MX2011005383A - Terapia anti-angiogenesis para el tratamiento del cancer de mama. - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere en general al tratamiento de enfermedades y patologías con anticuerpos anti-VEGF. Más específicamente, la invención se refiere al tratamiento de sujetos humanos susceptibles a, o diagnosticados con, cáncer de mama utilizando un anticuerpo anti-VEGF, con preferencia, en combinación con uno o más agentes terapéuticos antitumorales adicionales.

Description

TERAPIA ANTI-ANGIOGÉNESIS PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER DE MAMA SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad frente a, y el beneficio de, la Solicitud de Provisoria Estadounidense Acta No. 61/179.307, presentada el 18 de mayo, 2009, Solicitud de Provisoria Estadounidense Acta 61/178.009, presentada el 13 de mayo, 2009, y Solicitud de Provisoria Estadounidense Acta No. 61/117.102, presentada el 22 de noviembre, 2008, cuyas memorias descriptivas son incorporadas a la presente en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere, en general, al tratamiento de enfermedades humanas y afecciones patológicas. Más específicamente, la invención se refiere a la terapia anti-angiogénesis, ya sea sola o en combinación con otras terapias anticancerígenas, para el tratamiento del cáncer de mama.

ANTECEDENTES El cáncer sigue siendo una de las amenazas más mortales para la salud humana. En los Estados Unidos de América, el cáncer afecta a casi 1 ,3 millones de nuevos pacientes cada año, y es la segunda causa principal de muerte después de la enfermedad cardiaca, representando aproximadamente 1 de 4 muertes. El cáncer de mama es la segunda forma más común de cáncer y la segunda causa de muerte por cáncer entre las mujeres americanas. También se predice que el cáncer puede superar a las enfermedades cardiovasculares como la causa número uno de muerte dentro de los 5 años. Los tumores sólidos son responsables de la mayoría de estas muertes. Si bien han habido avances significativos en el tratamiento médico de ciertos cánceres, la tasa de supervivencia de 5 años general para todos los cánceres ha mejorado solo en aproximadamente 10% en los pasados 20 años. Los cánceres, o tumores malignos, hacen metástasis y crecen rápidamente en forma descontrolada, haciendo que la detección a tiempo y el tratamiento sean extremadamente difíciles.

El cáncer de mama es una enfermedad que mata a muchas mujeres cada año en los Estados Unidos. De acuerdo con la Sociedad Americana de Cáncer, aproximadamente 40.000 morirán a causa de la enfermedad en el 2008. Más de 180.000 casos nuevos de cáncer de mama son diagnosticados anualmente, y se estima que una de ocho mujeres desarrollarán cáncer de mama. Estos números indican que el cáncer de mama es una de las enfermedades más peligrosas que enfrentan las mujeres hoy en día.

El cáncer de mama metastásicó es generalmente incurable con solo unos pocos pacientes que logran una supervivencia a largo plazo después de quimioterapia convencional. Greenberg et al., J. Clin. Oncol. 14:2197-2205 (1996).

El conocimiento de la biología básica del cáncer de mama se ha expandido exponencialmente durante las últimas tres décadas con cierto impacto sobre la terapia. Un ensayo en fase II, de etiqueta abierta, multinacional de 222 mujeres con cáncer de mama metastásicó que sobreexpresa HER2 encontró un índice de respuesta de 15% con seis respuestas completas confirmadas utilizando un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante (trastuzumab, también conocido como Herceptin®, Genentech, Sur de San Francisco) dirigido contra HER2 (Cobleigh et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17:97 (1998)). Un ensayo de fase III al azar evaluó la seguridad y la eficacia de agregar Herceptin a la quimioterapia de primera línea con paclitaxel o la combinación de doxorubicina más ciclofosf amida. El índice de respuesta general y el tiempo a la progresión mejoraron significativamente con la adición de Herceptin a la quimioterapia en comparación con la quimioterapia sola (Slamon et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17:98 (1998)). Más importantemente, la adición de Herceptin prolongó la supervivencia general (Norton et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 18:127a (1999)).

Si bien trastuzumab es el primer agente terapéutico biológicamente basado, novedoso, aprobado para el tratamiento de una subpoblación de pacientes con cáncer de mama que tienen cánceres con sobreexpresión de HER2, diversos otros métodos han demostrado ser prometedores y han entrado en la fase clínica. Se estima que el 75 por ciento de las mujeres con cáncer de mama metastásico recientemente diagnosticado son HER2-negativas. Los compuestos que inhiben la angiogénesis han generado un interés particular para alcanzar poblaciones con cáncer de mama adicionales y han sido y son el objeto de ensayos clínicos tanto en los Estados Unidos como en el exterior.

La angiogénesis es un evento celular importante en el cual proliferan las células endoteliales vasculares, se cortan y reorganizan para formar nuevos vasos de la red vascular preexistente. Existe una evidencia obligatoria de que el desarrollo de un suministro vascular es esencial para los procesos proliferativos normales y patológicos (Folkman y Klagsbrun Science 235:442-447(1987)). La administración de oxígeno y nutrientes, así como también la remoción de productos catabólicos, representan pasos limitadores del índice en la mayoría de los procesos de crecimiento que ocurren en organismos multicelulares.

Si bien la inducción de nuevos vasos sanguíneos se considera que es el modo predominante de angiogénesis tumoral, datos recientes han indicado que algunos tumores pueden crecer cooptando vasos sanguíneos huéspedes existentes. La vasculatura cooptada luego retrocede, conduciendo a la regresión tumoral que es eventualmente revertida por angiogénesis inducida por hipoxia en el margen tumoral. Holash et al. Science 284:1994-1998 (1999).

Uno de los reguladores positivos claves de la angiogénesis normal y anormal es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)-A. VEGF-A es parte de una familia de genes que incluye VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, y PIGF. VEGF-A principalmente se une a dos tirosina quinasas receptoras de alta afinidad, VEGFR-1 (Flt-1 ) y VEGFR-2 (Flk-1/KDR), siendo esta última el mayor transmisor de señales mitógenas de células endoteliales vasculares de VEGF-A. Por añadidura, la neuropilina-1 ha sido identificada como un receptor para las isoformas de VEGF-A de unión a heparina, y puede jugar un rol en el desarrollo vascular.

Además de ser un factor angiogénico en la angiogénesis y la vasculogénesis, VEGF, como un factor de crecimiento pleiotrópico, exhibe múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tales como la supervivencia de células endoteliales, permeabilidad y vasodilatación de vasos, quimiotaxis de monocitos y flujo entrante de calcio. Ferrara y Davis-Smyth (1997), supra. Adicionalmente, estudios han informado sobre efectos mitógenos de VEGF sobre unos pocos tipos de células no endoteliales, tales como células epiteliales de pigmentos retínales, células de ductos pancreáticos y células de Schwann. Guerrin et al. J. Cell Physiol. 164:385-394 (1995); Oberg-Welsh et al. Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132 (1997); Sondell et al. J. Neurosci. 19:5731-5740 (1999).

El reconocimiento de VEGF como un regulador primario de la angiogénesis en condiciones patológicas ha conducido a numerosos intentos de bloquear las actividades de VEGF en afecciones que involucran la angiogénesis patológica. La expresión de VEGF es regulada ascendentemente en una mayoría de enfermedades y la sobreexpresión de VEGF se correlaciona con una etapa más avanzada o con una prognosis más pobre en muchos tumores sólidos. Por lo tanto, se han utilizado moléculas que inhiben las rutas de señalización de VEGF para el tratamiento de tumores sólidos relativamente avanzados en los cuales se nota la angiogénesis patológica.

Puesto que el cáncer es aun una de las amenazas más mortales, son necesarios tratamientos para el cáncer adicionales para los pacientes. Específicamente, los tratamientos para pacientes con CM son necesarios para mejorar el control de la enfermedad para evitar síntomas, reduciendo al mínimo al mismo tiempo la toxicidad. La invención resuelve estas y otras necesidades, como será evidente luego de la revisión de la siguiente descripción.

SÍNTESIS La invención se refiere a los usos de anticuerpo anti-VEGF para tratar eficazmente pacientes con cáncer de mama para cáncer de mama metastásico previamente sin tratar. En particular, la invención proporciona datos de un ensayo clínico en fase III al azar de bevacizumab (AVASTIN®) en combinación con regímenes de quimioterapia en sujetos con cáncer de mama metastásico previamente sin tratar en sujetos humanos. Dichos regímenes de quimioterapia incluyen terapia con taxano (por ej., docetaxel o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®)), terapia de antraciclinas (por ej. doxorubicina, epirubicina o sus combinaciones) o terapia con capecitabina. En algunas realizaciones, el tratamiento se utiliza como terapia de primera línea para cáncer de mama metastásico localmente recurrente o previamente sin tratar. El éxito del ensayo muestra que agregando anticuerpo anti-VEGF a una quimioterapia convencional proporciona beneficios estadísticamente significativos y clínicamente representativos para los pacientes con cáncer de mama. Por añadidura, la seguridad era consistente con los resultados de los ensayos previos de bevacizumab.

Los resultados obtenidos en estudios clínicos del uso de bevacizumab en sujetos humanos con cáncer de mamá metastásico muestran que la eficacia, según lo evaluado mediante la supervivencia libre de evolución (SLE) era positiva especialmente cuando se compara con los datos de SLE para los agentes quimioterapéuticos por si solos. Los sujetos en los ensayos clínicos que recibieron bevacizumab en combinación con terapia de taxano (por ej., docetaxel o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®))/terapia de antraciclina (por ej., doxorubicina, epirubicina o sus combinaciones) tenían un aumento en la supervivencia libre de evolución en comparación con sujetos tratados con la terapia de taxanos (por ej., docetaxel o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®))/terapia de antraciclinas (por ej., doxorubicina, epirubicina o sus combinaciones) por si solo. Los sujetos en los ensayos clínicos quienes recibieron terapia con bevacizumab en combinación con capecitabina según lo descrito más adelante, tuvieron un aumento en la supervivencia libre de evolución en comparación con los sujetos tratados con terapia con capecitabina sola. La diferencia fue significativamente ¡mpórtante.

Por lo tanto, se proporcionan en esta invención métodos para tratar a un sujeto diagnosticado con cáncer de mama metastásico previamente sin tratar, que comprende administrar al sujeto un régimen de tratamiento que comprende una cantidad eficaz de por lo menos una quimioterapia y un anticuerpo anti-VEGF, donde dicho sujeto no ha recibido ninguna quimioterapia para cáncer de mama metastásico o localmente recurrente. Opcionalmente, el sujeto es HER2-negativo. En algunas realizaciones, el sujeto es HER2 positivo. Opcionalmente, el sujeto no ha recibido con anterioridad quimioterapia coadyuvante en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis. El régimen de tratamiento que combina la quimioterapia y la administración del anti-VEGF extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución (SLE) del sujeto. En ciertas realizaciones, el régimen de tratamiento que combina la quimioterapia y el anticuerpo anti-VEGF tiene un perfil de seguridad que es consistente con los resultados de los ensayos anteriores de bevacizumab.

Se proporcionan además en esta invención usos de un anticuerpo anti-VEGF con por lo menos un agente quimioterapéutico en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer de mama metastásico previamente sin tratar en un sujeto, donde dicho sujeto no ha recibido ninguna quimioterapia para cáncer de mama metastásico o localmente recurrente. Opcionalmente, el sujeto es HER2-negativo. En algunas realizaciones, el sujeto es HER2 positivo. Opcionalmente, el sujeto no ha recibido con anterioridad quimioterapia coadyuvante en recurrente menos de o igual a 12 meses desde la última dosis. El uso del anti-VEGF y el agente quimioterapéutico extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución (SLE) del sujeto. En ciertas realizaciones, el uso de la quimioterapia y del anticuerpo anti-VEGF tiene un perfil de seguridad que es consistente con los resultados de los ensayos previos con bevacizumab.

Se proporcionan además en esta invención anticuerpos anti-VEGF para utilizar en un método para tratar cáncer de mama metastásico o localmente recurrente en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un régimen de tratamiento que comprende una cantidad eficaz de una quimioterapia y un anticuerpo anti-VEGF, donde dicho sujeto no ha recibido quimioterapia alguna para el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico. Opcionalmente, el sujeto es HER2-negativo. En algunas realizaciones, el sujeto es HER2 positivo. Opcionalmente, el sujeto no ha recibido con anterioridad quimioterapia coadyuvante en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis. El régimen de tratamiento que combina la quimioterapia y la administración el anti-VEGF extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución (SLE) del sujeto. En ciertas realizaciones, el régimen de tratamiento que combina la quimioterapia y el anticuerpo anti-VEGF tiene un perfil de seguridad que es consistente con los resultados de los ensayos previos con bevacizumab.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos, los usos y composiciones proporcionados en esta invención, la SLE se extiende aproximadamente 1 mes, 1 ,2 meses, 2 meses, 2,4 meses, 2,9 meses, 3 meses, 3,5 meses, 4 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 1 año, aproximadamente 2 años, alrededor de 3 años, etc. En una realización, la SLE se extiende aproximadamente 2,9 meses a 3,5 meses (por ej., con capecitabina). En una realización, la SLE se extiende alrededor de 1 ,2 meses a aproximadamente 2,4 meses (por ej., con taxano/antraciclina).

Puede utilizarse cualquier agente quimioterapéutico que exhiba actividad anticancerígena de acuerdo con cualquiera de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención. En ciertas realizaciones, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo formado por agentes alquilantes, antimetabolitos, análogos del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, e inhibidores relacionados, alcaloides de la Vinca, epipodopillotoxinas, antibióticos, L-Asparaginasa, inhibidor de topoisomerasa, interferones, complejos de coordinación de platino, urea sustituida con antracenodiona, derivados de metilhidrazina, supresores adrenocorticales, adrenocorticosteroides, progestinas, estrógenos, antiestrógeno, andrógenos, antiandrógeno, y análogo de la hormona liberadora de gonadotropina. En ciertas realizaciones, el agente quimioterapéutico es por ejemplo, capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida o sus combinaciones. Pueden utilizarse dos o más agentes quimioterapéuticos (por ej., en un cóctel) a ser administrados en combinación con la administración del anticuerpo anti-VEGF.

Los beneficios clínicos de cualquiera de los métodos, usos y composiciones proporcionados aquí de acuerdo con esta invención pueden medirse por, por ejemplo, la duración de la supervivencia libre de evolución (SLE), falla del tiempo hasta el tratamiento, índice de respuesta objetiva y durante de respuesta.

Por lo tanto, la invención presenta un método para instruir a un sujeto humano con, por ej., cáncer de mama proporcionando instrucciones para recibir tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF de modo de aumentar la supervivencia libre de evolución del sujeto, para disminuir el riesgo del sujeto de recurrencia del cáncer o aumentar la probabilidad del sujeto de sobrevivir. En algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar instrucciones para recibir tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico. El tratamiento con el anticuerpo anti-VEGF puede ser concurrente con o consecutivo con el tratamiento con el agente quimioterapéutico. En ciertas realizaciones, el sujeto es tratado según las instrucciones mediante el método de instrucción.

La invención proporciona además un método promocional, que comprende promover la administración de un anticuerpo anti-VEGF para el tratamiento de, por ej., cáncer de mama en un sujeto humano. En algunas realizaciones, el método comprende además promover la administración de por lo menos un agente quimioterapéutico. La administración del anticuerpo anti-VEGF puede ser concurrente con, o consecutiva a, la administración del agente quimioterapéutico. La promoción puede llevarse a cabo mediante cualquier medio disponible. En algunas realizaciones, la promoción es mediante un material impreso del paquete que acompaña una formulación comercial del anticuerpo anti-VEGF. La promoción también puede ser mediante un material impreso del paquete que acompaña una formulación comercial del agente quimioterapéutico. La promoción puede ser por comunicación escrita u oral a un médico o proveedor del cuidado de la salud. En algunas realizaciones, la promoción es mediante un material impreso del paquete donde el material impreso del paquete proporciona instrucciones para recibir la terapia con anticuerpo anti-VEGF. En algunas realizaciones, la promoción es seguida por el tratamiento del sujeto con el anticuerpo anti-VEGF con o sin el agente quimioterapéutico.

La invención proporciona un método comercial, que comprende comercializar un anticuerpo anti-VEGF para el tratamiento de, por ej., cáncer de mama en un sujeto humano de modo de aumentar la supervivencia libre de evolución, o disminuir la probabilidad del sujeto de recurrente del cáncer o aumentar la probabilidad del sujeto de supervivencia. En algunas realizaciones el método comprende además comercializar un agente quimioterapéutico para utilizar en combinación con el anticuerpo anti-VEGF. En algunas realizaciones la comercialización es seguida por el tratamiento del sujeto con el anticuerpo anti-VEGF con o sin el agente quimioterapéutico.

Se proporciona además un método de comercialización, que comprende comercializar un agente quimioterapéutico en combinación con un anticuerpo anti-VEGF para el tratamiento de, por ej., cáncer de mama en un sujeto humano de modo de aumentar la supervivencia libre de evolución, o disminuir la probabilidad del sujeto de recurrencia del cáncer o aumentar la probabilidad de supervivencia del sujeto. En algunas realizaciones, la comercialización es seguida por tratamiento del sujeto con la combinación del agente quimioterapéutico y el anticuerpo anti-VEGF.

