MX2011006255A - Preparaciones a base de fibrinogeno y polisacaridos sulfatados. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una preparación que comprende fibrinógeno y un polisacárido sulfatado como una composición de un componente o como un equipo que comprende el fibrinógeno y el polisacárido sulfatado como componentes separados. La presente invención además proporciona una estructura de tipo coágulo de fibrina que se puede obtener a través de un procedimiento definido, un parche hemostático, un sistema de jeringa de dos componentes y varios usos de las preparaciones descritas, estructura de tipo coágulo de fibrina y parches.

Description

PREPARACION ES A BASE DE FIBRI NOGENO Y POLISACARI DQS SULFATADOS Campo de la i nvención La invención se refiere a preparaciones comprendiendo fi brinógeno y un polisacárido sulfatado, estructuras tipo coágulo de fi brina obtenidas de las mismas, parches hemostáticos y métodos para usar los mismos.

Antecedentes de la invención Adhesivos de tejido basados en fibrinógeno son empleados para unión de soporte con costura y/o si n costura de tejido humano o animal o partes de órganos, para sellado de heridas, hemostasis y promoción de curación de heridas. Su modo de acción se basa en el hecho de que el fibrinógeno (soluble) contenido en un adhesivo de tej ido líquido, listo para usar, es convertido mediante trombina en fibrina (insoluble). El factor XI I I también puede ser incluido en el adhesivo de tejido l íquido, donde es activado al Factor 111 a , mediante la acción de trombina . Esto retícula la fibrina formada para formar un pol ímero de alto MW, el cual puede mejorar la efectividad del adhesivo de tejido. La actividad de trombi na requerida puede originarse ya sea desde el tejido (la superficie de herida) a ser adherida o puede adicionarse en la forma de una trombina y solución conteniendo ión de Ca2+ al adhesivo de tejido en el curso del sellado. Los adhesivos de tejido basados en fibrinógeno son conocidos de AT-B-359 653, AT-B-359 652 y AT-B-369 990. Además del fi brinógeno y Factor XI I I tam bién pueden contener proteínas adicionales, tales como fibronectina y albúmina y opcional mente agentes anti bióticos. US5,962 ,405 (Seelich; I mmuno AG) describe preparaciones de fibrinógeno estables en al macenamiento en forma liofi l izada o una forma que resulta de preparaciones líquidas de congelación profunda (congeladas profu ndas) , las cuales pueden ser reconstituidas y licuadas rápidamente y en u na manera simple para formar soluciones adhesivas de tejido y/o fibrinógeno listas para usar. Tales preparaciones son comercializadas como Tisseel® Fibri n Sealant por Baxter Healtcare Corporation (CA, US) .

Los parches hemostáticos, tales como aquél los hechos de colágeno, pueden usarse para sellar tej ido y controlar el sangrado en una variedad de procedimientos quirúrgicos. Pueden usarse con un recubri miento de adhesivo de tejido , tal como pegamento de fibrina . De manera alternativa, los parches hemostáticos hechos a partir de una esponja de colágeno recubierta con trombina y fibrinógeno están disponibles, tales como TachoComb® o TachsoSil® (Nycomed) .

Los selladores de fibrina y parches hemostáticos permiten la hemostasis segura , buena adherencia del sello a la herida y/o áreas de tejido, alta fuerza de las adhesiones y/o sellado de herida, resorbabilidad completa del adhesivo en el curso del proceso de curación de herida , y pueden tener propiedades promotoras de curación de heridas. No obstante, usualmente es necesario sostener partes de tejido selladas en la posición deseada por varios mi nutos para asegurar que el arreglo de sellador de fibrina se adhiera firmemente al tejido circundante. Los compuestos que mejoran la formación de coágulo de fibrina y/o que fortalecen la estructura de coágulo de fi brina mejoran los selladores de fibrina y parches hemostáticos. Por ejemplo, un coágulo fortalecido sería menos propenso a la fibri nólisis y sería más estable y más duradero.

El listado o discusión de un documento publicado previo en esta especificación no sería tomada como u n reconoci miento de que el documento es pa rte del estado de la técnica o es conocimiento general común.

Breve descripción de la invención En un primer aspecto, la presente invención proporciona una preparación que comprende fibrinógeno y un polisacárido sulfatado como una composición de un componente o como un conj unto de partes comprendiendo fi brinógeno y polisacárido sulfatado como componentes separados.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una estructura ti po coágulo de fibrina obtenible mediante un proceso que comprende los pasos de (a) proporcionar una preparación de la presente invención como una solución, (b) proporcionar una solución conteniendo catión como un componente separado, conteniendo opcionalmente trombina, o como una solución junto con el componente de pol isacárido sulfatado de la presente invención , conteniendo opcionalmente trombina , (c) opcionalmente proporcionar una solución de trombi na , y (d) mezclar (a) y (b) y opcionalmente (c) ya sea de manera simultánea o subsecuente en cualquier orden de manera que una estructura ti po coágulo de fibrina es obtenida.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un parche hemostático que comprende ( 1 ) un portador, y (2) al menos un agente hemostático, el cual es un polisacárido sulfatado, en donde si el portador es un polisacárido sulfatado , no es el mismo polisacárido sulfatado que el agente hemostático.

En un cuarto aspecto, la presente i nvención proporciona un sistema de jeringa de dos componentes que comprende YA SEA (a) la composición de un componente de la reivindicación 1 en el primer barril , y (b) una preparación conteniendo catión , opcionalmente junto con trombina, en el segundo barril; O (a') el polisacárido sulfatado separado de la reivindicación 1 y una preparación conteniendo catión , opcionalmente j unto con trombina en el primer barril , y (b') una preparación de fibrinógeno en el segundo barril .

En un quinto aspecto , la presente invención proporciona el uso de una preparación de la presente invención, una estructura tipo coágulo de fibrina de la presente invención o un parche de la presente invención para intensificar la hemostasis.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una preparación de la presente invención , u na estructura tipo coágulo de fi brina de la presente i nvención o un parche de la presente invención para curación de heridas.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona el uso de una preparación de la presente invención, una estructura tipo coágulo de fibrina de la presente invención o un parche de la presente invención para usarse como un sistema de entrega de medicamento.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para sellar tejido o pegar tejido que comprende apl icar en una superficie de herida una preparación de la presente i nvención, una estructu ra tipo coagulo de fibrina de la presente invención o un parche de la presente invención .

Descri pción detallada de modal idades preferidas de la i nvención En un primer aspecto, la presente invención proporciona una preparación que comprende fibrinógeno y un pol isacárido sulfatado como una com posición de un componente o como un kit de partes comprendiendo fi brinógeno y polisacárido su lfatado como componentes separados.

Las preparaciones de fibrinógeno son bien conocidas en la técnica anterior. Normal mente, la preparación de fi brinógeno es una preparación liofilizada o una solución congelada . Las preparaciones adecuadas pueden hacerse como se describe en US 5 , 962 ,405, la cual describe substancias para aumentar la sol ubi lidad del fi brinógeno, bajar la temperatura de licuefacción de fibrinógeno congelado profundo concentrado y/o soluciones de adhesivo de tejido así como su viscosidad a temperatura ambiente. Tales substancias incluyen benceno, piridina, piperidina, pirimidina, morfolina, pirrol, imidazol, pirazol, furano, tiazol, compuestos de purina o vitaminas, bases nucleicas, nucleósidos o nucleótidos, de preferencia en la cantidad de 0.03 mmol a 3 mmol, muy preferiblemente en una cantidad de 0.07 mmol a 1.4 mmol, por g de fibrinógeno. Entre estas substancias se encuentran, por ejemplo, ácido benzoico, ácido p-aminobenzoico (vitamina I ), ácido p-aminosalicílico, ácido hidroxibenzoico, fenilalanina hidroxisalicílica, procaína, niacina, niacinamida, ácido picolínico, vitamina B6 (piridoxina), hidroxipiridinas, ácido piridin dicarboxílico, ácido piridin sulfónico, éster de ácido piperidin carboxílico, pirimidina, ácido barbitúrico, uracilo, uridina, fosfato de uridina, timina, citosina, citidina, hidroxipirimidina, tiamina (vitamina B^, morfolina, pirrolidona, imidazol, histidina, hidantoína, ácido pirazol dicarboxílico, fenazona, adenosina, fosfato de adenosina, inosina, fosfato de guanosina, ácido a-furoico (ácido furan-2-carboxílico), ácido ascórbico (vitamina C) y xantosina. Substancias particularmente preferidas son histidina y niacinamida. Otros componentes, los cuales son de utilidad en la solución de adhesivo de tejido, tal como aquéllos discutidos en relación al primer aspecto de la invención, pueden incluirse en la preparación de fibrinógeno.

