MX2011007643A - Dispositivo microfluidico funcionalizado para inmunofluorescencia. - Google Patents

Abstract

La solicitud reclama un dispositivo microfluídico y un método correspondiente adecuado para los ensayos de inmunofluorescencia. El dispositivo comprende dos componentes planos, uno de los cuales incluye una muesca sobre una superficie. Cuando las dos superficies son agrupadas por pares, la muesca llega a ser un canal. El componente sin la muesca es funcionalizado con las nanopartículas del óxido metálico: esta capa constituye el fondo del canal cuando el dispositivo es ensamblado. El objetivo de la funcionalización es permitir una mejor adhesión de las células sobre el fondo del canal, para efectuar las pruebas de fluorescencia, en particular las pruebas de FISH sobre el dispositivo.

Description

DISPOSITIVO MICROFLUIDICO FÜNCIONALIZADO PARA INMUNOFLUORESCENCIA Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de los ensayos a base de fluorescencia, analíticos y, en particular, a un dispositivo que puede ser utilizado en los ensayos de FISH. Un método para efectuar eficientemente la prueba por el uso del dispositivo de la invención está abarcado también.

Antecedentes de la Invención La microfluídica es una ciencia multidisciplinaria reciente, que trata de volúmenes muy pequeños de líquidos, desde microlitros descendiendo hasta femtolitros. Su aplicación más temprana está relacionada con las cabezas de impresión de las impresoras por chorro de tinta, pero se ha probado que va a ser adecuada para el desarrollo de la tecnología de un "laboratorio que cabe en la palma de la mano", especialmente en el campo de la bioctecnología, en donde las muestras están caracterizadas por tamaños muy pequeños. La biología molecular, el análisis enzimático, el análisis genómico, la proteómica, la patología clínica, los diagnósticos, el análisis del medio ambiente, etc., todos son campos de explotación potencial de la microfluídica . A tales dimensiones de microescala, los fluidos pueden mostrar un comportamiento muy diferente comparado con la macroescala, REF.221963 una característica que debe ser tomada en cuenta cuando se diseñan dispositivos o experimentos microfluídicos que hacen uso de ellos. Por ejemplo, la tensión superficial, la disipación de la energía, la resistencia y difusión de los fluidos, puede tener una amplia influencia en los resultados de los experimentos .

Por estas razones, los protocolos ordinarios o acostumbrados de estos ensayos no pueden ser utilizados directamente en los dispositivos microfluídicos , sino que en lugar de esto se deben diseñar procedimientos especiales antes de la implementación.

Las ventajas relacionadas con el uso de la microfluídica nos regresan al manejo más facilitado permitido por tales dispositivos, el control de flujo más elevado permitido, el tiempo reducido del análisis, el control elevado otorgado sobre tanto la concentración como las interacciones moleculares, el ahorro de costos incomparable para los reactivos y los productos de desecho, haciendo por consiguiente su uso más favorable ambientalmente y proporcionando la capacidad para procesar más muestras con menos espacio debido a impedimentos reducidos de los instrumentos .

Las ventajas anteriores hacen posible que los experimentos que incluyen el uso de dispositivos microfluídicos sean automatizados, lo cual podría ser muy interesante desde el punto de vista industrial .

La biotecnología de microchips, en particular, está beneficiándose de la mayoría de las substancias microfluídicas , gracias al flujo de trabajo integrado desarrollado recientemente.

Los dispositivos del laboratorio que cabe en la palma de la mano son chips desde alguno milímetros cuadrados hasta algunos centímetros cuadrados sobre los cuales los bio-ensayos son reproducidos a escala mucho más pequeña, en la forma de circuitos microfluídicos .

Los dispositivos del laboratorio que cabe en la palma de la mano, o los circuitos microfluídicos para su uso en los dispositivos, son ampliamente descritos en la literatura .

La patente US No. 6,613,560 describe dispositivos miniaturizados para llevar a cabo procesos químicos y bioquímicos, en particular un micro-reactor para llevar a cabo una amplificación del ADN; este documento enfrenta el problema de una adsorción indeseable de la muestra bajo análisis por las paredes del micro-reactor, y propone el uso de micro-reactores hechos (o con superficies recubiertas) con materiales que exhiben una adsorción reducida de los compuestos presentes en la muestra.

La solicitud de patente internacional WO 95/22051 describe un dispositivo de célula de flujo que tiene en sus canales reactivos inmovilizados que producen una respuesta detectable eléctrica u ópticamente a un analito que puede estar contenido en una muestra de prueba.

La solicitud de patente europea EP 1542010 describe un dispositivo microfluídico que comprende un área de reacción, diseñada para alojar una reacción entre al menos una especie presente en la muestra y al menos una substancia específica, fijada en el área, que puede provocar la interacción específicamente o no específicamente con una o más substancias predeterminadas (especies objetivo) . La fijación segura de la substancia específica á las paredes del circuito microfluídico es obtenida por medio de una película inmovilizada, intermedia (hecha generalmente de un compuesto orgánico formado previamente sobre las paredes.

Los dispositivos de laboratorio que cabe en la palma de la mano ya están disponibles para su uso en una variedad de técnicas analíticas, tales como la electrofóresis , cromatografía, teñido, citometría por fluorescencia, análisis de proteínas, reacción en cadena de la polimerasa, análisis de la sangre, etc., y, como una aplicación adicional, la Hibridación In Situ por Fluorescencia (FISH) . Como una referencia general a FISH, véase, por ejemplo, "Cytogenetic and FISH techniques in Myeloid alignancies" , L. J. Campbell, Methods in Molecular Medicine, 2006, Vol. 125, pp. 13-26.

De manera más detallada, FISH es una herramienta muy sensible utilizada en el diagnóstico para la detección de alteraciones del genoma.

FISH representa una herramienta de diagnóstico muy promisoria para la identificación de rearreglos o anormalidades cromosómicas , que no pueden ser detectadas con otras técnicas convencionales. Por ejemplo, el análisis de las alteraciones en los cromosomas puede ser predictivo de una enfermedad futura o de una respuesta a la terapia.

Como primera etapa, FISH requiere la inmovilización celular sobre un soporte, tal como, por ejemplo, un portaobjetos de microscopio; después de esto, las células padecen una digestión de las proteínas para remover las proteínas citoplásmícas y cromosómicas, permitiendo así un "acceso" mejorado al ADN cromosómico, que necesita ser desnaturalizado, por ejemplo por la incubación con soluciones a 'base de formaldehído . Después de la deshidratación de las células con una serie de soluciones a base de etanol, las sondas del ADN son agregadas. La desnaturalización es efectuada entonces a aproximadamente 75 °C durante 2-5 minutos y se permite la incubación. Un tratamiento con una solución post-hibridación adecuada hace posible que las aglutinaciones de alteración no específica debidas a la hibridación cruzada sean evitadas. Los sitios de la anormalidad en la secuencia del cromosoma llegan a ser así evidentes por formación de imágenes por fluorescencia.

Previo a FISH, el análisis del ADN hacia uso de métodos escasamente efectivos en cuanto al costo, mientras que, en el tiempo actual, FISH permite a los investigadores investigar y entender rápidamente las características básicas de muchas enfermedades y cánceres.

