MX2010011018A

MX2010011018A - Metodos de extincion mejorados para la inactivacion de patogenos en globulos rojos.

Info

Publication number: MX2010011018A
Application number: MX2010011018A
Authority: MX
Inventors: Naheed Mufti; Anna Erickson; Anne North
Original assignee: Cerus Corp
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2010-11-12
Also published as: EP2285210A2; BRPI0911176B8; EA023596B1; JP2014231528A; US20150157665A1; CN102046006B; JP5916383B2; ZA201006936B; KR101896430B1; ES2636563T3; WO2009126786A2; JP2011516570A; AU2009233807B2; SG189745A1; IL208431A; US8900805B2; WO2009126786A3; EP3257375A1; CA2720824C; EP2285210B1

Abstract

La presente invención proporciona métodos mejorados para tratar composiciones de glóbulos rojos con un compuesto inactivador de patógeno bajo condiciones que proporcionan una inactivación de patógeno adecuada mientras se mantiene la vitalidad celular. También se proporcionan métodos para reducir la deshidratación de los glóbulos rojos, así como composiciones de glóbulos rojos tratadas.

Description

METODOS DE EXTINCION MEJORADOS PARA LA INACTIVACION DE PATOGENOS EN GLOBULOS ROJOS Campo de la Invención El campo de esta invención se refiere a métodos mejorados para extinguir compuestos electrófilos reactivos utilizados en el tratamiento de productos sanguíneos para inactivar posibles contaminantes patógenos. En particular, los compuestos nucleófilos, tales como tioles, se utilizan a una concentración elevada para extinguir los compuestos electrófilos reactivos en composiciones de glóbulos rojos, después se disminuyen en concentración para reducir la deshidratación de los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) .

Antecedentes de la Invención La transmisión de enfermedades a través de productos sanguíneos y otros materiales biológicos permanece como un serio problema de la salud. Mientras han ocurrido los avances significativos en la clasificación de donadores de sangre y ensayos de sangre, los virus tales como el virus de la hepatitis B (VHB) , hepatitis C (VHC) , y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) pueden escapar a la detección en productos sanguíneos durante las pruebas debido a los bajos niveles de virus o anticuerpos virales. Además del peligro viral, actualmente no existen pruebas reguladas Ref. 214282 adecuadas para clasificar la presencia de microbios no virales, tales como bacterias o protozoarios , en sangre prevista para uso en transfusiones. El riesgo también existe en que un patógeno hasta ahora desconocido puede hacerse prevalente en el suministro sanguíneo y presentar una amenaza de transmisión de enfermedades, como el hecho ocurrido antes del reconocimiento del riesgo de la transmisión de VIH a través de las transfusiones sanguíneas.

Los agentes químicos han sido introducidos en la sangre o en plasma sanguíneo para inactivar patógenos antes del uso clínico del producto sanguíneo. Típicamente, para productos sanguíneos tienen poco o nada de contenido de glóbulos rojos, tales como plaquetas y plasma, se utilizan compuestos fotoquímicamente activados tales como psoralenos. Para productos sanguíneos que contienen glóbulos rojos, los compuestos han sido desarrollados para la activación y la inactivación del patógeno, que no requiere la fotoactivación. Estos compuestos típicamente tienen grupos electrófilos que reaccionan con patógenos, más específicamente con ácido nucleico patógeno. Por ejemplo, la Patente de E. U. A. No. 5,055,485 describe la inactivación de virus en composiciones que contienen células y proteínas utilizando epóxidos de aril diol . Otros compuestos que general electrófilos in situ pueden utilizarse. LoGrippo et al., evalúa el uso de mostaza de nitrógeno, CH3-N (CH2CH2C1) 2 , para la inactivación viral.

LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusión, Bibliotheca Haematologica (Hollander, ed.), 1958, pp . 225-230. Más significativamente, las Patentes de E. U. A. Nos. 5,691,132; 6,177,441; 6,410,219; 6,143,490; y 6,093,725, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia, describen el uso de compuestos que tienen un componente que activa el ácido nucleico así como un componente electrófilo que reacciona con el ácido nucleico con el fin de inactivar el patógeno. Las Patentes de E . U. A. Nos. 6,093,725 y 6,514,987, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia, describen compuestos similares, en donde el componente que activa el ácido nucleico del compuesto está enlazado al componente electrófilo reactivo a través de un enlazador hidrolizable . Las Patentes de E. U. A. Nos. 6,136,586 y 6,617,157, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia, describen el uso de oligómeros de etileno diamina y compuestos relacionados para la activación de patógenos. Estos compuestos derivados de etileno diamina típicamente tienen un grupo aziridina, que proporciona el componente electrófilo reactivo, y un componente de poliaminas, que proporciona la activación del ácido nucleico del compuesto. La clase general de compuestos activados por ácido nucleico que tienen un grupo reactivo electrófilo o similar con el ácido nucleico se utilizan para inactivar patógenos en la sangre, productos sanguíneos, y una variedad de muestras de origen biológico.

Existe una preocupación en que, mientras estos compuestos se diseñan para específicamente activar ácidos nucleicos, pueden reaccionar con otros compuestos de la sangre, tales como proteínas o membranas celulares. Estas reacciones secundarias son desf vorables y pueden causar efectos adversos, tales como modificaciones de proteínas y membranas celulares que pueden reconocerse por el sistema inmunitario. Cuando se utilizan estos productos sanguíneos tratados repetidamente, pueden dar como resultado una respuesta inmunitaria del receptor para el producto sanguíneo tratado. Las Patentes de E. U. A. Nos. 6,270,952; 6,709,810; y 7,293,985, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia, describen métodos para extinguir tales compuestos inactivadores de patógeno con el fin de reducir el nivel de cualquier reacción secundaria adversa. La publicación de Patente de E. U. A. No. 2006/0115466, la descripción de la cual se- incorpora aquí por referencia, describe mejoras a estas condiciones de extinción que tratan una respuesta desarrollada contra el compuesto inactivador de patógenos. Sin embargo, a pesar de la mejora en la efectividad de la extinción, en algunos casos los glóbulos rojos tratados se ha encontrado que tienen una vida útil disminuida atribuida a una deshidratación celular aumentada según medida a través de la fragilidad osmótica disminuida y el hematocrito centrifugado disminuido.

De esta forma, existe la necesidad de métodos para reducir reacciones secundarias electrófilas indeseadas de compuestos inactivadores de patógeno mientras se conserva la habilidad del compuesto inactivador del patógeno para inactivar patógenos dañinos sin adversamente afectar la vitalidad y la vida útil del producto sanguíneo tratado. Específicamente, existe la necesidad de métodos mejorados para extinguir los compuestos inactivadores de patógeno en los glóbulos rojos.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una variedad de métodos para tratar composiciones de glóbulos rojos con un compuesto inactivador de patógenos y un extintor bajo condiciones que proporcionan la inactivación del patógeno adecuada y la reducción de reacciones secundarias indeseadas (tal como la modificación de los glóbulos rojos) , mientras se reducen o minimizan los efectos adversos tales como deshidratación incrementada de las células. En algunas modalidades, el extintor es glutationa que se neutraliza con una cantidad apropiada de base. En algunas modalidades, el método involucra reducir la concentración de glutationa después de la inactivación del patógeno.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una composición de glóbulos rojos que comprende: a) proporcionar i) una cantidad efectiva de un compuesto inactivador de patógeno para inactivar un patógeno, si está presente, en donde el compuesto inactivador del patógeno comprende un grupo funcional que es, o que forma, un grupo electrófilo reactivo, ii) una cantidad efectiva de un extintor que comprende un grupo tiol, en donde el tiol es capaz de reaccionar con el grupo electrófilo reactivo del compuesto inactivador del patógeno, y iii) una composición que comprende glóbulos rojos; b) mezclar el compuesto inactivador del patógeno y el extintor con la composición que comprende glóbulos rojos; y c) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla, con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor. En algunas de estas modalidades, la disminución de la concentración del extintor comprende la eliminación de la solución utilizada durante la inactivación y la adición de una solución aditiva final (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente, tal como SAG-M, AS-5 o cualquier solución de las Tablas 2, 3, o 4) .

En algunas modalidades, el paso (a) además comprende proporcionar una base adecuada, el paso (b) además comprende mezclar la base con la composición que comprende glóbulos rojos, y la base tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel de una reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos en la mezcla, con relación a la mezcla en la base. En algunas modalidades, la reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos es la modificación de la superficie de los glóbulos rojos a través del compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el paso (a) además comprende proporcionar una base adecuada, el paso (b) además comprende mezclar la base con la composición que comprende glóbulos rojos, y la base tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel del anticuerpo del compuesto inactivador anti-patógeno que se une a la composición de glóbulos rojos tratada en la mezcla resultante en por lo menos aproximadamente 5% (o al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%) con relación a la mezcla en la base. En algunas modalidades, la base y el extintor se mezclan con la composición de glóbulos rojos antes de, al mismo tiempo, o no más de aproximadamente 30 minutos después del mezclado del compuesto inactivador del patógeno con la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, la base y el extintor se mezclan juntos antes de mezclar ya sea la base o el extintor con la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, la base es NaOH. En algunas modalidades, la base es un regulador de pH básico. En algunas modalidades, la base comprende de aproximadamente 0.5 a 1.5 equivalentes de base, en donde un equivalente significa una cantidad molar que es equivalente a la cantidad molar del extintor en la mezcla. En algunas modalidades, la base comprende de aproximadamente de 0.75 a 1.25 equivalentes de base. En algunas modalidades, la base comprende de aproximadamente 1 equivalente de base. En algunas modalidades, la mezcla resultante del paso (b) tiene un pH a 37°C de aproximadamente 6.0 a 7.5. En algunas modalidades, el pH es de aproximadamente 6.5 a 7.1. En algunas modalidades, el pH es de aproximadamente 6.8 o 6.9.

En algunas modalidades, el extintor comprende cisteína o un derivado de cisteína. En algunas modalidades, el extintor es glutationa o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, la concentración del extintor en la mezcla resultante del paso (b) es mayor de 2 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 25 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es de aproximadamente 20 mM.

En algunas modalidades, la disminución de la concentración del extintor en el paso (c) comprende la centrifugación de la mezcla seguido por la eliminación del sobrenadante. En algunas modalidades, el paso (c) comprende separación de exclusión de tamaño. En algunas modalidades, el extintor en la mezcla resultante del paso (c) está a una concentración menor de aproximadamente 10 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es menor de aproximadamente 8 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es menor de aproximadamente 6 mM (o menor de aproximadamente 4 mM, o menor de aproximadamente 2 mM) . En algunas modalidades, el almacenamiento de la mezcla es el almacenamiento de la mezcla durante más de 10 días a 4°C. En algunas modalidades, el almacenamiento de la mezcla es el almacenamiento de la mezcla durante más de 42 días (o 28 días) a 4°C. En algunas modalidades, el método comprende la adición de una solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) . En algunas modalidades, la mezcla se almacena en una solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) . En algunas modalidades, el método además comprende reemplazar la solución del tratamiento (por ejemplo, cualquier solución descrita en las Tablas 2, 3, o 4 y/o una solución que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato, y/o manitol) con una solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) . En algunas modalidades, la concentración del cloruro de la composición antes de disminuir la concentración del extintor es menos de aproximadamente 100 mM (o aproximadamente 75 mM) . En algunas modalidades, la concentración del cloruro de la composición después de disminuir la concentración del extintor y/o agregar la solución aditiva es mayor de aproximadamente 100 mM (o aproximadamente 125 mM) .

En algunas modalidades de cada uno de los métodos antes mencionados, así como otros métodos descritos en la presente, el grupo funcional es una mostaza, un intermediario de mostaza, o un equivalente de mostaza. En algunas modalidades, el grupo funcional es, o es capaz de formar, un ión de aziridinio. En algunas modalidades, el grupo electrófilo reactivo es capaz de reaccionar con ácidos nucleicos. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno además comprende un ligando que se une al ácido nucleico. En algunas modalidades, el ligando que se une al ácido nucleico es un intercalador . En algunas modalidades, el intercalador es una acridina. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno comprende un enlazador frágil que se enlaza al grupo funcional y el ligando que se une al ácido nucleico. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno es ß-alanina, N- (acridin-9-ilo) , 2-[bis (2-cloroeti) amino] etil éster. En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno es la mezcla resultante del paso (b) es de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 5 mM. En algunas modalidades, la concentración es suficiente para inactivar por lo menos 1 log de un patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente. En algunas modalidades, la concentración es suficiente para inactivar por lo menos 3 logs de un patógeno. En algunas modalidades, el tiempo entre el paso (b) y el paso (c) es de aproximadamente 1 a 48 horas. En algunas modalidades, el tiempo es de aproximadamente 10 a 30 horas. En algunas modalidades, el tiempo es de aproximadamente 15 a 25 horas. En algunas modalidades, el tratamiento inactiva por lo menos 1 log de un contaminante de patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente. En algunas modalidades, el tratamiento inactiva por lo menos 3 logs. En algunas modalidades, el método además comprende el paso de disminuir la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla. En algunas modalidades, el paso de disminuir la concentración del extintor en la mezcla y disminuir la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla ocurre al mismo tiempo.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos antes mencionados, así como otros métodos descritos en la presente, a 20. horas después del paso (b) , los glóbulos rojos (RBC) de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo del compuesto inactivador anti -patógeno (ABC) menor de 65% comparado con el valor ABC de los glóbulos rojos del mismo método bajo las mismas condiciones, pero sin el uso de base. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de ABC menor de aproximadamente 50,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de ABC menor de aproximadamente 40,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de ABC de entre aproximadamente 25,000 y 70,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de ABC de entre aproximadamente 35,000 y 45,000. En algunas modalidades, los RBC de la mezcla resultante tienen menos de 1% de hemolisis después del paso (c) . En algunas modalidades, los RBC tienen menos de 1% de hemolisis en un tiempo de 42 días (o 28 días) a 4°C después del paso (c) . En algunas modalidades, los RBC de la mezcla resultante tienen un Volumen Celular Empacado (PCV) mayor de 50% después del paso (c) . En algunas modalidades, los RBC tienen un PCV mayor de 50% en un tiempo de 42 días (o 28 días) a 4°C después del paso (c) . En algunas modalidades, los RBC de la mezcla resultante tienen un Calor de Fragilidad Corpuscular Media mayor de 140 (o 150) después 42 días (o 28 días) a 4°C después del paso (c) . En algunas modalidades, la cantidad del compuesto inactivador del patógeno no se reduce y/o el compuesto inactivador del patógeno no se pone en contacto con un dispositivo de absorción de compuesto (CAD) .

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para reducir la deshidratación de los glóbulos rojos, que comprende: a) proporcionar una composición de glóbulos rojos que comprende una mezcla de i) un extintor, en donde el extintor es capaz de reaccionar con un compuesto inactivador de patógeno, y ii) glóbulos rojos; y b) disminuir suficientemente la concentración del extintor (y opcionalmente la concentración del compuesto inactivador del patógeno y/o sus subproductos) en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor. En algunas modalidades, el extintor comprende cisteína o un derivado de cisteína. En algunas modalidades, el extintor es glutationa o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el extintor en la mezcla resultante del paso (b) está a una concentración menor de aproximadamente 10 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es menor de aproximadamente 8 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es menor de aproximadamente 6 mM, o menor de aproximadamente 2 mM. En algunas modalidades, los glóbulos rojos (donde el) de la mezcla resultante tienen menos de 1% hemolisis después del paso (b) . En algunas modalidades, los RBC tienen menos de 1% de hemolisis en un tiempo de 42 días (o 28 días) a 4°C después del paso (b) . En algunas modalidades, los RBC de la mezcla resultante tienen un Volumen Celular Empacado (PCV) mayor de 50% después del paso (b) . En algunas modalidades, los RBC de la mezcla resultante tienen un PCV mayor de 50% en un tiempo de 42 días (o 28 días) a 4°C después del paso (b) . En algunas modalidades, los RBC de la mezcla resultante tienen un Valor de Fragilidad Corpuscular Media mayor de 140 (o 150) después 42 días (o 28 días) a 4°C después del paso (b) . En algunas modalidades, el almacenamiento de la mezcla es el almacenamiento de la mezcla durante más de 10 días a 4°C. En algunas modalidades, el almacenamiento de la mezcla es el almacenamiento de la mezcla durante más de 42 días (o 28 días) a 4°C. En algunas modalidades, la cantidad del compuesto inactivador del patógeno no se reduce y/o el compuesto inactivador del patógeno no se pone en contacto con un dispositivo de adsorción de compuesto (CAD) .

Son provistas Las composiciones de Glóbulos Rojos (RBC) producidas por cada uno de los métodos antes mencionados. También son provistas las composiciones RBC que se preparan a través de cada uno de los métodos antes mencionados.

En un aspecto más, la invención proporciona una composición que comprende a) glóbulos rojos, en donde los glóbulos rojos reaccionan covalentemente con un grupo electrófilo de un compuesto inactivador de patógeno; y b) un extintor que comprende un grupo tiol que es capaz de reaccionar con el compuesto inactivador del patógeno; en donde la composición es adecuada para infusión en humanos después de almacenamiento de hasta 42 días (o 28 días) a 4°C. En algunas modalidades, por lo menos 1 log de un patógeno se inactiva, si está presente. En algunas modalidades, por lo menos 3 logs se inactivan. En algunas modalidades, el grupo electrófilo es una mostaza, un intermediario de mostaza, o un equivalente de mostaza. En algunas modalidades, el grupo electrófilo es, o es capaz de formar, un ión de aziridinio. En algunas modalidades, el grupo electrófilo es capaz de reaccionar con ácidos nucleicos. En algunas modalidades, el grupo electrófilo reacciona covalentemente con la superficie celular de los glóbulos rojos. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno además comprende un ligando que se une al ácido nucleico. En algunas modalidades, el ligando que se une al ácido nucleico es un intercalador .

En algunas modalidades, el intercalador es una acridina. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno comprende un enlazador frágil que se enlaza al grupo electrófilo y al ligando de unión del ácido nucleico. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno es ß-alanina, N- (acridin-9-ilo) , 2 - [bis ( 2 -cloroeti ) amino] etil éster. En algunas modalidades, el extintor comprende cisteína o un derivado de cisteína. En algunas modalidades, el extintor es glutationa o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el extintor está a una concentración que es lo suficientemente baja para evitar o minimizar la deshidratación de los glóbulos rojos durante el almacenamiento. En algunas modalidades, la concentración del extintor es menor de aproximadamente 10 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es menor de aproximadamente 8 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor es menor de aproximadamente 6 mM, o menor de aproximadamente 2 mM. En algunas modalidades, los glóbulos rojos (RBC) tienen un Volumen Celular Empacado (PCV) mayor de 55%. En algunas modalidades, los RBC tienen un PCV mayor de 60%. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de capacidad de unión del anticuerpo (ABC) menor de aproximadamente 50,000. En algunas modalidades, RBC tienen un promedio ABC menor de aproximadamente 40,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de ABC de entre aproximadamente 25,000 y 60,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de ABC de entre aproximadamente 25,000 y 70,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un promedio de ABC de entre aproximadamente 35,000 y 45,000. En algunas modalidades, la composición además comprende una solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) . En algunas modalidades, la concentración de cloruro de la solución aditiva y/o de la composición es mayor de aproximadamente 100 mM (o aproximadamente 125 mM) .

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para infundir glóbulos rojos en un individuo, que comprende: a) proporcionar cualquiera de las composiciones de glóbulos rojos antes mencionadas o una composición de glóbulos rojos producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente y, b) infundir la composición de glóbulos rojos en el individuo.

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una composición de glóbulos rojos que comprende: (a) mezclar (i) un compuesto inactivador del patógeno que comprende un grupo funcional que es, o que forma, un grupo electrófilo reactivo (por ejemplo, una cantidad efectiva de un compuesto inactivador de patógeno para inactivar un patógeno, si está presente) ; (ii) un extintor (por ejemplo, una cantidad efectiva de un extintor) que comprende un grupo tiol, en donde el tiol es capaz de reaccionar con el grupo electrófilo reactivo del compuesto inactivador del patógeno; y (iii) una composición que comprende glóbulos rojos; y (b) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor. En algunas de estas modalidades, la disminución de la concentración del extintor comprende la eliminación de la solución utilizada durante la inactivación y la adición de una solución aditiva final (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente, tal como SAG-M, AS-5 o cualquier solución de las Tablas 2, 3, o 4). El método puede comprender cualquiera o más de las modalidades enumeradas anteriormente y/o en la presente.

En algunas modalidades, el método además comprende mezclar una base adecuada con la composición que comprende glóbulos rojos, y la base tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel de una reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos en la mezcla, con relación a la mezcla en la base. En algunas modalidades, la reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos es la modificación de la superficie de los glóbulos rojos a través del · compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el método además comprende mezclar una base adecuada con la composición que comprende glóbulos rojos, y la base tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel del anticuerpo del compuesto inactivador anti-patógeno que se une a la composición de glóbulos rojos tratada en la mezcla resultante en por lo menos aproximadamente 5% (o al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%) con relación a la mezcla en la base.

En un aspecto, la invención proporciona un método para reducir la deshidratación en la composición de glóbulos rojos en donde la composición es una mezcla que comprende un extintor capaz de reaccionar con un compuesto inactivador de patógeno, y glóbulos rojos; el método comprende, disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para la infusión de glóbulos rojos, que comprende infundir una composición de glóbulos rojos descrita en la presente en un individuo.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la fragilidad osmótica de glóbulos rojos a varios niveles de base después de la dosificación del extintor inicial como se describe en el Ejemplo 6.

La Figura 2 muestra la densidad de los glóbulos rojos a varios niveles de base a 20 horas de incubación.

La Figura 3 muestra la densidad de los glóbulos rojos a varios niveles de base después de la incubación y 36 días de almacenamiento.

La Figura 4 muestra la fragilidad osmótica de glóbulos rojos después de la incubación y 36 días de almacenamiento con y sin disminución de la concentración del extintor (es decir, con/sin paso de intercambio) .

La Figura 5 muestra la fragilidad osmótica de glóbulos rojos después de la incubación y 42 días de almacenamiento con concentraciones del extintor inicial variables (con el paso de intercambio) comparado con la concentración del extintor inicial moderada (sin el paso de intercambio) .

La Figura 6 muestra la fragilidad osmótica de glóbulos rojos después de la incubación y 36 días de almacenamiento con y sin compuesto inactivador de patógeno.

