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MX2011011684A - Usos de inmunoconjugados dirigidos a cd138. - Google Patents

Usos de inmunoconjugados dirigidos a cd138.

Info

Publication number
MX2011011684A
MX2011011684A MX2011011684A MX2011011684A MX2011011684A MX 2011011684 A MX2011011684 A MX 2011011684A MX 2011011684 A MX2011011684 A MX 2011011684A MX 2011011684 A MX2011011684 A MX 2011011684A MX 2011011684 A MX2011011684 A MX 2011011684A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
immunoconjugate
cells
cancer
antibody
carcinoma
Prior art date
Application number
MX2011011684A
Other languages
English (en)
Inventor
Christoph Bruecher
Benjamin Daelken
Steffen Zeng
Frank Osterroth
Christoph Uherek
Silke Aigner
Andrea Wartenberg-Demand
Chantal Zuber
Gregor Schulz
Niklas Czeloth
Andre Engling
Thomas Haeder
Gabriele Niemann
Original Assignee
Biotest Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotest Ag filed Critical Biotest Ag
Publication of MX2011011684A publication Critical patent/MX2011011684A/es

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Abstract

Se dan a conocer métodos y regímenes de tratamiento que incluyen la administración de inmunoconjugados dirigidos a CD138 para combatir enfermedades. El de inmunoconjugado se usa ya sea como único activo, como parte de un régimen de tratamiento o como parte de una combinación anticancerígena.

Description

USOS DE INMUNOCONJUGADOS DIRIGIDOS A CD138 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y regímenes de tratamiento, en particular para sujetos humanos, que incluyen la administración de inmunoco jugados que se diseñan para hacer blanco en células que expresan CD138. La presente invención también se dirige a combinaciones anticáncer, a composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas, y a sus usos en el tratamiento de cánceres que tienen células blanco u objetivo que expresan CD138. La presente invención en particular se dirige a combinaciones anticáncer que muestran sinergia u otros efectos aditivos inesperados en el tratamiento sobre tratamiento que involucra menos que todos los componentes de la combinación.
ANTECEDENTES CD138, que actúa como un receptor para la matriz extracelular, se sobre-expresa en células de mieloma múltiple (MM) y se ha mostrado que influencia el desarrollo y/o proliferación de células MM. CD138 también se expresa en células de carcinoma de ovarios, cáncer cervical (Numa et al., 2002), cáncer endometrial (Choi et al., 2007), carcinoma renal o de riñon, vesicular biliar, carcinoma de vesícula-células de transición, cáncer gástrico (Wiksten et al. 2008), adenocarcinoma de próstata (Zell eger et al., 2003) , carcinoma mamario (Loussouarn et al., 2008) carcinoma pulmonar de células no pequeñas (Shah et al., 2004) , carcinoma pulmonar de células escamosas (Toyoshima et al., 2001), células de carcinoma de colon y células de linfomas de Hodgkin y no-Hodgkin, carcinoma colorectal (Hashimoto et al, 2008), hepato-carcinoma (Li et al., 2005) , leucemia linfocitica crónica (CLL = Chronic Lymphocytic Leukemia) , carcinoma pancreático (Conejo et al., 2000), y carcinoma de cabeza y cuello (Anttonen et al., 1999) por nombrar solo unos cuantos.
Las publicaciones y otros materiales, incluyendo patentes, aquí empleados para ilustrar la invención y en particular, para proporcionar detalles adicionales respecto a la práctica, se incorporan por referencia. Por conveniencia, las publicaciones son referidas en el siguiente texto por autor y fecha y/o se citan alfabéticamente por autor en la bibliografía anexa.
Tassone et al. (2004) reportó excelente enlace del anticuerpo B-B4 IgGl murino al antígeno CD138 expresado en la superficie de células M. Tassone también reportó alta actividad citotóxica del inmunoconjugado B-B4-DM1, que comprende el maitansinoide DM1 como una molécula efectora, contra células de mieloma múltiple (ver publicación de patente de los E.U.A. No. 20070183971).
Ikeda et al. (2008 y 2009) reportó resultados promisorios in vitro y resultados en modelos de xenoinjerto con el inmunoconjugado BT062, que se basa en B-B4.
Mientras que Tassone et al., e Ikeda et al., representan contribuciones a proporcionar un tratamiento efectivo de MM y una composición de materia que puede emplearse en ese tratamiento, queda una cantidad de necesidades por satisfacer en la técnica.
Permanece en particular una necesidad por proporcionar regímenes de tratamiento convenientes para enfermedades asociadas con expresión CD138, incluyendo desórdenes plasma-proliferativos asociados con expresión CD138, tal como MM. Aún más en particular permanece una necesidad por regímenes de tratamiento que aseguran que toxicidades hacia células no tumorales, que también expresan CD138, se mantienen a un nivel clínicamente aceptable, ya sea al emplear solo ciertas cantidades tolerables de inmunoconjugado y/o por combinar el inmunoconjugado con agentes citotóxicos conocidos como efectivos contra el desorden en cuestión. También hay necesidad por regímenes de tratamiento que reducen la necesidad por medicamentos que se emplean para aliviar otros síntomas de la enfermedad.
La invención cumple, en ciertas modalidades, una o más de estas necesidades así como otras necesidades en la técnica que serán más aparentes para la persona con destreza en la técnica una vez dada la siguiente descripción .
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención cumple una o más de las necesidades anteriormente descritas por los métodos aqui descritos para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138.
La invención, en una modalidad, se dirige a un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, que comprende: administrar a un sujeto, en particular un sujeto humano, que lo requiere, una cantidad efectiva, pero que de preferencia es tolerable, de un inmunoconjugado que comprende al menos un agente dirigido, por ejemplo, un anticuerpo dirigido de ingeniería que hace blanco a células que expresan CD138, y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido es conectado funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado .
De preferencia al menos una parte del anticuerpo dirigido de ingeniería confiere de preferencia propiedades de isotipo IgG4 o en forma alterna cualquier otro inmunoconjugado aquí descrito.
En una modalidad adicional, la invención es un inmunocon ugado para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconj ugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y \ (ii) al menos en una molécula efectora, en donde el agente dirigido se conecta funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado se va a administrar en una cantidad efectiva, y en donde la cantidad efectiva es una cantidad tolerable.
Adicionalmente, en esta modalidad, la invención es el uso de un inmunoconjugado para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconj ugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado se va a administrar en una cantidad efectiva, y en donde la cantidad efectiva es una cantidad tolerable.
El inmunoconjugado de preferencia se administra al sujeto en una cantidad de 5 mg/m2 a 200 mg/m2 o su equivalente farmacocinético .
Una modalidad preferida adicional es una preparación combinada de un inmunoconjugado y un agente para tratar efectos secundarios adversos, para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, y en donde el inmunoconjugado se va a administrar en una cantidad que es un equivalente farmacocinético de 5 mg/m2 a 200 mg/m2 del inmunoconjugado cuando se administra solo.
Adicionalmente, esta modalidad preferida adicional es el uso de un inmunoconjugado y un agente para tratar efectos secundarios adversos para la fabricación de una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado y en donde el inmunocon ugado se va a administrar en una cantidad que es un equivalente farmacocinético de 5 mg/m2 a 200 mg/m2 del inmunoconjugado cuando se administra solo.
En particular, el inmunoconjugado puede administrarse al sujeto en una cantidad de 5 mg/m2 o 10 mg/m2 a menos que 160 mg/m2, de preferencia a 150 mg/m2, 140 mg/m2, 130 mg/m2 o 120 mg/m2.
La concentración máxima del inmunoconjugado en el plasma del sujeto entre 0 a 2 horas después del fin de una primera administración, puede ser menor que 50%, de preferencia menor que 40%, más preferiblemente menor que 30%, aún más preferible menor que 20%, o incluso menos que 10% de una concentración máxima teórica para el inmunoconj ugado .
El inmunoconjugado puede administrarse al menos cuatro veces y una concentración máxima del inmunoconjugado en el plasma del sujeto entre 0 a 2 horas después del fin de cada una de las administraciones puede ser menos que 55%, de preferencia menos que 50%, más preferiblemente menos que 40%, aún más preferiblemente menos que 30%, menos que 20% o incluso menos que 10% de la concentración máxima teórica para el inmunoconjugado .
La concentración máxima puede ser menos que 3 g/ml para 10 mg/m2; menos que 8 g/ml para 20 mg/m2, menos que 15 g/ml para 40 mg/m2, menos que 25 g/ml para 80 mg/m2, menos que 30 µg/ml para 120 mg/m2.
La concentración máxima del inmunocon ugado después de una cuarta aplicación en el plasma del sujeto entre 0 a 2 horas después de un fin y una primera administración puede ser menor que 55%, de preferencia menor que 50%, más preferiblemente menor que 40%, aún más preferiblemente menos que 30%, menos que 20% o incluso menos que 10% de la concentración máxima teórica para el inmunoconjugado .
La concentración máxima puede ser menos que 14 µg/ml para 20 mg/m2, menos que 15 µg/ml para 40 mg/m2 o menos que 25 pg/ml para 80 mg/m2. El inmunoconjugado puede administrarse en forma intravenosa. El inmunoconjugado puede administrarse en forma intravenosa en una sola dosis repetida y la concentración máxima del inmunoconjugado en el plasma del sujeto entre 0 a 2 horas después del fin de cualquiera administración, puede ser menos que 55%, menos que 50% o menos que 40% de la concentración máxima teórica para el inmunoconjugado . Una enfermedad estable puede mantenerse por al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ciclos de tratamiento (por al menos 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 semanas) . Un estado de al menos enfermedad estable puede mantenerse por 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ciclos de tratamiento a 20 mg/m2 y opcionalmente, la concentración máxima del inmunocon ugado en el plasma del sujeto 0 a 2 horas después de un fin de cualquier administración puede ser menos que 55%, menos que 50% o menos que 40% de la concentración máxima teórica para el inmunocon ugado. En ciertos casos, una respuesta menor puede observarse después de hasta 8 ciclos de tratamiento.
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138 que comprende administrar a un sujeto, de preferencia un sujeto humano, . que requiere este tratamiento, una cantidad efectiva de' un inmunoconjugado que comprende : al menos un agente dirigido que hace diana en CD138 expresado en superficie celular, al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado se administra en una dosis, de preferencia una dosis sencilla repetida, no mayor a aproximadamente 10, 20, 30, 40, 80, 90, 100 ó 120 mg/m2, una dosis diaria promedio de aproximadamente 400 Ug/m2 a aproximadamente 6 mg/m2, incluyendo aproximadamente 500 pg/m2, aproximadamente 1 mg/m2, aproximadamente 2 mg/m2, aproximadamente 3 mg/m2, aproximadamente 4 mg/m2, y/o una dosis semanal promedio de aproximadamente 3 mg/m2 a aproximadamente 40 mg/m2, incluyendo aproximadamente 5 mg/m2, aproximadamente 10 mg/m2, aproximadamente 15 mg/m2, aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 25 mg/m2, aproximadamente 30 mg/m2 o ) aproximadamente 35 mg/m2.
Los métodos aquí referidos pueden permitir mantenimiento de enfermedad estable por aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 210 o más días y/o por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de tratamiento cada uno de aproximadamente tres semanas.
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138 que comprende administrar a un sujeto, de preferencia un sujeto humano, que requiere este tratamiento, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado que comprende : ^ al menos un agente dirigido que hace diana en CD138 expresada de superficie celular, al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se conecta funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunocon ugado, en donde CD138, en el sujeto se expresa en las células diana y en células no diana, en donde la administración resulta en eliminación o depuración en plasma moderada o lenta, y en donde las células no diana, en particular células epiteliales, substancialmente no son afectadas .
La cantidad efectiva que se administra puede ser menos que 200 mg/m2 o menos que un equivalente farmacocinético de 200 mg/m2 cuando se administra en combinación con un agente para tratar efectos secundarios adversos y en donde la administración puede resultar en una respuesta del sujeto, de preferencia después de menos de 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 horas.
La cantidad efectiva puede ser mayor a 120 mg/m2.
Los niveles de expresión de CD138 en células diana y no diana (por ejemplo células del epitelio) pueden ser comparables.
La cantidad efectiva puede administrarse como, por ejemplo una sola dosis o una dosis repetida sencilla o en múltiples dosis.
La cantidad efectiva puede administrarse en múltiples dosis, en donde el valor Cmax después de cada administración es mayor a 55% del valor Cmax teórico.
La enfermedad puede asociarse con dolores de huesos y/o complicaciones de huesos y la administración del inmunoconjugado o una combinación anticáncer de acuerdo con la presente invención puede reducir los dolores de huesos y/o complicaciones de huesos, de preferencia a un nivel aceptable. La administración de medicamento para aliviar los dolores de huesos y/o complicaciones de huesos puede cesar o reducirse desde un nivel base comúnmente administrado por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%. El nivel base es el nivel que generalmente se recomienda para los síntomas a tratar y puede evaluarse de instrucciones de uso que acompañan el medicamento o que se conoce por la persona con destreza en la técnica de administración de medicamentos para el dolor.
Por ejemplo, bisfosfonato, por ejemplo pamidronato, que típicamente se administra a 90 mg cada cuatro semanas o ácido zoledroínico, que típicamente se administra a una dosis de 4 mg una vez al mes (Terpos et al., 2009) puede reducirse por 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% (o a intervalos de tiempo más grandes que corresponden a esta reducción) o pueden eliminarse.
La administración también puede resultar en niveles de proteína M o FLC de al menos, enfermedad estable, una respuesta menor o una respuesta parcial en el sujeto, de preferencia después de una primera administración .
El inmunoconjugado puede comprender una Región de Enlace de Antigeno (ABR = Antigen Binding Región) contra CD138, y una región de anticuerpo adicional, en donde al menos parte de la región de anticuerpo adicional puede ser de un anticuerpo humano y puede conferir las propiedades de isotipo IgG4.
El inmunoconjugado puede comprender nBT062 o un anticuerpo dirigido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% de identidad de secuencia con nBT062 o puede corresponder a BT062.
El sujeto puede ser un sujeto humano.
El método puede consistir esencialmente de administrar una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado y un portador farmacéutico aceptable, en donde un ingrediente activo de la composición puede esencialmente consistir del inmunoconjugado .
Cualquiera de los métodos aquí descritos puede resultar en una enfermedad estable, una respuesta, en particular una respuesta menor, una respuesta parcial, una muy buena respuesta parcial, una respuesta completa severa o una respuesta completa durable por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ciclos de tratamiento o más en donde los ciclos de tratamiento cada uno comprende aproximadamente 3 semanas con una administración del inmunoconjugado el día 1 de cada ciclo de tratamiento.
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, que comprende (i) identificar la enfermedad como asociada con células diana que expresan CD138, tales como mieloma múltiple y que no responden o responden deficientemente a tratamiento con uno o más agentes citotóxicos, inmunomoduladores tales como lenalidomida y/o inhibidores de proteasoma tales como bortezomib, y (ii) administrar, de preferencia en forma intravenosa al sujeto, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado como se especifica aquí, a una dosis menor a 200 mg/m2 cuando el inmunoconjugado se administra solo o en donde la cantidad efectiva es el equivalente farmacocinético de 200 mg/m2 cuando sé administra con un agente para tratar efectos secundarios, incluyendo efectos secundarios potenciales, en donde el sujeto no responde, o responde deficientemente a tratamiento con uno o más agentes citotóxicos, inmunomoduladores tales como lenalidomida ylo inhibidores de proteasoma tal como bortezomib, y en donde la enfermedad es tratada.
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, que comprende administrar a un sujeto que requiere este tratamiento y que exhibe altos niveles de sCD138, tales como más que 50 ng/ml, más que 60 ng/ml, más que 70 ng/ml, más que 80 ng/ml, más que 100 ng/ml, más que 150 ng/ml, más que 200 ng/ml, más que 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ng/ml, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado como se especifica aquí, en donde una cantidad tan baja como 20 mg/m2 o tan baja como 40 mg/m2 es efectiva para resultar en una respuesta tal como una respuesta menor. La respuesta puede resultar del enlace selectivo del inmunoconjugado . El sujeto puede no responder o responder deficientemente, a tratamiento con agentes citotóxicos, inmunomoduladores tales como lenalidomida y/o inhibidores de proteasoma tales como bortezomib.
El anticuerpo de ingeniería dirigida puede comprender una región de enlace de antígeno (ABR) contra CD138, y una región de anticuerpo adicional, en donde al menos parte de la región de anticuerpo adicional es de un anticuerpo humano y confiere las propiedades de isotipo IgG4.
La enfermedad puede ser mieloma múltiple, en particular mieloma múltiple de relapso o refractario.
La enfermedad que expresa CD138 en células diana también puede seleccionarse del grupo que' consiste de carcinoma de células renales, cáncer endometrial, cáncer cervical, adenocarcinoma de próstata, carcinoma pancreático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, carcinoma mamario, hepato-carcinoma, carcinoma colorectal, carcinoma de colon, carcinoma de células escamosas, cáncer pulmonar en particular carcinoma pulmonar de células escamosas, linfoma no Hodgkin, carcinoma de timo, de útero, urinario o de ovarios.
En modalidades preferidas, el inmunoconjugado hace diana homogéneamente en células diana u objetivo que expresan CD138.
En ciertas modalidades, el anticuerpo dirigido de ingeniería de la presente invención puede (i) consistir esencialmente de región de enlace de antígeno (ABR) contra CD138 de un anticuerpo no-humano, o (ii) comprende una región de enlace de antígeno (ABR) contra CD138, en donde la región de enlace de antígeno es de un anticuerpo no-humano, y una región de anticuerpo adicional, en donde al menos parte de la región de anticuerpo adicional es de un anticuerpo humano.
La ABR puede comprender: (a) región variable de cadena pesada CDR3 que comprende residuos de aminoácidos 99 a 111 de SEQ ID NO: 1, y (b) región variable de cadena ligera CDR3 que comprende residuos aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 2, respectivamente .
La ABR además puede comprender: (a) región variable de cadena pesada CDRl y CDR2 que comprende residuos aminoácidos 31 a 35 y 51 a 68 de SEQ ID NO: 1, y/o (b) región variable de cadena ligera CDRl y CDR2 que comprende residuos aminoácidos 24 a 34 y 50 a 56 de SEQ ID NO: 2, respectivamente.
La región de aminoácidos adicional puede comprender : (a) residuos aminoácidos 123 a 448 de SEQ ID NO: 1, y/o (b) residuos aminoácidos 108 a 214 de SEQ ID NO: 2 , respectivamente y sus mutaciones que (i) mantienen o reducen la citotoxicidad dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad dependientemente de complemento del anticuerpo dirigido de ingeniería y/o (ii) estabilizar el anticuerpo dirigido de ingeniería .
El anticuerpo puede comprender una cadena ligera que tiene al menos aproximadamente 70%, más preferible 80%, 85% o 90%, identidad de secuencia con SEQ ID No: 2 y una cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 70%, más preferible 80%, 85% o 90%, identidad de secuencia con SEQ ID No: 1, y comprende las regiones de enlace de antigeno anteriormente especificadas. ' La molécula efectora puede enlazarse al anticuerpo dirigido de ingeniería por un enlazador. El enlazador puede comprender un enlace disulfuro. La molécula efectora (e.g., DM4) puede proporcionar impedimento estérico entre el anticuerpo dirigido y la molécula efectora. La molécula efectora puede ser al menos un maitansinoide (e.g., DM1, DM3, o DM4) taxano o un CC1065, o su análogo.
El inmunoconjugado puede enlazar CD138 con una variación dirigida de menos de 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% o 50%.
El inmunoconjugado puede en ciertas modalidades de los métodos aquí descritos, comprender: un agente dirigido que hace diana en CD138, que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de inmunoglobulina o una parte de la misma, en donde la cadena pesada de inmunoglobulina o su parte tiene al menos 70% identidad de secuencia con SEQ ID NO:l. Una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina de la parte puede ser una región constante isotipo IgG4.
El agente dirigido del inmunoconj ugado puede comprender una secuencia de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente 70% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. El agente dirigido del inmunoconjugado también puede comprender una secuencia de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 70% identidad de secuencia con SEQ ID NO:l.
La presente invención también se dirige a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los inmunoconj ugados aquí especificados para la inhibición, retardo y/o prevención del crecimiento de tumores y/o diseminación de células de tumor, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
La composición farmacéutica puede incluir agentes citotóxicos como se especifica aquí.
La presente invención también se dirige a un equipo que comprende, en recipientes separados, la composición farmacéutica en una o más formas de dosis y en un recipiente separado, instrucciones de cómo administrar la una o más formas de dosis a un sujeto, en particular a un sujeto humano que lo requiere, por ejemplo como una dosis sencilla repetida u otro régimen de tratamiento aquí discutido .
En particular, en un aspecto de la invención la administración de cualquiera de los inmunocon ugados aqui descritos es para un sujeto o células de este sujeto, en particular un sujeto humano, que se beneficia de dicha administración. El inmunoconjugado también puede emplearse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de este desorden.
La invención además proporciona un inmunoconjugado para tratar una enfermedad en un sujeto asociada con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde el sujeto no responde, o responde deficientemente, a tratamiento con uno o más agentes citotóxicos incluyendo inmunomoduladores y/o inhibidores de proteasoma, y en donde el inmunoconjugado se va a administrar al sujeto, de preferencia en forma intravenosa, en una cantidad de 5 mg/m2 a 200 mg/m2.
Adicionalmente, la invención proporciona el uso de un inmunoconj ugado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto asociado con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde el sujeto no responde, o responde deficientemente, al tratamiento con uno o más agentes citotóxicos que incluyen inmunomoduladores y/o inhibidores de proteasoma, y en donde el inmunoconj ugado se va a administrar al sujeto, de preferencia en forma intravenosa, en una cantidad de 5 mg/m2 a 200 mg/m2.
La invención también proporciona una preparación combinada de un inmunoconjugado y un agente para tratar efectos secundarios adversos, para usos simultáneo, separado o secuencial para tratar una enfermedad en un sujeto asociado con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconj ugado , en donde el sujeto no responde o responde deficientemente, a tratamiento con uno o más agentes citotóxicos que incluyen inmunomoduladores y/o inhibidores de proteasoma, y en donde el inmunoconj ugado se va a administrar al sujeto, de preferencia en forma intravenosa, en un equivalente farmacocinético de 5 mg/m2 a 200 mg/m2 del inmunoconj ugado cuando se administra solo.
Además, la presente invención proporciona el uso de un inmunoconj ugado y un agente para tratar efectos secundarios adversos para la fabricación de una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial para tratar una enfermedad en un sujeto asociado con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconj ugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconj ugado, en donde el sujeto no responde, o responde deficientemente, a tratamiento con uno o más agentes citotóxicos incluyendo inmunomoduladores y uno o más inhibidores de proteasoma, y en donde el inmunoconjugado se va a administrar al sujeto, de preferencia en forma intravenosa, en un equivalente farmacocinético de 5 mg/m2 a 200 mg/m2 del inmunoconj ugado cuando se administra solo.
Adicionalmente, la presente invención proporciona un inmunoconjugado para tratar una enfermedad en un paciente asociado con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconj ugado comprende : (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ü) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunoconj ugado, en donde el paciente exhibe niveles de SCD138 en su plasma de más que 50 ng/ml, y en donde el inmunoconj ugado de preferencia se va a administrar en una cantidad efectiva para proporcionar al menos una respuesta menor.
La presente invención también proporciona el uso de un inmunoconj ugado para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en ^células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunocon ugado, en donde el paciente exhibe niveles de sCD138 en su plasma, mayores a 50 ng/ml, y en donde el inmunocon ugado de preferencia a administrar en una cantidad efectiva para proporcionar al menos una respuesta menor.
En una modalidad preferida, el inmunoconjugado se va a administrar en una cantidad de al menos 20 mg/m2 y más preferible al menos 40 mg/m2.
En una modalidad preferida, los niveles de sCD138 que exhibe el paciente en el plasma es mayor a 60 ng/ml, más que 70 ng/ml, más que 80 ng/ml, más que 100 ng/ml, más que 150 ng/ml, más que 200 ng/ml, o más que 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 ng/ml.
La invención también se dirige a una combinación anticáncer que comprende al menos un agente citotóxico y al menos un inmunocon ugado que comprende un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde (a) la combinación tiene una relación de sinergia mayor a 1, mayor a 1.1, mayor a 1.2, mayor a 1.3, mayor a 1.4, o (b) la combinación tiene una relación de sinergia de aproximadamente 1 y la molécula efectora y el agente citotóxico tienen modos de acción de interferencia, y en donde la combinación de anticáncer es una composición farmacéutica o un equipo que comprende el agente citotóxico como mínimo y el inmunoconjugado de recipientes separados .
El agente citotóxico puede ser un inhibidor de proteasoma, un agente inmunomodulador o anti-angiogénico, un agente de alquilación de ADN o una mezcla de dos más de estos .
El agente citotóxico puede ser bortezomib, talidomida, lenalidomida, melfalan o una mezcla de dos o más de estos.
La molécula efectora y el agente citotóxico de la combinación anticáncer pueden tener modos de acción de interferencia y en donde estos modos de acción involucran de preferencia inhibición de microtúbulos o inducción de freno de ciclo celular (melfalan, bortezomib y lenalidomida o talidomida son agentes citotóxicos que inducen freno de ciclo celular) . En forma alterna, puede haber modos de acción sin interferencia.
Si la combinación anticáncer es parte de la composición farmacéutica, la composición farmacéutica puede comprender al menos un excipiente farmacéutico aceptable.
La combinación anticáncer también puede ser parte de un equipo en el que al' menos un agente citotóxico y el inmunoconjugado como mínimo se almacenan en recipientes separados .
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, que comprende: administrar a un paciente que lo requiere, una cantidad efectiva de la combinación anticáncer aquí mencionada o una combinación anticáncer que comprende al menos un agente citotóxico y al menos un inmunoconjugado que comprende un agente dirigido que hace blanco en células que expresan CD138 y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, y en donde el inmunoconjugado supera un fenotipo refractario de un paciente contra el agente citotóxico.
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, que comprende: administrar a un paciente que lo requiere, una cantidad efectiva de una combinación anticáncer aquí discutida y en donde el inmunoconj ugado supera un fenotipo refractario .
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad proliferativa sin plasma asociada con células diana que expresan CD138, que comprende: administrar a un sujeto que lo requiere o a células de la enfermedad no proliferativa de plasma, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado que comprende: al menos un agente dirigido que hace blanco en células que expresan CD138, y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde CD138 es en el sujeto, expresado en las células diana y en células no diana a niveles comparables o en donde CD138 en el sujeto, se expresa en las células diana a niveles inferiores a las células no objetivo que expresan CD138.
Las células no objetivo que expresan CD138 pueden ser células epiteliales.
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad no proliferativa de plasma asociada con células diana que expresan CD138, que comprende: administrar a un sujeto que lo requiere o a células de la enfermedad no proliferativa de plasma, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado que comprende al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y al menos un molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde las células diana del CD138 desprendido por la enfermedad sobre un periodo de 24 horas, 2, 3, 4, 5, 6 días.
La enfermedad puede ser carcinoma mamario.
La invención además proporciona una preparación combinada de al menos un agente citotoxico y al menos un inmunoconjugado, para uso simultáneo, separado o secuencial para tratar una enfermedad en un sujeto asociado con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora como mínimo para formar el inmunoconjugado, y en donde el sujeto tiene un fenotipo refractario.
Adicionalmente, la invención proporciona el uso de al menos un agente citotóxico y al menos un inmunoconjugado para la fabricación de una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial para tratar una enfermedad en un sujeto asociado con células diana que expresan CD138, en donde el inmunocon ugado comprende: (i) un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138 y (ii) al menos una molécula efectora en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora como mínimo para formar el inmunoconjugado, y en donde el sujeto tiene un fenotipo refractario.
En una modalidad preferida, la combinación del agente citotóxico como mínimo y el inmunoconjugado como mínimo tiene una relación o proporción de sinergia mayor a 1, mayor a 1.1, mayor a 1.2, mayor a 1.3 o mayor a 1.4. En forma alterna, la combinación del agente citotóxico como mínimo y el inmunoconjugado como mínimo tiene una relación o proporción de sinergia de aproximadamente 1 y la molécula efectora y el agente citotóxico tiene modos de acción superpuestos o traslapantes .
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un inmunoconj ugado para tratar una enfe medad no proliferativa de plasma en un sujeto asociado con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (il) al menos un molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunocon ugado, y en donde en el sujeto, CD138 se expresa en las células diana a niveles comparables (equivalentes) a o inferiores a los niveles en los cuales CD138 se expresa en las células no diana.
La invención también proporciona el uso de un inmunoconj ugado para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad no proliferativa de plasma en un sujeto asociada con células diana que expresan CD138, en donde el inmunoconjugado comprende: (i) al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y (ii) al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, y en donde en el sujeto, CD138 se expresa en las células diana a niveles comparables (equivalentes) a o inferiores a los niveles en los cuales CD138 se expresa en células no diana.
La invención también se dirige a un método para tratar una enfermedad no proliferativa de plasma asociada con células diana que expresan CD138, que comprende: administrar a un sujeto que lo requiere, o a células de la enfermedad no proliferativa de plasma, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado que comprende: cuando menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde el inmunoconjugado induce remisión de un tumor sólido. Ésta remisión puede ser una remisión seguida por intervalo de tiempo que está libre de nuevo crecimiento del tumor (remisión completa) . Este intervalo de tiempo puede ser mayor a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas, medio año o 1 año o más.
El tumor sólido puede ser un carcinoma pancreático o un carcinoma mamario.
La enfermedad puede ser carcinoma de células renales, cáncer endometrial, cáncer cervical, adenocarcinoma de próstata, carcinoma pancreático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, carcinoma mamario, hepato carcinoma, carcinoma colorectal, carcinoma de colon, carcinoma de células escamosas, cáncer pulmonar en particular carcinoma pulmonar de células escamosas, linfoma no Hodgkin, carcinoma de timo, de útero, urinario u ovarios. i El tumor sólido puede ser un carcinoma mamario, que es receptor negativo de estrógeno y/o receptor negativo de progesterona .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 proporciona una representación esquemática de nBT062 que tiene moléculas efectoras enlazadas .
La FIGURA 2 es una representación química de BT062.
La FIGURA 3 muestra la conversión de ansamitocina P-3 a maytansinol (se omite la estereoquímica por simplicidad) .
La FIGURA 4 muestra un esquema de síntesis representativa de DM4.
La FIGURA 5 es una representación esquemática de una conjugación de anticuerpo (nBT062 a DM4) .
La FIGURA 6 muestra un análisis del enlace de nBT062-SPDB-DM4, nBTO 62-SPP-DM1 , nBT062-SMCC-DMl y anticuerpo nBT062 a células OPM-2. Diferentes concentraciones de nBT062 y conjugados se suministraron a las células y se midió fluorescencia promedio por análisis FACS.
Las FIGURAS 7 (A) -(D) ilustran citotoxicidad in vitro de nBT062-D x conjugados hacia OLP-8 (CD138+) y células BJAB (CD138") . Las células se cultivaron en placas de fondo plano e incubaron con las concentraciones indicadas de inmunoconjugados por 5 días. Reactivo ST se agrega por 3 horas más para estimar la viabilidad celular. En (D), la actividad citotóxica de nBT062-SPDB-DM4 se analiza en la presencia o ausencia de anticuerpo bloqueador (1 ju M nBT062) .
La FIGURA 8 muestra volúmenes de tumor para ratones individuales tratados con (A) PBS, (B) anticuerpo nBT062, (C) DM4 libre o (D) conjugado no dirigido huC242- DM4 con el tiempo (días) post-inoculación con células de tumor MOLP-8.
La FIGURA 9 muestra volúmenes de tumor para ratones individuales tratados con (A) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 o (D) nBT062-SPP-DMl con el tiempo (dias) posterior a inoculación con células de tumor MOLP-8.
La FIGURA 10 ilustra volumen de tumor promedio (+/- SD) de xenoinjertos de mieloma múltiple humano MOLP-8 en ratones CB.17 SCID con el tiempo (dias) posterior a inoculación.
Las FIGURAS 11A y B muestran actividad anti-tumor de nBT062-DMx contra células de tumor CD138+ MOLP-8 en un modelo de tumor MOLP-8 voluminoso en ratones SCID. El volumen de tumor se da como promedio ( +/- SD) por cada grupo.
La FIGURA 12 es una gráfica que refleja la eficacia anti-tumor de nBT062 que contiene DMx conjugados en el modelo SCIDhu/INA-6 hacia células de mieloma múltiple en el ambiente de médula ósea humana. Receptor IL-6 humano soluble producido por múltiples células de mieloma (shuIL-6R) se empleó como un indicador para carga de tumor. Triángulo: nBT062-SPP-DMl , Cuadrado: nBT062-SPDB-DM4 ; Diamante: vehículo de control.
La FIGURA 13 muestra exterminio por activación inespecífica mediada por nBT062-SPDB-DM4 , in vitro. Células OPM2 positivas a CD138 y células Namawla negativas a CD138 se cultivaron con nBT062-SPDB-DM4 a diferentes concentraciones y la viabilidad celular se midió. Valores OD450 representan una medida para viabilidad celular.
La FIGURA 14 muestra curvas de crecimiento de tumor en un modelo de ratón de xenoinjerto una sola inyección de BT062. Las dosis marcadas con un asterisco (*) se basan en el peso molecular de DM4 enlazado.
La FIGURA 15 muestra la remisión completa de un carcinoma de páncreas de xenoinjerto en ratones tratados con BT062 contra un control.
La FIGURA 16 muestra la remisión completa de un carcinoma mamario de xenoinjerto en ratones tratados con BT062 contra un 'control.
La FIGURA 17 ilustra la rápida eliminación en plasma para dosis en el intervalo de 40 mg/m2 a 120 mg/ra2, mientras que dosis superiores como se ilustra aquí por una dosis de 160 mg/m2, mostraron una eliminación de plasma más cercana al valor esperado.
La FIGURA 18 compara el perfil en plasma de BT062 al de monos tratados a la misma dosis. La comparación aclara que la rápida eliminación de plasma a bajas dosis no puede ser extrapolada de los modelos en animales disponibles y parece ser especifica para los humanos.
La FIGURA 19 muestra los valores cmax medidos de BT062 en comparación con los valores Cmax teóricos.
Las FIGURAS 20 y 21 muestran que los valores Cmax en general son similares sobre varios ciclos de tratamiento.
La FIGURA 22 aclara que la rápida eliminación de plasma no puede ser atribuida a un efecto amortiguador provocado por CD138 soluble.
La FIGURA 23 ilustra un diagrama de tratamiento en sujetos humanos con diferentes dosis de BT062 administradas en el curso de los ciclos de tratamiento indicados, en donde cada ciclo de tratamiento duró 21 días y la dosis respectiva se administró el día 1 de cada ciclo.
La Figura 24 muestra el nivel de proteína M de orina medido para un paciente que recibe 20 mg/m2 a intervalos de tres semanas. Los días 5 a 205 se muestran.
La Figura 25 muestra el nivel de proteína M en suero medido por el paciente que recibe 40 mg/m2 a intervalos de tres semanas. Los días 21 a 119 se muestran.
La. Figura. 26 muestra el nivel de kappa FLC medido para un paciente que recibe 160 mg/m2 a intervalos de tres semanas. Los días 21 a 101 se muestran.
La Figura 27 muestra la concentración en plasma para BT062 en la cohorte de 20 mg/m2 de pacientes.
La Figura 28 muestra los efectos de la terapia de combinación en volumen de tumor medio (TV = Tumor Volume) en un modelo de ratón de xenoinjerto. El resultado muestra los efectos de la combinación de BT062 y lenalidomida .
La Figura 29 muestra el efecto de la terapia de combinación en volumen de tumor medio (TV) en un modelo de ratón de xenoinjerto. El resultado muestra los efectos de la combinación de BT062 y VELCADE.
La Figura 30 muestra el efecto de la terapia de combinación en volumen de tumor medio (TV) en un modelo de ratón de xenoinjerto. El resultado muestra los efectos de la combinación de BT062 y melfalan.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE DIVERSAS Y MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la administración de sujetos, en particular sujetos humanos (pacientes), que lo requieren, de inmunoconjugado que comprenden agentes dirigidos a CD138 aqui descritos y el suministro de la o las moléculas efectoras de los inmunoconjugados en sitios diana y la liberación de una o , varias moléculas efectoras sobre o en el sitio diana, .en particular células, tejidos y/u órganos diana. ' Más particularmente, la presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden estos agentes dirigidos a CD138 y moléculas efectoras potenciales que se enlazan a los agentes dirigidos. Las moléculas efectoras pueden ser activadas por ruptura y/o disociación de la porción de agente dirigido del inmunoconjugado sobre o en sitio objetivo. Los inmunoconjugados pueden administrarse solos o como parte de una combinación anticáncer que incluye un agente citotóxico tal como pero no limitado a, un inhibidor de proteasoma (por ejemplo, bortezomib) , agente anti- angiogénico/agente inmunomodulatorio (por ejemplo, talidomida o lenalidomida) , agente alquilante de ADN (por ejemplo, melfalan) o corticosteroide (por ejemplo, dexametasona) , en donde la combinación anticáncer tiene efectos de sinergia o efectos aditivos inesperados en el tratamiento de cáncer sobre el inmunoconjugado empleado solo en monoterapia, el agente citotóxico empleado solo en monoterapia o ambos.
Los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a un sujeto que requiere tratamiento o a células aisladas de este sujeto que requiere tratamiento. La o las moléculas efectoras pueden liberarse o desprenderse del inmunoconjugado por disociación/ruptura en o dentro de una célula o tejido y/u órgano diana.
