MX2008011280A

MX2008011280A - Anticuerpor policlonal recombinante para el tratamiento de infecciones por el virus sincitial respiratorio.

Info

Publication number: MX2008011280A
Application number: MX2008011280A
Authority: MX
Inventors: Lars S Nielsen; Johan Lantto; Lucilla Steinaa; Klaus Koefoed; Henriette Schjoenning Nielsen
Original assignee: Symphogen As
Priority date: 2006-03-06
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2008-09-12
Also published as: EP2004686A1; KR20080113223A; WO2007101441A1; US20100040606A1; JP2009528828A; IL193386A0; ZA200806362B; BRPI0708636A2; AU2007222798A1; CN101395182A; CA2638833A1

Abstract

Se describen anticuerpos policlonales nuevos, los cuales se dirigen al virus sincitial respiratorio (RSV), y nuevas moléculas de anticuerpo de alta afinidad reactivas con RSV. Los anticuerpos policlonales pueden comprender moléculas de anticuerpo que sean reactivas tanto con proteína F de RSV como con proteína O de RSV, y de preferencia los anticuerpos policlonales se dirigen a una variedad de epítopes en estas proteínas. Las moléculas de anticuerpo individuales de la invención muestran exhibir afinidades que proporcionan constantes de disociación tan bajas como el intervalo picomolar. Se describen también métodos para producir los anticuerpos de la invención, así como métodos para su uso en el tratamiento de infección por RSV.

