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MX2012001404A - Vectores de base adenoviral. - Google Patents

Vectores de base adenoviral.

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Publication number
MX2012001404A
MX2012001404A MX2012001404A MX2012001404A MX2012001404A MX 2012001404 A MX2012001404 A MX 2012001404A MX 2012001404 A MX2012001404 A MX 2012001404A MX 2012001404 A MX2012001404 A MX 2012001404A MX 2012001404 A MX2012001404 A MX 2012001404A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
vaccine
heterologous sequence
adenoviral
sequence
protein
Prior art date
Application number
MX2012001404A
Other languages
English (en)
Inventor
Timothy P Mayall
Jeff Alexander
Original Assignee
Paxvax Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Paxvax Inc filed Critical Paxvax Inc
Publication of MX2012001404A publication Critical patent/MX2012001404A/es

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Abstract

La presente invención proporciona vectores adenovirales competentes de replicación capaces de expresar antígenos de patógenos infecciosos, tales como virus de influenza. Los vectores adenovirales pueden ser utilizados para vacunar sujetos contra los patógenos infecciosos. Los vectores adenovirales comprenden secuencias heterólogas que codifican los antígenos. Las secuencias heterólogas pueden ser insertadas en varias ubicaciones en los vectores adenovirales, incluyendo en o cerca de eliminaciones E3 específicas y/o integrarse en la región de codificación de hexón adenoviral. Los vectores adenovirales pueden derivarse de cualquier serotipo adenoviral, particularmente un serotipo Ad4 o Ad7.

Description

VECTORES DE BASE ADENOVIRAL REFERENCIA CRUZADA A SOLICITU DES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional estadounidense No. 61 /230,61 7, presentada el 31 de julio de 2009, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
DESCRIPCIÓN DEL ARCHIVO DE TEXTO PRESENTADO DE MANERA ELECTRÓNICA El contenido del texto presentado de manera electrónica con la presente se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia: una copia en versión electrónica del listado de secuencias (nombre del archivo: PAXV_004_01WO_SeqList_ST25.txt, fecha de registro: 30 de julio de 201 0, tamaño del archivo 62 kilobytes).
Antecedentes de la invención Los adenovirus han sido ampliamente estudiados como agentes infecciosos, como objeto de investigaciones fundamentales, y por su uso potencial en terapias génicas y en vacunas. Se han identificado cuarenta y nueve serotipos adenovirales humanos y se han clasificado en seis subgéneros (del A al F) según comparaciones de ácidos nucleicos, características de las proteínas fibrosas y propiedades biológicas. Por ejemplo, el grupo A incluye los serotipos 12 y 31 , el grupo B incluye los serotipos 3 y 7, el grupo C incluye los serotipos 2 y 5, el grupo D incluye los serotipos 8 y 30, el grupo E incluye el serotipo 4, y el grupo F incluye los serotipos 40 y 41 .
Con respecto a la estructura general , todos los adenovirus examinados a la fecha son icosaedros regulares sin envoltura de aproximadamente 80 nanómetros de diámetro. Los adenovirus contienen DNA de doble cadena lineal que forma un com plejo con proteínas centrales y cubierto por la cápside adenoviral. Los viriones individuales contienen aproximadamente 1 1 proteínas diferentes designadas con números romanos ( l l-XI I) por orden de tamaño decreciente en geles SDS.
La cápside se compone de siete prote ínas estructurales: I I (hexón), I I I (pentón) , I l la , IV (fibra) , VI , VI I y IX. La cápside comprende 252 capsómeros, de los cuales 240 son capsómeros hexones y 1 2 son capsómeros pentones. Los capsómeros hexones, los cuales son trímeros de la proteína hexón , conforman aproximadamente el 75% de la proteína de la cápside. Los capsómeros pentones , los cuales son pentámeros de la proteína pentón , se ubican en cada uno de los 1 2 vértices del virión. Cada capsómero pentón está ligado a seis capsómeros hexones adyacentes y una fibra , La fibra, la cual es normalmente un trímero de la proteína fibrosa, se proyecta desde el capsómero pentón . La proteína hexón y, en menor medida, la proteína fibrosa , componen los determinantes antigénicos principales de un adenovirus y también determinan la especificidad serotípica .
Los i nvestigadores han analizado y comparado la estructura de las proteínas de la cápside en diferentes serotipos adenovirales, y en particular, en las proteínas hexón, en un esfuerzo por definir las regiones de las proteínas contra las que se producen los anticuerpos neutralizantes. Las regiones predominantes en las proteínas hexón contra las cuales se dirigen los anticuerpos neutralizantes parecen estar en los bucles 1 y 2 (es decir, Ll u 1 1 y Ll l o 12, respectivamente), los cuales se proyectan hacia afuera desde la base del capsómero hexón. Un análisis de los bucles 1 y 2 en diferentes proteínas hexón adenovirales ha revelado la presencia de siete regiones hipervariables discretas (HVR1 a HVR7) correspondientes a ubicaciones donde las proteínas hexón difieren considerablemente de un serotipo al otro.
El núcleo de un virión adenoviral contiene genoma de DNA de doble cadena lineal y las proteínas asociadas V, VI I , X (mu), IVa2 y la proteína terminal (TP). Se conserva la organización genómica de los diferentes adenovirus y se ha propuesto que tiene una función temporizadora, donde los extremos del genoma se transcriben primero (los genes de expresión inmediata temprana E1 y E4 se ubican en los extremos opuestos del genoma lineal). La transcripción temprana de E 1 y E4 conduce a la apertura de la región central del genoma, permitiendo la transcripción de la región central.
Los genomas adenovirales están típicamente conformados por ocho unidades transcripcionales de RNA polimerasa I I : cinco unidades tempranas, E1 A, E1 B, E2A-E2B, E3, y E4; dos unidades tempranas retardadas, IX y IVa2; y la unidad transcripcional tardía principal. La unidad transcripcional tardía principal se subdivide además en las regiones L1 -L5 en función del uso de sitios de empalme alternativos.
Con frecuencia, las unidades transcripcionales expresan proteínas de función similar. Por ejemplo, la unidad E1 A codifica dos proteínas responsables por la activación de la transcripción y la inducción de la fase S ante la infección celular; la unidad de transcripción E1 B codifica dos proteínas que inhiben la apoptosis celular; la unidad transcripcional E3 está implicada en la evasión de la respuesta inmunitaria; y la unidad transcripcional tardía principal codifica las proteínas estructurales necesarias para el ensamblaje de la cápside.
Para la terapia génica y la vacunación, se han diseñado vectores adenovirales recombinantes para codificar y expresar genes y antígenos heterólog os . Los seroti pos Ad2 y Ad5 se han utilizado extensa mente en este contexto. Se han insertado las secuencias heterólogas en los genomas adenovirales, incluyendo las unidades transcripcionales tempranas y las regiones de codificación de varias proteínas estructurales, tales como hexón, pentón y fibra. En muchos casos, las eliminaciones en el genoma adenoviral (por ejemplo, en las regiones E 1 ) se han utilizado para crear vectores adenovirales incapaces de replicarse, los cuales se han considerado generalmente más seguros para su administración a sujetos humanos. A pesar de la investigación y desarrollo exhaustivos, todavía persiste en la técnica la necesidad de nuevos vectores adenovirales recombinantes adecuados, por ejemplo, como vacunas contra enfermedades infecciosas.
Breve descripción de la invención La presente invención se dirige a vectores adenovirales recombinantes que encuentran su uso como vacunas eficaces. La invención se basa, en parte, en el desarrollo de vectores adenovirales recombinantes novedosos que expresan secuencias heterólogas a altos niveles. La invención también se basa, en parte, en el desarrollo de vectores adenovirales recombinantes novedosos diseñados para mejorar la respuesta inmunitaria del hospedador y evadir los anticuerpos neutralizantes pre-existentes. La invención también se basa, en parte, en el desarrollo de vectores adenovirales recombinantes novedosos a ser utilizados como vacunas contra la influenza universal y/o contra un antígeno específico.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende un vector adenoviral, que comprende una primera secuencia heteróloga, donde el vector adenoviral es capaz de replicarse y tiene una eliminación parcial de E3. En determinadas modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50. En otras modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus de chimpancé, por ejemplo, Ad C 1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra en una ubicación que contiene la eliminación parcial de E3. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de o se encuentra ligado de forma operativa a una secuencia de control adenoviral traduccional y/o transcripcional. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede estar bajo el control de o encontrarse ligada de forma operativa al promotor tard ío principal (MLP) adenoviral , a una secuencia líder tripartita (TLP) adenoviral , a una secuencia aceptora de empalme adenoviral , y/o a una secuencia de señal de poliadenilación adenoviral . En determ inadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende y/o se encuentra bajo el control de una secuencia de control no adenoviral transcripcional y/o traduccional, tal como un potenciador, un promotor, una secuencia intrón y/o una secuencia líder de citomegalovirus (CMV) , virus del sarcoma de Rous (RSV) , o virus de simio 40 (SV40) , o cualquier combi nación de dichos elementos. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se modifica para aumentar la expresión . Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede ser optimizada mediante codones y/o mod ificada para incluir una secuencia de consenso Kozak. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un polipéptido inmunogénico de un patógeno infeccioso, tal como el virus de la influenza , el virus del papiloma humano (H PV), el virus de la inmunodeficiencia humana (H IV) , Bacillus, Shigella, Mycobacterium, Plasmodium, etc. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica al menos dos polipéptidos separados y/o un multímero de epítopos inmunogénicos de un patógeno infeccioso.
En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende un vector adenoviral, que comprende una primera secuencia heteróloga, donde el vector adenoviral es capaz de replicarse y tiene una eliminación total de E3. En determinadas modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50. En otras modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus de chimpancé, por ejemplo, Ad C1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7, o Ad68. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se integra en una ubicación que contiene la eliminación total de E3. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de o se encuentra ligada de forma operativa a una secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede estar bajo el control de o encontrarse ligada de forma operativa al promotor tardío principal (MLP) adenoviral, a una secuencia líder tripartita (TPL) adenoviral, a una secuencia aceptora de empalme adenoviral, y/o a una secuencia de señal de poliadenilación adenoviral. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende y/o se encuentra bajo el control de una secuencia de control no adenoviral transcripcional y/o traduccional, tal como un potenciador, un promotor, una secuencia intrón y/o una secuencia líder de citomegalovirus (C V), virus del sarcoma de Rous (RSV), o virus de simio 40 (SV40), o cualquier combinación de dichos elementos. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se modifica para aumentar la expresión. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede ser optimizada mediante codones y/o modificada para incluir una secuencia de consenso Kozak. En ciertas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un polipéptido inmunogénico de un patógeno infeccioso, tal como el virus de la influenza , el virus del papiloma humano (H PV), el virus de la inmunodeficiencia humana (H IV), Bacillus, Shigella, Mycobacterium, Plasmodium, etc. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica al menos dos polipéptidos separados y/o un multímero de epítopos inm unogénicos de un patógeno infeccioso.
En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una primera secuencia heteróloga , donde dicho vector adenoviral es capaz de replicarse, y donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de una secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional. En determinadas modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7 , Ad1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22 , Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50. En otras modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus de chimpancé, por ejemplo, Ad C 1 , Ad C3 , Ad C6, Ad C7 o Ad68. En determinadas modalidades, el adenovirus tiene una eliminación de E3 total o parcial . En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se integra en una ubicación que contiene una eliminación total o parcial de E3. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de o se encuentra ligada de forma operativa a una M LP adenoviral . En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de o se encuentra ligada de forma operativa a un MLP adenoviral y a una secuencia TLP adenoviral . En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra además bajo el control de o se encuentra ligada de forma operativa a una secuencia aceptora de empalme adenoviral y/o a una secuencia de señal de poliadenilación adenoviral. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se modifica para aumentar la expresión. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede ser optimizada mediante codones y/o modificada para incluir una secuencia de consenso Kozak. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un polipéptido inmunogénico de un patógeno infeccioso, tal como el virus de la influenza, el virus del papiloma humano (HPV), el virus de la inm unodeficiencia humana (HIV), virus de la fiebre del dengue, Streptococcus, Bacillus, Shigella, Mycobacterium, Plasmodium, etc. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica al menos dos polipéptidos separados y/o un multímero de epitopos inmunogénicos de un patógeno infeccioso.
En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una primera secuencia heteróloga y una segunda secuencia heteróloga, donde la segunda secuencia heteróloga se encuentra integrada en una región del hexón adenoviral, donde la primera secuencia heteróloga se encuentra integrada en una región no hexón adenoviral, y donde el vector adenoviral es capaz de replicarse. En determinadas modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50. En otras modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus de chimpancé, por ejemplo, Ad C1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68. En determinadas modalidades, el adenovirus tiene una eliminación de E3 total o parcial. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se integra en una ubicación que contiene la eliminación total o parcial de E3. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de o se encuentra ligada de forma operativa a una secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede estar bajo el control de o encontrarse ligada de forma operativa a un promotor tardío principal (MLP) adenoviral, a una secuencia líder tripartita (TPL) adenoviral, a una secuencia aceptora de empalme adenoviral, y/o a una secuencia de señal de poliadenilación adenoviral.
En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga se encuentra integrada en una o más regiones hipervariables de la región del hexón. Por ejemplo, la segunda secuencia heteróloga puede integrarse en una secuencia HVR1 , HVR2, HVR4, o HVR5 del hexón, o una combinación de las mismas. En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica una porción de la proteína de la membrana del virus (ej. , una proteína integral de la membrana o una proteína periférica de la membrana). Por ejemplo, la segunda secuencia heteróloga puede codificar una porción extracelular de una proteína de la membrana del virus conservada. En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica una porción de una proteína M2 de la influenza, una proteína matriz de la influenza, una proteína NP de la influenza, o una región hipervariable del hexón de un adenovirus que tenga un serotipo diferente. En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica dos o más copias de una proteína, tal como la proteína de la membrana del virus, o un fragmento de la misma.
En determinadas modalidades, el vector adenoviral comprende una o más secuencias heterólogas adicionales, donde cada secuencia heteróloga adicional se encuentra integrada en una región del hexón y es diferente de la segunda secuencia heteróloga. Por ejemplo, las secuencias heterólogas adicionales pueden ser todas de las regiones hipervariables de un adenovirus que tenga un serotipo diferente.
En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una segunda secuencia heteróloga, donde la segunda secuencia heteróloga codifica una región de la proteína de la membrana de un virus y se encuentra integrada en una región del hexón del vector adenoviral. En determinadas modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50. En otras modalidades, el vector adenoviral deriva de un adenovirus de chimpancé, por ejemplo, Ad C1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68. En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga es adyacente a una secuencia endógena adenoviral. En otras modalidades, la segunda secuencia heteróloga está flanqueada por un espaciador. En determinadas modalidades, el espaciador codifica la secuencia de péptidos "LGS". En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga es de u n virus de la influenza . Por ejemplo, la segunda secuencia heteróloga puede codificar un polipéptido M2 de la influenza, matriz de la i nfluenza o NP de la influenza, o un fragmento de los mismos.
En aún otro aspecto, la invención proporciona métodos para la vacunación mediante el uso de una vacuna basada en un vector adenoviral recombinante descrita en la presente. En determinadas modalidades, la vacunación es para la influenza, virus del papiloma humano (H PV) , virus de la inmunodeficiencia humana (H IV), virus de la fiebre del deng ue, Streptococcus, Bacillus, Shigella, Mycobacterium, o Plasmodium.
Breve descripción de los dibujos La Fig ura 1 es un diagrama de varias etapas de clonación implicadas en la producción del vector adenoviral recombi nante pPV-Ad4vax.
La Figura 2 es un diagrama de la región E3 de Ad4 que ilustra la ubicación de varios marcos abiertos de lectura , los criterios de valoración de elim inaciones de E3 parciales y totales de ejemplo y las ubicaciones representativas de donde pueden ser i nsertadas las secuencias heterólogas en la región.
La Figura 3 es un diagrama que muestra la ubicación de varias unidades de transcripción en el genoma del adenovirus.
Figura 4. Detección de la expresión de hemaglutinina mediante Western blot en células A549 infectadas con 4 virus Ad4 H5-HA diferentes. Se infectaron células A549, (confluencia de 50%-70% en una placa de 6 pocilios) con 2.5 ? 107 vp/mL de cada virus y se incubaron a 37 °C en un incubador de C02. Después de 24 o 48 horas se prepararon Usados celulares completos. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y a bandas sondadas con anticuerpos para detectar HA, ß-actina y a-tubulina como se indicó. También se identificaron sendas y controles marcadores tanto no infectados como virus recombinantes no relevantes. Todos los virus recombinantes expresan la HA de manera vigorosa, salvo el virus CMV no optimizado, PXVX01 13, que expresó un nivel sustancialmente más bajo de HA.
La Figura 5 demuestra la expresión de una proteína HA de la influenza de dos vectores adenovirales diferentes de la invención según se detectó mediante análisis de transferencia Western. El vector PXVX01 01 contiene una eliminación parcial de E3 y una secuencia heteróloga que codifica HA, donde la secuencia heteróloga se inserta en la eliminación parcial de E3 y bajo el control del MLP endógeno. El vector PXVX01 1 1 contiene una eliminación total de E3 y una secuencia heteróloga que codifica HA, donde la secuencia heteróloga se inserta cerca de la eliminación parcial de E3 y comprende un promotor de CMV.
La Figura 6 muestra una expresión de mRNA por análisis de PCR en tiempo real para el antígeno H3 HA y las proteínas adenovirales de células A549 infectadas con PXVX0101 .
La Figura 7 demuestra la expresión superficial de HA en un ensayo FACS donde las células A549 fueron infectadas con PXVX0101 y PXVX01 1 1 .
Las Figuras 8A y 8B muestran un diagrama de flujo que describe un ensayo de crecimiento en una etapa que puede ser utilizado para analizar la producción de vectores adenovirales de la invención y los resultados de los ensayos para PXVX0101 y PXVX01 1 1 en tres líneas celulares diferentes.
Las Figuras 9A y 9B muestran la aglutinación de glóbulos rojos en células A549 infectadas con el virus de la influenza (A) o PVXV0101 (B).
La Figura 10 es un diagrama de varias etapas de clonación implicadas en la creación de una secuencia de hexón que puede ser utilizada para generar secuencias de codificación de hexones quiméricas.
La Figura 1 1 es un diagrama de la ubicación de las regiones 1 a 6 del hexón HVR en un fragmento de la secuencia de codificación del hexón que se esté utilizando para construir secuencias quiméricas.
La Figura 12 ilustra varias secuencias de epítopos de la influenza que pueden ser utilizadas para reemplazar las secuencias HVR del hexón. H5 M2e (SEQ ID NOs: 339-341 ), H7 M2e (SEQ I D NOs: 342-343); H9 M2e (SEQ I D NOs: 344-345); M2e humana (SEQ I D NOs: 346-347); NP (SEQ ID NOs: 348-349); CTL matriz 58-66 (SEQ I D NOs: 350-351 ).
La Figura 13 ilustra una serie de construcciones del hexón de Ad4 quiméricas e indica cual HVR puede ser reemplazado con secuencias de M2 de la influenza, matrices, y/o NP, u otras secuencias HVR del hexón de Ad7.
La Figura 14 ilustra las respuestas de anticuerpos específicas para HA en ratones inducidas por los adenovirus recombinantes PXVX0103 y PXVX01 16.
Figura 15. Representación esquemática del diseño del vector Ad4-H5-Vtn (PXVX0103). La secuencia codificadora natural de H5 HA, sin el dominio polibásico, se derivó del virus de la influenza A/VietNam/1 194/2004 y se insertó en la región génica E3 del virus Ad4. Los genes E3 24.8K, E3 6.8K y E3 29.7K del virus Ad4 se eliminaron para colocar el transgene HA y se retuvo el sitio aceptor de empalme de E3 24.8K para dirigir la expresión del transgene HA. La secuencia de señal de poliadenilación de E3A, derivado de Ad5, se colocó corriente abajo con respecto a la secuencia codificadora de HA.
Figuras 16A-B. (A) Caracterización de PXVX0103 que demuestra la expresión en la superficie celular de H5 HA. Se confirmó la expresión superficial de HA (H5-Vtn) mediante la infección de 1 x 106 células A549 con niveles diferentes de PXVX0103 (como se indicó) durante 48 horas antes de la tinción superficial con un anticuerpo monoclonal H5 de ratón anti-aviar (clon 1 9C1 1 , Advanced ImmunoChemical). La detección se realizó mediante un anticuerpo secundario IgG-PE de cabra anti-ratón. Se utilizó Ad4 de tipo salvaje como control (área sombreada) para la comparación con las (líneas de) células infectadas con Ad4-H5-Vtn. Con cantidades crecientes de Ad4-H5-Vtn, un desplazamiento significativo a la derecha indica que las células están expresando niveles vigorosos de la proteína H5 en la superficie celular. (B) análisis Western de las mismas muestras usadas para la citometría de flujo en (A).
Figuras 17A-B. La HA recombinante (Vtn) expresada de PXVX0103 es funcional como lo demostró la formación de rosetas de glóbulos rojos de las células A549 infectadas por virus. Imágenes representativas de células A549 infectadas con (A) PXVX0103 o (B) Ad4-wt por 24 horas, lavadas y luego incubadas en la presencia de glóbulos rojos (RBC) de un donante humano. Las rosetas se indican con flechas blancas como signo de la interacción entre la HA expresada por el virus en la superficie de las células ?54T (células más grandes) y el ácido N-aceti lneuram ín ico (el ácido siá l ico predom i na nte e n las célu las) encontrado en la superficie de los RBC (células más pequeñas). Esto ocurrirá únicamente si la HA está correctamente plegada.
Figuras 18A-E. El crecimiento del virus Ad4-H5-Vtn (PXVX0103) se atenúa en varias líneas celulares humanas en comparación con el tipo salvaje del virus Ad4. Se compararon el crecimiento de virus Ad4-H5-Vtn con el crecimiento del virus Ad4 WT en varias líneas celulares humanas; A549 (carcinoma de pulmón; A), H1299 (carcinoma de pulmón; B), HepG2 (carcinoma hepatocelular; C), HuTu 80 (adenocarcinoma de duodeno; D) y MRC-5 (fibroblasto de pulmón embrionario; E).
Figuras 19A-B. Títulos de anticuerpos neutralizantes específicos de Ad4 (A) e inmunidad celular específica de Ad4 luego de inmunización contra Ad4wt (B). Se inmunizaron ratones intranasalmente con 1 x 10fl vp del virus Ad4wt por ratón para establecer la inmunidad pre-existente al vector. Luego de cuatro semanas de la inmunización, se sangraron diez ratones individuales y se determinaron títulos de anticuerpos neutralizantes específicos de Ad4 (A). Se sacrificaron dos ratones y se agruparon esplenocitos para determinar la inmunidad celular específica del virus Ad4wt, como se probó mediante IFN-? ELISPOT (B) .
Figuras 20A-B. Se reforzaron los títulos de anticuerpos HAI inducidos por la vacuna Ad4-H5-Vtn (A) y las respuestas inmunitarias celulares específicas de la HA (B) luego de la inmunización con la vacuna Ad4-H5-Vtn y de la exposición al virus reagrupado de H5N1. Se inmunizaron grupos de ratones (pretratados) con el virus Ad4 WT para establecer la inmunidad pre-existente. Se inmunizaron consecuentemente ratones pretratados y sin tratamiento previo de manera intranasal con una titulación de dosis de vacuna Ad4-H5-Vtn¡ 1 x 109, 1 x 108, 1 x 107 y 1 x 106 vp por ratón y se sangraron 6 semanas después de la inmunización por vacuna y nuevamente luego de 5 días de la exposición al virus reagrupado de H5N1 para determinar los títulos de anticuerpos HAI. Se sangraron tres ratones del grupo y se agrupó el suero para determinar los títulos de anticuerpos HAI (A). También se sacrificaron dos ratones en los mismos puntos de tiempo, antes y después de la exposición a H5N1 , y los esplenocitos se agruparon para determinar la inmunidad celular específica de HA H5 específica para cuatro péptidos 15-mer derivados de vtn de HA H5 evaluados mediante I FN-Y ELISPOT (B) . Ratones pretratados con el virus Ad4 WT y expuestos al virus reagrupado H5N1 no demostraron títulos detectables de anticuerpos HAI y respuestas celulares específicas de HA H5 5 días después de la exposición al virus de la influenza.
Figuras 21 A-C. Ratones inmunizados con dosis más altas de la vacuna Ad4-H5-Vtn no perdieron peso (A), sobrevivieron a la exposición a un virus H5N 1 reagrupado letal (B) y presentaron una atenuación del virus H5N 1 reagrupado en los pulmones (C). Se inmunizaron grupos de ratones (pretratados) con el virus Ad4 WT para establecer la inmunidad pre-existente. Posteriormente, se inmunizaron ratones de manera intranasal con una titulación de dosis de la vacuna Ad4-H5-Vtn. Luego de seis días de la inmunización con la vacuna Ad4-H5-Vtn, los ratones fueron expuestos a una dosis letal del virus H5N 1 reagrupado. Se evaluó el peso de los ratones diariamente (A), se evaluó la supervivencia de los ratones durante un período de 14 días (B) y 5 d ías luego de la exposición al virus H5N 1 reagrupado se recuperaron los pulmones de un subgrupo de ratones para determinar títulos virales específicos de la influenza como un porcentaje de reducción de títulos virales en relación con los ratones no inmunizados (C).
Figuras 22A-C. El Ad4-H5-Vtn (PXVX0103) induce respuestas inmunitarias al transgene HA H5 en conejos cuando se administra mediante múltiples vías de administración . Se realizaron ensayos ELISA con las muestras de sangre tomadas luego de 14 días (A) de la primera inmunización o luego de 43 días (B), lo que representa 14 días luego de la segunda inmunización. Los datos ELISA se analizaron mediante la determinación de criterios de valoración y el análisis representado en una tabla (C).
Figuraa 23A-C. La vacuna de la influenza Ad4-H5-Vtn (PXVX0103) induce respuestas significativas de anticuerpos específicas de HA H5 en ratones cuando se administra por vía sublingual, vaginal y rectal. Se realizaron ensayos ELISA en las muestras de sangre tomadas 2 a 4 semanas luego de la segunda inmunización con partículas virales de Ad4-H5-Vtn recombinante mediante vía de administración sublingual (A), vaginal (B), o rectal (C).