En un ejemplo, el inmunoconjugado BT062, que hace diana en células que expresan CD138 mediante el anticuerpo nBT062 y comprende DM4 como una molécula efectora, se administró a un paciente con mieloma múltiple refractario/de relapso cuatro veces en una cantidad de 80 mg/m2 como dosis sencillas repetidas, en donde la duración de cada ciclo de tratamiento fue 21 días con la única dosis/por ciclo que se administra el día uno del ciclo. En este ejemplo, el inmunoconj ugado se administró en forma intravenosa al paciente, de manera tal que pueda mejor concentrarse en y/o dentro de las células de los tumores. Las mediciones de la concentración de plasma de BT062 muestran que en una fase de medición inicial (hasta 2 horas después del fin de administración) valores Cmax para BT062 fueron significativamente inferiores al valor calculado teórico mientras que no se observaron efectos secundarios adversos, sugiriendo que BT062 se concentra en la diana de tumor en vez de agregarse aleatoriamente a CD138 diana y no diana. Un "efecto amortiguador" que resulta de sCD138 puede ser excluido (ver Figura 20) .
En otro ejemplo, el inmunoconjugado BT062 se administra a un paciente con mieloma múltiple refractario/de relapso, diez veces en una cantidad de 20 mg/m2 cada una como dosis sencilla repetida, en donde la duración de cada ciclo de tratamiento fue 21 días con la única dosis/por ciclo que se administra el dia uno del ciclo. En este ejemplo, el inmunoconjugado se administró intravenosamente al paciente de manera tal que pueda mejor concentrarse en y/o dentro de las células de tumor. No se proporcionaron medios adicionales para liberar la molécula efectora del inmunoconjugado . Diez ciclos de tratamiento fueron bien tolerados y al menos pudo lograrse enfermedad estable para estos ciclos de tratamiento.
En otro ejemplo, el inmunoconjugado BT062 se administró a un paciente con mieloma múltiple de relapso cuatro veces en una cantidad de 160 mg/m2 como dosis sencillas repetidas, en donde la duración de cada ciclo de tratamiento fue 21 días con la única dosis/por ciclo que se administra el día uno del ciclo. En este ejemplo, el inmunoconjugado se administró intravenosamente al paciente de manera tal que pudo mejor concentrarse en y/o dentro de las células de tumor. A esta concentración, eliminación de plasma todavía fue inferior a la Cmax teórica, pero no al grado observado con dosis menores. Sin embargo, un fuerte decremento del nivel FLC del suero puede observarse después de un solo 'tratamiento. Una respuesta parcial pudo observarse después de un 2o, 3° y 4o tratamientos.
En ciertos regímenes de tratamiento, la administración" de medicamento que alivia dolor y/o complicaciones de huesos pudo interrumpirse ya que el dolor del paciente disminuyó ante la administración del inmunoconjugado . Como resultado, se evitaron efectos secundarios asociados con estos medicamentos (incluyendo bisfosfonatos y otro medicamento de osteoporosis ) , tal como osteronecrosis de la mandíbula.
Todavía en otro ejemplo, el inmunoconjugado BT062 se administra en forma concomitante a un paciente con mieloma múltiple de relapso, cuatro veces en una cantidad de 120 mg/m2 con una dosis oral diaria de 10 mg del agente Inmunomudulador lenalidomida como dosis sencillas repetidas, en donde la duración de cada ciclo de tratamiento es 21 dias con la única dosis/por ciclo que se administra el día uno del ciclo. En este ejemplo, el inmunoconjugado se administra en forma intravenosa al paciente, de manera tal que pueda mejor concentrarse en y/o dentro de las células de tumor.
En otro ejemplo, el inmunoconjugado BT062 se administra a un paciente que sufre de un tumor pancreático, como dosis sencillas repetidas, en donde la duración de cada ciclo de tratamiento es 21 dias con la única dosis/por ciclo que se administra el día del ciclo. En este ejemplo, el inmunoconj ugado se administra en forma intravenosa al paciente de manera tal que pueda concentrarse mejor en y/o dentro de las células de tumor.
CD138 o syndecan-1 (también descrito como SYNDl; SYNDECAN; SDC; SCD1; CD138 ANTIGEN, número de acceso SwissProt: P18827 humano) es una glicoproteina de membrana que originalmente fue descrita presente en células de origen epitelial, y subsecuentemente se encontró en células hematopoyéticas (Sanderson, 1989) . CD138 tiene un largo dominio extracelular que enlaza con moléculas solubles (por ejemplo, los factores de crecimiento EGF, FGF, HGF) y a moléculas insolubles (por ejemplo, a los componentes de matrices extracelulares de colágeno y fibronectina) a través de cadenas heparan sulfato (Langford, 1998; Yang, 2007) y actúa como receptor para la matriz extracelular . CD138 también media adhesión célula a célula a través de moléculas de enlace de heparina expresadas por células adherentes. Se ha mostrado que CD138 tiene un papel como un co-receptor para factores de crecimiento de células de mieloma (Bisping, 2006) . Estudios de diferenciación de células de plasma muestran que CD138 también debe considerarse como un antigeno de diferenciación (Bataille, 2006) .
En hematopoyesis maligna, CD138 se expresa altamente en la mayoría de las células MM, carcinoma de ovarios, carcinoma de riñon, carcinoma de vesicular biliar, carcinoma de mama, cáncer de próstata, cáncer pulmonar, células de carcinoma · de colon y células de linfomas de Hodgkin y no-Hodgkin, leucemia linfocitica crónica (CLL = Chronic Lymphocytic Leukemia) (Horvathova, 1995), leucemia linfoblástica aguda (ALL = Acute Lymphoblastic Leukemia) , leucemia mieloblástica aguda (AML = Acute Myeloblastic Leukemia) (Seftalioglu, 2003 (a); Seftalioglu, 2003 (b) ) , sarcomas de tejido sólido, carcinomas de colon así como otras malignidades hematológicas y tumores sólidos que expresan CD138 (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al., 1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O'Connell et al., 2004; Orosz and Kopper, 2001) . La expresión de CD138 también se asocia con diferentes tipos de malignidades gastrointestinales (Conejo et al., 2000).
Como se ilustra en la Tabla 1, una cantidad de lineas celulares tumorigénicas existen asociadas con expression/sobre-expresión de CD138.
Linea Origen SensiExpresión celular biliCD138 dad IC50 RFI* Recep- (nM) tores/- célula NCI-H929 MM 0.38 502 788,752 PC-3 Cáncer de 0.79 541 195, 671 próstata U266 MM 1.59 617 782, 987 MOLP-2 MM 1.78 425 161, 064 SK-BR-3 Carcinoma de 2.72 485 444, 350 mama LNCaP Cáncer de 7.39 179 23, 388 próstata CAPAN-2 Carcinoma de 15.51 328 n. d. páncreas PANC-1 Carcinoma de 36.38 34 18,085 páncreas T47D Carcinoma de 89.28 217 42,264 mama Jurkat Linfoma de 39.00 n. 0 células T d.
Tabla 1: Expresión CD138 en diferentes lineas celulares. En el contexto de MM se mostró que la sensibilidad hacia BT062 se correlaciona con una expresión superior de CD138 (índice de fluorescencia relativa, RFI = Relative Fluorescence Index) .
La sensibilidad observada, por ejemplo de las líneas celulares de carcinoma de mama y líneas celulares de carcinoma de páncreas fueron substancialmente menores que las de líneas celulares MM. Sin embargo, como se describe en la sección experimental en modelos de xenoinjerto de ratón utilizando células de pacientes con cáncer de mama y cáncer pancreático, no solo se obtuvieron resultados comparables, sino significativamente mejores que modelos de xenoinjerto comparables para MM. En ambos casos, remisión completa pudo obtenerse eventualmente, mientras que modelos MM comparables mostraron un retraso marcado en crecimiento de tumor, pero no remisión completa.
Mientras que en cáncer pancreático no parece haber diferencia en expresión de ARNm de syndecan-1, entre los tumores tempranos o iniciales y avanzados, en carcinoma mamario, se reportó que CD138 puede perderse con el tiempo como se refleja por tinción IHC débil o carente. Pérdida de expresión CD138 se ha reportado y a menudo se correlaciona con un cambio de expresión, es decir expresión de novo en estroma circundante (Loussouarn, 2008) . Cómo resultado, menos dianas para agentes dirigidos a CD138 pueden esperarse con el tiempo.
Otros cánceres que se han mostrado positivos para expresión CD138 son muchos adenocarcinomas de ovarios, carcinomas de células de transición de vejiga, carcinomas de células claras de riñon, carcinomas pulmonares de células escamosas; y cánceres uterinos (ver, por ejemplo, Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).
El tratamiento de mieloma múltiple activo (sintomático) y desórdenes plasmaproliferativos relacionados habrán de servir como un ejemplo de enfermedades que pueden tratarse por inmunoconjugados de la presente invención.
Desórdenes plasmaproliferativos como se emplea aquí, significan desórdenes hematológicos y/o de células de plasma tales como MGUS, SMM, MM Activo (sintomático) , Macroglobulinemia de Waldenstróm, plasmacitoma solitario, amiloidosis AL sistémica y síndrome de POEMS .
Mieloma múltiple (MM) se refiere a una proliferación maligna de células de plasma que típicamente se origina en la médula ósea, involucra primordialmente el esqueleto de un paciente y presenta características clínicas que se atribuyen a los sitios particulares de participación y anormalidades en formación de proteínas de plasma. La condición usualmente se caracteriza por numerosas acumulaciones nodulares o focos difusos de células de plasma anormales o malignas en la médula de diversos huesos (en especial el cráneo) , provocando palpable hinchamiento de los huesos, y ocasionalmente en sitios extraesqueléticos . Ante examen radiológico, las lesiones de huesos pueden tener una apariencia "punzonada" característica. Las células involucradas en el mieloma típicamente producen proteínas anormales y/o niveles de proteínas anormales en el suero y en la orina. La enfermedad típicamente se desarrolla gamopatía monoclonal de significancia no determinada ( GUS = Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance ) a mieloma múltiple indolente (SMM = Smoldering Múltiple Myeloma) a mieloma múltiple activo (MM = Active Múltiple Myeloma) . Síntomas de estas condiciones varían, pero pueden incluir hipercalcemia, insuficiencia renal, fatiga, anemia, dolor de huesos, fracturas espontáneas, incrementada frecuencia o duración de infección, o color u olor anormal de la orina. Cuando la presente invención se refiere a Mieloma Múltiple se refiere a (MGUS), mieloma múltiple indolente (SMM) y mieloma múltiple activo (MM) asi como otra proliferación maligna de células de plasma que pueden desarrollarse eventualmente en MM activo.
MGUS, una condición de precursor clínicamente benigno de MM es más común que MM, ocurriendo en 1% de la población con más de 50 años de edad y 3% de aquellos con más de 70 años de edad (Greipp and Lust, 1995) . Es importante distinguir pacientes con MGUS de aquellos con MM, ya que los pacientes de MGUS pueden ser observados con seguridad sin recurrir a terapia.
Sin embargo, durante seguimiento a largo plazo, de 241 pacientes con MGUS, 59 pacientes (24.5%) continúan desarrollando MM o un desorden relacionado (Ver Kyle et al. , 1993) .
El término gamopatía se refiere a una perturbación primaria en síntesis de inmunoglobulina de un paciente .
La gamopatía monoclonal se refiere a cualquiera de un grupo de desórdenes que se asocian típicamente con la proliferación de un solo clon de células de plasma o linfoides (normalmente visibles en electroforésis de proteínas de suero (SPEP = Serum Protein ElectroPhoresis ) como un solo pico) y caracterizado por la presencia de inmunoglobulina monoclonal en el suero u orina de un paciente .
MM indolente (SMM = Smoldering M) se ha reportado que precede al inicio de mieloma múltiple sintomático en los mayores. Mieloma múltiple indolente a menudo se considera como una fase avanzada de MGUS; incluso al tiempo de progresión, mieloma múltiple evolucionado de mieloma múltiple indolente usualmente carece de lesiones osteoliticas u otras características cardinales de mieloma múltiple sintomático.
Síntomas clínicos de MM incluyen anemia, hipercalcemia, insuficiencia renal y lesiones de huesos líticas. Distinciones en el curso y severidad de la enfermedad conforme se desarrolla gamopatía monoclonal de significancia no determinada (MGUS) ' a mieloma múltiple indolente (SMM) a mieloma múltiple (MM) se proporcionan en la Tabla 2 siguiente. La tabla también resume métodos de detección, diagnóstico y supervisión de estas condiciones. Estos síntomas y técnicas son familiares para aquellos con destreza en la especialidad.
TABLA 2 Comparación de Características Clínicas de MM, SMM, o MGUS Características MM SMM MGUS Células de plasma de médula >=10% >=10% <10% Proteína M de >=3 suero >=3 g/dL g/dL <3 g/dL <1 g/24 <1 g/24 Bence-Jones >=1 g/24 h h h Proteína en orina Si Si Si usualmente Puede Au¬ Anemia presente ser sente Hipercalcemia, insuficiencia Puede estar renal presente ausente ausente Lesiones de hueso Usualmente líticas presente ausente Ausente MM = mieloma múltiple SMM = mieloma múltiple indolente MGUS = gamopatia monoclonal de significancia indeterminada Etapas de clasificación por características clínicas y severidad de mieloma múltiple Etapa de avance de enfermedad Etapa I (MM activo) Relativamente pocas células de cáncer se diseminan a través del cuerpo. El número de glóbulos rojos y la cantidad de calcio en la sangre son normales.
No se encuentran tumores (plasmacitomas ) en el hueso. La cantidad de proteina M en la sangre u orina es muy baja. Puede no haber síntomas de enfermedad.
Etapa II (MM activo) Un número moderado de células de cáncer se ha diseminado a través del cuerpo Etapa III (MM activo) Una cantidad relativamente grande de células de cáncer se ha diseminado a través del cuerpo .
Puede haber uno o más de los siguiente: Una disminución en el número de glóbulos rojos, provocando anemia.
La cantidad de calcio en la sangre es muy alta, debido a que los huesos se dañan.
Más de tres tumores óseos (plasmacitomas ) se encuentran .
Altos niveles de proteina M se encuentran en la sangre u orina.
Caracteristicas clínicas de MM 1 Hiperealeemia Insuficiencia renal Anemia Proteina monoclonal : SPEP (electroforésis de proteína de suero) SPIEP (inmunoelectroforésis de proteína de suero) Inmunoelectroforésis de proteína en orina (proteína Bence - Jones protein) Diagnóstico de MM >10% de células de plasma en médula o agregados en biopsia o un plasmacitoma Proteina monoclonal : Proteína M de suero >3 g/dl o Proteína M en orina ieloma múltiple activo (MM) se reconoce típicamente en forma clínica por la proliferación de células de plasma malignas en la médula ósea de un paciente. Estas células de plasma neoplásticas producen inmunoglobulinas y evolucionan de linfocitos B. Las inmunoglobulinas que se producen por las células de plasma pueden ser detectadas en el suero de sangre y/u orina de un paciente por prueba de electroforésis .
Como se indica en la Tabla 2, la medición de proteina M de suero es una herramienta importante para estimar MM en diferentes etapas.
"Proteina M" se refiere a una proteina monoclonal que típicamente se visualiza como una banda estrecha en gel electroforético, o un arco anormal en inmunoelectroforésis . Representa una proliferación de inmunoglobulina homogénea producida por células de clon que se originan de una célula común sencilla, por ejemplo una inmunoglobulina monoclonal caracterizada por una cadena pesada de una sola clase y sub-clase, y cadena ligera de un solo tipo (también referido como pico M y más ampliamente como paraproteína ) .
"Electroforésis de proteina en suero" (SPE o SPEP) y "inmunofijación por electroforésis" (IFE) pueden detectar inmunoglobulina monoclonal, que se produce en varios desórdenes proliferativos de células de plasma incluyendo mieloma múltiple (MM) . A lo ancho de la población, hasta 61% de estos hallazgos no están asociados con síntomas clínicos, permitiendo un diagnóstico de monogamopatía de significancia no determinada (MGUS) . SPE y IFE sin embargo no detectan todas las inmunoglobulinas monoclonales, particularmente cuando solo se secretan cadenas ligeras.
Aquellas "moléculas de cadena ligera libres" (FLCs = "Free Light Chain Molecules") incluyen cadenas ligeras ? y ?. Las células de plasma producen uno de los cinco tipos de cadenas pesadas junto con cualquiera de moléculas ? o ?. Esto normalmente es en forma aproximada 40% de exceso de producción de cadena ligera libre sobre síntesis de cadena pesada. Células de plasma secretan cadenas ligeras libres (FLC, kappa o lambda) además de moléculas de inmunoglobulina intactas, y en niveles de cadena ligera en suero- se determinan por las proporciones relativas de síntesis (?>?) y excresión renal (?>?) . En la presencia de una inmunoglobulina monoclonal, las proporciones ?:? ya pueden ser superiores o menores que el intervalo normal, dependiendo de la clase de FLC involucradas. La vida media en suero de FLCs es de 2-6 horas, en comparación 5 días para IgA, 6 días para IgM y 21 días para IgG. De esta manera, la medición de niveles de FLC en suero permite una evaluación bastante más rápida de respuesta de tumor a la terapia que la medición de inmunoglobulina intacta. Igualmente, mediciones de FLC en suero permiten detección temprana de relapso.
Enfermedades no proliferativas de plasma también se asocian con expresión de CD138.
Carcinoma pancreático La mayoría de casos comprenden tipo exócrino. La mayoría de estos cánceres exócrinos representan adenocarcinoma ductal (además subtipos más rápidos comprenden tumores císticos, tumores de células acinares y sarcoma) . Cáncer endocrino del páncreas representa un tumor que produce hormona.
Carcinoma in situ se refiere a la etapa temprana de cáncer, cuando está confinada a la capa de células en donde empezó. En cáncer de mama, in situ significa que las células de cáncer permnecen confinadas a ductos (carcinoma ductal in situ) o lóbulos (carcinoma . lobular in situ). No han crecido en tejidos más profundos en la mama o diseminado a otros órganos en el cuerpo, y en ocasiones se refieren como cánceres de mama no-invasivos o pre-invasivos.
Carcinoma invasivo (infiltrante) .
Las células exócrinas y células endocrinas del páncreas forman tipos completamente diferentes de tumores.
Tumores exócrinos Estos son por mucho, el tipo más común de cáncer de páncreas y la mayoría de los tumores exócrinos pancreáticos son malignos. Aproximadamente 95% de cánceres del páncreas exócrino son adenocarcinomas (un adenocarcinoma es un cáncer que empieza en células de glándulas) . Estos cánceres usualmente empiezan en los ductos del páncreas, pero en ocasiones se desarrollan de céulas que constituyen las enzimas pancreáticas (carcinomas de células acinares) .
Tipos menos comunes de cánceres ductales del páncreas exócrino incluyen carcinomas adenoescamosos, carcinomas de células escamosas y carcinomas de células gigantes .
Tumores endocrinos Tumores de páncreas endocrino no son comunes. Como grupo, se conocen como tumores neuroendócrinos pancreáticos (NETs = neuroendocrine tumors), o en ocasiones i como tumores de células de isleta. Hay varios subtipos de tumores de células de isletas. Cada uno se nombra de acuerdo con el tipo de célula productora de hormona en la que empieza: El sistema principal empleado para describir las etapas de cánceres de páncreas exócrino es el sistema TNM del Comité Conjunto Americano de Cáncer (AJCC = American Joint Committee on Cáncer (AJCC) como se dispone por la Sociedad Americana de Cáncer (ACS = American Cáncer Society) . El sistema TNM para clasificación contiene 3 partes clave de información: T describe el tamaño del o de los tumores primarios, medidos en centímetro (cm) , y si el cáncer se ha diseminado dentro del páncreas o a órganos cercanos. Se hacen distinciones entre TX, TO, TI, T2, T3 y T4, en donde un número superior indica avance de la enfermedad.
N describe la diseminación a nodos linfáticos cercanos (regional) . Las categorías N incluyen NX, NO y NI.
M indica si el cáncer se ha sometido a metástasis (diseminado) a otros órganos del cuerpo. (Los sitios más comúnes de cáncer pancreático diseminados son el hígado, pulmones, y peritoneo - el espacio alrededor de los órganos digestivos) . Categorías M incluyen: MX, MO y MI .
Después ..que las categorías T, N y M se han determinado, esta información se combina para asignar una etapa, un proceso denominado agrupamiento por fases o etapas .
Etapa 0 (Tis, NO, MO) : El tumor se confina a las capas superiores de células de ductos pancreáticos y no ha invadido tejidos más profundos. No se ha diseminado fuera del páncreas. Estos tumores en ocasiones se refieren como carcinoma pancreático in situ o neoplasia intraepitelial pancreática III (Panln III) .
Etapa IA (TI, NO, MO) : El tumor está confinado al páncreas y tiene menos de 2 cm en tamaño. No se ha diseminado a nodos linfáticos cercanos o sitios distantes.
Etapa IB (T2, NO, MO) : El tumor se confina al páncreas y es mayor que 2 cm en tamaño. No se ha diseminado a nodos linfáticos cercanos o sitios distantes.
Etapa IIA (T3, NO, MO) : El tumor crece fuera del páncreas pero no en grandes vasos sanguíneos. No se ha diseminado a nodos linfáticos cercanos o sitios distantes.
Etapa IIB (Tl-3, NI, MO) : El tumor ya está confinado al páncreas o creciendo fuera del páncreas pero no en grandes vasos sanguíneos o nervios mayores cercanos . Se ha diseminado a nodos linfáticos cercanos pero no a sitios distantes.
Etapa III (T4, Cualquier N, MO) : El tumor crece fuera del páncreas en grandes vasos sanguíneos o nervios mayores cercanos. Puede o no haberse diseminado a nodos linfáticos cercanos. No se ha diseminado a sitios distantes .
Etapa IV (Cualquier T, Cualquier N, MI) : El cáncer se ha diseminado a sitios distantes.
Aunque formalmente no forma parte del sistema TNM, otros factores también son importantes para determinar pronóstico (perspectiva) . El grado de cáncer (qué tan anormales serían las células bajo el microscopio) , en ocasiones se cita en una escala de Gl a G4, con cánceres Gl que se ven como las células más semejantes a normales y que ) tienen la mejor perspectiva.
Para pacientes que se han sometido a cirugía, otro factor importante es la extensión de la resección - si se retiró o no todo el tumor. Esto en ocasiones se cita a escala de RO (en donde todo tumor visible y microscópico se retiró) a R2 (en donde algún tumor visible no pudo retirarse ) .
Desde un punto de vista práctico, qué tan lejos se ha diseminado el cáncer a menudo no puede ser determinado en forma precisa sin cirugía. Esta es la razón por la que los doctores a menudo utilizan un sistema de clasificación más simple, que divide los cánceres en grupos con base en si o no es probable que puedan ser retirados quirúrgicamente. Estos grupos se denominan resecables, o que pueden ser operados, avanzados localmente (no resecables), y metastásicos . Estos términos pueden emplearse para describir tanto cánceres pancreáticos exócrinos como endocrinos.
Resecable: Si el cáncer solo está en el páncreas (o se ha diseminado justo más allá de él) y el cirujano puede retirar el tumor, se denomina resecable.
Avanzado localmente (no resecable) : Si el cáncer no se ha diseminado aún a órganos distantes pero todavía no puede ser retirado por completo con cirugía, se denomina avanzado localmente . A menudo la razón por la que el cáncer no puede retirarse es debido a que demasiado del mismo está presente en vasos sanguíneos cercanos.
Metastásico: cuando el cáncer se ha diseminado a órganos distantes, se denomina metastásico. Todavía puede realizarse cirugía, pero la meta sería aliviar los síntomas no curar el cáncer.
Cánceres neuroendócrinos pancreáticos no se clasifican como los cánceres del páncreas exócrino. Por el contrario, las estadísticas se descomponen en etapas diferentes: localizado (solo en el páncreas), regional (diseminado a tejidos o nodos linfáticos cercanos) , y distante (diseminado a sitios distantes, tales como el hígado) .
Tumores de vejiga se agrupan por la forma en la que las células de cáncer se ven al microscopio.
Carcinoma de células de transición (también denominado carcinoma urotelial) es por mucho el tipo más común de cácer de vejiga. Entre este grupo también están subtipos. Se nombran dependiendo de la forma de las células y si tienden a diseminarse e invadir otros órganos. (Si es probable que crezcan más profundos dentro de la pared de la vejiga se denominan invasivos, si no es probable que no sean invasivos) . Estos tumores se dividen en grados basados en como se ven las células al microscopio. Si las células se ven más como células normales, el cáncer se denomina un cáncer de bajo grado. Cuando las células tienen un aspecto muy anormal, el cáncer es de alto grado. Cánceres de bajo grado tienden a crecer más lentamente y tienen un mejor resultado que los cánceres de grado superior.
También se incluyen en la definición, carcinoma de células escamosas (no es común; usualmente invasivo) ; adenocarcinoma (no es común; casi todos son invasivos) ; células pequeñas (raro). Otros cánceres de vejiga raros también se incluyen en esta definición.
Cáncer de vejiga también se clasifica: Etapa Oa (Ta, NO, MO) : El cáncer es un carcinoma papilar no invasivo. Tiene crecimiento hacia el centro hueco de la vejiga pero no tiene crecimiento al músculo o tejido conectivo de la pared de la vejiga.
No se disemina a los nodos linfáticos o sitios distantes .
Etapa OÍS (Tis, NO, MO) : El cáncer es plano, carcinoma no invasivo, también conocido como carcinoma plano in situ (CIS = carcinoma in situ) . El cáncer crece en la capa de revestimiento de la vejiga solamente. Ni tiene crecimiento hacia dentro a la parte hueca de la vejiga ni ha invadido el músculo o tejido conectivo de la pared de la vejiga. No se ha diseminado a los nodos linfáticos o sitios distantes. Etapa I (TI, NO, MO) : El cáncer ha crecido en la capa de tejido conectivo bajo la capa de revestimiento de la vejiga sin crecimiento en la capa gruesa de músculo en la pared de la vejiga. El cáncer no se ha diseminado a los nodos linfáticos o a sitios distantes.
Etapa II (T2 , NO , MO) : El cáncer ha crecido dentro de la capa de músculo grueso de la pared de la vejiga pero no ha pasado completamente a través del músculo para llegar a la capa de tejido graso que circunda a la vejiga. El cáncer no se ha diseminado a los nodos linfáticos o a sitios distantes.
Etapa III (T3 o T4a, NO, MO) : El cáncer ha crecido completamente a través de la vejiga dentro de la capa de tejido graso que circunda a la vejiga (T3) . Puede haberse diseminado a la próstata, útero o vajina (T4a) . No crece dentro de la pared pélvica o abdominal. El cáncer no se ha diseminado a nodos linfáticos o a sitios distantes.
Etapa IV (T4b, NO, MO) o (cualquier T, N 1 a 3, MO) o (cualquier T, cualquier N, MI) : El cáncer se ha diseminado a través de la pared de la vejiga a la pared pélvica o abdominal (T4b) y/o se ha diseminado a nodos linfáticos (Nl-3) y/o a sitios distantes tales como huesos, hígado o pulmones (Mi). ( Tipos de carcinoma de vesícula biliar Más de 9 de 10 cánceres de vesícula biliar son adenocarcinoma . Un adenocarcinoma es un cáncer que empieza en las células con propiedades tipo glándula que revisten muchas superficies internas y externas del cuerpo (incluyendo el interior del sistema digestivo) .
Un tipo de adenocarcinoma de vesícula biliar que merece atención especial se denomina adenocarcinoma papilar o solo cáncer papilar. Estos son cánceres de vesícula biliar cuyas células se disponen en proyecciones tipo dedos cuando se ve al microscopio. En general, los cánceres papilares no es probable que crezcan dentro del hígado o nodos linfáticos. cercanos. Tienden a tener un mejor pronostico (perspectiva) que la mayoría de otros tipos de adenocarcinomas de vesícula biliar. Aproximadamente 6% de todos los cánceres de vesícula biliar son adenocarcinomas papilares .
Hay otros tipos de cáncer que pueden desarrollarse en la vesícula biliar, tales como carcinomas adenoescamosos , carcinomas de células escamosas y carcinomas de células pequeñas, pero estos no son comunes.
Las siguientes etapas de carcinomas de vesícula biliar se distinguen con base en el sistema TNM de AJCC: Etapa 0: Tis , NO, M0 : Este es un pequeño cáncer solo en la capa epitelial de la vesícula biliar. No se ha diseminado fuera de la vesícula biliar.
Etapa IA: TI (a o b) , NO, MO : El tumor crece en la lamina propria (Tía) o la capa muscular (Tlb) . No se ha diseminado fuera de la vesícula biliar.
Etapa IB: T2, NO, MO : El tumor crece dentro del tejido fibroso perimuscular. No se ha diseminado fuera de la vesícula biliar.
Etapa IIA: T3, NO, MO : El tumor se extiende a través de la capa serosa y/o directamente crece dentro del hígado y/o una o más estructuras cercanas. No se ha diseminado a los nodos linfáticos o a tejidos u órganos lejanos de la vesícula biliar.
Etapa IIB: Ti a T3, NI, MO : Además de cualquier crecimiento en la vesícula biliar, el tumor se ha diseminado a nodos linfáticos cercanos (NI) . No se ha diseminado a tejidos u órganos lejanos de la vesícula biliar .
Etapa III: T4, cualquier N, MO : El tumor invade los vasos sanguíneos principales que dirigen dentro del hígado o ha alcanzado a más de un órgano cercano diferente al hígado. Puede o no haberse diseminado a los nodos linfáticos. No se ha diseminado a tejidos u órganos alejados de la vesícula biliar.
Etapa IV: Cualquier T, cualquier N, MI: El tumor se ha diseminado a tejidos u órganos lejanos de la vesícula biliar .
Carcinoma mamario Un adenocarcinoma se refiere en general a un tipo de carcinoma que empieza en tejido glandular (tejido que produce y secreta una sustancia) . En el contexto de cáncer de mama, los ductos y lóbulos de la mama son tejido glandular, de manera tal que los cánceres que empiezan en estas áreas a menudo se denominan adenocarcinomas . Hay varios tipos de cáncer de mama, aunque algunos de ellos son bastante raros. En algunos casos, un solo tumor de mama puede tener una combinación de estos tipos o tener una mezcla de cáncer invasivo e in situ.
¦ Carcinoma ductal in'situ (DCIS; también conocido como carcinoma intra ductal) es el tipo más común de cáncer de mama no invasiva.
Carcinoma ductal invasivo (o infiltrante) (IDC = invasive ductal carcinoma) es el tipo más común de cáncer de mama. Carcinoma ductal invasivo (o infiltrante) (IDC) empieza en un pasaje de leche (ducto) de la mama, rompe la pared del ducto y crece dentro del tejido graso de la mama. En este punto puede ser capaz de diseminarse (metástasis) a otras partes del cuerpo a través del sistema linfático y la corriente sanguínea. Aproximadamente 8 a 10 cánceres de mama invasivos son carcinomas ductales infiltrantes.
Pacientes IDC revelan expresión de CD138 (Loussouarn et al., 2008).
Cáncer de mama triple negativo describe cánceres de mama (usualmente carcinomas ductales invasivos) cuyas células carecen de receptores de estrógeno y receptores de progesterona, y no tienen un exceso de la proteína HER2 en sus superficies. Cánceres de mama triple negativos tienden a crecer y diseminarse más rápidamente que la mayoría de los otros tipos de cáncer de mama. Debido a que las células de tumor carecen de estos ciertos receptores, ni terapia de hormonas ni fármacos que hacen diana en HER2 son efectivos contra estos cánceres (aunque la quimioterapia todavía puede ser útil, de requerirse) .
Algunos otros cánceres- de mama . que caen bajo el término "carcinoma mamario" son cáncer de mama inflamatorio, carcinoma médular, carcinoma metaplástico, carcinoma mucinoso, carcinoma tubular, carcinoma papilar, carcinoma cístico adenoide (carcinoma adenocístico) , tumor phyllodes .
Cirugía, radiación o quimioterapia constituyen terapias de cáncer estándar. Terapia de hormonas se emplea en ocasiones. La terapia de hormonas es una forma de terapia sistémica. Es más a menudo empleada como una terapia adyuvante para ayudar en reducir el riesgo de recurrencia de cáncer después de cirugía, aunque puede emplearse como tratamiento neoadyuvante por igual. También se utiliza para tratar cáncer que ha regresado después de tratamiento o se ha diseminado. Estrógeno promueve el crecimiento de aproximadamente 2 de 3 cánceres de mama -aquellos que contienen receptores de estrógeno (cánceres ER-positivos ) y/o receptores de progesterona (cánceres PR-positivos) . Debido a esto, varios enfoques a bloquear el efecto de estrógeno o reducir los niveles de estrógeno, se emplean para tratar cánceres de mama ER-positivos y PR-positivos. Sin embargo, terapia de hormonas es ineficaz para pacientes que carecen de ERs o PRs .
Carcinoma mamario también sigue este sistema de clasificaciones : Etapa 0: Células .atipicas no se han diseminado fuera de los ductos o lóbulos, los órganos productores de leche, dentro del tejido de mama circundante. Referido como carcinoma in situ, se clasifica en dos tipos: "Carcinoma ductal In Situ" (DCIS), que es un cáncer muy temprano que es altamente tratable y es de sobrevivencia y "Carcinoma Lobular In Situ" (LCIS) , que no es un cáncer sino un indicador que identifica a una mujer que tiene un riesgo incrementado en desarrollar cáncer de mama.
Etapa I: El cáncer no es más grande que dos centímetros (aproximadamente una pulgada) y no se ha diseminado a nodos linfáticos circundantes o fuera de la mama .
Etapa II: Ésta etapa se divide en dos categorías de acuerdo ' con el tamaño de tumor y si o no se ha diseminado a los nodos linfáticos: Cáncer de mama Etapa II A — el tumor tiene menos de dos centímetros y se ha diseminado hasta tres nodos linfáticos de axila auxiliares. 0, el tumor ha crecido más de dos centímetros, pero no más de cinco centímetros y no se ha diseminado a los nodos linfáticos circundantes.
Cáncer de mama Etapa II B — el tumor ha crecido entre dos y cinco centímetros y se ha diseminado hasta tres nodos linfáticos axilares auxiliares. O, el tumor es más grande que cinco centímetros, pero no se ha diseminado a los nodos linfáticos circundantes.
Etapa III: Esta etapa también se divide en dos categorías : Cáncer de mama Etapa III A — el tumor es más grande que dos centímetros pero más pequeño que cinco centímetros y se ha diseminado hasta nueve nodos linfáticos axila auxiliares.
Cáncer de mama Etapa III B — el cáncer se ha diseminado a tejidos cerca de la mama incluyendo la piel, pared de pecho, costillas, músculos o nodos linfáticos en la pared del pecho o sobre la clavícula.
Etapa IV: Aquí, el cáncer se ha diseminado a otros órganos o tejidos, tales como hígado, pulmones, cerebro, sistema esquelético o nodos linfáticos cerca de la clavícula .
Cáncer pulmonar Hay 4 tipos de tumores pulmonares neuroendocrinos, es decir carcinoma neuroendocrino de grandes células, tumor carcinoide atípico, tumor carcinoide típico y cáncer pulmonar de células pequeñas. Los tumores carcinoides son tumores que empiezan de células del sistema neuroendocrino difuso. Tumores carcinoides típicos y atípicos se ven diferentes al microscopio. Carcinoides típicos crecen lentamente y solo raramente se diseminan más allá de los pulmones y aproximadamente 9 de 10 carcinoides de pulmón son carcinoides típicos.
Para propósitos de tratamiento dos tipos principales de cáncer pulmonar, que son tratados de manera muy diferentemente, se distinguen, es decir cáncer pulmonar de células pequeñas (SCLC = Small Cell Lung Cáncer) y cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC = Non-Small Cell Lung Cáncer) . Si el cáncer tiene características de ambos tipos, se denomina cáncer de células grandes/células pequeñas mixtas.
Aproximadamente 10% a 15% de todos los cánceres pulmonares son el mismo tipo de célula. Otros nombres para SCLC son carcinoma microcitico y carcinoma no diferenciado de células pequeñas .
Este cáncer a menudo empieza en los bronquios cerca del centro del pecho. Aunque las células de cáncer son pequeñas, pueden dividirse rápidamente, forman grandes tumores, y se diseminan a los nodos linfáticos y otros órganos a través del cuerpo. La cirugía raramente es una opción y nunca es el único tratamiento suministrado. Tratamiento ncluye agentes citotóxicos, tales como fármacos para determinar la enfermedad amplia/extensa.
Hay 3 sub-tipos de NSCLC, es decir carcinoma de células escamosas; adenocarcinoma; carcinoma de células grandes (no diferenciado) .
Clasificación de cáncer pulmonar de células no pequeñas El sistema empleado para clasificar cáncer pulmonar de células no pequeñas es el sistema del conjunto americano para cáncer (AJCC = American Joint Committee on Cáncer) . Las clasificaciones se describen utilizando números Romanos de 0 a IV (0 a 4) . Algunas clasificaciones además se dividen en A y B. Como regla, entre menor sea el número menos se ha diseminado el cáncer. Número superior, tal como etapa IV (4), significa un cáncer más avanzado.
Un sistema de clasificación respectivo, incluyendo las Clases I a IV, también se desarrolló' para carcinoma de células escamosas (cáncer de cabeza y cuello) .
Cánceres de Clase I son cánceres localizados y usualmente curables, clase II y III, típicamente son avanzados localmente y/o se han diseminado a los nodos linfáticos locales, y los cánceres de Clase IV usualmente son metastáticos (que se han diseminado a partes distantes del cuerpo) y en general se consideran inoperables.