Si la preparación de fibrinógeno es liofilizada, debe ser reconstituida. Esto es logrado normalmente al adicionar agua, normalmente agua para inyección, o una solución. La solución puede proporcionar solutos útiles, tal como aprotinina, la cual es un inhibidor de fibrinólisis. El calentamiento y/o agitación o mezclado pueden aplicarse para mejorar la reconstitución de la solución de adhesivo de tejido. Donde la preparación de fibrinógeno es congelada, es normal calentar la preparación para descongelada, sobre lo cual se vuelve la solución de adhesivo de tejido. Sin embargo, material adicional puede agregarse a la preparación de fibrinógeno durante o después de la descongelación.

Soluciones de fibrinógeno adecuadas y métodos para hacer las mismas se describen en US 5,962,405. Las soluciones de fibrinógeno fáciles de usar contienen generalmente 60-1 20 mg de fibrinógeno por mi. El componente de fibrinógeno puede contener además opcionalmente Factor XII I , y opcionalmente fibronectina o pequeñas cantidades de plasminógeno, las cuales pueden ser ventajosas en el curso de curación de heridas. Un inhibidor de activador de plasminógeno e inhibidor de plasmina también pueden ser incluidos opcionalmente, tal como aprotinina, inhibidor de a2-plasmina, <x2-macroglobulina y similares. En general, estos componentes son incluidos opcionalmente en la solución de fibrinógeno. Las soluciones de fibrinógeno generalmente no contienen iones de calcio libres, ya que estos pudieran provocar activación de trazas residuales de protrombina y de ahí coagulación prematura, no deseada. Normalmente, un agente quelante de calcio es incluido en soluciones de adhesivo de tejido para formar complejo con iones de calcio residuales. De manera adecuada, el citrato es incluido como un agente en la forma de una sal fisiológicamente aceptable, tal como citrato trisódico. De acuerdo con esto, la solución de fibrinógeno lista para usarse generalmente contiene 70-120 mg de fibrinógeno, opcionalmente 0.5-50 U de, Factor XIII, opcionalmente 0.5 a 15 mg de fibronectina, 0 a 150 pg de plasminógeno y 0 a 20,000 KIU de aprotinina, de preferencia 1,000 hasta 15,000 KIU de aprotinina, por mi. Una solución de adhesivo de tejido ejemplar es la solución de proteína selladora del sellador de fibrina Tisseel® (Baxter Healthcare Corporation, CA), que comprende 67-106 mg/ml de fibrinógeno humano, 2250-3750 KlU/ml de inhibidor de fibrinólisis de aprotinina, albúmina humana, 25 mmol/l de citrato trisódico, histidina, niacinamida, polisorbato 80 y agua para inyección.

El término "polisacárido", como se usa en la presente, se refiere a un polímero que comprende una pluralidad (es decir, dos o más) de residuos de sacáridos covalentemente enlazados. Los enlaces pueden ser naturales o no naturales. Los enlaces naturales incluyen, por ejemplo, enlaces glicosídicos, mientras que los enlaces no naturales pueden incluir, por ejemplo, porciones de enlace de éster, amida u oxima. Los polisacáridos pueden tener cualquiera de un amplio rango de valores de peso molecular promedio (MW), pero generalmente son de al menos aproximadamente 300 daltones. Por ejemplo, los polisacáridos pueden tener pesos moleculares de al menos aproximadamente 500, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10,000, 20,000, 30,000, 50,000, 100,000, 500,000 daltones o incluso mayores. El peso molecular de un polisacárido puede ser determinado mediante cromatografía de exclusión de tamaño de alto rendimiento. Los polisacáridos pueden tener estructuras de cadena lineal o ramificada. Los polisacáridos pueden incluir fragmentos de polisacáridos generados mediante degradación (por ejemplo, hidrólisis) de polisacáridos más grandes. La degradación puede ser lograda mediante cualquiera de una variedad de medios conocidos para aquéllos expertos en la técnica, incluyendo tratamiento de polisacáridos con ácido, base, calor o enzimas para producir polisacáridos degradados. Los polisacáridos pueden ser alterados químicamente y pueden tener modificaciones, incluyendo pero no limitando a, sulfatación, polisulfatación, esterificación y metilación.

En principio, cualquier grupo hidroxilo libre sobre un componente de monosacárido de un polisacárido puede ser modificado mediante sulfatación para producir un polisacárido sulfatado para uso potencial en la práctica de la invención. Por ejemplo, tales polisacáridos sulfatados pueden incluir sin limitación mucopolisacáridos sulfatados (residuos de D-glucosamina y ácido D-glucurónico), curdlan (carboximetil éter, sulfato de hidrógeno, curdlan carboximetilado) (Sgima-Aldrich), esquizofilano sulfatado (Itoh et al. (1990) Int. J. Immunopharmacol. 12:225-223; Hirata et al., (1994) Pharm. Bull. 17:739-741), glicosaminoglicanos sulfatados, complejo polisacárido-peptidoglicano sulfatado, malto-oligosacárido de alquilo sulfatado (Katsuraya et al. (1994) Carbohydr Res. 260:51-61), sulfato de amilopectina, N-acetil-heparina (NAH) (Sigma-Aldrich), heparina N-acetil-de-O-sulfatada (NA-de-o-SH) (Sigma-Aldrich), heparina de-N-sulfatada (De-NSH) (Sigma-Aldrich) y heparina De-N-sulfatada-acetilada (De-NSAH) (Sigma-Aldrich).

Como una clase, los polisacáridos sulfatados son caracterizados por una plétora de actividades biológicas con perfiles de tolerabilidad frecuentemente favorables en animales y humanos. Estas moléculas polianiónicas son derivadas frecuentemente de tejidos de plantas y animales y abarcan un amplio rango de subclases incluyendo heparinas, glicosaminoglicanos, fucoidanos, carrageninas, polisulfatos de pentosano y sulfatos de dermatano o dextrano (TOida et al., (2003) Trends in Glycoscience and Glycotechnology (Tendencias en glicociencia y glicotecnología) 15:29-46). Polisacáridos sulfatados químicamente sintetizados, menos heterogéneos y de menor peso molecular han sido reportados y se han alcanzado varias etapas de desarrollo de medicamento (Sinay (1999) Nature 398:377-378; Orgueira et al., (2003) Chemistry 9:140-169; Williams et al., (1998) Gen. Pharmacol. 30:337-341).

De manera adecuada, la preparación comprende 0.01 pg a 5000 pg de polisacárido sulfatado por cada mg de fibrinógeno. Normalmente, la preparación comprende 0.01, 0.02, 0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 o 300 pg de polisacárido sulfatado para cada mg de fibrinógeno.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una estructura tipo coágulo de fibrina obtenible mediante un proceso que comprende los pasos de (a) proporcionar una preparación de la presente invención como una solución, (b) proporcionar una solución conteniendo catión como un componente separado, conteniendo opcional mente trombina, o como una solución junto con el componente de pol isacárido sulfatado de la presente invención , opcionalmente conteniendo trombi na , (b) proporcionar u na solución conteniendo catión como un componente separado, conteniendo opcionalmente trombina, o como una solución junto con el componente de pol isacárido sulfatado de la presente invención , conteniendo opcionalmente trombina, (c) opcionalmente proporcionar una solución de trombi na, y (b) mezclar (a) y (b) y opcionalmente (c) ya sea de manera simultánea o su bsecuente en cualquier orden de manera que una estructura tipo coágu lo de fibrina es obtenida.

El catión es al menos divalente, de preferencia del grupo que consiste de calcio, magnesio, bario y estroncio, el más preferido calcio, por ejemplo, CaCI2.

Una estructura tipo coágulo de fibrina puede ser obtenida al mezclar (de manera simultánea o subsecuente en cualquier orden), una solución de fibrinógeno, una sol ución de polisacárido su lfatada , una solución conteniendo catión , por ejemplo, ión de calcio, opcionalmente j unto con una solución de trombina de manera que se forma una estructura tipo coágulo de fibri na .

U na estructura como coág ulo de fi bri na tam bién puede obtenerse al mezclar (de manera simultánea o subsecuente en cualquier orden) un fibrinógeno y solución conteniendo polisacárido sulfatado, una solución conteniendo catión , por ejemplo, ión de calcio, opcionalmente junto con una solución de trombina de manera que se forma una estructura tipo coágulo de fibrina.