Figura 24. Demostración mediante análisis Western de (PA) soluble y PA recombinante asociado a las células (PA+GPI) de células A549 infectadas con vectores rAd4. Se analizó un lisado de células completo (panel izquierdo) o sobrenadante de cultivo de células (panel derecho) de células A549 infectadas con rAd4-PA mediante análisis de Western blot luego de la separación en gel S DS-PAG E. Se sondaron membranas de nitrocelulosa con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-PA. Se realizó la confirmación de la expresión de la proteína recombinante mediante referencia a un PA recombinante (rPA) disponible comercialmente cargado en paralelo para un control positivo. Las A549 y A549 infectadas con el virus Ad4 de tipo salvaje (Ad4 WT) representan los controles negativos, demostrando la especificidad a rPA. Los niveles de proteína se muestran como cantidades relativas por nivel total de proteínas.
Figura 25. Expresión de rPA en la superficie celular detectada en células A549 infectadas con Ad4-PA. Se infectaron células A549 con una MOI de 100 y se midió la expresión de PA en la superficie celular mediante un anticuerpo monoclonal específico de PA luego de 24 horas del cultivo mediante un análisis FACS. La intensidad de fluorescencia media (MFI) para cada uno de los grupos se muestra a la derecha.
Figura 26. Los adenovirus Ad4-PA recombinantes PXVX0212 y PXVX0214 muestran un crecimiento atenuado en comparación con el Ad4 WT en dos líneas celulares humanas. Se midió la evolución temporal de los niveles de rAd4 mediante TCI D50 luego de la infección con el virus rAd4-PA de células A549 (carcinoma de pulmón) o MRC-5 (fibroblasto de pulmón embrionario, diploide). El tamaño de ráfaga de las células se calculó mediante el uso de un nivel de infectividad m ínimo (1 hora para A549 y 24 horas para MRC-5) como referencia, corrigiendo así las diferencias en la infección.
Figura 27. Lisados celulares de A549 infectadas con rAd4 protegen a ratones de la exposición a u na toxina leta l . Se i n m un izaron ratones (6 por grupo) mediante una inyección intraperitoneal (I P) de lisados de células completos equivalentes a 5 x 1 06 células infectadas con 5 x 108 partículas virales de Ad4 WT, Ad4-PA recombinante, o Ad4-PA-GPI recombinante. Se administraron 10 pg de rPA de manera subcutánea (S.C.) como control positivo. Cinco semanas después de la inmunización, se expusieron ratones a una toxina letal de manera intravenosa (combinación de 120 pg de PA con 60 pg de LF) y se controlaron diariamente.
Figura 28. Se detectaron respuestas de anticuerpos a rPA luego de la administración I P de lisados de células A549 infectadas con rAd4-PA. Se midieron las respuestas de anticuerpos en suero obtenidas de ratones inmunizados de manera intraperitoneal con lisados de células completos de células A549 infectadas con adenovirus Ad4-PA recombinantes. Se analizaron las respuestas de anticuerpos 21 días después de la inmunización mediante ELISA (panel izquierdo) y un ensayo de neutralización de toxinas basado en macrófagos in vitro. Se calculó el EC50 de 6 animales por grupo.
Figura 29. Ilustración esquemática de experimentos de exposición letales realizados luego de la inmunización intranasal de ratones con virus rAd4 PA purificados. Se inmunizaron ratones con uno de los 5 antígenos diferentes indicados (n=25/grupo) en el día 0 se administraron los virus rAd4 por vía instranasal (I . N.) como 1 x1010 vp en 50-62.5 pL de PBS por animal, con el virus Ad4 de tipo salvaje como control negativo. Controles positivos inyectados por vía subcutánea en el volumen final de 100 µ?_ de PBS contenían 10 \ig de antígeno protector recombinante (rPA) solo o 10 pg de rPA adsorbido a 1 mg de gel de hidróxido de aluminio (Rehydragel HPA). Se midió la inmunidad celular (IFN-? ELISPOT e IL-4 ELISPOT) 27 días luego de la inmunización en esplenocitos agrupados de 2 ratones/grupo. Se analizó la inmunidad celular de los ratones que sobrevivieron a la exposición a la toxina #1 (20 días luego de la inmunización, n= 10/grupo) en el día 54. Se sangraron los mismos 9 animales/grupo (5 grupos) para los ensayos ELISA y de neutralización de toxinas luego de 14 y 40 días de la inmunización. Un total de 10 ratones por grupo también se expuso a una toxina letal (con una combinación de 120pg de PA y 60pg de factor letal) luego de 46 días de la inmunización. La supervivencia se controló durante los 30 días posteriores a la exposición.
Figura 30. Se midieron las respuestas de anticuerpos en suero a los 14 y 40 días luego de la inmunización intranasal con los virus Ad4- PA y Ad4-PA-G PI purificados. Las respuestas IgG anti-PA analizadas mediante ELISA se muestran en los paneles de la izquierda, y los anticuerpos neutralizantes de las toxinas (TNA) medidas mediante un ensayo de neutralización de toxinas basado en macrófagos murinos in vitro se m uestran en los paneles de la derecha. Se calculó el EC50 mediante el uso de una curva de respuesta a la dosis sig moidal ajustada para los datos de la dilución en serie de las m uestras.
Figura 31 . Las curvas de supervivencia muestran la protección de los ratones contra la exposición a la toxina letal cuando son inmunizados con los virus rAd4-PA. Se i nmun izaron ratones (n = 10/grupo) con uno de los cinco inmunógenos diferentes (rPA, rPA + alumbre, Ad4 de tipo salvaje, Ad4-PA y Ad4-PA-G PI) en el día 0 y se expusieron a una toxina letal (60 pg de PA y 30 pg de LF en un volumen total de 1 00 p L de PBS) en los d ías 20 y 46 luego de la inmunización . La supervivencia se controló durante 30 días. El panel de la izquierda muestra la supervivencia luego de la exposición 20 d ías después la inmunización. El panel de la derecha muestra la supervivencia luego de la exposición 46 d ías después de la inmunización.
Figura 32. La inmunización de los ratones con virus rAd4-PA induce respuestas inmunitarias mediadas por las células que se detectan luego de la exposición a la toxina letal . Se m idieron las respuestas inmunitarias mediadas por las células (I FN-? ELISPOT y IL-4 ELISPOT) 27 d ías luego de la inmunización en esplenocitos agrupados de ratones (2 ratones/grupo) inmunizados con uno de los cinco inmunógenos diferentes (rPA, rPA + alumbre, Ad4 de tipo salvaje, Ad4- PA, y Ad4-PA-GPI) en el día 0. Se analizó la inmunidad celular de los ratones que sobrevivieron a la exposición a la toxina #1 (20 días luego de la inmunización, n=10/grupo) en el día 54 (34 días luego de la exposición). Panel de la izquierda: Respuestas Th 1 medidas por IFN-? ELISPOT. Panel de la derecha: Respuestas Th2 medidas por IL-4 ELISPOT.
Figuras 33a-B. Expresión de Ad4-C V-HTL24 (PXVX0109) del polipéptido 52.5K. (A) una representación esquemática del gene polipéptido HTL24 que contiene 24 epítopos auxiliares de la influenza cada uno separado por una secuencia espaciadora GPGPG (SEQ ID NO: 353). (B) Análisis de Western blot de lisados celulares de células A549 infectadas con un virus Ad4 recombinante con una eliminación total de la región E3 y con una expresión de HTL24 dirigida por el promotor de CMV (PXVX01 09). Como control positivo, se infectaron células A549 con influenza A/Uruguay/716/2007 (tipo A/Brisbane/1 0/2007) (NYMC X-175C reagrupado, NI BSC). El adenovirus recombinante PVXV0109 expresa de manera eficiente el polipéptido HTL24 como se muestra en las bandas que migran a 52.5 kDa.
Descripción detallada Tal como se usan en la presente, los siguientes términos tendrán los siguientes significados.
El término "vector adenoviral" se refiere a un genoma adenoviral de tipo salvaje, mutante y/o recombinante, así como también a los adenovirus que comprendan dicho genoma. Un vector adenoviral puede comprender todo o parte del genoma de cualquier serotipo adenoviral, así como también combinaciones de los mismos (es decir, genomas híbridos).
El término "patógeno infeccioso" se refiere a cualquier agente capaz de infectar humanos y de causar el deterioro de la salud y/o desencadenar una respuesta inmunitaria. En ciertas modalidades, el patógeno infeccioso es un virus, tal como el virus de la influenza, un retrovirus (es decir, HIV, virus del sarcoma de Rous (RSV), retrovirus endógeno humano K (HERV-K)), retrovirus endógeno humano K (HERV-K)), virus del papiloma (por ej., virus del papiloma humano), picornavirus (por ej., Hepatitis A, Poliovirus), hepadnavirus (por ej., Hepatitis B), flavivirus (por ej., Hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus de la fiebre del dengue, virus de la encefalitis japonesa, Virus del Nilo Occidental), togavirus (por ej., virus de chikungunya, virus de la encefalitis equina del este (EEE), virus de la encefalitis equina occidental (WEE), virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), herpesvirus (por ej., citomegalovirus), paramixovirus (virus parainfluenza, virus de la neumonía, virus de la bronquiolitis, virus del resfriado común, virus del sarampión, virus de las paperas), rhabdovirus (por ej., virus de la rabia), filovirus (por ej., virus ébola), bunyavirus (por ej., Hantavirus, virus de la fiebre del valle de Rift), calicivirus (por ej., Norovirus), o reovirus (por ej., Rotavirus, virus de Epstein-Barr, virus del herpes simple tipos 1 y 2).
En otras modalidades, el patógeno infeccioso es un organismo procariota tal como una bacteria gram negativa, una bacteria gram positiva u otro tipo de bacteria. Tales organismos procariotas incluyen , de manera no taxativa, Bacillus (por ej. , Bacillus anthracis), Mycobacterium (por ej. , Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium Leprae) , Shigella (por ej. , Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri), Helicobacter (por ej. , Helicobacter pylori) , Salmonella (por ej. , Salmonella entérica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium) , Neisseria (por ej. , Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis), Moraxella (por ej. , Moraxella catarrhalis), Haemophilus (por ej. , Haemophilus influenzae) , Klebsiella (por ej. , Klebsiella pneumoniae), Legionella (por ej. , Legionella pneumophila) , Pseudomonas (por ej. , Pseudomonas aeruginosa) , Acinetobacter (por ej. , Acinetobacter baumannii) , Listeria (por ej. , Listeria monocytogenes) , Staphylococcus (por ej., resistentes a la meticilina, resistentes a los multifármacos, o Staphylococcus aureus resistente a la oxacilina), Streptococcus (por ej. , Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae), Corynebacterium (por ej. , Corynebacterium diphtheria) , Clostridium (por ej. , Clostridium botulinum, Clostridium tetan!, Clostridium difficile) , Chlamydia (por ej. , Chlamydia pneumonía, Chlamydia trachomatis), Camphylobacter (por ej. , Camphylobacter jejuni), Bordetella (por ej. , Bordetella pertussis) , Enterococcus (por ej. , Enterococcus faecalis, Enterococcus faecum, enterococos resistentes a la vancomicina (VRE)), Vibrio (por ej. , Vibrio cholerae) , Yersinia (por ej. , Yersinia pestis), Burkholderia (por ej. , Burkholderia cepacia complex) , Coxiella (por ej. , Coxiella burnetti), Francisella (por ej . , Francisella tularensis), y Escherichia (por ej. , E. coli enterotoxigénico, enterohemorrágico o productor de toxinas Shiga , tal como ETEC, EHEC, EPEC, EI EC, y EAEC)) .
En aún otras modalidades, el patógeno infeccioso es un organismo eucariótico. Los ejemplos de organismos eucariotas incluyen, de manera no taxativa , los protistas tales como Plasmodium (por ej. , Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium diarrhea) , y hongos tales como Candida (por ej. , Candida albicans) , Aspergillus (por ej. , Aspergillus fumigatus) , Cryptococcus (por ej. , Cryptococcus neoformans), Histoplasma (por ej. , Histoplasma capsulatum), Pneumocystis (por ej., Pneumocystis jirovecii) , y Coccidioides (por ej. , Coccidioides immitis).
El término "cáncer" se refiere a una afección médica caracterizada por un incremento anormal en la proliferación de una población de células en particular. Las células cancerosas pueden derivar de cualquier tejido u órgano, incluyendo, por ejemplo, la piel , los músculos, los pulmones, el corazón , el h ígado, el ri ñon, tejido neural, etc. En determinadas modalidades, el cáncer es benigno (por ej. un tumor benigno). En otras modalidades, el cáncer es maligno (por ej . un tumor maligno) . En determinadas modalidades, el cáncer es metastásico (es decir, las células cancerosas son capaces de migrar desde su lugar de origen a otro órgano o tejido) .
Otros términos se definirán, cuando se requiera, a lo largo de la especificación .
La presente invención se dirige a vacunas adenovirales recombinantes. La invención se basa , en parte, en el desarrollo de vectores adenovirales recombinantes novedosos que expresan secuencias heterólogas a altos niveles. La invención también se basa, en parte, en el desarrollo de vectores adenovirales recombinantes novedosos diseñados para mejorar la respuesta inmunitaria del hospedador y evadir los anticuerpos neutralizantes pre-existentes. La invención también se basa, en parte, en el desarrollo de vectores adenovirales recombinantes novedosos a ser utilizados en vacunas contra la influenza universal y/o de antígeno específico.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un vector adenoviral que comprende una primera secuencia heterologa. Tal como se usa en la presente, una "secuencia heterologa" es una secuencia de ácido nucleico que, cuando se integra a un vector adenoviral, crea una yuxtaposición que no ocurre naturalmente de secuencias adenovirales con la secuencia de ácido nucleico. Típicamente, una secuencia heterologa comprenderá una secuencia de ácido nucleico cuyo origen no es adenoviral. Por ejemplo, la secuencia heterologa puede ser de origen no adenoviral en su totalidad, en su mayoría o en parte (por ej. un mosaico de secuencias adenovirales y no adenovirales). Sin embargo, en algunos casos, la secuencia heterologa puede ser de origen adenoviral en su totalidad, por ej. una secuencia adenoviral de un tipo de adenovirus puede integrarse en un vector adenoviral generado de un tipo diferente de adenovirus. Por ejemplo, una secuencia adenoviral que codifica una proteína hexón o fibrosa de un tipo de adenovirus puede integrarse en un vector adenoviral generado de un tipo diferente de adenovirus para producir un adenovirus recombinante con proteínas fibrosas de diferentes serotipos y/o un adenovirus con proteínas hexones y fibrosas quiméricas. Los vectores adenovirales que comprenden una primera secuencia heterologa pueden ser útiles, por ejemplo, como vacunas contra patógenos infecciosos o células cancerosas. De esta manera, la primera secuencia heterologa puede codificar un antígeno de un patógeno infeccioso. De manera alternativa, la primera secuencia heterologa puede codificar un antígeno asociado a células cancerosas.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica toda o parte de una proteína producida por un patógeno infeccioso. La proteína o un fragmento de la misma (por ej. producto de la escisión, dominio estructural, unidad(es) de estructura secundaria, epítopos de linfocitos B, epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL), epítopos de los linfocitos T auxiliares (HTL)), etc. , pueden estar ubicadas en la superficie del patógeno infeccioso. Por ejemplo, la proteína o un fragmento de la misma pueden ser altamente antigénicos, implicados en la selección de objetivos celulares y/o implicados en el ingreso en la célula. De manera alternativa, la proteína o un fragmento de la misma (por ej. producto de la escisión, dominio estructural, unidad(es) de estructura secundaria, epítopos HTL o CTL, etc.), pueden estar ubicados en el interior del patógeno infeccioso. Por ejemplo, la proteína o fragmento de la misma pueden ser una proteína intracelular, una cápside o una proteína central de un virus con envoltura, una proteína central de un virus sin envoltura, etc.
En determinadas modalidades, el epítopo, dominio estructural, o la unidad de estructura secundaria se conserva de forma evolutiva. Tal como se usa en la presente, el término "conservado de forma evolutiva" significa que una secuencia es al menos conservada aproximadamente en un 50% entre un grupo variado de cepas de un patógeno infeccioso en particular. Para los virus, un grupo variado de cepas incluye al menos una forma aislada de cada subclase identificada (por ej . serotipo) capaz de infectar y, por lo tanto, causar una enfermedad o afección en la población objetivo de la vacuna, o un número representativo de formas aisladas infecciosas que abarque la variedad de dichas cepas. Por ejemplo, en determinadas modalidades, un grupo variado de cepas de la influenza incluye cepas representativas que están asociadas con enfermedades en seres humanos, porcinos, y/o aves, incluyendo cepas de H 1 N 1 (por ej. , A/Wilson-Smith/33, A/New Caledonia/20/99, A/Swine Korea/S 1 0/2004, A/Brevig ission/1 /1 91 8, A/Pureto Rico/8/34/Mount Sinai, A/California/7/2009, A/California/05/2009, A/California/08/2009, A/Texas/04/2009, A/swine/Saskatchewan/1 8789/02, A/mallard/Alberta/1 30/2003, A/mallard/Alberta/2001 , A/swine/Cotes d'Armor/1482/99, A/swine/Betzig/2/2001 , y/o A/turkey/Germany/3/91 ), cepas de H3N2 (por ej. A/Perth/1 6/2009), cepas de H2N2 (por ej. A/Japan/305/57 , A/Ann Arbor/6/60, A/Canada/720/05, A/mallard/NY/6750/78, A/mallard/Potsdam/1 77-4/83, y/o A/duck/Hokkaido/95/2001 ), cepas de N3N2 (por ej. A/Hong Kong/1 /66, A/Charlottesville/03/2004, A/Canterbury/129/2005, A/Fujian/41 1 /01 -like, A/duck/Korea/S9/2003, A/swine/Texas/41 99-2/98, A/turkey/Ohio/313053/2004, y/o A/turkey/North Carolina/12344/03) , cepas de H5N 1 (por ej. A/swine/Shandong/2/03, A/goose/Guangdong/1 /96, A/duck/Hunan/1 14/05, A/Viet Nam/1203/2004, A/Viet Nam/DT-036/2005, A/V¡etnam/1 1 94/2004, A/Vietnam/1203/2004, A/Anhui/1 /2005, A/Egypt/2321/2007, A/Egypt/3300-NAMRU3/2008, A/grebe/Novosibirsk/29/2005, A/Bar-headed goose/Mondolia/1 /05, A/cat/Tha¡land/KU-02/04, A/Hong Kong/213/03, A/chicken/Guangdong/174/04, y/o A/HK/159/97), cepas de H6N 1 (por ej. A/teal/Hong Kong/1073/99), cepas de H6N2 (por ej. , A/chicken/dalifornia/0139/2001 , y/o A/guillemot/Sweden/3/2000), cepas de H6N9 (por ej. A/goose/Hong Kong/W217/97), cepas de H7N 1 (por ej. A/FPV/Rostock/34), cepas de H7N3 (por ej. , A/chicken/British Columbia/04, y/o A/turkey/ltaly/2201 58/2002), cepas de H7N7 (por ej. A/chicken/Netherlands/1 /2003, A/Netherlands/21 9/03, A/FPV/Dobson/27, y/o A/chicken/FPV/Weybridge), cepas de H9N2 (por ej. A/shorebird/Delaware/9/96, A/swine/Korea/S452/2004, A/duck/Hong Kong/Y439/97, A/Hong Kong/1073/99, A/HK/2108/2003, A/qua¡l/Hong Kong/G1 /97, A/duck/Hong Kong/Y280/97, A/ch¡cken HK/FY23/03, y/o A/chicken HK/G9/97), y cepas de la influenza B (por ej. B/Brisbane/60/2008) . En determinadas modalidades, un grupo variado de cepas de influenza incluye todas las cepas anteriormente mencionadas como también otras cepas de influenza que están asociadas a enfermedades en seres humanos, porcinos, o aves. Para los patógenos celulares, tales como las bacterias, los protistas y los hongos, etc. , un grupo variado de cepas incluye al menos una forma aislada de cada especie capaz de infectar y, por lo tanto, causar una enfermedad o afección en la población objetivo de la vacuna, o un número representativo de formas aisladas infecciosas que abarque la variedad de dichas cepas. En determinadas modalidades, el epítopo o el motivo estructural está conservado en al menos un 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una pluralidad de epítopos (por ej. células B, epítopos CTL o HTL) y/o motivos estructurales (por ej. dominios proteicos o unidades de estructura secundaria) presentes en proteínas producidas por el patógeno infeccioso. En determinadas modalidades, uno o más de la plural idad de e pítopos y/o motivos estructurales se conservan de manera evolutiva. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica al menos 5, 10, 1 5, 20, 25, 30, 35, 40 o más epítopos y/o motivos estructurales. La pluralidad de epítopos y/o motivos estructurales pueden ser de una sola proteína o de múltiples proteínas. En determinadas modalidades, la pluralidad de epítopos y/o los motivos estructurales consisten en o comprenden un multimero de epítopo o motivo estructural únicos. En otras modalidades, la pluralidad de epítopos y/o los motivos estructurales consisten en o comprenden un multimero de epítopos y/o motivos estructurales diferentes. Por ejemplo, el multimero puede incluir dos o más epítopos y/o motivos estructurales de una proteína sola o uno o más epítopos y/o motivos estructurales de cada una de dos o más proteínas. Tal como se utiliza en la presente, un "multimero" es una secuencia de proteínas que comprende una serie de polipéptidos discretos que han sido unidos para formar un único polipéptido más grande. En determinadas modalidades, se utiliza una secuencia enlazadora para conectar los polipéptidos discretos adyacentes en un multímero. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente secuencias de péptidos cortas capaz de actuar como enlazadores en un multímero.
En determinadas modalidades, la pluralidad de epítopos comprende una pluralidad de epítopos HTL, donde cada epítopo HTL comprende un péptido que se une a HLA clase II. Tal como se utiliza en la presente, un "péptido que se une a HLA clase II" es un péptido que se une a una molécula HLA clase II con un IC50 < 1000 nM. En general, un péptido que se une a HLA clase II tiene un largo de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 aminoácidos, o de aproximadamente 13 a aproximadamente 21 aminoácidos. En determinadas modalidades, uno o más de dicha pluralidad de epítopos HTL comprenden péptidos que se unen a la clase II que se unen a una molécula HLA clase II seleccionada del grupo que consiste en HLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0301, HLA- DRB1*0401, HLA-DRB1*0402, HLA-DRB1*0404, HLA-DRB1*0405, HLA- DRB1*0701, HLA-DRB1*0801, HLA-DRB1*0802, HLA-DRB1*0901, HLA- DRB1 001, HLA-DRB1*1101, HLA-DRB1*1107, HLA-DRB1*1201, HLA- DRB1*1301, HLA-DRB1 302, HLA-DRB1*1333, HLA-DRB1*1401, HLA- DRB1*1403, HLA-DRB1 *1447, HLA-DRB1*1501, HLA-DRB1*1601, HLA- DRB3*0101, HLA-DRB3*0201, HLA-DRB3*0215, HLA-DRB3*0301, HLA- DRB4*0101 y HLA-DRB5*0101 , HLA-DRB5-0202. En determinadas modalidades, uno o más de dicha pluralidad de epítopos HTL comprenden un péptido de unión a la clase II que se une a una molécula HLA clase II seleccionada del grupo que consiste en variantes de supertipo HLA-DR1 , HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR5, HLA-DR9 como se describió, por ejemplo, en Doytchinova y Flower (2005) J Immunol 174:7085 y/o Southwood et al. (1998) J Immunol 160:3363. En determinadas modalidades, uno o más de dicha pluralidad de epítopos HTL comprenden un péptido de unión a la clase II que se une con una pluralidad de moléculas HLA clase II (por ej. , al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). La pluralidad de moléculas HLA clase II pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en HLA-DRB1*0101 , HLA-DRB1*0301, HLA-DRB1*0401 , HLA-DRB1*0402, HLA-DRB1 *0404, HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*0701 , HLA-DRB1*0801 , HLA-DRB1 *0802, HLA-DRB1*0901, HLA-DRB1 001 , HLA-DRB1 *1101 , HLA-DRB1*1107, HLA-DRB1*1201, HLA-DRB1 301 , HLA-DRB1*1302, HLA-DRB1*1333, HLA-DRB1*1401, HLA-DRB1 403, HLA-DRB1*1447, HLA-DRB1 *1501 , HLA-DRB1 601, HLA-DRB3*0101 , HLA-DRB3*0201 , HLA-DRB3*0215, HLA-DRB3*0301, HLA-DRB4*0101 y HLA-DRB5*0101 , HLA-DRB5-0202. En determinadas modalidades, uno o más de dicha pluralidad de epítopos HTL comprenden un péptido de unión a la clase II que se une a una molécula HLA clase II seleccionada del grupo que consiste en variantes de supertipo HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR5, HLA-DR9 como se describió, por ejemplo, en Doytchinova y Flower (2005) J Immunol 174:7085 y/o Southwood et al. (1998) J Immunol 160:3363. En determinadas modalidades, la pluralidad de epítopos HTL comprende péptidos que se unen a la clase II que se unen colectivamente a cada molécula HLA clase II en el grupo que consiste en HLA-DRB1*010 , HLA-DRB1 *0301 , HLA-DRB1 *0401 , HLA-DRB1 *0402, HLA-DRB1 *0404, HLA-DRB1 *0405, HLA-DRB1 *0701 , HLA-DRB1 *0801 , HLA-DRB1 *0802, HLA-DRBT0901 , HLA-DRB1 *1001 , HLA-DRB1 *1 101 , HLA-DRB1 *1 107, HLA-DRB1 *1201 , HLA-DRB 1 *1 301 , HLA-DRB1 *1302, HLA-DRB1 *1333, HLA-DRB1 401 , HLA-DRB1 403, HLA-DRB1 *1447, HLA-DRB1 *1 501 , HLA-DRB1 *1 601 , HLA-DRB3*01 01 , HLA-DRB3*0201 , HLA-DRB3*021 5, HLA-DRB3*0301 , HLA-DRB4*0101 y HLA-DRB5*0101 , HLA-DRB5-0202. En determinadas modalidades, uno o más de dicha pluralidad de epitopos HTL comprenden un péptido de unión a la clase I I que se une a una molécula HLA clase I I seleccionada del grupo que consiste en variantes de supertipo HLA-DR1 , HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR5, HLA-DR9, como se describió, por ejemplo, en Doytchinova y Flower (2005) J Immunol 174:7085 y/o Southwood et al. (1998) J Immunol 160:3363.