La Figura 7 muestra los valores de la capacidad de unión del anticuerpo (ABC) para varias preparaciones de glóbulos rojos utilizando los métodos de la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos para tratar composiciones de glóbulos rojos para inactivar patógenos que pueden estar presentes, mientras se reduce o minimiza las reacciones secundarias indeseadas (tales como la modificación de los glóbulos rojos que conducen a una respuesta inmunitaria indeseada) mientras se reducen o minimizan los efectos adversos sobre la la vitalidad celular (por ejemplo, fragilidad osmótica disminuida y/o deshidratación incrementada) y/o la vida útil durante y después del tratamiento. Se ha encontrado que un apropiado control del pH junto cantidad adecuadas del extintor durante el procedimiento de inactivación del patógeno pueden reducir la deshidratación inicial de los glóbulos rojos tratados con el compuesto inactivador del patógeno. El procedimiento además puede ser seguido por la reducción de la concentración del extintor inicial para proporcionar glóbulos rojos inactivados en cuanto a patógenos saludables capaces de almacenar la célula, sin cambios significativos en la fragilidad osmótica. Estos métodos son particularmente adecuados para la preparación de composiciones de glóbulos rojos en donde los patógenos han sido inactivados para uso clínico, especialmente cuando las composiciones se van a almacenar durante un periodo de tiempo antes del uso clínico.

Por consiguiente, la presente invención en un aspecto proporciona un método para tratar una composición de glóbulos rojos que comprende un compuesto inactivador de patógeno y un extintor, a través (1) mezclar el compuesto inactivador del patógeno y el extintor con la composición que comprende glóbulos rojos; y (2) disminuir suficientemente la concentración del extintor para reducir el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos resultante del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla a la concentración original.

En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para reducir la deshidratación y/o aumentar la fragilidad osmótica en glóbulos rojos, así como métodos para infundir glóbulos rojos en humanos. También se proporcionan composiciones de glóbulos rojos tratadas.

Glóbulos Rojos Las composiciones de glóbulos rojos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cualquier producto sanguíneo que comprende glóbulos rojos (por ejemplo, sangre humana) , en donde el producto sanguíneo proporciona, o se procesa para proporcionar, glóbulos rojos adecuados para utilizar en humanos, mamíferos, y/o vertebrados, tal como por infusión.

Las composiciones o glóbulos incluyen, por ejemplo, sangre completa y concentrados de glóbulos rojos, tales como glóbulos rojos empacados (pRBC; por ejemplo, glóbulos rojos con hematocritos incrementados y/o sin contener una solución aditiva) . Las composiciones de glóbulos rojos pueden describirse a través de su volumen de hematocrito o de célula empacada (PCV) , una medición de la concentración de los glóbulos en la composición. Las composiciones de glóbulos pueden tener un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 1 a 100%, más probablemente de aproximadamente 10 a 90%, también de aproximadamente 35 a 80%, o aproximadamente 40 a 70%. Las composiciones de glóbulos pueden incluir químicos, tales como compuestos inactivadores de patógeno y extintores. También pueden incluir reguladores de pH y otras soluciones, tales como las soluciones aditivas de glóbulos rojos (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente, tal como SAG-M, AS-5 o cualquier solución de las Tablas 2, 3, o 4), incluyendo sales o soluciones reguladas en el pH. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos descrita en la presente son glóbulos rojos empacados que tiene un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 70 a 90%, o aproximadamente 75 a 85%, o aproximadamente 80%, antes de utilizarlo en los métodos de tratamiento descritos en la presente. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos son glóbulos rojos no empacados que tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 50 a 70%, o aproximadamente 55 a 65%, o aproximadamente 60%, antes de y/o durante el uso en los métodos de tratamiento descritos en la presente. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos se diluye con una solución diluyente y tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 30 a 50%, o aproximadamente 35 a 45%, o aproximadamente 40%, antes de y/o durante el uso en el método de tratamiento descrito en la presente. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos descrita en la presente se han leuco-reducido antes de utilizarlo en los métodos de tratamiento descritos en la presente. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos no se han leuco-reducido. Cualquier composición de glóbulos rojos que se ponga en contacto con, o se introduzca en, un humano, mamífero o vertebrado viviente, en donde el contacto lleva un riesgo de transmisión de una enfermedad debido a los patógenos contaminantes puede tratarse como se describe en la presente .

Patógenos Sanguíneos El contaminante de patógeno, si está presente, a ser inactivado en los métodos de la invención incluye cualquier agente que contiene ácido nucleico capaz de causar la enfermedad en un humano, otros mamíferos, o vertebrados. El agente patogénico puede ser unicelular o multicelular. Los ejemplos de patógenos son bacterias, virus, protozoarios , hongos, levaduras, moldes, y micro-plasmas que causan enfermedades en humanos, otros mamíferos, o vertebrados. El material genético del patógeno puede ser AND o ARN, y el material genético puede estar presente como ácido nucleico de estructura de cadena individual o de estructura de cadena doble. La Tabla 1 enumera los ejemplos de virus, y no pretende limitar la invención en ninguna forma.

Tabla 1. Ejemplos no limitantes de virus Familia Virus : Adeno Adenovirus 2 Hepatitis de canino Arena Pichinde Lassa Bunya Turlock Encefalitis de California Herpes Herpes simple 1 Herpes simple 2 Citomegalovirus Pseudorabia Orothomyxo Influenza Papova SV-40 Paramyxo Sarampión Familia Virus : Paperas Parainfluenza 2 y 3 Picornia Poliovirus 1 y 2 Coxsackie A- 9 Eco 11 Pox Vacuna Viruela aviar Reo Lengua azul Fiebre de pulga de Colorado Retro VIH Sarcoma aviar Sarcoma de murino Leucemia de murino Rhabdo Virus de estomatitis vesicular Toga Encefalitis equina del Oeste Dengue 2 Dengue 4 Encefalitis de San Luis Hepadna Hepatitis B Bacteriófago Lambda R17 T2 (Rickettsia) R. cari (rickettsialpox) Además de los contaminantes de patógenos inactivadores posibles, los métodos de la presente invención también inactivan leucocitos que pueden estar presentes en la composición de glóbulos rojos. Los métodos de leuco-reducción se utilizan para preferiblemente eliminar la mayor parte de leucocitos de las composiciones de glóbulos rojos previstas para infusión, ya que pueden dar como resultado respuestas inmunitarias indeseadas en el receptor. Sin embargo, no toda la sangre se leuco-reduce, o los métodos de leuco-reducción no pueden eliminar todos los leucocitos. Por consiguiente, la investigación de cualquier leucocito residual a través de los métodos de la invención como se describe en la presente además reduce el riesgo de las respuestas inmunitarias.

Compuestos Inactivadores de Patógeno La inactivación de un patógeno en la composición de glóbulos rojos se efectúa poniendo en contacto el patógeno en la composición de glóbulos rojos con un compuesto inactivador de patógeno. En cualquiera de las modalidades descritas en la presente, el compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, S-303 descrita en la presente) puede estar presente en una cantidad efectiva (por ejemplo, una cantidad efectiva para inactivar un patógeno, tal como una cantidad suficiente para inactivar, por ejemplo, por lo menos 1 log, 2 log, o 3 log de un patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente) . Los compuestos inactivadores del patógeno pueden utilizarse a través de los métodos de la invención que incluyen compuestos que comprenden un grupo funcional el cual es, o el cual es capaz de formar y se ha formado, por ejemplo, in situ, un grupo reactivo, tal como un grupo electrófilo. En algunos casos, los compuestos inactivadores de patógeno de la presente invención no requieren la fotoactivación a ser reactiva. Por ejemplo, el grupo funcional puede ser un grupo de mostaza, un intermediario del grupo de mostaza, un equivalente del grupo de mostaza, un epóxido, un formaldehído, o un formaldehído sinton. Los grupos funcionales son capaces de formar in situ un grupo reactivo, tal como una aziridina electrófila, aziridinio, tiirano, o ión de tiiranio. Un grupo de mostaza puede ser un grupo mono- o bis- (haloetil ) amina o grupo mono- (haloetil) sulfuro . Un equivalente de mostaza es un grupo que reacciona a través de un mecanismo similar a las mostazas, por ejemplo, formando intermediarios reactivos tales como los grupos de aziridinio y aziridina o los grupos de tiirano o tiriidanios. Los ejemplos incluyen derivados de aziridina, los grupo mono- o bis- (mesiletil) amina, los grupos mono- (mesiletil) sulfuro, los grupos mono- o bis-tosiletil) amina y los grupos mono- (tosiletil) sulfuro . Un formaldehído sinton es cualquier compuesto que se separa en un formaldehído, que incluye una hidroxilamina tal como hidroxilmetilglicina . El grupo reactivo del compuesto inactivador del patógeno es capaz de reaccionar con los ácidos nucleicos del patógeno, por ejemplo con grupos nucleófilos en el ácido nucleico. El grupo reactivo también es capaz de reaccionar con un grupo nucleófilo de un extintor. Los compuestos inactivadores del patógeno también pueden incluir un componente que activa el compuesto a ácidos nucleicos, tales como la porción de anclaje. La porción de anclaje comprende una fracción que es capaz de unirse no covalentemente al biopolímero del ácido nucleico, tal como ADN o ARN, y también es referido como un ligando de unión de ácido nucleico, grupo de unión de ácido nucleico, o fracción de unión de ácido nucleico.

Los ejemplos de tales compuestos se describen en las Patentes de E. U. A. Nos. 5,691,132, 6,410,219, 6,136,586, 6,617,157, y 6,709,810, cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente. Otra clase de compuestos inactivadores de patógeno que pueden extinguirse a través de los métodos de la invención comprenden los grupos reactivos antes mencionados enlazados a un grupo de unión de ácido nucleico a través de un enlazador hidrolizable , como se describe en la Patente de E. U. A. No. 6,514,987, incorporada aquí por referencia. La porción de anclaje de los compuestos inactivadores del patógeno tiene una afinidad para ácidos nucleicos. Esta afinidad puede deberse a cualquiera de los métodos de unión al ácido nucleico no covalentemente, que incluyen, pero no se limitan a, intercalación, modos de unión al ácido nucleico no covalentemente que incluyen, pero no se limitan a, intercalación, enlace de ranura menor, enlace de ranura mayor, y enlace electrostático (por ejemplo, unión de estructura de fosfato) . La afinidad también puede deberse a los modos de mezclado de la unión (por ejemplo, intercalación y unión de ranura menor) . La unión puede ser específica de la secuencia (es decir, afinidad de unión incrementada para una o más secuencias de ácido nucleico sobre otras secuencias de ácido nucleico) o no específico de secuencia. Los ejemplos detallados de las fracciones de unión de ácido nucleico pueden encontrarse en las patentes antes mencionadas .

En algunas modalidades de cada uno de los métodos, composiciones y kits descritos en la presente, el compuesto inactivador del patógeno puede comprender un grupo funcional el cual es, o que forma, un grupo electrófilo reactivo que reacciona con el nucleófilo del extintor seleccionado. En algunas modalidades, el grupo inactivador del patógeno comprende un ligando que se une al ácido nucleico y un grupo funcional que es, o que forma un grupo electrófilo.

Un ejemplo específico del compuesto inactivador del patógeno adecuado para utilizarse en la presente invención es ß-alanina, N- (acridin-9-ilo) , éster 2- [bis (2- cloroetil ) amino] etílico (también alternativamente referido en la presente como "S-303"), la estructura del cual es como sigue, incluyendo sus sales.

S-303 En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno, tal como S-303, en la mezcla con la composición de glóbulos rojos y el extintor está en el intervalo de aproximadamente 0.05 mM a 4 mM, aproximadamente 0.05 mM a 2 mM, aproximadamente 0.05 mM a 0.5 mM, aproximadamente 0.1 mM a 0.3 mM, o aproximadamente 0.2 mM. En algunas modalidades, la relación molar del extintor al compuesto inactivador del patógeno una vez que ambos componentes se han mezclado con la composición de glóbulos rojos es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 400:1, también aproximadamente 10:1 a aproximadamente 200:1, también aproximadamente 20:1 a aproximadamente 200:1, también aproximadamente 50:1 a aproximadamente 200:1, también aproximadamente 100:1.

Ex intores Los extintores para utilizarse en los métodos de la presente invención pretenden reducir reacciones secundarias indeseadas de las especies electrófilas reactivas utilizadas para inactivar patógenos (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno a la superficie RBC que puede conducir a una respuesta inmunitaria indeseada) . En cualquiera de las modalidades descritas en la presente, el extintor (por ejemplo, glutationa descrita en la presente) puede estar presente en una cantidad efectiva (por ejemplo, una cantidad efectiva para reducir las reacciones secundarias indeseadas, tales como las cantidades descritas en la presente. Los extintores adecuados incluyen un grupo nucleófilo que es capaz de reaccionar con un grupo electrófilo del compuesto inactivador del patógeno. Los ejemplos no limitantes se describen con detalle en la Patente de E. U. A.. No. 6,709,810, incorporada por referencia en la presente en su totalidad. En algunas modalidades, los extintores son capaces de significativamente reducir las reacciones secundarias indeseadas en una composición de glóbulos mientras permiten que el compuesto inactivador del patógeno inactive suficientemente un patógeno que ser contaminante para la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, los métodos mejorados de la presente invención proporcionan una cantidad efectiva del extintor en combinación con una cantidad del compuesto inactivador del patógeno bajo condiciones que proporcionan la reducción óptima de las reacciones secundarias indeseadas combinadas (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno) , o suficientemente inactivación del patógeno, sin significativamente alterada (por ejemplo, sin disminuir) la fragilidad osmótica celular y sin significativamente alterar (por ejemplo, sin incrementar) la deshidratación . Una variedad de reacciones secundarias indeseadas puede reducirse, tal como la reacción del compuesto inactivador del patógeno con proteínas y/o componentes de glóbulos rojos. En algunas modalidades, el extintor proporciona una reducción óptima en la modificación de glóbulos rojos, tales como la unión de IgG a los glóbulos rojos o la unión del compuesto inactivador del patógeno a los glóbulos rojos. Ya que los métodos de la invención involucran el tratamiento ex vivo de composiciones de glóbulos rojos, algunos extintores pueden permanecer en la composición después de la introducción en un individuo. Es decir, en algunas modalidades, los extintores de la invención son adecuados para infusión. Los extintores adecuados incluyen, pero no se limitan a, compuestos que comprenden un grupo tiol, tales como los extintores que comprenden una cisteína de aminoácido o un derivado de cisteína adecuado, tal como N-acetil cisteína. Los ejemplos de los extintores incluyen cisteínas y péptidos que comprenden por lo menos una cisteína, tal como glutationa. En algunas modalidades, los extintores adecuados comprenden un derivado de cisteína que puede formar un grupo tiol in situ, con o sin el uso de químicos adicionales o enzimas adicionadas, tales como S-acetil cisteína u otro tiol adecuado derivado de profármacos de cisteína, o péptidos que comprende S-acetil cisteína u otro tiol derivado de profármacos y cisteína. Los derivados adecuados de cisteína son los que comprenden, o son capaces de formar in situ, un cisteinil tiol, que es capaz de reaccionar con el grupo electrófilo del compuesto inactivador del patógeno.

En algunas modalidades, el extintor es un péptido de 2 a 10 aminoácidos, en donde por lo menos uno de los aminoácidos es cisteína, N-acetil cisteína, S-acetil cisteína, u otro derivado de cisteína adecuado. En algunas modalidades, el extintor es un péptido de por lo menos 3 aminoácidos, tal como aproximadamente 3-10 aminoácidos, también aproximadamente 3-6 aminoácidos, en donde por lo menos uno de los aminoácidos es cisteína, N-acetil cisteína, S-acetil cisteína, u otro derivado de cisteína adecuado. En algunas modalidades, el extintor es un péptido de por lo menos 3 aminoácidos, tal como aproximadamente 3-10 aminoácidos, también aproximadamente 3-6 aminoácidos, en donde por lo menos uno de los aminoácidos es cisteína, N-acetil cisteína, S-acetil cisteína, u otro derivado de cisteína adecuado, también en donde por lo menos 2 o por lo menos 3 de los aminoácidos es cisteína, N-acetil cisteína, S-acetil cisteína, u otro derivado de cisteína adecuado.

En una modalidad preferida, el extintor es glutationa neutralizada (también conocido como L-glutationa y ?-L-glutamil-L-cisteinil-glicina) . La glutationa tiene muchas propiedades que la hacen particularmente útil como un extintor. Está normalmente presente en todos los tipos celulares. No se cree que sea capaz de penetrar pasivamente en el patógeno, tal como pasando a través de las membranas celulares o las capas lípidas, de la bacteria y los virus que envuelven el lípido, o pasar a través de la capsida viral de virus no envuelto. A un pH aproximadamente neutral, la glutationa se carga y en la ausencia de un transporte activo, no penetra las bicapas lípidas a un grado significativo. Esto es consistente con la inactivación de los virus envueltos con lípidos tales como VIH y VSV que se mantienen sustancialmente sin afectar por la glutationa, incluyendo el uso de concentraciones de glutationa neutralizada mayores de 2 mM. El uso de glutationa tiene algún efecto sobre la inactivación de, por ejemplo, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus epidermidis y Serratia marcescens . Sin embargo, esto puede manejarse mediante el uso de cantidades efectivas de glutationa neutralizada y el compuesto del activador del patógeno. Es decir, los métodos preferidos para extinción son provistos en la presente, en donde la contaminación de una composición de glóbulos rojos a través de un patógeno viral o bacteriano se inactiva en por lo menos 2 log, preferiblemente por lo menos 3 log. En algunas modalidades, Staphylococcus epidermidis puede inactivarse a través de por lo menos 3 log, también aproximadamente 4 log, o aproximadamente 5 log y VSV puede inactivarse hasta por lo menos 4 log, también aproximadamente 5 log, o aproximadamente 6 log. En algunas modalidades, la inactivación de Staphylococcus epidermidis con S-303 está dentro de aproximadamente 3 log, también aproximadamente 2 log, o aproximadamente 1 log que es de una composición similar inactivada con 2 mM de glutationa ácida y 0.2 mM de S-303. En algunas modalidades, la inactivación de VSV con S-303 está dentro de aproximadamente 2 log, o aproximadamente 1 log, o esencialmente igual a la misma composición similar inactivada con 2 mM de glutationa ácida y 0.2 mM de S-303. A las condiciones apropiadas, como se describe por la presente invención, la glutationa también es compatible con el almacenamiento in Vitro de glóbulos rojos y la composición de glóbulos resultantes es adecuada para introducción in vivo.

En algunas modalidades, el extintor es glutationa en su forma reducida. El disulfuro de glutationa, la forma oxidada de la glutationa, también puede utilizarse, mientras el disulfuro de glutationa se reduzca lo suficiente en la solución antes de la adición a la solución a la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos o reduzca suficientemente después de la adición a la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos.

En algunas modalidades, el extintor es un derivado de glutationa, tal como glutationa monoalquil éster o dialquil éster, en donde el grupo alquilo es un grupo de cadena recta o ramificada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a grupo metilo, etilo, grupo propilo, grupo isopropilo, grupo butilo, grupo isobutilo, grupo ter-butilo, grupo pentilo, grupo isopentilo, grupo neopentilo, grupo ter-pentilo, grupo 1-metilbutilo, grupo hexilo, grupo isohexilo, grupo 2-metilpentilo, grupo 1-etilbutilo, grupo heptilo, grupo octilo, grupo nonilo, y grupo decilo. Por ejemplo, los ejemplos no limitantes de derivados de glutationa incluyen éster metílico de glutationa, éster monoetílico de glutationa, y éster monoisopropilico de glutationa. En algunas modalidades, el éster dietílico de glutationa oxidado (GSSG- (glicilo) -dietil -éster) se utiliza. En algunas modalidades, un tioéster de glutationa se hidroliza después de la adición a la composición de glóbulos rojos para formar el tiol.

Se entiende que en algunas modalidades, el extintor . puede ser provisto en la forma de un ácido o base libre, mientras, en otras modalidades, el extintor será provisto en la forma de una sal. Si el extintor está en la forma de una sal, la sal es preferiblemente una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos (en la forma de productos solubles de agua en aceite o dispersables) incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario que se forman, por ejemplo, de ácidos o bases inorgánicas u orgánicas. Los ejemplos de las sales de adición de ácido incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodecilsulfato, etansulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietansulfonato, lactato, maleato, etansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales base incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino, tales como sales de sodio y potasio, sales de metal alcalinotérreo tales como sales calcio y magnesio, sales con base orgánicas tales como sales de diciclohexilamina, N-metil -D-glucamina , y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, etc. También, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con los agentes como haluros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; dialquilsulfatos como dimetilo, dietilo, dibutilo; y diamil sulfatos, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo; y haluros de aralquilo como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen la sal de sulfato de etanolato y sales de sulfato.

Por ejemplo, en algunas modalidades, el extintor está en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable formada de glutationa. En algunas modalidades, el extintor está en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable formada de glutationa y uno o más cationes tales como sodio, aluminio, calcio, litio, magnesio, zinc o tetrametil amonio. En algunas modalidades, el extintor es glutationa (reducida) y se proporciona en la forma de una sal monosódica de glutationa (disponible, por ejemplo, de Biomedica Foscama, Italia) . En algunas modalidades, la glutationa (reducida) se proporciona en la forma de la sal de clorhidrato de glutationa. En algunas modalidades, la glutationa se proporciona en la forma de una sal disódica de glutationa (reducida) . En otras modalidades, se utiliza éster sulfato de monoalquil glutationa. En algunas modalidades, la glutationa se proporciona en la forma de una sal disódica oxidada de glutationa .

Métodos de Inactivación y Extinción Los métodos de la presente invención involucran la combinación de una composición de glóbulos rojos con un compuesto inactivador del patógeno y un extintor bajo condiciones en donde, después de la mezcla de la composición con el compuesto inactivador del patógeno y el extintor, el pH de la composición resultante está en un intervalo adecuado para proporcionar una inactivación adecuada del patógeno y la reducción de las reacciones secundarias indeseadas (tal como la modificación de los glóbulos rojos) con un efecto limitado o sin efecto sobre la vitalidad (por ejemplo, fragilidad osmótica y deshidratación) y/o la vida útil del producto sanguíneo tratado. Además, la presente invención describe la disminución de la concentración del extintor en la composición de glóbulos rojos después del periodo de inactivación del patógeno para ayudar en la manutención de la vitalidad y la vida útil de los glóbulos rojos durante almacenamiento. Una solución aditiva, como se describe en la presente, también puede utilizarse para los glóbulos rojos durante almacenamiento y puede utilizarse para reemplazar las soluciones de tratamiento y/o soluciones diluyentes utilizadas durante la inactivación del patógeno.

