MX2012007372A - Sistema y metodo para la filtracion de particulas. - Google Patents
Sistema y metodo para la filtracion de particulas.Info
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Abstract
Las modalidades de la presente descripción presentan un sistema de filtración que comprende un módulo de filtración para la filtración de partículas y métodos para usar el dispositivo para el aislamiento de las partículas (p.ej., células viables). De manera ventajosa, modalidades del dispositivo proporcionan filtración de alta producción de grandes volúmenes de muestra mientras se preserva la viabilidad celular y se proporcionan altos rendimientos.
Description
SISTEMA Y MÉTODO PARA LA FILTRACIÓN DE PARTÍCULAS
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los métodos para separar células de muestras biológicas son importantes para muchos procedimientos clínicos y para métodos de investigación científica. En el banco de sangre del cordón ' umbilical , la sangre del cordón umbilical se puede reducir en volumen usando un proceso de separación de células antes de entrar en la criopreservación para reducir el costo de almacenamiento a largo plazo. En la terapia celular, se pueden enriquecer determinados tipos celulares antes de la transfusión a un paciente para aumentar el injerto. Las tecnologías de filtración actuales para la separación celular por lo generan no logran preservar la viabilidad celular y típicamente, tienen bajos rendimientos. Por ejemplo, las técnicas de separación celular que dependen de la exclusión por tamaño someten las células frágiles a estrés de cizallamiento provocando lisis o daño celular. La acumulación de restos celulares acelera el atascamiento y las obstrucciones del dispositivo. Con frecuencia, las células aisladas usando dichos métodos se activan, alteran, dañan o mueren. Los dispositivos de microfluidos se limitan por el volumen de la muestra que pueden procesar. El simple aumento de la tasa de flujo a través de dichos dispositivos es inútil dado que a medida que aumenta la tasa de flujo, el estrés de cizallamiento de las células que se mueven a través del dispositivo también aumenta. Por lo tanto, el estrés de cizallamiento limita la producción volumétrica. Por lo tanto, se desea proporcionar un método y un dispositivo para la filtración de partículas que no usa exclusión por tamaño como mecanismo de filtración. En particular, se desea proporcionar un método y un dispositivo para la filtración celular que no se obstruya fácilmente, que tenga una elevada producción volumétrica, que sea físicamente compacta y que no dañe o active las células.
BREVE DESCRIPCIÓN
Tal como se describe a continuación, la presente descripción presenta un dispositivo para la filtración de partículas y métodos para usar el dispositivo para el enriquecimiento de células viables. En particular, la presente descripción presenta el uso de dichos dispositivos para el aislamiento de tipos de glóbulos rojos, reducción del volumen de sangre del cordón umbilical y preparación de fracciones vasculares estromales .
De manera ventajosa, el dispositivo puede proporcionar la filtración de alta producción de grandes volúmenes de muestra mientras se preserva la viabilidad celular y se proporcionan altos rendimientos . Algunas modalidades de la presente descripción pueden comprender dispositivos adecuados para la automatización y procesamiento de alta producción, y algunas modalidades de la presente descripción pueden comprender sistemas que permiten el procesamiento de muestras clínicas en sistemas cerrados. Además, el método para usar el dispositivo puede proporcionar un alto rendimiento, una alta tasa de recuperación y, en algunos casos, alto nivel de pureza. Además, el método para usar el dispositivo se aplica al procesamiento de muestras clínicas, por ej . , reducción del volumen de la sangre del cordón umbilical, enriquecimiento de células madres de la médula ósea, procesamiento de las células madre de la sangre periférica y preparación de fracción vascular estromal puede proporcionar el mantenimiento de un alto nivel de post separación de viabilidad celular, facilidad de uso, seguridad y rentabilidad.
En una modalidad, la descripción proporciona un dispositivo de filtración de partículas que proporciona la separación de alto rendimiento de células viables. Dado que el dispositivo de filtración de partículas prevé la separación de partículas con mínima fuerza de cizallamiento, al menos alrededor de 50%, 75%, 85%, 95%, 98%, 99%, 99.5% o más de las células separadas son viables y adecuadas para investigación y uso médico. En diversas modalidades, el sistema de filtración presenta uno o más recipientes adecuados para sostener una muestra y/o fluido portador para su administración a uno o más dispositivos de filtro y uno o más recipientes adecuados para sostener el retentado o el filtrado que emana del dispositivo. En una modalidad, los recipientes son bolsas flexibles adecuadas para mantener líquidos. En otra modalidad, los recipientes están conectados a la unidad de filtrado mediante tubos flexibles adecuadas para transportar fluidos. Si se desea, los tubos están conectados al alojamiento de unidad de filtro y/o recipiente mediante un adaptador.
Los aspectos y las modalidades de la descripción se dirigen a un sistema de filtración de partículas que contiene un cartucho que contiene un alojamiento y una pluralidad (por ejemplo, alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 250, 500, 750, 1,000, 2,000 o 5,000) de unidades de filtración, donde el alojamiento contiene una entrada de muestra de alimentación, una salida de retentado y una salida de filtrado; y cada unidad de filtración contiene una cámara de retentado que tiene extremos proximales y distales, una cámara de filtrado y una fila de pilares posicionados entre la cámara de retentado y la cámara de filtrado, los pilares definen una pluralidad de poros que permiten la comunicación fluida entre la cámara de retentado y la cámara de filtrado, donde el ancho de la cámara de retentado disminuye desde el extremo proximal hasta el extremo distal, el ancho de la cámara de filtrado aumenta desde el extremo proximal hasta el extremo distal y la unidad de filtración está configurada de manera tal que el tamaño eficaz de poro de los poros sea más pequeño que, por ejemplo, alrededor de 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% del tamaño eficaz de poro físico de los poros; la entrada de muestra de alimentación está en conexión fluida con el extremo proximal de la cámara de retentado presente en cada unidad de filtración; la salida de filtrado está en conexión fluida con la cámara de filtrado presente en cada unidad de filtración; y la lida de cámara de retentado está en conexión fluida con el extremo distal de la cámara . de retentado presente en cada una de las muchas unidades de filtración.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema para la filtración de partículas que contiene un cartucho que comprende un alojamiento y una pluralidad de unidades de filtración, donde el alojamiento contiene una entrada de muestra de alimentación, una salida de retentado y una salida de filtrado; y cada una de las unidades de filtración contiene una cámara de retentado que tiene extremos proximales y distales; una cámara de filtrado que contiene al menos un extremo distal y un filtro que contiene una pluralidad de poros posicionados entre la cámara de retentado y la . cámara de filtrado, los poros permiten la comunicación fluida entre la cámara de retentado y la cámara de filtrado, donde la cámara de filtrado, el filtro y la cámara de retentado están configurados de manera tal que el tamaño eficaz de poro de los poro sea menor al tamaño de poro físico de los poros; la entrada de muestra de alimentación está en conexión fluida con el extremo proximal de la cámara de retentado presente en cada unidad de filtración; la salida de filtrado está en conexión fluida con la cámara de filtrado presente en cada unidad de filtración; y la salida de cámara de retentado está en conexión fluida con el extremo distal de la cámara de retentado presente en cada una de las diversas unidades de filtración.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema para la filtración de partículas que contiene un cartucho que contiene un alojamiento y una pluralidad de unidades de filtración, donde el alojamiento contiene una entrada de muestra de alimentación, una salida de retentado y una salida de filtración; y cada unidad de filtración contiene una primera cámara de flujo, una segunda cámara de flujo y un filtro que contiene alrededor de 3 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 250, 300, 500, 1,000, 2,000, 5,000 o más poros que tienen un tamaño de poro físico entre alrededor de 100 nm y alrededor de 3 mm (por ejemplo, alrededor de 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 750 nm, 1 m, 2 µt?, 3 µp\, 5 µ??, 7.5 µ??, 10 µp?, 20 µp?, 30 µ??, 50 µt?, 75 µp?, 100 µp?, 200 µ??, 300 µp?, 500 -µp?, 1 mm, 2 mm o 3 mm) donde el filtro está colocado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo; y la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo están configuradas de manera tal que las partículas de retentado se retengan en el filtro sin restricción física; la entrada de muestra de alimentación está en conexión fluida con el extremo proximal de la primera cámara de retentado presente en cada unidad de filtración; la salida de filtrado está en conexión fluida con el extremo distal de la segunda cámara de filtrado presente en cada unidad de filtración; y la salida de retentado está en conexión fluida con el extremo distal de la primera cámara de flujo presente en cada una de las diversas unidades de filtración.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema para la filtración de partículas que contiene un cartucho que contiene un alojamiento y una pluralidad de unidades de filtración, donde el alojamiento contiene una entrada de muestra de alimentación, una salida de retentado y una salida de filtrado; y cada unidad de filtración contiene una primera
cámara de flujo que tiene extremos proximales y distales, una segunda cámara de flujo y un filtro posicionados entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo que contiene poros que tienen un tamaño de poro físico entre alrededor de 10 nm y 10 mm, donde la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo están configuradas de manera tal que el tamaño de retención del filtro sea menor al tamaño de poro físico; la entrada de muestra de alimentación está en conexión fluida con el extremo proximal de la primera cámara de flujo presente en cada unidad de filtración; la salida de filtrado está en conexión fluida con el extremo distal de la segunda cámara de flujo presente en cada unidad de filtración; y la salida de cámara de retentado está en conexión fluida con el extremo distal de la primera cámara de flujo presente en cada una de las diversas unidades de filtración .
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema para la filtración de partículas que contiene un cartucho que contiene un alojamiento y una pluralidad de unidades de filtración, donde el alojamiento contiene una entrada de muestra de alimentación, una salida de cámara de retentado, una salida de filtrado y opcionalmente una entrada de fluidos portadores. Cada unidad de filtración puede incluir un primer puerto de entrada, un primer puerto de salida, un segundo puerto de entrada y opcionalmente un segundo puerto de entrada en conexión fluida con la entrada de fluidos portadores. Cada unidad de filtración puede tener un índice de eficiencia de diseño mayor a alrededor de 0.3 ram'2. La entrada de muestra de alimentación puede estar en conexión fluida con el primer puerto de entrada presente en cada unidad de filtración. La salida de filtrado puede estar en comunicación fluida con el primer puerto de salida presente en cada unidad de filtración. La salida de retentado puede estar en conexión fluida con el segundo puerto de salida presente en cada una de las diversas unidades de filtración.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema de filtro tubular que contiene un tubo de centrifugado, una inserción tubular y una tapa, donde la inserción tubular contiene al menos una unidad de filtración de acuerdo con cualquiera de los aspectos previos, un depósito de muestra de alimentación y opcionalmente un depósito de fluido portador, cada uno de los cuales está en conexión fluida con la primera cámara de¦ flujo o el extremo proximal de la cámara de retentado y un depósito de salida en comunicación fluida con el extremo distal de la cámara de retentado o la segunda cámara de flujo, donde el depósito de salida se adapta para recibir la cámara de retentado o el filtrado desde la unidad de filtración.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema de filtro de placa que contiene uno o más pocilios de muestra y opcionalmente un pocilio de fluido portador en conexión fluida con una unidad de filtración de acuerdo con cualquier aspecto previo o cualquier otro aspecto de la descripción delineada en la presente; y un pocilio de filtrado y un pocilio de retentado en conexión fluida con la unidad de filtración, donde el pocilio de filtrado y un pocilio de retentado están configurados para recibir el filtrado y el retentado de la unidad de filtración.
En otro aspecto, la descripción proporciona un sistema de filtro de placa que contiene uno o más pocilios de muestra y opcionalmente un pocilio de fluido portador en conexión fluida con una unidad de filtración de acuerdo con cualquier aspecto previo o cualquier otro aspecto de la descripción delineada en la presente; y un pocilio de filtrado y un pocilio de retentado donde el pocilio de filtrado y un pocilio de retentado están configurados para recibir el filtrado y el retentado de la unidad de filtración. En una modalidad, el pocilio de filtrado o el pocilio de retentado no se encuentra en la misma placa que el pocilio de muestra.
En diversas modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores o cualquier otro aspecto de la descripción delineada en la presente, la entrada de muestra de alimentación tiene un extremo proximal conectado a un adaptador mediante una línea de tubos, la salida de retentado está conectada a una bolsa de recolección de cámara de retentado mediante una línea de tubos y la salida de filtrado está conectada a una bolsa de recolección de filtrado mediante una línea de tubos. En otras modalidades de los aspectos anteriores, la entrada de muestra de alimentación está conectada a una bolsa de recolección de muestras que tiene extremos proximales y distales, donde el extremo proximal contiene una membrana adaptada para recibir una aguja y el extremo distal contiene un puerto donde se puede unir un adaptador. En otras modalidades de los aspectos anteriores, la entrada de muestra de alimentación tiene un extremo proximal conectado a un bolsa de recolección de muestras mediante una línea de tubos, la salida de retentado está conectada a una bolsa de recolección de retentado mediante una línea de tubos y la salida de filtrado está conectada a una bolsa de recolección de filtrado mediante una línea de tubos. En- aun otras modalidades de los aspectos anteriores, la bolsa de recolección de muestras contiene una aguja para introducir muestras dentro de la bolsa de recolección de muestras .
Las composiciones y los artículos definidos por la descripción se aislaron o, de otra manera, se fabricaron en conexión con los ejemplos proporcionados a continuación. Otras características y ventajas de la descripción serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.
De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se proporciona un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración comprende una primera cámara de flujo. La primera cámara de flujo incluye al menos una entrada configurada para recibir una alimentación que comprende partículas y un fluido y al menos una salida de retentado. El dispositivo de filtración comprende una segunda cámara de flujo que incluye un extremo distal que tiene al menos una salida de filtrado y un filtro posicionados entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo. El filtro incluye una primera fila de pilares y una pluralidad de poros definidos por los espacios entre los pilares adyacentes. Cada poro de la pluralidad de poros incluye un tamaño de poro físico definido por una distancia entre los pilares adyacentes que definen el poro y un tamaño de poro eficaz más pequeño que el tamaño de poro físico. El dispositivo de filtración comprende adicionalmente medios para mover el alimento a través del dispositivo de filtración. La primera cámara de flujo, la segunda cámara de flujo, el filtro y los medios para mover el alimento a través del dispositivo de filtración están configurados para retener una fracción sustancial de partículas que tiene un tamaño mayor que los tamaños de poros eficaces de los poros y más pequeños que los tamaños de poros físicos de los poros como retentado en la primera cámara de flujo y para pasar una fracción sustancial del fluido como filtrado en la segunda cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, la primera cámara de flujo comprende una primera profundidad sustancialmente constante. De acuerdo con algunas modalidades, la segunda cámara de flujo comprende una segunda profundidad sustancialmente constante. De acuerdo con algunas modalidades, una distancia entre el filtro y una pared lateral de la primera cámara de flujo disminuye junto con una longitud desde al menos una entrada hasta al menos una salida de retentado. De acuerdo con algunas modalidades, una distancia entre el filtro y una pared lateral de la segunda cámara de flujo aumenta junto con una longitud desde al menos un extremo proximal de la segunda cámara de flujo hasta el extremo distal.
De acuerdo con algunas modalidades, un ángulo entre una línea tangente a la pared lateral de la segunda cámara de flujo y una línea tangente a la fila de pilares es menor a alrededor de 5, grados .
De acuerdo con algunas modalidades, un subconjunto de los poros tiene tamaños de poros físicos sustancialmente idénticos .
De acuerdo con algunas modalidades, un subconjunto de los poros tiene tamaños de poros eficaces sustancialmente idénticos .
De acuerdo con algunas modalidades, la primera fila de pilares comprende más de alrededor de 10 por ciento de todos los pilares presentes en el dispositivo de filtración.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración reivindicado tiene una longitud de dispositivo definido por una mayor longitud de la primera cámara de flujo y una longitud de una ' segunda cámara de flujo y un ancho de dispositivo definido por una suma de ancho de la primera cámara de flujo y un ancho de la segunda cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la primera cámara de flujo y un ancho de la segunda cámara de flujo, la relación entre la longitud del dispositivo y el ancho del dispositivo es mayor a alrededor de 6.
De acuerdo con algunas modalidades, cada poro tiene un tamaño de poro eficaz que es menor a alrededor de 80 por ciento del tamaño de poro físico del poro.
De acuerdo con algunas modalidades, la primera cámara comprende al menos una entrada de fluido portador distinto de al menos una entrada.
De acuerdo con algunas modalidades, dicho al menos un fluido portador comprende al menos uno de colorantes de ácido nucleico, fijadores, soluciones de congelación, agentes alquilantes, anticuerpos, perlas magnéticas, enzimas, colagenasa, lipasa, DNasa, sustratos de determinadas enzimas, derivados activos de ciclofosfamida, factores de crecimiento, detergentes y soluciones de.lisis.
De acuerdo con algunas modalidades, cada una de la primera cámara de flujo y el filtro están libres de todo borde dominante que tenga un radio de curvatura menor a alrededor de 1 µt?, en una trayectoria de flujo a través del dispositivo .
De acuerdo con algunas modalidades, un primer subconjunto de poros tiene un tamaño de poro eficaz diferente de un segundo subconjunto de poros. En algunas modalidades, dicha al menos una entrada de filtrado de la segunda cámara de flujo está configurada para recolectar el filtrado que pasa a través del primer subconjunto de poros y donde la segunda cámara de flujo comprende una segunda salida de filtrado configurada para recolectar el filtrado que pasa a través del segundo subconjunto de poros.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración comprende además un segundo filtro y una tercera cámara de flujo. El segundo flujo se puede colocar entre la primera cámara de flujo y la tercera cámara de flujo. La tercera cámara de flujo puede incluir un extremo proximal y un extremo distal, dicho extremo distal tiene al menos una salida. La tercera cámara se puede ensanchar a lo largo de la longitud del extremo proximal hasta el extremo distal.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración tiene una longitud de dispositivo definido por una longitud de la primera cámara de flujo y un ancho de dispositivo definido por una suma de un ancho de la primera cámara de flujo, un ancho de la segunda cámara de flujo y un ancho de la tercera cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la primera cámara de flujo, un ancho de la segunda cámara de flujo y un ancho de la tercera cámara de flujo, la relación entre la longitud del dispositivo y el ancho del dispositivo es mayor a alrededor de 5.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración tiene menos que alrededor de 5,000 pilares.
De acuerdo con algunas modalidades, el primer filtro y el segundo filtro comprenden más de alrededor de 15 por ciento de todos los pilares incluidos en el ' dispositivo de filtración .
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración es sustancialmente simétrico alrededor de un plano de espejo a través de una línea central de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, una línea tangente definida por la primera fila de pilares y una línea tangente definida por una segunda fila de pilares no son paralelas.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración comprende además un segundo filtro, una tercera cámara de flujo y una cuarta cámara de flujo. El segundo filtro se puede colocar entre la tercera cámara de flujo y la cuarta cámara de flujo. La tercera cámara de flujo puede comprender al menos una entrada y al menos una salida. La cuarta. cámara de flujo puede comprender al menos una salida.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un retentado del primer filtro. La tercera cámara de flujo puede comprender además una segunda salida distinta de dicha al menos una salida donde la segunda salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un retentado del segundo filtro.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un retentado del primer filtro y un retentado del segundo filtro.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un retentado del primer filtro y un retentado del segundo filtro. La tercera cámara de flujo puede comprender además una segunda salida distinta de dicha al menos una salida donde la segunda salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un filtrado del primer filtro.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración reivindicado tiene una longitud de dispositivo definido por una suma de una longitud de la primera cámara de flujo y una longitud de la tercera cámara de flujo y un ancho de dispositivo definido por la suma mayor de un ancho de la primera cámara de flujo y un ancho ' de la segunda cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la primera cámara de flujo y un ancho de la segunda cámara de flujo, y una suma de un ancho de la tercera cámara de flujo y un ancho de la cuarta cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la tercera cámara de flujo y un ancho de la cuarta cámara de flujo, la relación entre la longitud del dispositivo y el ancho del dispositivo es mayor a alrededor de 10.
De acuerdo con algunas modalidades, el primer filtro y el segundo filtro comprenden no menos de 10 por ciento de todos los pilares incluidos en el dispositivo de filtración.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una entrada de la tercera cámara de flujo está en conexión fluida con dicha al menos una salida de filtrado de la segunda cámara de flu o.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una entrada de la tercera cámara de flujo está en conexión fluida con dicha al menos una salida de retentado de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una entrada de la tercera cámara de flujo está en conexión fluida con dicha al menos una salida de la primera cámara de flujO y con dicha al menos una salida de la segunda cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, la tercera cámara comprende además al menos una entrada de fluido portador distinto de dicha al menos una entrada.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para satisfacer el "criterio de expansión de la cámara de filtrado" .
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para satisfacer el "criterio de la mínima cantidad de poros" .
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para hacer fluir un flujo a través de cada poro a una relación de flujo volumétrico menor a alrededor de 3 por ciento de una relación de flujo volumétrico en el extremo proximal de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para hacer fluir un flujo a través de la primera cámara a una velocidad de flujo sustancialmente constante.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para hacer fluir un flujo a través de la segunda cámara a una velocidad de flujo sustancialmente constante.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para hacer fluir un flujo a través de esencialmente todos los poros a una velocidad de flujo sustancialmente idéntica.
De acuerdo con algunas modalidades, los pilares tienen cortes transversales en forma de huevo.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración comprende además un segundo filtro, un tercer filtro, un cuarto filtro, una tercera cámara de flujo, una cuarta cámara de flujo, una quinta cámara de flujo y una sexta cámara de flujo. El segundo filtro se puede colocar entre la primera cámara de flujo y la tercera cámara de través de cada poro a una relación de flujo volumétrico menor a alrededor de 3 por ciento de una relación de flujo volumétrico en el extremo proximal de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para hacer fluir un flujo a través de la primera cámara a una velocidad de flujo sustancialmente constante.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para hacer fluir un flujo a través de la segunda cámara a una velocidad de flujo sustancialmente constante.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración está configurado para hacer fluir un flujo a través de esencialmente todos los poros a una velocidad de flujo sustancialmente idéntica.
De acuerdo con algunas modalidades, los pilares tienen cortes transversales en forma de huevo.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración comprende además un segundo filtro, un tercer filtro, un cuarto filtro, una tercera cámara de flujo, una cuarta cámara de flujo, una quinta cámara de flu o y una sexta cámara de flujo. El segundo filtro se puede colocar entre la primera cámara de flujo y la tercera cámara de flujo. El tercer filtro se puede colocar entre la cuarta cámara de flujo y la quinta cámara de flujo. El cuarto filtro se puede colocar entre la cuarta cámara de flujo y la sexta cámara de flujo. La tercera cámara de flujo puede comprender un primer extremo y al menos una salida. La tercera cámara de flujo se puede ensanchar a lo largo de longitud desde el primer extremo de la tercera cámara de flujo hacia dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo. La quinta cámara de flujo puede comprender un primer extremo y al menos una salida. La quinta cámara de flujo se puede ensanchar a lo largo de longitud desde el primer extremo de la quinta cámara de flujo hacia dicha al menos una salida de la quinta cámara de flujo. La sexta cámara de flujo puede comprender un primer extremo y al menos una salida. La sexta cámara de flujo se puede ensanchar a lo largo de longitud desde el primer extremo de la sexta cámara de flujo hacia dicha al menos una salida de la sexta cámara de flujo. La cuarta cámara de flujo puede comprender al menos una entrada y al menos una salida. Dicha al menos una entrada de la cuarta cámara de flujo puede estar en conexión fluida con dicha al menos una salida de retentado de la primera cámara de flujo, dicha al menos una salida de filtrado de la segunda cámara de flujo y dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtración comprende además un segundo filtro y una tercera cámara de flujo. El segundo filtro se puede colocar entre la segunda cámara de flujo y la tercera cámara de flujo. La tercera cámara de flujo puede comprender al menos una entrada y al menos una salida.
De acuerdo con. algunas modalidades, el dispositivo es sustancialmente simétrico alrededor de un plano de espejo a través de la primera cámara de flujo y la cuarta cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, la cuarta cámara comprende además una entrada de fluido portador distinta de dicha al menos una entrada de la cuarta cámara de flujo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para la filtración de partículas. El método comprende proporcionar un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración incluye al menos una unidad de filtración. Cada unidad de filtración incluye una primera cámara de flujo que incluye una entrada de alimentación y una salida de retentado, una segunda cámara de flujo que incluye una salida de filtración y un filtro que incluye una pluralidad de poros que tiene tamaños de poros físicos, dicho filtro está colocado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo. El método comprende además introducir un alimento que incluye un fluido de alimentación y al menos una población de partículas que tiene tamaños menores a los tamaños de poros físicos inmersos en el fluido de alimentación dentro del dispositivo a través de la entrada de alimentación aplicando una fuerza motriz para dirigir el alimento a través del dispositivo de filtración pasando el alimento a través del dispositivo de filtración de manera tal que una fracción sustancial de las partículas de dicha al menos una población se retenga como retentado en la primera cámara de flujo y que una fracción sustancial del fluido de alimentación pase a través del filtro como filtrado hacia la segunda cámara de flujo, recolectando la cámara de retentado en la salida de cámara de retentado y recolectando el filtrado en la salida de filtración.
De acuerdo con algunas modalidades, proporcionar un dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que incluye más de 10 unidades de filtración .
De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento dentro del dispositivo comprende introducir una suspensión líquida de las células dentro de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el alimento comprende células viables y el método comprende además separar células del alimento, donde al menos alrededor de 90% de las células viables permanecen viables luego de la separación.
De acuerdo con algunas modalidades, el método comprende además separar las células del alimento y donde menos de alrededor de 0.03 por ciento de estas células están lisadas por el dispositivo de filtración. ·
De acuerdo con algunas modalidades, menos de alrededor de 0.03% de las células están atrapadas en el dispositivo de filtración.
De acuerdo con algunas modalidades, pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar más de
105 células por segundo a través del dispositivo de filtración .
De acuerdo con algunas modalidades, pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar más de
106 células por segundo a través del dispositivo de filtración.
De acuerdo con algunas modalidades, pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar más de
107 células por segundo a través del dispositivo de filtración .
De acuerdo con algunas modalidades, proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que comprende al menos una unidad de filtración que tiene un volumen de retención menor a 0.8 microlitros .
De acuerdo con algunas modalidades, proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que tiene un área de espacio y una profundidad de cámara sustancialmente constante, y donde pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar células a través del dispositivo de filtración a una velocidad normalizada de procesamiento, definida como la cantidad de células que pasan a través del dispositivo de filtración por segundo dividido entre el producto de la profundidad de cámara sustancialmente constante y el área de espacio, mayor a 10,000 células por segundo por milímetro cúbico.
De acuerdo con algunas modalidades, proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que tiene un área de espacio y una profundidad de cámara sustancialmente constante y, donde pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar células a través del dispositivo de filtración a una velocidad normalizada de procesamiento, definida como la cantidad de células que pasan a través del dispositivo de filtración por segundo dividido entre el producto de la profundidad de cámara sustancialmente constante y el área de espacio, mayor a 100,000 células por segundo por milímetro cúbico.
De acuerdo con algunas modalidades, proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que tiene una profundidad de cámara característica, un área de espacio y una densidad de unidad de filtración, definidos como la cantidad de módulos de filtración incluidos en el módulo dividido entre el producto de la profundidad de cámara característica y el área de espacio, donde la densidad de unidad de filtración es mayor a 400 unidades de filtración por centímetro cúbico.
De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento dentro del dispositivo comprende introducir un líquido de alimentación incluyendo médula ósea dentro de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, introducir <¦ el alimento dentro del dispositivo comprende introducir un líquido de alimentación incluyendo sangre dentro de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento dentro del dispositivo comprende introducir un líquido de alimentación incluyendo sangre del cordón umbilical dentro de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento comprende introducir un líquido de alimentación incluyendo células madre dentro de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento comprende introducir un líquido de alimentación incluyendo células formadoras de colonias dentro de la primera cámara de flujo. De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento comprende introducir un líquido de alimentación incluyendo células inmunes dentro de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento dentro del dispositivo comprende introducir líquido amniótico dentro de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento dentro del dispositivo comprende introducir tejido adiposo digerido dentro de la primera cámara de flujo.
•De acuerdo con algunas modalidades, introducir el alimento en el dispositivo comprende introducir una de las siguientes células, glóbulos sanguíneos, células de sangre del cordón umbilical, células de médula ósea, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, células epiteliales, células madre, células cancerosas, células tumorales, células tumorales circulantes, células progen'itoras , precursores de células, células madre de sangre del cordón umbilical, células madre hematopoyéticas , células madre mesenquimales , células madre adiposas, células madre pluripotentes , células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células derivadas del cordón umbilical, células derivadas de tejidos grasos, células en fracciones vasculares estromales (SVF) , células en los líquidos amnióticos, células en la sangre menstrual, células en el líquido cef lorraquídeo, células en la orina, células madre en la médula ósea, células madre en la sangre periférica, células CD34+, células formadoras de colonias, linfocitos T, linfocitos B, células neurales, células inmune, células dendríticas, megacariocitos , células de la médula ósea inmovilizadas, plaquetas, espermatozoides, huevos, ovocitos, microbios, microorganismos, bacteria, hongos, levaduras, protozoos, virus, orgánulos, núcleos, ácidos nucleicos, mitocondrias , micelas, lxpidos, proteínas, complejos de proteína, restos celulares, parásitos, gotas de grasa, organismos multicelulares, esporas, algas, clusters, agregados de los anteriores, polvos industriales, polímeros, polvos, emulsiones, gotas, partículas de polvo, microesferas , partículas y coloides en la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el alimento comprende partículas que tienen tamaños entre alrededor de 5 µt? y alrededor de 30 µt?.