En determinadas modalidades, la pluralidad de epitopos comprende una pluralidad de epitopos CTL, donde cada epítopo CTL comprende un péptido que se une a HLA clase I . Tal como se utiliza en la presente, un "péptido que se une a HLA clase I" es un péptido que se une a una molécula HLA clase I I con un IC50 < 500 nM. En general, un péptido que se une a HLA clase I tiene un largo de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 aminoácidos, o de aproximadamente 8, 9, 10 u 1 1 aminoácidos. En determinadas modalidades, uno o más de dicha pluralidad de epitopos CTL comprende un péptido de unión a HLA clase I que se une a una molécula HLA clase I seleccionada del grupo que consiste en variantes de supertipo HLA-A01 , HLA-A02, HLA-A03, HLA-A24, HLA-B07, HLA-B08, HLA-B27, HLA-B58, HLA-B62 y HLA-B44, como se describió, por ejemplo, en Sidney et al. (2008) J Immunol 9:1. En determinadas modalidades, uno o más de dicha pluralidad de epítopos CTL comprenden un péptido de unión a HLA clase I que se une con una pluralidad de moléculas HLA clase I (por ej., al menos 2, 3, 4, 5, o 6) Por ejemplo, el epítopo CTL puede unirse a una pluralidad de variantes de supertipo HLA-A01 (por ejemplo, seleccionados de un grupo que consiste en A*0101, A*2601, A*2602, A*2603, A*2902, A*3001, A*3002, A*3003, A*3004, y A*3201); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-A02 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*0214, A*0217, A*6802, y A*6901); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-A03 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en A*0301, A*1101, A*3101, A*3301, A*6601, A*6801, y A*7401); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-A24 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en A*2301, A*2402, y A*2902); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-B07 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en B*0702, B*0703, B*0705, B*1508, B*3501, B*3503, B 201, B*5101, B*5102, B*5103, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, y B*7801); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-B08 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en B*0801 y B*0802); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-B27 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en B*1402, B 503, B*1509, B*1510, B*1518, B*2702, B*2703, B*2704, B*2705, B*2706, B*2707, B*2709, B*3801, B*3901, B*3902, B*3909, B 801, y B*7301); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-B44 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en B*1801 , B*3701 B 001, B 002,, B 006, B 402, B 403, y B 501); una pluralidad de variantes de supertipo HLA-B58 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B*5801, y B*5802); o una pluralidad de variantes de supertipo HLA-B62 (por ej., seleccionados del grupo que consiste en B*1501, BM502, B*1512, B*1513, B*4601, y B*5201). En determinadas modalidades, la pluralidad de los epítopos CTL comprende péptidos de unión a HLA clase I que se unen colectivamente a al menos una molécula HLA clase I de cada uno de los supertipos HLA-A01, HLA-A02, HLA-A03, HLA-A24, HLA-B07, HLA-B08, HLA-B58, HLA-B62 y HLA-B44.
Estudios en seres humanos han indicado que las respuestas inmunitarias de las células cumplen una función en el control de la infección por influenza. Idéase, por ejemplo, McMichael et al. (1983) New England J. Med. 309(1):13; Sonoguchi et al. (1985), J Infect. Disease 151(1 ):81. El efecto protector de las respuestas inmunitarias de las células pueden ser de particular importancia en los ancianos (véase, por ej., Almanzar et al. (2007), Wien. Med. Wochenschr 157/5-6:116, McElhaney et al. (2006), J Immunol. 176:6333) y también en los infantes (véase, por ej., Forest et al. (2008) Clin. Vaccine Immunol. 15(7):1042). Con el fin de evaluar la inmunogenicidad específica para los epítopos identificados, las respuestas de memoria pueden llevarse a cabo mediante la utilización de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y péptidos de un donante humano. Puede asumirse que las respuestas de memoria específicas de los epítopos son el resultado de una infección previa con el virus de la influenza y la presencia de tales células T indica que los epítopos se generan naturalmente y que, por lo tanto, son una excelente opción para incluirlos en la vacuna. En determinadas modalidades, un epítopo CTL o HTL codificado por la primera secuencia heteróloga tiene la capacidad de generar una respuesta gamma interferón humana (I FN-?) (específicamente, células formadoras de manchas (SFC) por 1 x 1 06 células) de al menos dos veces por encima de las respuestas iniciales, por ej. , 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1 1 00, 1200, 1300, 1400, 1 500, 2000, 2500, 3000, o más con análisis de ensayo ELISPOT. Los péptidos CTL o HTL seleccionados pueden ser analizados de dos maneras: (1 ) directamente ex vivo, donde los PBMC se descongelan, se dejan reposar 5 días en medios de cultivo, y las respuestas se miden con ensayo IFN-? ELISPOT, y (2) siguiendo una etapa de cultivo con péptidos para aumentar la sensitividad. Las respuestas significativas de los epítopos indicados pueden definirse como respuestas mayores a las respuestas iniciales medias más (2.0 x Std. Dev.). Es importante determinar las respuestas iniciales para este método. Las respuestas iniciales puede determinarse mediante el uso de los péptidos de unión a CTL y HTL de patógenos cuyos donantes no fueron expuestos, tales como HIV, HBV, HCV y Plasmodium falciparum. En determinadas modalidades, un epítopo CTL o HTL codificado por la primera secuencia heteróloga se conserva de manera evolutiva y tiene la capacidad de generar una respuesta I FN-? humana de al menos dos veces por encima de las respuestas iniciales, por ej. , 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, o más con análisis de ensayo ELISPOT. En determinadas modalidades, un epítopo CTL o HTL codificado por la primera secuencia heteróloga se conserva de manera evolutiva y tiene la capacidad de generar una respuesta IFN- ? humana de al menos dos veces por encima de las respuestas iniciales, por ej., 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, o más con análisis de ensayo ELISPOT, y exhibe una unión degenerativa a (es decir, se une a más de una) moléculas HLA clase I o clase II, respectivamente. Los métodos para probar la habilidad de los epítopos CTL o HTL para unirse con moléculas HLA clase I y clase II y de generar una respuesta IFN-? humana se conocen en la técnica y se han descrito, por ej., en WO 2008/054540 (Alexander et al.), presentada el 18 de mayo de 2007, WO 2008/039267 (Alexander et al.), presentada el 23 de julio de 2007, y Assarsson et al. (2008), J Virol 82:12241, el contenido de las cuales se incorpora a la presente mediante esta referencia.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga es de un virus de la influenza. Un antígeno de la influenza adecuado puede ser un antígeno de la superficie, tal como la hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), M2, o un fragmento de los mismos (por ej., uno o más epítopos HTL o CTL). Otros antígenos de la influenza adecuados incluyen M1, P, NS1, NS2, PA, PB1 y PB2, o fragmentos de los mismos (ej., uno o más epítopos HTL o CTL).
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína HA de la influenza de longitud completa, o una porción de la misma, tal como una porción externa (es decir, una porción ubicada en la superficie externa del virus de la influenza), un fragmento HA1 , un fragmento HA2, o uno o más epítopos (por ej. , epítopos de células B, HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción, fragmento o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase II , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferón humanas (IFN-?) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso del PBMC de un donante humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos HA HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, SEQ I D NOs; 1 a 1 2). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos HA CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 2 (es decir, SEQ ID NOs: 62 a 67).
Tabla 1 a) El % de conservación se basa en el análisis de la secuencia cepas de la influenza (H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H9N2, b) El n° de alelos unidos se refiere al número de moléculas HLA de clase II del grupo que consiste en HLA-DRB1*0101 , HLA-DRB1*0301 , HLA-DRB1*0401, HLA-DRB1*0404, HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*0701 , HLA-DRB1*0802, HLA-DRB1 *0901 , HLA-DRB1 *1101 , HLA-DRB1 *1302, HLA-DRB1*1501, HLA-DRB4*0101 y HLA-DRB5*0101 unidos por el péptido. c) memoria se refiere al número de donantes humanos que exhiben respuestas IFN-? dos veces mayores a las respuestas iniciales en análisis de ensayo ELISPOT.
Tabla 2 a) El N° de alelos unidos se refiere a un número de moléculas HLA clase I de un supertipo HLA particular unidas por el péptido. Para HLA-A1, se analizaron A*101, A*2601, A*2902, y A*3002 ; para HLA-A2, se analizaron A*0201, A*0202, A*0203, A*0206, y A*6802; para HLA-A3, se analizaron A*0301, A 101, A*3101, A*3301, y A*6801; para HLA-A24, se analizaron A*2301, A*2402, A*2902, y A*3002; para HLA-B7, se analizaron B*0702, B*3501, B*5101, B*5301, y B*5401; y para HLA-B44, se analizaron B*1801, B*4001, B 002, B 403, y B*4501.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína NA de la influenza de longitud completa, o una porción de la misma, tal como una porción externa (es decir, una porción ubicada en la superficie externa del virus de la influenza), un fragmento o un epítopo (por ej., uno o más epítopos de células B, HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción, fragmento o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase II, respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferon humanas (IFN-y) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso del PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica una o más copias de la SEQ I D NO: 19 (véase la tabla 1 ). En otras modalidades, la primera secuencia heterologa codifica uno o más epítopos NA CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 3 (es decir, SEQ ID NOs: 86109).
Tabla 3 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica una proteína M2 de la influenza de longitud completa, o una porción de la misma, tal como una porción externa (es decir, M2e, una porción ubicada en la superficie externa de un virus de la influenza), un fragmento o un epítopo (por ej. , uno o más epítopos de células B, HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción, fragmento o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. Por ejemplo, en determinadas modalidades, la porción M2 externa tiene una secuencia que se muestra en la tabla 4. La primera secuencia heterologa puede codificar un concatémero de dos o más fragmentos o porciones de M2 (por ej. , dos o más repeticiones de una secuencia individual M2e mostrada en la tabla 4 o dos o más secuencias M2e mostradas en la tabla 4). En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica una secuencia que se repite que incluye la SEQ I D NO: 31 2, SEQ ID NO: 31 8, SEQ I D NO: 321 , SEQ ID NO: 327 o cualquier combinación de las mismas (por ej. , al menos una copia de las cuatro secuencias). En determinadas modalidades, el epítopo M2 es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferón humanas (IFN-?) ante la restimulación con péptidos en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de un PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica una o más copias de la SEQ I D NO: 18 (véase la tabla 1 ). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos M2 CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 5 (es decir, las SEQ ID NOs: 80 a 85).
Tabla 4 Tabla 5 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína M 1 de la influenza de longitud completa, o una porción de la misma, tal como un epítopo (por ej. , uno o más epítopos HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferón humanas (I FN-?) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos M 1 HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, las SEQ I D NOs; 13 a 17). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos M1 CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 6 (es decir, las SEQ ID NOs: 68 a 79).
Tabla 6 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína N P de la influenza de longitud completa, o una porción de la misma , tal como un epítopo (por ej . , uno o más epítopos HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva . En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhi be una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferón humanas (I FN-?) en el análisis del ensayo ELI S POT mediante el uso de PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos NP HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, las SEQ I D NOs; 20 a 26) . En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos NP CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 7 (es decir, las SEQ I D NOs: 1 1 0 a 1 39) . En aún otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una o más copias de la secuencia NP de la SEQ ID NO: 337 (es decir, LELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRAS).
Tabla 7 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína de influenza NS 1 de longitud completa, o una porción de la misma, tal como un epítopo (por ej ., uno o más epítopos HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferón humanas (IFN-?) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos NS 1 HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, las SEQ ID NOs: 27 a 29). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos NS1 CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 8 (es decir, la SEQ I D NOs: 140 a 1 52).
Tabla 8 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína de influenza NS2 de longitud completa, o una porción de la misma, tal como un epítopo (por ej. , uno o más epítopos HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferon humanas (IFN-?) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos NS2 HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, las SEQ ID NOs: 30 a 33). En otras modalidades, la primera secuencia heterologa codifica uno o más epítopos NS2 CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 9 (es decir, las SEQ ID NOs: 1 53 a 163).
Tabla 9 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica una proteína de influenza PA de longitud completa, o una porción de la misma, tal como un epítopo (por ej. , uno o más epítopos HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferón humanas (IFN-?) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos PA HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, las SEQ ID NOs: 34 a 40). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos PA CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 10 (es decir, las SEQ ID NOs: 164 a 205).
Tabla 10 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína PB1 de la influenza de longitud completa, o una porción de la misma, tal como un epítopo (por ej. , uno o más epítopos HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferón humanas (I FN-?) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica uno o más epítopos PB1 HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, las SEQ ID NOs: 41 a 54). En otras modalidades, la primera secuencia heterologa codifica uno o más epítopos PB1 CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 1 (es decir, las SEQ I D NOs: 206 a 264).
Tabla 11 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína PB2 de la influenza de longitud completa, o una porción de la misma, tal como un epítopo (por ej. , uno o más epítopos HTL o CTL). En determinadas modalidades, la porción o epítopo es de una secuencia conservada de manera evolutiva. En determinadas modalidades, el epítopo es un epítopo HTL o CTL que exhibe una unión degenerativa a moléculas HLA clase I o clase I I , respectivamente, y/o tiene la capacidad de generar respuestas gamma interferon humanas (IFN-?) en el análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de PBMC humano. Como se discutió anteriormente, los epítopos HTL o CTL pueden formar un concatémero donde un único epítopo HTL o CTL se repite y/o donde una pluralidad de epítopos HTL y/o CTL se unen. En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica uno o más epítopos PB2 HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 (es decir, las SEQ I D NOs: 55 a 61 ). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos PB2 CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 12 (es decir, las SEQ I D NOs: 265 a 309).
Tabla 12 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una pluralidad de epítopos HTL enumerados en la tabla 1 (es decir, las SEQ ID NOs: 1 a 61 ) donde la pluralidad de epítopos HTL incluye epítopos de una pluralidad de epítopos de la influenza. La secuencia codificada puede, por ejemplo, codificar un multímero de epítopos HTL de diferentes proteínas de la influenza. En determinadas modalidades, la pluralidad de epítopos HTL se selecciona, en parte, en función de su porcentaje de conservación de la secuencia, número y tipo de alelos unidos HLA clase I I (es decir, para asegurar la unión a un espectro amplio de alelos HLA clase II), respuesta IFN-? en análisis del ensayo ELISPOT mediante el uso de PBMC humano, o cualquier combinación de los mismos. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos HTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 1 3. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un multímero de todos los epítopos HTL mostrados en la tabla 1 3.
Tabla 13 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 1 . b) Véase nota al pie (b) de la tabla 1 . c) Véase nota al pie (c) de la tabla 1 .
En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una pluralidad de epítopos CTL enumerados en las tablas 2-3 y 5 a 12 (es decir, las SEQ I D NOs: 62 a 309) donde la pluralidad de epítopos CTL incluye epítopos de una pluralidad de proteínas de la influenza. La secuencia codificada puede, por ejemplo, cod ificar un multímero de epítopos CTL de diferentes proteínas de la influenza. En determinadas modalidades, la pluralidad de epítopos CTL se selecciona , en parte, en función de su porcentaje de conservación de la secuencia, número y tipo de alelos unidos HLA clase I (es decir, para aseg urar la unión a un espectro amplio de alelos H LA clase I), respuesta I FN-? en análisis en el ensayo ELI SPOT mediante el uso de PB C humano, o cualquier com bi nación de los mismos. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica uno o más epítopos CTL seleccionados del grupo que se muestra en la tabla 14. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un multímero de todos los epítopos CTL mostrados en la tabla 14.
Tabla 14 a) Véase nota al pie (a) de la tabla 2. b) Assarsson et al. (2008), J Virol 82: 12241 .
La primera secuencia heteróloga puede codificar una proteína o antígeno inmunogénico de cualquier patógeno infeccioso descrito en la presente. Por ejemplo, en algunas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica u na proteína inmunogénica de un virus, una bacteria, un protista y/o un hongo. En una modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína inmunogénica de un virus de la influenza, poliovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (H IV) , virus del papiloma humano (HPV), virus de chikungunya, y/o virus de la fiebre del Dengue. En otra modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína inmunogénica de Bacillus (por ej. , Bacillus anthracis) , Mycobacterium (por ej. , Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium Leprae) , Shigella (por ej. , Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri), Streptococcus, y/o Escherichia (por ej. , E . coli enterotoxigénico, enterohemorrágico o productor de toxinas Shiga). En otra modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína inmunogénica de E. coli enterotoxigén ico (ETEC) , E. coli enteropatogénico (EPEC), E. coli enteroinvasivo (EI EC), E. coli enterohemorrágico (EHEC), y/o E. coli enteroagregativo (EAEC) . En aún otra modalidad , la primera secuencia heteróloga codifica una proteína inm unogénica de Burkholderia (por ej. , Burkholderia cepacia complex) , Pseudomonas (por ej. , Pseudomonas aeruginosa), Clostridium (por ej. , Clostridium botulinum, Clostridium reían/', Clostridium difficile), Staphylococcus (por ej. Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina, resistentes a los multifármacos, o resistente a la oxacilina) , Enterococcus (por ej. , Enterococcus faecalis, Enterococcus faecum, enterococos resistentes a la vancomicina (VRE)), Streptococcus (por ej. , Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae), y/o Vibrio (por ej., Vibrio cholerae). En otra modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína inmunogénica de Camphylobacter (por ej., Camphylobacter jejuni), Bordetella (por ej., Bordetella pertussis), Chlamydia (por ej., Chlamydia pneumonía, Chlamydia trachomatis), Corynebacterium (por ej., Corynebacterium diphtheria), Legionella (por ej., Legionella pneumophila), Listeria (por ej., Listeria monocytogenes), Neisseria (por ej., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis), Salmonella (por ej., Salmonella entérica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium), Yersinia (por ej., Yersinia pestis), Haemophilus (por ej, Haemophilus influenzae), Helicobacter (por ej., Helicobacter pylori), Coxiella (por ej., Coxiella burnetti), y/o Francisella (por ej., Francisella tularensis). En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína inmunogénica de influenza, HIV, HPV, Bacillus anthracis, Plasmodium y/o Shigella. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína inmunogénica de influenza, HIV, y/o Bacillus anthracis.
Los antígenos de la influenza codificados por la primera secuencia heteróloga pueden ser de cualquier cepa de la influenza, que existan actualmente o que se aislen consecuentemente, incluyendo, por ej. una cepa asociada con la gripe española de 1918 (H1N1), la gripe asiática de 1957 (H2N2), la gripe de Hong Kong de 1968 (H3N2), la gripe de Hong Kong de 1997 (H5N1), la gripe de Vietnam de 2004 (H5N1), la gripe porcina de 2009 (H1N1), etc. De esta manera, por ejemplo, el antígeno HA puede ser un antígeno HA H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o B, mientras que el antígeno NA puede, por ejemplo, ser un antígeno NA N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9. En algunas modalidades, el antígeno HA es un antígeno HA H1, H3, H5 o B. Ejemplos no taxativos de cepas de influenza que pueden ser la base una secuencia heteróloga de la invención incluyen: A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1); A/Brevig Mission/1/1918 (H1N1); A/Wilson-Smith/33 (H1N1); A/Puerto Rico/8/34/ Mount Sinai (H1N1); A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1); A/USSR/90/1977 (H1N1); A/New Caledonia/20/1999(H1N1)¡ A/Solomon lslands/3/2006(H1 N1 ); A/Brisbane/59/2007(H1 N1 ); A/California/7/2009 (H1N1); A/California/14/2009 (H1N1); A/California/08/2009 (H1N1); A/California/05/2009 (H1N1); A/Texas/04/2009 (H1N1); A/Mexico/lnDRE4114/2009 (H1N1); A/New York/1669/2009 (H1N1); A/Canada-AB/RV1532/2009 (H1N1); A/Leningrad/134/47/57 (H2N2); A/Ann Arbor/6/60 (H2N2); A/Berlin/3/64 (H2N2); A/Tokyo/3/67 (H2N2); A/Singapore/1/57 (H2N2); A/Hong Kong/1/68 (H3N2); A/Albany/1/76 (H3N2); A/Panama/2007/99 (H3N2); A/Wisconsin/67/05(H3N2); A/Hong Kong/1774/99 (H3N2); A/Moscow/10/99 (H3N2); A/Hiroshima/52/2005(H3N2); A/California/7/2004(H3N2); A/New York/55/2004(H3N2); A/Brisbane/10/2007(H3N2); A/Perth/16/2009 (H3N2); A/goose/Guiyang/337/2006 (H5N1) ciado 4; A/HK/156/97 (H5N1); A/HK/483/97 (H5N1); A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) ciado 1; A/Viet Nam/1203/2004 (H5N1) ciado 1; A/duck/NCVD1/07 (H5N1); A/chicken/Viet Nam/NCVD-21/07 (H5N1); A/lndonesia/5/05 (H5N1) ciado 2.1; A/Turkey/65-596/06 (H5N1) ciado 2.2; A/chicken/lndia/NIV33487/2006 (H5N1) ciado 2.2; A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1) ciado 2.2; A/Egypt/902782/2006 (H5N1); A/Egypt/2321/2007 (H5N1); A/Egypt/3300-NAMRU3/2008 (H5N1); A/Anhui/1/2005 (H5N1); A/China/GD01/2006 (H5N1); A/common magpie/Hong Kong/50525/07 (H5N1) ciado 2.3.2; A/Japanese white-eye/Hong Kong/1038/2006 (H5N1) ciado 2.3.4; A/chicken/Viet Nam/NCVD-15/2007 (H5N1); A/chicken/ltaly/2335/2000 (H7N1); A/turkey/ltaly/3675/99 (H7N1); A/chicken/New York/21211-2/05 (H7N2); A/New York/107/03 (H7N2); A/chicken/British Columbia/GSC human B/04 (H7N3); A/Canada/ rv504/04 (H7N3); A/chicken/British Columbia/CN-6/04 (H7N3); A/equine/San Paulo/4/76 (H7N7); A/seal/Mass/1/1980 (H7N7); A/chicken/Victoria/1/1985 (H7N7); A/chicken/Netherlands/2586/2003(H7N7); A/mallard/California/HKWF1971/2007 (H7N7); A/chicken/Beijing/1/94 (H9N2); A/quail/Hong Kong/G1/1997 (H9N2); A/Korea/KBNP-0028/2000 (H9N2); A/chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2); A/chicken/Hong Kong/CSW153/ 2003 (H9N2); A/chicken/Shantou/6781/2005 (H9N2); A/chicken/Jiangsu/L1/2004 (H9N2); A/Hong Kong/1073/99 (H9N2); A/Hong Kong/2108/2003 (H9N2); A/chicken/Shiraz/AIV- IR004/2007(H9N2); A/chicken/Zibo/L2/2008(H9N2); A/chicken/Henan/L1/2008(H9N2); A/avian/lsrael/313/2008(H9N2) y B/Brisbane/60/2008. Otras cepas de la influenza pueden ser fácilmente identificadas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la tabla 1 de WO 2008/054540 proporciona una lista extensa de las diferentes cepas de la influenza que se han aislado hasta la fecha, como se muestra en el sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI).
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno HA de la influenza seleccionado de los virus de la influenza H 1 , H3, H5 o B. El antígeno HA puede derivarse, en algunas modalidades, de una o más de las cepas seleccionadas del grupo que consiste en A/Vietnam/1 194/2004, A/Vietnam/1203/2004, A/Anhui/1 /2005, A/Egypt/2321/2007, A/Egypt/3300-NAMRU3/2008, A/Perth/16/2009, A/California/05/2009, o B/Brisbane/60/2008. En algunas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno NP o M 1 de la influenza. En una modalidad, el antígeno NP o M 1 deriva de las cepas de influenza A/Texas/04/2009 o A/California/08/2009.
En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de un virus de papiloma humano (HPV). El HPV puede ser de cualquier cepa descubierta a la fecha o posteriormente (por ej., HPV-1 , HPV-2, HPV-6, HPV-1 1 , HPV-16, HPV-18, HPV-31 , HPV-45, etc.). En una modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de una cepa HPV-16 o HPV-18. En determinadas modalidades, el antígeno HPV es un antígeno de la superficie, tal como una proteína L1 de longitud completa o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En una modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína L1 de longitud completa que se encuentra total o parcialmente optimizada por codones. En otras modalidades, el antígeno HPV es una L2 de longitud completa o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En otras modalidades, el antígeno HPV es un polipéptido híbrido L2 o un polipéptido híbrido L1 /L2. Por ejemplo, en una modalidad particular, el antígeno HPV es un polipéptido L1 que comprende un fragmento de un polipéptido L2 (por ej. , un fragmento L2 se puede insertar en un bucle del polipéptido L1 ). En aún otras modalidades, el antígeno HPV es una proteína E6 o E7 de longitud completa, o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En aún otras modalidades, el antígeno HPV es una proteína de fusión que comprende proteínas L1 , L2 y/o E6 y E7. Por ejemplo, en algunas modalidades, el antígeno HPV es una proteína de fusión que comprende un polipéptido híbrido L1 /L2 fusionado a una proteína E7. En otras modalidades, el antígeno HPV es una proteína de fusión que comprende un polipéptido híbrido L1/L2 fusionado a una proteína E6, En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de un virus de inmunodeficiencia humana (HIV). El HIV puede ser de cualquier cepa conocida o que se descubra posteriormente (por ej. HIV-1 , HIV-2, etc.). En determinadas modalidades, el antígeno HIV es un antígeno de la superficie, tal como una proteína env. de longitud completa (ej. , gp 160) o un fragmento u oligómero de la misma (por ej. , gp140, gp120, gp41 , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En otras modalidades, el antígeno HIV es una proteína cápside de longitud completa (p24), una proteína matriz (p1 7) o un fragmento de la misma (por ej . , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL) . En otras modalidades, el antígeno H IV es una proteína Tat (por ej. , p1 6 o p14) , Rev (p1 9), Vif (p23) , Vpr (p14) , Nef (p27) , Vpu (p1 6) o Gag . El antígeno HIV puede ser cualquier proteína H IV, de longitud completa o no, tal como un epítopo HTL o CTL, y puede ser una secuencia conservada de manera evolutiva . En algunas modalidades, la secuencia de antígenos H IV puede ser modificada genéticamente para contener dominios de trimerización heterólogos (por ej . , GCN de levadura, tal como GCN4 y motivos de fibrina FT de bacteriófagos T4) o determ inadas secuencias de señalización para modificaciones postraduccionales, tal como los sitios de anclaje de glicosi lfosfatidilinositol (G PI) . Por ejemplo, en una modalidad, una proteína de envoltorio HIV, tal como gp 140 o gp 120, puede ser modificada para contener un sitio de anclaje de GPI . En otra modalidad, una secuencia gp 140 H IV puede ser modificada para contener un dom inio de trimerización GCN heterólogo y/o un sitio de anclaje GPI . En algunas modalidades, el dominio de trimerización GCN o el sitio de anclaje GPI está fusionado a el extremo carboxilo de una secuencia de proteínas de envoltorio H IV (por ej . , la secuencia gp 140 HIV) .