Los métodos mejorados incluyen varias características que pueden ser importantes para la extinción. La primera característica es el grupo tiol, u otro grupo nucleófilo adecuado. La segunda es el ajuste del pH de la solución. Es posible proporcionar algún nivel de extinción ajustando de manera adecuada el pH de la solución. Es decir, los extintores de la invención proporcionan alguna capacidad reguladora de pH a la composición que comprende glóbulos rojos, en donde la capacidad reguladora de pH por sí misma proporciona una extinción mejorada. Por ejemplo, el uso de un análogo de cisteína tal como metionina como un extintor, cuando se modifica apropiadamente para proporcionar un cambio en el pH adecuado en la composición de glóbulos rojos, dará como resultado algún nivel de extinción de la unión del compuesto inactivador del patógeno para los glóbulos rojos. Ya que el átomo de azufre en la metionina no es nucleófilo, la metionina no proporciona ninguna extinción diferente de proporcionar el pH necesario de la solución. De esta forma, la combinación del ajuste del pH y un grupo tiol proporcionan una extinción mejorada. El ajuste apropiado del pH y el equivalente base también pueden disminuir el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos durante el periodo de inactivación. Una tercera característica que puede ser importante para proporcionar una extinción mejorada en algunas modalidades, es la selección de extintores preferidos que no penetran sustancialmente dentro de los patógenos tales como virus y bacterias. Los extintores proporcionan una extinción adecuada en el entorno extracelular, en donde ocurren las reacciones perjudiciales tales como la unión a glóbulos rojos, sin extinción adicional del compuesto inactivador del patógeno una vez que ha penetrado dentro del patógeno. Finalmente, los métodos de extinción mejorados de la presente invención incluyen la disminución de la concentración del extintor después de la inactivación y, en algunos casos, la adición de la solución aditiva para almacenamiento. Los glóbulos rojos han demostrado que tienen una vida útil mejorada y niveles disminuidos de deshidratación durante almacenamiento cuando la concentración total del extintor se disminuye a niveles adecuados.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar una composición de glóbulos rojos que comprende: a) proporcionar i) un compuesto inactivador de patógeno que comprende un grupo funcional que es, o que forma, un grupo electrófilo reactivo (por ejemplo, una cantidad efectiva de un compuesto inactivador de patógeno para inactivar un patógeno, si está presente) , ii) un extintor (por ejemplo, una cantidad efectiva de un extintor como se describe en la presente) que comprende un grupo tiol, en donde el tiol es capaz de reaccionar con el grupo electrófilo reactivo del compuesto inactivador del patógeno, y iii) una composición que comprende glóbulos rojos; b) mezclar compuesto inactivador del patógeno y el extintor con la composición que comprende glóbulos rojos; y c) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla, con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor. En algunas modalidades, ¦ el paso (a) además comprende proporcionar una base adecuada, el paso (b) además comprende mezclar la base con la composición que comprende glóbulos rojos, y la base tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel de una reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos en la mezcla, con relación a la mezcla en la base. En algunas modalidades, la reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos es la modificación de la superficie de los glóbulos rojos a través del compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el paso (a) además comprende proporcionar una base adecuada, el paso (b) además comprende mezclar la base con la composición que comprende glóbulos rojos, y la base tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel del anticuerpo del compuesto inactivador anti-patógeno que se une a la composición de glóbulos rojos tratada en la mezcla resultante en por lo menos aproximadamente 5% (o al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%) con relación a la mezcla en la base. En algunas modalidades, el almacenamiento de la mezcla es mayor de, igual a, o menor que 7, 10, 14, 21, 28, 35, o 42 días de almacenamiento a 4°C o temperatura ambiente. En algunas modalidades, la mezcla se almacena en una solución aditiva (por. ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) . En algunas modalidades, el método además comprende reemplazar la solución utilizada durante el' tratamiento con una solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) .

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para reducir la deshidratación en glóbulos rojos, que comprende: a) proporcionar una composición de glóbulos rojos que comprende i) un extintor, en donde el extintor es capaz de reaccionar con un compuesto inactivador de patógeno, y ii) glóbulos rojos; y b) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor. En algunas modalidades, el almacenamiento de la mezcla es mayor de, igual a, o menor que 7, 10, 14, 21, 28, 35, o 42 días de almacenamiento a 4°C o temperatura ambiente.

En algunas modalidades, el método además comprende la adición de una solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) , por ejemplo, antes de almacenamiento .

El extintor y/o la base adicional (o el extintor neutralizado) utilizado en los métodos descritos en la presente puede mezclarse con la composición de glóbulos rojos antes de, al mismo tiempo que, o después de la adición del compuesto inactivador del patógeno a la composición de glóbulos rojos. Si el extintor y la base (o extintor neutralizado) se mezclan con la composición de glóbulos rojos después de que la solución inactivadora del patógeno se mezcla con la composición de glóbulos rojos, el extintor y/o base (o extintor neutralizado) preferiblemente se adicionan a la composición de glóbulos rojos antes de una cantidad significativa de reacción secundaria del compuesto inactivador del patógeno con los glóbulos rojos ha ocurrido, de tal forma que la extinción adecuada de la reacción secundaria indeseada puede lograrse. En algunas modalidades, el extintor y/o base (o extintor neutralizado) se mezclan con la composición de glóbulos rojos dentro de aproximadamente una hora, dentro de aproximadamente 30 minutos, dentro de aproximadamente 20 minutos, dentro de aproximadamente 10 minutos, dentro de aproximadamente 5 minutos, dentro de aproximadamente 2 minutos, o dentro de aproximadamente 1 minute después del mezclado del compuesto inactivador del patógeno con la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, el extintor y la base se mezclan con .la composición de glóbulos rojos al mismo tiempo que el compuesto inactivador del patógeno.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos descritos en la presente, el extintor y la base adicionada (o el extintor neutralizado) se pre-tratan con la composición de glóbulos rojos durante un intervalo de tiempo adecuado antes de la adición del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, S-303) , tal como menos de aproximadamente una hora, menos de aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente 20 minutos, menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos, menos de aproximadamente 2 minutos, o menos de aproximadamente 1 minuto antes de mezclar el compuesto inactivador del patógeno con la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, el pre-tratamiento es una temperatura de aproximadamente 1°C a 30°C, también aproximadamente 18°C a 25 °C, o aproximadamente 37 °C, o aproximadamente temperatura ambiente .

En algunas modalidades de cada uno de los métodos descritos en la presente, el compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, S-303) se incuba con la composición de glóbulos rojos en la presencia del extintor y la base adicionada (o el extintor neutralizado) durante un intervalo de tiempo adecuado, tal como aproximadamente 30 minutos a 48 horas, también de aproximadamente 2 a 36 horas, también de aproximadamente 8 a 24 horas, también de aproximadamente 20 horas. En algunas modalidades más, la incubación es una temperatura en el intervalo de aproximadamente 1°C a 30°C, también aproximadamente 18°C a 25°C, o aproximadamente 37°C, o aproximadamente temperatura ambiente.

Con respecto a la característica de ajustar el pH de la composición de glóbulos rojos, los métodos previos para extinguir los compuestos inactivadores del patógeno fallan al reconocer la importancia del pH de la mezcla resultante con respecto a tanto la efectividad de extinción como la vitalidad celular durante la inactivación. Aunque los métodos previos han demostrado la necesidad de una base suficiente y un nivel de pH adecuado para adecuadamente extinguir reacciones secundarias indeseadas del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, aumentando los niveles de glutationa no protonada para reducir la unión del compuesto inactivador del patógeno a la superficie RBC) , estos métodos no realizan y describen los efectos de la base incrementada sobre la deshidratación celular durante el proceso de inactivación. De esta forma, un aspecto de la presente invención involucra ajustar el pH de la composición de glóbulos rojos a un nivel adecuado para la incubación del compuesto inactivador del patógeno y el extintor (por ejemplo, un nivel adecuado para evitar adversamente afectar la deshidratación) .

En algunas modalidades, después de la mezcla del compuesto inactivador del patógeno y el extintor con la composición de glóbulos rojos, el pH de la mezcla está a un nivel adecuado para reducir las reacciones secundarias indeseadas del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno con la superficie RBC que puede conducir a una respuesta inmunitaria indeseada) y reducir suficientemente la deshidratación celular durante la inactivación. En algunas modalidades, las reacciones secundarias indeseadas es la modificación de la superficie de los glóbulos rojos a través del compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, la modificación es la unión covalente del compuesto inactivador del patógeno a la superficie de los glóbulos rojos. En otras modalidades, la modificación es la unión no covalente del compuesto inactivador del patógeno en la superficie de los glóbulos rojos.

Como se describe en la presente, en algunas modalidades de cada uno de los métodos, una reacción secundaria indeseada (también referida en la presente como "indeseada") del compuesto inactivador del patógeno con los glóbulos rojos se reduce. En algunas modalidades, la reacción secundaria indeseada que se reduce es la modificación de la superficie de los glóbulos rojos a través del compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el nivel de la reacción secundaria se reduce en por lo menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%. La disminución en la reacción secundaria puede demostrarse, por ejemplo, midiendo la cantidad de unión a los glóbulos rojos tratados de anticuerpos específicos al compuesto inactivador del patógeno y/o viviendo la vida útil de los glóbulos rojos tratados in vivo, y comparando estas mediciones con los glóbulos tratados por un segundo, diferente método (por ejemplo, un método sin suficiente extintor y/o base adicionada a la mezcla de reacción, un método en el cual no se adiciona un extintor y/o base a la mezcla de reacción, y/o un tratamiento a un pH inferior. Por ejemplo, en algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, el nivel de anticuerpos del compuesto inactivador anti-patógeno que se une a los glóbulos rojos tratados se disminuye en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%, con relación a un segundo método (por ejemplo, un método sin suficiente extintor y/o base adicionados a la mezcla de reacción, un método en el cual no se adiciona y/o base a la mezcla de reacción, y/o tratamiento a un pH inferior) .

En algunas modalidades, después de la mezcla del compuesto inactivador del patógeno y el extintor con la composición de glóbulos rojos, el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 8.5, aproximadamente 6.0 a 7.5, aproximadamente 6.5 a 7.1, aproximadamente 6.5 a 7.0, aproximadamente 6.6 a 6.8, o aproximadamente 6.6, 6.7, 6.8, o 6.9. Ya que el pH en la composición de glóbulos rojos puede cambiar con el tiempo, se desea que el pH esté en un intervalo deseado cuando el extintor se adiciona a la composición de glóbulos rojos, ya sea sí o no ya contiene el compuesto inactivador del patógeno. Los métodos de la presente invención involucran la adición de un compuesto de inactivación de patógeno de un extintor a la composición de glóbulos rojos. El intervalo de pH deseado es necesario después de la adición tanto del compuesto inactivador del patógeno como del extintor, independientemente del orden de adición del compuesto inactivador del patógeno y/o extintor a la composición de glóbulos rojos. En otras palabras, una vez que los tres componentes han sido mezclados, el pH está dentro del intervalo deseado. En algunas modalidades, el extintor se adiciona antes del compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno se adiciona antes del extintor. En algunas modalidades, el extintor y el compuesto inactivador del patógeno se adicionan esencialmente de manera simultánea. De esta forma, después de la adición del compuesto inactivador del patógeno y el extintor significa el punto en donde ambos el extintor y el compuesto inactivador del patógeno se han mezclado con la composición de glóbulos rojos. El pH deseado puede lograrse a través de varios medios, y no está limitado a cuando el pH de la composición de los glóbulos rojos de ajusta, o en algunas modalidades, no se ajusta significativamente del pH natural del producto sanguíneo. Por ejemplo, el pH deseado de la composición de glóbulos rojos puede lograrse ajustando el pH. El ajuste del pH puede hacerse, por ejemplo, mediante la adición de una solución aditiva adecuada, tal como una solución reguladora de pH, antes de la adición del compuesto inactivador del patógeno y el extintor. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos puede lavarse una o más veces con un regulador de pH adecuado antes de suspenderlo en el mismo regulador de pH u otro regulador de pH adecuado. Alternativamente, el pH de la composición de glóbulos rojos puede ajustarse simultáneamente con la adición de ya sea el compuesto inactivador del patógeno, el extintor, o ambos. En algunas modalidades, el pH se ajusta simultáneamente con la adición del extintor. En algunas modalidades, el extintor se neutraliza, de tal forma que la adición del extintor neutralizado proporciona el intervalo de pH deseado en la composición de glóbulos rojos. Como un ejemplo, la neutralización de glutationa puede utilizarse para efectuar los ajustes de pH necesarios. En algunas modalidades, puede utilizarse un nivel apropiado de neutralización de la glutationa, por ejemplo, a través de la adición de un equivalente de base, para proporcionar un extintor el cual, después de la adición a la composición de glóbulos rojos, proporcionará el ajuste de pH necesario de la composición. La neutralización apropiada dependerá del extintor utilizado. Por ejemplo, cuando se utiliza un péptido puede depender de los componentes de aminoácido del péptido. En algunas modalidades, se puede utilizar un extintor que no afecte significativamente el pH de la composición de glóbulos rojos. Por ejemplo, el uso de un péptido que comprende una cisteína que puede además comprender uno o más aminoácidos que dan como resultado un pH más neutral para una solución del péptido naturalmente aislado. En algunas modalidades, el péptido además comprende por lo menos un aminoácido básico, tal como arginina o lisina.

En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, cuando se mezcla una base la composición de glóbulos rojos junto con el compuesto inactivador del patógeno y el extintor para aumentar el pH de la mezcla a un nivel deseado y/o mejorarla extinción de las reacciones secundarias indeseadas, la base es una sal básica. La sal básica puede primero disolverse en una solución acuosa antes de mezclarse con la composición de glóbulos rojos. En otras modalidades, la sal puede adicionarse directamente a la composición de glóbulos rojos en forma sólida. En algunas modalidades, la sal básica comprende el extintor y proporciona que se mezclen tanto el extintor como la base. En algunas modalidades, la base utilizada en el método es una base fuerte, tal como NaOH. Típicamente, una base fuerte como NaOH se disolverá primero en una solución acuosa antes de mezclar con la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, la base fuerte (por ejemplo, en forma de solución o sólida) se mezcla con el extintor antes de mezclar el extintor con la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, la base es un regulador de pH básico (adicionado en cantidades suficientes y que tiene un pKa apropiado para llevar la mezcla a un intervalo de pH deseado) . Si se utiliza un regulador de pH básico, el regulador de pH, en algunas modalidades, será un regulador de pH farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el regulador de pH tendrá un protón titulable con un pKa en el intervalo de aproximadamente 7 a 8. Los Ejemplos de reguladores de pH que pueden utilizarse como reguladores de pH básicos incluyen, pero no se limitan a ácido N- (2 -hidroxietil ) -piperazin-N' -2- etansulfónico (HEPES) , salina regulada en su pH con fosfato (PBS) , y regulador de pH de fosfato de sodio. Otros reguladores de pH básicos adecuados se identificarán fácilmente por un experto en la técnica.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, el pH de la mezcla de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y cualquier base adicionada es mayor de aproximadamente 5.5, mayor de aproximadamente 5.7, mayor de aproximadamente 6.0, mayor de aproximadamente 6.3, mayor de aproximadamente 6.5, mayor de aproximadamente 6.7, mayor de aproximadamente 7.0, o mayor de aproximadamente 7.2. En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, el pH de la mezcla de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y la base (si se adiciona a cualquiera) ) está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 8.5, aproximadamente 6.0 a 7.5, aproximadamente 6.5 a 7.1, aproximadamente 6.5 a 7.0, o aproximadamente 6.6 a 6.8, o aproximadamente 6.6, 6.7, 6.8, o 6.9. En algunas modalidades, el pH indicado es el pH a temperatura ambiente. En algunas modalidades, el pH indicado es el pH a 37 °C. Por ejemplo, en algunas modalidades, la composición que comprende los glóbulos rojos se trata con el compuesto inactivador del patógeno en la presencia del extintor y cualquier base adicionada, en donde el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.0 (ó 7.1) t 37 °C.

En algunas modalidades, el pH de la mezcla de glóbulos rojos, el extintor, y la base (si se adiciona base como parte del método) está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 8.5, aproximadamente 6.0 a 7.5, aproximadamente 6.5 a 7.1, aproximadamente 6.5 a 7.0, o aproximadamente 6.6 a 6.8, o aproximadamente 6.5, 6.7, 6.8, o 6.9, antes de mezclar el compuesto inactivador del patógeno con la composición de glóbulos rojos. En algunas modalidades, el pH se logra al mismo tiempo que o dentro de aproximadamente 1 hora, dentro de aproximadamente 30 minutos, dentro de aproximadamente 20 minutos, dentro de aproximadamente 10 minutos, dentro de aproximadamente 5 minutos, o dentro de aproximadamente 2 minutos del mezclado del compuesto inactivador del patógeno con la composición que comprende los glóbulos rojos. En algunas modalidades de los métodos en donde el pH se ajusta, el pH se ajusta a un intervalo de pH deseado antes, al mismo tiempo de que, o dentro de aproximadamente 1 hora, dentro de aproximadamente 30 minutos, dentro de aproximadamente 20 minutos, dentro de aproximadamente 10 minutos, dentro de aproximadamente 5 minutos, o dentro de aproximadamente 2 minutos del mezclado del compuesto inactivador del patógeno con la composición que comprende los glóbulos rojos. En esas modalidades, en donde el extintor es glutationa y el compuesto inactivador del patógeno es S-303, el pH de la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos y el extintor que preferiblemente se ajusta a un intervalo de pH deseado (por ejemplo, pH 6.5 a 7.0) antes de mezclar S-303 con la composición de glóbulos rojos.

En algunas modalidades, el pH resultante de la composición después mezclar los glóbulos rojos, el extintor, y la base, no necesariamente se ajusta el pH de la composición de glóbulos rojos de partida. Por ejemplo, una composición de glóbulos rojos puede tener un pH en el intervalo deseado de 6.0-7.5, y el pH de la composición no cambia significativamente en la adición del extintor, y posteriormente el compuesto inactivador del patógeno. En tales modalidades, el extintor ya sea naturalmente proporciona el pH deseado, o se neutraliza correspondientemente para proporcionar el pH deseado. Es la combinación de la adición de cantidades altas iniciales del extintor, tales como aproximadamente 5 mM a aproximadamente 40 mM, con un pH resultante en el intervalo deseado lo que es importante. Los métodos conocidos que utilizan tales concentraciones de glutationa, por ejemplo, no se han utilizado con el intervalo de pH deseado junto con otros aspectos de la presente invención. De esta forma, para péptidos, independientemente del extintor de péptido, pueden efectivamente neutralizarse según sea necesario para proporcionar un intervalo de pH adecuado cuando se adiciona a una composición de glóbulos rojos y además puede seleccionarse para proporcionar una cantidad adecuada del regulador de pH en el intervalo de pH deseado. Es decir, un extintor neutralizado significa que el extintor se titula adecuadamente con ácido o base según sea necesario de tal forma que en la adición a la composición de glóbulos rojos la mezcla resultante tiene un pH que proporciona una mejor extinción de la reacciones secundarias indeseadas (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno a la superficie RBC que puede conducir a una respuesta inmunitaria indeseada, mientras se evita la deshidratación celular durante la inactivación, tal como un pH en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 8.5, aproximadamente 6.0 a 7.5, aproximadamente 6.5 a 7.0, aproximadamente 6.5 a 7.1, o aproximadamente 6.6 a 6.8, o aproximadamente 6.6, 6.7, 6.8, o 6.9. En algunas modalidades, el péptido se aisla naturalmente, se neutraliza adecuadamente, es decir, no requiere la adición de un ácido o base para proporcionar el pH deseado en la mezcla final. Además, los extintores preferidos proporcionarán capacidad reguladora de pH para mantener el pH en el intervalo deseado durante un tiempo necesario para extinguir las reacciones secundarias indeseadas.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, el extintor se neutraliza. Un extintor se dice que se "neutraliza" a través de una base, si una cantidad suficiente de la base ha sido combinada con el extintor, de tal forma que la extinción de una reacción secundaria indeseada entre el compuesto inactivador del patógeno y los glóbulos rojos se mejora en una mezcla que comprende la composición que comprende los glóbulos rojos, el compuesto inactivador del patógeno y el extintor. Un "extintor neutralizado" no necesariamente tiene un pH neutral, y tampoco necesariamente está sin cargar. En algunas modalidades, el extintor neutralizado no está ni en su forma más protonada, ni en su forma más desprotonada . En algunas modalidades, cuando el extintor es muy ácido, el pH del extintor neutralizado aún puede ser inferior de 7.0 (por ejemplo, aproximadamente 6.6, 6.7, 6.8, o 6.9). En algunas modalidades, el pH de la solución del extintor neutralizado puede mayor de 7.0. En algunas modalidades, el pH de la solución del extintor neutralizado será detectablemente mayor que el del extintor antes de la adición de la base. En algunas modalidades, el extintor se neutraliza con al menos aproximadamente 0.25 equivalentes, -al menos aproximadamente 0.5 equivalentes, al menos aproximadamente 0.75 equivalentes, al menos aproximadamente 1 equivalente, al menos aproximadamente 1.25 equivalentes, al menos aproximadamente 1.5 equivalentes, o al menos aproximadamente 2 equivalentes de una base. En algunas modalidades, el extintor se neutraliza con menos de aproximadamente 2 equivalentes, menos de aproximadamente 1.5 equivalentes, menos de aproximadamente 1.25 equivalentes, menos de aproximadamente 1 equivalente, o menor de aproximadamente 0.75 equivalentes de una base. En algunas modalidades, el extintor se neutraliza con aproximadamente 0.25 a aproximadamente 2 equivalentes, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5 equivalentes , o aproximadamente 0.75 a aproximadamente 1.25 equivalentes de base. En algunas modalidades, el extintor se neutraliza con aproximadamente 0.75 equivalente de base. En otras modalidades, el extintor se neutraliza con aproximadamente 1 equivalente de base. En otras modalidades, el extintor se neutraliza con aproximadamente 1.25 equivalente de base. Por ejemplo, en algunas modalidades de la invención, la glutationa se neutraliza con aproximadamente 1 equivalente de una base adecuada, tal como hidróxido de sodio. En este caso, una solución de la glutationa protonada tiene un pH de aproximadamente 3, una solución neutralizada con 1 equivalente de hidróxido de sodio tiene un pH de aproximadamente 4.5, y una solución neutralizada con 2 equivalentes de hidróxido sodio tiene un pH de aproximadamente 9.5. Cualquier extintor de péptido apropiado que comprende por lo menos una cisteína puede adecuadamente ajustarse para proporcionar el pH después de la adición a la composición de glóbulos rojos.

Los métodos apropiados para neutralizar glutationa y otros extintores serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. En algunas modalidades, se utiliza hidróxido de sodio para neutralizar o parcialmente neutralizar el extintor. En algunas modalidades, los gránulos sólidos de NaOH primero se disuelven en agua para genera una solución concentrada de la base. Tal como soluciones de 1 N, 5 N, 10 N, ó 20 N de NaOH. En algunas modalidades, una cantidad apropiada de esa solución de NaOH después se adiciona al extintor ya sea antes de, al mismo tiempo, o después de la adición del extintor en la mezcla. Alternativamente, el NaOH se adiciona a la composición de glóbulos rojos o al compuesto inactivador del patógeno, o la combinación de los dos, antes de la adición del extintor a la mezcla.

