MX2008011839A - Propagacion de celulas primarias. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para propagar células de interés obtenidas a partir de un espécimen biológico al a) enriquecer las células bajo condiciones que mantengan una suficiente viabilidad celular; y b) propagar las células bajo condiciones eficaces para permitir la viabilidad, proliferación e integridad celular.

Description

PROPAGACION DE CELULAS PRIMARIAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las metástasis son la causa principal de muerte en pacientes diagnosticados con un tumor primario. Ocurre metástasis del cáncer cuando las células se esparcen del tumor primario y se diseminan hacia partes distantes del cuerpo a través de la corriente de sangre periférica o el drenaje linfático. Se ha mostrado que la presencia de CTCs en sangre periférica está asociada con supervivencia disminuida libre de progresión y supervivencia general disminuida en pacientes tratados para cáncer de mama metastásico. Aunque fuerzas mecánicas o la respuesta inmune de un individuo destruyen muchas de estas células tumorales que entran a la corriente sanguínea, se sabe que un porcentaje de células tumorales sobreviven y pueden ser analizadas. La presencia, enumeración y caracterización de estas células epiteliales raras en sangre entera, podría proveer información clínica y de diagnóstico valiosa. Aproximadamente 70 a 80% de todos los tumores sólidos se originan de células epiteliales, las cuales no se encuentran normalmente en la circulación. Los análisis amplios del ARN mensajero de células epiteliales circulantes en la sangre periférica, pueden proveer información valiosa sobre el pronóstico de carga tumoral y la eficacia de tratamiento. Por ejemplo, el receptor Her-2 es sobreexpresado en sólo 30% de los pacientes con cáncer de mama, lo cual sugiere que Herceptin sería una terapia ineficaz para todos los pacientes. De esta manera, el análisis molecular de CTCs debe llevar a caracterización mejorada de CTCs, y finalmente al desarrollo de estrategias terapéuticas novedosas personalizadas más efectivas. La detección temprana del cáncer y su estado metastásico son críticos para el tratamiento efectivo de cánceres que lleva a índice de supervivencia general y calidad de vida mejorada. Las metástasis resultan de la propagación de células tumorales esparcidas del tejido primario que llegan a diferentes tejidos a través de la sangre periférica, referidas con frecuencia como células tumorales circulantes (CTCs). Se ha mostrado que la presencia de estas CTCs en la sangre, detectada por la tecnología CellSearch™, está asociada con índice de supervivencia disminuido, sirviendo de esta manera como "marcadores" pronosticables para progresión de cáncer (metástasis). Estas CTCs podrían usarse potencialmente para estudios farmacogenómicos (por ejemplo, quimiosensibilidad). Además, pueden llevarse a cabo estudios de análisis molecular en las CTCs que deben llevar además a un mejor entendimiento de los mecanismos subyacentes de progresión/potencial metastásico, pronóstico e incluso utilidad terapéutica. Los retos son varios: recuperación de ácidos nucleicos de calidad de CTCs; su disponibilidad en cantidad muy limitada; limitaciones de sensibilidad de las pruebas existentes; y aplicación/validación de series de marcadores existentes para las CTCs. Además, el análisis molecular puede no llevar siempre a resultados precisos, debido a la contaminación de las CTCs capturadas con leucocitos, cuyo perfil de expresión puede interferir con los resultados. La adaptación de las CTCs a crecer in vitro podría resultar en la propagación de las células hasta niveles suficientes, y aliviar los retos mencionados anteriormente. Las células propagadas de esta manera podrían usarse para varias aplicaciones que incluyen evaluación de la capacidad de clonación de diferentes poblaciones de células, descubrimiento de identificaciones, desarrollo de pruebas usando dichas identificaciones, hibridación in situ fluorescente (FISH) e inmunohistoquímica (IHC). La detección temprana del cáncer y su estado metastásico son críticos para el tratamiento efectivo de cánceres que lleva dramáticamente a índice de supervivencia incrementado y calidad de vida mejorada. Las metástasis resultan de la propagación de células tumorales esparcidas del tejido primario que llegan a diferentes tejidos a través de la sangre periférica, referidas con frecuencia como células tumorales circulantes (CTCs). Se ha mostrado que la presencia de estas CTCs en la sangre, detectada por la tecnología CellSearch™, está asociada con índice de supervivencia disminuido, sirviendo de esta manera como "marcadores" predecibles para progresión de cáncer (metástasis). Estas CTCs podrían usarse potencialmente para estudios farmacogenómicos (por ejemplo, quimiosensibilidad). La expresión génica en cáncer puede ser interrumpida a través de alteración genética o alteración epigenética, las cuales alteran el estado heredable de la expresión génica. La modificación epigenética principal del genoma humano es la metilacion de residuos de citosina dentro del contexto del dinucleótido de CpG. La metilación del ADN es interesante desde un punto de vista de diagnóstico, debido a que puede detectarse fácilmente en células liberadas de lesiones neoplásicas y preneoplásicas en suero, orina o esputo. Y desde un punto de vista terapéutico, debido a que genes epigenéticamente silenciados pueden ser reactivados por inhibidores de la metilación del ADN y/o histona desacetilasa. Recientemente, se ha publicado un estudio que implica la caracterización molecular de las CTCs que usó análisis de la expresión por análisis GeneChip® y PCR-transcripción inversa cuantitativa. Las muestras usadas en este estudio tuvieron más de 100 CTCs que es mucho mayor que lo que se observa típicamente en la identificación temprana (<10 CTCs). Los presentes inventores demandan que la tecnología de PCR específica de metilación múltiplex cuantitativa (QMSP) realiza preamplificación (PCR anidada) para obtener suficiente ADN objetivo a partir de una pequeña cantidad de ADN de CTCs capturadas (<5 células).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee métodos, aparatos y equipos para el procesamiento de muestras de células tumorales circulantes (CTCs) dentro de sangre periférica y evaluación de sus perfiles de expresión génica, mientras que provee apoyo para la plataforma CellSearch™ para la realización de pruebas de recurrencia de enfermedades. El equipo CellSearch Profile está destinado para el aislamiento de CTCs de origen epitelial en sangre entera en conjunto con el sistema CellSearch® AutoPrep. El equipo CellSearch™ Profile contiene un reactivo de captura basado en ferrofluido, que consiste de nanopartículas con un núcleo magnético rodeado por una capa polimérica recubierta con anticuerpos que determinan como blanco el antígeno de la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) para la captura de CTCs. El sistema CelITracks™ AutoPrep automatiza y estandariza el procesamiento, dispensando reactivos con precisión y regulando pasos de incubación magnética, ofreciendo a los científicos herramientas avanzadas para aislar reproduciblemente y eficientemente CTCs para investigación importante en una variedad de carcinomas. La vasta mayoría de leucocitos y otros componentes de la sangre están agotados de la muestra enriquecida, reduciendo de esta manera al mínimo el fondo. Se realiza otro análisis usando técnicas establecidas de biología molecular que incluyen RT-PCR y RT-PCR múltiplex. La prueba de caracterización molecular es una prueba de diagnóstico molecular que está destinada para su uso después del enriquecimiento de las CTCs. Esta prueba incorpora marcadores epiteliales y de tejido de origen que confirman que células circulantes en un paciente previamente diagnosticado y tratado para cáncer de mama, se originan de hecho de mama.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que describe la estabilidad del ARN con el tiempo. La figura 2 es una gráfica que describe ARN mensajero específico de próstata obtenido de células tumorales circulantes. La figura 3 es una gráfica que describe ARN mensajero específico de próstata obtenido de células tumorales circulantes. Las figuras 4A y 4B describen los resultados de 100 ng de ADN de PBL de adición conocida o en 500 ng de ADN de PBL de adición conocida.