En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de una bacteria Bacillus. El Bacillus puede ser cualquiera de un grupo de especies patogénicas (por ej . , B. anthracis, B. cereus, etc.) y puede ser de cualquier aislado de dicha especie conocido o descubierto posteriormente. En determ inadas modalidades, el antígeno de Bacillus es un antígeno de la superficie, tal como una proteína residente en la membrana celular, o un fragmento de la misma (por ej., un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En otras modalidades, el antígeno de Bacillus es una proteína intracelular o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En determinadas modalidades, el antígeno de Bacillus está asociado con la entrada de la célula hospedadora. Por ejemplo, el antígeno puede ser una proteína de unión celular objetivo (por ej. , un antígeno protector (PrAg or PA)), una metalopeptidasa (por ejemplo, un factor letal (LF)), una adenilato ciclasa (por ej. , un factor edema (EF)), o un fragmento de los mismos (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva, y/o un epítopo HTL o CTL). En algunas modalidades, el antígeno Bacillus puede modificarse para eliminar un sitio de escisión de termolisina o contener un ancla GPI . En una modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno protector o un antígeno protector modificado que ha sido modificado para eliminar un sitio de escisión de termosilina o contener un ancla GPI.
En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de una bacteria Shigella. El Shigella puede ser cualquiera de un grupo de especies patogénicas (por ej. , S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexneri, etc.) y puede ser cualquier aislado de dicha especie conocido o descubierto posteriormente. En determinadas modalidades, el antígeno de Shigella es un antígeno de la superficie, tal como una proteína residente en la membrana celular o asociada a ella, tal como una proteína integral de la membrana o una proteína periférica de la membrana, o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). Por ejemplo, el antígeno puede ser una proteína de la membrana externa, tal como la cepa de Karp p56. En otras modalidades, el antígeno de Shigella es una proteína intracelular o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En determinadas modalidades, el antígeno de Shigella está asociado con la entrada de la célula hospedadora, tales como las proteínas invasivas IpaB, IpaC, o IpaD. En otra modalidad, los antígenos de Shigella son antígenos universales que comprenden polipéptidos IcsP y/o SigA.
En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de una micobacteria. La micobacteria puede ser cualquiera de un grupo de especies patogénicas (por ej. , M. tuberculosis, M. leprae, M. lepromatosis, etc.) y puede ser cualquier aislado de dicha especie conocido o descubierto posteriormente. En determinadas modalidades, el antígeno de micobacteria es un antígeno de la superficie, tal como una proteína residente en la membrana celular o asociada a ella, tal como una proteína integral de la membrana o una proteína periférica de la membrana, o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En otras modalidades, el antígeno de micobacteria es una proteína intracelular o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En determinadas modalidades, el antígeno de micobacteria se selecciona del grupo que consiste en Ag85A, Ag85B, Ag85C, ESAT-6, CFP-1 0, HspX, y combinaciones de los mismos.
En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de Plasmodium. El plasmodium puede ser cualq uiera de un grupo de especies patogénicas (por ej. , P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, etc. ) y puede ser cualquier aislado de dicha especie conocido o descubierto posteriormente. En determ inadas modalidades, el antígeno de plasmodium es un antígeno de la superficie, tal como una prote ína residente en la membrana celular o asociada a el la , tal como una proteína integral de la membrana o una proteína periférica de la mem brana, o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL) . En otras modalidades, el antígeno de plasmodium es una prote ína intracelular o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En determinadas modalidades, el antígeno de plasmodium seleccionado del grupo que consiste en CS, CSP (no escindido) , MSP1 , MSP2 (p-42 c-terminal) , LSA1 , EBA-1 75, AMA1 , FMP1 , Pfs48/45, y MSP3.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de Streptococcus pneumoniae {por ej., Pneumococcus) . En determinadas modalidades, el antígeno de Streptococcus pneumoniae es un antígeno de la superficie, tal como una proteína residente en la membrana celular o asociada a ella, tal como una proteína integral de la membrana o una proteína periférica de la membrana , o un fragmento de la misma (por ej . , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL) . En otras modalidades, el antígeno de Streptococcus pneumoniae es una proteína intracelular o un fragmento de la misma (por ej. , un epítopo conservado de manera evolutiva y/o un epítopo HTL o CTL). En determinadas modalidades, el antígeno de Streptococcus pneumoniae es seleccionado del grupo que consiste en proteínas de la superficie de neumococo (por ej . , PspA, PspC), neumolisina (Ply), enzimas de nauraminidasa (por ej. , NanA, NanB), autolisina A (LytA), proteínas de tríada de histidina neumocócicas, PiaA, PiuA, fructosa bisfosfato aldolasa (FBA), adhesina A, y neumolisoide.
En aún otras modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de la superficie, una proteína interna, una toxina, una proteína asociada con la invasión, proteasa u otras enzimas, proteína de choque térmico u otro antígeno de cualquier otro patógeno infeccioso. Por ejemplo, el antígeno de la superficie puede ser de un patógeno infeccioso seleccionado del grupo que consiste en Bordetalla pertussis, Chlamydia pneumonía (por ej. , proteína D de la membrana, proteína de la membrana externa), Chlamydia trachomatis (por ej. , proteína D de la membrana, proteína de la membrana externa), Legionella pneumophilia, Staphylococcus aureus, incluyendo cepas resistentes a la meticilina, resistentes multifármacos y resistentes a la oxacilina (por ej. , IsdA, IsdB, SdrD, SdrE), Streptococcus pneumoniae (por ej., PsPA), Streptococcus aeruginosa (por ej . , flagellar Ag , porins), Streptococcus pyogenes (por ej. , proteína M, proteína de unión a la fibronectina Sfb1 ), Streptococcus agalactiae, E. coli enterohemorrágico (por ej., intimina, adhesina FimH), Haemophilis influenzae (por ej. , Pili, P1 , P2, P4, P6), Candida (por ej. , Alsl p, Als3p), Coccidioides immitis (por ej. , Ag2), Pseudomonas aeruginosa (por ej. , antígeno flagelar, porinas), virus del sarcoma de Rous (por ej. , proteína F, proteína G), retrovirus endógeno humano K (por ej . , antígeno HERV-K-MEL de melanoma) virus del herpes (por ej. , glucoproteína D2), virus de la fiebre del dengue (por ej. , proteínas de envoltorio DEN 1 , DEN2, DEN3, DEN4, proteína de dominio 4xEDI I I tetravalente), etc. La toxina puede seleccionarse del grupo que consiste en toxina lábil de Camphyiobacter jejuni, toxinas A y B de Clostridium difficile, exotoxinas y endotoxinas pirogénicas de Streptococcus pyogenes, toxina B de Vibrio cholerae, toxina Shiga (por ej, Stx-1 , Stx-2) de E. coli enterohemorrágico, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, etc. La proteasa u otras enzimas puede seleccionarse del grupo que consiste en factor de proteasa secretado de Chlamydia, neumolisina, autolisina o neuraminidasa de Streptococcus pneumoniae, proteasa de cisteína o peptidasa C5a de Streptococcus pyogenes, ureasa de Helicobacter pylori, ureasa de Coccidioides immitis, His-62, antígeno H, y hsp70 de Histoplasma capsulatum, etc.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína producida por una célula cancerosa en su totalidad o en parte. La proteína o un fragmento de la misma (por ej. producto de la escisión, dominio estructural, unidad(es) de estructura secundaria, epítopos de células B, epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL), epítopos de los linfocitos T auxiliares (HTL)), etc. , pueden estar en la superficie de la célula cancerosa. Por ejemplo, la proteína o fragmento de la misma puede ser altamente antigénica y/o un marcador para la célula cancerosa (por ej. , un marcador específico de células cancerosas o un antígeno altamente enriquecido en las células cancerosas). De manera alternativa, la proteína o un fragmento de la misma (por ej. producto de la escisión, dominio estructural, unidad(es) de estructura secundaria, epítopos HTL o CTL, etc.), pueden estar en el interior de la célula cancerosa. Por ejemplo, la proteína o el fragmento de la misma puede ser una proteína citosólica, una proteína nuclear, etc.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende al menos un marco abierto de lectura completo (ORF), donde el al menos un ORF completo codifica un polipéptido discreto capaz de ser expresado en una célula hospedadora infectada con el vector adenoviral. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende al menos dos o más ORF completos, cada uno de los cuales codifica un polipéptido discreto capaz de ser expresado en una célula hospedadora infectada con el vector adenoviral. Uno o más de los polipéptidos discretos pueden ser una proteína de longitud completa o un fragmento de la misma, como se describió anteriormente. Asimismo, uno o más de los polipéptidos discretos pueden ser un multímero de dominios proteicos, motivos estructurales, o epítopos (por ej. , epítopos de células B, HTL o CTL), como se describió anteriormente. Por ejemplo, en determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende un primer ORF que codifica una proteína de longitud completa (por ej. , HA de la influenza) y un segundo ORF que codifica un multímero de dominios proteicos, motivos estructurales, o epítopos (por ej . , un multímero de una o más secuencias M2 de la influenza seleccionadas de la tabla 4, un multímero de uno o más epítopos de células B de la influenza, un multímero de uno o más epítopos HTL de la influenza seleccionados de la tabla 1 o de la tabla 13, o un multímero de uno o más epítopos CTL de la influenza seleccionados de las tablas 2-3 y 5 a 12 o de la tabla 14, etc.).
De esta manera, en algunas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína de fusión. La proteína de fusión puede comprender uno o más epítopos o fragmentos de . proteínas antigénicas o proteínas de longitud completa del mismo patógeno infeccioso o de un patógeno infeccioso diferente. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión comprende un polipéptido híbrido L1 /L2 de HPV como se describió en la presente, fusionado a proteínas E6 y E7 de HPV. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende un polipéptido híbrido L1 /L2 derivado de HPV-16 (por ej . , una proteína L1 HPV-16 de longitud completa con un fragmento de L2 H PV-16 insertado en un bucle L1 ) fusionado a una proteína E7. En otras modalidades, la proteína de fusión comprende un polipéptido híbrido L1 /L2 derivado de HPV-18 (por ej. , una proteína L1 HPV-18 de longitud completa con un fragmento de L2 HPV-18 insertado en un bucle L1 ) fusionado a una proteína E6. En otra modalidad, la proteína de fusión comprende fragmentos inmunogénicos de proteínas de HA y NA de la influenza fusionadas (por ej. , epítopos de neutralización de HA de la influenza o proteínas NA como se describió en la presente). En otra modalidad, la proteína de fusión comprende uno o más epítopos de neutralización de proteínas de HA de la influenza como se describió en la presente, fusionadas a proteínas NA de la influenza de longitud completa. En aún otra modalidad, la proteína de fusión puede ser un multímero de varios epítopos como se describió en la presente. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser un multímero de epítopos HTL, donde cada epítopo se conecta por medio de una secuencia enlazadora (véase el ejemplo 13 de un multímero representativo). En algunas modalidades, la proteína de fusión codificada por la primera secuencia heteróloga comprende un antígeno de dos o más especies o serotipos de un patógeno infeccioso. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender dominios EDI 11 de las prote ínas de envoltorio de cada uno de los cuatro serotipos del vi rus de la fiebre del dengue 1 a 4.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende dos ORF completos, donde el primer y segundo ORF se orientan en paralelo (por ej. , de la cabeza a la cola). En determinadas modalidades relacionadas, la primera secuencia heteróloga comprende adicionalmente una secuencia de entrada ribosómica interna (I RES) ubicada 3' del codón de terminación del primer ORF y 5' del codón de inicio del segundo ORF, permitiendo de esta manera que los polipéptidos codificados por el primer y segundo ORF sean traducidos desde una única transcripción de mRNA. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente las secuencias I RES adecuadas que son funcionales en células de mamíferos (por ej. , de humanos) y cómo tales secuencias deberían posicionarse para asegurar una traducción suficiente del segundo ORF.
En determinadas modalidades relacionadas, la primera secuencia heteróloga comprende dos ORF completos, donde el primer y segundo ORF se orientan en paralelo (por ej. , de la cabeza a la cola), y comprenden adicionalmente un aceptor de empalme ubicado a 3' del codón de terminación del primer ORF y 5' del codón de inicio del segundo ORF, permitiendo de esta manera que los polipéptidos codificados por el primer y segundo ORF sean traducidos desde una única transcripción de mRNA o como dos transcripciones separadas de mRNA. Los expertos en la técnica pueden identificar elementos de empalme e incorporarlos de manera correcta. Los aceptores de empalme pueden ser secuencias de consenso (tal como sitios de empalme SV40) o secuencias no consenso (tal como el aceptor de empalme ADP de Ad5) dependiendo del resultado que se desee. Por ejemplo, en la unidad de transcripción tardía principal del adenovirus, los sitios de empalme 3' que tengan polipirimidina atípica se prefieren tardíos en la infección viral. Véase, por ejemplo, Muhlemann et al. (1995), J. Virology 69(1 1 ):7324.
En determinadas modalidades relacionadas, la primera secuencia heteróloga comprende dos ORF completos, donde el primer y segundo ORF se orientan en paralelo (por ej. , de la cabeza a la cola), y comprenden adicionalmente un elemento de salteado de 2A (autoprocesado intraribosómico) ubicado en el marco entre el 3' extremo del primer ORF (codón de terminación eliminado) y 5' en el marco del codón de inicio del segundo ORF, permitiendo de esta manera que los polipéptidos codificados por el primer y segundo ORF sean traducidos desde una única transcripción de mRNA, como un péptido único que se "saltea" un enlace peptídico en la ubicación del elemento A2 y genera de esta manera dos polipéptidos. Los expertos en la técnica pueden identificar los elementos de salteado de 2A, tales como aquellos derivados del virus de la glosopeda (FMDV) y picornavirus y organizarlos de manera tal que los dos ORF formen un péptido continuo único.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende dos ORF completos, donde el primer y segundo ORF se orientan de punta a punta. Por ejemplo, el extremo 3' del primer ORF puede ser adyacente al extremo 3' del segundo ORF. De manera alternativa, el extremo 5' del primer ORF puede ser adyacente al extremo 5' del segundo ORF.
En general, la primera secuencia heteróloga es parte de una unidad de transcripción que contiene mínimamente un potenciador y/o promotor de transcripción y una secuencia de poliadenilación. En determinadas modalidades, la unidad de transcripción comprende adicionalmente uno o más intrones, uno o más potenciadores de empalme, una secuencia líder, una secuencia de consenso de Kozak, uno o más elementos que aumentan la estabilidad y/o el procesamiento del RNA, o cualquier combinación de los mismos.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de o se encuentra ligada de forma operativa a una secuencia de control adenoviral traduccional y/o transcripcional. Tal como se utiliza en la presente, "bajo el control de" y "ligado de forma operativa a" significan que la transcripción y/o traducción de un ORF contenido en una secuencia heteróloga se encuentra afectada por la secuencia de control. De esta manera, por ejemplo, la transcripción y/o traducción del ORF puede verse aumentada como resultado de una secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional. En determinadas modalidades, "ligado de manera operativa a" indica que la secuencia de control y la secuencia heteróloga se encuentran cerca la una de la otra. Por ejemplo, en determinadas modalidades, una secuencia de control adenoviral que se encuentra ligada de manera operativa a una secuencia heteróloga se ubica dentro de aproximadamente 100 bps, entre aproximadamente 100 aproximadamente 200 bps, entre aproximadamente 200 aproximadamente 300 bps, entre aproximadamente 300 aproximadamente 400 bps, o entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 bps de un extremo de la secuencia heteróloga.
Tal como se usa en la presente, una "secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional" es una secuencia de ácido nucleico implicada en la regulación transcripcional y/o traduccional que se deriva de un adenovirus. Tales secuencias incluyen, de manera no taxativa, promotores adenovirales (por ej. , el promotor tardío principal (MLP) o promotor dentro de la unidad de transcripción tardía principal (MLTU), potenciadores de transcripción adenoviral, sitios aceptores de empalme adenovirales (por ej. , el sitio aceptor de empalme natural para la transcripción dirigida por MLP de Ad4 E3 24.8k ORF o la secuencia aceptora de empalme de ADP de Ad5), potenciadores de empalme adenovirales, secuencias líderes adenovirales (por ej. , secuencias líderes tripartitas (TPL)), elementos adenovirales que aumentan la estabilidad y/o procesamiento del RNA (por ej . , elementos de exportación de RNA que actúan en cis), y secuencias de señalización poli A adenovirales (por ej. , secuencia de señalización de poliadenilación Ad5 E3A). La secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional puede ser de cualquier cepa de adenovirus. De esta manera, el vector adenoviral (por ejemplo, el vector Ad4) de la invención puede comprender una secuencia de control transcripcional y/o traduccional adenoviral derivada de una cepa de adenovirus diferente (es decir, una cepa no Ad4) . La secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional puede tener una secuencia de tipo salvaje (es decir, una secuencia que se encuentra en un adenovirus de origen natural) o una secuencia variante de la misma. Las secuencias de control adenoviral transcripcional y/o traduccional han sido descritas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias TPL adenovirales se describen en la solicitud de patente estadounidense 2006/01 15456; los potenciadores se describen en Massie et al. (1995), Biotechnology 1 3(6):602; y las secuencias de poliadenilación se discuten en Bhat and Wold (1986), J. Virology 57(3): 1 155. Secuencias de control adenovirales transcripcionales y/o traduccionales adicionales pueden ser identificadas por los expertos en la técnica.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo (es decir, bajo el control de) un MLP adenoviral. Tal como se usa en la presente, "promotor tardío principal (MLP)" se usa de manera intercambiable con promotor de unidad transcripcional tardía principal (MLTU). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un MLP adenoviral y TPL adenoviral. En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un MLP adenoviral y ligada de forma operativa a una secuencia aceptora de empalme adenoviral. En aún otras modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un MLP adenoviral y un TLP adenoviral y ligada de forma operativa a una secuencia aceptora de empalme adenoviral. En ciertas modalidades, la secuencia aceptora de empalme adenoviral es una secuencia no consenso. Sin intención de limitarse por la teoría, se cree que los aceptores de empalme no consenso se desempeñan mejor que los aceptores de empalme de consenso cuando se usan junto con el MLP adenoviral. En cualquiera de las modalidades que preceden, la primera secuencia heteróloga puede, además, estar ligada de forma operativa a una secuencia de señal poli A adenoviral.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo (es decir, bajo el control de) una secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional. Tal como se usa en la presente, una secuencia de control adenoviral transcripcional y/o traduccional "endógena" es una secuencia de ácido nucleico involucrada en la regulación traduccional y/o transcripcional que es natural de un vector adenoviral y no ha sido introducida o movida a una nueva ubicación mediante tecnolog ías recombinantes. Por ejemplo, cualquier secuencia de control transcripcional y/o traduccional de Ad4 presente en un vector adenoviral Ad4 es endógena al vector adenoviral Ad4 siempre que la ubicación de la secuencia no haya sido modificada mediante tecnolog ías recombinantes.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende una secuencia de control transcripcional y/o traduccional exógena. Tal como se usa en la presente, una secuencia de control transcripcional y/o traduccional "exógena" se refiere a una secuencia de control transcripcional y/o traduccional no adenoviral o a una secuencia de control transcripcional y/o traduccional adenoviral sacada de su contexto de tipo salvaje y colocada en un nuevo contexto dentro de la secuencia heteróloga. Ejemplos de secuencias de control transcripcionales y/o traduccionales exógenas incluyen, de manera no taxativa, promotores funcionales en células de mamíferos (por ejemplo, promotores constitutivos, tal como un promotor de CMV, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor SV40, el promotor de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el promotor de ß-actina, el promotor de la fosfoglicerol quinasa (PGK), el promotor EF1 a (Invitrogen), etc.), secuencias potenciadoras funcionales en células de mam íferos (por ejemplo, secuencias potenciadoras de CMV o RSV), señales de empalme, potenciadores de empalme, secuencias líder, secuencias Kozak, secuencias que aumentan la estabilidad y/o procesamiento del RNA (por ejemplo, elementos de exportación de RNA que actúan en cis, elemento de regulación postraduccional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE)), secuencias de señal poli A (por ejemplo, hormona del crecimiento bovino (BGH) o secuencia de señal poli A SV40) , etc. Varias secuencias de control transcripcionales y/o traduccionales han sido descritas en la técnica previa. Un promotor de CMV adecuado ha sido descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense 2006/01 15456. Los elementos de WPRE se han descrito, por ejemplo, en Donello et al. (1998), J. Virology 72(6):5085. Los elementos de WPRE deben ubicarse dentro del mensaje del ORF, típicamente entre el extremo 3' del gene y la secuencia de poliadenilación 5'. Sin intención de limitarse por la teoría, se cree que los WPRE funcionan mediante el aumento de la eficacia del desplazamiento del mRNA del núcleo, así como el aumento de la traducción y estabilidad del RNA. Las secuencias Kozak también han sido descritas, por ejemplo, en Kozak, Nucleic Acid Res 15(20), 8125-48 (1987).
Secuencias de control transcripcionales y/o traduccionales adecuadas, ya sean adenovirales o de otra forma, incluyen secuencias de origen natural así como formas modificadas de dichas secuencias. Dichas formas modificadas pueden incluir uno o más cambios de base (por ejemplo, eliminaciones, inserciones, sustituciones) diseñados para potenciar una actividad deseable asociada con la secuencia de control transcripcional y/o traduccional o reducir o eliminar una actividad no deseada asociada con la secuencia de control transcripcional y/o traduccional adenoviral endógena.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende múltiples secuencias de control transcripcionales y/o traduccionales. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede comprender suficientes secuencias de control transcripcionales y/o traduccionales para asegurar la expresión de un ORF en la primera secuencia heteróloga luego de la infección de una célula apropiada (por ejemplo, una célula humana) por parte del vector adenoviral. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende un promotor (por ejemplo, un promotor de CMV) y una secuencia TPL adenoviral. En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende un promotor (por ejemplo, un promotor de CMV), un TPL adenoviral y una secuencia de señal poli A adenoviral (por ejemplo, una secuencia de señal poli A del Ad5 E3A). En relación con cualquiera de las modalidades que preceden, la primera secuencia heteróloga puede comprender además una secuencia Kozak.
En ciertas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende una o más secuencias de control transcripcionales o traduccionales para cada uno de dos o más ORF. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede comprender suficientes secuencias de control transcripcionales o traduccionales para asegurar la expresión de cada uno de dos o más ORF. Por consiguiente, en determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga comprende un promotor y una secuencia de señal poli A para cada uno de dos ORF. La primera secuencia heteróloga puede comprender además un TPL adenoviral y/o una secuencia Kozak para cada uno de los ORF. Alternativamente, en determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga puede comprender suficientes secuencias de control transcripcionales o traduccionales para asegurar la expresión de un ORF (por ejemplo, un promotor y/o potenciador y una secuencia de señal poli A) mientras que comprende un segundo ORF que se encuentra bajo el control de o ligado de forma operativa a secuencias de control transcripcionales o traduccionales adenovirales endógenas.
En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa se ha optimizado para aumentar o maximizar la expresión y/o traducción de al menos un ORF. Por ejemplo, en determinadas modalidades, se optimizó un ORF en la primera secuencia heterologa mediante codones (por ejemplo, para su expresión en células de mamíferos, tales como células humanas). En una modalidad, la primera secuencia heterologa fue optimizada mediante codones y se encuentra bajo el control de un promotor no adenoviral, tal como un promotor de CMV. En otras modalidades, una secuencia Kozak ligada de forma operativa a un ORF es la primera secuencia heterologa optimizada para crear, por ejemplo, una secuencia Kozak de consenso. En aún otras modalidades, la primera secuencia heterologa fue optimizada para quitar posibles secuencias inhibidoras, tales como silenciadores de empalme exónicos o secuencias aisladoras (por ejemplo, secuencias que funcionan para organizar cromatina y bloquear los efectos de largo alcance de promotores y/o potenciadores). La optimización mediante codones y otros tipos de optimización de secuencias son habituales en la técnica y los expertos entenderán fácilmente como llevar a cabo tales optimizaciones.
En algunas modalidades en las cuales la primera secuencia heterologa se encuentra bajo el control de un promotor LP, la primera secuencia heterologa no está optimizada mediante codones es decir, la primera secuencia heteróloga es la secuencia natural del patógeno infeccioso. Por ejemplo, en una modalidad, el vector adenoviral comprende una primera secuencia heteróloga no optimizada mediante codones bajo el control de un promotor MLP adenoviral, donde el vector adenoviral tiene capacidad de replicarse y tiene una eliminación parcial de E3. En otra modalidad, el vector adenoviral se deriva de Ad4.
La primera secuencia heteróloga puede insertarse en una cantidad de ubicaciones diferentes en el vector adenoviral, incluyendo las regiones E1 , E2, E3, E4, L3 y L5 o el límite E4-ITR. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se inserta en una región E 1 , E2B, E3, L3 o L5 o un límite E4-ITR. En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga se inserta en una región E3, una región L3 o un límite E4-ITR. En aún otras modalidades, la primera secuencia heteróloga se inserta en una región E3. En determinadas modalidades, un sitio de inserción de región E3 adecuado está ubicado corriente abajo de la secuencia de señal poli A E3B. En determinadas modalidades, un sitio de inserción de región L3 adecuado está ubicado corriente abajo del gene de la proteasa L3 23k (por ejemplo, el gene de la proteasa 23k de un vector Ad5, o la secuencia equivalente en cualquier otro vector adenoviral). El sitio preciso de inserción dentro de las regiones o límites adenovirales puede seleccionarse tal que la primera secuencia heteróloga se encuentre bajo el control de o ligado de forma operativa a una o más secuencias de control transcripcionales y/o traduccionales adenovirales endógenas. De manera alternativa, o adicionalmente, el sitio preciso de inserción puede seleccionarse para minimizar cualquier impacto sobre la capacidad del vector adenoviral recombinante resultante de replicarse en células de mamíferos (por ejemplo, humanas).
Los vectores adenovirales de la invención pueden comprender eliminaciones en el genoma adenoviral. Dichas eliminaciones pueden, por ejemplo, proporcionar espacio para la inserción de secuencias heterólogas (por ejemplo, una primera secuencia heterologa) y ayudar a minimizar cualquier impacto de la inserción sobre la habilidad del vector adenoviral recombinante resultante de replicarse en células de mamíferos (por ejemplo, humanas). El vector adenoviral puede eliminarse en una cantidad de ubicaciones diferentes, incluyendo las regiones E 1 , E2, E3, E4, L3 y L5 o el límite E4-ITR. En determinadas modalidades, el vector adenoviral se elimina en una región E 1 , E2B, E3, L3 o L5 o un límite E4-ITR. En otras modalidades, el vector adenoviral se elimina en una región E3, una región L3 o un límite E4-ITR. En aún otras modalidades, el vector adenoviral se elimina en una región E3. En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa se inserta en, o próximo a, cualquiera de las eliminaciones que anteceden. Por ejemplo, la primera secuencia heterologa puede insertarse en una eliminación parcial de E3 o próxima a una eliminación total de E3.