Además de proporcionar un extintor que tiene un pH adecuadamente ajustado o neutralizado, en algunas modalidades, los extintores preferidos no son capaces de significativamente entrar en los patógenos, de tal forma que óptimamente extinguen las reacciones indeseadas en el entorno extracelular, pero no interfieren con la inactivación del patógeno una vez que el contexto inactivador del patógeno ha penetrado dentro del patógeno.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos descritos en la presente, el extintor es un compuesto ácido. En algunas modalidades, el extintor es provisto en la forma de ácido libre. En algunas modalidades, el extintor es ácido y al menos aproximadamente 1 equivalente de base se adiciona para neutralizar el extintor. Una solución que comprende el extintor neutralizado puede ser, en algunos casos, básico, neutral, o aún ácida. En algunas modalidades, aproximadamente 1 equivalente de base se adiciona para neutralizar o parcialmente neutralizar el extintor. En algunas modalidades, se adicionan aproximadamente 2 equivalentes de base. En algunas modalidades, el extintor es ácido y aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5 equivalentes de base se utilizan para neutralizar el extintor. En algunas modalidades, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 1.25 equivalentes de base se utilizan. En algunas modalidades, se utiliza aproximadamente 1 equivalente de base.

En algunas modalidades, el extintor se neutraliza antes de la adición a la composición de glóbulos rojos y/o el compuesto inactivador del patógeno. En otras modalidades, el extintor se neutraliza después de combinar el extintor con ya sea la composición de glóbulos rojos y/o el compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el pH del extintor neutralizado antes de la adición a la composición de glóbulos rojos y/o compuesto inactivador del patógeno está en el intervalo de aproximadamente 2.5 a 7.5, aproximadamente 3.0 a 6.5, aproximadamente 3.5 a 5.5, aproximadamente 4.0 a 5.0, o aproximadamente 4.3 a 4.5, o aproximadamente 4.4.

En algunas modalidades, el. extintor es glutationa y se proporciona en la forma de una sal monosódica de glutationa y se neutraliza con aproximadamente 1 equivalente de base, o no se neutraliza con base. En algunas modalidades, el extintor es glutationa y se proporciona en la forma de la sal de clorhidrato de glutationa y se neutraliza con aproximadamente 1 equivalente de base .

En algunas modalidades de cada uno de los métodos descritos en la presente, la concentración inicial del extintor en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y cualquier base adicionada que se eleva durante un periodo de inactivación, y después se reduce a una concentración menor después del periodo de inactivación. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor es adecuada para suficientemente reducir las reacciones secundarias indeseadas del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno a la superficie RBC) , después se reduce a una concentración menor para reducir suficientemente la afección adversa de la vitalidad (por ejemplo, fragilidad osmótica y deshidratación) y/o la vida útil durante el almacenamiento de la célula.

La invención abarca cualquier número de métodos de uso para reducir la concentración del extintor, después del periodo de inactivación del patógeno. En algunas modalidades, la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) se reduce a través de centrifugación de la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor y el compuesto inactivador del patógeno, seguido por la eliminación del sobrenadante de la mezcla, después de la adición de una solución fresca, tal como una solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución aditiva descrita en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) para la resuspensión de la células (por ejemplo, a través del lavado de la célula) . El procedimiento de ' centrifugación, de eliminación del sobrenadante y la adición de una solución fresca (por ejemplo, cualquier solución aditiva en la Tabla 2, y/o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato y/o manitol) , puede, en algunas modalidades, repetirse durante 1, 2, 3, 4, ó 5 o más veces adicionales. En algunas modalidades, el método utilizado para reducir la concentración del extintor se automatiza. En algunas modalidades, la solución fresca no comprende el extintor o comprende una concentración menor del extintor. En algunas modalidades, la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) se reduce desactivando químicamente el extintor. En algunas modalidades, la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) se reduce a través de la adsorción en un procedimiento de eliminación por lotes o flujo o exclusión de tamaño en un proceso de flujo utilizando membranas (por ejemplo, membranas de fibra hueca o membranas de diálisis) , o gránulos de exclusión de tamaño. En algunas modalidades, el extintor no se reduce y/o no se pone en contacto con un dispositivo de adsorción (CAD) .

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y cualquier base adicionada es mayor de aproximadamente 2 mM, mayor de aproximadamente 4 mM, mayor de aproximadamente 6 mM, mayor de aproximadamente 8 mM, mayor de aproximadamente 10 mM, mayor de aproximadamente 15 mM, o mayor de aproximadamente 20 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor inicial en la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 100 mM, aproximadamente 2 mM a 40 mM, aproximadamente 4 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 30 mM, o aproximadamente 10 mM a 30 mM, o hasta 2 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, o 100 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor inicial en la mezcla es de aproximadamente 20 mM.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla of glóbulos rojos, el extintor, y el compuesto inactivador del patógeno es mayor de aproximadamente 2 mM, mayor de aproximadamente 4 mM, mayor de aproximadamente 6 mM, mayor de aproximadamente 8 mM o mayor de aproximadamente 10 mM, y el pH de la mezcla es mayor de aproximadamente 5.5, mayor de aproximadamente 5.7, mayor de aproximadamente 6.0, mayor de aproximadamente 6.3, mayor de aproximadamente 6.5, mayor de aproximadamente 6.7, mayor de aproximadamente 7.0, o mayor de aproximadamente 7.2. En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, la concentración inicial del extintor en la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 40 mM, aproximadamente 4 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 30 mM, o aproximadamente 10 mM a 30 mM, o aproximadamente 20 mM, y el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 8.5, aproximadamente 6.0 a 7.5, aproximadamente 6.5 a 7.1, aproximadamente 6.5 a 7.0, o aproximadamente 6.6 a 6.8, o aproximadamente 6.6, 6.7, 6.8, o 6.9. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor en la mezcla es mayor de aproximadamente 2 mM, mayor de aproximadamente 4 mM, mayor de aproximadamente 6 mM, mayor de aproximadamente 8 mM o mayor de aproximadamente 10 mM, y el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 8.5, aproximadamente 6.0 a 7.5, aproximadamente 6.5 a 7.1, aproximadamente 6.5 a 7.0, o aproximadamente 6.6 a 6.8, o aproximadamente 6.6, 6.7, 6.8, o 6.9. En algunas modalidades, la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM, y el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 7.5. En algunas modalidades, la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 20 mM, y el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.5 a 7.0 (ó 7.1).

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base adicionada después del periodo de inactivación se reduce en más de 2 veces, o 3 veces, o 4 veces, o 5 veces, o 6 veces, o 7 veces, o 8 veces, o 9 veces, o 10 veces, o 15 veces, o 20 veces, o 25 veces, o 30 veces, o 35 veces, o 40 veces, o 50 veces, o 100 veces, o 500 veces, o 1000 veces, con relación a la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, la concentración disminuida del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base agregada después del periodo de inactivación es menos de aproximadamente 15 mM, menos de aproximadamente 10 mM, menos de aproximadamente 8 mM, menos de aproximadamente 6 mM, menos de aproximadamente 5 mM, menos de aproximadamente 4 mM, menos de aproximadamente 3 mM, menos de aproximadamente 2 mM, menos de aproximadamente 1 mM, menos de aproximadamente 0.75 mM, menos de aproximadamente 0.5 mM, o menor de aproximadamente 0.25 mM. En algunas modalidades, la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 20 mM, aproximadamente 2 mM a 15 mM, aproximadamente 3 mM a 10 mM, aproximadamente 4 mM a 8 mM, o aproximadamente 5 mM a 6 mM. En algunas modalidades, la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación esta a una concentración de hasta aproximadamente 0.25 mM, o 0.5 mM, o 0.75 mM, o 1 mM, o 1.5 mM, o 2 mM, o 3 mM, o 4 mM, o 5 mM, o 6 mM, o 7 mM, o 8 mM, o 9 mM, o 10 mM, o 12.5 mM, o 15 mM, o 20 mM.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base adicionada es mayor de 2 mM, mayor de aproximadamente 4 mM, mayor de aproximadamente 6 mM, mayor de aproximadamente 8 mM o mayor de aproximadamente 10 mM, y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación es menos de aproximadamente 15 mM, menos de aproximadamente 10 mM, menos de aproximadamente 8 mM, menos de aproximadamente 6 mM, menos de aproximadamente 5 mM, menos de aproximadamente 4 mM, menos de aproximadamente 3 mM, menos de aproximadamente 2 mM, menos de aproximadamente 1.5 mM, menos de aproximadamente 1 mM, menos de aproximadamente 0.75 mM, menos de aproximadamente 0.5 mM, o menor de aproximadamente 0.25 mM. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 100 mM, aproximadamente 2 mM a 40 mM, aproximadamente 4 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 30 mM, o aproximadamente 10 mM a 30 mM, o aproximadamente 20 mM, y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 20 mM, aproximadamente 2 mM a 15 mM, aproximadamente 3 mM a 10 mM, aproximadamente 4 mM a 8 mM, o aproximadamente 5 mM a 6 mM. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) está en el intervalo de aproximadamente 10 mM a 30 mM, y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 15 mM. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) es de aproximadamente 20 mM, y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 4 mM a 8 mM.

En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor (por ejemplo, glutationa) , el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base adicionada es mayor de 2 mM, mayor de aproximadamente 4 mM, mayor de aproximadamente 6 mM, mayor de aproximadamente 8 mM o mayor de aproximadamente 10 mM; el pH de la mezcla es mayor de aproximadamente 5.5, mayor de aproximadamente 5.7, mayor de aproximadamente 6.0, mayor de aproximadamente 6.3, mayor de aproximadamente 6.5, mayor de aproximadamente 6.7, mayor de aproximadamente 7.0, o mayor de aproximadamente 7.2; y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación es menos de aproximadamente 15 mM, menos de aproximadamente 10 mM, menos de aproximadamente 8 mM, menos de aproximadamente 6 mM, menos de aproximadamente 5 mM, menos de aproximadamente 4 mM, menos de aproximadamente 3 mM, menos de aproximadamente 2 mM, menos de aproximadamente 1.5 mM, menos de aproximadamente 1 mM, menos de aproximadamente 0.75 mM, menos de aproximadamente 0.5 mM, o menor de aproximadamente 0.25 mM. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 100 mM, aproximadamente 2 mM a 40 mM, aproximadamente 4 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 30 mM, o aproximadamente 10 mM a 30 mM, o aproximadamente 20 mM; el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 8.5, aproximadamente 6.0 a 7.5, aproximadamente 6.5 a 7.0, aproximadamente 6.5 a 7.1, o aproximadamente 6.6 a 6.8, o aproximadamente 6.6, 6.7, 6.8, o 6.9; y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 20 mM, aproximadamente 2 mM a 15 mM, aproximadamente 3 mM a 10 mM, aproximadamente 4 mM a 8 mM, o aproximadamente 5 mM a 6 mM. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) está en el intervalo de aproximadamente 10 mM a 30 mM; el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 7.5; y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 15 mM. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) es de aproximadamente 20 mM; el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.5 a 7.0 (o 7.1); y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 4 mM a 8 mM .

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, el periodo de tiempo entre el punto de la adición del extintor a la concentración inicial y el punto de reducción de la concentración del extintor a una concentración disminuida en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y cualquier base adicionada es suficiente para reducir las reacciones secundarias indeseadas del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno a la superficie RBC que puede conducir a una respuesta inmunitaria indeseada) . En algunas modalidades, el periodo de tiempo es suficiente para reducir las reacciones secundarias indeseadas del compuesto inactivador del patógeno y para evitar o reducir la deshidratación celular durante el procedimiento de inactivación.

En algunas modalidades, el periodo de tiempo entre el punto de la adición del extintor a la concentración inicial y el punto de reducción de la concentración del extintor a una concentración disminuida en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y cualquier base adicionada es mayor de, aproximadamente igual a, o menor que 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, o 50 horas. En algunas modalidades, el periodo de tiempo es de aproximadamente 1 a 96 horas, o aproximadamente 1 a 72 horas, o aproximadamente 1 a 48 horas, o aproximadamente 10 a 30 horas, o aproximadamente 15 a 25 horas, o aproximadamente 20 horas.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) en la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base adicionada es mayor de 2 mM, mayor de aproximadamente 4 mM, mayor de aproximadamente 6 mM, mayor de aproximadamente 8 mM, mayor de aproximadamente 10 mM, o mayor de aproximadamente 15 mM; la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación es menos de aproximadamente 25 mM, menos de aproximadamente 20 mM, menos de aproximadamente 15 mM, menos de aproximadamente 10 mM, menos de aproximadamente 8 mM, menos de aproximadamente 6 mM, menos de aproximadamente 5 mM, menos de aproximadamente 4 mM, menos de aproximadamente 3 mM, menos de aproximadamente 2 mM, menos de aproximadamente 1.5 mM, menos de aproximadamente 1 mM, menos de aproximadamente 0.75 mM, menos de aproximadamente 0.5 mM, o menor de aproximadamente 0.25 mM; y el periodo de tiempo entre el punto de la adición del extintor a la concentración inicial y el punto de reducción de la concentración del extintor a una concentración disminuida es mayor de, aproximadamente igual a, o menor que 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, o 50 horas.

En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 100 mM, aproximadamente 2 mM a 40 mM, aproximadamente 4 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 40 mM, aproximadamente 5 mM a 30 mM, o aproximadamente 10 mM a 30 mM, o aproximadamente 20 mM; la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 20 mM, aproximadamente 2 mM a 15 mM, aproximadamente 3 mM a 10 mM, aproximadamente 4 mM a 8 mM, o aproximadamente 5 mM a 6 mM; y el periodo de tiempo entre el punto de la adición del extintor a la concentración inicial y el punto de reducción de la concentración del extintor a una concentración disminuida es de aproximadamente 1 a 96 horas, o aproximadamente 1 a 72 horas, o aproximadamente 1 a 48 horas, o aproximadamente 10 a 30 horas, o aproximadamente 4 a 30 horas, o aproximadamente 10 a 25 horas, o aproximadamente 15 a 25 horas, o aproximadamente 20 horas.

En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) está en el intervalo de aproximadamente 10 mM a 30 mM; la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 15 mM; y el periodo de tiempo entre el punto de la adición del extintor a la concentración inicial y el punto de reducción de la concentración del extintor a una concentración disminuida es de aproximadamente 10 a 30 horas. En algunas modalidades, la concentración inicial del extintor (por ejemplo, glutationa) es de aproximadamente 20 mM; y la concentración disminuida del extintor en la mezcla después del periodo de inactivación está en el intervalo de aproximadamente 4 mM a 8 mM; y el periodo de tiempo entre el punto de la adición del extintor a la concentración inicial y el punto de reducción de la concentración del extintor a una concentración disminuida es de aproximadamente 15 a 25 horas. En algunas de estas modalidades, el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.5 a 7.0 (ó 7.1) . En otras de estas modalidades, el pH de la mezcla está en el intervalo de aproximadamente 6.0 a 7.5.

En cualquiera de estas modalidades, la temperatura de la mezcla que comprende la composición de glóbulos rojos y el extintor durante el periodo de tiempo entre el punto de la adición del extintor a la concentración inicial y el punto de reducción de la concentración del extintor a una concentración disminuida está a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 1°C a 30°C, también aproximadamente 18°C a 25°C, o aproximadamente 37 °C, o aproximadamente temperatura ambiente .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para tratar una composición de glóbulos rojos que comprende: a) proporcionar i) un compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, una cantidad efectiva de un compuesto inactivador de patógeno para inactivar un patógeno, si está presente) que comprende un enlazador frágil que enlaza un grupo de mostaza y un ligando de unión de ácido nucleico (por ejemplo, S-303) , ii) un extintor (por ejemplo, una cantidad efectiva de un extintor) que comprende un grupo tiol, en donde el tiol es capaz de reaccionar con el grupo electrófilo reactivo del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, glutationa) , iii) una composición que comprende glóbulos rojos, y iv) una base adecuada (por ejemplo, NaOH) ; b) mezclar el compuesto inactivador del patógeno, el extintor, y una base adecuada con la composición que comprende glóbulos rojos; y c) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla (por ejemplo, después 10, 28, ó 42 días a 4°C), con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor. En algunas modalidades, la mezcla comprende aproximadamente 0.5 a 1.5 equivalentes de base (o aproximadamente 0.75 a 1.25 equivalentes), en donde un equivalente significa una cantidad molar que es equivalente a la cantidad molar del extintor en la mezcla, y/o la mezcla resultante del paso (b) tiene un pH a 37 °C de aproximadamente 6.0 a 7.5 (o aproximadamente 6.5 a 7.0, ó 7.1). En algunas modalidades, la base del paso (a) tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel del anticuerpo del compuesto inactivador anti -patógeno que se une a la composición de glóbulos rojos tratada en la mezcla resultante en por lo menos aproximadamente 5% (o al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%) con relación a la mezcla en la base. En algunas modalidades, la concentración del extintor es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM (o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 25 mM) y/o el extintor en la mezcla resultante del paso (c) está a una concentración menor de aproximadamente 10 mM (o menor de aproximadamente 6 mM, o menor de aproximadamente 2 mM) . En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno es la mezcla resultante del paso (b) es de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 5 mM y/o es suficiente para inactivar por lo menos 1 log (ó 3 log) de un patógeno en la composición de glóbulos rojos, si están presente. En algunas modalidades, el tiempo entre el paso (b) y el paso (c) es de aproximadamente 1 a 48 horas (ó 15 a 25 horas) . En algunas modalidades, a las 20 horas después del paso (b) , los glóbulos rojos (RBC) de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo (ABC) menor de 65% comparado con el valor ABC de los glóbulos rojos del mismo método bajo las mismas condiciones, pero sin el uso de base y/o tienen un promedio ABC menor de aproximadamente 50,000 (o entre aproximadamente 25,000 y 70,000), y/o tienen menos de 1% de hemolisis después del paso (c) (o después de almacenamiento durante 28 o 42 días a 4°C) y/o tienen un Volumen Celular Empacado (PCV) mayor de 50% después del paso (c) (o después de almacenamiento durante 28 o 42 días a 4°C) y/o tienen un Valor de Fragilidad Corpuscular Media mayor de 140 (ó 150) después 28 (ó 42) días a 4°C después del paso (c) . En algunas de estas modalidades, la disminución de la concentración del extintor en el paso (c) comprende la eliminación de la solución utilizada durante la inactivación y la adición de una solución aditiva final (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente, tal como SAG-M, AS-5, cualquier solución de las Tablas 2, 3, ó 4, o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato, y/o manitol) .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para tratar una composición de glóbulos rojos que comprende (a) mezclar (i) un compuesto inactivador de patógeno (por ejemplo, una cantidad efectiva de un compuesto inactivador de patógeno para inactivar un patógeno, si está presente) que comprende un grupo funcional que es, o que forma, un grupo electrófilo reactivo (por ejemplo, S-303) ; (ii) un extintor (por ejemplo, una cantidad efectiva de un extintor) que comprende un grupo tiol (por ejemplo, glutationa) , en donde el tiol es capaz de reaccionar con el grupo electrófilo reactivo del compuesto inactivador del patógeno; (iii) una composición que comprende glóbulos rojos; y (iv) una base adecuada (por ejemplo, NaOH) , y; (b) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla (por ejemplo, después 10, 28, ó 42 días a 4°C) a la concentración original del extintor. En algunas modalidades, la mezcla comprende aproximadamente 0.5 a 1.5 equivalentes de base (o aproximadamente 0.75 a 1.25 equivalentes), en donde un equivalente significa una cantidad molar que es equivalente a la cantidad molar del extintor en la mezcla, y/o la mezcla resultante del paso (a) tiene un pH a 37 °C de aproximadamente 6.0 a 7.5 (o aproximadamente 6.5 a 7.0, o 7.1) . En algunas modalidades, la base del paso (a) tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel del anticuerpo del compuesto inactivador anti-patógeno que se une a la composición de glóbulos rojos tratada en la mezcla resultante en por lo menos aproximadamente 5% (o al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 90%) con relación a la mezcla en la base. En algunas modalidades, la concentración del extintor es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM (o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 25 mM) y/o el extintor en la mezcla resultante del paso (b) está a una concentración menor de aproximadamente 10 mM (o menor de aproximadamente 6 mM, o menor de aproximadamente 2 mM) . En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno es la mezcla resultante del paso (a) es de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 5 mM y/o es suficiente para inactivar por lo menos 1 log (ó 3 log) de un patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente. En algunas modalidades, el tiempo entre el paso (a) y el paso (b) es de aproximadamente 1 a 48 horas (ó 15 a 25 horas). En algunas modalidades, a las 20 horas después del paso (a) , los glóbulos rojos (RBC) de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo (ABC) menor de 65% comparado con el valor ABC de los glóbulos rojos del mismo método bajo las mismas condiciones, pero sin el uso de base y/o tienen un ABC promedio menor de aproximadamente 50,000 (o entre aproximadamente 25,000 y 70,000), y/o tienen menos de 1% de hemolisis después del paso (b) (o después de almacenamiento durante 28 ó 42 días a 4°C) y/o tienen un Volumen Celular Empacado (PCV) mayor de 50% después del paso (b) (o después de almacenamiento durante 28 ó 42 días a 4°C) y/o tienen un Valor de Fragilidad Corpuscular Media mayor de 140 (ó 150) después 28 (ó 42) días a 4°C después del paso (b) . En algunas de estas modalidades, la disminución de la concentración del extintor en el paso (b) comprende la eliminación de la solución utilizada durante la inactivación y la adición de una solución aditiva final (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente, tal como SAG-M, AS-5, cualquier solución de las Tablas 2, 3, ó 4, o una solución aditiva que comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, guanosina, citrato, y/o manitol) .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para reducir la deshidratación en glóbulos rojos, que comprende: a) proporcionar una composición de glóbulos rojos que comprende i) un extintor (por ejemplo, glutationa) , en donde el extintor es capaz de reaccionar con un compuesto inactivador del patógeno, y ii) glóbulos rojos; y b) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor (por ejemplo, después 10, 28, ó 42 días a 4°C) . En algunas modalidades, el extintor en la mezcla resultante del paso (b) está a una concentración menor de aproximadamente 10 mM (o menor de aproximadamente 6 mM, o menor de aproximadamente 2 mM) . En algunas modalidades, los glóbulos rojos (RBC) de la mezcla resultante tienen menos de 1% de hemolisis después del paso (b) (o después de almacenamiento durante 28 ó 42 días a 4°C) y/o tienen un Volumen Celular Empacado (PCV) mayor de 50% después del paso (b) (o después de almacenamiento durante 28 ó 42 días a 4°C) y/o tienen un Valor de Fragilidad Corpuscular Media mayor de 140 (ó 150) después 28 (ó 42) días a 4°C después del paso (b) .