En cualquiera de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención, el anticuerpo anti-VEGF puede ser sustituido con un antagonista específico de VEGF, por ej., una molécula receptora de VEGF o molécula receptora de VEGF quimérica según lo descrito en esta invención. En ciertas realizaciones de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención, el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab. El anticuerpo anti-VEGF, o su fragmento de unión al antígeno, puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo totalmente humano, o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos ejemplares útiles en los métodos de la invención incluyen bevacizumab (AVASTIN®), un anticuerpo G6, un anticuerpo B20, y sus fragmentos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF tiene una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEC ID No. 1 ) y una región variable de cadena liviana que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWY QKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEC ID No. 2).

El anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, también puede ser un anticuerpo que carece de una porción de Fe, una estructura F(ab')2, Fab, o Fv.

En una realización de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención, el tratamiento es una combinación de un antagonista específicos de VEGF, por ej., anticuerpo anti-VEGF, y por lo menos un agente quimioterapéutico. En otras realizaciones de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención, el antagonista específico de VEGF es una monoterapia.

Cada uno de cualquiera de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención puede practicarse con relación al tratamiento de cánceres incluyendo, aunque sin limitarse a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más particulares de ese tipo de cánceres incluyen cáncer de mama, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma escamoso pulmonar, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer vulvar, cáncer de tiroide, carcinoma hepático, cáncer gástrico, melanoma, y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En algunas realizaciones de los métodos de la invención, el sujeto tiene cáncer de mama metastásico. En algunas realizaciones de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención el sujeto tiene cáncer de mama metastásico previamente no tratado. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer de mama metastásico HER2-negativo.

Cada uno de los aspectos antes mencionados puede incluir además monitorear al sujeto para determinar la recurrencia del cáncer. El monitoreo puede lograrse, por ejemplo, evaluando la supervivencia libre de evolución (SLE) o supervivencia general (SG) o índice de respuesta objetiva (IRO). En una realización, La SLE o la SG o el IRO se evalúan después del inicio del tratamiento.

Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, las dosis preferidas para el anticuerpo anti-VEGF, por ej., bevacizumab, son descritas en esta invención y pueden oscilar entre aproximadamente 1 pg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, con máxima preferencia entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aunque sin limitarse a 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg. La frecuencia de administración variará dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad. Para las administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la afección, el tratamiento es sostenido hasta que el cáncer es tratado o el efecto terapéutico deseado es logrado, según lo medido mediante los métodos descritos en esta invención o conocidos en la técnica. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF es administrado una vez por semana, cada dos semanas, o cada tres semanas, en un rango de dosis entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aunque sin limitarse a 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de la terapia de la invención es fácilmente monitoreado mediante técnicas y ensayos convencionales.

En realizaciones adicionales de cada uno de los aspectos antes mencionados, el antagonista específico de VEGF, por ej., anticuerpo anti-VEGF es administrado local o sistémicamente (por ej., por vía oral o intravenosa). En otras realizaciones, un aspecto del tratamiento es con el antagonista específico de VEGF en una monoterapia o una monoterapia durante la duración del período de tratamiento con el antagonista específico de VEGF, por ej., en terapia de fase de tratamiento prolongado o de mantenimiento, según lo evaluado por el clínico o descrito en esta invención.

En otras realizaciones de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención, el tratamiento, uso o composición con el antagonista específico de VEGF es en combinación con una terapia anticancerígena adicional, incluyendo aunque sin limitarse a, cirugía, terapia de radiación, quimioterapia, terapia de diferenciación, bioterapia, inmunoterapia, un inhibidor de la angiogénesis, un. agente citotóxico, y/o un compuesto antiproliferativo. El tratamiento, uso y composición con el antagonista específico de VEGF puede incluir además cualquier combinación de los tipos antes mencionados de regímenes terapéuticos. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico y el antagonista específico de VEGF son administrados concurrentemente.

En las realizaciones de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención que incluyen una terapia anticancerígena adicional, el sujeto puede ser adicionalmente tratado con la terapia anticancerígena adicional antes, durante (por ej., simultáneamente), o después de la administración del antagonista específico de VEGF. En una realización, el antagonista específico de VEGF, administrado solo o con una terapia anticancerígena, puede ser administrado como terapia de mantenimiento.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente Descripción Detallada, los dibujos y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 ilustra el diseño de estudio para el . ensayo de cáncer de mama metastásico utilizando bevacizumab (BV) o placebo (PL) con diversas quimioterapias.

Figura 2 ilustra las curvas de supervivencia libre de evolución (SLE) para brazo de capecitabina del ensayo. INV (investigador) es SLE evaluado por el investigador y CRI es SLE evaluada por el comité de revisión independiente (CRI), donde el placebo es PL y bevacizumab es BV.

Figure 3 ilustra curvas de SLE para el brazo de taxano/antraciclina del ensayo. INV es SLE evaluado por el investigador y la CRI es SLE evaluado por el comité de revisión independiente (CRI), donde el placebo es PL y bevacizumab es BV.

Figura 4 ilustra un análisis de subgrupos de SLE en los grupos de capecitabina y taxano/antraciclina del ensayo.

Figura 5 ilustra el índice de respuesta objetiva para los grupos de capecitabina (Cape) y taxano/antraciclina (T/Antra).

Figura 6 ilustra un análisis de subgrupos de SLE para cohortes de taxano/antraciclina (T/Antra).

DESCRIPCIÓN DETALLADA I. DefiniCIONES El término "VEGF" o "VEGF-A" se utiliza para hacer referencia al factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humanas de 165 aminoácidos y factores de crecimiento de células endoteliales vasculares humano de 121 , 145, 189 y 206 aminoácidos relacionados, según lo descrito por, por ej., Leung et al. Science, 246:1306 (1989), y Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), junto con sus formas naturales alélicas y procesadas. VEGF-A es parte de una familia genética que incluye VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, y PIGF. VEGF-A se une principalmente a dos tirosina quinasas receptoras de elevada afinidad, VEGFR-1 (Flt-1 ) y VEGFR-2 (Flk-1/KDR), siendo este último el mayor transmisor de señales mitógenas de células endoteliales vasculares de VEGF-A. Adicionalmente, se ha identificado la neuropilina-1 como un receptor para las isoformas de VEGF-A de unión a heparina, y puede jugar un rol en el desarrollo vascular. El término "VEGF" o "VEGF-A" también se refiere a VEGFs de especies no humanas tales como ratón, rata o primate. Algunas veces el VEGF de una especie específica es indicado mediante términos tales como VEGFh para VEGF humano o VEGFm para VEGF murino. Típicamente, VEGF se refiere a VEGF humano. El término "VEGF" también es utilizado para hacer referencia a formas truncadas o fragmentos del polipéptido que comprende los aminoácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humano de 165 aminoácidos. La referencia a cualquiera de esas formas de VEGF puede ser identificada en la solicitud, por ej., mediante "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" o "VEGF165." Las posiciones de aminoácidos para un VEGF nativo "truncado" son numeradas según lo indicado en la secuencia de VEGF nativo. Por ejemplo, la posición de aminoácido 17 (metionina) en VEGF nativo truncado es también la posición 17 (metionina) en VEGF nativo. El VEGF nativo truncado tiene afinidad de unió para los receptores KDR y Flt-1 comparable con VEGF nativo.

Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se une a VEGF con suficiente afinidad y especificidad. El anticuerpo seleccionado normalmente tendrá una afinidad de unión para VEGF, por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a VEGFh con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de los anticuerpos pueden determinarse mediante un ensayo basado en resonancia de plasmón superficial (tal como el ensayo BIAcore según lo descrito en la Publicación de Solicitud de PCT No. WO2005/012359); ensayo de inmunoabsorbencia ligada a enzima (ELISA); y ensayos de competición (por ej. RIA's), por ejemplo. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede utilizarse como un agente terapéutico en el direccionamiento e interferencia con enfermedades o afecciones donde la actividad de VEGF está involucrada. También, el anticuerpo puede ser sometidos a otros ensayos de actividad biológica, por ej., a fin de evaluar su eficacia como un agente terapéutico. Ese tipo de ensayos son conocidos en la técnica y dependen del antígeno objetivo y del uso pretendido para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de inhibición de HUVEC; ensayos de inhibición del crecimiento de células tumorales (según lo descrito en WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC, según sus siglas en inglés) y ensayos de citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) (Patente de los Estados Unidos No. 5.500.362); y ensayos de actividad agonista o hematopoyesis (ver WO 95/27062). Un anticuerpo anti-VEGF no se unirá, en general, a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni a otros factores del crecimiento tales como PIGF, PDGF o bFGF.

Un "antagonista de VEGF" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades del VEGF incluyendo su unión a uno o más receptores de VEGF. Los antagonistas del VEGF incluyen anticuerpos anti-VEGF y sus fragmentos de unión al antígeno, moléculas receptoras y derivados los cuales se unen específicamente a VEGF secuestrando de ese modo su unión a uno o más receptores, anticuerpos de receptor anti-VEGF y antagonistas de receptor de VEGF tales como inhibidores de moléculas pequeñas de las tirosina quinasas del VEGFR.

Un polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido derivado de la naturaleza. Por consiguiente, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de polipéptido natural de cualquier mamífero. Ese tipo de polipéptido de secuencia nativa puede ser aislado de la naturaleza o puede ser producido mediante medios recombinantes o sintéticos. El término polipéptido de "secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o secretadas naturales del polipéptido {por ej., una secuencia de dominio extracelular), formas de variantes naturales (por ej., formas alternativamente empalmadas y cortadas) y variantes alélicas naturales del polipéptido.

Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo que tiene por lo menos aproximadamente 80% identidad de secuencias de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos donde se agregan uno o más residuos de aminoácidos, o se suprimen, en el término N o C del polipéptido. Normalmente, una variante tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, e incluso más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos {por ej., anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos (ver más abajo) siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada.

A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), que se incorpora expresamente a la presente como referencia. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU de lgG1 humano.

El "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención es, en una realización, medido mediante un ensayo de unión de VEGF radioetiquetado (RIA) realizado con la versión Fab del anticuerpo y una molécula de VEGF según lo descrito mediante el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión de la solución de Fabs para VEGF equilibrando Fab con una concentración mínima de VEGF (125l)-etiquetado VEGF(109) en presencia de una serie de titulación de VEGF no etiquetado, luego capturando VEGF unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881 ). En un ejemplo, para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtítulo (Dynex) son recubiertas durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato sódico 50 mM (pH 9,6), y posteriormente bloqueado con 2% (p/v) se seroalbúmina bovina en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM [125I]VEGF(109) se mezclan con diluciones seriadas de un Fab de interés, por ej., Fab-12 (Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés es luego incubado durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante 65 horas para asegurar que se alcance el equilibrio. A continuación, las mezclas son transferidas a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente durante una hora. Luego, la solución es retirada y la placa se lava ocho veces con 0,1% de Tween-20 en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150 ul/pocillo de agente de centelleo (MicroScint-20; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que . dan menos o igual a 20% de unión máxima se seleccionan para utilizar en ensayos de unión competitiva. De acuerdo con otra realización, la Kd o valor Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con VEGFh inmovilizado (8-109) CM5 chips a -10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) son activados con clorhidrato de N-etW-N'- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El VEGF humano se diluye con acetato sódico 10mM, pH 4,8, en 5ug/ml. (~0,2uM) antes de la inyección a un índice de flujo de 5ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (IR) de proteína acoplada. Luego de la inyección de VEGF humano, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones de la cinética, se inyectan diluciones seriadas de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a un índice de flujo de aproximadamente 25ul/min. Se calculan los índices de asociación (kencend¡do) y los índices de disociación (kapagado) utilizando un modelo de unión Langmuir uno a uno simple (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) mediante ajuste simultáneo del sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la relación kapagado/kencend¡do. Ver, por ej., Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Si el índice encendido excede 106 M'1 S"1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial antes mencionado, entonces el índice encendido puede determinarse utilizando una técnica de templado fluorescente que mide el aumento o reducción de la intensidad de emisión de la fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm pase de banda (band-pass)) a 25°C de un anticuerpo anti-VEGF 20nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones en aumento de la forma corta de VEGF humano (8-109) o VEGF de ratón según lo medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de terminación (stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con un recipiente agitado.

Un anticuerpo "de bloqueo" o un "antagonista" de anticuerpo es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista específico de VEGF une VEGF e inhibe la capacidad de VEGF para inducir la angiogénesis, para inducir la proliferación de células endoteliales vasculares o para inducir la permeabilidad vascular. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben completamente la actividad biológica del antígeno.

A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo multivalente" se utiliza a lo largo de esta memoria descriptiva para denotar un anticuerpo que comprende tres o más sitios de unión al antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo multivalente es modificado genéticamente para que tenga los tres o más sitios de unión al antígeno y no es generalmente un anticuerpo de IgM o IgA de secuencia nativa.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden solamente una porción de un anticuerpo intacto, generalmente incluyendo un sitio de unión al antígeno del anticuerpo intacto y así reteniendo la capacidad de unión al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos abarcados por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1 ; (ii) el fragmento Fab', el cual es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos cisteína en el término C del dominio CH1 ; (iii) el fragmento Fd que tiene los dominios VH y CH1 ; (iv) el fragmento Fd' que tiene los dominios VH y CH1 y uno o más residuos cisteína en el término C del dominio CH1 ; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et ai, Nature 341 , 544-546 (1989)) el cual consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas CDR; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' ligados mediante un puente disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpos de cadena simple (por ej. Fv de cadena simple; scFv) (Bird ef al., Science 242:423-426 (1988); y Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacuerpos" con dos sitios de unión al antígeno, que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH, según sus siglas en inglés) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL, según sus siglas en inglés) en la misma cadena polipeptídica (ver, por ej., EP 404,097; WO 93/11161 ; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1 ) los cuales, junto con polipéptidos de cadena liviana complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno (Zapata ef al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); y Patente de los Estados Unidos No. 5.641.870).

El término "anticuerpo monoclonal " según se utiliza en esta invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto las posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un único antígeno. Por añadidura, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" no debe ser interpretado como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo con la invención pueden prepararse mediante el método del hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ej., Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados de genotecas de anticuerpos en fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991 ) o Marks eí al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991 ), por ejemplo.

Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo el cual contiene un sitio de reconocimiento y unión al antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena liviana en asociación estrecha, el cual puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo en scFv. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDRs o un subconjunto del mismo confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, si bien en general a una afinidad inferior al sitio de unión entero.

Según se utiliza en esta invención, "dominio variable del anticuerpo" se refiere a las porciones de las cadenas liviana y pesada de moléculas de anticuerpos que incluyen secuencias de aminoácidos de Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs, según sus siglas en inglés; es decir, CDR1 , CDR2, y CDR3), y Regiones de Estructura (FRs, según sus siglas en inglés). VH se refiere al dominio variable de la cadena pesada. VL se refiere al dominio variable de la cadena liviana. De acuerdo con los métodos utilizados en esta invención, las posiciones de aminoácidos asignadas a CDRs y FRs pueden definirse de acuerdo con Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991 )). La numeración de los aminoácidos de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno es también de acuerdo con aquella de Kabat.

Según se utiliza en esta invención, el término "Regiones Determinantes de Complementariedad" (CDRs; es decir, CDR1 , CDR2, y CDR3) se refiere a los residuos aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión al antígeno. Cada dominio variable típicamente tiene tres regiones CDR identificadas como CDR1 , CDR2 y CDR3. Cada región determinante de complementariedad puede comprender residuos aminoácidos de una' "región determinante de complementariedad" según lo definido por Kabat (es decir alrededor de los residuos 24-34 (L1 ), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena liviana y 31-35 (H1 ), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (es decir, aproximadamente los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena liviana y 26-32 (H1 ), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). En algunos casos, una región determinante de complementariedad puede incluir los aminoácidos tanto de una región CDR definida de acuerdo con Kabat como de un lazo hipervariable. Por ejemplo, la CDRH1 de la cadena pesada de anticuerpo 4D5 incluyen a los aminoácidos 26 a 35.

"Regiones de estructura" (en adelante FR según sus siglas en inglés) son aquellos residuos de dominio variable que no son los residuos de CDR. Cada dominio variable típicamente tiene cuatro FRs identificadas como FR1 , FR2, FR3 y FR4. Si las CDRs son definidas de acuerdo con Kabat, los residuos de FR de cadena liviana son posicionados en aproximadamente los residuos 1-23 (LCFR1 ), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), y 98-107 (LCFR4) y los residuos de FR de cadena pesada son posicionados aproximadamente en los residuos 1 -30 (HCFR1 ), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), y 103-1 13 (HCFR4) en los residuos de cadena pesada. Si las CDRs comprenden residuos aminoácidos de lazos hipervariables, los residuos de FR de cadena liviana están posicionados aproximadamente en los residuos 1-25 (LCFR1 ), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), y 97-107 (LCFR4) en la cadena liviana y los residuos de FR de cadena pesada están posicionados aproximadamente en los residuos 1 -25 (HCFR1 ), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), y 102-1 13 (HCFR4) en los residuos de cadena pesada. En algunos casos, cuando la CDR comprende aminoácidos tanto de una CDR según lo definido por Kabat como aquellas de un lazo hipervariable, los residuos de FR serán ajustados concordantemente. Por ejemplo, cuando CDRH1 incluye a los aminoácidos H26-H35, los residuos de FR1 de cadena pesada están en las posiciones 1-25 y los residuos de FR2 están en las posiciones 36-49.