En determinadas modalidades, una eliminación en el vector adenoviral elimina uno o más marcos abiertos de lectura. Por ejemplo, pueden eliminarse uno, dos, tres o más marcos abiertos de lectura. Los marcos abiertos de lectura pueden tener una función conocida o desconocida. En determinadas modalidades, la eliminación se encuentra en la región E3 y comprende la eliminación de uno, dos, tres o más ORF en la región E3 (por ejemplo, ORF de E3 con función desconocida). La eliminación en una región E3 puede ser una elim inación parcial . De manera alternativa , la eliminación en una región E3 puede ser una eliminación total . La Figura 2 muestra ejemplos de elim inaciones parciales y totales en la región E3 de Ad4. La eliminación de ejemplo parcial de E3 de Ad4 quita los ORF 24.8k, 6.3k y 29.7k, todos los cuales actualmente no tienen función conocida, mientras que la el im inación total de E3 de Ad4 quita los ORF 23.3k, 1 9k, 24.8k, 6.3k, 29.7k, 10.4k, 14.5k y 1 4.7k Una eliminación parcial de E3 alternativa quita los ORF 24.8k, 6.3k, 29.7k, 1 0.4k, 14.5k y 14.7k.
Por lo tanto, en determinadas modalidades, el vector adenoviral de la invención es un vector Ad4 que comprende una elimi nación de uno o más (por ejemplo, todos) los ORF 24.8k, 6.3k y 29.7k de E3. En modalidades relacionadas, el vector adenoviral es un vector Ad4 que comprende una elim inación que corresponde a nucleótidos de alrededor de 28,446 a alrededor de 30, 226 de la secuencia Gen Bank AY594254. En otras modalidades, el vector adenoviral de la invención es un vector Ad4 que comprende una eliminación en la región E3 pero retiene uno o más ORF de E3 seleccionado del grupo que consiste en 23.3k, 19k, 24.8k, 6.3k, 29.7k, 1 0.4k, 14.5k y 14.7k (por ejemplo, pueden retenerse los ORF 23.3k y 1 9k, pueden retenerse los ORF 10.4k, 14.5k y 14.7k o pueden retenerse los ORF 23.3k, 1 9k, 1 0.4k, 14.5k y 14.7k). En modalidades relacionadas, el vector adenoviral es un vector Ad4 que comprende una elim inación que corresponde a nucleótidos de alrededor de 28,446 a alrededor de 31 ,282 o de alrededor de 17,356 a alrededor de 30,226 de la secuencia GenBank AY594254. En aún otras modalidades, el vector adenoviral de la invención es un vector Ad4 que no retiene ninguno de los ORF de E3 del grupo que consiste en 23.3k, 19k, 24.8k, 6.3k, 29.7k, 10.4k, 14.5k y 14.7k. En determinadas modalidades relacionadas, el vector adenoviral es un vector Ad4 que comprende una eliminación que corresponde a nucleótidos de alrededor de 27,356 a alrededor de 31 ,282 de la secuencia GenBank AY594254.
En determinadas modalidades, un ORF se considera como eliminado incluso si una parte de las secuencias de ácido nucleico que comprenden el ORF permanece presente en el vector adenoviral (es decir, incluso si el ORF se elimina solo parcialmente). En determinadas modalidades, la expresión de un ORF parcialmente eliminado puede eliminarse mediante manipulación adicional de la secuencia del ORF. Por ejemplo, en determinadas modalidades, puede eliminarse el codón de inicio del ORF. En determinadas modalidades, una eliminación parcial o total de la región E3 de Ad4 da como resultado una eliminación parcial del ORF 23.3k de E3. En determinadas modalidades, un vector Ad4 que tiene un ORF 23.3k de E3 parcialmente eliminado comprende además una mutación que quita el codón de inicio del ORF 23.3k de E3 (por ejemplo, una mutación en el codón ATG presente en la posición 27279 de la secuencia GenBank AY594254).
En aún otras modalidades, los vectores adenovirales de la invención pueden comprende una eliminación parcial en la región E3 que corresponde a la región ADP del genoma Ad5 (por ejemplo, la región entre el ORF pg 19k de Ad5 E3 y el ORF RI D-alpha de Ad5 E3). Por ejemplo, la eliminación parcial de E3 de Ad4 mostrada en la Figura 2 corresponde a una eliminación de la región ADP de la región E3 de Ad5. De manera similar, la región que se encuentra entre el ORF 18.3k de Ad7 E3 (es decir, la región que comprende los ORF 20. 1 k, 20.6k y 7.7k de Ad7 E3) corresponde a la región ADP de la región E3 de Ad5. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente qué regiones en un vector adenoviral, de un serotipo que no sea Ad4 o Ad7, corresponden a la región ADP de Ad5.
Una primera secuencia heteróloga puede insertarse en una eliminación en el vector adenovira l (por ejem pl o, una e l i m inación como se describió anteriormente). De manera alternativa, la primera secuencia heteróloga puede insertarse en el vector adenoviral en una ubicación próxima a la eliminación (por ejemplo una eliminación como se describió anteriormente). Por ejemplo, en determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se inserta en una eliminación parcial de E3 (por ejemplo, una eliminación parcial de E3 en un vector Ad4). En otras modalidades, la primera secuencia heteróloga se inserta en una eliminación total de E3 (por ejemplo, una eliminación total de E3 en un vector Ad4). En aún otras modalidades, la primera secuencia heteróloga se inserta en una región próxima a una eliminación parcial o total de E3 (por ejemplo, entre la secuencia de señal poli A de E3B una secuencia corriente abajo, tal como el gene de fibra L5 o el exón U. En determinadas modalidades, la primera secuencia heteróloga se inserta en una eliminación parcial de E3 tal que se encuentre bajo el control de un promotor endógeno (por ejemplo, un LTP). En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa comprende un promotor exógeno y, opcionalmente, otras secuencias de control transcripcionales o traduccionales y se inserta en una eliminación parcial o total de E3. En determinadas modalidades, la primera secuencia heterologa no está integrada a un ORF que codifica una proteína adenoviral. Tal como se usa en la presente en este contexto, el término "integrado" significa que una secuencia heterologa se inserta en un ORF adenoviral tal que la secuencia resultante codifica una proteína quimérica, donde parte de la proteína quimérica está codificada por el ORF adenoviral y parte de la proteína quimérica está codificada por la secuencia heterologa.
En algunas modalidades, un vector adenoviral de la invención comprende una primera secuencia heterologa que se encuentra bajo el control de un promotor adenoviral (por ejemplo, promotor tardío principal), donde la primera secuencia heterologa codifica un antígeno de la influenza, Bacillus, HIV, HPV, togavirus (por ejemplo virus de la fiebre del dengue), Shigella, Mycobacterium, Streptococcus o Plasmodium. En una modalidad, la primera secuencia heterologa codifica el antígeno H 1 HA, H3 HA, H5 HA o B HA de la influenza. En otra modalidad, la primera secuencia heterologa codifica un antígeno protector o un antígeno protector modificado de Bacillus anthracis. En otra modalidad, la primera secuencia heterologa codifica una proteína de envoltura (por ejemplo gp160, gp140, gp120), proteína de envoltura modificada o proteína gag del HIV. En aún otra modalidad, la primera secuencia heterologa codifica una proteína L1 , proteína L2, proteína E6, proteína E7 o fusiones de las m ismas del HPV incluyendo HPV16 y HPV1 8. En aún otra modalidad , la primera secuencia heterologa codifica CSP, Pfs48/45, MSP1 , MS P (C-terminal , p42) o LSA1 de Plasmodium. En algunas modalidades, la primera secuencia heterologa codifica Ag85, ESAT, HspX o com binaciones de los mismos de Mycobacterium. En otras modalidades, la primera secuencia heterologa codifica PSSP, proteína r56Karp o una proteína de invasión (por ejemplo, una proteína IpaB, I paC o I paD) de Shigella. En modalidades adicionales, el vector adenoviral puede comprender además una secuencia l íder tripartita. Por ejemplo, la primera secuencia heterologa puede encontrarse bajo el control de un M LP adenoviral y l íder tripartito, donde la primera secuencia heterólogo codifica un antígeno de la influenza , Bacillus, HIV, HPV, togavirus (por ejemplo, virus de la fiebre del dengue) , Shigella, Mycobacterium, Streptococcus o Plasmodium.
En otras modalidades, un vector adenoviral de la invención comprende una primera secuencia heterologa que se encuentra bajo el control de un promotor no adenoviral (por ejemplo, un promotor de CMV, promotor RSV LTR, promotor SV40, promotor DH FR, promotor de ß-actina, promotor PGK, el promotor EF1 a) , donde la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de la influenza, Bacillus, H IV, H PV, togavirus (por ejemplo, virus de la fiebre del dengue), Shigella, Mycobacterium, Streptococcus o Plasmodium. Por ejemplo, en una modalidad , la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor de CMV y codifica un antígeno de la influenza, Bacillus o HIV. En una modalidad particular, la primera secuencia heteróloga es una secuencia optimizada mediante codones de la influenza, Bacillus o HIV. En otra modalidad, la primera secuencia heteróloga es una secuencia natural de la influenza, Bacillus o HIV. En otra modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica el antígeno H 1 HA, H3 HA, H5 HA B HA, NP o M 1 de la influenza. En otra modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno protector o un antígeno protector modificado de Bacillus anthracis. En aún otra modalidad, la primera secuencia heteróloga codifica una proteína de envoltura (por ejemplo, gp160, gp140, gp120), proteína de envoltura modificada o proteína gag del HIV. En algunas modalidades, el vector adenoviral puede comprender además una secuencia líder tripartita. Por ejemplo, la primera secuencia heteróloga puede encontrarse bajo el control de un promotor de CMV y líder tripartito adenoviral, donde la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de la influenza, Bacillus, HIV, HPV, togavirus (por ejemplo, virus de la fiebre del dengue), Shigella, Mycobacterium, Streptococcus o Plasmodium.
En determinadas modalidades, un vector adenoviral de la invención comprende una segunda secuencia heteróloga. Por lo tanto, en determinadas modalidades, el vector adenoviral de la invención comprende tanto una primera secuencia heteróloga como una segunda secuencia heteróloga. De manera alternativa, el vector adenoviral de la invención puede comprender una segunda secuencia heteróloga en vez de la primera secuencia heteróloga.
La segunda secuencia heteróloga puede tener una estructura como se describió anteriormente para la primera secuencia heteróloga y puede insertarse en el genoma adenoviral de cualquiera de las maneras descritas anteriormente. Por lo tanto, en determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga puede codificar un antígeno de longitud completa o un fragmento del mismo (por ejemplo, un dominio, unidad/es de estructura secundaria, epítopo conservado, epítopos de células B, HTL o CTL o combinaciones de los mismos). En algunas modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica una proteína terapéutica tal como una citocina o factor de crecimiento u otra proteína que estimule el sistema inmune. Por ejemplo, en una modalidad, la segunda secuencia heteróloga codifica una proteína que estimula a los leucocitos, tal como un factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF). En algunas modalidades, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de un patógeno infeccioso y la segunda secuencia heteróloga codifica una proteína terapéutica. En una modalidad particular, la primera secuencia heteróloga codifica un antígeno de la influenza (por ejemplo, el antígeno H1 HA, H3 HA, H5 HA o B HA) y la segunda secuencia heteróloga codifica una proteína que estimula a los leucocitos (por ejemplo, GM-CSF). En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga se inserta en la misma región del vector adenoviral que la primera secuencia heteróloga (por ejemplo, tal que la primera y segunda secuencias heterólogas se ubiquen cerca la una de la otra). En otras modalidades, la primera y segunda secuencias heterólogas se insertan en diferentes regiones del vector adenoviral.
La segunda secuencia heteróloga también puede integrarse a un ORF adenoviral. En determinadas modalidades el ORF adenoviral codifica una proteína estructural adenoviral (por ejemplo, una proteína de la cápside tal como una proteína hexón o proteína fibrosa). Por lo tanto, en determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga se integra a un ORF del hexón adenoviral , donde la fusión resultante del ORF del hexón y las secuencias heterólogas codifican una proteína hexón quimérica. En otras modalidades, la segunda secuencia heteróloga se integra a un ORF de fibra adenoviral , donde la fusión resultante del ORF de fibra y las secuencias heterólogas codifican una proteína fibrosa quimérica. En general , una proteína fibrosa o hexón quimérica de la invención retendrá la función de fibra o hexón (por ejemplo, de los capsómeros hexones o fibras y contribuirá a la formación de cápsides) m ientras que presenta nuevos antígenos de la superficie de los adenovirus resultantes. La presentación de nuevos antígenos de la superficie de adenovirus recombinantes de la i nvención es ventajosa porque ayuda a evitar problemas con inm unidad preexistente al adenovirus en la población en general , lo cual puede reducir la eficacia de las vacunas basadas en adenovirus. Además, la presentación de antígenos de patógenos infecciosos en la superficie de los adenovirus recombinantes puede ampliar la respuesta inmunitaria estimulada por las vacunas basadas en adenovirus de la invención presentando una mayor variedad de antígenos de patógenos infecciosos al sistema inmune de un sujeto que toma la vacuna.
En algunas modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica una proteína fibrosa de un serotipo adenoviral diferente y la segunda secuencia heteróloga reemplaza la secuencia que codifica la proteína fibrosa natural del adenovirus. Por lo tanto, el adenovirus recombinante resultante expresa fibras de otro serotipo adenoviral. Por ejemplo, en una modalidad, un adenovirus Ad5 expresa proteínas de fibra de un adenovirus Ad4, Ad7, Ad2, etc.
Por consiguiente, en determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga se integra al ORF de una proteína estructural adenoviral (por ejemplo, una proteína de la cápside, tal como un hexón o proteína), donde la segunda secuencia heteróloga codifica un antígeno de un patógeno infeccioso. El patógeno infeccioso y el antígeno del mismo pueden ser como se describieron anteriormente. En determinadas modalidades, el antígeno es de una proteína de superficie de influenza, tal como M2 (por ejemplo, un dominio, fragmento o epítopo externo de M2). En determinadas modalidades, el antígeno M2 se selecciona del conjunto de secuencias de péptidos enumerados en la Tabla 4 (por ejemplo, la SEQ ID NO. 312, 318, 321 o 327). En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica más de una de las secuencias de péptidos M2 enumeradas en la tabla 4. Por ejemplo, la segunda secuencia heteróloga puede codificar al menos dos secuencias M2 de cepas de la influenza H 1 , H2 y/o H3 (por ejemplo, al menos dos secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 312-317), cepas de la influenza H5 (por ejemplo, al menos dos secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 318-320), cepas de la influenza H7 (por ejemplo, al menos dos secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 321 -326) o cepas de la influenza H9 (por ejemplo, al menos dos secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 327-335). De manera alternativa, la segunda secuencia heteróloga puede codificar secuencias M2 de una pluralidad de diferentes serotipos de influenza (por ejemplo, a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 312-317, en combinación con al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 318-320, al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 321 -326, al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 327-335 o cualquier combinación de las mismas). En otras modalidades, la segunda secuencia heteróloga puede codificar una o más copias de una secuencia matriz de la influenza (por ejemplo, GAAAGILGFVFTLNAA -SEQ ID NO: 336) o secuencia NP de la influenza (por ejemplo, LELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRAS - SEQ I D NO: 337). En aún otras modalidades, el antígeno de la influenza es un epítopo HTL o CTL. Por ejemplo, la segunda secuencia heteróloga puede codificar uno o más epítopos HTL seleccionados de las Tablas 1 o 1 3 o uno o más epítopos CTL seleccionados de las Tablas 2-3 y 5 a 12 o de la Tabla 14.
En otras modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica una o más porciones de una proteína hexón adenoviral de un serotipo adenoviral para el cual la inmunidad pre-existente (por ejemplo, en la población humana) no es significativa. Por ejemplo, existe una inmunidad pre-existente mínima contra el serotipo adenoviral Ad35 en la población humana. Véase, por ejemplo, Vogels et al. (2003), J. Virology 77(15):8263. Otros serotipos adenovirales para los cuales existe una inmunidad pre-existente mínima, incluyen, por ejemplo, Ad1 1 , Ad34, Ad43, Ad48, Ad50, Ad26, Ad28, Ad45 y Ad49. Los serotipos adenovirales que tienen niveles levemente más altos, pero aún bajos, de inmunidad pre-existente incluyen, por ejemplo Ad22, Ad24, Ad36, Ad37, Ad38, Ad46, Ad47 y Ad10. Por lo tanto, una vacuna basada en adenovirus de la invención puede derivarse, por ejemplo, de un serotipo Ad4, y puede comprender una segunda secuencia heteróloga que codifica uno o más fragmentos de una proteína hexón Ad35, tal que el adenovirus recombinante codifica una proteína hexón que es quimérica para las secuencias Ad4 y Ad35. De manera alternativa, una vacuna basada en adenovirus de la invención puede derivarse, por ejemplo, de un serotipo Ad25, y puede comprender una segunda secuencia heteróloga que codifica uno o más fragmentos de una proteína hexón Ad68, tal que el adenovirus recombinante codifica una proteína hexón que es quimérica para las secuencias Ad25 y Ad68. Por supuesto que la preocupación sobre la inmunidad pre-existente depende de la población objetivo para la enfermedad - si un serotipo adenoviral particular está asociado o no con la inmunidad pre-existente en la población objetivo dependerá de la población objetivo. Los expertos en la técnica pueden evaluar rápidamente este problema y seleccionar en consecuencia secuencias de hexones apropiadas para la segunda secuencia heteróloga. La integración de las secuencias heterólogas en proteínas estructurales adenovirales tales como hexón ha sido descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense 6, 127,525.
En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga se integra en una porción de un ORF del hexón que codifica una región hipervariable (HVR). Por ejemplo, la segunda secuencia heteróloga puede integrarse como una inserción o tal que remplace todo el ORF que codifica la HVR del hexón o una porción del mismo Cualquier HVR del hexón puede alterarse o remplazarse de esta manera. En determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga se integra en (y, opcionalmente, reemplaza) la región codificadora de HVR5 del hexón. En otras modalidades, la segunda secuencia heteróloga se integra en (y, opcionalmente, remplaza) la región codificadora de HVR1 , HVR2 o HVR4 del hexón. La selección de cuál HVR alterar puede basarse en la diversidad relativa de las diferentes HVR. Por ejemplo, la HVR5 de Ad5 tiene la mayor diversidad para las HVR del hexón de Ad5. En aún otras modalidades, más de una HVR del hexón puede tener una inserción o sustitución. Por lo tanto, en determinadas modalidades, la segunda secuencia heteróloga codifica un fragmento quimérico de la región codificadora del hexón donde al menos dos de las regiones codificadoras de HVR tienen inserciones o han sido reemplazadas. Como se discutió anteriormente, la segunda secuencia heteróloga puede codificar antígenos de patógenos infecciosos y/u otros serotipos de adenovirus. Por consiguiente, una o más de las HVR del hexón pueden contener una inserción de un antígeno de un patógeno infeccioso o puede reemplazarse por tal antígeno o una HVR de otro serotipo de adenovirus. En determinadas modalidades, una o más de las HVR del hexón pueden contener una inserción o un antígeno o pueden ser reemplazados por tal antígeno, mientras que una o más de las otras HVR del hexón puede reemplazarse por una HVR de otro serotipo de adenovirus (por ejemplo, un serotipo para el cual existe una inmunidad pre-existente mínima en la población objetivo). Un diagrama esquemático de construcciones de hexón quiméricas que puede usarse en los vectores adenovirales de la invención se muestra en la Figura 13.
Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente los limites de las HVR del hexón. Las HVR del hexón han sido identificadas, por ejemplo, para el hexón de Ad5. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense 6, 127,525. Por consiguiente, la alineación de las proteínas hexón de otros serotipos con el hexón de Ad5 puede usarse para identificar las HVR del hexón en dichos otros serotipos. De manera alternativa, la alineación de las proteínas hexón de un grupo diverso de serotipos de adenovirus puede usarse para identificar límites de HVR. Por ejemplo, para Ad4 los límites de HVR corresponden a los residuos aminoácidos 1 36-172 (HVR1 ), 192-208 (HVR2), 227-235 (HVR3), 268-278 (HVR4), 300-305 (HVR5), 329-334 (HVR6) y 442-480 (HVR7-9) de la secuencia del hexón L5 de la secuencia GenBank AY594254.
La cantidad de secuencia que puede insertarse en una única HVR del hexón depende de la HVR particular (por ejemplo, HVR1 , HVR2, etc.) y de la longitud de la HVR. En general, la inserción puede codificar una secuencia de polipéptidos que corresponde a la longitud de la secuencia de polipéptidos de HVR (si se está reemplazando la secuencia de HVR) además de 0 a 75, 1 a 70, 2 a 65, 3 a 60, 4 a 55 o 5 a 50 aminoácidos adicionales. Las inserciones de HVR del hexón han sido descritas, por ejemplo, para Ad5 en Matthews et al. (2008), Virology Journal 5: 98.
Las secuencias que codifican antígenos de patógenos infecciosos pueden reemplazar las HVR del hexón tal que las secuencias del hexón y las secuencias del antígeno estén una adyacente a la otra. Tal como se usa en la presente en este contexto, el término "adyacente" se refiere a una fusión dentro del marco entre las secuencias codificadoras del hexón y las secuencias codificadoras del antígeno donde no existe una secuencia enlazadora que conecte las secuencias del hexón y del antígeno. De manera alternativa, una secuencia enlazadora puede usarse para conectar las secuencias del hexón y del antígeno. En determinadas modalidades, la secuencia enlazadora es u na secuencia que codificada el tripéptido "LGS". La secuencia enlazadora puede incluirse, por ejemplo, al principio y al final de la secuencia del antígeno, como se m uestra en la Fig ura 12. Sin intención de lim itarse por la teoría, se cree que las secuencias enlazadoras LGS proporcionan flexibilidad estructural , mejoran la estabilidad de la prote ína de fusión hexón resultante y/o reducen la inmunogenicidad de las uniones entre las secuencias de la proteína hexón y las secuencias de proteína codificadas por la secuencia heteróloga. En otras modalidades, la secuencia enlazadora codifica la secuencia de péptidos "GAAA" (SEQ I D NO: 352) o "NAA." Dichas secuencias enlazadoras pueden usarse en combinación , por ejemplo, con la secuencia GAAA en el extremo N-terminal y la secuencia "NAA" en el extremo C-term¡nal de la proteína codificada por la secuencia heteróloga. Otras secuencias enlazadoras apropiadas pueden ser identificadas por los expertos en la técnica.
En determinadas modalidades, un vector adenoviral de la invención comprende una tercera secuencia heterologa. Por lo tanto, en determinadas modalidades, el vector adenoviral de la invención comprende una primera, segunda y tercera secuencia heterologa. De manera alternativa, el vector adenoviral de la invención puede comprender una segunda y una tercera secuencia heterologa. La tercera secuencia heterologa puede tener una estructura como se describió anteriormente para la primera secuencia heterologa o la segunda secuencia heterologa y puede insertarse en el genoma adenoviral de cualquiera de las formas descritas anteriormente.
Los vectores adenovirales de la invención pueden derivarse de cualquier serotipo adenoviral o adenovirus aislado conocido en la actualidad o descubierto eventualmente. Por ejemplo, en determinadas modalidades, el vector adenoviral se deriva de un serotipo Ad4. En otras modalidades, el vector adenoviral se deriva de un serotipo Ad7. En aún otras modalidades, el vector adenoviral se deriva de un serotipo Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50. En determinadas modalidades, el vector adenoviral se deriva de un adenovirus de chimpancé. Por ejemplo, en algunas modalidades, el vector adenoviral deriva de un Ad C1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68.
Los vectores adenovirales de la invención pueden variar en tamaño del tamaño correspondiente (es decir, tamaño del genoma) del adenovirus de tipo salvaje del cual se deriva el vector. Sin embargo, en general, las variaciones de tamaño se asocian con replicaciones de adenovirus defectuosas. Por ejemplo, la eliminación de grandes porciones del genoma del adenovirus puede llevar a que se quiten las regiones genómicas necesarias para la replicación y función virales apropiadas. De manera alternativa, agregar grandes inserciones puede resultar en un genoma que es muy grande para envasarlo eficazmente en la cápside del adenovirus, también interrumpiendo, por lo tanto, la replicación y función virales apropiadas. Por consiguiente, en determinadas modalidades, los vectores adenovirales de la invención tienen una longitud de alrededor de 95% a alrededor de 1 10%, alrededor de 97% a alrededor de 105%, alrededor de 99% a alrededor de1 03%, alrededor de 99.5% a alrededor de 102% o alrededor de 100% a alrededor de 1 01 % del largo del genoma del adenovirus de tipo salvaje del cual se derivó el vector. En otras modalidades, los vectores adenovirales de la invención tienen una longitud de alrededor de 34,000 bps a alrededor de 38,000 bps, alrededor de 34,500 bps a alrededor de 37,500 bps, alrededor de 35,000 bps a alrededor de 37,000 bps, alrededor de 35,500 bps a alrededor de 36,500 bps, alrededor de 35,750 bps a alrededor de 36,250 bps o alrededor de 36,000 bps.
Sin importar las modificaciones específicas que se hayan realizado (por ejemplo, la cantidad y tipo de las secuencias heterólogas, la cantidad y tipo de las eliminaciones, etc.), típicamente, los vectores adenovirales de la invención son capaces de replicarse. El término "capaz de replicarse" se refiere a la capacidad que tiene un vector adenoviral de replicarse dentro de un sujeto. En determinadas modalidades, los vectores adenovirales de la invención capaces de replicarse son capaces de replicarse dentro de un sujeto humano. En otras modalidades, los vectores adenovirales de la invención capaces de replicarse son capaces de replicarse dentro de un sujeto mam ífero (por ejemplo, un animal de granja, tal como un cerdo, res, caballo, oveja, cabra, etc. ; un animal de zoológico, tal como un león, tigre, elefante, rinoceronte, hipopótamo, jirafa, cebra, mono, simio, etc. ; o una mascota, tal como un perro, gato, conejo, cobayo, hámster, gerbo, rata, ratón, etc.). En determinadas modalidades, el tamaño de ráfaga in vitro (por ejemplo, como se mide en un cultivo celular) de un vector adenoviral de la invención capaz de replicarse es al menos 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10k, 15k, 20k, 25k, 30k, 35k, 40k, 45k, 50k, 75k, 100k, 150k, 200k, 300k, 400k o más. En otras modalidades, el tamaño de ráfaga in vivo (por ejemplo, en un sujeto) de un vector adenoviral de la invención capaz de replicarse es al menos 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10k, 15k, 20k, 25k, 30k, 35k, 40k, 45k, 50k, 75k, 100k, 150k, 200k, 300k, 400k o más. En determinadas modalidades, los vectores adenovirales de la invención capaces de replicarse son capaces de estimular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o ambas) en un sujeto. En determinadas modalidades, la respuesta inmunitaria incluye una respuesta mensurable (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral o celular mensurable, o una combinación de las mismas) a un epítopo codificado por una secuencia heterologa insertada o integrada al vector adenoviral. Los vectores adenovirales de la invención capaces de replicarse son particularmente útiles para superar los problemas asociados con la inmunidad pre-existente al adenovirus en sujetos objetivo. Por ejemplo, en determinadas modalidades, una respuesta inmunitaria eficaz a un antígeno heterólogo puede inducirse en un sujeto con inmunidad pre-existente al adenovirus con una dosis más baja de un vector adenoviral capaz de replicarse que expresa el antígeno heterólogo como se describe en la presente comparado con una dosis de un vector adenoviral que es no capaz de replicarse que expresa el mismo antígeno. Por lo tanto, en algunas modalidades, una dosis eficaz de un vector adenoviral de la invención capaz de replicarse es dos, tres, cuatro, cinco o diez veces menor que una dosis eficaz de un vector adenoviral que no es capaz de replicarse.