Por ejemplo, FISH ya encuentra aplicación en la prueba de la médula ósea para tumores hematológicos, tales como la leucemia, linfoma y mieloma, y en la prueba de los tumores sólidos, los nodos linfáticos y la sangre periférica, en el diagnóstico genético de pre- implante , en las evaluaciones de las anormalidades genéticas pre-natales y post-natales .

Como una ventaja general, FISH puede ser aplicada directamente a las muestras del tumor, tales como las biopsias, las secciones o el material sumergido en parafina, proporcionando una resolución hasta un nivel celular único, haciendo posible la detección de eventos raros sobre una muestra de una célula adecuada. A pesar de las ventajas potenciales ofrecidas por esta técnica, su adopción práctica ha sido impedida así por varias desventajas.

En primer lugar, FISH es extremadamente costosa, tanto en términos de los costos de los reactivos como tiempos-hombre y tiempos de la máquina necesarios para efectuar el protocolo y el análisis de imágenes. Este límite evita que FISH sea un método de selección en serie.

Un método adecuado para superar este límite podría ser el desarrollo de un protocolo miniaturizado por la explotación de las características de los dispositivos microfluídicos .

Sin embargo, un límite adicional de los protocolos y dispositivos de FISH que puede ser predicho es la baja eficiencia de la adhesión celular en los dispositivos microfluídicos ; esto se debe al hecho de que, debido a las secciones transversales muy limitadas de los canales microfluídicos , se deben aplicar presiones relativamente elevadas a las ' muestras líquidas para tener a éstas moviéndose en el dispositivo, lo cual a su vez conduce a velocidades de flujo relativamente elevadas. Por ejemplo, el artículo "FISH and chips : chromosomal analysis on microfluidic platforms", V. J. Sieben et al, IET Nanobiotechnologies, 2007, 1 (3) pp. 27-35, describe un protocolo de adhesión estándar por citocentrifugación, que sin embargo solamente obtiene un rendimiento de la retención de los analitos objetivo en el canal del dispositivo microfluídico del 20 %. Esta característica podría incrementar la velocidad de los "falsos negativos" cuando se buscan alteraciones raras.

Un dispositivo microfluídico capaz de inmovilizar eficientemente las células, adecuado para efectuar los ensayos de FISH, podrían ayudar a la ampliación del uso de la técnica.

Varios documentos del arte previo tienen la tarea de mejorar la retención de los analitos en los canales de los dispositivos microfluídicos .

El artículo "Enforced Adhesión of Hematopoietic Cells to Culture Dish Induces Endomitosis and Polyploidy" , X. Huang et al., Cell Cycle, 4(6), páginas 801-805, describe el uso de substratos funcionalizados con poli-D-lisina para mejorar la adhesión de las células; los substratos con un recubrimiento de poli-D-lisina, disponibles comercialmente por ejemplo de BD Biosciences, actualmente son considerados los antecedentes de la invención para la adhesión de las células y comúnmente son utilizados en este campo de investigación.

La solicitud de patente internacional WO 2008/031228, a nombre de la University of Alberta, describe un protocolo de fijación que permite lograr un porcentaje de células adheridas de hasta 75 % del total. La inmovilización de las células en los canales microfluídicos es obtenida por la elevación de la temperatura en el intervalo entre 50 y 95 °C durante un período de tiempo, determinado por la intervención de un operador humano, suficiente para permitir la inmovilización de una porción de una población de células de interés. Como una consecuencia, a pesar de la mejora en el porcentaje de las células adheridas, el método de este documento todavía sufre de la limitación de que la etapa de inmovilización debe ser controlada por un operador humano, y porque las temperaturas relativamente elevadas necesarias en esta etapa podrían dañar algunas células. Además, la solicitud describe dos modalidades del dispositivo microfluídico, llamadas "Microchip" y "Microchip Circulante", respectivamente. La modalidad llamada "Microchip" se hace de un portaobjetos de microscopio de 0.5 mm de grosor que lleva las substancias microfluídicas y un cubreobjetos de 0.17 mm de grosor, declarados que van a ser necesarios para crear una distancia de trabajo mínima para formación de imágenes de alta resolución. Ambos de los componentes del dispositivo son extremadamente frágiles y requieren un manejo extremadamente cuidadoso, previniendo un fácil escalamiento hacia arriba del dispositivos en medios ambientes industriales. La modalidad llamada "Microchip Circulante" está hecha de dos portaobjetos de microscopio de 1.1 mm de grosor y de una capa de PDMS intermedia de 0.254 mm de grosor. Esta modalidad supera los problemas de fragilidad del "Microchip" , pero su grosor no permite el uso de un lente de 100X para la adquisición de imágenes, previniendo así la obtención de imágenes de alta resolución, cuando se requiera por los estándares de FISH actuales .

La solicitud de patente europea EP 1215186 describe un soporte, que va a ser útil para la inmovilización de oligonucleótidos , que puede ser utilizado en la fabricación de dispositivos microfluídicos; este soporte tiene la superficie funcionalizada con un óxido elegido entre Hf02, Ti02, Ta205, Zr02 y sus mezclas, tratadas después de su deposición para hacer hidrofílica a su superficie. Este documento no dice nada sin embargo, acerca de la inmovilización de las células.

La solicitud de patente internacional O 00/33084 describe un amplio intervalo de dispositivos para su uso en el diagnóstico, en el cual la superficie activa es funcionalizada con los compuestos orgánicos, posiblemente depositados sobre un óxido de la "red gelificada" . Este documento no proporciona ninguna información acerca de los rendimientos de retención reales de las células.

En consecuencia, un dispositivo y método de FISH que pudieran superar las desventajas de los métodos del arte previo, tanto clásicos como de la microfluídica, son necesarios. En particular, podría ser deseable diseñar un dispositivo y un proceso, que pudieran ser económicos, fáciles de manejar, con escalamiento hacia arriba y funcionales, rápidos para ser llevados a cabo y también eficientes .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un dispositivo microfluídico mejorado, que puede ser utilizado de manera adecuada y ventajosa en las técnicas basadas en la fluorescencia analítica. Un protocolo adaptable para utilizar el dispositivo, que conduce a resultados sorprendentes e inesperados, también es descrito.

El primer objeto de la invención es un dispositivo microfluídico que comprende al menos un portaobjetos y una parte en la cual está presente una muesca, el portaobjetos y la parte son tales que por su unión se forma un microcanal, caracterizado porque al menos el área sobre la superficie del portaobjetos volteada hacia el microcanal es funcionalizada con un óxido metálico nanoestructurado seleccionado preferentemente entre el óxido de Ti, óxido de Zn u óxido de Zr .

Un objeto adicional de la invención es el uso del dispositivo de la invención para efectuar ensayos a base de fluorescencia, analíticos.

