MX2012015131A - Terapia contra el cancer que utiliza anticuerpos dirigidos a la cldn6 objetivo in vivo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al tratamiento y/o prevención de padecimientos tumorales asociados con células que expresan la CLDN6, en particular cáncer y metástasis de cáncer utilizando anticuerpos que se unen a la CLDN6. La presente solicitud demuestra que la unión de los anticuerpos a la CLDN6 en la superficie de las células tumorales es suficiente para inhibir el crecimiento del tumor y para prolongar la supervivencia y extender la esperanza de vida de pacientes con tumores. Además, la unión de los anticuerpos a la CLDN6 es eficiente para inhibir el crecimiento de tumores de células germinales positivas a la CLDN6 tales como teratocarcinomas o carcinomas embrionarios, en particular tumores de células germinales de los testículos.

Description

TERAPIA CONTRA EL CANCER QUE UTILIZA ANTICUERPOS DIRIGIDOS A LA CLDN6 OBJETIVO IN VIVO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es un problema de salud en todo el mundo y todavía está entre las principales causas de muerte. Las células cancerígenas biológicamente difieren de" manera sustancial de sus células de origen no malignas. Estas diferencias se deben a alteraciones genéticas adquiridas durante el desarrollo del cáncer y resultan, entre otras cosas, también de la formación de estructuras moleculares cualitativa o cuantitativamente alteradas en las células cancerígenas. Las estructuras asociadas con el cáncer de este tipo son, en particular, productos genéticos la expresión de los cuales es inducida o mejorada en el transcurso de' la transformación maligna o cancerosa.

El sistema inmune tiene la capacidad de reconocer y destruir células a través de dos modalidades separadas: inmunidad innata y adaptiva. El componente innato consiste de macrófagos, linfocitos citolíticos naturales (NK) , monocitos, y granulocitos . Estas células identifican patrones moleculares involucrados en la transformación celular y libera varias citocinas y mediadores inflamatorios. La respuesta innata carece de la capacidad de memoria de antígenos extraños, un aspecto presente en la respuesta inmune adaptiva. Este último componente del sistema inmune también presente la especificidad de antigenos extraños, impartida por la presencia de receptores en los linfocitos. Las células presentadoras de antigenos (APCs) también juegan un papel en la respuesta adaptiva - las mismas engullen antigenos extraños y presentan los mismos a los linfocitos en el contexto del complejo de mayor histocompatibilidad. Las células CD4+ T portan receptores que reconocen antigenos en el contexto de moléculas de MHC clase II, lo cual también permite a las mismas liberar citocinas y además activar los linfocitos CD8+ (linfocitos T citotóxicos; CTLs) o células B. Los CTLs son parte de la inmunidad mediada por células y son capaces de eliminar células presentadas en el contexto de moléculas de MHC clase I, a través de apoptosis o lisis celular mediada con perforina. Es ampliamente aceptado que la inmunidad mediada por células T juega un papel vital en una respuesta anti-tumoral . Las células están involucradas en la liberación de inmunoglobulinas y como tal son parte del sistema inmunohumoral .

Si se enfocan y mejoran apropiadamente, las funciones inmunes se pueden aprovechar terapéuticamente para controlar e incluso erradicar lesiones malignas. Los cambios genéticos y epigenéticos involucrados en la carcinogénesis generan antígenos que son reconocidos por el sistema inmune de un modo análogo a los antigenos microbianos.

Se han introducido exitosamente anticuerpos en la clínica para su uso en la terapia contra el cáncer y han sobresalido como la terapéutica más prometedora en la oncología en la última década. Las terapias a base de anticuerpos para el cáncer tienen el potencial de un perfil de mayor especificidad y menores efectos secundarios en comparación con los fármacos convencionales. La razón es una 1 precisa distinción entre células normales y neoplásicas por medio de anticuerpos y el hecho de que su modo de acción se basa en mecanismos anti-tumorales inmunológicos menos tóxicos, tales como la activación complementaria y reclutamiento de células inmunes citotóxicas.

Las claudinas son proteínas de la membrana integral ubicadas dentro de los empalmes de la zona de oclusión del epitelio y endotelio. Se predice que las claudinas tienen cuatro segmentos de transmembrana con dos bucles extracelulares, y están ubicados en N- y C-terminal¦ en el citoplasma. La familia de las claudinas (CLDN) de proteínas de transmembrana juega un papel crítico en el mantenimiento de los empalmes de la zona de oclusión del epitelio y endotelio y podrían jugar un papel en el mantenimiento del citoesqueleto y en la señalización celular.

Hemos encontrado que la CLDN6 se expresa en los tejidos de varios canceres mientras que la expresión en tejidos no cancerosos normales se limita a la placenta. Tales canceres incluyen cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas o microcitos (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , en particular carcinoma y adenocarcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer gástrico, cáncer de seno, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomorfo maligno, sarcoma, en particular sarcoma y carcinosarcoma sinovial, cáncer del ' conducto biliar, cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñon, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, incluyendo cáncer del íleon, en particular adenocarcinoma del intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y .cáncer testicular embrionario, y cáncer uterino, y formas metastásicas de los mismos.

Además, fuimos capaces de producir anticuerpos capaces de unirse específicamente a la CLDN6 en la superficie de células intactas que expresan CLDN6. Al no unirse a células que expresan proteínas claudinas diferentes a la CLD 6, en particular CLDN3, CLDN4 y CLDN9, no se observó que las células expresan ninguna de estas proteínas CLDN en estos anticuerpos.

Aquí, extendimos aquellas observaciones demostrando que la unión del anticuerpo a CLDN6 en la superficie de células tumorales es suficiente para conferir una inhibición significativa del crecimiento tumoral. La evaluación '· ín vivo del crecimiento tumoral de células tumorales trans ectadas con CLDN6 y xenotransplantes no transfectados mostró la inhibición específica del crecimiento tumoral de células transfectadas con CLDN6 mediada por la unión del anticuerpo al CLDN6. Además, se demostró que la unión del anticuerpo a CLDN6 es suficiente para inhibir el crecimiento tumoral in vivo de células tumorales que expresan la CLDN6 endógenamente. Esto establece la prueba de principio en el que la unión del anticuerpo a CLDN6 es efectiva en inhibir el crecimiento tumoral, y provee evidencia de que la CLDN6 es un objetivo atractivo para los anticuerpos terapéuticos diseñados para inhibir el crecimiento tumoral enfocando la CLDN6.

Además, se demostró que la unión del anticuerpo a la CLDN6 es eficiente para inhibir el crecimiento tumoral de una linea celular de tumores de células germinales positivas a CLDN6, humanas, in vivo demostrando la utilidad de " la unión II de anticuerpos a CLDN6 puesto que agentes terapéuticos selectivos enfocan e inducen la eliminación de tumores de células germinales tales como tumores de células germinales testiculares .

Por consiguiente, proporcionamos la primera evidencia de que la unión del anticuerpo a la CLDN6 en la superficie de células tumorales in vivo da como resultado la atenuación del crecimiento tumoral y proporcionamos la demostración de que la unión especifica a la CLDN6 da como resultado una intervención terapéutica mediante la cual el crecimiento tumoral es atenuado. Además, proporcionamos evidencia de que la unión del anticuerpo a la CLDN6 en la superficie de las células tumorales in vivo da como resultado la prolongación de la supervivencia y prolongando la esperanza de vida de pacientes con tumores.

De acuerdo con esto, la invención se refiere al tratamiento y/o prevención de padecimientos tumorales asociados con células que expresan la CLDN6, en particular cáncer y metástasis de cáncer utilizando anticuerpos los cuales se unen a la CLDN6. La presente solicitud demuestra que la unión de anticuerpos a la CLDN6 sobre la superficie de células tumorales es suficiente para inhibir el crecimiento del tumor y para prolongar la supervivencia y prolongar la esperanza de vida de pacientes con tumores. Además, la unión de los anticuerpos a la CLDN6 es eficiencia para inhibir el crecimiento de tumores de células germinales positivas a la CLDN6 tales como teratocarcinomas o carcinomas embrionarios, en particular tumores de células germinales particulares de los testículos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo el cual inhibe el crecimiento de un tumor in vivo, en donde las células de la claudina 6 que expresa tumores (CLDN6) y en donde el anticuerpo es capaz de unirse a la CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo inhibe el crecimiento del tumor al unirse a la CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo es específico para la CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético. El tumor puede seleccionar del grupo que consiste de cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , en particular carcinoma y adenocarcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer gástrico, cáncer de seno, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomorfo maligno, sarcoma, en particular sarcoma y carcinosarcoma sinovial, cáncer del conducto biliar-, cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñon, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, incluyendo cáncer del íleon, en particular adenocarcinoma del intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocárcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular cáncer testicular embrionario, y cáncer uterino, y , formas metastásicas de los mismos. El tumor puede ser un tumor de células germinales tales como un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario. El tumor de células germinales puede ser un tumor de células germinales de los testículos.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de (i) un anticuerpo producido por u obtenible de un clon depositado bajo el acceso no. DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A) , DSM ACC3058 (GT512mu AB 27A) , o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2)," (ii) un anticuerpo el cual es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo en (i), (iii) un anticuerpo el cual tiene la especificidad del anticuerpo en (i), y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión del antígeno o el sitio de unión del antigeno del anticuerpo en (i) . La porción de unión del antigeno o sitio de unión del antigeno del anticuerpo en (i) puede comprender la región variable del anticuerpo en (i) · El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anterior puede adherirse al menos a una porción efectora terapéutica tal como una radioetiqueta, citotoxina o enzima citotóxica.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un hibridoma depositado bajo el acceso no. DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A) , DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A) , o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2) .

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores. La composición farmacéutica puede estar en la forma de una vacuna tumoral terapéutica o profiláctica. En una modalidad, la composición farmacéutica es para usarse en el tratamiento o prevención de un padecimiento tumoral.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para tratar un paciente que tiene un padecimiento tumoral o que está en riesgo de desarrollar un padecimiento tumoral, en donde las células del tumor expresan claudinas 6 (CLDN6) y en donde el método comprende la administración de un anticuerpo capaz de unirse a la CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo cuando se administra al paciente inhibe el crecimiento del tumor en el paciente al unirse a la CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo se adhiere al menos a una porción efectora terapéutica tal como una radioetiqueta, citotoxina o enzima citotóxica. El anticuerpo puede ser especifico para CLDN6. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético. En una modalidad el método comprende la administración de una composición farmacéutica de acuerdo a cualquiera de los aspectos anteriores.

En cualquiera de los aspectos anteriores, el padecimiento tumoral puede seleccionarse del grupo que consiste de cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , en particular carcinoma y adenocarcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer gástrico, cáncer de seno, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas, melanoma II maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomorfo maligno, sarcoma, en particular sarcoma y carcinosarcoma sinovial, cáncer del conducto biliar cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñon, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de„ células renales papilares, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, incluyendo cáncer del íleon, en particular adenocarcinoma del intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocárcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, y cáncer uterino, y las " formas metastásicas de los mismos.

En cualquiera de los aspectos anteriores, el padecimiento tumoral puede ser un padecimiento tumoral de células germinales tales como un padecimiento caracterizado por un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario. El padecimiento tumoral de células germinales puede- ser un padecimiento tumoral de células germinales de los testículos.

En cualquiera de los aspectos anteriores, la CLDN6 puede comprender una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico la cual comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la SEC ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos y/o comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

Un anticuerpo descrito en la presente es cápaz de unirse a la CLDN6 y preferiblemente es capaz de unirse a la CLDN6 asociada con la superficie de una célula que expresa la CLDN6. Preferiblemente, el anticuerpo sustancialmente no es capaz de unirse a la CLDN3, en particular cuando está asociada con la superficie de una célula que expresa la CLDN3, y/o no es sustancialmente capaz de unirse a la CLDN4, en particular cuando está asociada con la superficie de una célula que expresa la CLDN4. Preferiblemente, el anticuerpo no es sustancialmente capaz de unirse a la CLDN9, en particular cuando está asociado con la superficie de una célula que expresa la CLDN9. Más preferiblemente, el anticuerpo sustancialmente no es capaz de unirse a la proteina CLDN diferente a la CLDN6, en particular cuando está asociado con la superficie de una célula que expresa dicha proteina CLDN, y es especifica para la CLDN6. Preferiblemente, dicha célula que expresa dicha proteina CLDN es una célula intacta, en particular una célula no permeabilizada, y dicha proteina CLDN asociada con la superficie de una célula tiene una conformación natural, es decir no desnaturalizada. Preferiblemente, el anticuerpo es capaz de unirse a uno o más epitopes de CLDN 6 en su conformación natural.

En particular las modalidades preferidas, un anticuerpo descrito en la presente se une a epitopes naturales de la CLDN6 presente en la superficie de :¡ células vivas tal como aquéllas de la SEC ID NO: 3, SEC ID ¡NO: 4 ó SEC ID NO: 5. En modalidades preferidas adicionales, el anticuerpo es especifico de células tumorales que expresan CLDN6 y no se une a células tumorales que no expresan la CLDN6. Preferiblemente, un anticuerpo descrito en la presente específicamente se une a CLDN6.

En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente es capaz de unirse a un epitope ubicado dentro de una porción extracelular de CLDN6, en donde dicha porción extracelular de la CLDN6 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 ó SEC ID NO: 5, más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5. Preferiblemente, el anticuerpo ! es capaz 1 de unirse a un epitope ubicado dentro de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5.

En una modalidad, el anticuerpo es obtenible mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 ó SEC ID NO: 5, más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5 ó un péptido inmunológicamente equivalente, o un ácido nucleico o célula huésped que exprese dicho péptido.

En diferentes modalidades, la CLDN6 a la cual el anticuerpo es capaz de unirse tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia 2 ó la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 6. Particularmente se prefiere que el anticuerpo sea capaz de unirse a la CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 y capaz de unirse a la CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos de la, SEC ID NO: 6.

En modalidades preferidas, un anticuerpo descrito péptido tiene una o más de las siguientes actividades: (i) eliminación de una célula que exprese la CLDN6, (ii) inhibición de la proliferación de una célula que exprese la CLDN6, (iii) inhibición de la formación de coloniás de una célula que exprese la CLDN6, e (iv) inhibición de la metástasis de una célula que exprese la CLDN6. La eliminación de células, inhibición de la proliferación de células y/o inhibición de la formación de colonias de células se puede utilizar terapéuticamente para inhibir el crecimiento tumoral el cual incluye detener y/o prevenir el crecimiento tumoral, retardar el crecimiento tumoral y/o reducir el tamaño de un tumor existente y por consiguiente, se puede utilizar terapéuticamente para tratar o prevenir el cáncer, metástasis de cáncer y/o la dispersión metastásicas de células cancerígenas.

Preferiblemente un anticuerpo descrito en la presente media la eliminación de células induciendo l lisis mediada por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , lisis mediada por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , apoptosis, adhesión homotípica, y/o fagocitosis, preferiblemente induciendo la lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC.

Preferiblemente, la lisis mediada por ACC de células tiene lugar en la presencia de células efectorás, las cuales en modalidades particulares se seleccionan del grupo que consiste de monocitos, células mononucleares , células NK y PMNs, y la fagocitosis es mediante macrófagos.

La actividad de inhibir o reducir la proliferación de células que expresan la CLDN6, preferiblemente células cancerígenas, se puede medir in vitro determinando la proliferación de células cancerígenas que expresan la CLDN6 en un ensayo utilizando Bromodesoxiuridina (5-bromo-2-desoxiuridina, BrdU) . La BrdU es un nucleósido sintético el cual es un análogo de la timidina y se puede incorporar en el ADN recién sintetizado de células replicantes (durante la fase S y el ciclo celular) , sustituyendo con timidina durante la replicación del ADN. La detección del químico incorporado utilizando, por ejemplo, los anticuerpos específicos de la BrdU indican células que replicaron activamente su ADN.

La actividad de la inhibición o reducción de la formación de colonias de células que expresan la. CLDN6, preferiblemente células cancerígenas, se puede medir in vitro en un ensayo clonogénico. Un ensayo clonogénico es una técnica de microbiología para estudiar la efectividad de agentes específicos en la supervivencia y proliferación de células. El mismo frecuentemente se utiliza en laboratorios de investigación sobre el cáncer para determinar el efecto de fármacos o la radiación en la proliferación de células tumorales. El experimento involucra tres pasos significativos: (i) aplicar un tratamiento a una muestra de células, en particular células cancerígenas, (ii) formar revestimientos con las células en un recipiente de cultivo de tejido y (iii) dejar crecer las células. Las colonias producidas se fijan, tiñen, y contaron. La formación de colonias es de importancia con respecto a la formación de la metástasis si las células tumorales individuales colonizan los órganos. La actividad inhibidora de los anticuerpos indica su potencial para suprimir la formación de metástasis. Los anticuerpos que tienen la actividad de inhibir o reducir la formación de colonias en un ensayo clonogénico son particularmente útiles para tratar o prevenir la metástasis y la dispersión metastásica de células cancerígenas, en particular de los tipos de cáncer mencionados en la presente.

En modalidades preferidas, un anticuerpo descrito en la presente exhibe una o más funciones efectoras inmunes contra una célula que porta la CLDN6 en su conformación natural, en donde una o más funciones efectoras inmunes preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste de citotoxicidad dependiente complementaria (CDC) , citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) , inducción de apoptosis, e inhibición de la proliferación, preferiblemente las funciones efectoras son ADCC y/o CDC- Preferiblemente la inhibición del crecimiento tumoral o funciones efectoras inmunes ejercidas por un anticuerpo descrito en la presente se inducen mediante la unión de dicho anticuerpo a la CLDN6, preferiblemente a un epitope ubicado dentro de una porción extracelulár de la CLDN6, en donde dicha porción extracelulár de la CLDN6 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4 ó SEC ID NO: 5, más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5.