Las técnicas para construir, manipular genéticamente y propagar vectores adenovirales recombinantes se describen en los Ejemplos que figuran a continuación. Véase también, por ejemplo. , el documento WO 2008/01 0864, la solicitud de patente estadounidense 2006/01 15456 y la patente estadounidense 6, 1 27,525, el contenido de los cuales se incorpora a la presente mediante esta referencia.
En otro aspecto, la presente invención proporciona vacunas que comprenden uno o más vectores adenovirales de la invención. Tal como se utiliza en la presente, el término "vacuna" se refiere a una composición que comprende un vector adenoviral de la invención y un portador. En determinadas modalidades, el vector adenoviral es un virus. En otras modalidades, el vector adenoviral es el genoma solo y no incluye la cápside adenoviral. En determinadas modalidades, el portador es un adyuvante. Ejemplos de dichos adyuvantes incluyen, de manera no taxativa, sales, tales como fosfato de calcio, fosfato de aluminio, hidróxido de calcio e hidróxido de aluminio; polímeros naturales tales como glucanos algáceos (por ejemplo, glucanos beta), quitosán inulina o cristalizada; polímeros sintéticos tales como poliláctidos, poliglicólidos, poliláctido-co-glicólidos o polímeros de metilacrilato; copolímeros o surfactantes bloqueadores catiónicos o no iónicos formadores de micelas tales como Pluronics, L121 , 122 o 123, Tween 80 o NP-40; ácido graso, vesículas basadas en lípidos o lípidos y proteínas tales como liposomas, proteoliposomas, ISCOM y estructuras acaracoladas; emulsiones estabilizadas mediante surfactantes compuestas de aceites sintéticos o naturales y soluciones acuosas. En determinadas modalidades, una vacuna de la invención, luego de ser administrada a un sujeto, es capaz de estimular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o ambas) en un sujeto. En determinadas modalidades, la respuesta inmunitaria incluye una respuesta mensurable (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral o celular mensurable, o una combinación de las mismas) a un epítopo codificado por una secuencia heterologa insertada o integrada a un vector adenoviral de la vacuna. En determinadas modalidades, una vacuna de la invención es capaz de proporcionar protección contra un patógeno infeccioso o contra cáncer. Por ejemplo, en determinadas modalidades, la vacuna es capaz de estimular una respuesta inmunitaria contra uno o más antígenos (por ejemplo, codificados por una secuencia heterologa) tal que, al encontrar después dicho antígeno, el sujeto que recibe la vacuna tiene una respuesta inmunitaria que es más fuerte de lo que hubiese sido si la vacuna no se hubiese administrado previamente. En algunas modalidades, una vacuna de la invención es capaz que proporcionar protección contra un patógeno infeccioso o cáncer en un sujeto con inmunidad pre-existente al adenovirus. En otras modalidades, una vacuna de la invención es capaz mejorar una infección patógena o cáncer y/o reducir al menos un síntoma de una infección patógena o cáncer. Por ejemplo, en una modalidad, la vacuna de la invención induce una respuesta inmunitaria terapéutica contra uno o más antígenos codificados por una secuencia heteróloga tal que los síntomas y/o complicaciones de una infección patógena o cáncer sean aliviados, reducidos o mejorados en un sujeto que sufre de dicha infección o cáncer.
Los vectores adenovirales usados para las vacunas pueden prepararse y formularse para su administración a un mam ífero de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica. Las formulaciones para administración oral pueden consistir de cápsulas o comprimidos que contienen una cantidad predeterminada de un vector adenoviral recombinante de la invención; soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del fármaco disuelto en diluyentes ¡ngeribles, tales como agua, solución salina, jugo de naranja y similares; suspensiones en un líquido apropiado; y emulsiones adecuadas.
Los vectores adenovirales de la invención pueden, por ejemplo, formularse como cápsulas recubiertas entéricamente para administración oral , como se describió anteriormente, para poder circu nvalar el tracto respiratorio superior y permitir la replicación viral en los intestinos. Véase, por ejemplo, Tacket et al. , Vaccine 1 0:673-676, 1992; Horwitz, en Fields et al. , eds. , Fields Virology, tercera edición , vol. 2 , pp. 2149-21 71 , 1 996; Takafuji et al. , J . Infec. Dis. 140:48-53, 1 979; y Top et al. , J. I nfec. Dis. 124: 1 55- 160, 1 971 . De manera alternativa , los vectores adenovirales pueden formularse en soluciones convencionales, tales como solución salina estéril y pueden incorporarse uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente otros agentes activos.
En determi nadas modalidades, las formulaciones de la invención comprenden una solución amortiguadora que comprende vectores adenovirales (por ejemplo, virus) en un portador farmacéuticamente aceptable. Puede usarse una variedad de portadores, tales como solución salina amortiguada, agua y similares. Dichas soluciones son generalmente estériles y libres de materia no deseable. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas o pueden filtrarse en condiciones estériles. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes amortiguadores y que ajustan el pH, agentes para ajustar la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares.
Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener un componente fisiológicamente aceptable que actúa, por ejemplo, para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir la absorción del virus y/o composición farmacéutica. Los compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutationa, agentes quelantes, proteínas con bajo peso molecular, composiciones que reducen la depuración o hidrólisis de cualquier agente co-administrado o excipiente u otros estabilizantes y/o amortiguadores. Los detergentes también pueden utilizarse para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir la absorción. El experto en la técnica apreciará que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende por ejemplo, de la vía de administración de la preparación adenoviral y de las características fisio-químicas particulares de cualquier agente co-administrado.
Los vectores adenovirales también pueden administrarse en un formulación lipídica, más particularmente ya sea formando un complejo con liposomas o a complejos de lípidos/ácido nucleico o encapsulado en liposomas. Los vectores de la invención actual, solos o combinados con otros componentes adecuados, también pueden convertirse en formulaciones en aerosol para administrarse mediante inhalación. Las vacunas también pueden formularse para su administración mediante las fosas nasales. Las formulaciones adecuadas para administración nasal, donde el portador es un sólido, incluyen un polvo grueso con un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de alrededor de 1 0 a alrededor de 500 micrones el cual se administra de la manera en que se inhala el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través de la fosa nasal desde un contenedor del polvo ubicado cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas donde el portador es un líquido para la administración como, por ejemplo, un atomizador nasal, gotas nasales o por administración por aerosol mediante nebulizador, incluyen soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. En algunas modalidades, los vectores adenovirales de la invención pueden formularse como supositorios, por ejemplo, para administración rectal o vaginal.
Las vacunas pueden tener una dosificación unitaria que comprende entre alrededor de 103 a alrededor de 1013 (por ejemplo, alrededor de 103 a alrededor de 104, alrededor de 104 a alrededor de 105, alrededor de 105 a alrededor de 1 06, alrededor de 106 a alrededor de 1 07, alrededor de 107 a alrededor de 108, alrededor de 108 a alrededor de 1 09, alrededor de 109 a alrededor de 1010, alrededor de 1010 a alrededor de 101 1 , alrededor de 101 1 a alrededor de 1012, alrededor de 1 012 a alrededor de 1013) de adenovírus recombinantes en una dosis individual. Las dosificaciones pueden variar según la vía de administración. Por ejemplo, las vacunas formuladas para administración sublingual o intranasal pueden contener una dosificación menor de adenovírus por dosis individual que las vacunas formuladas para administración oral. Un experto en la técnica puede determinar la dosificación apropiada para un paciente particular dependiendo del tipo de infección o cáncer y la vía de administración a utilizarse sin experimentación indebida.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos de inducir una respuesta inmunitaria a cualquier patógeno infeccioso descrito en la presente en un sujeto, los cuales comprenden administrar al sujeto una vacuna de la invención. En una modalidad , la invención proporciona un método de vacunar un sujeto contra un patógeno infeccioso el cual comprende administrar una cantidad suficiente de una vacuna de la invención a un sujeto con riesgo de ser infectado por un patógeno infeccioso. En otra modalidad, el sujeto tiene una infección inducida por el patógeno infeccioso. Por lo tanto, por ejemplo, en una modalidad, la presente invención proporciona un método de inducir una respuesta inmunitaria terapéutica en un sujeto que experimenta una infección inducida por un patógeno infeccioso. En algunas modalidades, uno o más s íntomas o com plicaciones de la infección se reducen o alivian en el sujeto luego de la administración de la vacuna. Las vacunas de la invención pueden usarse para vacunar sujetos humanos o animales.
Las vacunas de la invención pueden administrarse solas o pueden co-administrarse o administrarse secuencialmente con otras composiciones inmunológicas, antigénicas, de vacuna o terapéuticas. Dichas composiciones pueden incluir otros agentes para potenciar o ampliar la respuesta inm unitaria, por ejemplo. , IL-2 u otras citocinas que pueden admin istrarse a intervalos de tiempo específicos o administrarse de manera continua (véase, por ejemplo, Smith et al. , N Engl J Med 1 997 Apr. 24; 336( 17) : 1 260- 1 ; y Smith , Cáncer J Sci Am . 1 997 Diciembre; 3 Suppl 1 : S1 37-40). Las vacunas o vectores también pueden administrarte conjuntamente con otras vacunas o vectores. Por ejemplo, un adenovirus de la invención puede administrarse ya sea antes o después de la administración de un adenovirus de un serotipo diferente. También puede usarse una preparación de adenovirus, por ejemplo, para el cebado en un régimen de vacunación usando un agente de vacuna adicional.
Las formulaciones adenovirales pueden administrarse de forma sistémica, regional o local. La administración regional se refiere a la administración en un espacio anatómico específico, tal como intraperitoneal, intratecal, subdural, o a un órgano específico y similares. La administración local se refiere a la administración de una composición en un espacio anatómico limitado o circunscripto tal como una inyección intratumoral en una masa tumoral, inyecciones subcutáneas, inyecciones intramusculares y similares. El experto en la técnica comprende que la administración local o regional también puede dar como resultado la entrada de la preparación viral en el sistema circulatorio. Las vías típicas de administración incluyen administración parenteral por ejemplo, vías intradérmica, intramuscular o subcutánea. Otras vías incluyen la administración oral incluyendo la administración a la mucosa oral (por ejemplo, amígdalas), vías intranasal, sublingual, intravesical (por ejemplo, dentro de la vejiga), rectal e intravaginal. Para la administración de adenovirus, frecuentemente la administración puede realizarse mediante inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden, por ejemplo, colocarse en propulsores presurizados farmacéuticamentes aceptables, tales como diclorodifluoro-metano, nitrógeno y similares.
También se pueden formular como fármacos para preparaciones no presurizadas tal como en un nebulizador o un atomizador. Típicamente, dicha administración se encuentra en un amortiguador acuoso farmacéuticamente aceptable como se describió anteriormente. También puede lograrse la administración al pulmón, por ejemplo, usando un broncoscopio.
Las vacunas de la invención pueden administrarse en una cantidad de formas de dosificación unitarias dependiendo del uso deseado, por ejemplo, vacuna profiláctica o régimen terapéutico, y la vía de administración. En cuanto al uso terapéutico, la afección o enfermedad particular y la afección médica general de cada paciente influenciará el régimen de dosificación. La concentración del adenovirus en el excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser por ejemplo, de alrededor de 1 03 a alrededor de 1 013 partículas de virus por dosis, entre alrededor de 104 a alrededor de 1 01 1 partículas de virus por dosis, entre alrededor de 106 a alrededor de 1010 partículas de virus por dosis, entre alrededor de 107 a alrededor de 109 partículas de virus por dosis o entre alrededor de 109 a alrededor de 101 1 partículas de virus por dosis. En otras modalidades, la concentración del adenovirus en el excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, de alrededor de 103 a alrededor de 109, alrededor de 104 alrededor de 108 alrededor de 105 a alrededor de 1 07 unidades infecciosas por dosis.
Los vectores adenovirales de la invención capaces de replicarse se administran típicamente en dosis mucho menores que las necesarias para lograr los niveles de expresión equivalentes del transgene codificado por un adenovirus recom binante que no es capaz de replicarse administrado in vivo. Los vectores adenovirales capaces de replicarse pueden administrarse en un intervalo de dosificaciones (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4, 920, 209; Smith et al. , J . Infec. Dis. 1 22:239-248, 1 970; Top er al. , J . I nfect. Dis. 1 24: 1 55-160, 1 971 ; Takafuj i et al. , J . I nfec. Dis. 140:48-53, 1979; Tacket et al. , Vaccine 1 0:673-676, 1992) . Por ejemplo, pueden admin istrarse de 1 04 a 109 dosis infecciosas de cultivo tisular al 50% (o unidades formadoras de placas). Típicamente una dosificación oral para un adenovirus capaz de replicarse es de alrededor 1 07 de dosis infecciosas de cultivo de tejido al 50% o 1 07 unidades formadoras de placas. En algunas modalidades, una dosificación oral para un adenovirus capaz de replicarse es de alrededor de 1 01 1 un idades formadoras de placas. La administración intranasal típica de recombinantes de adenovirus se encuentra frecuentemente en dosificaciones de alrededor de 1 03 a alrededor de 1 05 unidades formadoras de placas. La concentración exacta del virus, la cantidad de la formulación y la frecuencia de administración también pueden ajustarse dependiendo de los niveles de, por ejemplo, expresión del transgene y retención del vector in situ luego de una administración inicial in vivo.
La cantidad y concentración del virus y la formulación de una dosis determinada o una dosis "terapéuticamente eficaz" pueden ser determinadas por el médico. Una dosis terapéuticamente eficaz de una vacuna es una cantidad de adenovirus que estimulará una respuesta inmunitaria en la o las proteínas codificadas por el ácido nucleico heterólogo incluido en el vector viral . El cronograma de dosificación, es decir, el rég imen de dosificación , dependerá de una cantidad de factores, por ejem plo, el estado general de salud del paciente, el estado físico, edad y similares. El estado de la técnica permite que el médico determine el régimen de dosificación para cada paciente individual . Los adenovirus han sido utilizados de manera segura por muchos años para vacunas para humanos. Véase, por ejemplo, Franklin et al. , anteriormente; Jag-Ahmade et al. , J . Virol . , 57: 267, 1 986; Ballay et al. , EMBO J . 4:3861 , 1 985; publicación PCT WO 94/1 7832. Estos ejemplos ilustrativos también pueden usarse como gu ía para determinar el régimen de dosificación cuando se lleven a cabo los métodos de la invención.
Las admi nistraciones individuales o múltiples de las formulaciones adenovirales pueden administrarse como vacunas profilácticas o terapéuticas. En una modalidad se administran múltiples dosis (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más dosis) a un sujeto para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica . Las dos o más dosis pueden separarse por intervalos periódicos, por ejemplo, intervalos de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, dos meses, tres meses o seis meses.
En aún otro aspecto, la invención tam bién proporciona kits que contienen los vectores, sistemas de vectores o vacunas de la invención . Los kits pueden , por ejemplo, contener también células para cultivar los adenovirus de la invención . Los kits pueden incluir además material instructivo que enseña las metodologías para generar adenovirus usando los kits y, para vacunas, puede incluir instrucciones para la indicación de dosificaciones, vías y métodos de administración y similares.
Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos de la presente invención. Por supuesto que los ejemplos deben considerarse como meramente ilustrativos de solo algunas modalidades de la invención y no constituyen limitaciones para el alcance de la invención que se define mediante las reivindicaciones que se adjuntan al final de esta especificación.
Ejemplos Ejemplo 1 : Construcción de vectores adenovirales recombinantes Se utilizó la recombinación homologa en E. coli para producir vectores adenovirales recombinantes rápida y confiablemente. Como ejemplo, se aisló DNA viral de Ad4 de tipo salvaje de un comprimido de Ad4 militar (del Lot. No. 4958221 , Wyeth Labs, licencia estadounidense N° 3) y clonado mediante recombinación homologa en un plásmido bacteriano capaz de replicarse en E. coli. El vector resultante fue designado como pPV-Ad4vax.
La construcción de inicio del vector pPV-Ad4vax se creó mediante síntesis de genes sintéticos del brazo izquierdo de Ad4 de tipo salvaje e inserción del fragmento sintético en un plásmido bacteriano. El plásmido resultante se designó como pPV-Ad4 Left Arm TM. Se proporcionó un polienlazador Xbal/EcoRI agregado en el extremo 3' del fragmento del gene sintético de Ad4 para permitir la inserción posterior del fragmento del brazo derecho de Ad4. Véase la Figura 1 . El fragmento del brazo derecho de Ad4 se generó con PCR de alta fidelidad del DNA genómico de Ad4 aislado del comprimido militar de Ad4 y luego clonado en los sitios de polienlazador Xbal/EcoRI . El plásmido resultante, designado como pPV-Ad4 RHT & LFT Arm TM, incluye los fragmentos de brazo izquierdo y derecho de Ad4 separados por sitios de restricción Xbal , Clal y Spel únicos. Véase la Figura 1 . Luego de la linealización con Xbal y Spel y la desfosforilación, el vector pPV-Ad4 RHT & LFT arm TM linealizado se co-transfectó con el DNA genómico de Ad4 de tipo salvaje en bacterias BJ 1583 capaces de recombinación. Los clones se analizaron mediante digestión de enzimas de restricción antes de volver a transformarlos en células TOP10. La validación final de pPV-Ad4pax se llevó a cabo mediante secuenciamiento.
Las secuencias heterólogas y modificaciones del genoma Ad4 se introdujeron en el vector pPV-Ad4pax utilizando plásmidos transportadores. Los plásmidos transportadores se modificaron genéticamente para que contuviesen una secuencia heteróloga flanqueada por suficiente DNA de Ad4 de tipo salvaje para permitir la recombinación homologa entre el vector transportador y el pPV-Ad4vax. Las secuencias heterólogas incluyeron genes que codifican la proteína verde fluorescente (GFP) y hemaglutinina de influenza (HA). Los genes de HA de longitud completa separados se sintetizaron artificialmente de HA Bbn (secuencia GenBank EU 1 99366 - "Influenza A virus (A/Brisbane/10/2007(H3N2) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds."), HA VT/1203 (secuencia GenBank EF541403 -A/Vietnam/1203/2004(H5N 1 )), y HA VT/1 194 (secuencia GenBank EF541402 - A/Vietnam/1 194/2004(H5N 1 ). La recombinación homologa entre el plásmido transportador y el pPV-Ad4pax dio como resultado la producción de vectores adenovirales recombinantes que contienen las modificaciones deseadas. La identidad de los vectores adenovirales recombinantes se confirmó mediante múltiples análisis de restricción de enzimas y secuenciamiento de DNA.
Ejemplo 2: Vectores adenovirales recombinantes que expresan secuencias heterólogas bajo el control de una MLTU adenoviral Para acomodar las secuencias heterólogas y respaldar su expresión mediante una unidad de transcripción tardía principal (MLTU), se generó una eliminación parcial en la región E3 del genoma Ad4. La eliminación parcial consistió de 1 780 pares de base y se ubicó en las posiciones de nucleótidos 28446-30226 de la secuencia GenBank AY594254. La eliminación parcial se diseñó para preservar la función conocida de la región E3 mientras se quitaban tres marcos abiertos de lectura con función desconocida (E3 24.8k, E3 6.3k y E3 29.7k). Véase la Figura 2. La región eliminada es análoga a la región ADP de Ad5, aunque Ad4 no codifica un gene similar a ADP.
La expresión de varias secuencias heterólogas (por ejemplo, HA Bbn, HA VT/1 194 o GFP) se enlazó al MLTU adenoviral endógeno clonando la secuencia heteróloga en la eliminación parcial de E3 de tal forma que la secuencia heteróloga se volvió ligada de forma operativa al aceptor de empalme natural de E3 24.8k para la expresión dirigida por MLP. El aceptor de empalme natural de E3 24.8k se encuentra cerca del consenso, por lo que la secuencia no requirió modificación. Para promover la iniciación de la traducción se optimizó la secuencia inmediatamente anterior al codón de inicio ATG de la secuencia heteróloga a una secuencia Kozak de consenso. En los vectores virales recombinantes resultantes puede ocurrir alguna expresión temprana de bajo nivel a través del promotor E3 endógeno en etapas tempranas de la replicación viral, pero la expresión se refuerza enormemente cuando el MLP se torna activo luego de la iniciación de la replicación del DNA en células infectadas. Para definir mejor el límite entre los productos de gene E3 tempranos y tardíos se incorporó una pequeña pieza de DNA que comprendía 29bps de la secuencia de señal poli A de E3A Ad5 corriente abajo de las secuencias heterólogas. Una secuencia potencialmente similar a la secuencia poli A de E3A Ad5 puede encontrarse más corriente abajo en Ad4 y puede ayudar a controlar la transcripción en etapas tempranas y maximizar la expresión de las secuencias heterólogas.
Diferentes vectores adenovirales recombinantes que exhiben expresión de secuencias heterólogas dirigidas por MTLU se enumeran en la Tabla 1 5. Para el vector Ad4-HA-Bbn el tamaño del genoma es 22 pares de base más pequeños que la cepa militar de Ad4 de tipo salvaje, como se indica a continuación: a) -1780 bps Eliminación parcial con la región E3 (nucleótidos 28446-30226 de AY594254); b) +10 bps 5' adición de secuencias Kozak de consenso; c) +1701 bps gene HA de longitud completa (A/Brisbane/10/2007(H3N2)) d) +18 bps polienlazador restante e) +29 bps secuencia de señal poli A de E3A Ad5 Tabla 15: Vectores adenovirales recombinantes que expresan antígenos de la influenza Descripción del gene de secuencia nativa u optimizada mediante codones.
Ejemplo 3: Vectores adenovirales recombinantes que expresan secuencias heterólogas bajo el control de un promotor exógeno Otro grupo de vectores adenovirales recombinantes se generaron donde las secuencias heterólogas de interés se integraron en el polienlazador de un cartucho de expresión que consiste de un promotor de CMV y una secuencia líder tripartita de Ad4, un polienlazador y una secuencia de señal poli A de la hormona de crecimiento bovino (BGH). Los cartuchos de expresión resultantes se integraron en vectores Ad4 que contenían eliminación parcial o total de E3. La eliminación parcial de E3 fue como se describió en el Ejemplo 2. La eliminación total consistió de 3926 pares de base, se ubicó en las posiciones de nucleótidos 27,356 a 31 ,282 de la secuencia GenBank AY594254 y comprendió además una mutación en el codón de inicio ATG del ORF 23.3k que fue solo eliminado parcialmente. Véase la Figura 2. Sin importar el tipo de eliminación de E3, los cartuchos de expresión se insertaron en el vector Ad4 entre la secuencia de señal poli A de E3 y el gene de fibra de L5. Véase la Figura 2.
Diferentes vectores adenovirales recombinantes que exhiben expresión de secuencias heterólogas dirigida por CMV se enumeran en la Tabla 15. "Opt." se refiere a la optimización mediante codones de la secuencia del antígeno.
Ejemplo 4: Producción del adenovirus recombinantes Los adenovirus recombinantes se crearon transfectando células A549 (MCB) con un fragmento de DNA lineal que corresponde a un genoma adenoviral recombinante. Los fragmentos de DNA lineal se escindieron para quitar todas las secuencias de plásmidos bacterianos extraños. Luego de que se observara un efecto citopático en las células A549 (típicamente después de 7-1 0 días), los virus se cosecharon y se pasaron en serie para obtener un rendimiento más alto. Para asegurarse que la identidad del virus fuera correcta se aisló el DNA viral usando un protocolo Hirt modificado y se analizó mediante PCR, restricción digestiva y secuenciamiento de los insertos heterólogos y regiones flanqueantes. La secuencia confirmó que los insertos heterólogos y regiones flanqueantes estaban correctas a nivel de nucleótidos.
Ejemplo 5: Expresión de secuencias heterólogas de adenovirus recombinantes Se analizaron células A549 infectadas con adenovirus recombinantes para detectar la expresión de secuencias heterólogas. La Figura 4 muestra la expresión de la HA de cuatro adenovirus Ad4H5HA recombinantes diferentes: H5HA de A/Vietnam/1 194/2004 bajo el control del promotor MLP endógeno (PVXV01 03); H5HA de A/Vietnam/1 194/2004 bajo el control del promotor de CMV (PVXV01 1 3); H5HA de A/Vietnam/1203/2004 bajo el control del promotor de CMV, eliminación total de E3 (PVXV01 14); y H5HA de A/Vietnam/1203/2004 bajo el control del promotor de CMV, eliminación parcial de E3 (PVXV0124). La Figura 5 muestra la expresión de la HA del MLP endógeno del vector adenoviral PXVX01 01 y de un promotor de CMV en el vector adenoviral PXVX01 1 1 . El análisis de PCR en tiempo real confirmó que los niveles de expresión de H3 HA del vector adenovi ral PXVX0101 fueron similares a la fibra de proteína adenoviral distal. Véase la Figura 6. Dos días después de la infección con estas construcciones, el antígeno HA se encuentra presente en la superficie de las células A549 como se muestra en los resultados del FACS de la Figura 7. De forma coherente con estos resultados, se mostró que las células A549 infectadas con PVXV0101 se aglutinaron con los glóbulos rojos. Véanse las Figuras 9A y 9B. Al usar un ensayo de crecimiento de una etapa (Figura 8A) PXVX0101 y PXVX01 1 1 mostraron crecimiento de tipo casi salvaje en las células A549, HepG2 y HuTu80 (Figura 8B).
