MX2009001233A - Metodos, composiciones y articulos de manufactura para contribuir al tratamiento de canceres. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos, composiciones y artículos de manufactura para contribuir al tratamiento de cánceres, incluyendo tumores sólidos. Los métodos, las composiciones y los artículos de manufactura pueden utilizar un agonista de endotelina B (ETB) para mejorar el suministro y la eficacia resultante de un agente quimioterapéutico.

Description

MÉTODOS, COMPOSICIONES Y ARTÍCULOS DE MANUFACTURA PARA CONTRIBUIR AL TRATAMIENTO DE CÁNCERES S- Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama la prioridad sobre la solicitud de patente norteamericana No. 11/461,961 presentada el August 2, 2006, que es una continuación en parte de la Solicitud de patente norteamericana No. 11/360,236 presentada el 22 de febrero de 2006 (que reclama el beneficio de las solicitudes de patente provisionales norteamericanas Nos. 60/655,656; 60/655,654; y 60/655,643 que fueron presentadas el 22 de febrero de 2005) que es una continuación en parte de la Solicitud de patente norteamericana No. 10/691,915 presentada el 23 de octubre de 2003 que reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional norteamericana No. 60/420,960, presentada el. 24 de octubre 2002. El contenido de las cuales se incorpora como referencia. Campo de la Invención La presente invención se refiere a los métodos, las composiciones y los artículos de manufactura para contribuir al tratamiento de cánceres incluyendo tumores sólidos a través de la administración de un agonista de endotelina y de un agente quimioterapéutico. Antecedentes de la Invención El tratamiento exitoso de cánceres, incluyendo tumores sólidos, sigue siendo una meta médica incumplida, a pesar del aumento entendimiento de la biolog ía molecu lar de las células del tumor y de la disponibilidad de u n n úmero aumento de agentes terapéuticos potenciales. Por ejemplo, la incidencia del cáncer de seno ha aumentado substancialmente en los últimos 1 0 años , y es la única sola principal de muerte para las m ujeres en edades de 40-49 años en los Estados U nidos. U n problema en el tratamiento de cánceres es q ue una dosis efectiva de u na g ran variedad de agentes q uimioterapéuticos potenciales es restring ida por el efecto no selectivo, altamente tóxico sobre los tej idos normales de estos agentes. Consecuentemente, muchos pacientes sufren de los efectos secu ndarios de la q uimioterapia sin obtener las ventajas del tratamiento. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico paclitaxel inhibe la proliferación celular e ind uce la apoptosis de las células del tumor. La utilidad cl ínica del paclitaxel ha sido obstaculizada , sin embargo, por su toxicidades q ue limita la dosis incluyendo hipersensibilidad , neutropenia y neuropatía periférica . Así , hay una necesidad de desarrollar terapias más específicas y menos tóxicas para el cáncer. El suministro dirigido de los agentes q uimioterapéuticos a los tumores podría tener la ventaja de promover la ventaja de los agentes quimioterapéuticos mientras que red uce al m ínimo sus efectos tóxicos sistémicos. Tal sumi n istro dirigido podría también servir para bajar la dosis req uerida de los agentes quimioterapéuticos reduciendo potencialmente as í los efectos nocivos inaceptables de estos agentes. Una manera posible de alcanzar el suministro dirigido de los agentes quimioterapéuticos es utilizar las características distintivas de la vasculatura del tumor. Los tumores de tamaño mayor a algunos mM requieren una fuente de nutrientes constante, y, por lo tanto, desarrollan su propio lecho vascular y flujo sanguíneo. Folkman, Cáncer Res, 46:467 (1986). Sin el alimento constante de estos vasos sanguíneos en desarrollo, los tumores llegan a ser hipóxicos y mueren posteriormente. La formación de la nueva vasculatura de vasos sanguíneos preexistentes se llama "angiogénesis". Durante la angiogénesis, los vasos sanguíneos del tumor se desarrollan substancialmente de forma diferente de la vasculatura normal, y tienen diversas características. Las células epiteliales estratificadas individuales son los primeros vasos sanguíneos formados del tumor. Estos vasos sanguíneos recién formados del tumor no tienen una capa o una inervación del músculo liso. Los tumores también incorporan los vasos sanguíneos maduros que poseen todas sus funciones autoreguladoras. Mattsson et al., Tumor Blood Circulation, CRC Press, Boca Ratón, pág. 129 (1979); Reinhold, Tumor Blood Circulation, CRC Press, Boca Ratón, pág. 115 (1979); Warren, Tumor Blood Circulation, CRC Press, Boca Ratón, pág.26 (1979). El tono vascular (el grado al cual se dilatan o constriñen los vasos sanguíneos) es gobernado por un grupo de factores endógenos que incluyen H\ K+, Ca2+, p02, PC02 y el óxido nítrico (NO), así como otras sustancias reguladoras tales como endotelina (ET-1). Secombe et al., Landss, Austin, página 40 (1994); Luscher Luscher et al., The endothelium: modulator of cardiovascular function, CRC Press, Boca Ratón, página 61 (1990). ET-1 contribuye perceptiblemente a regular el tono vascular (Yanagisawa et al., Nature, 332:411 (1988)) y los investigadores han demostrado un aumento en la expresión del receptor de ET1 y de ETB en tumores sólidos incluyendo carcinomas de seno. Alanen et al., Histopathology, 36:161 (2000); Nelson et al., Cáncer Res, 56:663 (1996); Kar et al., Biochem Biophys Res Commun 216:514 (1995); Pagotto et al., J Clin Invest, 96:2017 (1995); Yamashita et al., Cáncer Res, 52:4046 (1992); Yamashita et al., Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 74:363 (1991 ). Además, el estímulo de los receptores de ETB causa un aumento en el suministro de la sangre a los tumores con la vasodilatación de vasos sanguíneos del tumor. La presente invención se aprovecha de este hecho usando los agonistas del receptor de ETB para aumentar selectivamente el flujo sanguíneo a los tumores para promover el suministro dirigido de agentes quimioterapéuticos. Breve Descripción de la Invención La presente invención se dirige a la administración de agonistas de endotelina y de un agente quimioterapéutico para contribuir al tratamiento de cánceres incluyendo tumores sólidos. Particularmente, los tumores que tienen vasculatura distintiva incluyendo un número aumento de receptores ETB que, cuando está enlazado, causa la vasodilatación. Debido a que los receptores de ETB son vasodilatadores, un agonista del receptor ETB, conjuntamente con un agente quimioterapéutico, es útil en el tratamiento de un tumor sólido, tal como los encontrados en los cánceres de seno. El agonista del receptor de ETB puede proporcionar más eficientemente agentes quimioterapéuticos a los tumores dando por resultado un tratamiento mejorado. Específicamente, una modalidad según la presente invención incluye un método para contribuir al tratamiento de un cáncer que incluye el suministro de un agonista de ETB y un agente quimioterapéutico. En las varias modalidades de los métodos según la presente invención, el agonista ETB y el agente quimioterapéutico se pueden administrar substancialmente de forma simultánea o pueden ser administrados secuencialmente (el agente quimioterapéutico administrado antes del agonista ETB o el agonista de ETB es administrado antes del agente quimioterapéutico). En ciertas modalidades según la presente invención cuando el agonista ETB y el agente quimioterapéutico se administran de forma substancialmente simultánea, pueden ser administrados como una única composición. Otra modalidad según la presente invención incluye una composición que incluye un agente quimioterapéutico, un agonista de ETB, y un excipiente opcional. Otra modalidad según la presente invención incluye un artículo de manufactura que incluye una composición que incluye un agonista de ETB, y la información educacional que dirige la administración de la composición con un agente quimioterapéutico para tratar un tumor sólido. Los artículos de manufactura según la presente invención pueden incluyer más lejos uno o más agentes quimioterapéuticos. Cuando los artículos de manufactura según la presente invención incluyen uno o más agentes quimioterapéuticos, el agonista de ETB y el agente quimioterapéutico pueden ser parte de la misma composición, se pueden proporcionar como composiciones separadas, o ambas. Los cánceres que se tratan con los métodos, las composiciones o los artículos de manufactura según la presente invención pueden incluir tumores sólidos incluyendo, sin limitación, los tumores ováricos, tumores de colon, sarcoma de Kaposi, tumores de seno, melanoma, tumores de próstata, meningiomas, tumores del hígado, tumores filoides de seno y sus combinaciones. Los agonistas de endotelina B usados de acuerdo con los métodos, las composiciones o los artículos de manufactura de la presente invención pueden aumentar selectivamente el suministro de sangre a los tumores sólidos que aumentan así el suministro de agentes quimioterapéuticos al tumor sólido. Los agonistas de Endotelina B que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención pueden incluir, sin limitación, uno o más de ET-1, ET-2, ET-3, BQ3020, IRL1620 (N-suc- [Glu9, Alai 1 , 15] ET-1 (8-21)), sarafotoxin 56c, [Alai, 3, 11, 15] ET-1, y sus combinaciones. Los agentes quimioterapéuticos pueden incluir, sin limitación, uno o más de entre adriamicina, camptotecina, carboplatino, císplatino, daunorubicina, doxorubicina, interferón alfa, interferón beta, ¡nterferón gamma, interleucina 2, irinotecan, docetaxel, paclitaxel, topotecan, 5-fluorouracilo, y sus combinaciones. Los métodos, las composiciones o los artículos de manufactura particulares según la presente invención incluirán IRL1620 como el agonista de ETB con un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste de paclitaxel, doxorubicina, 5-fluorouracil, y sus combinaciones. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 muestra el efecto de IRL1620 sobre los cambios inducidos por el paclitaxel en la perfusión del tumor; Las figuras 2A-2E muestran el efecto de ET-1 sobre la hemodinámica sistémica de las ratas libres de cáncer y de las ratas que portaban un tumor de seno; [0016] figuras demostración de 3A-3B el efecto de ET-1 sobre el flujo sanguíneo y la resistencia vascular regional en el tejido del seno de las ratas libres de cáncer y de las ratas que portaban un tumor de seno; Las figuras 4A-4C muestran el efecto de ET-1 sobre la perfusión, la concentración de los glóbulos móviles (CMBC), y la velocidad de glóbulos en el tejido del seno de las ratas libres de cáncer y de las ratas que portaban un tumor de seno; Las figuras 5A-5C muestran el efecto de BQ788 sobre los cambios inducidos por ET-1 en la perfusión de la sangre, CMBC, y la velocidad de los glóbulos en el tejido del seno de las ratas libres de cáncer y de las ratas que portaban un tumor de seno; La figura 6 muestra el efecto del vehículo o de IRL1620 sobre la farmacinética plasmática del análisis del paclitaxel en ratas normales y que portaban tumores según lo determinado mediante HPLC; Las figuras 7 y 8 muestran el efecto del vehículo o de IRL1620 sobre la farmacinética plasmática de [3H]-paclitaxel según lo determinado por conteo por centelleo de líquido; Las figuras 9A y 9B muestran el efecto de IRL1620 sobre la perfusión del tumor de seno según lo medido por flujometría de láser Doppler; La figura 10 muestra el efecto dependiente del tiempo de la administración IRL1620 sobre la concentración del [3H]paclitaxel en el tumor y los órganos importabantes de las ratas que portaban el tumor de seno; La figura 11 muestra la diferencia del porcentaje en el peso corporal de ratas que portaban un tumor de seno comparada con el principio del tratamiento; La figura 12 muestra el efecto de la administración de IRL1620 sobre el volumen del tumor de ratas que portaban un tumor de seno; La figura 13 muestra el efecto de la administración de IRL1620 sobre la progresión, el estasis y la regresión del tumor en ratas que portaban un tumor de seno; Las figuras 14A y 14B muestran los efectos de diversas dosis de IRL1620 sobre la perfusión del tumor de próstata según lo medido por flujometría láser Doppler (14A) y el porcentaje cambia en la perfusión del tumor de próstata de la línea base después de la administración de IRL1620 (14B); La figura 15 muestra el efecto de IRL1620 sobre la concentración [1 C] -doxorubicina (DOX) en tumore y otros órganos importabantes de las ratas que portaban un tumor de próstata; La figura 16 muestra el peso corporal (16A); volumen del tumor (16B); y peso del tumor (16C) de ratas que portaban un tumor de próstata después de la administración de IRL1620 y de DOX; La figura 17 muestra el peso corporal (17A); volumen del tumor (17B); y peso del tumor (17C) de ratas que portaban un tumor de próstata después de la administración de IRL1620 y de 5-Fluorouracilo (5-FU); La figura 18A y 18B muestra el efecto de IRL1620 sobre la perfusión del tumor de melanoma según lo medido por flujometría láser Doppler (18A) y el cambio del porcentaje en la perfusión del tumor de melanoma de la línea base después de la administración de IRL1620 (18B); La figura 19 muestra el efecto de IRL1620 sobre la concentración de [3H] - paclitaxel en tumor y otros órganos importabantes de las ratas que portaban un tumor de melanoma. La figura 20 muestra los efectos de varias concentraciones de IRL 1620 con y sin radiación, sobre el volumen del tumor en un cierto plazo. Para los propósitos comparativos, no se muestra el efecto de la solución salina y la radiación y tampoco se muestra ningún tratamiento sobre el volumen del tumor. Descripción Detallada de la Invención I. Definiciones Instrucciones: Como se utiliza aquí el término "instrucciones" significará el material que acompaña a un producto farmacéutico que proporciona una descripción de cómo administrar el producto, junto con los datos de seguridad y de eficacia requeridos para permitir que el médico, el farmacéutico, y el paciente tomen una decisión informada con respecto al uso del producto. Estas Instrucciones se consideran generalmente como la "etiqueta" para un producto farmacéutico. Las Instrucciones puede venir en muchas formas incluyendo, sin limitación, un inserto de papel, un CD-ROM o la dirección a un sitio de internet que contiene la información referente al producto farmacéutico. Profármaco: Como se utiliza aquí el término "profármaco" significará los compuestos que se transforman rápidamente in vivo a un compuesto útil en la invención, por ejemplo, mediante hidrólisis. Una discusión cuidadosa de profármacos se proporciona en Higuchi et al., Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, of the A.C.S.D. Symposium Series, y en Roche (ed.