Los métodos de la invención incluyen el uso ex vivo de un compuesto inactivador de patógeno y un extintor. El uso ex vivo involucra el uso de compuestos para el tratamiento de una composición de glóbulos rojos, fuera de un humano, mamífero, o vertebrado viviente, en donde el material biológico tratado es previsto para utilizarse dentro de un humano, mamífero, o vertebrado viviente. Por ejemplo, la eliminación de sangre de un humano, y la introducción de un compuesto en esa sangre para inactivar los patógenos, se define como un uso ex vivo del compuesto si la sangre es prevista_para la reintroducción en el humano u otro humano. La reintroducción de la sangre humana es ese humano u otro humano sería el uso in vivo de la sangre, según opuesto al uso ex vivo del compuesto. Si el compuesto aún está presente en la sangre cuando se reintroduce en el humano, entonces el compuesto, además de su uso ex vivo se también se introduce in vivo. Algunas modalidades de la presente invención involucran el uso ex vivo de un extintor, en donde la composición de glóbulos rojos es prevista para uso in vivo. En algunos casos, algún nivel del extintor permanece en la composición de glóbulos rojos de tal forma que el extintor también se introduce in vivo. El uso in vitro de un material o compuesto involucra un uso del material del compuesto fuera de un humano, mamífero o vertebrado viviente, en donde el material o compuesto no es previsto a la reintroducción en el humano, mamífero o vertebrado viviente. Un ejemplo de un uso in vitro podría ser el análisis de diagnóstico de los componentes de la muestra de glóbulos rojos. Los métodos de la invención pueden aplicarse al uso in Vitro de las composiciones de glóbulos rojos, como modificaciones de los glóbulos rojos u otros constituyentes que pueden afectar el análisis in Vitro de los componentes de la muestra sanguínea. De esa forma, los métodos de la invención pueden proporcionar seguridad en el manejo de tales muestras in Vitro con extinción adecuada de modificaciones de la muestra que por el contrario podrían interferir con la prueba de diagnóstico de la muestra.

Las soluciones aditivas, que incluyen sales y/o soluciones reguladas en pH, pueden utilizarse con los métodos y las composiciones de glóbulos rojos descritos en la presente. Por ejemplo, un regulador de pH seleccionado (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita en las Tablas 2, 3, y/o 4) pueden adicionarse a la composición de glóbulos rojos antes de, durante, y/o después del periodo de inactivación y/o en el momento en que se disminuye la concentración del extintor. , Métodos de Inactivación Utilizando Glóbulos Rojos Empacados En algunas modalidades, los glóbulos rojos empacados (pRBC) (por ejemplo, glóbulos rojos que carecen de solución aditiva y/o tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 70 a 90%, o aproximadamente 75 a 85%, o aproximadamente 80%) se someten a un método de inactivación descrito en la presente (por ejemplo, un método en donde la composición comprende aproximadamente 20 mM GSH con aproximadamente 1 equivalente de base y aproximadamente 0.2 mM de S-303) , después se someten a (en algunos casos, se conservan con) una solución aditiva (por ejemplo, SAG-M, AS- 5, o cualquier solución descrita en la presente o en la Tabla 2) . Los ejemplos de soluciones aditivas se muestran en la Tabla 2 y se describen en la presente. En algunas de estas modalidades, la solución aditiva (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente o en la Tabla 2) se adiciona a la composición de glóbulos rojos que comprende el extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y cualquier base adicionada, de aproximadamente 5 minutos a 20 horas después de la adición del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, S-303) y/o el extintor (por ejemplo, GSH) . En algunas modalidades, la solución aditiva se adiciona a la composición RBC de aproximadamente 5 minutos a 10 horas, o aproximadamente 5 minutos a 5 horas, o aproximadamente 5 minutos a 60 minutos, o aproximadamente 5 minutos a 30 minutos, o aproximadamente 10 minutos a 20 minutos, o aproximadamente 15 minutos después de la adición del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, S-303) y/o el extintor (por ejemplo, GSH) . En algunas modalidades, la concentración del extintor se disminuye como se describe en la presente después de la adición de la solución aditiva (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita en la presente en la Tabla 2) . Por ejemplo, los pRBC pueden tratarse con un método de inactivación descrito en la presente (por ejemplo, tratamiento en donde la composición comprende aproximadamente 20 mM GSH, aproximadamente 1 equivalente de base, y aproximadamente 0.2 mM de S-303) , después se trata con una solución aditiva (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita en la presente o en la Tabla 2) en un tiempo especificado después la adición del compuesto inactivador del patógeno y/o el extintor (tal como aproximadamente 5 minutos a 5 horas, o aproximadamente 10 minutos a 20 minutos, o aproximadamente 15 minutos) , seguido por la disminución de la concentración del extintor como se describe en la presente (por ejemplo, a menos de aproximadamente 10 mM, o menos de aproximadamente 5 mM) . En algunas de estas modalidades, la disminución de la concentración del extintor comprende la eliminación de la solución del tratamiento y/o solución aditiva, seguido por la adición de una solución aditiva final (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita en la presente o en la Tabla 2) para proporcionar una composición de glóbulos rojos que tiene, por ejemplo, un hematocrito en el intervalo aproximadamente 50 a 70%, o aproximadamente 55 a 65%, o aproximadamente 60%. En algunas modalidades, la concentración del ión de cloruro en la composición de glóbulos rojos antes de y/o durante la inactivación es menor de o mayor de aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 90 mM, aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 60 mM, o. aproximadamente 50 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 20 mM, aproximadamente 10 mM, o entre aproximadamente 25 y 250 mM, o aproximadamente 40 y 100 mM, o aproximadamente 50 y 75 mM, 0 aproximadamente 60 y 70 mM, o aproximadamente 65 mM.

En algunas modalidades, la solución aditiva referida en la presente (por ejemplo, la solución aditiva administrada antes de y/o después de la disminución de la concentración del extintor) comprende uno o más de los siguientes componentes: dextrosa, adenina, guanosina, manitol, citrato (por ejemplo, citrato sódico) , ácido cítrico, fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) y cloruro (por ejemplo, de cloruro de sodio) . En algunas modalidades, la concentración de dextrosa de la solución aditiva y/o la concentración final de dextrosa en la composición RBC después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) está a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas modalidades, la concentración de adenina de la solución aditiva y/o la concentración final de adenina en la composición RBC después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) está a una concentración de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 5 mM, o aproximadamente 0.75 mM a aproximadamente 3 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2.5 mM. En algunas modalidades, la concentración de guanosina de la solución aditiva y/o la concentración final de guanosina en la composición RBC después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) está a una concentración de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 5 mM, o aproximadamente 0.75 mM a aproximadamente 3 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2.5 mM, o aproximadamente 1.5 mM a aproximadamente 2 mM. En algunas modalidades, la concentración de manitol de la solución aditiva y/o la concentración final de manitol en la composición BC después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) está a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 45 mM. En algunas modalidades, la concentración de. citrato (por ejemplo, citrato sódico) de la solución aditiva y/o la concentración final de citrato en la composición RBC después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) está a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades, la concentración de fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) de la solución aditiva y/o la concentración final de fosfato en la composición RBC después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) está a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 3 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 4 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de la solución aditiva y/o la concentración final de cloruro en la composición RBC después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) es menor de o mayor de aproximadamente 500 mM, o aproximadamente 250 mM, o aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 100 mM, aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 25 a aproximadamente 250 mM, o aproximadamente 40 a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 60 a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 125 mM a aproximadamente 175 mM, o aproximadamente 150 mM.

En algunas modalidades, la solución aditiva referida en la presente (por ejemplo, la solución aditiva administrada antes de y/o después de la disminución de la concentración del extintor) y/o la composición RBC final después del intercambio (por ejemplo, antes de la transfusión) comprende 10 mM a aproximadamente 150 mM (o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 90 mM) de dextrosa, 0.5 mM a aproximadamente 5 mM (o aproximadamente 0.75 mM a aproximadamente 3 mM) de adenina, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM (o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM) de manitol, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM (o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM) de citrato (por ejemplo, citrato sódico) , aproximadamente 3 mM a aproximadamente 75 mM (o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM) de fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) , y aproximadamente 50 a aproximadamente 250 mM, o (aproximadamente 100 a aproximadamente 175 mM) de cloruro.

Tabla 2: Soluciones Aditivas Ilustrativas AS-1 AS-3 SAG-M Eritrosol AS-5 PAGGS-M MAP Dextrosa 111.0 55.5 45.4 81.1 45.4 47.5 36.4 (mM) Adenina 2.0 2.2 1.3 1.6 2.2 1.4 1 (mM) Guanosina 1.44 (mM) Manitol 41.2 28.8 42.5 28.8 55 80 (mM) Citrato de 20 26.6 5.1 Sodio Dihidratado (mM) Na2HP04 17 8 AS-1 AS-3 SAG-M Eritrosol AS-5 PAGGS-M HAP (mM) Na2P04 20 4.7 8 6 (mM) NaCl 154.0 70 150 150 72 85 (mM) Acido 2 1 Cítrico (mM) Osmolaridad 276 359 175 351 296 (mOsm) Métodos de Inactivación Utilizando Glóbulos Rojos Diluidos Las composiciones de glóbulos rojos descritas en la presente pueden diluirse antes de la inactivación. El sometimiento de los glóbulos rojos a un diluyente puede disminuir la concentración de las especies disueltas (por ejemplo, sales tal como Cl") a un nivel que es adecuado para la inactivación con métodos descritos en la presente. Los ejemplos de soluciones diluyentes se describen en la presente y se muestran en la Tabla 3. En algunas modalidades, los glóbulos rojos no empacados (por ejemplo, glóbulos rojos que tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 50 a 70%, o aproximadamente 55 a 65%, o aproximadamente 60% y opcionalmente que comprende SAG-M u Optisol) se someten a una solución diluyente (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente o en la Tabla 3) antes de un método de inactivación descrito en la presente (por ejemplo, un método en donde la composición comprende aproximadamente 20 mM GSH con aproximadamente 1 equivalente base y aproximadamente 0.2 mM de S-303), seguido por la disminución de la concentración del extintor como se describe en la presente (por ejemplo, a menos de aproximadamente 10 mM, o menor de aproximadamente 5 mM) . En algunas de estas modalidades, la disminución de la concentración del extintor comprende la eliminación de la solución del tratamiento (por ejemplo, una solución de tratamiento diluida) seguido por la adición de una solución aditiva final (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita anteriormente o en la Tabla 2) para proporcionar, por ejemplo, una composición de glóbulos rojos que tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 50 a 70%, o aproximadamente 55 a 65%, o aproximadamente 60%) . En algunas modalidades, la concentración del ión de cloruro en la composición de glóbulos rojos se diluye a menos de o mayor de aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 90 mM, aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 50 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 20 mM, aproximadamente 10 mM, o entre aproximadamente 25 y 250 mM, o aproximadamente 40 y 100 mM, o aproximadamente 50 y 75 mM, o aproximadamente 60 y 70 mM, o aproximadamente 65 mM antes de la inactivación. En algunas modalidades, la cantidad (en volumen) de la solución diluyente adicionada a la solución RBC está entre aproximadamente 0.2 y 2 veces, o aproximadamente 0.3 y 1.5 veces, o aproximadamente 0.4 y 1 vez, o aproximadamente 0.5 y 0.75 veces la cantidad de la solución RBC. En algunas de estas modalidades, la composición de glóbulos rojos se diluye con una solución diluyente (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente o en la Tabla 3) a un nivel de hematocrito en el intervalo de aproximadamente 30 a 50%, o aproximadamente 35 a 45%, o aproximadamente 40%.

En algunas modalidades, la solución diluyente referida en la presente comprende uno o más de los siguientes componentes: dextrosa, adenina, manitol, citrato (por ejemplo, citrato sódico), ácido cítrico, fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) y cloruro (por ejemplo, de cloruro de sodio) . En algunas modalidades, la concentración de dextrosa de la solución diluyente y/o la concentración final de dextrosa en la composición RBC después de la dilución con la solución diluyente está a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 60 mM . En algunas modalidades, la concentración de adenina de la solución diluyente y/o la concentración final de adenina en la composición RBC después de la dilución con la solución diluyente es de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 5 mM, o aproximadamente 0.75 mM a aproximadamente 3 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2.5 mM. En algunas modalidades, la concentración de manitol de la solución diluyente y/o la concentración final de manitol en la composición RBC después de la dilución es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 35 mM . En algunas modalidades la concentración de citrato (por ejemplo, citrato sódico) de la solución diluyente y/o la concentración final de citrato en la composición RBC después de la dilución con la solución diluyente es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 35 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM. En algunas modalidades, la concentración de fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) de la solución diluyente y/o la concentración final de fosfato en la composición RBC después de la dilución con la solución diluyente es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 3 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 4 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de la solución diluyente y/o despué de la dilución con la solución diluyente es menor de o mayo de aproximadamente 500 mM, o aproximadamente 250 mM, o aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 20 mM, aproximadamente 10 mM o aproximadamente 25 a aproximadament 250 mM, o aproximadamente 40 a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 50 a aproximadamente 75 mM, o aproximadament 60 a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 125 mM a aproximadamente 175 mM.

En algunas modalidades, la solución diluyente referida en la presente y/o la composición RBC después de la dilución con la solución diluyente comprende 10 mM a aproximadamente 150 mM (o de aproximadamente 35 mM a aproximadamente 65 mM) dextrosa, 0.5 mM a aproximadamente 5 mM (o aproximadamente 0.75 mM a aproximadamente 3 mM) adenina, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM (o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM) de manitol, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 75 mM (o aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM) de citrato (por ejemplo, citrato sódico) , aproximadamente 3 mM a aproximadamente 75 mM (o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM) de fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) , y aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mM, o (aproximadamente 10 a aproximadamente 25 mM) de cloruro.

En algunas modalidades, los glóbulos rojos no empacados se someten a una solución diluyente (por ejemplo, cualquier solución descrita anteriormente o en la Tabla 3) antes de un método de inactivación descrito en la presente, seguido por la disminución de la concentración del extintor como se describe en la presente, después se trata con una solución aditiva final (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita anteriormente o en la Tabla 2) para proporcionar una composición RBC adecuada para utilizarse (por ejemplo, adecuada de transfusión) . En algunas modalidades, la solución aditiva final puede ser cualquier solución aditiva descrita en la presente, por ejemplo, una solución aditiva en donde la concentración de cloruro (y/o la concentración final de cloruro en la composición RBC después del intercambio, tal como antes de la transfusión) es menor de aproximadamente 500 mM, o aproximadamente 250 mM, o aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 100 mM, aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 25 mM, o entre aproximadamente 25 y 250 mM, o aproximadamente 40 y 100 mM, o aproximadamente 50 y 75 mM, o aproximadamente 60 y 70 mM, o aproximadamente 100 y 200 mM, o aproximadamente 125 mM y 175 mM, o aproximadamente 150 mM.

Tabla 3 : Soluciones Diluyentes Ilustrativas DS DS DS DS DS DS DS DS DS DS DS DS DS 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 23 Dextrosa 55 55 55 55 55 45.4 45.4 45.4 45.4 45.4 45.4 45.4 (nM) Menina/ 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 Menina Ha (trM) anitol 55 55 55 55 55 28.8 28.8 28.8 28.8 28.8 28.8 (ttM) Citrato 20 20 33.5 33.5 33.5 20 20 20 20 20 de Sodio deshidrat ado o anhidro (itM) Na;¡HP04 20 15 33.5 12.7 3.5 16.2 20 (rrM) NaH2P04 33.5 33.5 3.5 12.7 16.2 (ITM) NaCl (nM) 15 20 OsttDlari- 180 178 128 177 179 287 243 215 227 179 174 181 dad (nOsm) pH 6.9 7.6- 8.61 8.38 6.28 6.29 8.77 7.48 6.63 8.62 8.7 7.5 8.0 Métodos de Inactivación Utilizando Glóbulos Rojos Empacados reconstituidos En algunas modalidades, los glóbulos rojos empacados (pRBC) (por ejemplo, glóbulos rojos que tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 70 a 90%, o aproximadamente 75 a 85%, o aproximadamente 80%) se someten a una solución de tratamiento antes de conducir el método de inactivación descrito en la presente (por ejemplo, un método en donde la composición comprende aproximadamente 20 mM GSH con aproximadamente 1 equivalente de base y aproximadamente 0.2 mM S-303) . Los ejemplos de soluciones de tratamiento se muestran en la Tabla 4. En algunas modalidades, la solución de tratamiento (por ejemplo, cualquier solución descrita en la Tabla 4) se adiciona a los pRBC antes de la adición del extintor, el compuesto inactivador del patógeno, y cualquier base adicionada. En algunas de estas modalidades, la composición pRBC se trata con una solución de tratamiento que resulta de glóbulos rojos no empacados (por ejemplo, glóbulos rojos que tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 50 a 70%, o aproximadamente 55 a 65%, o aproximadamente 60%) . En algunas modalidades, (a) una solución de tratamiento se adiciona a pRBC, (b) un método de inactivación descrito en la presente (por ejemplo, un método en donde la composición comprende de aproximadamente 20 mM de GSH con aproximadamente 1 equivalente de base y aproximadamente 0.2 mM de S-303) se conduce, y (c) la concentración del extintor se disminuye como se describe en la presente (por ejemplo, a menos de aproximadamente 10 mM, o menor de aproximadamente 5 mM) . En algunas de estas modalidades, el paso (c) comprende la eliminación de la solución del tratamiento y la adición de una solución aditiva final (por ejemplo, cualquier solución descrita en la presente, tal como SAG- , AS-5 o cualquier solución de las Tablas 2, 3, ó 4) para proporcionar, por ejemplo, una composición de glóbulos rojos tienen un hematocrito en el intervalo de aproximadamente 50 a 70%, o aproximadamente 55 a 65%, o aproximadamente 60%. En algunas de estas modalidades, la concentración del ión de cloruro en la composición de glóbulos rojos antes de y/o durante la inactivación es menor de o mayor de aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 90 mM, aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 50 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 20 mM, aproximadamente 10 mM, o entre aproximadamente 25 y 250 mM, o aproximadamente 40 y 100 mM, o aproximadamente 50 and 75 mM, o aproximadamente 60 y 70 mM, o aproximadamente 65 mM.

En algunas modalidades, la solución de tratamiento referida en la presente comprende uno o más de los siguientes componentes: dextrosa, adenina, manitol, citrato (por ejemplo, citrato sódico) , ácido cítrico, fosfato (por ejemplo, Na2HP0 y/o NaH2P0 ) y cloruro (por ejemplo, de cloruro de sodio) . En algunas modalidades, la concentración de dextrosa de la solución del tratamiento y/o la concentración de dextrosa en la solución aditiva después de la eliminación de la solución del tratamiento en la composición RBC es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 50 mM a aproximadamente 60 mM. En algunas modalidades, la concentración de adenina de la solución del tratamiento y/o la concentración de adenina en la solución aditiva después de la eliminación de la solución del tratamiento en la composición RBC es de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 5 mM, o aproximadamente 0.75 mM a aproximadamente 3 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2.5 mM. En algunas modalidades, la concentración de manitol en la solución de tratamiento y/o la concentración de manitol en la solución aditiva después de la eliminación de la solución del tratamiento en la composición RBC es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 30 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM. En algunas modalidades, la concentración de citrato (por ejemplo, citrato sódico) en la solución de tratamiento y/o la concentración de citrato en la solución aditiva después de la eliminación de la solución del tratamiento en la composición RBC es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 7.5 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 15 mM. En algunas modalidades, la concentración de fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) en la solución de tratamiento y/o la concentración de fosfato en la solución aditiva después de la eliminación de la solución del tratamiento en la composición RBC es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 2 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 3 mM a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 4 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM. En algunas modalidades, la concentración de cloruro en la solución de tratamiento y/o la concentración de cloruro en la solución aditiva después de la eliminación de la solución del tratamiento en la composición RBC es de aproximadamente 250 mM, o aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 120 mM, o aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 90 mM, o aproximadamente 80 mM, o aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 60 mM, o aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 20 mM, aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 25 a aproximadamente 250 mM, o aproximadamente 40 a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 a aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 60 a aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 125 mM a aproximadamente 175 mM.

En algunas modalidades, la solución de tratamiento y/o la solución aditiva después de la eliminación de la solución del tratamiento en la composición RBC comprende de 10 mM a aproximadamente 150 mM (o aproximadamente 35 mM a aproximadamente 65 mM) de dextrosa, 0.5 mM a aproximadamente 5 mM (o aproximadamente 0.75 mM a aproximadamente 3 mM) de adenina, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 150 mM (o aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM) de manitol, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 75 mM (o aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM) de citrato (por ejemplo, citrato sódico) , aproximadamente 3 mM a aproximadamente 75 mM (o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM) de fosfato (por ejemplo, Na2HP04 y/o NaH2P04) , y aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mM, o (aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mM) de cloruro.

Tabla 4: Soluciones de Tratamiento Ilustrativas Sol 1 Sol 2 Sol 3 Sol 4 Sol 5 Dextrosa (mM) 45.4 45.4 45.4 45.4 45.4 Adenina/HCl de 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 Adenina (mM) Manitol (mM) 55 44.5 44.5 44.5 30 Citrato de Sodio 12 12 12 dihidratado o anhídrido (raM) Na2HP04 (mM) 15 NaH2P04 (mM) NaCl (mM) 70 60 60 60 70 Osmolaridad (mOsm) pH (ajustado 7 6.5 6.5 con ácido cítrico) Eficacia del Método de Evaluación Además de comparar la inactivación log como se explicó anteriormente, la eficacia de los métodos de extinción mejorados puede evaluarse a través de otros métodos, como se describe en la publicación de Patente de E. U. A. No. 2006/0115466, el contenido de la cual se incorpora por referencia en su totalidad. Por ejemplo, los métodos de extinción pueden evaluarse mediante la evaluación de la medición de la composición de glóbulos rojos en términos de la función, morfología y el estado de la hidratación de los glóbulos rojos, y en términos de la reactividad de los glóbulos rojos tratados con el sistema inmunitario, tal como con anticuerpos. Si la composición de glóbulos rojos tratados es prevista para uso humano, tal como infusión, los métodos de extinción sustancialmente no deberán dañar la función celular de los glóbulos rojos (por ejemplo, a través de deshidratación) . La falta de un efecto sustancialmente dañino en la función de los glóbulos rojos puede medirse a través de métodos conocidos en la técnica para probar la función de los glóbulos rojos. En particular, los niveles de deshidratación pueden medirse, por ejemplo, a través del hematocrito (volumen celular empacado, PCV) , fragilidad osmótica, concentración hemoglobina corpuscular media (MCHC) , porcentaje de hemolisis, y ectacitometría . Los niveles de otros indicadores de función, tales como ATP ( 5 ' -trifosfato de adenosina) , 2,3-DPG (2 , 3-difosfoglicerol) total o potasio extracelular puede medirse y compararse con un control sin tratar. Adicionalmente , el pH intracelular y extracelular, hemoglobina, consumo de glucosa y producción de lactato pueden medirse. Los métodos mejorados de la presente invención pueden compararse con las condiciones previamente descritas del tratamiento en la Publicación de Patente de E. U. A. No. 2006/0115466, (20 mM de glutationa, por ejemplo, completamente extinguidos (2 equivalente base) en combinación con la mezcla de S-303/células de glóbulos rojos sin la reducción de la concentración del extintor después de la incubación descrita en la presente) .

