamente 16; y una fase hidrofílica que comprende agua, silicato sódico a aproximadamente un pH 5 y la biomolécula, con el fin de formar una emulsión que comprende gotas de la fase hidrofílica dispersas en la fase hidrofóbica; y b) agitar la emulsión mientras que se forman las partículas de las gotitas.
En otra modalidad particular se provee un proceso para la fabricación de partículas que comprende una biomolécula, el proceso comprende: combinar un surfactante que tiene HLB entre aproximadamente 8 y aproximadamente 16 con un líquido hidrofóbico y añadir una trialcoxisilano de aminoalquilamino funcional con el fin de formar una fase hidrofóbica; combinar el agua y el silicato sódico, ajustar el pH a menos de aproximadamente 5 y agregar la biomolécula para formar una fase hidrofílica; combinar la fase hidrofóbica y la fase hidrofílica para formar una emulsión que comprende gotas de la fase hidrofílica dispersas en la fase hidrofóbica; agitar la emulsión mientras se forman las partículas de las gotas; y agregar un agente de tratamiento de superficie a al emulsión siguiendo la formación de las partículas con el fin de tratar la superficie de las partículas.
En esta modalidad, el paso de agregar la biomolécula puede realizarse inmediatamente (por ejemplo en menos de 1 minuto) antes del paso de combinar las fases hidrofílícas e hidrofóbicas. La biomolécula puede ser un ARN o un ADN u otras biomoléculas como se describió anteriormente. Puede ser un ARNip.
En variantes de la modalidad anterior, otros intervalo de pH pueden utilizarse en lugar de menos de aproximadamente 5. Por ejemplo pueden utilizarse condiciones básicas tales como pH superior a 8. Los inventores opinan que el pH en el rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 también sería utilizable.
Otras variantes posibles incluyen el uso de una suspensión coloidal, como sílica coloidal, en lugar de la combinación de agua/silicato sódico. Estas variantes pueden ser adecuadas para la encapsulacion de biomoléculas relativamente grandes como las proteínas.
Formación de nano-partículas (< 100nm) En varias modalidades puede ser ventajoso formar partículas en menor escala, particularmente de menos de 100nm en tamaño. Está previsto que esto puede proporcionar una entrega más eficaz de la biomolécula en algunos casos.
De conformidad, la invención también proporciona un proceso para la fabricación de partículas que comprende una biomolécula dispuesta en los poros de las mismas, comprendiendo el proceso: a) combinar: una fase hidrofóbica que comprende un líquido hidrofóbico y un surfactante; y una fase hidrofílica que comprende un líquido hidrofílico y un catalizador, con el fin de formar una emulsión compuesta por gotas de la fase hidrofílica dispersas en la fase hidrofóbica; b) agregar un precursor cerámico a la emulsión e hidolizar el precursor cerámico; c) ajustar el pH de la fase hidrofílica a un rango adecuado para la biomolécula; d) añadir la biomolécula y un precursor de cerámica funcionalizado a la emulsión; y e) agitar la emulsión mientras se forman las partículas dentro de las gotitas, en donde el precursor cerámico funcionalizado comprende un grupo funcional que es capaz de promover la penetración de las partículas en las células.
Muchas de las características y modalidades mencionadas anteriormente en relación con la preparación de micro-partículas pueden aplicarse igualmente a este aspecto de la invención. Como tal, estas características y modalidades son explícitamente incorporadas en la presente por referencia con el fin de evitar repeticiones innecesarias. En ese sentido, el precursor cerámico funcionalizado descrito de conformidad con este aspecto de la invención corresponde con el primer precursor cerámico mencionado anteriormente. El precursor cerámico que se describe de conformidad con este aspecto de la invención corresponde con el segundo precursor cerámico mencionado anteriormente.
A pesar de la incorporación de las características y modalidades antes mencionadas, en modalidades particulares de la invención el grupo funcional del precursor cerámico funcionalizado es capaz de interactuar químicamente con, por ejemplo interactuar electrostáticamente con, la biomolécula. Por ejemplo, el precursor cerámico funcionalizado puede ser un precursor de cerámica aminofuncional, tal como un alcoxisilano aminofuncional. En ciertas modalidades, el precursor de cerámica aminofuncional comprende un grupo de aminoalquilamino. Por ejemplo, el precursor cerámico aminofuncional puede comprender 3-(2-aminoet¡lamino) propil trimetoxisilano, 3-[2-(2-aminoetilamino) etilamino] propil trimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino) propil trietoxisilano o 3-[2-(2-aminoetilamino) etilamino] propil trietoxisilano, o una mezcla de dos o más de estos.
El surfactante puede tener otra vez un HLB de aproximadamente 8 a aproximadamente 16. Se ha encontrado que se pueden lograr buenos resultados con el etoxilato de nonilfenol. La fase hidrofóbica puede además comprender un co-surfactante, tal como un alcohol, por ejemplo 1-pentanol.
En el caso de la preparación de nanopartículas la viscosidad no se considera crítica porque se forman microemulsiones (en contraposición a emulsiones normales), que son termodinámicamente estables y consisten en pequeñísimas gotitas («10 nm).
En ciertas modalidades, el líquido hidrofóbico comprende un alcano (por ejemplo hexano (C6) a dodecano (C12)), un cicloalcano tal como ciclohexano, compuestos aromáticos (por ejemplo benceno, tolueno) y mezclas tales como kerosene La fase hidrofílica comprende un líquido hidrofílico y un catalizador. Por ejemplo, el líquido hidrofílico puede comprender agua y el catalizador puede ser un ácido. Más generalmente, catalizadores típicos para la hidrólisis de los alcóxidos de silicio pueden ser ácidos o bases, fluoruros u otro alcóxido de metal por ejemplo alcóxido de titanio.
La biomolécula puede ser como se describe anteriormente. Por ejemplo, puede ser cargada negativamente o suficientemente grande que sea incapaz de atravesar los poros de las partículas. La biomolécula puede comprender un ARN, un nucleótido antisentido, y antisentido, un aptámero, un ADN, una proteína, una glicoproteína, un polipéptido, un carbohidrato o una mezcla o aducto de cualquiera de cualquiera dos o más de estas. En una modalidad particular la biomolécula comprende un ARNip.
El proceso incluye ajustar el pH de la emulsión, por ejemplo por la adición de una base como NaOH, KOH y NH4OH antes de la adición de la biomolécula y del precursor de cerámica funcionalizado para evitar la desnaturalización de la biomolécula. Típicamente la hidrólisis se realiza a un pH bajo (tal como 2) para asegurar suficiente cinética para la reacción de hidrólisis, mientras que inhibe la condensación del precursor hidrolizado. Antes de la adición de la biomolécula, el pH se incrementa preferentemente a condiciones más neutrales (es decir, pH > 4).