Description

ANTICUERPO POLICLONAL RECOMBI ANTE PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES POR EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un anticuerpo policlonal recombinante para la prevención, tratamiento o reducción de uno o más síntomas asociados con infecciones por virus sincitial respiratorio. La invención se refiere también a líneas de células de expresión policlonales que producen un anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV (anti-RSV rpAb) . Además, la solicitud describe composiciones de diagnóstico y farmacológicas que comprenden anti-RSV rpAb y su uso en la prevención, tratamiento o reducción de uno o más síntomas asociados con una infección por RSV. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés) es una gran causa de enfermedades en el tracto respiratorio inferior en bebés y niños pequeños . Los bebés prematuros y niños con un problema de salud subyacente tal como enfermedad crónica pulmonar o enfermedad congénita cardiaca están en mayor riesgo de sufrir enfermedades serias tales como bronquiolitis y neumonía después de una infección por RSV. Recientemente, también se reconoció que RSV es un patógeno importante en ciertos adultos en alto riesgo, tales como adultos inmunocomprometidos , particularmente receptores de transplante de médula ósea, individuos ancianos e REF. : 194473 individuos con enfermedad pulmonar crónica . El RSV humano es un miembro de la subfamilia Pneumovirus de la familia Paramyxoviridae, y existe como un subtipo A y B. RSV es un virus de ARN de sentido negativo no segmentado y encapsidado. El genoma viral codifica para al menos 11 proteínas de las cuales tres son las proteínas asociadas con cápside, F (glicoproteína de fusión) , <5 (glicoproteína de unión a receptor) y SH (proteína hidrofóbica pequeña) . Las proteínas de cápside están pr-esentes sobre la superficie viral, y hasta cierto punto también sobre la superficie de células infectadas . La proteína F promueve la fusión de las membranas virales y celulares, permitiendo de esta manera la penetración del ARN viral en el citoplasma de la célula. La proteína F consiste en dos subunidades enlazadas por disulfuro, Fi y F2, producidas por corte proteolítico de un precursor N-glicosilado e inactivo de 574 aminoácidos. La proteína G es una glicoproteína transmembranar tipo II de 289-299 aminoácidos (dependiendo de la cepa del virus) . La forma precursora tiene 32 kDa, la cual madura a una proteína de 80-90 kDa luego de la adición de oligosacáridos tanto N como O-enlazados . La proteína RSV -G es responsable de la fijación de viriones a las células objetivo. Además de la forma unida a membrana de la proteína <3, también se produce una forma truncada y soluble. Se ha sugerido que la función de esto es redirigir la respuesta inmune lejos el virus y células infectadas. Además se ha demostrado que la proteína G está asociada con un número de efectos pro-inflamatorios tales como modificación de la expresión -de qumiocinas y citocinas así como reclutamiento de leucocitos. La proteína SH es una proteína de 64-65 aminoácidos que está presente en cantidades muy bajas sobre la superficie de partículas RSV purificadas, pero que es expresada abundamente sobre la superficie de células infectadas por RSV. La función de la proteína SH no ha sido definida aún, pero es posible que pueda auxiliar el transporte de proteínas virales a través del complejo de Golgi (Rixon et al 2004, J. Gen. Virol . 85:1153-1165) . Bloquear la función de las proteínas G y F se cree que es relevante en la prevención de infección por RSV. La prevención y tratamiento de infección por RSV ha recibido considerable atención durante las últimas décadas, e incluye desarrollo de vacunas, compuestos antivirales (Ribavirin aprobado para tratamiento) , fármacos antisentido, tecnología de interferencia de ARN (AR I) y productos de anticuerpo tales como inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales (todo revisado en Magno and Barik, 2004, Rev. Med. Virol. 14:149-168). De estos enfoques, la inmunoglobulina intravenosa, RSV-IVIG y el anticuerpo monoclnal Palivizumab, han sido aprobados para la profilaxis de RSV en niños en alto riesgo. Los productos de inmunoglobulina tales como RSV-IVIG (RespiGam) , son, sin embargo, conocidos por tener varias desventajas tales como baja actividad específica dando como resultado necesidad de inyección de grandes volúmenes, lo cual es difícil en niños con acceso venoso limitado debido a terapia intensiva anterior. Además, también existe el riesgo de transmisión de enfermedades virales de productos .de inmunoglobulina derivados de suero, así como de problemas con variaciones entre lotes. Finalmente, es difícil obtener suficientes donadores para satisfacer las necesidades de la producción de inmunoglobulina RSV hiperinmune, toda vez que sólo aproximadamente 8% de donadores normales tienen títulos de anticuerpos neutralizantes de RSV que son lo suficientemente altos. Los anticuerpos monoclonaLes contra la proteína F o la proteína G han demostrado tener efecto neutralizante in vi tro y efectos profilácticos in vivo {por ejemplo Beeper y Coelingh 1989. J. Virol . 63:2941-50; Garcia-Barreno et al. 1989. J. Virol. 63:925-32; Taylor et al. 1984. Immunology 52:137-142; Walsh et al. 1984, Infection and Immunity 43:756-758; US 5,842,307 y US 6,818,216). Actualmente el anticuerpo monoclonal Palivizumab ha sustituido en gran parte el uso de RSV-IVIG completamente. Ensayos de neutralización muestran que Palivizumab y RSV-IVIG actúan igualmente bien contra el subtipo B de RSV, mientras que Palivizumab actúa mejor contra el subtipo A (Johnson et al. 1997. J. Infect. Dis . 