La trombina puede ser provista como una preparación liofilizada o una solución congelada . Una preparación l iofi lizada puede ser reconstituida al adicionar agua o una solución , con o si n calentamiento y/o agitación/mezclado. Normalmente, iones de calcio en l a forma de una sal fisiológ icamente aceptable son i ncluidos en el liofilizado, o incluidos en la solución usada para reconstituir la preparación de trombina. Una solución congelada es descongelada normalmente para proporcionar la solución de trombina, aunque substancias adicionales tales como CaCI2 pueden adicionarse durante o después de la descongelación.

Normalmente, la solución de trombina comprende iones de calcio, adecuadamente CaCI2, de preferencia a una concentración de 36-44 µ ??? ?/ml .

La solución de trombina conteniendo la actividad de trombina requerida puede origi narse del tejido (superficie de herida) a ser sellada o puede ser adicionada exógenamente. Soluciones de trombina exógenas adecuadas son conocidas en la técnica. La concentración de trombina óptima de una solución de trombina usada para formar un sellador de fibrina depende de la indicación cl ínica, pero normalmente varía desde 1 hasta 1 000 l U/ml . La actividad de trombina de una solución conteniendo trombina es hoy en día comparada contra el segundo estándar internacional , que tiene por definición 1 1 0 I U/ampolleta (Whitton et ao. , Th rom b Haemost 2005; 93:261 -6). Varios ensayos para analizar la actividad de trombina están disponibles, incluyendo pruebas cromogénicas y basadas en coagulación (Gaffney y Edgell, Thromb Haemost 1 995; 74:900-3) . Con el fin de lograr una hemostasis rápida, altas concentraciones de trombina que conducen a coagulación prácticamente instantánea son usadas. Ejemplos son la solución de trombina del sellador de fibrina Tisseel® (Baxter Healthcare Corporation , CA) , que comprende 400-625 l U/ml de trombina humana y la sol ución de trombi na de Quixil® y sellador de fibrina Evicel® (Omrix) con 1 000 l U/ml de actividad de trombi na humana. Si la intención es usar el sellador de fi bri na como un pegamento (por ejemplo , en cirug ía cosmética o reconstructiva) , se usan concentraciones de trombina menores con el fin de permitir al cirujano más tiempo para manipulaciones antes de que ocurra la coag ulación. Para tales indicaciones, una variante de sellador de fi brina conteniendo 4 l U/ml de trombina está en el mercado en muchos países. Los senadores de fibrina con concentraciones de trombina mucho menores (menores que 1 I U/ml) no han sido prácticas en el pasado, debido a que el tiempo de coagulación sería demasiado largo. Si n embargo, donde un polisacárido sulfatado es incl uido de acuerdo con el pri mer aspecto de la i nvención , puede ser practica ble usar una solución de trombina teniendo una baja concentración de trombina, tal como 1 IU/ml . Las sol uciones de trombina y métodos para hacer las mismas se describen en US 5,714,370 (Eibl y Linnau; I mmuno AG) . En el método del primer aspecto de la invención, los iones de calcio son normalmente provistos en la solución de trombina . Los iones de calcio son provistos normalmente como CaCI2, pero otras sales de calcio sol u bles y fisiológicamente compatibles, tales como lactato de calcio y/o gluconato de calcio podrían ser usados a demás de o como una alternativa a CaCI2. La concentración de calcio en la solución de trombina es normalmente aproximadamente 40 mM . Por ejemplo, el sellador de fibrina Tisseel® (Baxter Healthcare Corporation, CA) contiene 36-44 mM de CaCI. Las sol uciones de trombina y soluciones de adhesivo de tejido son normalmente calentadas antes de mezclarse, normalmente a 37°C.

Una preparación de la presente invención puede usarse como una preparación tópica. Por "preparación tópica" se quiere deci r que una estructura tipo coágulo de fibri na es formada en un sitio pa rticular en un sujeto, normalmente una superficie de herida o tejido . Para lograr esto, ya sea una solución comprendiendo fibrinógeno y polisacárido sulfatado en la presencia de un catión , por ejemplo, calcio, y opcionalmente una sol ución de trombina se mezclan en el sitio tópico, o se mezclan externamente y entonces se introducen al sitio tópico antes de que la formación de coágulo se complete. Un ejemplo de lo último es cuando el coágulo de fibri na es usado como un pegamento para adherir un material como lámina de auto-soporte de fibrina reticulada a un sitio para prevenir o red uci r la formación de adhesiones post-quirúrgicas, como en WO 96/221 1 5 (Baxter I nternational Healthcare, I L) . El coágulo no debe formarse completamente antes de que el material tipo lámina sea introducido al sitio tópico, o el material no se adheri rá al sitio. Un coágulo formado in situ mediante el método del primer aspecto de la invención pudiera ser usado como auxiliar a hemostasis en cirugías i nvolucrando derivación cardiopulmonar y tratamiento de lesiones de bazo debido a trauma penetrante o embotado al abdomen , o como un auxiliar en el cierre de una colostom ía.

La estructura tipo coágulo de fibrina puede ser usada, por ejemplo, como un substrato para el cultivo de cél ulas adherentes, en particular células de mam ífero , para i ntensificar hemostasis o para pegado o sellado de tejido.

En un tercer aspecto, la presente invenci ón proporciona un parche hemostático que comprende (1 ) un portador, y (2) al menos un agente hemostático, el cual es un polisacárido sulfatado, en donde, si el portador es un polisacárido sulfatado, no es el mismo polisacárido sulfatado como el agente hemostático.

El portador es un material biocompatible, tal como, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de colágeno, gelati na , fibri nógeno, fibrina y un polisacárido, o derivados o mezclas de los mismos. De preferencia, colágeno o un derivado del mismo es usado.

Los polisacáridos incluyen por ejemplo, celulosa y derivados de los mismos, tal como por ejemplo, metilcelulosa , carboximetilcelulosa , celulosa oxidada , quitina , quitosán, condroitina, ácido hialurónico, almidón , etc.

El término "derivado" incluye substancias las cuales son qu í mica o físicamente, por ejemplo, mediante tratamiento de calor, modificado.

De preferencia , el pol isacárido sulfatado está presente en una cantidad desde 20 ng hasta 3 mg por cada cm2 de superficie activa del parche hemostático.

E l pol isacárido sulfatado puede estar presente en una superficie activa del parche hemostático o es distribuido dentro de una matriz del parche hemostático.

El parche puede comprender además trombina y fibrinógeno en una superficie activa del parche hemostático.

Por "parche hemostático" quiere deci r u n portador que comprende opcionalmente uno o más agentes hemostáticos el cual, cuando es aplicado a la superficie de una herida , promueve la hemostasis. De acuerdo con la presente invención , el parche hemostático comprende u n agente hemostático, el cual es un polisacárido sulfatado. Por "agente hemostático" quiere deci r un agente, el cual puede promover la hemostasis, por ejemplo, un agente antifibri nolítico, o agente promotor de coágulo. El portador es normalmente sólido , pero alternativamente puede ser un gel . Portadores adecuados son descritos en US 6, 733, 774 B2 (Stimmeder; Nycomed Pharma S) y US 7, 399,483 B2 (Stimmeder; Nycomed Pharma AS) e incl uir esponjas de colágeno, y portadores hechos a partir de un pol ímero biodegradable tal como ácido polihialurónico, ácido polihidroxi , por ejem plo, ácido láctico, ácido glucólico , ácido hidroxibutanoico, una cel ulosa o gelatina . Tales portadores son normalmente flexibles, tienen una densidad de 1 -1 0 mg/cm3 y tienen u n módulo de elasticidad de 5-1 00 N/cm2. Los portadores particularmente preferidos son degradados enzi máticamente dentro de aproximadamente 4 a 6 meses después de la aplicación, evitando la necesidad de remoción quirúrgica . Normalmente, el portador está en la forma de una fibra, incluyendo microfibras, un género, una espuma o un gel. El portador puede ser un polisacárido sulfatado, tal como celulosa sulfatada. Sin embargo, puede ser el mismo polisacárido sulfatado que el agente hemostático, el cual es un polisacárido sulfatado. De manera adecuada, de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención, si el portador comprende un polisacárido sulfatado, no es el mismo polisacárido sulfatado que el agente hemostático.