De acuerdo con algunas modalidades, el método comprende además recolectar partículas de retentado, que incluyen una de las siguientes células, células CD34+, una fracción vascular estromal, células madre, células progenitoras , células formadoras de colonias, células madre hematopoyéticas , células madre adiposas, células madre mesenquimales , células madre amnióticas, células nucleadas, leucocitos, linfocitos, células cancerosas, células tumorales, células dendríticas, células muertas, células vivas, . células divididas, reticulocitos , glóbulos rojos, células grasas y gotas de grasa .
De acuerdo con algunas modalidades, recolectar partículas de retentado comprende recolectar células y' donde más de alrededor del 95% de las células en el retentado son viables .
De acuerdo con algunas modalidades, el método comprende además recolectar filtrado que incluyen una de las siguientes células, células CD34+, una fracción vascular estromal, células madre, células progenitoras, células formadoras de colonias, células madre hematopoyéticas, células madre adiposas, células madre mesenquimales, células madre amnióticas, células plasmáticas, glóbulos rojos, células nucleadas, leucocitos, linfocitos, células cancerosas, células tumorales, células dendríticas, células muertas, 29
De acuerdo con algunas modalidades, el método comprende además recolectar partículas de retentado que incluyen una de las siguientes células, células CD34+, una fracción vascular estromal, células madre, células progenitoras , células formadoras de colonias, células madre hematopoyéticas , células madre adiposas, células madre mesenquimales , células madre amnióticas, células nucleadas, leucocitos, linfocitos, células cancerosas, células tumorales, células dendríticas, células muertas, células vivas, células divididas, reticulocitos , glóbulos rojos, células grasas y gotas de grasa .
De acuerdo con algunas modalidades, recolectar partículas de retentado comprende recolectar células y donde más de alrededor del 95% de las células en el retentado son viables.
De acuerdo con algunas modalidades, el método comprende además recolectar filtrado que incluyen una de las siguientes células, células CD34+, una fracción vascular estromal, células madre, células progenitoras, células formadoras de colonias, células madre hematopoyéticas, células madre adiposas, células madre mesenquimales, células madre amnióticas, células plasmáticas, glóbulos rojos, células nucleadas, leucocitos, linfocitos, células cancerosas, células tumorales, células dendríticas, células muertas, 30
células vivas, células divididas, reticulocitos , glóbulos rojos, células grasas y gotas de grasa.
De acuerdo con algunas modalidades, recolectar el filtrado comprende recolectar células y ' donde más de alrededor del 95% de las células en el filtrado son viables.
De acuerdo con algunas modalidades, el método comprende además proporcionar un dispositivo de filtración que tiene un tamaño de retención significativamente menor que los tamaños de poros físicos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para la reducción del volumen de sangre del cordón umbilical. El método comprende obtener una muestra que comprende sangre del cordón umbilical que tiene al menos una población de células nucleadas, dicha muestra tiene un volumen de muestra. El método comprende además proporcionar un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración incluye un primer receptáculo de recolección, un segundo receptáculo de recolección, un medio de acceso de alimentación y al menos tres unidades de filtración. Cada unidad de filtración tiene una cámara de flujo de microfluidos que incluye una entrada de alimentación, una salida de retentado y una salida de filtrado. Las cámaras de flujo de microfluidos incluyen al menos una dimensión que es perpendicular a la longitud de las mismas que es menor a alrededor de 1 milímetro. La entrada de alimentación está en comunicación fluida con el medio de acceso de alimentación. La salida de retentado está en conexión fluida con el primer receptáculo de recolección. La salida de filtrado está en conexión fluida con el segundo receptáculo de recolección. El método comprende además introducir la muestra en las entradas de alimentación de las unidades de filtración usando los medios de acceso de alimentación, aplicando una fuerza motriz a la muestra, pasando la muestra a través de las cámaras de flujo de microfluidos del dispositivo de filtración, creando condiciones de flujo laminar que dirigen una fracción sustancial del volumen de muestra a la salida de filtrado y una fracción sustancial de dicha al menos una población de células nucleadas hacia la salida de retentado, recolectando una salida de fluido desde la salida de retentado en el primer receptáculo de recolección y recolectando una salida de fluido desde la salida de filtrado en el segundo receptáculo de recolección.
De acuerdo con algunas modalidades, recolectar la salida de fluidos de_ la salida de retentado comprende recolectar más del 70% de las células nucleadas de la muestra en un volumen menor al 25% del volumen de muestra en el primer receptáculo de recolección.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una 32
población de células nucleadas comprende células CD34+ y recolectar la salida de fluidos de la salida de retentado comprende recolectar más del 75% de las células CD34+ de la muestra en el primer receptáculo de recolección.
De acuerdo con algunas modalidades, el método comprende además separar células viables de la muestra, y donde al menos alrededor del 95% de las células viables permanecen viables luego de la separación.
De acuerdo con algunas modalidades, obtener una muestra comprende obtener una muestra que comprende células nucleadas de sangre del cordón umbilical que tienen más de alrededor de 95% de viabilidad, y donde recolectar la salida de fluidos de la salida de retentado comprende recolectar células nucleadas que tienen más de alrededor de 95% de viabilidad.
De acuerdo con algunas modalidades, pasar la muestra a través de las cámaras de flujo de microfluidos comprende pasar más de 10,000,000 glóbulos sanguíneos por segundo a través del dispositivo de filtración.
De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un aparato de filtración de partículas. El aparato de filtración de partículas comprende una entrada de alimentación común, una salida de filtrado común, una salida de retentado común y al menos un dispositivo de alta densidad de módulos. Dicho al menos un dispositivo de alta densidad de 33
módulos incluye una pluralidad de unidades de filtración. Cada una de las unidades de filtración incluye una primera cámara de flujo que incluye al menos una entrada configurada para recibir un alimento que comprende partículas de alimentación en un fluido de alimentación y al menos una salida de retentado, una segunda cámara de flujo que incluye un extremo proximal, un extremo distal que tiene al menos una salida de filtrado y un primer filtro posicionado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo. El primer filtro incluye una primera fila de pilares y una pluralidad de poros definida por los espacios entre los pilares adyacentes de la fila de pilares. Cada poro de la pluralidad de poros incluye un tamaño de poro físico definido por una distancia entre los pilares adyacentes que definen el poro. El aparato de filtración de partículas comprende además medios para mover el alimento a través de una pluralidad de unidades de filtración. La primera cámara de flujo, la segunda cámara de flujo, el filtro y los medios para mover el alimento a través de la pluralidad de unidades de filtración están configurados para tener un tamaño de retención menor que los tamaños de poros eficaces de los poros y para retener una fracción sustancial de partículas de alimentación que tiene un tamaño mayor que el tamaño de retención como retentado en la primera cámara de flujo y pasar una fracción 33
módulos incluye una pluralidad de unidades de filtración. Cada una de las unidades de filtración incluye una primera cámara de flujo que incluye al menos una entrada configurada para recibir un alimento que comprende partículas de alimentación en un fluido de alimentación y al menos una salida de retentado, una segunda cámara de flujo que incluye un extremo proximal, un extremo distal que tiene al menos una salida de filtrado y un primer filtro posicionado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo. El primer filtro incluye una primera fila de pilares y una pluralidad de poros definida por los espacios entre los pilares adyacentes de la fila de pilares. Cada poro de la pluralidad de poros incluye un tamaño de poro físico definido por una distancia entre los pilares adyacentes que definen el poro. El aparato de filtración de partículas comprende además medios para mover el alimento a través de una pluralidad de unidades de filtración. La primera cámara de flujo, la segunda cámara de flujo, el filtro y los medios para mover el alimento a través de la pluralidad de unidades de filtración están configurados para tener un tamaño de retención menor que los tamaños de poros eficaces de los poros y para retener una fracción sustancial de partículas de alimentación que tiene un tamaño mayor que el tamaño de retención como retentado en la primera cámara de flujo y pasar una fracción sustancial del fluido de alimentación como filtrado en la segunda cámara de flujo. Cada una de dicha al menos una entrada de la pluralidad de unidades de filtración está en comunicación fluida con la entrada de alimentación, común. Cada una de dicha al menos una salida de filtrado de la pluralidad de unidades de filtración está en comunicación fluida con la salida de filtrado común. Cada una de dicha al menos una salida de retentado de la pluralidad de unidades de filtración está en comunicación fluida' con la salida de retentado común.
De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además un tubo, una tapa de tubo y una inserción de tubo. El dispositivo de alta densidad de módulos puede estar configurado para montarse dentro de la inserción de tubo. El tubo puede estar configurado para alojar la inserción de tubo. La inserción de tubo puede incluir un depósito de alimentación en conexión fluida con la entrada de alimentación común. La tapa de tubo puede estar configurada para cubrir el tubo y la inserción de tubo .
De acuerdo con algunas modalidades,' el tubo está configurado para recibir el retentado desde el dispositivo de alta densidad de módulos. La inserción de tubo puede incluir además un depósito de filtrado configurado para recibir el 35
filtrado desde el dispositivo de alta densidad de módulos.
De acuerdo con algunas modalidades, el tubo está configurado para recibir el filtrado desde el dispositivo de alta densidad de módulos. La inserción de tubo puede incluir además un depósito de retentado configurado para recibir el retentado desde el dispositivo de alta densidad de módulos.
De acuerdo con algunas modalidades, la inserción de tubo incluye además un depósito de fluido portador configurado para proporcionar un fluido portador a una entrada de al menos una primera cámara de fluido.
. De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además una bolsa de recolección de retentado en conexión fluida con la salida de retentado común y una bolsa de recolección de filtrado en conexión fluida con la salida de filtrado común.
De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además una entrada de fluido portador común en conexión fluida con una entrada de al menos una primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además un receptáculo de fluido portador configurado para proporcionar un fluido portador a la entrada de fluido portador común.
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De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además un adaptador configurado para establecer una conexión fluida entre una bolsa de recolección de alimentación y la entrada de alimentación común.
De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además una bolsa de recolección de alimentación en conexión fluida con la entrada de alimentación común.
De acuerdo con algunas modalidades, la bolsa de recolección de alimentación comprende al menos una aguja configurada para · introducir el alimento en la bolsa de recolección de alimentación.
De acuerdo con algunas modalidades, la bolsa de recolección de alimentación contiene un anticoagulante.
De acuerdo con algunas modalidades, la bolsa de recolección de alimentación contiene un fluido.
De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además un primer pocilio en comunicación fluida con la entrada de alimentación común y configurado como un depósito de fluidos, un segundo pocilio en comunicación fluida con la salida de retentado común y configurado como un depósito de fluidos, y un tercer pocilio en comunicación fluida con la salida de filtrado común y 37
configurado como un depósito de fluidos.
De acuerdo con algunas modalidades, el primer pocilio, el segundo pocilio y el tercer pocilio están configurados en un formato de placas multipocillo .
De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además un cuarto pocilio en comunicación fluida con la entrada de al menos una primera cámara de . flujo y configurado para proporcionar un fluido portador a al menos una primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el aparato de filtración de partículas comprende además una tapa configurada para cerrar al menos uno del primer pocilio, el segundo pocilio y el tercer pocilio.
De acuerdo con algunas modalidades, la tapa comprende una lámina de aluminio sustancialmente impermeable al aire y vapor y configurada para sellar dicho al menos uno del primer pocilio, el segundo pocilio y el tercer pocilio.
De acuerdo con algunas modalidades, al menos uno del primer pocilio, el segundo pocilio y el tercer pocilio contiene un fluido.
De acuerdo con algunas modalidades, cada unidad de filtración de la pluralidad de unidades de filtración tiene un volumen de retención de menos de 1 microlitro.
• 38
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de alta densidad de módulos tiene una densidad de unidad de filtración de más de 500 unidades de filtración por centímetro cúbico.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de alta densidad de módulos incluye más de 30 unidades de filtración.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de alta densidad de módulos tiene una índice de eficiencia de diseño de más de alrededor de 0.5 mm"2.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de alta densidad de módulos tiene una índice de eficiencia de diseño de más de alrededor de 5 mm"2.
De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un dispositivo de filtro. El dispositivo de filtro comprende una primera cámara de flujo que incluye al menos una entrada configurada para introducir un alimento que comprende partículas y al menos una salida de retentado configurada para recolectar un retentado del alimento. El dispositivo de filtro comprende además una segunda cámara de flujo que incluye un primer extremo y al menos una salida de filtrado, dicha al menos una salida de filtrado está configurada para recolectar un filtrado. El dispositivo de filtro comprende además un primer filtro. El primer filtro 39
incluye una pluralidad de poros que tienen un tamaño de poro físico y un tamaño de retención menor al tamaño de poro físico. El primer filtro está colocado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo. La primera cámara de flujo, la segunda cámara de flujo y el primer filtro están configurados para facilitar condiciones de flujo que aumentan sustancialmente la tasa de retención de partículas menor al tamaño de poro físico y mayor al tamaño de retención.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro está configurado para satisfacer el "criterio de expansión de la cámara de filtrado"..
De acuerdo con algunas modalidades, un ángulo entre una línea tangente de la pared lateral de la segunda cámara de flujo y una línea tangente del primer filtro es menor a alrededor de 5 grados .
De acuerdo con algunas modalidades, el tamaño de retención es menor a alrededor de 90 por ciento del tamaño de poro físico de los poros.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro está configurado para hacer fluir un flujo a través de cada poro a una relación de flujo volumétrico menor a alrededor de 3 por ciento de un tasa de flujo volumétrico en dicha al menos una entrada de la primera cámara de flujo. 40
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro tiene una relación entre longitud y ancho mayor a alrededor de 10.
De acuerdo con algunas modalidades, la primera cámara de flujo comprende una primera profundidad sustancialmente constante. La segunda cámara de flujo puede tener una segunda profundidad sustancialmente constante y la segunda cámara de flujo se puede expandir en ancho desde el primer extremo de la segunda cámara de flujo hacia dicha al menos una salida de filtrado de la segunda cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro está configurado para hacer fluir un flujo a través de la primera cámara a una velocidad de flujo sustancialmente constante .
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro está configurado para hacer fluir un flujo a través de la segunda cámara a una velocidad de flujo sustancialmente constante .
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro está configurado para hacer fluir un flujo a través de sustancialmente todos los poros a una velocidad de flujo sustancialmente idéntica.
De acuerdo con algunas modalidades, el primer filtro comprende una fila de pilares, donde los poros del primer 41
filtro comprenden pasajes de fluido entre los pilares adyacentes de la fila de pilares y donde la fila dé pilares comprende no menos del 10 por ciento de todos los pilares presentes en el dispositivo.
De acuerdo con algunas modalidades, la primera cámara comprende además al menos una entrada de fluido portador distinto de dicha al menos una entrada y está configurada para introducir un fluido portador en la primera cámara de fluj o .
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro está libre de todo borde dominante que tiene un radio de curvatura menor a alrededor de 0.5 µ??, en una trayectoria de flujo a través del dispositivo.
De acuerdo con algunas modalidades, un primer subconjunto de los poros tiene un tamaño de poro físico diferente a un segundo subconjunto de los poros.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una entrada de filtrado de la segunda cámara de flujo está configurada para recolectar el filtrado que pasa a través del primer subconjunto de poros y donde la segunda cámara de flujo comprende una segunda salida de filtrado configurada para recolectar l filtrado que pasa a través del segundo subconjunto de poros.
42
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro comprende además un segundo filtro y una tercera cámara de flujo, donde el segundo filtro está colocado entre la primera cámara de flujo y la tercera cámara de flujo y donde la tercera cámara de flujo comprende al menos una salida .
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro tiene una relación entre longitud y ancho mayor a alrededor de 5.
De acuerdo con algunas modalidades, el primer filtro comprende una primera fila de pilares. Los poros del primer filtro pueden comprender pasajes de fluido entre los pilares adyacentes de la primera fila de pilares. El segundo filtro puede comprender una segunda fila de pilares. Los poros del segundo filtro pueden comprender pasajes de fluido entre los pilares adyacentes de la segunda fila de pilares. La primera fila de pilares y la segunda fila de pilares pueden comprender no menos del 10 por ciento de todos los poros presentes en el dispositivo de filtro.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro es sustancialmente simétrico alrededor de un plano de espejo que pasa a través dé un centro de la primera cámara de flujo .
43
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro . comprende además un segundo filtro y una tercera cámara de flujo, donde el segundo filtro está colocado entre la segunda cámara de flujo y la tercera cámara de flujo y donde la tercera cámara de flujo comprende al menos una entrada y al menos una salida.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro comprende además un segundo filtro, una tercera cámara de flujo y una cuarta cámara de flujo, donde el segundo filtro está colocado entre la tercera cámara de flujo y la cuarta cámara de flujo, donde la tercera cámara de flujo comprende al menos una entrada y al menos una salida, y donde la cuarta cámara comprende al menos una salida.
De acuerdo con algunas modalidades, el dispositivo de filtro tiene menos que alrededor de 6,000 pilares.
De acuerdo con algunas modalidades, el primer filtro y el segundo filtro comprenden no menos de 10 por ciento de los poros incluidos en el dispositivo.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una entrada de la tercera cámara de flujo está en conexión fluida con dicha al menos una salida de filtrado de la segunda cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una entrada de la tercera cámara de flujo está en conexión fluida con dicha al menos una salida de retentado de la primera cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una entrada de la tercera cámara de flujo está en conexión fluida con dicha al menos una salida de la primera cámara de flujo y con dicha al menos una salida de la segunda cámara de flujo.
De acuerdo con algunas modalidades, la tercera cámara comprende además al menos una entrada de fluido portador distinto de dicha al menos una entrada y está configurada para introducir un fluido portador.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un retentado del primer filtro. La tercera cámara de flujo puede comprender además un segundo salida distinta de dicha al menos una salida. La segunda salida de la tercera cámara de flujo puede estar configurada para recolectar un retentado del segundo filtro.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un retentado del primer filtro y un retentado del segundo filtro.
De acuerdo con algunas modalidades, dicha al menos una salida de la tercera cámara de flujo está configurada para recolectar un retentado del primer filtro y un retentado del 45
segundo filtro. La tercera cámara de flujo puede comprender además una segunda salida distinta de dicha al menos una salida. La segunda salida de la tercera cámara de flujo puede estar . configurada para recolectar un filtrado del primer filtro.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos adjuntos no pretenden estar a escala y se •puede reducir la cantidad de elementos (por ejemplo, la cantidad de pilares) de lo que puede estar présente en una modalidad real para garantizar la legibilidad. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en distintas figuras se representa por medio de un número similar. Con fines de claridad, no todos los componentes se pueden etiquetar en cada dibujo. En los dibujos :
Las Figuras 1A-1G son diagramas esquemáticos que muestran diversos métodos para el aislamiento de partículas. La Figura 1A ilustra la exclusión de una partícula grande de un pequeño poro. La Figura IB ilustra l deformación de una partícula grande que entra parcialmente en un poro pero es incapaz de meterse por el poro. La Figura 1C muestra una partícula que entra a través de una abertura estrecha y que queda atrapada en el poro. La Figura ID muestra partículas atrapadas en poros. La Figura 1E muestra la falta de exclusión por tamaño. En este diagrama, una partícula atraviesa un poro dado que la partícula es más pequeña que el poro. La Figura 1F muestra otra falta en la exclusión por tamaño. En este caso, la partícula atraviesa un poro dado que puede deformarse y meterse por el poro. La Figura 1G. ilustra otra falta en la exclusión por tamaño. En este caso, las partículas no logran filtrarse dado que su trayectoria de flujo no logra encontrar poros de restricción física.
Las Figuras 2A y 2B son diagramas esquemáticos. La Figura 2A muestra el efecto de exclusión de flujo observado en. microcapilares de la circulación sanguínea. La Figura 2B muestra un posible mecanismo para la exclusión de flujo.
Las Figuras 3A-3C son diagramas esquemáticos que ilustran los principios de la exclusión de flujo en una modalidad de la presente descripción.
La Figura 4 es un gráfico que muestra un tamaño de poro eficaz como función del flujo a través de un poro. El tamaño de poro eficaz se calculó mediante estimulación de dinámica de fluidos por computadora.
Las Figuras 5A-5F son diagramas esquemáticos que muestran modalidades de módulo de filtro. La Figura 5A ilustra un diagrama esquemático de vista superior. La Figura 5B proporciona una vista montada en tres dimensiones. La 47
Figura 5C proporciona una vista detallada en tres dimensiones. La Figura 5D proporciona una vista en tres dimensiones que muestra pilares con una relación de aspecto menor a uno. La cubierta de la modalidad de módulo de filtro no se muestra. La Figura 5E proporciona una vista en tres dimensiones que muestra pilares con una relación de aspecto mayor a uno. La cubierta de la modalidad no se muestra. La Figura 5F proporciona una vista en tres dimensiones que muestra pilares cónicos. La cubierta de la modalidad no se muestra.
Las Figuras 6A y 6B son diagramas esquemáticos que proporcionan vistas superiores de dos modalidades de módulo de filtro.
Las Figuras 7A-7B son diagramas esquemáticos que ilustran modalidades de módulo de filtro. La Figura 7A proporciona una vista superior de una modalidad de módulo de filtro. La Figura 7B proporciona una vista superior de una modalidad de módulo de filtro. La Figura 7C es un gráfico que ilustra los tamaños de poro eficaces de módulos de filtro mostrados en la Figura 7A. La Figura 7D es un gráfico que ilustra los tamaños de poro eficaces de módulos de filtro mostrados en la Figura 7B.
La Figura 8 es un diagrama esquemático que proporciona µna vista en tres dimensiones de una modalidad de módulo de 48
filtro con diferentes tamaños de poro. L cubierta del módulo no se muestra.
Las Figuras . 9A-9H son diagramas esquemáticos que proporcionan vistas superiores de porciones de modalidades de módulo de filtro. La Figura 9A ilustra una cámara de filtrado ondulada. Las Figuras 9B-9H muestran diversas formas transversales de pilares.
Las Figuras 10A-10C son diagramas esquemáticos que muestran un módulo de filtro que tiene una cámara de filtrado más superficial que su cámara de retentado. Las Figuras 10A y 10B son una vista superior y una vista en tres dimensiones, respectivamente. La cubierta del módulo no se muestra. La Figura 10C ilustra una partícula que se mueve en el módulo.
Las Figuras 11A y 11B son dos diagramas esquemáticos que muestran una vista montada en tres dimensiones y una vista detallada en tres dimensiones de un módulo de filtro que comprende un filtro de análisis.
Las Figuras 11C y 11D son dos diagramas esquemáticos que muestran una vista montada en tres dimensiones y una vista detallada en tres dimensiones de un módulo de filtro que comprende un filtro de membrana porosa.
La Figura 12 es un diagrama esquemático que muestra una vista superior de un módulo de filtro.
49
La Figura 13 es un diagrama esquemático que muestra una vista superior de un módulo de filtro empleando un flujo portador .
Las Figuras 14A y 14B son diagramas esquemáticos que muestran vistas superiores de dos módulos de doble filtro.
Las Figuras 15A y 15B muestran vistas superiores de dos módulos de doble filtro.
Las Figuras 16A y 16B muestran vistas superiores de dos módulos de varios filtros.
Las Figuras 17A-17D son diagramas esquemáticos. La
Figura 17A proporciona una vista superior de un módulo de filtros ' en cascada que comprende dos módulos de filtro sustancialmente idénticos. La Figura 17B proporciona una vista superior de un módulo de filtros en cascada que comprende dos módulos de doble filtro sustancialmente idénticos. Las Figuras 17C y 17D proporcionan vistas superiores de dos módulos de filtros en cascada que comprenden cada uno dos módulos de doble filtro.
Las Figuras 18A-18C son diagramas esquemáticos que proporcionan vistas superiores de módulos de filtros en cascada que comprenden diferentes módulos de filtro. La Figura 18D es un gráfico que muestra características de filtración cualitativas.
50 '
Las Figuras 19A y 19B muestran vistas superiores de módulos de filtros en cascada que comprenden diferentes módulos de doble filtro.
Las Figuras 20A y 20B son diagramas esquemáticas. La Figura 20A proporciona una vista superior de un módulo de filtros en cascada que comprende dos módulos de filtro diferentes. La Figura 20B proporciona una vista superior de un módulo de filtros en cascada simplificado. La Figura 20C es un gráfico que muestra características de filtración cualitativas.
Las Figuras 21A y 21B son diagramas esquemáticos que proporcionan vistas superiores de dos módulos de doble filtro.
Las Figuras 22A y 22B son diagramas esquemáticos que proporcionan vistas superiores de dos configuraciones de módulo de doble filtro en cascada.
Las Figuras 23A-23C son diagramas esquemáticos que proporcionan vistas superiores de tres configuraciones de módulo de doble filtro. La Figura 23D es un diagrama esquemático que muestra un módulo de varios filtros. La Figura 23E es un diagrama esquemático que muestra un módulo de filtros en cascada que comprende dos módulos de doble filtro mostrados en la Figura 23C.
Las Figuras 24A-24F son diagramas esquemáticos. Las Figuras 24A-24D y 24F proporcionan vistas superiores de dispositivos de alta densidad de módulos. La Figura 24E proporciona una vista en tres dimensiones de un dispositivo de alta densidad de módulos. La cubierta del dispositivo no se muestra.
La Figura 25 es un diagrama esquemático que muestra una vista montada en tres dimensiones y una vista detallada en tres dimensiones de un dispositivo que comprende una pila de cuatro dispositivos de alta densidad de módulos y una cubierta.
Las Figuras 26A-26E son diagramas esquemáticos de un cartucho. La Figura 26A es un diagrama esquemático que muestra una vista montada en tres dimensiones del cartucho. La Figura 26B es un diagrama esquemático que muestra una vista frontal del cartucho. La Figura 26C es un diagrama esquemático que muestra una vista lateral del cartucho. La Figura 26D es un diagrama esquemático que muestra una vista detallada en tres dimensiones del cartucho. La Figura 26E es un diagrama esquemático que muestra una vista detallada lateral del cartucho.
Las Figuras 27A-27C son diagramas esquemáticos de un sistema de bolsa.
La Figura 28 es un diagrama esquemático de un sistema de bolsa.
Las Figuras 29A y 29B son diagramas esquemáticos que muestran respectivamente una vista montada en tres dimensiones y una vista detallada en tres dimensiones de un sistema de tubos.
Las Figuras 30A-30G son diagramas esquemáticos de una inserción de tubos. La Figura 30A es un diagrama esquemático que muestra una vista en tres dimensiones de la inserción de tubos. La Figura 30B es un diagrama esquemático que muestra una vista transversal de la inserción de tubos. Las Figuras 30C, 30D, 30E, 30F y 30G son diagramas esquemáticos que muestran respectivamente una vista superior, una vista frontal, una vista lateral, una vista posterior y una vista inferior de la inserción de tubos.
Las Figuras 31A-31C son diagramas esquemáticos de un sistema de placa. La Figura 31A es un diagrama esquemático que muestra una vista en tres dimensiones del sistema de placa. La Figura 31B es un diagrama esquemático que muestra una vista detallada en tres dimensiones del sistema de placa. La Figura 31C es un diagrama esquemático que muestra una vista lateral del sistema de placa.
Las Figuras 32A-32D son diagramas esquemáticos de un sistema de placa. La Figura 32A es un diagrama esquemático 53
que muestra una vista en tres dimensiones del sistema de placa. Las Figuras 32B, 32C y 32D son diagramas esquemáticos que muestran respectivamente una vista superior, una vista lateral y una vista frontal del sistema de placa.
La Figura 33 es una tabla que muestra resultados experimentales del aislamiento de leucocitos de sangre periférica usando un dispositivo de alta densidad de módulos.
Las Figuras 34A-34B son histogramas que muestran distribuciones de tamaños de leucocitos (WBC) , eritrocitos (RBC) y plaquetas (PLT) en muestras de sangre y en los retentados usados en un experimento donde se aislan los linfocitos de la sangre periférica. La Figura 34C es una tabla que muestra conteos de diversos tipos celulares. La Figura 34D es una tabla que muestra el rendimiento de un dispositivo de alta densidad de módulos.
Las Figuras 35A-35C son tablas que muestran resultados experimentales de reducción de volumen de sangre de cordón umbilical usando un dispositivo de alta densidad de módulos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Esta descripción no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de los componentes establecidos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La descripción es capaz de otras modalidades y de ponerse en práctica o realizarse de diferentes formas. Además, la fraseología y terminología se usan en la presente con el fin de descripción y no se deberán entender como limitantes. El uso de "que incluye", "que comprende", "que tiene", "que contiene", "que implica" y variaciones de los mismos en la presente pretenden comprender los ítems listados de ahí en adelante y equivalentes de los mismos así como ítems adicionales.
