MX2011006694A

MX2011006694A - Gen de delta-endotoxina axmi-150 y metodos de uso del mismo.

Info

Publication number: MX2011006694A
Application number: MX2011006694A
Authority: MX
Inventors: Daniel J Tomso; Volker Heinrichs; Kimberly S Sampson
Original assignee: Athenix Corp
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2011-10-24
Also published as: CA2747826A1; UY32361A; WO2010075498A2; BRPI0923159A2; US20120073016A1; EP2379724B1; US8791326B2; CN102388143A; EA019574B1; EA201170717A1; EP2379724A2; CO6400155A2; ZA201104532B; US8084416B2; US20100160231A1; AR075114A1; WO2010075498A3; UY38535A; ES2534581T3

Abstract

Se proveen composiciones y métodos para conferir actividad pesticida a bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas; las composiciones incluyen una secuencia de codificación para polipéptidos pesticidas; las secuencias de codificación pueden ser usadas en construcciones de ADN o cassettes de expresión para la transformación y expresión en plantas y bacterias; las composiciones además incluyen bacterias, plantas, células de plantas, tejidos, y semillas transformadas; en particular, se proveen moléculas de ácidos nucleicos pesticidas aisladas; además, se contemplan secuencias de aminoácidos que corresponden a los polinucleótidos; en particular, la presente invención provee moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 2, la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12, así como variantes y fragmentos de las mismas.

Description

GEN DE DELTA-ENDOTOXINA AXMI-150 Y MÉTODOS DE USO DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Se proveen nuevos genes que codifican proteínas pesticidas. Estas proteínas y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican resultan de utilidad en la preparación de formulaciones pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a las plagas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Bacillus thuríngiensis es una bacteria del suelo formadora de esporas gram-positiva que se caracteriza por su capacidad para producir inclusiones cristalinas específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos, pero que son inocuas para plantas y otros organismos blanco. Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de BacHIus thuríngiensis o sus proteínas pesticidas pueden ser utilizadas como insecticidas ambientalmente aceptables con el fin de controlar plagas de insectos o vectores de insectos agrícolas en una variedad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thuringiensis ejercen una potente actividad pesticida fundamentalmente contra larvas de Lepidópteros, Dípteros, y Coleópteros. Estas proteínas además han evidenciado actividad contra plagas de Himenópteros, Homópteros, Ftirápteros, Malófagos, y Ácaros, así como contra otros órdenes invertebrados como Nematelmintos, Platelmintos, y Sarcomastigorforos (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Estas proteínas fueron originalmente clasificadas como Cryl a CryV fundamentalmente en base a su actividad insecticida. Las clases principales eran Lep/cfópferos-específicas (I), Lepidópteros- y D/pteros-específicas (II), Co/eópteros-específicas (III), D/pteros-específicas (IV), y nemátodos-específicas (V) y (VI). Las proteínas además fueron clasificadas en subfamilias; las proteínas con la mayor relación dentro de cada familia recibieron letras divisionales como CryIA, CryIB, CryIC, etc. Las proteínas aún más relacionadas dentro de cada división recibieron denominaciones específicas como Cry1C1, Cry1C2, etc.

Recientemente se ha descripto una nueva nomenclatura para los genes Cry en base a la homología de las secuencias de aminoácidos en lugar de la especificidad por ciertos insectos (Crickmore et al. (1998) Microbio!. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En la nueva clasificación, cada toxina recibe una denominación única que incorpora un grado primario (un número arábigo), un grado secundario (una letra mayúscula), un grado terciario (una letra minúscula), y un grado cuaternario (otro número arábigo). En la nueva clasificación, los números romanos han sido reemplazados por números arábigos en el grado primario. Las proteínas con menos de 45% de identidad de secuencia tienen grados primarios diferentes, en tanto los criterios para los grados secundario y terciario son 78% y 95%, respectivamente.

La proteina cristal no exhibe actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto. La protoxina ingerida es hidrolizada por las proteasas en el tracto digestivo del insecto en una molécula tóxica activa. (Hófte and Whiteley (1989) Microbio!. Rev. 53:242-255). Esta toxina se une a los receptores de las vellosidades apicales en el intestino medio de las larvas blanco y se inserta en la membrana apical creando canales o poros iónicos, con lo cual se produce la muerte larval.

Las delta-endotoxinas en general tienen cinco dominios de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados (consultar, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado comprende siete alfa hélices y participa en la inserción en membrana y formación de poros. El dominio II comprende tres beta-láminas dispuestas en una configuración de clave Griega, en tanto el dominio III comprende dos beta-láminas antiparalelas en topología "jelly roll" (de Maagd et al., 2001 , supra). Los dominios II y III participan en el reconocimiento y unión a receptores, y por lo tanto se consideran determinantes en la especificidad de la toxina.

A causa de la devastación que los insectos pueden provocar, y la mejora en el rendimiento que se logra controlando las plagas, continuamente es necesario descubrir nuevas formas de toxinas pesticidas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para conferir actividad pesticida a bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácidos nucleicos que codifican secuencias para polipéptidos pesticidas e insecticidas, vectores que comprenden tales moléculas de ácidos nucleicos, y células huésped que comprenden los vectores. Las composiciones además incluyen secuencias de polipéptidos pesticidas, y anticuerpos para tales polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos pueden usarse en construcciones o cassettes de expresión de ADN para transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas diseñadas para expresión en un organismo que incluye, entre otros, un microorganismo o una planta. Las composiciones además comprenden bacterias, plantas, células de plantas, tejidos, y semillas transformadas.

En particular, se proveen moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican una proteína pesticida. Adicionalmente, se contemplan secuencias de aminoácidos que corresponden a la proteína pesticida. En particular, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12, así como vanantes y fragmentos de la misma. También se contemplan las secuencias de nucleótidos complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que se hibridan con una secuencia de la invención.

Se proveen métodos para producir los polipéptidos de la invención, y para el uso de tales polipéptidos en el control o eliminación de una plaga de lepidópteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros. Además se incluyen métodos y kits para la detección de ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra.

Las composiciones y métodos de la invención resultan de utilidad en la producción de organismos con resistencia o tolerancia mejorada a las plagas. Estos organismos y composiciones que comprenden los organismos son convenientes para fines agrícolas. Las composiciones de la invención también resultan de utilidad en la generación de proteínas alteradas o mejoradas con actividad pesticida, o con el fin de detectar la presencia de proteínas pesticidas o ácidos nucleicos en productos u organismos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para regular la resistencia o tolerancia a las plagas en organismos, particularmente plantas o células de plantas. El término "resistencia" hace referencia a que la plaga (por ejemplo, un insecto) es eliminado al ingerir o tener otro tipo de contacto con los polipéptidos de la invención. La expresión "tolerancia" hace referencia a un menoscabo o reducción del movimiento, alimentación reproducción, u otras funciones de la plaga. Los métodos comprenden transformar organismos con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina pesticida de la invención. En particular, las secuencias de nucleótidos de la invención resultan de utilidad en la preparación de plantas y microorganismos que poseen actividad pesticida. Así, se proveen bacterias, plantas, células de plantas, tejidos vegetales y semillas transformadas. Las composiciones son ácidos nucleicos y proteínas pesticidas de Bacillus u otras especies. Las secuencias son de aplicación en la construcción de vectores de expresión para la subsecuente transformación en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de proteínas pesticidas alteradas a través de métodos conocidos en el arte como intercambio de dominios o barajado de ADN. Las proteínas son de aplicación en el control o eliminación de poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, y otras, y en la producción de composiciones con actividad pesticida.

La expresión "toxina pesticida" o "proteína pesticida" hace referencia a una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, entre otras, miembros de los órdenes Lepidópteros, Dípteros, y Coleópteros, o del phylum Nemátodos, o una proteína que tiene homología respecto de tal proteína. Las proteínas pesticidas han sido aisladas de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas pesticidas incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de secuencias de nucleótidos de longitud total aquí reveladas, y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud total, ya sea por el uso de un sitio de inicio caudal abajo alternativo, o por el procesamiento que genera una proteína más corta con actividad pesticida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga luego de la ingestión de la proteína.

Las proteínas pesticidas comprenden las delta-endotoxinas. Las delta-endotoxinas incluyen proteínas identificadas como cryl a cry43, cytl y cyt2, y toxina tipo Cyt. Existen en la actualidad más de 250 especies conocidas de delta-endotoxinas con una amplia gama de especificidades y toxicidades. Por una lista extensa, consultar Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, y por actualizaciones regulares consultar Crickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," en www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.

La presente provee nuevas secuencias de nucleótidos aisladas que confieren actividad pesticida. Estas secuencias de nucleótidos aisladas codifican polipéptidos con homología respecto de delta-endotoxinas o toxinas binarias. Asimismo se proveen las secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas. La proteína resultante de la traducción de este gen permite a las células controlar o eliminar las plagas que la ingieren.

Moléculas de ácidos nucleicos aisladas, y variantes y fragmentos de las mismas Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y polipéptidos pesticidas o porciones biológicamente activas de las mismas, asi como moléculas de ácidos nucleicos suficientes para ser usadas como sondas de hibridación para identificar los ácidos nucleicos que codifican proteínas con regiones de homología de secuencia. De acuerdo a la presente, la expresión "molécula de ácido nucleico" comprende moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc, o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o doble, preferentemente es ADN de cadena doble.

Una secuencia de ácidos nucleicos "aislada" (o ADN) hace referencia en la presente a una secuencia de ácidos nucleicos (o ADN) que ya no está en su ambiente natural, por ejemplo, in vitro o en una célula huésped bacteriana o de planta recombinante. En algunas realizaciones, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferentemente secuencias de codificación de proteínas) que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias dispuestas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual el ácido nucleico deriva. A los fines de la invención, el término "aislado" cuando se lo usa con referencia a moléculas de ácidos nucleicos excluye cromosomas aislados. Por ejemplo, en varias realizaciones, la delta-endotoxina que codifica la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual el ácido nucleico deriva. En varias realizaciones, una proteína delta-endotoxina sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que poseen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, o 5% (en peso seco) de proteína no delta-endotoxina (también denominada "proteína contaminante").

Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la presente invención incluyen la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o 12, y variantes, fragmentos, y complementos de la misma. La expresión "complemento" se refiere a una secuencia de nucleótidos suficientemente complementaria a una secuencia de nucleótidos dada de modo que pueda hibridarse a la secuencia de nucleótidos dada para en consecuencia formar un dúplex estable. La correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína pesticida codificada por esta secuencia de nucleótidos está establecida en la SEQ ID NO: 2 o las secuencias de aminoácidos AXMI-004 descriptas en la Patente Estadounidense 7,355,089 y en la Solicitud de Patente Estadounidense Número 12/209,354, presentada en 12 de Septiembre de 2008 titulada "Synthetic AXMI-004 Delta-endotoxin Genes and Methods for Their Use.", las cuales se incorporan por completo a la presente como referencia.

Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican proteínas pesticidas también son contempladas por la presente invención. El término "fragmento" hace referencia a una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína pesticida, o puede ser un fragmento que puede ser usado como una sonda de hibridación o primer de PCR usando los métodos que se describen a continuación. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida comprenden por lo menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 100, 1200, 1300, 1350, 1400 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida de longitud total revelada en la presente de acuerdo al uso pretendido. La expresión nucleótidos "contiguos" se refiere a residuos de nucleótidos inmediatamente adyacentes entre si. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína pesticida y, en consecuencia, retienen la actividad pesticida. La expresión "retiene actividad" hace referencia a que el fragmento tendrá por lo menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad pesticida de la proteína pesticida. En una realización, la actividad pesticida es actividad coleoptericida. En otra realización, la actividad pesticida es actividad lepidoptericida. En otra realización, la actividad pesticida es actividad nematocida. En otra realización, la actividad pesticida es actividad diptericida. Los métodos para medir la actividad pesticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína pesticida que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína pesticida de longitud completa de la invención.