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un biomarcador es cualquier indicio de una proteína/ácido nucleico marcador indicado. Los ácidos nucleicos pueden ser cualquier ácido nucleico conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, nuclear, mitocondrial (homeoplasmia, heteroplasmia), viral, bacteriano, micótico, micoplasmático, etc. Los indicios pueden ser directos o indirectos, y pueden medir sobreexpresión o subexpresión del gen dados los parámetros fisiológicos y en comparación con un control interno, placebo, tejido normal u otro carcinoma. Los biomarcadores incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos y proteínas (sobreexpresión y subexpresión y directos o indirectos). Mediante el uso de ácidos nucleicos como biomarcadores, puede incluirse cualquier método conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, medición de la amplificación de ADN, deleción, inserción, duplicación, ARN, micro ARN (miARN), pérdida de heterocigosidad (LOH), polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs, Brookes (1999)), polimorfismos de número de copias (CNPs), ya sea directamente o sobre la amplificación del genoma, ADN de microsatélites, cambios epigenéticos tales como hipometilación o hipermetilación de ADN y FISH. Mediante el uso de proteínas como biomarcadores, se incluye cualquier método conocido en la técnica que incluye, sin limitación, medición de cantidad, actividad, modificaciones tales como glucosilación, fosforilación, ribosilación de ADP, ubiquitinación, etc., o inmunohistoquímica (IHC) y cambio. Otros biomarcadores incluyen marcadores de formación de imágenes, análisis molecular, conteo de células y apoptosis. El término "origen" referido en "tejido de origen", significa el tipo de tejido (pulmón, colon, etc.) o el tipo histológico (adenocarcinoma, carcinoma escamocelular, etc.), dependiendo de las circunstancias médicas particulares, y será entendido por cualquier experto en la técnica. Un gen marcador corresponde a la secuencia designada por SEQ ID NO cuando contiene esa secuencia. Un segmento o fragmento de gen corresponde a la secuencia de dicho gen, cuando contiene una porción de la secuencia referida o su complemento suficiente para distinguirlo como la secuencia del gen. Un producto de expresión génica corresponde a dicha secuencia, cuando su ARN, ARN mensajero o ADNc híbrida con la composición que tiene dicha secuencia (por ejemplo, una sonda) o, en el caso de un péptido o proteína, es codificado por dicho ARN mensajero. Un segmento o fragmento de un producto de expresión génica corresponde a la secuencia de dicho gen o producto de expresión génica, cuando contiene una porción del producto de expresión génica referido o su complemento, suficiente para distinguirlo como la secuencia del gen o producto de expresión génica. Los métodos, composiciones, artículos y equipos inventivos descritos y reclamados en esta especificación, incluyen uno o más genes marcadores. El término "marcador" o "gen marcador" se usa a lo largo de esta especificación, para referirse a genes y productos de expresión génica que corresponden con algún gen cuya sobreexpresion o subexpresión está asociada con una indicación o tipo de tejido. Métodos preferidos para establecer perfiles de expresión génica, incluyen determinar la cantidad de ARN que es producida por un gen que puede codificar para una proteína o péptido. Esto se logra usando transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR de exhibición diferencial, análisis Northern Blot, y otras pruebas relacionadas. Mientras que es posible realizar estas técnicas usando reacciones de PCR individuales, es mejor amplificar ADN complementario (ADNc) o ARN complementario (ARNc) producidos a partir de ARN mensajero, y analizarlo por medio de microdisposiciones. Muchas configuraciones de disposiciones diferentes y métodos para su producción, son conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos 5445934; 5532128; 5556752; 5242974; 5384261 ; 5405783; 5412087; 5424186; 5429807; 5436327; 5472672; 5527681 ; 5529756; 5545531 ; 5554501 ; 5561071 ; 5571639; 5593839; 5599695; 5624711 ; 5658734; y 5700637. La tecnología de microdisposiciones permite la medición del nivel de ARN mensajero de estado estable de miles de genes simultáneamente, presentando de esta manera una herramienta poderosa para identificar efectos tales como el inicio, detención o modulación de la proliferación celular no controlada. Dos tecnologías de microdisposiciones están actualmente en amplio uso. La primera son disposiciones de ADNc, y la segunda son disposiciones de oligonucleótidos. Aunque existen diferencias en la construcción de estos chips, esencialmente todos los análisis de datos corriente abajo y resultados son iguales. El producto de estos análisis son típicamente mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda marcada usada para detectar una secuencia de ADNc de la muestra que híbrida con una secuencia de ácido nucleico en un sitio conocido en la microdisposición. Típicamente, la intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc, y de esta manera ARN mensajero, expresado en las células de la muestra. Un gran número de dichas técnicas está disponible y es útil. Métodos preferidos para determinar la expresión génica pueden encontrarse en los documentos 6271002; 6218122; 6218114; y 6004755. El análisis de los niveles de expresión se realiza comparando dichas intensidades de señales. Esto se hace mejor generando una matriz de relación de las intensidades de expresión de genes en una muestra de prueba contra aquellas en una muestra control. Por ejemplo, las intensidades de expresión génica de un tejido enfermo pueden compararse con las intensidades de expresión generadas de tejido benigno o normal del mismo tipo. Una relación de estas intensidades de expresión indica el cambio en número de veces en la expresión génica entre las muestras control y de prueba. La selección puede basarse en pruebas estadísticas que producen listas ordenadas por sus rangos respecto a la evidencia de significancia de la expresión diferencial para cada gen entre factores relacionados con el sitio de origen original del tumor. Ejemplos de dichas pruebas incluyen las pruebas de ANOVA y de Kruskal-Wallis. Las clasificaciones jerárquicas pueden usarse como ponderaciones en un modelo diseñado para interpretar la suma de dichos pesos, hasta un límite, como la preponderancia de evidencia en favor de una clase sobre otra. La evidencia previa descrita en la literatura puede usarse también para ajusfar las ponderaciones. Una modalidad preferida es normalizar cada medición identificando una serie de control estable, y aumentando a escala esta serie a variancia cero a través de todas las muestras. Esta serie de control se define como cualquier transcrito endógeno individual o serie de transcritos endógenos afectados por error sistemático en la prueba, y no sabido que cambie independientemente de este error. Todos los marcadores son ajustados por el factor específico de la muestra que genera variancia cero para cualquier estadística descriptiva de la serie de control, tal como media o mediana, o para una medición directa. En forma alternativa, si la premisa de variación de controles respecto sólo a error sistemático no es verdadera, y sin embargo el error de clasificación resultante es menor cuando se realiza normalización, la serie de control se usará aún como se indicó. Controles de adición conocida no endógenos podrían ser también útiles, pero no se prefieren. Pueden exhibirse perfiles de expresión génica de muchas maneras. La más común es disponer intensidades de fluorescencia nuevas o matriz de relación en un dendrograma gráfico, en donde las columnas indican muestras de prueba y las hileras indican genes. Los datos se disponen, de modo que genes que tienen perfiles de expresión similares están próximos entre sí. La relación de expresión para cada gen se visualiza como un color. Por ejemplo, una relación menor de uno (subregulación) aparece en la porción azul del espectro, mientras que una relación mayor de uno (sobrerregulación) aparece en la porción roja del espectro. Están disponibles programas de software de cómputo disponibles comercialmente que exhiben dichos datos, incluyendo "Genespring" (Silicon Genetics, Inc.) y "Discovery" e "Infer" (Partek, Inc.). En caso de que se midan niveles de proteína para determinar la expresión génica, cualquier método conocido en la técnica es adecuado, siempre que resulte en especificidad y sensibilidad adecuadas. Por ejemplo, pueden medirse niveles de proteína por unión a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para la proteína, y midiendo la cantidad de proteína unida al anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser marcados por reactivos radiactivos, fluorescentes u otros reactivos detectables que faciliten la detección. Métodos de detección incluyen, sin limitación, prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y técnicas immunoblot. Genes modulados usados en los métodos de la invención, se describen en los ejemplos. Los genes que son expresados diferencialmente son sobrerregulados o subregulados en pacientes con carcinoma de un origen particular respecto a aquellos con