De acuerdo a la invención, una célula que expresa la CLDN6 preferiblemente es caracterizada por la asociación de la CLDN6 con su superficie celular. Una célula que expresa la CLDN6 o una célula caracterizada por la asociación de la CLDN6 con su superficie o portando la CLDN6 en su conformación natural preferiblemente es una célula tumoral, tal como una célula cancerígena, preferiblemente una célula cancerígena de un cáncer descrito en la presente.

Un anticuerpo descrito en la presente ': puede adherirse a una o más porciones efectoras terapéuticas, por ejemplo, radioetiquetas , citotoxinas, enzimas terapéuticas, agentes que inducen la apoptosis, y similar a fin de proveer citotoxicidad enfocada, es decir, la eliminación de células tumorales .

En una modalidad un anticuerpo descrito en la presente (i) se une a células que expresan la CLDN6, y (ii) no se une a células que no expresan la CLDN6. Un anticuerpo descrito en la presente preferiblemente (i) media la eliminación y/o inhibe la proliferación de células que expresan la CLDN6, y (ii) no media la eliminación y/o no inhibe la proliferación de células que no expresan la CLDN6.

En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente se puede caracterizar por una o más de las siguientes propiedades: a) especificidad a la CLDN6; b) una afinidad de unión a la CLDN6 de aproximadamente 100 n o menos, preferiblemente, aproximadamente 5-10 nM o menos y, más preferiblemente, de manera preferible 1-3 nM o menos; c) la capacidad de agotar las células tumorales las cuales expresan la CLDN6; d) la capacidad de detener o retardar la proliferación de células tumorales que expresan la CLDN6; e) la capacidad de prolongar la supervivencia de un sujeto que tiene células tumorales las cuales expresan la CLDN6.

En una modalidad, un anticuerpo descrito1 en la presente reduce el crecimiento de células tumorales y/o induce la muerte de células tumorales y por consiguiente, tiene un efecto inhibidor de tumores o destructor de tumores.

Un anticuerpo preferido descrito en la presente es un anticuerpo producido por u obtenible de una célula de hibridoma depositada en el DSMZ (Inhoffenstr . 76, 38124 Braunschweig, Alemania) y tiene una de las siguientes designaciones y números de acceso: 1. GT512muAB 36A, acceso no. DSM ACC3059, depositado el 13 de Abril de 2010; 2. GT512muMAB 27A, acceso no. DSM ACC3058, depositado el 13 de Abril de 2010; o 3. GT512muMAB 5F2D2, acceso no. DSM ACC3057, depositado el 13 de Abril de 2010.

Los anticuerpos de la invención se designan en la presente refiriéndose a la designación del anticuerpo y/o refiriéndose al clon que produce el anticuerpo, por ejemplo, muMAB 36A.

Los anticuerpos preferidos adicionales son aquéllos que tienen la especificidad de los anticuerpos producidos por y obtenibles de los hibridomas descritos anteriormente y, en particular, aquéllos que comprenden una porción de unión de antigeno o sitio de unión de antigeno, en particular una región variable, idéntica o altamente homologa a la de los anticuerpos producidos por y obtenibles de los hibridomas descritos anteriormente. Se contempla que los anticuerpos preferidos son aquéllos que tiene regiones de CDR ya sea idénticas o altamente homologas a las regiones de anticuerpos producidos por y obtenibles de los hibridomas anteriormente descritos. Por "altamente homologo" se contempla que pueden hacerse 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4, tal como de 1 a 3 ó 1 ó 2 sustituciones. Los anticuerpos particularmente preferidos son las formas quimerizadas y humanizadas de los anticuerpos producidos por y obtenibles de los hibridomas anteriormente descritos.

La presente invención también se refiere a una célula tal como una célula de hibridoma que produce un anticuerpo que se describe en la presente.

Las células de hibridoma son aquéllas depositadas en el DSMZ ( Inhoffenstr . 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y tiene una de las siguientes designaciones y números de acceso: 1. GT512muAB 36A, acceso no. DSM ACC3059, depositado el 13 de Abril de 2010; 2. GT512muMAB 27A, acceso no. DSM AGC3058, depositado el 13 de Abril de 2010; o 3. GT512muMAB 5F2D2, acceso no. DSM ÁCC3057, depositado el 13 de Abril de 2010.

La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos que comprenden genes o secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos o partes de los mismos, por ejemplo una cadena de anticuerpos, como se describe en la presente. Los ácidos nucleicos pueden estar comprendidos en un vector, por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector utilizado por ejemplo convencionalmente en ingeniería genética. El vector puede comprender genes adicionales tales como genes marcadores los cuales permiten la selección del vector en una célula huésped adecuada y bajo condiciones adecuadas. Además, el vector puede comprender elementos de control de la expresión que permiten una expresión apropiada de las regiones de codificación en huéspedes adecuados. Tales elementos de control son conocidos para el experto y pueden incluir un promotor, un cásete de empalme, y un codón de inicio de traducción.

Preferiblemente, el ácido nucleico de la invención se adhiere operativamente a elementos de control de expresión que permiten la expresión en células eucariotas o procariotas. Los elementos de control que aseguran la expresión en células eucariotas o procariotas son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Los métodos para la construcción de moléculas de ácido nucleico, para la construcción de vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico, para la introducción de vectores en células huéspedes apropiadamente elegidas, o para causar o lograr la expresión de moléculas de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una célula hospedera que comprende un ácido nucleico o vector como se describe en la presente.

En un aspecto, la invención provee composiciones, por ejemplo, composiciones/kits farmacéuticos o de diagnostico, que comprende un anticuerpo o una combinación de anticuerpos descritos en la presente. Una composición farmacéutica de la invención puede comprender un ¡portador farmacéuticamente aceptable y puede comprender opcionalmente uno o más adyuvantes, estabilizadores etc. En una modalidad particular, la composición incluye una combinación de anticuerpos la cual se une a distintos epitopes o la cual posee distintas características funcionales, tales como inducir el CDC y/o ADCC.

En una modalidad, la composición farmacéutica de la presente invención es una vacuna anti-tumoral terapéutica o profiláctica.

En un aspecto, la invención provee métodos terapéuticos y profilácticos para tratar un paciente que tiene un padecimiento tumoral o que está en riesgo de desarrollar un padecimiento tumoral. En un aspecto, la invención provee métodos para inhibir el crecimiento tumoral.

En un aspecto, la invención provee métodos para inducir la muerte de células tumorales. Estos aspectos pueden involucrar la administración de los anticuerpos o composiciones descritas en la presente a un paciente.

La presente invención también incluye la administración simultánea o secuencial de dos o más anticuerpos anti-CLDN6, en donde preferiblemente al menos uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo anti-CLDN6 quimérico y al menos un anticuerpo adicional es un anticuerpo ahti-CLDN6 humano, los anticuerpos se unen a los mismos o diferentes epitopes de CLDN6. Preferiblemente, un anticuerpo CLDN6 quimérico de la invención se administra primero seguido por la administración de un anticuerpo anti-CLDN6 humano, en donde el anticuerpo anti-CLDN6 humano preferiblemente se administra durante un periodo de tiempo prolongado, es decir como terapia de mantenimiento.

Un anticuerpo o una composición descrita en la presente se puede utilizar en una variedad de métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales que expresan la CLDN6 y/o eliminar selectivamente células tumorales que expresan la CLDN6 y por consiguiente inhibir el crecimiento tumoral poniendo en contacto las células con una cantidad efectiva del anticuerpo o composición, de modo tal que el crecimiento de la célula sea inhibido y/o la célula sea eliminada. En una modalidad, el método incluye la eliminación de la crecimiento tumoral que expresa la CLDN6, opcionalmente en la presencia de células efectoras, por ejemplo, mediante CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o mediante una combinación de dos o más de estos mecanismos.

Un anticuerpo o una composición descrita en la presente se pueden utilizar para tratar y/o prevenir padecimientos tumorales que involucran células que .expresan CLDN6 administrando el anticuerpo o composición a pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar tales padecimientos.

La invención puede involucrar un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de padecimientos tumorales, es decir para tratar un paciente que tiene un padecimiento tumoral o está en riesgo de desarrollar un padecimiento tumoral. En un aspecto, la invención provee métodos para inhibir el crecimiento tumoral que comprende la administración de uno o más de los anticuerpos y composiciones descritos en la presente. i.

Preferiblemente, los anticuerpos y composiciones descritas en la presente se administran de manera que la sustancia terapéuticamente activa, en particular el anticuerpo, no se suministra o no se suministra sustancialmente a un tejido u órgano en qué las células cuando el tejido u órgano está libre de tumores que: expresan la CLDN6 tal como tejido de placenta o placenta. Para este fin, los agentes y composiciones descritas en la presente se pueden administrar localmente.

En un aspecto, la invención provee un anticuerpo que se describe en la presente para usarse en los métodos de tratamiento descritos en la presente. En una modalidad, la invención provee una composición farmacéutica que se describe en la presente para usarse en los métodos de tratamiento descritos en la presente.

Los tratamientos descritos en la presente se pueden combinar con resección quirúrgica y/o radiación y/o quimioterapia tradicional.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Especificidad de unión de los anticuerpos muMAB 5F2D2, 21A y 36A monoclonales murinos anti-CLDN6. MuMAB 5F2D2, 27A y 36A son anticuerpos que se enlazan fuertemente a células que expresan la CLDN6, aunque las mismas no se unen a células que expresan CLDN3 o CLDN .

Figura 2: Titulación de la unión de muMAB 5F2D2 a células HEK293T transfectadas temporalmente con CLDN6, 3, 4 ó 9, respectivamente. El muMAB 5F2D2 muestra la unión fuerte a la CLDN6 humana y la unión débil a la CLDN9 humana. Los anticuerpos no interactúan con la CLDN3 ó 4 humana.

Figura 3: Titulación de la unión de muMAB 27A a las células HEK293T transfectadas temporalmente con CLDN6, 3, 4 ó 9, respectivamente. El muMAB 27A muestra la unión fuerte a la CLDN6 humana y la unión muy débil a la CLDN9 humana. Los anticuerpos no interactúan con la CLDN3 ó 4 humana.

Figura 4: Titulación de la unión de muMAB 36A a las células HEK293T transfectadas temporalmente con CLDN6, 3, 4 ó 9, respectivamente. El muMAB 36A muestra la unión fuerte a la CLDN6 humana y virtualmente no se une a la CLDN9 humana. El anticuerpo no interactúa con la CLDN3 ó 4 humana.

Figura 5: Afinidades relativas de anticuerpos monoclonales murinos anti-CLDN6 muMAB 5F2D2, 27A y 36A. El muMAB 5F2D2 y 27A exhibe valores EC50 de 350-450 ng/ml y la saturación de unión se logra a bajas concentraciones mientras que la muMAB 36A no muestra saturación de unión incluso a la concentración más alta.

Figura 6: Actividad de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo muMAB 5F2D2 monóclonal murino anti-CLDN6. El muMAB 5F2D2 muestra la actividad CDC de una manera dependiente de la dosis.

Figura 7: Actividad de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de los anticuerpos muMAB 27A y 36A monoclonales murinos anti-CLDN6. El muMAB 27A exhibe la CDC dependiente la dosis mientras que la muMAB 36A no es capaz de inducir la CDC in vitro.

Figura 8: Inducción de la citotoxicidad mediada por las células dependientes de anticuerpos (ADCC) mediante el anticuerpo chimAB 5F2D2 anti-CLDN6 quimérico en el NEC8 que expresa endógenamente la CLDN6 y NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 atenuada genéticamente) . El anticuerpo chimAB 5F2D2 anti-CLDN6 quimérico induce la ADCC en células NEC8 con células efectoras de dos diferentes donadores de una manera dependiente de la dosis. La eficacia para inducir la ADCC en células NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 atenuada genéticamente) es reducida fuertemente con chimAB 5F2D2.

Figura 9: Efecto terapéutico de muMAB 5F2D2 en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano. El muMAB 5F2D2 muestra inhibición del crecimiento tumoral específico y fuerte en ratones injertados con células HEK293 que expresan de manera estable la CLDN6 humana.

Figura 10: Efecto terapéutico en muMAB 5F2D2 en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano. Los volúmenes tumorales se reducen significativamente el: día 28 (y posteriormente) después del tratamiento con MuMAB 5F2D2 en una prueba Kruskal-Wallis .

Figura 11: Efecto terapéutico en muMAB 5F2D2 en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano. Los ratones tratados con el anticuerpo muMAB 5F2D2 anti-CLDN6 murino monoclonal mostraron una supervivencia prolongada en comparación con los grupos de control PBS .

Figura 12: Efecto terapéutico en muMAB 5F2D2 en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano. El muMAB 27A muestra una inhibición especifica y fuerte del crecimiento tumoral en ratones injertados con células HEK293 que expresan establemente la CLDN6 humana.

Figura 13: Efecto terapéutico del muMAB 36A en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano. El muMAB 36A muestra una inhibición especifica y fuerte del crecimiento tumoral en ratones injertados con células HEK293 que expresan establemente la CLDN6 humana.

Figura 14: Efecto terapéutico del muMAB 27A y 36A en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano. Los ratones tratados con los anticuerpos MuMAB 27A y 36A anti-CLDN6 murinos monoclonales mostraron supervivencia prolongada.

Figura 15: Análisis de inmunoelectrotransférencia de la expresión de las CLDN3, 4 6 y 9 humanas en células NEC8. La linea celular NEC8 de tumores de células germinales testiculares muestra solamente la expresión de CLDN6 (A) aunque no de CLDN3, 4 ó 9, respectivamente (B) .

Figura 16: Análisis de la expresión de superficie de la CLDN6 en células NEC8 utilizando citometria de flujo.

La CLDN6 se expresa en las células NEC8.

Figura 17: Efecto terapéutico del MuMAB 5F2D2 en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano utilizando ratones trasplantados con la linea celular de tumores NEC8.

En comparación con el grupo de control con solución salina el muMAB 5F2D2 mostró inhibición especifica y fuerte del crecimiento tumoral en ratones trasplantados con células NEC8 que expresan endógenamente la CLDN6 humana.

Figura 18: Efecto terapéutico del muMAB 5F2D2 en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano utilizando ratones trasplantados con la linea celular de tumores NEC8. La prueba Kruskal-Wallis muestra que los volúmenes tumorales se reducen el dia 21 y 42 después del tratamiento con muMAB 5F2D2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En toda esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un miembro establecido, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o etapa o , grupo de miembros, números enteros o etapas aunque en algunas modalidades tal otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el. contenido consiste en la inclusión de un miembro establecido, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el" "la" y referencia similar utilizada en el contexto para describir la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) se entiende que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en la presente o contradiga claramente por el contexto. La relación de rangos de valores en la presente se pretende meramente que sirva como un método de abreviatura para referirse individualmente a cada valor que caiga dentro del rango. A menos que se indique de otro modo en la presente, cada valor individual se incorpora en la especificación como si se mencionara individualmente en la presente. Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique en la presente o se contradiga claramente de otro modo por el contexto. EÍ uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplificante (tal como, "tal como") , provisto en la presente se pretende meramente que ilustren mejor la invención y no posee una limitación en el alcance de la invención reivindicada de otro modo. Ningún lenguaje en la especificación deberá interpretarse que indica cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de empalme ajustado, donde los mismos establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas de transmembrana que abarca la membrana 4 veces con el extremo N-terminal y el C-terminal ambos ubicados en el citoplasma. El primer bucle extracelular consiste en promedió de 53 aminoácidos y el segundo de alrededor de 24 aminoácidos. La CLDN6 y CLDN9 son los miembros más similares de la familia CLDN.

El término VCLDN" que se utiliza en la presente significa claudina e incluye CLDN6, CLDN9, CLDN4 y CLDN3. Preferiblemente, una CLDN es una CLDN humana.

El término "CLDN6" preferiblemente se refiere a CLDN6 humana, y, en particular, a una proteína que comprende (i) una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico el cual comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la SEC ID NO: 1 del listado de secuencia o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico, y/o (ii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 6 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN6 preferiblemente comprende los aminoácidos 28 a 80, más preferiblemente los aminoácidos 28 a 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 6, tal como la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 3. El segundo bucle extracelular de CLDN6 preferiblemente comprende los aminoácidos 138 a 160, preferiblemente los aminoácidos 141 a 159, más preferiblemente los aminoácidos 145 a 157 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 2 ó la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:, 6, tal como la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 5. Dicho primero y/o segundo bucles extracelulares preferiblemente forman la porción extracelular de CLDN6.

El término "CLDN9" preferiblemente se refiere a la CLDN9 humana, y, en particular, a una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID NO: 7 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN9 preferiblemente comprende los aminoácidos 28 a 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 7. El segundo bucle extracelular de CLDN9 preferiblemente comprende los aminoácidos 141 a 159 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 7. Dicho primer y/o segundo bucles extracelulares preferiblemente forman la porción extracelular de CLDN9.

El término "CLDN4" preferiblemente se refiere a la CLDN4 humana, y, en particular, a una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID NO: 8 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN4 preferiblemente comprende los aminoácidos 28 a 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 8. El segundo bucle extracelular de CLDN4 preferiblemente comprende los aminoácidos 141 a 159 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 8. Dichos primero y/o" segundo bucles extracelulares preferiblemente forman la porción extracelular de CLDN4.

El término "CLDN3" preferiblemente se refiere a la CLDN3 humana, y, en particular, a una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la secuencia 9 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de la CLDN3 preferiblemente comprende los aminoácidos 27 a 75 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 9. El segundo bucle extracelular de CLDN3 preferiblemente comprende los aminoácidos 140 a 158 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 9. Dicho primero y/o segundo bucles extracelulares preferiblemente forman la porción extracelular de CLD 3.