Las proteínas pesticidas preferidas de la presente invención son codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12. La expresión "suficientemente idéntica" hace referencia a una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que posee al menos aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% o 85% de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de referencia que usa uno de los programas de alineación descriptos en la presente con parámetros estándar. El experto en el arte reconocerá que estos valores pueden ser adecuadamente ajustados para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en consideración la degenerancia de codones, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas para una comparación óptima. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad porcentual = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otra realización, la comparación es a través de toda la secuencia de referencia (es decir, la secuencia revelada como cualquiera de las SEQ ID NO: 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12). La identidad porcentual entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a aquellas descriptas seguidamente, permitiendo o no espacios. En el cálculo de la identidad porcentual, típicamente se cuentan las concordancias exactas.

La determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Este algoritmo está incorporado a los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 2 5:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden ejecutarse con el programa BLASTN, puntaje = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteínas en BLAST pueden ejecutarse con el programa BLASTX, puntaje = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas las moléculas de la invención tipo delta-endotoxina. Para obtener alineaciones con espacios con fines comparativos, es posible utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) según se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, es posible utilizar PSI-Blast para ejecutar una búsqueda iterada que detecte las relaciones distantes entre las moléculas. Consultar Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, es posible emplear los parámetros por omisión de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN). La alineación también puede ejecutarse manualmente por inspección.

Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara las secuencias y alinea toda la secuencia de aminoácidos o ADN, y de tal forma puede proveer datos sobre la conservación de secuencia de toda la secuencia de aminoácidos. El algoritmo ClustalW se utiliza en varios paquetes de software de análisis de ADN/aminoácidos comercializados en el mercado, como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Surte (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Luego de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, es posible determinar la identidad porcentual de los aminoácidos. Un ejemplo no limitativo de un software de utilidad para el análisis de alineaciones ClustalW es GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite la determinación de la similitud de los aminoácidos (o ADN) y la identidad entre múltiples proteína. Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Este algoritmo está incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (comercializado por Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, es posible emplear una cuadro de residuos en peso PAM 20, una penalidad de longitud de espacio de 12, y una penalidad de espacio de 4.

Salvo indicación en contrario, GAP Versión 10, que utiliza el algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, será utilizado para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando Peso GAP de 50 y longitud peso de 3, así como la matriz de clasificación nwsgapdna.cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando peso GAP de 8 y longitud peso de 2, y el programa de clasificación BLOSUM62. También es posible utilizar programas equivalentes. La expresión "programa equivalente" hace referencia a cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualquiera en cuestión, genera una alineación que posee concordancias idénticas entre los residuos de nucleótidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia respecto de la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10. La invención además comprende moléculas de ácidos nucleicos variantes. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína pesticida incluyen aquellas secuencias que codifican las proteínas pesticidas reveladas en la presente pero que difieren conservativamente en razón de la degenerancia del código genético así como aquellas que son lo suficientemente idénticas según lo expuesto. Las variantes alélicas naturales pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular muy conocidas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación según se explica seguidamente. Las secuencias de nucleótidos variantes además incluyen secuencias de nucleótidos sintéticamente generadas que han sido obtenidas, por ejemplo, usando mutagénesis sitio-dirigida pero que aún codifican las proteínas pesticidas reveladas en la presente invención según se expone a continuación. Las proteínas variantes de acuerdo a la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, retienen actividad pesticida. La expresión "retienen actividad" hace referencia a que la variante tendrá por lo menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 80% de la actividad pesticida de la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad insecticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia.

El experto en el arte además advertirá que los cambios pueden ser introducidos por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención conduciendo en consecuencia a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas pesticidas codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Así, las variantes de moléculas de ácidos nucleicos aisladas pueden ser creadas introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos revelada, de manera que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos se introduzcan en la proteína codificada. Es posible introducir mutaciones mediante técnicas estándar, como mutagénesis sitio dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Estas variantes de secuencias de nucleótidos también quedan contempladas por la presente invención.

Por ejemplo, es posible realizar sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales preestablecidos. Un residuo de aminoácido "non esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia natural de una proteína pesticida sin alterar la actividad biológica, en tanto un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que posee una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina).

Las delta-endotoxinas en general tienen cinco dominios de secuencia conservados, y tres dominios estructurales conservados (consultar, por ejemplo, de Maagd et al. (2001 ) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado comprende siete alfa hélices y está involucrado en la inserción en membrana y la formación de poros. El dominio II comprende tres beta-láminas dispuestas bajo una configuración en clave Griega, en tanto el dominio III comprende dos beta-láminas antiparalelas en topología "jelly-roll" (de Maagd et al., 2001 , supra). Los dominios II y III están involucrados en el reconocimiento y unión a los receptores, y en consecuencia se consideran determinantes de la especificidad de las toxinas.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en regiones no conservadas que retienen la función. En general, estas sustituciones no se realizarían para residuos de aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde tales residuos son esenciales para la actividad de la proteína. Los ejemplos de residuos conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de las toxinas similares o relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que son idénticos en una alineación de proteínas homologas). Los ejemplos de residuos que son conservados pero que pueden permitir sustituciones de aminoácidos conservadoras y que aún retienen la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que poseen únicamente sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en una alineación de las toxinas similares y relacionadas con las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que solamente poseen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en las proteínas homologas de alineación). Sin embargo, el experto en el arte entenderá que las variantes funcionales pueden tener alteraciones conservadas o no conservadas menores en los residuos conservados.

Alternativamente, las variantes de secuencias de nucleótidos pueden realizarse introduciendo mutaciones aleatoriamente a lo largo de todo o parte de la secuencia de codificación, como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser clasificados por su capacidad para conferir actividad de pesticida para identificar mutantes que retienen la actividad. Luego de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada de manera recombinante, y la actividad de la proteína puede determinarse usando técnicas de ensayo estándar.

Mediante el uso de métodos como PCR, hibridación, y similares es posible identificar las correspondientes secuencias pesticidas, tales secuencias tienen una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Consultar, por ejemplo, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Metods and Applications (Academic Press, NY).

En un método de hibridación, toda o parte de la secuencia de nucleótidos de pesticida puede utilizarse para clasificar ADNc o bibliotecas genómicas. Los métodos de construcción de tales ADNc y bibliotecas genómicas en general son conocidos en el arte y están revelados en Sambrook and Russell, 2001 , supra. Las llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genónico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden ser marcadas con un grupo detectable como 32P, o cualquier otro marcador detectable, como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima. Las sondas para hibridación pueden realizarse marcando oligonucleótidos sintéticos en base a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pesticida conocida que se revela en la presente. Además es posible usar primers degenerados diseñados sobre la base de nucleótidos o residuos de aminoácidos conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos codificada. La sonda típicamente comprende una región of secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones astringentes a por lo menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, o 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pesticida de la invención o un fragmento o variante de la misma. Los métodos de preparación de sondas para hibridación son en general conocidos en el arte y están revelados en Sambrook and Russell, 2001 , supra que se incorpora a la presente como referencia.

Por ejemplo, una secuencia de proteína pesticida completa revelada en la presente, o una o más porciones de la misma, puede usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente a las correspondientes secuencias tipo proteínas pesticidas y ARNs mensajeros. Para lograr la hibridación específica bajo una variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas y que preferentemente tienen menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas pueden ser usadas para amplificar las correspondientes secuencias pesticidas de un organismo elegido por PCR.

Esta técnica puede ser empleada para aislar secuencias de codificación adicionales de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen hibridación por clasificación de bibliotecas de ADN en placas (ya sea placas o colonias; consultar, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

La hibridación de tales secuencias puede ser llevada a cabo bajo condiciones astringentes. La expresión "condiciones astringentes" o "condiciones de hibridación astringentes" hace referencia a las condiciones a las cuales una sonda se hibridará a su secuencia blanco en un grado detectable mayor que a otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el background). Las condiciones astringentes dependen de las secuencias y serán distintas en distintas circunstancias. Controlando la astringencia de la hibridación y/o las condiciones de lavado, es posible identificar secuencias blanco que sean 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, las condiciones de astringencia pueden ser ajustadas para permitir algún grado de desajustes en las secuencias de modo que se detecten menores grados de similitud (sondeo heterólogo). En general, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferentemente menos de 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, condiciones astringentes serán aquellas en las cuales la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1.5 M ión de Na, típicamente aproximadamente entre 0.01 y 1.0 M concentración de ión de Na (u otras sales) a un pH 7.0 a 8.3 en tanto la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos). Las condiciones astringentes también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja astringencia incluyen hibridación con una solución buffer de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCI, 1 % SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCI/0.3 M citrato trisódico) a 50 a 55°C. Los ejemplos de condiciones de astringencia moderada incluyen hibridación en 40 a 45% formamida, 1.0 M NaCI, 1 % SDS a 37°C, y un lavado en 0.5X a 1X SSC a 55 a 60°C. Los ejemplos de condiciones de astringencia alta incluyen hibridación en 50% formamida, 1 M NaCI, 1 % SDS a 37°C, y un lavado en 0.1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, los buffers de lavado pueden comprender aproximadamente entre 0.1 % y aproximadamente 1 % SDS. La duración de la hibridación es en general inferior a aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de los lavados posthibridación, siendo los factores críticos la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, el valor Tm puede ser aproximado a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal.

Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5X + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (bajo una resistencia iónica y pH definidos) a la cual un 50% de una secuencia blanco complementaria se híbrida en una sonda perfectamente concordada. Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de desajuste; así, la Tm, hibridación, y/o las condiciones de lavado pueden ajustarse para hibridarse a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm puede disminuir en 10°C. En general, las condiciones astnngentes son seleccionadas de modo que sean aproximadamente 5°C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una resistencia iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente astringentes puede utilizar una hibridación y/o lavado a 1 , 2, 3, o 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente astringentes pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm)¡ las condiciones de baja astringencia pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1 1 , 12, 13, 14, 15, o 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Los expertos en el arte advertirán que en el uso de la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, pueden variarse. Si el grado deseado de desajuste da como resultado una Tm inferior a 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que pueda emplearse una temperatura mayor. La hibridación de ácidos nucleicos está extensamente descripta en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocole in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). Consultar Sambrook et al. ( 989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas Las proteínas pesticidas también caen dentro del alcance de la presente invención. La expresión "proteína pesticida" hace referencia a una proteína que posee la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. Además se proveen fragmentos, porciones biológicamente activas, y variantes de las mismas, que pueden utilizarse para llevar a la práctica los métodos de la presente invención. Una "proteína aislada" hace referencia a una proteína que ya no está en su ambiente natural, por ejemplo in vitro o en una célula huésped bacteriana o de planta.

Los "fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2 y que exhiben actividad pesticida. Una porción biológicamente activa de una proteina pesticida puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos de longitud. Tales porciones biológicamente activas pueden ser preparadas mediante técnicas recombinantes y evaluadas para establecer la actividad pesticida. Los métodos de medición de la actividad pesticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia. De acuerdo a la presente, un fragmento comprende por lo menos 8 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2. La invención comprende otros fragmentos, sin embargo, como cualquier fragmento de más de aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, o 300 aminoácidos.