carcinomas de diferentes orígenes. La sobrerregulación y subregulación son términos relativos que significan que una diferencia detectable (más allá de la contribución de ruido en el sistema usarla para medirla) se encuentra en la cantidad de expresión de los genes respecto a algún punto de partida. En este caso, el punto de partida se determina con base en el algoritmo. Los genes de interés en las células enfermas son entonces sobrerregulados o subregulados respecto al nivel de punto de partida usando el mismo método de medición. El término enfermo, en este contexto, se refiere a una alteración del estado de un cuerpo que interrumpe o perturba, o tiene el potencial de perturbar, el desempeño adecuado de funciones corporales como ocurre con la proliferación de células sin control. Alguien es diagnosticado con una enfermedad, cuando algún aspecto del genotipo o fenotipo de esa persona es consistente con la presencia de la enfermedad. Sin embargo, el acto de realizar un diagnóstico o pronóstico puede incluir la determinación de cuestiones de estado/enfermedad, tales como la determinación de la probabilidad de recidiva, tipo de terapia y monitoreo de la terapia. En el monitoreo de la terapia, se hacen juicios clínicos respecto al efecto de un curso de terapia determinado, comparando la expresión de genes con el tiempo para determinar si los perfiles de expresión génica han cambiado o están cambiando a patrones más consistentes con el tejido normal. Los genes pueden ser agrupados, de modo que la información obtenida acerca de la serie de genes en el grupo provee una base profunda para hacer un juicio clínicamente relevante, tal como un diagnóstico, pronóstico o elección de tratamiento. Estas series de genes constituyen las carpetas de la invención. Como con la mayoría de los marcadores de diagnóstico, con frecuencia es deseable usar el menor número de marcadores suficiente para hacer un juicio médico correcto. Esto previene una demora en el tratamiento hasta otro análisis, así como uso improductivo de tiempo y recursos. Un método para establecer carpetas de expresión génica, es a través del uso de algoritmos de optimización tales como el algoritmo de variancia media usado ampliamente en el establecimiento de carpetas de existencias. Este método se describe en detalle en el documento 20030194734. Esencialmente, el método requiere el establecimiento de una serie de entradas (existencias en aplicaciones financieras, expresión como se mide aquí por intensidad) que optimizarán la declaración (por ejemplo, señal que se genera) que se recibe para usarlas, mientras que se reduce al mínimo la variabilidad de la declaración. Muchos programas de software comerciales están disponibles para realizar dichas operaciones. Se prefiere la "aplicación de optimización de variancia-media de Wagner Associates", referida como "Software Wagner", a lo largo de esta especificación. Este software usa funciones de la "colección de optimización de variancia-media de Wagner Associates" para determinar una frontera eficiente, y se prefieren carpetas óptimas en el sentido de Markowitz. Véase Markowitz (1952). El uso de este tipo de software requiere que los datos de las microdisposiciones sean transformados de modo que puedan tratarse como una entrada en la declaración de existencias del procedimiento, y se usan mediciones de riesgo cuando el software se usa para sus propósitos deseados de análisis financiero. El procedimiento de selección de una carpeta puede incluir también la aplicación de reglas heurísticas. De preferencia, dichas reglas se formulan con base en la biología y un entendimiento de la tecnología usada para generar resultados clínicos. Más preferiblemente, se aplican al resultado del método de optimización. Por ejemplo, el método de variancia media de selección de la carpeta puede aplicarse a datos de microdisposiciones para muchos genes expresados diferencialmente en sujetos con cáncer. El resultado del método sería una serie de genes optimizada que podría incluir algunos genes que son expresados en sangre periférica, así como en tejido enfermo. Si las muestras usadas en el método de prueba se obtienen de sangre periférica, y ciertos genes expresados diferencialmente en casos de cáncer pudieran ser expresados también diferencialmente en sangre periférica, entonces puede aplicarse una regla heurística en la cual se seleccione una carpeta de la frontera eficiente que excluya aquellos que son expresados diferencialmente en sangre periférica. De hecho, la regla puede aplicarse antes de la formación de la frontera eficiente, por ejemplo, aplicando la regla durante la preselección de datos. Pueden aplicarse otras reglas heurísticas que no necesariamente estén relacionadas con la biología en cuestión. Por ejemplo, puede aplicarse una regla que sólo un porcentaje prescrito de la carpeta pueda ser representado por un gen o grupo de genes particular. Software disponible comercialmente, tal como el Software de Wagner, acomoda fácilmente estos tipos de heurísticas. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando factores diferentes de exactitud y precisión (por ejemplo, derechos de licénciamiento anticipados) tienen un impacto sobre la conveniencia de que se incluyan uno o más genes. Los perfiles de expresión génica de esta invención pueden usarse también en conjunto con otros métodos de diagnóstico no genéticos útiles en el monitoreo de tratamiento, pronóstico o diagnóstico de cáncer. Por ejemplo, en algunas circunstancias, es benéfico combinar el poder de diagnóstico de los métodos basados en la expresión génica descritos anteriormente, con datos de marcadores convencionales tales como marcadores de proteínas en suero (por ejemplo, antígeno del cáncer 27.29 ("CA 27.29")). Existe una gama de dichos marcadores, que incluyen analitos tales como CA 27.29. En uno de dichos métodos, se toma periódicamente sangre de un paciente tratado, y se somete entonces a un inmunoensayo de enzimas para uno de los marcadores del suero descritos anteriormente. Cuando la concentración del marcador sugiere el retorno de tumores o falla de la terapia, se toma una fuente muestra sujeta a análisis de la expresión génica. En donde exista una masa sospechosa, se toma un aspirado con aguja fina (FNA), y los perfiles de expresión génica de las células tomadas de la masa se analizan entonces como se describió anteriormente. En forma alternativa, pueden tomarse muestras de tejido de áreas adyacentes al tejido del cual se removió previamente un tumor. Este procedimiento puede ser particularmente útil cuando otras pruebas dan resultados ambiguos. La presente invención provee un método para propagar células de interés obtenidas de una muestra biológica, a) enriqueciendo las células bajo condiciones que mantengan viabilidad suficiente de las células; y b) propagando las células bajo condiciones efectivas que permitan la viabilidad, proliferación e integridad de las células. La muestra biológica puede ser cualquier muestra conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, orina, sangre, suero, plasma, linfa, esputo, semen, saliva, lágrimas, fluido pleural, fluido pulmonar, lavado bronquial, fluido sinovial, fluido peritoneal, ascitis, fluido amniótico, médula ósea, aspirado de médula ósea, fluido cerebroespinal, lisado u homogenizado de tejido, o una pella de células. Véase, por ejemplo, el documento 20030219842. Las células obtenidas pueden usarse para determinar la presencia o ausencia de una indicación. La indicación puede incluir cualquier indicación conocida en la técnica incluyendo, sin limitación, cáncer, evaluación de riesgo de predisposición genética heredada, identificación de tejido de origen de una célula cancerosa tal como CTC 60/887,625, identificación de mutaciones en enfermedades hereditarias, estado de enfermedad (estadificación), pronóstico, diagnóstico, monitoreo, respuesta a tratamiento, elección de tratamiento (farmacológico), infección (viral, bacteriana, micoplasmática, micótica), quimiosensibilidad 71 12415, sensibilidad a fármacos, potencial metastásico o identificación de mutaciones en enfermedades hereditarias. El enriquecimiento de células puede ser por cualquier método conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, por separación magnética/anticuerpos (Immunicon, Miltenyi, Dynal) 6602422, 5200048, distribución de células activada por fluorescencia (FACs) 7018804, filtración, o manualmente. El enriquecimiento manual puede ser, por ejemplo, por masaje de la próstata. Véase Goessl et al. (2001 ) Urol 58: 335-338. La propagación puede ser por cualquier método conocido en la técnica, tal como por cultivo in vitro, ex vivo o in vivo. Dispositivos y condiciones se describen en la técnica. Véase el documento 20070026519; y http://www.miltenyibiotec.com/en/NN 24 MACS Cell Culture.aspx.