Una vez más, un agente de polímero o complejante podría añadirse de tal forma que sea dispuesto dentro de los poros de las partículas con la biomolécula para facilitar el escape endosomal. Típicamente el polímero podría ser una polietilinamina, una polilisina, o una polihistidina o cualquier sustancia que proporcione un efecto de esponja de protones.
Como con el aspecto anterior de la invención, el proceso puede comprender adicionalmente: f) agregar un agente de tratamiento de superficie a la emulsión tras la formación de las partículas para que se trate la superficie de las partículas.
El agente de tratamiento de superficie puede comprender una cadena de polietilenglicol acoplada a un grupo de enlace, siendo capaz dicho grupo de enlace de enlazar la cadena de polietilenglicol a la superficie de las partículas. Por ejemplo, el agente de tratamiento de superficie puede ser un PEG-silano, como PEG -trialcoxisilil.
El agente de tratamiento de superficie puede comprender un grupo objetivo para apuntar a un objetivo en un paciente. Por ejemplo, el agente de tratamiento de superficie puede comprender un PEG-trialcoxisilil que comprende el grupo objetivo en el extremo distal del PEG del grupo trialcoxisilano.
La invención también provee partículas hechas por un proceso como se describe en cualquiera de los párrafos anteriores.
Como se mencionó anteriormente, las biomoléculas pueden indicarse en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad, trastorno o condición.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende una sustancia de partículas según lo estipulado en este documento junto con un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente.
El portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente puede ser un relleno sólido o líquido, disolvente, diluyente o sustancia encapsulante que pueda utilizarse con seguridad en la administración sistémica. Dependiendo de la ruta de administración particular, puede utilizarse una variedad de portadores bien conocidos en el arte. Estos portadores pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas de fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y sales tales como sales de ácido mineral incluyendo clorhidratos, bromuros y sulfatos, ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos y malonatos y agua libre de pirógenos. Una referencia útil que describe portadores farmacéuticamente aceptables, diluyentes y excipientes es Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991) el cual se incorpora en la presente por referencia.
Las formas de dosificación incluyen tabletas, dispersiones, suspensiones, inyecciones, soluciones, jarabes, pastillas, cápsulas, supositorios, aerosoles, parches transdérmicos y similares. Estas formas de dosificación también pueden incluir la inyección o implantación de dispositivos de liberación controladas diseñados específicamente para este propósito u otras formas de implantes modificados para actuar adicionalmente de esta manera.
Cualquier ruta segura de administración puede emplearse para la administración de la sustancia de partículas de la invención. Por ejemplo, se pueden emplear oral, rectal, parenteral, sublingual, bucal, intravenosa, intra-articular, intramuscular, intradérmicos, subcutáneo, por inhalación, intraocular, intraperitoneal, intracerebroventricular, transdérmica y similares.
En otro aspecto se provee un método para tratar una enfermedad, trastorno o condición en un mamífero incluyendo el paso de administrar la sustancia de partículas según lo descrito en la presente, o la una composición farmacéutica, a dicho mamífero para así tratar dicha enfermedad, trastorno o condición.
En todavía otro aspecto se provee una sustancia de partículas según lo descrito en la presente, para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición en un mamífero.
La enfermedad, trastorno o condición puede ser una enfermedad genética, trastorno o condición (por ejemplo, fibrosis quística o enfermedad de Huntington), una enfermedad degenerativa, trastorno o condición (por ejemplo envejecimiento relacionado con la degeneración macular), un cáncer (por ejemplo, tumores sólidos, sarcomas, linfomas, mielomas, carcinomas, melanomas, incluyendo el cáncer de mama, cuello uterino, pulmón y próstata, aunque sin limitarse a ello) una enfermedad, trastorno o condición del sistema inmune, incluyendo enfermedades autoinmunes (por ejemplo diabetes tipo 1 , esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico) y condiciones inflamatorias (por ejemplo, asma, enfermedad inflamatoria intestinal, glomerulonefritis), una enfermedad, condición o trastorno causado por infección por un patógeno tal como un virus (por ejemplo hepatitis C, gripe, infección por virus respiratorio sincitial, SIDA), una bacteria (por ejemplo neumonía, meningitis bacteriana, tosferina, tuberculosis, tétanos), protozoa (por ejemplo malaria) o un hongo (por ejemplo, Candida), una enfermedad, trastorno o condición del sistema circulatorio (e.g ateroesclerosis, reestenosis, hipercolesterolemia), una enfermedad, trastorno o condición del sistema endocrino (por ejemplo diabetes tipo II, osteoporosis, pancreatitis) o un enfermedad neurológica, trastorno o condición (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o epilepsia), aunque sin limitación a éstas.
El mamífero puede ser un mamífero humano o no humano incluye animales de rendimiento (por ejemplo caballos de carrera), animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos) y ganado (por ejemplo ganado vacuno, caballos, ovejas, cerdos), aunque sin limitarse a ellos. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las modalidades de la presente invención ahora se describirán, solo como medio de ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes. Se debe apreciar que no se debe tomar la siguiente discusión como limitación de la invención en ninguna manera. En los dibujos: La figura 1 es un diagrama de flujo de la preparación de las partículas de la presente invención; La figura 2 muestra imágenes TEM (Microscopio electrónico de transmisión, MET) de partículas que contienen ARNip, hechas mediante el proceso de la invención; La figura 3 muestra la distribución del tamaño de partícula de las partículas; La figura 4 muestra TEMs adicionales de las partículas de la invención; La figura 5 muestra un gráfico que ilustra el efecto de la carga de la partícula y la PEGilación sobre la liberación de ADNip fluorescente de las partículas; La figura 6 muestra un gráfico que ilustra las cinéticas de liberación de diferentes cargas útiles en las partículas; La figura 7 muestra un cromatograma HPLC (High Performance Liquid Chromatography, es decir, Cromatografía líquida de Alto Rendimiento, CLAR, en español) de ARNip sin encapsular (trazo rojo) y ARNip liberado de las partículas preparadas de conformidad con esta invención; La figura 8 muestra fotografías de suspensiones de las partículas de la invención; La figura 9 muestra micrografías que ilustran la penetración de partículas en las células para partículas con cargas positivas, negativas y neutrales; La figura 10 muestra micrografías que ¡lustran la retención de la carga en las partículas que tienen cargas positivas, negativas y neutrales; Las figuras 11 y 12 muestran micrografías que ilustran que la carga entra en las células con las partículas - la Figura 11 muestra las partículas y la Figura 12 muestra la carga; La figura 13 muestra la dispersión del ADNip en células HEPG2 en función del tiempo; Figura 14 muestra la dispersión del ADNip en células HeLa como función del tiempo; La figura 15 muestra la dispersión del ADNip en células RAW264 como una función del tiempo; Figura 16 muestra la dispersión del ADNip en células como una función del tiempo; La figura 17 muestra el efecto de las partículas de la presente invención en la actividad de la DPP4 (Dipeptidil Peptidasa 4) en fibroblastos BJ; La figura 18 muestra el diagrama de flujo detallado de un método prototipo para la encapsulación de oligonucleótidos; La figura 19 muestra un diagrama de flujo de la preparación de las partículas de la presente invención, en la escala - nano; La figura 20 muestra imágenes de FEG-SEM de las partículas hechas de conformidad con el proceso que se ilustra en la figura 19; La figura 21 muestra imágenes de fase y fluorescencia de las partículas marcadas con ADN - fluoro; y La figura 22 muestra la penetración de nano partículas en células HeLa.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describe la encapsulación y la liberación controlada del ARNip de las partículas de sílica modificadas. Las partículas consisten en sílica amorfa (S1O2) con una proporción de aminosilanos incorporados para facilitar la penetración en la célula y la retención de carga. Las partículas son de superficie modificada para biocompatibilidad (Vida Media de circulación ~ 4 h). Las partículas pueden penetrar las membranas de las células de mamíferos y liberar su carga en los espacios intracelulares y endosomales.