La expresión "variantes" hace referencia a proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85%, aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. Las variantes además incluyen polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que se híbrida a la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: :1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o 12, o un complemento de la misma, bajo condiciones astringentes. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en secuencia de aminoácidos por mutagénesis. Consultar, por ejemplo, las variantes reveladas en los Ejemplos Experimentales en la presente. Las variantes de proteínas de la presente invención son biológicamente activas, es decir conservan la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, retienen la actividad pesticida. En algunas realizaciones, las variantes tienen una actividad mejorada con relación a la proteína nativa. Los métodos para medir la actividad pesticida son muy conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la Patente Estadounidense Número 5,743,477, todos los cuales se incorporan por completo a la presente como referencia.

Los genes bacterianos como los genes axmi de la presente invención con bastante frecuencia poseen múltiples codones de iniciación de metionina cerca del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, la iniciación de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, las bacterias como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción de los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en sistemas bacterianos pueden iniciarse en un codón TTG, a través de este evento TTG codifica una metionina. Además, con frecuencia no se determina a priori cuáles de estos codones son utilizados naturalmente en la bacteria. Así, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos también puede conducir a la generación de proteínas pesticidas. Estas proteínas pesticidas caen dentro del alcance de la presente invención y pueden ser usadas en los métodos de la presente invención. Se entenderá que, en caso de expresión en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo a ATG para una adecuada traducción.

También se contemplan los anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención, o para variantes o fragmentos de los mismos. Los métodos para la producción de anticuerpos son muy conocidos en el arte (consultar, por ejemplo, Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente Estadounidense Número 4,196,265).

Variantes alteradas o mejoradas Se reconoce que las secuencias de ADN de una proteína pesticida pueden ser alteradas a través de varios métodos, y que esta alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes de las codificadas por una proteína pesticida de la presente invención. Esta proteina puede ser alterada en varias formas incluyendo sustituciones, deleciones, truncaciones e inserciones de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, incluyendo hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 1 10, aproximadamente 1 15, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130, aproximadamente 135, aproximadamente 140, aproximadamente 145, aproximadamente 150, aproximadamente 155, o más sustituciones, deleciones o inserciones aminoácidos.

Los métodos para tales manipulaciones son en general conocidos en el arte. Por ejemplo, es posible preparar variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína pesticida por mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse por una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución directa. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectará en forma sustancial la función de la proteína. Estas variantes tendrán la actividad pesticida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de una proteína pesticida para conferir actividad pesticida puede mejorarse a través del uso de tales técnicas sobre las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, es posible expresar una proteina pesticida en células huéspedes que exhiban mayores tasas de falta de incorporación de bases durante la replicación del ADN, como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Luego de la propagación de tales cepas, es posible aislar el ADN de la delta-endotoxina (por ejemplo preparando plásmido de ADN, o amplificando por PCR y clonando el fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la proteína pesticida en una cepa no mutagénica, e identificar los genes de mutados con actividad pesticida, por ejemplo ejecutando un ensayo para evaluar la actividad pesticida. En general, la proteína se mezcla y usa en ensayos de alimentación. Consultar, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Tales ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o provocar la muerte de las plagas. Los ejemplos de mutaciones que dan como resultado una mayor toxicidad pueden encontrarse en Schnepf et al. (1998) Microbio!. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, es posible introducir alteraciones a la secuencia de muchas proteínas en el término amino o carboxi sin afectar en forma sustancial la actividad. Estas pueden incluir inserciones, deleciones, o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, como PCR, incluyendo amplificaciones por PCR que alteran o extienden la secuencia de codificación de la proteína en virtud de la inclusión de secuencias de codificación de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas agregadas pueden incluir secuencias de codificación de proteínas completas, como aquellas comúnmente utilizadas en el arte para generar fusiones de proteínas. Tales proteínas de fusión son a menudo utilizadas para (1) incrementar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática, o epitopo para facilitar la purificación de la proteína, detección de la proteína, u otros usos experimentales conocidos en el arte (3) secreción blanco o traducción de una proteína en un organelo subcelular, como el espacio periplásmico de las bacterias Gram-negativas, o el retículo endoplasmático de células eucarióticas, resultando éste último en la glicosilación de la proteína.

Las variantes de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la presente invención además comprenden secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos o recombinogénicos como barajado de ADN. Con este procedimiento, una o más regiones de codificación distintas de la proteína pesticida pueden utilizarse para crear una nueva proteína pesticida que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que poseen una identidad de secuencia sustancial y que pueden ser homólogamente recombinadas en vítro o en vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, es posible barajar los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre un gen de pesticida de la invención y otros genes pesticidas conocidos para obtener una nueva codificación genética para una proteína con una propiedad de interés mejorada, como una mayor actividad pesticida. Las estrategias para barajado de ADN son conocidas en el arte. Consultar, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-391 ; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 :288-291 ; y Patentes Estadounidenses Números 5,605,793 y 5,837,458.

El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar proteínas pesticidas alteradas. Los dominios pueden ser intercambiados entre las proteínas pesticidas, lo cual da como resultado toxinas híbridas o quiméricas con una mejor actividad insecticida o espectro blanco. Los métodos de generación de proteínas recombinantes y ensayo de las mismas tendientes a evaluar la actividad pesticida son muy conocidos en el arte (consultar, por ejemplo, Naimov et al. (2001 ) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925).

Vectores Una secuencia pesticida de la invención puede ser provista en un cassette de expresión para la expresión en una planta de interés. La expresión "cassette de expresión en planta" hace referencia a una construcción de ADN que es capaz de da como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula vegetal.

Típicamente estos contienen un promotor y una secuencia de codificación. Con frecuencia, tales construcciones además contendrán una región 3' sin traducir. Tales construcciones pueden contener una "secuencia de señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte co-translacional o post-translacional del péptido a ciertas estructuras intracelulares como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplasmático, o el aparato de Golgi.

La expresión "secuencia de señal" hace referencia a una secuencia de la cual se sabe o sospecha que da como resultado el transporte de péptidos cotranslacional o post-translacional a través de la membrana celular. En los eucariotes, esto típicamente comprende la secreción en el aparato de Golgi, con algo de glicosilación resultante. Las toxinas pesticidas de las bacterias a menudo son sintetizadas como protoxinas, que son proteolíticamente activadas en el intestino de la plaga blanco (Chang (1987) Metods Enzymol. 153:507-516). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia de señal se dispone en la secuencia nativa, o puede derivarse de una secuencia de la invención. La expresión "secuencia líder" hace referencia a cualquier secuencia que al ser traducida, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para disparar el transporte cotranslacional de la cadena de péptidos a un organelo sub-celular. Así, esto incluye secuencias líderes orientadas al transporte y/o glicosilación por pasaje al retículo endoplasmático, pasaje a las vacuolas, plástidos que incluyen cloroplastos, mitocondrias y similares.

La expresión "vector de transformación vegetal" hace referencia a una molécula de ADN que es necesaria para una transformación eficiente de una célula vegetal. Esta molécula puede comprender uno o más cassettes de expresión vegetales, y puede organizarse en más de una molécula de ADN "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetales que utilizan dos vectores de ADN no-contiguos para codificar todas las funciones cis- y trans- necesarias para la transformación de las células vegetales (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). La palabra "vector" hace referencia a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferencia entre distintas células huéspedes. La expresión "vector de expresión" hace referencia a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN heterólogas o fragmentos en una célula extraña. El cassette incluirá secuencias regulatorias 5' y 3' operativamente unidas a una secuencia de la invención. La expresión "operativamente unidas" hace referencia a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en tanto la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, operativamente unidas significa que las secuencias de ácidos nucleicos unidas son contiguas y, que cuando es necesario unen dos regiones de codificación de protelna, contiguas y en el mismo cuadro de lectura. El cassette puede adicionalmente contener al menos un gen adicional a ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el o los genes adicionales pueden ser provistos en múltiples cassettes de expresión.

La expresión "promotor" hace referencia a una secuencia de ácidos nucleicos que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia de codificación caudal abajo. El promotor junto con otras secuencias de ácidos nucleicos regulatorias transcripcionales y translacionales (también denominadas "secuencias de control") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Se provee un cassette de expresión de este tipo con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de pesticida bajo la regulación transcripcional de las regiones regulatorias.

El cassette de expresión incluirá en la dirección 5 -3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional y translacional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación translacional o transcripcional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, al huésped vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "nativo" o "homólogo" al huésped vegetal, se pretende que el promotor se encuentre en la planta nativa donde se introduce. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural para la secuencia de ADN operativamente unida de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente unida de interés, puede ser nativa con el huésped vegetal, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de interés, el huésped vegetal, o cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación convenientes se obtienen del plásmido-Ti de A. tumefaciens, como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Consultar además, Guerineau et al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991 ) Ce// 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261 -1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Cuando resulte adecuado, el o los genes pueden ser optimizados para una mayor expresión en la célula huésped transformada. Es decir, los genes pueden ser sintetizados usando los codones preferidos de la célula huésped para una expresión mejorada, o pueden ser sintetizados usando codones a una frecuencia de uso de codones preferidos en el huésped. En general, el contenido GC del gen será incrementado. Consultar, por ejemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 donde se describe el uso de codones preferidos en el huésped. Se dispone en el arte de métodos para sinterizar genes preferidos por las plantas. Consultar, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Números 5,380,831 , y 5,436,391 , y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, que se incorpora a la presente como referencia.

En una realización, la proteína pesticida es dirigida al cloroplasto para la expresión. De este modo, cuando la proteína no es directamente insertada en el cloroplasto, el cassette de expresión contendrá además un ácido nucleico que codifique un péptido de tránsito para dirigir la proteina a los cloroplastos. Estos péptidos de tránsito son conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 ; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

El gen pesticida a ser dirigido al cloroplasto puede ser optimizado para la expresión en el cloroplasto con el fin de contemplar las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este organelo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden ser sintetizados usando codones preferidos por el cloroplasto. Consultar, por ejemplo, Patente Estadounidense Número 5,380,831 , que se incorpora a la presente como referencia.

Transformación de la planta Los métodos de la invención comprenden introducir una construcción de nucleótidos en una planta. La expresión "introducir" hace referencia a presentar a la planta la construcción de nucleótidos de manera que la construcción tenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren la utilización de un método específico de introducción de una construcción de nucleótidos a una planta, solamente que la construcción de nucleótidos tenga acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos de introducción de construcciones de nucleótidos en plantas son conocidos en el arte e incluyen, entre otros, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus.

La expresión "planta" se refiere a plantas enteras, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de la misma. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivos en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen).

Las expresiones "plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "establemente transformados" hace referencia a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácidos nucleicos o fragmentos de ADN exógenos en la célula vegetal. Estas secuencias de ácidos nucleicos incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal sin transformar. La expresión "heterólogas" en general hace referencia a las secuencias de ácidos nucleicos que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo donde están presentes, y que han sido incorporadas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroforación, microproyección, o similares.

La transformación de las células vegetales puede lograrse mediante una de varias técnicas conocidas en el arte. El gen pesticida de la presente puede ser modificado para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Típicamente, una construcción que exprese dicha proteína contendría un promotor para impulsar la transcripción del gen, así como una región 3' sin traducir para permitir la terminación de la transcripción y poliadenilación. La organización de tales construcciones es muy conocida en el arte. En algunos casos, puede resultar de utilidad diseñar el gen de modo que el péptido resultante sea secretado, o de lo contrario dirigido dentro de la célula vegetal. Por ejemplo, el gen puede ser diseñado para contener un péptido de señal con el fin de facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplasmático. Asimismo puede ser conveniente diseñar el cassette de expresión vegetal de modo que contenga un intrón, de modo que se requiera el procesamiento de ARNm del intrón para la expresión.