Como un objeto todavía adicional, la presente invención se refiere a un método para efectuar ensayos a base de fluorescencia, analíticos, utilizando el dispositivo microfluídico de la invención.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1C muestran las vistas en planta y la vista en sección de una parte del dispositivo microfluídico ejemplar; las figuras 2A-2D muestra un dispositivo ensamblado de la invención en diferentes etapas del ensamblaje; la figura 3A muestra las partes que componen un dispositivo de la invención en una primera modalidad del mismo; la figura 3B una vista en sección del dispositivo ensamblado de la figura 3A; la figura 4A muestra las partes que componen un dispositivo de la invención en una segunda modalidad del mismo; la figura 4B muestra una vista en sección del dispositivo ensamblado de la figura 4A; la figura 5A muestra las partes que componen un dispositivo de la invención en una tercera modalidad del mismo; la figura 5B muestra una vista en sección del dispositivo ensamblado de la figura 5A; la figura 6 muestra esquemáticamente los resultados de las pruebas de adhesión de los células cultivadas (U937) sobre un portaobjetos funcionalizado de acuerdo con la invención, y sobre los portaobjetos que no son de la invención; la figura 7 muestra esquemáticamente los resultados de las pruebas de adhesión de las células cultivadas (U937) sobre un portaobjetos funcionalizado de acuerdo con la invención, y sobre los portaobjetos que no son de la invención, después de una corrida microfluídica completa (procedimiento de esfuerzo cortante prolongado) ; la figura 8A, figura 8B, figura 8C muestran esquemáticamente los resultados de las pruebas de adhesión de las células hematopoyéticas primarias sobre los portaobjetos funcionalizados con diferentes óxidos metálicos nanoestructurados de acuerdo con la invención, y sobre los portaobjetos y los óxidos metálicos que no son de la invención; la figura 9 muestra el resultado de la prueba de adhesión sobre dos dispositivos de la invención; la figura 10 y la figura 11 muestran células cultivadas (U937) después de las pruebas de FISH en el microcanal utilizando los dispositivos de la invención.

Descripción Detallada de la Invención En un primer aspecto de la misma, la invención se refiere a un dispositivo microfluídico. El dispositivo de la presente invención encuentra aplicaciones en el campo de los ensayos a base de fluorescencia, analíticos y, en particular, puede ser utilizado para efectuar los ensayos de FISH.

Con respecto a los dispositivos conocidos, el dispositivo de aquí tiene varias ventajas, que serán apreciadas por la persona experta en el arte.

El dispositivo microfluídico mejorado de la presente invención es formado acoplando al menos un portaobjetos y una parte en la cual una muesca está presente, de modo que la unión de estos (al menos) dos elementos definen un microcanal en el dispositivo. Aunque otras configuraciones pueden ser contempladas, la estructura aún más común para estos dispositivos es una en la cual la muesca no se extiende a lo largo de la longitud completa de la parte en la cual está presente, y se tiene acceso al microcanal desde la parte superior del dispositivo, a través de orificios formados en la parte (y en otros elementos posibles que componen el dispositivo completo) ; el resto de la descripción se hará con referencia a esta estructura común.

Dentro de la presente invención, cualquier portaobjetos adecuado puede ser utilizado, por ejemplo uno hecho de materiales transparentes tales como el vidrio, el cuarzo o algunos plásticos. El vidrio, en particular, es el material preferido para su característica inerte química, su transparencia, su costo bajo, su porosidad escasa, su hidrofilicidad y su estabilidad a largo plazo. Por razones de conveniencia, se puede hacer uso de un portaobjetos de microscopio estándar, que está, preferentemente en la forma de una hoja delgada de vidrio, tal como el borosilicato, sílice humeante o aún sosa-cal, de dimensiones de aproximadamente 25 x 76 x l mm.

El portaobjetos utilizado dentro de la presente invención tiene al menos el área, que en el dispositivo completo forma una pared del microcanal, funcionalizada con un óxido metálico nanoestructurado, para mejorar la adhesión celular; en lo que sigue, los óxidos metálicos nanoestructurados serán referidos como ns-MOXí en la cual M significa un metal.

Entre los ns-MOx, los preferidos son el óxido de Zn (ns-ZnO) , óxido de Zr (ns-Zr02) y, en particular, óxido de Ti (ns-Ti02) , en la forma de películas nanoestructuradas delgadas. Estas películas de óxido están constituidas por nanopartículas con una distribución de tamaño que cubre el intervalo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50 nm, centrado dentro de 5 y 15 nm, como es observado con la Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM) y Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) .

Las nanopartículas son ensambladas aleatoriamente para generar una estructura porosa con una densidad de la masa desde aproximadamente 1/2 hasta aproximadamente 1/10, de la densidad de la masa del óxido volumétrico correspondiente, como se mide por el MicroBalance del Cristal de Cuarzo (QCM) y AFM; en el caso del ns-Ti02, la densidad de la masa es típicamente de aproximadamente 1/7 de la densidad de la masa del Ti02 denso.

Estos materiales están compuestos de nanopartículas tanto nanocristalinas como amorfas como es revelado por TEM y Difracción de Rayos X (XRD) . En el caso de ns-Ti02f se ha observado (espectroscopia de Raman) que coexisten las fases de anatasa y rutilo.

Las películas, cuando se depositan con un espesor de 50 nm, son transparentes para longitudes de onda en la región visible.

En el caso particular del ns-Ti02, la absorción óptica llega a ser apreciable a aproximadamente 320 nm, en la región UV (espectroscopia de UV-VIS) . De las características del borde de absorción, el hueco de la banda óptica (modelo de Tauc) es evaluado entre 3.2 hasta 3.6 eV. El índice de refracción de ns-Ti02 tiene un valor de entre 1.6 y 1.8, mucho más bajo que uno del ns-Ti02 volumétrico (2.5 en Anatasa, 2.9. en Rutilo) , debido a la porosidad de nanoescala (modelo de Lorentz-Lorenz) .

Las películas nanoestructuradas de la invención tienen un espesor comprendido entre 20 nm y 200 nm, preferentemente entre 40 nm y 60 nm, con una rugosidad superficial entre 2 nm y 30 nm, preferentemente entre 5 nm y 15 nm .

Las películas delgadas de estos ns-MOx pueden ser depositadas sobre el portaobjetos de soporte por varias técnicas, tales como la deposición catódica o la Deposición de Rayo Láser Pulsante (PLD) ; sin embargo, la técnica preferida es por medio del uso de la Fuente del Grupo de Microplasmas Pulsantes (PMCS) . Esta técnica permite la deposición de películas nanoestructuradas delgadas y está basada en la ablación del material desde un cátodo colocado dentro de la fuente a través del plasma generado por un flujo del gas inyectado en la cámara de la fuente interconectada con un sistema de vacío. La diferencia de la presión entre la fuente y la cámara de vacío permite la extracción del material nanoparticulado . Para una referencia general a la técnica de PMCS, véase, por ejemplo, la solicitud de patente europea EP 1031639 o el Journal of Physics D, 32 (1999) , L105-109. PMCS es la técnica preferida porque probó que garantiza las características de la porosidad deseadas sobre el material depositado.

Cuando son producidas por medio de PCMS, las características superficiales de las películas de ns-MOx con consistentes con el proceso de crecimiento por agregación balística, que muestra en particular una rugosidad superficial dependiendo del espesor. Para un espesor dentro de 40-60 nm, la rugosidad superficial está entre 5 nm y 15 nm, y típicamente entre 8 nm y 12 nm (AFM) .

Las películas de ns-MOx son tratadas preferentemente después de la deposición con un plasma de oxígeno (tratamiento durante 150 segundos a 100 W) , para incrementar la humectabilidad y mejorar la capilaridad en el microcanal, favoreciendo así el flujo de los líquidos espontáneos dentro del microcanal.