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association y Pergamon Press, 1987. Tratar, tratamiento o contribuir al tratamiento de: como se utiliza aquí los términos; "tratar", "tratamiento" y "contribuir al tratamiento de" significará la prevención, el retardo de la progresión o el crecimiento de, la contracción, o la eliminación de un cáncer incluyendo un tumor sólido. Como tal, estos términos incluyen la administración terapéutica y/o profiláctica médica, según sea apropiado. De forma substancialmente simultánea: Como se utiliza aquí el término "de forma substancialmente simultánea" significará que dos preparaciones farmacéuticas (es decir un agonista de ETB y un agente quimioterapéutico) son administradas al mismo tiempo. Según esta definición, "al mismo tiempo" debe ser interpretado para incluir tanto simultáneamente así como en approximadamente diez minutos. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos tienen características citotóxicas que están dirigidas a destruir las células cancerosas, pero en el proceso inflijen un considerable daño a los sistemas fisiológicos normales del cuerpo. Sería de gran ventaja, por lo tanto, entregar selectivamente agentes quimioterapéuticos a los tumores sólidos que contribuyen así a evitar estos efectos negativos del tratamiento contra el cáncer. La angioarquitectura de los vasos sanguíneos del tumor es diferente al de los vasos sanguíneos normales. Carmeliet & Jain, Nature, 407:249 (2000). Por lo tanto, la reactividad vascular de tumores difiere de la del tejido normal. Por ejemplo, la administración de los donadores de óxido nítrico, niconamida y los agonistas del bradiquinina modulan el flujo sanguíneo a los tumores. Jordán et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 48:565 (2000); Fukumura et al., Am J Pathol, 150:713 (1997); Hirst et al., Br J Radiol, 67: 795 (1994). La endotelina es una sustancia vasoactiva que modula el flujo sanguíneo y está presente en concentraciones grandes en los tejidos del carcinoma de seno comparados al tejido normal del seno (específicamente, la endotelina puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 12 pg/mg en tejidos de carcinoma del seno con respecto a aproximadamente de 0.12 pg/mg en tejido normal de seno). Kojima et al., Surg Oncol, 4(6):309 (1995); Kurbel et al., Med Hypotheses, 52(4):329 (1999); Patel et al., Mol Cell Endocrinol, 126(2):143 (1997); Yamashita et al., Cáncer Res, 52(14):4046 (1992); Yamashita et al., Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 74(3):363 (1991 ). Las endotelinas son una familia de péptidos cíclicos con 21 aminoácidos, incluyendo tres isoformas en los mamíferos, ET-1, ET-2 y ET-3. Inoue et al., Proc Nati Acad Sci USA 86:2863 (1989); Yanagisawa et al., Nature, 332:411 (1988). Las endotelinas ejercen sus efectos ligándose a dos receptores distintos de la superficie de la célula, ETA y ETB. El receptor de ETB se liga a los tres isotipos del péptido con igual afinidad. En cambio, el receptor de ETA se enlaza a ET-1 con una afinidad más alta que las otras isoformas. Ambos receptores pertenecen al sistema de receptor acoplado con G y median respuestas biológicas de una variedad de estímulos, incluyendo factores de crecimiento, polipéptidos vasoactivos, neurotransmisores y hormonas. Masaki, J Cardiovasc Pharmacol, 35:S3 (2000); Gulati, Preface. Adv Drug DeNv Rev, 40:129 (2000); Gulati et al., Am J Physiol, 273:H827 (1997); Levin, N Engl J Med, 333:356 (1995). Los receptores de ETB, un enfoque de la presente invención, están presentes en las células endoteliales (EC) y las células musculares lisas vasculares (VSMC) y aumentan en el tejido del cáncer de seno (incluyendo en tejido de carcinoma de seno en humanos tanto invasivo como ductal y lobulado) cuando se comparan al tejido normal del seno. Wulfing et al., Oncol Rep, 11 :791 (2004); Wulfing et al., Clin Cáncer Res, 9:4125 (2003); Alanen et al., Histopathology, 36(2):161 (2000). La endotelina actúa en los receptores de ETB para producir la dilatación vascular de y aumentar el flujo sanguíneo al tejido del tumor del seno. Los receptores de ETB que predominan en EC, produce vasodilatación del producto por medio de la liberación de factores tales como prostaciclina y óxido nítrico, de Nucci et al., Proc Nati Acad Sci USA, 85:9797 (1988). Ya que ET-1 produce un aumento en el flujo sanguíneo a los tumores estimulando los receptores de ETB, un agonista del receptor de ETB se puede utilizar para aumentar selectivamente el suministro de sangre a los tumores, así aumentando el suministro dirigido y la eficacia resultante de los agentes quimioterapéuticos. Los receptores de ETB han sido mostrados, por ejemplo y sin limitación, cánceres ováricos, miofibroblastos, tumor de sarcoma de Kaposi y vasos intratumorales, cánceres de seno y melanomas. Bagnato et al., Am J Pathol, 158:841 (2001 ); Alanen et al., Histopathology, 36(2):161 (2000); Bagnato et al., Cáncer Res, 59:720 (1999); Kikuchi et al., Biochem Biophys Res Comm, 219:734 (1996). Por lo tanto, la administración de un agonista del receptor de ETB conjuntamente con un agente quimioterapéutico puede ser utilizada para contribuir al tratamiento de tumores sólidos, incluyendo, sin limitación, cáncer ovárico, carcinoma de colón, tumor de sarcoma de Kaposi, cáncer de seno, y melanomas. Los agonistas de ETB útiles de acuerdo con la presente invención incluyen, sin limitación, ET-1, ET-2, ET-3, BQ3020, IRL1620 (N-suc- [Glu9, Ala11'15] ET-1 (8-21)), sarafotoxina 56c, [Ala1' 3,11,15] y sus combinaciones. [Ala1, 3·11·15] ET-1 es un análogo linear de ET-1 en el cual los puentes de disulfuro han sido eliminados por substitución del Ala por los residuos de Cys. Saeki et al., Biochem Biophys Res Commun, 179:286 (1991 ). BQ3020 e IRL1620 son análogos sintéticos lineares truncados de ET-1 y son los agonistas sintéticos selectivos más ampliamente utilizados. IRL1620 es un análogo de ET cuya estructura se basa en el extremo terminal de carboxi de ET-1 y tiene selectividad de 120.000 veces para los receptores de ETB. Okada & Nishikibe, Cardiovasc Drug Rev, 20:53 (2002); Douglas et al., Br J Pharmacol, 114:1529 (1995). IRL1620 es un agonista altamente selectivo y potente de ETB, con la evidencia que se ha reportado de su selectividad para el subtipo del receptor de ETBi de preferencia sobre el subtipo ETB2. Brooks et al., J Cardiovasc Pharmacol, 26 Suppl 3:S322 (1995). Los agentes quimioterapéuticos útiles de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo y sin limitación, los agentes que alquilizan, los antimetabolitos, las hormonas y sus antagonistas, los radioisótopos, anticuerpos, así como los productos naturales, y sus combinaciones. Por ejemplo, un agonista de ETB se puede administrar con los antibióticos, tales como doxorubicina y otros análogos del antraciclina, mostazas de nitrógeno, por ejemplo, sin limitación, ciclofosfamida, análogos de pirimidina por ejemplo, sin limitación, 5-fluorouracilo, cisplatina, hidroxiurea, y sus derivados naturales y sintéticos, y similares. Como otro ejemplo, en el caso de tumores mezclados, tales como adenocarcinoma del seno, donde los tumores incluyen células dependientes de gonadotropina e independientes de la gonadotropina, agonista de ETB se puede administrar conjuntamente con, sin limitación, leuprolida o goserelina (análogos sintéticos del péptido de LH-RH). Ejemplos no-limitativos adicionales de los agentes quimioterapéuticos que se pueden utilizar con la presente invención incluyen adamicina, camptotecina, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, interferón (alfa, beta, y/o gamma), interleucina 2, irinotecan, el docetaxel, el paclitaxel, topotecan, y los análogos terapéuticamente eficaces y los derivados de los mismos. En una modalidad de la presente invención, un agonista de endotelina se utiliza conjuntamente con un agente quimioterapéutico para contribuir al tratamiento de un tumor sólido. En este método, el agonista de endotelina, en particular un agonista de ETB, aumenta el flujo sanguíneo al tumor, que es rico en receptores de ETB. El agonista de ETB, por lo tanto, proporciona un objetivo más selectivo para el agente quimioterapéutico y mejora el efecto quimioterapéutico del agente. Se tiene la teoría, pero sin basarse en ella, de que los agonistas de endotelina estimulan a los receptores de ETB para dilatar los vasos sangu íneos del tumor, aumenta ndo así el flujo sangu íneo y el suministro resultante de agentes q uimioterapéuticos al tumor. La perfusión aumento de sa ng re de los tumores causada por los agonistas de endotelina también a umenta la oxigenación del tejido. La oxigenación mejorada puede promover la acción terapéutica de agentes q uimioterapéuticos. La endotelina también puede tener características mitogén icas . Las acciones mitogénicas de la endotelina pueden ayudar a aumentar la acción de los agentes quimioterapéuticos, cuando se administran conj u ntamente. La acción mitogénica de un agonista de endoteli na puede a umentar la acción de agentes quimioterapéuticos mejorando su incorporación en la división de las células, así aumentando su eficacia. La quimioterapia se indica con frecuencia como coadyuvante a la cirug ía en el tratamiento de u n cáncer. El objetivo de la quimioterapia en el ajuste auxiliar es el de reducir el riesgo de repetición y promover supervivencia sana cuando se ha controlado el tumor primario. La quimioterapia se utiliza como coadyuvante del tratamiento para u n cáncer, con frecuencia cuando la enfermedad es metastática . Un agonista de ETB, por lo tanto, es particularmente útil antes o después de la cirug ía en el tratamiento de un tumor sólido conjuntamente con la q uimioterapia . MODELO DEL TU MOR DE SENO Ejemplo 1 . Efecto de I RL1620 y Paclitaxel en la perfusión del tumor de seno Los estudios sig uientes fueron cond ucidos pa ra examinar la hemodinámica sistémica y los efectos regionales del trazado de circuito de ET-1 en ratas normales y que portaban un tumor de seno.

Un modelo extensivamente estudiado del tumor del seno es el modelo mamario químicamente inducido de carcinogénesis de la rata, van Zwieten, The rat as animal model in breast cáncer research. Martinus Nijhoff Publishers, Boston, pág. 206 (1984); Dao et al., J Nati Cáncer Inst, 71 :201 (1983); Russo et al., J Nati Cáncer Inst, 61 :1439 (1978); Huggins et al., Science, 137 (1962); Huggins et al., Proc Nati Acad Sci USA, 45:1294 (1959). La tumorgenesis mamaria químicamente inducida en ratas es el modelo que se asemeja lo más de cercano posible a un cáncer humano. Russo et al., Lab. Invest., el 62:244 (1990). En términos de la arquitectura del tejido, la glándula mamaria de una rata es comparable a la de mujeres humanas. Es formada por un epitelio que cubre los conductos y los alvéolos y el estroma y un tejido conectivoque une este órgano. Estos dos compartimientos están en interacción continua durante el desarrollo embrionario y durante la edad adulta. Por lo tanto, este modelo experimental autóctono fue seleccionado como un modelo en los estudios actualmente descritos ya que se asemejan lo más de cerca posible al cáncer humano. La carcinogénesis mamaria químicamente inducida de la rata típicamente se logra por la administración de 7,12-dimetilbenceno(a)antraceno (DMBA) o N-metilnitrosourea (MNU). Rogers et al., Chemically induced mammary gland tumors in rats: modulation by dietary fat. Alan R. Liss, Inc., Nueva York 255 (1996).