Aspectos y modalidades de la presente descripción se dirigen a sistemas de filtración que pueden ser útiles para la filtración de partículas y a métodos para el funcionamiento de dichos sistemas de filtración.
Aspectos y modalidades de la descripción se basan, al menos en parte, en el descubrimiento de un dispositivo que emplea la exclusión de flujo y proporciona alta capacidad, alto rendimiento, poco daño de partículas, bajo cizallamiento y filtración resistente a la obstrucción de partículas y muestras biológicas. Además, la presente descripción proporciona un método y un dispositivo que se puede fabricar fácilmente como un dispositivo compacto usando materiales económicos que incluyen, de modo no taxativo, silicio y plásticos.
Los intervalos proporcionados en la presente hacen referencia a todos los valores dentro del intervalo. Por 55
ejemplo, un intervalo de 1 a 50 se entiende que incluye cualquier número, combinación de números o sub- intervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 O 50.
Salvo que se especifique o resultara obvio lo contrario, tal como se usa en la presente, el término "o" se entiende es abarcativo. Salvo que se especifique o resultara obvio lo contrario, tal como se usa en la presente, los términos "un", "una" y "la/el" comprenden singulares y plurales.
Salvo que se especifique o resultara obvio lo contrario, tal como se usa en la presente, el término "alrededor" se entiende comprendido en un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar del promedio. Alrededor se puede entender comprendido en 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, .4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% o 0.01% del valor establecido. Salvo que resultara evidente por el contexto, los valores numéricos proporcionados en la presente se modifican mediante el término alrededor.
La enumeración de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable en la presente incluye 56
definiciones de esa variable como cualquier grupo simple o combinación de grupos listados. La enumeración de una modalidad para una variable o aspecto en la presente incluye esa modalidad como cualquier modalidad simple o en combinación con cualquier otra modalidad o parte de la misma.
Todas las composiciones o métodos proporcionados en la presente se pueden combinar con uno o más de cualquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en la presente .
El término "partículas" tal como se usa en la presente incluye, de modo no taxativo, células, glóbulos sanguíneos, células de sangre del cordón umbilical, células de médula ósea, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, células epiteliales, células madre, células cancerosas, células tumorales, células tumorales circulantes, células progenitoras , precursores dé células, células madre de sangre del cordón umbilical, células madre hematopoyéticas , células madre mesenquimales , células madre adiposas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células derivadas del cordón umbilical, células derivadas de tejidos grasos, células en fracciones vasculares estromales (SVF) , células en los líquidos amnióticos, células en la sangre menstrual, células en el líquido cefalorraquídeo, células en la orina, células madre 57
en la médula ósea, células madre en la sangre periférica, células CD34+, células formadoras de colonias, linfocitos T, linfocitos B, células neurales, células inmunes, células dendríticas, megacariocitos , células de la médula ósea inmovilizadas, células madre de gelatina de Wharton, células eucariotas, células procariotas, células animales, plaquetas, espermatozoides, huevos, ovocitos, microbios, microorganismos, bacteria, hongos, levaduras, protozoos, virus, orgánulos, núcleos, ácidos nucleicos, mitocondrias , micelas, lípidos, proteínas, complejos de proteína, restos celulares, parásitos, gotas de grasa, organismos multicelulares, esporas, algas, clusters, agregados de los anteriores, así como otras partículas no biológicas suspendidas en fluido, tal como polvos industriales, polímeros, polvos, emulsiones, gotas, partículas de polvo, microesferas y coloides. Las partículas pueden ser rígidas o deformables y pueden tener una variedad de tamaños y formas. Las partículas pueden variar en tamaño, por ej . , pueden tener una dimensión máxima de alrededor de 50 nm a alrededor de 1 mm. La forma de las partículas puede ser, de modo no taxativo, rectangular, esférica, forma de disco, forma de caja, forma de varilla, espiral o cadenas o agregados de los anteriores. Modalidades de la presente descripción pueden ser útiles para la filtración de partículas que son deformables, 58
frágiles o vulnerables a gran estrés de cizallamiento .
Las "propiedades mecánicas" incluyen, de modo no taxativo, dimensiones físicas, tamaño, forma, defbrmabilidad, flexibilidad, elasticidad, densidad, viscosidad, rigidez y las distribuciones espaciales o tiempo de respuesta de los rasgos anteriores .
El término "exclusión por tamaño", tal como se usa en la presente, comprende prevenir o restringir la entrada o el pasaje mediante un bloqueo físico. Una modalidad de la exclusión por tamaño es usar poros pequeños 002 para prevenir que las grandes partículas no deformables 001 entren a los poros y pasen a través del filtro 003 (Fig. 1A) . Otra modalidad de la exclusión por tamaño es usar una pequeña abertura para prevenir que una partícula deformable 001 se meta en y pase a través de la abertura 002 (Fig. IB) . Aun otra modalidad de la exclusión por tamaño se muestra en la Fig. 1C donde una partícula 001 puede entrar una abertura ancha de un poro 002 y atascarse en la parte angosta del poro 002. Aun otra modalidad de la exclusión por tamaño se muestra en la Fig. ID. Una partícula 001 puede entrar en un poro 002 y quedarse atrapado dentro del filtro 003.
El término "exclusión por tamaño", tal como se usa en la presente, también comprende "restricción física". Las Fig. 1E, 1F y 1G muestran ejemplos donde las partículas no se 59
excluyen por tamaño ni se restringen físicamente mediante un filtro. Una partícula 001 puede ser muy pequeña para ser excluida por los poros 002 (Fig. 1E) . Una partícula 001 también puede ser tari deformable que se meta a través de un poro 002 bajo una fuerza motriz (Fig. 1F) . En la Fig. 1G, las partículas 001 se dirigen mediante una fuerza tangencial 004 de manera tal que no se muevan dentro de las partes angostas de los poros 002 que pueden de otra forma atrapar las partículas. Las partículas en las Fig. 1E, 1F y 1G no se consideran excluidos por tamaño o restringidos físicamente mediante el filtro.
El término "filtración", tal como se usa en la presente, comprende en general, de modo no taxativo, separación de partículas, fraccionamiento, aislamiento de partículas, lavado, concentración, enriquecimiento, purificación y/o intercambio 'de amortiguador en un dispositivo de separación de partículas con o sin el uso de un filtro. "Filtración" también se usa para referirse a la eliminación o retención parcial o completa de una o más poblaciones de partículas. El término "filtración", tal como se usa en la presente, también incluye aplicaciones específicas como separación celular, aislamiento dé células madre, leucorreducción, aislamiento de leucocitos, aislamiento de células cancerosas, reducción del volumen de 60
sangre del cordón umbilical, separación de plasma y generación de fracciones vasculares estromales (SVF) .
Un "filtro", tal como se usa en la presente, se refiere, de modo no taxativo, a una estructura que comprende múltiples aberturas o pasajes de fluidos, llamados "poros". El término "poro", tal como se usa en la presente, comprende una abertura o un pasaje de fluidos, por ejemplo, en un filtro. La forma transversal de un poro puede ser, de modo no taxativo, circular, rectangular, redondo, poligonal, irregular, larga y angosta o forma de hendidura. El término "poro", tal como se usa en la presente incluye, de modo no taxativo, el espacio entre pilares. Tal como se usa en la presente, una modalidad de un poro es el espacio entre dos pilares adyacentes en un canal de fluidos. Otra modalidad de un "poro" es un vacío entre una estructura basculante y un techo del canal de fluidos.
Se puede usar un filtro para permitir parcial o totalmente el pasaje de determinada partículas y/o anular o reducir un flujo de otras partículas. Tal como se usa el término en la presente "filtros" no se limita a tamices donde las partículas están bloqueadas o separadas en función de la exclusión por tamaño. Tal como se usa en la presente, una modalidad de un filtro comprende una estructura física que incluye obstáculos y poros. Otra modalidad de un filtro 61
comprende una estructura física que separa partículas usando flujos de bifurcación y poros más grandes que las partículas de retentado. Aun otra modalidad de un filtro comprende una estructura física que retiene partículas más pequeñas que las aberturas de poros de la estructura física usando fuerzas de flujo o fuerzas dinámicas de fluidos. Aun otra modalidad de un filtro que comprende un patrón hidrofílico en una superficie hidrofóbica para crear "poros" o vías de pasaje de fluidos para soluciones acuosas.
"Filtrar", tal como se usa en la presente,, significa realizar la filtración usando un filtro.
El término "retentado", tal como se usa en la presente, comprende partículas que están retenidas mediante un filtro o que no pasan a través del filtro. "Retentado", tal como se usa en la presente, puede incluir también el fluido que comprende partículas retenidas. "Retentado", tal como se usa. en la presente, también · se puede referir a la producción de fluidos o partículas que comprende partículas retenidas mediante un filtro en una modalidad de la presente descripción. "Retentado", tal como se usa en la presente, también se puede referir a la producción de fluidos que comprende partículas de interés usando un dispositivo de separación que puede o no comprender una estructura de filtro.
El término "filtrado", tal como se usa en la presente, comprende partículas que pasan a través de un filtro. "Filtrado", tal como se usa¦ en la presente, también puede comprender el fluido que contiene las partículas que pasan a través del filtro. "Filtrado", tal como se usa en la presente, también se puede referir a la producción de fluidos o partículas que comprende partículas que pasan a través de un filtro en una modalidad de la presente descripción. "Filtrado", tal como se usa en la presente, también se puede referir a la producción de fluidos que comprende un fluido donde las partículas de interés se eliminan total o parcialmente usando un dispositivo de separación que puede o no comprender una estructura de filtro.
o
El término "alimento", tal como se usa en la presente, comprende partículas que deben ser procesadas mediante un proceso de filtración o partículas que entran al dispositivo de filtración. El término "alimento" también puede comprender un fluido que contiene las partículas para ser procesadas mediante el proceso de filtración. El término "alimento", tal como se usa en la presente, puede incluir, de modo no taxativo, partículas, sangre, sangre del cordón umbilical, suero, tejido graso, tejido graso digerido, fracciones vasculares estromales, líquidos amnióticos, sangre menstrual, líquidos cefalorraquídeos, leche, médula ósea, orines y otros 63
fluidos corporales.
El término "tasa de retención" de una partícula tal como se usa en la presente se refiere a la probabilidad de que . la partícula esté retenida por un filtro incorporado en un dispositivo. El término "tasa de retención" de una población de partículas, tal como se usa en la presente, se refiere a la proporción de la población de partículas que se recolecta como el retentado de un dispositivo. El término "tasa de retención" de un fluido, tal como se usa en la presente, también se refiere a la proporción de fluido que se recolecta como el retentado mediante un dispositivo. El dispositivo de la presente puede comprender un filtro, un módulo de filtración, una unidad de filtración o un sistema de filtración. Por ejemplo, la "tasa de retención" de una población de partículas sustancialmente uniforme se puede calcular como la relación entre la cantidad de partículas en el retentado resultante y la cantidad de partículas en el alimento que se procesan. La tasa de retención de determinada población de partículas se puede referir a la proporción de dicha población en el alimento que se recolecta como el retentado en un proceso de filtración. La "tasa de retención" también se puede referir al "rendimiento de recuperación" o "remanente" .
64
El término "tamaño de poro físico", tal como se usa en la presente, se refiere al tamaño del espaciado físico de un poro. En la práctica, el "tamaño de poro físico" de un poro se puede medir esencialmente como el diámetro máximo de una esfera no deformable, por ej . , una microesfera polimérica que puede pasar a través del poro sin restricción física o exclusión por tamaño sustancial bajo configuraciones de filtración "bloqueadas". Por ejemplo, un poro que comprende el espaciado de dos pilares que están separados por 10 µ?? en un canal de microfluidos profundo de 50 µ?? tiene un tamaño de poro físico de 10 µt?. De manera similar, un poro que comprende un agujero circular de 5 pm de diámetro en una membrana tiene un tamaño de poro físico de 5 m. Si un poro comprende una hendidura, el tamaño de poro físico es sustancialmente el ancho de la hendidura. La filtración bloqueada se describe ampliamente en la siguiente referencia: Zeman, L. J. et ál . "Microfiltration and Ultrafiltration" Marcel Dekker, Inc., ISBN 0-8247-9735-3, p.328-331 (1996), la descripción detallada de la filtración bloqueada que se incorpora a la presente mediante esta referencia.
El "tamaño de poro eficaz" de un poro, tal como se usa en la presente, se refiere al diámetro mínimo de una esfera no deformable, por ej . , un a microesfera polimérica que se puede retener sustancialmente mediante el poro en condiciones 65
de flujo de interés. Un tamaño de poro eficaz se puede medir y determinar de forma experimental. Por ejemplo, una tasa de retención de referencia por un poro se puede establecer usando esferas pequeñas .no deformables que rastrean sustancialmente las líneas de flujo al fluir a través del poro en condiciones de flujo de interés sin exclusión. Las esferas más grandes no deformables se pueden retener debido a la exclusión de flujo mediante el poro a mayores tasas de retención que el punto de referencia en sustancialmente las mismas condiciones de funcionamiento. El diámetro de la esfera más pequeña no deformable que se puede retener a una tasa de retención sustancialmente mayor que el punto de referencia, por ej . , 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 98%, 99% o 100% mayor que el punto de referencia, se le hace referencia como "tamaño de poro eficaz" del poro. Al medir el tamaño de poro eficaz se prefiere que las partículas usadas tengan las siguientes características: (a) las partículas son sustancialmente esféricas; (b) las partículas son sustancialmente no deformables y rígidas; (c) las partículas se suspenden en suspensiones de partículas sustancialmente simples; (d) la suspensión de partículas se diluye y no hay sustancialmente interacción entre partículas; (e) las partículas no se instalan sustancialmente durante períodos de tiempo de interés; (f) las partículas no se pegan o atascan 66
sustancialmente al canal de fluido las superficies de filtro y (g) las partículas no interactúan entre sí o con el canal de fluidos, las superficies de filtro o los poros debido a carga eléctrica, adherencia, afinidad o fuerzas magnéticas. Se entiende que las características de partícula anteriores no pretenden ser taxativas.
El "tamaño de retención" de un dispositivo, tal como se usa en la presente, se refiere al diámetro mínimo de una esfera no deformable, por ej . , una microesfera polimérica, que tiene una tasa de retención sustancialmente mayor a, por ejemplo, alrededor de 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 98%, 99% o 100% mayor que la tasa de retención de un fluido procesado usando el dispositivo en sustancialmente las mismas condiciones de funcionamiento. El tamaño de retención de un dispositivo se puede medir y determinar de forma experimental. Por ejemplo, la tasa de retención de un fluido se puede establecer como punto de referencia usando esferas pequeñas no deformables que rastrean sustancialmente el movimiento del flujo del fluido en una serie de condiciones de funcionamiento. Las esferas más grandes no deformables mezcladas en el fluido pueden tener una mayor tasa de retención que el punto de referencia en sustancialmente las mismas condiciones de funcionamiento. El diámetro de la esfera más pequeña no deformable que tiene una tasa de 67
retención sustancialmente mayor que el punto de referencia, por ej . , alrededor de 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, ' 98%, 99% o 100% mayor que el punto de referencia, se le caracteriza como "tamaño de retención" del dispositivo. El dispositivo de la presente puede comprender un filtro, un módulo de filtración, una unidad de filtración o un sistema de filtración. Al medir el tamaño de retención, las partículas usadas pueden tener las siguientes características: (a) las partículas son sustancialmente esféricas; (b) las partículas son sustancialmente no deformables y rígidas; (c) las partículas se suspenden en suspensiones de partículas sustancialmente simples; (d) la suspensión de partículas se diluye y no hay sustancialmente interacción entre partículas; (e) las partículas no se instalan sustancialmente durante períodos de tiempo de interés; (f) las partículas no se pegan o atascan sustancialmente al canal de fluido o las superficies de filtro y (g) las partículas no interactúan entre sí o con el canal de fluidos, las superficies de filtro o los poros debido a carga eléctrica, adherencia, afinidad o fuerzas magnéticas. Se entiende que las características de partícula anteriores no pretenden ser taxativas .
El término "exclusión de flujo", tal como se usa en la presente, se refiere al uso de condiciones de flujo de fluido alrededor de un poro para lograr un tamaño de poro eficaz 68
sustancialmente menor al tamaño de poro físico. El término "exclusión de flujo", tal como se usa en la presente, también se refiere al uso de configuraciones de' flujo de fluido alrededor de un filtro para lograr un tamaño de retención sustancialmente menor al tamaño de poro físico de los poros que constituyen el filtro.
Se apreciará que las definiciones anteriores pretenden expresar el espíritu de la presente descripción y no pretenden ser taxativos .
Dispositivo de filtración de partículas
Los aspectos y las modalidades de la presente descripción proporcionan un dispositivo para la filtración de partículas que comprende (a) una primera cámara de flujo que tiene al menos una entrada y al menos una salida; (b) una segunda cámara de flujo que tiene al menos una salida y (c) un filtro que comprende una pluralidad de poros, por ejemplo, al menos 10 poros. Allí, se coloca el poro entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo y tiene un tamaño de poro físico de entre alrededor de 10 nm y alrededor de 10 mm. La primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo se configuran de manera tal que el tamaño de poro eficaz de los poros de filtro sea sustancialmente más pequeño, por ejemplo, hasta alrededor de un 95% más pequeño que el tamaño de poro físico. El dispositivo se puede fabricar a partir de materiales que incluyen, por ejemplo, silicio, vidrio o plástico. Algunas modalidades se pueden construir de manera tal que las partículas no se encuentren con bordes agudos reduciendo el daño.
Un dispositivo de filtración de partículas de acuerdo con aspectos y modalidades de la presente descripción se puede configurar de diferentes maneras. En algunas modalidades, la primera cámara de flujo tiene al menos una entrada que se puede usar para introducir un fluido portador. Otras modalidades comprenden un segundo filtro y una tercera cámara de flujo, donde dicho segundo filtro se coloca entre dicha primera cámara de flujo y dicha tercera cámara de flujo, y donde dicha tercera cámara de flujo comprende al menos una salida. Aun otras modalidades comprenden un segundo filtro y una tercera cámara de flujo que tienen al menos una salida de manera tal que el segundo filtro esté colocado entre la segunda cámara de flujo y una tercera cámara de flujo .
En algunas modalidades, las partículas se dirigen a través del dispositivo mediante al menos uno de los siguientes: un flujo de fluido, un flujo hidrodinámico, una pérdida de presión, una presión hidrodinámica, una fuente de presión, un vacío, una altura de cabezal, gravedad, una fuerza centrífuga, un campo eléctrico, un campo 70
electroforético, una fuerza electrocinética, una fuerza electroosmótica, una acción capilar o una combinación de los anteriores. En algunas modalidades, las partículas ("partículas de alimentación") pasan o se procesan a través del dispositivo a una tasa de. al menos alrededor de 100 partículas de alimentación, por ej . , al menos 102 , 103, 104 , 105, 1?6, 107, 108 , 1010, 1012 o 1015 por segundo. En algunas modalidades, el dispositivo tiene un volumen de retención menor a 500 ni, 200 ni, 100 ni, 50nl, 20nl o 10 ni. En algunas modalidades, las partículas se someten a estrés de cizallamiento que no daña las partículas.
Las modalidades del filtro se pueden formar de diferentes formas. En algunas modalidades, el filtro tiene una o más filas de pilares o salientes. Los pilares o salientes pueden tener una variedad de formas y tamaños. En otras modalidades, hay al menos dos filas de pilares o salientes. Otras modalidades de la descripción proporcionan un filtro formado a partir de una membrana que comprende poros. Aun otras modalidades de la descripción proporcionan un filtro formado a partir de un filtro de rejilla. En algunas modalidades, el filtro se construye de manera tal que las partículas no se encuentren con bordes agudos de manera tal que el potencial de daño de las partículas se reduzca o elimine. Esto puede ser importante cuando las partículas son células vivas o apoptóticas .
En algunas modalidades de la descripción, el filtro comprende poros cuyo tamaño de poro eficaz es menor al tamaño de poro físico en al menos alrededor de 0.5 µt?. En otras modalidades, el tamaño de poro eficaz es menor al 95% del tamaño de poro físico. En aun otras modalidades, el tamaño de poro eficaz puede ser sustancialmente menor al tamaño de poro físico, por ej . , el tamaño de poro eficaz es alrededor de 75%, alrededor de 60%, alrededor de 50%, alrededor de 30%, alrededor de 10% o alrededor de 5% del tamaño de poro físico. En aun otras modalidades, el tamaño de retención puede ser sustancialmente menor al tamaño de poro físico, por ejemplo, el tamaño de poro eficaz puede ser alrededor de 90%, alrededor de 75%, alrededor de 60%, alrededor de 50%, alrededor de 30%, alrededor de 10% o alrededor de 5% del tamaño de poro físico. En aun otras modalidades, una partícula no encuentra más de alrededor de 5,000 poros durante su pasaje a través del dispositivo.
Los aspectos y las modalidades de la presente descripción se pueden usar para filtrar, separar, fraccionar, procesar, enriquecer o aislar muchos tipos de partículas tales como sedimentos simples o complejos, deterioro o contaminantes de metales pesados que se encuentran en aguas residuales o diversos contaminantes que se encuentran en 72
fluidos de origen natural o sintetizados tales como petróleo, biocombustibles o similares. Además, algunos aspectos y modalidades de la descripción se pueden usar con fines clínicos para filtrar muchos tipos diferentes de células tales como las sanas, enfermas, en crecimiento, moribundas o muertas. Ejemplos de tipos celulares son glóbulos sanguíneos, células madre, células madre hematopoyéticas , células progenitoras , células madre mesenquimales , células madre adiposas, células CD34+, células tumorales, células de la médula ósea, células del cordón umbilical, linfocitos, leucocitos, células cancerosas, células del líquido cefalorraquídeo, células del líquido amniótico, células madre de gelatina de Wharton, células eucariotas, células procariotas, células animales, células vasculares estromales, células derivadas del cordón umbilical, células hepáticas, células neuronales y células inmunes. Otros tipos celulares incluyen células bacterianas, células de levadura y células anormales .
Los aspectos y las modalidades de la presente descripción se pueden usar para procesar, filtrar, separar o fraccionar muchos tipos de fluidos tales como sangre, sangre del cordón umbilical, suero, tejidos grasos, tejidos grasos digeridos, fracciones vasculares estromales, líquidos amnióticos, sangre menstrual, líquidos cefalorraquídeos, 73
leche, médula ósea y orines.
Los aspectos y las modalidades de la presente descripción también incluyen métodos para la filtración de partículas usando dispositivos tales como uno o más de los descritos anteriormente. En algunas modalidades del método las partículas de alimentación se introducen en la primera cámara de flujo del dispositivo mediante una o más entradas y se aplica una fuerza motriz a las partículas para impulsar las partículas a través del dispositivo. Las partículas del retentado se recolectan de una o más salidas de la primera cámara de flujo; y las partículas del filtrado se recolectan de las salidas de la segunda y/o tercera cámara de flujo. En algunas modalidades, un fluido portador se introduce en la primera cámara de flujo del dispositivo mediante al menos una entrada.
Principios de exclusión de flujo
La filtración puede ocurrir usando una bifurcación de flujo en vez de la exclusión por tamaño. Específicamente, las partículas pequeñas se pueden retener mediante un poro de filtro grande en determinadas disposiciones de flujo. Dado que las partículas pequeñas se excluyen de entrar en un poro grande mediante el flujo, en la- presente se refiere a este efecto como "exclusión de flujo". .El efecto de exclusión de flujo se observó ya en 1921 en microcirculación, esto es, 74
flujo sanguíneo en vasos sanguíneos diminutos (Krogh, A. "Studies on the Physiology of Capillaries: II. The Reactions to Local Stimuli of the Blood-vessels in the Skin and Web of the Frog" J. Physiol. 55(5-6): 412-422 (1921); Fahraeus, R. "The Suspensión Stability of the Blood" Physiological Reviews 9: 241-274 (1929). Cuando un vaso sanguíneo pequeño se ramifica en dos vasos, los glóbulos sanguíneos entran preferentemente al vaso a mayores tasas de flujo aun cuando no existe restricción física o exclusión por tamaño que previene que las células entren al vaso de bajas tasas de flujo si los patrones de flujo se cambiaron para favorecer la exclusión por tamaño (Fig. 2A) . Este efecto ocurre debido a complejas interacciones y fuerzas hidrodinámicas entre las células, los vasos y el flujo sanguíneo. La exclusión de flujo es la más pronunciada cuando las tasas de flujo en las dos ramificaciones difieren significativamente. Además, las células nucleadas parecerían haber experimentado la exclusión de flujo más significativamente que las células enucleadas, por ej . , glóbulos rojos y plaquetas.
Existen diferentes teorías desarrolladas en el intento de explicar la exclusión de flujo observada microcapilares (Krogh, A. "Studies on the Physiology of Capillaries: II. The Reactions to Local Stimuli of the Blood-vessels in the Skin and Web of the Frog" J Physiol 55(5-6): 412-422 (1921); 75
Fahraeus, R. "The Suspensión Stability of the Blood" Physiological Reviews 9: 241-274 (1929); Svanes, K. et ál . "Variations in Small Blood Vessel Hetnatocrits Produced in Hypothermic Rats by Micro-Occlusion" Microvasc Res. 1: 210-220 (1968); Yen, R. T. et ál . "Model Experiments on Apparent Blood Velocity and Heraatocr.it in Pulmonary Alveoli" J. Ap l . Physiol. 35: 510-517 (1973); ' Mayrovitz, H. N. et ál . "Leukocyte distribution to arteriolar branches: dependence on microvascular blood flow" Microvasc Res. 29(3): 282-294 (1985) .
Se pueden obtener más percepciones si consideramos la ecuación Navier-Stokes la cual rige el comportamiento hidrodinámico de fluidos newtonianos incomprimibles .
Aquí, p es la densidad del fluido, v es la velocidad del fluido, p es la presión, µ es la viscosidad y f son las fuerzas corporales externas, tales como gravedad. Considerar una célula simple que se mueve en un vaso ramificado tal como se muestra en la Fig. 2A. Para analizar la senda de migración de la célula, se debe calcular las fuerzas y la distribución del flujo de fluidos exactos en la célula. Esto por lo general es una tarea abrumadora que requiere el cálculo informático intensivo aun para una única célula. El problema 76
se torna mucho más difícil cuando muchas células interactúan entre sí como en el caso del flujo sanguíneo en circulación. Tal vez la forma más fácil para obtener una percepción de cómo ocurre la exclusión de flujo es aplicar el principio de Bernoulli que declara que ocurre un aumento en la velocidad del fluido simultáneamente con una reducción en la presión. Dada la diferencia de tasa de flujo entre los dos vasos ramificados, una célula experimenta una pequeña fuerza hacia • el vaso con mayores velocidades de flujo (Fig. 2B) . Esta fuerza de elevación previene o rechaza que la célula entre en el vaso de menor tasa de flujo aun cuando el vaso puede ser lo suficientemente grande físicamente como para permitir, el pasaje de la célula. Por lo tanto, ocurre la exclusión de flujo. Obviamente, la teoría · precedente puede ser una simplificación excesiva debido a las siguientes razones: (a) fluidos implicados tales como sangre y médula ósea pueden no ser newtonianos ; (b) las concentraciones de partícula son tan altas que la interacción entre partículas puede ser un principal factor que domina el movimiento de las partículas; (c) las partículas implicadas son deformables y flexibles como respuesta a las fuerzas hidrodinámicas.
Sin limitarse a un mecanismo o teoría en particular, los aspectos y las modalidades de la presente descripción se pueden entender de acuerdo con principios de flujo tangencial 77
y exclusión de principios. En una modalidad de la presente descripción, se usa un filtro que comprende grandes poros para retener partículas relativamente pequeñas en contraste a la filtración de flujo tangencial convencional donde se usan pequeños poros para retener grandes partículas mediante la exclusión por tamaño. Una ventaja relevante de algunas modalidades de la presente descripción es la reducción o eliminación significativa del daño de partículas y obstrucción de filtro permitiendo el procesamiento de partículas deformables y/o frágiles a altos rendimientos. Tal como se usa en la Fig. 3, las modalidades de la presente descripción pueden usar un flujo tangencial 301, un filtro 306 que comprende una disposición de pilares 302 y poros 304, y una cámara de flujo 303 (Fig. 3A) . En algunas modalidades, la cámara de flujo 303 puede extender gradualmente la dirección del flujo de fluido de manera tal que en condiciones de funcionamiento solo una pequeña fracción del flujo tangencial 301 se arrastre a través de los poros 304. La tasa a la que la cámara de flujo 303 se ensancha junto con la geometría de filtro determina la cantidad de flujo arrastrado a través de cada poro 304. Cuanto más gradualmente se expanda la cámara 303, se arrastrará menos flujo a través de los poros .