Típicamente este "cassette de expresión vegetal" será insertado en un "vector de transformación vegetal". Este vector de transformación vegetal puede estar constituido por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación vegetal. Por ejemplo, constituye una práctica común en el arte utilizar vectores de transformación vegetales que están compuestos por más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se denominan en el arte "vectores binarios". Los vectores binarios así como los vectores con plásmídos colaboradores son utilizados en la mayor parte de los casos para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente es bastante importante, siendo conveniente la separación de funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios típicamente contienen un vector de plásmido que contiene secuencias de actuación cis- necesarias para la transferencia de ADN-T (como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionado diseñado para ser capaz de expresión en una célula vegetal, y un "gen de interés" (un gen diseñado para ser capaz de expresión en una célula vegetal de la cual se desea la generación de plantas transgénicas). Asimismo en este vector de plásmido se encuentran presentes secuencias necesarias para la replicación bacteriana. Las secuencias con actuación cis- están dispuestas para permitir una eficaz transferencia a las células vegetales y su expresión en ellas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen pesticida se disponen entre los bordes izquierdo y derecho. Con frecuencia un segundo vector de plásmido contiene los factores de trans-actuación que median la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por clivaje en secuencias borde y la transferencia de ADN mediada por vir, tal como se entiende en el arte (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Es posible utilizar varias cepas de Agrobacterium (por ejemplo LBA4404, GV3101 , EHA101 , EHA105, etc.) para la transformación de la planta. El segundo vector de plásmido no es necesario para la transformación de las plantas por otros métodos como microproyección, microinyección, electroforación, polietilen glicol, etc.

En general, los métodos de transformación de plantas comprenden transferir el ADN heterólogo a las células vegetales blanco (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos no diferenciados, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección apropiada (de acuerdo al gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa de células sin transformar. Los explantos típicamente son transferidos a un suministro nuevo del mismo medio y cultivados de manera convencional. A continuación, las células transformadas son diferenciadas en brotes luego de colocarlas sobre medio de regeneración suplementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Los brotes luego son transferidos a un medio de radiculación selectivo para recuperar brotes o plántulas con raíz. La plántula transgénica luego crece hasta transformarse en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271 -282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantos son típicamente transferidos a un suministro nuevo del mismo medio y cultivados de manera convencional. Una descripción general de las técnicas y métodos de generación de plantas transgénicas se encuentra en Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células, tanto células transformadas como sin transformar están presentes en cualquier porción del callo blanco o tejido o grupo de células. La capacidad para matar las células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos vegetales transformados. Con frecuencia, la capacidad de eliminar las células no transformadas es una limitación a una recuperación rápida de las células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar de acuerdo al tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, blanco de transformación. La generación de plantas transgénicas puede realizarse mediante uno de varios métodos, incluyendo, entre otros, microinyección, electroforación, transferencia de gen directa, introducción de ADN heterologo por Agrobacterium en células vegetales (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células vegetales con ADN extraño heterologo adherido a partículas, aceleración de partículas balística, transformación con haz en aerosol (Solicitud de Patente Estadounidense Publicada No. 20010026941 ; Patente Estadounidense Número 4,945,050; Publicación Internacional Número WO 91/00915; Solicitud de Patente Estadounidense Publicada No. 2002015066), transformación Lec1 , y varios otros métodos no mediados directamente con partículas para transferir ADN.

Los métodos de transformación de cloroplastos son conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la liberación mediante una pistola de partículas de ADN conteniendo un marcador seleccionare y la dirección del ADN al genoma del plástido por recombinación homologa. Adicionalmente, la transformación del plástido puede lograrse por transactivación de un transgen de plástido silencioso por expresión con preferencia de tejido de una polimerasa de ARN con codificación nuclear y dirigida al plástido. Este sistema ha sido reportado en McBride ef al. (1994) Proc. Nati Acad. Sci. USA 91 :7301-7305.

Luego de la integración del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, se aplica un nivel de umbral máximo de selección adecuada en el medio para matar las células sin transformar y separar y proliferar las células putativamente transformadas que sobreviven a partir de este tratamiento de selección por transferencia regular a un medio nuevo. Mediante el paso continuo y desafío con la selección adecuada, es posible identificar y proliferar las células que se han transformados con el vector de plásmído. Luego es posible aplicar métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

Las células que han sido transformadas pueden transformarse en plantas mediante métodos convencionales. Consultar, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden entonces crecer, y polinizar con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante tener la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y herede en forma estable y luego cosecharse las semillas con el fin de asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada ha sido alcanzada. De este modo, la presente invención provee una semilla transformada (también denominada "semilla transgénica") que posee una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cassette de expresión de la invención, establemente incorporado a su genoma.

Evaluación de la Transformación de la Planta Luego de la introducción del ADN extraño heterólogo a las células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se conforma mediante varios métodos como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis PCR es un método rápido para clasificar las células transformadas, tejidos o brotes respecto de la presencia del gen incorporado en el estado temprano antes de trasplantar al suelo (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). El análisis PCR se ejecutar usando primers de oligonucleótidos específicos para el gen de interés o background del vector de Agrobacteríum, etc.

La transformación de la planta puede ser confirmada por análisis Southern blot del ADN genómico (Sambrook and Russell, 2001 , supra). En general, todo el ADN es extraído del transformante, digerido con enzimas de restricción adecuadas, fraccionado en un gel de agarosa y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon. La membrana o "blot" luego es sondeada con, por ejemplo, un fragmento de ADN blanco 32P radiomarcado para confirmar la integración del gen introducido al genoma de la planta de acuerdo a técnicas convencionales (Sambrook and Russell, 2001 , supra).

En el análisis Northern blot, el ARN es aislado de tejidos específicos del transformante, fraccionado en un gel de agarosa con formaldehido, y transferido sobre un filtro de nylon de acuerdo a procedimientos convencionales que son rutinariamente aplicados en el arte (Sambrook and Russell, 2001 , supra). Luego se prueba expresión de ARN codificado por la delta-endotoxina por hibridación del filtro en una sonda radioactiva derivada de una delta-endotoxina, a través de métodos conocidos en el arte (Sambrook and Russell, 2001 , supra).

Es posible realizar el análisis Western blot, ensayos bioquímicos y similares sobre las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen pesticida mediante procedimientos convencionales (Sambrook and Russell, 2001 , supra) usando anticuerpos que se unen a uno o más epitopos presentes en la proteína delta-endotoxina.

Actividad pesticida en plantas En otro aspecto de la invención, es posible generar plantas transgénicas expresando una proteína pesticida que posea actividad pesticida. Los métodos antes descriptos a modo de ejemplo pueden ser utilizados para generar plantas transgénicas, pero la forma en la cual ello se realice no resulta crítica a los fines de la invención. Los métodos conocidos o descriptos en el arte como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, y métodos mediados no por partículas pueden ser usados a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una delta-endotoxina pueden ser aisladas por métodos comunes descriptos en el arte, por ejemplo por transformación de callos, selección de callos transformados, y regeneración de plantas fértiles a partir de tales callos transgénicos. En este proceso, es posible usar cualquier gen como marcador seleccionable en la medida en que su expresión en las células vegetales confiera la capacidad de identificar o seleccionar las células transformadas.

Se ha desarrollado cierto número de marcadores para uso con células vegetales, como resistencia a cloranfenicol, el aminoglicósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifican un producto que interviene en el metabolismo de cloroplastos también pueden ser utilizados como marcadores seleccionables. Por ejemplo, los genes que proveen resistencia a los herbicidas vegetales como glifosato, bromoxinilo, o imidazolinona pueden encontrar particular uso. Tales genes han sido reportados (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (gen de nitrilasa con resistencia a bromoxinilo); y Sathasivan et al. (1990) Nucí. Acids Res. 18:2188 (gen de resistencia a imidazolinona AHAS). Además, los genes revelados en la presente resultan de utilidad como marcadores para determinar la transformación de las células bacterianas o vegetales. Los métodos para detectar la presencia de un transgen en una planta, órgano de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semilla, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie de la misma son muy conocidos en el arte. En una realización, la presencia del transgen es detectada evaluando la actividad pesticida.

Las plantas fértiles que expresan una proteina pesticida pueden ser sometidas a ensayos de actividad pesticida, y las plantas que exhiban una actividad óptima seleccionada para su posterior cría. En el arte se dispone de métodos tendientes a evaluar la actividad insecticida. En general, la proteína es mezclada y usada en ensayos de alimentación. Consultar, por ejemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293.

La presente invención puede ser utilizada para la transformación de especies vegetales, incluyendo, entre otras, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, entre otros, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, azafrán, maníes, batata, mandioca, café, coco, ananá, cítricos, cacao, té, banana, palta, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, castaña, macadamia, almendra, avenas, verduras, ornamentales, y coniferas.

Las verduras incluyen, entre otras, tomates, lechuga, porotos verdes, chauchas, arvejas, y miembros del género Curcumis como el pepino, melón, y cantalupo. Las ornamentales incluyen, entre otras, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, poinsettia, y crisantemo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son cultivos (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza, etc.).

Uso en el control pesticida Los métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, en el control pesticida o en el desarrollo de otros organismos como agentes pesticidas son conocidos en el arte. Consultar, por ejemplo la Patente Estadounidense Número 5,039,523 y EP 0480762A2.

Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleótidos de la presente invención, o una variante de la misma, o los microorganismos que han sido genéticamente alterados para contener un gen pesticida y la proteína pueden usarse en la protección de cultivos agrícolas y productos contra los insectos. En un aspecto de la invención, células enteras, es decir, sin lisar de un organismo producto de toxina (insecticida) son tratadas con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es aplicada al ambiente de la o los insectos blanco.

Alternativamente, el pesticida es producido introduciendo el gen pesticida en un huésped celular. La expresión del gen pesticida da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y mantenimiento del pesticida. En un aspecto de la presente invención, estas células luego son tratadas bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es aplicada al ambiente de la o las plagas blanco. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estos pesticidas naturalmente encapsulados pueden entonces ser formulados de acuerdo a técnicas convencionales para su aplicación al ambiente que aloja una plaga blanco, por ejemplo, el suelo, agua, y el follaje de plantas. Consultar, por ejemplo EPA 0192319, y las referencias allí citadas. Alternativamente, es posible formular las células que expresan un gen de la presente invención para permitir la aplicación del material resultante como un pesticida.

Los ingredientes activos de la presente invención normalmente son aplicados en forma de composiciones y pueden ser aplicados al área de cultivo o la planta a tratar, simultáneamente o luego de otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, eliminadores de malezas, crioprotectores, surfactantes, detergentes, jabones insecticidas, aceites insecticidas, polímeros, y/o formulaciones portadoras de liberación prolongada o biodegradables que permiten una dosificación a largo plazo sobre un área dada luego de una sola aplicación de la formulación. Asimismo pueden ser herbicidas, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amoebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscocidas selectivos o mezclas de varias de estas preparaciones, sí se desea, junto con portadores agricolamente aceptables adicionales, surfactantes o adyuvantes estimuladores de la aplicación convencionalmente empleados en el arte de la formulación.

Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en la tecnología de la formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes incrementadores de la pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. De igual modo, las formulaciones pueden ser preparadas en "cebos" comestibles o diseñadas como "trampas" para plagas para permitir la alimentación o ingestión por parte de la plaga blanco de la formulación pesticida.

Los métodos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquímica de la presente invención que contiene por lo menos una de las proteínas pesticidas producida por las cepas bacterianas de la presente invención incluyen aplicación al follaje, recubrimiento de semillas y aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infección por parte de plaga correspondiente.