El tratamiento en el contexto de la presente invención incluye evitar o frenar la progresión, estabilizar el estado de enfermedad, remitir la enfermedad 0 mejorar uno o más síntomas de un desorden asociado con células que expresan CD-138. El tratamiento de esta manera incluye evitar o frenar el aumento de severidad o la remisión del desorden. En el caso de MM generalmente solo pacientes con MM activo clase II o III reciben terapia primaria (pacientes de Clase I con SMM inicialmente solo se observan en intervalos de 3 a 6 meses) , un tratamiento de acuerdo con la presente invención no solo incluye tratamiento por ejemplo de cualquier clase activa de MM, sino también incluye el tratamiento de formas de estados de enfermedad que preceden el estado de enfermedad tradicionalmente tratado. El tratamiento en particular también incluye evitar la progresión de un estado de enfermedad al siguiente: en el caso de MM, esto por ejemplo sería la forma de progresión de MGUS a SMM o de SMM a clase 1 MM activo u otra clase de MM. En el caso de cánceres de páncreas exocrino, por ejemplo una progresión de la Clase I a Clase II, incluyendo cualquier empeoramiento como se refleja por las categorías establecidas por AJCC dentro de las clases, por ejemplo de IA a IB. Sin embargo, el término también incluye mantener el estatus quo, tal como mantener enfermedad estable y, como se discute a continuación, producir ciertas respuestas en el paciente tratado. Un paciente también se "trata" exitosamente si el paciente muestra reducción observable y/o medible en o en la ausencia de ínter alia, uno o más de los siguientes: reducción en el número de células de cáncer o ausencia de las células de cáncer; reducción en el tamaño de tumor; inhibición (es decir, frenar en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células dé cáncer en órganos periféricos incluyendo la diseminación de cáncer dentro del tejido suave y hueso; inhibición (es decir, frenar en cierta medida de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibición, en cierta medida de crecimiento de tumor; y/o alivio en cierta medida de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducir la morbilidad y mortalidad, y mejora en la calidad de aspectos de la vida. En general, un efecto de un cierto tratamiento en el estado de enfermedad de un paciente puede supervisarse, en el caso de M , al medir los niveles de proteína M en el suero y/u orina del paciente y/o los niveles FLC en el suero y/u orina del paciente. En el caso de otros desordenes asociados con células que expresan CD-138, se miden otros parámetros para estimar el efecto de un tratamiento de acuerdo con la presente invención. CRP es un parámetro de inflamación no especifico para supervisión clínica de cáncer. Por nombrar solo unos cuantos, para cáncer pancreático, parámetros relevantes que pueden medirse son CA 19-9 (antígeno en carbohidrato 19.9, un marcador de tumor a menudo elevado en cáncer pancreático) , bilirubina, o proteína C-reactiva. Además, la formación de imagen tal como sonografía, CT, MRT se emplea. En cáncer de cabeza y cuello, biomarcadores que dependen del tipo de tumor se emplean (por ejemplo, SCC para carcinoma de células escamosas, NSE : para célula erkel, CEA); en carcinoma de mama, . la expresión de CA 15-3Her2 y la expresión de Cadherina pueden emplearse como marcadores, mientras que el tratamiento supervisado por marcadores de suero tales como enolasa específica de neuronas (NSE = Neuron Specific Enolase) .
El antígeno de tumor de vejiga (BTA= Bladder Tumor Antigen) y las pruebas NMP22 pueden emplearse junto con- citoscopía (utilizando un tubo iluminado delgado para observar la vejiga) para diagnosticar la condición en sujetos sintomáticos. Estas pruebas también se utilizan para dar seguimiento a algunos pacientes después de tratamiento, aunque la citoscopia y citología de orina (utilizando un microscopio para buscar células de cáncer en la orina) todavía se recomiendan como las pruebas estándar para diagnóstico y seguimiento. Las pruebas ??? y NMP22 a menudo se emplean entre citoscopías. Valores normales pueden permitir que se realice citoscopia menos a menudo. Sin embargo, estas pruebas no pueden reemplazar a la citología y citoscopia de orina.
Para cáncer de vejiga avanzado, algunos de los marcadores empleados para otros cánceres tales como CEA, CA 125, CA 19-9, y TPA pueden ser elevados y pueden emplearse para dar seguimiento a los pacientes durante y después de tratamiento. Para cáncer pulmonar, no existen marcadores establecidos, pueden elevarse, CEA y NSE.
Células de tumor, tales como células de mieloma o células de carcinoma mamario se conoce que desprenden CD138. La pérdida de CD138 de superficies está correlacionada con un mal pronóstico en mieloma. Altos niveles de CD138 soluble también se han detectado en otras indicaciones oncológicas tales como cáncer de catieza y cuello o pulmonar (Anttonen et al. 1999). La pérdida de Syndecan-1 de superficie se correlaciona con la transición mesenquimal epitelial (EMT = Epithelial Mesenchymal Transition) este proceso describe la transformación de una célula maligna en una célula mal o menos diferenciada asociada con invasividad y estadio metastásico. Esto por ejemplo se reporta para cáncer de mama metastásico (Loussouarn et al., 2008).
Una cantidad efectiva de un agente, en particular un inmunoconjugado o una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado de acuerdo con la presente invención, se refiere a una cantidad requerida para "tratar" una enfermedad o desorden en un sujeto, en particular un sujeto humano (paciente) . En el caso de cáncer tal como MM, la cantidad efectiva del agente puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño de tumor; inhibir (es decir, frenar en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir (es decirr frenar en cierta medida y de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibir en cierta medida, crecimiento de tumor; y/o aliviar en cierta medida uno. o más de los síntomas asociados con el cáncer. Ver la definición aquí de "tratamiento".
"Un equivalente farmacociné ico" de, por ejemplo 200 mg/m2 se refiere a la cantidad de inmunoconjugado que resulta en farmacocinética igual observada a dosis de 200 mg/m2 cuando el inmunoconjugado se administra en combinación, incluyendo co-administrar con un agente para tratamiento actual incluyendo efectos secundarios adversos potenciales primordialmente en células no diana que también expresan CD138. Esos equivalentes pueden ser algo menos que 200 o algo más que 200, dependiendo del otro agente. Se incluyen por ejemplo cantidades efectivas menores a 160, menores a 170, menores a 180, menores a 190 y menores a 210, menores a 220, menores a 230 y menores a 240 mg/m2. Por ejemplo, la persona con destreza en la técnica esperará que la administración concomitante con corticosteroides o con antibióticos permitirá dosis ligeramente superiores del inmunoconjugado incluso en casos de efectos secundarios en la piel, que sin embargo pueden evaluarse fácilmente por la persona con destreza en la técnica.
Para evaluar el éxito de la administración de un fármaco, aquí un inmunoconjugado (su capacidad para producir una respuesta funcional, es decir su eficacia) , se distinguen diferentes "respuestas" a una administración.
En el contexto de M y otras enfermedades plasmaproliferativas, las respuestas se distinguen como sigue : la expresión respuesta completa (CR= Complete Response) se refiere a la inmunofijación negativa de suero y orina y desaparición de cualesquiera plasmacitomas de tejido suave y <5% de células de plasma en médula ósea; la expresión respuesta completa severa (sCR= Stringent Complete Response) se refiere a CR como se definió anteriormente más la proporción FLC normal y ausencia de células clónales en médula ósea por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia; la expresión respuesta parcial muy buena (VGPR = Very Good Partial Response) se refiere a componente M en suero y orina detectable por inmunofijación, pero no en electroforésis o > 90% o mayor reducción en componente M de suero más componente M de orina <100 mg por 24h; la expresión respuesta parcial (PR = Partial Response) se refiere a >50% reducción de proteína M en suero y reducción en 24 horas de proteína M urinaria por >90% o a <200 mg por 24 horas, si la proteína M de suero y orina no se miden, una disminución de >50% en la diferencia entre niveles FLC involucrados y no involucrados se requiere en lugar de los criterios de proteína M, si la proteína M en suero y orina no se puede medir, y tampoco se puede medir el ensayo o análisis de cadenas ligeras libres en suero, reducción de >50% en células de plasma de médula ósea se requiere en lugar de proteína , siempre que el porcentaje de líneas de referencia fue >30%, además de los criterios anteriores, de estar presentes en la línea de referencia, reducción de >50% en tamaño de plasmacitomas de tejido suave también se requiere (Durie et al., 2006) .
La expresión respuesta menor (MR = Minor Response) en relación a pacientes con mieloma de relapso/refractario se refiere a >25% pero reducción de <49% de proteina M en suero y reducción en proteina M de orina de 24 horas en 50-89%, que aún excede 200 mg por 24 horas, además de los criterios anteriores, de estar presentes en la linea de referencia, reducción de 25-49% en tamaño de plasmacitomas de tejido suave también se requiere, sin aumento en tamaño o número de lesiones de huesos liticas (desarrolladas por fractura de compresión no excluye respuesta) .
Sin embargo, una respuesta aunque no formalmente clasificada también incluye una reducción de al menos 30%, de preferencia al menos 40% o 50% en niveles de FLC en suero. Esto es en particular significante en casos en donde la proteina M no puede medirse.
La expresión enfermedad · estable (SD = Stable Disease) se refiere en el contexto de enfermedades plasmaproliferativas de la presente invención, al no cumplir los criterios para CR, VGPR, PR o enfermedad progresiva mientras que la expresión enfermedad progresiva (PD = Progressive Disease) se refiere al incremento de 25% desde el valor de respuesta más bajo en cualquiera uno o más de los siguientes: - Componente M en suero (incremento absoluto debe ser > 0.5g/100 mi) y/o - Componente en orina (incremento absoluto debe ser > 200 mg por 24 horas) y/o - Solo en pacientes sin niveles de proteina M medibles en suero y orina; la diferencia entre niveles FLC involucrados y no involucrados (aumento absoluto debe ser > 100 mg/1) - Porcentaje de células de plasma en médula ósea (por ciento absoluto debe ser >10%) - Desarrollo definido de nuevas lesiones de hueso o plasmacitomas de tejido suave o incremento definido en el tamaño de lesiones en hueso existentes o plasmacitomas de tejido suave.
-Desarrollo de hipercalcemia (calcio de suero corregido >11.5mg/100 mi) que puede ser atribuido solamente al desorden proliferativo de células de plasma.
La expresión mieloma con relapso se refiere aquí a una forma de M activa en un sujeto, en donde el sujeto se sometió cuando menos a un régimen de tratamiento previo y que no cumple con los criterios para mieloma de relapso/refractario .
El término mieloma refractario en general se refiere a un estado de la enfermedad cuando el número de células de plasma continúa incrementándose aun cuando se proporciona tratamiento, esto es la enfermedad al tiempo de evaluación ha demostrado que no es capaz de recibir el régimen de tratamiento administrado.
La expresión mieloma de relapso/refractario se refiere aquí al relapso de enfermedad mientras que en terapia de rescate, o progresión dentro de 60 días de la terapia más reciente.
La expresión fenotipo refractario incluye cualquier tipo de mieloma refractario, esto es mieloma refractario y de relapso/refractario.
La expresión mieloma de relapso o refractario cubre mieloma de relapso refractario y de relapso/refractario .
En el estudio clínico discutido con más detalle a continuación, los sujetos han sido tratados con al menos un inmunomodulador y una terapia inhibidora de proteasoma, que han fallado antes de entrar al estudio. La enfermedad se consideró refractaria a tratamiento si el sujeto experimenta enfermedad progresiva (PD) en su régimen previo .
La expresión "progresión a", por ejemplo "MM activa" en relación a pacientes con SMM se refiere en el contexto de la presente invención, a evidencia de progresión con base en los criterios del grupo de trabajo de mieloma internacional (IMWG = International Myeloma Working Group) para la enfermedad progresiva en MM en cualquiera uno o más de los siguientes que se siente relacionados al desorden proliferativo de células de plasma clónales subyacentes, desarrollo de nuevos plasmacitomas de tejido suave o lesiones de hueso, hipercalcemia (>11 mg/100 mi) , disminución en hemoglobina de >2 g/100 mi, y nivel de creatinina en suero =2 mg/100 mi. (Kyle & Rajkumar, 2009).
La patogénesis de mieloma múltiple involucra enlace de células de mieloma, mediante moléculas de adhesión de superficie celular, a células de estroma de médula ósea (BMSCs = Bone Marrow Stroma Cells) asi como la matriz extracelular (ECM = Extracellular Matrix) . Este enlace activa, y de esta manera puede hacerse finalmente responsable por crecimiento de células de mieloma múltiple, resistencia a fármaco, inmigración de células de MM en el medio de médula ósea (Munshi et al. 2008). En particular, la adhesión de células de mieloma múltiple a ECM mediante syndecan-1 (CD138) a colágeno tipo I, induce la expresión de metaloproteinasa de matriz 1, de esta manera promoviendo la resorción de huesos e invasión de tumor (Hideshima et al. 2007). Interacciones entre células de mieloma múltiple y el microambiente de médula ósea resulta en activación de una cascada pleyotropica proliferativa y antiapoptósica .
Para pacientes de mieloma múltiple, pero también para pacientes que sufren de otras enfermedades asociadas con dolores óseos, existe una cantidad de tratamientos de soporte para tratar este y otros síntomas. Medicamentos apropiados incluyen bisfosfonatos (por ejemplo, pamidronato, ácido zoledrónico) , que pueden frenar el daño a los huesos. También se ha demostrado que estos agentes son capaces de reducir lesiones de huesos osteol ticas y evitar fracturas (Ludwig et al., 2007). Primordialmente se suministran a través de una vena para disminuir el riesgo de complicaciones de huesos como fracturas, y para reducir los niveles de calcio en la sangre anormalmente altos (Hipercalcemia) . Datos sugieren que bisfosfonatos reducen el dolor de huesos asociado con MM. Los pacientes también pueden someterse a cirugía si sus huesos son débiles o se rompen .
En una modalidad, los inmunocon ugados reducen, en particular reducen a un nivel aceptable, dolores de huesos y/o complicaciones de huesos, tales como osteonecrosis . Una reducción a un nivel aceptable involucra en particular la capacidad para interrumpir la administración de un medicamento que alivia estos dolores o se dirige a reducir estas complicaciones de huesos. Los bisfosfonatos tales como pamidronato, ácido zoledrónico y clodronato, se administran comúnmente para aliviar complicaciones de huesos, tales como osteonecrosis en pacientes MM y de esta manera para aliviar dolores de huesos asociados con dichas complicaciones. Bisfosfonatos comunes incluyen para administración oral FOSOMAX, BONIVA, ACTONEL, DIDRONEL y SKELID, para administración intravenosa, BONEFOS, AREDIA y ZOMETA.
Una reducción en dolor de huesos y/o complicaciones de huesos de acuerdo con la presente invención puede resultar en una reducción en la cantidad de medicamento antidolor que se administra a un paciente y/o en la cantidad de cualesquiera medicamentos que se administran para contraatacar estas complicaciones. Esta reducción puede ser (i) respecto a una cantidad administrada previamente, cuando el paciente se somete a (a) un tratamiento de la enfermedad que provoca dolor de huesos y/o complicaciones de huesos que difieren de tratamiento de acuerdo con la presente invención o (b) sin tratamiento o (ii) respecto a una cantidad administrada a otro paciente que sufre de la misma enfermedad y está en aproximadamente la misma etapa de la enfermedad. Dicha reducción de preferencia es aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% de reducción y de preferencia una cesación completa de la administración del medicamento. Cuando este último se administra esto es, cuando el paciente no requiere subjetivamente medicamento alquno contra dolores de huesos y/o complicaciones de huesos como resultado de que se le administre el inmunoconjugado de acuerdo con la presente invención, ya sea sólo o como parte de una combinación anticáncer de acuerdo con la invención, la administración del inmunoconjugado se dice que ha reducido el dolor de huesos y/o complicaciones de huesos a un nivel aceptable. Como resultado efectos secundarios adversos que resultan de la medicamentación administrada para aliviar dolores de huesos y/o complicaciones de huesos deberá reducirse o ser abolidos.
Siguiendo la migración de células de mieloma múltiple al compartimiento estromal de médula ósea, la adhesión entre las células de mieloma múltiple y B SCs regula por incremento muchas citoquinas como interleucina-6 (IL-6) y factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1) que tienen . actividades promotoras de crecimiento de .tumor y angiogénicas (Hideshima et al. 2007). Las cascadas de señalización iniciadas por esta citoquinas eventualmente resultan en resistencia de células M a terapéutica convencional (Anderson et al. 2000; Hideshima et al. 2006).
En el compartimiento hematopoyético humano normal, la expresión de CD138 se restringe a células de plasma (Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999) y CD138 no se expresa en linfocitos de sangre periférica, monocitos, granulocitos y glóbulos rojos. En particular, células progenitoras y madre CD34+ no expresan CD138 y mAbs anti-CD138 no afectan el número de unidades formadoras de colonia en los cultivos de células madre hematopoyéticas ( ijdenes, 1996) . En compartimientos no hematopoyéticos, CD138 se expresa primordialmente en epitelios simples y estratificados dentro del pulmón, hígado, piel, ríñones e intestinos. Sólo se vio una débil tinción en células endoteliales (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996) . Se ha reportado que CD138 existe en formas polimórficas en células de linfoma humano (Gattei, 1999) .
Anticuerpos monoclonales B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2 en particular B-B4 se han reportado que son específicos a CD138. De aquellos B-B4, 1D4 y MI15 reconocen tanto la molécula intacta como la proteína núcleo de CD138 y se mostró que reconocen cualquiera de los mismos o epítopes cercanamente relacionados (Gattei, 1999) . Estudios previos reportaron que B-B4 no reconoce CD138 soluble, pero sólo CD138 en la forma ligada a membrana (Wijdenes, 2002).
El anticuerpo anti-CD138 inicial se desarrolló por Diaclone SAS (Besan on, Francia) como el ab B-B4 parental murino, generado por inmunización con la línea celular de mieloma múltiple humano U266, utilizando tecnología de hibridoma estándar (Clement, 1995; Wijdenes, 1996) . B-B4 liga a un epítopo lineal entre los residuos 90-93 de la proteína núcleo en syndecan-1 humano (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998). Consistente con el patrón de expresión de CD138, B-B4 se muestra que reacciona fuertemente con la línea celular de plasma RPMI8226, pero no reacciona con células endoteliales . También consistente con el patrón de expresión de CD138, B-B4 también reacciona con líneas celulares epiteliales A431 (derivadas de queratinocito) y HepG2 (derivado de hepatocito) . Una inmunotoxina B-B4-saporina también fue altamente reactiva hacia la línea celular de plasma RPMI8226, de hecho considerablemente más tóxica que la saporina libre. Sin embargo, de las dos líneas celulares epiteliales probadas, la B-B4-saporina muestra sólo toxicidad hacia la línea celular A431, aunque en un ensayo clonogénico B-B4-saporina no mostró efecto inhibitorio en excrecencia de células A431 (Vooijs, 1996). Otros investigadores reportaron la falta de especificidad de antígenos asociados con MM contra tumores (Couturier, 1999) .
B-B4 enlazado covalentemente con el maitansinoide DM1 mostró citotoxicidad selectiva en líneas celulares y células de mieloma múltiple, así como actividad anticáncer en modelos de xenoinjerto de mieloma múltiple humano en ratones SCID (Tassone, 2004).
La presente invención utiliza la expresión célula de tumor para incluir células de cáncer así como células precancerosas que pueden o no formar parte de un tumor sólido .
Un agente dirigido de acuerdo con la presente invención es capaz de asociarse con una molécula expresada por una célula diana e incluye péptidos. En particular, agentes dirigidos de acuerdo con la presente invención incluyen anticuerpos dirigidos y moléculas no dirigidas a inmunoglobulina, que pueden basarse en proteínas sin inmunoglobulina incluyendo pero no limitadas a moléculas AFFILIN®, ANTICALINS® y AFFIBODIES®. Moléculas no dirigidas a inmunoglobulina también incluyen moléculas no dirigidas peptídicas tales como oligonucleótidos dirigidos de ADN y ARN (aptámeros) , pero también ligandos fisiológicos, en particular ligandos del antígeno en cuestión tal como CD138.
Un anticuerpo, dirigido de acuerdo con la presente invención es o se basa en un anticuerpo natural o se produce en forma sintética o por ingeniería genética y liga a un antígeno en una célula o células (célula o células dirigidas) de interés. Un anticuerpo dirigido de acuerdo con la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) o un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo dirigido puede someterse a ingeniería por ejemplo para mejorar su afinidad a las células diana (Ross, 2003) o disminuir su inmunogenicidad . El anticuerpo dirigido puede ligarse a una formulación liposomal incluyendo moléculas efectoras (Cárter, 2001) . Un fragmento de anticuerpo que comprende una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia la región variable o de enlace de antigeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2/ y Fv pero también diacuerpos; anticuerpos de dominio (dAb) ( ard, 1989; patente de los E.U.A. Número 6,005,079); anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecificos formados de fragmentos de anticuerpo. En un anticuerpo de fragmento variable de cadena sencilla (scFv) las cadenas pesadas y ligeras (VH y VL) pueden enlazarse por un enlazador aminoácido corto que tiene por ejemplo la secuencia (glicina4serina) n, que tiene suficiente flexibilidad para permitir que los dos dominios ensamblen una cavidad de enlace de antigeno funcional. La adición de diversas secuencias de señal puede permitir una dirección más precisa del anticuerpo dirigido. La adición de la región constante de cadena ligera (CL) puede permitir dimerización mediante enlaces disulfuro, dando incrementada estabilidad y avidez. Regiones variables para construir scFv pueden, si un mAb contra un objetivo de interés está disponible, ser obtenidas por RT-PCR que clona las regiones variables de ARNm que se extrae del hibridoma precursor. En forma alterna, scFv puede generarse de novo por tecnología de expresión en fago (Smith, 2001). Como se emplea aquí, el término "fragmento funcional" cuando se emplea con referencia a un anticuerpo dirigido, se pretende que se refiera a una porción del anticuerpo dirigido que es capaz de ligar específicamente a un antígeno que se enlaza específicamente por el anticuerpo al que se hace referencia. Un anticuerpo biespecifico de acuerdo con la presente invención puede por ejemplo tener al menos un brazo que es reactivo contra un tejido diana y un brazo que es reactivo contra una porción enlazadora (Publicación de Patente de los E.U.A. Número 20020006379). Un anticuerpo biespecifico de acuerdo con la presente invención también puede ligar a más de un antígeno en una célula diana (Cárter, 2001). Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser modificado por ejemplo al introducir residuos cisteína para introducir grupos tiol (Olafsen, 2004) .
De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo dirigido puede derivarse de cualquier fuente y puede ser pero no está limitado a un anticuerpo de camello, un anticuerpo murino, un anticuerpo de ratón/humano quimérico o un anticuerpo de mono/humano quimérico, en particular un anticuerpo de ratón/humano quimérico tal como nBT062.
Anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias derivadas de un anticuerpo humano y de un anticuerpo no humano y también están dentro del alcance de la presente invención. Métodos convenientes para humanizar anticuerpos incluyen injerto de CDR (injerto de región de determinación de complementariedad) (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patentes de los E.U.A. Números 5,530,101; y 5,585,089), restauración con carillas o prótesis de recubrimiento (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, 1991; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), intercambio de cadenas (Patente de los E.U.A. Número 5,565,332) y Delmmunosation™ (Biovation, LTD) . En injerto de CDR, las regiones determinantes de complementariedad de ratón (CDRs) por ejemplo de mAb B-B4 se injertan en estructuras variables humanas, que después se unen, a regiones constantes humanas, para crear un anticuerpo B-B4 humano (hB-B4). Varios anticuerpos humanizados por injerto de CDR ahora están en uso clínico, incluyendo MYLOTARG (Sievers et al., 2001) y HECEPTIN (Pegram et al, 1998).
La tecnología de prótesis de recubrimiento utiliza una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagénesis para alterar las superficies no-CDR de regiones variables de anticuerpo para semejar las superficies de anticuerpos conocidos del hospedero diana. Estrategias y métodos para recubrimiento de anticuerpos, y otros métodos para reducir inmunogenicidad de anticuerpos dentro de un hospedero diferente, se describen por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 5,639,641. Anticuerpos humanos pueden elaborarse por una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de expresión en fago. Ver también las Patentes de los E.U.A. Números 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, y 5,814,318; y las publicaciones de solicitudes de patentes internacionales WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
Los anticuerpos dirigidos que se han sometido a cualquier modificación no natural tal como anticuerpos de ratón/humano quiméricos o anticuerpos de mono/humano quiméricos, anticuerpos humanizados o anticuerpos que se diseñaron por" ejemplo para mejorar su afinidad a las células diana o disminuir su inmunogenicidad pero también a fragmentos de anticuerpo en particular fragmentos funcionales de estos anticuerpos dirigidos que se han sometido a cualquier modificación no natural, diacuerpos; anticuerpos de dominio; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla donde, y anticuerpos multiespecificos aquí se refieren como anticuerpos dirigidos de ingeniería.
Anticuerpos quimerizados, mantienen la región de enlace de anticuerpo (ABR o región Fab) del anticuerpo no humano, por ejemplo el anticuerpo murino en el que se basan, mientras que cualesquiera regiones constantes pueden proporcionarse por ejemplo por un anticuerpo humano. En general, la quimerización y/o el intercambio de regiones constantes de un anticuerpo no afectará la afinidad de un anticuerpo debido a que las regiones del anticuerpo que contribuyen a enlace de antigeno no se afectan por este intercambio. En una modalidad preferida de la presente invención, el anticuerpo de ingeniería, en particular quimerizado de la presente invención, puede tener una superior afinidad de enlace (como se expresa por valores KD) que el anticuerpo no humano respectivo en el que se basa. En particular, el anticuerpo nBT062 y anticuerpos basados en él, pueden tener superior afinidad de anticuerpo que el B-B4 murino.
En otra modalidad preferida de la presente invención, inmunocon ugados que comprenden aquellos anticuerpos de ingeniería/quimerizados también exhiben esta superior afinidad de anticuerpo. Estos inmunoconjugados también pueden exhibir en ciertas modalidades, otras propiedades ventajosas, tales como una superior reducción de carga de tumor que sus contrapartes que contienen B-B4. En una modalidad preferida, los anticuerpos dirigidos de ingeniería en particular quimerizados exhiben afinidades de enlace que se caracterizan por constantes de disociación KD (nM) menores a 1.6, menores a 1.5 o aproximadamente o menores a 1.4, mientras que sus contrapartes murinas se caracterizan por constantes de disociación KD (nM) de aproximadamente o mayor a 1.6. Inmunoconjugados que comprenden agentes dirigidos tales como anticuerpos dirigidos pueden caracterizarse por constantes de disociación de KD (nM) de menos de 2.6, menos que 2.5, menos que 2.4, menos que 2.3, menos que 2.2, menos que 2.1, menos que 2.0, menos que o aproximadamente 1.9 se prefieren, mientras que inmunoconjugados que comprenden los anticuerpos contraparte murinos pueden caracterizarse por constantes de disociación KD (nM) de aproximadamente o mayores a 2.6 (compare la Tabla 9, Materiales y Métodos).
La molécula de anticuerpo básica es una estructura bifuncional en donde las regiones variables ligan antigeno mientras que las regiones constantes restantes pueden producir respuestas independientes de antigeno. Las clases mayores de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, se determinan por las regiones constantes. Estas clases además pueden dividirse en subclases (isotipos) . Por ejemplo, la clase IgG tiene cuatro isotipos, es decir, IgGl, IgG2, IgG3, y IgG4 que se determinan por las regiones constantes. De las diversas clases de anticuerpos humanos, sólo IgGl, IgG2, IgG3 y IgM humanos se conoce que activan efectivamente el sistema de complemento. Mientras que las regiones constantes no forman los sitios de enlace de antígeno, la estructura o arreglo de las regiones constantes y región bisagra pueden conferir flexibilidad de segmento en la molécula lo que le permite enlazar con el antigeno .
Diferentes isotipos IgG pueden ligar a receptores Fe en células tales como monocitos, células B y células NK, de esta manera activando las células para liberar citoquinas. Diferentes isotipos también pueden activar complemento, resultando en inflamación local o sistémica. En particular; los diferentes isotipos IgG pueden ligar FcyR a diferentes grados. FcyRs son un grupo de glicoproteinas de superficie que pertenecen a la súper-familia Ig y se expresan primordialmente en leucocitos. Las glicoproteinas . FcyR se dividen en tres clases designadas FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) . Mientras que IgGl, IgG2 y IgG3 ligan fuertemente a una variedad de estas clases de glicoproteinas FcyR, IgG4 exhiben un enlace mucho más débil. En particular, IgG4 es un enlazador intermedio FcyRI, que resulta en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC = Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) relativamente baja o incluso nula, y no ligan a FcyRIIIA o FcyRIIA. IgG4 también es un enlazador débil de FcyRIIB, que es un receptor inhibitorio. Además, IgG4 media sólo en forma débil o nula la fijación de complemento y débil o nula citotoxicidad dependiente de complemento f (CDC) . En el contexto de la presente invención, IgG4 puede emplearse específicamente para evitar el dirigir mediado por Fe de FcR hepático ya que no exhibe interacción con FCRYII en células endoteliales sinusoidales de hígado (LSECs = Liver Sinusoidal Endothelial Cells) , ninguna o débil interacción con FcRyl-III en células Kupffer (macrófagos) y ninguna interacción con FcRylH en células NK hepáticas. Ciertas mutaciones que reducen adicionalmente cualquier CDC también son parte de la presente invención. Por ejemplo, los residuos IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 se mostró que reducen la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC = Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) y CDC (Amour, 1999; Shields, 2001) . - Una de más mutaciones que estabilizan el anticuerpo también son parte de la presente invención (también referido aquí como "mutaciones estabilizantes") . Estas mutaciones incluyen en particular mutaciones de leucina-a-ácido glutámico en la región CH2 de IgG4 e intercambio serina-a- prolina en el núcleo bisagra IgG4. Estas mutaciones disminuyen, en ciertas modalidades de la invención, la cantidad de medias moléculas a menos que 10%, a menos que 5% y de preferencia menor que 2% o 1%. Aún más, la vida media in vivo de anticuerpos estabilizados puede incrementarse varios días incluyendo 1, 2, 3, 4 o más de 5 días (Schuurman, 1999) .
Cuando la presente invención se refiere a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo dirigido de ingeniería que confiere propiedades de isotipo IgG4, esto significa que el anticuerpo dirigido de ingeniería muestra afinidad significativamente reducida a células que expresan receptor Fe en comparación con la afinidad de anticuerpos del isotipo IgGl. Estas propiedades de preferencia son conferidas por una región de anticuerpo adicional, lo que es distinto de ABR, en donde la región de anticuerpo adicional en forma total o parcial es de un anticuerpo humano. El resultado es una carencia equitativamente reducida (mayor a 90% respecto a su contraparte de isotipo IgGl) o total de un potencial para inducir CDC o ADCC en comparación con el potencial para inducir CDC o ADCC usualmente observado con anticuerpos de isotipo IgGl. Esta propiedad puede ser medida en ensayos basados en células al emplear el anticuerpo dirigido de ingeniería en su forma no conjugada. CDC y ADCC pueden medirse por diferentes métodos tales como el descrito en Cáncer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993) o el Ensayo de Toxicidad Celular GUAVA. El beneficio total de inmunoconjugados que comprenden al menos parte de un anticuerpo dirigido de ingeniería que confiere propiedades de isotipo IgG4 es una mejora de la especificidad de enlace y una toxicidad reducida. También, la afinidad reducida resultante a receptores Fe mejora el blanco específico de antígeno de células de tumor lo que lleva a reducida toxicidad contra células negativas CD138.
Agentes dirigidos, incluyendo anticuerpos dirigidos aquí descritos también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de enlace a antígeno, en particular a CD138. Afinidades de enlace preferidas de agentes dirigidos tales como anticuerpos dirigidos se caracterizan por constantes de disociación KD (nM) menores a 1.6, menos a 1.5 o aproximadamente o menores a 1.4. Para inmunoconjugados que comprenden los agentes dirigidos tales como anticuerpos dirigidos con constantes de disociación KD (nM) menores a 1.6, menores a 1.5 o menores a 2.5, menores a 2.4, menores a 2.3, menores a 2.2, menores a 2.1, menores a 2.0, menores que o aproximadamente 1.9, se prefieren.
Una región de enlace de antígeno (ABR) de acuerdo con la presente invención variará con base en el tipo de anticuerpo dirigido o anticuerpo dirigido de ingeniería empleado. En un anticuerpo de origen natural y en la mayoría de los anticuerpos quiméricos y humanizados, la región de enlace de antígeno se constituye por una cadena ligera y los dos primeros dominios de una cadena pesada. Sin embargo, en anticuerpo de cadena pesada carente de cadenas ligeras, la región de enlace de antígeno será constituida por ejemplo de los primeros dos dominios de la cadena pesada solamente, mientras que en anticuerpos de cadena sencilla (ScFv) , que combinan en una sola cadena polipéptido los dominios variables de cadena ligera y pesada de una molécula de anticuerpo, ABR se proporciona por sólo una molécula polipéptido. Fragmentos FAB usualmente se obtienen por digestión con papaina y tienen una cadena ligera y parte de una cadena pesada y de esta manera comprenden una ABR con sólo un sitio de combinación de antigeno. Por otra parte, diacuerpos son pequeños fragmentos de anticuerpo con dos regiones de enlace de antigeno. En el contexto de la presente invención, sin embargo una región de enlace de antigeno de un anticuerpo dirigido o anticuerpo dirigido de ingeniería es cualquier región que · determina en forma primordial la especificidad de enlace del anticuerpo dirigido o anticuerpo dirigido de ingeniería .
Si la ABR u otra región de anticuerpo dirigido se dice que es "de un cierto anticuerpo", por ejemplo un anticuerpo humano o no humano, esto significa en el contexto de la presente invención que ABR ya es idéntico a una ABR de origen natural correspondiente o se basa en ella. Una ABR se basa en una ABR de origen natural si tiene la especificidad de enlace de la ABR de origen natural. Sin embargo, dicha ABR puede comprender, por ejemplo mutaciones punto, adiciones, deleciones o modificación post traducción tales como glicosilación . Esta ABR en particular puede tener más que 70%, más que 80%, más que 90%, de preferencia más que 95%, más que 98% o más que 99% de identidad de secuencia con la secuencia de la ABR de origen natural. nBT062 (ver también la Figura 1) es un IgG4 mAb quimérico humano murino, es decir una versión quimerizada de B-B4. Esta versión quimerizada de B-B4 se creó para reducir la respuesta humoral de anticuerpos humanos anti ratón (HAMA = Human Anti- ouse Antibody) mientras que mantiene la funcionalidad de la región de enlace de anticuerpo de B-B4 para CD138. De manera sorprendente, los resultados obtenidos utilizando un inmunoconjugado que comprende este anticuerpo dirigido de ingeniería fueron mucho más homogéneos (la variancia en los resultados se redujo) . El protocolo para producir nBT062 se especifica a continuación. Células de ovario de hámster chino que expresan nBT062 se han depositado con DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig en diciembre 11, 2007. El número de identificación es DS ACC2875. Un anticuerpo quimérico específico CD138 basado en B-B4 se refiere genéricamente aquí como C-B-B4.
La secuencia de aminoácidos para ambas, las cadenas pesadas y ligeras se ha pronosticado de la traducción de la secuencia de nucleótidos para nBT062. La secuencia de aminoácidos pronosticadas para cadena pesada y cadena ligera se presentan en Tabla 3. Regiones variables pronosticadas están con negritas, CDRs pronosticadas están subrayadas .
Tabla 3. Secuencia de Aminoácidos Pronosticada para nBT062 - secuencia pronosticada de cadena pesada nBT062 (SEQ ID NO:l) : 1 QVQLQQSGSE LMMPGASVKI SCKATGYTPS NYWIEWVKQR PGHGLEWIGE 51 ILPGTGRTIY NEKFKGKATF TADISSNTVQ MQLSSLTSED SAVYYCARRD 101 YYGNFYYAMD YWGQGTSVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL 151 VKDYFPEPVT VS NSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV 351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG (K) La lisina C-terminal tiende a cortar y puede estar presente debido a recorte incompleto en una cierta proporción. (K) en paréntesis no es parte de SEQ ID NO:l. - Secuencia pronosticada de cadena ligera nBT062 (SEQ ID NO:2) : 1 DIQMTQSTSS LSASLGDRVT ISCSASQGIN NYLNWYQQKP DGTVELLIYY 51 TSTLQSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIGTYYCQQ YSKLPRTFGG 101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFN RGEC Tabla 4. Muestra una comparación de las definiciones de CDR generales de Kabat y Chothia y las CDRs pronosticadas para nBT062.
Definición CDR de Kabat ???062 Cadena ligera CDR1 : residuos CDR1 : residuos 24-34 24-34 CDR2: residuos CDR2 : residuos 50-56 50-56 CDR3 : residuos CDR3 : residuos 89-97 89-97 Cadena pesada CDR1 : residuos CDR1 : residuos 31-35 31-35 CDR2: residuos CDR2 : residuos 50-56 51-68 CDR3 : residuos CDR3 : residuos 95-1.02 99-111 Definición CDR de Chothia nBT062 Cadena ligera CDR1 : residuos CDR1 : residuos 26-32 24-34 CDR2 : residuos CDR2: residuos 50-52 50-56 CDR3 : residuos CDR3 : residuos 91-96 89-97 Cadena pesada CDR1: residuos CDR1 : residuos 26-32 31-35 CDR2: residuos CDR2: residuos 52-56 51-68 CDR3 : residuos CDR3 : residuos 96-101 99-111 Anticuerpos totalmente humanos también pueden emplearse. Esos anticuerpos pueden seleccionarse por el enfoque de expresión en fago, en donde CD138 o su determinante de antihigiénico se emplea para ligar selectivamente expresión en fago, por ejemplo regiones variables B-B4 (ver, Krebs, 2001) . Éste enfoque se acopla ventajosamente con una técnica de maduración de afinidad para mejorar la afinidad del anticuerpo. Todos los anticuerpos aquí referidos son anticuerpos aislados (ver publicación de patente de los E.U.A. Número 20090175863) .
