MX2011000552A - Glicosidasa modificadas de la familia 6 con especificidad alterada del sustrato. - Google Patents
Glicosidasa modificadas de la familia 6 con especificidad alterada del sustrato.Info
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- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
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Abstract
Se proporciona una enzima de glicosidasa modificada de la Familia 6 que comprende sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas del grupo 182, 367, 399, 400 y 427 (la posición determinada de la alineación de una glicosidasa precursora de la Familia 6 con SEQ ID NO: 1) También se proporcionan constructos genéticos y microbios genéticamente modificados que comprenden secuencias nucleicas que codifican la glicosidasa modificada de la Familia 6. La glicosidasa de la Familia 6 de la invención despliega actividad de hidrólisis disminuida de polisacáridos beta ligados en 1-4 y actividad de hidrólisis creciente de polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 en comparación con una glicosidasa precursora de la Familia 6. Tales glicosidasas encuentran uso en una variedad de aplicaciones en la industria, por ejemplo, en la hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 durante el procesamiento de granos de cereales o la producción de alcohol, forraje animal o productos alimenticios.
Description
GLICOSIDASAS MODIFICADAS DE LA FAMILIA 6 CON ESPECIFICIDAD
ALTERADA DEL SUSTRATO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a enzimas modificadas de glicosil hidrolasa (GH) . Más específicamente, la invención se refiere a enzimas modificadas de la Familia 6 GH (GH6) con especificidad de sustrato alterada. La presente invención también se refiere a constructos genéticos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican y dirigen la expresión y secreción de enzimas GH modificadas, métodos para la producción de enzimas GH modificadas a partir de cepas hospederas, y el uso de las enzimas GH modificadas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las glicosil hidrolasas (GHs) son un grupo grande de enzimas que escinden enlaces glicosidicos entre monómeros individuales de carbohidratos en moléculas grandes de polisacáridos . Por ejemplo, las celulasas escinden el enlace beta 1-4 entre monómeros de glucosa en el polímero de celulosa; las arabinofuranosidasas escinden los enlaces alfa 1-2 y/o alfa 1-3 entre arabinosa y xilosa en arabinoxilano; las amilasas escinden los enlaces alfa 1-4 entre las moléculas de glucosa en almidón, etc. Como resultado de la diversidad de moléculas de polisacáridos , hay también muchas enzimas diferentes de GH . Sin embargo, estas enzimas comparten todas uno de dos mecanismos comunes, denominados inversión y retención, para la introducción de una molécula de agua en un enlace glicos.idico escindiendo asi el polisacárido . La mayoría de las enzimas GH utilizan el mecanismo de retención.
Las enzimas GH se agrupan en más de 100 familias diferentes con base en su familiaridad en sus estructuras primaria y terciaria y sus mecanismos catalíticos (sitio web CAZy, URL: cazy.org: Coutinho and Henrissat, 1999). Algunas familias de las enzimas GH se agrupan en clanes más grandes. Dependiendo de la familia en particular (todos los números están de acuerdo con el sitio web CAZy para el 13 de marzo de 2008), pueden haber solamente unos cuantos ejemplos conocidos (por ejemplo, familia GH82) o muchos (por ejemplo, familia GH34); más de la mitad de las familias tienen menos de 200 miembros. Similarmente , todos los miembros de una familia en particular pueden representar esencialmente una actividad sencilla, lo que significa actividad contra un sustrato específico sencillo (por ejemplo, GH11, todos los cuales son xilanasas) , mientras que otras familias pueden tener enzimas que cubren un amplio intervalo de actividades (por ejemplo, GH5, que comprende celulasas, xilanasas, mananasas, quitosanasas, galactanasas, etc.)- Individualmente, la mayoría de las enzimas tienen su mayor actividad para un sustrato sencillo, aunque hay ejemplos de enzimas particulares que tiene alta actividad contra varios sustratos (por ejemplo, Cel7B de Trichoderma reesei, que tiene tanto actividad de celulasa y de xilanasa) .
La Familia 6 de GH no pertenece a ningún clan; comprende más de 100 miembros, todos' los cuales muestran principalmente actividad de celulasa al usar el mecanismo de inversión. Tanto las endo- y exo-celulasas han sido identificadas a partir de una variedad de fuentes bacterianas y de hongos. Además, algunos miembros GH6, que incluyen Cel6A de Trichoderma reesei, han demostrado tener actividad hidrolítica contra beta-glucano, el cual es un polímero lineal de glucosa con ligaduras mixtas (Henriksson et al., 1995) .
Los beta-glucanos forman un gran grupo de polisacáridos industrialmente importantes. Debido a sus ligaduras mixtas, los beta-glucanos tienen mayor solubilidad en soluciones acuosas que los polímeros más regulares tales como la celulosa. En la forma soluble, los beta-glucanos le otorgan viscosidad y/o propiedades de tipo gel a una solución. Existen dos tipos principales: beta 1-3, 1-6 glucano, también conocido como laminaran debido a que una fuente importante de este glucano son las algas de color café Laminaria (kelp), y beta 1-3, 1-4 glucano, también conocido como liquenano debido a que una fuente importante de este glucano es el liquen. Sin 5 embargo, beta 1-3, 1-4¦ glucano también se encuentra como un componente importante del endosperma de la avena y la cebada.' La hidrólisis de beta 1-3, 1-4 glucano a partir de granos es deseable en la escala industrial para reducir la viscosidad en procesos tales como la producción de cerveza, en la -]_Q producción de etanol de grano para combustible, y también para incrementar el acceso a nutrientes en forrajes animales. En particular, Cel6A de Trichoderma reesei expresado en la levadura de cervecería se usa para ayudar en los procesos de malta y producción de cerveza (Enari et al., 1987).
15 Se han hecho algunos esfuerzos por preparar por ingeniería las enzimas GH con objeto de cambiar su actividad de un sustrato a otro, aunque los expertos en la ingeniería de proteínas coinciden en que este es uno de los desafíos más difíciles de. la ingeniería de proteínas (c.f. Tao y Cornish,
20 2002) . El grupo- de investigación de W. M de Vos identificó tres residuos clave de aminoácidos' de una beta-glucosidasa GH1 que determinó la especificidad del sustrato con base en una comparación estructural a una beta-galactosidasa de la misma familia. Al convertir los residuos de la beta-glucosidasa a aquellos encontrados en la beta-galactosidasa, convirtieron la beta-glucosidasa en una beta-galactosidasa. Similarmente , los residuos clave de GH10 xilanasa que discriminan entre xilano y celulosa han sido identificados y mutagenizados para cambiar la enzima de una xilanasa a una celulasa (Andrews et al., 2000)..
La familia de enzimas GH6 ha sido el objetivo de estudios de ingeniería de mutaciones y de proteínas. La exocelulasa Cel6A de Trichoderma reesei, la exocelulasa Cel6A de Humicola insolens, y las celulasas Cel6A (endo) y Cel6B (exo) de Thermobifida fusca son enzimas representativas que han sido particularmente bien caracterizadas. Los sitios específicos de investigación incluyen los que se conocen como regiones de rizo. Estos son los determinantes principales de si una enzima es una endocelulasa (que carece de rizos) o una exocelulasa (que posee rizos). Las mutaciones en los rizos (Varrot et al., 2002) o la eliminación de los rizos (Meinke et al., 1995) alterarán la interacción entre Cel6A y celulosa. Una serie detallada de mutaciones de punto fue estudiada en las dos enzimas de T. fusca, Cel6A y Cel6B (Zhang et al., 2000a; Zhang et al., 2000b). Los cambios en las actividades relativas hacia sustratos diferentes específicamente papel filtro, carboximetil celulosa, celulosa hinchada y celulosa microcristalina bacteriana - fueron observados. Otros estudios han examinado el papel de los aminoácidos aromáticos en el enlace a sustratos (Koivula et al., 1996; Koivula et al., 1998; Zou et al., 1999) y el papel de los aminoácidos cargados en la actividad y estabilidad (Koivula et al., 2002; Wohlfahrt et al, 2003).
La Cel6A de T. reesei (o TrCel6A) es una de las dos celobiohidrolasas importantes segregadas por este hongo y ha demostrado ser eficiente en la hidrólisis enzimática de celulosa cristalina, con baja actividad pero medible en la hidrólisis de beta. 1,3-1,4 glucanos de ligadura mixta tal como beta-glucano y liquenano. El residuo de aminoácidos de triptofano en la posición 367 ( 367) de Cel6A de Trichoderma reesei representa un residuo altamente conservado dentro de una región fuertemente conservada de la enzima (Figura 1). Generalmente, la mutación de los residuos conservados resulta en la inactivación de enzimas, o una pérdida severa de actividad.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a enzimas modificadas de glicosil hidrolasa (GH) . Más específicamente, a enzimas modificadas de la Familia 6 de GH (GH6) con especificidad de sustrato alterada. La presente invención también se refiere a constructos genéticos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican y dirigen la expresión y secreción de enzimas GH modificadas, métodos para la producción de enzimas GH modificadas a partir de cepas hospederas, y el uso de las enzimas GH modificadas.
Es un objetivo de. la invención proporcionar una glicosidasa modificada con una especificidad de sustrato alterada .
La presente invención proporciona glicosidasa modificada con una preferencia alterada de sustratos a partir de EC 3.2.1.91 (celulasa) a EC 3.2.1.73 (beta-glucanasa).
La presente invención se refiere a una glicosidasa modificada de la Familia 6 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: N182X, 367X, E399X, C/S400X y A427X, la glicosidasa modificada de la Familia 6 que tiene una secuencia de aminoácidos en la cual los aminoácidos que corresponden a aquellos desde la posición 83 a la posición 447 de TrCel6A (SEQ ID NO: 1) muestran desde alrededor de 47% a alrededor de 99.9% dé identidad con los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de SEQ ID NO: 1. Además, la una o más sustituciones de aminoácidos pueden ser seleccionadas del grupo que consiste en N182S, N182R,' N182G, N182A, 367A, W367C, W367G, W367N, W367R, W367S, . 367T, 367V, E399H, E399S, E399T, C400V, C400 , C400T, C400S, A427V, A427L, y A427S .
La presente invención también proporciona una glicosidasa modificada de la Familia 6 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: N182X, W367X, E399X, C/S400X y A427X, la glicosidasa modificada de la Familia 6 que tiene una secuencia de aminoácidos en la cual los aminoácidos que corresponden a aquellos desde la posición 83 a la posición 447 de TrCel6A (SEQ ID NO: 1) muestran desde alrededor de 70% a alrededor de 99.9% de identidad con los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de cualquiera de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 36. Además, la una o más sustituciones de aminoácidos pueden ser seleccionadas del grupo que consiste en N182S, N182R, N182G, N182A, W367A, W367C, W367G, W367N, W367R, 367S, W367T, W367V, E399H, E399S, E399T, C400V, C400 , C400T, C400S, A427V, A427L, y A427S.
La posición de la una o más sustitución de aminoácidos antes definida puede ser determinada de la alineación de secuencias de los aminoácidos que corresponden a las posiciones 83-447 de SEQ ID NO: 1 de una enzima de glicosidasa precursora de la Familia 6 con los aminoácidos 83-447 de la secuencia de aminoácidos de Trichoderma reesei Cel6A como se define en SEQ ID NO: 1.
La glicosidasa modificada de la Familia 6 puede ser derivada de una glicosidasa precursora de la Familia 6 que es idéntica de otra manera a la glicosidasa modificada de la Familia 6 excepto por la sustitución del aminoácido que se presenta naturalmente en una o más de las posiciones 182, 367, 399, 400 y 427., Por ejemplo, esta invención incluye una glicosidasa modificada de la Familia 6 como se define anteriormente y además que comprende un residuo de prolina en la posición 413.
La glicosidasa modificada de la Familia 6 que comprende estas mutaciones puede ser de un hongo filamentoso, tal como Trichoderma reesei.
La presente . invención también se refiere a una glicosidasa modificada de la Familia 6 como se define anteriormente y que tiene desde alrededor de un incremento de 1.2 veces en actividad en la hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 o beta ligados en 1-3, 1-6 y puede también mostrar al menos una disminución de 1.2 veces en actividad en la hidrólisis de beta polisacáridos ligados en 1-4 con relación a una glicosidasa precursora de la Familia 6 a partir de la cual se deriva.
La presente invención también se refiere a glicosidasas modificadas de la Familia 6 seleccionadas del grupo que consiste en:
TrCel6A-N182S-S413P (SEQ ID NO: 83);
TrCel6A-Nl82R-D350E-S413P (SEQ ID NO: 84);
TrCel6A-N182G-S413P (SEQ ID NO:. 85);
TrCel6A-N182A-S413P (SEQ ID NO: 86);
TrCel6A-W367A-S413P (SEQ ID NO: 37);
TrCel6A-W367C-S413P (SEQ ID NO: 38);
TrCel6A-W367G-S413P (SEQ ID NO: 39);
TrCel6A-W367N-S413P (SEQ ID NO: 40);
TrCel6A-W367R-S413P (SEQ ID NO: 41);
TrCel6A-W367S-S413P (SEQ ID NO: 42);
TrCel6A- 367T-S413P (SEQ ID NO: 43);
TrCel6A-W367V-S4Í3P (SEQ ID NO: 44);
HiAvi2-W367G (SEQ. ID NO: 45);
PcCel6A-W367G (SEQ ID NO: 46);
TrCel6A-S25G-T60S-E399H-S413P (SEQ ID NO: 87);
TrCel6A-E399T-S413P (SEQ ID NO: 88);
TrCel6A-E399S-S413P (SEQ ID NO: 89);
TrCel6A-C400V-S413P (SEQ ID NO: 90);
TrCel6A-C400M-S413P (SEQ ID NO: 91);
TrCel6A-C400T-S413P (SEQ ID NO: 92);
TrCel6A-C400S-S413P (SEQ ID NO: 93) ;
TrCel6A-A427V-S413P (SEQ ID NO: 94);
TrCel6A-A427L-S413P (SEQ ID NO: 95); y
TrCel6A-A427S-S413P (SEQ ID NO: 96) .