Las secuencias de CLDN descritas anteriormente incluyen cualquier variante de dichas secuencias, en particular mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquéllos que están presentes de manera natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, la importancia de la cual frecuentemente es poco clara. La secuenciación de genes completa frecuentemente identifica numerosas variantes alélicas para un gen dado. Un homólogo de especie es un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos con una especie diferente a la de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos dados. El término "CLDN" abarcara (i) variantes de empalme de CLDN (ii) variantes modificadas posttraducción con CLDN, particularmente incluyendo variantes con diferente glicosilación tal como un estatus N-glicosilación, (iii) variantes de conformación de CLDN, (iv) variantes no relacionadas con el cáncer de CLDN y relacionadas con el cáncer de CLDN. Preferiblemente, una CLDN está presente en su conformación natural.

El término "porción" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o proteina el término "porción" del mismo puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferiblemente, una porción de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, aun más preferiblemente al menos 80%, y más preferiblemente al menos 90%, de los aminoácidos dicha secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, si la porción es una fracción discontinua dicha fracción discontinua está compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más partes de una estructura, cada parte es un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede estar compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más, preferiblemente no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en donde cada parte preferiblemente comprende al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.

Los términos "parte" y "fragmento" se utilizan indistintamente en la presente y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o proteina se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura preferiblemente comprenden una o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epitope o péptido preferiblemente es inmunológicamente activo al epitope o péptido del cual se deriva.

El término "una porción extracelular de una CLDN" en el contexto de la presente invención se refiere a una parte de una CLDN frente al espacio extracelular de una célula y preferiblemente es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, mediante anticuerpos ubicados fuera de la célula. Preferiblemente, el término se refiere a uno o más bucles extracelulares o una parte de los 'mismos o cualquier otra parte extracelular de una CLDN la cual preferiblemente es especifica para dicha CLDN. Preferiblemente, dicha parte comprende al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 30, o al menos 50 aminoácidos o más.

De acuerdo a la invención, una CLDN expresada por una célula preferiblemente está asociada con la superficie de dicha célula. El término "CLDN asociada con la superficie de una célula" significa que la CLDN está asociada con y ubicada en la membrana de plasma de dicha célula, en donde al menos una parte de la CLDN, preferiblemente la porción extracelular, frente al espacio extracelular de dicha célula y es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, mediante anticuerpos ubicados fuera de la célula. La asociación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la asociación puede ser mediante uno o más dominios de transmembrana, uno o más anclajes de lipidos, y/o mediante la interacción con cualquier proteina, lipido, sacárido, u otra estructura que se puede encontrar en la hoja externa de la membrana de plasma de una célula. Por ejemplo, uña CLDN asociada con la superficie de una célula puede ser una proteina de transmembrana.

La CLDN6 está asociada con la superficie de una célula si la misma está ubicada en la superficie de dicha célula y es accesible para unirse mediante los anticuerpos específicos de la CLDN6 agregados a la célula. Se entenderá que en el caso donde la CLDN6 es expresada por las células, la CLDN6 asociada con la superficie de dichas células puede solamente ser una porción de la CLDN6 expresadas.

El término "una célula que porta una CLDN" preferiblemente significa que dicha célula porta una , CLDN en su superficie, es decir, que la CLDN está asociada con la superficie de dicha célula.

"Superficie celular" o "superficie de una célula" se utilizan de acuerdo con su significado normal en la técnica, y por consiguiente incluye el exterior de «la célula la cual es accesible para unirse mediante proteínas y otras moléculas.

La expresión "CLDN expresada en la superficie de una célula" significa que la CLDN expresada mediante una célula es encontrada en asociación con la superficie de dicha célula .

De acuerdo a la invención CLDN sustancialmente no se expresa en una célula y no está sustancialmente asociada con una secuencia celular si el nivel de expresión y asociación es más bajo en comparación con la expresión y asociación en células de placenta o tejido de placenta. Preferiblemente, el nivel de expresión y asociación es menor al 10%, preferiblemente menor al 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% ó 0.05% de la expresión y asociación en células de placenta o tejido de placenta o incluso más bajo. Preferiblemente, CLDN6 sustancialmente no se expresa en una célula y no está sustancialmente asociada con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación excede el nivel de expresión y la asociación en tejido no tumorigénico y no canceroso diferente al tejido de placenta por no más de 2 veces, preferiblemente 1,5 veces, y preferiblemente no excede el nivel de expresión y asociación en dicho tejido no tumorigénico y no canceroso. Preferiblemente, CLDN6 no se expresa sustancialmente en una célula y no está asociado sustancialmente con una superficie celular si el nivel de expresión o asociación está por debajo del limite de detección y/o si el nivel de expresión o asociación es demasiado bajo para permitir la unión mediante anticuerpos específicos de la CLDN6 agregados a las células.

De acuerdo a la invención la CLDN6 es expresada en una célula y está asociada con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación excede el nivel de expresión y asociación en tejido no tumorigénico y no canceroso diferente al tejido de placenta, preferiblemente a más de 2 veces, preferiblemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces, ó 10000 veces. Preferiblemente, la CLDN6 es expresada en una célula y está asociada con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación está por arriba del límite de detección y/o si el nivel de expresión y asociación, es lo suficientemente alto para permitir su unión mediante los anticuerpos específicos de la CLDN6 agregados a las células. Preferiblemente, la CLDN6 expresada en una célula es expresada o expuesta en la superficie de dicha célula: El término "balsa" se refiere a los microdominios de membrana ricos en colesterol y esfingolípidos ubicados en el área de la hoja externa de la membrana de plasma de una célula. La capacidad de ciertas proteínas de asociarse dentro de tales dominios y su capacidad de formar "agregados" o "agregados focales" puede efectuar la función de la proteína. Por ejemplo, la translocación de moléculas de CLDN6, en tales estructuras, después de unirse mediante los anticuerpos de la presente invención, crea una alta densidad de complejos de antígenos-anticuerpos de la CLDN6 en las membranas de plasma. Tal densidad elevada de complejos de antígeno-anticuerpo de CLDN6 puede permitir una eficiente activación del sistema complementario durante el CDC.

El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas mediante uniones de disulfuro, e incluye cualquier molécula que comprende una porción de unión de antígenos del mismo. El ,¡ término "anticuerpo" incluye anticuerpos y fragmentos monoclonales o derivados de los mismos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, por ejemplo, scFv' s y fragmentos de anticuerpos de unión de antígenos tales como fragmentos de Fab y Fab' y también incluye todas las formas de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos expresados en proca-riotas, anticuerpos no glicosilados, y cualquier fragmento y derivado de anticuerpos de unión de antigenos como se describe en la presente. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente1 como VH) y región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hiper-variabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad 1 (CDR) , entremezcladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino-terrninal al carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 , FR . Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico de complementos.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión del antigeno que es sustancialmente derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión de antigeno puede comprender ya sea dominios variables completos fusionados en dominios constantes o solamente las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en regiones de armazón apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión de antigenos pueden ser de cepa natural o modificarse con una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificadas para asemejarse más estrechamente a inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpo humanizados conservan todas las secuencias de GDR (por ejemplo un anticuerpo de ratón humanizado el cual contiene todas las seis CDRs del anticuerpo de ratón) . Otras, formas tienen una o más CDRs las cuales son alteradas con respecto al anticuerpo original.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesada y ligera es homologa a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homologo a las correspondientes secuencias en otras. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homologas a las secuencias de anticuerpos derivados de otros. Una clara ventaja . en tales formas quiméricas es que la región variable se puede derivar convenientemente de fuentes actualmente conocidas que utilizan células B fáciles de conseguir o hibridomas de organismos huésped no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de facilitar la preparación y la especificidad no es afectada por la fuente, la región constante es humana, es menos probable que produzca una respuesta inmune de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos pudiera ser la región constante de una fuente no humana. Sin embargo la definición no se limita a este ejemplo particular.

El término "porción de unión del antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de unión de antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión de antigeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F{ab' )2r fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; fragmentos Fd que consiste de los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), el cual consiste de un dominio VH; (vi) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDRs aislados el cual puede unirse opcionalmente mediante un enlace sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican mediante genes separados, los mismos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes , mediante un enlace sintético que permite hacer los mismos como una cadena de una sola proteina en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas (conocido como Fv de una sola cadena (scFv) ; ver por ejemplo Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). También se pretende ; abarcar tales anticuerpos de una sola cadena dentro del término "porción de unión de antigeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional es las proteínas de fusión de inmunoglobülina de dominio de unión que comprende (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona a un polipéptido de la región de bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región de bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada a la región constante de CH2. El polipéptido de dominio de unión puede ser a una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina del dominio de unión se describen además en US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas para aquellos expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan por su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los anticuerpos descritos en la presente son, útiles para inmunoterapia anti-tumoral pasiva, y pueden o no adherirse a porciones efectoras terapéuticas, por ejemplo, radioetiquetas, quimioterapéuticos tales como cisplatino, metotrexato, adriamicina, y similares para terapia contra el cáncer, citotoxinas, enzimas terapéuticas, agentes que inducen apoptosis, y similares a fin de proveer citotoxicidad focalizada, es decir, eliminación de células tumorales.' Preferiblemente los anticuerpos descritos en la presente median la eliminación de células al inducir la lisis mediada por la citotoxicidad dependiente complementaria (CDC) , lisis mediada por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), apoptosis, adhesión homotípica, y/o preferiblemente induciendo la lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC. Los anticuerpos descritos en la presente preferiblemente interactúan con componentes del sistema inmune, preferiblemente a través de ADCC o CDC. Sin embargo, los anticuerpos de la invención también puede ejercer un efecto simplemente uniéndose a antigenos tumorales en la superficie celular, por consiguiente, por ejemplo bloqueando la proliferación de las células.

La ADCC describe la capacidad de eliminación de células de células efectoras que se describen en la presente, en particular los linfocitos, lo cual preferiblemente requiere que la célula objetivo sea comercializada con un anticuerpo .

La ADCC preferiblemente se presenta cuando los anticuerpos se unen a antigenos en células tumorales y los dominios Fe del anticuerpo acoplan los receptores Fe (FcR) en la superficie de células efectoras inmunes. Varias .familias de receptores Fe han sido identificadas, y las poblaciones de células especificas característicamente expresan receptores Fe definidos. El ADCC se puede ver como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción de tumores inmediata que también lleva a la presentación de antígeno y la inducción de respuestas de las células T dirigidas a tumores. Preferiblemente, la inducción in vivo del ADCC llevará a respuestas de células T dirigidas a tumores y respuestas de anticuerpos derivados de huéspedes.

El CDC es otro método de eliminación de células que se puede dirigir mediante anticuerpos. La IgM es el isotipo más efectivo para la activación de complementos. IgGl e IgG3 también son ambas muy efectivas en dirigir el CDC a través de la vía de activación complementaria clásica. Preferiblemente, en esta cascada, la formación de complejos de antigeno-anticuerpo da como resultado la desencapotación de múltiples sitios de unión Clq en proximidad cercana en los dominios CH2 de moléculas de anticuerpos participantes tales como moléculas IgG (Clq es uno de los tres subcomponentes del complemento Cl) . Preferiblemente estos sitios de unión Clq descapotados convierten la interacción Clq-IgG de baja afinidad previamente en una de alta avidez, lo cual provoca una cascada de eventos que involucran una serie de otras proteínas complementarias y lleva a la liberación proteolítica de los agentes C3a y C5a quimiotácticos/activadores de células efectoras.

Preferiblemente, la cascada de complementos termina en la formación de un complejo de ataque de la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilita el libre paso de agua y solutos hacia adentro y hacia afuera de la célula y puede llevar a la apoptosis.

El término "anticuerpo" incluye "moléculas biespecificas", es decir las moléculas que tienen dos diferentes especificidades de unión. Por ejemplo, la' molécula puede unirse a, o interactuar con (a) un antigeno de la superficie celular, y (b) un receptor Fe en la superficie de una célula efectora. El término "anticuerpo" también incluye "moléculas multiespecificos" o "moléculas heteroespecificas", es decir moléculas las cuales tienen más de dos diferentes especificidades de unión. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interactuar con (a) un antigeno de superficie celular, (b) un receptor Fe en la superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. De acuerdo con esto, la invención incluye, pero no se limita a, moléculas biespecificas, triespecificas, tetraespecificas y otras moléculas multiespecificas las cuales se dirigen a la CLDN6, y a otros objetivos, tales como receptores Fe en 1 células efectoras. El término "anticuerpo" también , incluye "anticuerpos biespecificos" los cuales también 1 incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecificos bivalentes en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena de polipéptidos, pero utilizando un enlace que es demasiado corto para permitir el apareo entre los dos dominios en la misma cadena, forzando asi el aparear los dominios con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antigenos (ver por ejemplo, <Holliger, P., et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al., (1994) Structure 2:1121-1123).

El término "anticuerpo" también incluye "heteroanticuerpos" el cual términos se refiere a dos o más anticuerpos, derivados de los mismos, o regiones de unión de antigenos enlazados conjuntamente, al menos dos de los cuales tienen diferentes especificidades. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión de un receptor Fe en una célula efectora, y una especificidad de unión para un antigeno o epitope en una célula objetivo, por ejemplo, una célula tumoral.

"Célula objetivo" significara cualquier célula indeseable en un sujeto (por ejemplo, un humano o animal) que se puede focalizar mediante un anticuerpo de la invención. En modalidades preferidas, la célula objetivo es una cé,lüla que expresa CLDN6. Las células que expresan CLDN6 típicamente incluyen células tumorales.

Cuando se utiliza en la presente, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune la cuál está involucrada en la fase efectora de una respuesta inmune, contrariamente a las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmune. Las células inmunes e emplificantes incluyen células de origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, células B y células T que incluyen células T citoliticas (linfocitos T citotóxicos; CTLs) , células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulocitos , mastocitos, y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fe específicos y llevan a cabo funciones inmunes específicos. En modalidades preferidas, una célula efectora es capaz de inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir la ADCC. Por ejemplo, monocitos, macrófagos, los cuales expresan FcR están involucrados en la eliminación específica de células objetivo y que presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmune, o uniéndose a células que presentan antígenos. En otras modalidades, una célula efectora puede fagocitar un antígeno, célula objetivo, o microorganismo. La expresión de un FcR particular en una célula efectora se puede regular mediante factores humorales tales como citocinas. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de Fc-gammaRl es sobre-regulada por el interferón gamma (IFN-?) . Esta expresión mejorada incrementa la actividad citotóxica de células que portan el Fc-gammaRl contra los objetivos. Una célula efectora puede convertir en fagocitosis o lisar un antigeno objetivo o una célula objetivo.

Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", que se utiliza en la presente, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lineas germinales humanas. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de lineas germinales humanos (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o mutagénesis especifica puntual in vitro o mediante mutación somática in vivo) .

Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser anticuerpos monoclonales . El término "anticuerpo monoclonal" que se utiliza en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Un anticuerpo monoclonal exhibe una especificad de unión 'única y afinidad con un epitope particular. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales son producidos por un hibridoma el cual incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, ratón, fusionado a una célula inmortalizada.

Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser anticuerpos recombinantes . El término "anticuerpo recombinante" , que se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir del mismo, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatorios, recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que involucra el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN .

El término "transfectoma" , que se utiliza en la presente, incluye células huésped eucariotas, recombinantes, que expresan un anticuerpo, tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HE 293T, células vegetales, u hongos, incluyendo células de levadura.

Cuando se utiliza en la presente, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación a un organismo transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante correspondiente al encontrado en un organismo que no consiste del organismo transgénico, y que generalmente se deriva de una especie diferente al organismo transgénico.

Cuando se utiliza en la presente, un "anticuerpo heterohibrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligera y pesada de organismos de diferentes orígenes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohibrido .

La invención incluye todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos que se describen en la presente los cuales para los propósitos de la invención, son abarcados por el término "anticuerpo". El término "derivados de anticuerpos" se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos descritos en la "presente preferiblemente son aislados. Un "anticuerpo aislado""' que se utiliza en la presente, se pretende referirse a un anticuerpo el cual está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpos aislado que específicamente se une a la CLDN6 está sustancialmente libre de anticuerpos que unen específicamente antígenos diferentes a la CLDN6) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítope, isoforma o variante de la CLDN6 humana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de CLDN6) . Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y se combinan en una composición bien definida.

De acuerdo a la presente invención, un anticuerpo es capaz de unirse a un objetivo predeterminado si el mismo tiene una afinidad significativa con dicho objetivo predeterminado y se une a dicho objetivo predeterminado en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" frecuentemente es medida mediante la constante de disociación (KD) de equilibrio. Preferiblemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a un objetivo predeterminado con una constante de disociación (KD) de 10~5 M o más baja, 10~6 M o más baja, 10~7 M o más baja, 10"8 M o más baja, 10"9 o más baja, 10"10 M o más baja, 10"11 M o más baja, ó 10~12 M o más baja.

Un anticuerpo no es (sustancialmente) capaz de unirse a un objetivo si el mismo no tiene afinidad significativa a dicho objetivo y no se une significativamente a dicho objetivo en ensayos estándar. Preferiblemente, un anticuerpo (sustancialmente) no es capaz de unirse a un objetivo si el mismo no se une detectablemente a dicho objetivo en un análisis de citometria de flujo (análisis FACS) en donde se determina la unión de dicho anticuerpo a dicho objetivo expresado en la superficie de células intactas. Preferiblemente, el anticuerpo no se une detectablemente a dicho objetivo si está presente en una concentración de hasta 2, preferiblemente 10, más preferiblemente 20, en particular 50 ó 100 pg mi o más. Preferiblemente, un anticuerpo no tiene afinidad significativa con un objetivo si el mismo se une a dicho objetivo con un KD que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces más alta que la KD para unirse al objetivo predeterminado al cual el anticuerpo es capaz de unirse. Por ejemplo, si la KD de unión de un anticuerpo al objetivo al cual el anticuerpo está apto para unirse es 10"7 M, la KD de unión a un objetivo para el cual el anticuerpo no tiene afinidad significativa podría ser al menos 10"6 M, 10"5 M, 10~4 M, 10"3 M, 10"2 M, ó 10"1 M.