La composición puede ser formulada como un polvo, harina, pellet, gránulo, spray, emulsión, coloide, solución, o similar, y es posible prepararla por aplicación de métodos convencionales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, • sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido. En todas estas composiciones que contienen por lo menos un polipéptido insecticida, el polipéptido puede estar presente en una concentración que oscila aproximadamente entre 1 % y aproximadamente 99% en peso.

Los lepidópteros, dípteros o coleópteros pueden ser eliminados o reducidos en número en un área dada por los métodos de la invención, o es posible la aplicación profiláctica a un área para impedir la infección por una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere, o se pone en contacto con una cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida del polipéptido.

La expresión "cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida" se refiere a una cantidad del pesticida capaz de ocasionar prácticamente la muerte de por lo menos una plaga, o reducir en forma notable el crecimiento de la plaga, su alimentación, o desarrollo fisiológico normal. Esta cantidad dependerá de factores tales como, por ejemplo, las plagas especificas a controlar, el ambiente, localización, planta, cultivo, o sitio agrícola a tratar, las condiciones ambientales, y el método, tasa, concentración, estabilidad, y cantidad de aplicación de la composición de polipéptido efectiva desde el punto de vista pesticida. Las formulaciones también pueden variar con relación a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales, y/o frecuencia de aplicación y/o severidad de la infección con la plaga.

Las composiciones pesticidas descriptas pueden ser preparadas formulando la célula bacteriana, cristal y/o suspensión de esporas, o componente de proteína aislada con el portador agricolamente aceptable deseado. Las composiciones pueden ser formuladas antes de la administración en un medio adecuado como liofilizado, secado por congelamiento, desecado, o en un portador, medio o diluyente acuoso adecuado, como una solución salina u otro buffer. Las composiciones formuladas pueden adoptar la forma de un polvo o material granular, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o de emulsiones en agua o aceite/agua, o de polvo humectable, o combinadas con cualquier otro material portador adecuado para aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son muy conocidos en el arte. La expresión "portador aceptable desde el punto de vista agrícola" cubre a todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, surfactantes, agentes incrementadores de la pegajosidad, aglutinantes, etc. comúnmente usados en la tecnología de formulación de pesticidas; estos son muy conocidos por los expertos en el arte de la formulación de pesticidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y preparadas de diferentes formas, por ejemplo, mezclando homogéneamente, combinando y/o moliendo la composición insecticida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y métodos de aplicación adecuados están descriptos en la Patente Estadounidense Número 6,468,523, que se incorpora a la presente como referencia.

La expresión "peste" incluye, entre otros, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, ácaros, garrapatas, y similares. Los insectos incluyen aquellos seleccionados de los órdenes Coleópteros, Dípteros, Himenópteros, Lepidópteros, Malófagos, Homeópteros, Hemípteros, Ortópteros, Tisanópteros, Dermápteros, Isópteros, Anoplurosa, Sifonápteros, Tricópteros, etc., particularmente Coleópteros, Lepidópteros, y Dípteros.

El orden Coleópteros incluye los subórdenes Adéfagos y Polífagos. El suborden Adéfagos incluye las superfamilias Caraboideos y Girinoideos, mientras que el suborden Polífagos incluye las superfamilias Hidrofiloideos, Estafilinoideos, Cantaroideos, Cleroideos, Elateroideos, Dasciloideos, Driopoideos, Birroideos, Cucujoideos, Meloideos, Mordeloideos, Tenebríonoideos, Bostricoideos, Scarabaoideos, Cerambicoideos, Crisomeloideos, y Curculionoideos. La superfamilia Caraboideos incluye las familias Cicindelidos, Carábidos, y Ditiscidos. La superfamilia Girinoideos incluye la familia Girinidos. La superfamilia Hidrofiloideos incluye la familia Hidrofílidos. La superfamilia Estafilinoideos incluye las familias Sílfidos y Estafilínidos. La superfamilia Cantaroideos incluye las familias Cantáridos y Lampíridos. La superfamilia Cleroideos incluye las familias Cléridos y Derméstidos. La superfamilia Elateroideos incluye las familias Elateridos y Buprestidos. La superfamilia Cucujoideos incluye la familia Cocinelidos. La superfamilia Meloideos incluye la familia Meloidos. La superfamilia Tenebríonoideos incluye la familia Tenebriónidos. La superfamilia Scarabaeoideos incluye las familias Pasálidos y Scarabaeidos. La superfamilia Cerambicoideos incluye la familia Cerambícidos. La superfamilia Crosomeloideos incluye la familia Crisomélidos. La superfamilia Curculionoideos incluye las familias Curculiónidos y Scolítidos.

El orden Dípteros incluye los Subórdenes Nematóceros, Braquíceros, y Ciclórrafos.. El suborden Nematóceros incluye las familias Tipúlidos, Psicólidos, Culícidos, Ceratopogónidos, Quironómidos, Simúlidos, Bibiónidos, y Cecidómidos. El suborden Braquíceros incluye las familias Estratiómidos, Tabánidos, Terévidos, Asílidos, Mídidos, Bombílidos, y Dolicópodidos. El suborden Ciclórrafos incluye las Divisiones Aschiza y Aschiza. La División Aschiza incluye las familias Fondos, Sírfidos, y Conópidos. La División Aschiza incluye las Secciones Acaliptratados y Caliptrataos. La Sección Acaliptratados incluye las familias Otitidos, Tefrítidos, Agromizidos, y Drosofilidos. La Sección Caliptrátados incluye las familias Hipobóscidos, Oéstridos, Taquínidos, Antomíidos, Múscidos, Califóridos, y Sarcofágidos.

El orden Lepidópteros incluye las familias Papiliónidos, Piéridos, Licaénidos, Ninfálidos, Danaidos, Satírídos, Hesperíidos, Esfíngidos, Saturníidos, Geométridos, Arctíidos, Noctúidos, Limantríidos, Sesíidos, y Tinéidos.

Las plagas de insectos de la invención para los cultivos principales incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, Taladro del maíz europeo; Agrotis Ípsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano soldado de otoño; Diatraea grandiosella, y. taladro del maíz del sudoeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Diatraea saccharalis, taladro de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz; Diabrotica longicornis barben, gusano de la raíz del maíz del norte; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis, escarabajo enmascarado del norte (larva blanca); Cyclocephala immaculata, escarabajo enmascarado del sur (larva blanca); Popillia japónica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, escarabajo del maíz; Rhopalosiphum maidis, áfido de la hoja del maíz; Anuraphis maidiradicis, áfido de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, minador de la hoja del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de la hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Sorgo: Chilo partellus, taladro del sorgo; Spodoptera frugiperda, gusano soldado de otoño; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Phyllofagos crinita, larva blanca; Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer; Feltia subterránea, granúlate cutworm; Phyllophaga crinita, larva blanca; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos del alambre; Oulema melanopus, escarabajos de la hoja del cereal; Chaetocnema pulicaria, escarabajo pulga del maíz; Sphenophorus maidis, escarabajo del maíz; Rhopalosiphum maidis, áfido de la hoja del maíz; Sipha flava, áfido amarillo de la caña de azúcar del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, escarabajo chinche; Contarinia sorghicóla, mosca del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano soldado de otoño; Elasmopalpus lignosellus, barrenador del maíz; Agrotis orthogonia, gusano cortador del oeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja del cereal; Hypera punctata, gorgojo del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz del sur; áfido del trigo Ruso; Schizaphis graminum, escarabajo verde; Macrosiphum avenae, áfido del grano Inglés; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Mayetiola destructor, Mosca de Hess; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusano del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, mosca del tallo del trigo; Acería tulipae, acaro del enrulado del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla del capullo del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano cogollero del algodón; Helicoverpa zea, gusano de la cápsula del algodón; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano cogollero rosado; Anthonomus grandis, gorgojo cogollero; Aphis gossypii, áfido del algodón; Pseudatomoscelis seríatus, pulga del algodón; Tríaleurodes abutilonea, mosca blanca de alas rayadas; Lygus lineolaris, escarabajo de planta manchado; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Arroz: Diatraea saccharalis, taladro de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano soldado del otoño; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo de agua del arroz; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, langosta del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, escarabajo chinche; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, oruga de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas; Plathypena scabra, gusano verde de la soja; Ostrinia nubilalis, taladro del maíz Europeo; Agrotis Ípsilon, gusano cortador negro; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Heliothis virescens, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Epilachna varívestis, escarabajo del frijol Mexicano; Myzus persicae, áfido del durazno verde; Empoasca fabae, langosta de la papa; Acrosternum hilare, escarabajo verde; Melanoplus femurrubrum, langosta de patas rojas; Melanoplus differentialis, langosta diferencial; Hylemya platura, gusano de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, acaro araña de la frutilla; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Cebada: Ostrinia nubilalis, taladro del maíz Europeo; Agrotis Ípsilon, gusano cortador negro; Schizaphis graminum, escarabajo verde; Blissus leucopterus leucopterus, escarabajo chinche; Acrosternum hilare, chinche verde; Euschistus servus, chinche marrón; Delia platura, gusano de la semilla del maíz; Mayetiola destructor, mosca de Hess; Petrobia latens, ácaro del trigo marrón; Colza: Brevicoryne brassicae, áfido de la col; Phyllotreta cruciferae, Escarabajo pulga; Mamestra configúrala, gusano soldado Bertha; Plutella xylostella, polilla dorso de diamante; Delia ssp., gusanos de la raíz.

Los nemátodos incluyen nemátodos parasíticos como nematodos formadores de nudos en la raíz, quiste, y de la lesión, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; particularmente elementos de los nemátodos quiste, que incluyen, entre otros, Heterodera glycines (nemátodos del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nemátodos del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nemátodos del quiste de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nemátodos del quiste de la papa). Los nemátodos de la lesión incluyen Pratylenchus spp.

Métodos para incrementar el rendimiento vegetal Se proveen métodos para incrementar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden introducir en una planta o célula vegetal un polinucleótido que comprende una secuencia pesticida revelada en la presente. De acuerdo a la presente, el término "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. El término "biomasa" se refiere a cualquier producto de la planta medido. Un incremento en la producción de biomasa constituye una mejora en el rendimiento del producto medido de la planta. El incremento del rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa de hojas de la planta puede aumentar la producción de vegetales de hoja para consumo humano o animal. Adicionalmente, el incremento de la biomasa de hojas puede utilizarse para incrementar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier incremento estadísticamente significativo que incluye, entre otros, por lo menos 1 % de aumento, por lo menos un 3% de aumento, por lo menos un 5% de aumento, por lo menos un 10% de aumento, por lo menos un 20% de aumento, por lo menos un 30%, por lo menos un 50%, por lo menos un 70%, por lo menos un 100% o un aumento mayor en el rendimiento respecto de una planta que no exprese la secuencia pesticida.