78
En condiciones de flujo laminar (Fig. 3A) , el flujo tangencial 301 se bifurca alrededor de cada pilar 302 a medida que el flujo sanguíneo se bifurca alrededor de vasos sanguíneos ramificados en microcirculación . Si el flujo ramificado 305 que entra al poro 304 tiene una tasa de flujo mucho menor que el flujo tangencial 301, entonces puede ocurrir el efecto de exclusión de flujo. Una partícula 321 que fluye por el pilar 302 puede o no entrar al poro 304, dependiendo de la fuerza de la exclusión de flujo en la partícula (Fig. 3B) . Dado que diferentes tipos celulares experimentan diferentes efectos de exclusión de flujo y dado que la exclusión de flujo es una función de la tasa de flujo a través de un poro, se pueden crear condiciones de exclusión de flujo que son útiles para separar determinados tipos celulares controlando las tasas de flujo , en los poros 304. Por ejemplo, se puede diseñar una cámara de flujo 303 que se extienda gradualmente para crear condiciones de flujo bifurcadas que provoquen una fuerte exclusión de flujo en linfocitos 311 y una leve exclusión de flujo en glóbulos rojos 312 (Fig. 3C) . Como resultado, los linfocitos 311 son retenidos por el filtro 306 y los glóbulos rojos 312 pasan a través del filtro 306. La exclusión de flujo se usa como base de la filtración de partículas en algunos aspectos y modalidades de la presente descripción.'
' 79
En algunos aspectos y modalidades de la presente descripción, la tasa de flujo volumétrico a través del poro es mucho más pequeña que la del flujo tangencial. Usando el cálculo de dinámica de fluidos por computadora de una única partícula esférica rígida en un flujo laminar de condiciones de bajo número de Reynolds, se puede estimar 'el tamaño de poro eficaz como una función de la cantidad de flujo arrastrado a través del poro para un diseño particular. La Fig. 4 muestra los resultados de dicho cálculo para una modalidad mostrada en la Fig. 5A, asumiendo una profundidad de cámara de flujo de 30 pm, un ancho de entrada de alimentación de 110 pm, un diámetro de pilar de 30 pm y una distancia centro a centro de 40 m entre pilares adyacentes, dando como resultado un tamaño de poro tísico de alrededor de 10 pm. Cuando la tasa de flujo a través de cada poro es alrededor de 0.4% de la tasa de flujo tangencial en la entrada de alimentación 502, el tamaño de poro eficaz es aproximadamente 3.8 pm, que es significativamente menor que el tamaño de poro físico de 10 pm. Sin embargo, obsérvese que cuando la tasa de flujo volumétrico a través de cada poro es alrededor de 1.6% de la tasa de flujo volumétrico en la entrada, el tamaño de poro eficaz se torna casi igual que el tamaño de poro físico. Cuando la tasa de flujo a través de cada poro es mayor al 1.6% de la tasa de flujo tangencial en 80
la entrada, la exclusión por tamaño se convierte en la principal base para la separación de partículas y el dispositivo se torna un dispositivo de filtración convencional. Como contraste a la filtración de flujo tangencial convencional, la cual emplea una presión de transmembrana para alcanzar una separación basada en exclusión por tamaño, la presente descripción emplea una distribución de la tasa de flujo alrededor de los poros para alcanzar la separación basada en exclusión por tamaño.
A pesar de que el antes mencionado cálculo por computadora da una percepción de la exclusión de flujo en condiciones idealizadas y sobresimplificadas (una única partícula, rígida y esférica en fluido newtoniano sin movimiento browniano) , el proceso de filtración de las partículas de alimentación en la presente descripción puede ser sustancialmente estocástico descrito por probabilidad y puede no ser determinista.
Las interacciones entre partículas, las deformaciones de partículas y el movimiento browniano, entre otros factores, pueden cambiar el patrón de flujo y las fuerzas ejercidas sobre las partículas haciendo que la exclusión de flujo sea estocástica. Esta naturaleza estocástica de la exclusión de flujo puede ser prominente y muy sustancial especialmente cuando las partículas de alimentación 81
comprenden partículas y fluidos complicados, por ej . , sangre, sangre del cordón umbilical, médula ósea, fracción vascular estromal, etc. Para apreciar la complejidad de dichas muestras realistas, consideremos la sangre del cordón umbilical. Una muestra típica de sangre del cordón umbilical contiene alrededor de 4 mil millones de glóbulos rojos, 10 millones de glóbulos blancos y 200 millones de plaquetas por mililitro. Estas células constituyen alrededor del 40% del volumen sanguíneo y se deforman a medida que interactúan entre sí. Además, las células se instalan a diferentes tasas bajo gravedad. Sin diluir la muestra de manera significativa, por ej . , mediante un factor de 1,000, 10,000, 100,000 o más, las interacciones entre partículas pueden hacer que los glóbulos rojos se muevan de forma estocástica y puede ser sustancialmente imposible predeterminar si se puede retener una célula particular usando una modalidad de la presente descripción.
Tamaño de poro físico y tamaño de poro eficaz
Una técnica para caracterizar un filtro y su tamaño de poro es la medida de la retención de partícula usando esferas rígidas (Zeman, L. J. et ál . " icrofiltration and Ultrafiltration" Marcel Dekker, Inc., ISBN 0-8247-9735-3, p.265-274 (1996)). Ejemplos de medidas de retención de partículas descritos en esta publicación se incorporan en la 82
presente mediante esta referencia. Ejemplos de partículas que se pueden usar para dichas mediciones incluyen perlas de látex y microesferas de polímero. El "tamaño de poro físico", el "tamaño de poro eficaz" y el "tamaño de retención" se pueden medir y caracterizar usando dichas técnicas, .tal como se describe anteriormente. Usando esferas rígidas como estándar, se pueden caracterizar y comparar diferentes filtros y dispositivos sin perjuicio de su uso pretendido. Por ejemplo, se puede comparar un dispositivo de filtración convencional para eliminar las bacterias del agua con un dispositivo de filtración de sangre aunque las bacterias pueden tener diferentes tamaños, formas, deformabilidad, carga, concentración y otras características de los glóbulos sanguíneos .
En la filtración de exclusión por tamaño convencional, el tamaño de poro eficaz de un poro es mayor o sustancialmente igual al tamaño de poro físico y el tamaño de retención de un filtro también es mayor o sustancialmente igual al tamaño de poro físico. En cambio, en algunos aspectos y modalidades de la presente descripción, el tamaño de poro eficaz de un poro es menor o sustancialmente menor al tamaño de poro físico usando exclusión de flujo (Fig. 4) .
Mientras que los dispositivos se pueden caracterizar y comparar usando esferas rígidas y estándar, las modalidades 83
reales de la presente descripción para muestras biológicas se pueden optimizar empíricamente para cada aplicación particular. Una partícula que es sustancialmente mayor al tamaño de poro eficaz de un poro puede aun pasar a través del filtro debido a la deformación de partículas o la naturaleza estocástica del proceso. Este fenómeno se llama en la presente "fuga". En un filtro convencional donde el tamaño de poro eficaz es mayor o sustancialmente igual al tamaño de poro físico, las partículas tienden a obstruir y atascar el filtro cuando ocurren fugas. Cuando las partículas deformables y frágiles se fugan a través de un filtro convencional, las partículas pueden sufrir un gran cizallamiento y dañarse o lisarse, provocando una cascada de filtro que se atasca además de la obstrucción. Este es un serio problema para las aplicaciones que usan células y muestras biológicas.
Algunos aspectos y modalidades de la presente descripción comprenden métodos y dispositivos que emplean poros sustancialmente mayores que. el tamaño de poro eficaz reduciendo o evitando significativamente así el atascamiento o la obstrucción del filtro. Además, las modalidades de la presente descripción emplean bajas tasas de flujo volumétrico a través de sus poros como medio para crear una exclusión de flujo. La combinación de grandes poros y pequeñas tasas de 84
flujo facilitan un bajo cizallamiento en y alrededor de los poros, reduciendo asi los problemas de atascamiento, obstrucción, activación de partículas y daño de partículas. MÓDULOS, UNIDADES Y DISPOSITIVOS DE FILTRACIÓN
Módulo de filtro
Otra modalidad de la presente descripción es un módulo de filtro mostrado en la Fig. 5. Una primera cámara de flujo 501 tiene una entrada 502 y una salida 503. Las partículas de alimentación, esto es, las partículas a ser procesadas por filtración, entran por la entrada 502 y se dirigen a través de la primera cámara de flujo 501 desde la entrada hacia la salida usando una fuerza motriz. La primera cámara de flujo 501 está separada de y en conexión fluida con una segunda cámara de flujo 504 mediante un filtro 508 que comprende una disposición de pilares 505. El espaciado entre los pilares constituye los poros 506 del filtro 508. La segunda cámara de flujo 504 está dispuesta para arrastrar pequeñas cantidades de flujos a través de los poros 506 a través del filtro 508 para recibir las partículas de filtrado y para recolectar partículas de filtrado mediante una salida de filtrado 507. Las tasas de flujo a través de cada poro 506 están diseñadas para ser una fracción pequeña, por ej . , 1/10, 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/500, 1/1,000, 1/2,000, 1/5,000, 1/10,000, 1/20,000, 1/50,000 o 1/100,000, de las tasas de 85
flujo en la entrada 502 de la primera cámara de flujo 501 para facilitar la exclusión de flujo. En algunas modalidades, los poros 506 tienen tamaños de modo que los tamaños de poros físicos sean sustancialmente mayores al tamaño de poro eficaz. Algunas modalidades del filtro 508 pueden tener de alrededor de 10 a alrededor de 50,000 poros 506, por ej . , 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000 o 50,000 ' poros. Para conveniencia de discusión adicional, la primera cámara de flujo 501, donde migran las partículas de retentado y alimentación, se conoce en la presente como la "cámara de retentado", y la segunda cámara de flujo 504, donde migran las partículas de filtrado, como la "cámara de filtrado".
El flujo de partículas dentro de varias modalidades se puede crear usando un flujo de fluido, una presión de conducción, un vacío, una altura de cabezal, gravedad, una fuerza centrífuga, una fuerza magnética, una acción capilar o una combinación de los anteriores. El flujo de partículas se puede crear también usando un campo eléctrico, un campo electroforético, un campo dielectroforético, una fuerza electroosmótica, una fuerza electrocinética o una combinación de las fuerzas anteriores. Estos campos o fuerzas pueden mover las partículas y pueden o no . mover los fluidos en los cuales están contenidas las partículas. En algunos casos, estos campos o fuerzas pueden mover las partículas sin mover 86
los fluidos en los cuales están contenidas las partículas. Por ejemplo, en ausencia de cualquier flujo electrocinético, un campo electroforética puede dirigir partículas cargadas a través de modalidades de un dispositivo de la presente descripción sin crear un flujo de fluido. En el caso de gravedad, las partículas que tienen densidades mayores a las del fluido se pueden establecer a través del fluido. En otros casos, el fluido puede fluir en la dirección opuesta como las partículas. Claramente, la exclusión de flujo no ocurre en estos ejemplos. Sin embargo, las fuerzas de conducción dentro del dispositivo pueden crear sus propios efectos de exclusión, tanto como lo hacen los flujos de fluidos. Por lo tanto, también puede usarse gravedad, fuerzas centrífugas, campos eléctricos, campos electroforéticos y fuerzas electrocinéticas para dirigir las partículas y lograr efectos de filtración que no se basan en la exclusión por tamaño o restricción física.
En algunas modalidades, los pilares 505 pueden tener alturas similares a sus anchos, teniendo así una relación de aspecto cercana a 1, por ej., 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2 o 1.3, tal como se muestra en la Fig. 5B y 5C. De manera alternativa, los pilares 505 pueden comprender alturas más pequeñas que sus anchos, teniendo así una relación de aspecto sustancialmente más pequeña que 1, por ej., 0.1, 0.2, 0.3, 87
0.4, 0.5 o 0.6, tal como se muestra en la Fig'. 5D, o alturas mayores a sus anchos, teniendo asi una relación de aspecto sustancialmente mayor a 1, por ej . , 1.5, 2, 3, 5, 8, 10, 20, 100, 500, 2,000 o 10,000, tal como se muestra en la Fig. 5E. Los diseños de pilares de alta relación de aspecto tienen la ventaja de tener mayores capacidades y producciones, mientras que los diseños de pilares de baja relación de aspecto tienen la ventaja de tener facilidad de fabricación. Los pilares 505 pueden reducirse- o ahusarse gradualmente (Fig. 5E) . El ángulo de diseño podría aproximarse a 90 grados, por ej . , 80, 85, 87, 88 o 89 grados. Los pilares ahusados pueden facilitar el desmoldeo y pueden llevar a cabo la fabricación usando moldeo por inyección, grabado en relieve-, litografía suave u otras técnicas de replicación menos difíciles.
En algunas modalidades, las paredes laterales de la cámara de retentado 50 y la cámara de filtrado 51 son aproximadamente paralelas entre sí (Fig. 5A) . En algunas modalidades, la cámara de retentado 501 puede tener un ancho sustancialmente constante, puede ampliarse gradualmente o puede reducirse gradualmente (Fig. 6) . Un cambio en el ancho de la cámara de retentado 501 puede ocasionar un cambio en las tasas de flujo en la cámara 501 y el estrés de cizallamiento resultante. En la modalidad ilustrada en la Fig. 6B, debido a que los líquidos de alimentación se 88 "
introducen en la cámara de filtrado 504, la velocidad de flujo en la cámara de retentado 501 se vuelve gradualmente más pequeña mientras los fluidos se mueven hacia la salida 503. Por el contrario, en la modalidad ilustrada en la Fig. 6A, los fluidos en la cámara de retentado 501 se pueden acelerar hacia la salida 503 mientras que el área transversal total de la cámara de retentado 501 y la cámara de filtrado 504 se hacen más pequeñas. El grado hasta el cual se amplía la cámara de filtrado 504 puede determinar sustancialmente la cantidad de flujo introducida a través de los poros 506, y se puede optimizar para un tamaño de poro eficaz deseado.
En otra modalidad de la presente descripción, la cámara de retentado se puede reducir gradualmente desde el lado de la entrada hacia la salida de retentado, y la cámara de filtrado se puede ampliar gradualmente hacia la salida de filtrado. Para aplicaciones donde se desea la alta tasa de flujo y bajo estrés de cizallamiento, se puede preferir que la cámara de retentado sea ancha en el lado de la entrada y angosta en el lado de la salida. Dicha configuración puede mantener la velocidad de flujo baja en la entrada y el estrés de cizallamiento bajo en toda la cámara de retentado. En otra modalidad de la presente descripción, la cámara de retentado puede estar configurada para reducir gradualmente el lado de la entrada hacia la salida de retentado y para mantener la 89
velocidad de flujo promedio en la cámara de retentado sustancialmente constante mientras los fluidos fluyen desde la entrada hacia la salida. En otra modalidad de la presente descripción, la cámara de retentado y la cámara de filtrado pueden estar configuradas de modo que la velocidad de flujo promedio en la cámara de retentado sea sustancialmente constante mientras los fluidos fluyen desde la entrada hacia la salida.
En otra modalidad de la presente descripción, el filtro comprende pilares colocados en una curva (Fig. 7) . La "formación de curva" del filtro puede ocasionar una característica de filtro específica. Esto es, cada poro puede tener un tamaño de poro eficaz diferente diseñado para lograr determinados requisitos de filtración. En la modalidad descrita en la Fig. 7A, el filtro 701 forma al principio un pequeño ángulo con la pared lateral 710 de la cámara de filtrado 711, permitiendo que la cámara de filtrado extraiga una cantidad muy pequeña de flujo a través del filtro 701. El ángulo entre el filtro 702 y la pared lateral 710 se agranda luego para aumentar la cantidad de flujo extraído a través de los poros, lo que da como resultado tamaños de poros eficaces más grandes. El ángulo entre el filtro 703 y la pared lateral 710 puede achicarse hacia la salida de filtrado 720, lo que reduce la cantidad de flujo extraído a través de los poros. 90
En la Fig. 7B, el filtro 704 comprende pilares colocados en una curva diseñada para mantener determinadas características de filtros. El tamaño de poro eficaz de cada poro como una función de su posición desde el costado de la entrada 722 al costado de la salida 721 se ilustra cualitativamente en la Fig. 7C y Fig. 7D para las modalidades descritas en la Fig. 7A y 7B, respectivamente. Se entiende que también se pueden usar otras disposiciones de pilares, dependiendo de las características de pilares deseadas para la aplicación particular en consideración.
En aun otra modalidad, las tasas de flujo a través de cada poro son esencialmente idénticas. En aun otra modalidad, las tasas de flujo extraídas a través de cada poro son más pequeñas que o iguales a una fracción máxima x de las tasas de flujo del flujo tangencial, donde x oscila entre alrededor de 1/5 y alrededor de 1/100,000. Por ejemplo, una x deseable puede ser 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1,000, 1/2,000, 1/5,000, 1/10,000, 1/20,000, 1/50,000 o 1/100,000. Un ejemplo de esta modalidad se muestra en la Fig. 5. El filtro comprende entre alrededor de 10 y alrededor de 100,000 pilares, por ej . , alrededor de 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 30,000 o 100,000 pilares. Los pilares y la cámara de filtrado están configurados de manera tal que el tamaño de poro eficaz sea sustancialmente menor que el tamaño de poro eficaz.
En aun otra modalidad de la presente descripción, el filtro comprende una disposición de pilares que están espaciados equitativamente, tal como se muestra en la Fig. 5, Fig. 6 y Fig. 7. En aun otra modalidad de la presente descripción, los pilares están espaciados no uniformemente, tal como se muestra en la Fig. 8. Para algunas aplicaciones puede ser ventajoso variar los tamaños de poros físicos de modo que se permita que determinadas partículas pasen a través de poros físicamente grandes. Los pilares pueden tener diferentes formas transversales. Los ejemplos de formas transversales deseables incluyen, de modo no taxativo, aquellas descritas en la Fig. 9, por ej . , redondas (Fig. 9A y 9B) , forma ovalada (Fig. 9C) , elípticas (Fig. 9D) , forma de huevo (Fig. 9E y 9F) , forma aerodinámica (Fig. 9G) , etc. Un filtro puede comprender también pilares de diferentes formas y/o tamaños (Fig. 9H) . Para una separación delicada de partículas frágiles se puede preferir que los pilares no tengan bordes agudos que puedan estar en contacto con las partículas. Los .bordes agudos pueden abrir, dividir o lisar partículas frágiles. Mientras que se prefiere que las superficies de pilares no agudas en varias aplicaciones que requieren filtración delicada, también es posible usar cortes transversales de pilares poligonales, cuadrados o 92
rectangulares, por ejemplo, en casos donde no es de preocupación el daño de las partículas.
En otra modalidad de la presente descripción, la cámara de filtrado 901 tiene una pared lateral ondulada 902 que comprende partes cóncavas y convexas alternativas (Fig. 9A) , y el período de la pared lateral ondulada coincide con la distancia centro a centro de los poros 903. Las paredes laterales onduladas pueden ayudar a estabilizar el flujo y mantener pequeños tamaños de poros eficaces.
Se entiende que en modalidades de la presente descripción el filtro puede comprender pilares de diferentes formas y tamaños, colocados de forma uniforme o no en una línea recta o una curva, de modo de lograr determinadas características de filtros.
En otra modalidad de la presente descripción, la cámara de filtrado 504 es más superficial que la cámara de retentado 501 (Fig. 10) . En esta modalidad, el filtro 508 comprende una superficie contigua 512 y pilares 505. La cámara de filtrado 504 puede ser más superficial que algunas partículas de retentado grandes 321 (Fig. 10C) . Sin embargo, debido a que las partículas de retentado 321 se excluyen por flujo desde los poros físicos, nunca entran sustancialmente en la cámara de filtración superficial 504 o en las partes angostas 571 de los poros (Fig. 10C) . En consecuencia, los efectos perjudiciales asociados con la filtración de exclusión por tamaño puede ocurrir pocas veces en esta modalidad. Este diseño reduce las relaciones de- aspecto de los pilares 505 sin reducir la profundidad o área de filtro, y puede hacer que la fabricación del dispositivo sea fácil y resistente.
En aun otra modalidad de la presente descripción, un módulo de filtro comprende una cámara de retentado 130, un filtro 131 que comprende un filtro de rejilla y una cámara de filtrado 132 que controla los flujos que atraviesan el filtro de rejilla 131 (Fig. HA y 11B) . Las cámaras de flujo 130, 132 comprenden capas 133, 134 que comprenden ranuras. La cámara de filtrado 132 comprende una ranura que se profundiza gradualmente en la capa 134, colocada para extraer pequeñas Cantidades de flujo a través del filtro 131. El filtro 131 se coloca entre la capa de la cámara de retentado 133 y la capa de la cámara de filtrado 134. Esta modalidad permite una gran área de filtros, y puede alcanzar capacidad y producción muy altas. Una variación de esta modalidad comprende una capa de filtro poroso 131 colocada entre una capa de la cámara de retentado 133 y una capa de la cámara de filtrado 134 (Fig. 11C y 11D) . La capa de filtro poroso puede comprender, por ejemplo, una membrana grabada con surcos o una lámina de metal a máquina de láser, etc. Las capas pueden estar pegadas, unidas o simplemente presionadas entre sí (Fig. 11C 94
y 11D) . Los poros en el filtro 131 pueden estar regularmente espaciados, tal como se muestra en las Fig. 11A-11D, o pueden estar aleatoriamente distribuidos, . como con filtros de membrana grabada con surcos de radiación.
Las modalidades descritas anteriormente de la presente descripción pueden ser útiles como dispositivos para concentrar partículas, o para retirar una población de partículas de retentado de una población de partículas de filtrado. Sin embargo, en algunos casos, puede ser deseable reducir la población de filtrado desde la población de retentado, o aislar las partículas de retentado en un fluido diferente .
Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable aislar glóbulos sanguíneos nucleados de la. sangre total, y retirar tantos glóbulos rojos enucleados como sea posible. Se puede introducir un fluido portador 522 en la cámara de retentado 501 (Fig. 13). En una modalidad, la cámara de flujo de retentado 501 comprende al menos una entrada de flujo portador 521 además de al menos una entrada de alimentación 502. Aquí, se puede inyectar un fluido portador 522 en la cámara de retentado 501 y formar una corriente de flujo laminar 522 junto a la corriente de flujo de alimentación 523. Las condiciones de flujo laminar pueden provocar que el flujo portador 522 y el flujo de · alimentación 523 se muevan 95
de forma paralela sin mezcla convectiva. La interfaz entre las dos corrientes 522, 523 se muestra como la línea punteada 524 en la Fig. 13. Las partículas de retentado 531 se pueden retener mediante los pilares que comprenden filtros 505 y se pueden mover desde la corriente de alimentación 523 hacia la corriente portadora 522. En la salida de retentado 503, las partículas de retentado 531 están en el flujo portador 522, librándose sustancialmente así de la población de filtrado. Dependiendo del requisito de pureza deseada, las tasas de flujo del fluido portador pueden ser más pequeñas que, iguales o mayores a las tasas de flujo del fluido retentado. Se entiende que se puede aplicar un flujo portador de forma similar a cualquiera de las modalidades de la presente descripción, y no está limitado a ninguna modalidad particular. También se puede introducir el flujo portador para lavar, tratar o etiquetar las partículas de retentado. En algunas modalidades, se puede introducir más de un flujo portador para tratar las partículas de retentado. Por ejemplo, se pueden usar algunas modalidades de la presente descripción para etiquetar y lavar células en una forma continua de flujo. Se puede introducir una solución que contiene tinciones o etiquetas de anticuerpo contra células de retentado específicas junto al flujo de alimentación como el primer flujo portador, y se puede introducir una solución 96
de lavado cerca del primer flujo portador como el segundo flujo portador. Debido a la exclusión de flujo las células de retentado pueden migrar desde el flujo de alimentación hacia el primer flujo portador donde las células están teñidas o etiquetadas, y luego pueden migrar desde el primer flujo portador hacia el segundo flujo portador donde las células están lavadas . Se puede usar más de una entrada en una cámara de retentado para introducir flujos portadores para cualquiera de las modalidades de la presente descripción.
Módulo de doble filtro
En algunas modalidades, se pueden combinar dos módulos de filtros sustancialmente idénticos para formar un "módulo de doble filtro" . En una modalidad, dos módulos de filtros pueden formar imágenes espejo con respecto a cada uno y pueden compartir una cámara de retentado para formar un "módulo de doble filtro" (Fig. 14A) . La cámara de retentado
501 puede tener al menos una entrada 502 y una salida 503. Las partículas de alimentación pueden entrar en la entrada
502 y pueden ser dirigidas a través de la cámara de flujo 501 hacia la salida 503 usando, por ejemplo, un flujo de fluido, una pérdida de presión, una presión hidrodinámica, una fuente de presión, un vacío, una altura de cabezal, gravedad, una fuerza centrífuga, un campo eléctrico, un campo electroforético, una fuerza electrocinética, una fuerza 97
electroosmótica, una acción capilar o una combinación de los anteriores. La cámara de flujo de retentado 501 se puede separar de cada una de las dos cámaras de flujo de filtrado 504 mediante un filtro 508, y se puede colocar simétricamente con respecto a la línea central 514. Las modalidades del filtro 508 puede comprender una disposición de alrededor de 10 a alrededor de 100,000 pilares 505, por ej . , 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000 o 100,000 pilares. Las aberturas entre los pilares pueden constituir poros 506 del filtro 508. Las cámaras de flujo de filtrado 504 pueden estar diseñadas para extraer una pequeña cantidad de flujo a través de cada poro 506, y retirar partículas de filtrado a través de las salidas de filtrado 507. La tasa de flujo a través de cada poro 506 puede estar diseñada para ser una fracción pequeña, por ej . , 1/10, 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/500, 1/1,000, 1/2,000, 1/5,000, 1/10,000, 1/20,000, 1/50,000 o 1/100,000, de las tasas de flujo en la cámara de flujo de retentado 501 para facilitar la exclusión de flujo.
En cualquiera de las modalidades del módulo de doble filtro, la cámara de retentado puede comprender además una entrada de fluido portador 521 (Fig. 14B) . Se puede introducir un flujo portador 522 entre los dos flujos de alimentación 523 de modo que las partículas de retentado se 98
recolecten en el flujo portador 522 en la salida de retentado 503. Esta modalidad puede ser capaz de proporcionar partículas de retentado de alta pureza.
Otra modalidad del módulo de doble filtro se describe en la Fig. 15 donde dos módulos de filtros forman imágenes espejo y comparten una cámara de filtrado. La cámara de filtrado 504 que comprende una salida de filtrado 507 se puede colocar entre dos cámaras de retentado 501. La cámara de filtrado 504 puede extraer una pequeña cantidad de flujo a través de cada poro 506 en los filtros 508 para facilitar la exclusión de filtro. El flujo de alimentación puede entrar a la cámara de retentado 501 a través de una entrada 502. Las partículas de retentado se pueden recolectar en las salidas de retentado 503. Las partículas de filtrado se pueden recolectar en la salida de filtrado 507. Esta modalidad puede comprender además al menos una entrada de flujo portador 521 (Fig. 15B) . Las corrientes de fluido portador 522 se pueden establecer junto a la corriente de flujo de alimentación 523 de modo que las partículas de retentado se recolecten en las corrientes de flujo portador 522. De nuevo, el flujo portador aumenta la pureza de las partículas de retentado.
Módulo de varios filtros
Dos módulos de doble filtro pueden compartir además una cámara de retentado o una cámara de filtrado para formar módulos de varios filtros (Fig. 16) . En la modalidad descrita en la Fig. 16A, dos módulos de doble filtro (Fig. 14A) comparten una cámara de filtrado y forman un módulo de varios filtros que tiene cuatro filtros en el módulo. Asimismo, más de dos módulos de doble filtro pueden compartir también cámaras de retentado o cámaras de filtrado para formar módulos de varios filtros (Fig. 16B) . También se puede combinar un diseño de módulo de doble filtro con un módulo de filtro para formar un módulo de varios filtros que comprende tres filtros. También se puede combinar un diseño de módulo de varios filtros con un módulo de filtro de forma similar. Módulo de filtros en cascada
En algunas modalidades, se pueden conectar en serie dos o más módulos de filtros, módulos de doble filtro o módulos de varios filtros para formar un "módulo de filtros en cascada". En la modalidad descrita en la Fig. 17A, dos módulos de filtros sustancialmente idénticos 171, 172 están conectados en serie. La entrada 177 del segundo módulo 172 está en conexión fluida con las salidas 503, 507 del primer módulo 171. Las partículas de alimentación pueden entrar en la entrada 502 del primer módulo 171 y pueden estar separadas en el retentado y filtrado por el primer filtro 173. Cuando el dispositivo funciona en condicionas de flujo laminar, el retentado y el filtrado pueden formar dos corrientes de flujo 100
laminar en paralelo sin mezcla convectiva luego de la separación. Mientras las dos corrientes de partículas entran en el segundo módulo 172, el filtrado desde el primer módulo 171 puede encontrar el segundo filtro 174 mediante el cual se pueden retener algunas partículas. El retentado del primer módulo de filtros en cascada 170 se puede recolectar en la salida 503. El filtrado del primer módulo de filtros en cascada 170 como un todo puede pasar a través de ambos filtros 173, 174, y puede recolectarse en la salida 507. Esta modalidad aumenta el rendimiento de recuperación de las partículas de retentado, dado que las partículas que pueden no estar retenidas por el primer filtro 173 pueden estar retenidas por el segundo filtro 174. De manera similar, dos o más módulos de doble filtro pueden estar combinados en serie para formar un módulo de filtros en cascada (Fig. 17B) . La entrada 177 del segundo módulo 172 puede estar en conexión fluida con las salidas 503, 507 del primer módulo 171. Se pueden conectar más de dos módulos de doble filtro de forma similar. También se pueden combinar en serie otras configuraciones de filtros, tal como módulos de varios filtros, para formar un módulo de filtros en cascada.