Los tumores inducidos por DMBA o MNU tienen diversas características morfológicas. Particularmente, los tumores inducidos por MNU se localizan más en el seno y son menos probables a extenderse por metástasis. Macejova et al., Endocr Regul, 35:53 (2001). Por lo tanto, MNU se elige frecuentemente como el agente químico para la inducción específica de los tumores del seno en ratas. Estos tumores del seno pueden ser benignos con fibroadenomas y papilomas, o pueden ser malignos, van Zwieten, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, pág. 206 (1984). Las ratas tienen seis pares de glándulas mamarias, uno en la región cervical, dos en la región torácica, uno en la región abdominal, y dos en la región inguinal. Id; Astwood et al., J Anat, 61 (1937). Las ratas vírgenes tratadas con MNU desarrollan más tumores en la región torácica que la región abdominal. Russo et al., Lab Invest, 57:112 (1987). Se utilizaron ratas hembra de Sprague Dawley (Harían Co., Madison, WIS.) pesando 180 - 200 gramos (f). Todos los animales fueron contenidos, tres a una jaula, en un cuarto a temperatura controlada (°C) 23 ±1, humedad (50 ±10%), y luz artificial (0600-1800 horas). Los animales recibieron alimento y agua ad libitum. Los experimentos fueron conducidos después de que los animales hubifueron sido aclimatados al ambiente por lo menos cuatro días. La N-metilnitrosourea (MNU) fue comprada de Ash Stevens Inc. (Detroit, Mich). IRL1620 y Endotelina-1 (ET-1) fueron obtenidos de American Peptide Company inc. (Sunnyvale, Calif). ET-1 fue disuelto en albúmina al 0.1 %. MNU (50 mg/kg) o solución salina (1 ml/kg) fueron administrados intraperitonealmente (i.p.) a las ratas hembra de Sprague Dawley. Después de que los tumores alcanzaron aproximadamente 2-4 cm en diámetro, fueron realizados los experimentos del flujo sanguíneo. Durante los experimentos del flujo sanguíneo, las ratas fueron anestesiadas con uretano (1.5 g/kg, i.p.) Clay Adams, Parsipanny, N.J.) y la vena femoral izquierda fue canalizada (cánula de PE 50, Clay Adams, Parsipanny, N.J.) para la administración del fármaco. Los animales fueron divididos en los grupos siguientes: Grupo I: solución salina + paclitaxel (taxol; 3 mg/kg; 15 minutos después de la administración de la solución salina) en las ratas normales (N=4); Grupo II: IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (3 mg/kg; 15 minutos después de la administración IRL1620) en las ratas normales (N=4); Grupo III: Solución salina + paclitaxel (3 mg/kg; 15 minutos después de la administración salina) en las ratas que portaban el tumor (N=4); y Grupo IV: IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (3 mg/kg; 15 minutos después de la administración de IRL1620) en las ratas que portaban el tumor (N=4). La perfusión de la sangre a la glándula mamaria de las ratas fue medida usando flujometría del láser Doppler. Ver Song et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 18:903 (1990); Song et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 17:1041 (1989). En este procedimiento, los animales fueron afeitados alrededor de los pezones y la piel que rodeaba las glándulas mamarias fue disectada. Una sonda de fibra óptica del modelo estándar fue asegurada a la arteria mamaria y conectada con un flujometro de láser doppler Periflux PF2b 4000 (Perimed KB, Estocolmo, Suecia). La constante de tiempo fue fijada a 1.5 segundos, y el ancho de banda fue fijada a 4 kilociclos. Los datos fueron analizados usando el análisis de variación (ANOVA) seguido por la prueba de Duncan. Un nivel de p<0.05 fue considerado como significante. No se observo cambio en el flujo sanguino al tejido de seno de las ratas normales después d ela administraciónd e solución slaina o IRL1620 pacrlitaxel. Se observaron significantes diferencias entre el dlujod e sangre en el tejido tumoral después de la inyección IRL1620 (363%, p<0.05) y después el paclitaxel después de la administración de IRL1620 (51.9%, p<<0.05) de la líena base (ver figura 1). Este estudio así demuestra que ellRL1620 pued eproporcionar un adyuvante importábante a los tratamientos del cáncer incluyendo la administración de agentes quimioterapéuticos. Ejemplo 2- Efecto de la infusión de ET-1 sobre la hemodinámica sistémica y el flujo sanguíneo al tejido mamamrio de ratas normales y que portaban tumores. Tratamientos con MNU y con solución salina se realizaron como inyeccines i.po. tres meses antes de los estudios. Las ratas se palparon regularmente empezando cuatro semanas después de los tratamientos. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 4-8 mm de diámetro, se iniciarion los experimentos. Las ratas fueron anestesiadas con uretano (1.5 g/kg, i.p.) (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.). Todas las áreas quirúrgicas fueron afeitadas y limpiadas con esponjas con alcohol. La vena femoral izquierda fue canalizada (cánula de PE 50, Clay Adams, Parsipanny, Nueva Jersey) para la administración del fármaco. La arteria femoral izquierda fu canalizada (cánula de PE 50) y fue utilizada para el retiro de la muestra de sangre de referencia en estudios de microesfera usando una bomba extractora (modelo 22, Harvard Apparatus, South Natick, Mass.). La arteria femoral derecha fue canalizada (cánula del PE 50) y fue conectada con un transductor de presión Gould P23 ID para registrar la presión arterial en un polígrafo Grass P7D (Grass instrument Co., Quincy, Mass.) a través de un preamplificador 7PI. El ritmo cardíaco (HR) fue registrado a través de un tacógrafo Grass 7P4B (Grass instrument Co., Quincy, Mass.) accionado por las señales de la presión arterial. La arteria carótida derecha fue expuesta y una cánula PE 50 fue dirigida a través de la arteria carótida común en el ventrículo izquierdo. La presencia de la cánula en el ventrículo izquierdo fue confirmada registrando la presión sobre el polígrafo Grass usando el transductor de presión Statham P23 DC (Grass instrument Co., Quincy, Mass.) Cuando la cánula alcanzó el ventrículo izquierdo; la presión diastólica cayó a cero. Para mantener constante el p02, pCQ2, y pH de la sangre y evitar el efecto de la respiración el la presión arterial y HR, los animales fueron mantenidos con respiración artificial a una tasa constante insertando una cánula endotraqueal conectada con un ventilador para roedor (modelo 683, Harvard Apparatus Inc., South Natick, Mass.). Las ratas fueron divididas inicialmente en dos grupos, cada una recibió uno de los tratamientos siguientes: Grupo I: ET-1(50 ng/kg/min) infusión durante 30 minutos en ratas tratadas con solución salina (ratas normales) (N=6); y Grupo II: ET-1(50 ng/kg/min) infusión durante 30 minutos en ratas tratadas con MNU (50 mg/kg, i.p.; ratas con tumor) (N=6). Los parámetros de la circulación sistémicos hemodinámicos y regionales fueron determinados a 30, 60, y 120 minutos de la línea base, después de comenzar la infusión de ET-1 (50 ng/kg/min). Porque la infusión ET-1 fue realizada por 30 minutos, los datos de los 30 minutos muestan el efecto de ET-1, y los datos a 60 - y 120 minutos indican la duración del efecto de ET-1. La hemodinámica sistémica y la circulación de sangre regional fueron determinados usando un procedimiento descrito en la literatura. Ver Gulati et al., J Lab Clin Med, 126:559 (1995); Gulati et al., Life Sci., 55:827 (1994); Sharma et al., Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 22:593 (1994). En cada medición, una suspensión mezclada a fondo de aproximadamente 100.000 microesferas (diámetro de 15±1 µ?t?) etiquetada con 46Sc (escandio), 113Sn (estaño), 1 1Ce (cerio), o 95Nb (niobio) (New England Nuclear Corporation, Boston, Mass., EE.UU.)- en 0.2 mi de solución salina fueron inyectados en el ventrículo izquierdo y enjuagados con un chorro de agua con 0.3 mi de solución salina durante un periodo de 15 segundos. Para calcular el flujo sanguíneo, se extrajo sangre arterial a una tasa de 0.5 ml/min a través de la arteria femoral derecha. La sangre fue extraída durante 90 segundos comenzando aproximadamente 5-10 segundos antes de la inyección de las microesferas. La perfusión de la sangre a la glándula mamaria de las ratas fue medida usando flujometría del láser doppler. Ver Song et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 18:903 (1990); Song et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys, 17:1041 (1989). Los animales fueron afeitados alrededor de los pezones. La piel que rodeaba las glándulas mamarias fue disectada en forma de un jirón de aproximadamente 6 cm de ancho y 4 cm de largo. Una sonda de fibra óptica del modelo estándar fue aplicada a la superficie del jirón, y asegurada al tejido por la cinta doble del palillo. El jirón fue colocado en un soporte de metal y se fijo con una cinta adhesiva para prevenir el movimiento, después se conect a una flujometría láser doppler Periflux PF2B 4000 (Perimed KB, Estocolmo, Suecia). La constante de tiempo fue fijada en 1.5 segundos y el ancho de banda se fijó en 4 kilociclos. Los datos fueron analizados usando el análisis de variación seguido por la prueba de Duncan. Un nivel de p>0.5 se consideró como significativo. Al final del experimento, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico. Todos los tejidos y órganos fueron disectados, pesados, y puestos en frascos. La radioactividad de los estándares, las muestras de sangre, y las muestras de tejido fueron contadas en un contador gamma Packard Minaxi Auto-Gamma serie 5000 (Packard Instruments Co., Downers Grove, III.) con las ventanas preestablecidas que discriminan las energías del isótopo. Los parámetros siguientes fueron calculados: (1) volumen cardiaco (CO) ((radiactividad inyectad x tasa se extracción de sangre arterial) /radioactividad en la sangre arterial muestreada), (2) volumen de golpe (SV) (CO/HR), (3) resistencia periférica total (TPR) (presión arterial media (MAPA)/CO), (4) flujo sanguíneo regional ((radiactividad en tejido x tasa de extracción de de sangre arterial) /radioactividad en sangre arterial muestreada), y (5) resistencia vascular regional (MAP/ flujo sanguíneo regional). Los datos fueron calculados usando los programas de computadora descritos en la literatura. Saxena et al., Comput Programs Biomed, 12:63 (1980). Los parámetros hemodinámicos sistémicos de la línea base en ratas normales (solución salina tratada) fueron MAP: 111.1 ±4.8 mmHg; CO: 268.6 ±17.6 ml/min; SV: 0.87 ±0.06 mi; TPR: 419.6 ±.24.37 mmHg.min/ml; y HR: 312.5 ±20.2 latidos/Min. En ratas normales, fue observado un aumento significativo en MAP en 30 minutos (14.5%; p O.05) y un aumento a los 120 minutos (17.8%; p<0.05) después de la infusión de ET-1. TPR aumento a 120 minutos (49.2%; p<0.05). CO se redujo a los 60 y 120 minutos (22.9% y 42.5% respectivamente; p<0.05) después de la infusión de ERT-1: El SV se redujo a los 60 y 120 minutos (20.9% y 36% respectivamente; p<0.05). No se observó un cambio significativo en HR (figuras 2A-2E). Los parámetros hemodinámicos sistémicos de línea base en ratas que portaban tumores (Tratadas con MNU) fueron similares a los encontrados en ratas normales. Un aumento significativo en MAP fue observado a los 30 minutos (el 19.1%; p<0.05) y a los 60 minutos (15.3%; p<0.05) después de la infusión ET-1 en ratas que portaban tumores. TPR aumento a los 30 minutos (73.9%; p<0.05), 60 minutos (39.7%; p<0.05), y 120 minutos (71.4%; p<0.05) después de la administración de ET-1. CO disminuyo a los 30, 60 y 120 minutos (29.4%, 16.7% y el 36.1% respectivamente; p<0.05). SV disminuyo perceptiblemente a los 30, 60 y 120 minutos (31.1%, 17.9% y 32.1% respectivamente; p<0.05). No se observó ningún cambio en HR (figuras 2A-2E). No se observó ningún cambio significativo en el flujo de sangre al tejido del seno o cambio en la resistencia vascular de ratas tratadas con solución salina normales después de la administración de ET-1. Diferencias significativas fueron observadas entre el flujo de sangre y la resistencia vascular regional en el tejido del seno que porta tumores (tratado con MNU) al ser comparados al de ratas normales (tratadas con solución salina). Un aumento significativo (153%; p<0.05) en flujo de sangre al tejido del seno de las ratas que portaban tumores con respecto a ratas normales fue observado en los 60 minutos posteriores a la administración de ET-1. La resistencia vascular en las ratas que portaban tumores fue perceptiblemente diferente en línea base (102%; p<0.05) y a los 60 minutos (147%; p<0,05) después de la administración de ET-1 en comparación con las ratas normales (figuras 3A-3B). Las figuras 4A-4C muestran los cambios en la perfusión, la concentración de los glóbulos móviles (CMBC), y la velocidad de los glóbulos rojos (RBC) en el tejido del seno de las ratas que portaban tumores y de las normales. La perfusión de la sangre en el tejido del seno de ratas normales no cambió perceptiblemente después de la administración ET-1. La perfusión en el tejido del seno de las ratas que portaban tumores en los 30 minutos posteriores la administración ET-1 aumentó perceptiblemente (176%; p<0.05) comparado a la de las ratas normales. Este aumento en la perfusión volvió a la línea base en los 60 y 120 minutos posteriores a la administración ET-1 en ratas que portaban tumores. El CMBC en las ratas que portaban tumores aumento perceptiblemente (54%; p<0.05) en 60 minutos después de la administración de ET-1 con respecto a las ratas normales. CMBC volvió a la línea base 120 minutos después de la administración de ET-1. La velocidad de RBC aumento perceptiblemente (252%; p<0.05) en 30 minutos después de la administración ET-1 en comparación con las ratas normales. Dos horas (120 minutos) después de la administración ET-1, la velocidad de RBC en ratas que portaban tumores volvió a la línea base (figuras 4A-4C). Otro estudio evaluó el papel de los receptores de ETB en los cambios inducidos por la infusión de ET-1 en la hemodinámica y el flujo de sangre sistémicos al tejido mamario de ratas normales y de ratas con tumores del seno. BQ788 (es decir, N-cis-2,6-dimetilpi pe ri dinoca rbonil-L-gamma-metil-eucil-D-1- metoxicarbonil-triptofanil-D-Nle) es un antagonista específico del receptor de ETB que inhibe el enlace a los receptores de ETB con un valor de IC5o de 1.2 nm. BQ788 por lo tanto fue utilizado para determinar el papel de los receptores de ETB en la vasodilatación inducida por ET-1 en el tumor de seno. Este estudio empleó los métodos descritos en el estudio anterior salvo que los animales fueron divididos en los grupos siguientes: Grupo I: Infusión de BQ788 (American Peptide Company inc. (Sunnyvale, Calif) disuelta en solución salina a0.5 pmol/k,g) por 20 minutos seguidos por la infusión de ET-1(50 ng/kg/min) durante 30 minutos en las ratas normales tratadas con solución salina (N = 5); y Grupo II: Infusión de BQ788 (0.5 pmol/kg) durante 20 minutos seguida por la infusión de ET-1 (50 ng/kg/min) durante 30 minutos en las ratas con tumores tratadas con MNU (50 mg/kg, i.p.) (N = 5). Las figuras 5A-5C muestran el efecto de BQ788 sobre los cambios inducidos por ET-1 en la perfusión de la sangre, CMBC, y la velocidad de RBC en ratas, que portaban tumores y normales, respectivamente. La perfusión de la sangre en el tejido del seno de ratas normales no cambió perceptiblemente después de la administración de BQ788 o de la infusión de ET-1. Sin embargo, la perfusión en el tejido del tumor del seno de las ratas que portaban tumores disminuyó perceptiblemente en 30 (25.25.