Las plantas también pueden ser tratadas con una o más composiciones químicas, que incluyen uno o más herbicidas, insecticidas, o fungicidas. Los ejemplos de composiciones químicas incluyen: Herbicidas para Frutas/Verduras: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Simazina, Trifluralin, Fluazifop, Glufosinato, Halosulfuron Gowan, Paraquat, Propyzamida, Setoxidim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Insecticidas para Frutas/Verduras: Aldicarb, Bacillus thuriengiensis, Carbarilo, Carbofuran, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrin/beta-ciflutrin, Esfenvalerato, Lambda-cihalotrin, Acequinocilo, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Fluacripirim, Tolfenpirad, Clotianidin, Spirodiclofen, Gamma-cihalotrin, Espiromesifen, Espinosad, Rinaxipir, Ciazipir, Spinoteram, Triflumuron.Spirotetramat, Imidacloprid, Flubendiamida, Tiodicarb, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofen, Cianopirafen, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Espinotoram, Tiodicarb, Flonicamid, Metiocarb, Emamectina-benzoato, Indoxacarb, Foztiazato, Fenamifos, Cadusafos, Piriproxifen, Fenbutatin-oxid, Hextiazox, Metomilo, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino] furan-2(5H)-ona; Fungicidas para Frutas/Verduras: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Azufre, Tiofanate-metil, Azoxistrobin, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetilo, Iprodiona, Kresoxim-metilol, etalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobin, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobin, Fenhexamid, Oxpoconazol fumarato, Ciazofamid, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobin, Piraclostrobin, Ciflufenamid, Boscalid; Herbicidas para Cereales: Isoproturon, Bromoxinilo, loxinilo, Fenoxis, Clorsulfuron, Clodinafop, Diclofop, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluroxipir, Metsulfuron, Triasulfuron, Flucarbazona, lodosulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafen, Mesosulfuron, Beflubutamid, Pinoxaden, Amidosulfuron, Thifensulfuron, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfosulfuron, Pyrasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas para Cereales: Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobin, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorf, Epoxiconazole, Kresoxim-metilo, Quinoxifen, Tebuconazol, Trifloxistrobin, Simeconazol, Picoxistrobin, Piraclostrobin, Dimoxistrobin, Protioconazol, Fluoxastrobin; Insecticidas para Cereales: Dimetoato, Lambda-cihaltrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, ß-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Clorfrifos, Metamidofos, Oxidemeton-metilo, Pirimicarb, Metiocarb; Herbicidas para el Maíz: Atrazina, Alaclor, Bromoxinilo, Acetoclor, Dicamba, Clopiralid, (S-)Dimetenamid, Glufosinato, Gliposato, Isoxaflutol, (S-)Metolaclor, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foramsulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Insecticidas para el Maíz: Carbofuran, Clorpirifos, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprid, Lambda-Cihalotrina, Teflutrina, Terbufos, Thiametoxam, Clotianidina, Spiromesifen, Flubendiamida, Triflumuron, Riynaxipir, Deltametrina, Tiodicarb, fi-Cflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina.Tebupirimfos, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Avermectina, Metiocarb, Spirodiclofen, Spirotetramat; Fungicidas para el Maíz: Fenitropan, Tiram, Protioconazol, Tebuconazol, Trifloxistrobin; Herbicidas para el Arroz: Butaclor, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cihalofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazosulfuron, Mefenacet, Oxaziclomefona, Pirazosulfuron, Piributicarb, Quinclorac, Tiobencarb, Indanofan, Flufenacet, Fentrazamida, Halosulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalid, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargilo, Etoxisulfuron, Pretilaclor, Mesotrione, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimisulfan; Insecticidas para el Arroz: Diazinon, Fenitrotion, Fenobucarb, Monocrotofos, Benfuracarb, Buprofezin, Dinotefuran, Fipronil, Imidacloprid, Isoprocarb, Tiacloprid, Cromafenozida, Tiacloprid, Dinotefuran, Clotianidina, Etiprole, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprid, Tiametoxam, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Emamectina-Benzoato, Cipermetrina, Clorpirifos, Cartap, Metamidofos, Etofenprox, Triazofos, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Carbofuran, Benfuracarb; Fungicidas para el Arroz: Tiofanato-metilo, Azoxistrobin, Carpropamid, Edifenfos, Ferimzoría, Iprobenfos, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Pyroquilon, Triciclazole, Trifloxistrobin, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil; Herbicidas para el Algodón: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butilo, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac-sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; Insecticidas para el Algodón: Acefato, Aldicarb, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofos, Abamectina, Acetamiprid, Emamectina Benzoato, Imidacloprid, Indoxacarb, Lambda-Cihalotrina, Espinosad, Tiodicarb, Gamma-Cihalotrina, Espiromesifen, Piridalilo, Flonicamid, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramat, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, gamma Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-dífluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalylo, Espiromesifen, Sulfoxaflor, Profenofos, Triazofos, Endosulfan; Fungicidas para el Algodón: Etridiazol, Metalaxilo, Quintozeno; Herbicidas para la Soja: Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron-Etilo, Cloransulam-Metilo, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-)Metolaclor, Metribuzin, Pendimetalina, Tepraloxidim, Glufosinato; Insecticidas para la Soja: Lambda-cihalotrina, Metomilo, Paration, Tiocarb, Imidacloprid, Clotianidin, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Emamectina-Benzoato, Fipronil, Etiprole, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramat, Espinodiclofen, Triflumuron, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrina; Fungicidas para la Soja: Azoxistrobin, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobin, Tebuconazol, Trifloxistrobin, Protioconazol, Tetraconazol; Herbicidas para la Remolacha: Cloridazon, Desmedifam, Etofumesato, Fenmedifam, Trialato, Clopiralid, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidim, Triflusulfuron, Tepraloxidim, Quizalofop; Insecticidas para la Remolacha: Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Acetamiprid, Dinetofuran, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gamma/lambda Cihalotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronil, Carbofuran; Herbicidas para Cañóla: Clopiralid, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazaclor, Trifluralin Etametsulfuron, Quinmerac, Quizalofop, Cletodim, Tepraloxidim; Fungicidas para Cañóla: Azoxistrobin, Carbendazim, Fludioxonil, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolin; Insecticidas para Cañóla: Carbofuran, Organofosfatos, Piretroides, Tiacloprid, Deltametrina, Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Acetamiprid, Dinetofuran, ß-Ciflutrina, gamma y lambda Cihalotrina, tau-Fluvaleriato, Etiprol, Espinosad, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.

Los siguientes ejemplos tienen carácter ilustrativo y no limitan el modo alguno el invento.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Extracción del ADN del plásmido La secuencia genética completa fue identificada a partir de la cepa mediante el enfoque MiDAS genomics de la siguiente forma: • Preparación de ADN extracromosómico de la cepa. El ADN extracromosómico contiene una mezcla de algunos o todos los siguientes: plásmidos de varios tamaños; cromosomas fagos; fragmentos de ADN genómico no separados por el protocolo de purificación; otras moléculas extracromosómicas sin caracterizar.

• Corte mecánico o enzimático del ADN extracromosómico para generar fragmentos distribuidos por tamaño.

• Secuenciado del ADN fragmentado por métodos de piro-secuenciado de alto rendimiento.

• Identificación de genes de toxina putativos por homología y/u otros análisis computacionales.

Cuando resulte necesario, la terminación de la secuencia del gen de interés mediante una de varias estrategias de PCR o clonación (por ejemplo TAIL-PCR).

EJEMPLO 2 Expresión heteróloqa de AXMI-150 El ORF completo de axmi-150 (~2 kb que codifican una proteína de ~77.5 kD) fue clonado en un vector de expresión de E. coli en base a pRSFI b (para obtener pAX5482). La secuencia genética de axm¡-150 comenzando con una metionina interna (19 aminoácidos caudal debajo de la metionina original en pAX5482) también fue clonada en el vector basado en pRSFI b para obtener pAX5484.

La secuencia que codifica axmi-150 también fue clonada en un vector de expresión de Bacillus en base a pAX916 (para obtener pAX5483). Todos los clones resultantes fueron confirmados por análisis de restricción y finalmente, por el secuenciado completo del gen clonado.

Para la expresión en E. coli, se transformó BL21*DE3 con pAX5482 o pAX5484. La colonia fue inoculada en LB suplementado con kanamicina y se dejó incubar durante la noche a 37°C. Al día siguiente, se inoculó el doble de medio nuevo con 1 % de cultivo nocturno y se dejó incubar a 37°C a una fase logarítmica. Luego, los cultivos fueron inducidos con 1 mM IPTG por espacio de 3 horas a 37oC o a 20oC durante la noche. Cada pellet celular fue suspendido en 50mM de buffer de carbonato de sodio, pH 10.5 suplementado con 1 mM DTT y sonicado. El análisis por SDS-PAGE detectó la expresión de una proteína de 130kD que corresponde a Axmil O.

Para la expresión en Bacillus, se transformó Bt51 con pAX5483 y se incubó una colonia en medio CYS-glu por espacio de 3 días hasta la esporulación. El pellet celular luego fue extraído con 50mM de Tris Cl buffer, pH 8.0, o 50 mM de buffer de carbonato de sodio, pH 10.5 suplementado con 1 mM DTT. La fracción soluble evidenció la presencia de una proteína de 8kD Axmi150. La tripsinización de Axmi150 arrojó una banda de proteína apenas visible de aproximadamente 55kD.

La secuencia del marco de lectura abierto de axmi-150 se provee en la presente como SEQ ID NO: 1 y codifica la proteína AXMI-150 (SEQ ID NO: 2).

La búsqueda de la secuencia de aminoácidos AXMI-150 contra las bases de datos de secuencias públicas demuestra que AXMI-1 50 es homologa a la proteína AXMI-004 (Patente Estadounidense Número 7,355,099). AXMI-150 además exhibe homología de aminoácidos respecto de cry1 Ca4, y un grupo de proteínas tipo AXMI-004 descriptas en la Publicación de la Solicitud Internacional Número WO2005/107383.

Homólogos conocidos e identidad porcentual aproximada: AXMI-004 - 85.5% Cry Ca4 (dominio de toxina) - 51.8% EJEMPLO 3 Actividad pesticida de AXMI-150 Se sometieron a un ensayo con insectos extractos solubles de AXMI-150 con controles adecuados. Una lectura de 5 días de la placa indicó que AXMI-150 tiene actividad pesticida sobre el Taladro del Maíz Europeo (ECB), la oruga de las leguminosas (VCB), y alta mortalidad (>50%) sobre la polilla dorso de diamante (DMB) y el taladro del maíz del sudoeste (SWCB).

El cuadro 1 lista una descripción de las asignaciones de clasificación usadas en la presente.

CUADRO 1 Descripción del Sistema de Clasificación CUADRO 2 Actividad pesticida de AXMI-150.

Plaga Actividad de AXMI-150 Taladro del maíz europeo +++ Oruga de las leguminosas + Polilla dorso de diamante +++++ Taladro del maíz del sudoeste ++++ EJEMPLO 4 Ensayos adicionales de actividad pesticida Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser testeadas en cuanto a su capacidad para producir proteínas pesticidas. La capacidad de la proteína pesticida de actuar como un pesticida sobre una plaga a menudo es evaluada de distintas formas. Una manera muy conocida en el arte consiste en realizar un ensayo de alimentación. En este ensayo de alimentación, uno expone la plaga a una muestra que contiene los compuestos a probar, o muestras de control. Con frecuencia esto se ejecuta colocando el material a probar, o una dilución adecuada de este material, sobre un material que la plaga ingerirá, como una dieta artificial. El material a probar puede estar compuesto de un líquido, sólido, o pasta. El material a testear puede ser colocado sobre la superficie y luego se deja secar. Alternativamente, el material a testear puede mezclarse con una dieta artificial fundida, luego colocado en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, plato, o una cavidad de una placa de microtitulación.

Los ensayos sobre plagas chupadoras (por ejemplo, áfidos) pueden comprender la separación del material de ensayo del insecto mediante una división, idealmente una porción que pueda ser perforada por la boca chupadora del insecto, para permitir la ingestión de dicho material de ensayo. A menudo el material de ensayo se mezcla con un estimulante de la alimentación, como sucrosa, al efecto de estimular la ingestión del compuesto de ensayo.

Otros tipos de ensayos pueden incluir la microinyección del material de ensayo en la boca, o el intestino de la plaga, así como el desarrollo de plantas transgénicas, seguido por un ensayo de la habilidad de la plaga para alimentarse de ella. El ensayo sobre la planta puede comprender el aislamiento de partes de la planta normalmente consumidas, por ejemplo, pequeñas jaulas fijadas a una hoja, o el aislamiento de las plantas enteras en jaulas que contengan los insectos.