El fragmento "Fab" contiene un dominio variable y constante de la cadena liviana y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 comprenden un parte de fragmentos Fab los cuales son generalmente covalentemente ligados cerca de sus terminales carboxi por cisteínas bisagra entre los mismos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos son también conocidos en la técnica.

Fragmentos de anticuerpos de "Fv de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios de VH y \A_ de anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple. En general, el polipéptido de Fv comprende además un ligante polipeptídico entre los dominios de VH y V|_, lo cual permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión al antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (V|_) en la misma cadena polipeptídica (VH y V|_). Utilizando un ligante que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos son descritos más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161 ; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1 ) los cuales, junto con polipéptidos de cadena liviana complementaria, forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica a, u homologa a, las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie en particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico a, u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851 -6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ej., murinos) son anticuerpos quiméricos los cuales contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Por añadidura, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos los cuales no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones son realizadas para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad o por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de los lazos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente todas las regiones FR son .aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos la cual corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido preparado utilizando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos según lo descrito en esta invención. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona entre una genoteca de fagos, donde esa genoteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al.. Proc. Nati. Acad. Sel. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991 )). También pueden prepararse anticuerpos humanos introduciendo sitios de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ej., ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos han sido parcial o completamente inactivados. Luego del desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, los cuales se asemejan estrechamente a los vistos en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización genética, ensamblaje, y repertorio de anticuerpos. Este método es descrito, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano puede ser preparado por medio de inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno objetivo (dichos linfocitos B pueden ser recuperados de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Ver, por ej., Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1 ):86-95 (1991 ); y la Patente de los Estados Unidos No. 5.750.373.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más de sus CDRs lo cual da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental el cual no posee aquella o aquellas alteraciones. Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante barajado de dominios VH y VL (domain shuffiing). La mutagénesis al azar de residuos de CDR y/o estructura es descrita por: Barbas, et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un "sitio de unión al antígeno funcional" de un anticuerpo es aquel que es capaz de unión a un antígeno objetivo. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión al antígeno no es necesariamente tan fuerte como el anticuerpo parental del cual deriva el sitio de unión al antígeno, pero la capacidad de unión al antígeno debe poderse medir utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión del anticuerpo a un antígeno. Asimismo, la afinidad de unión a un antígeno de cada uno de los sitios de unión a un antígeno de un anticuerpo multivalente de esta invención no necesariamente es cuantitativamente la misma. Para los anticuerpos multiméricos de la presente invención, la cantidad de sitios de unión al antígeno funcionales puede evaluarse utilizando análisis de ultracentrifugación según lo descrito en el Ejemplo 2 de la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20050186208. De acuerdo con este método de análisis, se combinan diferentes relaciones de antígeno objetivo a anticuerpo multimérico y se calcula el peso molecular promedio de los complejos asumiendo cantidades diferentes de sitios de unión funcionales. Estos valores teóricos son comparados con los valores experimentales reales obtenidos a fin de evaluar la cantidad de sitios de unión funcionales.

Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado es aquel que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo la cual la distingue de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno.

A fin de seleccionar anticuerpos los cuales se unen a un epítopo en un antígeno unido mediante un anticuerpo de interés, puede llevarse a cabo un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988).

Un "anticuerpo dependiente de una especie" es aquel el cual tiene una afinidad de unión más fuerte para un antígeno de una primera especie de mamífero que la que tiene para un homólogo de ese antígeno de una segunda especie mamífera. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie "se une específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10"7 M, con preferencia no más de aproximadamente 1 x 10"8 M y con máxima preferencia, no más de aproximadamente 1 x 10"9 M) aunque tiene una afinidad de unión para un homólogo del antígeno de una segunda especie mamífera no humana que es por lo menos aproximadamente 50 veces, o por lo menos aproximadamente 500 veces, o por lo menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión para el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos según lo definido anteriormente, pero típicamente es un anticuerpo humanizado o humano.

Según se utiliza en esta invención, "mutante de anticuerpo" o "variante de anticuerpo" se refiere a una variante de secuencia de aminoácidos del anticuerpo dependiente de la especie donde uno o más de los residuos aminoácidos del anticuerpo dependiente de la especie se han modificado. Dichos mutantes tienen necesariamente menos de 100% de identidad o similitud de secuencia con el anticuerpo dependiente de la especie. En una realización, el mutante de anticuerpo tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75% de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o liviana del anticuerpo dependiente de la especie, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, y con máxima preferencia por lo menos 95%. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia es definida en esta invención como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticos (es decir, mismo residuo) o similar (es decir, residuo aminoácido del mismo grupo en base a las propiedades de cadena lateral comunes, ver más adelante) con los residuos de anticuerpo dependiente de la especie, después de alinear las secuencias e introducir espacios, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencias. Ninguna de las extensiones, supresiones o inserciones de terminal N, terminal C o internas en la secuencia del anticuerpo fuera del dominio variable deberá interpretarse como afectando la identidad o similitud de secuencias.

Para aumentar la vida media de los anticuerpos o del polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos de esta invención, se puede unir un epítopo de unión al receptor salvaje al anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo), según lo descrito, por ej., en la Patente de los Estados Unidos No. 5.739.277. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica el epítopo de unión al receptor de rescate puede estar ligada en marco a un ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica de esta invención de modo que la proteína de fusión expresada por la molécula de ácido nucleico modificada genéticamente comprenda el epítopo de unión al receptor de rescate y una secuencia polipeptídica de esta invención. Según se utiliza en esta invención, el término "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ej., IgG-i, lgG2, lgG3, o lgG4) que es responsable de aumentar la vida media sérica in vivo de la molécula de IgG (por ej., Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), Tabla 1 ). Los anticuerpos con sustituciones en una región Fe de los mismos y vidas medias en suero aumentadas son también descritos en WOOO/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001 ); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)). En otra realización, la vida media sérica también puede ser aumentada, por ejemplo, uniendo otras secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, los anticuerpos u otros polipéptidos útiles en los métodos de la invención pueden unirse a albúmina sérica o a una porción de albúmina sérica que se une al receptor FcRn o a un péptido de unión a albúmina sérica de modo que la albúmina sérica se une al anticuerpo o polipéptido, por ej., dichas secuencias polipeptídicas son descritas en WO01/45746. En una realización, el péptido de albúmina sérica a ser unido comprende una secuencia de aminoácidos de DICLPRWGCLW. En otra realización, la vida media de un Fab es incrementada mediante estos métodos. Ver además, Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) para secuencias peptídicas de unión a albúmina sérica.

Una "proteína receptora de VEGF quimérica" es una molécula receptora de VEGF que tiene secuencias de aminoácidos derivadas de por lo menos dos proteínas diferentes, por lo menos una de las cuales es una proteína receptora de VEGF. En ciertas realizaciones, la proteína receptora de VEGF quimérica es capaz de unión a, y de inhibir, la actividad biológica de VEGF.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo estará purificado (1 ) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según lo determinado mediante el método de Lowry, y con máxima preferencia, más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos de terminal N o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, coloración con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que por lo menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante, por lo menos, un paso de purificación.

Por "fragmento" se quiere decir una porción de una molécula de polipéptido o ácido nucleico que contiene, con preferencia, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o más de la longitud entera de la molécula o polipéptido de ácido nucleico de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100, 200, 300, 400, 500, 600, o más nucléótidos o 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 aminoácidos o más.

Un "agente anti-angiogénesis" o "inhibidor de la angiogénesis" se refiere a una sustancia de peso molecular pequeño, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhibe la angiogénesis, vasculogénesis, o la permeabilidad vascular no deseada, ya sea en forma directa o indirecta. Debería entenderse que el agente anti-angiogénesis incluye aquellos agentes que unen y bloquean la actividad angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente anti-angiogénesis es un anticuerpo u otro antagonista de un agente angiogénico según lo definido a lo largo de la memoria descriptiva o conocido en la técnica, por ej., aunque sin limitarse a, anticuerpos contra VEGF-A o contra el receptor de VEGF-A (por ej., el receptor KDR o el receptor Flt-1), VEGF-trap, inhibidores anti-PDGFR tal como Gleevec (Mesilato de Imatinib). Los agentes anti-angiogénesis también incluyen a los inhibidores de la angiogénesis nativos, por ej., angiostatina, endostatina, etc. Ver, por ej., Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991 ); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 ,(2003) (por ej., la Tabla 3 que enlista la terapia anti-angiogénica en melanoma maligno); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ej., la Tabla 2 que enlista factores antiangiogénicos conocidos); y Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por ej., la Tabla 1 enlista agentes anti-angiogénicos utilizados en los ensayos clínicos).

Una dosis de "mantenimiento" en la presente invención se refiere a una o más dosis de un agente terapéutico administrado al sujeto durante o después de un período de tratamiento. En general, las dosis de mantenimiento son administradas en intervalos de tratamiento espaciados, tales como de aproximadamente todas las semanas, aproximadamente cada 2 semanas, aproximadamente cada 3 semanas, o aproximadamente cada 4 semanas.

"Supervivencia" se refiere a que el sujeto sigue estando vivo, e incluye la supervivencia libre de evolución (SLE) y la supervivencia en general (SG). La supervivencia puede ser estimada mediante el método de Kaplan-Meier, y cualquier diferencia en la supervivencia se computa utilizando el ensayo de rangos log estratificado ("stratified log-rank test").

"Supervivencia libre de evolución (SLE)" se refiere al tiempo desde el tratamiento (o randomización) hasta la primera progresión de la enfermedad o muerte. Por ejemplo, es el tiempo que el sujeto permanece vivo, sin retorno del cáncer, por ej., durante un período de tiempo definido tal como de aproximadamente 1 mes, 1 ,2 meses, 2 meses, 2,4 meses, 2,9 meses, 3 meses, 3,5 meses, 4, meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 1 año, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, etc., desde el inicio del tratamiento o desde el diagnóstico inicial. En una realización, la SLE se extiende alrededor de 2,9 meses hasta 3,5 meses (por ej., con capecitabina). En una realización, la SLE se extiende alrededor de 1 ,2 meses hasta aproximadamente 2,4 meses (por ej., con taxano/antraciclina). En un aspecto de la invención, la SLE puede evaluarse mediante los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST).

"Supervivencia general" se refiere a que el sujeto permanece vivo durante un período definido de tiempo, tal como alrededor de 1 año, alrededor de 2 años, alrededor de 3 años, alrededor de 4 años, alrededor de 5 años, alrededor de 10 años, etc., desde el inicio del tratamiento o desde el diagnóstico inicial. En los estudios que son el fundamento de la invención, el evento utilizado para el análisis de la supervivencia fue la muerte por cualquier causa.

Por "supervivencia prolongada" o "aumento de la probabilidad de supervivencia" se quiere decir aumento de la SLE y/o SG en un sujeto tratado con respecto a un sujeto no tratado (es decir, con relación á un sujeto no tratado con un antagonista específico de VEGF, por ej., un anticuerpo de VEGF), o con relación a un protocolo de tratamiento de control, tal como tratamiento únicamente con el agente quimioterapéutico, tal como aquellos utilizados en la terapia convencional para el cáncer de mama, por ej., capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida o sus combinaciones. La supervivencia se controla durante, por lo menos alrededor de un mes, dos meses, cuatro meses, seis meses, nueve meses, o por lo menos alrededor de 1 año, o por lo menos alrededor de 2 años, o por lo menos alrededor de 3 años, o por lo menos alrededor de 4 años, o por lo menos alrededor de 5 años, o por lo menos alrededor de 10 años, etc., luego del inicio del tratamiento o luego del diagnóstico inicial.

La relación de peligro (HR, según sus siglas en inglés) es una definición estadística de los índices de eventos. Para el propósito de la invención, la relación de peligro se define como la representación de la probabilidad de un evento en el brazo experimental dividido por la probabilidad de un evento en el brazo control en cualquier punto temporal específico. La "relación de peligro" en el análisis de la supervivencia libre de evolución es una síntesis de la diferencia entre dos curvas de supervivencia libre de evolución, que representa la reducción del riesgo de muerte en tratamiento en comparación con el control, durante un período de seguimiento.

El término "concurrentemente" se utiliza en la presente invención para hacer referencia a la administración de dos o más agentes terapéuticos, donde por lo menos parte de la administración se superpone en el tiempo. Por lo tanto, la administración concurrente incluye un régimen de dosificación cuando la administración de uno o más agentes continua después de discontinuar la administración de uno o más agentes diferentes.

Por "monoterapia" se quiere decir un régimen terapéutico que incluye solamente un único agente terapéutico para el tratamiento del cáncer o del tumor durante el transcurso del período de tratamiento. La monoterapia que utiliza un antagonista específico de VEGF significa que el antagonista específico de VEGF es administrado en ausencia de una terapia anticancerígena adicional durante el período de tratamiento.

Por "terapia de mantenimiento" se quiere decir un régimen terapéutico que es administrado para reducir la probabilidad de recurrencia de la enfermedad o progresión de la misma. La terapia de mantenimiento puede ser proporcionada durante cualquier longitud de tiempo, incluyendo períodos de tiempo prolongados hasta de por vida. La terapia de mantenimiento puede ser proporcionada después de la terapia inicial o en conjunto con terapias iniciales o adicionales. Las dosis utilizadas para la terapia de mantenimiento pueden variar y pueden incluir dosis reducidas en comparación con las dosis utilizadas para otros tipos de terapia. Ver también "mantenimiento" en esta invención.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a, o describen, la condición fisiológica en mamíferos que es típicamente caracterizada mediante el crecimiento celular desregulado. Se incluyen en esta definición los cánceres benignos y malignos así como también los tumores latentes o micrometástasis. Los ejemplos de cáncer incluyen, aunque sin limitarse a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de mama, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma pulmonar, y carcinoma escamoso pulmonar), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñon o cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroide, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y de cuello, así como también linfoma de células B (incluyendo linfoma no Hodgkin (NHL, según sus siglas en inglés)de bajo grado/ folicular; NHL linfocítico pequeño (SL, según sus siglas en inglés); NHL de grado intermedio /folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado elevado; NHL linfoblástico de grado elevado; NHL de células no disociadas pequeñas de elevado grado; NHL de enfermedad de gran masa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL, según sus siglas en inglés); leucemia linfoblástica aguda (ALL, según sus siglas en inglés); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo posterior a transplante (PTLD, según sus siglas en inglés), así como también la proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como aquel asociada con tumores cerebrales), y síndrome de Meigs.

Por "metástasis" se quiere decir el esparcimiento del cáncer desde su sitio primario hacia otros lugares en el cuerpo. Las células cancerígenas puede desintegrarse desde un tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través del torrente sanguíneo, y crecer en un foco distante (metástasis) en tejidos normales en otra parte del cuerpo. La metástasis puede ser local o distante. La metástasis es un proceso secuencial, contingente en células tumorales que se desprenden del tumor primario, que viajan a través del torrente sanguíneo, y que se detienen en un sitio distante. En el nuevo sitio, las células establecen un suministro de sangre y pueden crecer para formar una masa que amenaza la vida. Tanto las rutas moleculares estimuladoras como inhibidoras dentro de la célula tumoral regulan este comportamiento, y las interacciones entre la célula tumoral y las células huéspedes en el sitio distante son también significativas.

Por "sujeto" se quiere decir un mamífero, incluyendo, aunque sin limitarse a, un ser humano o mamífero no humano tal como bovino, equino, canino, ovino o felino. Con preferencia, el sujeto es un humano. Los pacientes también son sujetos en la presente invención.

Para los métodos de la presente invención, el término "instruir" a un sujeto significa proporciona instrucciones para la terapia aplicable, la medicación, el tratamiento, los regímenes de tratamiento y similares, mediante cualquier medio, pero preferentemente por escrito, tal como en la forma de material impresos de paquete u otro material promocional escrito.

Para los métodos de la presente invención, el término "promover" significa ofrecer, publicar, vender, o describir un fármaco en particular, combinación de fármacos, o modalidad de tratamiento, por cualquier medio, incluyendo, por escrito, tal como en la forma de material impresos de paquete. Promover en la presente invención se refiere a la promoción de un agente terapéutico, tal como un antagonista de VEGF, por ej., anticuerpo anti-VEGF o agente quimioterapéutico, para una indicación, tal como el tratamiento para el cáncer de mama, donde dicha promoción es autorizada por el Food and Drug Administration (FDA, agente que regula la Administración de Alimentos y Fármacos) como habiendo demostrado estar asociado con la eficacia terapéutica estadísticamente significativa y seguridad aceptable en una población de sujetos.