El material preferido para la funcionalización del portaobjetos es el ns-Ti02, estequiométrico o no, preferentemente obtenido por medio de la técnica de PMCS. El dióxido de titanio es un material altamente biocompatible y bio-activo; en efecto, el material probó que no interfiere con las actividades de las células normales, tales como el crecimiento celular, ni interactúa con los reactivos utilizados en la preparación de cultivos celulares. Además, el dióxido de titanio nanoestructurado muestra una señal del fondo de fluorescencia muy baja (autofluorescencia) , que mejora la relación de la señal/ruido en el caso de las mediciones a base de la fluorescencia.

Un dióxido de titanio nanoestructurado es descrito en WO 2007/009994 a nombre del solicitante. Este documento describe substratos para inmovilizar los virus o células,- sin embargo, este documento no menciona el uso en el campo de la microfluídica, y no existe sugerencia acerca del hecho de que el ns-??? puede tener propiedades superiores, comparado con otros materiales promotores de la adhesión conocidos, cuando son utilizados en este campo específico.

La parte en la cual la muesca está presente puede ser una almohadilla que utiliza diferentes materiales blandos, generalmente polímeros tales como la silicona o el neopreno o PDMS (polidimetilsiloxano) ; o, puede ser una plancha delgada de un material rígido, generalmente un material inorgánico tal como el vidrio, el cuarzo o semejante.

La muesca tiene típicamente una longitud del orden de milímetros y una sección transversal con dimensiones laterales del orden de decenas o pocos cientos de micrómetros ; los orificios y posiblemente las cavidades adicionales también tienen dimensiones abajo de un milímetro. Estas características son producidas típicamente por grabado con ácido, que puede ser llevado a cabo con diferentes técnicas conocidas en el arte, tales como pulido por aplicación de un chorro de arena, grabado químico (por ejemplo grabado químico con HF) , Grabado con Iones Reactivos Intensos o grabado con plasma, con el uso o no, de mascarillas para el grabado. En el caso de las almohadillas poliméricas, otras técnicas, tales como el moldeo o vaciado, pueden ser utilizadas para formar la muesca.

La muesca puede tener diferentes geometrías de la sección transversal, tales como, por ejemplo, cuadrada, circular, hexagonal, etc., de acuerdo con la necesidad; la sección transversal más común es rectangular. La misma también puede estar compuesta de un número variable de microcanales , por ejemplo.

La parte preferida con la muesca de acuerdo con la invención es una almohadilla polimérica. Un ejemplo de la almohadilla con una muesca micrométrica está representada en las figuras 1A-1C; en particular, en la figura 1A, muestra la almohadilla en una vista superior, la figura IB muestra la misma almohadilla en una vista inferior, y La figura 1C muestra una vista lateral de la almohadilla, en una sección transversal realizada a lo largo de un plano paralelo a, y que incluye la muesca.

Las dimensiones de la almohadilla ejemplares son de 75.6 x 25.0 x 1.0 mm y las dimensiones de la muesca ejemplares son de 300 µ?? x 50 µp? x 10 mm; las aberturas de acceso para la inyección de los reactivos, los gases y de las muestras, tienen un diámetro de 0.7 mm.

El uso de un dispositivo microfluídico en lugar de un portaobjetos plano, como en la mayoría de las técnicas del arte previo, conduce a una cantidad baja de los reactivos necesaria para efectuar el ensayo. En particular, una cantidad mucho más baja de las sondas de FISH costosas será requerida, que también podría ser ambientalmente más segura.

Además, en un dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención, la superficie permisible para la adhesión es del mismo tamaño que la superficie inferior del microcanal. Esta superficie es mucho más pequeña que una funcionalmente correspondiente en un ensayo de FISH estándar: si el recubrimiento para la adhesión celular de la invención es provisto, una cantidad semejante de células llega a estar disponible para el análisis y esto conduce a una cantidad menor de tiempo para adquirir las imágenes resultantes, reduciendo por consiguiente los costos debidos a la asignación del tiempo de la máquina.

Para la realización del FISH miniaturizado, los reactivos a base de agua (o compatibles con agua) con diferente viscosidad y densidad, deben ser utilizados consecutivamente: puesto que la reacción ocurre en un microcanal, la capilaridad del microcanal es un pre-requisito esencial para el flujo de los reactivos y la ejecución correcta del análisis. Esta condición puede ser obtenida ya sea por la producción de la almohadilla o la plancha (en la cual el microcanal es obtenido) con un material hidrofílico, o por la funcionalizacion del portaobjetos del substrato con una película de ns-MOx hidrofílica.

En una modalidad preferida de la invención, se utiliza una almohadilla de PDMS o silicona, que ya se sabe que van a ser hidrofóbicas , previniendo el flujo espontáneo de los líquidos dentro del microcanal. Por lo tanto, llega a ser necesario el post-tratamiento de los recubrimientos de ns-MOx, en cualquier parte que las películas como son depositadas también sean hidrofóbicas , para hacer a éstas hidrofílicas y por consiguiente favorecer el flujo de los reactivos acuosos dentro del microcanal .

Por el post-tratamiento de ns-MOx, preferentemente por la adición de la carga superficial (por ejemplo por el tratamiento con el plasma de oxígeno durante 150 segundos a 100 W) , los recubrimientos de ns-MOx con una humectabilidad adecuada son obtenidos, como se mide por el análisis del ángulo de contacto (los ángulos de contacto no arriba de 10° han sido obtenidos consistentemente por los inventores en el caso de los recubrimientos tratados con el plasma) . Los inventores han observado que tal tratamiento es capaz de conferir capilaridad en el contexto de los microcanales , y verificaron que los líquidos fluyen dentro del microcanal espontáneamente, sin la necesidad de la aspiración asistida por la bomba, que confirma la capilaridad del dispositivo.

La primera modalidad más simple del dispositivo microfluídico de la invención, comprende un portaobjetos de vidrio de microscopio funcionalizado que está acoplado con una almohadilla de PDMS o silicona provista con una muesca micrométrica. El acoplamiento puede explotar al menos parcialmente la adhesión espontánea entre el PDMS o la silicona o el vidrio. Esta adhesión sin embargo es reversible, permitiendo una separación facilitada de las dos partes al final del ensayo.

El ensamblaje será efectuado de modo que el microcanal esté localizado en correspondencia con el área funcionalizada sobre la superficie del portaobjetos. Gracias al acoplamiento reversible entre el portaobjetos y la almohadilla, esta última puede ser removida al final de la fase de hibridación de modo que las imágenes de fluorescencia puedan ser adquiridas directamente sobre el portaobjetos sin que alguna manipulación adicional de la muestra sea necesaria .

Inesperadamente, se ha observado que el primer acoplamiento y las etapas de desunión posteriores no afectan a algún grado la adhesión de las células sobre la capa funcionalizada del portaobjetos ni antes ni después que el ensayo de FISH sea efectuado.

Una vez desacoplado, el portaobjetos puede ser colocado directamente así "bajo" un microscopio, con el objetivo del microscopio volteado hacia el lado del portaobjetos sobre el cual la muestra está fijada. Esto permite ajustar correctamente la distancia de trabajo, permitiendo la adquisición de la imagen con un objetivo 100X, proporcionando así la resolución de la imagen requerida por los estándares de la práctica usual de FISH.

Al mismo tiempo, la posibilidad de utilizar, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio de microscopio estándar de 1 mm de grosor permite obtener un dispositivo lo suficientemente robusto para que sea manejado fácilmente.