La figura 1 ilustra la síntesis de las partículas, incluyendo la encapsulación del ARNip (una biomolécula representativa, que representa la carga de las partículas resultantes). Así, con referencia a la figura 1 , una fase continua hidrofóbica fue hecha mediante la combinación de 30 mL de aceite de parafina pesada y 4.5 g de SPAN-20 (= 500 mM). Éstos fueron combinados agitando (30 minutos). Aminosilano (DATMS o TATMS, no APTES) entonces fue agregado en cantidad suficiente para la carga deseada: para las partículas negativas, sin adición, para partículas neutras, DATMS (1.5 uL = 1 %mol como silicio) y para las partículas positivas, DATMS (15 uL = 10 % mol como silicio). La mezcla resultante se agita luego por al menos 10 minutos adicionales pero no más de 60 minutos.
Luego se preparó una solución de sílica mediante la combinación de 4 mL de silicato sódico y 20 mL de agua. Se añade suficiente resina de intercambio catióníco a la mezcla resultante con agitación para llevar el pH a 4.0. La solución de sílica se decantó entonces de la resina hacia un recipiente fresco.
La fase hidrofóbica (hecha como se describió anteriormente) se fijó para agitación magnética y sonicación simultáneos (sonda de 0.9525 cm), y el agitador activado. El sonicador se intensificó a 70% de potencia (~ 700 W) en preparación para combinar las fases hidrofílicas e hidrofóbicas. 5 mg de carga (250 uL 20 mg/mL solución de ARNip) se mezcló con 1.25 mL de la solución de sílica preparada como se describió anteriormente. Después de sonicación por 10 segundos, la mezcla de silicona/carga fue agregada en la zona activa del sonicador. La sonicación se continuó durante 30 segundos y luego se desactivó el sonicador. La emulsión fue removida y se introdujo a un agitador magnético y se agitó durante 1 hora. Después de esto, se añadió PEG5000-silano (10 mg) a la mezcla y la suspensión de partículas resultante se agitó durante la noche.
Las partículas fueron recolecttadas de la emulsión por centrifugación (15000xg durante 10 minutos). La emulsión fue entonces diluida con 0.5 en volumen de ciciohexano para reducir su viscosidad y se lavó dos veces con ciciohexano (aproximadamente 40 mL) y dos veces con etanol al 100% (aproximadamente 40 mL). Cada paso de lavado involucró resuspender y recolectar las partículas y decantar el sobrenadante. Finalmente, las partículas fueron resuspendidas en 5 mL de etanol al 100% para almacenamiento a -20°C ó 4°C. Las partículas pueden almacenarse durante varios meses a 4°C sin pérdida sustancial de la actividad biológica, sin embargo una temperatura inferior de almacenaje proporcionará un tiempo mayor de almacenamiento.
El método anterior proporciona partículas que van de tamaño de partícula de 100-1000nm, con un diámetro medio de masa ponderada (do s) de aproximadamente de 300 nm. Estos se muestra en las figuras 2 y 4. La figura 3 muestra distribuciones de tamaño de partícula de las partículas. El hombro en cerca de 1 micrón representa probablemente una menor cantidad de partículas agregadas. El método anterior se ha utilizado en los estudios descritos a continuación, sin embargo modificaciones del método han producido partículas dispersas con do.5< 150 nm.
Las partículas se prepararon con diferentes cargas variando la cantidad y/o tipo de aminosilano añadido. Fue utilizado DATMS (aminoetilaminopropiltrimetoxisilano: 2 átomos de nitrógeno por molécula) como el estándar, los APTES (aminopropiltrimetoxisilano: 1 átomo de nitrógeno por molécula) fue mucho menos eficaz y los TATMS (aminoetilaminoetilaminopropiltrimetoxisilano: tres átomos de nitrógeno por molécula) mostraron resultados similares a los DATMS.
Como se mencionó anteriormente, el aminosilano fue añadido a la fase hidrofóbica y después transferido a la fase hidrofílica por transferencia hidrofílica. Debido a la partición entre las fases la cantidad de aminosilano incorporado fue menor a la cantidad añadida. Se encontró que la adición directa del aminosilano a la fase hidrofílica (es decir, la combinación con el silicato sódico) no fue practicable a un pH ácido ya que esto causa gelificación prematura.
La carga de las partículas se midió a un pH de 7.0 en 10 mM MOPS (tampón de ácido sulfónico de 3-N-morfolinopropáno). Potenciales zeta de las partículas fueron los siguientes: Nativo (no aminosilano): ?= -30 mV Neutral (1% DATMS): -5 mv < ? < 5 mV Positivo (10% DATMS): ? > + 10 mV A pesar del uso de un método de medición indirecta, la carga medida fue muy repetible entre lotes.
El porcentaje de la eficacia de encapsulación (EE) se determinó por la comparación de la carga teórica de los ARNip (determinado de la cantidad añadida) con la carga real según lo medido por la cantidad liberada. Los resultados se muestran a continuación: Carga teórica: 5% EE (desde una liberación de 1 mg/mL) Lote 1: 85 % +/- 5 % EE (desde una liberación de 0.1 mg/mL) Lote l : 80 % +/- 2 % Lote 2: 85 % +/- 10 % Carga real 4.2 % Carga teórica: 10% EE 75%, cargando 7.5% Así cuanto mayor sea la cantidad de ARN introducido mas baja será la eficacia de encapsulación.