En una modalidad, el anticuerpo dirigido en su forma no conjugada es internalizado de manera moderada o deficiente. La internalización moderada constituye aproximadamente 30% a aproximadamente 75% de internalización de anticuerpo total, deficiente internalización constituye aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 30% de internalización después de 3 horas de incubación a 37°C. En otra modalidad preferida, el anticuerpo dirigido enlaza a CD138, por ejemplo anticuerpos B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q14S4, 5F7, 104-9, 281-2 en particular B-B4. Células de hibridoma que se generaron al hibridizar células de mieloma SP02/0 con células de bazo de ratones Balb/c se han depositado con DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig en diciembre 11, 2007 . El número de identificación de estas células de hibridoma que expresan B-B4 es DS ACC2874. En otra modalidad, el anticuerpo dirigido no liga sustancialmente CD138 no expresado en superficie celular. Cuando, en el contexto de la presente invención el nombre de un anticuerpo específico se combina con l-a expresión "anticuerpo dirigido" tal como "anticuerpo dirigido nBT062", esto significa que este anticuerpo dirigido tiene la especificidad de enlace del anticuerpo nBT062. Si se dice que un anticuerpo dirigido está "basado en" un anticuerpo especificado, esto significa que este anticuerpo dirigido tiene la especificidad de enlace de este anticuerpo, pero puede tomar cualquier forma consistente con la descripción anterior de un anticuerpo dirigido. Cuando, en el contexto de la presente invención el nombre de un antigeno especifico se combina con la expresión "anticuerpo dirigido" tal como "anticuerpo dirigido CD138", esto significa que este anticuerpo dirigido tiene especificidad de enlace para CD138. Si, en el contexto de la presente invención, por ejemplo un -anticuerpo dirigido se dice que hace algo "selectivamente" tal como "dirigido selectivamente a superficie celular que expresa CD138" o que es "selectivo" para algo, esto significa que hay una selectividad significante (es decir una superior afinidad hacia células positivas CD138 en comparación con células negativas CD138) , para que en el caso del ejemplo que se proporciona, CD138 expresado en superficie celular en comparación con cualquier otro antigeno expresado en superficie celular. Efectos secundarios adversos en un ambiente determinado pueden reducirse sustancialmente o incluso evitarse debido a esta selectividad. " oléculas dirigidas sin inmunoglobulina" de acuerdo con la presente invención, incluyen moléculas dirigidas derivadas de proteínas no inmunoglobulina así como moléculas dirigidas no peptídicas. Pequeñas proteínas sin inmunoglobulina que se incluyen en esta definición se diseñan para tener afinidades específicas hacia, en particular CD138 expresada en superficie. Estas proteínas pequeñas sin inmunoglobulina incluyen moléculas de ingeniería basadas en andamio tales como las moléculas Affilin® que tienen un peso molecular relativamente bajo tal como entre 10 kDa y 20 kDa. Andamios o estructuras apropiadas incluyen por ejemplo gama cristalina. Aquellas moléculas tienen en su estado natural actividad de enlace no específica hacia las moléculas diana. Por ingeniería de la superficie de proteína a través de aleatorización definida localmente de aminoácidos expuestos a solvente, se crean sitios de enlace completamente nuevos. Proteínas sin enlace anteriores de esta manera se transforman en proteínas de enlace específicas. Éstas moléculas pueden diseñarse específicamente para ligar una diana, tal como CD138, y permitir suministró específico de una o más moléculas efectoras (ver scil Proteins GmbH en www.scilproteins.com, 2004). Otro tipo de moléculas dirigidas sin inmunoglobulina se derivan de lipocalinas, e incluyen por ejemplo ANTICALINS®, que semejan en estructura algo a las inmunoglobulinas . Sin embargo, las lipocalinas están compuestas de una sola cadena polipéptido con 160 a 180 residuos aminoácido. La cavidad de enlace de las lipocalinas puede reconformarse para reconocer una molécula de interés con altas afinidad y especificidad (verr por ejemplo Beste et al., 1999) . Receptores bacterianos artificiales tales como aquellos comercializados bajo la marca Affibody® (Affibody AB) también están dentro del alcance de la presente invención. Estas moléculas receptoras bacterianas artificiales son pequeñas proteínas simples y pueden estar compuestas por un haz de tres hélices con base en el andamio de uno de los dominios de enlace IgG de la Proteína A (Staphylococcus aureus) . Estas moléculas tienen propiedades de enlace similares a muchas inmunoglobulinas pero son sustancialmente más pequeñas, tienen un peso molecular que a menudo no excede lOkDa y también son comparablemente estables. Moléculas receptoras bacterianas artificiales convenientes son por ejemplo descritas en las Patentes de los E.U.A. Números 5,831,012; 6,534,628 y 6,740,734.
Otras "moléculas dirigidas sin inmunoglobulina" son ligandos fisiológicos del antígeno en cuestión. Ligandos fisiológicos de CD138 incluyen por ejemplo pero no están limitados a ADAMTS4 (aggrecanasa-1 ) , antitrombina-3, bFGF, catepsina G, CCL5 (RANTES) , CCL7, CCL11, CCL17, CD44, colágenos (colágeno tipo 1, colágeno tipo 2, colágeno tipo 3, colágeno tipo 4, colágeno tipo 5, colágeno tipo 6), CXCL1, elastasa, gpl20, factor de crecimiento de hepatocitos [HGF = Hepatocyte Growth Factor], laminina-1, laminina-2, laminina-5, midkina, MMP-7, neutrófilo elastasa y pleyotrofina (HBNF, HBGF-8) . Moléculas dirigidas no peptidicas incluyen pero no están limitadas a oligonucleótidos de ADN y ARN que ligan a CD138 (aptámeros) .
Una "molécula efectora" de acuerdo con la presente invención es una molécula o un derivado o su análogo que se enlaza con un agente dirigido, en particular un anticuerpo dirigido y/o un anticuerpo dirigido de ingeniería, y que ejerce un efecto deseado, por ejemplo apoptosis u otro tipo de muerte celular, o un freno del ciclo celular continuo en la o las células dirigidas. Moléculas efectoras de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas que pueden ejercer los efectos deseados en una célula objetivo e incluyen pero no están limitados a fármacos citotóxicos, incluyendo fármacos citotóxicos de bajo peso molecular (masa molecular menor a 1500 Da, de preferencia menor a 1400, menor a 1200, menor a 1000, menor a 800, menor a 700, menor a 600, menor a 500, menor a 300 pero en general mayor a 120 Da) . Éstos fármacos citotóxicos de acuerdo con la presente invención en general son fármacos citotoxicos biológicos no proteináceos y contienen o inducen, ante administración, la producción de otro fármaco citotóxico de al menos 5 átomos de C, 10 átomos de C, de preferencia más de 12 átomos de C, a menudo mayor a 20 átomos de C y en ocasiones mayor a 30, 40 o 50 átomos de C Y en general al menos una estructura de anillo, tal como un anillo benceno que a menudo esté sustituido. Sin embargo, a menudo estructuras de anillo de interconexión son parte de estas moléculas. Estos fármacos citotoxicos biológicos no proteináceos pueden intercalarse en ADN (intercaladores de ADN) o alquilación de ADN, inhibir formación de microtúbulos son inhibidores de mitosis. Los inhibidores de enzimas involucradas en la integridad estructural de ADN, tales como histona de acetilato o inhibidores de enzimas que de otra forma son vitales a una célula y provocan ruptura del métabolismo celular. Los efectores también puede categorizarse como radionúclidos, modificadores de respuesta biológica, agentes formadores de poros, ribonucleasas, proteínas de cascadas de señalización apoptósica con actividades que inducen apoptosis, oligonucleótidos antisentido, agentes antimetástasis, sustancias antioxidativas, anticuerpos o citoquinas, asi como sus derivados funcionales o análogos/fragmentos.
Las toxinas pueden incluir toxinas bacterianas, tales como pero no limitadas a toxina Difteria o Exotoxina A, toxinas de plantas, tales como pero no limitadas a Ricina, otros alcaloides y polifenoles, micotoxinas tales como alfa amanitina o más especialmente Amatoxinas y falotoxinas. Toxinas no sólo pueden ser de origen bacteriano sino también fungal, de plantas, vertebrados y de origen invertebrado, todas las cuales pueden ser modificadas en forma genética o química. Aún más, las toxinas también pueden ser toxinas ambientales tales como pero no limitadas a metil mercurio. Moléculas efectoras pueden ser proteínas tales como aquellas de cascadas de señalización apoptóticas con actividades que inducen apoptosis, incluyendo pero no limitadas a Granzima B, Granzima A, Caspasa-3, Caspasa-7, Caspasa-8, Caspasa-9, Bid truncado- (tBid) , Bax y Bak. Las toxinas también pueden ser dolastatinas 10 y 15 son pequeños péptidos aislados de cuña marina liebre (Dolabella auricularia) que se ha mostrado que interactúa con tubulina.
Efector Masa molecular (g/mol [Da] Doxorubicina 564 Danurubicina 528 Vinblastina 811 Docetaxel 808 Paclitaxel 854 Epotilona B 508 Vorinostat 264 Neocarzinostatina 660 Calicheamicina ?? 1368 Esperamicina 1342 Metotrexato 454 Componentes de 482 silimarina asoprocol 302 Ácido 132 aminolevulinico Miltefosina 407 Epigalocatequina 459 galato (EGCG) Psoraleno 186 elfalan 304 Tabla 5 proporciona ejemplos de fármacos citotóxicos de bajo peso molecular que pueden servir como moléculas efectoras.
En una modalidad preferida, la molécula efectora aumenta el suministro de efector interno del inmunocon ugado, en particular cuando la forma natural del anticuerpo en el que se basa el anticuerpo dirigido del inmunoconjugado es deficientemente internalizable . En otra modalidad preferida, el efector en su forma nativa no es selectivo. En ciertas modalidades, el efector tiene alta toxicidad no selectiva, incluyendo toxicidad sistémica, cuando ésta en su forma nativa. La "forma nativa" de una molécula efectora de la presente invención es una molécula efectora antes de enlazarse al agente dirigido para formar un inmunoconjugado. En otra modalidad preferida, la toxicidad no selectiva de la molécula efectora se elimina sustancialmente ante conjugación con el agente dirigido. En otra modalidad preferida, la molécula efectora provoca, al alcanzar la célula objetivo o diana, muerte o freno del ciclo celular, incluyendo freno de ciclo celular continuo, en la célula diana.
Una molécula efectora de acuerdo con la presente invención incluye pero no está . limitada a agentes antineoplásicos , en particular agentes quimioterapéuticos intracelulares que se definen a continuación.
Fármacos citotóxicos de bajo peso molecular (ver anteriormente para peso moleculares) pueden ser de preferencia antimitóticos, más particular agentes que afectan la tubulina, que incluyen inhibidores de polimerización de tubulina tales como maitansinoides, } dolastatinas (y derivados tales como auristatina) y criptoficina y fármacos taxoides potentes (taxano) (Payne, 2003) . Además se incluye en la definición de pequeño fármaco de alta toxicidad y están otros agentes que interfieren con tubulina tales como epotilonas (por ejemplo ixabepilona) y derivados de colchicina (agentes que interfieren con tubulina se discuten más a continuación) .
Una molécula efectora que es un maitansinoide, incluye maitansinoides de cualquier origen, incluyendo pero no limitados a maitansinol sintético y análogos y derivados de maitansinol.
La maitansina es un producto natural originalmente derivado del arbusto etiope Maytenus serrata (Remillard, 1975; Patente de los E.U.A. Número 3,896,111). Éste fármaco inhibe la polimerización de tubulina, resultando en bloqueo mitótico y muerte celular (Remillard, 1975; Bhattacharyya, 1977; Kupchan, 1978). La citotoxicidad de ma-itansina es' de 200-1000 veces superior a la de los fármacos anticáncer en uso clínico que afectan la polimerización de tubulina, tales como Vinca alcaloides o taxol. Sin embargo, pruebas clínicas de maitansina indican que carece de una ventana terapéutica debido a su alta toxicidad sistémica. La maitansina y los maitansinoides son altamente citotóxicos pero su uso clínico en terapia de cáncer se ha limitado enormemente por los severos efectos secundarios sistémicos primordialmente atribuidos a su deficiente selectividad para tumores. Pruebas clínicas con maitansina muestran serios efectos adversos en el sistema nervioso central y el sistema gastrointestinal.
Los maitansinoides también se han aislado de otras plantas incluyendo tejido de semillas de Trewia nudiflora (Patente de los E.U.A. Número 4,418,064) .
Ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y C-3 maitansinol ésteres (Patente de los E.U.A. Número 4,151,042) .
La presente invención se dirige a maitansinoides de cualquier origen, incluyendo maitansinol sintético y análogos de maitansinol que se describen por ejemplo en las Patentes de los E.U.A. Números 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,371,533; 4,424,219 y 4,151,042.
En una modalidad preferida, el maitansinoide es un maitansinoide que contiene tiol y se produce más preferiblemente de acuerdo con los procesos descritos en la Patente de los E.U.A. Número 6,333,410 otorgada a Chari et al. o en Chari et al. (Chari, 1992).
DM-1 (N2-deacetil-N2- (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina) es una molécula efectora preferida en el contexto de la presente invención. DM1 es 3 a 10 veces más citotóxico que maitansina y se ha convertido en un profármaco al ligarlo mediante uno o varios enlaces disulfuro a un anticuerpo monoclonal dirigido hacia un antigeno asociado a tumor. Ciertos de estos conjugados (en ocasiones denominados "fármacos activados por tumor" (TAPs = Tumor Activated Prodrugs) ) no son citotóxicos en el compartimiento sanguíneo, ya que se activan al asociar con las células diana e internalizan, de esta manera liberando el fármaco (Bláttler, 2001) . Varios conjugados anticuerpo-DMl se han desarrollado (Payne, 2003) , y se han evaluado en pruebas clínicas. Por ejemplo el tratamiento con huC242-DMl en pacientes de cáncer colorectal fue bien tolerado, no induce ninguna respuesta inmunodetectable y ha tenido un prolongado tiempo de circulación (Tolcher, 2003) .
Otros maitansinoides particularmente preferidos comprenden una cadena lateral que contiene un tiol estéricamente impedido ligado tal como pero no limitado a maitansinoides N2' -deacetil- N2'- (4-mercapto-l-oxopentil) -maitansina, también referidos como "DM3" y N2' -deacetil-N2'- (4-metil-4-mercapto-l-oxopentil) -maitansina, también referido como "DM4". La síntesis de DM4 se ilustra en las Figuras 3 y 4 y se describe en otra parte aquí. DM4 difiere de DM1 y DM3 ya que tiene grupos metilo en su cxC. Esto resulta en un impedimento esférico cuando DM4 se liga mediante un enlazador en particular, pero no limitado a, un enlazador que comprende un enlace disulfuro, a un agente dirigido tal como nBT062. Una amplia variedad de maitansinoides que contienen un grupo tiol estéricamente impedido (que posee uno o dos sustituyentes , en particular sustituyentes alquilo, tales como los sustituyentes metilo de DM4) se describen en la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2004/0235840, publicada en noviembre 25, 2004, que se incorpora aquí en su totalidad por referencia. El impedimento estérico conferido por los grupos alquilo tales como los grupos metilo en el carbono adyacente al átomo de azufre de DM3 y DM4, puede afectar la velocidad de ruptura intracelular del inmunoconjugado . La unidad alquilo variable por lo tanto afecta potencia, eficacia y seguridad/toxicidad in vitro y in vivo.
Como se reporta por Goldmahker et al., en la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2006/0233814, tal impedimento ., induce alquilación (por ejemplo, metilación) del fármaco libre,' una vez que el fármaco se libera en su diana. La alquilación puede incrementar la estabilidad del fármaco permitiendo el efecto asi denominado de activación inespecifica (bystander) . Sin embargo, como apreciará la persona con destreza en la especialidad, otras moléculas efectoras que comprenden sustituyentes tales como grupos alquilo en posiciones que resultan en un impedimento estérico cuando el efector se enlaza a un agente diana mediante un enlazador, son parte de la presente invención (Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2004/0235840) . De preferencia, este impedimento induce una modificación química tal como alquilación del fármaco libre para incrementar su estabilidad total, lo que permite al fármaco no sólo inducir muerte celular o freno de ciclo celular continuo en células de tumor que expresan CD138 sino que opcionalmente también afecta células auxiliares que por ejemplo soportan 0 protegen el tumor de los fármacos, en particular células del estroma de tumor y la vasculatura de tumor y que generalmente no expresan CD138 para disminuir o perder su función de soporte o protección.
La maitansina se evalúo en pruebas clínicas Fase 1 y Fase II auspiciadas por el Instituto Nacional de Cáncer (NCI = National Cáncer Institute) bajo IND #11,857 (presentada a la FDA en septiembre 19., 1975) . Ambas respuestas completas y parciales se vieron en pacientes con malignidades hematológicas y respuestas parciales en pacientes con un amplio espectro de tumores sólidos (Blum and Kahlert., 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978, Eagan et al., 1978, Cabanillas et al., 1978). Sin embargo, toxicidades significantes incluyendo náusea, vómito, diarrea, elevaciones de pruebas de función de hígado, letargía y neuropatía periférica se notaron (ver Maytansine IND #11,857, Annual Report, February, 1984; Blum and Kahlert., 1978, Issell and Crooke, 1978, Chabner et al., 1978) . Efectos tóxicos impidieron mayor desarrollo.
Una clase de agentes que interfieren con tubulina comprenden taxanos (Payne 2003), en especial unos altamente potentes y aquellos que contienen grupos tiol o disulfuro. Los taxanos son venenos del uso mitótico que inhiben la despolimerización de tubulina, resultando en un aumento en la velocidad de estructura de microtúbulos y muerte celular. Los taxanos que están dentro del alcance de la presente invención son por ejemplo descritos en las Patentes de los E.U.A. Números 6,436,931; 6,340,701; 6,706,708 y las Publicaciones de Patentes de los E.U.A. Número 20040087649; 20040024049 y 20030004210. Se describen otros taxanos por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 6,002,023, Patente de los E.U.A. Número 5,998,656, Patente de' los E.U.A.- Número 5,892., 063, Patente de los E.U.A. Número 5,763,477, Patente de los E.U.A. Número 5,705,508, Patente de los E.U.A. Número 5,703,247 y Patente de los E.U.A. Número 5,367,086. Como la persona con destreza en la técnica apreciará, los taxanos PEGilados tales como aquellos descritos en la Patente de los E.U.A. Número 6,596,757, también están dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención incluye adicionales moléculas efectoras que afectan ADN, más particularmente agentes de intercalado tales como antraciclinas y derivados (daunorubicina, valrubicina, doxorubicina, aclarubicina, epirubicina, idarubicina, amrubicina, pirarubicina, zorubicina) y antracendionas, tales como sustancias derivadas de Streptomyces (actinomicina, mitomicina, bleomicina, aactinomicina) o amsacrina.
Una molécula efectora puede representar agentes alquilantes de ADN más particulares como y más particularmente mostaza de nitrógeno y análogos (por ejemplo Ciclofosfamida, Melfalano, Estramustina) , Alquilsulfonatos, Nitrosoureas, Aziridinas, Hidrazinas, Etilen Iminas, y otras sustancias tales como Trenimon y Mitobronitol (un análogo de manitol) . En particular, agentes alquilantes de ADN preferidos son análogos de CC-1065 o derivados (Patentes de los E.U.A. Números 5,475,092; 5,585, 499; .6,-716,821) y duocarmicina .
CC-1065 representa un antibiótico antitumor potente aislado de cultivos de Streptomyces zelensis y se ha mostrado que es excepcionalmente citotóxico in vitro (Patente de los E.U.A. Número 4,169,888) . Dentro del alcance de la presente invención por ejemplo están los análogos CC-1065 o derivados descritos en las Patentes de lo,s E.U.A. Números 5, 475,092, 5,585, 499 y 5,739,350. Como la persona con destreza en la técnica fácilmente apreciará, análogos de CC-1065 o derivados modificados como se describe en la Patente de los E.U.A. Número 5,846,545 y prodrogas de análogos CC-1065 o derivados como se describe por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 6,756,397, también están dentro del alcance de la presente invención. En ciertas modalidades de la invención, análogos y derivados de CC-1065 pueden por ejemplo ser sintetizados como se describe en la Patente de los E.U.A. Número 6,534, 660.
Otras moléculas efectoras de alquilación de ADN tales como sustancias basadas en platino se incluyen además (por ejemplo carboplatina, nedaplatina, oxaliplatina, triplatina, satraplatina) .
Entre las moléculas efectoras que afectan ADN también se incluyen inhibidores de topoisomerasa I y II tales como sustancias derivadas de Camptoteca (belotecano, topotecano) y Podofilotoxina y derivados (etopósido, tenipósido) .
Una subclase adicional de moléculas efectoras que afectan ADN incluye antimetabolitos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato, conocidos como inhibidores de dihidrofolato reductasa) o Aminopterina . También se incluyen metabolitos que interfieren con el metabolismo de purina o pirimidina, en particular inhibidor de adenosina deaminasa (pentostatina) , o inhibidor de ribonucleótido reductasa/halogenado (cladribina, clofarabina) , tiopurina y tiazofurina. Adicionales antimetabolito incluyen inhibidor de polimerasa de ADN (citarabina) , inhibidor de ribonucleótido reductasa (gemcitabina) , y agentes hipometilantes (azacitidina, decitabina) e inhibidores de ribonucleótido reductasa. En forma más general se incluyen también sustancias de entrelazamiento de ADN tales como cisplatina .
Una molécula efectora de acuerdo con la presente invención puede ser antibióticos antitumores definidos como moléculas efectoras que dañan o modifican el ADN incluyendo antibióticos de enediina tales como calicheamicina que incluyen por ejemplo gamma II, N-acetil calicheamicina y otros derivados de calicheamicina. La calicheamicina liga en una forma especifica de secuencia con el surco menor de ADN, se somete a rearreglo y expone radicales libres, llevando a ruptura de ADN de doble hebra, resultando en apoptosis y muerte celular. Un ejemplo de una molécula efectora de calicheamicina que puede emplearse en el contexto de la presente invención se describe en la Patente de los E.U.A. Número 5,053,394. Este compuesto se emplea en inmunoconjugados con los anticuerpos monoclonales publicados como gemtuzumab, ozogamicina y irtotuzumab ozogamicina .
Un subgrupo de enediina comprende las cromoproteinas esperamicina y neocarzinostatina . En particular, Trabectedina, que también se categoriza como agente que daña el ADN, denominados antibióticos antitumor.
Trabectedina provoca ruptura de la estructura principal de AND, y puede aislarse de una ascidia (también conocida como ecteinascidina 743 o ET-743) se vende por ZELITA y JOHNSON & JOHNSON bajo la marca YONDELIS.
Otro grupo de moléculas efectoras preferidas son sustancias tales como pero no limitadas a toxinas que afectan el metabolismo celular. En particular inhibidores de enzima tales como pero no limitados a olaprib o más preferido proteasoma (por ejemplo bortezomib) e inhibidores de proteina quinasa o inhibidores de lipoxigenasa tales como masoprocol son parte de la presente invención. También se incluyen antagonistas receptores tales como pero no limitados a antagonista receptor de endotelina A (por ejemplo atrasentano) , o esteroides' de sexo tales como testolactona, que interfieren con el metabolismo de estrona. Además se incluyen sustancias que interactúan con receptor de estrógeno tales como polifenoles derivados de plantas, por ejemplo pero no sólo isoflavonoides, estilbenos, silimarina, glicósidos fenilpropanoides referidos como hitoestrógenos .
También adecuadas como moléculas efectoras son sustancias que afectan el metabolismo celular, tales como sustancias empleadas para terapia fotodinámica o de radiación incluyendo pero no limitadas a derivados de porfirina, por ejemplo ácido d-Aminolevulinico . Efaproxiral representa un radiosensibilizante, que aumenta los niveles de oxigeno al disminuir la afinidad de oxigeno-hemoglobina. Además incluyen retinoides (de primera, segunda y tercera generación) , en particular Tretinoina (ATRA) , todos ácidos trans retinóicos que se emplean para tratar leucemia promielocitica aguda (APML = Acute Promyelocytic Leukemia) que se vende para esta indicación por ROCHE bajo la marca VESANOID. Los retinoides son una clase de compuestos químicos que están relacionados químicamente con vitamina A, ejerciendo funciones diversas tales como por ejemplo activación de genes de supresión de tumor. En la actualidad, se emplean para tratar cáncer de la piel y desórdenes inflamatorios de la piel.
En otra - modalidad preferida, las moléculas efectoras pueden afectar las rutas de señalización tales como pero no limitadas a señalización de calcio. Son ejemplos trióxido de arsénico o cloruro de trimetilestaño, este último es un compuesto de organoestaño altamente tóxico .
La presente invención también incluye moléculas efectoras que afectan los mecanismos de resistencia fármacos que pueden incluir, por ejemplo actividad de resistencia anti-múltiples fármacos (mediante inhibición de P-glicoproteína ) . Compuestos heteroaromáticos bicíclicos y derivados pueden servir como ejemplos no limitantes.
Otra clase de molécula efectora puede incluir sustancias, o más particularmente proteínas que interfieren con una ruta de señalización apoptósica, incluyendo, pero no limitadas a, oliqonucleótidos antisentido, más particularmente oligodeoxinucleótidos tales como Oblimersen (INN, marca Genasense; también conocido como Augmerosen y oligodeoxinucleótido antisentido bcl-2 G3139) , que es un oligodeoxiribonucleótido antisentido actualmente estudiados como un tratamiento posible para varios tipos de cáncer, incluyendo leucemia linfocítica crónica, linfoma de células B y cáncer de mama. Se ha propuesto que este compuesto pueda exterminar células de cáncer al bloquear la producción de Bcl-2 y al hacerlas más sensibles a quimioterapia. Una clase de sustancias inductores de apoptosis adicional que pueden servir como moléculas efectoras, comprende polifenoles de plantas tales como pero no limitados a, silimarinas, que son capaces de interferir con reguladores del ciclo celular y proteínas involucradas en apoptosis.
Otras moléculas efectoras pueden incluir enzimas tales como pero no limitadas a, asparaginasa u otras enzimas con actividades antineoplásticas.
Una molécula efectora de fármaco de acuerdo con la presente invención también puede ser un fármaco antiprotozoaria tal como Miltefosine.
En otra modalidad las moléculas efectoras pueden representar polifenoles de plantas, tales como pero no limitadas a, psoralenos y sus metabolitos hidroxi.
Polifenoles de plantas tales como flavonoides, taninos (proantocianidinas) , estilbenoides, curcuminoides y lignanos tienen una de las actividades antitumor anteriormente mencionadas (por ejemplo que inducen apoptosis, freno del ciclo celular) o actividad adicional tal como secuestradores o receptores de radicales libres, actividad quelante de metal, actividad de interferencia de receptor de estrógeno, antioxidante, que interfiere con enzimas que metabolizan los fármacos) son también moléculas efectoras posibles. Más específicamente, los psoralenos y sus metabolitos hidroxi que, son capaces de intercalar en ADN que actúan como queladores de metal que tienen propiedades antioxidantes y citoprotectoras son moléculas efectoras preferidas. Particularmente se prefieren reservatol y derivados polihidroxilados y flavonoides, tales como catequinas y epicatequinas, más específicamente epigalocatequinas 3-0 galato, que pueden actuar como antioxidantes .
Una amplia clasificación de moléculas efectoras de acuerdo con su mecanismo también es posible: Agentes antineoplásticos y agentes inmunomoduladores (de acuerdo con el código ATC L01) en particular "Agentes Quimioterapéuticos Intracelulares" ATC: Sistema de Clasificación Química Terapéutica Anatómica (WHO) 1) Antimicóticos, o moléculas que afectan microtúbulos (agentes de enlace a tubulina) tales como vinca alcaloides y análogos (Vinca alcaloides (Vinblastina, Vincristina, Vinflunina, Vindesina, Vinorelbina) y Taxanos (Paclitaxel, Larotaxel, Docetaxel) dolastatinas (y derivados por ejemplo auristatina) y critoficina, maitansinas y derivados de colchicina, epotilonas (por ejemplo ixabepilona) 2) que afectan la replicación de ADN a) Agentes de intercalado tales como Anferaciclinas ( Daunorubicina, valrubicina, Doxorubicina, Aclarubicina, Epirubicina, Idarubicina, Amrubicina, pirarubicina, Zorubicina) y Antracendionas, tales como sustancias derivadas de Estreptomicinas (Actinomicina, Mitomicina, Bleomicina, Dactinomicina ) o Amsacrina b) Agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno, Nitrosoureas, Alquilsulfonatos, Aziridinas, Hidrazinas ( Procarbazina) , Triazenos, Epóxidos, Etileno Iminas, Altretamina, Mitobronitol, dupcarmicina y análogos/estereoisomeros, Trenimon, Estramustina, CC-1065 c) Agentes tipo alquilantes tales como Platino (por ejemplo Carboplatino, Nedaplatino, Oxaliplatino, Triplatino Tetranitrato, Satraplatino) d) Inhibidores específicos de topoisomerasa I tales como camptoteca (Belotecano, Topotecano) e) Inhibidores específicos de topoisomerasa II tales como Podofilotoxina y derivados (Etoposido, Tenipósido) f) Antimetabolitos que afectan la síntesis de ADN/ARN por interferencia con ácido fólico tal como inhibidores de Dihidrofolato reductasa (por ejemplo Aminopterina, Metotrexato) , inhibidor de timidilato sintasa purina tales como inhibidor de adenosina deaminasa ( Pentostatin) , inhibidor de ribonucleótido reductasa/halogenado (Cladribina, Clofarabina) , Tiopurina, Tiazofurina - Pirimidina tal como inhibidor de Polimerasa de ADN (Citarabina) , inhibidor de ribonucleótido reductasa (Gemcitabina) , agente hipometalante (Azacitidina, Decitabina) - deoxiribonucléotido tal como inhibidor de ribonucleótido reductasa Hidroxicarbamid g) otros agentes de entrelazamiento de ADN tales como compuestos basados en platino (por ejemplo Cisplatino) 3) Otras sustancias que interfieren con ADN por ejemplo "antibióticos citotóxicos/antitumor" tales como Elsamicina A, adicionales antibióticos tales como CC-1065, y subclases de antibióticos tales como calicheamicina enediina o derivada de bacterias o cromo proteina enediina Esperamicina (agentes de combinación de ADN extremadamente tóxicos) o Neocarzinostatina (Otros miembros del grupo de antibióticos de neocarzinostatina son macromicina, actinoxantina, kedarcidina y maduropeptina ) o Trabectedina (ruptura de estructura principal de ADN) 4) toxinas que afectan el metabolismo celular por ejemplo inhibidores HSP90, Lonidamida (inhibidores tanto de respiración y glicólisis que lleva a un decremento en ATP celular) a) Inhibidores de enzimas por ejemplo Olaprib (inhibidor PARP) , inhibidores CDK (Alvocidib) ,· - Proteasoma (Bortezomib) , inhibidores de Proteina quinasa, Masoprocol (inhibidor de Lipoxienasa) b) Antagonistas receptores tales como tutina (antagonista receptor de Glicina (toxina de planta), Atrasentan, receptor de retinoide X (Bexaroteno) , esteroides de sexo tales como testolactona, sustancias que interfieren con el receptor de estrógeno c) Fotosensibilizantes u otros compuestos empleados para terapia foto dinámica (Porfirmer Sodio) , derivados de Porfirina por ejemplo ácido £-Aminolevulínico) d) Radiosensibilizante tal como Efaproxiral que aumenta los niveles de oxígeno al disminuir la afinidad de hemoglobina-oxígeno e) Sustancias que afectan las rutas de señalización por ejemplo señalización de Ca2+ tales como trióxido de arsénico y cloruro de trimetilestaño f) Otras sustancias que interfieren con el metabolismo tales como retinoides y derivados Tretinoina (ATRA) 5) Que afectan procesos epigenéticos tales como inhibidores de HDAC (por ejemplo Panobinostat, Vorinostat, ácido Valporico, MGCD0103 (Mocetinostat) , que están en la actualidad en desarrollo clínico para linfoma de células T cutánea, leucemia mieloide aguda, linfoma de Hodgkin o linfoma folicular) 6) Que afectan los mecanismos de resistencia a drogas tales como compuestos heteroaromáticos bicíclicos, que inhiben P-glicoproteína 7) Sustancias que inducen mecanismos/señalización apoptotica que incluye proteínas pero también oligodeoxinucléotidos antisentido tales como Oblimersen (marca Genasense) 8) Enzimas tales como Asparaginasa 9) Fármacos antiprotozoarios tales como Miltefosina 10) Polifenoles de plantas tales como Flavonoides, Taninos (Proantocianidinas) , Estilbenoides, curcuminoides y lignanos que tiene una de las actividades antitumor anteriormente mencionadas (por ejemplo que inducen apoptosis, freno de ciclo celular) o actividad adicional tal como secuestro o barrido de radicales libres, actividad quelante de metal, actividad de interferencia de receptor de estrógeno, antioxidante, que interfiere con enzimas que metabolizan fármacos) . Más específicamente soralenos y sus metabolitos hidroxi, reserva ol y derivados polihidroxilados, Flavonoides, tales como Catequizas y Epicatequinas, más específicamente epigalocatequinas 3-0 galato 11) Adicionales sustancias naturales y derivados tales como Eotoxina A, toxina Difteria y sus derivados, en donde los derivados pueden ser modificados en forma química o genética.
Moléculas efectoras también pueden ser categorizadas de acuerdo con la clase de sustancia a la que pertenecen tales como compuestos inorgánicos, compuestos aromáticos, compuestos basados en metal, proteínas relacionadas al metabolismo celular, enzimas, péptidos, oligonucleótidos, tales como nucleótidos antisentido, toxinas bacterianas, toxinas derivadas de plantas y polifenoles tales como taninos, flavonoides y cumarinas así como terpenoides, alcaloides, antibióticos anti-tumor (por ejeraplo antibióticos enediina) , micotoxinas, toxinas de invertebrados así como vertebrados, toxinas ambientales.
Un inmunoconjugado de acuerdo con la presente invención comprende al menos un agente dirigido, en particular anticuerpo dirigido y una molécula efectora. El inmunoconjugado puede comprender adicionales moléculas por ejemplo para estabilización. Para inmunoconj ugados , el término "conjugado" en general se emplea para definir la asociación operativa del agente dirigido con una o más moléculas efectoras y no se pretende que se refiera solamente a cualquier tipo de asociación operativa y particularmente no se limita a "conjugación" química. Siempre que el agente dirigido sea capaz de ligar al sitio diana y el efector agregado funciona suficientemente como se pretende, particularmente cuando se suministra el sitio diana, será adecuado cualquier modo de conexión. Los métodos de conjugación de acuerdo con la presente invención incluyen pero no están limitados a, conexión directa de la molécula efectora al anticuerpo dirigido con o sin modificación previa de la molécula efectora y/o el anticuerpo dirigido o en conexión mediante enlazadores. Los enlazadores pueden categorizarse funcionalmente por ejemplo, en ácidos lábiles, enlazadores fotolábiles, enlazadores de ruptura por enzimas, tales como enlazadores que pueden ser descompuestos por peptidasas. Se prefieren enlazadores susceptibles a ruptura en muchas modalidades de la invención. Estos enlazadores susceptibles a ruptura pueden ser descompuestos bajo condiciones presentes en el ambiente celular, en particular un ambiente intracelular y que no tienen efecto nocivo en el fármaco liberado ante la descomposición. Bajos pHs tales como pH de 4 a 5, como existen en ciertos departamentos intracelulares, romperán enlazadores ácido lábiles, mientras que los enlazadores fotolábiles pueden ser descompuestos por ejemplo por luz infrarroja. Sin embargo, los enlazadores que se rompen por/bajo condiciones fisiológicas presentes en la mayoría de las células se prefieren y se refieren aquí como enlazadores de descomposición fisiológica. De acuerdo esto, los enlazadores disulfuro se prefieren en muchas modalidades de la invención. Estos enlazadores son susceptibles a ruptura a través de intercambio de disulfuro, que puede ocurrir bajo condiciones fisiológicas. Enlazadores disulfuro heterobifuncionales incluyen pero no están limitados a, N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (ver, por ejemplo, Carlsson et al. (1978)), N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) (ver, por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 4,563, 304), N-succinimidil 4- (2-piridilditio)pentanoato (SPP) (ver, por ejemplo, Registro CAS número 341498-08-6), N-succinimidil 4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1- carboxilato (SMCC) (ver, por ejemplo, Yoshitake et al., (1979)) y N-succinimidil 4-metil-4- [2- (5-nitro-piridil) -ditio] pentanoato (SMNP) (ver, por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 4,563,304). Las moléculas enlazadoras más preferidas para utilizar en la composición de la invención son SPP, SMCC y SPDB.
Otros enlazadores convenientes pueden incluir enlaces "no segmentables" , tales como pero no limitados a Sulfosuccinimidil maleimidometil ciclohexano carboxilato (SMCC) , que es un enlazador heterobifuncional capaz de enlazar compuestos con compuestos que contienen SH. Moléculas enlazadoras bifuncionales y heterobifuncionales, tales como moléculas enlazadoras heterobifuncionales dirigidas a carbohidratos, tales como S- (2-tiopiridil ) -L-cisteina hidrazida (TPCH) , también están dentro del alcance de la presente invención (Vogel, 2004). La molécula efectora, tal como un maitaisinoide, que puede conjugarse con el anticuerpo dirigido mediante un proceso de dos etapas de reacción, incluyendo como una primer etapa modificación del anticuerpo dirigido con un reactivo de entrelazamiento tal como N-succinimidil piridilditiopropionato (SPDP) para introducir grupos ditiopiridilo en el anticuerpo dirigido. En una segunda etapa, un maitansinoide reactivo que tiene un grupo tiol, tal como DM1, puede agregarse al anticuerpo modificado, resultando en el desplazamiento de los grupos tiopiridil en el anticuerpo modificado, y la producción de conjugado anticuerpo/maitaisinoide citotóxico enlazado a disulfuro (Patente de los E.U.A. número 5,208,020) . Sin embargo, procesos de conjugación de una etapa tales como el descrito en la Publicación de Patente de los E.U.A. número 20030055226 a Chari et al., también están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad de la presente invención múltiples moléculas efectoras del mismo o diferente tipo se conectan o enlazan a un anticuerpo dirigido. Como se discute aquí en otra parte, la naturaleza de los enlazadores empleados puede influenciar el exterminio por actividad inespecifica (Kovtun et al., 2006) . Ver también la discusión de .la Figura 13. Ver también las Patentes de los E.U.A. Números 5,208,030; 5,416,064; 6,333,410; 6,441,163; 6,716,821; 6,913,748; 7,276,497 y la Solicitud de Patente de los E.U.A. Número 2005/0169933, método para preparar inmunoconjugados .
Análogos CC-1065 o derivados pueden conjugarse al agente dirigido mediante por ejemplo grupos de enlace PEG como se describe en la Patente de los E.U.A. Número 6,716, 821.