+/- 5.7%; P<0.05) y 60 minutos (25.17.+/-2.8%; P<0.05) después de la infusión de ET-1 en ratas previamente tratadas con BQ788. El tratamiento previo con BQ788 atenuó el aumento en la perfusión inducida por ET-1 en ratas que portaban tumores. No se observó ninguna diferencia entre la perfusión en el tejido del seno de las ratas que portaban tumores y de las ratas normales después de la administración ET-1 en ratas pretratadas con BQ788. Este resultado sugiere que las respuestas vasodilatadoras inducidas por ET-1 son mediados a través de los receptores del ETB. La línea base de CMBC en ratas que portaban tumores fue perceptiblemente más alta que la línea base CMBC del tejido de seno de las ratas normales (42.4%; P<0.05). Sin embargo, después de la infusión de BQ788, no se observó ninguna diferencia entre el CMBC délas ratas que portaban tumores y las ratas normales. Además, no se observó ninguna diferencia en la velocidad de RBC entre los dos grupos (figuras 5A-5C). Las pruebas anteriores muestran el efecto de ET-1 sobre la hemodinámica y el flujo sanguíneo sistémicos al tejido del seno de las ratas portadoras de tumor tratadas con solución salina y tratadas con MNU. Se sabe que ET-1 estimula la angiogenesis promoviendo la producción de VEGF. Los estudios han mostrado que ET-1 está elevado de muchos tejidos cancerosos como el carcinoma de seno (Yamashita et al, Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 74:363 (1991)), tumor filloide de seno (Yamashita et al, Cáncer Res, 52:4046 (1992)), carcinoma de próstata (Nelson et al., Cáncer Res, 56:663 (1996)), carcinoma del hígado (Kar et al., Biochem Biophys Res Commun 216:514 (1995)), y algunos meningiomas (Pagotto et al., J Clin Invest, 96:2017 (1995)).. Las pruebas anteriores emuestran los cambios en las respuestas vasculares inducidas por ET-1 -en el tumor de seno. El método usado en estas pruebas fue una técnica radiactiva establecida de microesfera para estudiar la hemodinámica sistémica y la circulación de sangre regional. Ejemplo 3. El efecto de IRL1620 sobre la farmacinética de Paclitaxel Altfuerondo la dinámica del flujo sanguíneo en el cuerpo puede afectar perceptiblemente la farmacinética de una porción terapéutica, y el paclitaxel se sabe que tiene características farmacocinéticas complejas. Ver, por ejemplo, Sparreboom et al., Cáncer Res 56:2112 (1996a); Gianni et al., J Nati Cáncer Inst 87:1169 (1995b); Sonnichsen & Relling, Clin Pharmacokinet 27:256 (1994); Huizing et al., J Clin Oncol 11 :2127 (1993); Brown et al., J Clin Oncol 9: 1261 (1991 ); Longnecker et al., Cáncer Treat Rep 71 :53 (1987); Wiemik et al., Cáncer Res 47:2486 (1987b). Es por lo tanto importábante entender el impacto de IRL1620 en la farmacinética plasmática del paclitaxel. El estudio actualmente descrito por lo tanto fue conducido para determinar si IRL1620, un agonista selectivo del receptor de ETB, altera la farmacinética del paclitaxel en ratas que portaban un tumor de seno. Las ratas hembra de Sprague Dawley vírgenes (Harían Co., Madison, Wl), de 48 días de edad (120-140g) fueron utilizadas para este estudio. Al llegar, todas las ratas fueron alojadas em grupos de tres en una jaula, en un cuarto con temperatura controlada de 23 ± 1(°C), humedad (50 ± el 10%) y luz artificial (0600-1800 horas). Las ratas fueron alimentadas y recibieron agua ad libitum. Los experimentos fueron comenzados solamente después que las ratas se habían aclimatado al ambiente por lo menos 4 días. IRL1620 fue comprado a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Paclitaxel (solución de 6 mg/ml) fue comprado a Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford OH). La cetamina y xilazina fueron compradas a Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). [3H] -paclitaxel (ImCi, 6.4 Ci/mmol, actividad específica) fue comprado a Moravek Biochemicals (Moravek Biochemícals, CA). El uretano fue comprado a Sigma Aldrich (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). N-metíl-n-nítrosourea (MNU) se administro en una dosis de 50mg/kg, i.p. y las ratas fueron palpadas dos veces semanalmente. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 75-100mm3, se realizaron los estudios farmacocinéticos. Estudios HPLC-UV Las ratas fueron anestesiadas con una sola inyección i.p. de uretano (1.5 mg/kg(Sigma Chemicals, St. Louis, MO). La región femoral derecha fue afeitada y limpiada con desinfectante y alcohol quirúrgicos. La arteria y la vena femoral derecha fueron expuestas y canalizadas con una cánula estéril PE-50. El cuello fue afeitado y limpiado con desinfectante y alcohol quirúrgicos. Una incisión media fue hecha alrededor de la región del cuello y la tráquea se entubo y fue conectada a un ventilador para roedores (modelo 683, Harvard Apparatus Inc., South Natick, MA). Todas las cirugías fueron realizadas bajo condiciones asépticas. Crema antibiótica Neosporin (Pfizer, Morris Plains, NJ) fue aplicada a las heridas para prevenir la infección. Un período de recuperación de 45 minutos fue permitido antes de la administración de la droga. Se usaron ratas normales (tratadas con solución salina) y ratas que portaban tumor (tratadas con MNU). Paclitaxel fue suministrado i.v. (3 mg/kg) 15 minutos después de IRL1620 (3 nmol/kg) o la administración del vehículo (solución salina, mL/kg 3). La sangre fue recolectada antes de la administración IRL1620 para proporcionar valores de línea base. 0.5 mi de sangre fueron extraídos de las ratas en jeringas heparinizadas en línea base, 5, 30 minutos, y 2, 6, y 10 horas después de la administración de paclitaxel. Las muestras fueron centrifugadas y el plasma se colectó y almacenó a -80°C hasta el análisis. Las muestras de plasma fueron analizadas para el contenido de paclitaxel usando un sistema HPLC. Brevemente, el plasma fue descongelado y mezclado con 50 pL del estándar interno de N-ciclohexil benzamida interna (3 mM, de una curva estándar menor y 30 mM de curva de la mayor nivel) y de 3mL de éter de etilo (Fisher Scientific, Chicago, IL) en 13 x 100 tubo' de cultivo de vidrio. La mezcla fue agitando usando un agitador recíproco durante 5 minutos y después fue centrifugada durante 5 minutos a 3.000 RPM a 4°C. El sobrenadante resultante fue transferido á 13 x 100 tubos de cultivo de vidrio de borosilicato y se evaporó bajo una corriente de nitrógeno en un baño de agua caliente (37°C). El residuo fue reconstituido con el 200µ? de la fase móvil A (50% agua desionizada, 50% acetonitrilo). Una alícuota de 100 µ?_ (curva menor y las muestras estándar colectadas después de la administración i.v.) del material reconstituido fue inyectado en una columna de 4mm NovaPak C18 150 x de 3.9m m (Waters Associates, Milford, MA) precedida por precolumna de 4mm NovaPak C18 de 20 x de 3.9mm usando un módulo de separaciones Waters 2695 conectado con un detector de la absorbencia Waters 2487 fijado a 227 nm. Un gradiente linear fue iniciado con 100% de la fase móvil A bombeada a una tasa de flujo de 1 mL/min. La fase móvil A entonces fue disminuida hasta el 70% a partir 10 a 11 minutos con la fase móvil A mantenida a 70% a partir 11 a 16 minutos para retirar los materiales que se eluyeron lentamente de la columna antes de la inyección siguiente. Posteriormente, la fase móvil A fue aumentada a 100% a partir 16 a 17 minutos y mantenida al 100% de la fase móvil A durante tres minutos que proporcionaban un tiempo de paso total de 20 minutos. Las concentraciones plasmáticas para el paclitaxel fueron calculadas de la proporción del área del pico de paclitaxel al área del pico de ?-ciclohexil benzamida usando regresión linear de mínimos cuadráticos y el peso por 1/x. Dentro de día y entre los días se midió la variabilidad medida por un coeficiente de variación fue < 10%. Fueron comparados los perfiles de concentración del plasma de las ratas normales y que portaban el tumor. Estudio de conteo de centelleo líquido. Las ratas fueron anestesiadas con una sola inyección i.p. de una combinación del cetamina (100 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg). El cuello fue afeitado y limpiado con desinfectante y alcohol quirúrgicos. La arteria carótida derecha fue expuesta y canalizada con cánula estéril de PE-50. Una incisión de línea media fue hecha alrededor de la región del cuello y la arteria carótida izquierda canalizada con la cánula de PE-50 para tomar muestras de sangre. Los catéteres fueron hechos un túnel subcutáneo y exteriorizados en la base del cuello seguido por el cierre de las incisiones usando grapas quirúrgicas. Buehler et al., Free Radie Biol Med 37:124 (2004). La cánula abierta fue tapada con una línea. Todas las cirugías fueron realizadas bajo condiciones asépticas. Antibiótico en crema Neosporin (Pfizer, Morris Plains, NJ) fue aplicado a las heridas para prevenir la infección. Un período de recuperación 45 minutos fue permitido antes de la administración del fármaco. IRL1620 fue administrado i.v. a los animales que portaban el tumor en una dosis de 3nmol/kg. [3H] - paclitaxel (160 Ci/kg) fue mezclado con paclitaxel sin etiqueta. El paclitaxel fue administrado i.v. durante 15 minutos después de la administración del vehículo o de IRL1620. El plasma fue colectado antes de la administración del vehículo o IRL1620 para proporcionar valores de línea base. Aproximadamente, 0.2mL de sangre fueron extraídos de las ratas con jeringas heparinizadas en la línea base, 1, 5, 15 y 30 minutos y 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas. Las muestras se centrifugaron y el plasma fue separado y almacenado a -80°C hasta el análisis. Las concentraciones de [3H] - paclitaxel en las muestras del plasma fueron medidas usando un contador de centelleo líquido Beckman Coulter (modelo LS 6500). Brevemente, el plasma fue descongelado y mezclado con 20 mL del coctel líquido de centelleo. Las muestras fueron contadas y los conteos fueron convertidos de "dpm" unidades a " fmol/mL" usando la fórmula siguiente: fmol/mL = valor dpm x factor de decaimiento x 2.2x10"12 /10"12 x volumen de la muestra en mL Después de la conversión en fmol/mL, la farmacinética del paclitaxel total fue calculada usando la proporción de [3H] - paclitaxel al paclitaxel sin etiqueta. Las estimaciones farmacocinéticas del paclitaxel en el plasma fueron determinadas usando análisis de tanto sin compartimiento y con compartimiento según lo implementado en WinNonlin Pro 4.1 (Pharsight Corp, Mt. View, CA). En el análisis sin compartimento, el área debajo de la curva (AUCO-00) fue estimada usando la regla trapezoidal a la última concentración mensurable (Clast) y extrapolada al infinito dividiendo Clast por el valor negativo de la pendiente terminal (?) de la concentración plasmática lineal logarítmica vs. curva del tiempo. Los parámetros siguientes también fueron calculados: el tiempo de residencia medio (MRTiv) fue calculado como el recíproco de ?, separación sistémica (CL) fue calculada como la proporción de la dosis a AUCO-8 y a la distribución de volumen aparente fue calculada como la proporción de CL y de ?. La vida media del plasma fue calculada como el producto de 0.693 (logaritmo natural 2) y MRTiv. En los análisis de compartimiento, una serie de modelos de compartimiento no lineares fue ajustada a la concentración del plasma contra los datos de la curva de tiempo. Específicamente, los modelos de un compartimiento, de dos compartimientos y de tres compartimientos fueron comparados. Se examinaron los pesos basados en los datos uniformes y previstos. La selección final del modelo fue basada en los diagramas de diagnóstico (observados vs. Previstos y diagrama de residuos), criterios de información de Akaike (AIC) y criterios de Schwartz (SC). El modelo con criterios AIC menores y SC fue considerado como el modelo final. Los datos fueron analizados por un ANOVA unidireccional seguido por la prueba de Duncan para los estudios de HPLC-UV y por la t-prueba para el estudio de centelleo líquido. Un p<0.05 se considera significante. El resultado principal meiddo en estos estudios de espuesta famacologica fue la diferencia en concentración de paclitaxel en plasma. El perfil farmacocinético de pacrlitaxel no fue afectado por la administración de IRL (figuras 6 y 7) en las ratas normales o las que portaban tumores. El análisis PLC del perfil farmacocinético plasmático es similar al perfil más extenso de la disposición de paclitaxel radioactivo. La figura 7 muestra le perfil farmacocinético de la radioactividad depaclitaxel en las ratas que porten tumor tratadas con vehículo y con IRL1620. El perfil farmacocinético se analizo por medio de métodos sin compartimiento y con compartimiento. En el análisis sin compartimento, el AUC calculado para el grupo de vehículo + paclitaxel fue 0433.53 + 1465.00 ng*h/ml_ y fue "similar (p>0.05) al de las ratas con tumores tratadas con IRL1620 . La vida media de eliminación fue calculada como 0.14 ± 0.08 horas. El aclaramiento calculado como Dosis/AUC se estimo que fue 0.56 ± 0.07 I ./h /kg. El volumen de distribución, calculado como aclaramiento/Kel se encontró que es 10.11 ± 4.17 L/kg. EM general como puede verse en la tabla siguiente, IRL1620 no afectó al perfil farmacocinético del paclitaxel.

Las concentraciones plasmáticas de paclitaxel fueron calculadas a partir de los conteos del dpm en las muestras de plasma. Un modelo de tres compartimientos describe mejor la farmacinética del paclitaxel. La figura 8 representa diagramas farmacocinéticos observados vs los previstos para las ratas tratadas con vehículo y con IRL1620. El AUC del paclitaxel en ratas tratadas con vehículo fue 9.42 ± 3.18 pg-h/mL. El volumen de distribución en estado estacionario (Vss) fue 10.31 ± 4.54 L/Kg. El aclaramiento fue estimadi en 0.69± 0.17 L./h /Kg. Los a t1/2, ß t1/2 y t1/2 fueron 0.03 ± 0.01 horas, 1.0 ± 0.32 horas, y 25.87 + 17.81 horas, respectivamente. El tiempo de residencia medio fue 27.92 ± 19.84 horas. Como puede ser visto en la tabla siguiente, estos parámetros estimados en el grupo tratado IRL1620 no fueron perceptiblemente diferentes del grupo tratado con vehículo.