La preparación de un portador recubierto puede consistir esencialmente de la preparación de una suspensión de los ingredientes activos, distribución uniforme de la suspensión sobre el portador, secado del portador recubierto a una composición sólida o gel/fijacíón de los ingredientes activos al portador. La suspensión comprende normalmente partículas teniendo un diámetro promedio de 25-100 µp?. Las suspensiones de polisacáridos sulfatados son preparadas normalmente en solventes orgánicos. Un método para distribuir uniformemente una suspensión sobre un portador se describe en US 5,942,278 (Hagedorn et al., Nycomed Arzneimittel GmbH, DE). Un método para recubrir un portador con fibrinógeno y trombina se describe en US 6,733,774 B2. Estos métodos podrían ser adaptados fácilmente por la persona experta para obtener un parche hemostático comprendiendo un polisacárido sulfatado.

De manera alternativa, el enlace covalente de polisacáridos sulfatados a las fibras de un parche hemostático, tal como una hoja de celulosa oxidada, puede ser realizado. Medios para realizar este enlace covalente son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, US 204/0101546 (Gorman y Pendharkar) describe el enlace covalente de agentes hemostáticos a un parche de cel ulosa modificado con aldehido, oxidado.

Como una alternativa, o además del recubrimiento superficial del parche hemostático, el pol isacárido sulfatado puede ser distribuido a través del pa rche hemostático. Por ejemplo, un portador sól ido puede ser remojado en una solución del polisacárido sulfatado y subsecuentemente secado. De manera alternativa, una solución o suspensión del polisacárido sulfatado podría combi narse con una solución de un monómero , el cual es polimerizado entonces para formar el portador sólido con el polisacárido su lfatado distribuido uniformemente a través. Por ejemplo, u n pol isacárido su lfatado podría ser disuelto j unto con colágeno solu ble en ácido a pH 2-3. Sobre la neutralización , un gel de colágeno hecho de una red de fibras de colágeno, conteniendo el polisacárido sulfatado en la fase l íquida del gel, es formado. Después de secar por congelación el gel de colágeno, se obtiene un parche hemostático comprendiendo u n cojín de colágeno esponjoso conteniendo polisacáridos sulfatados distribuidos uniformemente dentro del coj ín . La preparación de monómero de colágeno soluble en ácido y su precipitación a pH neural y liofilización se describen en US 6, 773,699 (Tissue Adhesive Technologies, I Nc) . Las membranas de colágeno son revisadas en Bunyaratavej P y Wang H L (2001 ) J . Periodontol . 72:21 5-29.

U n portador alternativo es el material tipo hoja de auto-soporte de fibrina reticulada descrito en W096/221 1 5 (Delmotte y Krack; axter I nternational Healthcare, I L) . Normalmente, tal portador es usado como una barrera bio-mecánica en el tratamiento de lesiones traumáticas internas, en particu lar para la prevención de formación de ad hesión como una complicación post-operatoria. Cuando el portador contiene un polisacárido sulfatado de acuerdo con el noveno aspecto de la i nvención , puede tener propiedades hemostáticas.

La presencia del pol isacárido sulfatado aumenta la efectividad del parche hemostático en hemostasis. Como se describe en la presente, los polisacáridos su lfatados promueven la generación de fi brina , y sí puede promover la formación de coágulos en una superficie de herida. El fibrinógeno y trombina pueden estar disponibles en la superficie de herida, o pueden ser adicionados de manera exógena . De manera adecuada, el polisacárido sulfatado está presente en una cantidad que afecta la formación de un coágulo de fibrina al promover la generación de fibrina mediada por trombina. El parche hemostático es más efectivo para promover la hemostasis que un parche hemostático que carece del polisacárido sulfatado, pero de composición simi lar otra manera. La efectividad del parche hemostático en hemostasis puede probarse en relación a heridas experimentales en ani males, tal como de acuerdo con pruebas descritas en US 6, 733, 774 B2. Por ejemplo, 48 horas siguiendo la incisión y perforación del bazo o resección de la punta del lóbulo hepático craneal en perros, puede realizarse la necroscopia y evidencia de hemorragia secundaria buscada med iante observación gruesa y examen histológico. U n parche hemostático puede ser aplicado a una lesión de bazo experimental en cerdos y tiempo de cese de hemorragia puede medirse.

Normalmente, el polisacárido sulfatado está presente en la superficie activa del parche hemostático, normalmente en una cantidad desde 20 ng hasta 3 mg/cm2, normalmente desde 0.2 hasta 300 pg/cm2, por ejemplo desde 3 hasta 300 pg/cm2. Por ejemplo, el portador puede ser recubierto con el polisacárido sulfatado . Normalmente, el polisacárido sulfatado está en una forma sólida y es distribuido uniformemente y fijado sobre el portador.

De manera alternativa , el polisacárido sulfatado es distribuido dentro de la matriz del parche hemostático, normalmente en una cantidad desde 20 ng hasta 3 mg para cada cm2 de la superficie activa del parche hemostático, normalmente desde 0.2 hasta 300 pg/cm2, por ejemplo desde 3 hasta 300 pg/cm2. La "matriz'' del parche hemostático es la parte o partes del portador, que termina en una superficie activa. Si la matriz tiene u na profundidad de 1 cm , el polisacárido sulfatado está presente normalmente en una cantidad desde 20 ng/cm3 hasta 3 mg/cm3 de la matriz. Si la matriz tiene una profund idad de 1 mm , el polisacárido sulfatado está presente normalmente en una cantidad desde 200 ng/cm3 hasta 30 mg/cm3 de la matriz.

Se entenderá que el pol isacárido su lfatado puede ser distribuido en la matriz del parche hemostático y también está presente en la superficie activa. En ese caso, el polisacárido sulfatado combinado sobre la superficie activa y en la matriz es normalmente desde 20 ng hasta 3 mg por cada cm2 de la superficie activa , y normalmente desde 0.2 hasta 300 pg/cm2, por ejemplo desde 3 hasta 300 pg/cm2.

El parche hemostático puede no contener agentes q ue promuevan la hemostasis diferentes del polisacárido sulfatado. De manera alternativa, puede contener uno o más agentes activos diferentes, por ejemplo, agentes antifibrinolítico, o agentes que promuevan la coagulación. En una modalidad preferida, una superficie activa del parche hemostático comprende además trombina y fibrinógeno. De manera adecuada, la trombina está presente en una cantidad de 1.0-5.5 IU/cm2, de preferencia aproximadamente 2.0 IU/cm2 y el fibrinógeno está presente en una cantidad de 2-10 mg/cm2, de preferencia 4.3-6.7 mg/cm2. Un método para hacer un parche hemostático comprendiendo trombina y fibrinógeno es descrito en US 6,733,774 B2.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de sellado de ejido o pegado de ejido comprendiendo aplicar sobre una superficie de herida un parche hemostático de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para obtener hemostasis comprendiendo aplicar sobre un área de fuga de sangre un parche hemostático de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.

El parche hemostático de la presente invención es útil para hemostasis, pegado de tejido y sellado de tejido, en particular en intervención quirúrgica en el sistema gastrointestinal, tal como el esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto sobre órganos parenquimatosos, tales como hígado, bazo, páncreas, ríñones, pulmones, glándulas adrenales, tiroide y nodulos linfáticos, cirugía cardiovascular, cirugía torácica incluyendo cirugía en la tráquea, bronquios o pul mones, i ntervenciones quirúrgicas en el área de oído, nariz y garganta (ENT) i ncluyendo cirug ía dental , ginecológica, urológica, ósea (por ejemplo, resección espongiosa) y cirugía de emergencia, cirug ía neurológica , linfática, biliar y fístulas cerebroespinales (CSF) y fugas de ai re durante ci rug ía torácica y pulmonar. La presente invención también se refiere así al uso de parche hemostático del noveno aspecto de la invención pa ra los fines anteriores. Además, el parche hemostático puede ser substancialmente hermético a líquido, haciéndolo altamente útil en cirugía de órganos de alto sangrado , tales como h ígado y bazo y para cirugía , por ejemplo, en el canal gastrointestinal . El parche hemostático de la presente invención va a ser aplicado normalmente cuando el sangrado no pueda ser controlado con métodos convencionales o cuando estos métodos pudieran produci r resultados desfavorables.