La presente invención se refiere a constructos genéticos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una glicosidasa modificada de la Familia 6 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: N182X, 367X, E399X, C/S400X y A427X, la glicosidasa modificada de la Familia 6 que tiene, una secuencia de aminoácidos que exhibe desde 47% a 99.9% identidad con los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de SEQ ID NO: l o una secuencia de aminoácidos que exhibe desde 70% a 99.9% identidad con los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de cualesquiera de SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO: 36. La secuencia de ácidos nucleicos puede estar ligada operativamente a otras secuencias de ácidos nucleicos que regulan su expresión y secreción de un microbio hospedero. Preferiblemente, las otras secuencias nucleicas que regulan la expresión y secreción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 se derivan a partir del microbio hospedero usado para la expresión de la glicosidasa modificada de la Familia 6. El microbio hospedero puede ser una levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae, o un hongo filamentoso, tal como Trichoderma reesei.
La invención también se refiere a un constructo genético como se define anteriormente, en donde la glicosidasa modificada de la Familia 6 codificada por el constructo genético además comprende una sustitución del aminoácido en la posición 413 con una prolina o cualquier otras mutaciones adicionales en las posiciones diferentes a 182, 367, 399, 400 o 427.
La invención también se refiere a un microbio genéticamente modificado que comprende un constructo genético que codifica la glicosidasa modificada de la Familia 6 y capaz de expresión y secreción de una glicosidasa. modificada de la Familia 6 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: N182X, W367X, E399X, C/S400X y A427X, la glicosidasa modificada de la Familia 6 que tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe 70% a 99.9% identidad con los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que exhibe desde 70% a 99.9% identidad con los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de cualesquiera de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 36. En una modalidad, el microbio genéticamente modificado es capaz de expresión y secreción de una glicosidasa modificada de la Familia 6 además que comprende una sustitución del aminoácido en la posición 413 con una prolina o algunas otras mutaciones adicionales en las posiciones diferentes a 182, 367, 399, 400 o 427. El microbio genéticamente modificado puede ser una levadura u hongo filamentoso. Por ejemplo, el microbio genéticamente modificado puede ser una especie de Saccharomyces , Pichia , Hansenula, Tqchoderma, Hypocrea, Aspergillus , Fusarium, Humicola o Neurospora.
La presente invención también se refiere a un proceso para hidrolizar un sustrato de polisacárido ligado a beta 1-3, 1-4 con glicosidasa modificada de la Familia 6.
La invención también se refiere a un proceso de producción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 como se define anteriormente, incluyendo la transformación de un hospedero de levadura o de hongo con un constructo genético que comprende una secuencia de ADN que codifica la glicosidasa modificada de la Familia 6, selección de cepas recombinantes de levaduras u hongos que expresan la glicosidasa modificada .de la Familia 6, cultivo de las cepas recombinantes seleccionadas en fermentaciones sumergidas de líquidos bajo condiciones que inducen la expresión de la glicosidasa modificada de la Familia 6 y recuperar la glicosidasa modificada de la Familia 6 por separación del filtrado de cultivo a partir del microbio hospedero.
Los inventores han hecho el descubrimiento sorprendente de que aunque la sustitución de N182, W367, E399, C/S400 o A427 por otro aminoácido resulta generalmente en pérdida de actividad contra el . sustrato de celulosa ligado en beta 1-4, varias de estas mutaciones incrementan significativamente la actividad de la enzima hacia beta .1-3, 1-4 glucanos. Ya que estos aminoácidos participan todos en el enlace a sustratos dentro del sitio active, los inventores postulan, sin desear apegarse por la teoría, que la especificidad de sustrato alterada de tales glicosidasas modificadas de la Familia 6 puede ser una' consecuencia de una expansión del sitio activo de enzimas para acomodar los sustratos . ramificados ligados a beta 1-3, 1-4. Esta especificidad de sustrato alterada tiene valor potencial aplicado a industrias donde la reducción de viscosidad provocada por el beta 1-3, 1-4 glucano es deseable, como se describe anteriormente. La glicosidasa modificada de la Familia 6 exhibe al menos alrededor de un incremento de 1.2 veces en actividad en un polisacárido ligado en beta-1-3, 1-4 y puede también mostrar al menos una disminución de 1.2 veces en actividad sobre un polisacárido ligado a beta 1-4 tal como celulosa. Por ejemplo, la glicosidasa modificada de la Familia 6 puede mostrar un incremento desde alrededor de 1.2- hasta alrededor de 4 veces en actividad sobre un polisacárido ligado en beta 1-3,¦ 1-4 y puede también mostrar una. disminución desde alrededor de 1.2 veces hasta alrededor de 10 veces en actividad sobre un polisacárido ligado en beta 1-4 tal como celulosa.
Las glicosidasas modificadas de la Familia 6 de la presente despliegan actividad creciente sobre polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 y actividad disminuida sobre polisacáridos beta ligados en 1-4 con relación a la glicosidasa precursora de la Familia 6 a partir de la cual se derivan .
Tales glicosidasas encuentran uso en una variedad de aplicaciones en la industria que requieren de alta actividad sobre sustratos de polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 o beta 1-3, 1-6. Por ejemplo, glicosidasas modificadas de la Familia 6, como se describen en la presente, pueden ser usadas en aplicaciones de procesamiento de granos industriales tales como producción de cerveza, producción de etanol de grano para combustible, y también para incrementar el acceso a nutrientes en forrajes animales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Estos y otros aspectos de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la cual se hace referencia a los dibujos anexos en donde:
La Figura 1 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos entre glicosidasas fúngicas seleccionadas a partir de la Familia 6 de glicosil hidrolasa y una secuencia de consenso de la Familia -6. Una representación gráfica de la frecuencia de la presencia del aminoácido en cada posición de la glicosidasa de consenso de la Familia 6 entre las 36 glicosidasas fúngicas de la Familia 6 se muestra debajo de las secuencias alineadas. Los residuos catalíticos de ácido aspártico en las posiciones equivalentes 175 y 221 en TrCel6A se indican por flechas. Los aminoácidos altamente conservados en el. equivalente de posiciones 182, 367, 399, 400 y 427 en TrCel6A están indicados por asterisco. Para celulasas con un dominio de enlace a celulosa, solamente se presentan las secuencias del núcleo catalítico.
La Figura 2 muestra una matriz de identidad para la alineación de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 83-447 de SEQ ID NO: 1 para cada una de las 36 secuencias de aminoácidos de la glicosidasa de la Familia 6 una con la otra.
La Figura 3 detalla los vectores plásmidos a) YEp352/PGK91-lAWhel-ass-TrCel6A-S413P, y b) YEpFLAGAKpnlO-Cj h2 que dirigen la expresión y secreción de TrCel6A nativa y modificado a partir de Saccharomyces cerevisiae recombinante, c) YEp/PGK-ass-NKE-PcCel6A que dirige la expresión y secreción de PcCel6A nativo y modificado a partir de Saccharomyces cerevisiae recombinante (La misma organización si se encuentra para las variantes PcCel6 clonadas en los mismos vectores), d) YEp/PGK-ass-NKE-HiAvi2 que dirige la expresión y secreción de HiAvi2 nativo y modificado a partir de Saccharomyces cerevisiae recombinante (La misma organización si se encuentra para las variantes HiAvi2 clonadas en los mismos vectores) .
La Figura 4 muestra la actividad relativa de glicosidasas modificadas derivadas de glicosidasa precursora TrCel6A-S413P con (a) sustituciones de aminoácidos de W367 y (b) sustituciones de aminoácidos en W367, A427, C400, E399 y N182 en celulosa, beta-glucano de cebada y liquenano a la actividad de una glicosidasa precursora TrCel6A en cada sustrato.
La Figura 5 muestra la actividad relativa de glicosidasas TrCel6A, PcCel6A y HiAvi2 precursoras y modificadas sobre (A) betaglucano de cebada: celulosa y (B) liquenano: celulosa.
La Figura 6 muestra los mapas de los vectores de transformación de Trichoderma pCel6Apst-S413P-pyr4-TV (A) y pCel6A413pst-hph-BB (B) .
La Figura 7 muestra la verificación del direccionamiento del lugar genético TrCel6A con el lugar nativo Cel6A por hibridación Southern. Se aisló el ADN genómico de los transformantes P577A, B, C y cepas precursoras BTR213, BTR2Í3aux28 digeridas con enzima de restricción EcoRl, separada en un gel de agarosa al 1%, transferida a una membrana de nitrocelulosa e hibridizada al usar la secuencia de ácidos nucleicos que codifica TrCel6A como una sonda. El plásmido de transformación pCel6ApXT-S413P-pyr4-TV digerido con EcoRl fue usado como un control (pista pCel6APXt-pyr4-TV) .
La Figura 8 muestra la expresión de la glicosidasa modificada TrCel6A-W367G-S413P por transformantes de Trichoderma reesi (P988A, P989A, B, C, P990A, P991B, P992A, P 1005 A, C, D) y la expresión de TrCel6A de tipo natural por la cepa hospedera (P577C) y cepa precursora BTR213aux en microcultivos . La abundancia de TrCel6A-W367G-S413P o la proteína TrCel6A se indica en cada barra como un porcentaje de la proteína total.
La Figura 9 muestra la estructura de cristal de TrCel6A (al usar las coordenadas del archivo PDB 1QK2) representada en forma de listón con el ligando del sitio activo ( celotetraosa ) en barras negras y los aminoácidos en las posiciones 182, 367, 399, 400 y 427 representados como bolas y barras negras y están etiquetados. Los residuos 403 al 424 fueron retirados por facilidad de visualización .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se. refiere a glicosidasas modificadas. Más específicamente, la invención se refiere a glicosidasas modificadas de la Familia 6 con especificidad de sustrato alterada. La presente invención también se refiere a constructos genéticos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican glicosidasas modificadas de la Familia 6, métodos para la producción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 a partir de cepas hospederas y el uso de la glicosidasa modificada de la Familia 6 en la hidrólisis de beta-glucano .
La siguiente descripción es de una modalidad preferida a manera de ejemplo solamente y sin limitación a la combinación de los aspectos necesarios para llevar a efecto la invención.
Glicosidasas modificadas de la Familia 6 de Glicosil hidrolasa
Una enzima de glicosil hidrolasa se clasifica como una glicosidasa de la Familia 6 si exhibe similitud en sus estructuras de proteínas primaria, secundaria y terciaria con aquellas de otras glicosidasas de la Familia 6. Por ejemplo, todas las glicosidasas de la Familia 6 comprenden dos residuos de ácido aspártico (D) que pueden servir como residuos catalíticos. Estos residuos de ácido aspártico se encuentran en las posiciones 175 y 221 (ver la Figura 1; con base en TrCel6A, Cel6A de Trichode ma reesei, numeración de aminoácidos) . La mayoría de las glicosidasas de la Familia 6 identificadas hasta ahora son mesofílicas ; sin embargo, esta familia también incluye celulasas termoestables de Ther obifida fusca (TfCel6A y TfCel6B) y las celulasas alcalofílicas de Humicola insolens (HiCel6A y HiCel6B) . Las glicosidasas de la Familia 6 también comparten una estructura tridimensional similar: un barril alfa/beta con un barril central beta que contiene siete hebras beta paralelas conectadas por cinco hélices alfa. Las estructuras tridimensionales de diversas glicosidasas de la Familia 6 son conocidas, tales como TrCel6A (Rouvinen, J. , et al. 1990), endo-beta-1, 4-glucanoasa Cel6A de Thermobifida fusca (TfCel6A, Spezio, M. , et al. 1993), celobiohidrolasa Cel6A de Humicola insolens (HiCel6A, Varrot, A., et al. 1999), endo-beta-1, 4-glucanoasa Cel6B de Humicola insolens (HiCel6B, Davies, G.J., et al. 2000) y H37Rv Cel6A de Mycobacterium tuberculosis (MtCel6A, Varrot, A., et al. 2005).
Como se muestra en las Figuras 1 y 2, existe un alto grado de conservación de secuencias primarias de aminoácidos entre glicosidasas de la Familia 6. La alineación múltiple a través de las 36 secuencias de aminoácidos de glicosidasas de la Familia 6 actualmente conocidas de origen fúngico muestra que la mayoría de las glicosidasas de la Familia 6 que se presentan naturalmente muestran desde alrededor de 47% hasta alrededor de 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 83-447 que comprenden el dominio catalítico de TrCel6A (Tabla 1) y desde alrededor de 70% a 100% identidad de secuencia de aminoácidos hacia al menos alguna otra glicosidasa de la Familia 6. Las glicosidasas de la Familia 6 de origen bacteriano muestran un grado mucho menor de identidad de secuencia de aminoácidos con TrCel6A o con las otras glicosidasas de la Familia 6 de origen fúngico.
Existen varias posiciones en donde un aminoácido en particular se conserva universalmente en la misma posición correspondiente a través de todos los miembros de la Familia 6. Por ejemplo, W135, W269, W2.72 y 367 son aminoácidos altamente conservados que interactúan con las subunidades de glucosa en el sustrato de celulosa en los subsitios -2, +1, +2 y +4 en el túnel de sitio activo de TrCel6A. N182, E399, y A427 son otros residuos altamente conservados encontrados en el subsitio -2 en el túnel de sitio activo de TrCel6A.