El término "comercializar" se utiliza en esta invención para describir la promoción, venta o distribución de un producto (por ej., un fármaco). Comercializar incluye específicamente el paquete, publicidad y cualquier actividad comercial con el propósito de comercializar un producto.

Una "población" de sujetos se refiere a un grupo de sujetos con cáncer, tal como en un ensayo clínico, o según lo observado por oncólogos luego de la aprobación por FDA para una indicación en particular, tal como la terapia para el cáncer de mama. En una realización, la población comprende por lo menos alrededor de 1200 sujetos.

El término "terapia anticancerígena" se refiere a una terapia útil para el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos anticancerígenos incluyen, aunque sin limitarse a, por ej., cirugía, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes utilizados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina, y otros agentes para tratar un cáncer, tal como anticuerpos anti-HER-2 (por ej., Herceptin®), anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, según sus siglas en inglés) (por ej., un inhibidor de tirosina quinasa), inhibidor de HER1/EGFR (por ej., erlotinib (Tarceva®)), inhibidores del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (por ej., Gleevec™ (Mesilato de Imatinib)), un inhibidor de COX-2 (por ej., celecoxib), interferones, citoquinas, antagonistas (por ej., anticuerpos neutralizantes) que se unen a uno o más de los siguientes objetivos ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o receptor(es) de VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. Las combinaciones de los mismos son también incluidas en la invención.

El término "agente citotóxico " según se utiliza en esta invención se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de células. El término tiene el propósito de incluir isótopos radiactivos (por ej. At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm 53, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-T 1 ); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato del óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ej., calicheamicina, especialmente calicheamicina gammal l y calicheamicina omegaM (ver, por ej., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina, así como también cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIA YCIN® doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como, denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, y tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, y testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, y trilostano; recargador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2- etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ej., TAXOL® paclitaxel (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® Cremophor-free, formulación de nanopartículas modificadas con albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne- Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil; GEMZAR® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina; novantrona; . teniposida; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-1 1 ) (incluyendo el régimen de tratamiento de irinotecan con 5-FU y leucovorina); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluormetilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino, incluyendo el régimen de tratamiento con oxaliplatino (FOLFOX); lapatinib (Tykerb®); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ej., erlotinib (Tarceva®)) y VEGF-A que reducen la proliferación celular y sales, ácidos o derivados aceptables para uso farmacéutico de cualquiera de los antes mencionados.

También se incluye en esta definición a los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivos (SERMs, según sus siglas en inglés), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® toremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, la cual regula la producción de estrogenos en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-¡midazoles, aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® exémestano, formestano, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, y ARIMIDEX® anastrozol; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como también troxacitabina (un análogo de 1 ,3-dioxolano nucleósido citosina); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las rutas de señalización implicadas en la proliferación de células aberrantes, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ej., la ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas tales como vacunas de terapia génica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN®, y la vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y las sales aceptables para uso farmacéutico, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas mediante una población de células la cual actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y hormonas polipéptidas tradicionales. Se incluyen entre las citoquinas a la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento humana, hormona del crecimiento humna de N-metionilo, y hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como la hormona estimuladora de folículos (FSH, según sus siglas en inglés), hormona estimuladora de tiroides (TSH, según sus siglas en inglés), y hormona luteinizante (LH, según sus siglas en inglés); factor del crecimiento epidérmico; factor del crecimiento hepático; factor del crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor alfa y beta de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-alfa; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformadores (TGFs) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor I y II de crecimiento del tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón alfa, -beta y -gamma, factores estimuladores de colonias (CSFs, según sus siglas en inglés) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de macrófagos- granulocitos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleuquinas (ILs) tales como IL-1 , IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipéptidós incluyendo LIF y ligando kit (KL). Según se utiliza en esta invención, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en esta invención, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de un célula in vitro y/o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento, puede ser aquel que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar que no es la fase S), tales como agentes que inducen la detención de G1 y la detención en fase M. Los bloqueadores de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), TAXOL®, y los inhibidores de topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también se derraman a la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Más información puede ser encontrada en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1 , titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente p. 13.

El término "profármaco" como se utiliza en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco progenitor y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido en la forma parental más activa. Ver, por ej., Wilman, "Prodrugs ¡n Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, aunque sin limitarse a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5- fluorocitosina y los otros profármacos de 5-fluorouridina los cuales pueden ser convertidos en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados en una forma de profármaco para utilizar en esta invención incluyen, aunque sin limitarse a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

Por "terapia de radiación" se quiere decir el uso de rayos gamma dirigidos o rayos beta dirigidos para inducir suficiente daño a una célula de modo de limitar su capacidad de funcional normalmente o de destruir la célula en su totalidad. Se apreciará que habrán muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosis y la duración del tratamiento. Los tratamientos típicos son proporcionados como una administración de una vez y las dosis típicas oscilan entre 10 y 200 unidades (Grays) por día.

Por "reducir o inhibir" se quiere decir la capacidad de causar una disminución general con preferencia de 20% o más, más preferentemente de 50% o más, y con máxima preferencia de 75%, 85%, 90%, 95%, o más. Reducir o inhibir puede hacer referencia a los síntomas del trastorno que se está tratando, la presencia o tamaño de las metástasis o micrometástasis, el tamaño del tumor primario, la presencia o el tamaño del tumor latente o el tamaño o cantidad de vasos sanguíneos en los trastornos angiogénicos.

El término "infusión intravenosa" se refiere a la introducción de un fármaco en la vena de un animal o sujeto humano durante un período de tiempo superior a aproximadamente 5 minutos, con preferencia de aproximadamente 30 a 90 minutos, si bien, de acuerdo con la invención, la infusión intravenosa es administrada alternativamente durante 10 horas o menos.

El término "bolo intravenoso" o "empuje intravenoso" se refiere a la administración de un fármaco en una vena de un animal o ser humano de modo que el cuerpo reciba el fármaco en aproximadamente 15 minutos o menos, con preferencia en 5 minutos o menos.

El término "administración subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco debajo de la piel de un animal o de un ser humano, preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, mediante la administración sostenida, relativamente lenta de un receptáculo de fármaco. El bolsillo puede ser creado pellizcando o estirando la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente.

El término "infusión subcutánea" se refiere a la introducción de un fármaco debajo de la piel de un animal o sujeto humano, con preferencia dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, mediante la administración sostenida, relativamente lenta de un receptáculo de fármaco durante un período de tiempo que incluye, aunque sin limitarse a, 30 minutos o menos, o 90 minutos o menos. Opcionalmente, la infusión puede realizarse por implante subcutáneo de una bomba de entrega de fármaco implantada debajo de la piel del animal o sujeto humano, donde la bomba entrega una cantidad predeterminada de fármaco durante un período de tiempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos, o un período de tiempo que abarca la longitud del régimen de tratamiento.

El término "bolo subcutáneo" se refiere a la administración de un fármaco debajo de la piel de un animal o sujeto humano, donde la administración del fármaco en bolo es preferentemente menos que aproximadamente 15 minutos, más preferentemente menos de 5 minutos, y con máxima preferencia menos de 60 segundos. La administración es preferentemente dentro de un bolsillo entre la piel y el tejido subyacente, donde el bolsillo es creado, por ejemplo, pellizcando o estirando la piel hacia arriba y lejos del tejido subyacente.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas afecciones patológicas las cuales predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitativos de trastornos a ser tratados en esta invención incluyen cáncer; tumores benignos y malignos; enfermedades linfoides y leucemias; trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrófagos, epiteliales, estromales y blastocoélicos, y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir la cantidad de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y con preferencia detener) la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y con preferencia detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierta medida, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o matar las células cancerígenas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo puede, por ejemplo, medirse evaluando la duración de la supervivencia, la duración de la supervivencia libre de evolución (SLE), los índices de respuesta (IR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

"Tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno así como también aquellos que necesitan una prevención del trastorno.

La palabra "etiqueta" cuando se utiliza en esta invención se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el polipéptido. La etiqueta puede por si misma ser detectable (por ej., etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.

II. ANTICUERPOS anti-VEGF Y AntagonistAs (i) Antígeno de VEGF El antígeno del VEGF a ser utilizado para la producción de anticuerpos puede ser, . por ej., la molécula de VEGF-I65 así como también otras isoformas de VEGF o un fragmento del mismo que contiene el epítopo, deseado. Otras formas de VEGF útiles para generar anticuerpos anti-VEGF de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica.

Se obtuvo VEGF humano cribando (screening) en primer lugar una genoteca de ADNc preparada de células humanas, utilizando ADNc de VEGF bovino como una sonda de hibridación. Leung et al. (1989) Science, 246:1306. Una vez que el ADNc identificado de ese modo codifica una proteína de 165 aminoácidos que tiene más del 95% de homología con VEGF bovino; esta proteína de 165 aminoácidos es típicamente denominada VEGF humano (VEGFh) o VEGF165- La actividad mitógena de VEGF humano se confirmó expresando el ADNc de VEGF humano en células huéspedes de mamífero. El medio acondicionado por las células transfectadas con el ADNc de VEGF humano promovió la proliferación de células endoteliales capilares, mientras que las células controles'no lo hicieron. Leung ef al. (1989) Science, supra. Se realizaron más esfuerzos para clonar y expresar VEGF por medio de técnicas de ADN recombinante. (Ver, por ej., Ferrara, Laboratory Investigation 72:615-618 ( 995), y las referencias citadas en dicho documento).

VEGF es expresado en una variedad de tejidos como formas homodiméricas múltiples (121 , 145, 165, 189, y 206 aminoácidos por cada monómero) que son el resultado del empalme de ARN alternativo. VEGF121 es un mitógeno soluble que no une heparina; las formas más largas de VEGF unen heparina con afinidad progresivamente superior. Las formas de unión a heparina de VEGF puede disociarse en el término carboxi mediante plasmina para liberar una o más formas que se pueden difundir de VEGF. El secuenciado de aminoácidos del péptido de terminal carboxi identificado después de la disociación con plasmina es Arg110-Alain. La proteína "núcleo" de terminal amino, VEGF (1-110) aislada como un homodímero, se une a anticuerpos monoclonales neutralizantes (tales como los anticuerpos denominados 4.6.1 y 3.2E3.1.1 ) y las formas solubles de receptores de VEGF con afinidad similar en comparación con el homodímero de VEGF 65 intacto. .

También se han identificado recientemente diversas moléculas estructural mente relacionadas con VEGF, incluyendo el factor de crecimiento de placenta (PIGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E. Ferrara y Davis-Smyth (1987) Endocr. Rev., supra; Ogawa ef al. J. Biological Chem. 273:31273-31281(1998); Meyer et al. EMBO J., 18:363-374(1999). Se ha identificado una tirosina quinasa receptora, Flt-4 (VEGFR-3), como el receptor para VEGF-C y VEGF-D. Joukov et al. EMBO. J. 15:1751(1996); Lee et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:1988-1992(1996); Achen et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:548-553. VEGF-C ha demostrado estar involucrado en la regulación de la angiogénesis linfática. Jeltsch et al. Science 276:1423-1425(1997).

Dos receptores de VEGF han sido identificados, Flt-1 (también denominado VEGFR-1) y KDR (también denominado VEGFR-2). Shibuya et al. (1990) Oncogene 8:519-527; de Vries et al. (1992) Science 255:989-991 ; Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579-1586. La neuropilina-1 ha demostrado que es un receptor de VEGF selectivo, capaz de unirse a las isoformas de VEGF de unión a heparina (Soker et al. (1998) Cell 92:735-45). (ii) Anticuerpos Anti-VEGF Los anticuerpos anti-VEGF que son útiles en los métodos de la invención incluyen cualquier anticuerpo, o su fragmento de unión al antígeno, que se un con suficiente afinidad y especificidad por VEGF y puede reducir o inhibir la actividad biológica de VEGF. Un anticuerpo anti-VEGF no se unirá generalmente a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni a otros factores de crecimiento tales como PIGF, PDGF, o bFGF.

En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-VEGF incluyen, aunque sin limitarse a, un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709; un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599. En una realización, el anticuerpo anti-VEGF es "Bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®". El mismo comprende regiones de estructura de lgG1 humanas mutadas y regiones determinantes de complementariedad de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal anti-VEGFh murino A.4.6.1 que bloquean la unión de VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente 93% de la secuencia aminoácida de bevacizumab, incluyéndo la mayoría de las regiones de estructura, es derivada de lgG1 humana, y alrededor de 7% de la secuencia es derivada del anticuerpo murino A4.6.1.

Bevacizumab (AVASTIN®) fue la primera terapia anti-angiogénesis aprobada por la FDA y está aprobada para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico (tratamiento de primera y segunda línea en combinación con quimioterapia a base de 5-FU intravenosa), cáncer pulmonar de células nó pequeñas, no escamosas, avanzado (NSCLC, según sus siglas en inglés) (tratamiento de primera línea de NSCLC no reseccionable, localmente avanzado, recurrente o metastásico en combinación con carboplatino y paclitaxel) y cáncer de mama metastásico HER2-negativo (cáncer de mama metastásico HER2 negativo, sin tratamiento previo en combinación con paclitaxel).

Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados son adicionalmente descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6.884.879 concedida el 26 de Feb., 2005. Los anticuerpos adicionales incluyen anticuerpos de las series G6 o B20 (por ej., G6-31 , B20-4.1 ), según lo descrito en la Publicación de PCT No. WO2005/012359, Publicación de PCT No. WO2005/044853, y Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/991.302, el contenido de estas solicitudes de patentes se incorpora expresamente en esta invención a modo de referencia. Para anticuerpos adicionales véase las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.054.297; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1 ; Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409, y 20050112126; y Popkov et al., Journal of Immunological ethods 288:149-164 (2004). Otros anticuerpos incluyen aquellos que se unen a un epítopo funcional en VEGF humano que comprende los residuos F17, M18, D19, Y21 , Y25, Q89, 191 , K101 , E103, y C104 o, alternativamente, que comprende los residuos F17, Y21 , Q22, Y25, D63, I83 y Q89.

En una realización de la invención, el anticuerpo anti-VEGF tiene una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS (SEC ID No. 1 ) y una región variable de cadena liviana que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : DIQ TQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEC ID No. 2).

Un "anticuerpo de la serie G6" de acuerdo con esta invención, es un anticuerpo anti-VEGF que es derivado de una secuencia de un anticuerpo G6 o anticuerpos derivado de G6 de acuerdo con cualquiera de las Figuras 7, 24-26, y 34-35 de la Publicación de PCT No. WO2005/012359, cuya descripción en su totalidad se incorpora expresamente a la presente como referencia. Véase además la Publicación de PCT No. WO2005/044853, cuya descripción en su totalidad se incorpora expresamente en esta invención a modo de referencia. En una realización, el anticuerpo de serie G6 se une a un epítopo funcional en VEGF humano que comprende los residuos F17, Y21 , Q22, Y25, D63, I83 y .Q89.

Un "anticuerpo de la serie B20" de acuerdo con esta invención es un anticuerpo anti-VEGF que es derivado de un secuencia del anticuerpo B20 o de un anticuerpo derivado de B20 de acuerdo con cualquiera de las Figuras 27-29 de la Publicación de PCT No. WO2005/012359, cuya descripción en su totalidad se incorpora expresamente a la presente como referencia. Ver además Publicación de PCT No. WO2005/044853, y Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 60/991.302, el contenido de estas solicitudes de patente se incorpora expresamente a la presente invención a modo de referencia. En una realización, el anticuerpo de la serle B20 se une a un epítopo funcional en VEGF humano que comprende los residuos F17, M18, D19, Y21 , Y25, Q89,'I91 , K 01 , E103, y C104.