Otros métodos y enfoques para realizar ensayos sobre plagas son conocidos en el arte y pueden encontrarse, por ejemplo, en Robertson, J. L. & H. K. Preisler. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, Boca Ratón, FL. Alternativamente, los ensayos son comúnmente descriptos en las revistas "Arthropod Management Tests" y "Journal of Economic Entomology" o es posible obtener información de los miembros de la Entomological Society of America (ESA).

EJEMPLO 5 Evolución dirigida de AXMI-004 La evolución dirigida fue ejecutada sobre AXMI-004 (SEQ ID NO: ; 14). Se apuntaron para mutagénesis tres bucles en la región de unión del receptor. En una primera etapa, se generaron deleciones de los bucles 1 (que corresponden a los residuos 311-316 de la SEQ ID NO: 14), 2 (que corresponden a los residuos 368-378 de la SEQ ID NO: 14) y 3 (que corresponden a los residuos 434-438 de la SEQ ID NO: 14), se expresaron en Bt51 y se probó su bioactividad. Las deleciones de los bucles 2 y 3 disminuyeron severamente la solubilidad de la proteína, mientras que la deleción del bucle 1 no afectó la solubilidad de la proteína. La variante de deleción del bucle 1 mostró menor toxicidad contra el taladro del maíz europeo (ECB), pero retuvo su actividad contra la polilla dorso de diamante (DMB). A continuación, dentro de estos 3 bucles, se mutagenizaron un total de 23 posiciones. Se generó un conjunto de mutantes puntuales.

El plásmido pAX5485 (His6-axmi004-m2 en pRSFI b) fue utilizado para la expresión de wt axmi-004 y también fue la base para la mutagénesis y la expresión variante. La mutagénesis fue realizada usando el kit de mutagénesis sitio dirigida con luz QUIKCHANGE® (Stratagene), se secuenciaron los mutantes, y se identificaron variantes únicas. Se generó la siguiente diversidad de mutantes puntuales: CUADRO 3 Bucle 1 CUADRO 4 Bucle 2 Posición 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 wl P L Q Q P A P A P P F A A P R D G R G S C A G W S P K R G W G s C T G G S V S A C T T T s T R G L C S S w A w c R W T N P T R c W G R A L E T w D A R S L F T V F V V L R G R Q K V H H N H V I I V V E E K Q E F K V L Y N V L F M D L I L H K D H Y N A D E D V Q E I I D G I Y H E K E H Y R F Q Q Q Q I 1 T K E M M D L E s E M N E I w L N H Y D Y H TOTAL 14 12 12 15 16 18 14 14 16 16 16 CUADRO 5 Bucle 3 Las variantes para el bucle 1 , bucle 2, y bucle 3 fueron agrupados por separado.

Expresión y cribado de bibliotecas: Cribado primario: Las variantes de bibliotecas agrupadas, así como pAX5485 fueron transformadas en células BL21 *DE3 y colocadas en placas en LB+ Kanamicina (100 pg/ml). Las colonias frescas fueron colocadas en 16 mi de medio líquido LB + Kanamicina (100 pg/ml) y cultivadas en 24 bloques de cavidades profundas 37 grados C y 300 rpm hasta alcanzar un OD600 nm de 0.3-0.4. Se agregó IPTG hasta una concentración final de 0.5 mM y los cultivos fueron incubados durante 18 horas más a 20 grados C. Se determinó OD600 nm y las células fueron colectadas por centrifugación (10 minutos a 4500 rpm, 4 grados C). Los pellets de células fueron resuspendidos en 50 mM Carbonato de sodio pH 10.5, 1 mM DTT a una densidad de 10 OD600/ml. Las células fueron rotas por lisis mecánica y los extractos solubles fueron obtenidos luego de una centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos a 4 grados C.

Los extractos fueron sometidos a ensayos de actividad contra ECB, taladro del maíz del sudoeste (SWCB), Heliothis virescens (Hz), oruga de las leguminosas (VBC) y DBM en 4 replicados por variante. Luego de 5 días, los resultados de toxicidad fueron determinados promediando las clasificaciones de los 4 replicados. Se sometieron a ensayo 122 variantes del pool del bucle 1 , 240 variantes del pool del bucle 2 pool, y 121 variantes del pool del bucle 3 pool, respectivamente, en este cribado primario, proporcionando una cobertura de 1.5x de la biblioteca.

Reensayos y Escalado: Se secuenciaron y sometieron a ensayo nuevamente las variantes con los resultados mejorados sobre ECB o SWCB a 4 replicados por variante. Las variantes que nuevamente mostraron una actividad mejorada contra ECB o SWCB fueron seleccionadas para el escalado.

Para los escalados, 3 colonias recién transformadas fueron colocadas en 70 mi LB+Kanamicina (100 g/ml) y cultivadas en frascos agitadores de 0.5 litros a 37 grados C y 150 rpm hasta alcanzar un OD600 nm de 0.3-0.4. Se agregó IPTG hasta una concentración final de 0.5 mM y los cultivos fueron incubados durante 18 horas más a 20 grados C. Se determinó el OD600 nm y las células fueron colectadas por centrifugación (10 minutos a 5000 rpm, 4 grados C). Los pellets de células fueron resuspendidos en 50 mM carbonato de sodio pH10.5, 1 mM DTT a una densidad de 10 OD600/ml. Las células fueron rotas por lisis mecánica y los extractos solubles fueron obtenidos luego de centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos a 4 grados C. Las variantes de Axmi-004 en los extractos fueron cuantificadas en SDS-PAGE marcado con Coomassie comparando las diluciones en serie del extracto contra estándar BSA de concentración conocida. Todas las proteínas variantes sometidas a ensayo se expresaron a niveles muy similares. Las preparaciones escaladas fueron probadas contra ECB, SWCB, VBC, Hz, y DBM a 16 replicados por variante y plaga. Los resultados fueron promediados.

Las siguientes variantes del bucle 2 mostraron una toxicidad mejorada en el cribado primario, reensayo y escalados: CUADRO 6 ECB SWCB Atrofia Porcentaje de Atrofia Porcentaje de mortalidad mortalidad axmi-004 +++ 13% - 6% L21 B11 + 9% + 16% L21 F2 ++ 6% + 14% L23G5 + 9% + 16% L21A5 ++ - - L22H7 ++ L22E7 + L22F7 ++ pRSFI b - - La diversidad de secuencias en las posiciones 370, 373, 376, y listan en el cuadro 7.

Tres variantes de la biblioteca del bucle 1 mostraron una toxicidad mejorada en el ensayo primario y el reensayo (Cuadro 8).

CUADRO 8 Las tres variantes mejoradas son mutadas en la posición 316 de la SEQ ID NO: 14, donde el residuo asparagina fue mutado a valina, prolina, o fenilalanina en los mutantes L1 1 E8, L1 1 F9, y L1 1 H1 1 , respectivamente, lo cual sugiere que la identificación de una posición importante vinculada a actividad mejorada.

Las siguientes variantes de bucle 3 mostraron una toxicidad mejorada en el cribado primario, reensayo de la actividad ECB y en los escalados: CUADRO 9 Las variantes mejoradas son mutadas de lisina en la posición 434 de AXMI004 por treonina y valina en los mutantes L31 B10 y L31A1 1 , respectivamente, y de prolina en la posición 438 de AXMI004 por serina en el mutante L31 H1 1. En una estructura cristalina simulada de estas AXMI004, las cadenas laterales de las posiciones mutadas en los bucles 1 , 2, y 3 van en la misma dirección general. Este descubrimiento sugiere que los aminoácidos en varios bucles pueden contribuir a una interfaz de unión común. Las permutaciones adicionales que incorporan la diversidad mejorada de funcionalidad en varios bucles pueden así generar mejoras adicionales en la actividad.

EJEMPLO 6 Evolución dirigida de AXMI-150 Este ejemplo describe la evolución dirigida de AXMI- 50 (SEQ ID NO: 2). Un bucle en la región de procesamiento putativa ha sido dirigido para mutagénesis.

El plásmido pAX5482 (His6-axmi150 en pRSFI b) fue utilizado para la expresión de wt axmi-150 y también constituyó la base para la mutagénesis y expresión de variantes. La mutagénesis fue realizada usando el kit de mutagénesis sitio dirigida con luz QUIKCHANGE® (Stratagene), se secuenciaron los mutantes, y se identificaron variantes únicas. Se generó la siguiente diversidad de mutantes puntuales: CUADRO 10 Expresión y cribado de bibliotecas: Cribado primario: Las variantes de bibliotecas agrupadas, así como pAX5482 fueron transformadas en células BL21 *DE3 y colocadas en placas en LB+ Kanamicina (100 pg/ml). Las colonias frescas fueron colocadas en 16 mi de medio líquido LB + Kanamicina (100 pg/ml) y cultivadas en 24 bloques de cavidades profundas 37 grados C y 300 rpm hasta alcanzar un OD600 nm de 0.3-0.4. Se agregó IPTG hasta una concentración final de 0.5 mM y los cultivos fueron incubados durante 18 horas más a 20 grados C. Se determinó OD600 nm y las células fueron colectadas por centrifugación (10 minutos a 4500 rpm, 4 grados C). Los pellets de células fueron resuspendidos en 50 mM Carbonato de sodio pH 10.5, 1 mM DTT a una densidad de 10 OD600/ml. Las células fueron rotas por lisis mecánica y los extractos solubles fueron obtenidos luego de una centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos a 4 grados C.

Los extractos fueron sometidos a ensayos de actividad contra ECB, SWCB, Hz, VBC y DBM en 4 replicados por variante. Luego de 5 días, los resultados de toxicidad fueron determinados promediando las clasificaciones de los 4 replicados. Se sometieron a ensayo 119 variantes, proporcionando una cobertura de 1.5x de la biblioteca.

Reensayos v escalado: Se secuenciaron y sometieron a ensayo nuevamente las variantes con los resultados mejorados sobre ECB o SWCB a 4 replicados por variante. Las variantes que nuevamente mostraron una actividad mejorada contra ECB o SWCB fueron seleccionadas para el escalado.

Para los escalados, 3 colonias recién transformadas fueron colocadas en 70 mi LB+Kanamicina (100 pg/ml) y cultivadas en frascos agitadores de 0.5 litros a 37 grados C y 150 rpm hasta alcanzar un OD600 nm de 0.3-0.4. Se agregó IPTG hasta una concentración final de 0.5 mM y los cultivos fueron incubados durante 18 horas más a 20 grados C. Se determinó el OD600 nm y las células fueron colectadas por centrifugación (10 minutos a 5000 rpm, 4 grados C). Los pellets de células fueron resuspendidos en 50 mM carbonato de sodio pH10.5, 1 mM DTT a una densidad de 10 OD600/ml. Las células fueron rotas por lisis mecánica y los extractos solubles fueron obtenidos luego de centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos a 4 grados C. Las variantes de Axmi-150 en los extractos fueron cuantificadas en SDS-PAGE marcado con Coomassie comparando las diluciones en serie del extracto contra estándar BSA de concentración conocida. Todas las proteínas variantes sometidas a ensayo se expresaron a niveles muy similares.

Las preparaciones escaladas fueron probadas contra ECB, SWCB, VBC, Hz, y DBM a 16 replicados por variante y plaga. Los resultados fueron promediados y se determinaron las desviaciones estándar.

Las actividades de las variantes que muestran mejoras se indican en las Cuadros 11-13 a continuación.