Tabla 1: % Identidad de Secuencia de Aminoácidos de las Glicosidasas Fúngicas de la Familia 6 a TrCel6A
SEQ Organismo Proteina Identidad ID con el dominio catalítico TrCel6A (83- 447)
2 Hypocrea koningii Celobiohidrolasa II (Cbh2) 98.9
3 Trichoderma viride CICC Celobiohidrolasa II 98.9
13038 (Cbhll; Cbh2)
4 Hypocrea koningii 3.2774 Celobiohidrolasa II (Cbh2; 98.1
Cbhll)
5 Hypocrea koningii Cbh2 97.8
AS3.2774
6 Trichoderma parceramosum Celobiohidrolasa II 97.8
(Cbhll)
7 Aspergillus nidulans Celobiohidrolasa 72.4
FGSC A4 (AN5282.2)
8 Aspergillus niger CBS .Anl2g02220 72.4
513.88
9 Aspergillus oryzae RIB AO090038000439 67.8
40
10 Aspergillus niger CBS An08g01760 67.7
513.88
11 Acremonium Celobiohidrolasa II (Acc2) 67.3
cellulolyticus Y-94
12 Talaromyces emersonii Celobiohidrolasa II 66.8
(Cbhll)
13 Gibberella zeae K59 Cel6 - Cel6 66.1
14 Fusarium oxysporum Endoglucanoasa B 66.1
15 Neurospora crassa OR74A NCU09680.1 (64C2 180) 65.9
16 Aspergillus nidulans AN1273.2 65.5
FGSC A4
17 Aspergillus tubingensis Producto de proteínas sin 65 5
nombrar (fragmento)
18 Magnaporthe grísea 70-15 MG05520.4 65 4
19 Chaetomium thermophilum Producto de proteínas sin 65 1
nombrar
20 Chaetomium thermophilum Celobiohidrolasa (Cbh2) 65 0
CT2
21 Stilbella annulata Producto de proteínas sin 64 9
nombrar
22 Humicola insolens Avicelasa 2 (Avi2) 63 7
23 Humicola insolens Celobiohidrolasa (CBHII)- 63 1
Cel6A
24 Cochliobolus Celobiohidrolasa II (CEL7) 59 6
heterostrophus C4
25 Agaricus bisporus D649 Celobiohidrolasa II (Cel3; 57 7
Cel3A)
26 Polyporus arcularius Celobiohidrolasa II (Cel 57 1
69B-8 2)
27 Lentinula edodes Stamets Celulasa-Cel6B 56 3
CS-2
28 Lentinula edodes L54 Celobiohidrolasa (CBhlI -1) 56 0
29 Malbrancchea cinnamomea Producto de proteína sin 54 9
nombrar
30 Phanerochaete Celobiohidrolasa II 54 9
chrysosporium
31 Volvariella volvacea Celobiohidrolasa II-I 53 8
(CbhII-I).
32 Chrysosporium Celobiohidrolasa (EG6; CBH 49 5
lucknowense II) - Cel6A
33 Pleurotus sajor-caju Celobiohidrolasa II 47 2
34 Trametes versicolor ORF 47 0
35 Neurospora .crassa OR74A NCU03996.1 46 8
36 Magnaporthe grísea 70-15 MG04499. 45 1
Por "numeración TrCel6A", . significa la numeración correspondiente a la posición de aminoácidos con base en la secuencia de aminoácidos de TrCel6A (Tabla 1; Figura 1; SEQ ID N0:1) . Como se establece a continuación, y como es evidente de la Figura 1, las glicosidasas de la Familia 6 exhiben un grado sustancial de similitud de secuencias. Por lo tanto, al alinear los aminoácidos para optimizar la similitud de secuencias entre las enzimas de glicosidasa, y al usar la numeración de aminoácidos de TrCel6A como la base para la numeración, las posiciones de aminoácidos dentro de las otras glicosidasas . de la Familia 6 pueden ser determinadas con relación a TrCel6A.
Los métodos para alinear secuencias de aminoácidos son bien conocidos y están disponibles para aquellos expertos en la técnica e incluyen BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica, URL: blast . ncbi . nlm. nih . gove/Blast . chi ; . Altschul et al., 1990; al usar los parámetros por omisión publicados) la cual es útil para alinear dos secuencias y CLUSTALW (URL: ebi . cak. ak/Tools/clustalw2/index. html) para alineación de dos o más secuencias.
Por "glicosidasa modificada de la Familia 6" o "glicosidasa modificada",, significa una glicosidasa de la Familia 6 la cual comprende una o más sustituciones de aminoácidos, introducidas por técnicas de ingeniería
genética, seleccionadas del grupo que consiste en: N182X(es decir N en la posición 182. se sustituye por X), W367X, E399X, C/S400X, y ?427?, donde X es cualquier aminoácido y la posición se determina a partir de la alineación de secuencias de la glicosidasa modificada de la Familia 6 con una secuencia de aminoácidos de Trichoderma reesei Cel6A como se define en SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, la glicosidasa modificada de la Familia 6 comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: N182S, N182R, N182G, . N182A, 367A, W367C, W367G, 367N, 367R, 367S, W367T, 367V, E399H, E399S, E399T, C400V, C400M, C400T, C400S, A427V, A427L, y A427S.
Se entenderá que la glicosidasa modificada de la Familia 6 puede derivarse de cualquier glicosidasa de la Familia 6. Por ejemplo, la glicosidasa modificada de la Familia 6 puede derivarse de una glicosidasa de tipo natural o de una glicosidasa que ya contiene otras sustituciones dé aminoácidos.
Una "glicosidasa modificada de la Familia 6" puede también definirse como una enzima capaz de hidrolizar polisacáridos que usan un mecanismo de inversión y que tienen una o más sustituciones de aminoácidos, introducidas por técnicas de ingeniería genética, seleccionadas del grupo que consiste en: N182X, W367X, E399X, C/S400X, y A427X, el cual se caracteriza porque tiene una secuencia de aminoácidos que es desde alrededor de 47% hasta alrededor de 99.9% idéntica con los aminoácidos 83 a 447 de la secuencia de aminoácidos TrCel6A (SEQ ID NO: 1) o que tiene una secuencia de aminoácidos que es desde alrededor de 70% a alrededor de 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 (TrCel6A) de cualquiera de las glicosidasas de la Familia 6 de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID i NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 13, SEQ
ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 17, SEQ
ID, NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 21, SEQ
ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID' NO : 24, SEQ ID NO: 25, SEQ
ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO: 29, SEQ
ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 33, SEQ
ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, y SEQ ID NO : 36 > . Por ejemplo, una glicosidasa modificada de la Familia 6 puede tener una secuencia de aminoácidos que es alrededor de 47%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 de SEQ ID NO: l o que es alrededor de 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de cualesquiera de las glicosidasas de la Familia 6 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, y SEQ ID NO: 36. Alguien experto en la técnica reconoce que la secuencia de aminoácidos de una glicosidasa dada de la Familia 6 puede ser modificada por la adición, eliminación o sustitución de una o más aminoácidos y considerarse todavía una glicosidasa modificada de la Familia 6. Ejemplos no limitativos de glicosidasas de la Familia 6 que pueden ser modificados siguiendo en enfoque y metodología general como se detalla en la presente se proporcionan en la Tabla 1.
Ejemplos de glicosidasas de la Familia 6 útiles para la presente invención, los cuales no significa que sean limitativos, incluyen Cel6A de Trichoderma reesei, Cel6A de Humicola insolens, Cel6A dé Phanerochaete chrysosporium, Cel6B de Cellulomonas fimi, Cel6B de Thermobifida fusca. Preferiblemente, la glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención comprende una glicosidasa modificada de Trichoderma reesei Cel6A.
Como se usa en la presente con respecto a las secuencias de aminoácidos de la glicosidasa modificada de la Familia 6, "derivado de" se refiere al aislamiento de un elemento objetivo de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la glicosidasa modificada deseada de la Familia 6 al usar material genético o información de secuencias de ácidos nucleicos especifica para la glicosidasa precursora correspondiente de la Familia 6. Como es conocido por alguien experto en la técnica, tal información del material o secuencia puede ser usada para generar una secuencia de ácidos nucleicos que codifique la glicosidasa modificada de la Familia 6 deseada ai usar una o más técnicas de biología molecular que incluyen, pero no se limitan a, clonación, sub-clonación, amplificación por PCR, síntesis vitro, y los similares .
En una modalidad de la invención, la glicosidasa modificada de la Familia 6 comprende una secuencia de aminoácidos que es desde alrededor de 70% hasta 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 de SEQ ID NO: 1 y exhibe un incremento desde alrededor de 1.2 veces, por ejemplo desde alrededor de 1.2 veces hasta 4 veces, en actividad en la hidrólisis de polisacáridos ligados a beta 1-3, 1-4 y puede también mostrar al menos una disminución de 1.2 veces, por ejemplo desde alrededor de 1.2 veces hasta 10 veces en actividad en la hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-4 con relación a una glicosidasa precursora de la Familia 6 a partir de la cual se derivan.
En otra modalidad de la invención, la glicosidasa modificada de la Familia 6 comprende una secuencia de aminoácidos que es desde alrededor de 80% hasta alrededor de 99.9% idéntica a los aminoácidos 83- 447 (numeración TrCel6A) de cualquiera de SEQ ID NO: 1 hasta 36 y muestra un incremento desde alrededor de 1.2 veces en actividad en la hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 y puede también mostrar al menos una disminución de 1.2 veces en actividad en la hidrólisis de beta polisacáridos ligados en 1-4 con relación a una glicosidasa precursora de la Familia 6 a partir de la cual se deriva.
En otras modalidades de la invención, la glicosidasa modificada de la Familia 6 comprende una secuencia de aminoácidos que es desde alrededor de 90% hasta alrededor de 99.9% idéntica a los aminoácidos 83- 447 de SEQ ID NO: 1 o desde alrededor de 95% hasta alrededor de 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de cualesquiera de SEQ ID NO: 1 a la 36 y exhibe un incremento desde alrededor de 1.2 veces en actividad en la hidrólisis de polisacáridos ligados a beta 1^3, 1-4 y puede también mostrar al menos una disminución de 1.2 veces en actividad en la hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-4 con relación a una glicosidasa precursora de la Familia 6 a partir de la cual se deriva.
Las técnicas para alteración de secuencias de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de cásete, mutagénesis aleatoria, construcción sintética de oligonucleótidos, clonación y otras técnicas de ingeniería genética (Eijsink VG, et al. 2005). Se entenderá que la glicosidasa modificada de la Familia 6 puede ser derivada de cualquier glicosidasa de la Familia 6 — es decir, puede ser derivada de una glicosidasa de la Familia 6 de "tipo silvestre" o que se presenta naturalmente o de una glicosidasa de la Familia 6 que ya contiene otras sustituciones de aminoácidos.
Por glicosidasa de la Familia 6 de "tipo natural" o "nativa", significa una glicosidasa de la Familia 6 que tiene una secuencia de aminoácidos cuando se codifica por el genoma del organismo que produce naturalmente tal glicosidasa de la Familia 6 sin la introducción de ningunas sustituciones, eliminaciones, inserciones, o modificaciones. Por ejemplo, por TrCel6A de tipo silvestre, HiCel6A de tipo silvestre y PcCel6A de tipo silvestre significa que las celulasas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 30 respectivamente, sin ningunas sustituciones de aminoácidos.
Para los propósitos de la presente invención, una "glicosidasa precursora de la Familia 6" o "glicosidasa precursora" es una glicosidasa de la Familia 6 que no contiene las sustituciones de aminoácidos (s) en las glicosidasas modificadas de la Familia 6, en particular en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 182, 367, 399, 400 y 427 (numeración TrCel6A) pero que es idéntica de otra manera a la glicosidasa modificada de la Familia 6. Como tal, la glicosidasa precursora de la Familia 6 puede ser una glicosidasa de la Familia 6 que contiene sustituciones de aminoácidos en otras posiciones que han sido introducidas, por ingeniería genética u otras técnicas. Sin embargo, una glicosidasa precursora de la Familia 6 no incluye aquellas enzimas de la Familia 6 en las cuales uno o más de los aminoácidos que se presentan naturalmente en las posiciones 182, 367, 399, 400 y 427 son, respectivamente, triptofano, asparagina, triptofano, ácido glutámico, cisteína o serina, y alanina.
Alternativamente, después de la producción de una glicosidasa modificada de la Familia 6 que comprende sustituciones de aminoácidos en una o más de posiciones 182, 367, 300, 400 y 427, la glicosidasa modificada de la Familia 6 puede ser además posteriormente modificada para contener sustituciones de aminoácidos adicionales.
Con objeto de ayudar a alguien experto en la técnica referente a aquellas posiciones de aminoácidos de una glicosidasa dada de la Familia 6 en la cual las sustituciones de aminoácidos (diferentes a N182X, W367X, E399X, C/S400X y W427X) pueden ser hechas y producir una enzima activa, una alineación de 36 glicosidasas de la Familia 6 derivada de fuentes fúngicas se proporciona en la Figura 1 junto con una gráfica que muestra la frecuencia de la presencia d cada aminoácido de la secuencia de consenso en cada posición. Al usar la información proporcionada en la Figura 1, alguien experto en la técnica reconocería las regiones de baja conservación de secuencias entre las glicosidasas de la Familia 6 y puede introducir sustituciones adicionales de aminoácidos en estas regiones.
Alteración de la Especificidad de Sustratos de glicosidasas de la Familia 6
La especificidad del sustrato de la glicosidasa modificada de la Familia 6 está determinada por la incubación de la enzima en la presencia de varios sustratos diferentes de polisacáridos y medir la liberación de azúcares solubles de esos sustratos. La liberación de azúcares soluble puede ser medida por ensayos químicos o químico-enzimáticos posteriores conocidos para alguien experto en la técnica, incluyendo la reacción con ácido ' dinitrosalicílico (DNS). La hidrólisis de polisacáridos también puede ser observada por métodos cromatográficos que separan y cuantifican mono-, di-y oligo-sacáridos solubles liberados por la actividad de la enzima. En adición, sustratos colorimétricos soluble pueden ser incorporados en medio de . agar sobre el cual un microbio hospedero que expresa y secreta una glicosidasa modificada o precursora de la Familia 6 se hace crecer. En tal ensayo de placas de agar, la actividad de la glicosidasa se detecta como un halo coloreado o incoloro alrededor de la colonia microbiana individual que expresa y secreta una glicosidasa activa. La práctica de la presente invención no está limitada por el método usado para evaluar la especificidad de sustrato de la glicosidasa modificada de la Familia 6.
El efecto de sustituciones de aminoácidos en la posiciones 182, 367, 399, 400 y 427 fue determinado por medio de un estudio comparativo de la especificidad de sustrato de glicosidasas modificadas y precursoras TrCel6A. Como se muestra en las Figuras 4 y 5 y resumidas para actividad en beta 1-3, 1-4 glucano de cebada en la Tabla 2
Tabla 2: Especificidad Alterada de Sustratos. de las Glicosidasas modificadas de la Familia 6
En una modalidad preferida, la glicosidasa modificada de la Familia 6 exhibe al menos un incremento de 1.2 veces, por ejemplo desde alrededor de 1.2 veces hasta alrededor de 4 veces, en su actividad de hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 y puede también mostrar al menos una disminución de 1.2. veces, por ejemplo desde alrededor de 1.2 veces hasta alrededor de 10 veces, en su actividad, de hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-4.