En un aspecto adicional , la presente invención proporciona un método para hacer un parche hemostático de acuerdo con la presente invención, que comprende recubrir n portador con un polisacárido sulfatado y/o distribuir un polisacárido sulfatado dentro de u n portador. Los métodos adecuados son como se descri be antes.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un sistema de jeri ngas de dos componentes comprendiendo YA S EA (a) la composición de un componente de la reivindicación 1 en el primer barril , y (b) una preparación conteniendo catión , opcionalmente junto con trombina, en el segu ndo barril ; O (a') el polisacárido sulfatado separado de la reivindicación 1 y una preparación conteniendo catión , opcionalmente junto con trombina en el primer barril , y (b') una preparación de fibrinógeno en el segundo barril .

En otro aspecto, la presente i nvención proporciona una jeringa comprendiendo una sol ución de trombina en un ba rril , una solución conteniendo fi brinógeno en un segundo barril y una sol ución de polisacárido sulfatado en un tercer barril y iones de calcio ya sea en la trombina o en la solución de polisacárido sulfatado.

E n un quinto aspecto , la presente invención proporciona el uso de una preparación de la presente invención, una estructura tipo coágulo de fibrina de la presente invención o un parche de la presente invención para intensificar la hemostasis.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una preparación de la presente invención, una estructura tipo coágulo de fibrina de la presente invención o un parche de la presente invención para curación de heridas.

En un séptimo aspecto , la presente invención proporciona el uso de una preparación de la presente invención , una estructura tipo coágulo de fi brina de la presente invención o un parche de la presente invención para usarse como un sistema de entrega de medicamento.

En un octavo aspecto, la presente i nvención proporciona un método de sellado de ejido o pegado de tejido comprendiendo aplicar en una superficie de herida una preparación de la presente i nvención, una estructura tipo coág ulo de fibrina de la presente invención o un parche de la presente invención .

En otro aspecto , la presente i nvención proporciona una superficie in vitro recubierta con un coágulo formado in vitro de acuerdo con el método de la presente invención . La superficie in vitro puede ser usada como un substrato para el cultivo de células adherentes, en particular células de mamífero.

US 2006/1 34093 (Ronfard , DFB Pharmaceuticals I nc, US) describe soportes de células de fibri na para cultivos celulares formados mediante la mezcla de fi brinógeno y trombina . Los soportes de célu las de fibrina pueden ser usados para reparar un cultivo de células tales como queratinocitos, recu perar el cultivo en la forma de un tejido reconstituido y transportar los mismos. El tejido reconstituido es particularmente adecuado para usarse como un injerto de piel . El coágu lo y superficie in vitro del séptimo y octavo aspectos de la invención pueden usarse como se describe en US 2006/1 34093. Las superficies adecuadas pueden consistir de una mem brana sintética hecha a partir de uno o más de los sig uientes materiales (poliéster, PTFE o pol iuretano) ; de uno o más pol ímeros biodegradables (por ejemplo, ácido hial urónico, ácido poli láctico o colágeno) ; o vendaje de gasa de Vaseline o silicón, o cualquier otro material adecuado para vendaje de heridas.

En cualq uiera de los aspectos de la invención , se prefiere que el polisacárido sulfatado sea un polisacárido sulfatado no a nticoagulante (NASP) . "NAS P" como se usa en la presente, se refiere a un polisacárido sulfatado que exhibe actividad anticoagulante en un tiempo de protrombina diluido (dPT) o ensayo de coagulación de tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) que no es más de un tercio y de preferencia menor que un décimo, la actividad anticoagulante molar (aumento estadísticamente significativo en tiempo de coagulación) de heparina no fraccionada (rango de MW 8,000 hasta 30,000; promedio 18,000 daltones). NASPs puede purificarse y/o modificarse de fuentes natrales (por ejemplo, algas cafés, corteza de árbol, tejido animal), o puede sintetizarse de novo y puede variar en peso molecular desde 100 daltones hasta 1,000,000 daltones. Una tendencia reducida hacia un efecto ant-coagulante in vivo, comparada con polisacáridos sulfatados los cuales no son NASPs, es deseable como una medida de precaución, ya que cualquier riesgo de un efecto anti-coagulante para un paciente es por lo tanto minimizado. En cualquier caso, los senadores de fibrina y parches hemostáticos se pretenden solamente para uso tópico, y así la fuga del polisacárido sulfatado hacia el sistema sanguíneo debería ser gradual, minimizando cualquier efecto anti-coagulante no deseado. Por lo tanto, los polisacáridos sulfatados teniendo efectos anti-coagulantes pueden ser usados, en particular a bajas concentraciones.

Los NASPs son "no anti-coagulantes", ya que no aumentan significativamente los tiempos de coagulación sobre el rango de concentraciones estudiadas. Los polisacáridos sulfatados con actividad de NASP potencial incluyen, pero no están limitadas a, glicosaminoglicanos (GAGs), moléculas similares a heparina incluyendo N-acetil heparina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) y heparina N-desulfatada (Sigma-Aldrich), sulfatoides, oligosacáridos polisulfatados (Karst et al, (2003) Curr. Med. Chem. 10:193-2031; Kuszmann et al. (2004) Pharmazie. 59:344-348), sulfatos de condroitina (Sigma-Aldrich), sulfato de dermatano (Celsus Laboratories Cincinnati, Ohio), fucoidano (Sigma-Aldrich), polisulfato de pentosano (PPS) (Ortho-McNeil Pharmacueticals, Raritan, N.J.), sulfatos de fucopiranona (Katzman et al., (1973) J. Biol. Chem.248:50-55) y sulfatoides novedosos tales como GM1474 (Williams et al. (1998) General Pharmacology 30:337) y SR 80258A (Burg et al. (197) Laboratory Investigation 76:505) y heparinoides novedosos, y sus análogos. Los NASPs pueden ser purificados y/o modificados de fuentes naturales (por ejemplo, algas cafés, corteza de árbol, tejido animal) o pueden sintetizarse de novo y pueden variar en peso molecular desde 100 daltones hasta 1,000,000 daltones. Los compuestos adicionales con actividad de NASP potencial incluyen heparina oxidada con peryodato (POH) (Neoparin, Inc., San Leandro, Calif.), laminarina químicamente sulfatada (CSL) (Sigma-Aldrich), ácido algínico químicamente sulfatado (CSSA) (Sigma-Aldrich), pectina químicamente sulfatada (CSP) (Sigma-Aldrich), sulfato de dextrano (DXS) (Sigma-Aldrich), oligosacáridos derivados de heparina (HDO) (Neoparin, Inc, San Leandro, Calif.).

Los NASPs preferidos son polisulfato de pentosano y fucoidano.

El fucoidano es un polisacárido compuesto mayormente de ésteres sulfatados de fucosa, con un grado variable de ramificación. Los enlaces pueden ser predominantemente a(1-»2) o <x(1->3). Los enlaces a(1->4) también pueden estar presentes. Los ésteres de fucosa son predominantemente sulfatados en la posición 4 y/o 2 y/o 3. Las fucosas monosulfatadas dominan , aunque la fucosa desulfatada también puede estar presente. Además de ésteres de fucosa sulfatados, el fucoidano también puede contener fucosa no su lfatada, D-xilosa , D-galactosa, ácido urónico, ácido glucurónico o combinaciones de más de uno de ésteres. El F-fucoidano es >95% compuesto por ésteres sulfatados de fucosa, mientras que U-fucoidano es aproximadamente 20% ácido glucurónico.

La presente invención tam bién proporciona un método de preparación de u n coágulo de fi brina que comprende mezclar una sol ución de adhesivo de tejido com prendiendo fi bri nógeno con una sol ución de trombina en la presencia de iones de calcio y un polisacárido sulfatado.

En especial , la presencia del polisacárido sulfatado provoca un aumento en la opacidad de coágulo del coágulo de fibrina.

En un aspecto preferido, el método es para una preparación tópica de un coágulo de fibrina .

En un aspecto preferido, la solución de adhesivo de tejido comprende polisacárido sulfatado, por ejemplo , a una concentración de entre 1 .2 ug/g/m l y 20 mg/ml , tal como entre 0.6 pg/ml y 10 mg/ml en una composición formada sobre mezclado de la solución de adhesivo de tejido y la sol ución de trombina .

En un aspecto preferido, la solución de ad hesivo de tejido y la solución de trombina son provistas cada una en un barril de jeringa separado de una jeri nga de múlti ples barriles.

La presente invención también proporciona una preparación de fibrinógeno comprendiendo un polisacárido su lfatado.

De preferencia la preparación de fi brinógeno es u na , en donde una solución de adhesivo de tejido com prendiendo la prepa ración de fibrinógeno es capaz de formar un coág ulo de fibrina en no más de 1 0 minutos a 37°C sobre mezclado con un volu men ig ual de una solución comprendiendo 4 I U de trombina y 40 pmol de CaCI2 por mi .