En este estudio, un modelo de tres compartimientos describe mejor la farmacinética del paclitaxel. Este modelo sugiere que el paclitaxel está distribuido a los diferentes órganos si la perfusión de la sangre en los órganos es alta, media o baja. La administración IRL1620 no cambió la distribución del paclitaxel. Los parámetros farmacocinéticos del plasma, generados por el modelo de 3 compartimentos, exhibieron aclaramientos, volúmenes de distribución y de absorción, distribución y vidas medias de eliminación comparables para los grupos tratados con el vehículo y los tratados con IRL1620. Sin embargo, IRL1620 aumenta la perfusión de la sangre del tumor y la concentración de paclitaxel en el tumor. Rai et al., American Association of Pharmaceutical Scientists, Pharmaceutics and Drug Delivery Conference. Philadelphia, PA (2004); Rai & Gulati, Cáncer Chemother Pharmacol, 51 :21 (2003). Por lo tanto, IRL1620 aumenta selectivamente la perfusión del tumor sin alterar perceptiblemente el perfil farmacocinético del paclitaxel. Estos estudios demostraron que el uso de IRL1620 no afectó a la farmacinética del paclitaxel. La farmacinética se puede considerar frecuentemente como un sustituto de la seguridad del compuesto. Por lo tanto estos resultados también sugieren que la seguridad del paclitaxel no cambia debido a la administración de IRL1620. Consecuentemente, IRL1620 se podría utilizar para mejorar la eficacia del paclitaxel y para permitir la titulación apropiada de la dosis para minimizar sus toxicidades severas. Ejemplo 4. Eecto de la repsuesta a la dosis de IRL1620, efecto de IRL1620 sobre la bio-distribución del [3H]paclitaxel en órganos principales y tejidos tumorales y el efecto de IRL1620 sobre la eficacia de Paclitaxel sobre estado del tumor Los experimentos descritos en el presente ejemplo fueron diseñados para evaluar además (a) el efecto de la reacción a cierta dosis del agonista del receptor de ETB, IRL1620, sobre la perfusión del seno de las ratas normales y que portaban el tumor, (b) el efecto de IRL1620 sobre la bio-distribución del [3H] paclitaxel en órganos principales y tejido tumorales y (3) el efecto de IRL1620 sobre la eficacia del paclitaxel sobre el estado del tumor en ratas MNU- inducidas que portaban un tumor de seno. Ratas hembra de Sprague Dawley vírgenes (Harían Company, Madison, Wl) fueron compradas con 40 días de edad y se alojaron en grupos de dos por jaula en un cuarto con temperatura controlada a el 23 ±1 °C y mantenidas bajo horario de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Recibieron agua y dieta del roedor estándar ad libitum. IRL1620 fue comprado a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). [3H] -paclitaxel fue comprado a Moravek Biochemicals (Moravek Bíochemicals, CA). Paclitaxel (solución de 6 mg/ml) fue comprado a Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford OH). Cetamina y xilazina fueron compradas a Phoeníx Scientífic, Inc. (St. Joseph, MO). El solubilizer del tejido (TS-2) fue comprado a RPI Corp. (Chicago, IL).

A los 48 días de edad, cada animal recibió una sola inyección i.p. de N-metil nitrosourea (MNU, Ash Stevens, Detroit, MI) a una dosis de 50 mg/kg. MNU fue disuelto en 3% ácido acético y diluido en 0.9% NaCI (concentración final 12.5 mg/ml) y fue administrado en el transcurso de 30 minutos después de la preparación. Este tratamiento induce una incidencia de casi 100% del adenocarcinoma mamaria en ratas en aproximadamente 100 días de tratamiento cancerígeno. Mehta, Eur J Cáncer, 36:1275 (2000). El aspecto y la localización del tumor fueron supervisados por palpación manual de la glándula mamaria y la superficie del tumor fue medida con un calibrador digital. Las ratas con el volumen del tumor de 500-800 mm3 fueron seleccionadas para el estudio. Estudio de perfusión. La perfusión al tejido y al tumor mamario de la rata fue medida usando una flujometría de láser doppler Periflux PF2B 4000 (Perimed, Estocolmo, Suecia) según lo descrito previamente. Brevemente, las ratas fueron anestesiadas usando el cetamina (100 mg/kg) y el xilazina (2 mg/kg) como una sola inyección combinada i.p. La piel fue afeitada alrededor de los pezones y los animales fueron colocados en un cojín de calefacción (37°C) para minimizar las variaciones de temperatura. La piel que rodeaba las glándulas mamarias fue disectada aproximadamente 6 mM de ancho y aproximadamente de 4 mM de largo. Una sonda de fibra óptica del modelo estándar (la sonda del flujo MP3, Noors Instruments, Devon, Inglaterra) fue aplicada a la superficie del tejido expuesto. Entonces fue conectada a una flujometría del láser Doppler Periflux PF2B 4000. La constante de tiempo fue fijado a 1.5 segundos y el ancho de banda fue fijada a 4 kilociclos. Este método mide un cambio doppler en la luz láser (flujo), que es determinado por número y velocidad de los eritrocitos, y es proporcional al flujo sanguíneo total con un volumen de tejido determinado. Los valores del flujo fueron adquiridos usando el software Polyview. Una línea base de 15 minutos de registro estable fue obtenida antes de la administración de la solución salina o de IRL1620. A los animales les fue administrado 1, 3 o 9 nmol/kg de IRL1620 y la perfusión fue registrada durante 3 horas. Cada dosis fue administrada por lo menos a 4 animales. El efecto de la administración de IRL1620 sobre la perfusión del tumor se encontró que es transitorio y relativo a la dosis (figura 9A). Un aumento máximo de 244.0% (p< 0.001) de ia línea base en la perfusión del tumor fueron observados 30 minutos después de la administración de 3 nmol/kg IRL1620. El aumento en la perfusión se encontró que fue significativo a los 15, 30 y 60 minutos comparada con la línea base así como con ratas tratadas con solución salina, (figuras 9A y 9B). La administración de 1 y 9 nmol/kg de IRL1620 produjo solamente aumentos marginales en la perfusión del tumor de seno en comparación a la perfusión de línea base y de las ratas tratadas con solución salina. Los aumentos del máximo en la perfusión (60.9 y 63.3%) fueron registrados a 120 y 30 minutos después de 1 y 9 nmol/kg de IRL1620, respectivamente. Sin embargo, los aumentos en la perfusión en los animales tratados con 9 nmol/kg de IRL1620 se encontró que fueron significativos a 15, 30 y 60 minutos con respecto a las ratas tratadas con solución salina (figura 9A). La administración de solución salina a las ratas que portaban el tumor no produjo ningún cambio significativo en la perfusión de la sangre comparada a la línea base (figura 9A). La administración de solución salina o de 1, 3 o 9 nmol/kg de IRL1620 no produjo ningún cambio significativo en la perfusión del seno en las ratas hembra normales (datos no mostrados). Estos resultados muestran que la administración de 3 nmol/kg o 9 nmol/kg IRL1620 produce un aumento en la perfusión del tumor comparado con a la línea base y a las ratas tratadas con vehículo. Aunque 1, 3 y 9 nmol/kg IRL1620 aumenten la perfusión del tumor en cierta medida, la dosis de 3 nmol/kg produce el efecto máximo.

Estud io de bio-distribución. Después de la formación del tumor seg ú n lo descrito previamente, las ratas fueron a nestesiadas con cetamina ( 1 00 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) como inyección combinada i.p. El peso corporal, la localización del tumor y el volumen del tumor de las ratas fueron documentados. Los animales entonces fueron agrupados aleatoriamente para recibir solución salina o I RL1 620 (3 nmol/kg) a través de la vena de la cola en u n volumen final de 0.2 mi. Las ratas de cada g rupo entonces recibieron [3H] paclitaxel (40 pCi/rata en 50:50 de Cremophor EL y etanol) en un volumen final de 1 .0 mi a 1 5, 1 20 y 240 min utos después de IRL1620. Seis ratas fueron estudiadas para cada punto de tiempo y un total de 36 ratas fueron utilizadas. Los animales fueron sacrificados 3 horas después de la adm in istración del [3H] paclitaxel . La concentración del paclitaxel [3H] fue determi nada en el tejido del tumor, los ríñones, el h ígado, los pulmones y el bazo. Específicamente , el tumor y los órganos fueron rebanados en pequeños pedazos. Aproximadamente 500 mg del tejido o del tumor fueron colocado en frascos separados que conten ían el solubilizador del tejido (6 mi) y se incubaron en un baño de ag ua a 50°C . Los frascos fueron retirados del ba ño de agua después de q ue el tejido o el tumor se disolvifueron y se agregaron 1 .2 mi de ácido acético glacial al 1 0% . El contenido del frasco fue dividido igualmente en 3 frascos y 1 5 mi de coctel del l íquido de centelleo (Safety Solve, R PI Corp, Chicago, I L) fueron agregados a cada frasco y almacenados durante la noche el equilibrio. La radiactividad en los tubos fue contada usando un contador de centelleo líquido (Beckman Coulter, LS 6500). La concentración del [3H] paclitaxel en el tumor aumentó perceptiblemente de las ratas tratadas con (3 nmol/kg) IRL1620 comparadas a las ratas tratadas con solución salina. El efecto máximo fue observado en el grupo de paclitaxel administrado a los animales 15 minutos después de la administración de IRL1620. Un aumento de 277.1, 151: 9 y 34.7% en la concentración del paclitaxel en el tumor fueron observados cuando el paclitaxel fue administrado 15, 120 y 240 minutos, respectivamente después de la administración de IRL1620 (figura 10). La administración IRL1620 no alteró perceptiblemente la acumulación de paclitaxel en el hígado, los pulmones, los ríñones y el bazo al compararse con los animales de control (figura 10). Estudio de la eficacia. Los animales que portaban el tumor (tratados con MNU) fueron divididos aleatoriamente en siete grupos (12 ratas/grupo): Grupo I - Solución salina; Grupo II - IRL1620 (3 nmol/kg); Grupo III - Cremophor EL: etanol; Grupo IV - Vehículo (solución salina) + paclitaxel (1 mg/kg); Grupo V - Vehículo (solución salina) + paclitaxel (5 mg/kg); Grupo VI - IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (1 mg/kg); y Grupo VII - IRL1620 (3 nmol/kg) + paclitaxel (5 mg/kg). El horario de dosificación fue una vez cada tres días para un total de 5 dosis. El peso corporal, el tamaño del tumor y la localización fueron supervisados cada tercer día durante un total de 30 días después de la dosis final. Las categorías siguientes fueron utilizadas para su calificación: Progresión: el tumor crece más del 40% en comparación al comienzo del tratamiento; Estasis: el tumor no fluctuó más del 40% de su área inicial a través del curso del tratamiento; regresión parcial: el tumor retrocedió más del 40% de su área inicial; termino de la remisión: el tumor ya no es palpable o mensurable; multiplicidad del tumor: aparición de nuevos tumores durante el tratamiento; y período de observación de 30 días. Los animales fueron sacrificados 30 días después de la dosis final (5°). Los datos fueron analizados usando el análisis de variación seguido por la prueba de Duncan. Un nivel de P<0.05 fue considerado significante. Peso corporal. Las diferencias del porcentaje en el peso corporal de animales de la línea base (antes de comenzar el tratamiento) a 30 días después de la dosis final se dan en figura 11. El aumento del porcentaje en peso corporal al final del experimento en ratas tratadas con solución salina de control fue 7.2 ± 1.7% en comparación con el peso corporal de la línea base. Hubo un aumento del 5.1 ± 3.6, 9.4 ± 2.4, 14.3 ± 3.1 y 13.1 ± 1.8% en el peso corporal en el grupo de animales tratados con el vehículo + el paclitaxel (1 mg/kg), el vehículo + paclitaxel (5 mg/kg), IRL1620 + paclitaxel 1 mg/kg y IRL1620 + paclitaxel 5 mg/kg, respectivamente (figura 11). El aumento del porcentaje en el peso corporal de los animales que recibieron Cremophor EL:etanol e IRL1620 comparado con la línea base se encontró que fue < 10% (datos no mostrados). Volumen del tumor. Los tamaños de tumor en varios grupos fueron comparables y no perceptiblemente diferentes entre sí al comienzo del tratamiento (figura 12). El volumen del tumor de ratas de control aumentó a una tasa rápida y variable. La gran variabilidad del crecimiento del tumor se puede atribuir a la estructura de crecimiento al azar de tumores con crecimiento autóctono. Al final del período de observación de 30 días, los tumores de control tenían un volumen del tumor 2693.4 ± 790.9 mm3. Las ratas tratadas con IRL1620 tenían un patrón similar de desarrollo con un volumen final del tumor de 2560.5 ± 844.4 mm3. El tratamiento de Cremophor EL:etanol también dio lugar a una estructura de crecimiento similar con un volumen final del tumor de 2338 ± 1329 mm3. Así, IRL1620 y cremophor EL:etanol no tuvieron por si mismo efectos significativos sobre el crecimiento de los tumores de seno inducidos por MNU (datos no mostrados). Las ratas tratadas con vehículo + paclitaxel (1 mg/kg) demostraron un crecimiento levemente reducido del tamaño de tumor (1960.8 ± 611.9 mm3). El grupo de vehículo + paclitaxel (5 mg/kg) mostró una reducción mayor en el volumen del tumor (1682.7 ± 497.3 mm3) al ser comparado con las ratas de control. Las ratas tratadas con IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) también mostraron una reducción del tamaño del tumor (1707.2 ± 621.1 mm3). Sin embargo, el tamaño medio menor del tumor (730.1 ± 219.4 mm3) fue observado en el grupo de animales tratados con IRL1620 + el paclitaxel (5 mg/kg). IRL1620 seguido por 5mg/kg paclitaxel cada tercer día para un total de 5 dosis (p<0.05) perceptiblemente redujo el volumen del tumor en comparación con las ratas a las que se les administro la solución salina + paclitaxel (5 mg/kg) (Figura 12). También se encontró que el volumen del tumor fue menor en el grupo de IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) en comparación con a las ratas trató con IRL1620 o cremophor EL:etanol (datos no mostrados). Multiplicación del tumor. Los animales en todos los grupos de tratamiento desarrollaron tumores adicionales para el final del período de observación de 30 días. Hubo un aumento de 58.4, 57.1 y 60.8% en aspecto adicional del tumor en los animales tratados con solución salina, cremophor EL:etanol e IRL1620, respectivamente. Se encontraron nuevas ocurrencias de tumores en el 78.3 y el 41% en los animales administrados con vehículo + paclitaxel (1 y 5 mg/kg, respectivamente). Sin embargo, el porcentaje de tumores adicionales se encontr que fue 69.2 y 44.8% en IRL1620 + paclitaxel (1 y 5 mg/kg, respectivamente) (datos no mostrados). Avance del tumor. El porcentaje de los tumores que avanzaron, permanecían en estasis, retrocedieron o desaparecieron se calculo según lo descrito previamente. 73.5% de tumores en el grupo tratado con solución salina tuvieron un avance mayor al 40% del tamaño de tumor inicial. Los grupos tratados con IRL1620 (82.7%) y el cremophor EL:etanol (80.4%) tuvieron un porcentaje similar de tumores que avanzaron más del 40% del tamaño inicial del tumor. Un porcentaje menor de tumores avanzaron en el grupo de vehículo + paclitaxel (5 mg/kg) (71.4%), el grupo vehículo + paclitaxel (1 mg/kg) ( 61.1%) y los grupos de IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) (69%). Pero, el porcentaje menor (40%) fue observado en el grupo de IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) (figura 13). Estasis del tumor. 16.9% de los tumores en las ratas tratadas con solución salina permanecían en estasis, no creciendo más allá del rango del 40% por el día final de 30 días. Otros grupos de control demostraron que seguía habiendo un porcentaje levemente menor de tumores en estasis: IRL1620 (13.7%), cremophor EL: etanol (15.2%). Vehículo + paclitaxel (1 mg/kg) (22.2%) y ratas tratadas con vehículo + paclitaxel (5 mg/kg) (19.5%) mostraron un porcentaje más alto de tumores que permanecían en estasis. Las ratas tratadas con IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) (23.8%) y las tratadas con IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) mostraron un porcentaje mayor de tumores que permanecían en el estasis (26.6%) (figura 13).