Sin desear apegarse por la teoría, los inventores hacen
la hipótesis de que la actividad creciente de beta 1-3, 1-4
glucanos exhibida por las glicosidasas modificadas de la ^ Familia 6 se debe a 1a- ubicación de aminoácidos sustituidos
dentro o cerca del sitio activo de la enzima. La Figura 9 muestra que, para TrCel6A, los aminoácidos W367, E399, C400 están involucrados en el enlace al sustrato mientras que los aminoácidos N182 y A427 están localizados dentro de las 10 regiones de rizo que encierran el túnel del sitio activo. Por lo tanto, las mutaciones de estos aminoácidos altamente conservados pueden resultar en una geometría más abierta o flexible dentro del sitio activo TrCel6A que permite acomodar
los beta 1-3, 1-4 glucanos ramificados.
^ ~* Constructos genéticos que codifican Glicosidasa modificada de
la Familia 6
La presente invención también se refiere a constructos genéticos que comprenden una. secuencia de ácidos nucleicos que codifica la glicosidasa modificada de la Familia 6. La 0
secuencia de ácidos nucleicos que codifica la glicosidasa modificada puede ligarse operativamente a secuencias
reguladoras de ácidos nucleicos que dirigen la expresión y
secreción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 desde un microbio hospedero. Por "secuencias reguladoras de ácidos nucleicos" significa un promotor y una secuencia de ADN que codifica un péptido de señal de secreción. Las secuencias reguladoras de ácidos nucleicos son preferiblemente funcionales en un hospedero fúngico. Las secuencias reguladoras de ácidos nucleicos pueden estar derivadas de genes que están altamente expresados y secretados en el microbio hospedero bajo condiciones de fermentación industrial. En una modalidad preferida, las secuencias reguladoras de ácidos nucleicos se derivan desde uno o más genes de celulasa o hemicelulasa de Trichoderma reesei.
El constructo genético puede comprender además un gen marcador de selección para permitir el aislamiento de un microbio genéticamente modificado transformado con el constructo como se conoce . comúnmente por aquellos expertos en la técnica. El gen marcador de selección puede otorgar resistencia a un antibiótico o la capacidad de crecer en un medio que carece de un nutriente especifico para el organismo hospedero que de otra manera no puede crecer bajo estas condiciones. La presente invención no está limitada por la elección del gen marcador de selección, y alguien experto en la técnica puede fácilmente determinar un gen apropiado. En una modalidad preferida, el gen marcador de selección confiere resistencia a la higromicina, fleomicina, kanamicina, geneticina, o G418, complementa una deficiencia del microbio hospedero en uno de los genes trp, arg, leu, pyr4, pyr, ura3, ura5,. his, o ade o confiere la capacidad de crecer en acetamida como una única fuente de nitrógeno.
El constructo genético puede comprender ademas otras secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, terminadores de la transcripción, secuencias de ácidos nucleicos que codifican etiquetas de péptidos, secuencias sintéticas para ligar juntas las diversas secuencias de ácidos nucleicos, orígenes de replicación y los similares. La práctica de la presente invención no está limitada por la presencia de alguna o más de estas otras secuencias de ácidos nucleicos.
Microbios genéticamente modificados que producen glicosidasas modificadas de la Familia 6
La glicosidasa modificada de la Familia 6 puede ser expresada y secretada desde un microbio genéticamente modificado producido por transformación de un microbio hospedero con un constructo genético que codifica la glicosidasa modificada de la Familia 6. El microbio hospedero puede ser una levadura o un hongo filamentoso, particularmente aquellos microbios que son miembros de la clase Ascomycota. Los géneros de levaduras útiles como microbios hospederos para la expresión de beta-glucosidasas modificadas TrCel3A de la presente invención incluyen Saccharomyces , Pichia, Hansenula , Kluyveromyces , Yarrowia, y Arxula. Los géneros de hongos útiles como microbios para la 5 expresión de beta-glucosidasas modificadas TrCel3A de la presente invención incluyen Trichoderma , Hypocrea, Aspergillus , Fusarium , Humicola , Neurospora , y Penicillium. Típicamente, el microbio hospedero es uno a partir del cual los genes que codifican alguna o todas las glicosidasas de la ]_ Q Familia 6 han sido eliminadas. En una modalidad más preferida, el microbio- hospedero es una cepa industrial de Trichoderma reesei.
El constructo genético puede ser introducido dentro del microbio hospedero por cualquier número de métodos conocidos
15 por alguien experto en la técnica de transformación microbiana, incluyendo pero no limitado a, tratamiento de células con CaCl2, electroporación, bombardeo biolístico, fusión mediada de protoplastos por PEG (por ejemplo, White et al., WO 2005/093072). Después de seleccionar las cepas
20 fúngicas recombinantes que expresan la glicosidasa modificada de la Familia 6, las cepas recombinantes seleccionadas pueden ser cultivadas en fermentaciones sumergidas de líquidos bajo condiciones que inducen la expresión y secreción de la glicosidasa modificada de la Familia 6. Preferiblemente, la glicosidasa modificada de la Familia 6 se produce en fermentación sumergida de cultivos líquidos y separada desde las células al final de la fermentación. Las células pueden ser separadas por filtración, centrifugación, u otros procesos familiares con aquellos expertos en la técnica. La fracción que contiene glicosidasa libre de células luego puede ser concentrada (por ejemplo, por medio de ultrafiltración) , conservado, y/o¦ estabilizado previo al uso.
Por lo tanto la presente invención también proporciona un proceso para la producción de una glicosidasa modificada de la Familia 6. El método comprende hacer crecer un microbio genéticamente modificado que comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican una glicosidasa modificada de la Familia 6, en un medio de cultivo bajo condiciones que inducen la expresión y secreción de la glicosidasa modificada de la Familia 6, y recuperar la glicosidasa modificada de la Familia 6 desde el medio de cultivo. La glicosidasa modificada de la Familia 6 que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada del grupo que consiste en N182X, W367X, E399X, C/S400X, y A427X, la posición determinada a partir de la alineación de una secuencia de aminoácidos de glicosidasa precursora de la Familia 6 con una secuencia de aminoácidos de Trichoderma reesei Cel6A como se define en SEQ ID NO: 1, en donde los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de la glicosidasa
modificada de la Familia 6 son desde alrededor de 47% a
alrededor de 99.9% idéntica a los aminoácidos 83-447 de SEQ
ID NO: 1, o desde alrededor de 70-90% idéntica a los
5 aminoácidos 83-447 de cualesquiera de SEQ ID NO: 1 hasta 36.
Producción de Glucosidasas Modificadas de la Familia 6
Una glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención puede ser producida en un proceso de
fermentación al usar un microbio genéticamente modificado que ^ comprende un constructo genético que codifica la glicosidasa
modificada de la Familia 6, por ejemplo, en fermentación sumergida de cultivo liquido.
Las fermentaciones' sumergidas en liquido de microorganismos, que incluyen Trichoderma y hongos
15
filamentosos relacionados, se efectúan típicamente como un proceso intermitente, intermitente con alimentación o
continuo .
En un proceso intermitente, todos los materiales necesarios, con la excepción de oxígeno para los procesos
20
aeróbicos, se colocan en un reactor al inicio de la operación y la fermentación se permite que avance hasta la terminación,
punto en el cual se cosecha el producto. Un proceso
intermitente para producir la glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención puede ser llevado a cabo en un matraz con agitación o un bioreactor.
En un proceso intermitente con alimentación, el cultivo se alimenta continuamente o secuencialmente con uno o más componentes de medios sin la remoción del fluido de cultivo. En un proceso continuo, el medio fresco se. suministra y el fluido de cultivo se retira continuamente a velocidades volumétricamente iguales para mantener el cultivo a una velocidad de crecimiento uniforme.
Alguien experto en la técnica sabe que el medio de fermentación comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y otros nutrientes, vitaminas y minerales los cuales pueden ser añadidos a los medios de fermentación para mejorar el crecimiento y producción de enzimas de la célula hospedera. Estos otros componentes de medios pueden ser añadidos antes de, simultáneamente con o después de la inoculación del cultivo con la célula hospedera.
Para el proceso para la producción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención, la fuente de carbono puede comprender un carbohidrato que inducirá la expresión de la glicosidasa modificada de la Familia 6 desde un constructo genético en el ' microbio genéticamente modificado. Por ejemplo, si el microbio genéticamente modificado es una cepa de Trichoderma , la fuente de carbono puede comprender una o más de celulosa, celobiosa, sefarosa, y oligo- o poli-sacáridos relacionados conocidos por inducir la expresión de celulasas y beta-glucosidasa en Trichoderma.
En el caso de la fermentación intermitente, la fuente de carbono puede ser añadida al medio de fermentación previo a o simultáneamente con inoculación. En los casos de operaciones continuas o con alimentación intermitente, la fuente de carbono puede ser suministrada también continuamente o intermitentemente durante el proceso de fermentación. Por ejemplo, cuando el microbio genéticamente modificado es una cepa de Trichoderma, la velocidad de alimentación de carbono está entre 0.2 y 2.5 g carbono/L de cultivo/h, o cualquier cantidad intermedia.
El proceso para la producción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención puede ser llevada a cabo a una temperatura desde alrededor de 20°C hasta alrededor de 40°C, o cualquier temperatura intermedia, por ejemplo desde alrededor de 25°C hasta alrededor de 37°0,· o cualquier temperatura intermedia, o desde 20, 22, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32., 35, 37, 40°C o cualquier temperatura intermedia.
El proceso para la producción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención puede ser llevado a cabo a un pH desde alrededor de 3.0 hasta 6.5, o cualquier pH intermedio, por ejemplo desde alrededor de pH 3.5 hasta pH 5.5, o cualquier pH intermedio, por ejemplo desde alrededor de pH 3.0, 3.2, 3.4, 3.5, 3.7, 3.8, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.2, 5.4, 5.5, 5.7, 5.8, 6.0, 6.2, 6.5 o cualquier pH intermedio.
Después de la fermentación, el caldo de fermentación que contiene la glicosidasa modificada de la Familia 6 puede ser usado directamente, o la glicosidasa modificada de la Familia 6 puede ser separada a partir de las células fúngicas, por ejemplo por filtración o centrifugación. Los solutos de bajo peso molecular tales como los componentes no consumidos del medio de fermentación pueden ser removidos por ultra-filtración. La glicosidasa modificada de la Familia 6 puede ser concentrada, por ejemplo, por evaporación, precipitación, sedimentación o filtración. Los productos químicos tales como glicerol, sacarosa, sorbitol y los similares pueden ser agregados para estabilizar la enzima de celulasa. Otros productos químicos, tales como benzoato de sodio o sorbato de potasio, pueden ser añadidos a la enzima de celulasa para evitar el crecimiento de la contaminación microbiana.
El Uso de Glicosidasa modificada de la Familia 6
La glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención se usa para la hidrólisis enzimática de polisacáridos que contienen ambas ligaduras beta 1-3, 1-4 y/o beta 1-3, 1-6 glicosidicas . Más preferiblemente, la glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención se usa para la hidrólisis enzimática de beta 1-3, 1-4 glucanos presentes en granos de cereales. Las glicosidasas modificadas de la Familia 6 de la presente invención pueden ser usadas en procesos industriales tales como producción de cerveza, producción de etanol de grano para combustible, y también para incrementar el acceso a nutrientes en alimentos para animales.
Por el término "hidrólisis enzimática", significa un proceso mediante el cual las enzimas o mezclas de glicosidasa, incluyendo aquellas que comprenden la glicosidasa modificada de la Familia 6 de la presente invención, actúan sobre los polisacáridos para convertir todo o una porción de los mismos a azúcares solubles.
EJEMPLOS
La presente, invención será ilustrada además en los siguientes ejemplos. Sin. embargo, se entenderá que estos ejemplos son solamente para propósitos ilustrativos y no deben usarse para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Ejemplo 1 : Cepas y Vectores
La cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 ( ATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0 ñkre2) fue obtenida desde ATCC (#4014317) . El vector YEp352/PGK91-l fue obtenido desde el Instituto Nacional de Salud. El vector YEPFLAGAJ-/7H10-S 13P se describe en la publicación de E.U.A. No. 2008/0076152A1. El vector YEpFLAG-1 fue obtenido a partir de Sigma como parte de un kit de expresión de levadura en el terminal amino.
Ejemplo 2: Clonación de genes de glicosidasa modificada y transformación de Saccharomyces cerevisiae
a. Clonación del gen TrCel6ñ-S413P en el vector YEp352/PGK91-1 y transformación de BY4742 de S. cerevisiae
Con objeto de facilitar la clonación al usar enzimas de restricción Nhel y Kpnl , el sitio único Nhel en la posición 1936 del vector YEp352/PGK91-l se formó en puntas romas al usar el fragmento grande de ADN de Polimerasa I (Klenow) para generar YEp352/PGK91-lANheI . El gen TrCel6A-S413P fue amplificado por PCR a partir del. vector YEpFLAGAKpnlO-S 13P (publicación de E.U.A. No. 2008/0076152A1) al usar los cebadores 5'i\J eCel6A y 3 ' BGlKpnCel6R. En paralelo, la secuencia líder de levadura del factor a fue amplificada por PCR a partir del vector YEpFLAG-1 (Sigma) al usar los cebadores ( 5 ' BGlAlfaSS y 3 ' ?/heAlfaSS ) para introducir BG1II en el extremo 5' y un sitio Miel en el extremo 3' del amplicón. Las SEQ ID NOS: 47-50 fueron utilizadas como secuencias cebadoras.