Un anticuerpo de acuerdo a la presente invención preferiblemente es capaz de unirse específicamente a un objetivo predeterminado, en particular CLDN6.

Un anticuerpo es especifico para un objetivo predeterminado si el mismo es capaz de unirse a dicho objetivo predeterminado mientras el mismo no sea capaz de unirse a otros objetivos, es decir tiene afinidad significativa con otros objetivos y no , se une significativamente a otros objetivos en ensayos estándar. De acuerdo a esta invención, un anticuerpo es especifico para el CLDN6 si el mismo es capaz de unirse a la CLDN6 aunque no sea ( sustancialmente) capaz de unirse a otros objetivos, en particular proteínas de Claudina diferente a CLDN6 tal como CLDN9, CLDN4, CLDN3 y CLDN1. Preferiblemente, un anticuerpo es específico para la CLDN6 si la afinidad con y la unión a una proteína de Claudina diferente a la CLDN6 tal como CLDN9, CLDN4, CLDN3 y CLDN1 no excede significativamente la afinidad con o unión a proteínas no excede significativamente la afinidad con o unión a proteínas no relacionadas con la Claudina tales como albúmina de suero de bovino (BSA) , caseína, albúmina de suero humano (HSA) o proteínas de transmembrana diferentes a la Claudina tales como ¡moléculas de MHC o receptor de transferrina o cualquier otro polipéptido especificado. Preferiblemente, un anticuerpo es específico para un objetivo predeterminado si el mismo se une a dicho objetivo con una KD que sea al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, ó 106 veces más baja que la KD para unirse a un objetivo para el cual el mismo no especifico. Por ejemplo, si la KD para la unión de un anticuerpo al objetivo para el cual el mismo es especifico es 10"7 , la KD que se une a un objetivo para el cual el mismo no es especifico debería ser al menos 10"6 M, 10"5 M, 10"4 M, 10"3 M, 10"2 M, ó 10"1 M.

La unión de un anticuerpo a un objetivo se puede determinar experimentalmente utilizando cualquier método; ver, por ejemplo, Berzofsky et al., "Antibody^Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (192), y los métodos descritos en la presente. Las afinidades pueden determinarse fácilmente utilizando técnicas convencionales, tal como mediante diálisis de equilibrio; utilizando el instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimientos generales resumidos por el fabricante; mediante radioinmunoensayo utilizando antígeno objetivo radioetiquetado; o mediante cualquier otro método conocido para el artesano experto. Los datos de afinidad puede analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949). La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antígeno particular puede variar si se mide bajo diferentes condiciones, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por consiguiente, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión de antigeno, por ejemplo, KD, IC50, preferiblemente son hechas con soluciones estandarizadas de anticuerpo y antigeno, y un amortiguador estandarizado.

Cuando se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgGl) que es codificado por genes de región constante de cadena pesada. Los anticuerpos de acuerdo a la invención incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales e incluyen anticuerpos IgG2a (por ejemplo IgG2a, ?, ?) , IgG2b (por ejemplo IgG2b, ?, ?) , IgG3 (por ejemplo IgG3, ?, ?) e IgM. Sin embargo, otros isotipos de anticuerpos también son abarcados por la invención, incluyendo anticuerpos de IgGl, IgAl, IgA2, IgA secretorio, IgD, e IgE.

Cuando se utiliza en la presente, "intercalación de isotipos" se refiere al fenómeno mediante el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.

El término "presente de manera natural" cuando se utiliza en la presente se aplica a un objeto que se refiere al hecho de que se puede encontrar un objeto en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se pueden aislar de una fuente en la naturaleza y la cual no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio está presente de manera natural.

El término "reconfigurado" que se utiliza en la presente se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera en donde un segmento V se posiciona inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus del gen de inmunoglobulina reconfigurado (anticuerpo) se puede identificar mediante su la comparación del ADN de linea germinal; un locus reconfigurado tendrá al menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado .

El término "no reconfigurado" o "configuración de línea germinal" que se utiliza en la presente con referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no se recombina a fin de estar inmediatamente adyacente a un segmento D o J.

De acuerdo a la invención, los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, incluyendo pero no limitadas a ratón, rata, conejo, cobayo y humano. Los anticuerpos también incluyen moléculas quiméricas en las cuales una región constante de anticuerpo derivada de una especie, preferiblemente humana, se combina con el sitio de unión del antigeno derivado de otra especie. Además, los anticuerpos incluyen moléculas humanizadas en las cuales los sitios de antigeno de un anticuerpo derivado de una especie no humana se combinan con regiones constantes y regiones de armazón de origen humano.

Los anticuerpos se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales, convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas, estándar, de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975) . Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo transformación viral u oncogénica de linfocitos B o técnicas de exhibición de fagos utilizando genotecas de genes de anticuerpos.

El sistema con animales preferido para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales 1 es el sistema con murinos. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados son conocidos e la técnica. Los socios de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión también son conocidos.

Otros sistemas con animales preferidos ' para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema con ratas y conejos (por ejemplo descrito en Spieker-Polet et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 92:9348 (1995), también ver Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005) ) .

En aun otra modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra la CLDN6 se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmune humano a diferencia del sistema con ratones. Estos ratones transgénicos o transcromosómicos incluyen ratones conocidos como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se mencionan colectivamente en la presente como "ratones transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en tales ratones transgénicos se puede realizar como se describe a detalle para CD20 en WO2001 035607.

Aún otra estrategia para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente genes que codifiquen anticuerpos de linfocitos que producen anticuerpos de estrategia definida por ejemplo ver Babcock et al., 1996. Una estrategia para generar anticuerpos monoclonales de linfocitos aislados simples que producen anticuerpos de estrategia definida. Para detalles de ingeniería de anticuerpos recombinantes ver también elschof y Kraus, Recombinant antibodies for cáncer therapy ISBN-0-89603-918-8 y Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Para generar anticuerpos para CLDN6, los ratones se pueden inmunizar con péptidos conjugados con portadores derivados de la secuencia de CLDN6, una preparación enriquecida de antigeno de CLDN6 recombinantemente expresado o fragmentos de los mismos y/o células que expresan CLDN6 o fragmentos de los mismos, como se describe. Alternativamente, los ratones se pueden inmunizar con ADN que codifica CLDN6 humana de longitud completa o fragmentos de los mismbs. En el caso de que las inmunizaciones que utilizan una preparación purificada o enriquecida del antigeno CLDN6 no den como resultado anticuerpos, los ratones también se pueden inmunizar con células que expresan CLDN6, por ejemplo, para promover respuestas inmunes.

La respuesta inmune se puede monitorear en el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen de la vena de la cola o sangrados retroorbitales . Los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina anti- CLDN6 se pueden utilizar para fusiones. Los ratones se pueden reforzar intraperitoneal o intravenosamente con células que expresan CLDN6 3-5 días antes del sacrificio y remoción del bazo para incrementar la relación de hibridomas que secretan anticuerpos específicos.

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales a CLDN6, las células de ganglios linfáticos, bazos o médula ósea obtenidos de ratones inmunizados se pueden aislar y fusionar a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden seleccionar entonces para la producción de anticuerpos de antígenos específicos. Los pozos individuales se pueden seleccionar mediante ELISA para hibridomas que secretan de anticuerpos. Mediante inmunofluorescencia y análisis FACS que utilizan células que expresan CLDN6, se pueden identificar anticuerpos con especificidad para CLDN6. Los hibridomas que secretan anticuerpos se pueden revestir, seleccionar contra, y si todavía son positivos a anticuerpos monoclonales anti-CLDN6 se pueden subclonar limitando la dilución. Los sübclones estables se pueden cultivar entonces in vitro para generar anticuerpos en el medio de cultivo de tejidos para la caracterización .

Los anticuerpos de la invención también se pueden producir en un transfectoma de células huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes que son bien conocidos en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, en una modalidad, el (los) gen (es) de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, se pueden ligar en un vector de expresión tal como plásmido de expresión de eucariotas tal como se utiliza mediante el sistema de expresión de genes GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clones se puede introducir en células huésped eucariotas tales como células CHO, células NS/O, células HEK293T o células HEK293 o alternativamente otras células eucariotas como células derivadas de plantas, células de hongos o levaduras. El método utilizado para introducir estos genes pueden ser los métodos descritos en la técnica tal como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de la introducción de estos genes de anticuerpos en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo se pueden identificar y seleccionar. Estás células representan los transíectomas los cuales se pueden amplificar a su nivel de expresión y escalarse ascendentemente para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes se pueden aislar y purificarse a partir de estos sobrenadantes de cultivo y/o células.

Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados se pueden expresar en otros sistemas de expresión, incluyendo células procariotas tales como microorganismos, por ejemplo E. coli. Además, los anticuerpos se pueden producir en animales no humanos transgénicos, tales como en la leche de ovejas y conejos o en huevos de gallinas, o en plantas transgénicas, ver por ejemplo Verma, R., et al., (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al., (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; y Fischer, R. , et al., (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Los anticuerpos monoclonales murinos se pueden utilizar como anticuerpos terapéuticos en humanos cuando se etiquetan con toxinas o isótopos radioactivos. Los anticuerpos murinos no etiquetados son altamente inmunógenos en el hombre cuando se aplican repetidamente llevando a la reducción del efecto terapéutico. La principal inmunogenicidad es mediada por las regiones constantes de cadena pesada. La inmunogenicidad de anticuerpos murinos en el hombre se puede reducir o evitar completamente si los respectivos anticuerpos son quimerizados o humanizados. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos, las diferentes porciones de los cuales se derivan de diferentes especies animales, tales como aquéllos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se logra mediante la unión de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de anticuerpos murinos con la región constante de .cadena pesada y ligera humana (por ejemplo como se describe por Kraus et al., en la serie Methods in Molecular Biology, Recombinant antibodies for cáncer therapy ISBN-0-89603-918-8) . En una modalidad preferida, los anticuerpos son generados uniendo la región constante de cadena ligera kappa humana a la región variable de cadena ligera de murino. En una modalidad también preferida, los anticuerpos quiméricos se pueden generar uniendo la región constante de cadena ligera lambda humana a la región variable de cadena ligera murina. Las regiones constantes de cadena ligera preferida para la generación de anticuerpos quiméricos son IgGl, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de cadena pesada preferidas para la generación de anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.

Los anticuerpos interactúan con antigenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácidos que están ubicados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos presentes de manera natural específicos construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo presente de manera natural, específicos, injertados en secuencias de armazón de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (ver, por ejemplo Riechmanñ, L. et al., (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al., (1986) Nature 321: 522-525; y Queen, C. et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Tales secuencias de armazón se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de línea germinal. Estas secuencias de línea germinal diferirán de secuencias de genes de anticuerpos maduros debido a que las mismas no incluirán genes variables completamente ensamblados, los cuales se forman mediante unión V (D) J durante la maduración de las células B. Las secuencias de genes de línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo del repertorio secundario de alta afinidad en posiciones individuales uniformemente a través de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la porción amino terminal de la región 1 de armazón y en la porción carboxi-terminal de la región 4 de armazón. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia de ADN entera de un anticuerpo particular a fin de recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (ver WO 99/45962) . Las secuencias de cadena pesada y ligera parcial que abarca las regiones CDR típicamente son suficientes para este propósito. La secuencia parcial se utiliza para determinar cuál segmento de gen de unión y variable de línea germinal contribuyó a los genes variables de anticuerpos recombinados. La secuencia de línea germinal se utiliza entonces para rellenar las porciones faltantes de las regiones variables. Las secuencias líderes de cadena pesada y ligera son escindidas durante la maduración de las proteínas y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para agregar secuencias faltantes, las secuencias de ADNc clonadas se pueden combinar con oligonucleótidos sintéticos mediante la ligación o amplificación PCR. Alternativamente, la región variable entera se puede sintetizar como un conjunto de oligonucleótidos traslapados, cortos, y combinarse mediante amplificación PCR para crear un clon de región variable completamente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas tales como la eliminación o inclusión de sitios de restricción particulares, u optimización de codones particulares.

Las secuencias de nucleótidos de transcriptos de cadena pesada y ligera de hibridomas se utilizan para designar un conjunto de traslape de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticos como las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: series de bases de nucleótidos repetidos se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y amplificación PCR; sitios de inicio de traducción óptimos se incorporan de acuerdo a las regles de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); y sitios HindIII se diseñan genéticamente corriente arriba de los sitios de inicio de traducción.

Para tanto las regiones variables de cadena pesada y ligera, las secuencias de hebra optimizadas y correspondientemente no codificantes se desintegran en 30-50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del correspondiente oligonucleótido no codificante. Por consiguiente, para cada cadena, los oligonucleótidos se pueden ensamblar en conjuntos de hebras dobles traslapados que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. Las acumulaciones se pueden utilizar entonces como plantillas para producir productos de amplificación PCR de 150-400 nucleótidos. Típicamente, un solo conjunto de oligonucleótidos de región variable se desintegrarán en dos recolecciones los cuales se amplifican separadamente para generar dos productos PCR traslapados. Estos productos traslapados se combinan entonces mediante amplificación PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento traslapado de la región constante de cadena pesada o ligera en la amplificación PCR para generar fragmentos que se puedan clonar fácilmente en los constructos del vector de expresión.

Las regiones variables de cadena pesada y ligera quimerizadas y pesadas reconstruidas se combinan entonces con el promotor clonado, líder, inicio de traducción, región constante, 3' no traducida, poliadenilación, y secuencias de terminación de transcripción para formar constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera se pueden combinar en un solo véctor, co-transfectado, transfectado en serie, o transfectado por separado en células huésped las cuales se fusionan entonces para formar una célula huésped que exprese ambas cadenas. Se describen los plásmidos para usarse en la construcción de vectores de expresión para IgGx humana. Los plásmidos se pueden construir de modo que las secuencias de ADNc de cadena ligera kappa V y pesada V amplificada con PCR se puedan utilizar para reconstruir minigenes de cadena pesada y ligera completos. Estos plásmidos se pueden utilizar para expresar anticuerpos Kappa IgGl, Kappa o IgG4, IgGl quiméricos o completamente humanos. Los plásmidos similares se pueden construir para la expresión de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.

Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, los aspectos estructurales de los anticuerpos anti-CDLN6 descritos en la presente, se utilizan para crear anticuerpos anti- CDLN6 humanizados estructuralmente relacionados que mantienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como su unión a la CDLN6. Más específicamente, una o más regiones CDR de anticuerpos monoclonales de ratón se pueden combinar recombinantemente con regiones de armazón humanas conocidas y CDRS para crear anticuerpos anti-CLDN6 humanizados, creados genéticamente de manera recombinante, adicionales.

La capacidad de un anticuerpo de unir la CDLN6 se puede determinar utilizando ensayos de unión estándar, tales como los establecidos en los ejemplos (por ejemplo, ELISA, Transferencia Western, Inmunofluorescencia y análisis citométrico de flujo) .

El término "epítope" se refiere a un determinante antigénico en una molécula, es decir, a la parte en una molécula que es reconocida por el sistema inmune, por ejemplo, que es reconocido por un anticuerpo. Por ejemplo, los epitopes son los sitios tridimensionales discretos en un antigeno, los cuales son reconocidos por el sistema inmune. En el contexto de la presente invención, el epitope preferiblemente se deriva de una proteina CLDN . Los epitopes usualmente consisten de agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Los epitopes conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros pero no en los últimos se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes. Un epitope de una proteína tal como un CLDN preferiblemente comprende una porción continua o discontinua de dicha proteína y preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epitope puede preferiblemente ser de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 aminoácidos de longitud .

El término "epitope discontinuo" que se utiliza en la presente, significa un epitope conformacional en un antigeno de proteina el cual está formado de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteina.

De acuerdo a la invención, el término "unión" preferiblemente se refiere a una unión especifica. "Unión especifica" significa que un agente tal como un anticuerpo se une más fuertemente a un objetivo tal como un epitope para el cual el mismo es especifico en comparación con la unión a otro objetivo. Un agente se une más fuertemente a un primer objetivo en comparación con un segundo objetivo si el mismo se une al primer objetivo con una constante de disociación (KD) el cual es más bajo que la constante de disociación para el segundo objetivo. Preferiblemente la constante de disociación (KD) para el objetivo al cual el agente se une específicamente es más de 102 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces, 108 veces, 109 veces, 1010 veces, más baja que la constante de disociación (KD) para el objetivo al cual el agente no se une específicamente.

El término "ácido nucleico", que se utiliza en la presente, se pretende que incluya ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) . Los ácidos nucleicos comprenden de acuerdo a la invención ADN genómico, ADNc, ARNm, que produce recombinantemente y sintetiza químicamente las moléculas. De acuerdo a la invención, un ácido nucleico puede estar presente como una molécula covalentemente cerrada de manera circular o lineal y de una sola hebra o doble hebra.

Los ácidos nucleicos descritos de acuerdo a la invención preferiblemente han sido aislados. El término "ácido nucleico aislado" significa de acuerdo a la invención que el ácido nucleico se (i) amplificó in vitro, por ejemplo mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR), (ii) se produjo recombinantemente mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo mediante escisión y fraccionamiento electroforético de gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo mediante síntesis química. Un¦ ácido nucleico aislado es un ácido nucleico el cual está disponible para su manipulación mediante técnicas de ADN recombinantes.

Los ácidos nucleicos, de acuerdo a la invención, pueden presentarse solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, los cuales pueden ser homólogos o heterólogos. En modalidades preferidas, un ácido nucleico se enlaza de manera funcional a secuencias de control de expresión las cuales pueden ser homologas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico en donde el término "homólogo" significa que el ácido nucleico también se enlaza funcionalmente a la secuencia de control de expresión naturalmente y el término "heterólogo" significa que el ácido nucleico no se enlaza funcionalmente a la secuencia de control de expresión de manera natural.