Las calicheamicinas pueden conjugarse a los anticuerpos dirigidos por enlazadores (Patente de los E.U.A. Número 5,877,296 y Patente de los E.U.A. Número 5,773,001) o de acuerdo con los métodos de conjugación descritos en la Patente de los E.U.A. Número 5,712,374 y la Patente de los E.U.A. Número 5,714,586. Otro método preferido para preparar conjugados de calicheamicina se describe en la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 20040082764. Los inmunoconjugados de la presente invención pueden tomar la forma de proteínas de fusión recombinantes.
Una asociación operacional en forma de conexión con o sin un enlazador se refiere aquí como "conexión o enlace funcional".
Un inmunoconjugado que esencialmente consiste de ciertos componentes significa en el contexto de la presente invención que el anticuerpo/inmunoconjugado consiste de los componentes especificados y cualesquiera materiales o componentes adicionales que no afectan materialmente las características básicas del anticuerpo.
La Figura 9 muestra en (C) y (D) las diferencias en homogeneidad de enlace/dirección entre inmunoconj ugados que comprenden anticuerpo murino BB4 (BB4-SPP-D 1 ; Figura 9C) y el anticuerpo dirigido de ingeniería nBT062 (nBT062-SPP-DM1; Figura 9D) con base en el mismo. Como puede verse de estas gráficas, los resultados obtenidos con el inmunoconjugado que comprende el anticuerpo dirigido de ingeniería son sustancialmente más homogéneos que aquéllos obtenidos con los inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo murino. Esto es particularmente notable ya que la región de enlace de anticuerpo de BB4 no se modificó en nBT062. De esta manera, el inmunoconjugado que comprende la región de enlace de anticuerpo del anticuerpo murino, pero no otras partes del anticuerpo murino, mostró propiedades que exceden por mucho los resultados que hubiera esperado la persona con destreza en la especialidad.
Algunos de los inmunocon ugados de la presente invención tienen una molécula efectora que está estéricamente impedida, y contiene un enlazador segmentable, inmunoconjugado impedido, HICL- Hindered Immunconjugate, Cleavable Linker. Una contraparte no impedida (UI: inmunoconjugado no impedido (UI = ünhindered Immunoconjugate ) de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo dirigido de ingeniería contra CD138 enlazado a una molécula efectora mediante un enlazador segmentable (CL) y se describe aquí como UICL. El UICL es un inmunoconjugado equivalente a HICL que comprende un anticuerpo dirigido de ingeniería en donde la molécula efectora sin embargo no se impide estéricamente. Ejemplos de un par de HICL/UICL son BT062 y nBT062-SPP-DMl . Una contraparte no impedida de este inmunoconjugado que comprende un enlazador no segmentable (UINCL) se refiere al inmunoconjugado equivalente que comprende un anticuerpo dirigido de ingeniería en donde la molécula efectora no está. impedida estéricamente y comprende un enlazador no segmentable. Para BT062 (nBT062-SPDB-DM4) , nBT062-SMCC-DMl constituirá un ejemplo de esta contraparte no impedida que comprende un enlazador no segmentable (UNICL) .
Un crecimiento de una actividad inhibidora del tumor (= actividad inhibidora de crecimiento de tumor) de un inmunoconjugado, es una medida relativa. Describe la actividad inhibidora de crecimiento de tumor de un conjugado respecto a la actividad del inmunoconjugado de más alto desempeño cuya actividad se establece como 100%. Por ejemplo, si la actividad del inmunoconjugado de más alto desempeño, digamos BT062 provocará un retraso en crecimiento de tumor . (TGD = Tumor Growth Delay) de 32 días, se ajusta como 100%, la actividad por ejemplo de nBT062-D l que exhibe un retardo de crecimiento de tumor (TGD) de 18 días se calcula como sigue: Actividad Inhibitoria de Crecimiento de Tumor lOOx (TGDnBT062-D i/TGDBT062 ) , en forma más genérica: Actividad Inhibitoria de Crecimiento de Tumor= lOOx (TGDMuestra/TGDReferencia) · Tabla 6 proporciona ejemplos convenientes a partir de los resultados ilustrados en la Figura 11B: TGD* (días) %Actividad ** PBS 0 0 nBT062-SMCC-DMl 18 56 BT062 32 100 nBT062-SPP-DMl 13 40 Tabla 6: Retardo de crecimiento de tumor (TGD) y % de Actividad de nBT062-DMx contra xenoinjertos de tumor MOLP-8 en ratones SCID con base en los grupos de tratamiento que reciben una dosis de 450 g/kg.
(*) Retardo de crecimiento -de tumor en dias (TGD) como tiempo promedio en dias para que el grupo de tratamiento alcance un tamaño predeterminado (160 mm3) menos el tiempo promedio para que el grupo de control alcance este tamaño predeterminado.
(**) Actividad Inhibitoria de Crecimiento de Tumor =100x (TGDMUeStra/TGDBT062) · La actividad de BT062 se define como 100%.
En el ejemplo que se proporciona en la Tabla 6, BT062 proporciona un crecimiento de una actividad inhibitoria de tumor que excede la de su contraparte no impedida (nBT062-SPP-DMl ) en 60%, y un crecimiento de actividad inhibitoria de tumor que excede la de su inmunoconjugado de contraparte no impedida que comprende un enlazador no segmentable (nBT062-SMCC-DMl) en 44%.
Como se discutió anteriormente, ciertos fármacos tales como maitansinoides, mientras que son efectivos son altamente tóxicos, destruyendo en su forma nativa, es decir no conjugada, las células en forma no selectiva. El enlace del maitansinoide citotóxico a un anticuerpo puede mantener al fármaco inactivo hasta que alcanza la célula objetivo (Lambert 2005) . Varios conjugados anticuerpos-maitansinoide están bajo desarrollo clínico.
Se realizaron estudios de fase I y II con IMGN901 (huN901-DMl, BB-10901) para tratar tumores sólidos positivos a CD56 (cáncer pulmonar de células pequeñas y cánceres neuroendocrinos ) . En estos estudios I GN901 se administró en 4 semanas consecutivas cada- 6 semanas, y en general fue bien tolerado (Fossella et al., 2005, Lorigan et al., 2006, McCann et al., 2007, Cárter and Senter, 2008, Johnson et al. 2008). La porción anticuerpo del inmunoconjugado huN901 muestra significante actividad CDC o ADCC . El mismo inmunoconjugado se investiga para tratamiento de mieloma múltiple positivo CD56. En un estudio Fase I, la administración de IMGN901 en 2 semanas consecutivas cada 3 semanas a un paciente con mieloma múltiple positivo CD56 quien ha fallado tratamientos de mieloma múltiple establecidos, ha mostrado evidencia preliminar de seguridad asi como actividad clínica. Diez y ocho pacientes se reportó que han recibido IMGN901 (3 pacientes cada uno a 40, 60, 75, 90, 112, y 140 mg/m2/semana) . Resultados PK preliminares se reportó que indican, una relación aproximadamente lineal entre dosis y concentración en suero máxima observada. Actividad clínica interesante se ha observado con un perfil de seguridad tolerable. Una respuesta menor (MR = Minor Responce) confirmada se documentó eñ" 3 pacientes fuertemente pretratados (1 paciente cada uno con 60, 90, y 112 mg/m2/semana) utilizando los criterios Europeos de Trasplante de Médula Ósea. Se reportó enfermedad estable 'durable a dosis de 60, 90, 112, y 140. mg/m2/semana (Chanan-Khan et al., 2007, Chanan-Khan et al., 2008). IMGN901 también se investiga en un estudio Fase I en tumores sólidos. El inmunoconjugado se administra diariamente por 3 días cada 3 semanas. Actividad clínica preliminar se ha notado en pacientes con cáncer pulmonar de células pequeñas, carcinoma de células merkel y otros tumores sólidos. Continúa la escala de dosis.
MLN2704 (huJ591-DMl) se investiga para tratar cáncer de próstata resistente a castración (Milowsky et al., 2006, Brand and Tolcher 2006). Una prueba Fase I de MLN2704 en pacientes con cáncer de próstata resistente a castración metastásico progresivo investigan el perfil de seguridad, farmacocinética, inmunogenicidad y actividad antitumor de MLN2704 cuando se administra una- vez cada cuatro semanas. Resultados demuestran que las dosis terapéuticas de MLN2704 pueden administrarse en forma segura en una base repetitiva (Galsky et al., 2008). Pruebas en paralelo se realizaron con otro inmunoconjugado-DM1, es decir bivatuzumab mertansina que hace diana en CD44v6, que se expresa en carcinomas de cabeza y cuello y otros tumores sólidos. En la prueba clínica con el programa de administración más condensado (administración semanal) enlace a CD44v6 en queratinocitos de piel media toxicidad seria en la piel con un resultado fatal en un paciente, que llevó a terminar el programa de desarrollo de bivatuzumab mertansina (Tijink et al., 2006, Sauter et al., 2007, Rupp et al., 2007, Riechelmann et al., 2008).
CD44v6 no sólo se expresa en diversas células de cáncer, sino también en tejido de piel normal y semeja en este aspecto CD138 que también se expresa no sólo en células de cáncer sino en tejido de piel normal. De manera sorprendente, se encontró que BT062 muestra eficacia clínica sin efectos secundarios intolerables como toxicidad en la piel como se encuentra en bivatuzumab mertansina. Ver Figura 23, que muestra que repetidas dosis sencillas de BT062 de hasta 160 mg/m2 llevan a cuando menos enfermedad estable con efectos secundarios manejables. Los resultados ilustrados en la Figura 23 también muestran que 10 dosis sencillas repetidas de 20 mg/m2 (tratamiento sobre más de 6 meses) , 5 dosis sencillas repetidas de 40 mg/m2, 5 dosis sencillas repetidas de 80 mg/m2, 6 dosis sencillas repetidas de 160 mg/m2, y 1 sola dosis sencilla de 200 mg/m2, seguido por 6 dosis sencillas repetidas de 160 mg/m2 (ergo, una dosis total de 1160 mg/m2) fueron bien toleradas (pacientes asociados con 003-005 y 002-012, y 002-011 todavía están en proceso de tratamiento) .
CD138 también se expresa en células de sangre normal y otras células, tales como células del epitelio, cuya destrucción llevaría a efectos secundarios intolerables. Independientemente de esto, no se encontró toxicidad limitante de dosis hacia células no cancerosas/no tumorales que expresan CD138 de cualquier tipo en los regímenes de tratamiento ilustrados en la Figura 23 hasta 120 mg/m2, mientras que la dosis tolerable máxima (MTD = Máximum Tolerable Dose) era en este estudio determinada como 160 mg/m2 y la dosis administrada máxima (MAD = Máximum Administered Dose) se determinó que es 200 mg/m2. Dosis entre 160 mg/m2 y 200 mg/m2 no se probaron. Dosis superiores en general no se suministraron en vista de las toxicidades limitantes de dosis (DLT = Dose Limiting Toxicities) a 200 mg/m2. Sin embargo, se observó que la dosis de DLT todavía era aceptable cuando se administra con dosis menores subsecuentes tales como dosis de 160 mg/m2. Una toxicidad clínicamente no significante contra células no cancerosas/no tumorales que expresan CD138 (células no diana que expresan CD138) se refiere aquí como "toxicidad clínicamente aceptable" o "toxicidad tolerable" contra dichas células y el o los órganos respectivos. La cantidad respectiva de inmunoconjugado que se administra se refiere aquí como "cantidad tolerable". De esta manera, en una modalidad de la presente invención, el inmunoconjugado exhibe toxicidad clínicamente aceptable hacia estas células no objetivo que expresan CD138, en particular células del epitelio que expresan CD138, que no se detectan por BT062 en el modelo de xenoinjerto de ratón debido a especificidad de humano.
Toxicidad clínicamente aceptable incluye que se lleve a cabo una reacción adversa, hasta un nivel manejable o tolerable.- Una reacción adversa se define como un efecto indeseable, razonablemente asociado con el uso de un fármaco, aquí el inmunoconjugado, que puede ocurrir como parte de la acción farmacológica del fármaco o puede no ser pronosticable en su ocurrencia. Esta definición no incluye todos los eventos adversos observados durante uso de un fármaco, sólo aquellos para los cuales hay cierta base para creer que hay una relación causal entre el fármaco y la ocurrencia del evento adverso. Reacciones adversas -pueden incluir signos y síntomas, cambios en parámetros de laboratorio y cambios en otras medidas de función crítica del cuerpo, tales como signos vitales y ECG.
Si una célula, tal como una célula no diana especialmente una célula no diana (célula no tumoral) que expresa CD138 se dice que es "sustancialmente no afectada" por la administración, en particular la administración de una cierta dosis de un compuesto tal como un inmunoconjugado, significa que cualquier interacción que este compuesto ha tenido con la célula no diana resultó en ninguna o una reacción adversa tolerable/manejable.
Estudios Fase I con la forma de inmunoconj ugada de ' trastuzumab (T-DM1) para tratamiento de cáncer de mama metastásico que sobreexpresa HER2 se realizan para investigar seguridad y farmacocinética de T-DM1 administrado semanalmente una vez cada 3 semanas. En ambos estudios AEs de grado > 2 relacionado a T-DMl ha sido infrecuente y manejable. Respuestas de tumor objetivas se han observado a dosis en o por debajo de MTD (Burris et . al., 2006, Krop et al., 2007, Beeram et al., 2008, Holden et al., 2008) . Un estudio Fase II que investiga T-DMl en cáncer de mama metastásico HER2 positivo cuando se administra una vez cada 3 semanas, se ha iniciado (Beeram et al., 2008, Cárter and Senter, 2008, Holden et al., 2008) . Una prueba clínica Fase III que evalúa T-DM1 para cáncer de mama metastásico HER2-positivo de segunda línea y pruebas clínicas Fase II que evalúan T-DM1 para cáncer de mama metastásico HER2-positivo de primera, segunda y tercer líneas están en proceso. Una prueba clínica Fase Ib en combinación con pertuzumab para pacientes de cáncer de mama metastásico HER2-positivo quienes han progresado en tratamiento basado en Herceptina, se planea. Tres pruebas clínicas fase I se han completado con cantuzumab mertansina, un conjugado DMl del anticuerpo huC242 que hace blanco o diana en un antígeno que se encuentra en cánceres colorectales y otros cánceres que expresan C242. El tratamiento con huC242-DMl administrado en una base semanal así como una vez cada 3 semanas se encontró que es seguro y tolerado (Rowinsky et al., 2002, Tolcher et al., 2003, Helft et al. , 2004) .
Cuatro estudios investigan inmunocon ugados utilizando el maitansinoide DM4 que contiene tiol, que también es un componente BT062: Un análogo de cantuzumab mertansina, IMGN242 (huC242-DM4 ) , se investigó en un estudio fase I en sujetos con cáncer que expresan CanAg (Tolcher et al., 2006) . Sujetos recibieron una sola infusión IV de IMGN242 una vez cada 3 semanas con una dosis en el intervalo de 18 a 297 mg/m2. Toxicidad limitante de dosis se experimentó por 2 de 6 sujetos tratados al nivel de dosis 223 mg/m2 durante su segundo ciclo de tratamiento. El fármaco fue bien tolerado al nivel 168 mg/m2 y no induce ninguna respuesta de anticuerpo detectable (Mita et al., 2007). Con base en los primeros resultados de seguridad del estudio Fase I, se inició un estudio Fase II para evaluar IMGN242 para tratar cáncer gástrico que expresa CanAg para dosis de 168 mg/m2 (Sankhala et al., 2007). Cuarenta y cinco pacientes han sido tratados con IMGN242 en dos pruebas clínicas. Con base en la seguridad y completos análisis clínicos farmacocinéticos ( PK) /farmacodinámicos (PD) , el estudio Fase II se enmendó para tratar pacientes con bajos niveles de CanAg en plasma en la dosis de 126 mg/m2 y pacientes con altos niveles de CanAg en plasma a 168 mg/m2 (Qin et al. 2008) .
Un estudio fase I con anticuerpo huMy9-6 conjugado a DM4 (AVE9633) también se realizó para el tratamiento de sujetos con leucemia mieloide aguda CD33-positiva (AML) . El régimen de tratamiento consistió de infusiones IV una vez cada 3 semanas utilizando un intervalo de dosis de 15 a 260 mg/m2. Ni mielosupresión asociada ni respuestas se han anotado en un estudio de una sola dosis (Giles et al., 2006). Un segundo estudio de fase I que investiga AVE9633 con el régimen de tratamiento que consiste de infusiones IV el día 1 y el día 8 de un ciclo de 28 días también mostró que AVE9633 fue bien tolerado y muestra evidencia de actividad antileucemia incluyendo un sujeto con respuesta completa (respuesta de plaquetas inadecuada, dependiente de transfusión) que dura al menos 4 meses (Legrand et al., 2007) . Dos adicionales inmunocon ugados DM4 (SAR3419 y BIIB015) han entrado a pruebas clínicas de Fase I.
También, se conoce de otros inmunoconjugados tales como Mylotarg que hace blanco o diana en CD33, que la actividad del inmunoconjugado puede no ser suficiente para tratar pacientes a bajas dosis. Este problema se ha aliviado por ejemplo por administración de factor de estímulo de colonia de granulocitos humanos recombinantes (rhG-CSF = recombinant' human Granulocyte Colony Stimulating Factor) para sensibilizar células diana que expresan CD33 (Fianchi et al., Annals of Oncology 2008 19 (1) : 128-134) .
Los estudios anteriores demuestran que las respuestas a diferentes inmunoconjugados, en particular inmunoconjugados que contienen maitansinoide (tales como DM1 o DM4), varían ampliamente. Las pruebas de BT062 en sujetos humanos mostraron tolerable toxicidad contra células no cancerosas que expresan CD138 a diferentes dosis de enfermedad estable, en especial a dosis de hasta 160 mg/m2.
El inmunoconjugado aquí descrito puede administrarse en combinación con agentes citotóxicos. Estas combinaciones se refieren aquí como combinaciones anticáncer .
Actualmente, muchas combinaciones en particular de fármacos anti-mieloma se investigan en pruebas clínicas. El propósito del uso de una combinación en general ya sea para mejorar la efectividad, para superar un fenotipo refractario, por ejemplo, de células de mieloma, para reducir efectos secundarios debido al uso de menores concentraciones de uno de los socios de combinación o una combinación de los mismos. Se mostró que reduce toxicidad utilizar una baja dosis, por ejemplo, de lenalidomida más una baja dosis de dexametasona (Rajkumar et al., 2010) .
Especialmente en pacientes con ¦ mieloma múltiple de relapso o refractario, hay y se han investigado varias combinaciones de fármacos.
Un ejemplo estándar para combinar agentes quimioterapéuticos representa la combinación triple de vincristina, dexametasona, doxorubicina (régimen VAD) .
Inhibidores proteasomales tales como bortezomib se han combinado con fármacos de mieloma, tales como melfalan y prednisona (VMP) . Esta combinación resultó en una tasa de respuesta completa de 16% y una tasa de respuesta total de 89% (Mateos et al., 2006).
Bortezomib también se ha aprobado para uso en com inación con doxorubicina liposomal para pacientes de relapso o refractarios (Ning et al., 2007) .
Bortezomib se investiga en varios estudios clínicos para uso en combinación con dexametasona, melfalan, prednisona y/o talidomida.
Bortezomib también está bajo investigación, combinado con doxorubicina liposomal, ciclofosfamida y dexametasona en pacientes de mieloma múltiple. Combinaciones con Vorinostat actualmente están bajo investigación dirigidas a resensibilizar pacientes a bortezomib que son refractarios a este fármaco.
La talidomida, que se administra oralmente, se ha combinado con melfalan / prednisona (MPT) (Facón et al., 2006) o dexametasona o bendamustina (Ponisch et al., 2008) .
Aún más, lenalidomida, un fármaco inmunomodulador, empleado en combinación con dexametasona, resultó en un tiempo prolongado a progresión de tumor e incrementada supervivencia en comparación con dexametasona sola (Weber et al., 2006). Lenalidomida combinada con dexametasona también se ha estudiado en pacientes recientemente diagnosticados (Rajkumar et al., 2005) asi como la combinación con melfalan/prednisona (RMP) (Palumbo et al. , 2006) .
La Publicación de Patente de los E.ü.A. No. 2010/0028346 otorgada a Lutz et al., describe efectos sinergísticos de ciertos inmunocon ugados con agentes quimioterapéuticos .
En el presente contexto, una meta de emplear combinaciones es una reducción en la dosis efectiva del inmunoconjugado de la presente invención, reduciendo sus efectos secundarios y abriendo nuevas ventanas terapéuticas con efectos secundarios aceptables. Otra meta es reducir la dosis efectiva de agentes citotóxicos previamente empleados tales como VELCADE o lenalidomida y de preferencia reducir los efectos secundarios de estos agentes. Similarmente, las consecuencias positivas de dosis incluyen, pero no están limitados a prolongación de tratamiento, superiores dosis, otros programas de aplicación,, respuesta mejor y más sostenida al tratamiento.
Pacientes que exhiben un fenotipo refractario a fármacos tales como lenalidomida, melfalan (estudio en proceso) pueden hacerse sensibles de nuevo por el uso de inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención.
La expresión "agente citotóxico" comprende "fármacos citotóxicos/de cáncer" incluyendo agentes quimioterapéuticos, en particular agentes quimioterapéuticos que, en general se emplean en células de rápida división, es decir: Agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno (por ejemplo melfalan, ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, clorambucil, ifosfamida) o nitrosureas (e.g. carmustina, lomustina, streptozocina) o alquilsulfonatos; - Agentes tipo alquilantes tales como cisplatina, carboplatina, nedaplatina, oxaliplatina; o agentes alquilantes no clásicos tales como tetrazinas, dacarbizina, procarbazina, altretamina Antraciclinas tales como doxorubicina y doxorubicina liposomal (DOXIL) - Alcaloides tales como vincristina La expresión "agentes citotóxicos" también comprende fármacos inunomoduladores (ImiDs = imunomodulatory drugs) tales como talidomida (o análogos), lenalidomida (CC-5013) , pomalidomida, actimid, que se emplean para terapia de mieloma en vista de sus propiedades inmunomoduladoras pleiotrópicas . Comúnmente exhiben actividad anti-inflamatoria por inhibición de producción TNF alfa, pero también exhiben actividad anti-angiogénica y propiedades inmunomoduladoras tales como co-estimulo de células T e influencia en células T regulatorias (Quach et al. , 2010) .
La expresión "agente citotóxico" también comprende esteroides, tales como, pero no limitados a, dexametasona y prednisona asi como inhibidores proteosomales tales como bortezomib (VELCADE) o carfilzomib que inducen la activación de muerte celular programada en células neoplásicas dependientes de supresión de rutas pro-apoptóticas .
Adicionales agentes citotóxicos . potentes, incluyen etopósido, que inhiben la enzima topoisomerasa II, citarabina, que ante conversión daña ADN cuando un ciclo celular se mantiene en fase S (síntesis de ADN) y de esta manera en particular afecta a células de rápida división tales como células de cáncer. Además, agentes inhibidores de microtúbulos tales como vinca alcaloides, taxanos (como se describió anteriormente en el contexto de moléculas efectoras) también pueden servir como agentes citotóxicos de acuerdo con la presente invención.
También s,e incluye en la definición inhibidor quinasa tales como inhibidores sorafenib o HDAC (histona deacetilasa) tales como romidepsina así como agentes inhibidores de crecimiento, agentes anti-hormonales, agentes anti-angiogénicos , cardioprotectores , agentes inmunoestimulatorios, agentes inmunosupresores, inhibidores de angiogénesis, inhibidores de proteína tirosina quinasa (PTK = Protein Tyrosine Kinase) .
Además incluyen en esta definición agentes citotóxicos basados en anticuerpo incluyendo inmunoconjugados y anticuerpos que tienen un efecto citotóxico reconocido en la técnica. Anti-CD40 es un anticuerpo preferido. Otros anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo AVASTIN (bevacizumab) o MYELOMACIDE (milatuzumab) .
Talomida (a- (N-ftalimido) glutarimida; talidomida) , es un agente inmunomodulador . La fórmula empírica para talidomida es Ci3Hí0N2O4 y el peso molecular en gramos es 258.2. El número CAS de talidomida es 50-35-1. Parece tener múltiples acciones, incluyendo la capacidad de inhibir el crecimiento y supervivencia de células de mieloma en diversas formas y de inhibir el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos.
Lenalidomida (REVLIMID) es un derivado de talidomida que representa la segunda generación de compuestos inmunomoduladores (ImiDs = immunomodulatory compounds) que inicialmente se desarrollaron como inhibidores de TNF alfa. Efectos de lenalidomida incluyen freno de crecimiento o apoptosis, abrogado de adhesión de células de mieloma a células estromales de médula ósea y modulación de citoquinas que promueven crecimiento celular, supervivencia y resistencia a fármacos de células de mieloma (Morgan et al., 2006) . Lenalidomida es efectiva en pacientes refractarios a talidomida. Además de efectos en células inmunes, ImiDs tales como lenalidomida se sugirió que provocan freno de ciclo celular en fase G0/G1. Además, se considera que ImiDs regulan por disminución los receptores de adhesión cleular (VLA-4, VLA-5, CD138) (Quach et al. , 2010) .
Una regulación por disminución de CD138 se esperará que provoque un enlace reducido de cualquier agente que hace blanco CD138, tal como BT062, a células dian .
Inhibidores de proteasoma pueden dividirse en adicionales subgrupos: a) derivados péptidos de origen natural que tienen una estructura epoxi cetona C-terminal, derivados beta-lactona, aclacinomicina A, lactacistina, clastolactacistina; y b) inhibidores sintéticos (que comprenden aldehidos péptido modificados, estructuras alfa, beta epoxicetona, vinil sulfonas, residuos de ácido bórico, pinacolesteres . Un inhibidor proteasomal preferido de la presente invención es bortezomib (PS 341; VELCADE, ver la discusión a continuación) . Uno de los mecanismos propuestos sugiere que la inhibición proteasomal puede evitar degradación de factores pro-apoptósicos, permitiendo activación de muerte celular programada en células neoplásicas dependientes de supresión de rutas pro-apoptóticas. Además, bortezomib provoca freno de ciclo celular G2/M (Wang et al., 2009) . De esta manera, bortezomib puede interferir con agentes anti-mitóticos que son parte del inmunconjugado de la presente invención, por ejemplo con el efecto de maitansinoide DM4, que actúa también en esta fase de ciclo celular. Además, la segmentación de PARP (Poli (ADP-ribosa) Polimerasa) , que se lleva a cabo en la apoptosis, también es afectada tanto por DM4 como bortezomib. De acuerdo con esto, la combinación de un inmunoconj ugado que comprende un agente anti— mitótico, y un inhibidor proteasomal que exhibe las características de bortezomib, no se adapta con las guías generales establecidas previamente para obtener efectos sinergísticos (Takimoto et al, 2009) .
VELCADE (bortezombid) es un inhibidor de proteasoma empleado para tratar mieloma múltiple. Se considera que VELCADE actúa en las células de mieloma para provocar muerte celular, y/o actúa indirectamente para inhibir crecimiento celular de mieloma y supervivencia por acción en el microambiente de huesos. Sin estar limitado a una teoría o modo de acción específico, VELCADE de esta manera interrumpe procesos celulares normales, resultando en inhibición de proteasoma que promueve apoptosis.
Dexametasona es una hormona esteroide glucocorticoide sintética que actúa como un antiinflamatorio e inmunosupresor . Cuando se administra a pacientes de cáncer, dexametasona puede contra-atacar los efectos secundarios de la terapia de cáncer. Dexametasona tam ién puede suministrarse sola o junto con otros agentes anticáncer, incluyendo talidomida, lelinalidomida, bortezomib, adriamicina o vincristina.
Sustancias para tratamiento, que pueden emplearse en combinación con BT062 también incluyen agentes inmunomoduladores (por ejemplo talidomida y lenalidomida, y pomalidomida) , inhibidores de proteasoma (por ejemplo bortezomib y carfilzomib) , esteroides (por ejemplo dexametasona) , agentes alquilantes y quimioterapia de alta dosis, combinaciones (por ejemplo Melfalan y Prednisona (MP) , Vincristina, doxorubicina (Adriamicina), y dexametasona (VAD) ) , y bisfosfonatos .
La expresión "en combinación con" no se limita a la administración exactamente al mismo tiempo. Por el i contrario, el término abarca administración del inmunoconjugado de la presente invención y el otro régimen (por ejemplo radioterapia) o agente, en particular los agentes citotóxicos referidos previamente en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que puedan actuar en conjunto para proporcionar un beneficio (por ejemplo, incrementada actividad, disminuidos efectos secundarios) que se incrementa en comparación con el tratamiento con solo cualquier inmunoconjugado de la presente invención, o por ejemplo el o los otros agentes. Se prefiere que el inmunoconjugado y el otro agente o agentes actúen en forma aditiva, y en especial se prefiere que actúen en forma sinergistica . Estas moléculas son proporcionadas de manera conveniente en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. El practicante médico con destreza en la especialidad puede determinar en forma empírica, o al considerar la farmacocinética y modos de acción de los agentes, la o las dosis apropiadas de cada agente terapéutico, así como las sincronizaciones y métodos de administración apropiados. Como se emplea en el contexto de la presente invención "la administración concurrente" se refiere a la administración al mismo tiempo que el inmunoconjugado, a menudo en una forma de dosis combinada.
Efectos sinergísticos, que son los efectos de dos componentes tales.. como un inmunoconjugado y un agente citotóxico, que excede un efecto estrictamente aditivo. Estos efectos sinergísticos pueden ser contra-atacados por una cantidad de factores que se discuten adicionalmente a continuación .
El sinergismo se ha calculado como sigue (Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009): PROPORCIÓN (r) = FTV esperado (combinación) /FTV observado (combinación) FTV: Volumen de tumor fraccional (Fractional tumor volume) = volumen de tumor promedio (prueba) /volumen de tumor promedio (control) Una relación > 1 se considera como sinergistica, mientras que r < 1 es menos que aditiva.
La relación (r) es, cuando está sobre 1, también se refiere como "PROPORCIÓN DE SINERGIA".
La CALIFICACIÓN DE ACTIVIDAD es otra medida para los efectos de una combinación. Esta calificación se basa en el exterminio celular Logio Exterminio celular Logio = (T-C) / Td x 3.32 en donde (T-C) o retraso en crecimiento de tumor, es el tiempo promedio en días requerido para que los tumores del grupo de tratamiento (T) y el grupo de control (C) , alcancen un tamaño predeterminado (600 mm3) . Td es el tiempo de duplicación del tumor, con base en el volumen de tumor promedio en el ratón de control, y 3.32 es el número de duplicaciones celulares por log del crecimiento celular. (Bissery et al., 1991). Un exterminio celular Logio superior a 2.8 indica que la combinación es altamente activa, un exterminio celular logio de 2.0-2.8 indica que la combinación es muy activa, un exterminio celular logio de 1.3-1.9 indica que la combinación es activa, un exterminio celular logio de 0.7- 1.2 indica que la combinación es moderadamente activa y un exterminio celular logio menor a 0.7 indica que la combinación es inactiva.
Selección de socios de combinación de fármacos Un conjunto de guías para el diseño de regímenes de quimioterapia de combinación se ha desarrollado (Takimoto, 2006) . Cumplir con estas guías en general incrementará las posibilidades de que una combinación particular logre al menos uno de las tres ventajas teóricas más importantes de la quimioterapia en combinación sobre la terapia de un solo agente: 1) Llevar al máximo el exterminio celular mientras que reduce al mínimo las toxicidades y hospederos al utilizar agentes con toxicidades limitantes de dosis sin interferencia; 2) Incrementar el intervalo de actividad de fármaco contra células de tumor con resistencia endógena a tipos de terapia específicos; y 3) Evitar o frenar el desarrollo de nuevas células de tumor resistentes.
Los principios recomendados a considerar para seleccionar agentes para uso en regímenes de quimioterapia en combinación comprenden: a) seleccionar fármacos que se conoce inducen remisión completa como agentes sencillos, b) seleccionar fármacos con diferentes modos de acción y con efectos citotóxicos aditivos o sinergísticos que deberán combinarse, c) seleccionar fármacos con diferentes toxicidades limitantes de dosis, d) seleccionar fármacos con diferentes patrones de resistencia para reducir al mínimo la resistencia cruzada .
También, fármacos deberán administrarse a su dosis óptima y programa (e) , y la administración deberá realizarse a intervalos consistentes, mientras que el periodo libre de tratamiento deberá ser lo más corto posible para permitir la recuperación de tejido normal (f) (Takimoto et al, 2009) . * Efectos sinergísticos o efectos solo aditivos pueden ser contra-atacados por una variedad de factores: Por ejemplo, los componentes de una combinación anticáncer pueden inactivarse entre sí, por ejemplo al ligar entre sí. Además., un componente de una combinación anticáncer puede interferir con el modo de acción de otro componente. Por ejemplo: Lenalidomida regula por disminución los receptores de adhesión celular tales como CD138, que es el objetivo o diana del inmunoconjugado de la presente invención (Quach et al., 2010). El inhibidor de proteasoma bortezomib provoca freno de ciclo celular G2/M (Wang et al., 2009) que también se afecta por agentes anti-mitóticos . De esta manera, si la molécula efectora del inmunoconj ugado es un maitansinoide, compartirá un objetivo o diana para acción con bortezombid, que se considera desventajoso.
Dosis, rutas de administración y uso recomendado de los agentes citotóxicos de acuerdo con la presente invención que se han empleado ampliamente en terapia de cáncer se conocen en la técnica y se han descrito en literatura tal como el Manual de Referencia para Médicos (PDR = Physician's Desk Reference) . El PDR describe dosis de los agentes que se han empleado en tratamiento de diversos cánceres. El régimen de dosis y dosis de estos agentes citotóxicos que son efectivos, dependerá del cáncer en particular que se trata, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares al médico con destreza en la técnica y pueden ser determinados por el médico. La edición 2006 del (PDR) describe el mecanismo de acción y dosis preferida de tratamiento y programas de dosis para talidomida (p 979-983), VELCADE (p 2102-2106) y melfalan (p 976-979) . Una persona con destreza en la técnica puede revisar el PDR, utilizando uno o más de los siguientes parámetros, para determinar régimen de dosis y dosis de los agentes quimioterapéuticos y conjugados que pueden emplearse de acuerdo con las enseñanzas de esta invención. Estos parámetros incluyen: 1. índice completo de acuerdo con a) Fabricante b) Productos (por compañía o nombre de fármaco con marca) c) índice de categoría (por ejemplo, "inhibidores de proteasoma", "agentes alquilantes de ADN", "melfalan" etc.) d) índice genérico/químico (nombre de fármacos comúnes sin marca) . 2. Imágenes de color de medicamentos 3. Información de producto, consistente con etiquetado de la FDA incluyendo a) Información química b) Función/acción c) Indicaciones y Contra-indicaciones d) Investigación de prueba, efectos secundarios, advertencias.
Como apreciará la persona con destreza en la técnica, la secuencia de aminoácidos de la porción de anticuerpo dirigido de ingeniería preferida de un inmunoconjugado, nBT062 puede variarse sin pérdida de la funcionalidad de la porción de anticuerpo dirigido a CD138. Esto en particular es cierto cuando la región variable de cadena pesada CDR3 que comprende los residuos aminoácidos 99 a 111 de SEQ ID NO: 1, y la región variable de cadena ligera CDR3 que comprende residuos aminoácidos 89 a 97 de SEQ ID NO: 2, respectivamente de la región de enlace de antígeno (ABR = Antigen Binding Región) . Ventajosamente, las regiones variables de cadena pesada CDRl y CDR2 que comprende residuos aminoácidos 31 a 35 y 51 a 68 de SEQ ID NO: 1, y/o (b) región variable de cadena ligera CDRl y CDR 2 que comprenden residuos aminoácidos 24 a 34 y 50 a 56 de SEQ ID NO: 2, respectivamente de la región de enlace de antígeno (ABR) también se mantienen.
La expresión "identidad de secuencia" se refiere a una medida de la identidad de secuencias de nucleótido o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias se alinean de manera tal que se obtiene la correspondencia de más alto orden. "Identidad", per se, tiene significado reconocido en la técnica y puede calcularse utilizando técnicas publicadas. (Ver, e.g.: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. , ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Mientras existe una cantidad de métodos para medir identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por las personas con destreza (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
Si cualquier molécula de ácido nucleico particular es al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico, por ejemplo a la secuencia de ácido nucleico nBT062, o una parte de la misma, cada una puede determinarse en forma convencional utilizando programas de computadora conocidos tales como el programa DNAsis (Hitachi Software, San Bruno, Calif.) para alineamiento de secuencia inicial seguido por ESEE versión 3.0 DNA/protein sequence software (cabot@trog.mbb. sfu. ca) para alineamientos de múltiples secuencias.
Si la secuencia de aminoácidos es al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica, por ejemplo a SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 2, o una parte de los mismos, puede determinarse en forma convencional utilizando conocidos programas de computadora tales como el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) . BESTFIT utiliza el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias.
Cuando se utilizan DNAsis, ESEE, BESTFIT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular por ejemplo es 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se establecen de manera tal que el porcentaje de identidad se calcula sobre toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de referencia y que se permiten espacios en homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia .
Si, en el contexto de la presente invención, se hace referencia a una cierta identidad de secuencia con una combinación de residuos de una secuencia particular, esta identidad de secuencia se refiere a la suma de todos los residuos especificados.
Como se discutió anteriormente, BT062 es un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo quimérico dirigido a CD138 tiene nBT062 que se conecta mediante un enlazador, aquí SPDB, al derivado maitansinoide citostático DM4. Una representación química de BT062 se proporciona en Figuras 1 y 2. Inmunoconjugados que comprenden nBT062 y una molécula efectora maitansinoide a menudo se caracterizan en términos de su enlazador y efector maitansinoide, e.g., nBT062-SMCC-DMl , es un inmunoconjugado que comprende nBT062, SMCC (un enlazador "no segmentable" que contiene un enlace tioéster) y DM1 como un efector. En forma más genérica, un inmunoconjugado que contiene nBT062 y una molécula efectora también puede describirse como un efector-enlazador-nBT062 o solo como un efector nBT062 (nBT062N, en donde N es cualquier efector descrito aquí (ver también la Publicación de Patente de los E.U.A. 20090232810).