5' BGlAlfaSS: 5' ACC AAA AGA TCT ATG AGA TTT CCT TCA ATT (SEQ ID NO: 47)
3' ?heAlfaSS: 5' TGA GCA GCT AGC CCT TTT ATC CAA AGA TAC (SEQ ID NO: 48)
5' N eCel6A: 5' AAA AGG GCT AGC TGC TCA AGC GTC TGG GGC (SEQ ID NO: 49)
3' BGlKpnCel6l\: 5' GAG CTC AGA TCT GGT ACC TTA CAG GAA CGA TGG GTT (SEQ ID NO: 50)
La secuencia líder de levadura del factor alfa fue aislada por digestión de BG1II /Nhel y una ligación de tres piezas efectuada con · el gen TrCel6A-S 13P (aislado por digestión Nhel/BGIII) y vector YEp352/PGK91-lAM?eI (aislado por digestión de BG1II) . El vector resultante YEp352/PGK91-lAN el-ass-TrCel6A-S413P (Figura 3) fue transformado en la cepa de levadura BY4742 al usar el procedimiento descrito por Gietz, R . D. and Woods, R. ?. (2002) .
b. Clonación de los genes PcCel6A, Pccel6A-W361G, HiAv2 y HiAvi2-W374G en YEp/PGK-ass-NKE y transformación en levadura
Generación de YEep/PGK-alfass-NKE : Vector YEp352/PGK91-l fue digerido con Nhel y fJcoRl y la banda de plásmido se aisló a partir de gel . Se hizo un adaptador de ADN al combinar los pares de bases de los cebadores fosforilados en 5' AT046 and AT047 y se ligó con el vector digerido. Para eliminar la concatemerización posible, el plásmido fue luego digerido con Kpnl y auto-ligado. El vector resultante se nombra YEp/PGK-alfasS-NKE y su integridad de secuencia se confirma por la formación de secuencias.
AT046: 5' CTA GCT GAT CAC TGA GGT ACC G (SEQ ID NO: 54) AT047: 5' AAT TCG GTA CCT CAG TGA TCA G (SEQ ID NO: 55)
Generación de vectores PcCel6A y PcCel6A-W361G: El gen PcCel6A fue amplificado por PCR a partir del vector YEpFLAGAKpnlO-PcCelGA (publicación de E.U.A. No.
2008/0076152A1) al usar los cebadores 5VH098 y 3VH099. PcCel6A fue clonado NheVKpnl en YEp/PGK-alfa3S-NKE . PcCel6A-W361G fue generado por PCR de dos etapas al mutar PcCel6A en YEp/PGK-al fasS-NKE al usar los cebadores 5 ' VH067 and 3 ' PGK-terminal para el fragmento uno y YalfaN21-2 y 3'VH066 para generar el fragmento dos. Los fragmentos 1 and 2 fueron combinados al usar los cebadores YalfaN21-2 and 3 1 PGK-terminal.
5'VH098: 5' GGT ATC TTT GGA TAA AAG GGC TAG CTC GGA GTG- GGG ACA G (SEQ ID NO:56)
3'VH099: 5' GGA GAT CGA ATT CGG TAC CTA CAG CGG CGG GTT GG (SEQ ID NO: 57)
5'VH067: 5' CAG TGG GGA GAC GGG TGC AAC ATC AAG (SEQ ID NO: 58)
3'VH066: 5' GTC TCC CCA CTG TTG GCG GAT G (SEQ ID NO: 59)
YalfaN21-2 5 ' GCC AGC ATT GCT GCT AAA G (SEQ ID NO: 60)
Los. vectores resultantes, YEpFLAGAKpnl 0-PcCel 6A y YEpFLAGA pn 10-PcCel6A-W361G fueron usados para transformar la cepa de Saccharomyces cerevisiae BY4742 al usar el procedimiento descrito por Gietz, R. D. and oods, R. A. (2002) .
Generación de los vectores HiAvi2 y HiAvi2-W374G: El gen Hiavi2 fue amplificado por PCR a partir del vector YEpFLAGAKpnlO-HiAvi2 (publicación de E.U.A. No. 2008/0076152A1) al usar los cebadores 5'NM083 and 3'NM084. HiAvi2 fue clonado Nhel/Kpnl en YEp/PGK-alfasS-N E. HiAvi2-W374G fue generado por PCR de dos etapas al mutar HiAvi2 en YEp/PGK-alfass-NKE al usar los cebadores 5??065 y 3 ' PG -terminal para el fragmento uno y YalfaN21-2 y 3'VH064 para generar el fragmento dos. Los fragmentos 1 y 2 fueron combinados al usar los cebadores YalfaN21-2 y 3 ' PGK-termínal .
5'NM083: 5' AAG GAT GAC GAT GAC AAG GAA TTC CTC GAG GCT AGC TGT GCC CCG ACT TGG GGC (SEQ ID NO: 61)
3'NM084: 5' AGC GGC CGC TTA CCG CGG GTC GAC GGG CCC GGT ACC TCA GAA CGG CGG ATT GGC (SEQ ID NO: 62)
5'VH065: 5' GAA TGG GGC CAC GGG TGC AAT GCC ATT GG (SEQ ID NO: 63)
3'VH064: 5' GTG GCC CCA TTC CTT CTG GCC G (SEQ ID NO: 64)
Los vectores resultantes, YEpFLAGAKpnlO-HiA i2 y YEpFLAG AKpnl0-HiAvi2-W374G fueron usados para transformar la cepa de Saccharomyces cerevisiae ¦ BY4742 al usar el procedimiento descrito por Gietz, R. D. and Woods, R. A. (2002) .
Ejemplo 3: Elaboración de Bibliotecas PCR Propensas a Error
Se generaron bibliotecas de mutagénesis aleatoria al usar dos métodos: un método de polimerasa de ADN Mutazyme® II DNA y un método de mezcla de dNTP desviado por Mn2+. Para el método por polimerasa de. ADN Mutazyme® II, una serie de cuatro PCR independientes se efectuaron al usar 10, 20, 30, 40 ng del vector YEp352/PGK91-lAN el-ass-TrCel6A-S413P y la polimerasa de ADN Mutazyme® II con cebadores YalfaN21 and 3 ' PGK-terminal . La amplificación se hizo durante 25 ciclos. Los cuatro productos por PCR fueron acumulados y diluidos hasta 10 ng/ L. Una segunda etapa de mutagénesis de PCR fue 5 efectuada al usar 30 ng de producto acumulado por PCR con polimerasa de ADN Mutazyme® II al usar los mismos cebadores para los 30 ciclos de amplificación. El vector YEp352/PGK91- IAN el-ass-TrCel6A-S413P se digirió con Nhel y Kpnl y el fragmento de vector vacio fue aislado. Este fragmento lineal -j_ Q y el amplicón final fueron transformados simultáneamente y clonados por recombinación i.n vivo en la cepa de levadura BY4742 (Butler et al, 2003) .
Para el método de mezcla de dNTP desviado por Mn2+, se llevó a cabo una PCR al usar 25 ng de vector YEp352/PGK91- 15 lAA¾el-ass-TrCel6A-S413P, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dCTP, 0.24 mM dGTP, 0.2 mM dTTP, y 0.64 mM Mn2+ con polimerasa de ADN Taq (Sigma) con cebadores YalfaN21 y 3 ' PGK-terminal durante 30 ciclos de amplificación. El amplicón final fue clonado dentro del vector YEp352/PGK91-lAJ\¾el-ass-TrCel6A-S413P como se
20 describe anteriormente.
YalfaN21: 5 ' AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG (SEQ ID NO: 49) 3 ' PGK-terminal: 5 ' GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC (SEQ ID NO:
Ejemplo 4 : Cribado de Biblioteca de PCR Propensa a Error de TrCel6A
a. Cribado Primario de la Biblioteca de TrCel6A EP-PCR - Ensayo de Placas
Transformantes de Saccharomyces cerevisiae se hicieron crecer sobre placas que contienen medio sintético completo (SC: 2% agar p/v, 0.17% levadura base nitrógeno p/v, 0.078% -suplemento de vaciado Ura p/v, 2% glucosa p/v, 2% casaminoácidos p/v,- 0.5% sulfato de amonio p/v,- pH 5.5) y 0.12% Azo-cebada~3-glucano (Megazyme) por 2 días a 30°C. Las colonias que presentaron halos de depuración más grandes, después de una incubación durante la noche a 45°C, en comparación con la enzima precursora TrCel6A-S413P fueron seleccionados y formados en secuencias como se describe a continuación en la sección c.
b. Cribado Primario de la Biblioteca TrCel6A EP-PCR -Ensayo Líquido
Los clones a partir de bibliotecas de EP-PCR (Ejemplo 3) o SSM (Ejemplo 5) que expresan las variantes de TrCel6A-S413P fueron seleccionados para pre-cultivos en medios líquidos por inoculación con palillo dental de 150 iL de medios completos sintéticos (SC: 0.17% base de levadura de nitrógeno p/v, 0.078% de suplemento de vaciado Ura p/v, 2% glucosa p/v, 2% casaminoácidos p/v, 0.5% sulfato de amonio p/v, pH 5.5) en microplacas de 96 pocilios. Pre-cultivos se hicieron crecer durante la noche (16-18 h) a 30°C y 300 rpm hasta fase estacionaria. Para la inoculación del cultivo de expresión, 25 µ?? de pre-cultivo se usaron para inocular 1 mL de medios SC en raicroplacas dé pozo profundo que contienen una perla de vidrio. Los pre-cultivos restantes fueron usados para preparar reservas de cultivo por la adición de glicerol hasta una concentración final de 15% y almacenados a -80°C.
Los cultivos de expresión se hicieron crecer durante 3 días a 30°C con agitación orbital y control de humedad. Las places fueron centrifugadas a 710 x g por 5 minutos hasta células granuladas y el sobrenadante se aspiró para ensayos de cribado. Una alícuota (0.05 mL) de sobrenadante de levadura fue incubada con 0.5% beta-glucano en una reacción amortiguada con citrato de 0.1 mL (50 mM; pH 5) . Los ensayos de actividad se efectuaron durante 3 horas en una placa PCR a 50°C: En cada placa PCR de 96 pocilios estaban contenidos ' 6 controles de TrCel6A-S413P precursor usados para comparación. Una curva estándar de glucosa fue colocada en la primera columna de la placa PCR en el intervalo a partir de 3 hasta 0.05 mg/mL. Después, de la incubación, 0.08 mL de reactivo DNS fueron agregados a todos los pozos y las places se colocaron a ebullición durante 10 min. Una alícuota (0.15 mi) fue transferida a una microplaca y se midió la absorbancia a 560 nm .
El reactivo DNS contiene
Componente g/L
Ácido 3, 5-Dinitrosalicílico (Acros) 20
Hidróxido de sodio (Fisher) 20
Fenol (Sigma) 4
Metabisulfato de sodio (Fisher) 1
[ La concentración de las glicosidasas TrCel6A precursoras o modificadas en filtrados de levadura se determinaron por ELISA. El estándar del componente purificado y el filtrado fueron diluidos 0.01-10 yg/mL (con base en la proteína total) en solución salina amortiguada de fosfato, pH 7.2 (PBS) y se incubó durante la noche a 4°C en placas de microtitulacion (Costar EIA #9018) . Estas placas se lavaron con PBS que contiene 0.1% de Tween-20 (PBS/Tween) y luego se incubaron en PBS que contiene albúmina de suero de bovino al 1% (PBS/BSA) durante 1 h a temperatura ambiente. Los pozos bloqueados de microtitulacion se lavaron PBS/Tween. Antisueros policlonales de conejo específicos para TrCel6A se diluyeron (1:16,000) en PBS/BSA, agregados a places de microtitulacion por separado e incubadas durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron e incubaron con un anticuerpo de anti-conejo de cabra acoplado con peroxidasa de raíz de rábano (Sigma #A6154), diluida 1/2000 en PBS/BSA, por 1 hr a temperatura ambiente. Después del lavado, se agregó tetrametílbenzidina a cada placa y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. La absorbancia a 360 nm fue medida en cada pozo y se convirtió en la concentración de proteínas al usar la curva estándar TrCel6A.
La actividad de enzimas fue determinada al convertir los valores de ?=6? a los equivalentes reductores al usar la curva estándar de glucosa. Una actividad específica fue calculada para todas las glicosidasas TrCel6A precursoras y modificadas al dividir la actividad de las enzimas por la concentración de enzimas determinada por ELISA. La actividad especifica para cada glicosidasa modificada TrCel6A fue comparada con el promedio de 6 controles precursores de glicosidasa TrCel6A sobre una microplaca en particular y los positivos fueron seleccionados en el nivel de confianza de 95% al usar una prueba t. Todas las variantes positivas fueron producidas de nuevo en microcultivo y vueltas, a cribar para reducir el número de positivos falsos.
c. Formación de secuencias de genes que codifican glicosidasas modificadas
El ADN plásmido que comprende genes que codifican 6 glicosidasas modificadas TrCel6A con especificidad de sustrato alterada fue aislado á partir de cultivos de levadura que se hicieron crecer a partir de las reservas de glicerol preparadas en el Ejemplo 4b. Los genes de glicosidasa TrCel6A modificados se sometieron a formación de secuencias de ADN para identificar mutaciones que confieren especificidad de sustrato alterada.
Ejemplo 5: Elaboración de Bibliotecas de Mutagénesis de Saturación en el Sitio (SSM)
Se llevó a cabo la mutagénesis de saturación del sitio del residuo 367 por PCR. de megacebador (reacción de dos etapas de PCR) al usar el cebador mutagénico 3' W367X (SEQ ID
NO: 51), el vector YEp352/PGK91-lAI\fteI-alfass-TrCel6A-S413P como plantilla, y la polimerasa de ADN Platinum® Taq de Alta Fidelidad ( Invitrogen) . La PCR de primera etapa se hizo al usar el cebador mutagénico 3' W367X y el cebador externo complementario (YalfaN21 o 3 ' PGK-terminal , SEQ ID NOS: 52 y
53, respectivamente). El amplicón purificado sirvió como un megacebador para la PCR de segunda etapa y los otros cebadores externos complementarios se usaron para amplificar el gen mutado complete. El vector YEp352/PGK91-lñW el-alfass-TrCel6A-S413P fue digerido con Nhel y Kpnl y fue aislado el fragmento vacio del vector. Este fragmento lineal y el amplicón final fueron transformados simultáneamente y clonados por recombinación in vivo dentro de la cepa de levadura BY4742 (Butler et al. 2003) .