La proliferación es duplicación de por lo menos una célula. La integridad se determina por proliferación de células de interés contra células contaminantes.

Las células de la invención reclamada pueden usarse, por ejemplo, para determinar el potencial metastásico de una célula de una muestra biológica, aislando ácidos nucleicos y/o proteínas de las células; y analizando el ácido nucleico y/o la proteína para determinar la presencia, el nivel de expresión o el estado de un biomarcador específico para potencial metastásico. Las células de la invención reclamada pueden usarse, por ejemplo, para identificar mutaciones en células de enfermedades hereditarias de una muestra biológica, aislando ácidos nucleicos y/o proteínas de las células; y analizando el ácido nucleico y/o la proteína para determinar la presencia, el nivel de expresión o el estado de un biomarcador específico para una enfermedad hereditaria. Las células de la invención reclamada pueden usarse, por ejemplo, para obtener y preservar material celular y partes constituyentes del mismo, tales como ácido nucleico y/o proteína. Las partes constituyentes pueden usarse, por ejemplo, para obtener vacunas de células tumorales o en terapia con células inmunes. Véase los documentos 20060093612 y 20050249711. Las células de la presente invención pueden propagarse para proveer líneas de células y poblaciones de células clónales. Las células pueden usarse, por ejemplo, para identificar químicos para eficacia farmacéutica, y para obtener productos celulares tales como anticuerpos y citocinas. Véase los documentos 70153 3; 685544; y 6413744.

Los equipos obtenidos de conformidad con la invención incluyen pruebas formateadas para determinar los perfiles de expresión génica. Estos pueden incluir todos los materiales o algunos de ellos necesarios para realizar las pruebas, tales como reactivos e instrucciones, y un medio a través del cual los biomarcadores se ponen a prueba.

Los artículos de esta invención incluyen representaciones de los perfiles de expresión génica útiles para tratar, diagnosticar, pronosticar y de otra manera evaluar enfermedades. Estas representaciones de los perfiles son reducidas a un medio que pueda ser leído automáticamente por una máquina, como es el caso de medios legibles en computadora (magnéticos, ópticos, y similares). Los artículos pueden incluir también instrucciones para evaluar los perfiles de expresión génica en dichos medios. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM que tenga instrucciones de cómputo para comparar perfiles de expresión génica de las carpetas de genes descritos anteriormente. Los artículos pueden tener también perfiles de expresión génica registrados digitalmente en los mismos, de modo que puedan compararse con los datos de expresión génica de muestras de pacientes. En forma alternativa, los perfiles pueden registrarse en diferentes formatos de representación. Un recordatorio gráfico es uno de dichos formatos. Algoritmos de agrupación tales como aquellos incorporados en el software "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. mencionados anteriormente, pueden ayudar mejor en la visualización de dichos datos. Diferentes tipos de artículos de fabricación de conformidad con la invención, son medios o pruebas formateadas usados para revelar perfiles de expresión génica. Estos pueden comprender, por ejemplo, microdisposiciones en las cuales complementos de secuencia o sondas son adheridos a una matriz a la cual las secuencias indicativas de los genes de interés se combinan, creando un determinante legible de su presencia. En forma alternativa, los artículos de conformidad con la invención pueden ser adaptados en equipos de reactivos para realizar hibridación, amplificación y generación de señales indicativas del nivel de expresión de los genes de interés para la detección de cáncer. La presente invención define carpetas de marcadores específicas que han sido caracterizadas para detectar una célula de tumor de mama circulante individual en un fondo de sangre periférica. La carpeta de prueba múltiplex de caracterización molecular ha sido optimizada para su uso como una prueba múltiplex de QRT-PCR, en donde el múltiplex de caracterización molecular contiene 2 marcadores de tejido de origen, 1 marcador epitelial y un marcador de mantenimiento. Se llevará a cabo QRT-PCR en el Smartcycler II para la prueba múltiplex de caracterización molecular. La carpeta de prueba singlex de caracterización molecular ha sido optimizada para su uso como una prueba de QRT-PCR, en donde cada marcador se introduce en una reacción individual que usa 3 marcadores de estado de cáncer, 1 marcador epitelial y un marcador de mantenimiento. A diferencia de la prueba múltiplex de RPA, la prueba singlex de caracterización molecular se introducirá en el 7900HT de Applied Biosystems (ABI), y usará una placa de 384 cavidades como plataforma. Las carpetas de prueba singlex y de prueba múltiplex de caracterización molecular, detectan con precisión una célula epitelial circulante individual que le permite al médico clínico predecir recurrencia. La prueba múltiplex de caracterización molecular usa ADN polimerasa de Thermus thermophilus (TTH), debido a su capacidad para llevar a cabo reacción de transcriptasa inversa y en cadena de polimerasa en una sola reacción. En contraste, la prueba singlex de caracterización molecular usa la mezcla maestra One-Step de Applied Biosystems que es una reacción de dos enzimas que incorporan MMLV para transcripción inversa y Taq polimerasa (ADN polimerasa de Thermus aquaticus) para PCR. Los diseños de prueba son específicos para ARN por la incorporación de una unión de exón-intrón, de modo que el ADN genómico no es amplificado y detectado eficientemente. La presente invención demuestra el método para capturar las CTCs y cultivarlas in vitro. El experimento y los resultados se describen a continuación. Existen varios aspectos novedosos de esta invención. Primero, la invención es la primera demostración de la combinación de pruebas de qRTPCR múltiplex y la tecnología CellSearch para el enriquecimiento de células epiteliales circulantes. Los presentes inventores proveen una descripción detallada de métodos novedosos desarrollados para aislar el ARN después del enriquecimiento y usar el ARN en una prueba de qRTPCR. Segundo, la invención puede usarse como un sustituto para las células mismas. Es decir, en ambientes clínicos en donde se encuentran números muy pequeños de células circulantes, o en situaciones en donde se encuentran muy pocas células circulantes intactas (puesto que las células dañadas no son reconocidas por el algoritmo de enumeración CellSearch), el uso de la prueba de qRTPCR podría proveer una enumeración más sensible de células tumorales circulantes, debido a que el ARN sería aislado de células tumorales circulantes intactas y dañadas, incrementando la sensibilidad de la detección, y las pruebas de qRTPCR altamente sensibles podrían incrementar además la sensibilidad. Un aspecto clave final de la invención es que, mediante el uso de una prueba múltiplex cuantitativa, puede generarse un algoritmo basado en dos o más genes que genera información de pronóstico en pacientes de quienes se han aislado células tumorales circulantes. De modo importante, la información molecular puede proveer información de pronóstico adicional o incluso nueva cuando se combina con la enumeración de células epiteliales circulantes. En una modalidad, la prueba singlex de caracterización molecular se basa en la reacción de transcriptasa inversa cuantitativa-reacción en cadena de polimerasa (QRT-PCR), en donde cada marcador se introduce en una reacción individual. La presente invención describe el uso de 3 marcadores de tejido de origen, 1 marcador epitelial para confirmación de que las células tumorales circulantes están presentes de cáncer de mama, y un marcador control para la verificación de la calidad de la muestra. Se diseñan combinaciones específicas de sonda/iniciador para cada marcador, que resultan en análisis de alta especificidad y sensibilidad para predecir la recurrencia en pacientes con cáncer de mama. Estas combinaciones de iniciador/sonda para marcadores específicos son optimizadas para la plataforma 7900HT de Applied Biosystems (ABI) que detecta una célula de tumor de mama circulante individual en un fondo de sangre periférica. Los resultados de esta prueba muestran que podría usarse en paralelo con el equipo de enumeración de CTCs CellSearch™, y de esta manera es benéfico para el médico clínico y el paciente para predecir recurrencia. En una segunda modalidad, la prueba múltiplex de mama de caracterización molecular se basa también en QRT-PCR; sin embargo, en contraste con la prueba singlex presentada anteriormente, la muestra del paciente se analiza en una reacción individual con 3 marcadores de diagnóstico que permiten un mayor porcentaje de detección. La presente invención describe el uso de 2 marcadores de tejido de origen, 1 marcador epitelial para confirmación de que están presentes células tumorales circulantes de cáncer de mama, y un marcador control para verificación de la calidad de la muestra. Se diseñan combinaciones específicas de iniciador/sonda para cada marcador que resultan en alta sensibilidad, mientras son muy específicas en un fondo de leucocitos de sangre periférica. La viabilidad de estas aplicaciones se demuestra por la capacidad de esta prueba para detectar menos de 5 células SKBR3 introducidas en 7.5 mi de sangre periférica. Estas combinaciones de iniciador/sonda para marcadores específicos, son optimizadas para la plataforma del Smartcycler II. Los resultados de esta prueba presentan un método para la detección de células de tumor de mama circulantes que no está acoplado cuando se compara con los métodos disponibles actuales debido a la sensibilidad de la prueba y el uso simultáneo de 4 genes. Será la intención de los presentes inventores hacer que esta prueba esté disponible para uso comercial en conjunto con el equipo de enumeración de CTCs CellSearch™. En una tercera modalidad, la prueba de caracterización molecular se basa en qRTPCR para la caracterización de células de próstata circulantes. En este ejemplo, una prueba múltiplex muy sensible incorpora 1 marcador epitelial (CK19), un tejido de próstata de marcador de origen (PSA, conocido también como calicreína 3), y un gen control (PBGD). Esta prueba puede usarse también para la detección altamente sensible de células de próstata. La presente invención provee un método para cultivar CTCs de sangre. El procedimiento implica el uso de la tecnología CellSearch™, y su sistema CelITracks® AutoPrep y equipo CellSearch™ Profile asociados. Estas células propagadas podrían usarse en estudios farmacogenómicos, y también para extraer los ácidos nucleicos en cantidades suficientes para su uso en estudios de análisis molecular. Por último, esta prueba podría usarse también como una herramienta confirmatoria en combinación con los resultados de enumeración de CTCs.