Se entiende que los módulos de filtros, módulos de doble filtro o módulos de varios filtros que están conectados en serie para formar un módulo de filtros en cascada pueden 101
ser o no sustancialmente idénticos, y pueden tener o no tamaños de poros eficaces o tamaños de retención sustancialmente idénticos. En cualquiera de las modalidades de módulos de filtros en cascada la' cámara de retentado de un módulo puede comprender además una entrada de fluido portador. La Fig. 17C muestra una modalidad de módulos de filtros en cascada que comprenden dos módulos de doble filtro 171, 172. El módulo de doble filtro 172 comprende una entrada de flujo portador. 175, que puede comprender un canal y un agujero pasante 176. La Fig. 17D muestra una modalidad de módulos de filtros en cascada que comprenden dos módulos de doble filtro que comprende dos entradas de fluido portador 521, 175.
Se pueden combinar diversos módulos de filtros, módulos de doble filtro o módulos de varios filtros de tamaños de poros eficaces o tamaños de retención sustancialmente diferentes para formar un módulo de filtros en cascada que puede fraccionar el alimento en varias fracciones . En una modalidad, descrita en la Fig. 18A, un módulo en cascada 180 comprende un primer módulo de filtros 181 y un segundo módulo 182. El primer módulo 181 comprende una primera cámara 501 que comprende una entrada 502 para el alimento y una salida 503 para un primer retentado, denominado en la presente "fracción 1". Se coloca un primer filtro 508 entre la primera 102
cámara 501 y una segunda cámara 504. La segunda cámara se puede diseñar para extraer una pequeña cantidad de flujo a través de los poros en el primer filtro 508 para facilitar la exclusión de flujo, y puede recibir el filtrado desde el primer filtro como el primer filtrado. La salida de filtrado 183 del primer módulo 181 está en . conexión fluida con la entrada 184 del segundo módulo 182. El segundo módulo 182 comprende un filtro 509 que puede retener una subpoblación del primer filtrado como "fracción 2", que se recolecta en una salida 510. Se puede colocar una tercera cámara 511 para recibir el filtrado del segundo filtro 509, y puede extraer una pequeña cantidad flujo a través de los poros del segundo filtro para facilitar la exclusión de flujo. El filtrado del segundo filtro 509 puede salir a través de una salida 507, y se conoce en la presente como "fracción 3". El segundo módulo 182 puede utilizar un tamaño de retención más pequeño que el del primer módulo 181. Los dos módulos 181, 182 se pueden colocar para reducir la longitud de la segunda cámara 504 (Fig. 18B) . En otra modalidad de la presente descripción, descrita en la Fig. 18C, un módulo en cascada 180 comprende un primer módulo de filtros 181 y un segundo módulo 182. ;La entrada 184 del segundo módulo 182 se conecta a las salidas 183, 186 del primer módulo 181. Cuando el módulo 180 se opera en condiciones de flujo laminar, el filtrado y- el retentado 103
desde el primer módulo 181 pueden fluir en paralelo como dos corrientes de flujo separadas sin mezcla convectiva. La interfaz entre las dos corrientes se muestra como la línea punteada 185. El módulo en cascada 180 puede fraccionar partículas de alimentación en tres fracciones diferentes, fracción 1, fracción 2 y fracción 3, que se pueden recolectar a través de las salidas 503, 510 y 507, respectivamente. Para aumentar la pureza de la fracción 1 se puede introducir un fluido portador a través de la entrada 521.
La Fig. 18D representa cualitativamente el resultado de la distribución de tamaños que puede alcanzar un módulo en cascada al separar partículas esféricas rígidas y diluidas en tres fracciones. Los complejos de alimentos, tal como sangre, se pueden separar en tres o más fracciones . La separación se puede basar en varios factores, incluyendo interacciones entre partículas, deformación de partículas y/o comportamientos de fluidos no newtonianos.
Los módulos de doble filtro y módulos de varios filtros se pueden colocar en cascada para formar módulos de filtros en cascada, similar a la forma que pueden estar los módulos de filtros.. La Fig. 19 muestra dos de dichas modalidades. La Fig. 19A muestra una modalidad que representa una disposición de imagen espejo de dos módulos de doble filtro mostrados en la Fig. 18C, en tanto comparte la cámara de retentado 501. 104
Las partículas se fraccionan y recolectan en las salidas 503, 510, 507. De modo similar, dos módulos de filtros en cascada de la Fig. 18C pueden compartir las cámaras 504 para formar una modalidad mostrada en la Fig. 19B.
Los módulos de filtros en cascada pueden ser útiles para separar partículas en tres o más fracciones de acuerdo con las propiedades mecánicas de las partículas, por ej . , tamaño, forma, deformabilidad, flexibilidad, elasticidad y/o viscosidad. Por ejemplo, un módulo de filtro en cascada puede fraccionar sangre total en poblaciones de linfocitos, granulocitos y eritrocitos. Otra modalidad de un módulo de filtros en cascada puede fraccionar tejidos grasos digeridos de enzimas en células grasas, una fracción vascular estromal que comprende células madre adiposas y glóbulos sanguíneos .
En la Fig. 20A se muestra otra modalidad de un módulo de filtro en cascada. Una cámara de retentado 501 puede recibir un fluido de alimentación en una entrada 502. El alimento puede ser dirigido contra un primer filtro 508. Una primera cámara de filtrado 504 puede estar configurada para extraer pequeñas cantidades de flujos a través de poros del primer filtro 508 para facilitar la exclusión de flujo, y para recolectar el filtrado desde el primer filtro 508. El retentado del primer filtrado 508 puede entrar en el segundo módulo de filtros contra un segundo filtro 509. Una segunda 105
cámara de filtrado 516 puede estar configurada para extraer pequeñas cantidades de flujos a través de poros desde el segundo filtro 509 y para recolectar el filtrado desde el segundo filtro 509 mediante una salida 513. El tamaño de poro eficaz del primer filtro 508 puede estar configurado para ser más pequeño que el tamaño de poro físico del segundo filtro 509. El retentado del segundo filtro se pude recolectar mediante una salida 503 en la cámara de retentado 501.
La modalidad de la Fig. 20A puede simplificarse a la mostrada en la Fig. 20B debido a las condiciones de funcionamiento de flujo laminar. Los filtrados de los dos filtros 508, 509 de diversos tamaños de retención se pueden recolectar mediante la misma cámara de filtrado 504. Los dos filtrados pueden no mezclarse de forma convectiva y, por lo tanto, pueden recolectarse separadamente a través de dos salidas 541, 542.
En las modalidades ilustradas en las Fig. 20A y 20B, las partículas de alimentación se pueden fraccionar en tres fracciones: el filtrado del primer filtro 508 (fracción 3) , 'el filtrado del segundo filtro 509 (fracción 2) y el retentado del segundo filtro 509 (fracción 1) . En el caso del alimento que comprende partículas esféricas rígidas, se describe cualitativamente en la Fig. 20C un ejemplo de la distribución de tamaños de las tres fracciones. Se aprecia 106
que los módulos de filtros en cascada pueden formar módulos en cascada de doble filtro (Fig. 21) , tanto como dos módulos de filtro pueden formar un módulo de doble filtro (Fig. 14, 15) . Los módulos de doble filtro en las Fig. 20A y 20B pueden colocarse adicionalmente en cascada para formar módulos en cascada de la misma forma que dos módulos de doble filtro de la Fig. 14A pueden formar un módulo en cascada mostrado en la Fig. 17B.
Se aprecia que los módulos de filtros en cascada pueden comprender cascadas de dos o más módulos de filtros, módulos de doble filtro o módulos de varios filtros.
Las modalidades anteriores de los módulos de filtros en cascada también pueden emplear un flujo portador o varios flujos portadores para aumentar la pureza de retentados, para lavar las partículas, para tratar las partículas con diversos reactivos como el flujo portador, o para etiquetar las partículas .
Se aprecia que un módulo de doble filtro en cascada puede comprender filtros de más de dos tamaños de retención para separar un alimento en más de tres fracciones. Se aprecia también que aunque las modalidades de módulos de doble filtro en cascada descritas anteriormente son simétricas con respecto a las líneas de centro, un módulo de doble filtro en cascada¦'· puede ser asimétrico o aun puede 107
comprender filtros de diversos tamaños de poros eficaces en lados opuestos de la línea de centro.
Otras configuraciones de los módulos
En otra modalidad de la presente descripción, un módulo de filtro, que comprende una cámara de retentado, un filtro y una cámara de filtrado, puede ser curvo. Dicha modalidad de módulo de filtro puede tener la ventaja de un espacio reducido cuando se desea una longitud larga del filtro. De manera alternativa, los módulos de filtro, y módulos de filtros en cascada pueden estar dispuestos en forma de serpentina.
Los módulos se pueden combinar en formas para lograr diversas características de filtros. Por ejemplo, la Fig. 22A muestra una modalidad de la presente descripción para concentrar partículas de retentado de manera eficaz. El alimento puede entrar al primer módulo 221 a través de la entrada 220. El primer módulo puede concentrar partículas diana en el alimento como su retentado. El retentado puede entrar al segundo módulo 222 como alimento y se puede concentrar nuevamente antes de salir por una salida 225. Si cada módulo concentra su alimento mediante un factor de reducción de volumen de 5, entonces ambos módulos pueden reducir el volumen en un factor de 25. Más módulos, por ejemplo, 3, 4 o 5 se pueden unir de forma similar para 108
conseguir una salida aun más concentrada. Si tres módulos se disponen en cascada de manera similar, y si cada módulo tiene un factor de reducción de volumen de 4, entonces los tres módulos pueden reducir el volumen en un factor de 64. Se aprecia que los módulos no tienen que concentrar partículas con el mismo factor.
La Fig. 22B muestra una modalidad de la presente descripción donde las partículas de retentado se pueden lavar de manera eficaz. El alimento puede entrar al primer módulo 223 a través de entradas 227 . Se puede introducir un fluido portador a través de la entrada 226 . El retentado del primer módulo se puede "lavar" mediante el flujo portador y puede entrar- .al segundo módulo 224 . El segundo módulo puede comprender una entrada 228 para un segundo flujo portador. La entrada 228 puede comprender un agujero pasante en la modalidad. El segundo flujo portador puede o no ser idéntico al primer flujo portador. El retentado del primer módulo 223 se puede lavar mediante el segundo flujo portador en el segundo módulo 224 . Esta modalidad se puede usar para reducir la población de partículas de filtrado de una forma más completa y lograr mayor purificación de la población de partículas de retentado. También se puede usar para tratar, lavar o etiquetar partículas de retentado usando flujos portadores. Por ejemplo, el flujo portador puede comprender 109
un anticuerpo contra un antígeno diana en la población de retentado. Mientras que las partículas de retentado se mueven hacia la corriente de flujo portador, el anticuerpo puede etiquetar las partículas diana. Se aprecia que más de dos módulos se pueden disponer en cascada de formas similares.
Las Fig. 23A, 23B y 23C muestran modalidades de módulos de doble filtro donde · los módulos componentes están desplazados uno con respecto del otro. En la modalidad mostrada en la Fig. 23B, las partículas de alimentación pueden entrar a una cámara de retentado 236 a través de una entrada 230. Las partículas se pueden separar en una fracción retentado y una fracción de filtrado mediante un filtro 237. El filtrado puede fluir a través de una cámara de filtrado 231 y puede entrar en otra cámara 232. Aunque esta cámara 232 puede permitir que el filtrado- del primer filtro 237 pase a través de este, la cámara 232 también puede servir como cámara de retentado para un segundo filtro 238. Debido a las condiciones de flujo laminar, el retentado y el filtrado pueden no mezclarse de forma convectiva y se pueden recolectar luego de fluir a través de la cámara de retentado 232. Las fracciones de filtrado del primer filtro 237 y el segundo filtro 238 pueden salir a través de una primera salida 235 y una segunda salida 234, respectivamente, en tanto que las fracciones de retentado de ambos filtros 237, 110
238 se pueden recolectar a través de una salida 233. De manera similar, en la modalidad mostrada en la Fig. 23C, el retentado de una primera cámara de retentado 236 y el filtrado de una primera cámara de filtrado 231 pueden fluir en paralelo a través de una segunda cámara de retentado 232. En condiciones de flujo laminar, el retentado y el filtrado no se mezclan de forma convectiva. La línea punteada 239 muestra la interfaz de fluidos entre el retentado y el filtrado, que puede salir a través de dos salidas' 233, 235 diferentes, respectivamente.
La Fig. 23D muestra una modalidad de un módulo de varios filtros. Este módulo comprende dos módulos mostrados en la Fig. 23C como imágenes espejo entre sí. Las cámaras de filtrado 231 y las cámaras de retentado 232 se comparten. Debido a que el flujo es laminar, las corrientes de filtrado y de retentado pueden no mezclarse de forma convectiva. Las interfaces entre las corrientes se muestran como líneas punteadas 239. Las corrientes de filtrado se pueden recolectar a través de salidas 234, 235, en tanto que las corrientes de retentado se pueden recolectar a través de salidas 233.
La Fig. 23E muestra una modalidad de un módulo de filtros en cascada. Este módulo de filtros en cascada comprende dos módulos 2310, 2311, cada uno de los cuales 111
comprende un módulo mostrado en la Fig. 23C.
Se entiende que los diversos diseños y configuraciones de módulos de filtro descritos anteriormente son a modo de ejemplo únicamente y no pretenden ser taxativos. En el espíritu de la presente invención, el filtro puede comprender pilares de- varios cortes transversales, tal como se muestra en la Fig. 9. Los módulos se pueden combinar y/o colocar en cascada de diversas maneras para formar módulos de doble filtro, módulos de varios filtros, módulos de varios filtros en cascada, etc. Se puede introducir un flujo portador o varios flujos portadores a los diversos módulos para facilitar la reducción de población de filtrado, eliminación de población de filtrado, lavado de partículas, etiquetado de partículas, tratamiento de partículas y demás.
Condiciones estructurales para exclusión de flujo
Para lograr un tamaño de poro eficaz que sea sustancialmente más pequeño que el tamaño de poro físico, se puede configurar una cámara de filtrado de un dispositivo de filtración para expandirse gradualmente. Un experto en la técnica puede considerar las condiciones cuando la exclusión de flujo puede ocurrir en modalidades de la presente descripción .
Sin limitarse a ninguna teoría, derivación, ecuación ni fórmula matemática, se describen a continuación las condiciones que pueden promover la exclusión de flujos. Por ejemplo, consideremos la modalidad mostrada en la Fig. 12. Debido a que el flujo a través de un poro se controla por la expansión y contracción de las cámaras, por ejemplo, la ampliación de la cámara de filtrado y/o la reducción de la cámara de retentado, definamos el "área transversal proporcional de la cámara de filtrado" w como la relación entre el área transversal de la cámara de filtrado y el área transversal de todas las cámaras, donde las secciones transversales se toman sustancialmente de forma perpendicular a la dirección de flujo promedio. Cuando un módulo de filtración tiene cámaras de profundidad sustancialmente constante, como en la modalidad mostrada en la Fig. 12, el "área transversal proporcional de la cámara de filtrado" w es
W =
a + b
donde a es el ancho de la cámara de retentado y b es el ancho de la cámara de filtrado en un corte transversal de interés. El flujo a través de un poro como una fracción del flujo total en las cámaras depende sustancialmente del aumento de las "áreas transversales proporcionales de la cámara de filtrado" alrededor del poro. En la modalidad mostrada en la Fig. 12, el aumento se designa como
113
V
w — w =
a' + b' a + b
Por otro lado, debido a que la cantidad de flujo extraído a través de un poro es aproximadamente proporcional al área de la abertura del poro .y la» velocidad de flujo promedio a través del poro, y debido a que la cantidad de flujo que desciende hacia las cámaras es aproximadamente proporcional al área transversal total de las cámaras y la velocidad de flujo promedio en las cámaras, se espera que el flujo a través de un poro como una fracción del flujo en la cámara sea sustancialmente proporcional al tamaño ' de poro físico al cuadrado dividido entre el área transversal total de las cámaras .
Debido a que la exclusión de flujos ocurre cuando el flujo a través del poro es más débil que lo que puede permitir el tamaño de poro físico (Fig. 4), una condición para la exclusión sustancial de flujos a ocurrir puede ser entonces . 2
{Tamaño de poro físico)
w — w <
3 x (Área transversal tota!)
El factor de tres en el denominador es un factor proporcional estimado mediante simulación por ordenador (Fig.
4) . Este criterio se denomina en la presente "criterio de expansión de la cámara de filtrado". En algunas modalidades de la presente descripción, un módulo de filtración comprende 114
una cámara de retentado, una cámara de filtrado y un filtro que comprende pilares y poros que comprenden un tamaño de poro físico, donde la cámara de filtrado se expande a una tasa que satisface el "criterio de expansión de la cámara de filtrado". En algunas modalidades de la presente descripción, el o los ángulos en los cuales se amplía la cámara de filtrado, es decir, el o los ángulos fijos o variantes entre el filtro y la pared lateral de la cámara de .filtrado, son muy pequeños, por ejemplo, de alrededor de 0.1 grados, 0.2 grados, 0.3 grados, 0.5 grados, 0.7 grados, 1 grados, 1.5 grados, 2 grados, 2.5 grados, 3 grados o 5 grados.
Otra condición que puede promover la exclusión de flujos es incorporar . una gran cantidad de poros en un módulo de filtración, ya que cuando hay más poros se puede reducir el flujo a través de cada poro y puede ocurrir la exclusión de flujo. De modo similar a la derivación previa, se espera que la cantidad de poros que se puede requerir para la exclusión de flujo dependa sustancialmente de la cantidad de flujo recogido en la cámara de filtrado y la cantidad de flujo permitida por un poro que comprende un tamaño de poro, físico. Por lo tanto, la cantidad mínima de poros que se puede requerir para la exclusión de flujo puede ser sustancialmente proporcional a la relación entre el área transversal de la salida de la cámara de filtrado y el tamaño 115
de poro físico al cuadrado. Por lo tanto,, otra condición para
la exclusión de flujo sustancial puede ser
N > [Área transversal de entrada de cámara de retentado)
(Tamaño de poro físico)2
donde N es la cantidad de poros en un módulo y J es el "área transversal proporcional de la cámara de filtrado" en el lado de salida del módulo de filtración. El factor de proporción de tres se estima usando simulación por ordenador. Este
criterio se denomina en la presente "criterio de cantidad mínima de poros". Para la modalidad mostrada en la Fig. 12,
la condición para la exclusión de flujo sustancial puede ser
En algunas modalidades de la presente descripción, un
módulo de filtración comprende una cámara de retentado, una cámara de filtrado y un filtro que comprende pilares y poros
que comprenden un tamaño de poro físico, donde la cantidad de poros satisface el "criterio de cantidad mínima de poros".
Se entiende que la teoría, las fórmulas, las ecuaciones y las derivaciones anteriores no pretenden ser taxativas. Se aprecia que el "criterio de expansión de la cámara de filtrado" y el "criterio de' cantidad mínima de poros" se pueden aplicar a varias modalidades de acuerdo con los módulos de filtración de la presente descripción incluyendo, de modo no taxativo, módulos de filtro, módulos de doble filtro, módulos de varios filtros y módulos de filtros en cascada.
Unidades de filtración
Una modalidad de la presente descripción es una unidad de filtración que comprende un módulo de filtración descrito anteriormente, canales de fluidos y puertos. Los canales de fluidos están configurados para proporcionar una conexión fluida entre los puertos y el módulo. Los canales de fluido también se pueden configurar para proporcionar resistencias de fluido apropiadas para establecer distribuciones deseadas de fluido en el módulo, por ejemplo, las proporciones correctas de fluido portador y de alimentación en el módulo y/o las correctas proporciones de fluidos recolectadas como el retentado y el filtrado, en condiciones de f ncionamiento deseadas .
Dispositivos de alta densidad de módulos
Una de las ventajas significativas de algunas modalidades de la presente descripción es permitir dispositivos de alta capacidad y alta producción para filtración de partículas basada en exclusión de flujos, mientras se mantienen espacios de dispositivo compactos y bajo cizallamiento . Las configuraciones de unidad y módulo descritas anteriormente son compactas y pueden diseñarse 117
fácilmente en dispositivos de alta densidad de módulos. Dichos dispositivos pueden tener capacidad escalable y producción de procesamiento, y pueden ser extremadamente útiles para varias aplicaciones, tal como reducción de volumen de sangre del cordón umbilical, lavado de células, aislamiento de células madre, preparación de fracciones vasculares estromales, separación de plasma y filtración de células madre de la médula ósea. Apilar varios de estos dispositivos compactos como un dispositivo puede proporcionar aun mayor capacidad y producción.
En otra modalidad de la presente descripción, un dispositivo comprende una pluralidad de unidades de filtración, donde cada unidad de filtración comprende un módulo descrito anteriormente y canales de fluidos que están en conexión fluida con el módulo. En aun otras modalidades de la presente descripción, una pluralidad de unidades de filtración, por ejemplo, alrededor de 3, 5, 8, 10, 15, 20 ¡ 30, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 500, 800 o más unidades de filtración, está dispuesta en una configuración de alta densidad en un único dispositivo. Dicho dispositivo se conoce en la presente como un "dispositivo de alta densidad de módulos" .
Las Fig. 24A - 24F muestran varias modalidades de los dispositivos de alta densidad de módulos donde las unidades 118
de filtración 249 están repetidas' para aumentar las producciones y capacidades. En la Fig. 24A, están dispuestas ocho unidades de filtración, cada una comprende un módulo de doble filtro. Las entradas de alimentación 502, salidas de retentado 503 y salidas de filtrado 507 de los módulos están conectados a puertos de entrada 241 y puertos de salida 242, 243 usando canales de entrada 244 y canales de salida 245, 246, respectivamente.'
Las resistencias de flujo a través de los canales 244, 245, 246 se pueden configurar para establecer cantidades adecuadas de flujos que ingresan por las entradas 502 y que salen por las salidas 503, 507 en condiciones de funcionamiento, y para facilitar el funcionamiento de los módulos individuales. Las resistencias de flujo a través de los canales 244, 245, 246 pueden estar diseñadas para ser más pequeñas que, considerable para o mayores a la resistencia de flujo de los módulos, dependiendo de las condiciones de funcionamiento para las cuales está diseñado el dispositivo. En algunas modalidades, las resistencias de flujo a través de los canales de entrada y salida 245, 246 pueden ser de alrededor de 0.01 a alrededor de 0.99 veces la resistencia del módulo de doble filtro.
En otra modalidad de la presente descripción (Fig. 24B) , cada módulo de doble filtro puede comprender una 119
entrada de flujo portador 521, que puede estar conectada a un puerto de entrada 247 a través de un canal 248. Las resistencias de flujo de los canales pueden estar diseñadas para facilitar el funcionamiento correcto de los módulos individuales. En aun otra modalidad de la presente descripción (Fig. 24C) , se conecta un módulo de varios filtros a puertos de salida y entrada usando canales. En aun otra, modalidad de la presente descripción (Fig. 24D) , varios módulos pueden compartir un puerto de entrada 241 y un puerto de salida 242. Los canales que conectan los módulos a los puertos pueden estar diseñados para tener sustancialmente las mismas resistencias. En aun otra modalidad de la presente descripción (Fig. 24E) , los módulos se pueden colocar en un disco circular. En la modalidad de la Fig. 24E, el disco se puede hilar alrededor de un eje central para generar una fuerza centrífuga que puede deslizar un fluido a través de los módulos colocados en el disco.
Los módulos no están limitados a ser colocados solamente en una fila. Se pueden colocar dos o más filas de módulos como un dispositivo. Con dos o más filas de módulos hay más disposiciones posibles para compartir puertos y reducir los espacios de los dispositivos. La Fig. 24F muestra una pluralidad de 20 módulos de doble filtro colocada en dos filas compartiendo puertos de entrada de alimentación 120
comunes. Asimismo, los dispositivos se pueden apilar para lograr alta capacidad y producción (Fig. 25) .
Se aprecia que varios módulos de filtro, módulos de doble filtro, módulos de filtro en cascada, módulos de doble filtro en cascada, módulos de varios filtros, módulos de varios filtros en cascada, otras configuraciones o se puede colocar cualquier combinación de los módulos anteriores en cualquier relación de dos o tres dimensiones posibles entre sí .
Técnicas de fabricación de dispositivo de filtración
Se puede usar una variedad de técnicas para fabricar modalidades de dispositivos de acuerdo con la presente descripción. En una modalidad de la descripción, se puede micromaquinar un dispositivo. Las técnicas de micromaquinación se pueden seleccionar de, de modo no taxativo, aquellas conocidas en la técnica, por ejemplo, técnicas convencionalmente usadas para la fabricación de circuitos integrados con base en silicio, grabado en relieve, grabado en relieve suave, fundido, impresión, moldeo, moldeo por inyección, extrusión, estereolitografía láser, sinterizado láser selectivo, litografía de vidrio fotodefinible y grabado húmedo, máquina de control numérico computarizado (CNC) , litografía leve de polidimetilsiloxano (PDMS) , micromolienda de ultrasonido, litografía fotosensible 121
gruesa, combinaciones de las técnicas anteriores y demás. Los ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen fotolitografía, grabado profundo de iones reactivos, grabado húmedo, moldeo, grabado en relieve, impresión, ablación por láser, litografía fotosensible gruesa, litografía suave, grabado con surcos de radiación y otras técnicas . Algunos aspectos y modalidades de dispositivos de filtración pueden estar hechos de materiales que son compatibles con las condiciones presentes en la aplicación de interés particular. Dichas condiciones pueden incluir, de modo no taxativo, pH, temperatura, solventes orgánicos, biocompatibilidad, fuerza iónica, presión, aplicación de campos eléctricos, propiedades de adhesión, carga de superficies, funcionalización de superficies, tratamiento de superficies, ángulo húmedo, hidrofilicidad, hidrofobicidad, fuerza mecánica y expansión de calor. Los materiales del dispositivo se pueden seleccionar también según sus propiedades ópticas, propiedades mecánicas, propiedades químicas, resistencia química a solventes, propiedades de fusión, y según su inercia a componentes de la aplicación a llevar a cabo en el dispositivo. Dichos materiales pueden incluir, de modo no taxativo, vidrio, sílice fusionado, caucho de silicona, silicio, cerámicas, vidrio fotodefinible , plástico, materiales poliméricos, polímeros fotosensibles, fotosensibilidad gruesa, resistencia de SU-8, polidimetilsiloxano (PDMS) , copolímero de olefina cíclica (COC) , polímero de olefina cíclica (COP) , policarbonato , polietileno, . polipropileno, polimetilmetacrilato (PMMA) , materiales sensibles a la presión, teflón, acrílico, polietersulfona, politetráfluoroetileno, etc. Los dispositivos se pueden esterilizar usando técnicas de esterilización estándar, por ej . , irradiación gamma, esterilización de óxido de etileno (EO) , iluminación de luz ultravioleta, autoclavado, etc.
Criterios de medición eficaces para caracterizar módulos, unidades y dispositivos de filtración de microfluidos
En comparación con otros dispositivos de microfluidos, algunos aspectos y modalidades de la presente descripción crean condiciones para la exclusión de flujo de manera mucho más eficiente. Modalidades de un módulo de filtros de acuerdo con la presente descripción se pueden colocar como un dispositivo físicamente compacto, por ej . , un dispositivo de alta densidad de módulos, que tiene una capacidad y/o producción deseada. Las modalidades de la presente descripción pueden tener varias ventajas significativas. Por ejemplo, modalidades de la presente descripción pueden no ser susceptibles a obstrucción. En segundo lugar, algunos aspectos y modalidades de la presente, descripción pueden ser 123
relativamente fáciles para fabricar ya que estos aspectos y modalidades pueden comprender un espacio muy pequeño y una cantidad relativamente pequeña de pilares. En tercer lugar, algunos aspectos y modalidades de la presente descripción pueden tender a ser apacibles con las partículas que se están filtrando. En algunas modalidades, una partícula de filtrado puede avanzar tan poco como un poro por módulo durante el proceso de filtración. En cuarto lugar, algunos aspectos y modalidades de la presente descripción introducen poca difusión ya que las partículas no están sometidas a la constante colisión y dispersión que pueden ocasionar otros diseños. Poca difusión puede resultar en una separación altamente eficaz.