En una modalidad, BT062 liga a células de mieloma múltiple positivas a CD138. Una vez que la célula diana internaliza y/o libera inmunoconjugado, DM4 se libera de la molécula dirigida, de esta manera restaurando su potencia citotóxica original de DM4. De esta manera, BT062 proporciona una carga útil de anticuerpo dirigido (??? = Targeted Antibody Payload) , en donde el enlace funcional de DM4 a nBT062 mantiene inactivo el fármaco citotóxico hasta que llega/se internaliza en la célula dirigida que expresa CD138.
Datos de estudios no clínicos que investigan citotoxicidad de BT062 en células de mieloma múltiple y modelos de animales aquí discutidos, demuestran que >BT062 tiene actividad antimieloma altamente significante a dosis que son bien toleradas en un modelo murino .
Se realiza un estudio de una sola dosis repetida, con escala de dosis, etiqueta abierta de fase I en pacientes con mieloma múltiple de relapso o de relapso/refractario .
Los inmunoconjugados aquí descritos pueden ser administrados por cualquier ruta, incluyendo en forma intravenosa, parenteral, oral, intramuscular, intratecal o como un aerosol. El modo de suministro dependerá del efecto deseado. Una persona con destreza fácilmente sabrá la mejor ruta de administración para un tratamiento particular de acuerdo con la presente invención. La dosis apropiada dependerá de la ruta de administración y el tratamiento indicado y puede determinarse fácilmente por una persona con destreza en la especialidad en vista de los protocolos de tratamiento actuales.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el inmunoconjugado de la presente invención y/o cualquier agente citotóxico adicional como ingredientes activos pueden prepararse de acuerdo con técnicas de formulación farmacéutica convencionales. Ver, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed. (1985, Mack Publishing Co., Easton, Pa . ) · Típicamente, cantidades efectivas de ingredientes activos se mezclarán con un portador farmacéutico aceptable. El portador puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para administración, por ejemplo, intravenosa, oral, paren-teral, intratec l, transdérmica o por aerosol.
Las combinaciones anticáncer de la presente invención de preferencia ya pueden ser en la forma de composiciones farmacéuticas o en la forma de equipos que comprenden los componentes de la combinación anticáncer en diferentes recipientes. Los componentes del equipo usualmente se administran en combinación entre sí, a menudo son co-administrados ya sea en una forma de dosis combinada o en formas de dosis separadas. Estos equipos también pueden incluir, por ejemplo otros componentes, un dispositivo para administrar los componentes o combinación, un dispositivo para combinar los componentes y/o instrucciones de cómo utilizar y administrar los componentes .
Para administración oral, el inmunocon ugado y/o agente citotóxico pueden formularse en preparaciones sólidas o liquidas tales como cápsulas, pildoras, tabletas, pastillas, fusiones, polvos, suspensiones o emulsiones. Para preparar las composiciones en forma de dosis oral, cualquiera de los medios farmacéuticos usuales pueden ser empleados, tales como por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes, agentes de suspensión, y semejantes en el caso de preparaciones liquidas orales (tales como por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones) ; o portadores tales como almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y semejantes en el caso de preparaciones sólidas orales (tal como por ejemplo, polvos, cápsulas y tabletas) . Debido a su facilidad de administración, tabletas y cápsulas representan la forma unitaria de dosis oral más ventajosa, en cuyo caso portadores farmacéuticos sólidos se emplean obviamente. Si se desea, las tabletas pueden ser de revetimiento con azúcar o revestimiento entérico por técnicas estándar. El agente activo debe ser estable para el paso a través del tracto gastrointestinal. De ser necesario, agentes convenientes para paso estable pueden emplearse, y pueden incluir fosfolipidos o derivados de lecitina descritos en la literatura, asi como liposomas, microparticulas (incluyendo microesferas y macroesferas) .
Para administración parenteral, el inmunoconjugado y/o agente citotoxico pueden disolverse en un portador farmacéutico y administrarse ya sea como una solución o una suspensión. Son ilustrativos de portadores convenientes agua, salino, solución amortiguada con fosfato (PBS = Phosphate Buffer Solution) , soluciones de dextrosa, soluciones de fructosa, etanol, o aceites de origen animal, vegetal o sintético. El portador también puede contener otros ingredientes, por ejemplo, conservadores, agentes de suspensión, agentes solubilizantes, amortiguadores y semejantes. Cuando el agente dirigido en un conjugado y/o inmunoconjugado y/o agente citotoxico se administran en forma intracerebroventricularl o intratecal, también puede ser disuelto en fluido cerebroespinal.
Dosis administradas a un sujeto pueden ser especificadas como cantidad, por área superficial del sujeto (que incluyen humanos asi como animales no-humanos) . La dosis puede ser administrada a dicho sujeto en cantidades de preferencia, pero no en forma exclusiva de aproximadamente 5 mg/m2 a aproximadamente 300 mg/m2, incluyendo aproximadamente 10 mg/m2, aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 40 mg/m2, aproximadamente 50 mg/m2, aproximadamente 60 mg/m2, aproximadamente 80 mg/m2, aproximadamente 100 mg/m2, aproximadamente 120 mg/m2, aproximadamente 140 mg/m2, aproximadamente 150 mg/m2, aproximadamente 160 mg/m2 and aproximadamente 200 mg/m2. Los inmunoconjugados se administran de manera conveniente a un tiempo o sobre una serie de tratamientos. En un régimen de múltiples dosis estas cantidades pueden administrarse una vez al dia, una vez a la semana o una- vez cada dos semanas. Dosis de carga con una sola dosis alta o en forma alterna, menores dosis que se administran brevemente una tras la otra, seguidas por dosis sincronizadas a más largos intervalos, constituyen una modalidad preferida de la presente invención. En una modalidad preferida, la sincronización de las dosis se ¦ ajusta para un sujeto de manera tal que haya pasado tiempo suficiente antes de un segundo y/o cualquier tratamiento subsecuente de manera tal que la dosis previa sea metabolizada en forma substancial, pero la cantidad de inmunoconjugado presente en el sistema del sujeto todavía inhibe, retrasa y/o evita el crecimiento de un tumor. Un régimen ejemplar de "dosis sencilla repetida" comprende administrar dosis de inmunoconjugado de aproximadamente 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 ó 200 mg/m2 una vez cada tres semanas. En forma alterna, una dosis inicial alta de por ejemplo 160 mg/m2 puede ser seguida por una dosis de mantenimiento de una, - no¬ dos o cada tres semanas, por ejemplo de aproximadamente 20 mg/m2. Otras combinaciones pueden evaluarse fácilmente por la persona con destreza en la técnica. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El avance de esta terapia se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos conocidos. Las dosis pueden variar, entre otras, dependiendo de si se administran para propósitos preventivos o terapéuticos, el curso de cualquier terapia previa, la historia clínica del paciente, el estado de enfermedad del paciente, la carga de tumor del paciente, la predisposición genética del paciente, las enfermedades concomitante del paciente, la etapa de enfermedad ante primer tratamiento y respuesta al agente dirigido/inmunoconjugado, los efectos secundarios experimentados por el paciente y la discreción del médico a cargo .
La presente invención, en una modalidad, se dirige a un régimen de administración de dosis baja con rápida eliminación de plasma, y en otra modalidad, a un régimen de administración de baja dosis sin rápida eliminación de plasma para administración de inmunoconjugados como se establece aquí. El primer régimen proporciona en general menos que 160 mg/m2, de preferencia no más que aproximadamente 120 mg/m2, no más que aproximadamente 100 mg/m2, no más que aproximadamente 80 mg/m2, incluyendo no más que aproximadamente 40 mg/m2, más preferiblemente no más que aproximadamente 20 mg/m2, aún más que de preferencia no más que aproximadamente 10 mg/m2 en un intervalo determinado de tres semanas (ciclo) . El intervalo 10 mg/m2 a 120 mg/m2 se traduce en una dosis diaria promedio de aproximadamente 475 µg/m2 a aproximadamente 5.71 mg/m2, o una dosis semanal promedio de aproximadamente 3.33 mg/m2 a aproximadamente 40 mg/m2. De esta manera, dosis diarias promedio de aproximadamente 400 \ig/ 2 a aproximadamente 5.71 mg/m2, incluyendo aproximadamente 500 g/m2, aproximadamente 1 mg/m2, aproximadamente 2 mg/m2 y aproximadamente 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2 son parte de la presente invención y asi son dosis semanales promedio de aproximadamente 3 mg/m2 a aproximadamente 40 mg/m2, incluyendo aproximadamente 5 mg/m2, aproximadamente 10 mg/m2, aproximadamente 15 mg/m2, aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 25 mg/m2, 30 mg/m2 o 35 mg/m2. Estos esquemas de administración de baja dosis se asocian con rápida eliminación de plasma en la fase de eliminación temprana, esto es, cualquier tiempo durante administración hasta dos horas después de que se complete la administración. Lo que distingue el régimen de administración de baja dosis de otros regímenes de bajas dosis es la rápida eliminación de plasma, que se define por una cmax medida durante este periodo que de preferencia es menor a 55%, menor que 50%, menor que 40%, o menor que 30% del cmax teórica.
Regímenes de administración de baja dosis, están a superiores niveles, acompañados por eliminación de plasma menos rápida, esto es eliminaciones de plasma que exceden 55%, a menudo 60%, 70% 80% o 90% del valor cmax teórico, que son referidos aquí como moderado (igual o > 55%, pero < 80% del valor cmax teórico) o lenta eliminación de plasma (igual o >80% del valor cmax teórico) . A estas eliminaciones, se encontró de manera sorprendente que a pesar de la concentración alta relativa del inmunoconjugado en el plasma, estos regímenes de administración todavía se asocian con toxicidades tolerables. Esto es a pesar del hecho de qué el' nivel de expresión CD138 en células no objetivo que expresan CD138, por ejemplo células de órganos vitales, tales como el epitelio que no son el blanco de cualquier tratamiento, también tienen relativamente alto CD138 (análisis de inmunohistoquímica con el anticuerpo BB4 CD138 que mostró que la reactividad a este anticuerpo al epitelio corresponde con las células de plasma del paciente de MM (Publicación de Patente de los E.U.A. 20070183971)). Niveles de expresión de CD138 en células objetivo y no objetivo diana que producen calificaciones iguales (por ejemplo más tres como en el ejemplo anterior) en análisis de inmunohistoquímica se refieren aquí a comparables niveles de expresión y son parte de la presente invención. En una modalidad alterna, los niveles de expresión en células diana fueron actualmente consistentes inferiores al epitelio (por ejemplo, más uno o más dos o más tres para el epitelio) . Algunas células diana de tumor muestran niveles de expresión mixtos, tales como algunas células tienen un nivel de expresión de más dos y algún un nivel de expresión de más tres. El promedio de un número representativo de células (tales como 100 células muestreadas en forma aleatoria) determinará si estas células objetivo o diana de tumor en cuestión caen bajo la definición de tener niveles de expresión comparables o inferiores al del epitelio. Estos regímenes de tratamiento en general están sobre 120 mg/m2, pero inferiores a 200 mg/m2 en un intervalo de tres semanas (ciclo) dado, que se traduce en una dosis diaria de aproximadamente 5.71 mg/m2 a aproximadamente 9.52 mg/m2 o una dosis semanal promedio de aproximadamente 40 mg/m2 a aproximadamente 66.67 mg/ m2.
Con respecto al Paciente 001-006, fue notable que este paciente tuviera progresión de la enfermedad sólo después de terminar el tratamiento, reflejando la eficacia de la administración de BT062 (Figura 25) .
Una dosis sencilla repetida, se refiere a una secuencia de administraciones, en donde la administración que sigue una administración se considera independiente de esta administración precedente. De esta manera, en el presente contexto, el nivel de inmunoconjugado en la sangre de un sujeto puede considerarse como igual después de cada administración. Cada vez que se administra el inmunocon gado, se espera que iguales niveles de inmunoconjugado estén inicialmente presentes en la sangre.
Intervalos de administración entre las "dosis sencillas" de las dosis sencillas repetidas se definen de acuerdo con la vida media calculada teórica de un isotipo de un inmunoconjugado en el caso de BT062, IgG4.
En general, la vida media de anticuerpos terapéuticos depende primordialmente de las características de anticuerpo/sus aspectos estructurales (por ejemplo enlace a receptores Fe) y la diana. Por ejemplo, la afinidad de enlace de la parte Fe al receptor neonatal FcRn está afectando la vida media. Al ligar a FcRn en endosomas, el anticuerpo es rescatado de degradación lisosomal y reciclado a la circulación, lo que prolonga la vida media. Para un IgG4, una vida media de 15.6 (+/- 4.5) días (Alyanakian et al., 2003 ; Salfeld et al., 2007 ) se ha reportado. En el estudio referido aquí, una "dosis sencilla repetida" se ha seleccionado que tiene intervalos de administración de tres semanas. Sin embargo, aproximadamente tres semanas, aproximadamente cuatro semanas, pero también aproximadamente cinco o aproximadamente seis semanas son intervalos alternos para dosis sencillas repetidas. Una referencia a "aproximadamente" se refiere en el contexto de tres semanas a +/- 96 horas y en el contexto de cuatro a seis semanas a +/- 120 horas.
El avance de la terapia se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos conocidos. La dosis puede variar entre otros, dependiendo de si se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, el curso de cualquier terapia previa, la historia clínica del paciente, el estado de enfermedad del paciente, la carga de tumor del paciente, la predisposición genética del paciente, las enfermedades concomitantes del paciente, la etapa de enfermedad ante, primer tratamiento y respuesta al agente dirigido/inmunoconjugado, los efectos secundarios experimentados por el paciente y la discreción del médico a cargo.
Las ventajas de un régimen de baja dosis son de amplio rango. Sin embargo, la ventaja probablemente más significante es reducir el riesgo de efectos secundarios adversos. Mientras que los inmunoconjugados en general permiten discriminación sensible entre células diana y normales, resultando en menos efectos secundarios tóx-icos que la mayoría de los fármacos quimioterapéuticos convencionales, muchos inmunoconjugados todavía no están completamente libres de efectos secundarios. A pesar de una superior dirección, el antigeno de interés en general también se expresa en células no cancerosas cuya destrucción durante la terapia puede llevar a efectos secundarios adversos. En el caso de CD138, el antigeno en particular se expresa en células epiteliales. También, el inmunoconjugado puede someterse a procesamiento dentro del cuerpo que no está relacionado con progresión en o en una célula objetivo y un cierto porcentaje de molécula efectora puede desprenderse en sitios remotos de las células diana lo que lleva a efectos secundarios tóxicos.
De manera sorprendente, se mostró que el inmunoconjugado de la presente invención fue efectivo a bajas dosis, mientras que exhibe toxicidades clínicamente aceptables. Bajas dosis en la presente invención se refieren a dosis de hasta 200 mg/m2. A dosis de hasta al menos 120 mg/m2 pero en cualquier caso a dosis menores a 160 mg/m2, el inmunoconjugado probado de la presente invención también mostró rápida eliminación de plasma en sujetos humanos.
Tablas 7 y 8 muestran la eliminación observada.
Nivel de plasma de BT062 ( g/ml) humano cmax cmax efectiva cmax efectiva Dosis teórica (ciclo 1) (ciclo 4) BT062 promedio (más promedio (más (mg/m2) bajo; más alto) bajo; más alto) 10 7 1.11 n. a. 20 14 2.9 7.06 (1.66; 4.44) (6.79; 7.34) 40 27 4.31 2.51 (0.97; 9.86) (1.02; 3.68) 80 54 18.8 14.2 (13.4; 23.6) (7.4; 21) 120 81 21.4 n . a . (15.1; 28.7) 160 109 81.2 77.4 (73.7; 85.5) 200 136 82.0 n. a. (68.0; 102.4) n.a. = datos no disponibles ¦ Tabla 7: Concentraciones en plasma después del fin de infusión y valores promedio de cmax efectivos de BT062 de plasma que se obtienen de pacientes que han recibido una sola dosis/dosis sencilla repetida de BT062 (primer y cuarto ciclo) . Una administración de dosis repetida en ciclos de 21 días. Valores Cmax se obtuvieron entre 0 y 2 horas posteriores a infusión. Ciclos de administración: ciclo 1: dia 1, ciclo 2: día 22; ciclo 3: dia 43; ciclo 4: dia 64 etc.
Nivel de plasma de BT062 (ig/val) humano Dosis cmax cmax Por ciento de BT062 teórico efectiva cmax teórico (mg/m2) (ciclo 1) (n) 10 7 1.1 15% (3) 20 14 2.9 20% (4) 40 27 4.31 16% (3) 80 54 18.8 34% (3) 120 81 21.4 26.5% (3) 160 109 81.2 74.5% (4) 200 136 82.0 60% (3) Cont .
Nivel de plasma de BT062 (pg/ml) humano Dosis BT062 cmax Por ciento de (mg/m2) efectivo cmax teórico (n) (ciclo 4) 10 n . a . n. a .
I 20 7.06 49% (2) 40 2.51 9% (3) 80 14.2 26% (2) 120 n . a . n . a . 160 77.4 71% (1) 200 n. a . n . a n.a. = datos no disponibles n: número de pacientes Tabla 8: Valores promedio cmax efectivo de BT062 de plasma que se obtienen en pacientes que han recibido una sola dosis/dosis sencilla repetida de BT062 (primer y cuarto ciclos) . Administración de dosis repetida en ciclos de 21 días. Valores máximos se obtuvieron dentro de las primeras 2 horas posteriores a inyección. Valores cmax se obtuvieron entre 0 y 2 horas posteriores a infusión. Cmax efectiva se indica en porcentaje de cmax teórica calculada. Ciclos de administración: ciclo 1: dia 1, ciclo 2: día 22; ciclo 3: dia 43; ciclo 4: dia 64 etc.
Cmax teórica se calcula de acuerdo con los siguientes parámetros estimados : Área Superficial del Cuerpo de los Pacientes 1.9 m2 Peso de Pacientes 70 Kg Pacientes 40 ml/kg (Dosis administrada x área superficial) /peso corporal) Volumen de Plasma Aunque la vida media de BT062 en plasma de los sujetos humanos tratados demostró ser significativamente menor que la vida media en plasma observada en monos macacos (días) y en plasma humano ex vivo (14 días), el inmunoconjugado todavía mostró eficacia en sujetos humanos, incluso a administraciones tan bajas como 20 mg/m2. Este hecho sugiere una dirección de tumor acelerada y enlace de células de tumor, lo que resulta en una eficacia incrementada. Esta propiedad de los inmunoconjugados de la presente invención probablemente resulta del isotipo IgG4 de la molécula dirigida/anticuerpo.
Como se notó anteriormente, una eliminación rápida inusual de plasma de pacientes MM tratados se ) observó en la fase de eliminación temprana (durante infusión y aproximadamente 0 a 2 horas posterior a infusión) seguido por una fase de eliminación terminal generalmente normal a niveles de dosis de hasta 120 mg/m2, mientras que un perfil de eliminación más típico se observó para todos los 4 pacientes a las dosis de 160 mg/m2 y 200 mg/m2 (3 pacientes), aún cuando la eliminación todavía estuvo por debajo del valor cmax teórico. Además, en los regímenes de administración que mostraron rápida eliminación de plasma en la fase de eliminación temprana, (por ejemplo 20, 40, 80 y 120 mg/m2) no sólo se observó rápida eliminación de plasma en la fase de eliminación temprana sino se observó una . respuesta (disminuida de proteina M orina) incluyendo respuestas que se manifiestan en un decremento de proteina M de orina en más de 50% después de dosis sencillas repetidas (Figura 24).
La Figura 17 ilustra la rápida eliminación de plasma para dosis en el intervalo de 40 mg/m2 a 120 mg/m2, mientras que dosis superiores como aquí se ilustra por una dosis de 160 mg/m2, mostraron eliminación de plasma más cercana al valor teórico. Ver la Figura 27 para eliminación de plasma que se observa a una dosis de 20 mg/m2. La Figura 18 compara el perfil de plasma de BT062 al de monos tratados a dosis comparables. La comparación aclara que la eliminación rápida de plasma a bajas dosis no puede ser deducida de modelos de animales disponibles y parece ser específica para humanos. La Figura 22 aclara que la rápida eliminación de plasma no puede atribuirse a un efecto amortiguador provocado por CD138 soluble. La Figura 19 muestra los valores cmax medidos de BT062 en comparación con los valores cmax teóricos.
A dosis superiores, por ejemplo 160 mg/m2, que sin embargo son relativamente bajas dosis en comparación con los esquemas de administración de otros inmunoconjugados, los perfiles de eliminación terminal fueron más cercanos a lo normal, esto es más cercanos a los valores cmax teóricos. Sin embargo, una rápida reducción de FLC en el suero puede observarse después de sólo una administración sencilla, lo que se manifiesta por si mismo en una respuesta parcial después de la segunda, tercera y cuarta administraciones (Figura 26) .
De esta manera, en una modalidad, la invención se dirigen a un régimen de administración de baja dosis, tal como un régimen de dosis sencilla repetida, en donde se observa una respuesta de preferencia al menos una MR de preferencia VGPR, CR, sCR o PR.
La invención también se dirige a un régimen de tratamiento de baja dosis, tal como un régimen de administración de dosis sencilla repetida, en donde la enfermedad estable se logra sobre múltiples ciclos de tratamiento que duran más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más semanas.
Análogos y Derivados Una persona con destreza en la técnica de agentes terapéuticos, tales como agente citotóxicos, fácilmente comprenderá que cada uno de estos agentes aquí descritos puede ser modificado de manera tal que el compuesto resultante todavía retiene la especificidad y/o actividad del compuesto de partida. La persona con destreza también comprenderá que muchos de estos compuestos pueden utilizarse en lugar de los agentes terapéuticos aquí descritos. De esta manera, los agentes terapéuticos de la presente invención incluyen análogos y derivados de los compuestos aqui descritos.
Para propósitos ilustrativos de los usos de los inmunoconjugados , ahora se verán e ilustrarán algunas aplicaciones no limitantes.
Materiales y Métodos Construcción de Anticuerpo Quimérico (cB-B4: nBT062) B-B4 Anticuerpo murino B-B4 como se caracterizó previamente (Wijdenes et al., Br J Haematol . , 94 (1996), 318) se empleó en estos experimentos.
Clonación y expresión de B-B4 y cB-B4 / nBT062 Técnicas de ADN recombinante estándar se realizaron como se describe en detalle en libros de texto como por ejemplo en J. Sambrook; Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2da Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, o como se recomienda por instrucción de los fabricantes en el caso en donde se emplean equipos. Clonación PCR y modificación de las regiones variables de ratón se han realizado utilizando metodología PCR estándar. Cebadores indicados en la sección de resultados respectivos se han empleado.
Expresión de cB-B4 / nBT062 Células COS de crecimiento exponencial, cultivadas en DMEM suplementado con FCS al 10%, 580 µ?/??? de L-glutamina, 50 Unidades/ml penicilina y 50 g/ml estreptomicina se recolectaron por tripsinización y centrifugación y lavaron en PBS. Las células resuspendieron en PBS a una concentración final de lxlO7 células/ml. 700 µ? de suspensión celular COS se transfirió a una cuba Gene Pulser y mezcló con ADN de vector de expresión de cadena ligera kappa y pesada (10 µg cada uno o 13 µg de Supervector) . Células se sometieron a electroporación a 1900' V, 25 ]iF utilizando un Bio-Rad Gene Pulser. Células . transformadas se cultivaron en DMEM suplementado con FBS libre de gama globulina al 10%, 580 g/ml de L-glutamina, 50 Unidades/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina por 72 horas antes de que se recolectaran sobrenadantes de cultivo celular que contiene anticuerpo .
ELISA de captura para medir niveles de expresión de cB-B4/nBT062 Placas de 96 pozos se revistieron con alícuotas de 100 µ? de 0.4 µg/ml· de anticuerpo IgG antihumano cabra diluido en PBS (4°C, durante la noche) . Se recolectaron placas tres veces con 200 µ?/???? de amortiguador de lavado t (PBS+ Tween-20 al 0.1%). Los pozos se bloquearon con BSA al 0.2%, Tween-20 al 0.02% en PBS, antes de adición de 200 µ? de sobrenadantes de cultivo celular que contienen el anticuerpo secretado (incubación a 37°C por una hora) . Los pozos se lavaron seis veces con amortiguador de lavado, antes de detección de anticuerpo ligado con conjugado de peroxidasa de cadena ligera kappa antihumano cabra.
Purificación de cB-B4/nBT062 de sobrenadantes de cultivo celular El anticuerpo cB-B4 se purificó de sobrenadantes de células COS 7 transformadas utilizando el equipo Protein A ImmunoPure Plus kit (Pierce, Rockford, IL) , de acuerdo con la recomendación del fabricante.
Ensayo de enlace y competencia de cB-B4 Análisis de actividad de enlace de B-B4 y cB-B4 a CD138 se realizó utilizando Diaclone (Besangon, Francia) equipo sCD138 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, considerando los cambios descritos en la sección de resultados.
Preparación de ARN y síntesis de ADNc Células B-B4 de hibridoma se desarrollaron y procesaron utilizando el Qiagen Midi kit (Hilden, Alemania) para aislar ARN siguiendo el protocolo de los fabricantes. Aproximadamente 5 g de ARN B-B4 se someten a transcripción inversa para producir ADNc B-B4 utilizando el equipo de síntesis de 1er hebra de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) siguiendo el protocolo del fabricante.
Clonación de ADNc inmunoglobulina B-B4 ADNc de cadena pesada de inmunoglobulina (IgH) se amplifica por PCR utilizando el cebador IgH MHV7 ( 5 ' -ATGG-GCATCAAGATGGAGTCACAGACCCAGG-3 ' ) [SEQ ID NO: 3] 0.02% y el cebador de región constante IgGl MHCG1 (51 -CAGTGGATA-GACAGATGGGGG-3 ' ) [SEQ ID NO:4]. Similarmente, cadena ligera de inmunoglobulina (IgL) se amplificó utilizando los tres diferentes cebadores Ig MKV2 (51 -ATGGAGACAGACACACTCCTGC-TATGGGTG-3 ' ) [SEQ ID NO: 5], MKV4 (5 ' -ATGAGGGCCCCTGCTCA-GTTTTTTGGCTTCTTG-3 ' ) [SEQ ID NO:6] y MKV9 ( 5 ' -ATGGTATCCAC-ACCTCAGTTCCTTG-3 ' ) [SEQ ID NO: 7], cada uno en combinación con cebador MKC (5 ' -ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3 ' ) [SEQ ID NO: 8]. Todos los productos de amplificación se ligaron directamente con el vector pCR2.1-TOPO utilizando el equipo TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Bacterias TOP10 de E. coli (Invitrogen) transformadas con las construcciones de vector pCR2.1 ligado se seleccionaron en placas de agar LB-ampicilina-Xgal. Cultivos a pequeña escala se inocularon con colonias blancas sencillas, desarrollaron durante la noche y se aislaron plásmidos utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep kit de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes .
Determinación de secuencia de ADNc Se secuenciaron plásmidos utilizando el BigDye Termination v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI, Foster City, CA) . Cada plásmido selecto se secuenció en ambas direcciones utilizando los cebadores 1210 y 1233 en ciclo en una máquina GeneAmp9600 PCR. El análisis de secuencia electroforética se realizó en un secuenciador capilar ABI.
El ciclo completo de clonación RT-PCR y análisis de secuencias de ADN se repitió para obtener tres conjuntos completamente independientes de información de secuencia para cada cadena de inmunoglobulina .
..Secuencia de ADN B-B4 VK Síntesis de 1er hebra se realiza en tres reacciones independientes. Los productos PCR generados al utilizar los cebadores KC y MKV2 (secuencias dadas anteriormente) se ligaron en vectores pCR2.1-TOPO de acuerdo con la instrucción del fabricante. Clones de cada conjunto independiente de reacciones RT-PCR se secuenciaron en ambas direcciones. Secuencia de producto cebado MKV2 fue altamente similar a transcripciones kappa estériles que se originan del socio de fusión de mieloma tal como MOPC-21, SP2 y Ag8 (Carroll et al., Mol Immunol . , 25 (1988), 991; Cabilly et al., Gene, 40 (1985); 157) y por lo tanto se descartó .
Los productos PCR que utilizan MKC con cebadores MKV4 y MKV9 fueron similares entre si y difieren solo en las posiciones de oscilación dentro del cebador de secuencia líder.
Secuencia B-B4 VH ADN Síntesis de 1er hebra se realiza en tres reacciones independientes y productos PCR se clonaron y secuenciaron de cada producto de 1er hebra. Cinco clones fueron secuenciados de cada 1er hebra.
Construcción de vectores de expresión cB-B4 quiméricos La construcción de los vectores de expresión quiméricos involucra agrega una secuencia líder conveniente a VH y VK, precedido por un sitio de restricción Bamñl y una secuencia Kozak. La secuencia de consenso Kozak es crucial para la traducción eficiente de una secuencia de región variable. Define el codón AUG correcto del cual un ribosoma puede iniciar la traducción, y la base más critica sencilla es la adenina (o menos preferible una guanina) en la posición -3, corriente arriba del inicio AUG. La secuencia líder se elige como la secuencia más similar en la base de datos Kabat (Kabat et al., NIH National Technical Information Service). Estas adiciones están codificadas dentro de los cebadores directos (For) (ambos que tienen la secuencia 5 ' -AGAGAAG-CTTGCCGCCACCATGATTGCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCC-3 ' [SEQ ID NO: 9] ; sitio de restricción esta subrayado; secuencia Kozak ésta con negritas) . Además, la construcción de los vectores de expresión quiméricos involucra introducir un fragmento 5' de la región constante gamma 1 humana, hasta un sitio de restricción Apal natural, contiguo con el extremo 3' de la región B-B4 y, para la cadena ligera, agregar un sitio donador de combinación y el sitio Hindl II. La secuencia donadora de combinación es importante para la conexión encuadro correcta de la región variable a su región constante apropiada, de ésta manera cortando el intrón V:C. El intrón kappa + CK se codifica en la construcción de expresión corriente abajo de la secuencia la B-B4 VK. Similarmente, gamma-4 CH se codifica en la construcción de expresión corriente abajo de la secuencia B-B4 VH.
Los genes B-B4 VH y VK primero se analizaron cuidadosamente para identificar cualesquiera sitios donadores de combinación indeseados, sitios aceptores de combinación, secuencias Kozak y para la presencia de cualesquiera sitios de restricción de sub-clonación extra que posteriormente interferirían con la sub-clonación y/o expresión de anticuerpo entero funcional. Un sitio HindIII indeseado se encontró en la secuencia VK que necesariamente se retiró por mutagénesis dirigida por sitio por PCR sin cambiar la secuencia de aminoácidos. Para estas reacciones, cebadores oligonucleótido BT03 (51 -CAACAGTATAGTAAGCTCCCTC-GGACGTTCGGTGG-3 ' ) [SEQ ID NO: 10] y BT04 ( 5 ' -CCACCGAACG-TCCGAGGGAGCTTACTATACTGTTG-3 ' ) [SEQ ID NO: 11] se emplearon y se realizó mutagénesis de acuerdo con el protocolo del equipo de Mutagénesis Stratagene (La Jolla, CA) Quickchange .
Cebadores de quimerización de cadena Kappa La secuencia líder B-B4 VK no ambigua, independiente de la secuencia de cebador PCR, se alineó con las secuencias líder murinas en la base de datos Kabat. La más cercana correspondencia para el líder B-B4 VH fue VK-10 ARS-A (Sanz et al., PNAS, 84 (1987), 1085) . Se pronostica que esta secuencia líder se corte correctamente por el algoritmo SignalP (Nielsen et al., Protein Eng, 10 (1997); 1). Cebadores CBB4Kfor (ver anteriormente) y g2258 (51-CGCGGGATCCACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3 ' [SEQ ID NO: 12] ; Sitio de restricción estáa subrayado) se diseñaron para generar un producto PCR que contiene un líder completo, la región B-B4 VK, y sitios de restricción terminales HindIII y BamRI, para clonar en el vector de expresión pKNlOO. El cebador directo, CBB4K introduce un sitio de restricción HindIII, un sitio de inicio de traducción Kozak y la secuencia líder VK-10 ARS-A. El cebador inverso g2258 introduce un sitio donador de combinación y un sitio de restricción BamUI . El fragmento resultante se clonó en los sitio de restricción Hindlll/Bamñl de pKNlOO.
Cebadores de quimerización de cadena pesada La secuencia líder B-B4 VH no ambigua, independiente de la secuencia de cebador PCR, se alineó con secuencia lider murina en la base de datos Kabat . La correspondencia más cercana para el líder B-B4 VK fue VH17-1A (Sun et al., PNAS, 84 (1987), 214). Esta secuencia líder se pronostica que se corte correctamente por el algoritmo SignalP. Cebadores cBB4Hfor (ver anteriormente) y g22949 ( 5 ' -CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3 ' [SEQ ID NO:13]; Sitio de restricción está subrayado) se diseñaron para ' generar un producto PCR que contiene un líder VH17-1A, la región B-B4 VH y sitios de restricción terminales tfindlll y Apal, para clonar en el vector de expresión pG4D200. El cebador directo cBBHFor introduce un sitio de restricción HindIII, un sitio de inicio de traducción Kozak y la secuencia líder VH17-1A. El cebador inverso g22949 introduce el extremo 5 ' de la región gamma 4C y un sitio de restricción Apal natural. El fragmento resultante se clonó en los sitio de restricción HindIII/Apal de pG4D200, resultando en el vector pG4D200cBB .
Producción de anticuerpo cBB4 Una ampolleta de células COS 7 se descongeló y desarrolló en DMEM suplementado con suero Fetal clon I al 10% con antibióticos. Una semana después, células (0.7 mi a 107 células/ml) se sometieron a electroporacion con pG4D200cBB4 más pKN100cBB4 (10 //g de ADN cada uno) o sin ADN. Las células se revistieron en 8 mi de medio de cultivo de por 4 días. Se repitió la electroporacion siete veces.
Detección de anticuerpo quimérico Un ELISA emparedado -se emplea para medir las concentraciones de anticuerpo en sobrenadantes COS 7. Células COS 7 transformadas de manera transitoria se trataron aproximadamente 6956 ng/ml de anticuerpo (datos no mostrados) .
Actividad de enlace de cB-B4 Para ensayar la actividad de enlace de cB-B4 en sobrenadantes de cultivo COS 7, el equipo Diaclone sCD138 se ha empleado, un ELISA de emparedado de fase sólida. Un anticuerpo monoclonal especifico para SCD138 se ha revestido sobre pozos de las tiras de microtitulación proporcionadas. Durante la primera incubación, sCD138 y anticuerpo biotinilado B-B4 (bio-B-B4) se incuban simultáneamente en conjunto con una serie de diluciones de anticuerpo de prueba sin etiquetar (B-B4 o cB-B4).
Las concentraciones de bio-B-B4 en este ensayo se han reducido a fin de obtener competencia con bajas concentraciones de anticuerpo no etiquetado (concentración de cB-B4 en sobrenadantes de cultivo celular COS 7 fueron de otra forma muy bajas para obtener una competencia suficiente) . Resultados de este ensayo revelan que ambos 5 anticuerpos tienen la misma especificidad para CD138 (datos no mostrados) .
Purificación de cB-B4 B-B4 quimérico se purifica a partir de sobrenadantes de células COS 7 utilizando el Protein A 10 ImmunoPure Plus kit (Pierce), de acuerdo con la recomendación del fabricante (datos no mostrados) .
Determinación de !¾: Comparación nBT062/ BB4 Purificación de CD138 soluble ." Antigeno CD138 soluble de sobrenadante de cultivo 15 celular U-266 se purificó por FPLC utilizando columna de un 1 mL "HiTrap activated NHS HP" acoplada con B-B4. Sobrenadante de cultivo celular se cargó en amortiguador PBS pH 7.4 sobre la columna y posteriormente en el antigeno CD138 se eluyó con trietilamina 50 mM pH 11 en fracciones 20 de 2 mL. CD138 eluido se neutralizó inmediatamente con 375 µ L de Tris-HCl 1 M, pH 3 para evitar daños estructurales y/o funcionales.
Biotinilación de CD138 Sulfo-NHS-LC (Pierce) se empleó para etiquetar 25 CD138. Biotinas activadas por NHS reaccionaron eficientemente con grupos aminos primarios como residuos lisina en amortiguadores pH 7-9 para formar enlaces amida estables .
Para biotinilación de CD138, 50 µ? de CD138 se desalifican utilizando columnas de centrifugado-desalificación de proteina (Pierce) . El reactivo de biotinilación (EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin, Pierce) se disolvió en H20 desionizada enfriada por hielo a una concentración final de 0.5 mg/mL. El reactivo de biotinilación y la solución de reactivo de captura se mezclaron que tienen 12 veces de exceso molar de reactivo de biotinilación en comparación con el reactivo de captura (50 pmol CD138 a 600 pmol de reactivo de biotinilación) e incubaron 1 h a temperatura ambiente mientras que se agita suavemente la ampolleta. El reactivo de biotinilación no ligado se retiró utilizando columnas de desalificación de proteina .
Inmovilización de bCDl38 El sensorchip (SENSOR CHIP SA, BIACORE AB) empleado en el ensayo BIACORE se diseña para ligar moléculas biotiniladas para análisis de interacción en sistemas BIACORE. La superficie consiste de una matriz de dextrano carboximetilado pre-inmovilizada con estreptavidina y lista para captura de alta afinidad de ligandos biotinilados . La inmovilización de bCD138 se realizó en SENSOR CHIP SA utilizando un gasto de flujo de 10 .L/min por inyección manual. La superficie de chip se acondiciono con tres inyecciones consecutivas de 1 minuto de NaCl 1 en NaOH 50 mM. Después CD138 biotinilados se inyecto por 1 minuto.