En algunas modalidades de la presente invención, los glóbulos rojos de los métodos y composiciones descritos en la presente tienen un daño mínimo o ningún daño después de tratamiento (por ejemplo, deshidratación, hemolisis, etc.). En algunas modalidades, los glóbulos rojos de la mezcla resultante que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base adicionada (antes o después de la reducción en la concentración del extintor) tiene menos de 4%, o menor que 3%, o menor que 2%, menos de 1% hemolisis, o menor que 0.5% hemolisis. En algunas modalidades, los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen menos de 4%, o menor que 3%, o menor que 2%, o menor que 1%, o menor que 0.5% de hemolisis en el tiempo de aproximadamente 10 días a 4°C, o aproximadamente 28 o 42 días a 4°C, o aproximadamente 42 días a 4°C después de de la reducción en la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) .

En algunas modalidades, los glóbulos rojos de la mezcla resultante que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base adicionada (antes o después de la reducción en la concentración del extintor) tiene más de 50%, o mayor de 55%, o mayor de 60%, o mayor de 65% de volumen celular empacado (PCV) . En algunas modalidades, los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen más de 50%, o mayor de 55%, o mayor de 60%, o mayor de 65% de volumen celular empacado (PCV) en el tiempo de aproximadamente 10 días a 4°C, o aproximadamente 28 o 42 días a 4°C, o aproximadamente 42 días a 4°C después de la reducción en la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) .

En algunas modalidades, los glóbulos rojos de la mezcla resultante que comprende la composición de glóbulos rojos, el extintor, el compuesto inactivador del patógeno y cualquier base adicionada (antes o después de la reducción en la concentración del extintor) tienen una Fragilidad Corpuscular Media (MCF; osmolaridad a la cual ocurre el 50% de hemolisis) mayor de 130, o mayor de 135, o mayor de 140, o mayor de 145, o mayor de 150, o mayor de 155. En algunas modalidades, los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen una Fragilidad Corpuscular Media (MCF) mayor de 130, o mayor de 135, mayor de 140, o mayor de 145, o mayor de 150, o mayor de 155 en el tiempo de aproximadamente 10 días a 4°C, o aproximadamente 28 o 42 días a 4°C, o aproximadamente 42 días a 4°C después de la reducción en la concentración del extintor (por ejemplo, glutationa) .

Los métodos para determinar ATP, 2,3-DPG, glucosa, hemoglobina, hemolisis, y potasio están disponibles en la técnica y se describen en la presente en la sección experimental. Ver' por ejemplo, Davey et al, Transfusión, 32:525-528 (1992), la descripción de la cual se incorpora en la presente. Los métodos para determinar la función de los glóbulos rojos también se describe en Greenwalt et al, Vox Sang, 58:94-99 (1990); Hogman et al, Vox Sang, 65:271-278 (1993); y Beutler et al, Blood, Vol . 59 (1982) la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia. Por ejemplo, el ATP total y 2,3-DPG total pueden medirse utilizando un kit Sigma ATP o un kit 2,3-DPG (Sigma, St . Louis, Mo . ) . El kit ATP puede utilizarse siguiendo el procedimiento No. 366 -UV de Sigma, la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia. El ATP total también puede medirse utilizando un ensayo enzimático con base en luciferasa, o un protocolo descrito por Beutler (1984) . Los niveles de potasio extracelulares pueden medirse utilizando un analizador Modelo 614 K+/Na+ de Ciba Corning (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA) . El pH extracelular puede medirse centrifugando las células a 4°C durante 15 minutos a 12,000 x g y eliminando el sobrenadante, por lo cual el pH puede medirse utilizando un medidor de pH estándar a temperatura ambiente (por ejemplo, electrodo de Beckman, Epoxy Calomel) . Para el pH intracelular, el gránulo restante puede tratarse en el tubo centrífugo y almacenarse aproximadamente a -80 °C durante al menos 2 horas. Esto después se lisa a través de la adición de agua desionizada. La muestra lisada puede mezclarse bien y el pH de la solución puede medirse ya sea a temperatura ambiente utilizando un medidor de pH estándar o a temperatura ambiente utilizando un analizador de gas sanguíneo Modelo 238 Ciba Corning (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA) .

Las mediciones pueden hacerse brevemente después del tratamiento y como una función del almacenamiento posttratamiento, por ejemplo, almacenamiento durante hasta 42 días. Los métodos de la presente invención proporcionan una composición de glóbulos rojos en donde la hemolisis de los glóbulos rojos tratados es menor de 3% después 28 días de almacenamiento, más preferiblemente menos de 2% después 42 días de almacenamiento, y más preferiblemente menos de o igual a aproximadamente 1% después 42 días de almacenamiento a 4°C. En algunas modalidades se proporciona una composición de glóbulos rojos (por ejemplo, una composición de glóbulos rojos utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente) en donde el nivel ATP total puede ser mayor cuando se compara con una composición de glóbulos rojos tratada utilizando 2 mM de glutationa ácida y 0.2 mM de S-303. En algunas modalidades, los métodos extinción descritos en la presente proporcionan composiciones de glóbulos rojos que tienen niveles ATP que son de aproximadamente 20%, también 30%, también 40% o aproximadamente 50% mayores cuando se comparan con las composiciones de métodos utilizando 2 mM de glutationa ácida y 0.2 mM de S-303. En algunas modalidades, el nivel más alto de ATP se mantiene después de 7, 14, 21, 28, 35, ó 42 días de almacenamiento. En algunas modalidades, el nivel mayor de ATP disminuye durante el almacenamiento.

En algunas modalidades de la presente invención, los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen composiciones de glóbulos rojos en donde los glóbulos rojos tienen un número reducido de reacciones secundarias indeseadas del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno a la superficie RBC) . En algunas modalidades, la reacción secundaria es la modificación de la superficie de los glóbulos rojos a través del compuesto inactivador del patógeno. La reducción en la modificación de los glóbulos rojos en los métodos de la presente invención puede evaluarse a través de varios ensayos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la publicación de Patente de E. U. A. No. 2006/0115466, el contenido de la cual se incorpora por referencia. La cuantificación de la unión de acridina a la superficie RBC también puede determinarse utilizando un ensayo citométrico de flujo inmunitario activado por fluorescencia sensible (IFC) descrito en la presente.

Con respecto a los ensayos de detección con fluorescencia, los métodos de extinción de la presente invención, cuando se comparan con el mismo tratamiento sin el uso de base (por ejemplo, métodos que utilizan glutationa neutralizante comparada con los métodos que utilizan glutationa no neutralizada) , puede dar como resultado la reducción de la fluorescencia media en por lo menos 10%, también por lo menos 25%, también por lo menos 50%, también por lo menos 75%, o por lo menos 90%. Por ejemplo, los métodos de extinción de la presente invención utilizando cualquiera de las composiciones descritas con el uso de base (por ejemplo, una composición de glóbulos rojos que comprende aproximadamente 15-25 mM de glutationa, aproximadamente 0.5 a 1.5 equivalente de base, y aproximadamente 0.2 mM de S-303) pueden dar como resultado un nivel inferior de fluorescencia media cuando se compara con una composición idéntica, pero sin el uso de base (por ejemplo, una composición de glóbulos rojos que comprende aproximadamente 15-25 mM de glutationa y aproximadamente 0.2 mM de S-303 sin base) .

El nivel de compuesto inactivador del patógeno unido a la superficie RBC para los métodos de extinción y composiciones de la presente invención también también pude medirse en términos de capacidad de unión del anticuerpo (ABC; el número de moléculas del compuesto inactivador del patógeno o sus derivador por glóbulo rojo, según se determina por el uso de perlas de calibración de Bangs Laboratories, Inc; Fishers, IN; ver Ejemplos 5 y 9) que involucra un anticuerpo anti -acridina monoclonal de ratón conjugado con aloficocianina (APC) y un citómetro de flujo FACS-Caliber (BD Biosciences) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y composiciones de la presente invención, los RBC tienen un valor ABC promedio menor de aproximadamente 75,000, o menor de aproximadamente 70,000, o menor de aproximadamente 60,000, o menor de aproximadamente 55,000, o menor de aproximadamente 52,500, o menor de aproximadamente 50,000, o menor de aproximadamente 47,500, o menor de aproximadamente 45,000, o menor de aproximadamente 42,500, o menor de aproximadamente 40,000, o menor de aproximadamente 37,500, o menor de aproximadamente 35,000, o menor de aproximadamente 32,500, o menor de aproximadamente 30,000, o menor de aproximadamente 27,500, o menor de aproximadamente 25,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un valor ABC promedio de entre aproximadamente 10,000 y 80,000, o entre aproximadamente 20,000 y 70,000, o entre aproximadamente 25,000 y 70,000, o entre aproximadamente 25,000 y 60,000, o entre aproximadamente 30,000 y 50,000, o entre aproximadamente 35,000 y 45,000. En algunas modalidades de los métodos descritos en la presente, cuando se comparan con un tratamiento similar con el extintor y la base (por ejemplo, glutationa neutralizada) , puede dar como resultado un valor ABC menor de 90%, también menor de 75%, también menor de 65%, también menor de 55%, también menor de 45%, también menor de 35%, también menor de 25%, o menor que 10% según comparado con métodos idénticos utilizando la composición RBC que no se trata con base (por ejemplo, glutationa que no se neutraliza) .

Los métodos de extinción de la invención también pueden compararse con métodos existentes determinando el nivel de modificación de los ácidos nucleicos en una muestra. Típicamente, una composición de glóbulos rojos puede contener leucocitos, y el ácido nucleico de los leucocitos puede aislarse. Un compuesto inactivador del patógeno que tiene un isótopo radioactivo el cual, después de la reacción del compuesto con ácido nucleico, permanecerá unido al ácido nucleico. Esto puede utilizarse para evaluar la cantidad del compuesto reaccionado con el ácido nucleico para una variedad de métodos de extinción, y proporciona una medición que puede directamente correlacionarse con la inactivación de leucocito esperada. El número de aductos S-303 formados por 1,000 pares bases de ácido nucleico puede utilizarse como un modelo para evaluar el impacto esperado de los varios métodos en la inactivación del patógeno. Alternativamente, una cantidad adecuada de un patógeno puede adicionarse a una composición de glóbulos rojos y el ácido nucleico del patógeno puede aislarse después del tratamiento. Sin embargo, en este caso la muestra necesita leuco-reducirse de tal forma que los niveles de cualquier leucocito residual no interfieran con la medición del ácido nucleico del patógeno.

Además de proporcionar una inactivación de patógeno adecuado mientras se reducen los niveles de reacciones secundarias indeseadas (por ejemplo, la unión del compuesto inactivador del patógeno a la superficie RBC que puede conducir a una respuesta inmunitaria indeseada) y deshidratación, los métodos de extinción de la presente invención también proporciona, en al menos algunas modalidades, una reducción en la concentración de las especies electrófilas reactivas después de la inactivación del patógeno. Si las composiciones de glóbulos rojos son previstas para infusión, es importante que el nivel de las especies electrófilas reactivas sea tan bajo como sea posible, preferiblemente esencialmente ya no detectable. La presencia de especies electrófilas reactivas puede determinarse utilizando métodos disponibles en la técnica, tales como métodos cromatográficos que incluyen cromatografía liquida-espectroscopia de masa (LC-MS-MS) . Además, la actividad residual de una mezcla puede evaluarse evaluando su habilidad para reaccionar con un residuo de guanina de un ácido nucleico, tal como utilizando el ensayo alquilador general descrito por Mattes (Mattes, WR, Anal. Biochem. 1992 Octubre; 206 (1) : 161-7) . En este ensayo, los RBC se extraen después de un tiempo de incubación adecuado con el compuesto inactivador del patógeno y el extintor. Cualquier compuesto inactivador del patógeno residual, así como el extintor y otras pequeñas especies, se separan de las proteínas. Estas especies después se incuban con un sintetizador de ADN de estructura de cadena doble (ds) con residuos de 8-3H guanina. El compuesto inactivador del patógeno residual reacciona con AND ds en la posición N7 de guanina, que acidifica el residuo 8-H y libera 3H en la solución, en donde puede aislarse y medirse. La cantidad de tritio liberada puede cuantificarse y tiene correlación de 1:1 con la cantidad de alquilador residual presente en las muestras extraídas ensayadas. El nivel de especies electrófilas según determinado por estos métodos puede evaluarse utilizando métodos mejorados de la invención y comparándolos con métodos conocidos.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos descritos en la presente, el método además comprende el paso de reducir la concentración de un compuesto de la mezcla, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste del compuesto inactivador del patógeno y un producto de degradación del compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el método método comprende el paso de reducir la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla. En algunas modalidades, el método comprende el paso de reducir la concentración de las especies electrófilas en la mezcla. La concentración del compuesto inactivador del patógeno en un material biológico, tal como un producto sanguíneo, puede reducirse después del tratamiento, por ejemplo, a través de adsorción en un proceso de eliminación por lotes o flujos. Los métodos y dispositivos que pueden utilizarse se describen en las Patentes de E. U. A. Nos. 6,544,727; 6,331,387; 6,951,713; y 7,037,642; y las Solicitudes de Patente 2002/0192632 (abandonada) y 2001/0009756 (abandonada) , las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Por consiguiente, en algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno se reduce poniendo en contacto la mezcla con un medio de adsorción que comprende partículas adsorbentes que tienen la afinidad para el compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, el sistema de adsorción se configuraría para eliminar el compuesto inactivador del patógeno en un proceso por lote. En algunas modalidades, el compuesto de inactivación de patógeno no se reduce mediante el uso de un dispositivo de adsorción del compuesto. En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla se reduce lavando los glóbulos rojos utilizando técnicas conocidas en la técnica. En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla se reduce eliminado algunas o todas las soluciones de tratamiento (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita en las Tablas 2, 3, y/o 4) a través de métodos descritos en la presente y/o conocidas en la técnica (utilizando centrífugas y dispositivos de expresión o centrífugos y extrusores combinados tales como TACSI hechos por Terumo®) . En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla se reduce eliminando algunas o todas las soluciones del tratamiento (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita en las Tablas 2, 3, y/o 4), seguido por la adición de una solución aditiva (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita en la Tabla 2) a la mezcla. En algunas modalidades, la concentración del compuesto inactivador del patógeno se reduce simultáneamente con una reducción en la concentración del extintor.

Composiciones Sanguíneas Tratadas En algunas modalidades, la invención también proporciona composiciones de glóbulos rojos que resultan de cada uno de los métodos de tratamiento descritos en la presente. En algunas modalidades, la invención también proporciona composiciones de glóbulos rojos que se preparan a través de cada uno de los métodos de tratamiento descritos en la presente. En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende a) glóbulos rojos, en donde los glóbulos rojos reaccionan covalentemente con un grupo electrófilo de un compuesto inactivador de patógeno; y b) un extintor que comprende un grupo tiol que es capaz de reaccionar con el compuesto inactivador del patógeno; en donde la composición es adecuada para infusión en humanos después almacenamiento de 28 o 42 días a 4°C.

En algunas modalidades de cada uno de los métodos y composiciones descritos en la presente, los glóbulos rojos en la composición de glóbulos rojos son glóbulos de mamífero. Por ejemplo, glóbulos rojos pueden ser de roedor (por ejemplo, ratón o rata) , canino, lagomorfo (por ejemplo, conejo) , primate no humano (por ejemplo chimpancé) , o glóbulos rojos de humano. Por ejemplo, En algunas modalidades, los glóbulos rojos son humanos. En algunas modalidades, los glóbulos rojos han sido leuco-reducidos . En otras modalidades, los glóbulos no han sido leuco-reducidos. En algunas modalidades, existe una posibilidad de que la composición comprende glóbulos rojos contaminados con un patógeno. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos está contaminada con un patógeno. En algunas modalidades, por lo menos 1 log, o por lo menos 2 logs, o por lo menos 3 logs, o por lo menos 4 logs del patógeno en la composición se inactivan, si está presente.

En algunas modalidades, la invención abarca composiciones de glóbulos rojos en donde los glóbulos rojos han sido modificados con un compuesto inactivador de patógeno (por ejemplo, S-303) , como se describe en la presente. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos producida por el tratamiento de los métodos comprende productos de degradación del compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, el producto de reacción del extintor con el compuesto inactivador del patógeno) . En algunas modalidades, la modificación de la reacción del grupo electrófilo de un compuesto inactivador de patógeno con la superficie de glóbulos rojos. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno está covalentemente enlazado a la superficie del glóbulo rojo. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno está covalentemente unido a una o más proteínas en la superficie del glóbulo rojo. En algunas modalidades, la modificación es un grupo nucleofilo del glóbulo rojo reaccionado con el grupo electrófilo del compuesto inactivador del patógeno, en donde el grupo electrófilo es un grupo de mostaza y el grupo nucleofilo ha reemplazado uno o más de sus átomos de cloruro con el grupo mostaza. En algunas modalidades, el compuesto inactivador del patógeno no está covalentemente enlazado a la superficie del glóbulo rojo. En algunas modalidades las composiciones RBC tienen un valor ABC promedio menor de 75,000, o menor que 70,000, o menor que 60,000, o menor que 55,000, o menor que 52,500, o menor que 50,000, o menor que 47,500, o menor que 45,000, o menor que 42,500, o menor que 40,000, o menor que 37,500, o menor que 35,000, o menor que 32,500, o menor que 30,000, o menor que 27,500, o menor que 25,000. En algunas modalidades, los RBC tienen un valor ABC promedio de entre aproximadamente 10,000 and 80,000, o entre aproximadamente 20,000 y 70,000, o entre aproximadamente 25,000 y 70,000, o entre aproximadamente 25,000 y 60,000, o entre aproximadamente 30,000 y 50,000, o entre aproximadamente 35,000 y 45,000.

En algunas modalidades, las composiciones de glóbulos rojos comprenden niveles reducidos de modificación en la superficie de los glóbulos rojos a través de los compuestos inactivadores del patógeno, con relación a los glóbulos rojos producidos a través de otros métodos que involucran el tratamiento con el compuesto inactivador del patógeno. En algunas modalidades, la composición de glóbulos rojos producidas por los tratamientos de los métodos descritos en la presente comprenden una cantidad reducida del compuesto inactivador del patógeno que comprende el grupo electrófilo después de la finalización del tratamiento, con relación a la composición de glóbulos rojos producida por otro método que involucra el tratamiento con un compuesto inactivador de patógeno (por ejemplo, un método sin suficiente extintor y/o base adicionados a la mezcla de reacción, un método en el cual no se adiciona un extintor y/o base a la mezcla de reacción, y/o un tratamiento a un pH inferior) . En algunas modalidades, la cantidad de compuesto inactivador de patógeno comprende el grupo electrófilo reactivo en la composición que ha sido reducido en aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproximadamente 50%, aproximadamente 75%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 99%, con relación a la composición tratada por otro método que involucra el compuesto inactivador del patógeno (por ejemplo, un método sin suficiente extintor y/o base adicionados a la mezcla de reacción, un método en el cual no se adiciona extintor y/o base en la mezcla de reacción, y/o un tratamiento a un pH inferior) .

En algunas de estas modalidades, la composición de glóbulos rojos comprende un compuesto extintor residual (por ejemplo, glutationa) . En algunas modalidades, la composición comprende una concentración del extintor suficientemente baja para mantener la vitalidad BC y la vida útil y evitar la deshidratación de los glóbulos rojos y/o reducir la fragilidad osmótica durante el almacenamiento. En algunas modalidades, la composición comprende una concentración del extintor que es suficientemente inferior que una concentración del extintor previamente utilizado en la composición. En algunas modalidades, la concentración más alta del extintor previamente utilizada disminuye la vitalidad RBC y la vida útil y/o aumenta la deshidratación de los glóbulos rojos y disminuye la fragilidad osmótica durante almacenamiento, mientras la concentración inferior es lo suficientemente más baja que una concentración del extintor previamente utilizada en la composición. En algunas modalidades, la concentración del extintor en la composición es menos de aproximadamente 25 mM, menos de aproximadamente 20 mM, menos de aproximadamente 15 mM, menos de aproximadamente 10 mM, menos de aproximadamente 8 mM, menos de aproximadamente 6 mM, menos de aproximadamente 5 mM, menos de aproximadamente 4 mM, menos de aproximadamente 3 mM, menos de aproximadamente 2 mM, o menos de aproximadamente 1 mM. En algunas modalidades, la concentración del extintor en la composición está en el intervalo de aproximadamente 1 mM a 20 mM, aproximadamente 2 mM a 15 mM, aproximadamente 3 mM a 10 mM, aproximadamente 4 mM a 8 mM, o aproximadamente 5 mM a 6 mM.

En algunas modalidades, la composición comprende una solución aditiva (por ejemplo, una solución descrita en la Tabla 2, o una solución que comprende cualquier combinación de los componentes descritos en la Tabla 2). En algunas modalidades, la composición comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, fosfato, y/o manitol. En algunas modalidades, la concentración final del ion de cloruro en la composición RBC (por ejemplo, antes de la transfusión) es menos de aproximadamente 500 mM, o aproximadamente 250 mM, o aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 100 mM, aproximadamente 75 mM, o aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 25 mM, o entre aproximadamente 25 y 250 mM, o aproximadamente 40 y 100 mM, o aproximadamente 50 y 75 mM, o aproximadamente 60 y 70 mM, o aproximadamente 100 y 200 mM, o aproximadamente 125 mM y 175 mM, o aproximadamente 150 mM.

En algunas modalidades, la composición es adecuada para la infusión en un individuo (por ejemplo, un humano) después aproximadamente 2 días, o aproximadamente 5 días, o aproximadamente 10 días, o aproximadamente 15 días, o aproximadamente 20 días, o aproximadamente 28 días, o aproximadamente 35 días, o aproximadamente 42 días de almacenamiento at 4°C.

En algunas de estas modalidades, la composición comprende a) glóbulos rojos que están covalentemente reaccionados con un grupo electrófilo de un compuesto inactivador de patógeno (por ejemplo, S-303) en la superficie celular e i) tienen un Volumen Celular Empacado (PCV) mayor de 60%, y/o ii) tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) de entre aproximadamente 25,000 y 70,000 (o aproximadamente 35,000 y 45,000) y b) un extinguidor de glutationa a concentración menor de aproximadamente 8 mM (o menor de 6 mM, o menor de aproximadamente 2 mM) . En algunas modalidades, por lo menos 3 log (o por lo menos 1 log) de un patógeno se inactiva, si está presente. En algunas modalidades, la composición es adecuada para la infusión en humanos hasta 28 o 42 días de almacenamiento a 4°C.

Jits Además de los métodos mejorados de . extinción, la presente invención proporciona kits desechables para el procesamiento de una composición de glóbulos rojos, en donde el procesamiento puede hacerse manual o automáticamente. En algunas modalidades, la presente invención proporciona kits que comprenden el compuesto inactivador del patógeno, el extintor, y/o una base utilizada en cada uno de los métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, el kit proporciona una solución fresca (tal como regulador de pH para resuspensión de las células) para utilizarse después de la disminución de la concentración del extintor descrito en la presente.