La presente invención provee un método para detectar marcadores de metilación en ADN de menos de 5 equivalentes de células (3 células en este estudio), después de la conversión con bisulfito de sodio. El procedimiento implica una preamplificación de la región objetivo, seguida de una prueba de QMSP múltiplex. Existen varios aspectos novedosos de esta invención. Primero, la invención es la primera demostración de la combinación de pruebas de QMSP múltiplex (incluyendo PCR anidada), y su extensión a la tecnología CellSearch™ que enriquece las células tumorales circulantes (CTCs). Segundo, la prueba de QMSP puede proveer información útil en varios marcadores moleculares, haciéndola de esta manera más sensible cuando se combina con la tecnología CellSearch™. Tercero, la prueba de QMSP múltiplex puede ser capaz de proveer un nuevo método de pronóstico para la detección de células tumorales múltiples, por ejemplo, de cánceres de próstata y mama. Por último, esta prueba podría usarse también como una herramienta confirmatoria en combinación con el resultado de enumeración de CTCs. La presente invención define carpetas de marcadores específicos de metilación que han sido caracterizadas para detectar menos de 20 pg de ADN después de la conversión con bisulfito de sodio, equivalente a 3 células tumorales circulantes, en un fondo de leucocitos de sangre periférica (PBL), equivalente a 10,000 a 100,000 PBL. Actualmente, la prueba múltiplex de caracterización molecular contiene 1 marcador específico de metilación de ADN y un marcador de mantenimiento (2 marcadores específicos de metilación de ADN adicionales se añadirán pronto). El ADN genómico se someterá a conversión con bisulfito de sodio y purificación usando el equipo ZymoResearch. Se llevará a cabo una preamplificación de regiones objetivo usando series de iniciadores anidados (iniciadores exteriores) en un thermocycler. En una reacción de QMSP subsiguiente, se generará una señal fluorescente usando iniciadores interiores con un diseño de sonda Scorpion en el Smartcycler® de Cepheid o plataforma equivalente.

CUADRO I Secuencias de iniciadores de PCR Plan experimental: Las formulaciones de reactivos de reacción de la primera PCR -amplificación) y las condiciones de ciclización, son como siguen: CUADRO II Reactivos para la PCR de preamplificación CUADRO III Condiciones de ciclización para la preamplificación 6 a 10% del producto de la primera PCR, como es sin purificación, de lo anterior, se transferirá a un tubo nuevo para la segunda PCR, sin la adición de los siguientes reactivos (cuadro IV), y se someterán a las condiciones de ciclización en el cuadro V. Las formulaciones de reactivos de la segunda reacción de PCR y las condiciones de ciclización, son como siguen: CUADRO IV Reactivos para la segunda PCR CUADRO V Condiciones de ciclización para la segunda PCR Las siguientes muestras de ADN se usaron en este estudio: ADN metilado de CpGenome Universal (CpG M), ADN de adenocarcinoma de próstata (PC) o ADN normal de próstata (PN) en un fondo de ADN introducido (100 ng o 500 ng) de linfocitos de sangre periférica (PBL).

Se llevaron a cabo reacciones de QMSP después de la conversión con bisulfito de sodio. Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren, pero no limiten, la invención.

EJEMPLO 1 Análisis de la expresión génica de ARN de mama diluido gradualmente introducido en un fondo de ARN de leucocitos Las pruebas de la carpeta de prueba singlex de caracterización molecular, incluyen una sonda de PCR específica de la unión que elimina la amplificación de ADN genómico. Las secuencias del iniciador y de la sonda de hidrólisis marcada doble puestas a prueba para esta muestra, se muestran a continuación: Pruebas singlex de RPA Pruebas Secuencia SEQ ID NO: B305D-RPAU22 AATGGCCAAAGCACTGCTCTTA 9 B305D-RPAL21 ACTTGCTG I I I I I GCTCATGT 10 B305D-RPAFAMP30 FAM-ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACA-BHQ1 -TT 11 CK19-RPAU22 CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT 12 CK19-RPAL20 TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC 13 CK19-RPAFAMP24 FAM-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ1 -TT 14 PBGD-RPAU22 CCACACACAGCCTACTTTCCAA 15 PBGD-RPAL21 TACCCACGCGAATCACTCTCA 16 PBGD-RPAP27FAM FAM-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ1 -TT 17 MG-RPAU21 AGTTGCTGATGGTCCTCATGC 18 MG-RPAL24 CACTTGTGGATTGATTGTCTTGGA 19 MG-RPAP23FA FAM-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT 20 P1 B289U21 GAGTACGTGGGCCTGTCTGCA 21 P1 B360L21 TTGCACTCCTTGGGGGTGACA 22 P1 B311 FAMP25 FAM-ACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAAGGA-BHQ1-TT 23 Cada reacción singlex se llevó a cabo en el 7900HT de Applied Biosystems usando las siguientes condiciones de ciclización y formulaciones de reactivos, como sigue: Condiciones de ciclización 48°C X 30 minutos 95°C x 10 minutos 40 ciclos de 95°C por 15 segundos 60°C por 1 minuto Después del aislamiento del ARN de líneas de células de cáncer de mama SKBR3 y MCF7, se diluyó gradualmente el ARN total para representar 1 a 400 equivalentes de células (CE). El ARN diluido gradualmente se introdujo entonces en ARN total de un fondo de leucocitos equivalente a 50,000 CE. Se aplicó PCR en tiempo real cuantitativa, y los resultados de pruebas óptimas que apoyan esta invención se muestran a continuación.