Un ácido nucleico, tal como un ARN que expresa ácido nucleico y/o proteina o péptido, y una secuencia de control de expresión se enlazan "funcionalmente" entre si, si los mismos se enlazan covalentemente entre si de modo tal que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico esté bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de expresión. Si el ácido nucleico va a traducirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de expresión funcionalmente enlazada a una secuencia de codificación, inducción de dicha secuencia de control de expresión da como resultado la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un desfase del marco de lectura en la secuencia de codificación o dicha secuencia codificante no es capaz de traducirse en la proteina o péptido deseado.

El término "secuencia de control de expresión" o "elemento de control de expresión" comprende de acuerdo a la invención promotores, sitios de unión del ribosoma, mejoradores y otros elementos de control los cuales regulan la transcripción de un gen o traducción de un ARNm. En modalidades particulares de la invención, las secuencias de control de expresión se pueden regular. La estructura exacta de las secuencias de control de expresión puede variar como una función de las especies o tipo celular, aunque generalmente comprende secuencias 5'- y 3' -no traducidas y 5' -no trascritas las cuales están involucradas en el inicio de transcripción y traducción, respectivamente, tal como caja TATA, secuencia de cubierta, secuencia CAAT, y similares. Más específicamente, las secuencias de control de expresión 5' -no transcritas comprenden una región promotora la cual incluye una secuencia promotora para el control de transcripción del ácido nucleico funcionalmente enlazado. Las secuencias de control de expresión también pueden comprender secuencias mej oradoras o secuencias activadoras corriente arriba.

De acuerdo a la invención el término "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico la cual se ubica corriente arriba (5' ) a la secuencia de ácido nucleico que se expresa y controla la expresión de la secuencia proporcionando un sitio de reconocimiento y unión para la polimerasa del ARN. La "región promotora" puede incluir sitios de reconocimiento y unión adicionales para factores adicionales los cuales están involucrados en la regulación de transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariota o eucariota. Además, un promotor puede ser "inducible" y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor o puede ser "constitutivo" si la transcripción no es controlada por un agente inductor. Un gen el cual está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o solamente se expresa en un menor grado si está ausente un agente inductor. En la presencia del agente inductor el gen se intercala en o el nivel de transcripción se incrementa. Esto es mediado, en general, mediante la unión de un factor de transcripción especifico.

Los promotores que se prefieren de acuerdo a la invención incluyen promotores para la polimerasa SP6, T3 y T7, promotor de ARN U6 humano, promotor CMV, y promotores híbridos artificiales de los mismos (por ejemplo CMV) donde una parte o partes se fusionan a una parte o partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como por ejemplo GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) , e incluyen o no incluyen (un) intrón(es) adicional (es ) .

De acuerdo a la invención, el término "expresión" se utiliza en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteina/péptido. Él mismo también comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede llevarse a cabo temporal o establemente. De acuerdo a la invención, el término expresión también incluye una "expresión aberrante" o "expresión anormal" .

"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significan de acuerdo a la invención que la expresión sea alterada, preferiblemente incrementada, comparada' con una referencia, preferiblemente comparada con el estado en una célula normal no tumorigénica o un individuo saludable. Un incremento en la expresión se refiere a un incremento de al menos 10%, en particular al menos 20%, al menos 50%, al menos 100%, al menos 200%, al menos 500%, al menos 1000%, a menos 10000% o incluso más. En una modalidad, la expresión solmene se encuentra en un tejido enfermo, mientras la expresión en un tejido saludable se reprime.

En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la invención presente en un vector, cuando sea apropiado con un promotor, el cual controla la expresión del ácido nucleico. El término "vector" se utiliza aquí en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico permite introducir dicho nucleico, por ejemplo, en células procariotas y/o eucariotas y, cuando sea apropiado, integrarse en un genoma. Los vectores de este tipo preferiblemente se replican y/o expresan en las células. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales. El término "plásmido" que se utiliza en la presente se refiere a un constructo de material genético extracromosómico, usualmente un dúplex de ADN circular, el cual se puede replicar independientemente del ADN cromosómico .

Cuando el vector para la expresión de un anticuerpo, ya sea de un tipo vector en el cual la cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos están presentes en diferentes vectores o un tipo de vector en el cual la cadena pesada y cadena ligera están presentes en el mismo vector se puede utilizar.

La enseñanza dada en la presente con respecto a secuencias de aminoácidos y de acido nucleico especificas, por ejemplo aquéllas mostradas en el listado de secuencias, se interpretara que también se refiere a modificaciones de dichas secuencias especificas resultantes de la secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias, por ejemplo las secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicos y secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácido nucleico especificas.

De manera similar, la enseñanza dada en la presente con respecto a anticuerpos específicos o hibridomas que producen anticuerpos específicos se interpretara que también se refiere a anticuerpos caracterizados por una secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico la cual está modificada en comparación con la secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácido nucleico de los anticuerpos específicos aunque sean funcionalmente equivalentes. Una propiedad importante es conservar la unión de un anticuerpo a su objetivo o sustentar las funciones efectoras de un anticuerpo. Preferiblemente, una secuencia modificada con respecto a una secuencia especifica, cuando la misma remplaza la secuencia especifica en un anticuerpo mantiene la unión de dicho anticuerpo al objetivo y preferiblemente las funciones de dicho anticuerpo como se describe en la presente, por ejemplo lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC.

Se apreciará por dichos expertos en la técnica que en particular las secuencias de la CDR, regiones hiper-variables y variables se pueden modificar sin perder la capacidad de unirse a un objetivo. Por ejemplo, las regiones CDR serán ya sea idénticas o altamente homologas a las regiones de anticuerpos especificados en la presente. Mediante "altamente homólogo" se contempla que de 1 a 5, preferiblemente pueden hacerse de 1 a 4, tal como 1 a 3 ó 1 ó 2 sustituciones en las CDRs. Además, las regiones hiper-variables y variables pueden modificarse de modo que los mismos muestren homología sustancial con las regiones de anticuerpos específicamente descritos en la presente.

Se entenderá que los ácidos nucleicos específicos descritos en la presente incluyen ácidos nucleicos modificados a causa de optimizar el uso de codones en una célula u organismo huésped. Las diferencias en el uso de codones entre organismos pueden llevar a una variedad de problemas concernientes a la expresión de genes heteróloga. La optimización de codones cambiando uno o más nucleotidos de la secuencia original puede dar como resultado una optimización de la expresión de un ácido nucleico, en particular en la optimización de la eficacia de traducción, en un huésped homólogo o heterólogo en el cual dicho ácido nucleico se va a expresar. Por ejemplo, si los ácidos nucleicos derivados de regiones constantes de codificación y humanas y/o regiones de armazón de anticuerpos que se van a utilizar de acuerdo a la presente invención, por ejemplo para preparar anticuerpos quiméricos o humanizados, puede preferirse modificar dichos ácidos nucleicos por el bien de la optimización del uso de codones, en particular si dichos ácidos nucleicos, opcionalmente fusionados a ácidos nucleicos heterólogos tales como los ácidos nucleicos derivados de otros organismos que se describen en la presente, se van a expresar en células de un organismo diferente al humano tal como de ratón o hámster. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas se pueden modificar para incluir uno o más, preferiblemente, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 y preferiblemente hasta 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 ó 100 ó más remplazos de nucleótidos que resultan de un uso de codones optimizado. Tales remplazos preferiblemente se refieren a remplazos de nucleótidos que no resultan de un cambio en la secuencia de aminoácidos codificados o se refieren a los correspondientes remplazos en las correspondientes posiciones en otras secuencias de ácido nucleico que codifican regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas, respectivamente .

Preferiblemente el grado de identidad entre una secuencia de ácido nucleico especifica y una secuencia de ácido nucleico la cual se modifica con respecto a o la cual es una variante de dicha secuencia de ácido nucleico especifica será al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90% o más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%. Con respecto a las variantes de ácido nucleico de CLDN6, el grado de identidad preferiblemente se da a una región de al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 550, al menos aproximadamente 600 ó al menos aproximadamente 630 nucleótidos. En las modalidades preferidas, el grado de identidad se da para la longitud entera de la secuencia de ácido nucleico de referencia, tal como las secuencias de ácido nucleico dadas en el listado de secuencias. Preferiblemente, las dos secuencias son capaces de hibridarse y formar un dúplex estable entre si, con hibridación preferiblemente se lleva a cabo bajo condiciones las cuales permiten la hibridación especifica entre polinucleótidos (condiciones rigurosas) . Las condiciones rigurosas se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York y se refieren, por ejemplo, a hibridación a 65°C en amortiguador de hibridación (3.5 x SSC, 0.02% de Ficoll, 0.02% de polivinilpirrolidona, 0.02% de albúmina de suero bovino, NaH2P04 2.5 mM (pH 7), 0.5% de SDS, EDTA 2 mM) . La SSC es cloruro de sodio 0.15 M/citrato de sodio 0.15 M, pH 7. Después de la hibridación, la membrana a la cual el ADN se ha transferido se lava, por ejemplo, en SSC 2x a temperatura ambiente y luego en 0.1-0.5 x SSC/0.1 x SDS a temperaturas de hasta 68°C.

El término "variante" con respecto a, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico, de acuerdo a la invención incluye cualquier variante, en particular, mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquéllas que están presentes de manera natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, la significancia de la cual frecuentemente es poco clara. La secuenciación de genes completa frecuentemente identifica numerosas variantes alélicas para un gen dado. Una especie homologa es una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos con una especie diferente de origen de la de una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos.

Con respecto a moléculas de ácido nucleico, el término "variante" incluye secuencias de ácidos nucleicos degenerados, en donde un ácido nucleico degenerado de acuerdo a la invención es un ácido nucleico que diferente de un ácido nucleico de referencia en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético.

Además, una "variante" de una secuencia de ácido nucleico especifica de acuerdo a la invención incluye secuencias de ácido nucleico que comprenden únicas o múltiples tales como al menos 2, al menos 4, o al menos 6 y preferiblemente hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 10, hasta 15, o hasta 20 sustituciones, eliminaciones y/o adicionales de nucleótidos.

Para los propósitos de la presente invención, "variantes" de una secuencia de aminoácido comprende variantes de inserción de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

En el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, uno o más residuos de aminoácidos se insertan en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible la inserción aleatoria con selección apropiada del producto resultante.

Las variantes de eliminación de aminoácidos se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de la secuencia .

Las variantes de sustitución de aminoácidos son caracterizadas por al menos un residuo en la secuencia que se remueve y otro residuo que se inserta en su lugar. Se da preferencia a las modificaciones que están en posiciones en la secuencia de aminoácidos las cuales no se conservan entre proteínas o péptidos homólogos y/o para remplazar aminoácidos con otros que tienen propiedades similares.

Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en variantes de proteína son cambios de aminoácidos conservativos, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados de manera similar o no cargados.

Preferiblemente el grado de similitud, preferiblemente la identidad entre una secuencia de aminoácidos especifica y una secuencia de aminoácidos la cual se modifica con respecto a o la cual es una variante de dicha secuencia de aminoácidos específicos tales como entre secuencias de aminoácidos que muestran homología sustancial será al menos de 70%, preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90% o más preferiblemente de al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%. Con respecto a las variantes del polipéptido CLDN6, el grado de similitud o identidad se da preferiblemente a una región de al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 210 aminoácidos. En modalidades preferidas, el grado de similitud o identidad se da para la longitud entera de la secuencia de aminoácidos de referencia tal como las secuencias de aminoácidos dadas en el listado de secuencias.

La "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son ya sea idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservativas. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos indica el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "porcentaje de identidad" se pretende que denote un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos los cuales son idénticos entre las dos secuencias a compararse, obtenidos después de la mejor alineación, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias que se distribuyen aleatoriamente y sobre su longitud completa. Las comparaciones de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente comparando estas secuencias después de haber alineado las mismas óptimamente, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" a fin de identificar y comparar regiones locales o similitud de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para comparación puede producirse manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nati Acad. Sci. USA 85, 2444, o por medio de programas informáticos los cuales utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias se comparan, dividiendo este número en el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 a fin de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias .

Pueden hacerse "sustituciones conservativas", por ejemplo, en base a la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo: (a) los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; (b) aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina, y glutamina; (c) aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y (d) aminoácidos negativamente cargados (acidicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones típicamente pueden hacerse dentro de los grupos (a) -(d). Además, la glicina y prolina sustituirse por otra en base a su capacidad de alterar las hélices a. Algunas sustituciones preferidas pueden hacerse entre los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G; y (iii) A, V, L e í. dado el código genético conocido, y las técnicas de ADN sintético y recombinante, el científico experto fácilmente puede construir ADNs que codifiquen las variantes de aminoácidos conservativos.

La invención incluye derivados de las secuencias de ácido nucleico, secuencias de aminoácidos, péptidos o proteínas, en particular los anticuerpos, descritos en la presente .

El término "derivado" comprende cualquier derivación química de un ácido nucleico en una base de nucleótidos, en el azúcar o el fosfato. El término "derivado" también comprende ácidos nucleicos los cuales contienen nucleótidos y análogos de nucleótidos no presentes de manera natural. Preferiblemente, una derivación de un ácido nucleico incrementa su estabilidad.

De acuerdo a la invención, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación y comprende sustituciones, eliminaciones y/o adiciones únicas o múltiples de cualquier molécula asociada con la proteína o péptido, tal como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. El término "derivado" también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferiblemente, un péptido modificado tiene estabilidad incrementada y/o inmunogenicidad incrementada .

De acuerdo a la invención, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de ácido nucleico, secuencia de aminoácido, péptido o proteina preferiblemente tiene una propiedad funcional de la secuencia de ácido nucleico, secuencia de aminoácido, péptido o proteina, respectivamente, de la cual se ha derivado. Tales propiedades funcionales comprenden la interacción con péptidos o proteínas tales como anticuerpos u objetivos para anticuerpos, en particular la CLDN6, la unión selectiva de ácidos nucleicos y una actividad enzimática. En una modalidad, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de ácido nucleico, secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de ácido nucleico, secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la cual el mismo se ha derivado. En una modalidad, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica .

De acuerdo a la invención una célula preferiblemente es una célula intacta, es decir una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, orgánulos, o material genético. Una célula intacta preferiblemente es una célula viable, es decir una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas. Preferiblemente, una célula es una célula no humana.

Una "célula" puede ser una "célula huésped" la cual, cuando se utiliza en la presente, se pretende que se refiera a una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico recombinante .

Los términos "animal transgénico" se refiere a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferiblemente transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y el cual preferiblemente es capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de cadena ligera humana y ya sea un transgen de cadena pesada humana o transcromosoma de cadena pesada humana, de modo tal que el ratón produzca anticuerpos anti-CLDN6 humana cuando se inmunizan con antigeno de CLDN6 y/o células que expresan CLDN6. El transgen de cadena pesada humana se puede integrar en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para los ratones transgénicos, por ejemplo, ratones HuMAb, tal como ratones HCo7 ó HCol2, o el transgen de cadena pesada humana se puede mantener extracromosómicamente, como es el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describe en O 02/43478. Tal ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales a CLDN6 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) sometiéndolos a recombinación V-D-J e intercalación de isotipos .

De acuerdo a la invención, el término "porción efectora terapéutica" significa cualquier molécula la cual pueda ejercer un efecto terapéutico. De acuerdo a la invención, una molécula efectora terapéutica preferiblemente se guia de manera selectiva a una célula la cual expresa la CLDN6 e incluye agentes anticancerigenos , radioisótopos, toxinas, fármacos citostáticos o citoliticos, etc. Los agentes anticancerigenos comprenden, por ejemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfán, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubina, doxorubicina, taxol, etopósido, fluorouracilo, interferón- , lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, HC1 de procarbazina, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina. Otros agentes anticancerigenos se describen, por ejemplo, en Goodman y Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., en particular el Capitulo 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi y Bruce A. Chabner) . Las toxinas pueden ser proteínas tales como la proteína antiviral de hierba carmín, toxina de cólera, toxina de tosferina, ricina, gelonina, abrina, exotoxina difteria o exotoxina de Pseudomonas . Los residuos de toxina también pueden ser radionúclidos emisores de alta energía tales como cobalto 60.

Cuando se utiliza en la presente "reducir" o "inhibir" significa la capacidad de causar una disminución total, preferiblemente de 5% o mayor, 10% o mayor, 20% o mayor, más preferiblemente de 50% o mayor, y más preferiblemente de 75% o mayor, en el nivel, por ejemplo en el nivel de proliferación de células. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir una reducción a cero o esencialmente a cero.

Los términos tales como "incrementar" o "mejorar" preferiblemente se refiere a un incremento o mejora de aproximadamente al menos 10%, preferiblemente de al menos 20%, preferiblemente de al menos 30%, más preferiblemente de al menos 40%, más preferiblemente de al menos 50%, incluso más preferiblemente de al menos 80%, y más preferiblemente de al menos 100%.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce las mismas o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo del efecto inmunológico tal como la inducción de una respuesta inmune humoral y/o celular, la resistencia y/o duración de la reacción inmune inducida, o la especificidad de la reacción inmune inducida. En el contexto de la presente invención, el término "inmunológicamente equivalente" preferiblemente se utiliza con respecto a los efectos inmunológicos o propiedades de un péptido o variante de péptido utilizadas para inmunización o un anticuerpo. Una propiedad inmunologica particular es la capacidad de unirse a anticuerpos y, cuando es apropiado, generan una respuesta inmune, preferiblemente estimulando la generación de anticuerpos. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos al exponerse al sistema inmune de un sujeto induce una reacción inmune, preferiblemente anticuerpos, que tienen una especificidad de reacción con la secuencia de aminoácidos de referencia, tal como la secuencia de aminoácidos de referencia que forma parte de la CLCN6.