En algunas modalidades, el kit comprende S-303, que incluye cualquiera de sus sales y glutationa neutralizada que incluye de cualquiera de sus sales. S-303 puede estar en forma sólida o en solución. Similarmente , la glutationa neutralizada puede estar forma sólida en solución. Estos sólidos o soluciones además pueden comprender excipientes, adyuvantes, diluyentes o estabilizantes aceptables. En algunas modalidades, S-303 es la sal de clorhidrato y la glutationa neutralizada se neutraliza con aproximadamente 1 equivalente de hidróxido de sodio. En algunas modalidades ,. S-303 y glutationa neutralizada están en forma sólida y el kit además comprende una solución adecuada para disolver S-303 y una solución adecuada para disolver la glutationa neutralizada. En algunas modalidades, la invención proporciona un kit que comprende un compuesto inactivador de patógeno, un extintor y una solución para disolver el extintor, en donde la solución neutraliza o parcialmente neutraliza el extintor. Los métodos y kits explicados en la presente abarcan cualquier formulación farmacéutica adecuada del compuesto inactivador del patógeno y extintor, que pueden formularse como una mezcla o de manera separada. Las formulaciones farmacéuticamente aceptables son conocidas por el experto en la técnica, y los ejemplos de excipiente, adyuvantes, diluyentes o estabilizantes adecuados pueden encontrarse, por ejemplo en Gennaro, ed. , Remington's The Science and Practice de Pharmacy, 20a edición, Lippincott Williams & Wilkins. La invención también incluye las composiciones resultantes de los métodos descritos anteriormente, que comprenden glóbulos rojos, un compuesto inactivador del patógeno y un extintor como se describe anteriormente, en donde la composición está a un intervalo de pH adecuado para efectuar la extinción mejorada del compuesto inactivador del patógeno.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit útil, por ejemplo, para tratar composiciones de glóbulos rojos para inactivar patógenos, que comprende un compuesto inactivador de patógeno que comprende un ligando de unión de ácido nucleico y un grupo funcional que es, o que forma, un grupo electrófilo (incluyendo cualquiera de sus sales) un extintor que comprende un grupo tiol (incluyendo cualquiera de sus sales), y aproximadamente 0.75 a aproximadamente 1.25 equivalentes de base, en donde un equivalente significa una cantidad molar que es equivalente a la cantidad molar del extintor en el kit . En algunas modalidades, el kit comprende aproximadamente 1 equivalente de una base adecuada .

En aún otro aspecto, la invención proporciona un kit para tratar composiciones de glóbulos rojos para inactivar patógenos, que comprende un ligando de unión de ácido nucleico y un grupo funcional el cual es, o que forma, un grupo electrófilo (por ejemplo, S-303) , incluyendo cualquiera de sus sales, un extintor neutralizado que comprende un grupo tiol (por ejemplo, glutationa neutralizada) , incluyendo cualquiera de sus sales, y la solución fresca opcionalmente (tal como un regulador de pH para la resuspensión de las células) para utilizarse después de la disolución de la concentración del extintor descrito en la presente. En algunas modalidades, la solución es una solución aditiva, una solución diluyente, y/o una solución de tratamiento descrito en la presente (por ejemplo, SAG-M, AS-5, o cualquier solución descrita anteriormente o en la Tabla 2, 3, y/o 4) .

Ejemplos, Materiales y Métodos La invención además se ilustra a través de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Preparación del organismo Ejemplos, Materiales, y Métodos Las cepas de bacterias y virus utilizadas para estos estudios fueron aislados clínicos obtenidos de ya sea del California Department of Health Services o la American Type Culture Collection.

Bacteria: Los concentrados operativos congelados de bacterias se inocularon en matraces de 500 mi conteniendo una mezcla de 50% medio de extracto de levadura sin glucosa adicionada en un baño de agua en agitación fijado a 37°C. La bacteria gram positiva se añadió en el producto sanguíneo directamente del cultivo nocturno. Los cultivos nocturnos de bacteria Gram positiva además se sub-cultivaron en una dilución de 1:1000 en medio de cultivo fresco y se incubaron como antes hasta que alcanzaron la fase log como se determina por densidad óptica. Este crecimiento de la fase log se añadió en el producto sanguíneo para experimentos PI .

Virus: Los concentrados virales sin células se prepararon utilizando las líneas celulares apropiadas para cada virus. Estos concentrados se congelaron -80°C hasta que se descongelaron y añadieron directamente en el producto sanguíneo para experimentos PI .

Ejemplo 2: Preparación de unidades de RBC La sangre se recibió en Cerus como unidades de 450 mi o 500 mi de sangre completa ya sea en el día de la recolección o hasta 3 días después de la recolección. En la mayor parte de los casos la sangre completa se leuco- filtró antes de procesarse en unidades de RBC. Las unidades ocasiones no se pueden leuco-filtrar exitosamente (por ejemplo, sangre de donadores con rasgo falciforme) y estas unidades se utilizaron sin leuco-filtración para los estudios PI de organismos que no se sabe si sobreviven dentro de los glóbulos blancos.

Después de la leuco-filtración, la sangre se centrifugó y el plasma se expresó. La solución aditiva de RBC deseada, tal como AS-3 (Nutricel) , después se agregó y la unidad de RBC resultante ya sea se utilizó inmediatamente o se almacenó a 4°C hasta uso.

Ejemplo 3: Inactivación del Patógeno (PI) El procedimiento PI involucra la inoculación de unidades de RBC con un cultivo del organismo a ser ensayado. La concentración objetivo de entrada típica de los organismos en las unidades de RBC fue aproximadamente 106 cfu o pfu/ml de RBC. En la mayor parte de los casos el volumen de organismo (incluyendo cualquier medio de cultivo) fue aproximadamente 1% del volumen de la unidad de RBC y no fue típicamente mayor de 10%. Para evaluar la inactivación de niveles de bacteria fisiológicamente más relevantes, inferiores, se utilizaron entradas de 10 a 10 cfu/unidad. Para estudios con entradas de bajo nivel, se agruparon dos unidades de RBC, se añadieron, después se dividieron en una unidad de ensayo que se trató como se describe en la presente y se agregó una unidad de Control a la cual solamente se agregó un extintor (por ejemplo, GSH) (sin inactivador de patógeno, por ejemplo, S-303) y que se mantuvo bajo las mismas condiciones de temperatura como la unidad de Ensayo .

Después de la adición del organismo en la unidad de RBC, la unidad se mezcló sujetando los extremos del contenedor y moviendo los extremos 10 veces en un movimiento en forma del número ocho o pedal de bicicleta.

Los RBC contaminados se transfirieron al contendor de mezclado del equipo desechable del procedimiento PI de RBC. El equipo consiste de una serie de contenedores de plástico y puertos conectados por una tubería de plástico. El contenedor de mezclado fue un contenedor doble de plástico PL 1813 con capacidad de 600 mi. Conectada a cada uno de los puertos estuvo un equipo de tubería Y con filtros pediátricos Luer adaptados a una punta. La punta sin utilizar en un puerto se conecta con otro contenedor de plástico PL 1813 de 600 mi de capacidad (Contenedor de Incubación) . La otra punta sin utilizar fue la línea utilizada para conectar la unidad de RBC original .

Las soluciones de dosificación se prepararon y agregaron a las unidades como sigue: Se preparó una solución de 600 mM de Glutationa (GSH) con 1 equivalente de NaOH disolviendo 2.8 g de GSH en -12 mi de 0.9% de salina y 0.9 mi de ION de NaOH. El volumen apropiado de la solución GSH se extrajo en una jeringa de 20 mi de capacidad. El volumen utilizado fue típicamente 10 mi de solución GSH por 280 mi de RBC, más una pérdida de línea de 2 mi para generar 20 mM de GSH en la unidad de RBC dosificada. La jeringa conteniendo GSH se conectó al contenedor de mezclado utilizando la punta filtrada que comparte una adaptación Y con la punta conectada al contenedor de incubación. La unidad se colocó en una mecedora para facilitar el mezclado de arriba hacia abajo durante la adición de las soluciones de dosificación. GSH se agregó a la unidad mientras la unidad se mezcla en la mecedora. La unidad después se mezcló manualmente utilizando el método de mezclado del número ocho descrito anteriormente. Después de la adición de GSH las unidades se dejaron reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.

Después del período de reposo, se removió una pequeña muestra de RBC y se cultivó para determinar la concentración de pre-tratamiento . Se utilizaron placas de ensayo estándar para muestras bacterianas y se utilizaron ensayos de cultivo celular para los virus.

Se preparó una solución de 6 mM de clorhidrato de amustalina (S-303) disolviendo 46 mg de S-303 en -15 mi de 0.9% de salina. La dosis apropiada de la solución de S-303 se extrajo en una jeringa de 20 mi. El volumen utilizado fue típicamente de 10 mi de solución S-303 por 280 mi de RBC, más 2 mi de pérdida de línea para generar 0.2 mM de S-303 en la unidad de RBC dosificada. La unidad después se mezcló manualmente utilizando el método de mezclado del número ocho como se describe anteriormente . La unidad de RBC tratada se incubó a temperatura ambiente por un mínimo de 3 horas después de la adición de S-303 para asegurar la finalización de la inactivación del patógeno antes del muestreo para la concentración de post-tratamiento .

A las 3 horas post-PI, las muestras se removieron y cultivaron, como se describe anteriormente, para determinar la concentración post-tratamiento. Para estudios que evalúan la inactivación de una entrada bacteriana de bajo nivel, ambas unidades de Ensayo y Control se incubaron a TA por -20 horas post-tratamiento y después se incubaron a 37°C durante la noche. Después de la incubación a 37°C, las muestras se removieron de cada unidad de Ensayo tratada y de la unidad de Control idéntica sin tratar y se cultivaron para obtener una evaluación cualitativa de la concentración bacteriana. La unidad de Control sin tratar exhibió un crecimiento.

La reducción log para cada unidad se determinó tomando el log de la proporción de la concentración de pre-tratamiento a la concentración de post-tratamiento, en donde las cantidades necesarias se expresaron como lOx de cfu o pfu/ml .

Ejemplo 4: Experimentos de Función in vitro de RBC Las unidades de RBC humanas se prepararon en soluciones aditivas, tales como AS-3 (Nutricel) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las unidades de RBC se trataron con varias concentraciones de GSH para llegar a concentraciones finales en el intervalo de 2 mM a 30 mM. En algunos casos se ajustó el pH de GSH con 1 o 2 equivalentes base con ya sea bicarbonato de sodio o hidróxido de sodio antes del tratamiento. Después del tratamiento con GSH los RBC se trataron S-303, disolvió con 0.9% de cloruro de sodio, para llegar a una concentración de 0.2 mM de S-303 en los RBC, o dosificado simulado con 0.9% de cloruro de sodio. Después del tratamiento, las unidades se incubaron por 20 h a 20-25°C. Después de la incubación algunas unidades se centrifugaron 6 min, a 21°C, 4100 x g, el sobrenadante se expresó se agregaron 100 mi de solución aditiva fresca al RBC. Todas las unidades se colocaron a 4°C después de prepararse en la solución aditiva.

La función in vitro se ensayó a varios puntos en el tiempo a lo largo del tiempo de almacenamiento. El pH extracelular a 37°C se determinó midiendo el pH de los RBC de cada unidad en un analizador de Gas Chiron Diagnostics. El ATP total se midió utilizando un ensayo enzimático basado en luciferasa o un protocolo descrito por Beutler (1984) . Los sobrenadantes sin células se prepararon para evaluar potasio, glucosa, y lactato extracelular. El potasio extracelular se determinó midiendo el contenido de K+ del sobrenadante sin células utilizando un analizador Na/K de Chiron Diagnostics (modelo #614) o analizador similar. La glucosa y lactato extracelulares se evaluaron en un analizador NexCT. Los índices de glóbulos rojos se recolectaron utilizando el analizador de hematología Advia (Siemens) .

Los RBC se lavaron tres veces en 0.9% de cloruro de sodio y se incubaron a un mínimo de 1 hora a TA antes del análisis para fragilidad osmótica y perfiles de densidad. El método utilizado para fragilidad osmótica se describe por Beutler et al., 1982, (Blood Journal 59:1141-1147) y se modificó para un formato de 96 cavidades (Lew et al., 2003, Blood 101:4189-4194) . Las curvas de distribución de densidad se obtuvieron de acuerdo con Danon y Marikovsky, 1964 (J Lab Clin Med 6:668-674), utilizando ésteres de ftalato en tubos de microhematocrito.

Ejemplo 5: Cuantificación del Compuesto Inactivador del Patógeno que se Une a la Superficie RBC El nivel de unión de acridina a la superficie RBC se detectó con un ensayo citométrico de flujo inmune sensible inactivado con fluorescencia (IFC) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-acridina de ratón conjugado a aloficocianina (APC) y un citómetro de flujo FACS-Caliber (BD Biosciences) . En resumen, los RBC se lavaron tres veces en 0.9% de salina y se volvieron a suspender en 4% de hematocrito en regulador de pH de incubación de flujo (HBSS, 1% de BSA, 0.1% de Na 3, 1 mM de EDTA, 3% de BSA) . Después, se agregó el anticuerpo anti-acridina monoclonal de ratón conjugado con ATC y se incubó por 30 minutos a 4°C; las células lavadas en regulador del pH de lavado de flujo (HBSS 1% de BSA, 0.1% de NaN3, 1 mM de EDTA) se volvieron a suspender en el mismo regulador de pH y se evaluó un total de 30,000 eventos en el FACS-Caliber a una activación periódica apropiada. La cuantificación de los números de moléculas S-303 unidas a la superficie celular de los RBC humano (ABC) se realizó utilizando kits de perlas Quantum Simply Cellular (Bang Laboratories, Inc; Fishers, IN) .

Ejemplo 6: Efectos del pH de glutationa en la Hidratación y Función de los RBC Inmediatos y relacionados con el Almacenamiento.

Las unidades RBC se trataron con S-303 (0.2 mM) y GSH (20 mM) a un pH ajustado con NaOH (equivalentes base variables) para potenciar la extinción de GSH. El pH de las soluciones de ensayo probadas fue de 2.9, 4.5, y 8.9 para 0 b.e., 1 b.e., y 2 b.e., respectivamente. Después del tratamiento las RBC se almacenaron a 4°C y ensayaron periódicamente para pH, glucosa, lactato y potasio extracelular, ATP total y hemolisis. Los parámetros físicos de los RBC (MCV, MCH, MCHC, HDW, etc.) se midieron mediante citometría de flujo óptica, las mediciones de fragilidad osmótica se realizaron según Beutler et al., (1982) con la modificación de Lew et al., (2003) .

La exposición de los RBC a GSH alcalino dio como resultado la disminución de Hct con fragilidad osmótica disminuida inmediata y sostenida y una densidad de los RBC aumentada (por ejemplo, ver. Figura 1) . Esta deshidratación inmediata se corrigió disminuyendo los equivalentes base, dando como resultado un pH menor en las soluciones GSH (ver Tabla 5) . Aunque la deshidratación inmediata se perfeccionó, la fragilidad osmótica de los RBC continuó cambiando (Tabla 6; Ejemplos adicionales en Figuras 2 y 3) por la presencia de GSH en una concentración en forma dependiente. La medición de MCHC y la distribución de MCH utilizando citometría de flujo óptica (analizador hematológico Adiva, Siemens) estuvieron correlacionadas con los cambios en la fragilidad osmótica y la densidad. La deshidratación fue independiente de S-303 ya que el efecto también se demostró por pH y GSH en ausencia de S-303.

Tabla 5: Efecto de los niveles de GSH ajustados con base en hidróxido de sodio en hidratación de los RBC inmediatamente después del tratamiento.

Nivel base MCF* Hct MCHC pH de (mOsm) (%) (g/dD sangre Sin tratar 160 62 31 6.743 Dosificación No hecho 56 33 6.759 simulada Dosificada 173 59 31 6.206 (0 b.e. ) Dosificada 156 52 36 6.713 (1 b.e.) Dosificada 142 47 42 7.180 (2 b.e.) * MCF (Fragilidad Corpuscular Media = osmolaridad a la cual ocurre 50% de hemolisis Tabla 6 : Efecto de los equivalentes base de GSH en la hidratación de RBC y función durante almacenamiento MCF (Fragilidad Corpuscular Media) = osmolaridad a la cual ocurre el 50% de la hemolisis ** Días post-dosif icación. Sangre dosificada a los 5 días antigua.

Los cambios en la hidratación de los RBC se correlacionan con GSH, pH y concentración, pero no se correlacionan con S-303 o ensayos bioquímicos (ATP, lactato, glucosa) rutinariamente utilizados para evaluar la función de los RBC. La limitación de la exposición a un alto pH de GSH evitó el efecto de la deshidratación inicial. La limitación de la exposición continua a altos niveles de GSH evitó el efecto de deshidratación en almacenamiento. Estos estudios muestran que la evaluación del estado de hidratación de los RBC almacenados debería incluirse como una forma de pronosticar la calidad de los RBC ya que los cambios sustanciales en la hidratación no tuvieron efecto en el criterio convencional pero pueden haber contribuido al cambio moderado en la vida útil de los glóbulos rojos.

Ejemplo 7: Método de Extinción Mejorado con una Disminución Posterior en los Resultados del Extintor en la Deshidratación de los RBC Disminuida Después del Almacenamiento Las unidades de los RBC se trataron con S-303 (0.2 mM) y GSH (20 mM) con pH ajustado con 1 equivalente de NaOH para potenciar la extinción de GSH. Después del tratamiento con GSH los RBC se trataron con S-303, se disolvieron con 0.9% de cloruro de sodio, para llegar a una concentración de 0.2 mM de S-303 en los RBC, o dosificación simulada con 0.9% de cloruro de sodio. Después del tratamiento, las unidades se incubaron por 20 h a 20-25°C. Después de la incubación algunas unidades se centrifugaron 6 min, a 21°C, 4100 x g, el sobrenadante se expresó y se agregaron 100 mi de solución aditiva fresca a los RBC. Todas las unidades se colocaron a 4°C para almacenamiento. Los controles sin tratar se colocaron a 4°C después de prepararse en solución aditiva. Las mediciones de la fragilidad osmótica del RBC se realizaron según Beutler et al., (1982) con la modificación de Lew et al. , (2003) .

La exposición prolongada del RBC a altas concentraciones de GSH dieron como resultado una densidad del RBC aumentada y una fragilidad osmótica disminuida (por ejemplo, ver Tabla 5, Figures 3 y 4) . Esta deshidratación relacionada con el almacenamiento se corrigió removiendo el GSH antes del almacenamiento del RBC (por ejemplo, ver Figures 4 y 5) . El tiempo y la deshidratación dependiente de concentración de GSH fue independiente de S-303 ya que el efecto también se demostró por GSH en ausencia de S-303 (por ejemplo, ver Figure 6) .

Los cambios en la hidratación estuvieron correlacionados con GSH. La limitación de la exposición a altas concentraciones de GSH mediante el intercambio de la solución de tratamiento por solución aditiva fresca evitó el efecto de deshidratación inducido por el almacenamiento.

Ejemplo 8: Inactivación del patógeno para Métodos de Extinción Mejorados Las unidades RBC leuco-reducidas con hematocrito de aproximadamente 60% se prepararon en medio de almacenamiento AS-3. Las unidades de RBC se inocularon con aproximadamente 6 logs/ml de organismo viable, y se removió una alícuota para servir como el control de entrada, sin tratar. GSH en una solución de 1 equivalente de NaOH se agregó a las unidades inoculadas a una concentración final de 20 mM y se mezcló bien. Se agregó S-303 a una concentración final de 0.2 mM y las unidades se volvieron a mezclar bien e incubaron de 20 a 25°C por tres horas. Después de la incubación, las muestras se removieron y ensayaron para detectar organismos viables residuales. Las muestras de control se titularon inmediatamente después de la preparación y de nuevo después del período de incubación de tres horas. Se realizaron al menos dos duplicados para cada organismo.

Con la excepción de la Pseudomonas, el Gram negativo, Gram positivo y un virus de ejemplo efectivamente se inactivaron mediante el tratamiento con GSH neutralizado con 1 equivalente de NaOH comparado con la neutralización con 2 equivalentes de NaOH (ver Tabla 7) .

La inactivación del patógeno de Pseudomonas aeruginosa utilizando una concentración de inoculación total de hasta 4.4 logs por unidad RBC dio como resultado una inactivación completa.

Tabla 7: Inactivación de patógeno para condiciones de extinción mejoradas contra condiciones previas.

Ejemplo 9: Niveles de Acridina unidos a la superficie para Métodos de Extinción mejorados con Paso de Intercambio El método descrito anteriormente en el Ejemplo 5 se utilizó para determinar la capacidad de unión del anticuerpo anti-acridina a glóbulos rojos tratados con 20 mM de GSH neutralizado con 1 equivalente de NaOH y 0.2 mM de S-303. La capacidad de unión del anticuerpo medida a través de varias preparaciones de RBC fue de aproximadamente 39,000 por glóbulo rojo (ver Figure 7). Este nivel de unión se compara con 18,407+1195 de ABC cuando los RBC se trataron con 20 mM de GSH neutralizado con 2 equivalentes de NaOH y 123, 714+5123ABC cuando los RBC se trataron con 2 mM de GSH ácido.

Ejemplo 10: Inactivación del patógeno con tratamiento con S-303 a Hematocrito Variable (Hct) Las unidades de RBC, de 450 a 500 mi de colecciones WB, se prepararon sin solución aditiva (80% de hematocrito centrifugado (Hct) ) o en solución aditiva (60% de Hct) . Los RBC de leuco-filtraron antes del tratamiento a menos que se indique lo contrario. Las unidades de ensayo a 40% de Hct se diluyeron con una solución diluyente. Las unidades de RBC se inocularon con ya sea una entrada a alto nivel de ~106 organismos/ml o una entrada de bajo nivel de 10 a 105 organismos por unidad. Para la entrada de alto nivel, se removió una muestra de control de 28 mi antes del tratamiento con S- 303. Para la entrada bacteriana de bajo nivel, las unidades de Ensayo y Control se prepararon agrupando y dividiendo las unidades de RBC completas y la unidad de Control se inoculó con -10 organismos por unidad. Las unidades de ensayo con 80% y 60% de Hct se trataron con 200 µ? de S-303 y 20 mM de GSH, neutralizado con un equivalente base de hidróxido de sodio (1 b.e.). Las unidades con 40% de Hct se trataron con 130 uM de S-303 y 13 mM de GSH (1 b.e.) . Las muestras o unidades de Control se trataron con ya sea 20 mM de GSH o 13 mM de GSH (1 b.e.) con base en Hct. Para las unidades con una entrada de alto nivel, las muestras de control se ensayaron para organismos viables en el momento en que se trató la unidad de Ensayo. Después de 3 horas de incubación a TA ambas la unidad de Ensayo y la de Control se ensayaron para organismos viables que se cuantificaron por el crecimiento en placas ricas en agar (bacteria) o mediante el ensayo en placa en células Vero (VSV) . Para unidades con una entrada de bajo nivel, las unidades de Control y Ensayo se incubaron a TA por 20 horas y después a 37°C por -20 horas. Las muestras después se colocaron para detectar el crecimiento bacteriano. Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8 : Datos de la inactivación de patógeno para muestras de valores de hematocrito variables . a La reducción Log se calculó como Log (Concentración sin tratar/concentración post-tratamiento) , con la concentración expresada como 10x/ml b Reducción de patógeno sin leuco-filtración c n=3 d En todos los casos, las unidades de control el nivel de entrada más bajo fueron positivas para crecimiento bacteriano .