Ejemplo 6: Integración de antígenos de la influenza en las HVR del hexón de Ad4 La Figura 10 ilustra una estrategia para generar vectores modificados a través del hexón. La estrategia depende de la incorporación de mutaciones silenciosas a la secuencia del hexón de Ad4 tal que un fragmento de DNA que contiene las regiones HVR 1 a 6 puede reemplazarse en una única etapa. La estrategia incorpora sitios de clonación tanto Xbal como Xhol en la región codificadora del hexón de Ad4. Luego se genera cada fragmento Xbal/Xhol mediante síntesis de gene sintético. La Figura 1 1 muestra la ubicación de los sitios de restricción en relación con las regiones HVR. Además, pueden usarse el sitio Xhol y un sitio BstXI endógeno para reemplazar HVR7 o HVR7-9 según se necesite. Se diseñaron una serie de epítopos alrededor de la secuencia M2e de distintos virus de la influenza (véase la Figura 12). Las secuencias proporcionan un consenso para las proteínas M2 de las cepas H5, H7 y H9 de la influenza. La M2E humana representa una secuencia de consenso para H 1 y H3 M2e. Las secuencias espaciadoras se incluyen para posicionar las secuencias integradas de una manera inmunorreactiva óptima. Las secuencias están diseñadas para prevenir que los anticuerpos se eleven a los límites entre los epítopos. La Figura 13 describe una serie de modificación de 17 hexones que puede generarse.
Ejemplo 7: Virus purificado Ad4-H5-Vtn de células A549 induce anticuerpos específicos para HA en ratones La inmunogenicidad de los virus Ad4-H5-Vtn PXVX0103 y PXVX01 16 purificados en ratones se analizó como se muestra en la Tabla 16. Los controles fueron el virus wt Ad4 (control negativo) y la proteína H5 HA (control positivo).
Las células A549 fueron infectadas con virus Ad4-H5-Vtn PXVX01 03 (promotor MLTU) y PXVX01 1 6 (promotor de CMV) . Los virus se aislaron posteriormente y se purificaron mediante cromatografía de intercambio de iones. Para cada g rupo en los estudios de inmunogenicidad se usaron seis ratones hembra C57BI/6 x Balb/c F 1 de entre 6 y 8 semanas de edad. Los ratones fueron inmunizados una vez en el d ía 0 (cebado) , nuevamente en el d ía 14 (refuerzo) usando las titulaciones de dosis de 1 x 1 010, 1 x 1 09, 1 x 1 08 vp/ratón y una vía de administración intramuscular (i. m. ) . Luego de 1 0 y 27 d ías se recogieron 0.2 mL de sangre por sangrado retro-orbital y los títulos de anticuerpo de suero se determi naron mediante ELISA con criterio de valoración de HA y inhibición de hemaglutinación (HAI ) .
Para el ensayo ELI SA se recubrieron brevemente placas ELISA de 96 pocilios con alta capacidad de u nión con 1 .5ug/ml (5x 109partículas/ml) de adenovirus o 5ug/ml de proteína HA purificada (I mmune Technologies) y se incubaron durante la noche a 4°C. Luego las placas ELI SA se lavaron y bloquearon con PBS + 3% de BSA durante 2 horas. Se agregaron diluciones en serie de suero a las placas y se incubaron durante 2 horas. Después de lavar rigurosamente, se detectaron anticuerpos de suero específicos del antígeno usando anticuerpo secundario acoplado con H RP. Las placas se desarrollaron con un reactivo sustrato de HRP, se detuvieron con ácido y se midió la absorbancia en un lector de placas PolarStar a 450nm . Los títulos de ELI SA con criterio de valoración se expresan como el valor recíproco de la dilución más alta que proporciona una lectura de tres derivaciones estándar sobre el promedio inicial. En caso de títulos HAI se permiten reaccionar diluciones en serie de suero con una dosis fija (4HAU) del virus de la influenza o una proteína HA seguido por la adición de RBC de pollo. En la presencia de un anticuerpo neutralizador se inhibe la capacidad del virus de aglutinar los RBC. El título de HAI del anticuerpo es el recíproco de la última dilución de suero capaz de inhibir la aglutinación.
Tabla 16: Antígenos, dosis, vía. a) H5-Vtn (hemaglutinina (HA) de la cepa A/Viet Nam/1 1 94/2004) b) PXVX01 03 - Ad4 con transgene HA dirigido por el promotor M LTU c) PXVX01 16 - vector Ad4 con transgene HA dirigido por el promotor de CMV Como se muestra en la Figura 14, los ratones inmunizados con una dosis alta ( 1 ? 101 0 p) de virus Ad4-H5-Vtn (PXVX01 03) purificado produjeron un título de anticuerpo específico para HA fuerte cuando se midió mediante ELI SA de aproximadamente 2.5 ? 1 0" y 7 ? 104 luego de una y dos inm unizaciones, respectivamente. Las respuestas específicas para HA menores pero significativas de aproximadamente 2.5 ? 1 03 y 2 ? 104 también se indujeron usando una dosis menor del virus ( 1 ? 1 09 vp) luego de una y dos inmunizaciones, respectivamente. En la dosis viral más baja ( 1 ? 1 08 vp) se observó una respuesta significativa de 8 ? 1 03 título con criterio de valoración de anticuerpo luego de dos inmunizaciones. Cuando el transgene H5 fue dirigido por CMV (PXVX01 16) se indujeron respuestas de anticuerpo aproximadamente 3 veces mayores. Como es de esperarse, los ratones inmunizados con virus purificado wt Ad4 ( 1 ? 1 010 vp) que no contiene un transgene HA, no indujeron una respuesta de anticuerpo específica para HA detectable. Luego de dos inmunizaciones, la proteína H5 indujo respuestas de criterio de valoración del anticuerpo HA de aproximadamente 7 ? 104. En cuanto a los títulos de HAI , los ratones inmunizados con 1 ? 101 0 vp de virus Ad4-H5-Vtn (PXVX0103) purificado produjeron un título de anticuerpo de HAI significativo de 1 : 20 y 1 :40 siguiendo una y dos inmunizaciones respectivamente. Luego de la segunda inmunización, el Ad4-H5-Vtn (PXVX01 03) en la dosis menor de 1 ? 1 09 p indujo una respuesta de HAI significativa de 1 : 20. Las repuestas específicas para HA no se detectaron para el virus wt Ad4. Nuevamente, el Ad4-H5-Vtn (PXVX01 16) indujo títulos de HAI aproximadamente 4 veces más grandes. La proteína H5 purificada indujo una respuesta sig nificativa de 1 :40 luego de la seg unda inmunización . Estos resultados son coherentes con el estudio que usa células infectadas donde se demostró que se necesitaron dos inm unizaciones de proteína H5 purificada para inducir un título de anticuerpo HAI mensurable.
Estos estudios de inmunogenicidad usando virus Ad4-H5-Vtn purificados muestran que, a pesar de la falta de replicación viral en ratones, los virus ingresaron a células in vivo y el transgene se expresó de manera suficiente para inducir una respuesta de anticuerpos específica para H5.
Ejemplo 8 : Evaluación de una vacuna de hemaglutini na H5 contra la influenza de adenovirus del serotipo 4 en ratones Diseño de una vacuna H5HA de adenovirus del serotipo 4 El adenovirus recombinante Ad4-H5-Vtn (PXVX01 03) descrito en el Ejemplo 7 se evaluó para determinar la seguridad , inmunogenicidad y eficacia como una vacuna en un modelo m urino. Como se m uestra en la Figura 1 5, la vacuna Ad4H5HA se construyó con los genes de E3 24.8K, 6.8K y 29.7K del virus Ad4 eliminados para colocar el gene HA del virus de la influenza A/VietNam/1 1 94/2004 H5N 1 . El sitio del aceptor de empalme del gene de E3 24.8K se retuvo para dirigir la expresión del transgene HA. La secuencia codificadora natural de HA se utilizó sin el sitio de escisión polibásico. La secuencia de señal de poliadenilación de E3A, derivado de Ad5, se colocó corriente abajo con respecto a la secuencia codificadora de HA. El secuenciamiento directo del DNA confirmó la integridad del transgene HA y las secuencias del vector flanqueante. Una vez que se identificó y aisló el recombinante correcto, se digirió con las enzimas de restricción apropiadas para quitar secuencias de plásmidos bacterianos extrañas, pero retener el DNA genómico de Ad4 recombinante completo que codifica el transgene HA.
Para producir el virus para su caracterización, se llevó a cabo la transfeccion de esta secuencia de DNA Ad4H5HA lineal en las células A549 de mamífero (ATCC, Manassas, VA). Un día antes de la transfeccion, se colocaron 3 x 105 de células A549 en placas en cada pocilio de una placa de 6 pocilios (BD Biosciences San José, CA) en DMEM (Hyclone, Logan, UT/10% de suero fetal de ternero (FBS) (Hyclone) y las placas se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de C02. El día siguiente las células tenían una confluencia de 50-90% y se transfectaron posteriormente con 2 pg de DNA Ad4H5HA linealizado por pocilio usando el reactivo de transfección Fugene HD a 8 pL por pocilio según las instrucciones del fabricante (Roche, Indianapolis, IN). Una vez que se observó un efecto citopático (CPE) , generalmente 7 a 1 0 d ías después de la transfección , el virus se cosechó de al menos 3 de los 6 pocilios desplazando las células infectadas usando raspadores de células de 16 cm (VWR, West Chester, PA) seguido por 3 ciclos de alteración celular mediante congelado-descongelado (nitrógeno líquido y un baño de agua a 37 °C) . El lisado se aclaró mediante centrifugación a 4 eC a 1 , 800g durante 1 0 minutos y se recogieron aproximadamente 6 m l_ de sobrenadante para un procedimiento de expansión viral de dos etapas. Se usaron tres mL de sobrenadante para infectar 1 .5 x 106 de célu las A549 en suspensión en un matraz de 75 cm2 (BD Biosciences) con un volumen final de 1 5 mL de DMEM/1 0% de FCS. De 3 a 7 días después de la observación del CPE, se quitaron las células utilizando raspadores de células de 1 6 cm y se sometieron a congelado-descongelado y a un procedimiento de aclarado para obtener el sobrenadante del virus.
Para evaluar la expresión de HA del virus recombinante Ad4H5HA se evaluó la expresión de la proteína HA mediante citometría de flujo in vitro. Las células A549 se infectaron con una titulación de dosis de las partículas virales (vp) de Ad4H5HA y se analizaron 48 horas después usando un anticuerpo primario específico para H5 y uno secundario etiquetado como PE. Como se muestra en la Figura 1 6A, las células A549 infectadas con la vacuna Ad4H5HA expresaron proteína HA de forma dosis-dependiente. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de la proteína HA detectada que corresponde a la dosis más alta de vacuna utilizada fue de aproximadamente 34.0 en comparación con las células infectadas con Ad4wt utilizadas como control negativo donde se detectó una MFI de aproximadamente 2.0.
Para confirmar la inducción del virus recombinante Ad4H5HA de la proteína HA in vitro y para asegurar la expresión estable luego de 15 pasajes en serie de células A549, se utilizó el análisis de Western blot. Se cosecharon las células A549 infectadas con el virus recombinante Ad4H5HA y se prepararon extractos celulares completos. Distintas cantidades de extractos de células infectadas se separaron mediante geles SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Se utilizó antisuero específico para H5HA para detectar la proteína HA mientras que el anticuerpo anti- -actina se utilizó como un control de carga de proteína. Como se muestra en la Figura 16B, se detectó la proteína HA derivada de los Usados celulares infectados con virus recombinante Ad4H5HA (2.5 y 5%) en el tamaño apropiado, 80 kDa, en comparación con los controles positivos de proteína (r)H5 recombinante purificada (100 y 200ng). La proteína específica de HA no se detectó usando proteínas de células A549 no infectadas (2.5 y 5%), control negativo. También se observaron bandas menores de fragmentos de HA1 y HA2 que corresponden a HAO escindida en Usados de células A549 infectadas con Ad4H5HA. El análisis Western también confirmó que el virus recombinante Ad4H5HA expresó de manera estable H5HA incluso luego de 15 pasajes en células A549. De forma coherente con estos resultados, se mostró que las células A549 infectadas con PVXV0103 se aglutinaron con los glóbulos rojos. Véanse laa Figuras 17A-B.
Eficacia de el adenovirus recombinante Ad4H5HA como una vacuna.
Para abordar la seguridad del virus recombinante, se comparó el crecimiento del virus Ad4H5HA con el virus Ad4wt en varias líneas celulares humanas; A549, H 1299, HepG2, HuTu 80 y MRC-5. Aunque los virus Ad5 se pueden evaluar mediante metodología de ensayo de propagación, el Ad4 no se comporta de forma similar y no lisa las células in vitro de forma rápida. Por lo tanto, se utilizó un ensayo de crecimiento tradicional de una etapa para evaluar la cinética del crecimiento (véase la Figura 8A). El crecimiento del virus Ad4H5HA fue similar o atenuado en comparación con el virus Ad4wt. Véanse las Figuras 18a-E. Específicamente, cuando se evaluaron los puntos de tiempo de 48 y 72 horas luego de la infección, las partículas infecciosas que se midieron luego de la lisis celular fueron de 1 .1 a 2.3 veces más altas para el virus Ad4wt en comparación con el virus Ad4H5HA en 4 de las 5 lineas celulares analizadas, Figuras 1 8a-E. Para la quinta línea celular, H1299, las partículas infecciosas medidas para Ad4wt en comparación a Ad4H5HA fue 7 a 6.5 veces mayor para los puntos de tiempo de 48 y 72 horas, respectivamente. En ningún caso el crecimiento del vector Ad4H5HA fue mayor que el virus Ad4wt.
La fase inicial del proceso de evaluación de inmunogenicidad y eficacia consistió en establecer la inmunidad pre-existente al virus Ad4wt para evaluar el efecto en la potencia de la vacuna. Por lo tanto, se inmunizaron ratones intranasalmente con 1 x 1 09 vp de virus Ad4wt y un mes después se determinaron los títulos de anticuerpo neutralizante específico para Ad4 y la inmunidad celular. Se recogió suero inmune de 10 ratones inmunizados y los títulos de anticuerpo neutralizante específico para Ad4 medidos variaron de 1 33 a 3140 con valores medios aritméticos y geométricos de 866 y 569, respectivamente, Figura 19A. También se ind ujo inmunidad celular específica para Ad4 significativa. Se agruparon los esplenocitos no purificados de dos ratones y se usaron en un ensayo ELI S POT. Luego de la incubación con el virus Ad4wt inactivado mediante calor se detectaron 140 IFN-? células formadoras de manchas (SFC) por 1 x 1 06 esplenocitos de ratones inmunizados con Ad4wt en comparación con 18 I FN-? SFC usando esplenocitos de ratones no inmunizados, Figura 1 9B. Estos ratones y ratones sin tratamiento previo sin inmunidad pre-existente a Ad4wt se usaron posteriormente para inmunizaciones con la vacuna Ad4H5HA.
Se midieron títulos de anticuerpo de inhibición de hemaglutinina (HAI) sig nificativos 6 semanas después de una única inmunización con la vacuna Ad4H5HA. Como se muestra en la figura 20A, se observó una respuesta a la dosis; 109 vp (40 HAI) , 1 08 vp (20 HAI) y 1 07 vp ( 1 0 HAI). La menor dosis de vacuna , 1 06 vp, no fue inmunogénica . Existió un efecto de la inmunidad pre-existente a Ad4wt en la potencia de la vacuna por el cual se midió un título de anticuerpo de HAI de 20 en la dosis de 1 09 vp, pero las dosis menores no fueron inmunogénicas. Luego de la exposición al virus reagrupado H5N 1 , las respuestas de HA1 fueron típicamente más altas por una dilución, por ejem plo, 40 a 80 y 20 a 40 en la dosis de vacuna de 1 09 vp. N uevamente , la menor dosis de vacuna, 106 vp, no fue inmunogénica. Para controles negativos y positivos de comparación, se inmunizaron ratones con 1 x 101 0 vp de virus Ad4wt y 1 5 ig de proteína H5HA recom binante, respectivamente.
Como era esperado, el virus Ad4wt no indujo una respuesta de título de anticuerpo HAI detectable. La proteína recombinante indujo respuestas de título de anticuerpo HAI antes y después de la exposición a la influenza de 10 y 20 títulos de anticuerpo HAI , respectivamente.
La inducción de inmunidad celular específica para H5HA de la vacuna se evaluó específicamente para un grupo de cuatro péptidos de 15 meros derivados de la proteína HA A/Vietnam/1 194/2004, Figura 20B. Los péptidos del grupo consistían de: HA.156, sec KSSFFRNVVWLIKKN (SEQ ID NO: 2); HA.241 sec RMEFFWTILKPNDAI (SEQ ID NO: 5); HA.325 sec NRLVLATGLRNSPQR (SEQ ID NO: 8); y HA.529 sec IYQILSI YSTVASSLALAI (SEQ ID NO: 338). Las respuestas de IFN- ? medidas fueron mayores a 80 SFC cuando los ratones fueron inmunizados con dosis de 1 07, 108 y 109 vp de la vacuna Ad4H5HA. La inmunidad pre-existente a Ad4wt también afectó la inducción de inmunidad celular de la vacuna en que solo la dosis de 1 09 vp de la vacuna Ad4H5HA fue inmunogénica induciendo aproximadamente 100 I FN-? SFC. Las respuestas celulares se aumentaron a los 5 días después de la exposición al virus reagrupado H5N 1 . En la presencia o ausencia de inmunidad pre-existente a Ad4wt, las dosis de 107, 108 y 109 vp de la vacuna Ad4H5HA indujeron entre 300 y 600 IFN-? SFC. Cabe destacar que en el caso de inmunidad pre-existente a Ad4wt y dosis de vacuna de 107 y 108 vp se reforzaron las respuestas de IFN-? mínimas de menos de 50 SFC a más de 500 SFC sugiriendo que incluso las dosis de vacunas más bajas se cebaron para respuestas celulares. La dosis de 106 vp no fue inmunogénica en ningún caso. Como controles de comparación , los ratones inmunizados con 1 5 g de proteína H5HA recombinante indujeron 80 y 680 IFN-? SFC antes y después de la exposición al virus reagrupado H5N 1 . No se detectaron respuestas celulares específicas para HA significativas 5 d ías después de la exposición al virus en ratones inmunizados solo con el virus Ad4wt y expuestos posteriormente al virus reagrupado H5N1 .
La pérdida de peso, supervivencia y reducción de los títulos del virus de la influenza pulmonar se tornaron depend ientes de la dosis de la vacuna luego de la exposición al virus reagrupado H5N 1 letal. El peso de los animales se midió durante 14 d ías luego de la exposición al H5N 1 reagrupado, Figura 21 A. Si se registraba q ue los animales habían perdido 20% o más de su peso original durante dos d ías seguidos, los mismos se sometían a eutanasia . Típicamente, era necesario sacrificar a los animales en los d ías 6 a 1 2 luego de la exposición . En los animales sin pre-tratamiento con virus Ad4wt se observó poca a ninguna pérdida de peso en las dosis de vacuna de 107, 1 08 y 1 09 vp. En el caso del pre-tratamiento con Ad4wt solo la dosis de vacuna alta de 1 09 vp impidió cualquier pérdida de peso. Se registró una pérdida de peso más severa en dosis de vacuna más bajas cuando los animales fueron pre-tratados con Ad4wt, dosis de vacuna de 108 vp (promedio máximo de 6% de pérdida de peso) y dosis de vacuna de 1 07 vp (promedio máximo de 17% de pérdida de peso) . Los animales que recibieron una dosis de vacuna de 10e vp no exhibieron prevención de pérdida de peso severa. Los ratones inmunizados con la proteína H5HA recombinante no perdieron peso m ientras que los ratones inmunizados con Ad4wt sucumbieron a la enfermedad.
La supervivencia de los ratones luego de la exposición al virus reagrupado H4N 1 letal se muestra en la Figura 21 B. Los grupos de ratones que recibieron 108 y 109 vp de la vacuna se encontraban totalmente protegidos, sobrevivieron 10 de los 10 ratones. El pre-tratamiento de los ratones con Ad4wt para establecer la inmunidad preexistente al vector no afectó la supervivencia de los animales en estas dosis. Sin embargo, a dosis de vacuna más bajas de 107 y 106 vp la vacuna no fue tan efectiva. La inmunidad pre-existente al virus Ad4wt afecto la dosis de vacuna de 107 vp en que solo 3 de 10 ratones sobrevivieron en la presencia de la inm unidad específica de Ad4wt en comparación con 1 0 de 10 animales que sobrevivieron cuando los ratones no fueron pre-tratados con el virus Ad4wt. La menor dosis de vacuna de 1 06 vp no fue protectora. La inmunización con el virus Ad4wt no protegió a los animales, sobrevivieron 0 de 10. La inmunización de los ratones con la proteína H5HA recombinante protegió completamente a los ratones, sobrevivieron 10 de 10.
Por último, como medida de eficacia, se obtuvieron los pulmones de dos ratones que representaban a cada grupo, 5 días después de la exposición al virus reagrupado H5N 1 para evaluar la titulación del virus de la influenza, Figura 21 C. Se observó una reducción mayor al 85% de la titulación del virus de la influenza en las dosis de vacuna Ad4H5HA más altas de 107, 108 y 109 vp. Siendo la excepción la dosis de vacuna de 107 vp donde el grupo de animales se pre-trató con Ad4wt lo que dio como resultado una reducción de la titulación del virus de la influenza de aproximadamente 40%, indicando por lo tanto un efecto de inmunidad pre-existente a Ad4wt en la potencia de la vacuna. No se observó ninguna reducción de la titulación del virus de la influenza cuando se inmunizó con una dosis de vacuna de 1 06 vp o con el control negativo de 1010 vp de Ad4wt. Los ratones inmunizados con la proteína H5HA recombinante también exhibieron una reducción en el virus de exposición en los pulmones mayor a un 85%.
En resumen, la inducción de la vacuna Ad4H5HA de inmunidad humoral y celular específica de H5HA generalmente predijo la eficacia de la vacuna. La inmunidad pre-existente al vector Ad4wt tuvo un efecto en tanto la inmunogenicidad como la eficacia pero el efecto fue más pronunciado en las dosis de vacuna menores sugiriendo que la inmunidad pre-existente al vector Ad puede superarse usando dosis de vacuna más altas.
Ejemplo 9: El Ad4-H5-Vtn (PXVX01 03) indujo respuestas inmunitarias al transgene HA H5 en mam íferos cuando se administró mediante múltiples vías Para evaluar la eficacia del adenovirus Ad4-H5 recombinante para inducir respuestas inmunitarias cuando se administra mediante diversas vías de administración, se inmunizaron conejos con diferentes formulaciones que comprendían partículas virales de Ad4-H5-Vtn (PXVX0103) mediante una de cuatro vías de administración diferentes. La vacuna del virus Ad4-H5-Vtn se amplificó en células MRC-5 y se purificó para su uso en estudios en animales mediante cromatografía de intercambio de aniones y ultrafiltración. El fármaco (BDS) y cápsulas recubiertas entéricamente se produjeron en PaxVax, usando BDS adicional para la producción de polvos secados por aerosol en Niro (Copenhagen, Dinamarca). A continuación se describen los componentes de las diversas formulaciones: BDS en forma líquida: 5 ? 101 0 partículas virales de Ad4-H5-Vtn, sacarosa , cloruro de magnesio hexah idrato, fosfato de potasio, glicerina Polvo secado por aerosol: 5 ? 1 01 0 partículas virales de Ad4-H5-Vtn, maltodextrina, beta ciclodextrina, sacarosa , cloruro de magnesio hexahidrato, fosfato de potasio, g licerina , tween 80 Polvo secado por aerosol recubierto entéricamente: 5 ? 1 01 0 partículas virales de Ad4-H5-Vtn, Eudragit L30D55, maltodextrina , beta ciclodextrina , sacarosa, cloruro de magnesio hexahidrato, fosfato de potasio, glicerina , tween 80 Cápsulas recu biertas entéricamente: 1 ? 1 01 0 partículas virales de Ad4-H5-Vtn (por cápsula) , AcryI EZE white, cápsu las de HPMC, maltodextrina, beta ciclodextrina, sacarosa, cloruro de magnesio hexahidrato, fosfato de potasio, glicerina, tween 80 Se inmunizaron conejos adultos machos blancos de Nueva Zelanda (3 por grupo) con 5 ? 1 01 0 vp usando una de las diferentes formulaciones de vacuna Ad4-H5-Vtn descritas anteriormente; fármaco (BDS), polvos recubiertos entéricamente (E.C.) y no recubiertos entéricamente (no E.C.) y cápsulas recubiertas entéricamente (5 cápsulas de 1 * 1 01 C vp/cápsula). Los animales se inmunizaron dos veces, con 30 días de diferencia. Se usaron múltiples vías de administración como se indicó; intramuscular (I .M.), intranasal (I .N.), sublingual (S. L.) o alimentación forzada oral (O.G.). Los conejos se sangraron para los ensayos inmunes ELISA dos semanas después de la segunda inmunización. Siendo la excepción que los datos exhibidos para el BDS administrado I . N. fueron de suero inmune tomado dos semanas luego de solo una inm unización .
Las placas de ELISA se recubrieron con 2 Mg/mL de proteína rHA purificada (eEnzyme) y se incubaron durante la noche a 4 °C antes de lavarse y bloquearse con PBS con 10% de suero de cabra durantes 2 horas. Se generó una serie de dilución en serie de 3 veces de cada suero agrupado y se agregó a las placas antes de una incubación de dos horas. Después de lavar rigurosamente, se detectaron anticuerpos de suero específicos del antígeno usando un anticuerpo secundario acoplado con HRP. Las placas se desarrollaron con un reactivo sustrato de HRP, se detuvieron con ácido y se midió la absorbancia a 450nm. Los títulos del criterio de valoración se expresan como el valor recíproco de la dilución más alta que proporciona una lectura de tres de derivaciones estándar sobre el promedio inicial. Los resultados muestran que la vacuna Ad4-H5-Vtn resultó inmunogénica en conejos cuando se administraba mediante diversas vías. Véanse las Figuras 22A-C.
En otra serie de experimentos se examinó la eficacia de un adenovirus Ad4-H5 recombinante para inducir respuestas inmunitarias cuando se administra mediante las vías de administración sublingual, vaginal y rectal. Los ratones se inmunizaron con partículas virales de Ad4-H5-Vtn (PXVX0103) mediante administración sublingual, vaginal o rectal. Para la administración sublingual los ratones anestesiados fueron inmunizados en el día 0 (cebado) y reforzados el día 43 (refuerzo) con 1 x 1010 de partículas virales de Ad4-H5-Vtn en 7 µ ?_ de amortiguador de formulación de fármaco (BDS) colocados bajo la lengua y el volumen se dejó reposar, típicamente 1 m inuto de tiempo de recuperación. Para la administración vaginal se administraron 2.5 mg de Depo-Provera S.C. cinco días antes de la inmunización para adelgazar la pared vaginal. Los ratones anestesiados se inmunizaron vaginalmente en el día 0 (cebado) y se reforzaron en el día 14 (refuerzo) quitando primero la mucosa con un hisopo y luego administrando 1 ? 1010 vp de Ad4-H5-Vtn en 20 µ? de volumen de amortiguador de formulación de BDS a la vagina. Los ratones se retuvieron mirando hacia arriba por 10 minutos bajo anestesia. Para la administración rectal, los ratones anestesiados se inmunizaron rectalmente en el día 0 (cebado) y se reforzaron en el día 14 (refuerzo) administrando 1 * 1010 vp de Ad4-H5-Vtn en 20 µ? de amortiguador de formulación de BDS en el recto. Los ratones se retuvieron mirando hacia arriba por 10 minutos bajo anestesia. Todos los ratones se anestesiaron usando isoflurano y se los hizo ayunar quitándoles la comida la noche anterior a la inmunización.