La preparación de fibrinógeno de la presente invenci ón comprende de preferencia 0.01 pg hasta 300 pg de polisacárido sulfatado para cada mg de fibrinógeno.

La presente invención también proporciona una preparación de trombina comprendiendo un polisacárido sulfatado.

La preparación de trombina es una de preferencia , en donde una solución de trombina comprendiendo la preparación de trombina es capaz de provocar u na solución de adhesivo de tejido comprendiendo 50 mg/ml de fibrinógeno para formar un coágulo de fibrina en no más de 1 0 minutos a 37°C sobre mezclado con un volumen igual de la solución de adhesivo de tejido, en donde cualquier solución comprende iones de calcio, de preferencia la preparación de trombina comprende desde 1 .2 ng hasta 20 mg de polisacárido sulfatado para cada I U de trombina.

En otro aspecto, la preparación de fibrinógeno o la preparación de trombina de la presente invención es u na preparación l iofilizada o una sol ución congelada.

La presente invención también proporciona una jeringa comprendiendo una solución de adhesivo de tej ido comprendiendo la preparación de fibrinógeno de la presente invención en un barri l .

La jeringa de preferencia comprende un barril adicional comprendiendo una solución de trombina.

En otro aspecto, la presente i nvención proporciona una jeringa comprendiendo una solución de trombi na en un barril , una solución de adhesivo de tejido en un segundo barril y una sol ución de polisacárido sulfatado en un tercer barri l .

La presente invención también proporciona u n coágulo formado de acuerdo con el método descrito antes.

La presente invención proporciona además u na superficie in vitro recubierta con u n coágulo formado de acuerdo con el método de la presente invención .

La presente invención también proporciona un método de sellado de tejido o pegado de tejido comprendiendo aplicar sobre una su perficie de herida un parche hemostático de acuerdo con la presente invención ; - un método para obtener hemostasis, comprendiendo aplicar sobre un área de fuga de sangre un parche hemostático de la presente invención , - un método para hacer el parche hemostático de la presente invención que comprende recubrir un portador co n un polisacárido sulfatado y/o distribuir u n polisacárido sulfatado dentro de un portador, - el uso de un polisacárido sulfatado para proporcionar una función hemostática en un parche hemostático, por ejemplo, un parche como de la presente invención .

De preferencia, el pol isacárido sulfatado en las preparaciones anteriores, en el parche anterior para los métodos y usos, es un polisacárido sulfatado no anticoagulante (NASP).

Descripción de las figuras: Figura 1 (A, B, C): Turbidez y apariencia de agregados tipo coágulo obtenidos a concentración de fibrinógeno constante (0 mg/ml) y varias concentraciones de fucoidanos y iones de Ca2+.

Figura 2 (A, B, C): Ultraestructura de materiales como geles obtenidos de la mezcla de fibrinógeno, fucoidano/pentosanpolisulfato y iones de Ca2+. Concentraciones: fibrinógeno, 50 m/ml; Ca2+, 20 mM; Pentosanpolisulfato (A), 200 µ?; fucoidano LMW de A. nodosum (B), 200 µ?; fucidano de Fucus vesiculosus (C), 20 µ?. La barra representa 5 pm.

Figura 3: Efecto hemostático de cojín de colágeno conteniendo fucoidano de A. nodosum/CaCI2 (B) comparado con el cojín de colágeno puro (Matristypt® (A) en un modelo de abrasión de superficie de hígado sobre conejos heparinizados. Las imágenes fueron tomadas 15 minutos después de las aplicaciones de cojín sobre la herida sangrante.

Figura 4: Influencia de fucoidanos sobre la turbidez durante la formación de coágulo de fibrina. Concentración durante formación de coágulo: fibrinógeno (Tisseel VH S/D diluido): 2.5 mg/ml; trombina 0.125 lU/ml. PPS - pentosanpolisulfato, 10 µ?; FAN - fucoidano A. nodosum, LMW: 10 µ?; HMW: 0.1 µ?; FLJ - fucoidano Laminaria japónica, 0.1 µ?; FFV - fucoidano Fucus vesiculosus, 1 µ?. .v.v Figura 5 (A y B) : Microscopía de exploración de electrones de coágulos de fibrina obtenida de sellador de fibri na Tisseel VH S/D diluido sin fucoidano adicionado (A) y con 1 µ? de fucoida no de Fucus vesiculosus (B). Concentraciones: fibri nóegno 2.5 mg/ml ; trombina 0.1 25 l/ml.

La presente invención será i lustrada adicionalmente en los siguientes ejemplos si n algu na lim itación a los mismos.

Ejem plo 1 : De manera sorprendente, hemos observado que alta concentración de fibrinógeno , en la presencia de fucoidanos y iones de Ca2+ se forman rápidamente agregados tipo gel macroscópicamente. Todos estos tres compuestos son necesarios para obtener estos agregados de auto-ensamble. La consistencia del material obtenido a una concentración de fibrinógeno de 50 mg/ml cambia de opalescencia l igera a apariencia tipo coágulo con concentración de fucoidano y ión de Ca2+ creciente (Figura 1 ) . En los experimentos, 0.5 mi de solución de proteí na selladora Tisseel VH S/D con la concentración designada de fucoidano es colocada primero en las cavidades de una placa de cultivo celular de 24 cavidades. 0.5 mi de una solución de CaCI2 se adicionan para alcanzar las concentraciones finales indicadas en la Fig ura 1 y se mezclan rápidamente con la solución de fibrinógeno. La turbidez y consistencia de la mezcla obtenida son evaluadas. A la concentración de fibrinógeno constante de 50 mg/ml , la turbidez de la mezcla está aumentando con concentración de fucoidano o pentosanpol isulfato creciente. Sin embargo, este aumento es fuertemente dependiente de ión de Ca2+. Es bajo a 1 mM de concentración de Ca2+ pero no pron unciado a 2 mM de concentración de Ca2+. Las mezclas obten idas a las altas concentraciones de fucoidano/pentosanpolisulfato y Ca2+ son tipo gel y se adhieren a las paredes de las placas de cultivo celular, mientras que aquéllas obtenidas a las bajas concentraciones tienen la consistencia de fluidos viscosos. Tanto el fucoidano/pentosanpol isulfato y iones de Ca2+ son necesarios a mayores concentraciones con el fin de obtener un material tipo gel. La falta de homogeneidad de la mezcla obtenida a las mayores concentraciones de fucoidano/pentosanpol isulfato y ión de Ca2+ pueden explicarse mediante mezclado pobre debido a un ajuste demasiado rápido mediante auto-ensamble y las incl usiones de burbujas de aire.

Ejem plo 2: La estructura de materiales ti po gel obtenida a las concentraciones más altas de fucoidano/pentosa npolisulfato y iones de Ca2+ en el ejemplo 1 (derecha superior en la Figura 1 A, B y C) es analizada mediante microscopía de exploración de electrones (SEM). Después del tiempo formador de coágulo de 1 .5 horas a 37°C , los coágulos son transferidos en una solución de fijación consistiendo de 2.5% de gl utaraldeh ído en 0.1 amortiguador de cacodilato a pH 7.3. La proporción en peso de coágulo a solución de fijación es 1 : 1 0. Después de 1 2 horas a 4°C , los coágulos son lavados 3 veces con 0.1 M amortiguador de cacodi lato pH 7.3, usando la misma proporción en peso como antes. La post-fijación es realizada en 0.5% de tetróxido de osmio conteniendo 1 % de ferrocianuro de potasio d urante 2 horas. Los coágu los son lavados en agua desti lada y deshidratados con 2.2 dimetoxipropano. Las muestras son transferidas en agua destilada y deshidratados con 2.2 di metoxipropano. Las muestras son transferidas en acetona y rotas en nitrógeno l íquido. Las muestras son qu ímicamente secadas con hexametildisi lazano , montadas en puntas romas y recubiertas con una aleación de paladio-oro.

Las imágenes obtenidas son mostradas en la Figu ra 2. Es evidente que el novedoso material tipo gel obtenido media nte la combinación de fi bri nógeno, fucoidano/pentosanpolisulfato y iones de Ca2+ tiene una organización muy diferente comparada con los coágulos de fibrina mostrados en la Figu ra 5A. En el proceso de auto-ensamble rápido y espontáneo, que inicia con puentear juntos los tres compuestos, se forma una estructura tridimensional de vesículas adherentes.