EJEMPLO 2 Análisis de la expresión génica de pruebas o marcadores alternativos Diseños adicionales puestos a prueba incluyen una sonda de PCR específica de la unión que elimina la amplificación de ADN genómico. Las secuencias del iniciador y de la sonda de hidrólisis marcada doble puestas a prueba para esta muestra, se muestran a continuación: Pruebas múltiplex de RPA Pruebas Secuencia SEQ ID NO: PIP82U20 CTCCTGGTTCTCTGCCTGCA 24 PIP155L24 GACGTACTGACTTGGGAATGTCAA 25 PIP116P28 FAM-AAGCTCAGGACAACACTCGGAAGATCAT- BHQ1 -TT 26 P1 B284U22 CTGAGGAGTACGTGGGCCTGTC 27 P1 B360L21 TTGCACTCCTTGGGGGTGACA 28 P1 B308FAMP25 FAM-CAAACCAGTGTGCCGTGCCAGCCAA-BHQ1 - TT 29 PIP-INT-U GCTTGGTGGTTAAAACTTACC 30 PIP-INT-L TGAACAGTTCTGTTGGTGTA 31 PIP-304-P27-FAM FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG- BHQ1 -TT 32 EJEMPLO 2 (CONTINUACION) Pruebas múltiplex de RPA Pruebas Secuencia SEQ ID NO: HPRT (BHQ)-496F TGACACTGGCAAAACAATGCA 33 HPRT (BHQ)-589R HPRT (BHQ)-519T GGTCC I I I I CACCAGCAAGCT 34 FAM- CTTTGC I I I CCTTGGTCAGGCAGTATAATCCA- BHQ1 -TT 35 B305D-CC4-U AAA AAC AAG C ATG G CCTAC 36 B305D-CC4-L CAGCAAGTTGAGAGCAGTCCT 37 B305D-923-P29- FAM-CATGAGCAAAAACAGCAAGTCGTGAAATT- FAM BHQ1 -TT 38 PDEF1024U20 CGCCCACCTGGACATCTGGA 39 PDEF1087L23 CACTGGTCGAGGCACAGTAGTGA 40 PDEF1045P25FAM FAM-GTCAGCGGCCTGGATGAAAGAGCGG- BHQ1 -TT 41 Las muestras se prepararon y los transcritos se amplificaron de la misma manera como se describió en el ejemplo 1. Los resultados de estas pruebas alternativas que apoyan esta invención se muestran a continuación. Cuando se comparan con el desempeño de marcadores en el ejemplo 1 , los siguientes resultados demuestran pruebas que tienen desempeño inferior contribuido principalmente por la falta de especificidad y/o sensibilidad del marcador y mal diseño del iniciador o sonda.

EJEMPLO 3 Análisis por QRT-PCR de células SKBR3 y MCF7 enriquecidas La prueba de caracterización molecular combinará la porción de captura de células de la tecnología CellSearch, con una prueba de detección molecular. La sensibilidad de la prueba CellSearch puede mejorarse usando una tecnología de detección molecular capaz de detectar la expresión de marcadores en células intactas y fragmentos de células típicamente no denominados positivos por la prueba CellSearch. El aislamiento de ARN usando células SKBR3 y MCF7 inmunomagnéticamente enriquecidas introducidas en sangre de donadores sanos extraída en tubos para toma de sangre con anticoagulante de EDTA, se llevó a cabo como se muestra a continuación.

La viabilidad de la prueba singlex de caracterización molecular ha sido demostrada por la detección reproducible y sensibilidad de transcritos de ARN mensajero específicos en menos de 5 células SKBR3 cuando se enriquecieron a partir de 7.5 mi de sangre de donadores sanos.

EJEMPLO 4 Análisis de la prueba múltiplex de caracterización molecular de ARN de mama diluido gradualmente introducido en un fondo de ARN de leucocitos Las pruebas de la carpeta de pruebas múltiplex de RPA incluyen una sonda de PCR específica de la unión que elimina la amplificación de ADN genómico. Las secuencias del iniciador y de la sonda de hidrólisis marcada doble puestas a prueba para esta muestra, se muestran a continuación: Pruebas múltiplex de RPA Prueba SEQ ID Secuencia NO: B305D-RPAU22 AATG G CC AA AG C ACTG CTCTT A 42 B305D-RPAL21 ACTTGCTG I I I I I GCTCATGT 43 B305D- TR-ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACA-BHQ2- RPATRP30 TT 44 CK19-RPAU22 CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT 45 CK19-RPAL20 TCCG I I I CTGCCAGTGTGTC 46 CK19- CY3-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TT 47 RPACY3P24 PBGD-RPAU22 CCACACACAGCCTACTTTCCAA 48 PBGD-RPAL21 TACCCACGCGAATCACTCTCA 49 PBGD- CY5-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2- RPACY5P27 TT 50 MG-RPAU21 AGTTGCTGATGGTCCTCATGC 51 MG-RPAL24 CACTTGTGGATTGATTGTCTTGGA 52 MG-RPAP23FAM FAM-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1 -TT 53 Condiciones de ciclización 95°C X 3 segundos 59°C x 12 minutos 70°C x 90 segundos 40 ciclos de: 95°C por 20 segundos 62°C por 30 segundos Cada reacción múltiplex se llevó a cabo en el Smartcycler II usando las siguientes condiciones de ciclización y formulaciones de reactivos, como sigue: Después del aislamiento de ARN de líneas de células de cáncer de mama SKBR3, se diluyó gradualmente ARN total para representar 1 a 125 equivalentes de células (CE). El ARN diluido gradualmente se introdujo entonces en ARN total de fondo de leucocitos equivalente a 50,000 CE. Se aplicó PCR en tiempo real cuantitativa, y los resultados que apoyan esta invención se muestran a continuación.

EJEMPLO 5 Análisis por QRT-PCR múltiplex de RPA de células SKBR3 enriquecidas La prueba múltiplex de caracterización molecular combinará la porción de captura de células de la tecnología CellSearch con una prueba de detección molecular. La sensibilidad de la prueba CellSearch puede mejorarse usando una tecnología de detección molecular capaz de detectar la expresión de marcadores en células intactas y fragmentos de células típicamente no denominados positivos por la prueba CellSearch. El aislamiento de ARN usando células SKBR3 inmunomagnéticamente enriquecidas que transcriben sólo CK19 introducido en sangre de donadores sanos extraída en tubos para sangre con anticoagulante de EDTA, se llevó a cabo como se muestra a continuación. En contraste con la prueba singlex de caracterización molecular en donde la muestra de un paciente tiene que dividirse entre todas las reacciones, la prueba múltiplex de caracterización molecular ofrece sensibilidad incrementada permitiéndole al usuario analizar el perfil molecular de una muestra entera en una sola reacción.

EJEMPLO 6 Análisis de la estabilidad del ARN de células SKBR3 enriquecidas Se evaluó la estabilidad del ARN de ARN intracelular a través de QRT-PCR usando la prueba múltiplex de caracterización molecular durante un curso de tiempo de 48 horas. Se introdujeron 200 células SKBR3 en tubos múltiples de 7.5 mi de sangre de donadores sanos. Al final de cada punto de tiempo, se procesaron muestras usando la porción de captura de células de la tecnología CelISearch y el equipo CellSearch Prolife. Después del aislamiento del ARN las muestras se analizaron, y los resultados se muestran en el cuadro siguiente y en la figura 1.

La presente invención provee métodos, aparatos y equipos para el procesamiento de muestras de células tumorales circulantes (CTC) dentro de sangre periférica, y evaluación de sus perfiles de expresión génica mientras que proveen soporte para la plataforma CellSearch para la realización de pruebas de recurrencia de la enfermedad. Los ejemplos muestran la capacidad para detectar células tumorales circulantes individuales en un fondo de sangre periférica, usando una prueba múltiplex novedosa que ofrece ventajas incrementadas sobre las pruebas de RT-PCR singlex tradicionales.

EJEMPLO 7 Células circulantes de próstata Se introdujo ARN de próstata en ARN de leucocitos, y se puso a prueba en una prueba múltiplex en el Smartcycler II Cepheid. Datos representativos se muestran a continuación y en la figura 2.

Valor de Ct promedio Peso de Peso de ARN de próstata (pg) Peso de PBGD/PBL KLK3/PBL CK19/PBL 2500 29.2 23.7 27.9 500 29.1 26.4 29.9 100 29.3 27.9 31.8 20 29.9 30.3 34.5 0 (20 ng de sólo ARN de PBL) 28.8 40.0 36.7 EJEMPLO 7 Sensibilidad incrementada para el análisis de la expresión qénica usando prueba de QRT-PCR múltiplex anidada de RPA de mama La detección por transcripción inversa (RT)-PCR en tiempo real de una sola ronda es generalmente inconsistente, debido a que la concentración de ARN extraído de células tumorales circulantes es con frecuencia muy baja. La QRT-PCR de dos rondas usando iniciadores anidados intensifica la especificidad y sensibilidad de la prueba, específicamente para aquellos que trabajan con mensajes raros u objetivo de baja calidad o mala calidad. Este método incorpora dos pares de iniciadores que se usan para amplificar primero una molécula de ácido nucleico molde más grande y, después una secuencia de ácido nucleico objetivo que está contenida en la molécula molde amplificada. De esta manera, usando QRT-PCR de dos rondas, se incrementan la sensibilidad y especificad para la prueba acompañante molecular de RPA de mama. Véase la figura 3. Se llevó a cabo reacción de amplificación múltiplex anidada en el Smartcycler II, usando las siguientes condiciones de ciclización y formulaciones de reactivos como sigue: Como se describió anteriormente, se usó en el siguiente ejemplo ARN de células SKBR3 diluido gradualmente introducido en ARN total de un fondo de leucocitos.