Determinación de KD de diferentes anticuerpos utilizando BIACORE El soporte lógico o programa de BIACORE C utiliza mascaras predefinidas, asi denominadas "Asistentes de instalación" para diferentes experimentos en donde' solo ciertos ajustes pueden cambiarse. Ya que BIACORE C se desarrollo originalmente para medir concentraciones, no hay asistente de instalación diseñado para llevar a cabo medidas de afinidad. Sin embargo, con los ajustes adecuados, el asistente de instalación para "enlace no especifico" puede emplearse para medir constantes de velocidad de afinidad y por lo tanto se empleó para determinación de KQ. Con este asistente de instalación/ dos celdas de flujo se midieron y la fase de disociación se ajustó a 90 s al realizar la "Regeneración 1" con amortiguador Solución Tampón de Corrida BIACORE. "Regeneración 2" que es equivalente a la regeneración real, se realizó con Glicina-HCl 10 mM pH 2.5. Después de ésta etapa, el ligando CD138 estaba en su estado competente de enlace de nuevo. Durante todo el procedimiento HBS-EP se emplea como solución tampón de corrida y dilución. Para determinar enlace de los diferentes anticuerpos (~150 kDa) a CD138, se analizan asociación y disasociación a diferentes concentraciones (100, 50, 25 12.5, 6.25 y 3.13 nM) . Las constantes de equilibrio de disociación se determinaron al calcular las constantes de velocidad ka y kd. Posteriormente, los valores KD de los analitos se calcularon por el coeficiente de kd y ka con el programa BIAevaluation. Los resultados se muestran en la Tabla 9.
Afinidad Anticuerpo KD (nM) KD promedio (nM) 1.4 nBT062 .. 1.4 1.4 +/- 0.06 1.5 1.7 B-B4 1.7 1.6 +/- 0.06 1.6 1.9 X1BT062-SPDB-DM4 1.9 1.9 +/- 0.00 <1.9 2.6 B-B4-SPP-DM1 2.7 2.6 +/- 0.06 2.6 Tabla 9: Análisis comparativo de valores KD de nBT062 y ?-? . Definiciones estándar se dan para valores KD promedio .
Discusión Valores KD promedio para cada anticuerpo se calcularon de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que todas las medidas nBT062 exhibe valores KD ligeramente disminuidos en comparación con B-B4 (valores KD promedio fueron 1.4 y 1.6 nM, respectivamente).
Preparación de Inmunoconjugados nBT062-DMl y huC242-DMl El maitansinoide que contiene tiol DM1 se sintetiza del producto de fermentación microbiano P-3, como se describió previamente por Chari (Chari et al., Cáncer Res. 1 (1992), 127). Preparación de C242 humanizado (huC242) (Roguska et al., PNAS, 91 (1994), 969) se ha descrito previamente. Conjugados anticuerpo-fármaco se prepararon como se describió previamente (Liu et al., PNAS, 93 (1996), 8618). Un promedio de 3.5 moléculas DM1 se enlazó por molécula de anticuerpo. nBT062-DM4 BT062 es un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del fármaco maitansinoide citotóxico DM4, enlazado mediante uniones disulfuro a través de un enlazador al anticuerpo monoclonal quimerizado nBT062. Maitansinoides son anti-mitóticos que inhiben polimerización de tubulina y estructura o ensamblado de microtúbulos (Remillard et al., Science 189 (1977), 1002) . Representaciones químicas y esquemáticas de BT062 (nBT062-DM4) se ilustran en las FIGURAS 1 y 2.
Síntesis de DM4 DM4 se prepara a partir del derivado bien conocido maitansinol (Kupchan et al., J. Med. Chem., 21 (1978), 31) . Maitansinol se prepara por segmentación reductiva de la porción éster del producto de fermentación microbiano, ansamitocina P3, con hidruro de trimetoxialuminio litio (ver FIGURA 3) .
DM4 se sintetiza por acilación de maitansinol con N-metil-N- ( 4-metiditiopentanoil ) -L-alanina (cadena lateral DM4) en la presencia de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y cloruro de zinc para dar el maitansinoide que contiene disulfuro DM4 -SMe . DM4-SMe se reduce con ditiotreitol (DTT) para dar el maitansinoide que contiene tiol deseado DM4 (ver FIGURA 4 para el diagrama de flujo de proceso DM4) .
Inmunoconjugado BT062 El procedimiento para la preparación de nBT062- DM4 se perfila en FIGURA 5. El anticuerpo nBT062 se modifica con N-succinimidil-4- (2-piridilditio) butirato (enlazador SPDB) para introducir grupos ditiopiridilo . DM4 se mezcla con el anticuerpo modificado a una concentración que excede los equivalentes de grupos ditiopiridilo. El conjugado BT062 se forma por una reacción de intercambio disulfuro entre el grupo tiol de DM4 y los grupos ditiopiridilo introducido en el anticuerpo por el enlazador. Purificación por cromatografía y diafiltración retira los reactivos de bajo peso molecular (DM4) y los productos de reacción ( tiopiridina) , así como agregados de anticuerpo conjugado, para producir la sustancia fármaco a granel .
Análisis FACS y ensayos de citotoxicidad WST Análisis FACS Células OPM-2 son líneas celulares de leucemia de células de plasma que muestran CD138 de alta expresión. Células OPM-2 se incubaron con nBT062, nBT062-SPDB-DM4 , nBT062-SPP-DMl "o nBT062-SMCC-DMl a diferentes concentraciones (indicado en la Figura 6) . Las células se lavaron y anticuerpo ligado a CD138 o conjugado se detectaron utilizando un anticuerpo secundario etiquetado por fluorescencia en análisis FACS. La florescencia promedio medida en estos experimentos se trazó contra la concentración de anticuerpo.
Ensayo de viabilidad celular Células CD138+ MOLP-8 se sembraron en placas de fondo plano a 3000 células/pozo. Células de control CD138" BJAB se sembraron a 1000 células/pozo. Las células se trataron con nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DMl o nBT062-SMCC-DM1 a diferentes concentraciones (indicado en la Figura 7) por cinco días. Reactivo WST (sal tetrazolio soluble en agua, ROCHE) se agrega a fin de medir la viabilidad celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ROCHE) . El reactivo se incubó por 7.5 horas en células MOLP-8 y por 2 horas en células BJAB. La fracción de células supervivientes se calcula con base en las densidades ópticas medidas en un lector de microplacas utilizando procedimientos estándar.
Discusión Enlace de nBT062-SPDB-DM4 , nBT062-SPP-DMl , nBT062-SMCC-DMl o nBT062 se analiza por FACS . CD138+ OPM-2 como células objetivo o diana se incuban con nBT062 o inmunocon ugados y se detectan moléculas ' ligadas a células utilizando un anticuerpo secundario etiquetado por fluorescencia. En la Figura 6, las florescencias promedio como se mide para la cantidad de anticuerpo ligado a células se traza contra diferentes concentraciones de conjugado o anticuerpo. Los resultados muestran que nBT062-SPDB-DM , nBT062-SPP-DMl y nBT062-SMCC-DMl presentan características de enlace muy similares. Además, los resultados sugieren fuertemente que las características de enlace del anticuerpo no conjugado no se afectan por las toxinas conjugadas.
En ensayos de viabilidad celular, se analizaron la actividad citotóxica del anticuerpo contra células objetivo o diana CD138+ MOLP-8 y contra células de control de linfoblastos B CD138" BJAB. Ambas lineas celulares se sembraron en placas de fondo plano e incubaron con concentraciones crecientes de los inmunocon ugados . Anticuerpo no conjugado se emplea como un control. La actividad citotóxica se analiza cinco días después de adición de los inmunoconj ugados al utilizar reactivo WST a fin de medir la viabilidad celular. En la Figura 7 (A) - (C) , la fracción de células supervivientes respecto a células de control tratadas con control de vehículo se traza contra concentraciones crecientes de inmunocon ugado . Los resultados muestran que la actividad citotóxica de nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DMl y nBT062-SMCC-DMl contra células MOLP-8 es muy similar. Como se espera, células de control CD138" BJAB no se exterminaron por los inmunoconj ugados , indicando que todos los inmunoconj ugados actúan mediante enlace específico de células a CD138. En experimentos de competencia, en donde células MOLP-8 se preincubaron con un exceso molar de nBT062 no conjugado. La preincubación sustancialmente bloqueó la citotoxicidad de nBT062-SPDB-DM4, proporcionando mayor evidencia que los inmunoconj ugados exterminan las células por enlace específico a CD138 sobre la superficie celular (Figura 7 (D) ) .
Experimentos de xenoinjerto de ratón Para evaluar la importancia de CD138 que hace diana en actividad antitumor de conjugados anticuerpo-maitansinoide de una versión quimérica humana del anticuerpo B-B4, nBT062, se realizaron experimentos de xenoinjerto de ratón. Dos versiones de conjugados maitansinoide-nBT062 se prepararon que pueden diferir en la estabilidad química de sus enlaces disulfuro (nBT062-SPP-DM1 y nBT062-SPDB-DM4) . La actividad antitumor de estos conjugados anticuerpo-fármaco se comparó con la actividad ¾del conjugado B-B4-SPP-DM1 (que comprende el anticuerpo precursor murino) , asi como maitansinoide libre no conjugado (DM4) , anticuerpo nBT062 no modificado nativo, y conjugado maitansinoide-IgGl (irreleva.nte) sin diana. Los conjugado se evaluaron en un modelo de xenoinjerto CD138 positivo (MOLP-8) de mieloma múltiple humano en ratones de inmunodeficiencia combinada grave (SCID = Severe Combined Immunodeficient) .
En estos ratones, se establecieron tumores subcutáneos (ratones CB.17 SCID hembra) por inoculación con i suspensiones celulares MOLP-8. El tratamiento con inyección intravenosa de un solo bolo se realizó cuando los volúmenes de tumor alcanzaron un promedio 113 mm3. Cambios en volumen de tumor y peso corporal se supervisaron dos veces por semana. Los experimentos se llevaron a cabo sobre 68 días después de inoculación de las células de tumor.
Experimentos de xenoinjerto de ratón A Ratones Ratones hembra CB.17 SCID, de cinco semanas de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories.
Líneas celulares de tumor humano MOLP-8, una linea celular de mieloma múltiple humano, se suministra de ATCC. Células MOLP-8 que expresan el antigeno CD138 en su superficie celular y desarrollaron tumores de xenoinjerto en ratones SCID, se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con L-glutamina 4 mM (Biowhittaker, Walkersville, D) , suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Logan, Utah) y estreptomicina al 1%/penicilina a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene C02 al 5%.
PARTE I Crecimiento de tumor en ratones Cada ratón se inoculó con lxlO7 células MOLP-8 subcutáneamente en el área bajo el hombro derecho. El volumen total fue 0.2 mi por ratón, en donde la proporción de medio libre de suero a matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA) fue 1/1 (v/v) . Antes de tratamiento, los tumores de xenoinjerto se supervisaron diariamente y se dejó que se establecieran. El volumen de tumor alcanzó aproximadamente 113 mm3 aproximadamente 11 días después de inoculación de células de tumor. La velocidad de toma de tumor de ratones CB.17 SCID fue 100%. 11 días después de inoculación de células de tumor, 42 ratones se seleccionaron con base en volúmenes de tumor y pesos corporales. El volumen de tumor estuvo en el intervalo de 68.2 a 135.9 mm3. Los cuarenta y dos ratones se dividieron en forma aleatoria en siete grupos (A-G) de seis animales cada uno basado en volumen de tumor.
Cada uno de seis ratones en el Grupo A recibió 200 µ? de PBS como control de vehículo. Cada ratón en el grupo B recibió 13.8 mg/kg de nBT062 de anticuerpo desnudo. Esta dosis es equivalente a la cantidad de componente de anticuerpo nBT062 en 250 ]ig/kg de maitansinoide enlazado. La proporción de pesos moleculares de maitansinoides a anticuerpo nBT062 en una molécula conjugada es aproximadamente 1/55. Cada ratón en el Grupo C recibió 250 µg/kg de DM4. Cada ratón en el Grupo D recibió 250 g/kg de huC242-DM4. Ratones en los grupos E, F y G recibieron 250 Ug/kg de nBT062-SPDB-DM4, B-B4-SPP-DM1 y nBT062-SPP-DMl cada uno respectivamente .
Todos los agentes se administraron en forma intravenosa como una sola inyección de bolo a través de una vena lateral de la cola con una jeringa de 1 mi adaptada con una aguja calibre 27 de 1.27 cm (½ pulgada). Antes de administración, las soluciones madre del anticuerpo nBT062, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl se diluyeron con PBS estéril a concentraciones de 2 mg/ml, 28.1 µg ml y 28.1 pg/ml, respectivamente, de manera tal que el volumen inyectado por cada ratón estuvo entre 120-220 µ? .
PARTE IX En un segundo juego de experimentos, células MOLP-8 (1.5xl07 células por ratón), suspendidas en una mezcla 50:50 de medio libre de suero y matrigel se inyectaron subcutáneamente en el área bajo el hombro derecho en 100 µ?. Volúmenes de tumor alcanzaron aproximadamente 80 mm3 el día 11 y el promedio de los controles fue aproximadamente 750 mm3 el día 25, posterior a inoculación celular. Los tiempos de duplicación de tumor se estimaron como de 4.58 días. Cada ratón en el grupo de control (n=6) recibió 0.2 mi de PBS estéril administrado en la vena de cola lateral (i.v.) en una inyección de bolo. Todas las dosis de tratamiento se basaron en maitansinoide conjugado. Nueve grupos (n=6) se trataron con una sola inyección intravenosa de nBT062-SMCC-DMl , nBT062-SPDB-DM4 , o nBT062-SPP-DMl, cada una a dosis de 450, 250 y 100 µg/kg. Un grupo adicional (n=6) recibió 250 ug/kg de nBT062-SMCC-DM1 en una dosis repetida (semanalmente por cinco semanas). Los ratones se aleatorizaron en 11 grupos (n=6) por volumen de tumor utilizando el Programa LabCat . Los volúmenes de tumor estuvieron en el intervalo de 40.0 a 152.5 mm3. Los ratones fueron dosificados con base en el peso corporal individual .
Tamaño de tumor se midió dos veces por semana en tres dimensiones utilizando el Sistema LabCat (Tumor Measurement and Tracking, Innovative Programming Associated, Inc., Princeton, NJ) . El volumen de tumor en mm3 se calculó utilizando la metodología descrita en Tomayko et al. (Tomayko et al., 1989): Volumen= Longitud x Ancho x Altura x ½ Exterminio celular Logio se calculó con la fórmula descrita por Bissery et al. (Bissery et al., 1991). exterminio celular Logio = (T-C) / Td x 3.32 y en donde (T-C) o retardo en el crecimiento de tumor, es el tiempo promedio en días requerido para que los tumores del grupo de tratamiento (T) y el grupo de control (C) , alcancen un tamaño predeterminado (600 mm3) . Td es el tiempo de duplicación de tumor, con base en el volumen de tumor promedio en los ratones de control y 3 . 32 es el número de duplicaciones de células por log de crecimiento celular.
Resultados El crecimiento de tumor en ratones individuales se muestra en las Figuras 8 y 9. El promedio de crecimiento de tumor ( +/- SD) por cada grupo se muestra en la Figura 10.
En comparación con crecimiento de tumor en los animales tratados con PBS, el tratamiento con anticuerpo nBT062, DM4 libre no conjugado o el conjugado no dirigido irrelevante huC242-D 4 no provocan ninguna inhibición significante de crecimiento de tumor.
Todos los tres conjugados dirigidos a CD138, nBT062-SPDB-DM4, B-B4-SPP-DM1 y · nBT062-SPP-D l a una dosis de 250 µ?/1^ provocaron un retardo marcado en crecimiento de tumor. Con base en los volúmenes de tumor promedio medidos en los grupos de tratamiento, el conjugado DM4 nBT062-SPDB-DM4 fue el más activo, mientras que el conjugado nBT062-SPP-DMl mostró actividad ligeramente incrementada en comparación con su contraparte murina B-B4-SPP-DM1 (Figura 10) . Los resultados obtenidos en ratones individuales muestran además que la actividad antitumor obtenida con B-B4-SPP-DM1 es más heterogénea y menos pronosticable que la medida en ratones tratados con nBT062-SPP-D 1. En términos de homogeneidad de actividad antitumor, el otro conjugado que utiliza nBT062 como anticuerpo dirigido nBT062-SPDB-D 4 se comportó similar a nBT062-SPP-DMl .
No se observó reducción en peso corporal en cualquier grupo de tratamiento sugiriendo que fueron bien tolerados los tratamientos .
Discusión Los resultados del análisis de tres conjugados dirigidos a CD138 en animales experimentales demostraron la importancia de suministro dirigido para la actividad antitumor. Mientras que los conjugados maitansinoides de nBT062 quimérico humano y los anticuerpos B-B4 murino muestran actividad significante como se mide por exterminio celular log, que no hubo impacto significante en crecimiento de tumor a partir del tratamiento con DM4 sin conjugar, anticuerpo huBT062 nativo sin modificar, o conjugado de control no dirigido (huC242-DM ) .
El inmunoconjugado preparado a partir del anticuerpo quimérico humano, nBT062-SPP-DMl dio una actividad antitumor ligeramente superior que el conjugado preparado de su contraparte murina B-B4-SPP-DM1. Además, el tratamiento con nBT062-SPP-DMl y nBT062-SPDB-DM4 resultó en respuestas más homogéneas en ratones individuales en comparación con tratamiento con B-B4-SPP-DM1. La alta variación de enlace de B-B4-SPP-DM1 explicó que la medición de volumen de tumor promedio (+/- SD) de MOLP-8 xenoinjertos de mieloma múltiple humano en ratones CB.17 SCID con el tiempo (días) posterior a inoculación actualmente proporcionó resultados relativamente mejores para B-B4-SPP-DM1 que para nBT062-SPP-DMl (datos no mostrados) . Esta característica de inmunoconj ugados utilizando nBT062 como un anticuerpo dirigido parece ser benéfica especialmente para uso terapéutico de los, i conjugados .
Finalmente, el más potente de los conjugados maitansinoides después de administración sencilla IV en los modelos de xenoinjerto MOLP-8 en ratones SCID fue nBT062-SPDB-DM4.
Exterminio por activación inespecífica (ensayo de viabilidad celular) Células CD138+ OP 2 y células CD138" Namalwa se sembraron en placas de fondo redondo ya sea en pozos separados o en co-cultivo. Las células se trataron con nBTO 62-SPDB-D 4 en concentraciones en el intervalo de lxlO"8 a lxlO-9 M. La fracción de células viables se detectó utilizando el reactivo WST (sal tetrazolio soluble en agua, ROCHE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ROCHE) . La fracción de células supervivientes se calcula con base en las densidades ópticas medidas en un lector de microplacas utilizando procedimientos estándar.
Discusión Exterminio por activación inespecífica de células no dirigidas en proximidad inmediata (como se presenta en pozos de fondo redondo) a células de mieloma múltiple ante tratamiento con nBT062-SPDB-DM4 se analizó en un estudio in vitro en donde células 0PM2 CD138 positivas se cultivaron en co-cultivo con células Namawla CD138 negativas (Figura 13) . En general, mientras que células CD138 positivas se exterminan eficientemente por nBT062-SPDB-DM4 , células CD138 negativas no fueron afectadas por el conjugado. En el co-cultivo en pozos de fondo redondo, sin embargo nBT062-SPDB-DM4 también exterminó las células negativas de antígeno en proximidad inmediata con las células de antigeno positivas (un efecto que a menudo es referido como exterminio por activación inespecifica) . Kovtun et al. (2006) discutió que el exterminio por activación inespecifica mediado por conjugados maitansinoide ocurre sólo en proximidad inmediata con células antigeno positivas. Kovtun et al. (2006) que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, también discute la importancia del enlazador del inmunoco jugado . Exterminio por activación inespecifica in vivo puede contribuir a l) la erradicación de células de tumor que expresan en forma heterogénea CD138, 2) la destrucción del microambiente de tumor por el exterminio de células de estroma de tumor, y 3) la prevención de la selección de células resistentes nBT062-SPDB-DM4 CD138 negativas.
El efecto por activación inespecífica es de importancia particular si la actividad de un inmunoconjugado se deteriora por el antigeno dirigido que se expresa en tumores en una forma heterogénea. Si este es el caso, una célula particular de un tumor expresa si lo hace de hecho, el antigeno no en una cantidad que permitiera dirigido o hacer diana directa efectiva y exterminio de la célula por el inmunoconjugado respectivo. La eficacia antitumor de nBT062-SPDB-DM4 en células CD138 negativas en co-cultivo con células CD138 positivas aclara que la presencia de células objetivo influencia, bajo las circunstancias apropiadas, la actividad citotóxica de nBT062-SPDB-DM4 hacia células ?s dirigidas .
Experimentos de ratón-xenoinjerto B En este juego de experimentos, ochenta y cinco ratones fueron inoculados con células MOLP-8 (1.5xl07 células/ratón) en forma subcutánea en el hombro derecho. La velocidad de toma de tumor fue 100%. Sesenta y seis ratones SCID que contienen tumores MOLP-8 voluminosos con un volumen promedio de tumor de aproximadamente 80 mm3 se aleatorizaron en once grupos de tratamiento (n=6) . Se trataron ratones con una sola dosis de uno de tres conjugados (nBT062-S CC-DMl, nBT062-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DM1) . Un grupo adicional recibió cinco dosis semanales de nBT062-SMCC-DMl y un grupo de control recibió una sola dosis de PBS. Volúmenes de tumor promedio se ilustran en la Figura 11A. Una respuesta de dosis se estableció por cada conjugado. Un volumen de tumor promedio de 750 mm3 en los animales tratados con PBS se alcanzó el día 25. Tiempo de duplicación de tumor determinado por el ajuste de curva con radiación lineal de mejor ajuste en un trazo log-lineal de crecimiento de tumor de control fue 4.58 días. Los animales tratados con nBT062-SPDB-DM4 a 450 pg/kg tuvieron el exterminio celular log más alto (LCK=2.89), seguido por animales tratados con nBT062-SMCC-DMl a 250 ug/kg de dosis semanal (LCK=2.1; ver Tabla 10) . Comparación de las curvas de crecimiento de tumor promedio para los grupos de tratamiento por medidas repetidas ANOVA realizando Prueba de Comparación Múltiple de Dunnett mostró una diferencia significante entre el grupo de control PBS 450 µg/ .g de nBT062-SPDB-DM4 (p<0.01), 250 ug/kg de nBT062-SPDB-DM4 (p<0.05) y dosis de cinco semanas " de 250 g/kg de nBT062-SMCC-DMl (p<0.05) . No hubo regresión de tumor parcial o completa en cualquiera de los grupos de tratamiento que ocurriera con excepción de un animal que recibe 450 g/kg de nBT062-SPDB-DM4, que tuvo regresión parcial del tumor hasta el día 85 posterior a inoculación.
Material de prueba Dosis LCK Dosificación (Ug/kg) PBS dosis sencilla nBT062-SMCC-DMl 450 0.85 dosis sencilla nBT062-SMCC-DMl 250 0.53 dosis sencilla nBT062-SMCC-D l 100 0 dosis sencilla nBT062-SPDB-DM4 450 2.89 dosis sencilla nBT062-SPDB-DM4 250 1.05 dosis sencilla nBT062-SPDB-D 4 100 0.39 dosis sencilla nBT062-SPP-DMl 450 0.8 dosis sencilla nBT062-SPP-DMl 250 0.39 dosis sencilla nBT062-SPP-DMl 100 0.2 dosis sencilla nBT062-SMCC-DMl 250 2.1 semanalmente por 5 semanas Tabla 10. Valores de exterminio celular Log (LCK = Log Cell Kill) como se mide para actividad antitumor de diferentes conjugados nBT062-D x en diferentes esquemas de dosificación. Refiérase a la sección de materiales y métodos para información respecto al cálculo de valores LCK.
Eficacia Jn vivo de nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 en el ambiente de médula ósea Preparación de ratones SCID que tienen implantes de huesos fetales humanos Huesos largos fetales humanos (trozos de huesos fetales humanos) se implantaron en el cuerpo superior de ratones CB17 SCID (SCID-hu) como se describió previamente (Urashima et l . , 1997) y de ésta manera se proporcionan un modelo en ratón para la migración de células MM humanas a células BM humanas.
Régimen de tratamiento (ratones SCID-hu/INA- 6) 4 semanas después de implante de hueso, 2.5xl06 células INA- 6 en un volumen final de 100 //L de RPMI-1640 medio de cultivo celular se inyectaron directamente en la cavidad de médula ósea humana en los ratones SCID-hu descritos anteriormente. Un aumento en los niveles de receptor IL-6 humano soluble (shuIL-6R), que se libera por células INA-6, se utiliza como un parámetro de crecimiento celular MM y carga de la enfermedad.
Los ratones desarrollaron shuIL-6R de suero susceptible a medirse aproximadamente 4 semanas después de inyección celular INA-6 y después recibieron 0.176 mg de conjugado o control de vehículo mediante inyección en la vena de la cola, semanalmente por 7 semanas. Después de cada tratamiento, se recolectaron muestras de sangre y midieron para niveles de shuIL-6R por un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN) . Los resultados se ilustran en la Figura 12.
Discusión Interleucina 6 (IL-6) es un factor de crecimiento y supervivencia para células de mieloma múltiple. INA-6 es una línea celular de mieloma humano dependiente de IL-6, que también requiere células estromales médula ósea (BMSC = bone marrow stromal cells) para proliferar. Líneas celulares INA-6 producen receptor IL-6 soluble (shuIL-6R) . Un aumento en los niveles de shuIL-6R puede utilizarse como un parámetro de crecimiento de células MM y carga de enfermedad.
De ésta manera, los ratones sCID-hu/INA-6 proporcionan un modelo para las células de mieloma múltiple que crecen en su ambiente de médula ósea normal. Las células de tumor de este modelo, que interactúan directamente con la médula ósea humana, semejan cercanamente a la situación en pacientes, en donde también se promueve crecimiento de células de tumor por la presencia de células estromales. A medida que las células INA-6 liberan receptor de interleucina-6 humano soluble (shuIL-6R) , las concentraciones en suero de ésta proteína pueden emplearse como una medida para carga de células de tumor en estos ratones. La potencia in vivo de nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DMl se probó en este ambiente.
Tratamiento de ratones SCIDhu/INA-6 con administraciones i.v. semanales de nBT062-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DMl por siete semanas, induce regresión de tumor eficiente, como se detecta por una disminución en niveles de shuIL-6R en suero respecto al control, indicando buena eficacia de los conjugados incluso en el ambiente de médula ósea humana, que refleja la situación relevante en los pacientes (Figura 12) . ·- Dosis en Ratones A fin de determinar dosis relevantes, una sola administración de. BT062 a dosis de 100, 250 y 450 µ?/kq (con base en la concentración DM4) se suministró a los ratones cuando los tumores alcanzaron un volumen de tumor promedio de 80 mm3 (Figura 14). Las dosis se reportan como una concentración DM4 de conjugado (1 /ig de DM4 igual a aproximadamente 55 µ? de proteína anticuerpo) . La eficacia anti-tumor fue dependiente de dosis con la dosis más alta probada (450 /.g/kg) resultando en un exterminio de células Log (LCK) de 2.9 (Compare también la Tabla 10). Los animales recuperaron peso a través del curso del estudio indicando que el tratamiento no era tóxico para los ratones .
La Figura 14 indica 250 /g/kg como una primer - - dosis efectiva en ratones, lo que se traduce en una dosis comparable en humanos de 166 mg/m2.
Indicador: Modelos de Xenoinjerto - Páncreas/ Mamario y otro Carcinomas Disposición Experimental General De acuerdo con el análisis de expresión de CD138 (análisis de inmunohistoquímica en micro hileras de tejido de tumor) se seleccionaron candidatos de tumor de una colección de tumores primarios, esto es, de tumores derivados de pacientes. Después de trasplante ¦ subcutáneo y establecimiento de tumores (tiempo de inducción 30 días) , el inmunoconjugado BT062 se inyectó intravenosamente a 2 diferentes concentraciones del maitansinoide DM4, 450 µq/kg y 250 /.g/kg (cada uno basado en el peso molecular de DM4 enlazado (1 mg de DM4 se conjuga a 52 mg de anticuerpo, igualando una masa total de 53 mg; 450 .g/kg DM4 = 23.850 //g). El inmunoconjugado se administró una vez a la semana por 10 semanas (en caso de tratamiento en ratones implantados con tumor pancreático) y 5 semanas (en caso de ratones implantados con tumor mamario) , Ejemplo 1: Carcinoma de Páncreas Tejido de tumor pancreático (PAXF 736 (Kuesters et al., 2006) se implanto (bilateral) en ratones NMRI . El tumor implantado se originó de un carcinoma pancreático primario a paciente (deficientemente diferenciado, adenocarcinoma infiltrante (un carcinoma exocrino),) . No se observaron efectos secundarios. El tumor de este paciente se identificó como tejido de alta expresión de CD138 por estudios de Inmunohistoquimica . Sin embargo, CD138 no se expresa en un grado comparable con células de plasma mielomatosas en pacientes de mi loma múltiple, como se detecta en lineas celulares tumorigénicas por tinción de superficie citométrica de flujo.
Tratamiento con BT062 se inició después de que los tumores alcanzaron- 'tamaño ' de aproximadamente 6-8 mm diámetro (mínimo 5 mm) . Diámetros de tumor se han medido dos veces a la semana. Volúmenes de tumor se calcularon de acuerdo con la fórmula a*b*b/2 en donde "a" es el eje más largo ·. y "b" su. eje perpendicular. La .inhibición de volúmenes de tumor en los grupos de prueba respecto al grupo de control de vehículos se calcula como la proporción de los volúmenes de tumor relativos medianos (T/C) .
Inhibición de tumor para un día particular (T/C en %) se calcula de la relación de los valores RTV promedio (volúmenes de tumor relativo) de los grupos de prueba contra control multiplicado por 100%.
Volúmenes de tumor relativo medio de grupo de control Día T/C (Día x) = x 100% volúmenes de tumor relativo medio del grupo de prueba Día El volumen de tumor puede reducirse significativamente por esta administración semanal de BT062. Como puede verse en la Figura 28, se observó remisión completa y parcial dependiente de dosis. La Figura muestra gue a una dosis de 23.85 mg/kg, puede obtenerse remisión completa 28 días después de implante del tumor, mientras que a una dosis de 13.25 mg/kg, puede obtenerse remisión completa 35 días después de implante del tumor. De manera notable, después de 52 días todos los ratones en ambos regímenes de- administración todavía "estaban vivos (8/8), que el octavo ratón del grupo de control hd se ha reducido a 1. Un valor T/C inferior a 10% indica remisión completa (CR = Complete Remission) (Bissery et al., 1991). De acuerdo con estos criterios, CR se logra en ambos grupos de tratamiento, reflejando la remisión completa que se logró por BT062.
En forma notable en una fase de observación libre de tratamiento, no se detecta recrecimiento de tumor, confirmando la curación completa en este modelo.
Día 52: Volumen Relativo de T/C promedio Intervalo tumor (%) (%) (±) Control 2055 . 2055 BT062-DM4; 13.25 mg/kg 0 (±1.0) 0 - 3.5 0.0 BT062-DM4; 23.85 mg/kg 0 (±0.01) 0 - 0.1 0.0 Tabla 11: Volumen de tumor es modelo de ratón-xenoinjerto de cáncer pancreático Ejemplo 2: Carcinoma mamario Ratones NMRI (desnudos) fueron implantados (bilateral) con tumor mamario primario de un paciente (determinado por IHC análisis como CD138 fuerte positivo) . Una metástasis en la piel de carcinoma -de mama se tomó en' la etapa MI. Un tumor que no responde a Herceptina, (bajo Her2 con expresión intermedia) . El tumor fue receptor negativo de estrógeno y receptor negativo de progesterona . Tumores a .implantarse fueron seleccionados de acuerdo con los resultados de tinción IHC (fuerte, expresión homogénea de CD138 detectada por BT062, triple negatividad (expresión negativa de receptores de hormona estrógeno y progesterona) ; expresión Her2 calificó 2 o menos (respecto a Herceptina no responde) .
El tratamiento con BT062 fue iniciado después de que los tumores alcanzaron tamaño aproximado de 6-8 mm de diámetro (mínimo 5 mm) . Los datos de tumor se midieron dos veces a la semana. Los volúmenes de tumor se calcularon de acuerdo con la fórmula a*b*b/2, con "a" que es el eje más largo y "b" su eje perpendicular. Inhibición de volúmenes de tumor en los grupos de prueba respecto a un grupo de control de vehículo se calcula como la proporción de los volúmenes de tumor relativo medianos (T/C) .
El volumen de tumor pudo reducirse significantemente por administración semanal de BT062. Se observó una remisión parcial y completa dependiente de dosis. El inmunoconjugado fue bien tolerado, sin influencia en peso corporal después de cada inyección. Un valor T/C inferior 10% se obtuvo en ambos grupos de tratamiento, reflejando una completa ' remisión lograda " por la administración de BT062. Como puede verse en la Figura YYY, el efecto anti-tumor (es decir, remisión completa) se logró después de 21 días, que puede considerarse una rápida respuesta BT062. En comparación con el modelo pancreático, la duración del tratamiento pudo recortarse a la mitad (5 semanas en lugar de 10 semanas) y la dosis baja de 13.25 mg/kg se redujo a 4 mg/kg para lograr un efecto similar, es decir completa remisión y sin recrecimiento de tumor. El periodo de tratamiento más corto para carcinoma mamario no se esperaba, ya que el análisis IHC el nivel de expresión CD138 fue similar. De ésta manera, no pudieron sacarse conclusiones del nivel de expresión CD138 a una recomendación general para la duración de tratamiento. Después de 21 días todos los ratones de ambos grupos tratados así como el grupo de control todavía estaban vivos. En un periodo de observación libre de tratamiento (39 días después de la última administración del inmunoconjugado) no se detectó recrecimiento de tumor, confirmando la curación completa.
Volumen de tumor Promedio Intervalo T/C relativo (%) (Día 21) Control (PBS) 533 (± 149.5) 339 - 878 BT062-DM4; 13.25 mg/kg/4 0 (± 0.02) 0 - 0.1 0.0 mg/kg BT062-DM4; 23.85 mg/kg 0 (± 1.75) 0 - 6.6 0.0 Tabla 12a: Volumen de tumor es un modelo de ratón-xenoinj erto de carcinoma mamario.
Muestras de tejido FFPE Calificación de tinción (membrana) 0.25 0.05 µ g/mL µ g/mL Mama, tumor 3 Homo 2-3 Homo Mets, -061909-13 Mama, tumor 2-3 Homo 1-2 Desconocido, -061909-12 Hetero Mama, tumor 3 Hetero 2 Focal Mets, -061909-09 Mama, tumor 3 Hetero 1-3 Primario, -111904-4 Hetero Mama, tumor 3 Hetero 1 Hetero Primario, -111904-1 Muestra de Piel Normal 1 3 Homo 3 Homo Muestra de Piel Normal 1 3 Homo 3 Homo Tabla 12b: Expresión de CD138 en células de carcinoma mamario contra células de epitelio Ejemplo 3: Carcinoma de Vejiga Ratones NMRI (desnudos) se implantan con un tumor de vejiga (determinado por análisis IHC . como CD138 fuerte positivo) , es decir un carcinoma de célula de transición.
Tratamiento con BT062 se inicia después de que los tumores alcanzaron un tamaño mayor a 5 mm. Los diámetros de tumor se miden dos veces a la semana. Volúmenes de tumor se calculan de acuerdo con la fórmula a*b*b/2, con "a" que es el eje más largo y "b" su eje perpendicular. La inhibición de volúmenes de tumor en un grupo de prueba respecto al grupo de control de vehículos se calcula como la proporción de los volúmenes de tumor relativos medianos (T/C) .
Volúmenes de tumor se busca reducir en forma significante por administración semanal de BT062. Se le da seguimiento a cualquier remisión parcial y completa dependiente de dosis.
Ejemplo 4: Carcinoma Pulmonar Ratones NMRI (desnudos) se implantan con un carcinoma pulmonar (determinado por análisis IHC como CD138 fuerte positivo) .
Tratamiento con BT062 se inicia después de que los tumores alcanzaron un tamaño mayor a 5 mm. Diámetros de tumor se miden dos veces a la semana. Volúmenes de tumor se calculan de acuerdo con la fórmula a*b*b/2, con "a" que es el eje más largo y "b" su eje perpendicular. La inhibición de volúmenes de tumor en grupos de prueba respecto al grupo de control de vehículo se calcula como la proporción de volúmenes de tumor relativos medios (T/C) .
Volumen de tumor se busca que se reduzca significantemente por administración semanal de BT062. Se le da seguimiento a cualquier remisión parcial y completa dependiente de dosis.
Estudios de Toxicidad Preclinicos Modelos de ratón-xenoin erto son excelentes para determinar si los inmunoconjugados de la presente invención son efectivos o no en contexto del cáncer modelado por el ratón. Sin embargo, ya que estos modelos carecen de la expresión apropiada inherente de CD138, no pueden servir como un modelo confiable para estudios de toxicidad y de ésta manera no pueden utilizarse para determinar por completo las cantidades tolerables de los inmunoconjugados de la presente invención.
En monos macacos y rhesus también no han mostrado que BT062 liga a cualesquiera antigenos relacionados a CD138 pero actualmente son la más adecuada especie , animal para estudios de toxicologia de BT062 conocidos. Se espera por lo tanto que el perfil de toxicidad de BT062 en ratones y monos se deba a los efectos no dirigidos del componente citotóxico del conjugado (DM4).
Estudios de toxicidad en una sola dosis se realizaron cumpliendo los requerimientos GLP en monos macacos y en ratones CD-1. Estos estudios se diseñaron para identificar dosis que provocan severa toxicidad y aquellos que no tienen efectos adversos (o mínimos) en animales, para identificar toxicidades potenciales en humanos y para identificar una dosis inicial segura para una prueba clínica Fase I utilizando una infusión de un solo bolo de BT062. « Estudio de Toxicidad Aguda en Ratones Se realizó un estudio de toxicidad de una sola dosis en ratones con BT062 administrado por una inyección sencilla IV de bolo en intervalo de 60-255 mg/m2 (20-85 mg/kg) . La dosis tóxica no severamente tóxica más alta (HNSTD = Highest Non Severely Toxic Dose) de BT062 en ratones fue 45 mg/kg ( 135. mg/m2) , con un estimado STD10 de 57 mg/kg (171 mg/m2).