La Figura 5 muestra el efecto de la liberación de un ADNip etiquetado fluorescente de partículas de sílica de diferentes cargas y modificación de superficies. Como hemos descrito anteriormente, la carga de la partícula puede ser manipulada al cambiar la cantidad de aminosilano utilizado. La liberación de partículas cargadas positivas fue mucho menor que el de las partículas cargadas negativamente, como se predijo por la atracción esperada entre las partículas cargadas positivamente y la carga útil cargada negativamente. Para las partículas cargadas negativamente, la presencia de PEG en la superficie de las partículas parece acelerar la liberación de la carga útil.
La liberación de la carga útil de las partículas se cree que sea primeramente por la disolución de la matriz de la partícula. En altas concentraciones en medios acuosos (> de aproximadamente 1 mg/mL de partículas), la lixiviación de las cargas de las partículas se limita a aquella mediada por la disolución de la partícula, es decir, la solución puede alcanzar la saturación en la matriz de la partícula, limitando así la liberación de la carga útil. Esto se muestra en la Figura 6, en la cual ocurre la liberación relativamente rápida de ambos activos (valores de momento de punto) y moléculas revueltas de ARNip (valores de momento cuadrado) hasta un límite dictado por la solubilidad de la matriz de sílica. Cabe señalar que esto no es evidente en la figura 5 ya que las concentraciones de partículas eran diferentes. A concentraciones substancialmente por debajo del límite de solubilidad de la sílica (aproximadamente 100pg/mL), o en situaciones en las que el líquido de liberación se actualiza continuamente, completa disolución de partículas ocurre por encima de aproximadamente 12 - 24 horas. Las partículas hechas como se describió anteriormente fueron almacenadas durante 36 días a 253 K en etanol al 96%. Después del almacenaje, las partículas se disolvieron totalmente en agua libre de RNasa (Ribonucleasa). La elución del líquido resultante en HPLC mostró un perfil muy similar al del ARNip no encapsulado en una solución amortiguadora, indicando que la encapsulación y la liberación no afectan significativamente los ARNip.
La Figura 7 muestra un cromatograma HPLC de un ARNip no encapsulado y el ARNip liberado de las partículas preparadas de conformidad con esta invención. Tanto las partículas como la referencia (ARNip no encapsulado) fueron tratadas con RNasa A durante 15 minutos y luego se lavaron tres veces con PBS antes de la suspensión en PBS con un inhibidor de RNasa. El material liberado de las partículas de sílica muestra un ARN intacto. La digestión similar de ARNip no encapsulado resultó en la destrucción completa. Estos experimentos demuestran la capacidad de las partículas para proteger la biomolécula encapsulada contra la degradación enzimática.
La Figura 8 muestra fotografías de las partículas en suspensión a 3 mg/L contra cualquier PBS (izquierda) o contra suero de murino al 50% en PBS (derecha). Después de la incubación durante la noche no ocurrió agregación visible. Las partículas también se suspendieron en 1 , 3, 10 mg/kg en 1500 ppm BSA y luego se incubaron durante 2 horas. El tamaño de partícula fue entonces determinado por Mastersizer (dispersión de Mié), revelando ningún cambio mediado en tiempo - o de concentración en el perfil de tamaño.
En conclusión, cargamentos de carga de 4% son rutinariamente alcanzables, y carga de aproximadamente el 8% se ha demostrado. Rutinariamente es obtenible una eficacia de encapsulación de > 80%. La retención de la biomolécula en las partículas parece estar mediada principalmente por fuerzas electrostáticas, produciendo características de liberación de disolución limitada a un pH fisiológico (es decir, la liberación toma lugar predominante por la disolución de la matriz). Las características de retención de carga han demostrado permanecer sin cambios después de un almacenaje de 40 días a -20°C en EtOH. al 96% Absorción en células de mamíferos Fueron investigados la influencia de la carga de la partícula en la penetración celular y la retención de carga, y el curso del tiempo de la absorción en las células y el escape endosomal.
Se sintetizaron partículas etiquetadas covalentemente con RITC (isotiocianato de rodamina) y que llevan un ADN con una secuencia de tipo ARNip y etiquetada con FITC (isotiocianato del fluorescena). Las células (NIH3T3, HeLa, HEPG2) fueron cultivadas a 50% de confluencia y partículas como se describe anteriormente (aproximadamente 30 g/ml, equivalente a 100nM de ADN) fueron agregadas directamente al medio de cultivo. Después de 40 h, los cultivos se lavaron una vez con PBS (solución salina tamponada de fosfato) con el fin de remover las partículas que no han penetrado en las células y luego se tomo una imagen por microscopía epifluorescente.
La Figura 9 muestra los resultados del monitoreo de la etiqueta RITC: en cada par de imágenes, la imagen de arriba es una imagen de contraste de fase y la imagen de abajo es una imagen de fluorescencia. La Fig. 9 indica que con el aumento de la carga positiva en las partículas, mayormente las partículas son tomadas por las células. Así una carga positiva en las partículas ayuda no sólo a atar la carga útil sino que también ayuda con la absorción de partículas en las células. La Figura 10 ilustra que la carga es retenida de manera más efectiva en partículas cargadas positivamente a medida que son tomadas por las células en comparación con las partículas cargadas negativamente o neutrales. Esta figura muestra la retención de ADNip por carga. En cada par de imágenes, la imagen de arriba es una imagen de contraste de fase y la imagen de abajo es una imagen de fluorescencia del ADNip.
La Figura 11 muestra la captación de partículas en dos diferentes líneas celulares (es decir, la distribución de la partícula) y la Fig. 12 muestra micrografías de las mismas muestras pero con la carga útil etiquetada resaltada (es decir, la distribución de la carga). En cada par de imágenes en ambas de estas figuras, la imagen de arriba es una imagen de contraste de fase. En la Fig.11 en cada par, la imagen de abajo es una imagen RITC de fluorescencia (canal rojo), y en la Fig. 12 en cada par la imagen de abajo es una imagen de fluorescencia del ADNip (canal verde). Por comparación de estas dos figuras se puede determinar que el ARNip es retenido en las partículas a medida que las partículas penetran en las células. La colocación de los puntos verdes y rojos dentro de la célula significa que la sílica ha penetrado dentro (puntos del canal rojo = partículas de sílica) mientras que retiene su carga de ADN fluorescente (puntos del canal verde = DNA), demostrando así que el ADN ha sido transfectado con éxito dentro de las células. Las Figuras 13 a la 15 muestran el curso del tiempo de introducción del ADNip etiquetado en varias líneas de célula (Fig. 13: HEPG2; Fig.14: HeLa: Figura 15: RAW264) a través de las partículas de la invención. Cada figura muestra la distribución de la fluorescencia en cada tiempo de post-tratamiento en las células. En cada caso, se puede ver que en períodos de tiempo más cortos el ADNip es localizado principalmente en pequeñas regiones, que representan la localización dentro de partículas situadas en las células. A períodos más largos de tiempo el ADNip se separa en regiones más amplias, que representan la liberación de las partículas por la disolución de la matriz de la partícula y la distribución a través de las células.