Un "epítopo funcional" de acuerdo con esta invención se refiere a residuos de aminoácidos de un antígeno que contribuyen energéticamente con la unión de un anticuerpo. La mutación de cualquiera de los residuos energéticamente contribuyentes del antígeno (por ejemplo, la mutación de VEGF del tipo salvaje mediante alanina o mutación homologa) interrumpirá la unión del anticuerpo de modo que la relación de afinidad relativa (IC50 muíante VEGF/IC50 VEGF tipo salvaje) del anticuerpo será superior a 5 (ver el Ejemplo 2 de WO2005/012359). En una realización, la relación de afinidad relativa se determina mediante un ELISA de exhibición de fagos de unión a solución. Brevemente, se recubren ¡nmunoplacas Maxisorp de 96 pocilios (NUNC) durante la noche a 4°C con un forma de Fab del anticuerpo que se va a analizar en un concentración de 2ug/ml en PBS, y se bloquea con PBS, 0,5% de BSA, y 0,05% de Tween20 (PBT) durante 2h a temperatura ambiente. Se incuban en primer lugar diluciones seriadas de mutantes puntuales de alanina de VEGFh por exhibición de fagos (forma de residuos 8-109) o VEGFh del tipo salvaje (8-109) en PBT en las placas recubiertas con Fab durante 15 min. a temperatura ambiente, y las placas se lavan con PBS, 0,05% de Tween20 (PBST). El fago unido se detecta con un conjugado de peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia) del anticuerpo monoclonal anti-M13 diluido 1 :5000 en PBT, desarrollado con sustrato de 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) durante aproximadamente 5 min., templado con 1 ,0 de H3P04, y se leen espectrofotométricamente a 450 nm. La relación de valores de IC50 (IC50,ala/IC50,wt) representa las veces de reducción en la afinidad de unión (la afinidad de unión relativa). (üi) Moléculas del receptor de VEGF los dos receptores de VEGF mejores caracterizados son VEGFR1 (también conocido como Flt-1 ) y VEGFR2 (también conocido como KDR y FLK-1 para el homólogo murino). La especificidad de cada receptor para cada miembro de la familia de VEGF varía aunque VEGF-A se une tanto a Flt-1 óomo a KDR. Tanto Flt-I como KDR pertenecen a la familia de tirosina quinasas receptoras (RTKs). Las RTKs comprenden un gran familia de receptores de transmembrana con actividades biológicas diversas. Por lo menos diecinueve (19) subfamilias de RTK diferentes han sido identificadas. La familia de tirosina quinasas receptoras (RTK) incluye receptores que son cruciales para el crecimiento y diferenciación de una variedad de tipos celulares (Yarden y Ullrich (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:433-478; Ullrich y Schlessinger (1990) Cell 61 :243-254). La función intrínseca de RTKs es activada luego de la unión del ligado, lo cual da como resultado la fosforilación del receptor y múltiples sustratos celulares, y posteriormente en una variedad de respuestas celulares (Ullrich & Schlessinger (1990) Cell 61 :203-212). Por ende, la transducción de señal mediada por la tirosina quinasa receptora es iniciada mediante interacción extracelular con un factor del crecimiento específico (ligando), típicamente seguido por dimerización del receptor, estimulación de la actividad de tirosina quinasa proteica intrínseca y transfosforilación del receptor. Los sitios de unión son creados de ese modo para moléculas de transducción de señal intracelulares y conducen a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmicas que facilitan la respuesta celular apropiada, (por ej., división celular, diferenciación, efectos metabólicos, cambios en el microambiente extracelular) ver, Schlessinger y Ullrich (1992) Neuron 9:1-20. Estructuralmente, tanto Flt-1 como KDR tienen siete dominios del tipo inmunoglobulina en el dominio extracelular, una región de transmembrana simple, y una secuencia de tirosina quinasa de consenso la cual es interrumpida por un dominio de material impreso de quinasa. Matthews et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:9026-9030; Terman et al. (1991 ) Oncogene 6:1677-1683. El dominio extracelular está involucrado en la unión de VEGF y el dominio intracelular está involucrado en la transducción de señal.

Las moléculas receptoras de VEGF, o sus fragmentos, que se unen específicamente a VEGF pueden utilizarse en los métodos de la invención para la unirse a y secuestrar la proteína de VEGF, evitando de ese modo su señalización.

En ciertas realizaciones, la molécula receptora de VEGF, o su fragmento de unión a VEGF, es una forma soluble, tal como sFlt-1. Una forma soluble del receptor ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad biológica de la proteína de VEGF mediante la unión a VEGF, evitando de ese modo su unión a sus receptores naturales presentes en la superficie de las células objetivo. También se incluyen proteínas de fusión al receptor de VEGF, ejemplos de las cuales son descritos más adelante.

Una proteína receptora de VEGF quimérica es una molécula receptora que tiene secuencias de aminoácidos derivadas de por lo menos dos proteínas diferentes, por lo menos una de las cuales es una proteína receptora de VEGF (por ej., el receptor flt-1 o KDR), que es capaz de unirse a, e inhibir, la actividad biológica de VEGF. En ciertas realizaciones, las proteínas receptoras de VEGF quiméricas de la invención consisten en secuencias de aminoácidos derivadas de solamente dos moléculas receptoras de VEGF diferentes; sin embargo, las secuencias de aminoácidos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o los siete dominios del tipo Ig de la región de unión al ligando extracelular del receptor flt-1 y/o KDR pueden estar ligadas a secuencias de aminoácidos de otras proteínas no relacionadas, por ejemplo, secuencias de ¡nmunoglobulinas. Otras secuencias de aminoácidos a las cuales los dominios del tipo Ig se combinan serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Los ejemplos de proteínas receptoras de VEGF quiméricas incluyen, por ej., Flt-1/Fc soluble, KDR/Fc, o FLt-1/KDR/Fc (también conocido como VEGF Trap). (Ver por ejemplo la Publicación de Solicitud de PCT No. W097/44453).

Una proteína receptora de VEGF soluble o proteínas receptoras de VEGF quiméricas de la invención incluye proteínas receptoras de VEGF las cuales no están fijadas a la superficie de células por medio de un dominio de transmembrana. Como tales, las formas solubles del receptor de VEGF, incluyendo las proteínas receptoras quiméricas, si bien son capaces de unirse a, e inactivar VEGF, no comprenden un dominio de transmembrana y por ende generalmente no se asocian con la membrana celular de células en las cuales la molécula es expresada.

III. USOS TERAPÉUTICOS Y COMPOSICIONES DE ANTICUERPOS Anti-VEGF La invención abarca la terapia antiangiogénica, una estrategia de tratamiento del cáncer novedosa que apunta a inhibir el desarrollo de los vasos sanguíneos tumorales requeridos para proporcionan nutrientes para sustentar el crecimiento tumoral. Debido a que la angiogénesis está involucrada tanto en el crecimiento de tumores primarios como de la metástasis, el tratamiento antiangiogénico proporcionado por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico de tumor en el sitio primario así como también de evitar la metástasis de tumores en los sitios secundarios, permitiendo de ese modo el ataque de los tumores mediante otros terapéuticos.

Específicamente, se proporcionan en esta invención métodos para tratar a un sujeto diagnosticado con cáncer de mama metastásico previamente sin tratamiento, que comprende administrar al sujeto un régimen de tratamiento que combina una cantidad eficaz de por lo menos un agente quimioterapéutico y un anticuerpo anti-VEGF, donde dicho sujeto no ha recibido quimioterapia alguna para el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico. Opcionalmente, el sujeto no ha recibido con anterioridad quimioterapia coadyuvante en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis. El régimen de tratamiento que combina la quimioterapia y la administración del anti-VEGF extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución (SLE) del sujeto. Se proporcionan adicionalmente en esta invención usos de un anticuerpo anti-VEGF con por lo menos un agente quimioterapéutico en la manufactura de un medicamento para tratar el cáncer de mama metastásico previamente no tratado en un sujeto, donde dicho sujeto no ha recibido quimioterapia alguna para el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico. Opcionalmente, el sujeto no ha recibido con anterioridad quimioterapia coadyuvante en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis. El uso del anti-VEGF y el agente quimioterapéutico extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución (SLE) del sujeto. Se proporcionan también en esta invención anticuerpos anti-VEGF para utilizar en un método para tratar el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un régimen de tratamiento que combina una cantidad eficaz de por lo menos un agente quimioterapéutico y un anticuerpo anti-VEGF, donde dicho sujeto no ha recibido quimioterapia alguna para el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico. Opcionalmente, el sujeto no ha recibido con anterioridad quimioterapia coadyuvante en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis. El uso del anti-VEGF y del agente quimioterapéutico extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución (SLE) del sujeto. En ciertas realizaciones, en cualquiera de los métodos, usos y composiciones de la invención, la administración de la quimioterapia y el anticuerpo anti-VEGF tiene un perfil de seguridad que es consistente con los resultados de los ensayos con bevacizumab (ver, por ej., el material impreso del producto de bevacizumab).

En algunas realizaciones de la invención, el sujeto es HER2 negativo. En algunas realizaciones de la invención, el sujeto es HER2 positivo. HER2 es reconocido como un factor predictivo y de pronóstico importante en algunos cánceres de mama. Ver, por ej., Slamon DJ, et al. Science. 1989;244:707-712; y Sjógren S, et al. J Clin Oncol. 1998;16:462-469. La amplificación del gen HER2 es un cambio genético permanente que da como resultado la sobreexpresión continua del receptor de HER2 (proteína HER2). Ver, por ej., Simón R, et al. J Nati Cáncer Inst. 2001 ;93:1141-11465; y, Sliwkowski MX, et al. Semin Oncol. 1999;26(supl 12):60-70. Diversos estudios han demostrado que la sobreexpresión de HER2 (ya sea copias extras del gen mismo, o una cantidad en exceso del producto proteico del gen) está asociada con una disminución de la supervivencia general. Véase, por ej., Slamon DJ, et al. Science. 1987;235:177-182; y, Paik S, et al. J Clin Oncol. 1990;8:103-112. Diversos ensayos comerciales están disponibles para determinar el estado de HER2, por ej., HercepTest® y Pathway™ para proteína y PathVysion® y HER2 FISH pharmDx™ para la alteración génica.

Terapias de Combinación La invención se refiere al uso o composiciones de una combinación de por lo menos un antagonista específico de VEGF con una o más terapias anticancerígenas adicionales. Los ejemplos de terapias anticancerígenas incluyen, sin limitación, cirugía, terapia de radiación (radioterapia), bioterapia, inmunoterapia, quimioterapia, o una combinación de estas terapias. Por añadidura, pueden utilizarse agentes citotóxicos, agentes antiangiogénicos y antiprpliferativos en combinación con el antagonista específico de VEGF.

En ciertos aspectos de cualquiera de los métodos y usos, la invención proporciona el tratamiento del cáncer de mama, administrando cantidades eficaces de un anticuerpo anti-VEGF y uno o más agentes quimioterapéuticos a un sujeto susceptible de, o diagnosticado con, cáncer localmente recurrente o metastásico previamente no tratado. Puede utilizarse una variedad de agentes quimioterapéuticos en los métodos de tratamiento combinados y usos de la invención. Una lista ejemplar y no limitativa de agentes quimioterapéuticos contemplados es proporcionada en esta invención bajo el encabezado "Definición", o descrito en esta invención.

En un ejemplo, la invención caracteriza los métodos y usos de un antagonista específico de VEGF con uno o más agentes quimioterapéuticos (por ej., un cóctel) o cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el agente quimioterapéutico es por ejemplo, capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida o sus terapias combinadas. En ciertas realizaciones, el antagonista de VEGF (por ej., anticuerpo anti-VEGF) se combina con lapatinib (Tykerb®). La administración combinada incluye la administración simultánea, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y la administración consecutiva en cualquier orden, donde preferentemente hay un período de tiempo mientras que ambos agentes activos (o la totalidad) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. La preparación y los programas de dosificación para ese tipo de agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según lo determinado empíricamente por el experto en la técnica. La preparación y programas de dosificación para la quimioterapia son también descritos en Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder, o administrarse luego de la administración del antagonista específico de VEGF o puede administrarse simultáneamente con el mismo.

En algunos otros aspectos de cualquiera de los métodos y usos, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia combinada de tumores con el anticuerpo de la invención incluyen antagonista de otros factores que están involucrados en el crecimiento tumoral tal como EGFR, ErbB2 (también conocido como Her2), ErbB3, ErbB4, o TNF. Algunas veces, puede resultar beneficioso administrar además una o más citoquinas al sujeto. En una realización, el anticuerpo de VEGF es administrado en forma conjunta con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser administrado en primer lugar, seguido por el anticuerpo de VEGF. Sin embargo, la administración simultánea o la administración del anticuerpo de VEGF en primer lugar es también contemplada. Las dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas utilizadas actualmente y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo anti-VEGF.

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según lo necesario para la indicación en particular que se está tratando, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente uno al otro. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos los cuales se unen a EGFR, VEGF (por ej. un anticuerpo el cual une un epítopo diferente o el mismo epítopo en VEGF), VEGFR, o ErbB2 (por ej., Herceptin®) en la única formulación. Alternativamente, o por añadidura, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina, agente inhibidor del crecimiento y/o antagonista de VEGFR. Ese tipo de moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

En ciertos aspectos de cualquiera de los métodos y usos, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia combinada contra el cáncer con el anticuerpo de la invención incluyen otros agentes antiangiogénicos. Se han identificado muchos agentes antiangiogénicos y son conocidos en las técnicas, incluyendo aquellos que son mencionados por Carmeliet y Jain (2000). En una realización, el anticuerpo anti-VEGF de la invención se utiliza en combinación con otro antagonista de VEGF o con un antagonista del receptor de VEGF tal como variantes de VEGF, fragmentos del receptor de VEGF solubles, aptámeros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR neutralizantes, inhibidores de bajo peso molecular de tirosina quinasas de VEGFR y cualquiera de las combinaciones de los mismos. Alternativamente, o por añadidura, dos o más anticuerpos anti-VEGF pueden ser administrados en forma conjunta al sujeto.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de antagonista específico de VEGF dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, según lo definido anteriormente, la severidad y el curso de la enfermedad, si el antagonista específico de VEGF es administrado con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del sujeto y la respuesta al antagonista específico de VEGF, y de la discreción del médico interviniente. El antagonista específico de VEGF es adecuadamente administrado al sujeto en una vez o durante una serie de tratamientos. En un régimen de terapia combinada, el antagonista específico de VEGF y uno o más agentes terapéuticos anticancerígenos de la invención son administrados en una cantidad terapéuticamente eficaz o sinérgica. Según se utiliza en esta invención, una cantidad terapéuticamente eficaz es aquella que la administración conjunta de un antagonista específico de VEGF y uno o más otros agentes terapéuticos, o la administración de una composición de la invención, da como resultado la reducción o inhibición del cáncer según lo descrito con anterioridad. Una cantidad terapéuticamente sinérgica es aquella cantidad de un antagonista específico de VEGF y uno o más otros agentes terapéuticos necesarios para reducir sinérgica o significativamente o eliminar las condiciones o síntomas asociados con una enfermedad en particular.

El antagonista específico de VEGF y el uno o más agentes terapéuticos diferentes pueden ser administrados en forma simultánea o consecutiva en una cantidad y durante un tiempo suficiente para reducir o eliminar la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latente, o una micrometástasis. El antagonista específico de VEGF y uno o más agentes terapéuticos diferentes pueden ser administrados como terapia de mantenimiento para evitar o reducir la probabilidad de recurrencia del tumor.

Los expertos en la técnica comprenderán que las dosis apropiadas de los agentes quimioterapéuticos o de otros agentes anticancerígenos serán en general cercanas a aquellas ya empleadas en las terapias clínicas, por ej., donde los quimioterapéuticos son administrados solos o en combinación con otros quimioterapéuticos. La variación en la dosificación se producirá probablemente dependiendo de la afección que se está tratando. El médico que administra el tratamiento podrá determinar la dosis apropiada para el sujeto individual.

Además de los regímenes terapéuticos antes mencionados, el sujeto puede ser sometido a terapia de radiación.

En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos, usos y composiciones, el anticuerpo de VEGF administrado es un anticuerpo desnudo intacto. Sin embargo, el anticuerpo de VEGF puede ser conjugado con un agente citotóxico. En ciertas realizaciones de cualquiera de los métodos y usos, el anticuerpo conjugado y/o antígeno al cual se une es/son internalizado/s por la célula, dando como resultado una mayor eficacia terapéutica del conjugado para matar las células cancerígenas a las cuales se une. En una realización, el agente citotóxico apunta o interfiere con ácido nucleico en la célula cancerígena. Los ejemplos de ese tipo de agentes citotóxicos incluyen maytansinoides, calicheamicinas, ribonucleases y endonucleases de ADN. La invención también caracteriza un método para instruir a un ser humano con cáncer de mama o un proveedor del cuidado de la salud proporcionando instrucciones para recibir tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF de modo de incrementar el tiempo para la supervivencia libre de evolución, para disminuir el riesgo del sujeto de recurrencia del cáncer o para aumentar la probabilidad del sujeto de supervivencia. En algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar instrucciones para recibir el tratamiento con por lo menos un agente quimioterapéutico. El tratamiento con el anticuerpo anti-VEGF puede ser concurrente con, o consecutivo con, el tratamiento con el agente quimioterapéutico. En ciertas realizaciones, el sujeto es tratado según las instrucciones mediante el método de instrucción. El tratamiento del cáncer de mama mediante la administración de un anticuerpo anti-VEGF con o sin quimioterapia puede ser continuado hasta la recurrencia del cáncer o la muerte.

La invención proporciona además un método promocional, que comprende promover la administración de un anticuerpo anti-VEGF para el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto humano. En algunas realizaciones, el método comprende además promover la administración de por lo menos un agente quimioterapéutico. La administración del anticuerpo anti-VEGF puede ser concurrente con, o consecutivo a, la administración del agente quimioterapéutico. La promoción puede llevarse a cabo mediante cualquier medio disponible. En algunas realizaciones, la promoción es mediante un material impreso dentro del paquete que acompaña una formulación comercial del anticuerpo anti-VEGF. La promoción también puede ser mediante un material impreso dentro del paquete que acompaña a una formulación comercial del agente quimioterapéutico. La promoción puede ser por escrito o comunicación oral a un médico o proveedor del cuidado de la salud. En algunas realizaciones, la promoción es mediante un material impreso dentro del paquete donde el material impreso dentro del paquete proporciona instrucciones para recibir la terapia para el cáncer de mama con anticuerpo anti-VEGF. En una realización más, el material impreso dentro del paquete incluye algunos o la totalidad de los resultados del Ejemplo 1. En algunas realizaciones, la promoción es seguida por el tratamiento del sujeto con el anticuerpo anti-VEGF con o sin el agente quimioterapéutico.