Aspectos y modalidades de la presente descripción pueden comprender alta producción, bajo cizallamiento y dispositivos de filtración compactos que son fáciles y económicos para la fabricación. Los criterios de medición se pueden definir para cuantificar la eficacia de un diseño de dispositivo y los probables esfuerzos que se requieren para la fabricación. Un criterio de medición que refleja los probables esfuerzos requeridos para fabricar un dispositivo de filtración de microfluidos es el volumen de retención del dispositivo. El volumen de retención es el volumen nulo dentro de un dispositivo, y puede representar la cantidad de 124
material que se quita o desplaza durante el proceso .de fabricación del dispositivo. Por ejemplo, un método para fabricar dispositivos de filtración de microfluidos en silicio es fotolitografía seguido de grabado iónico reactivo. La cantidad de dispositivos que se pueden realizar en un disco depende del tamaño del área grabada en un dispositivo, en tanto que el tiempo de máquina para el grabado iónico reactivo depende de la profundidad de grabado. El volumen de retención de un dispositivo puede ser aproximadamente el tamaño del área grabada multiplicado por la profundidad de grabado y, por lo tanto, puede representar los esfuerzos y costos requeridos para fabricar el dispositivo. Por ejemplo, para los dispositivos de filtración microfabricados en silicio usando microfabricación, cuanto mayor es el volumen de retención de un dispositivo, más material de disco, esfuerzos de fotolitografía y tiempo de máquina de grabado se necesitará. Otras técnicas de fabricación de dispositivos, tal como moldeo por inyección, ocasionan también correlaciones similares entre el volumen de retención y los esfuerzos necesarios para realizar el dispositivo.
Para los dispositivos de filtración de microfluidos que comprenden uno o más módulos de filtración, por ej . , un módulo de filtro, un módulo de doble filtro, un módulo de filtros en cascada o un módulo de varios filtros, el volumen 125
de retención del módulo de filtración puede . servir como buen criterio de medición para caracterizar el módulo de filtración y/o el dispositivo. Algunos aspectos y modalidades de la presente descripción comprenden módulos de filtración con poco volumen de retención, por ej . , un módulo de filtración puede comprender un volumen de retención de <1 µ?, <0.3 µ?, < 0.1 ul, <0.03 µ?, <0.01 µ? o menos. Los volúmenes de retención de varios ejemplos de modalidades de la presente descripción se calculan y describen en la sección de ejemplos a continuación.
Otro criterio de medición que se puede definir para estimar los esfuerzos requeridos para fabricar un módulo es la "densidad de la unidad de filtración", definida en la presente como la cantidad de unidades de filtración por volumen. Más específicamente, la "densidad de la unidad de filtración" se puede calcular como
. , , , . , , , . · ' { Cantidad de módulos por dispositivo)
Densidad de unidad de filtración = '- i
(Espacio de! dispositivo) X {Profundidad deí canal)
Por ejemplo, considerar un dispositivo de alta densidad de módulos que tiene 100 unidades de filtración idénticas, un espacio de 2 cm x 2 cm y una profundidad de canal característica promedio de 50 µp?, la "densidad de la unidad de filtración" es 100/ [(2 cm x 2cm) x 50 µ??] , lo que equivale a 5,000 cm"3. Dicha "densidad de la unidad de filtración"
126
significa que, en principio, se pueden empaquetar hasta 5,000 unidades de filtración en un dispositivo de alta densidad de módulos que tiene un tamaño de un centímetro cúbico. Para aumentar la utilidad y reducir el costo de un dispositivo de filtración de microfluidos puede ser deseable maximizar la "densidad de la unidad de filtración" del dispositivo, ya que la producción del dispositivo depende de -la cantidad de módulos en el dispositivo, y el costo tiende a aumentar con la cantidad volumétrica de características de fluido en el dispositivo. Algunos aspectos y modalidades de la presente descripción permiten que los dispositivos tengan una alta "densidad de la unidad de filtración". La "densidad de la unidad de filtración" de varios ejemplos de modalidades de la presente descripción se calculan y describen en la sección de ejemplos a continuación.
Además del espacio del dispositivo y la profundidad del canal, una especificación importante del rendimiento de un dispositivo de separación de microfluidos es la velocidad de procesamiento de partículas, definida como la cantidad de partículas de alimentación procesada por tiempo de unidad. Para caracterizar la velocidad de procesamiento de partículas de un dispositivo, puede ser importante tomar en cuenta el espacio del dispositivo y la profundidad del canal de fluidos, que se correlaciona con la dificultad y el costo de fabricación del dispositivo. Se puede definir una "velocidad normalizada de procesamiento" para un dispositivo de separación de microfluidos de la siguiente manera:
, , . (Velocidad de procesamiento de partículas)
Velocidad normalizada de procesamiento — ¦¦ -— - (Espacio del dispositivo) x (Profundidad del canal)
Puede ser deseable que un dispositivo tenga una alta velocidad normalizada de procesamiento. Varios aspectos y modalidades de la presente descripción permiten que los dispositivos de separación tengan altos "índices de velocidad de procesamiento" . Los índices de velocidad de procesamiento para varios ejemplos de modalidades de la presente invención se calculan y describen en la sección de ejemplos a continuación .
Otro factor importante con respecto a la eficacia y el costo de fabricación de un dispositivo de separación de microfluidos puede ser la velocidad de flujo de funcionamiento. Aumentar la velocidad del flujo en varios casos aumenta la producción del dispositivo sin aumentar el costo de fabricación. Sin embargo, este enfoque puede proporcionar . considerables limitaciones para las aplicaciones donde el estrés de cizallamiento es una preocupación. Velocidades aumentadas de flujo pueden ocasionar mayores condiciones de estrés de cizallamiento ocasionando un potencial daño a partículas y/o atascamiento de filtros. Para
128
las aplicaciones de filtración de células puede ser deseable que el cizallamiento sea limitado. Las células pueden ser vulnerables a alto estrés de cizallamiento y se pueden activar, dañar, alterar o aun lisar mediante alto estrés de cizallamiento. Varios aspectos y modalidades de la presente descripción permiten maximizar la velocidad de flujo mientras se limita el cizallamiento.
Cuando se comparan las producciones de diversos dispositivos de separación de flujo de microf luidos , se puede desear normalizar las producciones de acuerdo con los espacios del dispositivo, las profundidades del canal y las condiciones de cizallamiento de funcionamiento. Asimismo, las producciones se pueden normalizar de acuerdo con el cuadrado del tamaño de retención característico de los dispositivos de filtración dado que un dispositivo con mayor tamaño de retención puede tender a tener mayor producción. En la presente, un "índice de eficiencia de diseño" (D.E.I.) , que representa la producción normalizada de un dispositivo de separación de microfluidos , se define como:
donde Q es la producción volumétrica en la cual el dispositivo procesa el alimento, S es la máxima tasa de cizallamiento que experimenta una partícula cuando fluye a 129
través del dispositivo, A es el espacio del dispositivo, que es un área, D es la profundidad característica de los canales dé dispositivos y R es el tamaño de retención del dispositivo. Tasa de cizallamiento se define como el gradiente de velocidad del fluido en la dirección perpendicular a. la velocidad y tiene la dimensión de 1/vez. El índice de eficiencia de diseño tiene la dimensión de l/longitud2 y se puede considerar como una propiedad intrínseca del dispositivo independientemente del tamaño del dispositivo, las profundidades del canal, las condiciones en funcionamiento de cizallamiento y el tamaño de retención.
El "índice de eficiencia de diseño'' puede ser un buen indicador para la utilidad de un diseño de dispositivo. Los dispositivos con altos índices de eficacia de diseño pueden tener gran producción y pueden ser compactos, ligeros y fáciles de. fabricar. Los índices de eficacia de diseño pueden ser extremadamente útiles para caracterizar los rendimientos intrínsecos de producción de dispositivos de flujos de microfluidos para la filtración de partículas, donde las condiciones de funcionamiento son tales que el flujo es laminar, donde el número de Reynolds Re es bajo, por ej . , <0.01, <0.1, <1, <10, <100 o <500, y donde el intervalo de tamaño de partículas es de entre alrededor de 50 nm y alrededor de 300 pm.
130
Los aspectos y las modalidades de la presente descripción pueden permitir dispositivos de altos índices de eficacia de diseño. Los "índices de eficacia de diseño" de varios ejemplos de modalidades de la presente descripción se calculan y describen en la sección de ejemplos a continuación.
Se aprecia que los aspectos y las modalidades de la presente descripción pueden permitir que dispositivos de filtración, en particular dispositivos de separación de microfluidos , comprendan características de diseño que mejoren significativamente el rendimiento y la rentabilidad del dispositivo, según se caracterizó por el volumen de retención, la densidad de unidad de filtración, la velocidad normalizada de procesamiento y/o los criterios de medición del índice de eficiencia de diseño.
SISTEMAS
Sistema de bolsa para filtración de partículas
En algunas modalidades de la presente descripción, los dispositivos de alta densidad de módulos están alojados en un cartucho de filtros y están, conectados a bolsas y líneas de tubos para formar un sistema cerrado. Dichos sistemas pueden ser particularmente útiles para aplicaciones clínicas, por ej . , reducción del volumen de sangre del cordón umbilical, separación de los componentes de la sangre periférica, 131
aislamiento de células madre del líquido amniótico, filtración de la médula ósea, reducción de leucocitos, separación de plasma, generación de fracciones vasculares estromales (SVF) , etc. La muestra de partículas que se está procesando puede no estar expuesta a contaminantes externos . Además, la muestra de partículas puede estar contenida en el sistema, reduciendo así riesgos biológicos al operador.
Las Fig. 26A-26E muestran una modalidad de un cartucho de filtros que comprende un alojamiento 260 y varios dispositivos de alta densidad de módulos 261. El alojamiento 260 puede comprender un canal de alimentación 262, un canal de recolección de retentado 263 y un canal de recolección de filtrado 264. Los canales se pueden conectar a los accesorios 265, 266, 267 de modo que el cartucho se pueda conectar al tubo para formar un sistema de bolsa. El cartucho 260 puede distribuir el alimento a través de los dispositivos de alta densidad de módulos 261 de modo que los dispositivos puedan procesar el alimento en paralelo para lograr alta producción volumétrica. El cartucho 260 puede recolectar también el retentado y filtrado de los dispositivos de alta densidad de módulos 261. Tal como se muestra en las Fig. 26D y 26E, varios dispositivos de alta densidad de módulos 261 se pueden apilar usando empaquetadoras 268 para proporcionar un sellado adecuado de modo que el alimento, el retentado y el filtrado no se propaguen. De manera alternativa, los dispositivos de alta densidad de módulos 261 pueden estar pegados o unidos.
Las diversas partes del cartucho de filtros pueden estar pegadas, unidas, unidas por ultrasonido, engrapadas o atornilladas. El alojamiento del cartucho puede estar hecho de plástico usando técnicas de fabricación estándar, tales como moldeo por inyección, grabado en relieve, moldeo, grabado en relieve caliente, estereolitografía, maquinado, etc. El material plástico para el alojamiento puede incluir, de modo no taxativo, copolímero de olefina cíclica (COC) , polímero de olefina cíclica (COP) , policarbonato, polietileno, polipropileno, polimetilmetacrilato (PMMA) , materiales sensibles a la presión, teflón, acrílico, polietersulfona, politetrafluoroetileno, etc. Las empaquetadoras pueden estar hechas de materiales de caucho, tales como silicona, látex, neopreno, caucho de vinilo, usando técnicas estándar, tales como troquelado, moldeo, sistema de chorro de agua, etc.
Las Fig. 27A-27C muestran un sistema de bolsa que comprende un cartucho 270 que comprende varios dispositivos de alta densidad de módulos, una bolsa de recolección de filtrados 273 y una bolsa de recolección de retentado 272. Las bolsas 272, 273 se pueden conectar al cartucho 270 usando tubos 275, 276. La entrada de alimentación del cartucho 270 133
se puede conectar a un adaptador 271 usando un tubo 274. El adaptador 271 puede comprender una canaleta diseñada para penetrar una bolsa ' de recolección de muestras 278 en un puerto 279 (Fig. 27B) y permitir que las partículas de alimentación en la bolsa de recolección de muestras 278 entren al cartucho para su filtración. El alimento puede comprender alimentos o partículas descritas anteriormente, por ejemplo, sangre, sangre del cordón umbilical, células madre de sangre periférica, médula ósea, etc. Luego de que se enchufa el adaptador 271 en la bolsa de recolección de muestras 278, el sistema de bolsa puede colgar en la gravedad (Fig. 27C) , lo que puede dirigir el alimento a través de los dispositivos de alta densidad de módulos. De manera alternativa, se puede aplicar una presión para apretar la muestra de muestra 278 para dirigir la muestra a través del cartucho de filtros 270. De manera alternativa, se puede aplicar una bomba peristáltica para bombear los fluidos. La bolsa de recolección de muestras 278 puede comprender adicionalmente una aguja 2710 para facilitar la recolección de muestras desde una fuente de muestras, tal como un paciente o un cordón umbilical.
La capacidad volumétrica de las bolsas puede depender de la aplicación específica para la cual se diseñó el sistema. Con fines de depósito de' sangre del cordón 134
umbilical, la sangre del cordón umbilical se recoge de un cordón umbilical. La bolsa de muestras 278 puede ser capaz de acomodar un intervalo de alrededor de 20ml a alrededor de 250ml de sangre de cordón umbilical, más un intervalo de alrededor de Oml a alrededor de 400ml de anticoagulantes o aditivos. Se pueden usar citrato fosfato dextrosa (CPD) y heparina como anticoagulantes para la recolección de sangre del cordón umbilical. Los aditivos pueden comprender solución salina tamponada con fosfato, solución salina balanceada de Hank, un expansor de sangre, un medio de crecimiento de células madre, factores de crecimiento, etc. El anticoagulante o los aditivos se pueden precargar en la bolsa de recolección de sangre 278. En una modalidad de la presente descripción, una bolsa de recolección de muestras para sangre del cordón umbilical puede contener alrededor de 25ml a 35ml de CPD y puede tener la capacidad de recolectar hasta 20 Oml de sangre del cordón umbilical.
En el depósito de sangre del cordón umbilical, se puede procesar la sangre del cordón umbilical para reducir el volumen de sangre antes del congelamiento. Esta práctica puede reducir el costo de almacenamiento de largo plazo. Se puede usar una modalidad de sistema de bolsa de la presente descripción para la reducción del volumen de sangre del cordón umbilical, donde el sistema de bolsa . comprende 135
dispositivos de alta densidad de módulos diseñados para separar glóbulos -rojos y plasma del retentado. El retentado puede comprender células madre hematopoyéticas, células progenitoras , células formadoras de colonias y células CD34+. El retentado se puede mezclar con un medio de congelamiento, por ej . , sulfóxido de dimetilo (DMSO) , y se puede congelar en condiciones de criopreservación para uso terapéutico posterior. La bolsa de recolección de retentado 272 puede comprender una bolsa de congelamiento de criopreservación. En otra modalidad de la presente descripción, la bolsa de recolección de retentado puede comprender una bolsa de congelamiento de criopreservación que comprende al menos 2 compartimentos. En aun otra modalidad de la presente descripción, la bolsa de recolección de retentado puede comprender una bolsa de congelamiento de criopreservación con una capacidad de 25 mi.
Un sistema de bolsa puede comprender además una regleta de terminales 277 en el tubo de alimentación, tubo de retentado o tubo de filtrado para controlar el flujo de fluidos en el sistema de bolsa (Fig. 27) .
En otra modalidad de la presente descripción, se puede conectar una bolsa de recolección de muestras 281 a un cartucho de filtros 280 usando una línea de tubos 285 (Fig. 28) . El sistema puede comprender además una regleta de 136
terminales 287, que al principio puede estar en una posición cerrada. La muestra, por ej . , sangre, sangre del cordón umbilical, médula ósea, etc. se puede recolectar usando una aguja 284 desde una fuente, por ej . , un paciente, un cordón umbilical, etc. El sistema comprende opcionalmente una segunda aguja que se puede usar cuando la primera aguja esté obstruida. Luego de que se completó la recolección de muestras, se puede cambiar la regleta de terminales 287 a la posición abierta para permitir la conexión de líquidos entre la bolsa de muestras 281 y el cartucho de filtros 280. La muestra puede ser dirigida por una fuerza motriz, tal como gravedad, una presión o una bomba peristáltica.
Sistema de tubos para filtración de partículas
En otra modalidad de la presente descripción, se puede incorporar un dispositivo de alta densidad de módulos en un sistema de tubos para la filtración de muestras. El sistema de tubos puede comprender un tubo de centrífuga 290, una inserción de tubo 291 y una tapa 292 (Fig. 29). La inserción de tubo 291 puede comprender un dispositivo de alta densidad de módulos 293, un depósito de muestra de alimentación 294, un depósito de salida 295 y, opcionalmente, un depósito de fluido portador 296 (Fig. 30) . El depósito de salida puede estar diseñado para contener el filtrado o retentado desde el dispositivo de alta densidad de módulos 293.
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Para usar el sistema de tubos se puede agregar lá muestra de alimentación al depósito de muestras de alimentación. Opcionalmente se puede agregar un fluido portador al depósito de fluido portador. El fluido portador puede comercializarse junto con el sistema de tubos como un kit. El fluido portador se puede desgasificar para reducir el riesgo de formación de burbujas en el dispositivo de alta densidad _ de módulos o puede estar preempaquetado en una botella al vacío, es decir, a una presión en un intervalo de alrededor de 0.05 atm a alrededor de 0.95 atm. De manera alternativa, el fluido portador se puede cargar previamente en una inserción de tubo que está sellada usando un papel, por ej . , papel aluminio.
El dispositivo de alta densidad de módulos puede separar una muestra de alimentación en dos fracciones. Se puede recolectar una fracción en el tubo (290 en la fig. 29) y la otra fracción se puede recolectar en la inserción de tubo. En una modalidad, el retentado se puede recolectar en el tubo. En otra modalidad, el filtrado se puede recolectar en el tubo. En aun otra modalidad, las muestras de alimentación se pueden fraccionar en tres o más fracciones. Se. pueden recolectar dos o más fracciones de salida usando la inserción .
138
Para hacer funcionar el sistema de tubos (Fig. 29) , se puede insertar la inserción de tubos 291 en el tubo 290. Se pueden agregar un fluido portador y una muestra de alimentación al fluido portador y depósitos de muestra, respectivamente. Luego se puede colocar la tapa 292 para cerrar el tubo. El sistema de tubos puede ser dirigido por gravedad. De manera alternativa, el sistema de tubos puede ser dirigido por fuerza centrífuga, es decir, el sistema de tubos ensamblado se puede hilar en una centrifugadora. El tubo en el sistema puede ser un tubo de centrífuga listo para usar estándar, por ej . , un tubo de centrífuga de 50 mi, 15 mi o 10 mi, un tubo de microcentrífuga listo para usar estándar, por ej . , un tubo de microcentrífuga de 2 mi, 1.5 mi o 1 mi, o un tubo hecho a la medida no estándar de cualquier medida deseada.
Sistema de cartuchos y sistema de placas para filtración de partículas
En otra modalidad de ,1a presente descripción, un dispositivo de filtración puede estar conectado a pocilios para formar un cartucho para la filtración de muestras. El cartucho puede comprender un dispositivo de filtración y pocilios o depósitos para alojar una muestra de alimentación, retentado, filtrado o fluido portador. El cartucho puede comprender varios dispositivos de filtración y varios conjuntos de depósitos para facilitar la filtración de varias muestras. Los depósitos en el cartucho se pueden sellar con una película, por ej . , una película de plástico, una película de aluminio, etc.
En otras modalidades de la presente descripción, un dispositivo de filtración puede estar conectado a pocilios para formar un sistema de placas para la filtración de muestras. El sistema puede comprender un dispositivo de filtración y pocilios para alojar los fluidos de entrada y salida. El dispositivo de filtración puede comprender un módulo de filtros, un módulo de doble filtro, un módulo de filtros en cascada, un módulo de varios filtros, un dispositivo de alta densidad de módulos o cualquier configuración de filtros descrita en la presente descripción.
Las Fig. 31A-31C muestran una modalidad de sistema de placas de la presente descripción, que comprende un dispositivo de alta densidad de módulos 3105, un pocilio de muestra 3101, un pocilio de fluido portador 3102, un pocilio de filtrado 3103 y un pocilio de retentado 3104. Para usar el sistema se pueden cargar una muestra de alimentación y un fluido portador en el pocilio de muestra 3101 y el pocilio de fluido portador 3102, respectivamente. Luego se puede aplicar una presión al pocilio de muestra 3101 y al pocilio de fluido portador 3102 para dirigir los fluidos a través de los conjuntos de depósitos para facilitar la filtración de varias muestras. Los depósitos en el cartucho se pueden sellar con una película, por ej . , una película de plástico, una película de aluminio, etc.
En otras modalidades de la presente descripción, un dispositivo de filtración puede estar conectado a pocilios para formar un sistema de placas para la filtración de muestras. El sistema puede comprender un dispositivo de filtración y pocilios para alojar los fluidos de entrada y salida. El dispositivo de filtración puede comprender un módulo de filtros, un módulo de doble filtro, un módulo de filtros en cascada, un módulo de varios filtros, un dispositivo de alta densidad de módulos o cualquier configuración de filtros descrita en la presente descripción.
Las Fig. 31A-31C muestran una modalidad de sistema de placas de la presente descripción, que comprende un dispositivo de alta densidad de módulos 3105, un pocilio de muestra 3101, un pocilio de fluido portador 3102, un pocilio de filtrado 3103 y un pocilio de retentado 3104. Para usar el sistema se pueden cargar una muestra de alimentación y un fluido portador en el pocilio de muestra 3101 y el pocilio de fluido portador 3102, respectivamente. Luego se puede aplicar una presión al pocilio de muestra 3101 y al pocilio de fluido portador 3102 para dirigir los fluidos a través de los 140
dispositivos de filtración 3105. De manera alternativa, se puede aplicar un vacío leve al pocilio de filtrado 3103 y el pocilio de retentado 3104 para dirigir los fluidos. El filtrado y retentado se pueden recolectar en un pocilio de filtrado 3103 y un pocilio de retentado 3104, respectivamente .
Varios sistemas de placas tal como se describió anteriormente se pueden realizar en paralelo como un sistema de placas. Las Fig. 32A-32D muestran una modalidad de sistemas de placas de 96 pocilios de la presente descripción, que comprende varios dispositivos de alta densidad de módulos y 96 pocilios en un formato de placa de 96 pocilios. Este sistema puede tener la ventaja de usar un formato de placa de 96 pocilios y se puede integrar en un flujo de trabajo estándar usando pipeteo y estaciones de trabajo o robots de procesamiento. Este sistema puede tener la ventaja adicional de procesar varias muestras en un sistema, sea simultánea o consecutivamente. De manera alternativa, un sistema de placas puede estar diseñado y llevado a cabo en otros formatos de placas estándar, por ej . , una placa de 6 pocilios, una placa de 384 pocilios, etc. Adicionalmente , un sistema de placas puede estar diseñado y hecho en otros formatos de placas no estándar sin apartarse del espíritu de la presente descripción.
141
Las partículas y los fluidos implicados en el sistema de cartuchos o el sistema de placas se pueden transferir de manera manual o usando un instrumento automatizado, tal como un robot de pipeteo.
Otros formatos de sistemas para filtración de partículas
Otro sistema de diversos formatos puede estar diseñado y llevado a cabo sin apartarse del espíritu de la presente descripción. Por ejemplo, los dispositivos de filtración pueden estar integrados con depósitos y puntas de aplicación para distribuir el filtrado, el retentado y, opcionalmente , otras fracciones en tubos de prueba o placas multi -pocilio . En otra modalidad de la presente descripción, se conecta un dispositivo a Vacutainers .
Técnicas de fabricación de sistemas
De acuerdo con algunas modalidades, los sistemas, tal como se describe anteriormente, pueden estar hechos de plástico usando técnicas de fabricación estándar, tales como moldeo por inyección, grabado en relieve, moldeo, grabado en relieve caliente, estereolitografla, etc. El material plástico para el alojamiento puede incluir, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS) , copolímero de olefina cíclica (COC) , polímero de olefina cíclica (COP) , policarbonato, polietileno, polipropileno, polimetilmetacrilato (PMMA) , 142
materiales sensibles a la presión, teflón, acrílico, polietersulfona, politetrafluoroetileno, etc. Los sistemas se pueden esterilizar usando técnicas de esterilización estándar, por ej . , irradiación gamma, esterilización de óxido de etileno (EO) , iluminación de luz ultravioleta, etc.
Funcionamiento de dispositivos y sistemas
En varios aspectos y modalidades de la presente descripción, las partículas y los fluidos se pueden dirigir a través de un dispositivo o sistema usando un flujo de fluidos, una presión de conducción, un vacío, una altura de cabezal, gravedad, una fuerza centrífuga, una fuerza magnética, una acción capilar, un campo eléctrico, un campo electroforético, un campo dielectroforético, una fuerza electroosomótica, una fuerza electrocinética o una combinación de las fuerzas anteriores. Asimismo, para un dispositivo o un sistema que comprende una bolsa flexible, se puede crear una presión de conducción aplicando una presión en la bolsa. Por ejemplo, una bolsa puede estar colocada entre dos placas rígidas . Se puede crear y controlar una presión dentro de la bolsa controlando el espacio entre las placas o la presión ejercida en las placas.
Las partículas y los fluidos también pueden ser • dirigidos o transferidos usando una o más. bombas, bombas peristálticas, bombas de jeringa, una centrifugadora o una 143
combinación de las anteriores, pueden ser controlados usando una o más válvulas o regletas de terminales, por ej . , válvulas de pinza, válvulas de control, válvulas de ventilación, regletas de terminales, etc. Asimismo, las partículas y los fluidos se pueden transferir también dentro de un sistema cerrado, en un sistema abierto, usando pipetas, usando pipetas robotizadas, usando la succión de uno o más Vacutainers o una combinación de los anteriores.
Los ' aspectos y las modalidades de dispositivos y sistemas de la presente descripción también pueden operarse con control de temperatura. El control de temperatura, por ej . , elementos de calefacción, elementos de enfriamiento y componentes de termómetro, se puede incorporar en un dispositivo o sistema con el fin de aumentar la reproducibilidad del proceso de filtración u optimizar el proceso de filtración. Por ejemplo, en la preparación de fracciones vasculares estromales (SFV) , puede ser ventajoso establecer la temperatura del dispositivo entre alrededor de 25 °C y alrededor de 37 °C para reducir la viscosidad de los fluidos que se están procesando.
Empaquetamiento y kits
En otra modalidad de la presente descripción, un dispositivo o sistema se puede cargar previamente o rellenar previamente con reactivos, por ej . , fluidos portadores. En 144
aun otra modalidad de la presente descripción, un dispositivo o sistema se puede empaquetar con reactivos, un manual de usuario, instrucciones, etiquetas, protocolos de funcionamiento, hojas de trabajo de datos, partes descartables , tubos de recolección, puntas de pipetas, pipetas de transferencia, Vacutainers, tiras de prueba, biochips, tiras de prueba de flujo lateral, una cámara de conteo de células, un hemacitómetro y/u otros dispositivos para formar un kit. Varios dispositivos o sistemas se pueden empaquetar y comercializar como un kit. En otra modalidad de la presente descripción, se puede esterilizar un dispositivo, sistema o kit. En aun otra' modalidad de la presente descripción, se puede empaquetar individualmente un dispositivo o sistema para beneficios adicionales de esterilización.
Se entiende que las diversas modalidades descritas en la presente son únicamente a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance de la descripción. Varias modificaciones, combinaciones y variaciones del método y dispositivo descritos de la descripción serán aparentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la descripción. Por ejemplo, varios de los materiales y las estructuras descritos en la presente se pueden sustituir con otros materiales y estructuras sin apartarse del espíritu de 145
la descripción. Asimismo, un flujo de fluidos descrito en la presente se puede sustituir con un campo eléctrico, un campo electroforático, flujo electrocinético, gravedad o una fuerza centrífuga. Se entiende también que las diversas teorías y explicaciones descritas en la presente no pretenden ser taxativas. Por ejemplo, las modalidades descritas en la presente pueden utilizar un flujo de fluidos, una pérdida de presión, una presión hidrodinámica, una fuente de presión, un > vacío, una altura de cabezal, gravedad, una fuerza centrífuga, un campo eléctrico, un campo electroforético, una fuerza electrocinética o una combinación de los anteriores para dirigir las partículas sin apartarse del espíritu de la descripción.
Se aprecia que mientras los filtros en varias de las modalidades descritas en la presente comprenden pilares y poros, se pueden utilizar otros diseños de filtros que comprenden poros que usan exclusión de flujo u otros mecanismos de filtración sin exclusión por tamaño sin apartarse del espíritu de la descripción. Se aprecia también que las modalidades de la presente descripción se pueden combinar con otros componentes o procesos para formar un dispositivo, sistema o instrumento más complicado.