La Figura 16 muestra un experimento similar usando microscopía confocal. En la Fig. 16, la imagen de arriba de cada par muestra la mancha del núcleo (canal azul) y la imagen de abajo muestra la fluorescencia del ADNip (canal verde). Así las células HeLa fueron plateadas sobre portaobjetos revestidos de poli- lisina a una confluencia de 25%. Estos fueron tratados por 24 ó 48 horas con partículas modificadas RITC que cargan ADN- FAM . Luego se lavaron con PBS y fijados con formaldehído al 3.7% en PBS. Luego fueron teñidos con 1.2 pg/mL de Hoescht 33342 en solución salina isotónica, montados en portaobjetos con Gelmount y acrílico y se tomó imagen con el microscopio confocal con un aumento de 100 x. Las imágenes son de 150 x 150 pm, la profundidad del eje z es de 350 nm. Las estructuras aproximadamente redondas bien definidas representan el ADN nuclear. Después de 24 horas hay un gran número de pequeñas regiones brillantes, que representan la carga útil localizada dentro de las partículas. Una pequeña cantidad de iluminación difusa representa una pequeña cantidad de la carga útil liberada. Después de 48 horas las fuentes puntuadas han desaparecido en gran parte, representando la disolución de las partículas. En cambio, cada célula tiene un halo difuso de la región de luz que representa la carga útil liberada dentro de la célula.
Estudios de Caída de Genes La Figura 17 muestra los resultados de un experimento para demostrar la efectividad de las partículas cargadas presentes en la caída (es decir, la inhibición de la expresión génica). Este experimento vio la caída de la efectividad de la DPP4 en fibroblastos humanos BJ. El ARNip solo fue Ineficaz, posiblemente debido a la inactivación por la RNasa presente en el sistema. Como era de esperar, las partículas de sílica descargadas también resultaron ineficaces. La medición con la etiqueta de ARNip/Lipo se refiere a el ARNip transfectada por medio de Lipofectamina ®, que se sabe transfecta oligonucleótidos a través de la membrana celular. Este sistema tiene los inconvenientes de que es tóxico y que no proporciona protección a los ARNip del ataque enzimático. La medición con la etiqueta ARNip/nano representa ARNip encapsulado en partículas de conformidad con la presente invención. En cada caso en el cual ARNip estuvo presente, fue utilizado aproximadament 200nM. Los resultados muestran que el ARNip encapsulado fue eficaz en la caída en esta concentración, y de hecho fue ligeramente más efectivo que el ARNip con Lipofectamina.
Conclusiones in Vitro • La encapsulación de biomoléculas en partículas de confodrmidad con la presente invención puede proteger las biomoléculas de la degradación enzimática. • cuándo se aplica a las células bajo condiciones de cultivo normal, las partículas cargadas con biomoléculas son capaces de penetrar la membrana citoplasmátlca y entregar su carga al espacio intracelular. • la entrega de biomoléculas mediante las partículas de la invención a las células de cultivo de tejidos resulta en la reducción de la dosis- dependiencia de los niveles de ARNm en esas células. • dosis de ARNip encapsulado en partículas suficientes para resultar en > 50% de reducción en los niveles de ARNm muestra ninguna toxicidad significativa en vitro.
Resultados Adicionales - Síntesis de Partículas El método sintético general es descrito por el diagrama de flujo en la Figura 18. La formación de partículas fue extremadamente rápida en adición del precursor acuoso a la solución surfactante. Sin embargo, en general se permitió al menos 12 horas entre la formación de la emulsión y la recolección de las partículas.
La retención de oligonucleótidos está fuertemente influenciada por interacciones electrostáticas entre la carga y el componente de aminosilano de las partículas. Esto hace que la cantidad y tipo de sustitución, y también el pH de tanto la formación como la liberación son factores críticos para determinar características de encapsulación, retención y liberación.
Parámetros El surfactante utilizado en este ejemplo fue monolaurato de sorbitan (Span ® 20). La concentración de surfactante utilizada fue de alrededor el 17% en masa. La fase hidrofóbica fue parafina líquida pesada, esta dio las partículas más pequeñas de aquellas probadas. El tamaño de partícula fue reducido a un valor aceptable para la inyección intravenosa mediante una combinación de agitación magnética y sonicación.
El aminosilano preferido utilizado para mejorar la retención de la carga fue DAT S (aminoetilaminopropil Isobutiltrimetoxisilano). Experimentos con APTES (aminopropil trietoxisilano) y TATMS (aminoetilaminoetilaminopropyl trimetoxisilano) muestran que ellos también tienen este efecto en menor o mayor medida y pueden ser de utilidad en ajustar las características de retención/liberación. Las operaciones de la carga se espera que afecten el potencial zeta de la partícula, y se espera que la modificación del aminosilano afecte la carga máxima.
El pH de la mínima estabilidad de silicato sódico es de aproximadamente 5.5, que representa el pH de máxima estabilidad para el ARN. Si la solución de silicato es demasiado cerca a neutral, el precursor gelificará espontáneamente antes de que puede ser utilizado para la síntesis de la partícula. Si la solución es demasiado ácida, se producirá una degradación significativa de la carga del nucleótido. Con cargas de ARN un pH precursor de 3.75 - 4.00 ha demostrado ser adecuado aunque algo difícil de manejar. El ADN, ALN u otros oligonucleótidos modificados pueden permitir soluciones de precursor más ácidas (y por lo tanto más estables).
Ejemplo - Figura 18 Encapsulación del ARNip en partículas modificadas con DATMS, rodamina, y mPEG-5000: Se agitaron 15 g de Dowex 50W con 100 mL de HCI de 5 M durante 30 minutos para convertir la resina en la forma protonada activa. La resina fue entonces recuperada por filtración asistida al vacío en un embudo de filtro de vidrio fritado, en donde se lavó dos veces con 100 mL de agua milliQ para eliminar el HCI residual.
Se pesaron 9 gramos de Span ® 20 en un vaso Teflon y se añadieron 60 mL de parafina líquida. La mezcla resultante se agitó durante unos 30 minutos para completar la disolución del Span ® 20 en la parafina. Se añadieron 29 pL de DATMS líquido y 6 pL al 10% de APTES - rodamina en 2-propanona a la solución de surfactante agitada.