3 W367X: 5 ' CAG CAA CAG TGG GGA GAC NNS TGC AAT GTG ATC GGC ACC (SEQ ID NO: 51)
YalfaN21: 5'AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG (SEQ ID NO: 52)
3 ' PGK-terminal : 5 ' GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC (SEQ ID
NO: 53)
Los aminoácidos N182, E399, C400 y A427 . de TrCel6A fueron sustituidos por separado para todos los aminoácidos (por medio de SSM) por PCR de dos etapas (Tabla 3) al usar los siguientes cebadores:
YalfaN21-2 5 ' GCC AGC ATT GCT GCT AAA G (SEQ ID NO: 60)
3'PGK-term 5 ' GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC (SEQ ID NO: 53)
N182X-F 5'CC CTT GCC TCG NNS GGC GAA TAC TC (SEQ ID NO: 66)
N182X-R 5'CGA GGC AAG GGC AGC GCA ATC G (SEQ ID NO: 65)
E399X-F 5'G CCA GGC GGC NNS TGT GAC GGC ACC (SEQ ID NO: 68)
E399X-R 5'GCC GCC TGG CTT GAC CCA GAC AAA CG (SEQ ID NO: 67)
C400X-F 5 'CA GGC GGC GAG NNS GAC GGC ACC AG (SEQ ID NO: 70)
C400X-R 5 'CTC GCC GCC TGG CTT GAC CCA GAC (SEQ ID NO: 69) A427X-F 5'CCG GCG CCT CAA NNS GGT .GCT TGG TTC C (SEQ ID NO:72) A427X-R 5'GAG GCG CCG GTT GCA AGG CAT CTG GG (SEQ ID N0:71
Tabla 3: PCR de dos etapas efectuada para generar mutagénesis saturada en el sitio para todas las cuatro posiciones.
PCR 1 y 2, Etapa 1 PCR Etapa 2
Posición Cebador 1 Cebador 2 Tamaño (pb) Cebador 1 Cebador 2 Tamaño (pb)
N182X-1 , Y N21 Wl N182X-R 588
YccN21?2 3 'PGK-Term 1473
N182X-2 N182X-F 3 PGK-Term 896
E399X-1 ?a?21 Wl E399X-R 1239
YaN21?2 3 'PGK-Term 1473
E399X-2 E399X-F 3'PGK-Term 244
C400X- 1 Y N21 W2 C400X-R 1242
YaN21 #2 3'PGK-Term 1473
C400X-2 C400X-F 3 PGK-Term 242
A427X- I YaN21 Wl A427X-R 1321
YaN21 #2 3 'PGK-Term 1473
A427X-2 A427X-F 3'PGK-Term 162
Para efectuar una reparación de espacios el vector Yep/PGK-alfasS3-6H-NKE fue digerido con Nhel y Kpnl y purificado sobre gel. La cepa de Saccharomyces cerevisiae kre2A (MATa his3 ?1 leu2 ?0 lys2A0 ura3A0 Akre2) fue usada como el hospedero. El vector digerido YEp/PGK-alfass-6H-NKE y los amplicones de la etapa 2 de PCR fueron transformados en la cepa de levadura kre2 ? al usar el procedimiento descrito por Gietz, R. D. and Woods, R. A. (2002) .
Ejemplo 6: Ensayos líquidos de glicosidasas modificadas para detectar preferencia alterada de sustancias
Las variantes de TrCel6A-S413P a partir de sobrenadante de levadura se probaron en ensayos de líquidos al usar tres
sustratos diferentes: cebada-p-glucano (Viscosidad Media; Megazyme) , liquenano y celulosa, hinchada con ácido (ASC, producida a partir de ¦ Sigmacell50 al usar los métodos descritos por Tansey, M. R. 1971) .
La actividad de cada enzima fue determinada al medir la liberación de los azúcares reductores a partir de los sustratos de cebada-p-glucano soluble o de liquenano. Específicamente, en una placa PCR de 300 i , 50 pL de sobrenadante de levadura (serie de dilución) fue mezclado con 50 yL de cebada-p-glucano o liquenano pre-calentado 1% (p/v) en 100 mM de citrato de sodio pH 5.0. Las mezclas fueron incubadas por hasta 2 h a 50°C. Después . de la incubación, 80 yL de reactivo DNS se agregaron a cada pocilio y la placa se puso a ebullición durante 10 minutos.
El reactivo DNS contiene:
Componente g/L
ácido 3 , 5-dinitosalicílico (Acros) 10
Hidróxido de sodio (Fisher) 10
Fenol (Sigma) 2
Metabisulfato de sodio (Fisher) 0.5
Una vez que la temperatura disminuyó debajo de 40°C, 150 yL de cada mezcla de reacción fueron transferidos a pocilios individuales de una microplaca de 96 pocilios y se midió la OD56o al usar un lector de microplacas Fluostar Galaxy. El valor blanco se midió al tratar el sobrenadante a partir de la cepa que lleva el vector vacio de la misma manera y fue restado a partir de cada valor. Los datos se ajustaron con la Ecuación A por el método de mínimos cuadrados al usar la solución en Excel y al variar los parámetros a y b para cada enzima .
Ecuación A: y = (a ' E) / (b + E) donde E representa concentración de enzimas.
Para determinar la relación inicial de cada enzima, la pendiente de la Ecuación A fue determinada cuando la concentración de enzimas se acercaba a cero. Esto se hizo al sustituir E = 0 dentro de la primera derivada de la Ecuación A. Las relaciones iniciales para cada variante se normalizaron al TrCel6A de tipo (Figura 4).
La actividad de cada enzima sobre ASC fue probada en un ensayo de hidrólisis de celulosa de 0.25 mL. Las variantes TrCel6A a partir de sobrenadante de levadura como se describe en el Ejemplo 4 se diluyeron en solución amortiguadora de citrato 50 mM (pH 5.0), complementada con Cel7B y Cel5A de Trichoderma reesei (10 mg proteína/g celulosa) y beta-glucosidasa de A. niger (125 IU/g celulosa) e incubada con 0.067% ASC. La incubación fue a 50°C por 19 hr. Las microplacas se centrifugaron durante 3 min a 2800 x g y una alícuota de sobrenadante fue muestreada para glucosa. La actividad de enzimas fue medida por medio de la detección de glucosa al usar un ensayo de reacción acoplado con oxidasa/peroxidasa estándar de glucosa (Trinder, 1969) . Los datos se ajustaron con la . Ecuación A por el método de mínimos cuadrados al usar la solución en Excel y al variar los parámetros a y b para cada enzima.
Ecuación A: y = (a " E) / (b + E) donde E representa concentración de enzimas.
Para determinar la tasa inicial de cada enzima, la pendiente de la Ecuación A fue determinada cuando la concentración de enzimas se aproximaba a cero. Esto se hizo al sustituir E = 0 dentro de la primera derivada de la Ecuación A. Las tasas iniciales para cada variante fueron normalizadas a Tr.Cel6A de tipo silvestre (Figura 4).
Las Figuras 4 y 5 muestran la actividad relativa de glicosidasas precursoras modificadas de la Familia 6 sobre celulosa y dos sustratos de beta-glucano : beta-glucano de cebada, con una relación de 3:1 (beta l-3:beta 1-4) y liquenano, con una relación de 2:1 (beta l-3:beta 1-4). Todas las variantes muestran al menos un incremento de 1.2 veces en actividad contra uno o ambos de los sustratos de beta-glucano. Algunas variantes también muestran una disminución de más de 1.2 veces en actividad contra la celulosa hinchada con ácido.
Ejemplo 7: Expresión de PcCel6A, HiAvi2 y sus variantes en cultivos en matraces
Los transformantes de Saccharomyces cerevisiae se hicieron crecer sobre · placas que contienen medio completo sintético (SC: 2% agar p/v, 0.17% base de nitrógeno de levadura p/v, 0.192% complemento de vaciado Ura p/v, 2% glucosa p/v, 2% casaminoácidos p/v, 0.5% sulfato de amonio p/v, pH 5.5) por 3 días a 30°C.
Una colonia sencilla de estas vetas fue usada para inocular 150 iL de medio complete sintético en una microplaca de 96 pocilios que contiene una perla de vidrio estéril pequeña. Los pre-cultivos se hicieron crecer durante la noche (16-18 hr) a 30°C y 300 rpm hasta fase estacionaria. Para la inoculación de cultivos de expresión, 25 L de pre-cultivos se usaron para inocular 50 mL de medios SC. Los cultivos de expresión se hicieron crecer por^ 3 días a 30°C y 250 rpm con control de humedad. Los cultivos fueron centrifugados a 3000 rpm durante 5 min y la solución amortiguadora del sobrenadante fue cambiada . a solución amortiguadora de citrato 50 mM pH 5.0 al usar a un dispositivo Sartorius de filtración con una membrana de corte de 5000 kDa. Todas las centrifugaciones para el intercambio de solución amortiguadora se hicieron a 4000 rpm a temperatura ambiente. Las enzimas se lavaron dos veces con 20 mL de solución amortiguadora de citrato 50 mM pH 5.0, y se concentraron en un volumen final de 3 mL (concentración aproximada de 15 veces) de solución amortiguadora de citrato 50 mM pH 5.0, y almacenadas a -20°C.
La actividad de cada glicosidasa precursora y modificada PcCel6A y HiAvi2 glicosidasa se midió al usar beta-glucano de cebada, liquenano y celulosa hinchada con ácido como se describe en el Ejemplo 6 excepto que los ensayos de actividad de HiAvi2 se efectuaron a pH 6.5.
Ejemplo 8: Expresión de glicosidasa modificada TrCel6A en Trlchoderma reesei
a. Cepas de Trichoderma reesei
Una cepa auxotrófica pyr4 de T. reesei (cepa BTR213) fue usada como cepa hospedera para la expresión de TrCel6A-W367G-S413. BTR213 es un derivado de RutC30 (ATCC #56765; Montenecourt and Eveleigh, 1979) producido por mutagénesis aleatoria y seleccionado primero por su capacidad para producir zonas de depuración más grandes sobre agar de medios mínimos que contienen 1% de celulosa hinchada con ácido y 4 g IT1 de 2-desoxiglucosa y luego seleccionados por su capacidad para crecer en medios de lactosa que contienen 0.2 yg/ml de carbendazim. El auxótropo de pyr4 de la cepa BTR213 fue aislado por su capacidad para crecer sobre 5-FOA (ácido 5-fluororótico) y su incapacidad para crecer prototróficamente en la ausencia de uridina .
b. Construcción de vectores de transformación
Dos vectores intermedios, pCel6Apst-hph-TV y pCel6ApXt-hph-TV, que contienen ya sea las versiones del gen genómico Cel6A o Cel6A cDNA, respectivamente, fueron construidos.
Para la generación de pCel 6Apst-hph-TV, el promotor Cel6A, señal de secreción, secuencia de codificación, y terminador fueron aislados a partir de pZUK636 (patente de E.U.A. No. 6,015,703) como un fragmento de 5.1 kb de fragmento Sphl/BG1II e insertado dentro de los mismos sitios de pUC-NSNB, un derivado del vector estándar de clonación pUC119 que contiene un adaptador que comprende sitios de restricción Nhel-Sphl- otl-BGHI, para hacer pCel6A-Not. Con objeto de incrementar el tamaño del fragmento de flanqueo 3', un fragmento de 1.7 kb que contiene parte del terminador Cel6A (cadena abajo del sitio BGIII) y la secuencia de flanqueo 3', fue amplificado a partir de ADN genómico BTR213 al usar los cebadores KW008 y KW052 (Tabla 5) y se clonaron dentro de pGEM T-easy (Promega). KW008 se combina en sus pares de bases al sitio interno BG1II localizado 1 kb cadena abajo del codón de detención mientras W052 introduce un sitio Smal de 2.7 kb cadena abajo del codón de detención. El fragmento de flanqueo Cel6A en 3 ' se amplificó como un fragmento de 1.7 kb al usar ADN genómico BTR213 como una plantilla, digerido con enzimas de restricción BG1II y Smal y clonado en los mismos sitios de pCel6A-Not para hacer pCel 6Apst-Not . pCel6Apst-Not fue linealizado con SacII y extremos con puntas romas con. polimerasa T4. El cásete marcador de selección hph fue aislado como un fragmento de 3.1 kb de XhoI/EcoRV a. partir de pHPT136, con extremos en puntas romas, y se clonó en el sitio con extremos romos SacII para hacer pCel 6Apst-hph-TV .
Para la generación del vector pCel6ApXt-hph-TV el promotor Cel6A fue amplificado a partir de pZUK636 al usar los cebadores W053 y KW054 (Tabla 4) y clonados dentro de pGEM T-easy (Promega) .. KW053 abarca el sitio .Sphl de 2.5 kb cadena arriba a partir del codón de inicio mientras KW054 introduce un sitio Ncol en el codón de inicio. La señal de secreción xyr¡2 fue amplificada a partir del ADN genómico BTR213 al usar los cebadores KW055 y KW056 con sitios introducidos Ncol y Nhel, respectivamente, y se clonaron en pGEM T-easy. Un fragmento de genes cel6A que codifica la glicosidasa madura TrCel6A-S413P precursora y el terminador cel6A se aislaron a partir de pc/xC2-S 13P-TV previamente construido (publicación E.U.A. No.
5 2008/0076152A1) como un fragmento Nhel/Sphl. Una ligación de tres factores con el promotor Cel6A {Sphl/Ncol) , la secuencia de codificación de la señal de secreción xyn2 (Ncol/W el) y el fragmento del vector pc/xC2-S413P-TV {Sphl/Nhel) se usó para hacer pCel6ApX-S413P. El fragmento de 5 kb de Sphl/BGIII que
Q contiene el gen que codifica TrCel6A-S413P fue aislado a partir de pCel6ApX-S413P y se clonó dentro de los mismos sitios de pUC-NSNB para hacer pCel6ApX-S413P-Not . El tamaño del fragmento de flanqueo 3' fue incrementado como se describe anteriormente (construcción del vector pCel6Apst-hph-TV) al generar el vector
5 pCel6AptX-S413P. El vector pCel6AptX-S 13P se linealizó con SacII (localizado en el terminador Cel6A) y terminó en extremos romos con polimerasa T . El cásete marcador de selección hph fue aislado como un fragmento de 3.1 kb de XhoI/EcoRV a partir de pHPT136, con extremos romos, y se clonó dentro del sitio g SacII con extremos romos para hacer pCel6ApXt-hph-TV. El marcador de selección de 2.2. kb pyr4 fue aislado como un fragmento Kpnl a partir de pNcBGl (patente de E.U.A. No. 6,939,704), con extremos romos y clonado dentro del sitio con extremos romos SacII para hacer pCel6ApXt-S413P-pyr4-TV (Figura 6A) .