La invención proporciona un método comercial, que comprende comercializar un anticuerpo anti-VEGF para el tratamiento del cáncer de mama eri un sujeto humano de modo de aumentar el tiempo del sujeto para la supervivencia libre de evolución, para disminuir la probabilidad del sujeto de recurrencia del cáncer o aumentar la probabilidad del sujeto de supervivencia. En algunas realizaciones, el método comprende además comercializar un agente quimioterapéutico para utilizar en combinación con el anticuerpo anti-VEGF. En algunas realizaciones, la comercialización es seguida por el tratamiento del sujeto con el anticuerpo anti-VEGF con o sin el agente quimioterapéutico.

También se proporciona un método comercial, que comprende comercializar un agente quimioterapéutico en combinación con un anticuerpo anti-VEGF para el tratamiento del cáncer de mama en un sujeto humano de modo de aumentar el tiempo del sujeto para la supervivencia libre de evolución, para disminuir la probabilidad del sujeto de recurrencia del cáncer o aumentar la probabilidad del sujeto de supervivencia. En algunas realizaciones, la comercialización es seguida por el tratamiento del sujeto con la combinación del agente quimioterapéutico y el anticuerpo anti-VEGF.

IV. DOSIFICACIONES Y DURACIÓN La composición del antagonista específico de VEGF será formulada, dosificada, y administrada en forma consistente con la buena práctica médica. Los factores que hay que tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno en particular que se está tratando, el sujeto en particular que se está tratando, la condición clínica del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el plan de administración, y otros factores conocidos por los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del antagonista específico de VEGF que se va a administrar será determinada por ese tipo de consideraciones, y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, aliviar, o tratar, o estabilizar, el cáncer; para aumentar el tiempo hasta la evolución (duración de la supervivencia libre de evolución) o para tratar o prevenir la aparición o recurrencia de un tumor, un tumor latente o una micrometástasis. El antagonista específico de VEGF no debe ser necesariamente formulado, aunque es opcionalmente formulado, con uno o más agentes actualmente utilizados para prevenir o tratar el cáncer o un riesgo de desarrollar un cáncer. La cantidad eficaz de ese tipo de otros agentes depende de la cantidad de antagonista específico del VEGF presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores descritos con anterioridad. Estos son generalmente empleados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración según se utiliza en esta invención antes o alrededor de entre 1 y 99% de las dosificaciones empleadas hasta la fecha.

Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, alrededor de 1 pg/kg a 100 mg/kg (por ej., 0,1-20 mg/kg) de antagonista específico del VEGF es una dosis candidata inicial para la administración al sujeto, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría oscilar entre alrededor de 1 pg/kg y alrededor de 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Las dosificaciones particularmente deseables incluyen, por ejemplo, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, y 15 mg/kg. Para las administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que el cáncer es tratado, según lo medido por los métodos descritos anteriormente o conocidos en la técnica. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser de utilidad. En un ejemplo, si el antagonista específico de VEGF es un anticuerpo, el anticuerpo de la invención es administrado una vez por semana, cada dos semanas, o cada tres semanas, en un rango de dosis entre alrededor de 5 mg/kg y alrededor de 15 mg/kg, incluyendo aunque sin limitarse a 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg. El progreso de la terapia de la invención es fácilmente controlado mediante técnicas y ensayos convencionales. En otras realizaciones, dicho régimen de dosificación es empleado en combinación con un régimen de quimioterapia como la terapia de primera línea para tratar el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico. Más información acerca de las dosis adecuadas es proporcionada en el Ejemplo que se brinda más adelante.

La duración de la terapia continuará durante el tiempo que sea médicamente indicada o hasta que se alcanza el efecto terapéutico deseado (por ej., lo descrito en ésta invención). En ciertas realizaciones, la terapia con el antagonista específico de VEGF es continuada durante 1 mes, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, o durante un período de varios años hasta de por vida.

Los antagonistas específicos de VEGF de la invención son administrados a un sujeto, por ej., un sujeto humano, de acuerdo con métodos conocidos, tal como la administración intravenosa como una infusión de bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. La administración local es particularmente deseada si los efectos secundarios prolongados o la toxicidad son asociados con el antagonista del VEGF. Una estrategia ex vivo también puede utilizarse para aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo involucran transfectar o transducir células obtenidas del sujeto con un polinucleótido que codifica un antagonista del VEGF. Luego, las células transfectadas o transducidas son regresadas al sujeto. Las células pueden ser cualquiera de un amplio rango de tipos incluyendo, sin limitación, a las células hematopoyéticas (por ej., células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células T, o células B), fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratiriocitos, o células musculares.

Por ejemplo, si el antagonista específico de VEGF es un anticuerpo, el anticuerpo es administrado por cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, y, en caso deseado, para el tratamiento local inmunosupresivo, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Por añadidura, el anticuerpo es adecuadamente administrado por infusión de pulsos, particularmente con dosis en disminución del anticuerpo. Con preferencia, la dosis es administrada mediante inyecciones, con máxima preferencia, mediante inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

En otro ejemplo, el compuesto del antagonista específico de VEGF es administrado localmente, por ej., por inyecciones directas, cuando el trastorno o localización del tumor lo permite, y las inyecciones pueden repetirse en forma periódica. El antagonista específico de VEGF también puede ser administrado sistémicamente al sujeto o directamente a las células tumorales, por ej., a un tumor o un lecho tumoral luego de la escisión quirúrgica del tumor, a fin de prevenir o reducir la recurrencia local o metástasis, por ejemplo de un tumor latente o micrometástasis.

Alternativamente, una molécula de ácidos nucleicos inhibidora o polinucleótido que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un antagonista específico del VEGF puede administrarse a las células apropiadas en el sujeto. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico puede ser dirigido hacia el tumor mismo.

El ácido nucleico puede ser introducido en las células por cualquier medio apropiado para el vector empleado. Muchos métodos de ese tipo son bien conocidos en la técnica (Sambrook et al., supra, y Watson et al., Recombinant DNA, Capítulo 12, 2da edición, Scientific American Books, 1992). Los ejemplos de métodos de administración de genes incluyen transfección mediada por liposomas, electroporación, métodos de fosfato cálcico/ DEAE dextrano, pistola genética y microinyección.

V. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Las formulaciones terapéuticas de los agentes (por ej., anticuerpos) utilizadas de acuerdo con la invención se preparan para almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes aceptables para uso farmacéutico opcionales (Remington's Pharmaceutica! Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen buffers tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ej. complejos de proteína Zn); y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones de anticuerpo anti-VEGF liofilizadas son descritas en WO 97/04801 , expresamente incorporada a la presente como referencia.

Opcionalmente, pero con preferencia, la formulación contiene una sal aceptable para uso farmacéutico, típicamente, por ej., cloruro sódico, y con ' preferencia, a alrededor de concentraciones fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden contener un conservante aceptable para uso farmacéutico. En algunas realizaciones, los rangos de concentración de conservante oscilan entre 0,1 y 2,0%, típicamente v/v. Los conservantes adecuados incluyen aquellos conocidos en las técnicas farmacéuticas. Son ejemplos de conservantes el alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno, y propilparabeno. Opcionalmente, las formulaciones de la invención pueden incluir un surfactante aceptable para uso farmacéutico en una concentración de 0,005 a 0,02%.

Típicamente, se suministra bevacizumab para usos terapéuticos en frascos de uso único, libres de conservante, de 100 mg y 400 mg para administrar 4 mi o 16 mi de bevacizumab (25 mg/ml). El producto de 100 mg es formulado en 240 mg a, a-trehalosa dihidrato, 23,2 mg de fosfato sódico (monobásico, monohidrato), 4,8 mg fosfato sódico (dibásico, anhidro), 1 ,6 mg de polisorbato 20, y Agua para Inyección, USP. El producto de 400 mg es formulado en 960 mg de a, a-trehalosa dihidrato, 92,8 mg de fosfato sódico (monobásico, monohidrato), 19,2 mg de fosfato sódico (dibásico, anhidro), 6,4 mg de polisorbato 20, y Agua para Inyección, USP. Ver además la etiqueta para bevacizumab.

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según lo necesario para la indicación en particular que se está tratando, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente uno a otro. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos los cuales se unen a EGFR, VEGF por ej. un anticuerpo el cual se une a diferentes epítopos en VEGF), VEGFR, o ErbB2 (por ej., Herceptin®) en la formulación individual. Alternativamente, o por añadidura, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina, agente inhibidor del crecimiento y/o antagonista de VEGFR. Ese tipo de moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutícal Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en la forma de artículos conformados, por ej., películas, o microcápsula. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-h¡drox¡et¡l-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de los Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico- ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico- ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Si bien los polímeros tales como el acetato de etilen-vinilo y el ácido láctico- ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de. la exposición a la humedad a 37°C, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden contemplarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, puede lograrse la estabilización modificando residuos sulfhidrilo, liofilizando de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

Las formulaciones que se van a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

VI. EFICACIA DEL TRATAMIENTO La ventaja principal de cualquiera de los métodos, usos y composiciones proporcionados en esta invención es la capacidad de producir efectos anticancerígenos marcados eh un sujeto humano sin causar toxicidades significativas o efectos adversos importantes, de modo que el sujeto se beneficie del tratamiento en general. En una realización de cualquiera de los métodos, usos o composiciones, el perfil de seguridad es comparable con los estudios previos de fase III de bevacizumab. La eficacia del tratamiento de la invención puede medirse mediante diversos criterios de referencia comúnmente empleados en la evaluación de los tratamientos contra el cáncer, incluyendo aunque sin limitarse a, la regresión del tumor, el peso del tumor o la reducción de tamaño, tiempo a la evolución, duración de supervivencia, supervivencia libre de evolución, índice de respuesta general, duración de la respuesta y calidad de vida. Debido a que los agentes anti-angiogénicos de la invención apuntan hacia la vasculatura del tumor y no necesariamente a las células neoplásicas por sí mismas, los mismos representan una única clase de fármacos anticancerígenos, y por lo tanto, puede requerir medidas únicas y definiciones dé respuestas clínicas a fármacos. Por ejemplo, la reducción tumoral de más del 50% en un análisis bidimensional es el corte estándar para declarar una respuesta. Sin embargo, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede causar la inhibición del esparcimiento metastásico sin encogimiento del tumor primario, o puede simplemente ejercer un efecto tumoristático. Por lo tanto, deberían emplearse nuevos métodos para determinar la eficacia de una terapia antiangiogénica, incluyendo por ejemplo, la medición de los marcadores plasmáticos o urinarios de la angiogénesis y la medición de la respuesta a través de imágenes radiológicas.

En otra realización, la invención proporciona métodos para aumentar la supervivencia libre de evolución de un sujeto humano susceptible a, o diagnosticado con un cáncer. El tiempo hasta la evolución de la enfermedad se define como el tiempo desde la administración del fármaco hasta la evolución de la enfermedad o muerte. En una realización preferida, el tratamiento combinado de la invención utilizando anticuerpo anti-VEGF y uno o más agentes quimioterapéuticos aumenta significativamente la supervivencia libre de evolución en por lo menos alrededor de 1 mes, 1 ,2 meses, 2 meses, 2,4 meses, 2,9 meses, 3,5 meses, con preferencia en alrededor de 1 a alrededor de 5 meses, cuando se compara con un tratamiento con quimioterapia sola. En una realización, la media de la SLE en meses (95% Cl) es 9,2 meses (8,6, 10,1 ) en los sujetos tratados con terapia con bevacizumab y taxano (por ej., terapia con docetaxel o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®))/antraciclina (por ej., doxorubicina, epirubicina o sus combinaciones) comparado con 8,0 meses (6,7, 8,4) la terapia con taxano/antraciclina sin bevacizumab, con un HR (índice de respuesta) (95% Cl) 0,644 (0,522, 0,795), valor p (rango log) inferior a 0,0001. En una realización, la SLE en los sujetos tratados con bevacizumab y taxano/antraciclina es de 10,7 meses comparado con 8,3 en sujetos tratados con placebo y taxano/antraciclina. En una realización, la media de SLE en meses (95% Cl) es de 8,6 meses (8,1 , 9,5) en los sujetos tratados con bevacizumab y capecitabina comparado con 5,7 meses (4,3, 6,2) con terapia con capecitabina sin bevacizumab, con un HR (índice de respuesta) (95% Cl) 0,688 (0,564, 0,840), valor p (rango log) 0,0002. En una realización, la SLE en los sujetos tratados con bevacizumab y capecitabina es de 9,7 meses comparado con 6,2 en los sujetos tratados con placebo y capecitabina.

En aun otra realización, el tratamiento de la invención aumenta significativamente el índice de respuesta en un grupo de sujetos humanos susceptibles a, o diagnosticados con un cáncer quienes son tratados con diversos agentes terapéuticos. El índice de respuesta es definido como el porcentaje de sujetos tratados quienes respondieron al tratamiento. En un aspecto, el tratamiento combinado de la invención utilizando anticuerpo anti-VEGF y uno o más agentes quimioterapéuticos aumenta significativamente el índice de respuesta en el grupo de sujetos tratado comparado con el grupo tratado con quimioterapia solamente.

En un aspecto, la invención proporciona métodos para aumentar la duración de la respuesta en un sujeto humano o un grupo de sujetos humanos como el tiempo desde la respuesta inicial hasta la evolución de la enfermedad.

En una realización, la invención puede utilizarse para incrementar la duración de supervivencia de un sujeto humano susceptible a, o diagnosticado con un cáncer.

VII. Producción de Anticuerpos (i) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se desarrollan generalmente en animales mediante inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) múltiples del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxi-succinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2, o R N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de, por ejemplo, 100 pg o 5 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección de la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se estimulan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De siete a catorce días más tarde los animales sangran y el suero se ensaya para el título de anticuerpo. Los animales se estimulan hasta que el título se estabiliza. Preferentemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden producir en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, los agentes de agregación, tales como el alumbre, se utilizan de forma adecuada para potenciar la respuesta inmune, (ii) Anticuerpos monoclonales Diversos métodos para preparar anticuerpos monoclonales en la presente invención están disponibles en la técnicas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567).

En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se ha descrito anteriormente para conseguir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, contribuyen a una producción a un nivel elevado estable de anticuerpo por las células productoras de los anticuerpos seleccionados, y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Entre éstos, las líneas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Se ensaya el medio de cultivo en el que las células de hibridoma están en crecimiento para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante la inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y se pueden . desarrollar mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPM1-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero mediante procedimientos de purificación de ¡nmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de ningún otro modo producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos será descrita en forma más detallada a continuación.

En una realización adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de genotecas de fagos-anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991 ) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991 ) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando genotecas de fagos. Las posteriores publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (rango de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir genotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21 : 2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas convencionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también se puede modificar, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de secuencias murinas homologas (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al. Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984)), o mediante unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina.

Habitualmente, dichos polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente. (iii) Anticuerpos humanizados y humanos Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos "importados", que habitualmente se sacan de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de CDRs de roedores o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligero como pesado, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método denominado "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba contra algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, pero ligeros y pesados, a ser utilizados en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la genoteca de secuencias de dominios variables humanas conocidas. A continuación, la secuencia humana que está más próxima a la del roedor se acepta como la estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151 : 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una estructura particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151 : 2623 (1993)).

Es también importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales humanizados utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles normalmente y son familiares para los expertos en la materia. Hay programas informáticos que muestran y visualizan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar del receptor e importar secuencias, de manera que se consigue la característica del anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad para el antígeno o ántígenos objetivos. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.

Los anticuerpos anti-VEGF humanizados y sus variantes maduradas por afinidad son descritos en, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 6.884.879, concedida el 26 de febrero, 2005.

Actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada -del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal da lugar a una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes humanos de inmunoglobulinas de la línea germinal en dichos ratones mutantes en la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la inducción de los antígenos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al. Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992).

Alternativamente, puede emplearse tecnología de exhibición de fagos (McCafferty ef al., Nature 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnicas, los genes de dominio V de anticuerpos son clonados en marco en ya sea un gen de proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhibidos como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Por consiguiente, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición de fagos puede realizarse en una variedad de formatos, véase, por ej., Johnson, Kevin S. y ChisweII, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden utilizarse para la exhibición de fagos diversas fuentes de segmentos genéticos V. Clackson ef al., Nature, 352:624-628 (1991 ) aislaron un grupo diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una genoteca combinatoria al azar pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y anticuerpos contra un grupo diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991 ), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, además , las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.565.332 y 5.573.905.

Según lo descrito anteriormente, también pueden generarse anticuerpos humanos mediante células B activadas ¡n vitro (ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.567.6 0 y 5.229.275).