Se añadieron 4.0 mL de solución de silicato de sodio a los 28 mL de agua milliQ. Se reservaron 8.0 mL de esta solución para la posterior valoración del volumen principal.
Utilizando una sonda de pH para vigilar continuamente el pH de la solución, se añadió resina de intercambio catiónico activada para reducir el pH de la mezcla de silicato a aproximadamente 3.5. La solución de silicato fue decantada de la resina y se volvió a revisar el pH.
Se transfirieron 2.5 mL de esta solución de precursor a un tubo de plástico de 5 mL. Un volumen adecuado (< 0.5 mL) de carga de solución de ARN fue transferida a un tubo de 1.5 mL.
La carga de solución de ARN fue pipeteada en el precursor de silicato. La mezcla de ARN/silicato fue pipeteada en la solución del surfactante y se continuó la sonicación con agitación durante 25 segundos.
La emulsión resultante rápidamente se agitó durante 15 minutos. Se añadieron entonces 15 mg de polvo de silano mPEG-5000 a la emulsión y la mezcla resultante se agitó durante la noche.
La mezcla entonces se centrifugó durante 5 minutos a > 2000 x g para aislar las partículas. Las partículas entonces se lavaron dos veces con ciciohexano para quitar la parafina y el surfactante, se centrifugó después de cada lavado y luego una vez más se lavó con etanol. Las partículas se recolectaron por centrifugación, se decantó el sobrenadante y las partículas se resuspendieron en 10 mL de etanol.
El peso típico del producto obtenido fue de 200 mg. La eficacia de encapsulación típica fue > al 80%. El zeta típico de las partículas a un pH de 7.4 fue de + 20 mV. La típica reducción de las proteínas de enlace a las partículas en comparación con las partículas de silicato nativas (una medida de la densidad de la PEGilación) fue > al 90%.
Ejemplos - Figura 19 A. Síntesis de la micro emulsión de las partículas para la encapsulación de la biomolécula Fueron disueltos 0.381 g de NP9 en 3 mL de ciclohexano (0.2 mol/L) agitando (magnético) en un frasco de vidrio y se añadieron posteriormente 0.065 mL de 1-pentanol como un co - surfactante con agitación continua (0.2 mol/L). La solución resultante constituyó la fase hidrofóbica.
Se añadieron 0.013 mL de HNO3 de 0.01 M para actuar como un catalizador ácido, constituyendo la fase hidrofílica, y la solución se agitó durante 20 minutos para homogeneizar. Esto dio como resultado la formación de una micro emulsión.
Se añadieron 0.018 mL de tetrametilortosilicato (TMOS) y la solución resultante se agitó por 66 horas para hidrolizar el TMOS y proporcionar una solución de precursor hidrolizada.
Se añadieron 0.013 mL de NaOH de 0.01 M y se agitó durante 5 minutos para ajustar el pH a más de aproximadamente 4.
Se simuló la adición de una biomolécula por adición de 0.010 mL de agua con agitación. Como un precursor cerámico funcionalizado, se añadieron 0.003 mL de 3-(2-aminoetilamino) propiltrimetoxisilano y la mezcla se agitó durante 6.5 horas, tiempo durante el cual la solución se volvió progresivamente mas neblinosa. Esto dio por resultado una suspensión de nanopartículás.
Se añadieron 5 mg de mPEG-silano (MW = 5000) y se dejo agitando la solución durante 15 horas. La solución fue entonces centrifugada (13,000 durante 1 minuto) para aislar las partículas, que luego se lavaron tres veces con 2 mL de etanol y suspendidas en 2 mL de etanol.
Se tomó imagen de las partículas por FEG-SEM, que mostró un rango de tamaño de 30 - 1.00 nm. Se hace referencia a la Figura 20.
B. Síntesis de la micro emulsión de partículas para la encapsulación de la biomolécula Fueron disueltos 0.636 g de NP9 en 5 mL de ciclohexano (0.2 mol/L) agitando (magnético) en un frasco de vidrio. Se agregaron 0.109 mL de 1-pentanol como un co-surfactante con agitación continua (0.2 mol/L). Se pipetearon 1.14 mL de la solución de pentanol de ciclohexano/NP9/1 en un segundo frasco de cristal (x 2).
Se añadieron 0.011 mL de HNO3 de 0.01 M a las sub muestras anteriores y se agitaron las soluciones durante 40 minutos para homogeneizarlas, formando una micro emulsión.
Se añadieron 0,0125 mL (0.08 mMol) de tetrametilortosilicato a las sub muestras y las soluciones resultantes se agitaron por 17.5 horas para hidrolizar el TMOS. Se añadieron 0.011 mL de NaOH de 0.01 M a ambas muestras y luego se agitaron durante 5 minutos para ajustar el pH a más de aproximadamente 4.
Se agregaron 0.006 mL de solución de ADN- fluoro (FITC- etiquetada DPP4 (par base 21)), se añadieron 0.5 mg/mL en agua sin dejar de agitar a una muestra y 0.006 mL de agua se añadieron a la segunda muestra sin dejar de agitar.
Se agregaron 0.002 mL (0.009 mMol) de 3-(2-aminoetilamino) propiltrimetoxisilano como el precursor cerámico funcionalizado para cada muestra y las mezclas se agitaron durante 6 horas.
Se añadieron 0.8 mg de mPEG-silano (MW = 5000) a cada muestra y las muestras fueron luego dejadas agitándose durante 18 horas. Se agregó 1 mL de acetona a cada muestra y se agitaron las soluciones durante 10 minutos.
Las soluciones fueron luego centrifugadas (13,000 por 1 minuto) para aislar las partículas, que luego se lavaron tres veces con 2 mL de etanol. La muestra que contiene el ADN - fluoro (CS11-0028) fue suspendida en 2 mL de etanol. La muestra hecha utilizando solamente agua (CS11-0029) fue secada a 40 0 C y pesada como 7.3 mg.
Se secaron varias gotas de las partículas con ADN - fluoro en un portaobjetos de microscopio y se tomó imagen usando un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro FITC a 40 x aumentos y 4 segundos de exposición. Se hace referencia a la Figura 21.
La Figura 22 ilustra la transfection de hepatocitos humanos cultivados con AlexaFluor-633 etiquetados como nanopartículas de sílica. Las células fueron tratadas durante 24 horas antes de la proyección de imagen.