Como se describió anteriormente, las figuras 2A-2D representan vistas superiores de un dispositivo ensamblado de la invención en diferentes etapas del ensamblaje. En la figura 2A se representa un soporte; la figura 2B es el soporte con el portaobjetos funcionalizado , en el cual el área central representada con un tono más oscuro es el área funcionalizada; la figura 2C es el soporte con el portaobjetos funcionalizado y la almohadilla microfluídica depositada sobre esta última; la figura 2D es el dispositivo ensamblado final con el receptáculo provisto con aberturas de acceso para las substancias microfluídicas .

Debido a la adhesión espontánea entre el PDMS o la silicona y el vidrio, el ensamblaje descrito podría ser innecesario si una almohadilla microfluídica hecha de uno de estos polímeros es utilizada. No obstante, es necesario proporcionar la compresión entre las partes si tales polímeros no son utilizados, particularmente con respecto a las modalidades adicionales posibles de la invención, tales como unas descritas posteriormente y nombradas "Junta 1" , "Junta 2" y "Junta 3" .

La modalidad de la "Junta 1" está representada en las figuras 3A y 3B. La figura 3A muestra los tres elementos que componen un dispositivo microfluídico de acuerdo con la primera modalidad, especialmente un portaobjetos superior, 31, provisto con aberturas de acceso microfluídicas para los reactivos, y la inyección de la muestra (que puede ser lograda con cualquier material rígido orgánico o inorgánico adecuado, por ejemplo el vidrio); la almohadilla 32 en la cual una abertura es producida; y la parte 33 es el portaobjetos funcionalizado . La figura 3B muestra una sección transversal del dispositivo 30 obtenido por la unión de los elementos 31, 32 y 33 de la figura 3A, la sección transversal tomada a lo largo de un plano perpendicular con respecto a la dirección de flujo de los fluidos en el microcanal del dispositivo. Con la construcción de la figura 3B, el ensamblaje del portaobjetos 31 y la almohadilla 32 define una muesca, y el portaobjetos 31 puede ser comprimido ligeramente contra la almohadilla 32, que por consiguiente actúa como una junta, asegurando un sello hermético al líquido con respecto al dispositivo. La almohadilla 32, en particular, puede ser realizada de un material polimérico, tal como, por ejemplo, el PDMS, la silicona o el neopreno .

El ensamblaje del dispositivo es efectuado de modo que el área funcionalizada del portaobjetos 33 sea colocada en correspondencia con la abertura en la almohadilla 32.

La figura 4A y la figura 4B muestran una modalidad particular adicional, llamada "Junta 2" (el dispositivo 40 en la figura 4B) , del dispositivo microfluídico de la invención; la relación entre las vistas en la Figura 4A y 4B es la misma que en las figuras 3A y 3B. En este caso el microcanal es realizado en un portaobjetos 41 en la figura 4A.

En esta modalidad, el portaobjetos funcionalizado 43 está acoplado al portaobjetos 41 provisto con la muesca y las aberturas para el acceso al microcanal . Para permitir un sello hermético al líquido entre los portaobjetos 41 y 43, un sello 42 está presente entre ellos. El sello, en particular, puede ser realizado de un material polimérico, tal como, por ejemplo, el PDMS, la silicona o el neopreno. El sello 42 está provisto con una abertura adecuada para cubrir el área funcionalizada sobre el portaobjetos 43 en la figura 4A.

El ensamblaje es efectuado de modo que los microcanales sobre el portaobjetos 41 sean colocados en correspondencia con el área funcionalizada del portaobjetos 43.

Las figuras 5A y 5B muestran una modalidad todavía adicional, llamada "Junta 3" del dispositivo de la invención (el dispositivo 50 en la Figura 5B) nuevamente, la relación entre las vistas en la Figura 5A y la Figura 5B es la misma que en las figuras 3A y 3B. En esta modalidad, el dispositivo es formado de un primer portaobjetos 51 y el portaobjetos funcionalizado 53 mostrado en la Figura 5A; el portaobjetos 51 está provisto con la muesca y las aberturas para la inyección de los reactivos, los gases y las muestras. El sello hermético al líquido entre los portaobjetos 51 y 53 es permitido por una capa polimérica delgada (52, no mostrada en la Figura 5A) , preferentemente de algunos micrómetros de grosor, fijada definitivamente al portaobjetos 51, que no cubre la parte de este portaobjetos provista con la muesca.

Todos los portaobjetos en las modalidades anteriores pueden ser cualesquiera portaobjetos adecuados, tales como, por ejemplo, portaobjetos de vidrio semejantes a los portaobjetos de vidrio del microscopio.

El dispositivo de la invención en la totalidad de las modalidades probó inesperadamente que resuelve los problemas principales de las tecnologías descritas en el arte previo.

En efecto, la adhesión de las células al substrato funcionalizado probó que va a ser del 90 % o mayor de las células iniciales, lo cual es sorprendente con respecto a los antecedentes de la invención. Inesperadamente, estos porcentajes de la adhesión también han sido obtenidos cuando se trata de las células hematopoyéticas , tales como U937, que son células derivadas del linfoma, definidas comúnmente como células no adherentes . Como una consecuencia, aún las muestras con un número bajo de células pueden ser utilizadas, con una esperanza razonable de reproducibilidad y adquisición de suficiente información.

Esto es de mayor interés, especialmente cuando no se pueden tratar muestras grandes, tales como, por ejemplo, con las muestras de las Células Tumorales Circulantes.

Nuevamente, la identificación de alteraciones raras de las células podría ser igualmente posible debido a la pérdida muy limitada de las células desde la muestra durante el procesamiento, reduciendo así el riesgo de falsos negativos .

Además, puesto que las células adheridas al portaobjetos mantienen su configuración 3D, en lugar de ser dispersadas y oprimidas sobre el portaobjetos como en las prácticas tradicionales, las imágenes tridimensionales (3D) pueden ser obtenidas recolectando los datos a diferentes distancias desde la muestra. Esta ventaja también es de interés mayor cuando se trata de alteraciones raras de las células o con las muestras de número de células bajas, permitiendo discriminar las señales sobre el eje z también, permitiendo así no rechazar información potencialmente interesante para problemas geométricos.

Como un segundo objeto de la presente invención, se proporciona un método de utilización del dispositivo de la invención en ensayos a base de fluorescencia, analíticos, y, en particular, para efectuar la FISH.

Para los propósitos de esta invención, en particular, se puede utilizar una suspensión de las células constituida por las células de las muestras biológicas, cultivadas in vitro, extraídas de los tejidos o de los fluidos .

Un protocolo adaptado ha sido implementado, permitiendo obtener efectos sorprendentes e inesperados con respecto a cualquier otro método y/o materiales previos utilizados .

En efecto, el método permite analizar aún muestras de tamaño pequeño y densidad baja, con una concentración tan baja como alrededor de 10 células/ml .

Con mayor detalle, el ensayo puede ser efectuado sobre diferentes tipos de células, tales como por ejemplo las células tumorales, células tumorales circulantes, células hematopoyéticas, células epiteliales, amniocitos y en general cualquier tipo de células de mamífero y diferentes de mamífero, primarias o cultivadas, ya sea vivientes o fijadas previamente con cualquier fijador celular adecuado, que son clasificadas comúnmente como adherentes o no adherentes a las células como se mencionó anteriormente. Las células adherentes o no adherentes, vivientes o fijas, pueden ser inmovilizadas al portaobjetos funcionalizado a un grado muy diferente .