Ejem plo 3: Debido a las propiedades observadas de fucoidanos en combi nación con iones de Ca2+ para formar un material tipo gel junto con fibrinógeno, un cojín hemostático basado en colágeno es preparado. La idea detrás es que estos aditivos contenidos en el cojín de colágeno pueden interactuar con el fibrinógeno sang u íneo y así intensificar las N propiedades hemostáticas del coj ín de colágeno. U na esponja de colágeno de 2 mm de espesor (Matristypt®, Dr. Suweiack, Alemania) es remojada con una solución conteniendo fucoidano de LMW de A. nodosum y CaCI2 y secada por congelación . La solución de remojo contiene los i ngredientes en una concentración de manera que después de secado por congelación se obtienen concentraciones de 0.3 mg/cm2 de fucoidano de LMW de A. nodosum y 0.9 mg/cm2 de CaCI2 en el coj ín . El coj ín es aplicado en un modelo de hemostasis de conejo para valorar sus propiedades hemostáticas. Los conejos son heparinizados con 1 000 l U/k g de peso corporal . Con u na herramienta rotatoria de molienda , un sangrado ci rcular (diámetro de 1 .8 cm) es fijado por abrasión de la cápsula de hígado. Esta herida es tratada con el coj ín descrito antes. El coj ín seco es aplicado sobre la herida de sangrado. El cojín es presionado contra la herida con la ayuda de gaza remojada en solución salina durante 2 minutos. Como un control se aplica Matristypt® sobre otro lóbulo de h ígado del mismo animal en la misma manera . Los experimentos son corridos por duplicado con un segundo animal . El resultad es ig ual en ambos anales y es mostrado ejemplarmente para un animal en la Fig ura 3. Como puede observarse a partir de la Figura 3, la sangre remojada en el cojín colágeno conteniendo fucoidano y CaCI2 parece más obscura que en el control . Esto puede explicarse mediante coagulación más rápida en el coj ín provocada por la acción de los ingredientes.

Ejemplo 4: La influencia de fucoidanos sobre la cinética de aumento de turbidez durante la formación de coágulo de fibrina catalizada por trombina y la turbidez final de los coágulos obtenidos, es confirmada adicionalmente usando sellador de fibrina diluido Tisseel VH S/D (Baxter) como substrato de fibrinógeno. La solución de proteína selladora Tisseel VH S/D es diluida 1/20 (correspondiendo a una concentración de fibrinógeno de 5 mg/ml) y las concentraciones de fucoidano ajustadas a 20 µ? (pentosanpolisulfato, Ascophyllum nodosum LMW), 2 µ? (Fucus vesiculosus y 0.2 Ascophyllum nodosum HMW, Laminaria japónica). 100 µ? de estas soluciones Tisseel VH S/D diluidas (conteniendo fibrinógeno, fibronectina y factor XII) se mezclan en cavidades de una microplaca de 96 cavidades con 100 µ? 0.25 IU/ml de solución de trombina (Baxter) conteniendo 40 mM CaCI2. La medición de aumento de turbidez durante la formación de coágulo a 3°C es registrada a 630 nm sobe un periodo de tiempo de 1.5 horas después del mezclado. Los resultados son mostrados en la Figura 4. Se observa que algunos fucoidanos pero también pentosanpolisulfato pueden acelerar la reacción de formación de coágulo catalizada por trombina e influenciar la formación de coágulos de fibrina con una turbidez incrementada.

Ejemplo 5: La turbidez incrementada de coágulos de fibrina es asociada con coágulos "gruesos", es decir coágulos de fibrina y estructura de fibrina -una retrospectiva. Biphys Chem. 2004 Dec 20;112(2-3):187-92).

Los coágulos de fibrina con el fucoidano de Fucus vesiculosus y sin fucoidano son preparados como se describe en el ejemplo 4. La preparación de las muestras para SEM es realizada como se describe en el Ejemplo 2.

Ejemplo 6: Un ensayo para estudiar trombina mediado por formación de fibrina y el efecto de polisacáridos sulfatados en este proceso ha sido desarrollado. Brevemente, la formación de coágulos es iniciada en una solución conteniendo fibrinógeno mediante la adición de trombina y seguida espectrofotométricamente. La absorbancia de 405 nm es indicativa de opacidad de coágulo, la cual depende de la cantidad y/o calidad del coágulo de fibrina.

A cada cavidad de una micro-placa de 96 cavidades (poliestireno, F-bottom; Greiner Bio-One GmbH, Kremsmuenster, Austria), 55 µ? de fibrinógeno humano (plasminógeno, fibronectina, factor XIII suprimido, American Diagnostica Inc., Stamford, C, US) diluidos en amortiguador de dilución (25 mM Hepes pH 7.35, 175 mM NaCI, 2.5 mM CaCI2, 5 mg/ml HSA) es adicionado. La concentración final de fibrinógeno en un volumen de ensayo de 100 µ? µ es 2.5 mg/ml. 10 µ? de la muestra de prueba de polisacárido sulfatado diluida en amortiguador de dilución (o amortiguador de dilución solo) es adicionado a la mezcla e incubada durante 15 minutos a 37°C en un incubador de micro-placa. La formación de coágulo de fibrina es iniciada mediante la adición de 35 µ? de trombina humana pre-calentada (Enzyme Research Laboratories, South Bend, I N , US) diluida en amortiguador de dilución (o amortiguador de dilución solo) , pre-calentado a 37°C . La micro-placa es transferida inmediatamente al lector de micro-placa pre-calentado (37°C) (lector de micro-placa Safire2M R; Tecan Trading AG , CH) y la formación de coágulo es seguida a 405 nm durante 60 minutos al leer cada 30 segundos. En cada pu nto en el tiempo, las lecturas de absorbancia de cada cavidad de muestra son corregidas por substracción de las lecturas de cavidades conteniendo solo fi brinógeno.

En un experimento inicial , la concentración de trombina es variada de 0.1 a 8 nm y los polisacáridos sulfatados no son incl uidos en el ensayo. La absorbancia a 405 nm aumenta rápidamente de manera i nicial pero alcanza una plataforma entre aproximadamente 20 y 30 minutos. La A405 a 60 mi nutos es registrada para cada una de las concentraciones de trombina. Los resultados son mostrados en la Tabla 1 a continuación .

Tabla 1 Trombina (nM)* 0 0.1 0.5 2 8 A4 05 a 60 minutos 0.0000 0.01 2 0.034 0.045 0.053 *Las concentraciones representan la concentración final en el ensayo Existe u na relación aproximadamente li neal entre la concentración de trombina y A405 a 60 mi nutos para concentraciones de trombina de 0 a 0.5 nM . I ncrementar la concentración de trombina no resulta adicionalmente en un incremento comprable en A405 a 60 minutos. De acuerdo con esto, una concentración de 0.5 nM de trombina es elegida para experi mentos adicionales.

Ejemplo 7 : La influencia de diferentes concentraciones de cada uno de 6 polísacáridos sulfatados sobre formación de coág ulo de fibrina mediada por trombina es exami nada de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6. Los detalles de los polísacáridos sulfatados son dados en la Tabla 2 a continuación .

Tabla 2 Polisacárido sulfatado MW (kDa) Fuente Pentosan polisulfato de 5.9 CF Pharma Ltd. (Budapes, sodio (P PS) H ungría) Fucoidano LMW, 7.5 Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, Ascophyllum nodosum Alemania) Fucoidano, Fucus - 1 1 5.5 F6531 ; Sigma-Aldrich Chemie vesiculosus GmbH (Taufkirchen , Alemania) Fucoidano, Lindaría - 1 27 Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, pinnatifida Alemania) Fucoidano HMW, -600 Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, Ascophyllum nodosum Alemania) Fucoidano, Laminaria >1 000 Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, japónica Alemania) En este experi mento, la concentración de trombina es 0.5 nM y A405 es registrada a 60 minutos. Para cada polisacárido probado, bajas concentraciones generalmente tienen poco efecto sobre la A40s a 60 minutos. Elevar la concentración generalmente resulta en un gran aumento en la A405 a 60 minutos. La concentración a la cual el aumento es observado varía entre diferentes polisacáridos. Por ejemplo, el flucoidano de L. japónica provoca un gran aumento en la ?405 a 60 minutos a 1 00 nM . En contraste, el pentosanpol isulfato de sodio a 100 nM tiene u n efecto despreciable, pero un gran efecto a 1 0000 nM . Los resultados se m uestran en la Tabla 3 a continuación .