Otro ejemplo Partículas etiquetadas covalentemente con FITC (isotiocianato de fluorosceina) y que llevan una carga útil de la ficoeritrina van ha ser sintetizadas. Las células HeLa van a cultivarse a una confluencia del 50% y las partículas como se describen anteriormente (aproximadamente 30pg/ml) se añadirán directamente al medio de cultivo. Después de 40 h, los cultivos van a lavarse una vez con PBS (salina tamponada de fosfato) con el fin de remover las partículas que no habían penetrado en las células y luego se tomó imagen por microscopía epifluorescente para así monitorear la liberación intracelular de la Ficoeritrina liberada.
A menos que el contexto lo requiera de otra forma o que se indique específicamente por el contrario, enteros, pasos o elementos de la invención descritos en la presente como enteros, pasos o elementos únicos claramente abarcan tanto formas únicas como plurales de los enteros, pasos o elementos descritos.
A lo largo de esta especificación, salvo que el contexto exija lo contrario, la palabra "comprende", o variaciones como "comprenden" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un paso indicado o elemento o entero o grupo de pasos o elementos o enteros, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o entero o grupo de pasos, elementos o enteros. Así, en el contexto de esta especificación, el término "que comprende" se utiliza en un sentido inclusivo y así debe entenderse como significando "incluyendo principalmente, pero no necesariamente únicamente".
Se apreciará que la descripción precedente se ha dado a modo de ejemplo ilustrativo de la invención y que todas dichas modificaciones y variaciones a la misma como sería evidente para las personas expertas en la técnica se consideran que caen dentro de la amplio alcance y el ámbito de la invención como lo establecido en la presente.

Claims (63)

REIVINDICACIONES:
1 . Una sustancia de partículas que comprende: partículas de una matriz cerámica que tienen un grupo funcional, siendo capaz el grupo funcional de promover la penetración de las partículas en las células; y una biomolecula dispuesta dentro de los poros de las partículas, siendo liberable la biomolecula de las partículas por la disolución de la matriz cerámica.
2. La sustancia de partículas de la reivindicación 1 , en donde la biomolecula es substancialmente no-liberable de las partículas por lixiviación en ausencia de disolución de la matriz cerámica.
3. La sustancia de partículas de la reivindicación 2, en donde el grupo funcional interactúa químicamente con la biomolecula para prevenir substancialmente la lixiviación.
4. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde la matriz cerámica que tiene un grupo funcional comprende una matriz de sílica funcionalizada.
5. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en donde el grupo funcional de la matriz cerámica comprende un grupo de aminoalquilamino.
6. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en donde la biomolécula se compone de un ARN, un nucleótido antisentido, un antisentido, un aptámero, un ADN, una proteína, una glicoproteína, un polipéptido, un hidrato de carbono o una mezcla o un aducto de cualquiera de dos o más de estas.
7. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, en donde las cadenas de polietilenglicol son acopladas a la superficie de las partículas.
8. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, en donde un grupo de objetivo es acoplado a la superficie de las partículas.
9. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde dichas partículas tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 0.1 a 10 mieras, preferiblemente de aproximadamente 0.1 a 1 miera.
10. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9, en donde dichas partículas tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 20 a aproximadamente 100nm.
11. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, en donde dichas partículas tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 1 a aproximadamente 50nm.
12. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 , en donde dichas partículas tienen una carga de biomoléculas de aproximadamente 1 a aproximadamente 20% w/w.
13. La sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, en donde un agente de polímero o complejante es dispuesto en los poros de las partículas con ia biomolécula.
14. La sustancia de partículas de la reivindicación 13, en donde el polímero es una polietolinamina, polilisina o polihistidina, o una sustancia que proporciona un efecto de esponja protón.
15. Un proceso para hacer partículas que comprenden una biomolécula dispuesta en los poros de las mismas, dicho proceso comprende: a) combinar: una fase hidrofóbica que comprende un líquido hidrofóbico, un primer precursor cerámico y un surfactante; y una fase hidrofílica que comprende un líquido hidrofílico, un segundo precursor cerámico y la biomolécula, de manera que se forme una emulsión que comprende gotas de la fase hidrofílica dispersas en la fase hidrofóbica; y b) agitar la emulsión a medida que se forman las partículas dentro de las gotas; en donde el primer precursor cerámico comprende de un grupo funcional que es capaz de promover la penetración de las partículas en las células.
16. El proceso de la reivindicación 15, que comprende los pasos de: combinar el surfactante con el líquido hidrofóbico; y agregar el primer precursor cerámico, de manera que se forme la fase hidrofóbica, dichos pasos se llevan a cabo antes del paso a).
17. El proceso de la reivindicación 15 ó 16, en donde el grupo funcional del primer precursor cerámico es capaz de interactuar químicamente con, por ejemplo interactuar electrostáticamente con, la biomolécula.
18. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 17, en donde el primer precursor cerámico es un precursor cerámico aminofuncional.
19. El proceso de la reivindicación 18, en donde el precursor cerámico aminofuncional es un alcoxisilano aminofuncional.
20. El proceso de la reivindicación 18 ó 19, en donde el precursor de cerámica aminofuncional está formado por un grupo aminoalquilamino.
21. El proceso de la reivindicación 20, en donde el precursor cerámico aminofuncional es 3-(2-aminoetilamino) propil trimetoxisilano, 3-[2-(2-aminoetilamino) etilamino] propil trimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino) propil trietoxisilano o 3-[2-(2-aminoetilamino) etilamino] propil trietoxisilano, o una mezcla de dos o más de estos.
22. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 21 , en donde el surfactante tiene un HLB de aproximadamente 8 a aproximadamente 16.
23. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 22, en donde el líquido hidrofóbico tiene una viscosidad de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 15000 mPa.s.
24. El proceso de cualquiera de los reclamos de 15 a 23, en donde el líquido hidrofóbico comprende de un aceite de parafina, aceite vegetal o un aceite mineral.
25. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 24, en donde el primer precursor cerámico es una base y la fase hidrofílica tiene un pH por debajo de pKa del primer precursor cerámico.
26. El proceso de la reivindicación 25, que comprende los pasos de: combinar el líquido hidrofílico y el segundo precursor cerámico; ajustar el pH a por debajo de pKa del primer precursor cerámico; y agregar la biomolécula, a manera de que se forme la fase hidrofílica, dichos pasos se llevan a cabo antes del paso a).
27. El proceso de la reivindicación 26, en donde el paso de ajustar el pH comprende exponer una solución del segundo precursor cerámico en el líquido hidrofílico a una resina de intercambio catiónico y luego separar la solución de la resina una vez que el pH de la solución ha alcanzado un pH deseado por debajo del pKa del primer precursor cerámico.
28. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 27, en donde el líquido hidrofílico es acuoso.
29. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 28, en donde el segundo precursor cerámico comprende silicato sódico o sílica coloidal o un alcóxido de silicio prehidrolizado.
30. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 29, en donde la biomolécula se carga negativamente o es suficientemente grande que es incapaz de pasar a través de los poros de las partículas.
31. El proceso de la reivindicación 30, en donde la biomolécula comprende un ARN, un nucleótido antisentido, y antisentido, un aptámero, ADN, una proteína, una glicoproteína, un polipéptido, un hidrato de carbono o una mezcla o aducto de cualquiera de dos o más de éstas.
32. El proceso de la reivindicación 31 , en donde la biomolécula comprende un ARNip.
33. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 32 que adicionalmente comprende: c) añadir un agente de tratamiento de superficie a la emulsión tras la formación de las partículas de manera que se trate la superficie de las partículas.
34. El proceso de la reivindicación 33, en donde el agente de tratamiento de superficie comprende de una cadena de polietilenglicol acoplada a un grupo de enlace, dicho grupo de enlace siendo capaz de acoplar la cadena de polietilenglicol a la superficie de las partículas.
35. El proceso de la reivindicación 34, en donde el agente de tratamiento de superficie es un PEG-silano, tal como un trialcoxisilil-PEG.
36. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 33 a la 35, en donde el agente de tratamiento de superficie comprende un grupo objetivo para apuntar a un objetivo en un paciente.
37. El proceso de la reivindicación 36, en donde el agente de tratamiento de superficie comprende un trialcoxisilil-PEG que comprende el grupo objetivo en el extremo distal del PEG del grupo trialcoxisilano.
38. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 15 a la 37, en donde un agente de polímero o complejante se añade de manera que sea eliminado dentro de los poros de las partículas con la biomolécula.
39. El proceso de la reivindicación 38, en donde el polímero es un polietilinamína, una polilisina, o una poli istídina o una sustancia que proporciona un efecto de esponja protón.
40. Un proceso para hacer las partículas que comprende una biomolécula dispuesta en los poros, dicho proceso comprende: a) combinanar: una fase hidrofóbica que comprende un líquido hidrofóbico y un surfactante; y una fase hidrofílica que comprende un líquido hidrofílico y un catalizador, con el fin de formar una emulsión que comprende gotas de la fase hidrofílica dispersas en la fase hidrofóbica; b ) agregar un precursor cerámico a la emulsión e hidrolizar el precursor cerámico; c) ajustar el pH de la fase hidrofílica a un rango adecuado para la biomolécula; d) añadir la biomolécula y un precursor cerámico funcionalizado a la emulsión; y e) agitar la emulsión mientras se forman las partículas dentro de las gotitas, en donde el precursor cerámico funcionalizado comprende un grupo funcional que es capaz de promover la penetración de las partículas en las células.
41. El proceso de la reivindicación 40, en donde el grupo funcional del precursor cerámico funcionalizado es capaz de interactuar químicamente con, por ejemplo interactuando electrostáticamente con, la biomolécula.
42. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 41 , en donde el precursor cerámico funcionalizado es un precursor cerámico aminofuncional. I
43. El proceso de la reivindicación 42, en donde el precursor cerámico aminofuncional es un alcoxisilano aminofuncional.
44. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 42 a la 43, en donde el precursor cerámico aminofuncional comprende un grupo aminoalquilamino.
45. El proceso de la reivindicación 44, donde el precursor cerámico aminofuncional es 3-(2-aminoetilamino) propil trimetoxisilano, 3-[2-(2-aminoetilamino) ethylamino] propil trimetoxisilano, 3-(2-aminoetilamino) propil trietoxisilano o 3-[2-(2-aminoetilamino) etilamino] propil trietoxisilano, o una mezcla de dos o más de éstos.
46. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a 45, en donde el surfactante tiene un HLB de aproximadamente 8 a aproximadamente 16, tal como etoxilato de nonilfenol.
47. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 46, en donde dicha fase hidrofóbica comprende además un co-surfactante, tal como un alcohol, por ejemplo 1-pentanol.
48. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 47, en donde el líquido hidrofóbico comprende un alcano tal como hexano (C6) a dodecano (C12), un cicloalcano como ciclohexano, compuestos aromáticos tales como benceno, tolueno y mezclas tales como queroseno.
49. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 48, en donde el líquido hidrofílico comprende agua y el catalizador es un ácido.
50. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 49, en donde la biomolécula se carga negativamente o es suficientemente grande, que es incapaz de atravesar los poros de las partículas.
51. El proceso de la reivindicación 50, en donde la biomolécula comprende un ARN, un nucleótido antisentido, y un antisentido, un aptámero, un ADN, una proteína, una glicoproteína, un polipéptido, un carbohidrato o una mezcla o aducto de cualquiera dos o más de ellos.
52. El proceso de la reivindicación 51 , en donde la biomolécula comprende ARNip.
53. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 52, que incluye ajustar el pH de la emulsión a más de 4, por ejemplo mediante la adición de una base, tal como NaOH, KOH y NH4OH, antes de la adición de la biomolécula y el precursor cerámico funcionalizado.
54. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 53, que comprende además: f) agregar un agente de tratamiento de superficie a la emulsión tras la formación de las partículas para tratar la superficie de las partículas.
55. El proceso de la reivindicación 54, en el que el agente de tratamiento de superficie comprende una cadena de polietilenglicol acoplada a un grupo de enlace, siendo capaz dicho grupo de enlace de unir la cadena de polietilenglicol a la superficie de las partículas.
56. El proceso de la reivindicación 55, en el que el agente de tratamiento de superficie es un PEG-silano, tal como un PEG - trialcoxisilil.
57. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 54 a la 56, en la que el agente de tratamiento de superficie comprende un grupo objetivo para apuntar a un objetivo en un paciente.
58. El proceso de la reivindicación 57, en el que el agente de tratamiento de superficie comprende un PEG - trialcoxisilil que comprende el grupo objetivo en el extremo distal del PEG para el grupo de trialcoxisilano.
59. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 40 a la 58, en donde un agente complejante o de polímero se agrega tal que se dispone dentro de los poros de las partículas con la biomolécula.
60. El proceso de la reivindicación 59, en el cual el polímero es una polietilinamina, una polilisina, o una polihistidina o una sustancia que proporciona un efecto de esponja de protón.
61. Una composición farmacéutica que comprende una sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
62. Un método de tratar una enfermedad, trastorno o condición en un mamífero, que incluye el paso de administrar la sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, o la composición farmacéutica de la reivindicación 61 a dicho mamífero para de este modo tratar dicha enfermedad, trastorno o condición.
63. Una sustancia de partículas de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, para usarse en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o condición en un mamífero.
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