El término "funciones efectoras inmunes" en el contexto de la presente incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmune que da como resultado la inhibición de crecimiento tumoral y/o inhibición de desarrollo tumoral, incluyendo la inhibición de la diseminación tumoral y metástasis. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes da como resultado la eliminación de células tumorales. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por anticuerpos. Tales funciones comprenden la citotoxicidad dependiente complementaria (CDC) , citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) , inducción de apoptosis en las células que portan el antigeno asociado con tumores, por ejemplo CLDN6, por ejemplo, mediante la unión del anticuerpo a un antigeno de superficie, y/o inhibición de la proliferación de las células que portan el antigeno asociado con tumores, preferiblemente ADCC y/o CDC. Por consiguiente, los anticuerpos que son capaces de mediar una o más funciones efectoras inmunes preferiblemente son capaces de medir la eliminación de células induciendo la lisis mediada por CDC, lisis mediada por ADCC, apoptosis, adhesión homotipica, y/o fagocitosis, preferiblemente induciendo la lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC. Los anticuerpos también pueden ejercer un efecto simplemente uniéndose a antigenos asociados con tumores en la superficie de una célula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos pueden bloquear la función del antigeno asociado con tumores o inducir la apoptosis justo al unirse al antigeno asociado con tumores en la superficie de una célula tumoral.

Los anticuerpos, composiciones y métodos descritos en la presente se pueden utilizar para tratar un sujeto con un padecimiento tumoral, por ejemplo, un padecimiento caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan CLDN6. Los ejemplos de padecimientos tumorales los cuales se pueden tratar y/o prevenir abarca todos los cánceres que expresan la CLDN6 y entidades tumorales que incluyen aquéllas descritas en la presente.

Los anticuerpos, composiciones y métodos descritos en la presente también se pueden utilizar para inmunización o vacunación para prevenir un padecimiento descrito en la presente .

De acuerdo a la invención, el término "padecimiento" se refiere a cualquier estado patológico, incluyendo el cáncer, en particular aquellas formas de cáncer descritas en la presente.

"Padecimientos que involucran células que expresan la CLDN6" significa de acuerdo a la invención que la expresión de la CLDN6 en células de un tejido u órgano enfermo preferiblemente se incrementa en comparación con el estado en un tejido u órgano saludable. Un incremento se refiere a un incremento de al menos 10%, en particular al menos 20%, al menos 50%, al menos 100%, al menos 200%, al menos 500%, al menos 1000%, al menos 10000%) o incluso más. En una modalidad, la expresión solamente se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime. De acuerdo a la invención, los padecimientos que involucran o que están asociados con células que expresan la CLDN6 incluyen padecimientos tumorales tales como padecimientos por cáncer. Además, de acuerdo a la invención, los padecimientos tumorales tales como padecimientos por cáncer, preferiblemente son aquéllos en donde las células tumorales o células cancerígenas expresan la CLDN6.

De acuerdo a la invención, el término "tumor" o "padecimiento tumoral" se refiere a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales) . Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece a una rápida proliferación celular incontrolada y continua creciendo después de los estímulos que iniciaron el nuevo cese de crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y usualmente forman una masa distinta de tejido, la cual puede ser ya sea benigna, pre^maligna o maligna.

Un tumor benigno es un tumor que carece de tres de las propiedades malignas de un cáncer. Por consiguiente, por definido, un tumor benigno no crece de una manera agresiva e ilimitada, no invade tejidos circundantes, y no se esparce a tejidos no adyacentes (convierte en metástasis) . Los ejemplos comunes de tumores benignos incluyen lunares y fibromas del útero .

El término "benigno" implica un padecimiento leve y no progresivo, y de hecho, muchos tipos de tumores benignos son inofensivos para la salud. Sin embargo, algunos neoplasmas que se definen como "tumores benignos" debidos a que los mismos carecen de las propiedades invasivas de un cáncer, todavía pueden producir efectos de salud negativos. Los ejemplos de esto incluyen tumores los cuales producen un "efecto masa" (compresión de órganos vitales tales como vasos sanguíneos), o tumores "funcionales" de tejidos endocrinos, los cuales pueden sobreproducir ciertas hormonas (los ejemplos incluyen adenomas de tiroides, adenomas adrenocorticales, y adenomas pituitarios) .

Los tumores benignos típicamente están rodeados por una superficie externa que inhibe su capacidad de comportarse de una manera maligna. En algunos casos, ciertos tumores "benignos" pueden por último dar origen a canceres malignos, los cuales dan como resultado cambios genéticos adicionales en una subpoblación de las células neoplásicas de los tumores. Un ejemplo prominente de este fenómeno es el adenoma tubular, un tipo común de pólipo de colon el cual es un precursor importante del cáncer de colon. Las células en adenomas tubulares, como la mayoría de tumores los cuales frecuentemente progresan a cáncer, muestran ciertas anormalidades de maduración y apariencia celular colectivamente conocidas como displasia. Estas anormalidades celulares no se ven en tumores benignos que rara vez o nunca se vuelven cancerosos, aunque se ven en otras anormalidades de tejido pre-cancerosas las cuales no forman masas discretas, tales como lesiones pre-cancerosas del cérvix uterino. Algunas autoridades prefieren referirse a tumores displásticos tales como "pre-malignos", y reservan el término "benigno" para tumores los cuales rara vez o nunca dan origen a cáncer.

El neoplasma una masa anormal de tejido como resultado de la neoplasia. La neoplasia (nuevo crecimiento en griego) es la proliferación anormal de células. El crecimiento de las células excede, y no se coordina con el de los tejidos normales alrededor de las mismas. El crecimiento persiste de la misma manera excesiva incluso después del cese de los estímulos. Esto usualmente causa una protuberancia o tumor. Los neoplasmas pueden ser benignos, pre-malignos o malignos .

El "crecimiento de un tumor" o "crecimiento tumoral" de acuerdo a la invención se refiere a la tendencia de un tumor de incrementar su tamaño y/o a la tendencia de proliferar de las células tumorales.

Preferiblemente, un "padecimiento tumoral" de acuerdo a la invención es un padecimiento por cáncer, es decir un padecimiento maligno, y una célula tumoral es una célula cancerígena. Preferiblemente, un "padecimiento tumoral" es caracterizado por células que expresan CLDN6 y una célula tumoral que expresa la CLDN6.

El cáncer (término médico: neoplasma maligno) es una clase de padecimientos en los cuales un grupo de células exhiben crecimiento descontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión en y destrucción de tejidos adyacentes), y algunas veces metástasis (esparcida a otras ubicaciones en el cuerpo a través de las linfas o sangre) . Estas tres propiedades malignas de cánceres se diferencian los mismos de tumores benignos, los cuales se auto-limitan, y no invaden o se convierten en metástasis. La mayoría de cánceres forman un tumor aunque algunos, como la leucemia, no.

Una célula que expresa la CLDN6 es una célula tumoral o célula cancerígena, preferiblemente de los tumores y cánceres descritos en la presente. Preferiblemente, tal célula es una célula diferente a una célula placentaria.

Los cánceres se clasifican por el tipo de célula que se asemeja al tumor, y por lo tanto, se asume que el tejido es el origen del tumor. Estos son la histología y la ubicación, respectivamente.

El término "cáncer" de acuerdo a la invención comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer adrenal, cáncer de tiroides, leucemia, cáncer de piel, cáncer del cerebro, cáncer cervical, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglios linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT) , cáncer de seno, cáncer de próstata, cáncer del útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos. Los ejemplos de los mismos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales, o metástasis de los tipos de cáncer o los tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo a la invención también comprende metástasis de cáncer.

Los padecimientos tumorales o canceres preferidos de acuerdo a la invención se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , en particular carcinoma y adenocarcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer gástrico, cáncer de seno, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomorfo maligno, sarcoma, en particular sarcoma y carcinosarcoma sinovial, cáncer del conducto biliar, cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñon, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, incluyendo cáncer del íleon, en particular adenocarcinoma del intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, y cáncer uterino, y formas metastásicas de los mismos.

Los padecimientos tumorales o cánceres particularmente preferidos de acuerdo a la invención se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de ovario metastásico y cáncer de pulmón metastásico. Preferiblemente, el cáncer de ovario es un carcinoma de ovario o un adenocarcinoma de ovario. Preferiblemente, el cáncer de pulmón es un carcinoma o un adenocarcinoma, y preferiblemente es cáncer bronquiolar tal como un carcinoma bronquiolar o adenocarcinoma bronquiolar. En una modalidad, la célula tumoral es una célula de tal cáncer. Los cánceres de ovario metastásico incluyen carcinomas de ovario metastásico y adenocarcinomas de ovario metastásico, y los cánceres de pulmón metastásicos incluyen carcinomas de pulmón, adenocarcinomas de pulmón metastásico, carcinomas bronquiolares metastásicos, y adenocarcinomas bronquiolares metastásicos.

Los principales tipos de cáncer de pulmón son carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) . Estos tres principales sub-tipos de los carcinomas de pulmón de células no pequeñas: carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma, y carcinoma de pulmón de células grandes. Los adenocarcinomas explican aproximadamente el 10% de los cánceres de pulmón.

Este cáncer de manera usual se ve periféricamente en los pulmones, contrariamente al cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células escamosas, ambos de los cuales tienden a estar ubicados más centralmente.

El cáncer de piel es un crecimiento maligno en la piel. Los cánceres de piel más comunes son cáncer de células básales, cáncer de células escamosas, y melanoma. El melanoma maligno es un tipo serio de cáncer de piel. El mismo se debe al crecimiento incontrolado de células pigmentarias, llamadas melanocitos .

De acuerdo a la invención, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluyendo las formas comunes de cáncer de seno, próstata, pulmón y colon.

El "carcinoma bronquiolar" es un carcinoma del pulmón, que se cree se deriva de bronquiolos terminales, en los cuales el tejido neoplásico se extiende a lo largo de las paredes alveolares y crece en pequeñas masas dentro de los alvéolos. La mucina se puede demostrar en algunas de las células y en el material en los alvéolos, lo cual también incluye células desnudas.

El "adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido también es parte de una categoría de tejido más grande conocido como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye la piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que reviste las cavidades y órganos del cuerpo. El epitelio se deriva de manera embrionaria del ectodermo, endodermo y mesodermo. Se clasifican como adenocarcinoma, las células que no necesariamente son parte de una glándula, siempre y cuando las mismas tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos mayores, incluyendo los humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a asemejarse al tejido glandular en el que los mismos se derivan de, mientras que pueden no diferenciarse pobremente. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Mientras que cada glándula puede no secretar la misma sustancia, siempre y cuando haya una función exocrina en la célula, la misma se considera glandular y su forma maligna por lo tanto se denomina adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y frecuentemente se convierten en metástasis dado que tienen suficientemente tiempo para hacerlo. El adenocarcinoma ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. El mismo incluye los adenocarcinomas del suero o las mucosas, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma del endometrio.

El "cistadenocarcinoma" es una forma maligna de un tumor del epitelio-estroma de superficie, un tipo de cáncer de ovario.

Los tumores del epitelio-estroma de superficie son una clase de neoplasmas de ovario que se cree se derivan del epitelio de la superficie del ovario (peritoneo modificado) o del tejido del endometrio ectópico o trompa de Falopio (de la trompa) . Este grupo de tumores explican la mayoría de todos los tumores de ovario.

El "coriocarcinoma" es un cáncer maligno, trofoblástico y agresivo, usualmente de la placenta. El mismo se caracteriza por la dispersión hematógena temprana a los pulmones .

El carcinoma de células renales también es conocido como cáncer de células renales o adenocarcinoma de células renales es un cáncer de riñon que se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal, los tubos muy pequeños en el riñon que filtran la sangre y remueven los productos de desecho. El carcinoma de células renales es con mucho el tipo más común de cáncer de riñon en adultos y el más letal de todos los tumores genitourinarios. Los distintos subtipos de carcinoma de células renales son el carcinoma de células renales y células claras y carcinoma de células renales papilares. El carcinoma de células renales y células claras es la forma más común de carcinoma de cáncer renal. Cuando se ven en un microscopio, las células que constituyen el carcinoma de células renales claras parecen muy pálidas o claras. El carcinoma de células renales papilares es él segundo subtipo más común. Estos cánceres forman pocas protuberancias similares a dedos pequeños (llamadas papilas) en algunos, si no es que en la mayoría, de los tumores.

Un sarcoma es un tumor maligno derivado del tejido conectivo, o células mesenquimatosas . Esto es en contraste con los carcinomas, los cuales son de origen epitelial. Un sarcoma sinovial es una forma rara de cáncer la cual usualmente se presenta cerca de las articulaciones del brazo o pierna. El mismo es uno de los sarcomas de los tejidos blandos .

Un tumor de células germinales es un neoplasma derivado de células germinales. Los tumores dé células germinales pueden ser tumores cancerosos o no cancerosos. Las células germinales normalmente están presentes dentro de las gónadas (ovarios y testículos) . Los tumores de células germinales que se originan fuera de las gónadas (por ejemplo en la cabeza, dentro de la boca, cuello, pelvis; en fetos, bebes, y niños pequeños más frecuentemente se encuentran en la línea media del cuerpo, particularmente en la punta del coxis) pueden ser defectos de nacimiento resultantes de errores durante el desarrollo del embrión.

Las dos principales clases de tumores de células terminales son los seminomas y no seminomas, en donde los no-seminomas incluyen: teratocarcinoma, carcinoma embrionario, tumores del saco del vitelo, coriocarcinoma y teratoma diferenciado. La mayoría de líneas celulares de los no-seminomas son equivalentes a carcinomas embrionarios, es decir, los mismos están compuestos casi completamente de células madre las cuales no se diferencia bajo condiciones básicas, aunque algunas responden a inductores de diferenciación tales como el ácido retinoico.

El teratocarcinoma se refiere a un tumor de células germinales que es una mezcla de teratoma con carcinoma embrionario, o con coriocarcinoma, o con ambos. Este tipo de tumor de líneas germinales mezcladas puede ser conocido simplemente como un teratoma con elementos de carcinoma embrionario o coriocarcinoma, o simplemente ignorando el componente de teratoma y remitiéndose solamente a su componente maligno: carcinoma embrionario y/o coriocarcinoma.

El linfoma y leucemia son malignidades derivadas de células hematopoyéticas (formadoras de sangre) .

El tumor blástico o blastoma es un tumor (usualmente maligno) el cual se asemeja a un tejido inmaduro o embrionario. Muchos de estos tumores son más comunes en niños .

Por "metástasis" se entiende la dispersión de células cancerígenas de su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, invasión de la matriz extracelular, penetración de las membranas del basamento endotelial que entran a la cavidad del cuerpo y vasos, y entonces, después se transportan por la sangre, la infiltración de órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir un tumor secundario o tumor metastásico, en el sitio objetivo depende de la angiogénesis . La metástasis tumoral frecuentemente ocurre incluso después de la remoción del tumor primario debido a que las células tumorales o componentes pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo a la invención se refiere a "metástasis distante" lo cual se refiere a una metástasis la cual está lejos del tumor primario y el sistema de ganglios linfáticos regionales.

Las células de un tumor secundario o metastásico son similares a aquéllas en el tumor original. Esto significa, por ejemplo, que, si el cáncer de ovarios se convierte en metástasis, el tumor secundario está compuesto de células de ovario anormales, no de células de hígado anormales. El tumor en el hígado se denomina entonces cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.

En el cáncer de ovario, la metástasis puede presentarse de las siguientes maneras: mediante contacto directo o extensión, la misma puede invadirse cerca del tejido u órganos ubicados cerca o alrededor del ovario, tal como las trompas de Falopio, útero, vejiga, recto, etc.; sembrándose o derramándose en la cavidad abdominal, la cual es la manera más común en la se esparce el cáncer de ovario. Las células cancerígenas rompen la superficie de la masa de los ovarios y "cae" en otras estructuras en el abdomen tal como el hígado, estomago, colon o diafragma; liberándose de la masa de los ovarios, invadiendo los vasos linfáticos y luego viajando a otras áreas del cuerpo u órganos distantes tales como el pulmón o hígado; liberándose de la masa de los ovarios; invadiendo el sistema sanguíneo y viajando a otras áreas del cuerpo u órganos distantes.

De acuerdo a la invención, el cáncer de ovarios metastásico incluye cáncer en las trompas de Falopio, cáncer en órganos del abdomen tal como cáncer en el intestino, cáncer en el útero, cáncer en la vejiga, cáncer en el recto, cáncer en el hígado, cáncer en el estomago, cáncer en el colon, cáncer en el diafragma, cáncer en los pulmones, cáncer en el revestimiento del abdomen o pelvis (peritoneo) , y cáncer en el cerebro. De manera similar, el cáncer de pulmón metastásico se refiere al cáncer que se ha dispersado de los pulmones a sitios distantes y/o varios sitios en el cuerpo e incluye el cáncer en el hígado, cáncer en las glándulas adrenales, cáncer en los huesos, y cáncer en el cerebro.

Una recaída o recurrencia se presenta cuando una persona es afectada de nuevo por una condición que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido un padecimiento tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicho padecimiento y de nuevo desarrolla dicho padecimiento recién desarrollado, puede considerarse como una recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo a la invención, una recaída o recurrencia de un padecimiento tumoral aunque puede no necesariamente estar presente en el sitio del padecimiento tumoral original. Por consiguiente, por ejemplo, si un paciente ha sufrido de tumor en el ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor en el ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones donde un tumor se presenta en un sitio diferente al sitio del tumor original así como en el sitio del tumor original. Preferiblemente, el tumor original para el cual el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

Por "tratar" se entiende administrar un compuesto o composición que se describe en la presente a un sujeto a fin de: prevenir o eliminar un tumor o reducir el tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o retrasar el crecimiento de un tumor en un sujeto; inhibir o retrasar el desarrollo de un nuevo tumor o metástasis tumoral en un sujeto; disminuir la frecuencia o severidad de síntomas y/o recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que previamente ha tenido cáncer; y/o prolongar, es decir incrementar la esperanza de vida del sujeto.

En particular, el término "tratamiento de un padecimiento" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, atrasar o inhibir el avance o empeoramiento, o prevenir y retardar la aparición de un padecimiento o los síntomas de los mismos.

Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, es decir un paciente que es identificado por tener un cambio mayor al normal de desarrollo de un padecimiento tumoral, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido o que actualmente tiene, un padecimiento tumoral, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un riesgo incrementado de desarrollar cáncer, como tal sujeto puede continuar desarrollando cáncer. Los sujetos que actualmente tienen, o que han tenido, un tumor también tienen un riesgo incrementado de metástasis tumorales.

El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que involucra una reacción inmune especifica. En el contexto de la presente invención, los términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo", o "protector" se refiere a la prevención o tratamiento o ambos de la aparición y/o la propagación de un tumor en un individuo y, en particular, para minimizar el cambio que un sujeto desarrollará un tumor o retardar el desarrollo de un tumor. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describe anteriormente, podría ser un candidato de la terapia para prevenir un tumor.

Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de la composición de la invención, preferiblemente protege al receptor del desarrollo del crecimiento tumoral. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de la composición de la invención, puede llevar a la inhibición del avance/crecimiento del tumor. Esto comprende la declaración del avance/crecimiento del tumor, en particular una interrupción del avance del tumor, el cual preferiblemente lleva a la eliminación del tumor.

El término "ir¡ vivo" se refiere a la situación en un sujeto.

Los términos "sujeto", "individual" o "paciente" se utilizan indistintamente y se refieren a vertebrados, preferiblemente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son humanos, primates no humanos, animales domésticos tales como perros, gatos, ovejas, ganado, cabras, cerdos, caballos etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, cobayos, etc., así como animales en cautiverio tales como animales de zoológico. El término "animal" que se utiliza en la presente también incluye humanos. El término "sujeto" también puede incluir un paciente, es decir, un animal, preferiblemente un humano que tiene un padecimiento, preferiblemente un padecimiento asociado con la expresión de CLDN6, preferiblemente un padecimiento tumoral tal como un cáncer.

Como parte de la composición de una inmunización o una vacuna, preferiblemente uno o más agentes que se describen en la presente se administran conjuntamente con uno o más adyacentes para inducir una- respuesta inmune o para incrementar una respuesta inmune. El término "adyuvante" se refiere a compuestos que prolongan o mejoran o aceleran una respuesta inmune. La composición de la presente invención preferiblemente ejerce su efecto sin la adición de adyuvantes. No obstante, la composición de la presente solicitud puede contener cualquier adyuvante conocido. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones de aceite (por ejemplo, adyuvantes de Freund) , compuestos minerales (tales como alumbre) , productos bacterianos (tales como la toxina Bordetella pertussis) , liposomas, y complejos inmuno-estimulantes. Los ejemplos para adyuvantes son monofosforil-lipido-A (MPL SmithKline Beecham) . Saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham) , DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS 18, y QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), adyuvantes de Freund incompletos, adyuvantes de Freund completos, vitamina E, montanid, alumbre, oligonucleótidos CpG (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), y varias emulsiones de agua en aceite las cuales se preparan de aceites biológicamente degradables tales como escualeno y/o tocoferol.

De acuerdo a la invención, una "muestra" puede ser cualquier muestra útil de acuerdo a la presente invención, en particular una muestra biológica tal como una muestra de tejido, incluyendo fluidos corporales, y/o una muestra celular y puede obtener de una manera convencional tal como mediante biopsia de tejidos, incluyendo biopsia por punción, y tomando sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales. De acuerdo a la invención, el término "muestra" también incluye muestras procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo ácido nucleico y aislados de péptido/proteina.

También pueden administrarse otras sustancias las cuales estimulan una respuesta inmune del paciente. Es posible, por ejemplo, utilizar citocinas en una vacuna, debido a sus propiedades reguladoras en linfocitos. Tales citocinas comprenden, por ejemplo, la interleucina-12 (IL-12) la cual mostró incrementar las acciones protectoras de vacunas (Hall (1995) Science 268:1432-1434), GM-CSF e IL-18.

Existe un número de compuestos los cuales mejoran una respuesta inmune y la cual por lo tanto puede utilizarse en una vacuna. Dichos compuestos comprenden co-estimular moléculas provistas en la forma de proteínas o ácidos nucleicos tales como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente) .

Los compuestos terapéuticamente activos de la invención pueden administrarse a través de cualquier ruta convencional, incluyendo inyección o infusión. La administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente ) , intramuscularmente, subcutáneamente o transdérmicamente . Preferiblemente, los anticuerpos se administran terapéuticamente a manera de un aerosol para pulmón.

En una modalidad adicional, los anticuerpos de la invención se pueden formular para prevenir o . reducir su transporte a través de la placenta. Esto se puede hacer mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la PEGilación de los anticuerpos o mediante el uso de fragmentos F(ab)2'. Se pueden hacer referencias además a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; y a "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.

Las composiciones de la invención se administran en cantidades efectivas. Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad la cual logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o conjuntamente con dosis adicionales. En el caso de tratamiento de un padecimiento particular o de una condición particular, la reacción deseada preferiblemente se refiere a la inhibición del transcurso del padecimiento. Esto comprende atrasar el avance del padecimiento y, en particular, interrumpir o revertir el avance del padecimiento. La reacción deseada en un tratamiento de un padecimiento o de una condición también puede ser el retardo de la aparición o una prevención de la aparición de dicho padecimiento o dicha condición.

Una cantidad efectiva de una composición de la invención dependerá de la condición a tratar, la severidad del padecimiento, los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, condición fisiológica, tamaño y peso, la duración de tratamiento, el tipo de una terapia acompañante (si está presente) , la ruta especifica de administración y factores similares. De acuerdo con esto, las dosis de las composiciones de la invención administradas pueden depender de varios de tales parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, pueden utilizarse dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas mediante una diferente ruta de administración más localizada) .

Las composiciones farmacéuticas de la invención preferiblemente son estériles y contienen una cantidad efectiva de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas de la invención generalmente se administran en cantidades farmacéuticamente compatibles y en una preparación farmacéuticamente compatible. El término "farmacéuticamente compatible" se refiere a un material no tóxico el cual no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Las preparaciones de este tipo usualmente pueden contener sales, sustancias amortiguadoras, conservadores, vehículos, sustancias de mej oradora de inmunidad suplementaria tales como adyuvantes, por ejemplo oligonucleótidos CpG, citocinas, quimiocinas, saponina, GM-CSF y/o ARN y, cuando sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos. Cuando se utilizan en medicina, las sales deben ser de ser farmacéuticamente compatibles. Sin embargo, las sales que son no compatibles farmacéuticamente pueden utilizarse para preparar sales farmacéuticamente compatibles y se incluyen en la invención. Las sales farmacológica y farmacéuticamente compatibles de este tipo comprenden de una manera no limitativa aquéllas preparadas de los siguientes ácidos: ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente compatibles también se pueden preparar como sales de metal alcalino o sales de metal alcalinotérreo, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Una composición farmacéutica de la invención puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de una naturaleza sintética o nativa, en la cual el componente activo se combina a fin de facilitar su aplicación. De acuerdo a la invención, el término "portador farmacéuticamente compatible" incluye uno o más agentes de relleno sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias de encapsulación, las cuales son adecuadas para su administración a un paciente. Los componentes de la composición farmacéutica de la invención usualmente son de modo tal que no ocurra una interacción la cual sustancialmente daña la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener sustancias amortiguadoras adecuadas tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas pueden, cuando sea apropiado, también contener conservadores adecuados tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal .

Las composiciones farmacéuticas usualmente se proveen en una forma de dosificación uniforme y puede prepararse de una manera conocida per se. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de cápsulas, tabletas, grageas, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o en la forma de una emulsión, por ejemplo.

Las composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden una preparación acuosa o no acuosa estéril del compuesto activo, el cual preferiblemente es isotónico para la sangre del receptor. Los ejemplos de portadores compatibles y solventes son solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijos, usualmente estériles se utilizan como solución o medio de suspensión.

La presente invención se describe a detalle mediante las figuras y ejemplos posteriores, los cuales se utilizan solamente para propósitos de ilustración y no significa que sean limitantes. Debido a la descripción y los ejemplos, las modalidades adicionales que probablemente se incluyan en la invención son accesibles para el experto.

EJEMPLOS Las técnicas y métodos utilizados aquí se describen en la presente o se llevan a cabo de una manera conocida per se y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Todos los métodos incluyendo el uso de kits y reactivos se llevan a cabo de acuerdo a la información del fabricante a menos que se indique específicamente.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos A. Generación de anticuerpos murinos contra la CLDN6 a. Generación de vectores de expresión que codifican la CLDN6 de longitud completa y fragmentos de CLDN6 Una secuencia de ADN de codones optimizados, no natural (SEC ID NO: 10) que codifica la CLDN6 de longitud completa (SEC ID NO: 2) se preparó mediante síntesis química (GENEART AG, Alemania) y se clonó en el vector pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen, EUA) , produciendo el vector p3953. La inserción de un codón de terminación permitió la expresión de la proteína CLDN6 sin fusionarse a la etiqueta myc-His codificada con el vector. La expresión de la CLDN6 se probó con transferencia Western, citometría de flujo y análisis de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-CLDN6 comercialmente disponibles (ARP, 01-8865; R&D Systems, MAB3656) .

Además, una secuencia de ADN de codones optimizados (SEC ID NO: 11) que codifica el fragmento del dominio extracelular (EC2) putativo de la CLDN6 (SEC ID NO: 5) como una fusión con un péptido de señal derivado de la Ig kappa líder N-terminal seguido por 4 aminoácidos adicionales para asegurar un sitio de escisión de la peptidasa de señal correcta (SEC ID NO: 12) se preparó y clonó en el vector pcDNA3.1 /myc-His que produce el vector p3974. Antes de la inmunización, la expresión del fragmento EC2 se confirmó mediante microscopía por inmunofluorescencia o se transfectan temporalmente y células CH0-K1 fijadas con paraformaldehído (PFA) utilizando un anticuerpo anti-myc comercialmente disponible (Cell Signaling, MAB 2276) . b. Generación de lineas celulares que expresan de manera estable la CLDN6 Las líneas celulares HEK293 y P3X63Ag8U.l que expresan de manera estable la CLDN6 se generaron mediante técnicas estándar utilizando el vector p3953. c. Inmunizaciones MuMAB 5F2D2: Los ratones Balb/c se inmunizaron con 25 µg del ADN del plásmido p3974 junto con 4 µ? de PEI-manosa (PEI- an; jetPEI™-Man in vivo de PolyPlus Transfection) (PEI-Man 150 mM en ¾0 con Glucosa al 5%) mediante inyección intraperitoneal los días 0, 16 y 36. Los días 48 y 62 los ratones se inmunizaron mediante inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.l transfectadas con el vector p3953 para expresar de manera estable la CLDN6. Las células administradas el día 62 se han irradiado con 300 rad antes de la inyección.

MuMAB 27A: Los ratones Balb/c se inmunizaron con inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.l transfectadas con el vector p3953 para expresar de manera estable la CLDN6 el día O y 13. Los ratones que desarrollaron tumores se reforzaron con inyección intraperitoneal con 2 x 107 células HEK293 transfectadas de manera estable con el vector p3953 el día 21. Después de tres días, los ratones se sacrificaron y se prepararon los esplenocitos . 5 x 107 esplenocitos se trasplantaron en otro ratón Balb/c mediante inyección intravenosa. El día 35, 49, y 27 y 104 los ratones trasplantados se inmunizaron con inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.l transfectadas de manera estable con el vector p3953 junto con oligodesoxinucleótidos CpG modificados con fosforotioato purificado con HPLC (PTO-CpG-ODN) (50 pg; 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Alemania) . Antes de la administración, las células se trataron con mitomicina-C (5 g/ml, Sigma-Aldrich, M4287) .

MuMAB 36A: Los ratones C57BL/6 se inmunizaron con 25 g del ADN de plásmido p3974 junto con 4 µ? de PEI-manosa (PEI-Man; jetPEI™-Man in vivo de PolyPlus Transfection) (PEI-Man 150 mM en H20 con Glucosa al 5%) con inyección intraperitoneal los días 0, 16 y 36. Los días 55, 69 y 85 los ratones se inmunizaron con inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.l transfectadas con el vector p3953 para expresar de manera estable la CLDN6. El día 85 las células se administraron junto con PTO-CpG-ODN purificado con HPLC (50 µ? en PBS; 5 ' -TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins G Operon, Alemania) .

La presencia de anticuerpos dirigidos contra CLDN6 en el suero de los ratones se monitoreó mediante microscopía de inmunofluorescencia utilizando células CHO-K1 co-transfectadas con ácidos nucleicos que codifican la CLDN6 y GFP. Para este fin, 24 h después de la transíección, las células fijadas con PFA o no fijadas se incubaron con dilución 1:100 de suero de ratones inmunizados durante 45 min a temperatura ambiente (RT) . Las células se lavaron, incubaron con un anticuerpo Ig anti-ratón etiquetado con Alexa555 (Molecular Probes) y se sometieron a microscopía por fluorescencia .

Para la generación de anticuerpos monoclonales, los ratones con respuestas inmunes anti-CLDN6 detectables se reforzaron cuatro días antes de la esplenectomía con inyección intraperitoneal de 2 x 107 células HEK293 transíectadas establemente con el vector p3953. d. Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales murinos contra la CLDN6 6 x 107 esplenocitos aislados de un ratón inmunizado se fusionaron con 3 x 107 células de la línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) utilizando PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001) . Las células se sembraron aproximadamente a 5 x 104 células por pozo en placas de microtitulación de fondo plano y se cultivaron durante aproximadamente dos semanas en medio selectivo de RPMI que contiene suero de bovino fetal inactivado con calor al 10%, fusión de hibridoma al 1% y suplemento de clonación (HFCS, Roche, CRL 11363735), HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glucosa al 4.5%, 2-mercaptoetanol 0.1 mM, 1 x penicilina/estreptomicina y 1 x suplemento HAT (Invitrogen, CRL 21060) . Después de 10 a 14 dias, los pozos individuales se seleccionar anticuerpos monoclonales anti-CLDN6 mediante citometria de flujo. Los hibridomas de secreción de anticuerpos se subclonaron limitando la dilución y de nuevo analizando los anticuerpos monoclonales anti-CLDN6. Los subclones estables se cultivaron para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para su caracterización. Al menos se seleccionó un clon de cada hibridoma el cual retuvo la reactividad de las células progenitoras (analizadas con citometria de flujo) . Se generaron bancos de células de nueve viales para cada clon y se almacenaron en nitrógeno liquido.

B. Citometria de flujo Para probar la unión de los anticuerpos a la CLDN6 y otras claudinas, las células se transfectaron temporalmente con el correspondiente plásmido de codificación de claudinas y la expresión se analizó mediante citometria de flujo. A fin de diferenciar entre células transíectadas y no transfectadas, las células HEK293T se co-transfectaron con un marcador de fluorescencia como un reportero. 24 h post-transfección las células se cosecharon con Tripsina/EDTA al 0.05%, se lavó con amortiguador FACS (PBS que contiene FCS al 2% y azida de sodio al 0.1%) y se resuspendió en amortiguador a una concentración de 2 x 106 células/ml. 100 µ? de la suspensión celular se incubaron con el anticuerpo apropiado a concentraciones indicadas durante 30 min a 4°C. Los anticuerpos anti-claudina de ratón comercialmente disponibles (R&D, CRL MAB3656) , anti-CLDN3 (R&D, AB4620) y anti-CLDN4 (R&D, MAB4219) sirvieron como controles positivos, mientras que la IgG2b de ratón (Sigma, CRL 8894) sirvió como un control de isotipos. Las células se lavaron tres veces con amortiguador FACS y se incubaron con un anticuerpo secundario especifico IgG l+2a+2b+3a anti-ratón conjugado con aloficocianina (APC) (Dianova, CRL 115-135-164) durante 30 min a 4°C. Las células se lavaron dos veces y se re-suspendieron en amortiguador FACS. La unión se analizó mediante citometria de flujo utilizando un BD FACSArray. La expresión del marcador de fluorescencia se gráfico en el eje horizontal contra la unión del anticuerpo en el eje vertical.

La unión de anticuerpos monoclonales a las lineas celulares que expresan endógenamente la CLDN6 se analizó de manera similar.

C. Análisis de inmunoelectrotransferencia Se analizó la expresión de la CLDN6, 3, 4 y 9 de las células NEC8 mediante análisis de inmunoelectrotransferencia . Puesto que las células HEK293T de control positivo se transfectaron temporalmente con CLDN6, 3, 4, 9 ó un plásmido prototipo como control negativo. Las células se cosecharon en amortiguador Laemmli, se lisaron y sometieron a SDS-PAGE. El gel se transfirió y tiñó con un anticuerpo anti-CLDN3 (Invitrogen, 34-1700), anti-CLDN4 (Invitrogen, 32- 9400), anti-CLDN6 (ARP, 01-8865) o anti-CLDN9 (Santa Cruz, sc-17672), respectivamente. Después de la incubación con un anticuerpo secundario etiquetado con peroxidasa, la transferencia se desarrolló con reactivo ECL y se visualizó utilizando un generador de imágenes LAS-3000 (Fuji) .

D. Análisis de CDC La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se determinó midiendo el contenido de ATP intracelular en células no lisadas después de la adición del complemento humano a las células incubadas objetivo con anticuerpos anti-CLDN6. Como un método analítico muy sensitivo la reacción bioluminiscente de luciferasa se utilizó para medir la ATP.