En una modalidad preferida, los ensayos a base de fluorescencia, analíticos, de la invención, son efectuados sobre células U937 vivientes, que son definidas comúnmente como células no adherentes .

Debido a que permite el uso de una suspensión de células vivientes, el método de la invención no requiere ningún tratamiento previo de las células con agentes fijadores, ni la lisis de las células, permitiendo así el uso de células integrales. Esto es de interés particular, en términos del tiempo, costo y volumen de los reactivos tóxicos; además, el análisis de las condiciones fisiológicas de las células puede ser efectuado así.

El método descrito en la presente invención es particularmente adecuado para que sea efectuado utilizando el dispositivo de la invención.

La invención será ilustrada adicionalmente por los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Este ejemplo es acerca de la preparación y el ensamblaje de dispositivos microfluídicos con un microcanal de acuerdo con la invención. a) Funcionalización del portaobjetos de la base con un ns-MOx Un portaobjetos de vidrio de microscopio limpiado ultrasónicamente (por ejemplo Schott Nexterion D) es colocado en la cámara de deposición de un sistema de vacío equipado con un PMCS . La exposición del portaobjetos al haz agrupado generado por PMCS se lleva a cabo por medio de una mascarilla de esténcil adecuada, que está colocada entre la fuente y el portaobjetos, para permitir la deposición del material deseado solamente sobre áreas limitadas del portaobjetos. Para obtener un espesor uniforme de la capa depositada, el portaobjetos es barrido continuamente en el frente del haz agrupado; para verificar el espesor de la capa de crecimiento un microbalance de cristal de cuarzo (QCM) es expuesto también al haz agrupado. La deposición es efectuada a temperatura ambiente, a una presión típica de 10"6 torr, y dura alrededor de 1 minuto por portaobjetos, siempre que exista una distancia de la f ente-portaobjetos de alrededor de 1 m.

El material elegido para la funcionalización del portaobjetos es el Ti02.

La película de ns-Ti02 resultante tiene un espesor promedio de aproximadamente 50 nm.

Después de la fase de deposición, el portaobjetos es expuesto a un plasma de oxígeno durante 150 segundos a 100 W. b) Acoplamiento de la muesca con el portaobjetos Una almohadilla de PDMS de la clase mostrada en la Figura 1 es provista, en la cual está presente una muesca micrométrica de longitud de 1 cm, anchura de 300 µ?? y altura de 50 µ??. La almohadilla y el portaobjetos funcionalizado son acoplados utilizando un centrador mecánico adecuado, proporcionando la colocación de la muesca sobre el área funcionalizada del portaobjetos, formando así un microcanal de acuerdo con la invención.

La adhesión entre las dos partes es obtenida ejerciendo una presión ligera.

Ejemplo 2 (Comparativo) Un dispositivo microfluídico es producido uniendo una almohadilla de PDMS igual a una utilizada en el Ejemplo 1 con un portaobjetos de vidrio de microscopio no funcionalizado ; en este caso también la adhesión entre la I almohadilla y el portaobjetos es obtenida simplemente aplicando una presión ligera a las dos partes.

Ejemplo 3 (Comparativo) El procedimiento del Ejemplo 2 es repetido, utilizando en este caso un portaobjetos, funcionalizado con una capa de una película de Ti02 no nanoestructurado, denso, obtenido por medio de un método de deposición catódica estándar; la película resultante tiene un espesor de aproximadamente 50 nm. En este caso también la adhesión entre el portaobjetos y la almohadilla es obtenida aplicando presión a las dos partes.

Ejemplo 4 (Comparativo) El procedimiento del ejemplo 2 es repetido, utilizando en este caso un portaobjetos funcionalizado con una capa de poli-D-lisina por la incubación de un portaobjetos de vidrio con una solución de 15 vq/ml de poli-D-lisina (SIGMA) durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se lava en una solución Salada Amortiguada con Fosfato de Dulbecco lx (DPBS) , secado con aire y utilizado para el experimento; en este caso también la adhesión entre el portaobjetos y la almohadilla es obtenida por la compresión de las dos partes .

Ejemplo 5 Este Ejemplo ilustra los resultados de una prueba de adhesión celular llevada a cabo sobre los dispositivos microfluídicos de los Ejemplos 1-4.

Los dispositivos microfluídicos son pre-incubados a 37 °C sobre la parte superior de una placa caliente durante un periodo de 2 minutos .

Para la preparación de los especímenes de prueba, las células U973 cultivadas (1 mi de células que crecen exponencialmente) son colocadas en un tubo de 1.5 mi y se lavan 3 veces con lx de DPBS, se cuentan y finalmente se resuspenden a la concentración de 10000 células/µ?. 1.5 µ? de la suspensión celular se cargan en la cavidad de entrada del microcanal de cada dispositivo microfluídico, mientras que se aspira desde la cavidad de salida del microcanal con una bomba de jeringa (KDS 120, KD Scientific) a 1.7 µ?/s; las células se dejan entonces que se adhieran al fondo del microcanal durante algunos minutos e inmediatamente se fijan agregando una solución de metanol/ácido acético en una relación de 3:1. Después de la adhesión, lx DPBS es agregado para lavar la sustancia de fijación mientras que se aspira con una bomba de vacío; este procedimiento somete a las células a esfuerzo cortante limitado. Al final del procedimiento, la almohadilla es removida, los portaobjetos son teñidos con DAPI (4,6-diamidino-2 - fenilindol , SIGMA) , y se monta para el análisis por microscopía. En el análisis, el número de células fijadas sobre el portaobjetos es contado. Los resultados son reportados en la Figura 6: como se observa claramente de esta figura, en las condiciones de prueba el número de células U937 adheridas sobre las superficies de los portaobjetos de los Ejemplos Comparativos 2-4 es semejante, e igual a aproximadamente 600 células fijadas, especialmente, aproximadamente 40 % de las células cargadas; por otra parte el número de células adheridas sobre el portaobjetos funcionalizado de la invención (Ejemplo 1) es de aproximadamente 1400, es decir, aproximadamente 130 % más elevada que en el caso de los portaobjetos comparativos, e igual a aproximadamente 93 % de las células cargadas.

Ejemplo 6 Este ejemplo ilustra los resultados de una segunda prueba de adhesión celular llevada a cabo sobre los dispositivos microfluídicos de los Ejemplos 1-4, bajo condiciones de esfuerzo cortante más severas que en el Ejemplo 5.

El procedimiento del Ejemplo 5 es repetido hasta la etapa de fijación con la solución de metanol/ácido acético 3:1; las muestras son sometidas entonces a un procedimiento, llamado en lo siguiente de "esfuerzo cortante prolongado", que comprende poner en contacto las células fijadas sobre el portaobjetos con una serie de reactivos utilizados en los ensayos biológicos. En particular, las siguientes soluciones son cargadas consecutivamente con una pipeta, incubadas a la temperatura y durante el tiempo indicados y aspiradas con una bomba de vacío: amortiguador de salmuera-citrato de sodio: 2 x (SSC) durante 30 minutos a 37 °C, un amortiguador con enzima (pepsina al 0.005%, 0.01N HC1, SIGMA) durante 15 minutos a 37 °C, lx DPBS durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA), un post-fijador (50 mM MgCl2, SIGMA), 0.95 % de formaldehído (SIGMA) en lx DPBS durante 5 minutos a TA, lx DPBS durante 5 minutos a TA, tres lavados consecutivos con EtOH al 70 %, 85 % y l00 % (BDH) durante 1 minuto cada uno a TA, una solución de desnaturalización (70 % de formamida, SIGMA, en 2x SSC SIGMA) durante 5 minutos a 75 °C, tres lavados subsiguientes con EtOH al 70 %, 85 % y 100 % durante un minuto cada uno a TA.