Regresión del tumor. La administración de IRL1620 antes del tratamiento con 5 mg/kg de paclitaxel redujo perceptiblemente el avance de los tumores comparados a los animales de control. Las ratas tratadas con solución salina mostraron un 9.2% de tumores que regresaban al volumen inicial del tumor. Las ratas tratadas con cremophor EL:etanol (4.3%), IRL1620 (3.4%) y vehículo + paclitaxel (1 mg/kg) (9.5%) no fueron perceptiblemente diferentes de aquellas del grupo de control en el porcentaje de tumores que retrosedieron de tamaño. Al final de la 5ta dosis, los tumores se habían retraído por 76.1 ± 10.5 y 45.9 ± 11.5% en las ratas tratadas con IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) y con vehículo + el paclitaxel (5 mg/kg), en comparación respectivamente a las ratas del control. Hubo una regresión de 80.2 un ± 6.9% ( p< 0.05) y 33.8 ± 19.4% en animales tratados con IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) y en el grupo de vehículo + paclitaxel (5 mg/kg), respectivamente (figura 13). La tasa de la regresión del tumor para el grupo de IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) y el grupo del vehículo + del paclitaxel (1 mg/kg) se encontró que era 47.1±15.4 y 37.7±16.2%, respectivamente. La administración del paclitaxel (5 mg/kg) 15 minutos después del IRL1620 produjo una regresión perceptiblemente mayor del tumor en comparación con la administración del paclitaxel (5 mg/kg) 15 minutos después de la solución salina. Los grupos tratados con cremophor EL:etanol y IRL1620 no fueron perceptiblemente diferentes en su regresión del tumor al ser comparados con las ratas del control en cualquier momento del tiempo (datos no mostrados). Remisión del tumor. La regresión completa, en donde los tumores desaparecieron totalmente, se observó solamente en dos grupos. Las ratas tratadas con IRL1620 + paclitaxel (1 mg/kg) (2.3%) e IRL1620 + paclitaxel (5 mg/kg) ( 15%) (figura 13). Los resultados de estos estudios de la eficacia indican que la administración de IRL1620 aumenta perceptiblemente la reducción inducida por el paclitaxel en el volumen del tumor comparado con las ratas tratadas con solución salina administradas con el paclitaxel. El mayor beneficio terapéutico considerado a la dosis de 5 mg/kg de paclitaxel se mantuvo hasta 30 días después de la dosis final. Esto indica que no hubo recaída en el volumen del tumor y el efecto de IRL1620 en el aumento de la eficacia del paclitaxel permaneción constante hasta el final del estudio. Sin embargo, el tratamiento con solución salina seguido por paclitaxel (1 y 5 mg/kg) no produjo un cambio tan significativo en el crecimiento del tumor. Además, la multiplicación del tumor fue reducida en el grupo de ratas tratadas con IRL1620 seguido por paclitaxel (5 mg/kg). Así, la administración IRL1620 antes del paclitaxel (5 mg/kg) tiene un efecto significativo sobre la eficacia del paclitaxel. Esto se ilustra mediante la disminución en la carga del tumor, el porcentaje de regresión del tumor, peso corporal no afectado y multiplicación. Además, hubo una remisión completa de 2.3 y del 15% de los tumores iniciales en el grupo de animales tratados con IRL1620 seguido por 1 y 5 mg/kg de paclitaxel, en comparación respectivamente con cualquier otro grupo. Los experimentos descritos en estos ejemplos de un modelo del tumor del seno muestran claramente que el agonista del receptor de ETB, IRL1620 aumenta perceptiblemente el flujo sanguíneo del tumor. La administración de IRL1620 produjo un aumento en flujo sanguíneo del tumor, mientras que la perfusión en tejido sano del control no fue alterado. El aumento en la perfusión del tumor duró 3 horas. La administración del [3H] paclitaxel durante la ventana de la perfusión elevada, aumentó perceptiblemente la concentración del [3H] paclitaxel en el tejido del tumor solamente pero no en otros órganos. Por otra parte, los resultados de los experimentos descritos en este ejemplo proporcionan evidencia de que la administración de IRL1620 podría galvanizar la eficacia antitumores del paclitaxel. Hubo una reducción 60.0% en el volumen del tumor en ratas tratadas con el paclitaxel (5 mg/kg), cada tercer día para un total de 5 dosis, con respecto a ratas del control. Sin embargo, la administración del paclitaxel 15 minutos después de que la administración IRL1620 redujo el volumen del tumor a 268.9% en comparación con las ratas del control al registrarse un mes después de la última dosis del paclitaxel. Hubo una reducción del 130.4% en volumen del tumor en las ratas a las que se les había administrado IRL1620 con respecto a las ratas tratadas solamente con paclitaxel. Hay una posibilidad que la perfusión elevada del tumor puede aumentar la disponibilidad de los alimentos que pudieran facilitar el crecimiento del tumor. Estos resultados demuestran que no hubo aumento significativo en volumen del tumor y multiplicación del tumor en las ratas tratadas con IRL1620 en comparación con las ratas tratadas con solución salina, indicando que el IRL1620 solo no produjo ningún efecto sobre el volumen y la multiplicación del tumor. MODELO DEL TUMOR DE PRÓSTATA Ejemplo 5. Efecto de IRL1620 sobre la perfusión, biodistribución y eficacia en el tumor de próstata de doxorubicina y de 5-Fluorouracilo Después de demostrar que IRL1620 puede mejorar la eficacia del paclitaxel en un modelo del tumor de seno, también fue examinado su efecto en un modelo del tumor de próstata. Específicamente, si IRL1620 podría mejorar los efectos anticáncerosos de doxorubicina (DOX) y 5-Fluorouracilo (5-FU) en un modelo de tumor de cáncer de próstata. Ratas de Copenhague de cinco semanas de edad que portaban un tumor de próstata (Harían, Indianapolis.lN) pesando 100-120 gramos fueron elegidas para ser usadas en los estudios descritos del modelo de tumor de próstata. Las instalaciones para los animales fueron conservadas a una temperatura controlada de 23 ± 1(°C), humedad (50 ± 10%) y un esquema de 12 horas de luz/oscuridad con iluminación artificial (L0600-1800 h). Las ratas fueron alojadas en grupos de tres en una jaula y se les suministro alimento y agua ad libitum. Se permitió que las ratas se aclimataran al ambiente por lo menos una semana antes de la examinacion veterinaria y el principio del experimentao. Todos los procedimientos y cuidados de los animales estuvieron de acuerdo con las pautas establecidas por el comité del cuidado animal de la Universidad de Illinois en Chicago. Las instalaciones animales fueron mantenidas según las regulaciones federales y fueron acreditadas por la asociación americana para la acreditación del cuidado del animal de laboratorio. IRL1620 fue comprado a American Peptide (Sunnyvale, CA). El clorhidrato de [14C]doxorubicina ([14C]adriamicina) fue comprado a GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). La cetamina y la xilazina fueron comprados de Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). El solubilizador de tejido (TS-2) fue obtenido de RPI Corp. (Chicago, IL). Los tumores de próstata fueron inducidos en las ratas de Copenhague macho usando las células JHU-4 (MAT-LyLu) obtenidas de ATCC (Manassas, VA). Ver Gaddipati et al., J Exp allí Oncol, 4 (3): 203-12 (2004) que se incorpora como referencia. Las células fueron mantenidas en medio de RPMI 1640 complementadas con suero vacuno fetal (10%) en una incubadora humedecida que contenía 5% C02 a 37°C. Se afeito el pelo del lado dorsal del cuello, y los animales fueron inoculados con 10.000 células JHU-4 (MAT LyLu) en 100µ? DE solución salina amortiguada con fosfato mediante inyección subcutánea (s.c). El aspecto y la localización del tumor fueron supervisados por palpación manual y los diámetros del tumor fueron medidos con un calibrador digital. Los procedimientos experimentales comenzaron una vez que el tamaño de tumor alcanzó más de 200mm3. Estudio de perfusión. Las ratas fueron anestesiadas usando cetamina (100 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) como inyección intraperitoneal combinada (i.p.). La piel fue afeitada alrededor del área del tumor y los animales fueron colocados en un cojín caliente (37°C) para minimizar las variaciones de la temperatura. La piel que rodeaba el tejido del tumor fue retirada aproximadamente 3 mm de ancho y de 3 mm de largo para exponer el tumor. Una sonda de fibra óptica del modelo estándar conectada con una flujometría del láser doppler de Periflux PF2B 4000 (la sonda del flujo MP3, Moors Instruments, Devon, Inglaterra) fue aplicada a la superficie del tumor expuesto. La constante de tiempo fue fijada en 1.5 segundos y el ancho de banda fue fijado en 4 kilociclos. Este método mide un cambio doppler en la luz láser (flujo), que se determina por el número y velocidad de eritrocitos, y es proporcional al flujo sanguíneo total dentro de un volumen dado de tejido. Los valores del flujo fueron adquiridos usando el software Polyview. Una línea base de 15 minutos de registro estable fue obtenida antes de la administración de la solución salina o de IRL1620. Los animales recibieron IRL1620 (1, 3, o 6 nmol/kg) en un volumen final de 0.2 mi vía la vena de la cola y la perfusión fue registrada durante 3 horas. Como puede ser visto en las figuras 14A y 14B, la administración de solución salina o de 1 nmol/kg IRL1620 no produjo ningún cambio significativo en la perfusión de la sangre del tumor en ratas que portaban el tumor. La administración de 3 nmol/kg o de 6 nmol/kg causó un aumento máximo en la perfusión de la sangre del tumor de 102.8% y 79.12% de la línea base respectivamente. Este aumento en la perfusión fue significativo a los 15, 30, y 60 minutos en comparación con a la línea base y a las ratas tratadas con solución salina (p< 0.005). Así, las dosis apropiadas de IRL1620 aumentan transitoriamente la perfusión de la sangre del tumor en un modelo animal del cáncer de próstata. Estudio de biodistribución. Las ratas que portaban el tumor fueron agrupadas aleatoriamente (N=6/grupo) para recibir de solución salina o de IRL1620 (1, 3 o 6 nmol/kg) vía la vena de la cola en un volumen final de 0.2 mi. Las ratas de cada grupo entonces recibieron I [1 C] doxorubicina (1 Ci/rata) i.v. en un volumen final de 1.0 mi 15 minutos después de la administración de solución salina o de IRL1620. Los animales entonces fueron sacrificados 3 horas después de la administración del [14C]doxorubicina. Se examino la concentración de [14C]doxorubicina en el tumor, el corazón, el cerebro, los ríñones, el hígado, los pulmones, la médula, la próstata, los músculos esqueléticos y el bazo. Específicamente, el tumor y los órganos fueron rebanados en pequeños pedazos. Los fémures de ambas piernas fueron separados y pesados eliminando la médula usando una jeringa que contenía el solubilizador de tejido. Aproximadamente 500 mg del tejido o del tumor se colocaron en los frascos separados que contenían el solubilizador de tejido (6 mi) y se incubaron en un baño de agua a aproximadamente 50°C. Los frascos fueron retirados del baño de agua después de que el tejido o el tumor fuera disuelto y se agregaron 1.2 mi de ácido acético glacial al 10%. El contenido del frasco entonces fue dividido igualmente en 3 frascos y 15 mi de coctel líquido de centelleo (Safety Solve, RPI Corp, Chicago, IL) fueron agregados a cada frasco y almacenados durante la noche para su equilibrio. La radiactividad en los tubos fue contada usando un contador de centelleo líquido (Beckman Coulter, LS 6500). Como puede observarse en la figura 15, la administración de 1 nmol/kg de IRL1620 no produjo ningún cambio significativo en la absorción de [ 4C] doxorubicina en el tumor y en otros tejidos. Las concentraciones del [ C] doxorubicina en el tumor, sin embargo, fueron aumentadas perceptiblemente en aquellas ratas que recibían 3 nmol/kg de IRL1620 (aumento del 115.85%; p< 0.01) o 6 nmol/kg IRL1620 (aumento del 80.02%; p< 0.05) en comparación a las ratas tratadas con solución salina. Ninguna dosis de IRL1620 produjo aumentos importabantes en la acumulación del [ 4C] doxorubicina en el corazón, el cerebro, los ríñones, el hígado, los pulmones, la médula, la próstata, los músculos esqueléticos o el bazo en comparación a los animales de control. Así, IRL1620 puede aumentar selectivamente el suministro de agentes quimíoterapéuticos al tejido del tumor. Estudios de la eficacia: Efecto de IRL1620 sobre la eficacia de la doxorubicina (DOX) En este estudio, IRL1620 (fragmento 8-21 de N-Succinil- [Glu9, Ala11,15] endotelina) fue obtenido de American Peptide (Sunnyvale, CA). El clorhidrato de doxorubicina (adriamicina, 2 mg/ml en solución) fue comprado a Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford, OH). 