Los anticuerpos anti-VEGF monoclonales humanos son descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5.730.977, concedida el 24 de marzo, 1998. (iv) Fragmentos de anticuerpos Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-1 17 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ser ahora producidos directamente mediante células huéspedes recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados de las genotecas de fagos de anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser directamente recuperados de E. coli y químicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et ai, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro método, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células huéspedes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). Ver WO 93/16185. (v) Otas modificaciones de secuencias de aminoácidos Se contemplan una o más modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Ese tipo de modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se realiza cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para arribar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traducción del anticuerpo, tal como cambiando el número o posición de sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" según lo descrito por Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989). En este punto, un residuo o grupo de residuos objetivos son identificados (por ej., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o cargado negativamente (con máxima preferencia alanina o polialanina) para efectuar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego son refinadas introduciendo variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, si bien el sitio para introducir una variación de secuencias de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no debe ser necesariamente predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se lleva a cabo barrido de ala o mutagénesis al azar en el codón o región objetivo y las variantes expresadas de anticuerpo son seleccionadas para la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de terminal amino- y/o carboxilo que oscilan en longitud entre un residuo y polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones intrasecuencias de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al término N o C del anticuerpo a una enzima (por ej., para ADEPT) o un polipéptido el cual aumenta la vida media en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero las alteraciones de FR son también contempladas.

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo son logradas seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener (a) la estructura del armazón polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la masa de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda ed., páginas 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), et (M) (2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H) Alternativamente, los residuos naturales pueden ser divididos en grupos en base a propiedades de cadenas laterales comunes: (1 ) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que incluyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras abarcarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier residuo cisteína no involucrado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar el entrecruzamiento aberrante. A la inversa, pueden agregarse el o los enlaces cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ej., un anticuerpo humanizado o humano). En general, el o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo parental del cual son generadas. Un modo conveniente de generar ese tipo de variantes sustitucionales involucra la maduración por afinidad utilizando exhibición de fagos. Brevemente, diversos sitios de región hipervariable (por ej., 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas son exhibidas en una forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto genético III de M13 empaquetado dentro de cada, partícula. Las variantes exhibidas en fago son luego seleccionadas por su actividad biológica (por ej., afinidad de unión) según lo descrito en esta invención. A fin de identificar sitios de regiones hipervariables candidatos para modificación, puede llevarse a cabo una mutagénesis por barrido con alanina para identificar residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente con la unión al antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede resultar beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno- anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y VEGF humano. Ese tipo de residuos de contacto y residuos lindantes son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en esta invención. Una vez que dichas variantes son generadas, el panel de variantes es sometido a cribado (screening) según lo descrito en esta invención y pueden seleccionarse los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para el desarrollo adicional.

Otro tipo de variante de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glicosilacion original del anticuerpo. Alteración quiere decir supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o adición de uno o más sitios de glicosilacion que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilacion de anticuerpos es típicamente ligada a N o ligada a O.

Ligada a N se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptidas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un sitio de glicosilacion potencial. Glicosilacion ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente seriná o treonina, si bien también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilacion al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo tal que contenga una o más de las secuencias tripéptidas antes descritas (para sitios de glicosilacion ligada a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilacion ligada a O).

Donde el anticuerpo comprende' una región Fe, el carbohidrato unido a la misma puede ser alterado. Por ejemplo, los anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura que carecen de fucosa unida a una región Fe del anticuerpo son descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2003/0157108 A1 , Presta, L. Véase además US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los anticuerpos con una N-acetilglucosamina (GIcNAc) de bisección en el carbohidrato unido a una región Fe del anticuerpo son referenciados en WO03/011878, Jean-Mairet ef al. y Patente de los Estados Unidos No. 6.602.684, Umana ef al. Los anticuerpos con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo son reportados en WO97/30087, Patel ef al. Véase, además, W098/58964 (Raju, S.) y W099/22764 (Raju, S.) referente a anticuerpos con carbohidrato alterado unido a la región Fe de los mismos.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ej., de modo de aumentar la citotoxicidad mediada por células dependiente del antígeno (ADCC, según sus siglas en inglés) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, según sus siglas en inglés) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, puede introducirse residuo(s) cisteína en la región Fe, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o mayor matanza de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también pueden ser preparados Utilizando entrecruzadores heterobifuncionales según lo descrito en Wolff ef al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede modificarse un anticuerpo el cual tiene regiones duales Fe y de ese modo puede tener capacidades de ADCC y lisis mediada por complemento mejoradas. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 ( 1989).

WO00/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con función de ADCC mejorada en presencia de células efectoras humanas, donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácidos en la región Fe de los mismos. Con preferencia, el anticuerpo con ADCC mejorada comprende sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fe (numeración Eu de residuos). Con preferencia, la región Fe alterada es una región Fe de lgG1 humana que comprende o que consiste en las sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Dichas sustituciones son opcionalmente combinadas con sustitución(es) la cuales aumentan la unión a C1q y/o la CDC.

Los anticuerpos con unión a C1q alterada y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alterada son descritos en W099/51642, Patente de los Estados Unidos No. 6.194.551 B1 , Patente de los Estados Unidos No. 6.242.195B1 , Patente de los Estados Unidos No. 6.528.624B1 y Patente de los Estados Unidos No. 6.538.124 (Idusogie et al.). Los anticuerpos comprenden una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de la región Fe de los mismos (numeración Eu de residuos).

Para aumentar la vida media sérica del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) según lo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5.739.277, por ejemplo. Según se utiliza en esta invención, el término "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ej., IgG-i, lgG2, lgG3, o lgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG.

Los anticuerpos con unión mejorada al receptor de Fe neonatal (FcRn), y vidas medias aumentadas, son descritos en WO00/42072 (Presta, L.) y US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la misma las cuales mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Por ejemplo, la región Fe puede tener sustituciones en una o más de las posiciones 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311 , 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 o 434 (numeración Eu de residuos). La variante de anticuerpo que comprende la región Fe preferida con unión a FcRn mejorada comprende sustituciones de aminoácidos en una, dos o tres de las posiciones 307, 380 y 434 de su región Fe (numeración Eu de residuos). En una realización, el anticuerpo tiene 307/434 mutaciones.

Los anticuerpos modificados genéticamente con tres o más (con preferencia cuatro) sitios de unión al antígeno funcionales son también contemplados (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US2002/0004587 A1 , Miller eí a/.).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin limitarse a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos naturales) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo. (vi) Inmunoconjugados La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito en esta invención conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina {por ej. una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de ese tipo de inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos los cuales pueden utilizarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de la toxina difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia (melón amargo), curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 31l, 131ln, 90Y y 186Re.

Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se preparan utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutareldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 ,5-difluor-2,4-d¡nitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina según lo descrito en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobenc¡l-3-metild¡etilen triaminapentaacético etiquetado con Carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en predireccionamiento hacia el tumor ("tumor pretargeting") donde el conjugado anticuerpo- receptor es administrado al sujeto, seguido por la remoción de conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de evacuación y luego administración de un "ligando" (por ej. avidina) el cual es conjugado a un agente citotóxico (por ej. un radionucleótido). (vi i) Inmunoliposomas El anticuerpo descrito en esta invención también puede ser formulado como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como lo descrito en Epstein ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado son descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 5.013.556.

Los liposomas particularmente útiles pueden ser generado mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivado con PEG (PEG-PE). Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la invención pueden ser conjugados a los liposomas según lo descrito en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico es opcionalmente contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al. J. National Cáncer insf.81 (19)1484 (1989) VIII. Artículos de manufactura y kits En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de manufactura comprende un contenedor, una etiqueta y un material impreso dentro del paquete. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores pueden ser formados a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor sostiene una composición la cual es eficaz para tratar la afección y puede tener una boca de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-VEGF. La etiqueta en, o asociada con, el contenedor indica que la composición es utilizada para tratar la afección de elección. El artículo de manufactura puede comprender además un segundo contenedor que comprende un buffer aceptable para uso farmacéutico, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Pude incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros buffers, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Por añadidura, el artículo de manufactura comprende un material impreso dentro del paquete con instrucciones para utilizar, incluyendo por ejemplo, indicando al usuario de la composición administrar la composición del anticuerpo anti-VEGF y un agente quimioterapéutico al sujeto, por ej., capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida o sus combinaciones. El material impreso dentro del paquete puede contener, opcionalmente, algunos o la totalidad de los resultados encontrados en el Ejemplo 1.

El antagonista específico de VEGF puede ser empaquetado solo o en combinación con otros compuestos terapéuticos anticancerígenos como un kit. el kit puede incluir componentes opcionales que ayudan en la administración de la dosis unitaria a sujetos, tales como frascos para reconstituir formas en polvo, jeringas para inyección, sistemas de administración IV ideados en forma personalizada, inhaladores, etc. Por añadidura, el kit de dosis unitaria puede contener instrucciones para la preparación y administración de las composiciones. En ciertas realizaciones, las instrucciones comprenden instrucciones para utilizar, incluyendo por ejemplo instruir al usuario de la composición a administrar la composición de anticuerpo anti-VEGF y un agente quimioterapéutico al sujeto, por ej., capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteínas (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida o sus combinaciones. Las instrucciones pueden contener, opcionalmente, algunos o la totalidad de los resultados encontrados en el Ejemplo 1. El kit puede ser manufacturado como una dosis unitaria de uso única para un sujeto, usos múltiples para un sujeto en particular (a una dosis constante o en donde los compuestos individuales pueden variar en potencia a medida que la terapia progresa); o el kit puede contener dosis múltiples para la administración a sujetos múltiples ("empaquetado en masa"). Los componentes del kit pueden ser ensamblados en cartones, paquetes de blisteres, botellas, tubos y similares.

Depósito de Materiales La siguiente línea de células de hibridoma ha sido depositada de conformidad con lo dispuesto en el Tratado de Budapest ante la Recolección Americana de Cultivos Tipificados (ATCC, siglas correspondientes a American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA: Designación de anticuerpo ATCC No. Fecha de Depósito A4.6.1 ATCC HB-10709 29 Marzo, 1991 El siguiente ejemplo tiene el mero propósito de ilustrar la práctica de la invención y no es provisto a modo de limitación. Las descripciones de todas las bibliografías de patente y científicas citadas en esta invención son expresamente incorporadas en su totalidad a modo de referencia.

EJEMPLO Ejemplo 1. Regímenes de Bevacizumab en combinación con Quimioterapia en Sujetos con Cáncer de Mama Previamente No Tratado y Metastásico El cáncer de mama metastásico (CMM) es una enfermedad incurable, en la cual la mayoría de los pacientes sucumben a su enfermedad dentro de los 2 años del diagnóstico (Greenberg, et al., 1996, J. Clin. Oncol. 14:2197-205; Dawood, et al., 2008, J. Clin. Oncol. 26:4891-8; y Chia et al., Cáncer. 2007, 110:973-9). De los pacientes que presentan CMM, aproximadamente 60% habrá presentado previamente una enfermedad localizada que ha vuelto; aproximadamente 40% de los pacientes presentará enfermedad metastásica de novo.

Dos ensayos de Fase III aleatorizados anteriores en CMM han demostrado beneficio de la adición de bevacizumab a la quimioterapia inicial con taxanos. En el ensayo E2100 en Fase III pivotal, la supervivencia libre de evolución (SLE) fue significativamente más larga en pacientes tratados con paclitaxel+ bevacizumab semanalmente que en aquellos tratados con paclitaxel solamente (Miller at lea., N. Engl J. Med.. 2007, 357:2666-76). Similarmente, el ensayo AVADO, el cual investigó la combinación de bevacizumab (a 7,5 y 15 mg/kg q3w (cada 3 semanas)) con docetaxel, encontró que los pacientes tratados con docetaxek bevacizumab tenían una supervivencia libre de evolución (SLE) que era más larga que en aquellos tratados con docetaxel solamente (Miles et al., 2008 ASCO Annual Meeting Chicago, IL). Con anterioridad, un ensayo en Fase III aleatorizado (AVF2119g) para CMM previamente tratado que evaluaba la combinación de bevacizumab con capecitabina demostró que el índice de respuesta general (IRG) era superior en aquellos tratados con capecitabina + bevacizumab que aquellos tratados con capecitabina solamente, pero no pudo cumplir con su objetivo primario de mejorar la SLE (Miller et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23:792-9).

Este ejemplo se refiere al análisis de resultados obtenidos con sujetos con cáncer de mama metastásico previamente sin tratar tratados en el ensayo clínico RIBBON 1 utilizando taxanos y quimioterapias no con taxanos. El objetivo primario del estudio consistió en determinar el beneficio clínico de la adición de bevacizumab a los regímenes de quimioterapia convencionales para cáncer de mama metastásico previamente sin tratar, según lo medido por SLE en base a la evaluación del tumor por parte del investigador. Véase, por ej., O'Shaughnessy y Brufsky, (2008), Clinical Breast Cáncer, 8(4): 370-373. El ensayo comprendió dos grupos de estudio que evaluaron AVASTIN® con diferentes tipos de quimioterapias en mujeres quienes no habían recibido anteriormente quimioterapia para su cáncer de mama HER2 negativo avanzado. En el primer grupo de estudio, las mujeres recibieron ya sea AVASTIN o placebo en combinación con taxano o quimioterapias basadas en antraciclina. En el segundo grupo de estudio, las mujeres recibieron ya sea AVASTIN o placebo en combinación con quimioterapia con capecitabina. El análisis de este ejemplo se basó en información de 1237 pacientes. Estos ensayos evaluaron la eficacia de bevacizumab (AVASTIN®) como terapia para pacientes con cáncer de mama metastásico previamente sin tratamiento.

Diseño del Estudio El diseño del estudio RIBBON1 se ilustra en la Figura 1.

En el ensayo RIBBON1 , se utilizó el siguiente protocolo de tratamiento: Brazo A: bevacizumab 15mg/kg IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días y ya sea el cohorte 1 , cohorte 2 o cohorte 3; Brazo _B: placebo IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días y ya sea cohorte 1 , cohorte 2 o cohorte 3.

Cohorte 1: Cualquiera de los siguientes taxanos administrados cada 3 semanas Docetaxel 75-100 mg/m2 IV Partículas de paclitaxel fijadas a proteína (Abraxane ®) 260 mg/m2 IV Cohorte 2: Cualquiera de las siguientes quimioterapias combinadas basadas en antraciclina, para sujetos previamente no tratados con antraciclinas, cada 3 semanas: FEC: 5-fluorouracilo 500 mg/m2 IV, epirubicina 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida 500 mg/m2 IV en el Día 1 FAC: 5-fluorouracilo 500 mg/m2 IV, doxorubicina 50 mg/m2 IV y ciclofosfamida 500 mg/m2 IV en el Día 1 AC: Doxorubicina 50-60 mg/m2 IV y ciclofosfamida 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 EC: Epirubicina 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 Cohorte 3: Capecitabina 1000 mg/m2 oral dos veces al día en los Días 1-14 de cada ciclo de 3 semanas.

Por añadidura, después de la fase de tratamiento ciega, algunos sujetos fueron administrados bevacizumab ya sea 15 mg/kg IV cada tres semanas o 10 mg/ml IV cada 2 semanas; administrado concurrentemente con quimioterapia.

Bevacizumab (AVASTIN®) fue suministrado como un concentrado líquido estéril, ligeramente opalescente, incoloro a marrón pálido para solución para infusión IV. Bevacizumab fue suministrado en ya sea un frasco de vidrio de 5 mi (100 mg) o 20 mi (400 mg) que contenía 4 ml_ o 16 ml_ de bevacizumab, respectivamente (25 mg/ml para cualquiera de los dos frascos). Los frascos contienen bevacizumab con fosfato, tehalosa, polisorbato 20, y Agua Estéril para Inyección (SWFI, según sus siglas en inglés), USP. Los frascos no contenían conservante alguno. AVASTIN® fue diluido en 0,9% de Inyección de Cloruro Sódico, USP, hasta un volumen total de 100 mi antes de la administración intravenosa continua.

Métodos Los Sujetos/ Pacientes elegibles tenían los siguientes criterios claves de eligibilidad: Edad > 18 años, ECOG 0 o 1 (Escala de Estado de Rendimiento (ECOG Performance Status Scale)), sin quimioterapia previa para cáncer de mama localmente recurrente o metastásico, Her2 negativo (a menos que Her2 positivo y trastuzumab contraindicado o no disponible) y/o quimioterapia coadyuvante previa permitida en caso de recurrencia > (o igual a) 12 meses desde la última dosis. Todos los sujetos tenían adenocarcinoma de mama histológica o citológicamente confirmado, los sujetos pudieron haber tenido ya sea enfermedad localmente recurrente o metastásica medible (por medio de los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST, siglas correspondientes a Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)) o no medible. La enfermedad localmente recurrente no fue factible a resección con intento curativo.

Los sujetos pudieron haber recibido terapia hormonal previa en el entorno coadyuvante o metastásico si se discontinuó más de o igual a 1 semana con anterioridad al Día 0, o quimioterapia coadyuvante si se discontinuó más de o igual a 12 meses con anterioridad al Día 0.