Después de la aspiración completa del EtOH puro, los portaobjetos son colocados a 60 °C durante 2 minutos hasta que se secan completamente, y luego se cargan con 0.3 µ? de la mezcla de hibridación (para 15 mi: 7.5 mi de formamida ultrapura, 6.0 mi de sulfato de dextrano al 25 %, 1.5 mi de 20x SSC). Las cavidades de los microcanales son selladas entonces con una gota de aceite mineral (SIGMA) para prevenir la evaporación, y se incuban durante 10 minutos a 37 °C. Después de la incubación, las almohadillas son removidas y los portaobjetos son sumergidos en jarras de Coplin que contienen la solución de lavado A (0.3 % de NP40, un detergente no desnaturalizante, no iónico, de octil fenoxilpolietoxiletanol, en 0.4x SSC (SIGMA) ) durante 2 minutos a 73 °C, y la solución de lavado B (0.1 % de NP40 en 2x SSC) durante 1 minuto a TA, se secan con exposición al aire y se montan con DAPI II (Abbott Molecular) para el análisis de microscopía. Para el conteo de las células, se forma una imagen de cada portaobjetos con el filtro de DAPI y se adquiere con un aparato ScanAR, una plataforma automatizada a base de microscopio para la selección por formación de imágenes (Olympus Europa, Alemania) equipado con una cámara Hamamatsu ORCA-AG, por la exploración de 13 imágenes adyacentes utilizando un objetivo 10x; luego las células son contadas utilizando la función de "analizar partículas" del software ImageJ después de tener un conjunto de objetos excluyentes y de umbral apropiados, fuera del intervalo de 15-75 pixeles cuadrados. Los datos son exportados y analizados por el software Excel.

Los resultados son reportados en la forma gráfica en la Figura 7. Como se puede observar de la figura, sobre el portaobjetos de Si02 el número de células se redujo dramáticamente descendiendo hasta -100 células/microcanal, aunque substancialmente permaneció sin cambio sobre los portaobjetos recubiertos con ns-Ti02 y poli-D-lisina. No obstante, debido a la diferente eficiencia de la inmovilización de las células iniciales (véase el Ejemplo 5) , al final de la prueba de esfuerzo cortante prolongado, el número de células totales fue significativamente diferente entre ns-Ti02 y poli-D-lisina (1400 células contra 600 células) que es mayor que dos veces más elevada sobre el portaobjetos recubierto con ns-Ti02.

Ejemplo 7 Este ejemplo ilustra los resultados de una tercera prueba de adhesión llevada a cabo sobre los dispositivos microfluídicos de los ejemplos 1-4, llevados a cabo bajo las mismas condiciones del Ejemplo 6, en este caso con el espécimen que comprende las células hematopoyéticas de un donador humano .

Los dispositivos microfluídicos son pre-acondicionados a 37 °C sobre la parte superior de una placa caliente durante un periodo de 2 minutos como en el Ejemplo 5.

Para la preparación de los especímenes de prueba, una alícuota de la Sangre Periférica (PB) (0.5-1 mi) del donador normal se trata con el amortiguador de la Lisis de los Eritrocitos (RBL) (0.15 M NH4C1, 9.93 mM KHC03 , 0.13 mM EDTA, de SIG A) hasta un volumen total de 10 mi; la suspensión es mantenida a 4 °C durante 5 minutos, luego se centrifuga a 1500 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante es desechado y las células hematopoyéticas así aisladas se resuspenden nuevamente en 10 mi del amortiguador de RBL, luego se centrifuga a 1800 rpm durante 5 minutos. Las células son resuspendidas en 1 mi de lx DPBS y se transfieren hacia un tubo de 1.5 mi, se lavan dos veces en lx DPBS, y finalmente se resuspenden a una concentración de 15000-25000 células/µ?. 1.5 µ? de la suspensión así obtenida son cargados en la cavidad de entrada del microcanal de cada dispositivo microfluídico . 20 µ? de la sustancia de fijación de Carnoy -metanol (SIGMA) /ácido acético (Cario Erba) 3:1 son agregados a la cavidad de entrada y se deja que se difundan hacia dentro para la fijación a las células. Después de 2 minutos las células son fijadas. Los microcanales son sometidos entonces al procedimiento de esfuerzo cortante prolongado ilustrado en el Ejemplo 6. Los resultados de la prueba están representados en las Figuras 8A- 8C: el número de células retenidas sobre el dispositivo de la invención varía entre aproximadamente 1.8 y 2.5 veces el número de células retenidas sobre los dispositivos de comparación.

Ejemplo 8 Este ejemplo es acerca de la comparación del funcionamiento de los dispositivos de la invención en los cuales la película de ns-Ti02 es post-tratada o no, después de la deposición.

La cara funcionalizada de un portaobjetos producido como se describió en el punto a) del Ejemplo 1 se somete a un tratamiento con un plasma de oxígeno durante 150 segundos a 100 w.

El portaobjetos así post-tratado, y un portaobjetos no post-tratado, son ensamblados con las almohadillas de PDMS como en el Ejemplo 1, y luego se somete al procedimiento del Ejemplo 6, utilizando en este caso las células fijas (U937) como la muestra de prueba. Los resultados de la prueba son reportados en la Figura 9, y muestran que ambos dispositivos de la invención presentan una retención elevada de las células, pero en el caso de la película ns-Ti02 post-tratada éstas están distribuidas más uniformemente sobre la superficie que corresponde al fondo del microcanal . Esto favorece la interpretación de los datos.

Ejemplo 9 Este ejemplo es acerca de la realización de un protocolo de ensayo de FISH completo utilizando un dispositivo microfluídico de la invención.

Un dispositivo microfluídico preparado de acuerdo con el Ejemplo 1 es utilizado para efectuar un ensayo de FISH de acuerdo con el protocolo de la invención.

Una alícuota de las células U937 (Colección americana de Cultivos Tipo, ATCC por sus siglas en inglés) es centrifugada a 600 g durante 5 minutos y se suspende en lx DPBS a 37 °C hasta una concentración de las células de 10000 células/µ? .

La suspensión de las células es transferida por pipeta manualmente hacia el dispositivo utilizando una pipeta de laboratorio estándar y se deja en incubación durante 4 minutos .

Un agente de inmovilización que comprende un alcohol y un ácido carboxílico débil es agregado (metanol/ácido acético 3:1) y la inmovilización se deja que ocurra durante 2 minutos; luego, se efectúa la aspiración con una bomba de vacío. 30 µ? de la solución 2x SSC (preparada a partir de una materia prima concentrada de 20x SSC, 3.0 M de NaCl, 0.3 M de citrato de sodio) pre-calentada a 37 °C se transfiere por medio de pipeta hacia el microcanal y se deja que suceda la incubación durante 15 minutos sobre una placa calentada a 37 °C.