Ejemplo 11: Hidratación del RBC después de Tratamiento con S-303 a Hematocrito Variable (Hct) Los RBC se prepararon de sangre completa leuco-reducida a 40% o 60% de Hct, medido por centrifugación de hematocrito, en solución aditiva y a 80% de Hct según como glóbulos rojos empacados. Las unidades se trataron con GSH (sal de sodio, BioMedica Foscama, Italia) y S-303 a una concentración final de 20 m y 0.2 mM respectivamente. Todas las unidades tratadas se incubaron hasta por 20 horas a TA. La solución del tratamiento se reemplazó con SAG-M y las unidades se ajustaron a 60% de Hct para almacenamiento a 4°C. Las unidades de RBC de control se prepararon en SAG-M y almacenaron a 4°C. Todas las unidades se ensayaron periódicamente para parámetros físicos; MCHC se midió manualmente, las mediciones de la fragilidad osmótica se realizaron por medio de métodos estándar (Beutler et al., y Lew et al., 2003). La fragilidad corpuscular media (MCF) se definió como la concentración de NaCl a la cual 50% de los RBC se hemolisaron. El cambio en MCF es un índice de la relación de superficie a volumen (S/V) y la hidratación del RBC durante almacenamiento. Después de aproximadamente 6 semanas de almacenamiento, todas las unidades tratadas tuvieron valores MCF comparables con los controles sin tratar, independientemente del Hct en el tiempo del tratamiento. MCHC, otro índice de la hidratación del RBC, fue similar entres las unidades de Ensayo y Control al final del almacenamiento. Los resultados se muestran en la Tabla 9. El almacenamiento del RBC tratado por hasta 6 semanas no alteró significativamente la hidratación del RBC y S/V sobre un amplio intervalo de Hct utilizado en la práctica de rutina para la preparación de concentrados de RBC.

Tabla 9: Datos de la hidratación para muestras de valores de hematocrito variables .

Ejemplo 12: Calidad in vitro de RBC almacenados después del Tratamiento con S-303 a Hematocrito Variable (Hct) Los RBC se prepararon de sangre completa leuco- reducida a 40% o 60% de Hct, medida por centrifugación de hematocrito, en solución aditiva y a 80% de Hct como glóbulos rojos empacados. Las unidades se trataron con GSH (sal de sodio, BioMedica Foscama, Italia) y S-303 a una concentración final de 20 mM y 0.2 mM respectivamente. Todas las unidades tratadas se incubaron hasta por 20 horas a TA. La solución del tratamiento se reemplazó con SAG-M y las unidades se ajustaron a 60% de Hct para almacenamiento a 4°C. Las unidades de RBC de control se prepararon en SAG-M y almacenaron a 4°C. La función in vitro se ensayó pre- y posttratamiento y a intervalos regulares de hasta 6 semanas en almacenamiento. Los parámetros evaluados para la función del RBC in vitro incluyeron pH; ATP total, hemolisis, y potasio, glucosa y lactato extracelular. Después de aproximadamente 6 semanas (Día 38 a Día 44) en almacenamiento, todas las unidades de Ensayo tuvieron niveles ATP totales mayores de 2 moles de ATP/g Hb y la hemolisis y MCHC fueron comparables con las unidades de Control, independientemente del tratamiento de Hct. A lo largo del almacenamiento la glucosa extracelular de la unidad de Ensayo fue mayor que la de las unidades de Control por 40% y 60% de Hct, mientras las unidades con 80% de Hct fueron más similares al Control. El lactato extracelular fue más bajo en todas las Unidades de ensayo, independientemente del Hct, comparado con el Control. Al final del almacenamiento, el K+ extracelular fue ligeramente inferior en las unidades de ensayo que el Control en unidades de 40% y 60% de Hct, mientras las unidades con 80% de Hct fueron comparables con el Control. El pH de todas las unidades de Ensayo fue similar al del Control en todo el almacenamiento. La hemoglobina producida del procedimiento, independientemente del tratamiento con Hct, cumplió con los requerimientos AABB . La actividad de todos los parámetros metabólicos fue similar al Control después del tratamiento con S-303 por un amplio intervalo de Hct a lo largo de 6 semanas en almacenamiento. Los resultados se muestran en la en Tabla 10.

Tabla 10: Parámetros metabólicos para inactivación de patógeno en RBC a valores de hematocrito variables .

Ejemplo 13: Función in vitro e Inactivación de Patógeno de RBC Diluidos Se prepararon unidades RBC SAG-M de unidades de sangre completa leuco-reducidas de recolecciones de 500 mi. Para los estudios de función del RBC, se agruparon unidades RBC SAG-M por tipo ABO, y se dividieron de unidades de Ensayo y Control comparadas. Antes del tratamiento, se agregaron 150 mi de solución diluyente que comprende 28.8 mM de manitol, 1.3 mM de adenina, 16.2 mM de fosfato de sodio, 20 mM de citrato de sodio, pH 7.5 a las unidades de Ensayo. Las unidades de Ensayo se trataron con una sal sódica de GSH y y S-303 a una concentración final de 20 mM y 0.2 mM respectivamente. Las unidades de Ensayo se incubaron hasta por 20 horas a temperatura ambiente (TA) . Después de la incubación a TA, las unidades se centrifugaron y el sobrenadante se intercambió con 100 mi de SAG-M que se adicionó antes del almacenamiento a 4°C. Las unidades RBC de control se prepararon en SAG-M y se almacenaron a 4°C. Todas las unidades se evaluaron durante aproximadamente 6 semanas de almacenamiento a 4°C muestreando a varios puntos en el tiempo. Para los estudios de inactivación de patógeno RBC, las unidades RBC SAG-M se dividieron a la mitad y las unidades RBC se inocularon con patógenos antes de la adición de la solución de tratamiento y GSH. Después de la adición de la solución de tratamiento y GSH, se removió una muestra de control (5 mi a 7 mi) de la unidad para determinar la concentración de patógeno de entrada y la unidad restante se trató con S-303. Las unidades tratadas se muestrearon para concentración de patógeno viable residual después de una incubación estática de 3 horas a temperatura ambiente .

Los índices metabólico y físico in vitro se evaluaron a varios puntos en el tiempo a lo largo del almacenamiento con ensayos in vitro. El pH extracelular a 37°C se midió en un analizador de Gas Siemens Diagnostics Blood. El ATP total se midió utilizando un ensayo enzimático con base en luciferasa. Los sobrenadantes sin células se prepararon para evaluar el potasio (K+) , glucosa y lactato extracelular. El potasio extracelular se determinó midiendo el contenido de K+ se sobrenadante sin células utilizando un analizador Na/K EasyLyte . La glucosa y el lactato extracelular se evaluaron en un analizador NexCT™. La concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC) y el hematocrito centrifugado se midieron manualmente. Las mediciones de la fragilidad osmótica se realizaron mediante métodos estándar (Beutler et al., y Lew et al., 2003). La fragilidad corpuscular media (MCF) se define como la concentración de NaCl en la cual el 50% de los RBC se hemolisaron.

Para los estudios de inactivación bacteriana, los RBC se inocularon con aproximadamente 6.5 log cfu/ml de E.coli, S. marcescens, 5. aureus, Y. enterocolitica, o P. aeruginosa. Para los estudios de inactivación viral, los RBC se inocularon con aproximadamente 4.1 log pfu/ml a 6.4 log pfu/ml, dependiendo del virus. GSG disuelto en salina se agregó a la unidad a una concentración final de 20 mM. Las concentraciones bacterianas se determinaron mediante la enumeración de unidades formadoras de colonia (cfu) en placas de agar y las concentraciones virales se determinaron mediante la enumeración de unidades formadoras de placa (pfu) en líneas celulares apropiadas. Las muestras sin tratar se diluyeron serialmente antes de la enumeración. Las muestras tratadas no se diluyeron antes de la enumeración de las concentraciones'.

Los resultados mostrados en las Tablas 11 y 12 siguientes demuestran la función metabólica y los parámetros fisiológicos de los RBC aceptables durante el curso de la duración del almacenamiento e . inactivación de patógeno aceptable .

Tabla 11 : Hidratación y parámetros metabólicos para inactivación de patógeno en unidades de RBC diluidas.

N=4 Tabla 12: Datos de inactivación de patógeno para muestras de unidades de RBC diluidas Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1.- Un método para tratar una composición de glóbulos rojos, caracterizado porque comprende: (a) mezclar (i) una cantidad efectiva de un compuesto inactivador de patógeno que comprende un grupo funcional que es, o que forma, un grupo electrófilo reactivo; (ii) una cantidad efectiva de un extintor que comprende un grupo tiol, en donde el tiol es capaz de reaccionar con el grupo electrófilo reactivo del compuesto inactivador del patógeno; y (iii) una composición que comprende glóbulos rojos; y (b) disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor .

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso (a) además comprende mezclar una base adecuada con la composición que comprende glóbulos rojos, y en donde la base tiene una cantidad suficiente para reducir el nivel de una reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos en la mezcla, con relación a la mezcla sin la base.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la reacción indeseada del compuesto inactivador del patógeno con glóbulos rojos es la modificación de la superficie de los glóbulos rojos a través del compuesto inactivador del patógeno.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque la base y el extintor se mezclan con la composición de glóbulos rojos antes de, al mismo tiempo, o no más de aproximadamente 30 minutos después del mezclado del compuesto inactivador del patógeno con la composición de glóbulos rojos.

5. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la base y el extintor se mezclan juntos antes de mezclar ya sea la base o el extintor con la composición de glóbulos rojos.

6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque la base es NaOH.

7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque la base es un regulador de pH básico.

8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, caracterizado porque la base comprende de aproximadamente de 0.5 a 1.5 equivalentes de base, en donde un equivalente significa una cantidad molar que es equivalente a la cantidad molar del extintor en la mezcla.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la base comprende de aproximadamente 0.75 a 1.25 equivalentes de base, en donde un equivalente significa una cantidad molar que es equivalente a la cantidad molar del extintor en el paso (a) de la mezcla.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la base comprende de aproximadamente 1 equivalente de base, en donde un equivalente significa una cantidad molar que és equivalente a la cantidad molar del extintor en el paso (a) de la mezcla.

11. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mezcla resultante del paso (a) tiene un pH a 37 °C de aproximadamente 6.0 a 7.5.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la mezcla resultante del paso (a) tiene un pH a 37 °C de aproximadamente 6.5 a 7.1.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la mezcla resultante del paso (a) tiene un pH a 37 °C de aproximadamente 6.8.

14. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extintor comprende cisteína o un derivado de cisteína.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el extintor es glutationa o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

16. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración del extintor en la mezcla resultante del paso (a) es mayor de 2 mM.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el extintor en la mezcla resultante del paso (a) está a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el extintor en la mezcla resultante del paso (a) está a una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 25 mM.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el extintor en la mezcla resultante del paso (a) está a una concentración de aproximadamente 20 mM .

20. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque la disminución de la concentración del extintor en el paso (b) comprende la centrifugación de la mezcla seguido por la eliminación del sobrenadante de la mezcla.

21. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque la disminución de la concentración del extintor en el paso (b) comprende separación de exclusión de tamaño.

22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extintor en la mezcla resultante del paso (b) está a una concentración menor de aproximadamente 10 mM.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el extintor en la mezcla resultante del paso (b) está a una concentración menor de aproximadamente 8 mM.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el extintor en la mezcla resultante del paso (b) está a una concentración menor de aproximadamente 6 mM.

25.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste de una mostaza, un intermediario de mostaza, y un equivalente de mostaza .

26.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el grupo funcional es, o es capaz de formar, un ión de aziridinio.

27.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el grupo electrófilo reactivo es capaz de reaccionar con ácidos nucleicos .

28.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto inactivador del patógeno además comprende un ligando que se une al ácido nucleico.

29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el ligando que se une al ácido nucleico es un intercalador .

30. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el intercalador es una acridina.

31. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28-30, caracterizado porque el compuesto inactivador del patógeno comprende un enlazador frágil que se enlaza al grupo funcional y al ligando de unión de ácido nucleico.

32. - El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el compuesto inactivador del patógeno es ß-alanina, éster N- (acridin-9-ilo) , 2- [bis (2-cloroeti) amino] etílico.

33.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla resultante del paso (a) es de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 5 mM .

34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la concentración del compuesto inactivador del patógeno es la mezcla resultante del paso (a) es suficiente para inactivar por lo menos 1 log de un patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente .

35. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla resultante del paso (a) es suficiente para inactivar por lo menos 3 logs de un patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente .

36. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tiempo entre el paso (a) y el paso (b) es de aproximadamente 1 a 48 horas .

37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el tiempo entre el paso (a) y el paso (b) es de aproximadamente 10 a 30 horas.

38. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el tiempo entre el paso (a) y el paso (b) es de aproximadamente 15 a 25 horas.

39.- El método de conformidad con cualquiera de las' reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tratamiento inactiva por lo menos 1 log de un contaminante de patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente .

40. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el tratamiento inactiva por lo menos 3 logs de un contaminante de patógeno en la composición de glóbulos rojos, si está presente.

41. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende el paso de disminuir la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla.

42. - El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el paso de disminuir la concentración del extintor en la mezcla y disminuir la concentración del compuesto inactivador del patógeno en la mezcla ocurren al mismo tiempo.

43. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-42, caracterizado porque a 20 horas después del paso (a) , los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo (ABC) menor de 65% comparado con el valor ABC de los glóbulos rojos del mismo método bajo las mismas condiciones, pero sin el uso de base .

44. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) menor de aproximadamente 50, 000.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) menor de aproximadamente 40,000.

46.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-43, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) de entre aproximadamente 25,000 y 70,000.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) de entre aproximadamente 35,000 y 45,000.

48.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen menos de 1% hemolisis después del paso (b) .

49.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen menos de 1% de hemolisis en un tiempo de 42 días a 4°C después del paso (b) .

50. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen un Volumen Celular Empacado mayor de 50% después del paso (b) .

51. - El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen un Volumen Celular Empacado mayor de 50% en un tiempo de 42 días a 4°C después del paso (b) .

52. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla resultante tienen un Valor de Fragilidad Corpuscular Media mayor de 140 después 42 días a 4°C después del paso (b) .

53. - Un método de infundir glóbulos rojos en un individuo, caracterizado porque comprende infundir en un individuo una composición de glóbulos rojos producida por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52.

54. - Un método para reducir la deshidratación en la composición de glóbulos rojos, caracterizado porque la composición es una mezcla que comprende un extintor capaz de reaccionar con un compuesto inactivador del patógeno, y glóbulos rojos; el método comprende, disminuir suficientemente la concentración del extintor en la mezcla a una cantidad que reduce el nivel de deshidratación de los glóbulos rojos que resulta del almacenamiento de la mezcla con relación al nivel de la deshidratación de los glóbulos rojos que resultan del almacenamiento de la mezcla a una concentración original del extintor.

55.- El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el extintor comprende cisteína o un derivado de cisteína.

56.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el extintor es glutationa o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

57. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-56, caracterizado porque la concentración del extintor se disminuye a menos de aproximadamente 10 mM.

58. - El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la concentración del extintor se disminuye a menos de aproximadamente 8 mM.

59. - El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la concentración del extintor se disminuye a menos de aproximadamente 6 mM.

60.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-59, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla después de la disminución de la concentración del extintor tienen menos de 1% de hemolisis.

61. - El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla después de la disminución de la concentración del extintor tienen menos de 1% de hemolisis en un tiempo de 42 días a 4°C.

62. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-61, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla después de la disminución de la concentración del extintor tienen un Volumen Celular Empacado mayor de 50%.

63. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla después la disminución de la concentración del extintor tienen un Volumen Celular Empacado mayor de 50% en un tiempo de 42 días a 4°C.

64. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-63, caracterizado porque los glóbulos rojos de la mezcla después de la disminución de la concentración del extintor tienen un Valor de Fragilidad Corpuscular Media mayor de 140 después de 42 días a 4°C.

65. - Una composición caracterizada porque comprende glóbulos rojos producidos por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-64.

66. - Una composición caracterizada porque comprende glóbulos rojos que se preparan a través del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-64.

67. - Una composición caracterizada porque comprende: (a) glóbulos rojos, en donde los glóbulos rojos reaccionan covalentemente con un grupo electrófilo de un compuesto inactivador de patógeno; y (b) un extintor que comprende un grupo tiol que es capaz de reaccionar con un compuesto inactivador del patógeno; en donde la composición es adecuada para la infusión en humanos después de almacenamiento de 42 días a 4°C.

68. - La composición de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque por lo menos 1 log de un patógeno se inactiva, si está presente.

69. - La composición de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque por lo menos 3 logs de un patógeno se inactivan, si está presente.

70. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-69, caracterizada porque el grupo electrófilo se selecciona del grupo que consiste de una mostaza, un intermediario de mostaza, y un equivalente de mostaza .

71. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-69, caracterizada porque el grupo electrófilo es, o es capaz de formar, un ión de aziridinio.

72. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-71, caracterizada porque el grupo electrófilo es capaz de reaccionar con ácidos nucleicos.

73. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-72, caracterizada porque el grupo electrófilo reacciona covalentemente con la superficie celular de los glóbulos rojos.

74. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-73, caracterizada porque el compuesto inactivador del patógeno además comprende un ligando que se une al ácido nucleico.

75. - La composición de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque el ligando que se une al ácido nucleico es un intercalador .

76.- La composición de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque el intercalador es una acridina.

77. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-76, caracterizada porque el compuesto inactivador del patógeno comprende un enlazador frágil que se enlaza al grupo electrófilo y al ligando de unión del ácido nucleico.

78. - La composición de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque el compuesto inactivador del patógeno es ß-alanina, éster N- (acridin-9- ilo) , 2- [bis (2-cloroeti) amino] etílico.

79.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-78, caracterizada porque el extintor comprende cisteína o un derivado de cisteína.

80.- La composición de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque el extintor es glutationa o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

81. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-80, caracterizada porque el extintor está a una concentración que es lo suficientemente baja para evitar la deshidratación de glóbulos rojos durante el almacenamiento .

82. - La composición de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el extintor está a una concentración menor de aproximadamente 10 mM.

83. - La composición de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el extintor está a una concentración menor de aproximadamente 8 mM.

84. - La composición de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque el extintor está a una concentración menor de aproximadamente 6 mM.

85. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-84, caracterizada porque los glóbulos rojos tienen un Volumen Celular Empacado mayor de 55%.

86.- La composición de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque los glóbulos rojos tienen un Volumen Celular Empacado mayor de 60%.

87. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-84, caracterizada porque los glóbulos rojos tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) menor de aproximadamente 50,000.

88. - La composición de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque los glóbulos rojos tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) menor de aproximadamente 40,000.

89. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-84, caracterizada porque los glóbulos rojos tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) de entre aproximadamente 25,000 y 70,000.

90.- La composición de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada porque los glóbulos rojos tienen una capacidad de unión del anticuerpo promedio (ABC) de entre aproximadamente 35,000 y 45,000.

91. - Un método para la infusión de glóbulos rojos, caracterizado porque comprende infundir una composición de glóbulos rojos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-90 en un individuo.

92. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52 ó 54-64, caracterizado porque el almacenamiento de la mezcla es el almacenamiento de la mezcla durante más de 10 días a 4°C.

93. - El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el almacenamiento de la mezcla es el almacenamiento de la mezcla durante más de 42 días a 4°C.

94. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la mezcla de la base y el extintor da como resultado una forma de sal del extintor.

95. - El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la base es glutationa, y la forma de sal es glutationa potásica o glutationa sódica.

96. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52 y 92-95, caracterizado porque la concentración de cloruro después del paso (a) y antes del paso (b) es menor de aproximadamente 100 mM.

97. - El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la concentración de cloruro después del paso (a) y antes del paso (b) es menor de aproximadamente 75 mM.

98. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52 y 92-97, caracterizado porque la concentración de cloruro después del paso (b) es mayor de aproximadamente 100 mM.

99. - El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque la concentración de cloruro después del paso (b) es mayor de aproximadamente 125 mM.

100. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52 y 92-99, caracterizado porque la composición que comprende glóbulos rojos en el paso (a) tiene un volumen celular empacado de entre aproximadamente 70 y 90% .

101. - El método de conformidad con la reivindicación 100, caracterizado porque la composición que comprende glóbulos rojos en el paso (a) que tienen un volumen celular empacado de entre aproximadamente 75 y 85%.

102. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-51 y 92-99, caracterizado porque la composición que comprende glóbulos rojos en el paso (a) que tiene un volumen celular empacado de entre aproximadamente 50 y 70%.

103. - El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la composición comprende glóbulos rojos en el paso (a) que tienen un volumen celular empacado de entre aproximadamente 55 y 75%.

104. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-51 y 92-99, caracterizado porque la composición comprende glóbulos rojos en el paso (a) que tiene un volumen celular empacado de entre aproximadamente 30 y 50% .

105. - El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la composición que comprende glóbulos rojos en el paso (a) que tiene un volumen celular empacado de entre aproximadamente 35 y 45%.

106. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52 y 92-105, caracterizado porque los glóbulos rojos en el paso (a) han sido leuco-reducidos .

107. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52 and 92-105, caracterizado porque los glóbulos rojos en el paso (a) no han sido leuco-reducidos .

108. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52, 54-65, y 92-107, caracterizado porque la disminución de la concentración del extintor comprende la adición de una solución aditiva.

109. - El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la solución aditiva comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, y manitol .

110. - El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la solución aditiva además comprende fosfato.

111.- El método de conformidad con la reivindicación 109 ó 110, caracterizado porque la solución aditiva además comprende citrato.

112.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-90, caracterizada porque además comprende cloruro de sodio, adenina, glucosa, y manitol.

113. - La composición de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque además comprende fosfato.

114. - La composición de conformidad con la reivindicación 112 ó 113, caracterizada porque además comprende citrato.

115. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-90, y 112-114, caracterizada porque el cloruro está presente a una concentración mayor de aproximadamente 100 mM.

116. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 115, caracterizada porque el cloruro está presente a una concentración mayor de aproximadamente 125 mM.