146
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Separación de microesferas de polímeros y medición de tamaño de retención
Las microesferas de polímeros fluorescentes de 3.0 µ?? y 6.9 pm de diámetro se separaron usando un dispositivo que comprende un módulo de doble filtro tal como se ilustra en la Fig. 14B. El módulo de doble filtro comprendía canales y cámaras de 30 pm de profundidad, y dos filtros que comprendían 165 pilares cada uno. Los pilares tenían 30 pm de altura y 12 pm de separación, creando así poros que tienen tamaños de poros físicos de 12 pm. La cámara de retentado y cámara de filtrado se diseñaron de modo que la velocidad de flujo a través de un poro fuera entre alrededor de 0.22% y alrededor de 0.28% de la velocidad de flujo en la entrada de cámara de retentado. El módulo de doble filtro tenía alrededor de 4 mm de largo y 0.25 mm de ancho.
El dispositivo se fabricó en silicio, usando técnicas de microf bricación estándar. Se usó fotolitografía y grabado reactivo de silicio profundo para crear los canales de fluidos, cámaras y estructuras de filtro. La profundidad de grabado fue 30 pm. El sustrato de silicio se selló en el canal grabado frente a un disco de vidrio para formar canales de fluidos cerrados usando unión anódica. El disco unido se puede cortar luego en dispositivos individuales. El dispositivo se acopló de forma mecánica a un cierre plástico con depósitos de fluidos externos para proporcionar fluidos de muestra.
El fluido de muestra comprendió microesferas de polímero fluorescente de 3.0 µp? y 6.9 m de diámetro suspendidas en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía 1% de albúmina de suero bovino. La densidad de las microesferas fue 1.05 g/cm3. Las concentraciones volumétricas de las microesferas de 3.0 pm y 6.9 pm en el fluido de muestra fueron 0.00004% y 0.00048%, respectivamente, que fue alrededor de 28 microesferas por cada µ? . Con dichas concentraciones, las interacciones entre partículas son poco importantes.
El dispositivo se montó en un microscopio de fluorescencia para visualizar las microesferas de polímero fluorescente. Se agregó un fluido portador al depósito de fluido portador en la cerradura de plástico para preparar el dispositivo. El fluido portador comprendía solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía 1% de albúmina de suero bovino. El fluido de muestra se agregó posteriormente al depósito de muestra. Ambos depósitos se levantaron luego por encima del nivel de los depósitos de retentado y de filtrado para crear una altura de cabezal de alrededor de 30 cm. Los fluidos se dirigieron a través del 148
dispositivo mediante gravedad y la altura de cabezal. La velocidad de flujo promedio en el módulo de doble filtro fue de alrededor de 1.5 cra/s, que corresponde a un número de Reynolds en las cámaras de alrededor de 0.45. La profundidad del canal se usó como la longitud característica en el cálculo del número de Reynolds. El flujo es laminar en tal número de Reynolds .
Las microesferas de polímero fluorescente que fluyen a través del dispositivo se contaron manualmente mientras egresaban del módulo de doble filtro. Los resultados se muestran de la siguiente manera:
Diámetro de
No Retención
microesfera Retenido
retenido Tasa
s
3.0 µp? Ó 20 0%
6.9 pm 258 3 99%
Las1 microesferas de 3.0 pm representan el punto de referencia donde ocurre poca retención y tiene una tasa de retención de alrededor de 0%. La tasa de retención para las microesferas de 6.9 pm es alrededor de 99%, lo que es considerablemente mayor que el punto de referencia establecido por las microesferas de 3.0 pm. Se determina .149
entonces que el "tamaño de retención" del módulo de doble filtro está en el intervalo de 3.0 µp? a 6.9 µ??, que es <58% del tamaño de poro físico de 12 µp? Para el módulo de doble filtro que tiene dicho tamaño de retención, el "tamaño de poro eficaz" de los poros constitutivos no debe ser mayor a 6.9 µp?. El ejemplo de dispositivo en el presente tiene un tamaño de poro eficaz de <58% del tamaño de poro físico.
Se aprecia que se puede aplicar el ejemplo de método para usar microesferas de polímeros para medir el tamaño de retención y el tamaño de poro eficaz a otros dispositivos de filtración como una prueba estándar para caracterizar los tamaños de retención, independientemente del uso pretendido de los dispositivos de filtración. Por ejemplo, los dispositivos usados en los Ejemplos 2, 3, 4 y 5 a continuación se pueden caracterizar usando microesferas de polímeros, aun aunque los dispositivos se pretendieran para el procesamiento celular.
Ejemplo 2. Aislamiento de leucocitos desde sangre periférica total
Los leucocitos se aislaron de la sangre periférica total usando un dispositivo de alta densidad de módulos.
El ejemplo de dispositivo fue un dispositivo de alta densidad de módulos tal como se ilustra en la Fig. 24B que comprende 72 unidades de filtración (249 en la Fig. 24B) , 150
cada uno comprende un módulo de doble filtro, un puerto de entrada de fluido portador (247 en la Fig. 24B) , un puerto de entrada de muestra, un puerto de salida de retentado, dos puertos de salida de filtrado y canales que conectan el módulo de doble filtro y los puertos. Los canales y las cámaras en el dispositivo tenían 30 pm de profundidad. Los módulos de doble filtro comprendían cada uno 2 filtros que comprendían 240 poros cada uno. Cada poro tenía una sección transversal de 30 pm x 12 pm, teniendo así un tamaño de poro físico de 12 pm. Las cámaras de retentado y cámaras de filtrado de los módulos de doble filtro se diseñaron de modo tal que la tasa de flujo a través de un poro fuera de entre alrededor de 0.12% y alrededor de 0.18% de la tasa de flujo en la entrada de la cámara de retentado. El dispositivo tenía 25 mm de longitud, 24 mm de ancho, 0.6 mm de espesor y tenía un espacio de 600 mm2 (25 mm x 24 mm) .
Usando el método descrito en el Ejemplo 1, se midieron el tamaño de poro eficaz y el tamaño de retención. Se estimó que el tamaño de retención del dispositivo fue de alrededor de 4 pm, lo que es significativamente más pequeño que el tamaño de poro físico de 12 pm.
El dispositivo se fabricó en silicio usando técnicas de microfabricación estándar. Se usó fotolitografía y grabado reactivo de silicio profundo para crear los canales de 150
cada uno comprende un módulo de doble filtro, un puerto de entrada de fluido portador (247 en la Fig. 24B) , un puerto de entrada de muestra, un puerto de salida de retentado, dos puertos de salida de filtrado y canales que conectan el módulo de doble filtro y los puertos. Los canales y las cámaras en el dispositivo tenían 30 pm de profundidad. Los módulos de doble filtro comprendían cada uno 2 filtros que comprendían 240 poros cada uno. Cada poro tenía una sección transversal de 30 pm x 12 pm, teniendo así un tamaño de poro físico de 12 pm. Las cámaras de retentado y cámaras de filtrado de los módulos de doble filtro se diseñaron de modo tal que la tasa de flujo a través de un poro fuera de entre alrededor de 0.12% y alrededor de 0.18% de la tasa de flujo en la entrada de la cámara de retentado. El dispositivo tenía 25 mm de longitud, 24 mm de ancho, 0.6 mm de espesor y tenía un espacio de 600 mm2 (25 mm x 24 mm) .
Usando el método descrito en el Ejemplo 1, se midieron el tamaño de poro eficaz y el tamaño de retención. Se estimó que el tamaño de retención del dispositivo fue de alrededor de 4 pm, lo que es significativamente más pequeño que el tamaño de poro físico de 12 pm.
El dispositivo se fabricó en silicio usando técnicas de microfabricación estándar. Se usó fotolitografía y grabado reactivo de silicio profundo para crear los canales de fluidos, cámaras y estructuras de filtro. La profundidad de grabado fue 30 µt?. El sustrato de silicio se selló en el canal grabado frente a un disco de vidrio para formar canales de fluidos cerrados usando unión anódica. El disco unido luego se cortó en dos dispositivos individuales. El dispositivo se acopló de manera mecánica a un cierre de plástico que comprende muestra externa, fluido portador y depósitos de filtrado y retentado.
Se usó sangre periférica total humana para las muestras en este ejemplo. La sangre se extrajo de donantes adultots que dieron su consentimiento usando K2EDTA, ACD o Vacutainers de heparina (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey) . Los hematocritos de las muestras de sangre fueron alrededor de 40%. Las sangres contuvieron más de 4 mil millones de eritrocitos por mi. El hematrocrito es la proporción de volumen de sangre que es ocupada por glóbulos rojos. La sangre se procesó a temperatura ambiente dentro de seis horas luego de la extracción. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía 0.5% de albúmina de suero bovino y 2 m de K2EDTA se usó como el fluido portador.
Se agregaron 8 mi del fluido portador al depósito de fluido portador en el cierre de plástico para preparar el dispositivo. Luego se agregaron 4 mi de sangre total al' depósito de muestra. Ambos depósitos de levantaron luego por 152
encima del nivel de los depósitos de retentado y de filtrado para crear una altura de cabezal de alrededor de 40 cm. La sangre y el fluido portador se dirigieron a través del dispositivo mediante gravedad y la altura de cabezal. El filtrado y el retentado se recogieron en los depósitos de filtrado y retentado, respectivamente. Después de alrededor de 40 minutos, la sangre se procesó completamente a través del dispositivo. Luego se midieron el filtrado y el retentado y se analizaron usando un conteo de células automatizado (Analizador de la hematología Coulter AcT diff, Beckman Coulter, Fullerton, California) . La viabilidad de los leucocitos aislado se midió inmediatamente después de la ejecución, usando yoduro de propidio, una tinción que impregnó células con membranas comprometidas, un hemacitómetro y un microscopio de fluorescencia.
Los volúmenes de retentado y filtrado resultantes fueron alrededor de 3.5 mi y 7.6 mi, respectivamente. Los leucocitos se recogieron en el fluido portador como el retentado. Este experimento se llevó a cabo dos veces, usando muestras de sangre de dos donantes diferentes. Los resultados se muestran en la Fig. 33. En promedio, la producción de procesamiento de sangre total fue de alrededor de 5.4 ml/hr. El dispositivo demostró la capacidad de procesar más de 6 millones de células por segundo. La retención de leucocitos 1 5 3
fue de alrededor de 94 % , el remanente de eritrocitos fue de alrededor de 2 % y el remanente de plaquetas fue < 1 % . Aquí, el remanente de eritrocitos y el remanente de plaquetas se refieren a las tasas de retención de eritrocitos y plaquetas, respectivamente. La viabilidad de leucocitos luego del procesamiento fue indistinguible dentro del error de medición de la anterior al procesamiento. Las mediciones mostraron que el dispositivo y el proceso de aislamiento no reducen la viabilidad de leucocitos y qué el dispositivo es capaz de aislar leucocitos con > 99 % de viabilidad.
Los criterios de medición de rentabilidad y rendimiento se muestran a continuación. El . volumen de retención de un módulo de filtración en el ejemplo de dispositivo fue de alrededor de 0 . 03 µ? . Cada unidad de filtración comprendió 4 8 0 pilares y ocupó un espacio de menos de 8 . 4 mm2 (es decir, un espacio de dispositivo de 25 mm x 24 mm dividido entre 72 unidades de filtración) . Con una profundidad de canal de 3 0 µ?t? , un espacio de dispositivo de 600 mm2 ( 25 mm x 24 mm) y 72 unidades de filtración en el dispositivo, la "densidad de la unidad de filtración" del dispositivo fue por lo tanto
72
Den sidad de unidad de filtración = —— ——— = 4,000 unidades de filtración por cms
La "velocidad normalizada de procesamiento" del ejemplo de dispositivo se calcula de la siguiente manera:
154
6 x 106 s~l
Velocidad normalizada de procesamiento = = 0.33 x 106 .<>~????~3
(25 mm x 24 mm) x (0.03 mm)
Dicha "velocidad normalizada de procesamiento" significa que cada milímetro cúbico de la estructura de filtros y de canal en este dispositivo contribuye al procesamiento de 0.33 x 106 células por segundo.
El índice de eficiencia de diseño del ejemplo de dispositivo se calcula a continuación.
Producción de procesamiento
del alimento: Q = 5.4 ml/hr = 1.5 mm3/s
Profundidad característica de
canal: D = 30 µt? = 0.03 mm
Espacio del dispositivo: A = 25 mm x 24 mm = 600 mm2
Tamaño de retención: R = 4 xm = 0.004 mm
Tasa de cizallamiento: S = 1900 s"1 (calculado a con inuación)
La tasa máxima de cizallamiento que puede experimentar un glóbulo sanguíneo de alimentación en el dispositivo ocurre en la superficie del canal de entrada de alimentación de acuerdo con el modelamiento por computadora. La tasa máxima de cizallamiento se puede calcular usando dinámica de fluidos por computadora o se puede estimar analíticamente de la siguiente manera asumiendo que el perfil de flujo es parábolico en el canal de entrada de alimentación. A partir
155
del hecho de que el dispositivo contiene 144 canales de
entrada de alimentación (2 por módulo, 72 módulos) y que cada
canal de entrada tiene una sección transversal conocida de 70
pm x 30 µtt?, se calcula que la velocidad de flujo promedio
< v > en el canal de entrada de alimentación es
La tasa de cizallamiento en la superficie del canal de
entrada de alimentación asumiendo un perfil de flujo
parabólico es por lo tanto
< v >
S 6 x— -s lOOO s 1
30 µ?t?
El índice de eficiencia de diseño {D.E.I.) del ejemplo de dispositivo es por lo tanto
Q 1.5mm3/s
' ' ~ ADSR2 ¾ 600mm2 x0.03mm x l000s-1 x (0.004mm)2 ~ ' mm
De manera similar, se puede calcular el índice de
eficiencia de diseño (D.E.I.) de una unidad de filtración del
ejemplo de dispositivo. Dado que había 72 unidades de
filtración en el dispositivo, cada unidad de filtración contribuyó a una' producción de procesamiento del alimento de
0.0208 mm3/s (1.5 mm3/s dividido entre 72) . El espacio
promedio de una unidad de filtración es 8.33 mm2 (25 mm x 24
mm ÷ 72) . El índice de eficiencia de diseño (D.E.I.) de una 156
unidad de filtración es por lo tanto
Q 0.0208mm3/s
ADSR2 ¾ 8.33mm2x0.03mm xlOOOs-ixCO.OO^m)2 = ' mm
A pesar que el dispositivo tiene una producción de
procesamiento mucho mayor que una única unidad de filtración,
el índice de eficiencia de diseño para la unidad de filtración es exactamente el mismo que el del dispositivo. Se aprecia que se puede usar tanto como microesferas de polímero
como una prueba estándar para medir el tamaño de retención de un dispositivo independientemente del uso pretendido, se
puede usar el índice de eficiencia de diseño como una característica estándar de un dispositivo independientemente
de sus tamaños de los canales, tasas de flujo de funcionamiento y. tamaños de retención.
Ejemplo 3. Reducción de leucocitos de sangre total
El ejemplo de dispositivo en el Ejemplo 2 puede servir como filtro para leucorreducción. El filtrado del dispositivo contuvo solamente 6% o menos de los leucocitos que entran al
dispositivo. El Ejemplo 2 mostró que se pueden usar los dispositivos de la presente descripción para reducir leucocitos de la sangre total . También se pueden usar otras configuraciones de dispositivos, con o sin un fluido portador, como filtros para leucorreducción.
Ejemplo 4. Aislamiento de linfocitos de sangre periférica
Los linfocitos se aislaron de la sangre periférica usando un dispositivo de alta densidad de módulos.
El ejemplo de dispositivo fue un dispositivo de alta densidad de módulos que comprende 87 unidades de filtración donde cada una comprende un módulo de filtros en cascada tal como se ilustra en la Fig. 17C. Cada módulo de filtros en cascada comprendió un primer módulo de doble filtro (elemento 171 en la Fig. 17C) y un segundo módulo de doble filtro (elemento 172 en la Fig. 17C) que comprenden una entrada de fluido portador (elemento 175 en la Fig. 17C) . Los canales y las cámaras en el dispositivo tenían 30 pm de profundidad. El primer módulo de doble filtro comprendió 2 filtros que comprendían 116 poros cada uno. Cada poro tenía una sección transversal de 30 pm x 12 pm, teniendo así un tamaño de poro físico de 12 pm. Las cámaras de retentado y cámaras de filtrado del primer módulo de doble filtro se diseñaron de modo tal que la tasa de flujo a través de un poro fuera de alrededor de 0.29% de la tasa de flujo en la entrada de la cámara de retentado del primer módulo de doble filtro. El segundo módulo de doble filtro comprendió 2 filtros que comprendían 120 poros cada uno. Cada poro tenía una sección transversal de 30 pm x 12 pm, teniendo así un tamaño de poro físico de 12 pm. Las cámaras de retentado y cámaras de 158
filtrado del segundo módulo de doble filtro se diseñaron de modo tal que la tasa de flujo a través de cada poro fuera de alrededor de 0.34% de la tasa de flujo en la entrada de la cámara de retentado del segundo módulo de doble filtro. El dispositivo tenía 21 mm de longitud, 24 mm de ancho, 0.6 mm de espesor y tenía un espacio de 504 mm2 (21 mm x 24 mm) .
El dispositivo se fabricó en silicio usando técnicas de microfabricación estándar. Se usó fotolitografía y grabado reactivo de silicio profundo para crear los canales de fluidos, cámaras y estructuras de filtro. La profundidad de grabado fue 30 µt?. El sustrato de silicio se selló en el canal grabado frente a un disco de vidrio para formar canales de fluidos cerrados usando unión anódica. La placa unida luego se dividió en dispositivos individuales. El dispositivo se acopló de manera mecánica a un cierre de plástico que comprende una muestra externa, fluido portador y depósitos de retentado y de filtrado.
Se usó sangre periférica humana para las muestras en este ejemplo. La sangre se extrajo de donantes adultos que dieron su consentimiento usando Vacutainers de K2EDTA (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey) . La sangre se diluyó 1:1 con solución salina balanceada de Hank y se procesó a temperatura ambiente dentro de las 8 horas luego de la extracción. La solución salina balanceada de Hank que 159
contenía 0.5% de albúmina de suero bovino y 2 mM de K2EDTA se usó como el fluido portador.
Se agregaron 10 mi del fluido portador al depósito de fluido portador en el cierre plástico para preparar el dispositivo. Luego se agregaron 8ml de muestra de sangre al depósito de muestra. Ambos depósitos de levantaron luego por encima del nivel de los depósitos de retentado y de filtrado para crear una altura de cabezal de alrededor de 45 cm. La sangre y el fluido portador se dirigieron a través del dispositivo mediante gravedad y la altura de cabezal. El filtrado y el retentado se recogieron en los depósitos de filtrado y retentado, respectivamente. Después de alrededor de 40 minutos, la sangre se procesó completamente a través del dispositivo. Luego se midieron el filtrado y el retentado y se analizaron usando un conteo de células automatizado (Analizador de la hematología Coulter AcT diff, Beckman Coulter, Fullerton, California) , donde los linfocitos, monocitos, granulocitos , eritrocitos y plaquetas se contaron diferencialmente .
Los 8 mi de muestra de sangre y 10ml de entrada de fluido portador dieron como resultado alrededor de 5 mi de retentado y alrededor de 13 mi de filtrado. Los linfocitos se recogieron como el retentado en el fluido portador. Este experimento se llevó a cabo dos veces, usando muestras de 160
sangre de dos donantes diferentes. Los resultados se muestran en las Fig. 34A-34D. La producción del procesamiento promedio fue 9.2 ml/hr y la pureza de linfocitos aislados fue >90%, es decir, de todos los leucocitos en el retentado >90% fueron linfocitos. El remanente de eritrocitos fue <0.5% y el remanente de plaquetas fue <1 . La sangre diluida usada en la presente contuvo más de 2 mil millones de eritrocitos por mi. Por lo tanto, el dispositivo demostró la capacidad de procesar más de 5 millones de células por segundo.
El ejemplo de dispositivo aquí demostró que cada módulo puede aislar linfocitos con alta eficacia y rendimiento, y que varios de dichos módulos pueden funcionar en paralelo como un dispositivo de alta densidad de módulos. Específicamente, cada unidad de filtración comprendió 472 pilares y ocupó un espacio de menos de 5.8 mm2 (es decir, un espacio de dispositivo de 21 mm x 24 mm dividido entre 87 unidades de filtración) . El volumen de retención de un módulo de filtración en el ejemplo de dispositivo fue de alrededor de 0.015 µ? . Con una profundidad de canal de 30 µ?t?, un espacio de dispositivo de 504 mm2 (21 mm x 24 mm) y 87 unidades de filtración en el dispositivo, la "densidad de la unidad de filtración" del dispositivo fue por lo tanto
87
Densidad de unidad de filtración = ——¦ =——— - 5,750 unidades de filtración por cms
504mmz x 0.03)nni2 1
161
La "velocidad normalizada de procesamiento" del ejemplo de índice de dispositivo se calcula de la siguiente manera:
5 x 106 s-1 '
Velocidad normalizada de procesamiento =— *—
(21 mm x 24 mm:)— tttt: r = 0.33 x I 06 .í" linm'¡ x (0.03 mm)
Dicha "velocidad normalizada de ' procesamiento" significa que cada milímetro cúbico de la estructura de filtros y de canal fabricados en este dispositivo contribuye al procesamiento de 0.33 millones de células por segundo.
Este ejemplo tipificó la naturaleza compleja de la exclusión de flujos en algunos aspectos y modalidades de la presente descripción, y cómo se puede usar la exclusión de flujo para aislar los componentes desde un fluido complejo, tal como aislamiento de linfocitos desde la sangre, de manera tal que no. fuera anticipado u obvio en vista de las descripciones previas a la fecha. En particular, todos los tipos importantes de células en la sangre, es decir, eritrocitos, granulocitos , monocitos y linfocitos, .fueron sustancialmente más pequeños que el tamaño de poro físico del dispositivo. Los diámetros de células promedio de eritrocitos, granulocitos, monocitos y linfocitos son de aproximadamente 7 µp?, 8 µt?, 6 µt? y 5 pm, respectivamente. Además, los linfocitos son los componentes más pequeños entre los cuatro tipos principales de células que tienen un volumen de célula promedio de alrededor de 60 fl, en comparación con
162
alrededor de 90 fl, 250 fl y 120 fl para eritrocitos, granulocitos y monocitos, respectivamente. Sin embargo, los linfocitos fueron el único tipo de célula que se . retuvieron sustancialmente por los filtros en el ejemplo de dispositivo, con una tasa de retención de alrededor de 60%, en comparación con las tasas de retención de alrededor de 0% para los otros tipos de células (Fig. 34C) .
Este ejemplo también demostró claramente que el proceso de separación en el ejemplo de aplicación es estocástico, y la retención de partículas se describe mejor usando la probabilidad, es decir, una probabilidad de retención o una tasa de retención. En particular, la senda de migración de un glóbulo sanguíneo puede no estar predeterminada, al menos no solamente predeterminada de acuerdo con un tamaño crítico. Los posibles factores que pueden haber afectado la probabilidad de retención incluyen interacción entre células, movimiento browniano, deformación celular y perturbación de patrones de flujo.
Ejemplo 5. Reducción de volumen de la sangre del cordón umbilical humano y enriquecimiento de células madre hematopoyéticas con alta viabilidad celular
Se redujo el volumen de la sangre del cordón umbilical mientras los leucocitos, las células CD34+ y las células madre formadoras que colonias y células ' progenitoras , 163
incluyendo CFC-G , se recuperaban con alta viabilidad celular usando un dispositivo de alta densidad de módulos.
El dispositivo usado en este ejemplo fue un dispositivo de alta densidad de módulos que comprende 87 unidades de filtración donde cada una comprende un módulo de filtros en cascada tal como se ilustra en la Fig. 17C. Cada módulo de filtros en cascada comprendió un primer módulo de doble filtro (elemento 171 en la Fig. 17C) y un segundo módulo de doble filtro (elemento 172 en la Fig. 17C) . Los canales y las cámaras en el dispositivo tenían 30 µp? de profundidad. El primer módulo de doble filtro comprendió 2 filtros que comprendían 120 poros cada uno. Cada poro tenía una sección transversal de 30 µ?? x 12 m, teniendo así un tamaño de poro físico de 12 µ?t?. Las cámaras de retentado y cámaras de filtrado del primer módulo de doble filtro se diseñaron de modo tal que la tasa de flujo a través de cada poro fuera de alrededor de 0.28% de la tasa de flujo en la entrada de la cámara de retentado del primer módulo de doble filtro. El segundo módulo de doble filtro comprendió 2 filtros que comprendían 320 poros cada uno. Cada poro tenía una. sección transversal de 30 m x 12 pm, teniendo así un tamaño de poro físico de 12 µp?. Las cámaras de retentado y cámaras de filtrado del segundo módulo de doble filtro se diseñaron de modo tal que la tasa de flujo a través de un poro fuera entre 164
alrededor de 0.10% y alrededor de 0.14% de la tasa de flujo en la entrada de la cámara de retentado del segundo módulo de doble filtro. El dispositivo tenia 23 mm de longitud, 24 mm de ancho, 0.6 mm de espesor y un espacio de 552 mm2 (23 mm x 24 mm) .
Se estima que el tamaño de retención del dispositivo fue de alrededor de 4 µ?t?, lo que es significativamente más pequeño que el tamaño de poro físico de 12 µ?t?.
El dispositivo se fabricó en silicio usando técnicas de microfabricación estándar. Se usó fotolitografía y grabado reactivo de silicio profundo para crear los canales de fluidos, cámaras y estructuras de filtro. La profundidad de grabado fue 30 µ?t?. El sustrato de silicio se selló en el canal grabado frente a un disco de vidrio para formar canales de fluidos cerrados usando unión anódica. La placa unida luego se dividió en dispositivos individuales. El dispositivo se acopló de manera mecánica a un cierre de plástico que comprende una muestra externa y depósitos de retentado y de filtrado .
Se usó sangre de cordón umbilical humano para las muestras en este ejemplo. La sangre se recogió de mujeres adultas que · dieron su consentimiento usando bolsas de recolección de sangre del cordón (Fenwal Inc., Round Lake, IL) . Las 'bolsas de recolección de sangre del cordón 165
contuvieron citrato fosfato dextrosa (CPD) como un anticoagulante. La sangre se procesó a temperatura ambiente dentro de las 6 horas luego de la extracción.
Se agregaron al dispositivo 12 mi de sangre del cordón sin dilución adicional. Los . hematocritos de las alimentaciones de sangre del cordón estuvieron en el intervalo de 19% a 45% y en promedio contuvieron 2.8 mil millones de glóbulos rojos por mi. El hematrocrito es la proporción de volumen de sangre que es ocupada por glóbulos rojos. La sangre se dirigió a través del dispositivo mediante gravedad y una altura de cabezal de alrededor de 40 cm. El filtrado y el retentado se recogieron en un depósito de filtrado y un depósito de retentado, respectivamente. Se esperó que los leucocitos, las células CD34+ y las células madre formadoras de colonias y células progenitoras se recuperen como el retentado. Después de alrededor de 1 hora, la sangre se procesó completamente a través del dispositivo. Luego se midieron el filtrado y el retentado y se analizaron usando un contador de células automatizado (Analizador de la hematología Coulter AcT diff, Beckman Coulter, Fullerton, California) para calcular el rendimiento de recuperación de leucocitos. La viabilidad de las células recuperadas se midió inmediatamente ' después de la ejecución, usando yoduro de propidio, una tinción que impregnó células con membranas contuvieron citrato fosfato dextrosa (CPD) como un anticoagulante. La sangre se procesó a temperatura ambiente dentro de las 6 horas luego de la extracción.
Se agregaron al dispositivo 12 mi de sangre del cordón sin ¦ dilución adicional. Los hematocritos de las alimentaciones de sangre del cordón estuvieron en el intervalo de 19% a 45% y en promedio contuvieron 2.8 mil millones de glóbulos rojos por mi. El hematrocrito es la proporción de volumen de sangre que es ocupada por glóbulos rojos. La sangre se dirigió a través del dispositivo mediante gravedad y una altura de cabezal de alrededor de 40 cm. El filtrado y el retentado se recogieron en un depósito de filtrado y un depósito de retentado, respectivamente. Se esperó que los leucocitos, las células CD34+ y Tas células madre formadoras de colonias y células progenitoras se recuperen como el retentado. Después de alrededor de 1 hora, la sangre se procesó completamente a través del dispositivo. Luego se midieron el filtrado y el retentado y se analizaron usando un contador de células automatizado (Analizador de la hematología Coulter AcT diff, Beckraan Coulter, Fullerton, California) para calcular el rendimiento de recuperación de leucocitos. La viabilidad de las células recuperadas se midió inmediatamente después de la ejecución, usando yoduro de propidio, una tinción que impregnó células con membranas comprometidas, un hemacitómetro y un microscopio de fluorescencia. La recuperación de células CD34+ se midió usando citometría de flujo. Para contar las células formadoras de colonias, se mezclaron la sangre del cordón y el retentado con una solución de lisis de cloruro de amonio (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) para lisar los glóbulos rojos, se lavaron y luego cultivaron en un medio de cultivo de metilcelulosa (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) durante 14 días usando un incubador establecido a 37 grados Celsius, 5% de C02 y alta humedad. Luego de 14 días, las colonias CFC-GM se contaron manualmente usando un microscopio invertido.