Después de la incubación, una solución que contiene pepsina al 0.005 % es transferida por medio de una pipeta y luego se incuba en el microcanal durante 15 minutos sobre una placa calentada.

La solución de pepsina es vaciada por medio de una bomba, se transfiere por pipeta el DPBS lx (Salmuera Amortiguada con Fosfato, Lonza Group) se deja en incubación durante 5 minutos, luego una solución que contiene formaldehído (para 50 mi de la solución: 1.3 mi de formaldehído al 37 %, 0.23 g de MgCl2, 48.7 mi de PBS) se incuba durante 5 minutos, se fluidifican con lx DPBS y se deja en incubación durante 5 minutos. El DPBS es bombeado fuera del microcanal, el cual se deja que se seque.

Una serie de soluciones de etanol al 70 %, 85 % luego al 100 % es transferida por pipeta consecutivamente y cada una se incuban durante 1 minuto.

Una solución desnaturalizante (para 50 mi de la solución: 35 mi de formaldehído al 37 %, 5 mi de 20x SSC, 10 mi de H20 a pH 7-8) precalentada a 73 °C se transfiere por pipeta, permitiendo la incubación durante 5 minutos sobre una placa calentada a 73 °C.

El dispositivo es removido entonces de la placa y se deja enfriar, después de lo cual la solución desnaturalizante es retirada vaciada por bomba y el tratamiento con las soluciones de etanol es repetido.

El dispositivo es colocado sobre una placa calentada a 45 °C y el etanol es removido completamente vaciándolo por bomba durante aproximadamente 1 minuto.

El dispositivo es removido de la placa de calentamiento y una sonda desnaturalizada etiquetada con Cy3 es cargada. El microcanal es sellado entonces con una gota de aceite mineral (Sigma) y la incubación se permite toda la noche sobre una placa mantenida a 37 °C.

Después de la incubación la almohadilla es separada del portaobjetos: el portaobjetos de vidrio se hace pasar entonces durante 2 minutos hacia una jarra de Coplin con una solución que contiene 0.4x SSC y 0.3 % de NP40, precalentada a 73 °C; luego durante 1 minuto con una solución que contiene 2x SSC y 0.1 % de NP40 a TA. En el extremo, el portaobjetos se deja que se seque con exposición al aire durante 1 minuto.

Un cubreobjetos de vidrio es aplicado entonces con una solución que contiene DAPI (4 , 6-diamidino-2-fenilindol, SIGMA) .

El portaobjetos está listo así para ser utilizado para adquirir imágenes con un objetivo lOOx para el sumergimiento en aceite (véase la Figura 10 y la Figura 11) .

La Figura 10 muestra la detección precisa sobre los núcleos de las células del cromosoma X por una sonda Específica para el Sitio etiquetada con Cy3 (véanse los dos puntos/núcleos brillantes) , por FISH, que confirman el funcionamiento preciso de la prueba, aún utilizando sondas de secuencia de abundancia baja para la detección genómica.

La Figura 11 muestra la detección precisa sobre los núcleos de las células del cromosoma X por la sonda Específica para el Centrómero etiquetada con Cy3 (véanse los dos puntos/núcleos brillantes) , por FISH, confirmando adicionalmente el funcionamiento óptimo de la prueba.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un dispositivo microfluídico que comprende un portaobjetos y una parte en la cual al menos una muesca está presente, el portaobjetos y la parte son tales que por su unión se forma un microcanal, caracterizado porque al menos el área sobre la superficie del portaobjetos volteada hacia el microcanal está funcionalizada con un óxido metálico nanoestructurado .

2. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el óxido metálico nanoestructurado está constituido por nanopartxculas con una distribución de tamaño que cubre el intervalo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50 nm y centrado dentro del intervalo de 5 y 15 nm.

3. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el óxido es seleccionado entre el óxido de Ti, el óxido de Zn o el óxido de Zr .

4. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el óxido metálico nanoestructurado está en la forma de una película.

5. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la película tiene un espesor comprendido entre 20 nm y 200 nm.

6. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la película tiene un espesor comprendido entre 40 nm y 60 nm y una rugosidad superficial comprendida entre 5 y 15 nm.

7. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el óxido metálico nanoestructurado tiene una estructura porosa con una densidad de la masa desde aproximadamente 1/2 hasta aproximadamente 1/10, de la densidad de la masa del óxido volumétrico correspondiente.

8. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el óxido es el óxido de Ti con una densidad de la masa de aproximadamente 1/7 de la densidad de la masa del Ti02 denso, un hueco de la banda óptica entre 3.2 y 3.6 eV y un índice de refracción entre 1.6 y 1.8.

9. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la película es depositada por la técnica de PMCS .

10. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el óxido es tratado con un plasma para hacerlo hidrofílico.

11. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la parte en la cual la muesca está presente es una almohadilla de un material blando o una plancha delgada de un material rígido.

12. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la parte es una almohadilla hecha de silicona, neopreno o polidimetilsiloxano .

13. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la almohadilla está acoplada reversiblemente al portaobjetos.

14. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un portaobjetos superior provisto con aberturas de acceso microfluídico para la inyección de los reactivos, los gases y la muestra, una almohadilla en la cual una abertura es producida, y un portaobjetos funcionalizado , de tal modo que el ensamblaje del portaobjetos superior y la almohadilla definan la muesca, y la almohadilla actúa como una junta que asegura un sello hermético al líquido para el dispositivo.

15. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un portaobjetos provisto con una muesca y aberturas para el acceso al microcanal, un portaobjetos funcionalizado y un sello entre los portaobjetos, el sello está equipado en una cavidad adecuada obtenida en el portaobjetos provisto con la muesca y el sello está provisto con una abertura de tal modo que no cubra el área funcionalizada del portaobjetos funcionalizado.

16. Un dispositivo microfluídico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un portaobjetos provisto con una muesca y aberturas para el acceso al microcanal y un portaobjetos funcionalizado, en el cual una capa polimérica está fijada a la cara del portaobjetos con la muesca, en la cual la muesca está presente, la capa polimérica está provista con una abertura de tal modo que no cubra el área funcionalizada del portaobjetos funcionalizado .

17. El uso del dispositivo microfluídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en un ensayo basado en la fluorescencia analítica.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde el ensayo es un ensayo de FISH.

19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, en la cual el ensayo de FISH se lleva a cabo de acuerdo con un protocolo que comprende las etapas de: a) cargar una muestra de las células en el microcanal del dispositivo microfluídico de las reivindicaciones 1 a 16; b) dejar las células en incubación; c) fijar las células con una solución de un alcohol y un ácido carboxílico débil; d) fluidizarlo con SSC; e) fluidizarlo con una solución de pepsina; f) post-fijarla con una solución de formaldehído; g) agregar una serie de soluciones de etanol; h) agregar una solución de un agente desnaturalizante; i) repetir la etapa g) una vez más; j) agregar la sonda etiquetada y dejarla en incubación; k) remover la parte que aloja el microcanal del portaobj etos ; 1) lavar con una solución que comprende SSC y NP40, en donde la muestra de las células está en la forma de una suspensión de las células.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde la suspensión de las células es una suspensión de células no adherentes .

21. El uso de conformidad con las reivindicaciones 19 o 20, en donde las células no adherentes son células vivientes.

22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde las células son células fijas.