Los ratones se sangraron de 2 a 4 semanas luego de la segunda inmunización (por ejemplo, inmunización de refuerzo) y se realizó el ensayo ELISA como se describió anteriormente usando H5 recombinante (A/VN/1203/04). Los resultados muestran que la vacuna de la influenza Ad4-H5-Vtn (PXVX0103) induce respuestas específicas de H5HA significativas en los ratones cuando se administra mediante las vías de administración sublingual, vaginal y rectal. Véase las Figuras 23A-C.
Ejemplo 10: Estudio de seguridad clínica de fase 1 para la vacuna Ad4-H5-Vtn Se inició un estudio de dosis ascendente controlado por placebo doble ciego de fase uno. Se incluyeron secuencialmente cuatro cohortes de dosificación, 107, 108, 109 y 1 010 partículas virales (vp). Cada cohorte consiste de aproximadamente 24 receptores de vacunas y 8 de placebo y todos sus contactos familiares (HHC). En cada cohorte de dosificación, los receptores de vacuna o placebo reciben tres vacunas con 56 días de diferencia (días 0, 56 y 1 12). Las medidas de la función inmune incluyen anticuerpo a H5 HA mediante HAI y microneutralización; anticuerpo neutralizante Ad4; evaluación de IgG e IgA a HA y Ad4 en secreciones nasales, rectales y cervicales; y respuesta de Civil a HA y a Ad4. La replicación y excreción del virus de la vacuna Ad4-H5-Vtn se evalúan mediante PCR y cultivo de hisopos rectales y de garganta y de sangre. Los parámetros inmunológicos y virológicos se analizan con estratificación mediante titulación de anticuerpo neutralizante Ad4 de referencia. Actualmente se incluyeron 1 32 receptores de vacuna/placebo y 67 HHC. Los cohortes 1 a 3 recibieron las tres dosis, el cohorte 4 recibió su primera dosis. Actualmente el cohorte 4 está recibiendo la dosis 2 y el cohorte 5 (101 1 vp) se somete a inclusión.
Los parámetros de seguridad primarios son la reactogenicidad, sucesos adversos graves o severos y anormalidades de laboratorio de seguridad clínica. Los mismos se evaluaron formalmente antes de cada una de las revisiones del comité de monitoreo de datos (DMC) y se evalúan en "tiempo real" de forma continua. En la revisión más reciente del DMC, se revisaron los datos de seguridad posteriores a las tres administraciones de dosis de los cohortes 1 , 2 y 3 y posteriores a la primera dosis del cohorte 4. No se identificó ninguna preocupación por la seguridad o toxicidad limitante de la dosis. No hubo anormalidades de laboratorio significativas ni sucesos adversos graves o severos. Generalmente la reactogenicidad se mantuvo de leve a moderada. Se detectó la eliminación del virus de la vacuna, monitoreado mediante PCR, en hisopos rectales en los días 7 y/o 14 luego de la vacunación. No hubo evidencia de propagación sistémica o respiratoria del virus de la vacuna. Todos los hisopos de garganta y especímenes de sangre resultaron negativos para el virus Ad4-H5-Vtn excepto un único caso de un hisopo de garganta positivo para PCR de una vacuna (cuyos hisopos rectales y sangre resultaron negativos para PCR). La vacuna se mantuvo completamente asintomática. Basándose en los datos, el DMC aprobó la administración de la dosis 2 al cohorte 4 y la inclusión del cohorte 5. El estado de referencia del anticuerpo Ad4 para cada uno de los cohortes en diferentes puntos de tiempo durante el estudio se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17. Estudio de seguridad clínica de fase 1 de la vacuna Ad4 Vtn como resultado un número más bajo de pacientes positivos para Ad4.
Ejemplo 11 : Construcción y evaluación de adenovirus recombinantes que expresan antígenos del ántrax Se generaron virus Ad4 recombinantes con eliminaciones totales o parciales de la región E3 que expresaban un antígeno protector (PA) de Bacillus anthracis con métodos similares a los descritos en los Ejemplos 1 a 3. Las modificaciones del transgene del PA incluyeron modificación mediante codones para la expresión optim izada en células humanas, adición del ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) para la expresión de la superficie celular y dos elim inaciones de fenilalanina para quitar el sitio de escisión de termol isina . La expresión del transgene fue dirigida por un promotor de CMV humano o MLTU natural . En la Tabla 1 8 se enumeran diferentes vectores adénovirales recombinantes que exhiben expresión de secuencias heterólogas dirigidas por CMV o por MTLU .
Tabla 18. Vectores adénovirales recombinantes que expresan antígenos del ántrax FDE3= elim inación total de la región E3 excepto por E3 1 2. 1 k; PDE= eliminación parcial de la región E3.
Se analizaron células A549 (5 x 1 05) infectadas con 2.5 x 1 07 de adenovirus Ad4-PA recombinantes para detectar la expresión de antígeno protector. Las células se incubaron a 37 °C durante 48 horas antes de la cosecha . Se analizó un lisado de células completo (Figura 24, panel izquierdo) o sobrenadante de cultivo de célu las (Figura 24, panel derecho) de cada muestra mediante análisis de Western blot luego de la separación en gel SDS-PAGE. Se sondaron membranas de nitrocelulosa con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-PA. Se realizó la confirmación de la expresión de la proteína recombinante mediante referencia a un PA recombinante disponible comercialmente cargado en paralelo para un control positivo. Las A549 y A549 infectadas con Ad4 WT representan controles negativos, demostrando la especificidad a rPA. Los niveles de proteína se m uestran como cantidades relativas por nivel total de proteínas. Véase la Figura 24.
Un d ía después de la infección con estas construcciones , el antígeno PA se encontraba presente en la superficie de las células A549 como muestra el análisis FACS presentado en la Figura 25. La intensidad de fluorescencia media (M FI ) , que representa una medida de intensidad de fluorescencia que es una indicación del nivel de expresión por célula, se muestra para cada uno de los grupos. Se utilizó un ensayo de crecimiento de una etapa para evaluar la cinética del crecimiento de los adenovirus recombinantes PXVX0212 y PXVX0214 en células A549 (carcinoma de pulmón) y RC-5 (fibroblasto de pulmón embrionario, diploide) (véase la Figura 8A). Se midió la evolución temporal de los niveles de rAd4 mediante TCI D50 luego de la infección con el virus rAd4-PA de células A549 o MRC-5. El tamaño de ráfaga de células se calculó mediante el uso del nivel mínimo de infectividad ( 1 hora para A549 y 24 horas para MRC-5) como referencia, corrigiendo así las diferencias en la infección. El tamaño de ráfaga confirma que tanto PXVX0212 como PXVX0214 muestran tasas reducidas de crecimiento en comparación con Ad4 Wt y también dan como resultado rendimientos por célula menores. Véase la Figura 26.
Ejemplo 12: Eficacia del adenovirus recombinante Ad4-PA como una vacuna protectora contra la exposición al ántrax Para determinar si el adenovirus recombinante que expresa antígeno protector (PA) de B. anthracis podría inducir una respuesta inmunitaria protectora contra la exposición al ántrax, se inmunizaron ratones con lisados celulares completos de células infectadas con uno de los vectores adenovirales recombinantes descritos en el Ejemplo 1 1 . Específicamente, se inmunizaron ratones (6 animales por grupo) mediante una inyección intraperitoneal (IP) de lisados de células completos equivalentes a 5 x 106 células infectadas con 5 x 108 partículas virales de Ad4 de tipo salvaje (Ad4 WT), Ad4-PA (PXVX0212) o Ad4-PA-GPI (PXVX0214). Se adm inistraron 1 0 pg de antígeno protector recombinante (rPA) de manera subcutánea (S . C. ) como control positivo. Cinco semanas después de la inmunización , los ratones se expusieron a una toxina letal de manera intravenosa (combinación de 120 pg de PA con 60 pg de factor letal ( LF)) y se controlaron diariamente. Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 27. U n lisado celular de Ad4-PA-GPI proteg ió completamente a los ratones contra la exposición a la toxina letal.
Las respuestas de los anticuerpos se midieron en los ratones inmunizados a partir de suero obtenido 21 d ías después de la inmunización I P. Las respuestas de los anticuerpos se analizaron tanto con ELISA (Figura 28, panel izquierdo) y ensayo de neutralización de toxina basado en macrófagos in vitro (Figura 28, panel derecho) . Se calculó un EC50 de 6 animales por grupo. Las respuestas de IgG específicas para PA se tornaron detectables tres semanas después de la inmunización con lisado celular com pleto de células A549 infectadas con adenovirus recombinante.
En otra serie de experimentos, se examinó la eficacia del adenovirus recombinante purificado para inducir respuestas inmunitarias protectoras. Se inmunizaron ratones (n=25/grupo) con uno de cinco antígenos diferentes (Ad4 de tipo salvaje, Ad4-CMV-PA (PXVX0212) , Ad4-CMV-PA-G PI (PXVX0214) , rPA y rPA + alumbre) en el día 0 como se indica en el esquema de la Figura 29. Los virus rAd4 fueron administrados intranasalmente (I . N .) como 1 x 1 01 0 de partículas virales (vp) en 50-62.5 p L de PBS por animal . El virus Ad4 de tipo salvaje sirvió como control negativo. Controles positivos, inyectados por vía subcutánea, en el volumen final de 1 00 µ?_ de PBS contenían 1 0 pg de antígeno protector recombinante (rPA) solo o 1 0 µg de rPA adsorbido a 1 mg de gel de hidróxido de aluminio (Rehydragel H PA) . Se midieron las respuestas inmu nitarias mediadas por células (I FN-? ELI SPOT y I L-4 ELI SPOT) 27 d ías después de la inmunización en esplenocitos agrupados de 2 ratones por grupo. Se analizaron las respuestas inmunitarias celulares de los ratones q ue sobrevivieron a la exposición a la toxina #1 (20 d ías después de la inmunización , n= 1 0/grupo) en el d ía 54. Se sangraron los mismos 9 animales/grupo (5 grupos) para los ensayos ELISA y de neutralización de toxinas luego de 14 y 40 días de la inm un ización . También se expusieron un total de 1 0 ratones por grupo, incluyendo 7 ratones de los 9 ratones q ue se sangraron, a una toxina letal (con una com binación de 120 g de PA y 60pg de factor letal) luego de 46 d ías de la inm unización. La supervivencia se controló durante los 30 d ías posteriores a la exposición .
Se midieron las respuestas de los anticuerpos en suero a los 14 y 40 días luego de la inmunización intranasal con los virus Ad4-PA y Ad4-PA-GPI purificados (véase la Figura 29). Las respuestas de IgG anti-PA se analizaron mediante ELI SA (Figura 30, paneles izquierdos), mientras que los anticuerpos neutralizantes de las toxinas (TNA) se midieron mediante un ensayo de neutralización de toxinas basado en macrófagos murinos in vitro (Figura 30, paneles derechos) . Se calculó el ECso mediante el uso de una curva de respuesta a la dosis sigmoidal ajustada para los datos de la dilución en serie de las m uestras. Se observó solo una respuesta m ínima de IgG anti-PA y no se observaron respuestas mensurables de TNA luego de 14 d ías después de la inmun ización (Figura 30) . Luego de 40 d ías después de la inmunización se observaron respuestas significativas de IgG anti-PA y TNA con tanto Ad4-PA (PXVX021 2) como Ad4-PA-GPI (PXVX0214) en comparación con rPA o rPA con alumbre (Figura 30) . Ambos adenovirus PA recombinantes (virus Ad4-PA y Ad4-PA-GPI) ind ujeron respuestas inmunitarias comparables.
Se inmun izaron ratones con uno de los cinco inmunógenos diferentes (n = 1 0/grupo) como se indica en la Fig ura 29 en el d ía 0 y se expusieron a una toxina letal (60 ¡g de PA y 30 de LF en un volumen total de 1 00 µ ?_ de PBS) en los d ías 20 y 46 luego de la inm unización. La supervivencia se controló durante 30 d ías. Los resultados se muestran en la Figura 31 . Luego de la exposición después de 20 días de la inmunización se observó un 80% de supervivencia con ratones inmunizados con rPA-alumbre, mientras que los grupos inmunizados con Ad4-PA y Ad4-PA-GPI tuvieron 50% y 20% de supervivencia, respectivamente (Figura 31 , panel izquierdo) . Un ratón del grupo inmunizado con Ad4 de tipo salvaje sobrevivió y en el grupo inmunizado con rPA no sobrevivió ninguno. Luego de la exposición 46 d ías después de la inmunización , se observó un 1 00% de supervivencia en los grupos inmunizados con rPA + alumbre y Ad4PA, mientras que se observó un 90% y un 30% de supervivencia en los grupos inmunizados con Ad4-PA-G PI y rPA, respectivamente (Figura 31 , panel derecho) . Del grupo tratado con Ad4 de tipo salvaje no sobrevivió n inguno. Los resultados indican que en una exposición con toxina letal, los dos virus del vector Ad4-PA confieren protección parcial 20 días después de la inmunización y protección total 46 d ías después de la inmun ización . No hubo diferencia estad ística en la protección proporcionadas por los adenovirus recombinantes Ad4-PA o Ad4-PA-GPI .
Se midieron las respuestas ¡nmun itarias mediadas por las células (I F N -Y ELISPOT e I L-4 ELI SPOT) 27 d ías luego de la inmunización en esplenocitos agrupados de ratones inm unizados con uno de los cinco antígenos diferentes (2 ratones por g rupo) como se indica en la Figura 29. Se analizaron las respuestas inmun itarias celulares de los ratones que sobrevivieron a la exposición a la toxina #1 (20 d ías después de la inmunización , n= 1 0/grupo) en el d ía 54 (34 d ías después de la exposición). Ambos adenovirus Ad4-PA y Ad4-PA-G PI recombinantes indujeron respuestas de Th 1 y Th2 al PA indicado por las respuestas a IFN-y e IL-4 (Figura 32) .
En resumen , los resultados de los experimentos descritos en este Ejemplo demuestran que los adenovirus recombinantes que expresan antígeno protector i nducen tanto inmunidad humoral como mediada por células en ratones y proporcionan protección contra la exposición a ántrax letal .
Ejem plo 1 3 : Expresión de un polipéptido epítopo HTL múltiple de adenovirus recombínante Se diseñó una secuencia de antígenos sintéticos de la influenza que contenía 24 epítopos de linfocitos T auxiliares (HTL) de la influenza cada uno separado por una secuencia espaciadora GPG PG (SEO. I D NO: 353) . Véase la Figura 33A. Se generó un virus Ad4 recom binante con una eliminación total de la reg ión E3 que expresa este polipéptido HTL24 bajo el control de un promotor de CMV (PXVX01 09) con métodos similares a los descritos en el Ejemplo 3. Las células A549 se infectaron con PXVX01 09 luego de la transfección para generar virus de dos clones plásmidos idénticos ( 15-4 y 1 9-1 ) . Las células infectadas se cosecharon a >90% de efecto citopático (CPE) y los Usados celu lares se prepararon a 1 x 1 0e células por 1 00 iL de a mortig uador RI PA q ue contiene inhibidores de la proteasa . Como control positivo, se infectaron células A549 con influenza A/Uruguay/71 6/2007 (tipo A/Brisba ne/1 0/2007) (NYMC X- 1 75C reagrupado, N I BSC) . Luego de la separación en un gel SDS-PAGE y transferencia posterior a una membrana de transferencia, se detectaron proteínas con un anticuerpo monoclonal marcador anti-HA y un anticuerpo secundario IgG de cabra anti-ratón H RP. Para el control de carga , se sondó una membrana paralela con un anticuerpo policlonal de conejo anti-beta-actina y un anticuerpo secundario IgG de cabra anticonejo H RP. Las bandas de proteína se visua lizaron mediante quimioluminiscencia (Supersignal West Femto, Thermoscientific). Como muestran los resultados del análisis de Western blot en la Figura 33B, el adenovirus Ad4 recombinante expresó altos niveles del polipéptido HTL24.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente discutidas y citadas en la presente se incorporan en su totalidad a la presente mediante esta referencia. Se entiende que la invención descrita no se limita a la metodología, protocolos y materiales particulares descritos ya que los mismos pueden variar. También se entiende que la terminología usada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que la invención descrita no se limita a la metodología, protocolos y materiales particulares descritos ya que los mismos pueden variar. También se entiende que la terminología usada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar usando solamente la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Se pretende que tales equivalentes estén comprendidos en las siguientes reivindicaciones.

Claims (58)

REIVINDICACIONES
1. Una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una primera secuencia heteróloga, donde dicho vector adenoviral es capaz de replicarse y tiene una eliminación parcial de E3 y donde la primera secuencia heteróloga se integra a una ubicación que comprende la eliminación parcial de E3.
2. La vacuna de la reivindicación 1, donde el vector adenoviral se deriva de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad11, Ad20, Ad21, Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41, Ad48, Ad49 o Ad50.
3. La vacuna de la reivindicación 1, donde el vector adenoviral se deriva de los serotipos de chimpancé Ad C1, Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68.
4. La vacuna de la reivindicación 1, donde la eliminación parcial de E3 comprende la eliminación de al menos 1, 2 o 3 marcos abiertos de lectura dentro de la región E3.
5. La vacuna de la reivindicación 1, donde la eliminación parcial de E3 comprende la eliminación de al menos 1, 2 o 3 marcos abiertos de lectura con función desconocida.
6. La vacuna de la reivindicación 1, donde la eliminación parcial de E3 comprende la eliminación de una región que corresponde a la región ADP de Ad5.
7. La vacuna de la reivindicación 1, donde el vector adenoviral se deriva de Ad4 y la eliminación parcial de E3 comprende una eliminación de E324.8k, E36.3k y E329.7k.
8. La vacuna de la reivindicación 1 , donde el vector adenoviral se deriva de Ad7 y la eliminación parcial de E3 comprende una eliminación de E3 20.1 k, E3 20.6k y E3 7.7k.
9. La vacuna de la reivindicación 1 , donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor adenoviral.
10. La vacuna de la reivindicación 9, donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor adenoviral endógeno.
1 1 . La vacuna de la reivindicación 10, donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor tardío principal endógeno y líder tripartito.
12. La vacuna de la reivindicación 1 , donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor no adenoviral.
13. La vacuna de la reivindicación 12, donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV).
14. La vacuna de la reivindicación 12, donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor de CMV y líder tripartito adenoviral.
1 5. La vacuna de la reivindicación 1 , donde la primera secuencia heteróloga se encuentra ligada de forma operativa a un aceptor de empalme adenoviral.
16. La vacuna de la reivindicación 1 5, donde la primera secuencia heterologa se encuentra ligada de forma operativa a un aceptor de empalme de E3 24.8k natural .
1 7. La vacuna de la reivindicación 1 , donde la primera secuencia heterologa se encuentra ligada de forma operativa a una secuencia de señal poli A adenoviral.
1 8. La vacuna de la reivindicación 1 7, donde la primera secuencia heterologa se encuentra ligada de forma operativa a una secuencia de señal poli A de Ad5 E3.
1 9. La vacuna de la reivindicación 1 , donde la primera secuencia heteróloga codifica una prote ína inmunogénica de un patógeno infeccioso.
20. La vacuna de la reivindicación 1 9, donde el patógeno infeccioso se selecciona del grupo que consiste de un virus, una bacteria , un protista y u n hongo.
21 . La vacuna de la reivindicación 20, donde el patógeno infeccioso es la influenza , el virus de inm unodeficiencia hu mana o el virus de papiloma hu mano.
22. La vacuna de la reivindicación 20, donde el patógeno infeccioso es Bacillus, Shigella, Mycobacterium o Plasmodium.
23. La vacuna de la reivindicación 1 , donde la primera secuencia heteróloga cod ifica la hemag lutinina de la influenza , neruaminidasa de la influenza , M2 de la influenza , un multímero de M2e , un multímero de epítopos HTL o un multímero de epítopos CTL.
24. La vacuna de la reivindicación 1 , donde la primera secuencia heteróloga comprende un primer ORF q ue codifica una proteína inmunogénica de un patógeno infeccioso y un segundo ORF que codifica un multímero de epítopos de dicho patógeno infeccioso.
25. Una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una primera secuencia heteróloga, donde dicho vector adenoviral es capaz de replicarse y donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor adenoviral.
26. La vacuna de la reivindicación 25, donde el promotor adenoviral es un promotor adenoviral endógeno.
27. La vacuna de la reivindicación 25, donde la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor tardío principal endógeno y líder tripartito.
28. La vacuna de la reivindicación 25, donde el vector adenoviral comprende una eliminación total o parcial de E3 y donde la primera secuencia heteróloga se integra a una ubicación que contiene la eliminación total o parcial de E3.
29. Una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una primera secuencia heteróloga donde dicho vector adenoviral se deriva de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49, Ad50, Ad C1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68, es capaz de replicarse y tiene una eliminación total de E3.
30. Una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una primera secuencia heteróloga y una segunda secuencia heteróloga, donde la segunda secuencia heteróloga se encuentra integrada en una región del hexón del adenovirus, donde la primera secuencia heteróloga se encuentra integrada en una región no hexón del adenovirus y donde el vector adenoviral es capaz de replicarse.
31 . La vacuna de la reivindicación 30, donde el vector adenoviral se deriva de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50.
32. La vacuna de la reivindicación 30, donde el vector adenoviral se deriva de los serotipos de chimpancé Ad C1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68.
33. La vacuna de la reivindicación 30, donde el vector adenoviral comprende una eliminación parcial de E3 y donde la primera secuencia heteróloga se integra a una ubicación que contiene la eliminación parcial de E3.
34. La vacuna de la reivindicación 30, donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor adenoviral.
35. La vacuna de la reivindicación 30, donde la expresión de la primera secuencia heteróloga se encuentra bajo el control de un promotor adenoviral endógeno.
36. La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heteróloga se integra a una región del hexón del vector adenoviral.
37. La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heteróloga se integra a HVR1 , HVR2, HVR4 o HVR5.
38. La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heterologa codifica una región de una proteína de la membrana de un virus.
39. La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heterologa codifica una parte extracelular de una proteína de la membrana de un virus conservada.
40. La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heterologa codifica una región de una proteína 2 de la influenza, un CTL de matriz de la influenza, un epítopo NP de la influenza, una o más HVR de un adenovirus de otro serotipo o una combinación de los mismos.
41 . La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heterologa codifica una o más copias de M2e de la M2 de la influenza.
42. La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heterologa codifica una o más copias de M2e de la M2 de la influenza, donde cada copia de M2 se integra a una HVR diferente y donde la una o más copias de M2e se integran a HVR1 , HVR2, HVR4, HVR5 o una combinación de las mismas.
43. La vacuna de la reivindicación 30, donde la segunda secuencia heterologa comprende la secuencia de la SEQ I D NO: 318 (H5 M2e), SEQ I D NO. 321 (H7 M2e), SEQ ID NO. 327 (H9 M2e), SEQ ID NO. 312 (M2e humana), SEQ I D NO. 337 (NP) o SEQ I D NO. 336 (CTL matriz).
44. Una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una segunda secuencia heteróloga, donde la segunda secuencia heteróloga codifica una región de un proteína de la membrana de un virus y se encuentra adyacente a una secuencia adenoviral endógena y donde la segunda secuencia heteróloga se integra a una región del hexón del vector adenoviral.
45. La vacuna de la reivindicación 44, donde la segunda secuencia heteróloga codifica una región de una proteína M2 de la influenza, un CTL de matriz de influenza, un epítopo NP de influenza, una o más HVR de un adenovirus de otro serotipo o una combinación de los mismos.
46. La vacuna de la reivindicación 44, donde el vector adenoviral se deriva de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad 1 1 , Ad20, Ad21 , Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41 , Ad48, Ad49 o Ad50.
47. La vacuna de la reivindicación 44, donde el vector adenoviral se deriva de los serotipos de chimpancé Ad C1 , Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68.
48. Una vacuna que comprende un vector adenoviral que comprende una segunda secuencia heteróloga, donde la segunda secuencia heteróloga codifica una región de una proteína de la membrana de un virus flanqueado por una secuencia espaciadora y donde la segunda secuencia heteróloga se encuentra integrada a una región del hexón del vector adenoviral.
49. La vacuna de la reivindicación 48, donde la secuencia espaciadora codifica un péptido "LGS".
50. La vacuna de la reivindicación 48, donde el vector adenoviral se deriva de Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad6, Ad7, Ad11, Ad20, Ad21, Ad22, Ad23, Ad24, Ad25, Ad26, Ad28, Ad34, Ad35, Ad40, Ad41, Ad48, Ad49 o Ad50.
51. La vacuna de la reivindicación 48, donde el vector adenoviral se deriva de los serotipos de chimpancé Ad C1, Ad C3, Ad C6, Ad C7 o Ad68.
52. La vacuna de la reivindicación 1, 25, 29, 30, 44 o 48, la cual se formula para administración oral, intranasal, sublingual, intravesical, rectal o intravaginal.
53. Una vacuna de la reivindicación 1, 25, 29, 30, 44 o 48 que comprende además un portador aceptable.
54. Una unidad de dosificación de la vacuna de la reivindicación 1, 25, 29, 30, 44 o 48, donde una dosis individual comprende alrededor de 103 a alrededor de 1013 partículas adenovirales.
55. Un método de inducir una respuesta inmunitaria a un patógeno infeccioso en un sujeto, la cual comprende administrar al sujeto la vacuna de la reivindicación 1, 25, 29, 30, 44 o 48.
56. El método de la reivindicación 55, donde se administran una o más dosis de la vacuna al sujeto.
57. El método de la reivindicación 55, donde el patógeno infeccioso es influenza, HIV, HPV, Bacillus, Plasmodium, Mycobacteria o Shigella.
58. El método de la reivindicación 55, donde el sujeto tiene una infección inducida por dicho patógeno infeccioso. RESU M E N La presente invención proporciona vectores adenovirales competentes de replicación capaces de expresar antígenos de patógenos infecciosos, tales como virus de influenza. Los vectores adenovirales pueden ser utilizados para vacunar sujetos contra los patógenos infecciosos. Los vectores adenovirales comprenden secuencias heterólogas que codifican los antígenos. Las secuencias heterólogas pueden ser insertadas en varias ubicaciones en los vectores adenovirales, incluyendo en o cerca de eliminaciones E3 específicas y/o integrarse en la región de codificación de hexón adenoviral. Los vectores adenovirales pueden derivarse de cualquier serotipo adenoviral, particularmente un serotipo Ad4 o Ad7.
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