CUADRO 11 n=16 Actividad contra ECB Actividad contra SWCB Resultado de Mortalidad Resultado de Mortalidad atrofia atrofia AXMI150 + - +++ 25% L11 D3 + - +++ 38% L11 D6 - - +++ 25% L11 B6 + - +++ 16% L1 1 E5 - - +++ 19% pRSFI b - - - - CUADRO 12 CUADRO 13 A continuación se describe la diversidad de secuencias para las variantes mejoradas.

CUADRO 14 116 117 118 119 120 121 122 AXMI150 N N T G S s K L11A6 N N s G s s K L11B5 N N N G s A K L11B6 N N T G s S K L11C10 K N T G s S K L11D1 N N T G G S K L11D10 N N T G Q S K L11D3 N N T K S S K L11F10 N N T G S P K EJEMPLO 7 Vectorización de genes para la expresión en plantas Cada una de las regiones de codificación de los genes de la invención está independientemente conectada con secuencias promotoras y terminadoras adecuadas para la expresión en plantas. Estas secuencias son muy conocidas en el arte y pueden incluir el promotor actina del arroz o el promotor ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor Arabidopsis UBQ3 o el promotor CaMV 35S para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o Pinll. Las técnicas para producir y confirmar las construcciones de promotor - gen - terminador también son muy conocidas en el arte.

En un aspecto de la invención, se diseñan y generan secuencias de ADN sintéticas. Estas secuencias sintéticas tienen secuencias de nucleótidos alteradas con relación a la secuencia de origen, pero codifican proteínas que son esencialmente idénticas á la proteína AXMI-150 de origen (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, o 7).

En otro aspecto de la invención, se contemplan secuencias de ADN sintéticas que codifican proteínas esencialmente idénticas a la proteína AXMI-004 (por ejemplo, SEQ ID NO: 8-12). La proteína AXMI-004 está descripta en la Patente Estadounidense Número 7,355,089 y en la Solicitud de Patente Estadounidense Número 12/209,354, presentada en 12 de Septiembre de 2008 titulada "Synthetic AXMI-004 Delta-endotoxin Genes and Metods for Their Use." En otro aspecto de la invención, se diseñan versiones modificadas de los genes sintéticos de manera que el péptido resultante sea dirigido a un organelo de planta, como el retículo endoplasmático o el apoplasto. Las secuencias de péptidos que dirigen las proteínas de fusión a organelos de la planta son conocidas en el arte. Por ejemplo, la región N-terminal del gen de fosfatasa ácida de Lupín Blanco Lupinus albus (Genbank® ID GM4276838; Miller et al. (2001 ) Plant Physiology 127: 594-606) es conocida en el arte por dirigir al retículo endoplasmático proteínas heterólogas. Si la proteína de fusión resultante además contiene una secuencia de retención endoplasmática que comprende el péptido N-término-lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina (es decir, el motivo "KDEL" (SEQ ID NO: 13) en el C-término, la proteína de fusión será dirigida al retículo endoplasmático. Si la proteína de fusión carece de una secuencia que la dirija al retículo endoplasmático en el C-término, la proteína será dirigida al retículo endoplasmático pero en última instancia quedará secuestrada en el apoplasto.

Por ello, este gen codifica una proteína de fusión que contiene 31 aminoácidos N-terminales del gen de fosfatasa ácida de Lupín Blanco Lupinus albus (Genbank® ID GM4276838; Miller et al. (2001), supra) fusionada al N-término de la secuencia de la invención así como la secuencia KDEL en el C-término. Por ello, se predice que la proteína resultante se dirigirá al retículo endoplasmático de la planta al expresarse en una célula de planta.

Los cassettes de expresión en plantas antes descriptos se combinan con un marcador seleccionable de planta adecuado para ayudar a la selección de las células transformadas, y tejidos, y se ligan a los vectores de transformación de plantas. Estos pueden incluir vectores binarios de la transformación mediada por Agrobacterium o vectores de plásmidos simples para transformación por aerosol o biolística.

EJEMPLO 8 Vectorización de genes para la expresión en plantas El ADN de la región de codificación de los genes de la presente está operativamente conectado con secuencias promotoras y terminadoras adecuadas para la expresión en plantas. Estas secuencias son muy conocidas en el arte y pueden incluir el promotor actina del arroz o el promotor ubiquitina del maíz para la expresión en monocotiledóneas, el promotor Arabidopsis UBQ3 o el promotor CaMV 35S para la expresión en dicotiledóneas, y los terminadores nos o Pinll. Las técnicas para producir y confirmar las construcciones de promotor - gen - terminador también son muy conocidas en el arte.

Los cassettes de expresión en plantas antes descriptos se combinan con un marcador seleccionable de planta adecuado para ayudar a las selecciones de las células transformadas y tejidos, y se ligan a los vectores de transformación de plantas. Estos pueden incluir vectores binarios de la transformación mediada por Agrobacterium o vectores de plásmidos simples para transformación por aerosol o biolística.

EJEMPLO 9 Transformación de células de maíz con los genes de proteínas pesticidas descriptos en la presente Las espigas de maíz se recogen mejor luego de 8-12 días de la polinización. Los embriones son aislados de las espigas, y aquellos embriones de 0.8-1.5 mm de tamaño son usados para la transformación. Los embriones son colocados en placas con el escutelo hacia arriba sobre un medio de incubación adecuado, como DN62A5S (3.98 g/L N6 Sales; 1 mL/L (de 1000x Madre) N6 Vitaminas; 800 mg/L L-Asparagina; 100 mg/L Mio-inositol; 1 .4 g/L L-Prolina; 100 mg/L Casaminoácidos; 50 g/L sucrosa; 1 mL/L (de 1 mg/mL Madre) 2,4-D). Sin embargo otros medios y sales además de DN62A5S resultan adecuados y se conocen en el arte. Los embriones son incubados durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche.

Los explantos resultantes son transferidos a cuadrados de malla (30-40 por placa), transferidos sobre medio osmótico por espacio de 30-45 minutes, luego transferidos a una placa de "radiculación" (consultar, por ejemplo, Publicación por el PCT Nro. WO/0138514 y la Patente Estadounidense Número 5, 240,842).

Las construcciones de ADN diseñadas para expresar los genes de la invención en tejidos de planta son acelerados en el tejido vegetal usando un acelerador con haz en aerosol, usando las condiciones esencialmente descriptas en la Publicación por el PCT Nro. WO/0138514. Luego del tratamiento, los embriones son incubados por espacio de 30 minutos en medio osmótico, luego colocados sobre medio de incubación durante la noche a 25°C en la oscuridad. Para evitar daños indebidos en los explantos, son incubados por espacio de por lo menos 24 horas antes de la transferencia al medio de recuperación. Los embriones luego son diseminados en medio de período de recuperación, por espacio de 5 días, 25°C en la oscuridad, posteriormente transferidos a un medio de selección. Los explantos son incubados en medio de selección durante hasta ocho semanas, de acuerdo a la naturaleza y características de la selección en particular utilizada. Luego del período de selección, el callo resultante es transferido a medio de maduración de embriones, hasta observar la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes luego son colocados bajo luz baja, y el proceso de regeneración es iniciado según se conoce en el arte. Los brotes resultantes se dejan echar raíz en medio de radiculación, y las plantas resultantes son transferidas a macetas para viveros y propagadas como plantas transgénicas.

Materiales Medio DN62A5S Se ajusta el pH de la solución a 5.8 con 1 N KOH/1 N KCI, se agrega Gelrite (Sigma) a 3g/L, y se coloca en autoclave. Luego de enfriar a 50°C, se agregan 2 ml/L de una solución madre de 5 mg/ml de Nitrato de Plata (Phytotechnology Labs).

EJEMPLO 10 Transformación de los genes de la invención en Células de Planta por transformación mediada por Aprobacterium Las espigas de maíz se recogen mejor luego de 8-12 días de la polinización. Los embriones son aislados de las espigas, y aquellos embriones de 0.8-1.5 mm de tamaño son preferidos para la transformación. Los embriones son colocados en placas con el escutelo hacia arriba sobre un medio de incubación adecuado, e incubados durante la noche a 25°C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche. Los embriones son puestos en contacto con una cepa de Agrobacteríum conteniendo los vectores adecuados para transferencia mediada por plásmido Ti por espacio de aproximadamente 5-10 min, y luego colocados en placas sobre medio de co-cultivo durante aproximadamente 3 días (25°C en la oscuridad). Luego del co-cultivo, los explantos son transferidos a medio de periodo de recuperación por espacio de cinco días (a 25°C en la oscuridad). Los explantos son incubados en medio de selección por espacio de hasta ocho semanas, de acuerdo a la naturaleza y características de la selección en particular utilizada. Luego del período de selección, el callo resultante es transferido a medio de maduración de embriones, hasta observar la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes luego son colocados bajo luz baja, y el proceso de regeneración es iniciado según se conoce en el arte.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria son indicativas del nivel de la técnica al cual la presente invención pertenece.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan a la presente como referencia como si cada una de ellas fuese específica e individualmente indicada como incorporada en calidad de referencia.

No obstante la invención precedente ha sido descripta con cierto nivel de detalle a modo ilustrativo y de ejemplo al efecto de permitir un mejor entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden llevarse a la práctica dentro del alcance de las reivindicaciones que se acompañan.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que posee actividad pesticida, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo integrado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 1 , 8, 9, 10, 1 1 , o 12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la seeuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y c) una secuencia de nueleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee como mínimo 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

2.- La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para expresarse en una planta.

3. - La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha secuencia está establecida en la SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, o 7.

4. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. - El vector de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

6. - Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 4.

7. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 6 caracterizada además porque es una célula huésped bacteriana.

8. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 6 caracterizada además porque es una célula de planta.

9.- Una planta transgénica que comprende la célula huésped de la reivindicación 8.

10. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque es seleccionada del grupo integrado por maíz, sorgo, trigo, col, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papa, algodón, arroz, soja, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza.

1 1. - Una semilla transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

12. - Un polipéptido aislado con actividad pesticida, que es seleccionado del grupo integrado por: a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee como mínimo 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y c) un polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 1.

13. - El polipéptido de conformidad con la reivindicación 12 caracterizado además porque comprende además secuencias de aminoácidos heterólogas.

14. - Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 12.

15. - La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha composición es seleccionada del grupo integrado por un polvo, harina, pellet, gránulo, spray, emulsión, coloide y solución.

16.- La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque se prepara por desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células bacterianas.

17. - La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque comprende aproximadamente entre 1% y aproximadamente 99% en peso de dicho polipéptido.

18. - Un método de control de una población de una plaga de lepidópteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida de un polipéptido de la reivindicación 2.

19. - Un método para eliminar una plaga de lepidópteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros que comprende poner en contacto dicha plaga, o alimentarla con una cantidad efectiva desde el punto de vista pesticida de un polipéptido de la reivindicación 12.

20.- Un método de producción de un polipéptido con actividad pesticida, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 bajo condiciones en las cuales se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

21 - Una planta que posee establemente incorporada a su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína con actividad pesticida, dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo integrado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 1 , 8, 9, 10, 1 , o 12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee como mínimo 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; en tanto dicha secuencia de nucleótidos está operativamente unida a un promotor que impulsa la expresión de una secuencia de codificación en una célula de planta.

22. - La planta de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque es una célula de planta.

23. - Un método de protección de una planta contra una plaga, que comprende introducir en dicha planta o célula deja misma al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido pesticida, dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo integrado por: a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 1 , 8, 9, 10, 11 , o 12; b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que posee como mínimo 95% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha planta produce un polipéptido pesticida que posee actividad pesticida contra plagas de lepidópteros, coleópteros, nemátodos, o dípteros.