Tabla 4: Cebadores usados para amplificación por PCR durante la construcción de vectores de transformación de Trichoderma
Cebador Sitio/Dirección de Secuencia §£Q |Q J^Q.
Hibridación
KW008 terminador celóa /delantero CG AG ATCTTCG AGGGCGTA AC
W052 flanco celóa 3' /reverso GCTC ACCCGGG AAG ACCAC ATGGC
flanco celóa 5' /delantero
W053 CCGTATAGTATCGCATGCAATTGC
KW054 señal de secreción celóa GCCGACAACCATGGTGCAATACACAG
/reverso AGGGTGA
W055 señal de secreción CATCACCATGGTCTCCTTCACCTCCCT
v«2/delantero CCTCGC
KW056 señal de secreción xyn CTTGAGCAGCTAGCCTGGCGCTTCTCC
2/reverso ACAGCC
El vector final para la transformación de T. reesei fue generado a partir de dos vectores de direccionamiento Cel6A previamente construidos - pCel6Apst-hph-TV y pCel6ApXt-hph-TV. Ambos vectores fueron digeridos con enzimas de restricción BGIII and Salí. El fragmento a partir del vector pCel6AXt-hph-TV que contiene la secuencia de codificación Cel6A, terminador y el cásete hph y el fragmento a partir del vector pCel6Apst-hph-TV que contiene los flancos Cel6A y el gen AmpR fueron purificados a partir de gel de agarosa y se ligaron en el vector pCel6A413pst-hph-BB (Figura 6B) .
La mutación de W367G dentro del gen Cel6A fue introducida por una ligación de PCR de 3 etapas como se describe a continuación. Dos pares de cebadores (Tabla 5) se usaron para amplificar la secuencia de codificación parcial de Cel6A y la secuencia de codificación en el C-terminal de Cel6A con el terminador. parcial de Cel6A. Ambos productos PCR tienen extremos cortos que se traslapan y se usaron en la segunda etapa, reacción OCR de diez ciclos como plantillas y cebadores para combinar los pares de bases uno encima de otro y llenar las hebras faltantes en cada extremo. Posteriormente, dos cebadores externos, Cel6A-BEII-Fl y Cel6A-Apa-R2, se agregaron y el fragmento entero se amplificó en una reacción por PCR de 35 ciclos estándar. El producto amplificado por PCR se digirió con enzimas BstEII and Apaly se ligaron en los sitios correspondientes del vector pCel6A4Í3pst-hph-BB vector que genera el vector pCel6A 13/367pst-hph-BB.
Tabla 5: Cebadores usados para introducción de la mutación W367G dentro del vector de transformación de Trichoderma .
Cebador Sitio/Dirección de Secuencia SEQ ID NO:
Hibridación
Cel6A-BEII- extremo celóa 5 ' en el CCTOOTGACCAACCTCGGTAC 7y
F 1 sitio BstEIl /delantero
Cel6A-367- extremo celóa 3' en la GTGGGGAGACGGGTGCAATGTG 80
posición de aminoácidos
367 /reverso
Cel6A-367- extremo celóa 3 ' en la CACATTGCACCCGTCTCCCCAC 81
posición de aminoácidos
367/ delantero
Cel6A-Apa- terminador celóa en el CCTCTGGGCCCCCAGATAAG 82
sitio ^pal/reverso
c. Generación de cepas de Trichoderma reesei que expresan glicosidasas TrCel6A modificadas por reemplazo directo de gen Cel6A de tipo natural
Para facilitar el cribado de transformantes de T. reesei que se dirigen al lugar Cel6A que resulta en el reemplazo del gen Cel6A de tipo silvestre con gen que codifica la proteina modificada Cel6A se generó cepa hospedera con lugar Cel6A etiquetado.
El vector pCel 6ApXt-S413P-pyr4 -TV fue transformado en la cepa BTR213aux28 de T. reesei al usar un método de transformación de protoplastos mediado por PEG. Alrededor de 5 x 106 esporas de BTR213aux28 se colocaron en placas encima de celofán estéril colocado en agar de dextrosa de papa (PDA)
(Difco) complementado con 5 mM de uridina e incubado durante 20 h a 30°C. Discos de celofán con micelas se transfirieron a 10 mL de una solución de preparación de protoplastos que contiene 7.5 g/L de Driselasa y 4 g/L beta-glucanasa
(InterSpex Products Inc., Cat. #0465-1 y 0439-2, respectivamente) en solución amortiguadora de fosfato de potasio 50 mM, pH 6.5 que contiene 0.6 M de sulfato de amonio
(Solución amortiguadora P) . Las micelas se digirieron durante 5 h a 28°C con agitación suave a 60 rpm. Los protoplastos fueron recolectados por centrifugación a 1000-1500 x g durante 10 min a temperatura ambiente y se lavaron con 5 mL de solución amortiguadora P. El granulado se volvió a suspender en 1 mL de solución amortiguadora STC (1.2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCL, pH 7.5) , separado a partir de micelas no digeridas por filtración a través de MIRACLOTH™ estéril No. 60 y recolectadas dentro de un tubo microcentrífugo estéril. Para la transformación, 0.1 mL de suspensión de protoplastos (aproximadamente 5 x 106 protoplastos ) fué ¦ combinada con 10 pg de ADN de vector, linealizada con enzima de restricción BG1II, y 25 µ? de solución de PEG (25% PEG 4000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5) . Los protoplastos con ADN se incubaron sobre hielo durante 30 min luego 1 mL de solución PEG fue agregada y la mezcla se incubó durante 5 min a. temperatura ambiente. La mezcla de transformación se diluyó con 2 mL de 1.2 M sorbitol en solución de PEG y 4 alícuotas de 0.75 mL de la mezcla se agregaron dentro de 25 mL de medio agar fundido de MMSS (ver a continuación) enfriado hasta alrededor de 47-50°C y las suspensiones de protoplastos se vaciaron encima de agar MM (ver a continuación) . Las placas se incubaron a 30°C hasta que fue visible el crecimiento de la colonia. Los transformantes se transfirieron a placas individuales que contienen agar MM y se dejar que formaran esporas. Las esporas se recolectaron y formaron- en placas a alta dilución sobre agar MM para aislar los transformantes de homocarion, los cuales luego se pusieron en placas sobre PDA e incubaron a 30°C para esporulación y análisis genético posterior.
Agar de medio mínimo (MM*) contiene:
Componente Cantidad por 1L de
KH2P04 10 g
( H4 ) 2SO4 6 g
Na3Citrato-2H20 3 g
FeS04-7H20 5 mg
MnS04-H20 1.6 mg
ZnSO¾-7H20 1.4 mg
CaCl2-2H20 2 mg
Agar 20 g
20% Glucosa f s . 50 mL
1 M MgS04-7H20 f.s. 4 mL
pH hasta 5.5
*E1 agar MMSS contiene los mismos componentes como el agar MM más 1.2 M sorbitol, 4 mM MgS04, 1 g/L YNB (Base Nitrógeno de Levadura c/o Aminoácidos a partir de DIFCO Cat. No.291940) y 0.12 g/L aminoácidos (Complemento de vaciado Ura de CLONTECH
Cat . No.8601-1) .
Tres transformantes estables de T. reesei fueron aislados y el sitio de integración del cásete de direccionamiento Cel6A fue caracterizado por análisis de hibridación Southern. Para la extracción genómica del ADN, transformantes mitóticamente estables, P577A, P577B y P577C,
y las cepas precursoras, BTR213 y BTR213aux28, fueron
esporuladas en PDA. Las esporas fueron inoculadas en 100 mL de medios mínimos ( M) e incubadas a 30°C y 150 rpm durante 5 días. La biomasa fue. filtrada al usar un filtro GF/A, transferida a laminado de aluminio y congelada de inmediato a -80°C por 24 hrs. La biomasa congelada fue molida hasta un polvo fino al usar nitrógeno líquido y se volvió a suspender en 3 mL de solución amortiguadora de extracción (100 mM Tris pH 8.0, 50 mM EDTA pH 7.5, 1% SDS). El homogenizado se transfirió a un tubo falcon estéril de 15 mL y se granuló por centrifugación a 4000 rpm por 5 min. El sobrenadante fue transferido a un tubo falcon estéril de 15 mL, volumen igual de fenol saturado amortiguado con TE (pH 6.6) fue agregado y formó vórtices por 1 min. La fase acuosa que contiene ADN fue separada por centrifugación durante 5 min a 4000 rpm y se transfirió a un tubo falcon fresco de 15 mL. El ADN genómico fue purificado además al añadir un volumen igual de fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (25:24:1), al mezclar y separar la fase acuosa por centrifugación durante 5 min a 4000 rpm. Esta etapa de purificación se repitió hasta que no estaba visible ninguna interfaz. El fenol fue retirado al extraer con un volumen igual de cloroformo, mezclar y separar la fase acuosa por centrifugación. El ADN genómico se precipitó durante la noche a -20°C al usar 0.1 X volumen de 3M NaOAc , pH 5.2 y un volumen 2.5X de 100% EtOH, luego granulado por centrifugación a 4000 rpm por 10-15 min. El granulado se lavó una vez con 1 volumen de 70% EtOH y una vez con 95% EtOH. Después de que el granulado se secó al aire, el ADN se volvió a suspender en 1 mL de solución amortiguadora TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM; pH 8). Para retirar el ARN, 5 L de RNasa A (10 mg/mL) se agregaron e incubaron a 37°C por 1 hora. La RNasa luego se extrajo con 1 volumen de fenol saturado (pH 6.6) seguido por 1 volumen de fenol : cloroformo : alcohol isoamilico (25:24:1) y 1 volumen de cloroformo. El ADN se precipitó a partir de fase acuosa separada con 0.1 volumen de NaOAc 3M pH 5.2 y 2.5 volumen de 100% EtOH, incubado a -20°C por 30 min, granulado por centrifugación a 12000 rpm por 15 min y lavado una vez con 1 volumen de 70% EtOH y una vez con 95% EtOH. Finalmente, el ADN volvió a suspenderse en 0.2 mL de solución amortiguadora TE y se usó para hibridación Southern como se describe a continuación.
La técnica Southern blot al usar etiquetado DIG y sistema de detección fue efectuada como se describe en el manual de Roche Applied Science. El patrón de restricción en el lugar Cel6A de tipo natural esperado después de la digestión del ADN genómico de BTR213 y BTR213aux28 fue predicho al usar la secuencia Cel6A de la base de datos JGI URL: genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2/home.html) y se esperó que fuera detectable como banda de 4.2 kb que hibridiza específicamente con la sonda Cel6A (Fig. 7) . En el caso de la integración del vector ectópico que resulte en la presencia de dos copias del gen CelGA en el genoma, se observarían dos bandas específicas. El direccionamiento de los vectores Cel6A dentro del lugar Cel6A en los transformantes P577A, P577B, y P577C resultaría en un fragmento de 6.4 kb, como se observa después de la digestión- de EcoRl del vector de transformación (Figura 7) debida a la presencia del cásete de selección pyr4. Como se demuestra en la Figura 7, la técnica Southern blot confirma la integración de los casetes del marcador Cel6A dentro del lugar nativo Cel6A y el reemplazo de la secuencia de codificación nativa Cel6A con la secuencia de codificación a partir del vector de transformación.
d. Generación de transformantes de Trichoderma reesei que expresan Tr Cel6A-W367G-S413P
El vector pCel6A413/367pst-hph-BB fue transformado en una nueva cepa hospedera de T. reesei generada, P577C, al usar transformación de protoplastos mediada por PEG como se describe anteriormente (Ejemplo 8c) . La selección de transformantes fue efectuada al usar resistencia a la higromicina como un marcador de selección. Alícuotas (0.75 mL) de protoplastos transformados se agregaron dentro de 25 mL de medios PDA enfriados hasta alrededor de 47-50°C y las suspensiones de protoplastos se vaciaron dentro de cajas de Petri de 200 mm. Después de que se solidificaron los medios PDA que contienen los protoplastos transformados, otros 25 mL de medios PDA complementados con 80U/mL de higromicina B se agregó al agar superior. Las placas se incubaron a 30°C hasta que fue visible el crecimiento de la colonia. Los transformantes se transfirieron dos veces a placas individuales que contienen medios PDA complementados con 40 U/mL de higromicina B (PDAH) y se dejaron formar esporas. Las esporas se recolectaron y formaron en placas a alta dilución en PDAH para aislar los transformantes de homocairon, los cuales luego se pusieron en placas sobre PDA y se incubaron a 30°C para esporulacion y análisis posterior.
Los transformantes que . poseen integración de vector dirigida dentro del lugar Cel6A se identificaron por su capacidad para crecer en la presencia de higromicina y la incapacidad para crecer en medios mínimos que carecen de complemento de uridina. Esto indicó que el cásete marcador de selección de pyr4 presente en la cepa hospedera P577C se reemplazó con la expresión modificada de Cel6A y los casetes marcadores de selección hph.
Ejemplo 9: Producción de glicosidasa modificada a partir de Trichoderma. reesei
a. Producción de TrCei6A-W367G-S413P en microcultivos de T.
Para confirmar la expresión de la proteina TrCel6A-
W367G-S413P, todas las cepas que poseen el reemplazo dirigido del gen Cel6A de tipo silvestre con el gen de codificación
TrCel6A-W367G-S 13P se hicieron crecer en microcultivos para
análisis de la proteina Cel6A.