Temperatura Tiempo 95°C 3 segundos 59°C 2 minutos 70°C 90 segundos 15 ciclos 95°C 20 segundos 62°C 30 segundos Pruebas múltiplex de RPA Después de la amplificación de la primera ronda, los tubos se centrifugan y se extrae una alícuota de tres microlitros del primer tubo, y se pone en un segundo tubo que contiene los siguientes iniciadores, sondas y reactivos.

Tem eratura Tiem o Se aplicó PRC en tiempo real cuantitativa usando los siguientes parámetros, y los resultados que apoyan esta invención se muestran a RT-PCR de la segunda ronda EJEMPLO 8 Análisis por QRT-PCR anidada de la segunda ronda de RPA de mama de células SKBR3 enriquecidas Se usará la prueba de QRT-PCR múltiplex anidada de RPA de mama en conjunto con el enriquecimiento por CellSearch, para mejorar la tecnología de detección molecular capaz de detectar la expresión de los marcadores en células intactas y fragmentos de células típicamente no denominados positivos por la prueba CellSearch de CTCs. El aislamiento de ARN usando células SKBR3 inmunomagnéticamente enriquecidas introducidas en sangre de donadores sanos extraída en tubos para sangre con anticoagulante de EDTA, se llevó a cabo como se muestra a continuación. En contraste con la prueba de QRT-PCR de una ronda de RPA, en donde la sensibilidad y especificidad son bajas, la prueba de QRT-PCR de dos rondas anidada de RPA de mama ofrece sensibilidad y especificidad incrementadas, permitiéndole al usuario tener sensibilidad de casi una sola copia.

RPA de mama introducida en EJEMPLO 9 Sensibilidad incrementada para el análisis de la expresión génica usando la prueba de QRT-PCR múltiplex anidada de la MCA de próstata La necesidad de mejores sensibilidad y especificidad en reacciones de PCR diseñadas para amplificar secuencias raras en células de tumor de próstata circulantes, se consigna en la presente invención. La tecnología usada en la prueba de QRT-PCR múltiplex anidada de RPA de mama, se intersectó para crear la prueba acompañante molecular (MCA) de QRT-PCR anidada de próstata.

Se llevó a cabo reacción de amplificación multiplex anidada en el Smartcycler II, usando las siguientes condiciones de ciclización y formulaciones de reactivos como sigue: Como se describió anteriormente, se usó en el siguiente ejemplo ARN de LNCAP diluido gradualmente introducido en ARN total de un fondo de leucocitos.

Temperatura Tiempo 95°C 3 segundos 59°C 2 minutos 70°C 90 segundos 15 ciclos 95°C 20 segundos 62°C 30 segundos Pruebas múltiplex de la MCA de próstata Después de la amplificación de la primera ronda, los tubos se centrifugaron y se extrajo una alícuota de tres microlitros del primer tubo, y se puso en un segundo tubo conteniendo los siguientes iniciadores, sondas y reactivos.

Se aplicó PCR en tiempo real cuantitativa usando los siguientes parámetros, y los resultados que apoyan esta invención se muestran a continuación.

RT-PCR de la segunda ronda EJEMPLO 10 Análisis por QRT-PCR múltiplex de la MCA de próstata de células LNCAP enriquecidas Se usará la prueba de QRT-PCR múltiplex anidada de la MCA de próstata en conjunto con el enriquecimiento con CellSearch, para mejorar la tecnología de detección molecular capaz de detectar la expresión de marcadores en células intactas y fragmentos de células típicamente no denominados positivos por la prueba CellSearch de CTCs. El aislamiento de ARN usando células LNCAP inmunomagnéticamente enriquecidas introducidas en sangre de donadores sanos extraída en tubos para sangre con anticoagulante de EDTA, se llevó a cabo como se muestra a continuación. En contraste con la prueba de QRT-PCR de próstata de una sola ronda en donde la sensibilidad y especificidad son bajas, la prueba de QRT-PCR anidada de la MCA de próstata de dos rondas ofrece sensibilidad y especificidad incrementadas, permitiéndole al usuario tener sensibilidad de casi una sola copia.

EJEMPLO 11 Introducción de células SKBR3 seguida de la captura por el sistema CellSearch™ Se introdujeron células SKBR3 a 1000 células en 7.5 ml_ de sangre de donadores (Vacutainer® de tapa púrpura con EDTA como conservador), como se muestra en el cuadro I.

CUADRO I Introducción de líneas de células SKBR3 en sangre de donadores Muestra Donador Condiciones Código de barras No. 1 1 Peso introducido/1000 células SKBr3 V22166 2 1 Peso introducido/1000 células SKBr3 V22167 3 1 No introducido V22168 4 1 No introducido V22169 5 2 Peso introducido/1000 células SKBr3 V22170 6 2 Peso introducido/1000 células SKBr3 V22171 Las CTCs se capturaron con perlas inmunomagnéticas conjugadas con EpCAM, usando el equipo CellSearch™ Profile y el sistema CelITracks® AutoPrep. Los tubos que contenían a las CTCs capturadas se removieron del sistema, se pusieron en un imán Magcellect®, y se incubaron por 10 minutos. El sobrenadante se removió con el tubo aún en el Magcellect®. La pella se suspendió en 200 L de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). La suspensión de células se sembró en una placa de 48 cavidades que contenía 1.0 mL por cavidad de medio mínimo esencial de Eagle completo con suero de bovino fetal (FBS) a 10%. Las células se evaluaron cualitativamente por hasta 14 días durante el crecimiento, y los resultados de la observación se resumen en el cuadro II. Al final del período de cultivo (5 días y 14 días) las células se lavaron dos veces con PBS, y fueron lisadas directamente en la cavidad usando regulador de pH RLT (Qiagen). Se aisló ARN total de los lisados usando el microequipo RNeasy (Qiagen). Estas muestras de ARN se usarán para otros análisis, incluyendo expresión génica global.

Resultados Las CTCs capturadas usando el sistema CelITracks® AutoPrep parecen ser viables, aunque se observó una disminución en la velocidad de duplicación en comparación con las células progenitoras. Los leucocitos murieron dentro de 2 días de cultivo, no interfiriendo de esta manera con el crecimiento de las CTCs.

Se observó que las CTCs estaban dividiéndose, aunque más lento que las células progenitoras control, como era de esperarse. El tiempo de duplicación del crecimiento para las CTCs, fue aproximadamente 2x mayor en comparación con las células progenitoras. Se observó una diferencia en las propiedades de crecimiento (calidad y viabilidad) entre las 2 réplicas, sugiriendo un efecto posible de la sangre de los donadores.

CUADRO II Resultados cualitativos Las cavidades sembradas de células que pasaron a través del CelITracks® AutoPrep, nunca fueron tan densas como la cavidad control.

EJEMPLO 12 Cantidades variables de ADN de CpG M introducido en 100 o 500 nq de ADN de PBL (25 ciclos de PCR de preamplificación y uso de 10% de producto de PCR diluido transferido a la segunda PCR). Los valores de Ct para ADN molde directo o preamplificado (CpG M), se muestran en el siguiente cuadro y en las figuras 4A y 4B.

EJEMPLO 13 ADN de PC y PN introducido en 500 nq de PBL (equivalente a 70,000 células) (20 ciclos de PCR de preamplificacion, seguidos por el uso de 6% de producto resultante en la segunda PCR).