Estudio de Toxicidad Aguda en Monos Se realizó un estudio de toxicidad en una sola dosis en monos macacos con BT062, administrada IV a dosis en intervalo de 48-336 mg/m2 (4-28 mg/kg). El HNSTD de BT062 en mono macaco, fue 12 mg/kg (144 mg/m2) . i Pruebas en Humanos con BT062 En el contexto de · la' presente invención, sujetos humanos respondieron bien a un régimen de baja dosis. Este incluso fue el caso en ausencia de cualesquiera tratamientos adicionales que pudieran compensar variaciones potenciales en expresión cualitativa o cuantitativa de CD138 en las células diana (en comparación con MYLOTARG) . Mientras que modelos de ratón demostraron que BT062 tiene actividad antimieloma altamente significante a dosis que son bien toleradas en ratones, la efectividad fue considerablemente mejor a dosis relativamente altas (ver la Figura 14), presentando la duda de cómo se han tolerado dosis superiores por sujetos humanos que expresan CD138 en una amplia variedad de células no tumorales.
Estudio de investigación Fase I Este estudio se realiza para probar los efectos (buenos y malos) y determinar la dosis tolerada máxima (MTD = Máximum Tolerated Dose) de BT062 para tratar pacientes con mieloma múltiple con relapso o con relapso refractario.
Hasta ahora, se reclutaron 26 pacientes. Al menos 11 de 26 pacientes experimentaron disminuida progresión de la enfermedad como se representa al recibir al menos un siguiente ciclo de tratamiento, mientras que 4 pacientes todavía están sometidos a tratamiento. La prueba se realiza en diferentes sitios, con grupos de 3 y 4 pacientes tratados con diferentes niveles de dosis (10 mg/m2, 20 mg/m2, 40 mg/m2, 80 mg/m2, 120 mg/m2, 160 mg/m2, 200 mg/m2) en cualquier punto entre 1 a 10 ciclos de tratamiento (ver Figura 23) . Como la persona con destreza en la técnica apreciará, una cantidad superior de ciclos de tratamiento es posible y dentro del alcance de las presentes invenciones, tales como 10 a 50, 10 a 100, 10 a 200 y más.
Disminuida progresión de la enfermedad con niveles de dosis relativamente bajos, es decir 20 mg/m2, 40 mg/m2, 80 mg/m2 y 120 mg/m2 con un paciente en el 2° nivel de dosis en 20 mg/m2 que no exhibe progresión de la enfermedad por 10 ciclos de tratamiento de 21 días. Ver la Figura 23, en donde las muestras de pacientes 001-001, 003-001, 002-002, 002-003, 002-004, 003-003, 001-005, 001-006, 001-008, 001-009, 004-001, 001-011, 004-002 y 001-012 se observó que la enfermedad avanzó eventualmente aun cuando es enfermedad estable y respuesta, incluyendo respuestas menores y parciales pudieron observarse. En la muestra de paciente 001-006, se mantuvo la dosis.
A estos niveles de dosis, como se describió anteriormente (ver Tablas 7 y 8), también se observó rápida eliminación de BT062 1000 del plasma. Algunos perfiles farmacocinéticos de estos esquemas de administración de baja dosis se ilustran en la Figura 17. Una comparación de perfiles en plasma de BT062 en humanos con los de monos, se muestra en la Figura 18. La gráfica a la izquierda muestra la diferencia a 120 mg/m2, mientras que aquellos 'a la derecha (160 mg/m2) muestran diferencias considerablemente menores .
Dosis de 160 mg/m2 y 200 mg/m2 también se administraron. Una dosis de 16Q mg/m2 se identifica como MTD y se expanden estudios en este grupo. Una dosis de 200 mg/m2 se identifica como MAD. Toxicidades limitantes de dosis (DLT = Dose Limiting Toxicities) se determinaron utilizando una graduación de acuerdo con NCI CTCAE v3.0 (agosto 09, 2006, http://ctep.cancer.gov). Criterios DLT específicos de estudio se citan a continuación: No Hematológico • Alopecia, de cualquier grado no se considera DLT • Náusea grados 3-4 y vómito que dura más de 3 días a pesar de medicamento antiemético óptimo3.
• Diarrea grados 3-4 que dura más que 3 días a pesar de medicamento antidiarreico óptimo3. a. Tratamiento antidiarreico y antiemético óptimo se determinó por cada investigador.
Hematológicos • Neutropenia grado 4 que dura más de 5 días.
• Neutropenia grado 3 o superior con temperatura mayor que o igual a 38.3°C (101°F) para 2 determinaciones consecutivas separadas 4 horas.
· Trombocitopenia grado 4 • Trombocitopenia grado 3 o superior con sangrado y que requiere el uso de transfusión de plaquetas.
• Neutropenia grado 3, trombocitopenia grado 3 NO se consideraron DLTs.
Todos los eventos adversos (Aes = Adverse Events) se evaluaron de acuerdo con NCI-CTCAE v3.0. Para AEs no citados en NCI-CTCAE v3.0, se estimó severidad por el investigador de acuerdo con estos criterios. Sólo fueron aceptables grado 1 y grado 2, con lo que grado 1 (Ligero) requiere mínimo o ningún tratamiento y no interfiere con las actividades diarias de los pacientes y grado 2 (Moderado) resulta en un bajo nivel de inconveniencia o consideración con las medidas terapéuticas. Eventos moderados pueden provocar algo de interferencia con el funcionamiento del sujeto.
AEs de Grado 3 (Severo) y Grado 4 (Que Amenaza la Vida) consideradas relacionados a BT062, se consideraron no aceptables y definen como DLT, si de otra forma no se definen por criterios DLT específicos del estudio.
Al tiempo muestras de pacientes 003-005, 002-012, y 002-011 fueron todavía participantes en el estudio.
Los pacientes de las muestras 002-003, 001-002 y 002-008 se retiraron.
Como se indica en la Figura 23. Dosis sencillas repetidas de régimen 10 mg/m2, 20 mg/m2, 40 mg/m2, 80 mg/m2, 120 mg/m2, 160 mg/m2, 200 mg/m2 se realizaron cada 21 días, lo que significa el día 1, día 22, día 43, día 64, día 85, día 106, y así en adelante. La enfermedad ha sido y se supervisará por evaluación de hematología del doctor, síntomas clínicos y química clínica así como al medir niveles de proteína M en el suero y orina de pacientes en (g/dL) y niveles de cadena ligera libre (FLC= Free Light Chain) en el suero de los pacientes con el tiempo.
Evaluación de Inmunoglobulina La cantidad de anticuerpos Ig incluyendo determinación de subgrupos IgG, se analizó en la evaluación.
Cuantificación de Proteina M y Ensayo de Cadena Ligera Libre de Suero Inicialmente, la respuesta a tratamiento se evalúo el día 1 de los ciclos de tratamiento 1-3 por cuantificación de proteína M utilizando inmunoelectroforésis (IEP) y inmunofij ación electroforésis (IFE) de suero y recolección de orina de 24 horas. Para los ciclos de tratamiento 3 y más allá, la cuantificación de proteína M se realizó en la visita del Día 15 a fin de que los resultados estén disponibles para estimar respuesta antes de iniciar el siguiente ciclo de tratamiento. Una evaluación de inmunoglobulina cuantitativa general se realizó junto con la cuantificación de proteína M.
Muestras en suero se emplearon para realizar ensayos FLC para examinar sujetos de mieloma múltiple sin proteína M detectable (mieloma no secretorio/oligosecretorio) y para . permitir detección de respuesta temprana al tratamiento. Por lo tanto, ensayos FLC en suero se realizaron los días 1, 2, 3, y 8 del ciclo de tratamiento en los días 1, 2, 3, 8 y 15 del ciclo 4, así como en los días 1, 8 y 15 de todos los otros ciclos de tratamiento. Proteína M y FLC se analizaron en la evaluación y en la visita final. Evaluaciones el día 1 del ciclo 1 sirvieron como valores de referencia.
\ Dosis Figura Mediciones de proteina M en mg/m2 orina/suero y mediciones FLC 20 Figura - Proteína M en orina disminuyó 24 después del 3er tratamiento por aproximadamente 17 semanas y aumentó después del 9o tratamiento - Criterio de proteína M para Respuesta Menor se alcanzó después del 8° tratamiento - Decremento en nivel de Proteína M en Orina de línea de referencia en más de 50% y del Día 42 (3er tratamiento) en más de 75% - Progresión de enfermedades después del Ciclo 10 - Proteina M en suero entre 0.06 y 0.1 g/dL (definido como no medible) 40 Figura - Enfermedad estable por 14 semanas 25 - Proteína M en suero disminuyó después del' 1er tratamiento y estabilizó por 14 semanas - Progresión de enfermedades se observa después del tratamiento se mantiene al . inicio del ciclo 6 (día 105) - Proteina M en orina aumentó de 0 en la evaluación a un máximo de aproximadamente 16 mg/24h (definido como no medible) 5 160 Figura - Nivel FLC en suero aumentó durante 26 el periodo de evaluación partiendo 21 días antes del dia 1 del tratamiento .
- Nivel FLC en suero disminuyó muy 10 pronto después del 1er tratamiento y ya estaba cerca de disminución de 25% el dia 8.
- En comparación con linea 'de referencia, niveles FLC se reducen 15 en aproximadamente 40% durante el 1er ciclo y en más de 50% después del 2o, 3er y 4° tratamiento.
- Criterios FLC para Respuesta Parcial se alcanzaron muy temprano. 20 - Progresión de enfermedad después del fin del 4° ciclo de tratamiento.
- Proteina M en suero no medible = 0; Proteina M en orina disminuyó de 140 mg/24h en linea de referencia a 25 120 mg/24h antes del 2° tratamiento (definido como no medible) => Mieloma no secretorio.
Tabla 13 Proporciona observaciones realizadas respecto a proteína M en Orina/Suero y mediciones FLC en suero en pacientes selectos.
De-terminación de BT062 y DM4 de plasma Para estimar propiedades PK de una sola dosis de BT062, después de administración IV de BT062, se realizó muestreado extenso de plasma durante el primer ciclo de tratamiento. Se realizó la misma evaluación durante el ciclo de tratamiento 4. En una proporción menor, las muestras de plasma también se obtuvieron el día 1 y 8 de todos los otros ciclos de tratamiento, así como en la visita final y seguimiento.
Determinación de Shed CD138 y HAPA Todas las muestras de plasma previas a la dosis se evaluaron para niveles de CD138 desprendido/soluble (sCDl38) para investigar una correlación potencial entre niveles de sCD138 y actividad anti tumor. Estas mediciones también permiten determinar valores cmax menores que lo esperado no dependen de la cantidad de sCD138 presente antes de administración de BT062 (ver Figura 22) . Muestras de plasma pre-dosis del día 1 de cada ciclo de tratamiento y de cada visita final y seguimiento, se evaluaron por la presencia de respuestas humorales contra BT062 (producto de fármaco) por evaluación de anticuerpos anti producto humano (HAPA = Human Antiproduct Antibodies) .
Mediciones de CD138 desprendido observado En pacientes de mieloma, pueden observarse altos niveles de SCD138 y pueden ser un indicador de pronóstico de pacientes de mieloma (Maisnar et al., 2005).
Pacientes con GUS y M pueden exhibir altos niveles de CD138 soluble concomitantes con niveles superiores de p2-rtiicroglobulina y' elevado contenido' de' células en plasma en la médula ósea (Aref et al., 2003) .
Se empleó un equipo para determinar CD138 soluble. De manera sorprendente, se encontró que a 20 mg/m2 de BT062 en. el paciente 003-003,. este paciente exhibió una respuesta menor respecto a niveles de proteina M en orina, aunque este paciente exhibió altos niveles de sCDl38 antes de tratamiento.
Valores CD138 solubles se determinaron en diferentes sujetos.
Sujeto SCD138 (ng/mL) 002-003 61.3 001-002 196 002-004 56.7 003-003 2583 Promedio 724.1 - - Tabla 14: Paciente 003-003 (dosis 20 mg/m2) exhibió valores muy altos de sCD138. Sin embargo este paciente logró una menor respuesta en nivel de Proteina M.
ESTUDIOS DE COMBINACIÓN Candidatos de fármacos antimieloma posibles se han evaluado como socios de combinación para "BT062 en lineas celulares.
Estudios de Lineas Celulares Estudios de combinación en modelos de ratón-xenoinjerto fueron precedidos por' estudios ' en ' lineas' celulares. La determinación de sinergia en diferentes lineas celulares se realizó de acuerdo con Chou and Tallay (1984) , utilizando el análisis de efecto medio. Aquí, se calculan valores IC50 para los efectos citotóxicos para cada fármaco y cada linea celular, y después proporciones IC50 para cada par de fármacos. Las células después se expusieron a series de dilución de cualquiera de estas mezclas de fármacos o los fármacos solos. Datos experimentales se analizaron utilizando el programa CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ) . índices de Combinación (CI = Combination Indexes) por cada experimento independiente, se calcularon y reportaron por separado. En el análisis, CI menor a 1, igual a 1 y más que 1 indica sinergia, aditividad y antagonismo, respectivamente. De acuerdo con la clasificación User' s guide, 2004), el autor del método, la escala de sinergia y el antagonismo es como sigue : Indice de Descripción Combinación < 0.1 Muy fuerte sinergia 0.1-0.3 Fuerte sinergia 0.3-0.7 Sinergia 0.7-0.85 Sinergia moderada 0.85-0.9 Ligera sinergia 0.9-1.1 Casi aditivo 1.1-1.2 Ligero antagonismo 1.2-1.45 Moderado antagonismo 1.45-3.3 Antagonismo 3.3-10 Fuerte antagonismo > 10 Muy fuerte antagonismo Células RPMI 8226 MOLP8 U266 Fármaco Bo tezomib Ligeramente Antago¬ Aditivo antagonista nista Talidomida Aditivo Aditivo a Antagoligeramente sinergistico nista antagonista Lenalido- Antagonista Aditivo a mida Sinergistico ligero a sinergistico moderado Melfalan Sinergistico Antagonista Aditivo a aditivo a ligero a sinergistico ligeramente moderado sinergistico Dexameta- No Aditivo Aditivo sona determinado Tabla 15: Estimados de resultados sinergisticos obtenidos en lineas celulares de acuerdo con el método de Chou and Talalay (1984) .
En este ejemplo lineas de células MOLP 8 se emplearon para combinación de BT062 con bortezomib, talidomida, lenalidomida, melfalan y dexametasona .
Combinación con talidomida o bortezomib, ni resulta en un efecto sinergistico ni aditivo, sino más bien un efecto antagonista. En contraste a estos estudios de cultivo celular la combinación con bortezomib fue sinergistica en el modelo de xenoinjerto descrito a continuación .
Posibles candidatos de fármaco anti-mieloma se han evaluado como socios de combinación para BT062 en estudios de Xenoinjerto utilizando células de mieloma múltiple de humano MOLP8.
Ejemplo 1 Efecto antl-mieloma de terapia de combinación con BT062 y Lenalidomida Ratones hembra se inocularon subcutáneamente con células de mieloma humano MOLP 8. Tratamiento con BT062 solo o en combinación con Lenalidomida se inició el día 11 posterior a inoculación de tumor. BT062 se emplea en concentraciones de 100 pg, 200 g y 400 g solo y en combinación con Lenalidomida que se dosifica en' forma intraperitoneal a 100 mg/kg los días 1 a 5 y los días 8 a 12. Un grupo de control de animales recibieron Salino amortiguado con fosfato (PBS) utilizando el mismo programa y . ruta de administración.. El crecimiento de tumor se supervisó al medir el tamaño de tumor y calculó con la fórmula de longitud x ancho x altura x 1/2, determinado los dias 10, 14, 18 y 21.
Sinergia se calcula como sigue (Yu et al., 2001; Gunaratnam et al., 2009): PROPORCIÓN (r) = FTV esperado (combinación) /FTV observado (combinación) FTV: Volumen de tumor fraccional = volumen de tumor promedio (prueba) /volumen de tumor promedio (control) Una relación A > 1 se considera sinergista, mientras que r < 1 es menos que aditivo.
La relación (r) es, cuando es superior a 1, referida aquí como "RELACION DE SINERGIA".
Como puede verse en la Tabla 15, la sinergia se observó después de 28 días en concentraciones de BT062 de 200 ig y 400 ug.
BT062 100 + Len Dias BT062 100 Lenalidomlda (observado) 10 0.93 1.00 0.97 14 0.75 0.82 0.59 17 0.52 0.45 0.23 21 0.53 0.42 0.19 24 0.44 0.55 0.18 28 0.33 0.46 0.17 BT062 200 + Len BT062 200 Lenalidomida (observado) 10 1.02 1.00 1.00 14 0.45 0.82 0.51 17 0.13 0.45 0.14 21 0.08 0.42 0.07 24 0.11 0.55 0.06 28 0.13 0.46 0.03 BT062 400 + Len BT062 400 Lenalidomlda (observado) 10 0.94 1.00 0.91 14 0.44 0.82 0.24 17 0.09 0.45 0.06 21 0.04 0.42 0.04 24 0.04 0.55 0.03 28 0.04 0.46 0.01 Cont.
Proporción Dias BT062 100 + Len esperado (exp/obs) 10 0.93 0.96 14 0.61 1.04 17 0.23 1.02 21 0.22 1.19 24 0.24 1.30 28 0.15 0.90 Proporción BT062 100 + Len esperado (exp/obs) 10 1.02 1.02 14 0.37 0.73 17 0.06 0.41 21 0.03 0.45 24 0.06 1.08 28 0.06 1.86 Proporción ??062 100 + Len esperado (exp/obs) 10 ¾ 0.95 1.04 14 0.36 1.49 17 0.04 0.63 21 0.02 0.44 24 0.02 0.80 28 0.02 1.43 Tabla 16: Volumen de tumor fraccional en xenoinjertos OLP 8.
Concentraciones diferentes de BT062 ya sea solas o en combinación con Lenalidomida se han administrado en xenoinjerto que contiene tumor. FTV representa el volumen de tumor relativo. Se desterminan efectos sinergisticos utilizando valores de relación de FTV esperado contra FTV observado. Una relación >1 indica sinergia.
Dosis por T/C (%) Agente inyección Dosis total (DÍA 17) PBS (0.2 mi) - - BT062 100 ug/kg 100 ug/kg 35 BT062 200 ug/kg 200 ug/kg 14 BT062 400 ug/kg 400 ug/kg 9 LenalidomidA 100 mg/kg lg/kg 31 BT062 100 ug/kg 100 ug/kg 19 LenalidomidA 100 mg/kg lg/kg BT062 200 ug/kg 200 ug/kg 12 Lenalidomida 100 mg/kg lg/kg BT062 400 ug/kg 400 ug/kg 6 Lenalidomida 100 mg/kg lg/kg Cont.
Regresiones Supervivientes libres de tumor día Agente Parcial Completa 77 Resultado PBS 0/6 0/6 0/6 BT062 0/6 0/6 0/6 Activo BT062 0/6 0/6 0/6 Activo BT062 4/6 1/6 0/6 Altamente activo Lenalido 0/6 0/6 0/6 Activo mida BT062 0/6 0/6 0/6 Activa Lenalido mida BT062 2/6 0/6 0/6 Activa lenalido mida BT062 5/6 4/6 0/6 Altamente activa Lenalido mida Tabla 17: Combinación de Lenalidomida BT062: efectos a diferentes dosis.
La Figura 28 muestra el efecto de la terapia de combinación en volumen de tumor medio (TV) en un modelo de ratón-xenoinjerto. El resultado muestra efectos aditivos de la combinación. Por favor refiérase a la Tabla 16 para la relación de sinergia.
Ejemplo 2 Efecto anti-mieloma de la terapia de combinación con BT062 y VELCADE VELCADE se ha evaluado como un socio de combinación de fármaco de mieloma múltiple potencial para BT062 en estudios de Xenoinjerto utilizando células de mieloma múltiple OLP8 (IMGN Inc.) . Tratamiento con BT062 solo o en combinación con VELCADE se inició 11 días posterior a implante de tumor. BT062 se empleó en concentraciones de 100 µg, 200 pg y 400 ig solo y en combinación con VELCADE que se dosificó a 1 mg/kg los días 1, 4, 8 y 11. Un grupo de control de animales recibió Salino amortiguado con fosfato (PBS) utilizando el mismo programa y ruta de administración. El crecimiento de tumor se supervisó al medir el tamaño de tumor y calcular con la fórmula longitud x altura x ancho x 1/2, determinado los días 10, 14, 17, 21, 24 y 28, respectivamente Se calculó sinergia como en el Ejemplo 1 de los estudios de combinación.
Como puede verse en la Tabla 18 , sinergia se observa en la combinación BT062 con VELCADE el día 25 en todos los regímenes de dosis BT062. Valores R reportados en la literatura son incluso superiores (Yu et al. , 2001) .
BT062 100 + Velcade Día BT062 100 Velcade (observado) 10 1.06 1.05 1.04 14 0.74 0.84 0.56 18 0.44 0.96 0.28 21 0.39 0.80 0.23 25 0.48 0.95 0.26 BT062 200 + Vel Días BT062 200 Velcade (observado) 10 1.02 1.05 1.07 14 0.52 0.84 0.45 18 0.13 0.96 0.10 21 0.10 0.80 0.05 25 0.10 0.95 0.04 BT062 400 + Vel Días BT062 400 Velcade (observado) 10 1.09 1.05 1.04 14 0.45 0.84 0.43 18 0.08 0.96 0.09 21 0.05 0 . 80 0.04 25 0.04 0.95 0.02 Cont. proporción Día esperado (exp/obs) 10 1.12 1.07 14 0.62 1.11 18 0.42 1.54 21 0.31 1.38 25 0.46 1.75 proporción Días esperado (exp/obs ) 10 1.12 1.07 14 0.44 0.98 18 0.12 1.19 21 0.08 1.47 25 0.09 2.09 Relación de Días esperado sinergia (exp/obs) 10 1.15 1.10 14 0.38 0.88 18 0.08 0.89 21 0.04 0.98 25 0.03 1.36 Tabla 18 : Tratamiento de combinación con VELCADE .
Volumen de tumor fraccional (FTV) representa el volumen de tumor promedio (prueba) / volumen de tumor relativo promedio (control) . La relación de FTV esperado (combinación) contra FTV observado (observado) . Valor de proporción > 1 indica sinergia, valores menores a 1 indican un efecto aditivo.
Combinación VELCADE Días de tratamiento (TX fecha Dosis de inicio (T- Exterpor = día 10 C) minio de inyecpost T/C en célu-las Agente ción inoc. ) (%) días log PBS (0.2 mi) Día 1 - - - BT062 100 Día 1 43 5.5 0.5 ug/kg BT062 200 Dia 1 11 14.5 1.3 ug/kg BT062 400 Day 1 7 31.5 2.8 ug/kg Velcade 1 mg/kg días 1, 100 0.5 0.0 4, 8, 11 BT062 100 Día 1 20 10.5 0,9 ug/kg Velcade 1 mg/kg días 1, 4, 8, 11 BT062 200 Día 7 23.5 2.1 ug/kg Velcade 1 mg/kg días 1, 4, 8, 11 BT062 400 Día 1 7 36.5 3.2 ug/kg Regresiones Supervivientes libres Complede tumor día Resul¬ Agente Parcial to 67 tado PBS 0/6 0/6 0/6 BT062 0/6 0/6 0/6 Inacti vo BT062 1/6 0/6 0/6 Activo BT062 4/6 2/6 0/6 Altamente activo Velcade 0/6 0/6 0/6 Inacti o BT062 1/6 0/6 0/6 Activo Velcade BT062 4/6 1/6 0/6 Alta¬ Velcade mente activo BT062 6/6 0/6 0/6 Altamente activo Tabla 19: Combinación VELCADE BT062: efectos a diferentes dosis.
La. Figura 29 muestra el- efecto de .la. terapia de combinación en volumen de tumor medio (TV) en un modelo de ratón de xenoinjerto. El resultado muestra que en el modelo empleado, tratamiento con VELCADE solo no tuvo efecto en el volumen de tumor. La combinación con BT062 proporciona efectos sinergisticos . Por favor refiérase a la Tabla 18 para la relación de sinergia.
Ejemplo 3: BT062/Melfalan ^ Células RPMI se han implantado en forma subcutánea en ratones desnudos. Ratones se aleatorizaron cuando el tumor alcanzó un volumen total de aproximadamente 100 mm3. BT062 se inyectó en forma intravenosa a 2 diferentes concentraciones: 400 pg/kg y 100 g/kg; cada uno con base en el peso molecular de DM4 enlazado. PBS sirvió como control negativo. Por grupo, 8 ratones con un tumor cada uno (implante unilateral) se emplearon. BT062 se dosificó semanalmente seguido por Melfalan una vez a la semana (3 mg/kg) un dia después de inyección intraperitoneal de BT062.
Los resultados se muestran en la Figura 30.
Una vez dada la descripción anterior, muchas otras características, ' modificaciones' "y mejoras serán aparentes a la persona con destreza. Estas otras características, modificaciones y mejoras por lo tanto se consideran como parte de esta invención, el alcance de la cual se va a determinar por el compendio de la invención y las siguientes reivindicaciones.
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Claims (55)

REIVINDICACIONES
1. Un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, caracterizado porque comprende: administrar a un paciente que lo requiere, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado que comprende cuando menos un agente dirigido que hace blanco o diana en células que expresan CD138, y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente con la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, y en donde la cantidad efectiva es una cantidad tolerable.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoconjugado se administra al sujeto en una cantidad de 5 mg/m2 a 200 mg/m2 o equivalente farmacocinético de 5 mg/m2 a 200 mg/m2 cuando se administra en combinación con un agente para tratar efectos secundarios adversos.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque una concentración máxima del inmunoconjugado en el plasma del sujeto entre 0 a 2 horas después del fin de una primera administración es menor a 50%, de preferencia menor a 40%, más preferiblemente menor a 30%, aún más preferible menor a 20%, o incluso menos que 10% de una concentración máxima teórica para el inmunoconjugado .
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el inmunoconjugado se administra al menos cuatro veces y una concentración máxima del inmunoconjugado en el plasma del sujeto entre 0 a 2 horas después del fin de cada una de las administraciones es menor que 55%, de preferencia menor que 50%, más preferiblemente menor que 40%, aún más preferible menor que 30%, menos que 20% o incluso menos que 10% de la concentración máxima' teórica para el inmunoconj ugado .
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoconjugado se administra en una dosis, de preferencia una dosis sencilla repetida, no mayor a aproximadamente 10, 20, 30, 40, 80, 90, 100 ó 120 mg/m2, una dosis diaria promedio de aproximadamente 400 ]ig/m2 a aproximadamente 6 mg/m2, incluyendo aproximadamente 500 µg/m2, aproximadamente 1 mg/m2, aproximadamente 2 mg/m2, aproximadamente 3 mg/m2, aproximadamente 4 mg/m2, aproximadamente 5 mg/m2, y/o una dosis semanal promedio de aproximadamente 3 mg/m2 a aproximadamente 40 mg/m2, incluyendo aproximadamente 5 mg/m2, aproximadamente 10 mg/m2, aproximadamente 15 mg/m2, aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 25 mg/m2, aproximadamente 30 mg/m2 o aproximadamente 35 mg/m2.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque por aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 210 o más días se mantiene la enfermedad estable.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque por aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ciclos de tratamiento cada uno de aproximadamente 3 semanas se mantiene enfermedad estable la enfermedad.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque al menos se mantiene enfermedad estable por 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ciclos de tratamiento de 20 mg/m2.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque una respuesta menor se observa después de 8 ciclos de tratamiento.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el método resulta en una enfermedad estable, una respuesta, en particular una respuesta menor, una respuesta parcial, una muy buena respuesta parcial, una respuesta completa severa o una respuesta completa durable por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ciclos de tratamiento o más en donde los ciclos de tratamiento comprenden cada uno aproximadamente 3 semanas con una administración del inmunoconjugado el día 1 de cada ciclo de tratamiento o por 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 ó 82 días, respectivamente.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inmunoconjugado se administra al sujeto en una cantidad de 5 mg/m2 o 10 mg/m2 a menos que 160 mg/m2, de preferencia a 150 mg/m2, 140 mg/m2, 130 mg/m2 o 120 mg/m2.
12. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración máxima es menor a 3 pg/ml por 10 mg/m2, menor a 8 µg/ml por 20 mg/m2, menor por 15 µg/ml por 40 mg/m2, menor que 25 µg/ml por 80 mg/m2, menor que 30 ug/ml por 120 mg/m2.
13. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la concentración máxima es menor que 14 µg/ml para 20 mg/m2, menor que 15 µg/ml por 40 mg/m2 o menor que 25 µg/ml para 80 mg/m2.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el CD138 en el paciente, se expresa en las células objetivo y en células no objetivo, en donde la administración resulta en eliminación del inmunoconjugado moderada o lenta en plasma, y en donde las células no diana que expresan CD138, en particular células epiteliales, no son substancialmente afectadas .
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el nivel de expresión de CD138 en las células diana y no diana que expresan CD138 es comparable.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porque la cantidad efectiva administrada es menor que 200 mg/m2 o menor que un equivalente farmacocinético de 200 mg/m2 cuando se administra en combinación con un agente para tratar efectos secundarios adversos y en donde la administración resulta en una respuesta en el sujeto, de preferencia después de menos de 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 horas.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad efectiva es mayor a 120 mg/m2.
18. El método de conformidad con la reivindicación 14 o cualquiera de las siguientes reivindicaciones, caracterizado porque la cantidad efectiva se administra como una sola dosis, una dosis sencilla repetida o en múltiples dosis.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque un valor cmax después de cada administración es mayor que 55% de un valor cmax teórico.
20. El método de conformidad con la reivindicación 14, o cualquiera de las siguientes reivindicaciones, caracterizado porque la administración resulta en niveles de proteina M o FLC de al menos enfermedad estable, una respuesta menor o una respuesta parcial en el sujeto, de preferencia después de una primera administración.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inmunoconjugado comprende una región de enlace de antigeno (ABR) contra CD138, y una región de anticuerpo adicional, en donde al menos parte de la región de anticuerpo adicional es de un anticuerpo humano y confiere las propiedades de isotipo IgG4.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el inmunoconjugado comprende nBT062 o un anticuerpo dirigido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% identidad de secuencia con nBT062 o corresponde a BT062.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque consiste esencialmente de administrar una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado y un portador farmacéutico aceptable, en donde un ingrediente activo de la composición consiste esencialmente del inmunoconjugado.
24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inmunoconjugado se administra en forma intravenosa.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el inmunoconjugado se administra en forma intravenosa en una dosis sencilla repetida .
26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la enfermedad es un desorden plasmaproliferativo asociado con la expresión CD-138, tal como mieloma múltiple, en particular mieloma múltiple de relapso o refractario.
27. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la enfermedad que expresa CD138 en células diana es seleccionada del grupo que consiste de carcinoma de células renales, cáncer endometrial, . cáncer cervical, adenocarcinoma de próstata, carcinoma pancreático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, carcinoma mamario, hepato-carcinoma, carcinoma colorectal, carcinoma de colon, carcinoma de células escamosas, cáncer pulmonar en particular carcinoma pulmonar de células escamosas, linfoma no Hodgkin, carcinoma de timo, útero, urinario o de ovarios .
28. ' El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la enfermedad se asocia con dolores de huesos y/o complicaciones de huesos y en donde la administración del inmunoconjugado reduce los dolores de huesos y/o - - complicaciones de huesos, de preferencia a un nivel aceptable .
29. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunoconjugado supera un fenotipo refractario. ^
30. Método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, caracterizado porque comprende (i) identificar una enfermedad, asociada con células diana que expresan CD138, tal como mieloma múltiple, y que no responde o responde deficientemente a tratamiento con uno o más agentes citotóxicos incluyendo inmunomoduladores y/o inhibidores de proteasoma, y (ii) administrar al sujeto, de preferencia en forma intravenosa, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado de la reivindicación 2, en donde el sujeto no responde o responde deficientemente a tratamiento con uno o más agentes citotóxicos incluyendo inmunomoduladores y/o inhibidores de proteasoma, y en donde la enfermedad se trata.
31. Un método para tratar una enfermedad asociada con células diana que expresan CD138, caracterizado porque comprende administrar a un paciente que requiere este tratamiento y que exhibe altos niveles de SCD138, tales como más que 50 ng/ml, más que 60 ng/ml, más que 70 ng/ml más que 80 ng/ml, más que 100 ng/ml, más que 150 ng/ml, más que 200 ng/ml, más que 200, 400, 500, 600, 700, 800, 900, - - 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ng/ml, una cantidad efectiva del inmunocon ugado de la reivindicación 1, en donde una cantidad tan baja como 20 mg/m2 o tan baja como 40 mg/m2 es efectiva para proporcionar una respuesta tal como una respuesta menor.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la respuesta resulta del enlace selectivo del inmunoconjugado .
33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el sujeto no responde o responde deficientemente a tratamiento con agentes citotóxicos incluyendo inmunomoduladores tales como inhibidores de lenalidomida y/o proteasoma tales como bortezomib.
34. Una combinación anticáncer caracterizada porque comprende: al menos un agente citotóxico y al menos un inmunoconjugado que comprende un agente dirigido que hace blanco a células que expresan CD138, y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde (a) la combinación tiene una relación de sinergia mayor a 1, mayor a 1.1, mayor a 1.2, mayor a 1.3, mayor a 1-4, o (b) la combinación tiene un exterminio celular Logio mayor a 2, o (c) la combinación tiene una relación de sinergia de aproximadamente 1 y la molécula efectora y el agente citotóxico tienen modos de acción de interferencia, y en donde la combinación anticáncer es una composición farmacéutica o un equipo que comprende recipientes separados del agente citotóxico como mínimo y el inmunoconjugado como mínimo.
35. La combinación anticáncer de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el agente citotóxico es un inhibidor de proteasoma, un agente inmunomodulador o un agente anti-angiogénico, un agente de alquilación de ADN o una mezcla de dos o más de los mismos.
36. La combinación anticáncer de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el agente citotóxico es bortezomib, talidomida, lenalidomida, melfalan o una mezcla de dos o más de los mismos.
37. La combinación anticáncer de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizada porque el agente dirigido es un anticuerpo dirigido de ingeniería que hace diana en células que expresan CD138.
38. La combinación anticáncer de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el anticuerpo dirigido de ingeniería comprende un ABR contra CD138, y una región de anticuerpo adicional en ,donde al menos parte de la región de anticuerpo adicional es de un anticuerpo humano y confiere propiedades de isotipo IgG4.
39. La combinación anticáncer de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque el inmunoconjugado comprende nBT062 o un anticuerpo dirigido que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% identidad de secuencia con nBT062 o corresponde a BT062.
40. La combinación anticáncer de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38, caracterizada porque la molécula efectora y el agente citotóxico tienen modos de acción de interferencia, y en donde estos modos de acción involucran de preferencia inhibición de microtúbulos o inducción de freno del ciclo celular.
41. La combinación anticáncer de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el modo de acción de interferencia es inducción de freno de ciclo celular ¦ y en donde el agente citotóxico es melfalan, bortezomib y lenalidomida o talidomida.
42. La combinación anticáncer de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, caracterizada porque la molécula efectora y el agente citotóxico tienen modos de acción sin interferencia.
43. La combinación anticáncer de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 42, caracterizada porque la combinación anticáncer es una composición farmacéutica que comprende al menos un excipiente farmacéutico aceptable.
44. La combinación anticáncer de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 42, caracterizada porque la combinación anticáncer es un equipo que comprende en un recipiente el inmunoconjugado, en un segundo recipiente el agente citotóxico como mínimo e instrucciones de como emplear los componentes del equipo.
45. Un método para tratar una enfermedad asociada con células diana- que expresan CD138, caracterizado porque comprende: administrar a un paciente que lo requiere, un cantidad efectiva de la combinación anticáncer de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 44 o una combinación anticáncer que comprende al menos un agente citotóxico y al menos un inmunoconjugado que comprende un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138 y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza funcionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, y en donde el inmunoconjugado supera un fenotipo refractario. )
46. Un método para tratar una enfermedad no proliferativa de plasma asociada con células diana que expresan CD138, caracterizado porque comprende: administrar a un sujeto que lo requiere o a células de la enfermedad no proliferativa de plasma, una cantidad efectiva de un inmunoconjugado que comprende al menos un agente dirigido que hace diana en células que expresan CD138, y al menos una molécula efectora, en donde el agente dirigido se enlaza uncionalmente a la molécula efectora para formar el inmunoconjugado, en donde CD138 en el sujeto, se expresa en las células diana y en células no diana a niveles comparables o en donde CD138, en el sujeto se expresa en las células diana a niveles inferiores a los de las células no diana que expresan CD138.
47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque las células no diana que expresan CD138 son células de epitelio.
48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque las células diana de la enfermedad desprenden CD138 sobre un periodo de 24 horas, 2, 3, 4, 5, 6 días.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la enfermedad es carcinoma mamario.
50. El método de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizado porque el inmunocon ugado induce remisión de un tumor sólido.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el tumor sólido es un carcinoma pancreático o carcinoma mamario.
52. El método de conformidad con la reivindicación 50 ó 51, caracterizado porque la remisión es seguida por un intervalo de tiempo que está libre de recrecimiento del tumor.
53. El método de conformidad con la reivindicación 45 ó 46, caracterizado porque la enfermedad es carcinoma de células renales, cáncer endometrial, cáncer cervical, adenocarcinoma de próstata, carcinoma pancreático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, carcinoma mamario, hepato-carcinoma, carcinoma colorectal, carcinoma de colon, carcinoma de células escamosas, cáncer pulmonar, en particular carcinoma pulmonar de células escamosas, linfoma no Hodgkin, carcinoma de timo, útero, urinario o de ovarios .
54. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el tumor es un carcinoma mamario, que es receptor negativo de estrógeno y/o receptor negativo de progesterona y/o resistente a herceptina .
55. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo dirigido es un anticuerpo de ingeniería.
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