Las células CHO-K1 se transíectaron de manera estable con CLDN6 (CHO-K1-CLDN6 ) se cosechó con tripsina/EDTA al 0.05%, se lavó dos veces con medio X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) y se suspendió a una concentración de 1 x 107 células/ml en X-Vivo 15. 250 µ? de la suspensión de células se transfirieron a una cubeta de eiectroporacion de 0.4 cm y se mezclaron con 7 ug de ARN transcrito in vitro que codifica la luciferasa (ARN IVT de luciferasa) . Las células se sometieron a eiectroporacion a 200 V y 300 µ? que utiliza un Gene Pulser Xcell (Bio Rad) . Después de la eiectroporacion, las células se suspendieron en 2.4 mi de D-MEM/F12 pre-calentado (1:1) con medio GlutaMax-I (Invitrogen, 31331-093) que contiene FCS al 10% (v/v) , penicilina/estreptomicina al 1% (v/v) y 1.5 mg/ml de G418. Se sembraron 50 µ? de la suspensión de células por pozo en una placa de PP de 96 pozos y se incubaron a 37 °C y C02 al 7.5%. 24 h post-electroporación 50 µ? de anticuerpos anti-CLDN6 murinos monoclonales en RPMI al 60% (que contiene HEPES 20 mM) y suero humano al 40% (acumulación de suero obtenida de seis donadores saludables) se agregaron a las células a concentraciones indicadas. 10 µ? de Tritón X-100 al 8% (v/v) en PBS por pozo se agregaron a controles de lisis total, mientras que se agregaron 10 µ? por pozo a controles de células viables máx. , y a las muestras presentes. Después de una incubación de 80 min a 37 °C y C02 al 7.5% 50 µ? de mezcla de luciferina ( D-luciferina 3.84 mg/ml, ATPasa 0,64 U/ml y HEPES 160 mM en ddH20) se agregaron por pozo. La placa se incubó en la oscuridad durante 45 min a TA. La bioluminiscencia se midió utilizando un luminómetro (Infinite M200, TECAN) . Los resultados se dan como unidades de luz relativas digitales integradas (RLU) .

La lisis especifica se calcula como sigue: lisis específica [%] células viables máx. : 10 µ? de PBS, sin anticuerpo lisis total: 10 µ? de Tritón X-100 al 8% (v/v) en PBS, sin anticuerpo E. Análisis de ADCC Se analizó la capacidad de inducir de los anticuerpos anti-CLDN6 monoclonales quimerizados de inducir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) contra células NEC 8 que expresan endógenamente la CLDN6 y células NEC 8 con CLDN6 atenuada genéticamente (NEC8 LVTS2 54) en un sistema de ensayo a base de luciferasa.

Se cosecharon células objetivo NEC8 o NEC8 LVTS2 54 Tripsina/EDTA al 0.05%, se lavaron dos veces con medio X-Vivo 15 y 2.5 x 106 células se sometieron a electroporación con 7 µ? de ARN IVT de luciferasa (200 V, 400 \iF) utilizando un Gene Pulser Xcell (Bio Rad) . Después de la electroporación, las células se suspendieron en 2.4 mi de RPMI pre-calentado que contiene FCS al 10%. 50 µ? de la suspensión celular (5 x 104 células) por pozo se sembraron en una placa de 96 pozos y se incubaron a 37 °C, C02 al 5% durante 6 h. Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) se enriquecieron con la sangre de donadores saludables utilizando Ficoll ( Ficoll-Paque TM Plus, GE Healthcare, 17-1440-03) . Las PBMCs se suspendieron en X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) suplementado con suero humano inactivado con calor al 5% y se incubaron a 37 °C y C02 al 5%. Después de la incubación durante 2-4 h el sobrenadante se enriqueció en células asesinas naturales (NK) . 25 µ? de anticuerpos diluidos en PBS a concentraciones indicadas se agregaron a las células NEC8. Las células NK enriquecidas se agregaron a una proporción de 20:1 (células efectoras respecto a células objetivo) y las muestras se incubaron durante 24 h a 37°C y C02 al 5%. La lisis de células se determinó midiendo el contenido de ATP intracelular con luciferasa como se describe en la "CDC".

F. Ensayo de tratamiento temprano Para tratamientos tempranos con anticuerpos 5 x 106 células HEK293-CLD 6 (células HEK293 que expresan establemente la CLDN6) en 200 µ? de PBS se inocularon subcutáneamente en el costado de ratones sin glándula timo Nude-Foxr¡2nu. Se utilizaron células prototipo HEK293 como controles negativos. Cada grupo experimental consistió de ratones hembra de 6-8 semanas de edad. (En el caso de ratones trasplantados con células prototipo o HEK293-CLDN6, respectivamente, los grupos de control con solución salina consistieron de diez ratones) . Tres días después de la inoculación 200 g de anticuerpos muMAB 5F2D2, 27A y 36A monoclonales murinos purificados se aplicaron 46 días alternando inyecciones intravenosas e intraperitoneales dos veces a la semana. Los grupos experimentales tratados con PBS sirvieron como un control negativo. El volumen del tumor (TV = longitud x anchura2 )/2) se monitoreó bi-semanalmente . El TV se expresó en mm3, permitiendo la construcción de curvas del crecimiento tumoral con el transcurso del tiempo. Cuando el tumor alcanzó un volumen mayor a 1500 mm3 los ratones se eliminaron los ratones.

Ejemplo 2: Unión de anticuerpos obtenidos de acuerdo a la invención a las claudinas La unión de los anticuerpos muMAB 5F2D2, 27A y 36A monoclonales murinos a la CLDN6, 3, 4 y 9 humanas se analizó mediante citometria de flujo utilizando células HEK293T que expresan temporalmente la correspondiente claudina. Las HEK293T se co-transfectaron con un marcador de fluorescencia para distinguir entre células no transfectadas (población Q3) y transfectadas (población Q4) . La concentración del anticuerpo utilizada fue la concentración en la que se saturó la unión a la CLDN6 (25 g/ml) . La expresión de la CLDN6, 3, 4 y 9 humana se confirmó con anticuerpos monoclonales comerciales disponibles contra la Claudina 6 humana (R&D Systems, AB3656) , Claudina 3 humana (R&D Systems, MAB4620) y Claudina 4 humana (R&D Systems, AB 4219) .

Los anticuerpos muMAB 5F2D2, 27A y 36A mostraron una fuerte unión a las células que expresan la CLDN6, aunque las mismas no se unen a células que expresan la CLDN3 ó CLDN4, ver la Figura 1.

Los anticuerpos muMAB 5F2D2, 27A y 36A se incubaron a diferentes concentraciones (0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000, 10000 y 25000 ng/ml) con células HEK293T que temporalmente expresan las CLDN6, CLDN3, CLDN4 ó CLDN9 humanas. La unión se detectó mediante citometria de flujo; ver las Figuras 2, 3 y 4. El eje y representa el porcentaje de células unidas por el anticuerpo (población Q2) mientras que el eje x representa la concentración de anticuerpos utilizada.

El muMAB 5F2D2 mostró una fuerte unión a la CLDN6 humana y la débil unión a la CLDN9 humana. El muMAB 27A mostró una fuerte unión a la CLDN6 humana y una muy débil unión a la CLDN9 humana. El muMAB 36A mostró una fuerte unión a la CLDN6 humana y virtualmente ninguna unión a la CLDN9 humana. Ninguno de los anticuerpos interactúa con la CLDN3 ó 4 humana .

Para determinar las afinidades relativas, la unión de anticuerpos anti-CLDN6 a la CLDN6 humana expresada de manera estable en la superficie de células HEK293 se analizó mediante citometria de flujo. En el experimento de unión por saturación la concentración de los anticuerpos se gráfico contra las señales FACS (media de intensidad de fluorescencia); ver la Figura 5. La EC50 (concentración del anticuerpo que se une a la mitad de los sitios de unión en equilibrio) se calculó mediante regresión no lineal. Los resultados mostraron que los anticuerpos tienen patrones de unión característicos. Los muMAB 5F2D2 y 27A exhibieron bajos valores EC50 (EC50 350-450 ng/ml) y la saturación de unión se logró a bajas concentraciones mientras que el muMAB 36A no mostró saturación de unión incluso a la concentración más alta .

Ejemplo 3: Funciones efectoras de anticuerpos obtenidos de acuerdo a la invención La actividad CDC de anticuerpos anti-CLDN6 se analizó utilizando un ensayo dependiente de la luciferasa para detectar ATP endógena dentro de células no Usadas. Para este fin, las células CH0-K1 que expresa de manera estable la CLDN6 humana se trataron con diferentes concentraciones de MuMAB 5F2D2, 27A ó 36A o anti-CLDN6 (R&D Systems, MAB3656) como un control interno.

El muMAB 5F2D2 mostró actividad CDC de una manera dependiente de la dosis; ver la Figura 6. El muMAB 27A exhibió actividad CDC dependiente de la dosis mientras que el muMAB 36A no fue capaz de inducir la CDC in vitro; ver la Figura 7.

La capacidad del anticuerpo chimAB 5F2D2 anti-CLDN6 quimérico de inducir citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC) o células NEC8 que expresan la CLDN6 endógenamente y NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 atenuada genéticamente) se determinó; ver la Figura 8. El anticuerpo chimAB 5F2D2 anti-CLDN6 quimérico y el ADCC inducido con Herceptina de control positivo en las células NEC8 con células efectoras de dos diferentes donadores de una manera dependiente de la dosis. La eficacia para inducir la ADCC en células NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 atenuada genéticamente) se disminuyó fuertemente con chimAB 5F2D2 en comparación con las células progenitoras NEC8, proporcionando la especificidad objetivo de chimAB 5F2D2.

Ejemplo 4: Eficacia terapéutica de anticuerpos obtenidos de acuerdo a la invención El efecto terapéutico del muMAB 5F2D2 se analizó en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano en donde los xenotransplantes HEK293-CLDN6 y prototipo-HEK293 transíectados establemente se trasplantaron en ratones sin glándula timo Nude-Foxnlnu .

El muMAB 5F2D2 mostró una inhibición fuerte y especifica al crecimiento tumoral en ratones trasplantados con células HEK293 que expresan establemente la CLDN6 humana; ver la Figura 9. El muMAB 5F2D2 no tuvo efecto en el crecimiento tumoral en ratones trasplantados con células prototipo de control. Los grupos de control con solución salina separados de ratones recibieron PBS como vehículo en volúmenes de inyección equivalentes a los anticuerpos aplicados .

Además, una prueba Kruskal-Wallis mostró que los volúmenes tumorales se redujeron significativamente el día 28 (y posteriormente) después del tratamiento con muMAB 5F2D2; ver la Figura 10. Además, los ratones tratados con el anticuerpo muMAB 5F2D2 anti-CLDN6 murino monoclonal mostró supervivencia prolongada en comparación con los grupos de control PBS. El efecto dependiente del anticuerpo no se observó en ratones trasplantados con células prototipo HEK293 como un grupo de control; ver la Figura 11.

De manera similar, el análisis del muMAB 27A y muMAB 36A en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano mostró una inhibición fuerte y especifica del crecimiento tumoral en ratones trasplantados con células HEK293 que expresan de manera estable la CLDN6; ver las Figuras 12 y 13. Además, el muMAB 27A y 36A son efectivos para prolongar la supervivencia de ratones trasplantados; ver la Figura 14.

Ejemplo 5: CLDN6 como un objetivo cancerígeno en tumores de células germinales La expresión de CLDN3, 4, 6 y 9 se analizó mediante análisis de inmunoelectrotransferencia en células NEC8. La línea celular NEC8 de tumores de células germinales testiculares solamente mostró la expresión del CLDN6 (A) pero no de CLDN3, 4 ó 9, respectivamente (B) ; ver la Figura 15. Las especificidades de los anticuerpos anti-CLDN3, 4 y 9 utilizados se analizaron mediante transferencia Western utilizando células HEK293T transfectadas temporalmente con vectores de expresión que codifican la correspondiente claudina humana.

La expresión de superficie de CLDN6 en las células NEC8 se analizó utilizando citometría de flujo. El anticuerpo anti-CLDN6 comercialmente disponible (R&D Systems, MAB3656) detectó la expresión de CLDN6 en las células NEC8; ver la Figura 16. El ratón Sigma, CRL M8894) se utilizó como un isotipo de control.

El efecto terapéutico de muMAB 5F2D2 en un modelo de xenotransplante de tratamiento temprano que utiliza ratones trasplantados con la linea NEC8 de células tumorales se analizó. En comparación con el grupo de control con solución salina del muMAB 5F2D2 mostró una inhibición fuerte y específica del crecimiento tumoral en ratones trasplantados con células NEC8 que expresan endógenamente la CLDN6 humana; ver la Figura 17. La prueba Kruskal-Wallis mostró que los volúmenes tumorales se redujeron el día 21 y 42 después del tratamiento con muMAB 5F2D2; ver la Figura 18.

INDICACIONES RELACIONADAS AL MICRORGANISMO DEPOSITADO U OTRO MATERIAL BIOLÓGICO A. Las indicaciones hechas más adelante se refieren al microorganismo depositado u otro material biológico referido en la descripción en la página _JJ , linea 6-7 B. IDENTIFICACIÓN DEL DEPÓSITO Los depósitos adicionales se identifican en una hoja adicional Nombre de la institución depositaría DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Dirección de la institución depositaría (incluyendo el código postal y país) In offenstr. 7B 38124 Braunschweig DE - Mieloma de ratón (Mus musculus) P3X63Ag8.653 fusionado con esplenocitos de ratón - Hibridoma que secreta anticuerpos con la CLDN6 humana D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN LAS INDICACIONES (si las indicaciones no son para lodos Estados designados) E. PROVISIÓN SEPARADA DE INDICACIONES (dejar en blanco si no aplica) Las indicaciones listadas abajo serán presentadas a la Oficina Internacional posteriormente (especificar la naturaleza general de las indicaciones, por ejemplo, "Número de Acceso del Depósito ") Para usarse sólo por la Oficina receptora Para usarse sólo por la Oficina Internacional Esta hoja fue recibida con la solicitud internacional Esta hoja fue recibida con la solicitud internacional el: Funcionario autorizado Funcionario autorizado Forma PCT/RO/134 (Julio 1998; reimpresión Enero 2004) Hoja Adicional del Material Biológico Indicación de depósitos adicionales: 1) El Nombre y Dirección de la institución depositaría de los depósitos son: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Inhoffenstr. 7 B 38124 Braunschwe DE Indicaciones Adicionales para todos los depósitos mencionados : - Mieloma de ratón (Mus musculus) P3X63Ag8.653 fusionado con esplenocitos de ratón - Hibridoma que secreta anticuerpos con la CLDN6 humana D) Depositante: Todos los depósitos mencionados se hicieron por: Ganymed Pharmaceuticals AG FreiligrathstraBe 12 55131 Mainz DE

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo caracterizado porque inhibe el crecimiento de un tumor in vivo, en donde las células del tumor expresan la claudina 6 (CLDN6) y en donde el anticuerpo es capaz de unirse a la CLDN6.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo inhibe el crecimiento del tumor uniéndose a la CLDN6.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el anticuerpo es especifico para la CLDN6.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tumor se selecciona del grupo que consiste de cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , en particular carcinoma y adenocarcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer gástrico, cáncer de seno, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomorfo maligno, sarcoma, en particular sarcoma y carcinosarcoma sinovial, cáncer del conducto biliar, cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñon, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, incluyendo cáncer del íleon, en particular adenocarcinoma del intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, un tumor de células germinales, en particular un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario, preferiblemente un tumor de células germinales de los testículos, y las formas metastásicas de los mismos.

6. Un anticuerpo caracterizado porque es seleccionado del grupo consiste de: (i) un anticuerpo producido por u obtenible de un clon depositado bajo el acceso no. DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A) , DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A) , o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2) , (ii) un anticuerpo el cual es una forma quimerizada 0 humanizada del anticuerpo en (i), (iii) un anticuerpo el cual tiene la especificidad del anticuerpo en (i) , y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión de antigeno o el sitio de unión de antigeno del anticuerpo en (i) , en donde la porción de unión de antigeno o sitio de unión de antigeno del anticuerpo en (i) preferiblemente comprende la región variable del anticuerpo en (i).

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es adherido al menos a una porción efectora terapéutica, en donde la porción efectora terapéutica preferiblemente es una radioetiqueta, citotoxina o enzima citotóxica.

8. Un hibridoma caracterizado porque es capaz de producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un hibridoma caracterizado porque es depositado bajo el acceso no. DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A) , DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A) , o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2).

10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de cualquiera de . las reivindicaciones 1 a 7, en donde la composición farmacéutica preferiblemente está en la forma de una vacuna tumoral terapéutica o profiláctica.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, para uso en el tratamiento o prevención de un padecimiento tumoral.

12. Un método para tratar un paciente que tiene un padecimiento tumoral o que está en riesgo de desarrollar un padecimiento tumoral, caracterizado porque las células del tumor expresan claudinas 6 (CLDN6) y en donde el método comprende la administración de un anticuerpo capaz de unirse a la CLDN6.

13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo cuando se administra al paciente inhibe el crecimiento del tumor en el paciente al unirse a la CLDN6.

14. El método de la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el anticuerpo se adhiere al menos a una porción efectora terapéutica, en donde la porción efectora terapéutica preferiblemente es una radioetiqueta, citotoxina o enzima citotóxica.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque el anticuerpo es especifico para la CLDN6.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque el método comprende la administración de una composición farmacéutica de la reivindicación 10 u 11.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 ó el método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizada porque el padecimiento tumoral puede seleccionarse del grupo que consiste de cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , en particular carcinoma y adenocarcinoma de pulmón de células escamosas, cáncer gástrico, cáncer de seno, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomorfo maligno, sarcoma, en particular sarcoma y carcinosarcoma sinovial, cáncer del conducto biliar, cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñon, en particular carcinoma de células renales incluyendo carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer del intestino delgado, incluyendo cáncer del íleon, en particular adenocarcinoma del intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, un padecimiento tumoral de células germinales, en particular un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario, preferiblemente un padecimiento tumoral de células germinales de los testículos, y las formas metastásicas de los mismos.

19. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 y 18 ó el método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, caracterizados porque la CLDN6 comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico la cual comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la SEC ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácido nucleico.

20. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 19, la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 10, 11, 18 y 19 ó el método de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, caracterizados porque la CLDN6 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la SEC ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.