Los resultados de los experimentos se muestran en las Fig. 35A - 35C. Los leucocitos, las células CD34+ y las células formadoras de colonias (por ej . , (por ej . , CFC-GM) se recuperaron en los retentados con rendimientos de recuperación de alrededor de 88%, 87% y 92%, respectivamente. El dispositivo redujo el volumen de sangre del cordón en un factor de alrededor de 5.4, es decir, los. volúmenes del retentado fueron alrededor de 18.5% del volumen de alimentación de la sangre del cordón. Con dicho factor de reducción del volumen, 100 mi de sangre del cordón se habrían reducido a 18.5 mi. Las viabilidades celulares antes y después del procesamiento fueron' sustancialmente idénticas, dentro del error de medición, y fueron >99%. La producción del procesamiento fue de alrededor de 11.4 ml/hr de promedio. Esta producción es equivalente al procesamiento de alrededor de 9 millones de células por segundo.
La "velocidad normalizada de procesamiento" del ejemplo de dispositivo se calcula de la siguiente manera:
9 x 106 s_1
Velocidad normalizada de p Krocesamiento =—(23 — — --r— r
mm x 24 mm) x (0.03 mm) = 0.54 x 106 s_1mTn"3
Cada milímetro cúbico de estructura de canal y de filtro fabricado en este ejemplo de dispositivo contribuyó al procesamiento de 0.54 millones de células por segundo.
Este ejemplo demostró que el dispositivo utilizado podía concentrar células madre de sangre del cordón y células progenitoras con muy buen rendimiento de recuperación y viabilidad celular. Específicamente, cada unidad de filtración comprendió 880 pilares y ocupó un espacio de menos de 6.4 mm2 (es decir, un espacio de dispositivo de 23 mm x 24 mm dividido entre 87 unidades de filtración) . El volumen de retención de un módulo de filtración en el ejemplo de dispositivo fue de alrededor de 0.04 µ?. Con una profundidad de canal de 30 µ??, un espacio de dispositivo de 552 mm2 (23 mm x 24 mm) y 87 unidades de filtración en el dispositivo, la "densidad de la unidad de filtración" del dispositivo fue por lo tanto
168
87
Densidad de unidad de filtración = = 5,250 unidades de filtración por cm3
552mmz x 0.03mm2
El índice de eficiencia de diseño del dispositivo utilizado se calcula a continuación.
Producción de procesamiento
del alimento: Q = 11.4 ml/hr = 3.17 mm3/s
Profundidad característica de
canal : D = 30 pm = 0.03 mm
Espacio del dispositivo: A = 23 mm x 24 mm = 552 mm2 Tamaño de retención: R = 4 m = 0.004 mm
Tasa de cizallamiento : S = 1900 s"1 (calculado a continuación)
La tasa máxima de cizallamiento en el dispositivo ocurre en la superficie de la cámara de retentado cerca de su entrada. La tasa máxima de cizallamiento se puede calcular usando dinámica de fluidos por computadora o se puede estimar analíticamente de la siguiente manera asumiendo que el perfil de flujo es parábolico en la cámara de retentado. A partir del hecho de que el dispositivo contuvo 87 módulos de filtración y que cada cámara de retentado tuvo una sección transversal conocida de 130 pm x 30 pm en la entrada, se calculó que la velocidad de flujo promedio < v > en la cámara de retentado en la entrada fue
169
3.17 mm3/s
< v >————— — -— - = 9.34 mm/s
87 x (130 µ?? x 30 µ??) '
La tasa de cizallamiento en la superficie de la cámara
de retentado, asumiendo un perfil de flujo parabólico, fue
por lo tanto
< v >
S * 6 x— = 1900 s"1
30 µp?
El índice de eficiencia de diseño (D.E.I.) del ejemplo
de dispositivo es por lo tanto
Q E Q 3.17mm3/s
l ^ ' 6 3 mm~"
" ~ ADSR2 ~ 552mm2x0.03mm x 1900s"1 x(0.004mm)2 ~
Ejemplo 6. Etiquetado de células aisladas
El ejemplo de dispositivo en el Ejemplo 2 puede servir para etiquetar subpoblaciones de células que tienen al menos
un antígeno específico, usando un fluido portador que
comprende anticuerpos contra dicho al menos antígeno
específico. El anticuerpo se puede conjugar a un fluoróforo o
una perla magnética para etiquetar células diana fluorescente
o magnéticamente. Durante el proceso de separación, las células de retentado se dirigen desde la corriente de
alimentación hacia la corriente de fluido portador y se
mezclaron con los anticuerpos. Las células de retentado que
tienen el antígeno específico se etiquetan y recogen como el
retentado. Opcionalmente se puede introducir una solución de
lavado en los módulos de filtración del dispositivo de la 170
misma forma que el flujo portador, para lavar las células mientras fluyen a través de los módulos. El proceso de separación se puede llevar a cabo a una temperatura favorable para el etiquetado de anticuerpo específico. Posteriormente, las células etiquetadas de forma fluorescente se pueden contar y caracterizar usando un citómetro de flujo, y las células etiquetadas de forma magnética se puede aislar usando un imán. Los anticuerpos que se pueden usar para etiquetar subpoblaciones de leucocitos y otras células presentes en la sangre incluyen, anticuerpos anti-CD45, anti-CD34, anti-CD71, anti-CD138, anti-CD14, anti-CD15, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD19, anti-HLA, anti-GPA, anti-CD271, anti-CD43, anti-CD10, anti-CD33, anti-CD66 y anti-CD105. El fluido portador puede comprender otros reactivos que los anticuerpos para etiquetar, tratar, alterar, teñir, lavar o aun lisar las células de retentado también se puede llevar a cabo de forma similar. Los posibles reactivos que se pueden usar como el flujo portador pueden incluir colorantes de ácido nucleico, fijadores, soluciones de congelación, agentes alquilantes, anticuerpos, perlas magnéticas, enzimas, colagenasa, lipasa, DNasa, sustratos de determinadas enzimas, derivados activos de ciclofosfamida, factores de crecimiento, detergentes y soluciones de lisis. Este ejemplo ilustra el uso de un dispositivo de filtración de la. presente descripción para realizar separación y etiquetado celular, tratamiento, alteración, tinción, lavado o lisis en un paso. Se espera que dicho método sea muy útil en varias aplicaciones, incluyendo el aislamiento de células madre CD34+, aislamiento de células tumorales circulantes, preparación de fracciones vasculares estromales, conteo de células CD4+, aislamiento de células plasmáticas malignas, detección de actividades de aldehido deshidrogenasa, separación de células específicas con base en actividades enzimáticas, aislamiento de células específicas con base en antígenos de superficie.
Otras modalidades
A partir de la descripción anterior, será aparente que se pueden realizar variaciones y modificaciones a la descripción en la presente para adaptarla a varios usos y condiciones . Dichas modalidades también se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.
La enumeración de una lista de elementos en cualquier definición de una variable en la presente incluye definiciones de esa variable como cualquier elemento simple o combinación (o sub-combinación) de elementos listados. La enumeración de una modalidad en la presente incluye esa modalidad como cualquier modalidad simple o en combinación con cualquier otra modalidad o partes de la misma.
172
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la presente memoria descriptiva están incorporadas en la presente mediante referencia al mismo grado como si se indicara especifica e individualmente que se incorpore cada patente y publicación independientes mediante referencia.
Habiendo así descrito varios aspectos de al menos una modalidad de la presente descripción, se debe apreciar que varias alteraciones, modificaciones y mejoras ocurrirán fácilmente para los expertos en la técnica. Dichas alteraciones, modificaciones y mejores pretenden ser parte de la presente descripción, y pretenden estar dentro del espíritu y alcance de la descripción. Por consiguiente, la descripción precedente y los dibujos son a modo de ejemplo únicamente .
Claims (76)
1. Un dispositivo de filtración que comprende: una primera cámara de flujo que incluye al menos una entrada configurada para recibir un alimento que comprende partículas y un fluido y al menos una salida de retentado; una segunda cámara de flujo que incluye un extremo distal que tiene al menos una salida de filtrado y un filtro colocado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo; dicho filtro incluye una primera fila de pilares y una pluralidad de poros definida por espacios entre los pilares adyacentes, donde cada poro de la pluralidad de poros incluye un tamaño de poro físico definido por una distancia entre los pilares adyacentes que definen el poro y un tamaño de poro eficaz más pequeño que el tamaño de poro físico y medios para mover el alimento a través del dispositivo de filtración; donde la primera cámara de flujo, la segunda cámara de flujo, el filtro y los medios para mover el alimento a través de dispositivos de filtración están configurados para retener una fracción sustancial de partículas que tienen un tamaño mayor que los tamaños de poros eficaces de los poros y más pequeños que los tamaños de poros físicos de los poros como retentado en la primera cámara de flujo y pasar una fracción sustancial del fluido como filtrado en la segunda cámara de flujo.
2. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde la primera cámara de flujo comprende una primera profundidad sustancialmente constante, donde la segunda cámara de flujo comprende una segunda profundidad sustancialmente constante, donde una distancia entre el filtro y una pared lateral de la primera cámara "de flujo disminuye a lo largo de una longitud desde dicha al menos una entrada a dicha al menos una salida de retentado, y donde una distancia entre el filtro y una pared lateral de la segunda cámara de flujo aumenta a lo largo de una longitud desde un extremo proximal de la segunda cámara al extremo distal.
3. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde un ángulo entre una línea tangente a la pared lateral de la segunda cámara de flujo y una línea tangente a la fila de pilares es menor a alrededor de 5 grados.
4. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde un subconjunto de los poros tiene tamaños de poros físicos sustancialmente idénticos.
5. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde un subconjunto de los poros tiene tamaños de poros eficaces sustancialmente idénticos.
6. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde la primera fila de pilares comprende más de alrededor de 10 por ciento de todos los pilares presentes en el dispositivo de filtración.
7. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, que tiene una longitud de dispositivo definida por una mayor longitud de la primera cámara de flujo y una longitud de la segunda cámara de flujo y un ancho de dispositivo definido por una suma de ancho de la primera cámara de flujo y un ancho de la segunda cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la primera cámara de flujo y un ancho de la segunda cámara de flujo, la relación entre la longitud del dispositivo y el ancho del dispositivo es mayor a alrededor de 6. 176
8. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde cada poro tiene un tamaño de poro eficaz que es menor a alrededor de 80 por ciento del tamaño de poro físico del poro.
9. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde la primera cámara comprende al menos una entrada de fluido portador distinta de dicha al menos una entrada.
10. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, cada una de la primera cámara de flujo y el filtro están libres de cualquier borde dominante que tiene un radio de curvatura menor a alrededor de 1 pm, en una trayectoria de flujo a través del dispositivo.
11. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde un primer subconjunto de poros tiene un tamaño de poro eficaz diferente a un segundo subconjunto de poros.
12. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde el dispositivo de filtración comprende además un segundo filtro y una tercera cámara de flujo, donde el segundo filtro está colocado entre la primera cámara de flujo y la tercera cámara de flujo, donde la tercera cámara de flujo incluye un extremo proximal y un extremo distal, dicho extremo distal tiene al menos una salida, y donde dicha tercera cámara se amplía a lo largo de una longitud desde el extremo proximal al extremo distal . 177
13. El dispositivo de filtración de la reivindicación 12, que tiene una longitud de dispositivo definida por una longitud de la primera cámara de flujo y un ancho de dispositivo definido por una suma de un ancho de la primera cámara de flujo, un ancho de la segunda cámara de flujo y un ancho de la tercera cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la primera cámara de flujo, un ancho de la segunda cámara de flujo y un ancho de la tercera cámara de flujo, la relación entre la longitud del dispositivo y el ancho del dispositivo es mayor a alrededor de 5.
14. El dispositivo de filtración de la reivindicación 12, que tiene menos de alrededor de 5,000 pilares.
15. El dispositivo de filtración de la reivindicación 12, donde el primer filtro y el segundo filtro comprenden más de alrededor de 15 por ciento de todos los pilares incluidos en el dispositivo de filtración.
16. El dispositivo de filtración de la reivindicación 12, donde el dispositivo de filtración es sustancialmente simétrico alrededor de un plano de espejo a través de una línea central de la primera cámara de flujo.
17. El dispositivo de filtración de la reivindicación 12, donde una línea tangente definida por la primera fila de pilares y una línea tangente definida por la segunda fila de pilares no son paralelas. ' 178
18. El dispositivo de filtración de la reivindicación 1, donde el dispositivo de filtración comprende además un segundo filtro, una tercera cámara de flujo y una cuarta cámara de flujo, donde el segundo filtro está colocado entre la tercera cámara de flujo y la cuarta cámara de flujo, donde la tercera cámara de flujo comprende al menos una entrada y al menos una salida, y donde dicha cuarta cámara comprende al menos una salida.
19. El dispositivo de filtración de la reivindicación 18, que tiene una longitud de dispositivo definida por una suma de una longitud de la primera cámara de flujo y una longitud de la tercera cámara de flujo y un ancho de dispositivo definido por una mayor suma de un ancho de la primera cámara de flujo y un ancho de la segunda cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la primera cámara de flujo y un ancho de la segunda cámara de flujo y una suma del ancho de la tercera cámara . de flujo y un ancho de la cuarta cámara de flujo en un punto de la suma mayor de un ancho de la tercera cámara de flujo y un ancho de la cuarta cámara de flujo, la relación entre la longitud del dispositivo y el ancho del dispositivo es mayor a alrededor de 10.
20. El dispositivo de filtración de la reivindicación 18, que tiene menos de alrededor de 5,000 pilares.
21.' El dispositivo de filtración de la reivindicación 18, donde el primer filtro y el segundo filtro comprenden no menos de alrededor de 10 por ciento de todos los pilares incluidos en el dispositivo de filtración.
22. El dispositivo de filtración de la reivindicación 18, donde dicha al menos una entrada de la tercera cámara de flujo está en conexión fluida con dicha al menos una salida de la primera cámara de flujo y con dicha al menos una salida de la segunda cámara de flujo.
23. El dispositivo de filtración de la reivindicación 22, donde la tercera cámara de flujo comprende además al menos una entrada de fluido portador distinta de dicha al menos una entrada.
24. Un método para la filtración de partículas que comprende -. proporcionar un dispositivo de filtración que incluye al menos una unidad de filtración, cada unidad de filtración incluye una primera cámara de flujo que incluye una entrada de alimentación y una salida de retentado, una segunda cámara de flujo que incluye una salida de filtrado y un filtro que incluye una pluralidad de poros que tiene tamaños de poros físicos, dicho filtro está 180 colocado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo; introducir un alimento incluyendo una fluido de alimentación y al menos una población de partículas que tiene tamaños más pequeños que los tamaños de poros físicos inmersos en el fluido de alimentación hacia el dispositivo a través de la entrada de alimentación,- aplicar una fuerza motriz para dirigir el alimento a través del dispositivo de filtración, y pasar el alimento a través del dispositivo de filtración de manera tal que una fracción sustancial de las partículas de dicha al menos una población se retenga como retentado en la primera cámara de flujo, y que una fracción sustancial del fluido de alimentación pase a través del filtro como filtrado hacia la segunda cámara de flujo; recolectar el retentado en la salida de retentado y recolectar el filtrado en la salida de filtrado.
25. El método de la reivindicación 24, donde proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que incluye más de 10 unidades de filtración.
26. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento al dispositivo comprende introducir una suspensión líquida de células a la primera cámara de flujo. 181
27. El método de la reivindicación 26, donde el alimento comprende células viables, donde el método comprende además separar . células del alimento y donde al menos alrededor del 90% de las células viables permanecen viables luego de la separación.
28. El método de la reivindicación 26', donde el método comprende además separar las células del alimento, y donde menos de alrededor del 0.03 por ciento de las células están lisadas por el dispositivo de filtración.
29. El método de la reivindicación 26, donde menos de alrededor del 0.03% de las células están atrapadas en el dispositivo de filtración.
30. El método de la reivindicación 26, donde pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar más de 105 células por segundo a través del dispositivo de filtración.
31. El método de la reivindicación 30, donde pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar más de 106 células por segundo a través del dispositivo de filtración.
32. El método de la reivindicación 31, donde pasar el alimento a través del dispositivo de filtración comprende pasar más de 107 células por segundo a través del dispositivo de filtración. 182
33. El método de la reivindicación 24, donde proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que comprende al menos una unidad de filtración que tiene un volumen de retención menor a 0.8 microlitros.
34. El método de la reivindicación 24, donde proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que tiene un área de espacio y una profundidad de cámara sustancialmente constante, y donde pasar el alimento a través del dispositivo dé filtración comprende pasar células a través del dispositivo de filtración a una velocidad normalizada de procesamiento, definida como la cantidad de células que pasan a través del dispositivo.de filtración por segundo dividido entre el producto de la profundidad de cámara sustancialmente constante y el área de espacio, de más de 10,000 células por segundo por milímetro cúbico.
35. El método de la reivindicación 24, donde proporcionar el dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que tiene una profundidad de cámara característica, un área de espacio y una densidad de unidad de filtración, definidos como la cantidad de módulos de filtración incluida en el módulo dividido entre el producto de la profundidad de cámara 183 característica y el área de espacio, donde la densidad de unidad de filtración es mayor a 400 unidades de filtración por centímetro cúbico.
36. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento al dispositivo comprende introducir un líquido de alimentación que incluye médula ósea a la primera cámara de flujo.
37. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento al dispositivo comprende introducir un líquido de alimentación que incluye sangre a la primera cámara de flujo.
38. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento comprende introducir un líquido de alimentación que incluye sangre del cordón umbilical a la primera cámara de flujo.
39. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento comprende introducir un líquido de alimentación que incluye células madre a la primera . cámara de flujo.
40. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento al dispositivo comprende introducir líquido amniótico a la primera cámara de flujo.
41. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento al dispositivo comprende introducir tejido adiposo digerido a la primera cámara de flujo. 184
42. El método de la reivindicación 24, donde introducir el alimento en el dispositivo comprende introducir una de las células, glóbulos sanguíneos, glóbulos sanguíneos del cordón umbilical, células de médula ósea, eritrocitos, leucocitos, linfocitos, células epiteliales, células madre, células cancerosas, células tumorales, células tumórales circulantes, células progenitoras , precursores de células, células madre de sangre del cordón umbilical, células madre hematopoyéticas , células madre mesenquimales , células madre adiposas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células derivadas del cordón umbilical, células derivadas de tejidos grasos, células en fracciones vasculares estromales (SVF) , células en los líquidos amnióticos, células en la sangre menstrual, células en el líquido cefalorraquídeo, células en la orina, células madre en la médula ósea, células madre en la sangre periférica, células CD34+, células formadoras de colonias, linfocitos. T, linfocitos B, células neurales, células inmune, células dendríticas, megacariocitos, células de la médula ósea inmovilizadas, plaquetas, espermatozoides, huevos, ovocitos, microbios, microorganismos, bacteria, hongos, levaduras, protozoos, virus, orgánulos, núcleos, ácidos nucleicos, mitocondrias , micelas, lípidos, proteínas, complejos de proteína, restos celulares, parásitos, gotas de 185 grasa, organismos multicelulares, esporas, algas, clusters, agregados de los anteriores, polvos industriales, polímeros, polvos, emulsiones, gotas, partículas de polvo, microesferas , partículas y coloides en la primera cámara de flujo.
43. El método de la reivindicación 24, que comprende además recolectar el retentado incluyendo una de las células, células CD34+, una fracción vascular estromal, células madre, células progenitoras, células formadoras de colonias, células madre hematopoyéticas , células madre adiposas, células madre mesenquimales , células madre amnióticas, células nucleadas, leucocitos, linfocitos, células cancerosas, células tumorales, células dendríticas, células muertas, células vivas, células divididas, reticulocitos , glóbulos rojos, célula grasa y gotas de grasa.
44. El método de la reivindicación 43, donde recolectar el retentado comprende recolectar células y donde más de alrededor del 95% de las células en el retentado son viables.
45. El método de la reivindicación 24, que comprende además recolectar el filtrado incluyendo una de las células, células CD34+, una fracción vascular estromal, células madre, células progenitoras, células formadoras de colonias, células madre hematopoyéticas, células madre adiposas, células madre mesenquimales, células madre amnióticas, plasma, plaquetas, glóbulos rojos, células nucleadas, leucocitos, linfocitos, 186 células cancerosas, células tumorales, células dendríticas, células muertas, células vivas, células divididas, reticulocitos , glóbulos rojos, célula grasa y gotas de grasa.
46. El método de la reivindicación 45, donde recolectar el filtrado comprende recolectar células y donde más de alrededor del 95% de las células en el filtrado son viables.
47. El método de la reivindicación 24, donde proporcionar un dispositivo de filtración comprende proporcionar un dispositivo de filtración que tiene un tamaño de retención significativamente menor que los tamaños de poros físicos.
48. Un método para la reducción del volumen de sangre del cordón umbilical que comprende: obtener una muestra que incluye sangre del cordón umbilical que tiene al menos una población de células nucleadas, dicha muestra tiene un volumen de muestra; proporcionar un dispositivo de filtración que incluye un primer receptáculo de recolección, un segundo receptáculo de recolección, un medio de acceso de alimentación y al menos tres unidades de filtración, cada unidad de filtración tiene una cámara de flujo de microfluidos que incluye una entrada de alimentación, 187 una salida de retentado y una salida de filtrado, donde cada cámara de flujo de microfluidos incluye al menos una dimensión que es perpendicular a una longitud de la misma que es más pequeña que alrededor de 1 milímetro, donde la entrada de alimentaciónestá en comunicación fluida con el medio de acceso de alimentación, donde la salida de retentado está en conexión fluida con el primer receptáculo de recolección y donde la salida de filtrado está en conexión fluida con el segundo receptáculo de recolección; introducir la muestra en las entradas de alimentación de las unidades de filtración usando el medio de acceso de alimentación; aplicar una fuerza motriz a la muestra; pasar la muestra a través de las cámaras de flujo de microfluidos del dispositivo de filtración; crear condiciones de flujo laminar que dirigen una fracción sustancial del volumen de muestra a la salida de filtrado y una fracción sustancial de dicha al menos una población de células nucleadas a la salida de retentado; recolectar una salida de fluidos de la salida de 188 retentado en el primer receptáculo de recolección y recolectar una salida de fluidos de la salida de filtrado en el segundo receptáculo de recolección..
49. El método de la reivindicación 48, donde recolectar la salida de fluidos de la salida de retentado comprende recolectar más del 70% de las células nucleadas de la muestra en un volumen menor al 25% del volumen de muestra en el primer receptáculo de recolección.
50. El método de la reivindicación 48, donde dicha al menos una población de células nucleadas comprende células CD34+ y recolectar la salida de fluidos de la salida de retentado comprende recolectar más del 75% de las células CD34+ de la muestra en el primer receptáculo de recolección.
51. El método de la reivindicación 48, donde el método comprende además separar células viables de la muestra, y donde al menos alrededor del 95% de las células viables permanecen viables luego de la separación.
52. El método de la reivindicación 48, donde obtener una muestra comprende obtener una muestra que comprende células nucleadas de sangre del cordón umbilical que tienen más de alrededor de 95% de viabilidad, y donde recolectar la salida de fluidos de la salida de retentado comprende recolectar células nucleadas que tienen más de alrededor de 95% de viabilidad. 189
53. El método de la reivindicación 48, donde pasar la muestra a través de las cámaras de flujo de microfluidos comprende pasar más de 10,000,000; glóbulos sanguíneos por segundo a través del dispositivo de filtración.
54. Un aparato de filtración de partículas que comprende : una entrada de alimentación común; una salida de filtrado común; una salida de retentado común y al menos un dispositivo de alta densidad de módulos que incluye una pluralidad de unidades de filtración, cada unidad de filtración incluye una primera cámara de flujo que incluye al menos una entrada configurada para recibir un alimento que comprende partículas de alimentación en un fluido de alimentación y al menos una salida de retentado; una segunda cámara de flujo que incluye un extremo proximal, un extremo distal que tiene al menos una salida de filtrado y un primer filtro colocado entre la primera cámara de flujo y la segunda cámara de flujo, dicho primer filtro incluye una primera fila de pilares y una pluralidad de poros definida por espacios entre los pilares adyacentes de la fila de pilares; donde cada poro de la pluralidad de poros incluye un tamaño de poro físico definido por una distancia entre los pilares adyacentes que definen el poro; medios para mover el alimento a través de la pluralidad de unidades de filtración; donde la primera cámara de flujo, la segunda cámara de flujo, el filtro y los medios para mover el alimento a través de la pluralidad de unidades de filtración se configuran para tener un tamaño de retención más pequeño que los tamaños de poros eficaces de los poros y retener una fracción sustancial de las partículas de alimentación que tiene un tamaño mayor que el tamaño de retención como retentado en la primera cámara de flujo, y pasar una · fracción sustancial del fluido de alimentación como filtrado en la segunda cámara de flu o,- donde cada una de dicha al menos una entrada de la pluralidad de unidades de filtración está en comunicación fluida con la entrada de alimentación común; 191 donde cada una de dicha al menos una salida de filtrado de la pluralidad de unidades de filtración está en comunicación fluida con la salida de filtrado común y donde cada una de dicha al menos una salida de retentado de la pluralidad de unidades de filtración está en comunicación fluida con la salida de retentado común.
55. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 54, que comprende además:. un tubo; una tapa de tubo y una inserción de tubo; donde el dispositivo de alta densidad de módulos está configurado para montarse dentro de la inserción de tubo; donde el tubo está configurado para alojar la inserción de tubo; donde la inserción de tubo incluye un depósito de alimentación en conexión fluida con la entrada de alimentación común y donde la tapa de tubo está configurada para abarcar el tubo y la inserción de tubo.
56. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 55, donde el tubo está configurado para recibir el retentado desde el dispositivo de alta densidad de módulos, y donde la inserción de tubo incluye además un depósito de filtrado configurado para recibir el filtrado desde el dispositivo de alta densidad de módulos.
57. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 55, donde el tubo está configurado para recibir el filtrado desde el dispositivo de alta densidad de módulos, y donde la inserción de tubo incluye además un depósito de retentado configurado para recibir el retentado desde el dispositivo de alta densidad de módulos .
58. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 55, donde la inserción de tubo incluye además un depósito de fluido portador configurado para proporcionar un fluido portador a una entrada de al menos una primera cámara de fluido.
59. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 54, que comprende además: una bolsa de recolección de retentado en conexión fluida con la salida de retentado común y una bolsa de recolección de filtrado en conexión fluida con la salida de filtrado común.
60. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 59, que comprende además una entrada de fluido portador común en conexión fluida con una entrada de al menos una primera cámara de flujo. 193
61. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 60, que. comprende además un receptáculo de fluido portador configurado para proporcionar un fluido portador a la entrada común de fluido portador.
62. El aparato de filtración de partículas de. la reivindicación 59, que comprende además un adaptador configurado para establecer una conexión fluida entre una bolsa de recolección de alimentación y la entrada de alimentación común.
63. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 59, que comprende además una bolsa de recolección de alimentación en conexión fluida con la entrada de alimentación común.
64. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 63, donde la bolsa de recolección de alimentación comprende al menos una aguja configurada para retirar el alimento en la bolsa de recolección de alimentación.
65. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 63, donde la bolsa de recolección de alimentación contiene un anticoagulante.
66. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 63, donde la bolsa de recolección de alimentación contiene un fluido. 194
67. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 54, que comprende además: un primer pocilio en comunicación fluida con la entrada de alimentación común y configurado como un depósito de fluidos; un segundo pocilio en comunicación fluida con la salida de retentado común y configurado como un depósito de fluidos y un tercer pocilio en comunicación fluida con la salida de filtrado común y configurado como un depósito de fluidos.
68. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 67, donde el primer pocilio, el segundo pocilio y el tercer pocilio están configurados en un formato de placas multipocillo .
69. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 67, que comprende además un cuarto pocilio en comunicación fluida con la entrada de al menos una primera cámara de flujo y configurado para proporcionar un fluido portador a al menos una primera cámara de flujo.
70. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 67, que comprende además una tapa configurada para cerrar al menos uno del primer pocilio, el segundo pocilio' y el tercer pocilio. 195
71. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 70, donde la tapa comprende una lámina de aluminio sustancialmente impermeable al aire y vapor y configurada para sellar dicho al menos uno del primer pocilio, el segundo pocilio y el tercer pocilio.
72. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 70, donde al menos uno del ' rimer pocilio, el segundo pocilio y el tercer pocilio contiene un fluido.
73. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 54, donde cada unidad de filtración de la pluralidad de unidades de filtración tiene un volumen de retención de menos de 1 microlitro.
74. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 54, donde el dispositivo de alta densidad de módulos tiene una densidad de unidad de filtración de más de 500 unidades de filtración por centímetro cúbico.
75. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 54, donde el dispositivo de alta densidad de módulos incluye más de 30 unidades de filtración.
76. El aparato de filtración de partículas de la reivindicación 54, donde el dispositivo de alta densidad de módulos tiene una índice de eficiencia de diseño de más de alrededor de 0.5 mm"2.
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