Tabla 3 Concentración 0 1 1 0 1 00 1 000 1 0 000 (nM)* Polisacárido A405 , 60 minutos PPS 0.043 0.037 0.064 0.429 A. nodosum 0.043 0.037 0.049 0.234 LMW F. vesiculosus 0.043 0.048 0.058 0.237 U. pinnatifida 0.043 0.044 0.046 0.058 A. nodosum 0.043 0.042 0.040 0. 1 1 3 HMW L. japónica 0.043 0.042 0.054 0. 163 "Las concentraciones representan la concentración final en el ensayo.

Aunque la concentración nM a la cual los polisacáridos sulfatados estimulan la formación de coág ulo de fibri na varía ampliamente, las concentraciones en g/ml que provocan la A4 05 a 60 minutos para al menos el doble en el ensayo comparado con el ensayo en la ausencia de polisacáridos sulfatados es aproxi madamente compa rable entre los diferentes pol isacáridos. Los resu ltados son mostrados en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4 Concentración a la cual A405 , 60 min es al menos el doble en la presencia comparada con la ausencia de polisacárido Polisacárido sulfatado Conc (n M) Conc (pg/ml) PPS 1 0 000 59 A. nodosum LMW 1 0 000 75 F. vesiculosus 1000 1 16 U. pinnatifida - - A. nodosum H MW 1 00 60 L. japónica 1 00 1 00 Altas concentraciones de los polisacáridos sulfatados, es deci r, en el rango de aproximadamente 50-1 00 Mg/ml , general mente provocan un aumento en la opacidad de coágulo a una concentración de trombina de 0.5 nM que es mayor que el aumento que es observado en el Ejemplo 6 mediante el uso de 8 nM trombina. Por lo tanto los resultados sugieren que la opacidad de coágulo (y de ahí la generación de fibrina y/o calidad de coágulo) pueden ser mejorados mediante polisacáridos sulfatados en una manera que no puede ser simulada al incrementar la concentración de trombina .

Ejem plo 8: Los polisacáridos su lfatados pueden ser i ncl uidos en selladores de fibrina con el fin de mejorar la generación de fibrina dependiente de trombina. U n sellador de fibrina adecuado que puede ser modificado por la incl usión de polisacáridos sulfatados es el sellador de fibrina Tisseel® de Baxter Healthcare Corporation (CA, US) . Esta es la modalidad más preferida de la invención.

La solución de proteína selladora es hecha al disolver el concentrado de proteína selladora en la solución de inhibidor de fi brinólisis a 37°C usando un dispositivo de calentamiento y agitación tal como Fibrinotherm® en la manera usual . Si n embargo, una cantidad de polisacárido sulfatado puede incluirse en el concentrado de proteína selladora o sol ución de in hibidor de fi brinólisis, para dar una concentración final en la solución de proteína sel ladora en el rango de 1 00 a 200 pg/ml . La trombina es reconstituida en solución de CaCI2 para hacer solución de trombina en la manera usual . Cada una de las soluciones es arrastrada hacia uno de los dos cuerpos de jeringa de la jeringa Duploject® l ista para usarse. El sellador de fi brina puede prepararse listo para usarse mediante otros métodos, por ejemplo, puede ser almacenado como una jeringa pre-llenada congelada , y descongelada lista para usarse. Cualquiera de los métodos apropiados para preparar sellador de fibrina Tisseel® es apropiado.

El sellador de fibrina listo para usarse puede ser usado por un profesional del cuidado de la salud, por ejemplo, para controlar el sangrado. Al mezclar las soluciones durante la expulsión de la jeringa Duploject®, el polisacárido sulfatado estará presente en la mezcla a un rango de concentración de 100 a 200 µ?/??? con el fin de mejorar la generación de fibrina. El sellador de fibrina puede aplicarse como una capa delgada a una superficie de herida seca y las partes selladas sostenidas o fijadas en la posición deseada durante aproximadamente tres a cinco minutos.

El sellador de fibrina puede ser usado en cualquier indicación para la cual el sellador de fibrina Tisseel® es adecuado. Por ejemplo, puede usarse como auxiliar en hemostasis en cirugías que involucran derivación cardiopulmonar y tratamiento de lesiones de bazo debido a trauma romo o penetrante al abdomen. De manera alternativa, puede usarse como un auxiliar en el cierre de una colostomía.

Como una alternativa para incluir el pol isacárido sulfatado en el componente de solución de proteína selladora, puede incluirse en la solución de trombina.

El sellador de fibrina Tisseel® usualmente contiene aprotinina para prevenir la fibrinólisis prematura. Sin embargo, algunos individuos son hipersensibles a aprotinina. Puede ser posible incluir polisacárido sulfatado en el sellador de fibrina Tisseel® y omitir la aprotinina para usarse en tales individuos. La generación de fibrina incrementada o calidad de coágulo mejorada mediada por el polisacárido sulfatado puede hacer i nnecesario el uso de aprotinina.

Ejem plo 9: Los polisacáridos sulfatados pueden ser i nclu idos dentro de un parche hemostático, con el fin de mejorar la generación de fibrina dependiente de trombina.

Por ejemplo, el material tipo lámina de auto-soporte de fibrina reticulada descrito en WO 96/221 1 5 (Del motte y Krack; Baxter International Healthcare, I L) puede ser remojado en una solución de polisacárido sulfatado, normal mente a una concentración de 1 00 a 200 Mg/ml . Se permite que la lámina de fibrina se seque bajo condiciones estériles y se almacene para uso futuro.

La lámina de fibrina puede ser usada su bsecuentemente mediante un cirujano para tratar una lesión traumática i nterna , tal como una lesión de bazo, al aplicar la lámina de fibrina a la superficie de herida, opcionalmente con una capa de sellador de fibrina Tisseel® entre la lámina de fi bri na y la superficie de herida . El polisacárido sulfatado promoverá la formación de coágulos, red uciendo así la hemorragia y la lámina de fibrina previene el desarrollo de adhesiones.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una preparación comprendiendo fibrinógeno y un polisacárido sulfatado como una composición de un componente o como un conjunto de partes comprendiendo fibrinógeno y polisacárido sulfatado como componentes separados.

2. Una estructura tipo coágulo de fibrina obtenible mediante un proceso que comprende los pasos de (a) proporcionar una preparación de la reivindicación 1 como una solución, (b) proporcionar una solución conteniendo catión como un componente separado, opcionalmente conteniendo trombina, o como una solución junto con el componente de polisacárido sulfatado de la reivindicación 1, conteniendo opcionalmente trombina, (c) opcionalmente proporcionar una solución de trombina, y (d) mezclar (a) y (b) y opcionalmente (c) ya sea de manera simultánea o subsecuente en cualquier orden de manera que se obtenga una estructura tipo coágulo de fibrina.

3. Un parche hemostático que comprende (1) un portador, y (2) al menos un agente hemostático, el cual es un polisacárido sulfatado, en donde, si el portador es un polisacárido sulfatado, no es el mismo polisacárido sulfatado que el agente hemostático.

4. El parche hemostático de la reivindicación 3, en donde el portador es un material biocompatible seleccionado del grupo que consiste de colágeno, gelatina, fibrinógeno, fibrina, y un polisacárido, o derivados o mezclas de los mismos.

5. Un sistema de jeringas de dos componentes que comprende YA SEA (a) la composición de un componente de la reivindicación 1 en el primer barril , y (b) una preparación conteniendo catión, opcionalmente junto con trombina, en el segundo barril; O (a') el polisacárido sulfatado separado de la reivindicación 1 y una preparación conteniendo catión, opcionalmente junto con trombina en el primer barril, y (b') una preparación de fibrinógeno en el segundo barril .

6. El uso de una preparación de la reivindicación 1 , una estructura tipo coágulo de fibrina de la reivindicación 2 o un parche de la reivindicación 3 o para intensificar la hemostasis.

7. El uso de una preparación de la reivindicación 1 , una estructura tipo coágulo de fibrina de la reivindicación 2 o un parche de la reivindicación 3 para curación de heridas.

8. El uso de una preparación de la reivindicación 1 , una estructura tipo coágulo de fibrina de la reivindicación 2 o un parche de la reivindicación 3 como un sistema de entrega de medicamento.

9. Un método de sellado de tejido o pegado de tejido que comprende aplicar sobre una superficie de herida una preparación de la reivindicación 1 , una estructura tipo coágulo de fibrina de la reivindicación 2 o un parche de la reivindicación 3.