CUADRO VII Valores de Ct para ADN molde directo o preamplifícado (adenocarcinoma de próstata o normal) Equivalente a células PC (pg) Actina (Ct) GSTP1 (Ct) de próstata 189 27 12.5 22.6 63 9 12.5 24.7 21 3 12.3 36.0 7 1 12.5 0.0 PN 63 9 12.0 0.0 Sólo PBL 0 12.1 0.0 Negativo (sin ADN) 0 0.0 0.0 Resultados Se detectaron 50 pg de ADN de CpG M (equivalente a 7 células) en un fondo de 100 ng o 500 ng de PBL (equivalente a 10,000 o 70,000 células, respectivamente) usando QMSP con o sin preamplificación. Se generaron buenas curvas de respuesta lineal para reacciones de preamplificación y amplificación directa. En el estudio inicial, menos de 20 pg de ADN de adenocarcinoma de próstata, equivalentes a 3 células tumorales circulantes, generaron una señal específica para la región de GSTP1 metilado, y se detectó en un fondo de 70,000 PBL. Por otra parte, no se observó señal detectable de ADN de próstata normal (PN) o sangre (PBL), sugiriendo la ausencia de GSTP1 metilado. Se observa sensibilidad de detección de la QMSP anidada de 1 copia en un fondo de 2.5 x 104 copias (20 pg de ADN metilado en 500 ng de ADN no metilado). No se detectaron productos no específicos significativos con el método de QMSP anidada, y el tamaño correcto de los fragmentos de PCR finales se observó en el gel (datos no mostrados). Otros experimentos de optimización de la prueba están en camino para incrementar la sensibilidad de detección y para reducir el valor de CT por menos de 3 células.

EJEMPLO 14 Demostración de la utilidad de la prueba para células tumorales circulantes (CTCs) en sangre, introduciendo líneas de células de cáncer de próstata (LnCAP y DU-145) en la sangre de donadores Líneas de células de tumor de próstata (LnCAP y DU-145) desarrolladas en cultivo, se introdujeron a 30, 100, 300 y 500 células en 7.5 mi de sangre de donadores, seguido de la captura de CTCs por el sistema CelITracks™ AutoPrep de la plataforma CellSearch™ usando el equipo Prolife. Se aisló ácido desoxirribonucleico de estas células usando microcolumnas Qiagen, y se sometieron a reacción de conversión con bisulfito. El ADN modificado del último paso se usó en una reacción de q-MSP de 2 rondas usando las condiciones indicadas en el cuadro III (22 ciclos) y el cuadro IV. Los resultados de los experimentos se muestran en los cuadros VIII y IX. CUADRO VIII Valores de Ct de CTCs (células introducidas, LnCAP) 10% de R1 transferido a GSTP1 0.2% de R1 transferido R2 a R2 Célula LnCAP No. Ct rfu Ct rfu 0 (sin introducción) 0.0 -51 0.0 -14 30 20.2 789 24.2 724 100 19.1 751 23.2 693 300 17.3 734 21.3 688 Actina 26.6-28.8 130-160 31.4-33.4 130-170 Las diferencias de las reacciones duplicadas fueron menores de , salvo 30 células, que fue de 1.5 a 1.7 Ct.

CUADRO IX Valores de Ct de las CTCs (células introducidas, Du-145) Estos resultados demuestran claramente que la q-MSP puede aplicarse exitosamente a las CTCs de pacientes con cáncer de próstata.

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para propagar células de interés obtenidas de una muestra biológica, que comprende los pasos de: a) enriquecer las células bajo condiciones que mantengan viabilidad suficiente de las células; y b) propagar las células bajo condiciones efectivas que permitan viabilidad, proliferación e integridad de las células.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica se selecciona de orina, sangre, suero, plasma, linfa, esputo, semen, saliva, lágrimas, fluido pleural, fluido pulmonar, lavado bronquial, fluido sinovial, fluido peritoneal, ascitis, fluido amniótico, médula ósea, aspirado de médula ósea, fluido cerebroespinal, lisado u homogenizado de tejido, o una pella de células.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células se usan para determinar la presencia o ausencia de una indicación.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la indicación es cáncer, evaluación de riesgo de predisposición genética heredada, identificación de tejido de origen de una célula cancerosa tal como CTC, identificación de mutaciones en enfermedades hereditarias, estado de enfermedad (estadificación), pronóstico, diagnóstico, monitoreo, respuesta a tratamiento, elección de tratamiento (farmacológico), infección (viral, bacteriana, micoplasmática, micótica), quimiosensibilidad, sensibilidad a fármacos, potencial metastásico o identificación de mutaciones en enfermedades hereditarias.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células son enriquecidas por separación magnética/anticuerpos, distribución de células activada por fluorescencia (FACs), filtración, o manualmente.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el enriquecimiento manual es por masaje de la próstata.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la propagación es por cultivo in vitro, ex vivo o in vivo.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proliferación es duplicación de por lo menos una célula.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la integridad se determina por proliferación de células de interés contra células contaminantes.

10. - Un método para determinar el potencial metastásico de una célula de una muestra biológica, que comprende los pasos de: a) enriquecer las células bajo condiciones que mantengan viabilidad suficiente de las células; b) propagar las células bajo condiciones efectivas que permitan viabilidad, proliferación e integridad de las células; c) aislar ácido nucleico y/o proteína de las células; y d) analizar el ácido nucleico y/o la proteína para determinar la presencia, el nivel de expresión o el estado de un biomarcador 5 específico para potencial metastásico.

11. - Un método para identificar mutaciones en enfermedades hereditarias de una célula de una muestra biológica, que comprende los pasos de: a) enriquecer las células bajo condiciones que mantengan viabilidad suficiente de las células; b) propagar las células bajo condiciones efectivas 10 que permitan viabilidad, proliferación e integridad de las células; c) aislar ácido nucleico y/o proteína de las células; y d) analizar el ácido nucleico y/o la proteína para determinar la presencia, el nivel de expresión o el estado de un biomarcador específico para una enfermedad hereditaria.

12. - Un método para preservar material genético de una célula • 15 de una muestra biológica, que comprende los pasos de: a) enriquecer las células bajo condiciones que mantengan viabilidad suficiente de las células; b) propagar las células bajo condiciones efectivas que permitan viabilidad, proliferación e integridad de las células; c) aislar ácido nucleico y/o proteína de las células; y d) preservar el ácido nucleico y/o la proteína. 20

13.- Un método para preparar una vacuna de células tumorales, que comprende los pasos de: a) enriquecer las células bajo condiciones que mantengan viabilidad suficiente de las células; b) propagar las células bajo condiciones efectivas que permitan viabilidad, proliferación e integridad de las células; c) aislar ácido nucleico y/o proteína de las células; y d) usar el ácido nucleico y/o la proteína para formular la vacuna.

14.- Una composición que comprende las células obtenidas por el método de la reivindicación 1.

15.- La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque las células son una población clonal.

16. - Un equipo que comprende agentes de detección de biomarcadores para llevar a cabo el método de la reivindicación 1.

17. - Un artículo que comprende agentes de detección de biomarcadores para llevar a cabo el método de la reivindicación 1.

18. - Un método para obtener un producto de células, que comprende: propagar células de la reivindicación 1 , y cosechar un producto generado por las células.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el producto es una proteína.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la proteína es un anticuerpo, una citocina, una proteína de superficie de la célula o una proteína recombinante.

21. - Un método para identificar un compuesto químico para eficacia farmacéutica, que comprende los pasos de propagar células de la reivindicación 1 , y someter las células al compuesto químico y medir la respuesta de las células al compuesto químico.

22. - Un método para obtener una línea de células primarias, que comprende los pasos de: propagar células de la reivindicación 1 , y continuar la propagación hasta que las células formen una línea de células.

23.- Un método para obtener una población de células clonal, que comprende los pasos de propagar células de la reivindicación 1 , y continuar la selección para una población clonal y propagación hasta que las células formen una población de células clonal.