Los transformantes de T. reesei y la cepa precursora de BTR213aux28 fueron cultivados en placas PDA complementadas
con 5mM de uridina durante 6-7 días a 30°C. Las suspensiones de esporas se prepararon al lavar las esporas de la placa de
agar con agua estéril. La composición de medios de microcultivo que contienen glucosa con carbohidratos que
inducen celulasa. como una fuente de carbono se indica a continuación.
Medios de microcultivo de Trichoderma
Componente Concentración g/L
Glucosa con carbohidratos
que inducen celulasa8 35
Sulfato de amonio¦ 12.7
KH2P04 8.0
MgSO„-7H20 4.0
CaCl2-2H20 1.0
FeS04-7H20 0.1
MnS04-7H20 0.032
ZnS047H20 0.028
CaC03 20
Licor fermentado de maíz (polvo) 5
pH4.24
aUn cóctel inductor de celulasa que comprende, como una función de carbohidratos' totales, 56% gentiobiosa, 14% soforosa, 6% cellobiosa, 10% trehalosa, 6% maltotriosa, 4% glucosa y 14% otros carbohidratos
Alrededor de 5000 esporas de T. reesei fueron inoculadas en cada pocilio de una placa de cultivo de 24 pocilios (COSTAR) que contiene 1 mL de medios. Las placas se incubaron durante 5-7 días a 30°C con agitación a 250 rpm.
La concentración relativa del TrCel6A- 367G-S413P producido por transformantes fue determinada por ELISA (Ejemplo 4). La concentración relativa de proteina TrCel6A-W367G-S413P fue calculada al dividir la concentración de TrCel6A-W367G-S413P por la cantidad total de proteina producida, como se determina al usar un ensayo de proteínas Bradford. Los niveles de expresión de Cel6A se presentan en la Figura 8.
b. Análisis de transformantes de T. reesei en fermentaciones piloto de 14L
Dos transformantes de T. reesei con los niveles de expresión más elevados de Cel6A, cepas P989B y P989B, fueron seleccionados para una fermentación piloto intermitente con alimentación de 14L y análisis de enzimas. Las esporas de Trichoderma fueron inoculadas en cajas Petri estándar de 85 mm que contienen agar de dextrosa de papa (PDA) . Estas placas se incubaron a 28°C por 3-5 días hasta alcanzar un
crecimiento confluente de esporas verdes frescas. Para preparar el inoculo para fermentación, se transfirieron
esporas a partir de una placa sencilla de PDA a matraces con división Erlenmeyer de 2 L, que contienen 750 mL de medios
líquidos Berkley (pH 5.5) complementados con 10 mM de uridina. Los matraces se incubaron a 28°C por 3 días al usar
un agitador orbital (Modelo G-52 New Brunswick Scientific Co.) que opera a 100 rpm.
Medios Berkley para Matraces .
Componente Concentración, g/L
(NH4)2S0 1.4
KH2P04 2.0
MgS04.7H20 0.31
CaCl2.2H20 0.53
Licor fermentado seco de maíz 5.1
Glucosa ' 10
^Solución con elementos en trazas que contiene 5 g/L de FeS04 . H20; 1.6 g/L MnS0 .H20; 1.4 g/L ZnSO .7H20.
Los contenidos del matraz de inoculo fueron transferidos
a un recipiente de fermentación de escala piloto de 14L (Modelo MF114 New Brunswick Scientific Co.) cargado con 10 L de medios iniciales para fermentación intermitente con
alimentación. (pH 5.5) complementada con 10 mM de uridina. El
recipiente se operó en un modo intermitente hasta que la
glucosa en los medios se agotó. En este punto, la fuente de carbono que contiene carbohidratos que inducen celulasa (56% gentiobiosa, 14% soforosa, 6% cellobiosa, 10% trehalosa, 6% maltotriosa, 4% glucosa y 14% otros carbohidratos) se agregó, en una base continua, a partir de una reserva que tenia 35.5% p/v de sólidos disueltos en agua.
Las bombas peristálticas se usaron para entregar la fuente de carbono a una velocidad de alimentación de 0.4 gramos de carbono por litro de cultivo por hora. Los parámetros operativos durante tanto las porciones intermitentes como intermitentes con alimentación de la corrida fueron: mezclado por agitación del impulsor a 500 rpm, burbujeo de aire a 8 litros estándar por minuto, y una temperatura de 28°C. El pH de cultivo se mantuvo a 4.0-4.5 durante el crecimiento del lote y el pH 3.5 durante la producción de celulasa al usar un controlador automatizado conectado a una sonda de pH en linea y una bomba que permite la adición de una solución de hidróxido de amonio al 10%. Periódicamente, muestra- de 100 mL de caldo se sacaron de la biomasa y análisis de proteínas. Después de 96 horas de tiempo de fermentación, se recolectó 1L de medios de fermentación y se filtró para análisis posterior de proteínas.
Medios Iniciales para Fermentaciones Intermitentes- con Alimentación
Componente Concentración, g/L
(NH4)2S04 2.20
KH7P04 1.39
MgS04 - 7H20 0.70
CaCl2.2H20 0.185
Licor seco fermentado de maíz 6.00
Glucosa 13.00
Elementos en trazas* 0.38 mL/L
*La solución con elementos en trazas contiene 5.g/L FeS047H20; 1.6 g/L MnS04 H20; 1.4 g/L ZnS04 TH20.
Ejemplo 10: Hidrólisis de beta-glucano por mezclas de enzimas de T. reesei que comprenden glicosidasas precursoras y
modificadas TrCel6A.
La prueba se llevó a cabo en una variedad de cebada Legacy a partir del norte de Saskatchewan . Sólidos 89.6%, 60% almidón, 10- 14% NSP (polisacáridos que no son de almidón) .
Se molieron muestras de granos para pasar un tamiz de malla 20 al usar un molino Wiley. Los carbohidratos totales fueron determinados mediante hidrólisis ácida y cromatografía de iones en un sistema DX-500 con columna PAl y detección amperométrica . Los carbohidratos totales menos el almidón total se usaron para determinar la cantidad de polisacáridos que no son de almidón en el sustrato con objeto de determinar
la dosis de enzima de partida. La determinación de sólidos se usó para corregir los pesos secos de muestra en¦ todos los experimentos . ' .
La reducción de viscosidad por las glicosidasas precursoras y modificadas de la Familia 6 fue determinada al usar un ensamble de envase y paleta Perten SuperRVA4, tiempo de retención fijo de 15 min, un tamaño de muestra de 30 mL a 35% de sólidos, solución amortiguadora de citrato 50 mM, pH 4.5, y una temperatura de 52°C. Una mezcla inicial secundaria a 900 rpm fue seguida por una recolección de datos a intervalos de 4 segundos a 160 rpm. Los datos se recolectaron en unidades en centipoises (cP)
Las muestras se trataron con soluciones diluidas de enzimas de 1 mL con base en el peso de proteina por tonelada métrica de sustrato. La reducción de viscosidad fue calculada como un cambio a partir del control sobre el ultimo minuto de recolección de datos. Los resultados se presentan en las Tablas 6 y 7.
Una reducción mucho mayor en la viscosidad del sustrato de beta-glucano de cebada se alcanza por los efectos de la glicosidasa modificada de la Familia 6 TrCel 6A-W367G-S 13P que por la glicosidasa de la Familia 6 TrCel6A de tipo silvestre, ambos cuando la glicosidasa de la Familia 6 está actuando sola (Tabla 6) o en combinación con otras celulasas hemicelulasas (Tabla 7).
Tabla 6: Reducción de la viscosidad de beta-glucano de cebada por glicosidasas modificadas y de tipo silvestre de la
Familia 6
Tabla 7: Reducción de viscosidad de beta-glucano de cebada por mezclas de celulasa-hemicelulasa que comprenden glicosidasas modificadas y de tipo silvestre de la Familia 6
Muestra Dosis de Dosis de Viscosidad
Ultimase XTP glicosidasa relativa a la (mg proteína/ (mg muestra sin muestra ) proteina/30 tratar
mi de ensayo)
Sin tratar 0 0 1.0
Ultimase XTP 0.069 0 0.175
Ultimase XTP* + 0.069 0.036 0.14
TrCel6A-W367G- 0.069 0.078 0.147
S413P
Ultimase. XTP* + 0.069 0.036 0.17
TrCel6A (tipo 0.069 0.078 0.17 silvestre )
1 Ultimase XTP es una celulosa entera comercial Trichoderma reesei con un componente termoestable enriquecí de. xilanasa II.
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Claims (15)
1. Una glicosidasa modificada de la Familia 6 caracterizada porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N182S, N182R, N182G, N182A, W367A, W367C, W367G, W367N, W367R, W367S, W367T, W367V, E399H, E399S, E399T, C400V, C400M, C400T, S400V, S400M, S400T, A427V, A427L y A427S, la posición de la una o más sustituciones de aminoácidos determinada a partir de la alineación de una secuencia de aminoácidos de glicosidasa precursora de la Familia 6 con una secuencia de aminoácidos de Trichoderma reesei Cel6A como se define en SEQ ID NO: 1, en donde los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de la glicosidasa modificada de la Familia 6 son a partir de alrededor de 54% hasta alrededor de 99.9% idénticos a los aminoácidos 83-447 de SEQ ID NO: 1.
2. Una glicosidasa modificada de la Familia 6 caracterizada porque comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en N182S, N182R, N182G, N182A, W367A, W367C, W367G, 367N, 367R, W367S, W367T, W367V, E399H, E399S, E399T, C400V, C400M, C400T, S400V, S400M, S400T, A427V, A427L y A427S, la posición de la una o más sustituciones de aminoácidos determinada de 5 la alineación de una secuencia de aminoácidos de glicosidasa precursora de la Familia 6 con una secuencia de aminoácidos de Trichoderma reesei Cel6A como se define en SEQ ID NO: 1, en donde los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de la glicosidasa modificada de la Familia 6 son a partir de -J_Q alrededor de 70% a alrededor de 99.9% idénticos a los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de cualesquiera de SEQ ID NO: 1 hasta. SEQ ID NO: 36.
3. La glicosidasa modificada de la Familia 6 de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque 15 la glicosidasa modificada de la Familia 6 exhibe al menos un incremento de 1.2 veces en la actividad de hidrólisis de los polisacáridos beta ligados en 1-3, 1-4 y al menos una disminución de 1.2 veces en la actividad de hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-4, en comparación con una 20 glicosidasa precursora de la Familia 6 a partir de la cual se deriva la glicosidasa modificada de la Familia 6.
4. La glicosidasa modificada de la Familia 6 de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la glicosidasa modificada de la Familia 6 exhibe al menos una disminución de 3 veces en la actividad de hidrólisis de polisacáridos beta ligados en 1-4, en comparación con la actividad de hidrólisis de una glicosidasa .precursora de la Familia 6 a partir de la cual se deriva la glicosidasa modificada de la Familia 6.
5. La glicosidasa modificada de la Familia 6 de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) son desde alrededor de 90% hasta alrededor de 99.9% idénticos a los aminoácidos 83-447 de SEQ ID NO: 1.
6. La glicosidasa modificada de la Familia 6 de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque los aminoácidos' 83-447 (numeración TrCel6A) son desde alrededor de 95% hasta alrededor de 99.9% idénticos a los aminoácidos 83-447 (numeración TrCel6A) de cualesquiera de SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 36.
7. Un constructo genético aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la glicosidasa modificada de la Familia 6 de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 6.
8. Un microbio aislado genéticamente modificado que comprende el' constructo genético de conformidad con la reivindicación 7..
9. El microbio aislado genéticamente modificado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el microbio es una especie de levadura u hongo filamentoso.
10. El microbio aislado genéticamente modificado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el microbio es Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei.
11. Un proceso para la producción de una glicosidasa modificada de la Familia 6 caracterizado porque comprende las etapas de hacer crecer el microbio genéticamente modificado de la reivindicación 8 en un medio de cultivo bajo condiciones que inducen la expresión y secreción de la glicosidasa modificada de la Familia 6 y recuperar la glicosidasa modificada de la Familia 6 del medio de cultivo.
12. Un proceso para hidrolizar un sustrato de polisacárido beta ligado a 1,3-1,4 caracterizado porque comprende poner en contacto el sustrato con la glicosidasa modificada de la Familia 6 de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
13. El proceso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el sustrato dé polisacárido beta ligado a 1,3-1,4 es un constituyente de un grano de cereal.
14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el proceso es parte de un proceso industrial para producir alcohol, forraje para animales o productos alimenticios.
15. Una glicosidasa modificada de la Familia 6 caracterizada porque consiste de una secuencia de aminoácidos como se establece en: TrCel6A-Nl82S-S413P (SEQ ID NO: 83); TrCel6A-N182R-D350E-S413P (SEQ ID NO: 84); TrCel6A-N182G-S413P (SEQ ID NO: 85); TrCel6A-N182A-S413P (SEQ ID NO: 86) : TrCel6A-W367A-S413P (SEQ ID NO: 37); TrCel6A-W367C-S413P (SEQ ID NO: 38); TrCel6A-W367G-S413P (SEQ ID NO: 39); TrCel6A-W367N-S413P (SEQ ID NO: 40); TrCel6A-W367R-S413P (SEQ ID NO: 41); TrCel6A-W367S-S413P (SEQ ID NO: 42); TrCel6A-W367T-S413P (SEQ ID NO: 43); TrCel6A-W367V-S413P (SEQ ID NO: 44); HiAvi2-W367G (SEQ D NO: 45)'; PcCel6A- 367G ( SEQ ID NO: 46); TrCel6A-S25G-T60S-E399H-S413P (SEQ ID NO: 87); TrCel6A-E399T-S413P (SEQ ID NO: 88); TrCel6A-E399S-S413P (SEQ ID NO: 89) TrCel6A-C400V-S413P (SEQ ID NO: 90) TrCel6A-C400M-S413P (SEQ ID NO: 91) TrCel6A-C400T-S413P (SEQ ID NO: 92) TrCel6A-C400S-S413P (SEQ ID NO: 93) TrCel6A-A427V-S 13P (SEQ ID NO: 94) TrCel6A-A427L-S413P (SEQ ID NO: 95) TrCel6A-A427S-S413P (SEQ ID NO: 96)
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