5-Flurouracilo (50 mg/ml) fue comprado a Cadlia Pharmaceuticals (Ahmedabad, India). Cetamina y xilazína fueron compradas de Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). Los tumores de la próstata fueron inducidos en las ratas de Copenhague macho de cinco semanas de edad (Harían, Indianapolis, IN) según lo descrito previamente. Los procedimientos experimentales comenzaron una vez que el tamaño de tumor alcanzó más de 200mm3. Los animales que portaban el tumor fueron divididos aleatoriamente en seis grupos (8 ratas/grupo): Grupo I - Solución salina; Grupo II - IRL1620 (3 nmol/kg); Grupo III - Vehículo (solución salina) + DOX (2.5 mg/kg); Grupo IV (solución salina) + DOX (5 mg/kg); Grupo V - IRL1620 (3 nmol/kg) + DOX (2.5 mg/kg); y Grupo VI - IRL1620 (3 nmol/kg) + DOX (5 mg/kg). DOX fue diluidoaen solución salina a un volumen final de 1.0 mi e inyectada vía la vena de la cola 15 minutos después de la solución salina o de la administración de IRL1620. El horario de dosificación fue una vez cada tres días para un total de 4 dosis. El peso corporal y el tamaño de tumor fueron supervisados cada tercer día hasta 12 días después de la dosis final. Los animales fueron sacrificados 12 días después de la dosis final (4ta). Los tumores fueron separados y pesados, y los tejidos fueron observados en cuanto a la metástasis gruesa. Los tejidos y el tumor fueron preservados en formalina amortiguada al 10% para el análisis histopatológico. Peso corporal. Hubo un aumento en peso corporal en los grupos de ratas tratadas con solución salina o IRL1620 solamente. El peso corporal de los animales que recibieron solución salina o solo IRL1620 al principio del experimento se encontró que eran 152 ± 6.97 y 148.8 ± 2.52 g respectivamente que aumentó 178.8 al ± 4.7 y 175.72 ± 2.35 g, respectivamente, el día 19 del estudio. Las ratas que recibieron la solución salina y DOX, o IRL1620 y DOX mostraron una disminución del peso corporal. La disminución máxima del peso corporal se encontró que era -8.46 ± 3.88 y -10.03 ± 2.12 en el grupo de ratas tratadas con solución salina + DOX (5 mg/kg) e IRL1620 + DOX (5 mg/kg), respectivamente, en el día 13. Sin embargo, la disminución del peso corporal no se considero imortante en cualquier momento entre los grupos que recibieron DOX al principio del tratamiento (figura 16A). Volumen del tumor. El volumen del tumor de las ratas tratadas con solución salina o de IRL1620 aumento rápidamente y todas las ratas en estos grupos fueron sacrificadas el día 19 debido a la carga grande del tumor. Todos los otros grupos fueron sacrificados el el día 22. Las ratas tratadas con solución salina o IRL1620 tenían un volumen de tumor de 10166 ± 957 y 11033 ± 873 mm3, respectivamente, después del sacrificio. El volumen del tumor de las ratas tratadas con solución salina + DOX (2.5 mg/kg) y solución salina + de DOX (5 mg/kg) se encontró que era 9102 ± 1442 y 4204 ± 299 mm3, respectivamente. Las ratas tratadas con IRL1620 + DOX (2.5 mg/kg) registraron un volumen del tumor de 5544 ± 845 mm3. El volumen menor del tumor (1965 ± 332 mm3) fue observado en el grupo de ratas tratadas con IRL1620 + DOX (5 mg/kg). La disminución del volumen del tumor en ratas tratadas con IRL1620 + DOX (5 mg/kg) se encontró que era significativa en los días 10, 13, 16, 19 y 22 con respecto las ratas tratadas con solución salina + DOX (5 mg/kg) (figura 16B). Peso del tumor. Las ratas tratadas con solución salina, IRL1620, y solución salina + de DOX (2.5 mg/kg) tenían un peso comparable del tumor después del sacrificio (19.14 ± 1.8, 20.77 ± 1.64 y 17.14 ± 2.42 g, respectivamente). El peso o las ratas del tumor trató con solución salina + DOX (5 mg/kg); IRL1620 + DOX (2.5 mg/kg) e IRL1620 + DOX (5 mg/kg) se redujo a 7.19 al ± 0.56, 10.44 ± 1.42 y 3.31 ± g 1.64 respectivamente después del sacrificio el día 22. Hubo una diferencia significativa en el peso del tumor entre las ratas tratadas con solución salina + DOX (5 mg/kg) e IRL1620 + DOX (5 mg/kg) (< de p; 0.005). Estos estudios demuestran que IRL1620 aumentó perceptiblemente la eficacia anticáncer de DOX (figura 16C). Estudios de eficacia: Efecto de IRL1620 sobre la eficacia de 5-Flurouracilo (5-FU) En un estudio complementario, los mismos procedimientos fueron seguidos salvo que las ratas que portaban el tumor fueron seleccionadas al azar en los seis grupos siguientes (6 ratas/grupo) para examinar el efecto de IRL1620 sobre la eficacia de 5-FU: Grupo I - Solución salina; Grupo IL - IRL1620 (3 nmol/kg); Grupo III - Vehículo (solución salina) + 5-FU (25 mg/kg); Grupo IV - Vehículo (solución salina) + 5-FU (50 mg/kg); Grupo V - IRL1620 (3 nmol/kg) + 5-FU (25 mg/kg); y Grupo VI - IRL1620 (3 nmol/kg) + 5-FU (50 mg/kg). 5-FU se diluyó en solución salina a un volumen final de 1.0 mi y se inyecto vía la vena de la cola 15 minutos después de la administración de la solución salina o de IRL1620. El horario y los procedimientos de dosificación fueron iguales a los del estudio anterior para DOX.

Peso corporal. El peso corporal de los animales tratados con la solución salina o IRL1620 al principio del experimento se encontró que era 172 ± 4.87 y 176.9 ± 6.19 g respectivamente, que aumentó a 200.3 al ± 2.57 y 202.2 ± 7.28 g, respectivamente en el día 16. La diferencia del porcentaje en el aumento del peso corporal de los animales tratados con solución salina o IRL1620 en el día 16 del principio del experimento se encontró que era 16.17 ± 1.64 y 14.19 ± 1.66 respectivamente. El peso corporal de ratas en otros grupos fue comparable al inicio del tratamiento y se encontró que era 170.38 ± 2.61, 174.6 ± 3.45, 174.7 ± 5.78 y 179.45 ± 2.53 g para la solución salina + 5-FU (25 mg/kg), solución salina + 5-FU (50 mg/kg), IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg) e IRL1620 + 5-FU (50 mg/kg) respectivamente. Sin embargo, el peso corporal disminuyó entre tanto por las cantidades siguientes: solución salina + 5-FU (25 mg/kg):- 5.46 ± 3.39; solución salina + 5-FU (50 mg/kg): -10.97 ± 2.18; IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg):- 8.27 ± 2.31; e IRL1620 + 50 mg/kg: -11.20 ± 2.41 (figura 17A). Volumen del tumor. Las ratas tratadas con solución salina o IRL1620 tenían un aumento progresivo rápido en el tamaño del tumor y todas las ratas en estos grupos fueron sacrificadas el día 16 debido a la carga grande del tumor. No hubo diferencia significativa en el tamaño de tumor de las ratas administradas con solución salina + 5-FU (25 mg/kg) e IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg). Sin embargo, hubo una disminución significativa constante del volumen del tumor de ratas tratadas con IRL1620 + 5-FU (50 mg/kg) en los días 13, 16, 19 y 22 con respecto a las ratas tratadas con solución salina + FU (50 mg/kg) (figura 17B). Peso del tumor. No hubo diferencias significativas en el peso del tumor de ratas administradas con solución salina o IRL1620 después del sacrificio el día 16 (los pesos fueron 17.92 ± 2.01 y 19.50 ± 2.37 g respectivamente). Hubo una disminución del 38.18% del peso del tumor de ratas tratadas con IRL1620 + 5-FU (25 mg/kg) con respecto a solución salina + 5-FU (25 mg/kg). Por otra parte, hubo una diferencia del 167.19% en peso del tumor de las ratas tratadas con IRL1620 + 5-FU (50 mg/kg) y solución salina + 5-FU (50 mg/kg) ratas (p< 0.01) (Figura 17C). Estos resultados demuestran que IRL1620 aumenta perceptiblemente la eficacia de 5-FU en la reducción del volumen del tumor y del peso del tumor. Estos estudios demuestran colectivamente que IRL1620 es eficaz en un modelo animal de cáncer de próstata para mejorar la perfusión de la sangre del tumor, aumentar el suministro de agentes quimioterapéuticos al tumor y promover la eficacia de agentes quimioterapéuticos. MODELO DE MELANOMA Ejemplo 6. Efecto de IRL1620 sobre la perfusión del tumor y la biodistribución de Paclitaxel Ratones desnudos machos fueron utilizados en los estudios descritos del modelo del melanoma. Todos los procedimientos y cuidados del animal estuvieron de acuerdo con las pautas establecidas por el comité del cuidado animal de la Universidad de Illinois en Chicago. Las instalaciones animales fueron conservadas a una temperatura controlada (humedad de 23 ± 1°C) (50 ± 10%) y bajo iluminación artificial (L0600-1800 h). Las instalaciones animales fueron mantenidas según las regulaciones federales y son acreditadas por la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado del Animal de Laboratorio. IRL1620 (fragmento 8-21 de N-Succinil- [Glu9, Ala11,15] endotelina) fue obtenido de American Peptide (Sunnyvale, CA). [3H] -paclitaxel fue comprado a Moravek Biochemicals (Moravek Biochemicals, CA). Paclitaxel (solución de 6 mg/ml) fue comprado a Ben Venue Laboratories Inc. (Bedford OH). Cetamina y xilazina fueron compradas a Phoenix Scientific, Inc. (St. Joseph, MO). El solubilizer del tejido (TS-2) fue comprado a RPI Corp. (Chicago, IL). Un modelo de melanoma transplantado inoculado con un linaje celular se utilizo para el estudio. Los ratones fueron inoculados subcutáneamente con un millón células de melanoma humano (UISO-MEL-2). Los ratones con un volumen de tumor de aproximadamente 200-400mm3 fueron seleccionados para el estudio. Estudio de perfusión. Los ratones (N=4/grupo) fueron anestesiados usando cetamina (150 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) como inyección combinada i.p. Los animales fueron colocados en un cojín caliente (37°C) para minimizar las variaciones de la temperatura. Una incisión de 10 mm de largo fue hecha en la piel que rodeaba el tumor. Una sonda de fibra óptica del modelo estándar conectada con una flujometría del láser doppler Periflux PF2B 4000 (la sonda del flujo MP3, Moors Instruments, Devon, Inglaterra) fue aplicada a la superficie del tumor expuesto. La constante de tiempo fue fijada a 1.5 segundos y el ancho de banda fue fijada a 4 kilociclos. Los valores del flujo fueron adquiridos usando el software Polyview. Una línea base de 15 minutos de registro estable fue obtenida antes de que la administración de solución salina o de IRL1620 (3 nmol/kg) vía la vena y la perfusión de la cola fuera registrada durante 3 horas.