Los criterios de exclusión incluyeron estado HER2 positivo conocido (a menos que el paciente haya progresado con la terapia con trastuzumab o la terapia con trastuzumab estuviese contraindicada o no estuviese disponible); la quimioterapia coadyuvante previa o neo coadyuvante dentro de los 12 meses; metástasis del sistema nervioso central conocida; presión sanguínea >150/100 mmHg; angina inestable; insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) de Grado II o superior de la Asociación Cardiaca de Nueva York (New York Heart Association); historia de infarto de miocardio dentro de los 6 meses; historia de accidente cerebrovascular o ataque isquémico transitorio dentro de los 6 meses; enfermedad vascular periférica clínicamente significativa; evidencia de diátesis sangrante o coagulopatia; historia de fístula abdominal, perforación gastrointestinal (Gl), o absceso intra abdominal dentro de los 6 meses; historia de reacción anafiláctica a terapia con anticuerpos monoclonales no controlada con premedicación; herida seria que no cicatriza; función orgánica inadecuada; enfermedad localmente recurrente factible a resección con intento curativo; historia de otras malignidades dentro de los 5 años. Si se escoge antraciclina como quimioterapia, los pacientes también debían tener fracción de eyección izquierda >50% y no debían tener historia previa de tratamiento con antraciclina.

El ensayo se llevó a cabo en todo el mundo (por lo menos 22 países) y reclutó a 1237 sujetos/pacientes (Taxano (T): 307; Antraciclina (Antra): 315; y Capecitabina (Cap): 615).

La criterio de referencia primario del estudio fue la supervivencia libre de evolución (SLE), definida como el tiempo desde la aleatorización a la evolución de la enfermedad o hasta la muerte, en base a la evaluación del investigador. Puede utilizarse la metodología de Kaplan-Meier para estimar la SLE media para cada brazo del tratamiento. En ciertas realizaciones, la relación de peligro para SLE será estimada utilizando un modelo de regresión Cox estratificado con los mismos factores de estratificación utilizados en la prueba de rango de log estratificada (stratified log-rank test). Los análisis de SLE en cada cohorte se llevan a cabo en el nivel de dos lados a=0,05. Los datos del tiempo al evento son comparados entre los brazos del tratamiento utilizando una prueba estratificada "log-rank". El método de Kaplan-Meier se utiliza para estimar la duración de los datos de tiempo a evento. Se computan los intervalos de confianza del 95% para la media de tiempo a evento utilizando el método de Brookmeyer-Crowley. La HR para los datos de tiempo a evento se estima utilizando un modelo de regresión Cox estratificado.

Los criterios de referencia secundarios incluyeron el índice de respuesta objetiva (IRO), tasa de supervivencia de un año, supervivencia general (SG) y SLE en base a la evaluación de IRC y seguridad. La SG se define como el tiempo desde la aleatorización hasta la muerte por cualquier causa. IRO se define como el porcentaje de pacientes quienes lograron una respuesta completa o parcial confirmada >28 días después de la documentación inicial de respuesta. La tasa de supervivencia de un año se evalúa entre los brazos del tratamiento utilizando el método de aproximación normal. IRO en pacientes con enfermedad medible en el punto de partida se compara utilizando la prueba Mantel-Haenszel ?2 estratificada. Los factores de estratificación de la aleatorización se incluyen en todos los análisis estratificados.

Resultados RIBBON1 era un estudio clínico internacional, multicentro, aleatorizado, de doble ciego, placebo controlado que inscribió a 1.237 sujetos/pacientes con cáncer de mama localmente recurrente o metastásico HER2-negativo quienes no habían recibido quimioterapia para su enfermedad metastásica. Véase la Tabla 1 para Características de los Sujetos/ Pacientes del ensayo. El criterio de referencia primario de estos ensayos fue la supervivencia libre de evolución (SLE), definida como el tiempo desde la aleatorización hasta la evolución de la enfermedad o la muerte, en base a la evaluación del investigador. Los resultados del ensayo indican que AVASTIN® en combinación con las siguientes quimioterapias utilizadas para el cáncer de mama HER 2 negativo metastásico de primer línea aumentó el tiempo de vida de las mujeres sin avance de su enfermedad, según lo definido como el punto de referencia primario de la supervivencia libre de evolución (SLE), en comparación con las quimioterapias por sí solas.

Tabla 1 : Características de los Sujetos/ Pacientes Los resultados de este estudio en fase III proporcionan un respaldo directo para el uso de agentes antiangiogénicos como terapia de primera línea para pacientes con cáncer de mama previamente sin tratamiento. La adición de bevacizumab, un anticuerpo anti-VEGF, a la terapia con taxano (por ej., terapia con docetaxel o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®))/antracicl¡na (por ej., doxorubicina, epirubicina o sus combinaciones) o quimioterapia con capecitabina confirió una mejora clínicamente significativa y estadísticamente significativa en pacientes con cáncer de mama según lo medido por, por ejemplo, la supervivencia libre de evolución. La SLE media en meses (95% Cl) es de 9,2 meses (8,6, 10,1 ) en los pacientes tratados con terapia con bevacizumab y taxano (por ej., terapia con docetaxel o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®))/antraciclina (por ej., doxorubicina, epirubicina o sus combinaciones) en comparación con 8,0 meses (6,7, 8,4) en la terapia con taxano/antraciclina sin bevacizumab, con una HR (95% Cl) 0,644 (0,522, 0,795), valor p (log-rank) inferior a 0,0001. Véase la Tabla 2. Véase la Figura 3 para ver los valores de SLE determinados por el investigador (INV) y los valores de SLE determinados por el comité de revisión independiente (CRI). La media de SLE en meses (95% Cl) es de 8,6 meses (8,1 , 9,5) en los pacientes tratados con bevacizumab y capecitabina en comparación con 5,7 meses (4,3, 6,2) en terapia con capecitabina sin bevacizumab, con una HR (95% Cl) 0,688 (0,564, 0,840), valor p (log-rank) de 0,0002. Véase la Tabla 2. Véase la Figura 2 para ver los valores de SLE determinados por el investigador (INV) y los valores de SLE determinados por el comité de revisión independiente (CRI). Véase la Tabla 3 para puntos de referencia secundarios, donde la SLE está dividida por subgrupos de quimioterapia. Véase las Figuras 4 y 6 para un análisis de los subgrupos de SLE por diversos cohortes, por ej., capecitabina y T/antraciclina en la Figura 4, y T/antraciclina en la Figura 6. Véase la Figura 5 para el índice de respuesta objetiva (IRO) y Tabla 2. Entre los respondedores, la duración media de la respuesta objetiva fue más larga en los brazos de bevacizumab para ambos cohortes : Cohorte de capecitabina, 9,2 meses (95% Cl: 8,5-10,4) contra 7,2 meses (95% Cl: 5,1-9,3); y para el cohorte con taxano / antraciclina, 8,3 meses (95% Cl: 7,2-10,7) contra 7,1 meses (95% Cl: 6,2-8,8). Véase la Tabla 4 para detalles de supervivencia general. No hay señal de seguridad inesperada alguna. La seguridad era consistente con los resultados de los ensayos con bevacizumab previos. Véase la Tabla 5 para un resumen de la seguridad. Esta mejora es clínicamente significativa.

Tabla 2 SLE y SG HR=(hazard ratio) relación de peligro Tabla 3 Punto de Referencia Secundario : SLE por Subgrupos de Quimioterapia (mPFS=SLE media) Taxano Antra PL(n=104) BV(n=203) PL(n=103) BV(n=212) mPFS, meses 8,2 9,2 7,9 9,2 HR (95% Cl) 0,75 (0,56-1 ,01 ) 0,55 (0/ m-0,74) valor p 0,0547 <0,0001 Tabla 4: Supervivencia General Tabla 5: Resumen de Seguridad * Eventos Adversos (EAs, según sus siglas en inglés) previamente mostrados que están asociados con bevacizumab **Excluye EAs relacionados con la evolución del cáncer de mama metastásico EAS— eventos adversos severos La adición de bevacizumab a los regímenes de quimioterapia basados en capecitabina, taxano o antraciclina utilizados en el tratamiento de primera línea del cáncer de mama metastásico, dio como resultado una mejora estadísticamente significativa en la SLE con un perfil de seguridad comparable con los estudios de Fase III anteriores.

Claims (40)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma cómo la misma ha de ser llevada a la práctica se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un método para tratar a un sujeto diagnosticado con cáncer de mama localmente recurrente o metastásico, que comprende administrar al sujeto un régimen de tratamiento que comprende una cantidad eficaz de por lo menos una quimioterapia y un anticuerpo anti-VEGF, donde dicho sujeto no ha recibido quimioterapia alguna para el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico, y/o no ha recibido quimioterapia coadyuvante previa en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis, y donde el régimen de tratamiento extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución del sujeto.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el agente quimioterapéutico es capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida o sus combinaciones.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde la quimioterapia del régimen de tratamiento comprende la administración de FEC: 5-fluorouracilo, epirubicina, y ciclofosfamida, o FAC: 5-fluorouracilo, doxorubicina y ciclofosfamida, o AC: doxorubicina y ciclofosfamida, o EC: Epirubicina y ciclofosfamida.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo anti-VEGF une el mismo epítopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo humanizado.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el sujeto es HER2 negativo.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab y la quimioterapia es capecitabina.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la administración de capecitabina es 1000 mg/m2 oral dos veces al día en los Días 1- 14 de cada ciclo de 3 semanas y la administración de bevacizumab es 15 mg/kg IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, donde la administración de bevacizumab es 15 mg/kg IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días, y la quimioterapia es docetaxel administrado 75-100 mg/m2 IV o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (Abraxane ®) administrado 260 mg/m2 IV cada 3 semanas, o FEC: 5-fluorouracilo el cual es administrado 500 mg/m2 IV, epirubicina administrada en una dosis de 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual es administrada en dosis de 500 mg/m2 IV en el Día 1 , o FAC: 5-fluorouracilo administrado a 500 mg/m2 IV, doxorubicina la cual se administra en dosis de 50 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual se administra a una dosis de 500 mg/m2 IV en el Día 1 , o AC: Doxorubicina administrada a una dosis de 50-60 mg/m2 IV y ciclofosfamida administrada en una dosis de 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 o EC: Epirubicina la cual se administra en una dosis de 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual es administrada en una cantidad de 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 cada tres semanas.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde la supervivencia libre de evolución del sujeto es extendida por lo menos alrededor de 1 mes o más cuando se compara con otro sujeto tratado con la quimioterapia solamente.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde la supervivencia libre de evolución del sujeto es extendida por lo menos alrededor de 2,9 meses cuando se compara con otro sujeto tratado con la quimioterapia solamente.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el anticuerpo anti-VEGF tiene una región variable de cadena pesada que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTL T VSS (SEC ID NO.1 ) y una región variable de cadena liviana que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR (SEC ID NO.2).

14. Un kit para tratar el cáncer de mama metastásico en un sujeto humano que comprende un paquete que comprende una composición de anticuerpo anti-VEGF e instrucciones para el uso de la composición del anticuerpo anti-VEGF en combinación con terapia con taxano o terapia con antraciclina, donde las instrucciones indican que la supervivencia libre de evolución para los sujetos que reciben terapia con taxano o terapia con antraciclina y bevacizumab es de 9,2 meses con una relación de peligro de 0,644.

15. Un kit para tratar el cáncer de mama metastáslco en un sujeto humano que comprende un paquete que comprende una composición de anticuerpo anti-VEGF e instrucciones para el uso de la composición de anticuerpo antl-VEGF en combinación con terapia con capecitabina, donde las instrucciones indican que la supervivencia libre de evolución para los sujetos que reciben terapia con capecitabina y bevacizumab es de 8,6 meses con una relación de peligro de 0,688.

16. El kit de acuerdo con la. reivindicación 14 o 15, donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

17. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, donde el sujeto está sin tratamiento previo.

18. El kit de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, donde el sujeto es HER2 negativo.

19. El uso de un anticuerpo anti-VEGF en la manufactura de un medicamento para tratar un cáncer de mama localmente recurrente o metastásico en un sujeto, donde dicho sujeto no ha recibido quimioterapia alguna para el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico, y/o no ha recibido quimioterapia coadyuvante previa en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis, donde el uso extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución del sujeto, y donde el medicamento comprende además por lo menos un agente quimioterapéutico.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el agente quimioterapéutico es capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epírubicina, 5-fluorouracílo, ciclofosfamida o sus combinaciones.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el agente quimioterapéutico es FEC: 5-fluorouraciló, epirubicina, y ciclofosfamida, o FAC: 5-fluorouracilo, doxorubicina y ciclofosfamida, o AC: doxorubicina y ciclofosfamida, o EC: Epirubicina y ciclofosfamida.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el anticuerpo anti- VEGF es un anticuerpo humanizado.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el sujeto es HER2 negativo.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab y el agente quimioterapéutico es capecitabina.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25, donde capecitabina se administra 1000 mg/m2 oral dos veces al día en los Días 1-14 de cada ciclo de 3 semanas y bevacizumab se administra en una dosis de 15mg/kg IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días.

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, donde la administración de bevacizumab es 15 mg/kg IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días, y la quimioterapia es docetaxel administrado en una dosis de 75-100 mg/m2 IV o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (Abraxane ®) el cual es administrado en una dosis de 260 mg/m2 IV cada 3 semanas, o FEC: 5-fluorouracilo administrado en una dosis de 500 mg/m2 IV, epirubicina administrada en una dosis de 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida administrada en una dosis de 500 mg/m2 IV en el Día 1 , o FAC: 5-fluorouracilo administrado en una dosis de 500 mg/m2 IV, doxorubicina administrada en una dosis de 50 mg/m2 IV y ciclofosfamida administrada en una dosis de 500 mg/m2 IV en el Día 1 , o AC: Doxorubicina la cual es administrada en una dosis de 50-60 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual se administra en una dosis de 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 o EC: Epirubicina la cual se administra en una dosis de 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual se administra en una dosis de 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 cada tres semanas.

28. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde la supervivencia libre de evolución del sujeto es extendida por lo menos alrededor de 1 mes o más cuando se compara con otro sujeto tratado con la quimioterapia solamente.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde la supervivencia libre de evolución del sujeto es extendida por lo menos alrededor de 2,9 meses cuando se compara con otro sujeto tratado con la quimioterapia solamente.

30. Un anticuerpo anti-VEGF para utilizar en un método para tratar el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un régimen de tratamiento que comprende una cantidad eficaz de por lo menos una quimioterapia y un anticuerpo anti-VEGF, donde dicho sujeto no ha recibido quimioterapia alguna para el cáncer de mama localmente recurrente o metastásico, y/o no ha recibido quimioterapia coadyuvante previa en recurrencia menos de o igual a 12 meses desde la última dosis, y donde el régimen de tratamiento extiende eficazmente la supervivencia libre de evolución del sujeto.

31. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde el agente quimioterapéutico es capecitabina, taxano, antraciclina, paclitaxel, docetaxel, partículas de paclitaxel fijadas a proteína (por ej., Abraxane®), doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, ciclofosfamida o sus combinaciones.

32. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde la quimioterapia del régimen de tratamiento comprende la administración de FEC: 5-fluorourac¡lo, epirubicina, y ciclofosfamida, o FAC: 5-fluorouracilo, doxorubicina y ciclofosfamida, o AC: doxorubicina y ciclofosfamida, o EC: Epirubicina y ciclofosfamida.

33. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo humanizado.

34. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

35. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde el sujeto es HER2 negativo.

36. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab y la quimioterapia es capecitabina.

37. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 36, donde la administración de capecitabina es 1000 mg/m2 oral dos veces al día en los Días 1-14 de cada ciclo de 3 semanas y la administración de bevacizumab es 15mg/kg IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días.

38. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 34, donde la administración de bevacizumab es 15 mg/kg IV en el día 1 de cada ciclo de 21 días, y la quimioterapia es docetaxel el cual es administrado en una dosis de 75-100 mg/m2 IV o partículas de paclitaxel fijadas a proteína (Abraxane ®) el cual es administrado 260 mg/m2 IV cada 3 semanas, o FEC: 5-fluorouracilo el cual es administrado en una dosis de 500 mg/m2 IV, epirubicina la cual es administrada en una dosis de 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual es administrada en una dosis de 500 mg/m2 IV en el Día 1 , o FAC: 5-fluorouracilo el cual se administra 500 mg/m2 IV, doxorubicina la cual es administrada en una dosis de 50 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual es administrada en una dosis de 500 mg/m2 IV en el Día 1 , o AC: Doxorubicina la cual es administrada en una dosis de 50-60 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual es administrada en una dosis de 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 o EC: Epirubicina la cual es administrada en una dosis de 90-100 mg/m2 IV y ciclofosfamida la cual es administrada en una dosis de 500-600 mg/m2 IV en el Día 1 cada tres semanas.

39. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde la supervivencia libre de evolución del sujeto es extendida por lo menos alrededor de 1 mes o más cuando se compara con otro sujeto tratado con la quimioterapia solamente.

40. El anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con la reivindicación 30, donde la supervivencia libre de evolución del sujeto es extendida por lo menos alrededor de 2,9 meses cuando se compara con otro sujeto tratado con la quimioterapia solamente.