La administración de solución salina no produjo ningún cambio significativo en la perfusión de la sangre del tumor en los ratones del melanoma. Un aumento de 154.4%, 189.0%, 198.1%, 172.8% y 94.07.12% de línea base en la perfusión del tumor fue observado a 30, 60, 90, 120 y 150 minutos respectivamente después de la administración de IRL1620. Así, IRL1620 aumentó perceptiblemente la perfusión de la sangre del tumor en ratones con melanoma en comparación a los controles tratados con solución salina. Este efecto fue transitorio, durando aproximadamente 2 horas (figuras 18A y 18B). Estudio de Biodistribución. Los ratones que portaban el tumor fueron anestesiados con cetamina (150 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) como inyección combinada i.p. Los animales fueron agrupados aleatoriamente (N=4/grupo) para recibir solución salina o IRL1620 (3 nmol/kg) vía la vena de la cola en un volumen final de 0.1 mi. Los ratones de cada grupo también recibieron el [3H]paclitaxel (10 pCi/ratón en 50:50 de Cremophor EL y del etanol) diluido a una concentración de [3H]paclitaxel del 20:80: solución salina en un volumen final de 1.0 mi (i.v) 15 minutos después de la administración de solución salina o IRL1620. Los animales fueron sacrificados 3 horas después de la administración del [3H]paclitaxel La concentración del [3H]paclitaxel fue determinada en el tumor, el corazón, los ríñones, el hígado, los pulmones y el bazo. El tumor y los órganos fueron rebanados en pequeños pedazos. 500 mg del tejido o del tumor fueron colocados en los frascos separados que contenían el solubilizador del tejido (6 mi) y se incubaron en un baño de agua a 50° C. Los frascos fueron retirados del baño de agua después de que el tejido o el tumor se disolviera y fueron agregados 1.2 mi de ácido acético glacial al 10%. El contenido del frasco fue dividido igualmente en 3 frascos y 15 mi de coctel líquido del centelleo (Safety Solve, RPI Corp, Chicago, IL) fueron agregados a cada frasco y almacenados durante la noche para su equilibrio. La radiactividad en los tubos fue contada usando un contador de centelleo líquido (Beckman Coulter, LS 6500). Como se muestra en la figura 19, la concentración del [3H]paclitaxel en el tumor fue aumentada perceptiblemente en los ratones tratados con IRL1620 en comparación a los ratones tratados con solución salina. La concentración del [3H]paclitaxel en el tumor se encontró que era 40.77 y 274.28 nmol/g de tejido en los animales inyectados con solución salina o IRL1620, respectivamente, 15 minutos antes de la administración del [3H]paclitaxel . Hubo un aumento del 572.99% en el [3H]paclitaxel del tumor de los anímales tratados con IRL1620 comparado a los ratones tratados con vehículo.

Sin embargo, la administración de I R L1 620 no produjo aumentos significativos en la acumulación del [3H]paclitaxel en el corazón , los ríñones, el h ígado, los pulmones o el bazo al compa rarse con los animales tratados con solución salina . Así , I RL1 620 puede mejora r perceptiblemente la absorción y el suministro del paclitaxel a los tejidos del tumor sin afectar su suministro a otros órganos. En conclusión , I RL 1620 se puede util izar como vasodilatador tumor-selectivo y se puede utiliza r para aumentar selectivamente el suministro y la eficacia de los agentes q uimioterapéuticos. El presente estudio demuestra claramente q ue se pueden alcanzar concentraciones muchas veces mayores del fá rmaco en el tejido del tumor adoptando esta estrategia terapéutica . Finalmente, se han propuesto los antagonistas del receptor de ETA también para mejorar el flujo sangu íneo del tumor (Sonveaux et al. , Cáncer Res, 64:3209 (2004)) y puede ser utilizada para mejorar el sumi nistro de fármacos anticancerosos al tumor de acuerdo con la presente invención . Las composiciones farmacéuticas que contienen los ingredientes activos descritos son conven ientes para la administración a los seres humanos o a otros mam íferos. Típicamente las composiciones farmacéuticas son estériles y no contienen ning ún compuesto tóxico, carcinógeno, o mutágeno que cause una reacción adversa al ser administrado. La admin istración de la composición farmacéutica puede ser realizada antes, du ra nte , o después del inicio del crecimiento sólido del tumor. U n método de la presente invención puede ser realizado usando los ingredientes activos q ue se describen anteriormente, o como sal fisiológicamente aceptable, derivado, profármaco, o solvato de los mismos . Los ing red ientes activos se pueden admi nistrar como compuesto pu ro , o como composición farmacéutica que contiene una o ambas entidades. Las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas en donde los ing redientes activos se administran en u na cantidad eficaz para alcanzar su propósito previsto. Más específicamente, u na "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad eficaz pa ra prevenir el desarrollo de , eliminarlo, retardar la prog resión de, o reducir el tamaño de un tu mor sólido. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser realizada por los expertos en la materia , especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada aqu í . Una "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de los ingred ientes activos que dan como resultado la obtención del efecto deseado. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales ingredientes activos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o a n imales de experimentales, por ejemplo determinando el LD50 (la dosis mortal para hasta el 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz para el 50% de la población) . La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se expresa como la proporción entre LD50 y ED50. Se prefiere un alto índice terapéutico. Los datos obten idos pueden ser utilizados para formu lar un rango de dosificación para el uso en seres h umanos. La dosificación de los ing redientes activos queda preferiblemente dentro de un rango de concentraciones de circulación que incluyan ED50 con poco o nada de toxicidad . La dosificación puede variar dentro de este rango depend iendo de la forma de dosificación empleada , y de la ruta de administración utilizada . La form ulación y la dosificación exactas se determinan por u n médico individ ual en base a la condición del paciente. La cantidad y el intervalo de la dosificación se pueden ajustar ind ividua lmente para proporcionar los niveles de los ingredientes activos que son suficientes para mantener los efectos terapéuticos o profilácticos. La cantidad de composición fa rmacéutica admin istrada puede depender del paciente tratado , de su peso , de la severidad de la aflicción , la manera de administración , y el juicio del médico que prescribe. Los ing redientes activos se pueden admin istrar solos, o con un portador farmacéutico seleccionado con respecto a la ruta prevista de administración y de la práctica farmacéutica estánda r. Composiciones fa rmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular así de una manera convencional usando uno o más portadores fisiológicos aceptables q ue incluyen los excipientes y los auxiliares q ue facilitan el proceso de los ingredientes activos en las preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente.

Cuando se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de los ing redientes activos, la composición puede estar bajo la forma de solución acuosa libre de pirógenos, parenteralmente aceptable. La preparación de tales soluciones parenteral aceptables , teniendo la debida consideración al pH , isoton icidad , estabilidad , y similares, está dentro de la habilidad normal en la téncica. U na composición preferida para la inyección intravenosa contend rá típicamente u n veh ículo isotónico aunq ue esta característica no se req u iere. Para el uso veterinario, los ing red ientes activos se admi n istran como formulación convenientemente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal . El veterina rio puede determinar fácilmente el régimen de dosificación q ue sea el más apropiado para un animal particular. Pueden realizarse y utilizarse varias adaptaciones y modificaciones a las modalidades sin salirse del alcance y del espíritu de la presente i nvención que se pueden relaizar de una forma diferente a lo descrito específicamente aqu í . La descripción anterior se pretende sea ilustrativa , y no restrictiva . El alcance de la presente invención debe ser determinado solamente por las reivindicaciones. Los términos y las expresiones que se han empleado aqu í se utilizan como términos de descripción y no de limitación , y no se tiene la intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir los equ ivalentes de las características demostradas y descritas, o porciones de ellas, reconociéndose q ue varías modificaciones son posibles dentro del alcance de la presente invención . Por otra parte, una o más características de cualquier modalidad de la presente invención se puede combina r con cualquier una o más ca racterísticas de cualquier; otra modalidad de la presente invención , sin salirse del alcance de la presente invención . A menos que se indicase lo contrario , todos los n úmeros que expresan cantidades de ing redientes, las ca racterísticas tales como peso molecu lar, las condiciones de reacción , y así sucesivamente usadas en la especificación y las reivindicaciones deben ser entendidos como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente" . Por consig uiente, a menos q ue se indiq ue lo contrario, los parámetros n uméricos ind icados en la descripcón siguiente y las reivindicaciones anexas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las características deseadas q ue se pretende sean obten idas por la presente invención . Por lo menos, y no como intento de limitar el uso de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro n umérico se debe por lo menos interpretar a la luz del n úmero de d ígitos sig n ificativos presentados y aplicando técnicas de redondeo ordinarias. A pesar de que los rangos y parámetros numéricos que disponen el alcance amplio de la presente invención son aproximaciones, los valores numéricos dispuestos en los ejemplos específicos se i ndican tan exactamente como sea posible. Cualq uier valor numérico, sin embargo, intrínsecamente contiene ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus medidas respectivas de la prueba. Los términos "un" y "una" y "el" y similares usados en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) deben ser interpretados para cubrir el singular y el plural, a menos que se indicare lo contrario aquí o claramente por el contexto. La indicación de rangos de valores aquís se pretende que simplemente sirva como método rápido para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del rango. A menos que se indique lo contrario aquí, cada valor individual se incorpora en la especificación como si fuera descrito individualmente aquí. Todos los métodos descritos aquí se pueden realizar en cualquier orden conveniente a menos que se indique lo contrario aquí o de otra manera claramente por el contexto. El uso de cualesquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo "tal como") provisto aquí se pretende aclarar mejor la invención y no plantear una limitación en el alcance de la presente invención reivindicada de otra manera. Ningún lenguaje en la descripción se debe interpretar como indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la presente invención. Las agrupaciones de elementos alternativos o las modalidades de la presente invención descritaa aquí no deben ser interpretadas como limitaciones. Cada miembro del grupo puede ser referido y ser reivindicado individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo o de otros elementos encontrados aquí. Se prevee q ue u no o más miembros de u n g rupo pueden ser incluidos, o suprimirse de, u n g rupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad . Cua ndo ocu rre cualquier inclusión o cancelación de ese tipo, se considera q ue la descripción contiene el g rupo según lo modificado satisfaciendo así la descripción escrita de todos los grupos de Markush usados en las reivindicaciones anexas. Ciertas modalidades de esta invención se describen aqu í , incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para realizar la invención . Por supuesto, las variaciones en estas modalidades llegarán a ser evidentes para aq uellos con experiencia ordinaria en la técnica después de la lectura de la descripción precedente. El inventor espera que los técnicos expertos empleen las variaciones como apropiadas ; y los inventores pretenden que la invención sea practicada de otra manera a la descrita específicamente aqu í.. Por consiguiente , esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del tema recitado en las reivindicaciones anexas a esto según lo permitido por ley aplicable. Por otra parte, cualquier combinación de los elementos descritos antes en todas las variaciones posibles es incluida en la invención a menos q ue se indique lo contra rio aq u í o se ind icase de otra manera claramente por contexto. Además, las referencias n uméricas que se han hecho a patentes y a publicaciones impresas en esta descripción . Cada una de las referencias arriba citadas y las publicaciones impresas aqu í son incorporadas individualmente como referencia .

Concluyendo, debe ser entendido que las modalidades de la presente invención descrita aqu í son ilustrativas de los principios de la presente invención . Otras mod ificaciones q ue pueden ser empleadas están dentro del alcance de la presente invención . Así , a modo de ejemplo , pero no de la limitación , las configuraciones alternativas de la presente invención se pueden utilizar de acuerdo con las presentes enseñanzas. Por consig uiente, la presente invención no se limita exactamente a lo que se muestra y se describe.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para contribuir al tratamiento de un cáncer que incluye administrar un agonista de endotelina B (ETB) y un agente quimioterapéutico.
2. 2. Un método según la reivindicación 1 en donde el cáncer es un tumor sólido.
3. 3. Un método según la reivindicación 2 en donde el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en un tumor ovárico, un tumor colón, sarcoma de Kaposi, un tumor de seno, un melanoma, un tumor de próstata, un meniangioma, un tumor de hígado, un tumor filoide de seno y sus combinaciones.
4. 4. Un método según la reivindicación 1 en donde el agonista de ETB se selecciona del grupo ET-1 que consiste de, ET-2, ET-3, BQ3020, IRL1620 (N-suc- [Glu9, Ala11 15] ET-1 (8-21)), sarafotoxina 56c, [Ala 1·3·11·15] ET-1, y sus combinaciones.
5. 5. Un método según la reivindicación 1 en donde el agente quimioterapéutico se selecciona de adriamicina que consiste del grupo, de camptotecina, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interleucina 2, irinotecan, docetaxel, paclitaxel, topotecan, 5-fluorouracil, y sus combinaciones.
6. 6. Un método según la reivindicación 2 en donde el agonista de ETB aumenta selectivamente el suministro de sangre al tumor sólido.
7. 7. Un método según la reivindicación 6 en donde el aumento en el suministro de sangre aumenta el suministro del agente quimioterapéutico al tumor sólido.
8. 8. Un método según la reivindicación 1 en donde el agonista de ETB y el agente quimioterapéutico se administran substancialmente de forma simultánea.
9. 9. Un método según la reivindicación 8 en donde el agonista de ETB y el agente quimioterapéutico se administran como una sola composición.
10. 10. Un método según la reivindicación 1 en donde el agonista de ETB y el agente quimioterapéutico se administran secuencialmente.
11. 11. Un método según la reivindicación 10 en donde el agente quimioterapéutico se administra antes del agonista de ETB o el agonista de ETB se administra antes del agente quimioterapéutico.
12. 12. Una composición que incluye un agente quimioterapéutico, un agonista de ETB, y un excipiente opcional.
13. 13. Un artículo de manufactura que incluye una composición que incluye un agonista de ETB, e información de intrucción que dirige la administración de la composición con un agente quimioterapéutico para tratar un tumor sólido.
14. 14. Un artículo de manufactura según la reivindicación 13 que además lejos incluye al agente quimioterapéutico.
15. 15. Un artículo de manufactura según la reivindicación 14 en donde el agonista de ETB y el agente quimioterapéutico son parte de la misma composición, se proporcionan como composiciones separadas, o ambas.
16. 16. Un artículo de manufactura según la reivindicación 14 en donde el agonista de ETB se selecciona del grupo ET- que consiste en, ET-2, ET-3, BQ3020, IRL1620 (N-suc- [Glu9, Ala11'15] ET-1 (8-21)), sarafotoxina 56c, [Ala 1·3·11·15] ET-1,, y sus combinaciones.
17. 17. Un artículo de manufactura según la reivindicación 14 en donde el agonista de ETB es IRL1620.
18. 18. Un artículo de manufactura según la reivindicación 14 en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de adriamicina, camptotecina, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interleucina 2, irinotecan, docetaxel, paclitaxel, del topotecan, 5-fluorouracilo, y sus combinaciones.
19. 19. Un artículo de manufactura según la reivindicación 14 en donde el agente quimioterapéutico es paclitaxel.
20. 20. Un artículo de manufactura según la reivindicación 14 en donde el agonista de ETB es IRL1620 y el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de paclitaxel, doxorubicina, 5-fluorouracilo, y sus combinaciones.