176:1215- 24.). Sin embargo, a pesar de los buenos efectos neutralizantes y profilácticos de anticuerpos monoclonales como los ilustrados por productos tales como Palivizumab y Numax, éstos también pueden estar asociados con ciertas desventajas debido a la naturaleza del virus RSV. El RSV existe en dos grupos o subtipos antigénicos distintos, A y B. La mayoría de las proteínas RSV son altamente conservadas entre los dos subgrupos, con la proteína F mostrando 91% de similitud de aminoácidos. Sin embargo, la proteína G presenta variabilidad de secuencia extensa, con sólo 53% de similitud de aminoácidos entre los subgrupos A y B (Sullender 2000. Clin. Microbiol . Rev. 13:1-15). La mayoría de las proteínas muestra también cierta variación entre subgrupos limitada, excepto por la proteína G, la cual difiere en hasta 20% dentro del subgrupo A y 9% dentro del subgrupo B a nivel de aminoácidos . Los subtipos de virus A y B co-circulan en la mayoría de las epidemias RSV, con la frecuencia relativa variando entre años diferentes. Así, un anticuerpo monoclonal debe ser cuidadosamente seleccionado de tal forma que sea capaz de neutralizar ambos subtipos así como variaciones entre subtipos . Además de la descendencia de los dos subtipos de RSV y de la diversidad entre subtipos, RSV humano, al igual que la mayoría de los virus de ARN, tienen la capacidad de sufrir mutaciones rápidas bajo presión selectiva. La selección de mutantes de escape de RSV in vi tro usando mAb está bien documentada (por ejemplo, Garcia-Barreno et al. 1989. J. Virol . 63:925-32). En forma importante, se descubrió recientemente que Palivizumab selecciona también mutantes de escape, in vi tro así como in vivo, y que algunos de los mutantes aislados son completamente resistentes a la profilaxis con Palivizumab en ratas de algodón (Zhao y Sullender 2005. J. Virol. 79:3962-8 y Zhao et al. 20?4. J. Infect. Dis. 190:1941-6.). Además, cepas de RSV tipo silvestre que son intrínsecamente resistentes a Palivizumab también pueden existir, como se demuestra por la falla del anticuerpo de murino, del cual se origina el Palivizumab, para neutralizar un aislado clínico (Beeper y Coelingh 1989. J. Virol. 63:2941-50). Más aún, un virus aparentemente resistente también ha sido identificado después de la profilaxis con Palivizumab en ratas de algodón inmunocompetentes (Johnson et al. 1997. J. Infect. Dis. 176:1215-24). De esta manera, bajo ciertas condiciones, el uso de un solo anticuerpo monoespecífico podría no ser adecuado o suficiente para el tratamiento de enfermedad por RSV, toda vez que existen mutantes de escape o pueden desarrollarse con el tiempo como resultado del tratamiento. Una consideración adicional en relación a la utilidad de RSV-IVIG y Palivizumab es la dosis requeri-da para un tratami-ento eficiente. Las concentraciones en suero de más de 30 ug/ml han mostrado ser necesarias para reducir replicación de RSV pulmonar 100 veces en el modelo de rata de algodón de infección por RSV. Para RSV-IVIG una dosis mensual de 750 mg de proteína total/kg administrada intravenosamente fue efectiva para reducir la incidencia de hospitalización por RSV en niños en alto riesgo, mientras que para Palivizumab dosis intramusculares mensuales de 15 mg/kg probaron ser efectivas. Sin embargo, la administración de varias dosis grandes intravenosas o intramusculares es inconveniente para el paciente, e impide el amplio uso de estos productos en la profilaxis y tratamiento del gran grupo de adultos en riesgo de infección por RSV. Así, existe la necesidad de un producto de anticuerpo que no dependa de la disponibilidad de donadores, y el cual se una inmunoespecíficamente a uno o más antígenos RSV que cubran los subtipos A y B así como cualquier mutante de escape que se origine debido a mutaciones de virus, sea altamente potente, tenga un perfil farmacocinética mejorado, y de esta manera tenga un perfil terapéutico mejorado total y por lo tanto requiera de menos administración frecuente y/o administración de una dosis más baja. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es por lo tanto el objetivo de la presente invención proporcionar un producto de inmunoglobulina anti-RSV alternativo altamente potente el" cual se produzca en forma recombinante y muestre reactividad a subtipos A y B del virus sincitial respiratorio así como a múltiples epítopes al menos en uno de los antígenos de superficie mayores para limitar la posibilidad de mutaciones de escape. La invención tiene también como un objetivo proporcionar moléculas de anticuerpo anti-RSV humanas nuevas así como derivados de las mismas, en donde las moléculas de anticuerpo o derivados exhiban características mejoradas sobre anticuerpos anti-RSV monoclonales y derivados de anticuerpos existentes. Se espera que el uso de una composición de anticuerpos policlonales que se dirige a varios epítopes en RSV reduzca al mínimo el desarrollo de imitantes de escape y también pueda proporcionar protección contra varios virus circulantes naturalmente. En contraste con RSV-IVIG derivada de suero, un anticuerpo policlonal de la presente invención no contiene moléculas de anticuerpo, las cuales se unen a antígenos no RSV. La presente invención proporciona un anticuerpo anti-RSV policlonal. De preferencia, el anticuerpo anti-RSV policlonal se obtiene de células que no producen naturalmente anticuerpos. Este anticuerpo es llamado un anticuerpo policlonal recombinante (rpAb) . Un anti-RSV rpAb de la presente invención es dirigido contra varios epítopes sobre la proteína F o G. En particular un anti-RSV rpAb que es dirigido contra varios epítopes tanto sobre las proteínas G como , F se prefiere. De preferencia, los epítopes de proteína G que pertenecen al grupo conservado y potencialmente también al grupo específico de subtipo y al grupo específico de cepa son cubiertos por el anti-RSV rpAb. Además, anticuerpos con reactividad contra la tercera proteína de cápside, proteína hidrofóbica pequeña (SH) son un componente deseado de un anti-RSV rpAb de la presente invención. Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas en donde el ingrediente activo es un anticuerpo policlonal anti-RSV, así como usos de estas composiciones en la prevención, reducción o tratamiento de infecciones por RSV. La presente invención proporciona además procedimientos para reflejar la respuesta inmune humoral desarrollada después de la infección con RSV, al aislar los pares de genes VH y VL originales de estos individuos atacados, y producir anticuerpos que mantienen su apareo original . Definiciones El término "anticuerpo" describe un componente funcional de suero y comúnmente es referido ya sea como una colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulina) o como una molécula (la molécula de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina) . Una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a o de reaccionar con un determinante antigénico especifico (el antigeno o el ep tope antigénico) , lo cual a su vez puede llevar a la inducción de mecanismos efectores inmunológicos . Una molécula de anticuerpo individual normalmente es considerada monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo puede ser monoclonal (es decir, consistir en moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonal (es decir, consistir en diferent-es moléculas de anticuerpo que reaccionen con el mismo o diferentes epitopes en el mismo antígeno o en diferentes antígenos distintos) . Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura única que le hace posible unirse específicamente a su antígeno correspondiente, y todas las moléculas de anticuerpo naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos también se conocen colectivamente como inmunoglobulina . Los términos anticuerpo o anticuerpos según se usan en la presente se usan en el sentido más amplio y cubren anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y de cadena individual, así como fragmentos de unión de anticuerpos, tales como Fab, fragmentos Fv o fragmentos scFv, así como formas multiméricas tales como moléculas IgA diméricas o IgM pentavalentes . En algunos casos, la presente solicitud usa el término "análogo de anticuerpo sintético o semi-sintético" , la cual se refi-ere específicamente a moléculas que ocurren no naturalmente las cuales exhiben características de anticuerpo (al exhibir unión específica a antígenos RSV) e incluye CDRs de anticuerpos que ocurren naturalmente -estos análogos son por ejemplo representados por fragmentos scFv, diacuerpos etc., pero que pueden por ejemplo ser también aparentemente anticuerpos que ocurren naturalmente los cuales se manipulan para incluir las CDRs <por ejemplo, mediante técnicas de injerto conocidas en la técnica) de una molécula de anticuerpo anti-RSV descrita en la presente - por ejemplo, este análogo de anticuerpo puede comprender CDRs descritas en la presente incorporadas en una molécula de anticuerpo de otra especie animal o en un isotipo o clase de anticuerpo diferente de la misma especie. El término "anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV" o "anti-RSV rpAb" describe una composición de diversas moléculas de anticuerpo producidas recombinantemente, en donde los miembros individuales son capaces de unirse a por lo menos un epítope sobre un virus sincitial respiratorio, y en donde la composición policlonal completa es capaz de neutralizar RSV. De preferencia, una composición anti-RSV rpAb neutraliza RSV tanto subtipo A como B. Se prefiere todavía más que el anti-RSV rpAb comprenda además reactividad de unión hacia la proteína G y F. De preferencia, la composición se produce a partir de una sola línea de células de fabricación policlonal. El término "par de codificación VH y VL cognado" describe un par original de secuencias de codificación VH y VL contenidos dentro o derivados de la misma célula. Así, un par VH y VL cognado representa el par VH y VL originalmente presente en el donador del cual esta célula se deriva. El término "un anticuerpo expresado de un par de codificación VH y VL" indica que un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se produce a partir de un vector, plásmido o similar que conti-ene la secuencia de codificación de VH y VL. Cuando un par VH y VL cognado es expresado, ya sea como un anticuerpo completo o como un fragmento estable del mismo, conserva la afinidad de unión y especificidad del anticuerpo expresado originalmente de la célula de la que se deriva. Una biblioteca de pares cognados también es llamada un repertorio o colección de pares cognados, y puede mantenerse individualmente o agrupada. Los términos "un miembro distinto de un anticuerpo policlonal recombinante" significa una molécula de anticuerpo individual de la composición de anticuerpos policlonal.es recombinantes , que comprende uno o más tramos dentro de las regiones variables, los cuales son caracterizados por diferencias en la secuencia de aminoácidos en comparación con los demás miembros individuales de la proteína policlonal. Estos tramos se ubican en particular en las regiones CDRl, CDR2 y CDR3. El término "epítope" se usa comúnmente para describir una proporción de una molécula más grande o una parte de una molécula más grande (por ejemplo, antígeno o sitio antigénico) que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, de preferencia un mamífero, y muy preferiblemente un humano. Un epítope que tiene actividad inmunogénica es una porción de una molécula más grande que desarrolle una respuesta a anticuerpo en un animal. Un epítope que tiene actividad antigénica -es una porción de una molécula más grande a la cual se une inmunoespecíficamente un anticuerpo como se determina por cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en la presente. Los epítopes antigénicos no necesariamente tienen que ser inmunogénicos . Un antígeno es una sustancia a la cual un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une inmunoespecíficamente, por ejemplo, toxina, virus, bacteria, proteínas o ADN. Un antígeno o sitio antigénico comúnmente tiene más de un epítope, a menos que sean muy pequeños, y comúnmente es capaz de estimular una respuesta inmune. Los anticuerpos que se unen en diferentes epítopes en el mismo antígeno pueden tener efectos variables en la actividad del antígeno al que se unen dependiendo de la ubicación del epítope. Un anticuerpo que se una a un epítope en un sitio activo del antígeno puede bloquear la función del antígeno completamente, mientras que otro anticuerpo que se una en un epítope diferente puede tener muy poco o ningún efecto en la actividad del antígeno solo.

Estos anticuerpos pueden no obstante activar aún el complemento y de esta manera dar como resultado la eliminación del antígeno, y pueden resultar en efectos sinérgicos cuando se combinen con uno o más anticuerpos que se unan en epítopes diferentes sobre el mismo antígeno. En la presente invención la molécula más grande de la cual el epítope es una proporción es de preferencia una proporción de un polipéptido RSV. Antígenos de la presente invención son de preferencia proteínas asociadas a RSV, polipéptidos o fragmentos de los mismos a los cuales se une inmunoespecíficamente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Un antígeno asociado a RSV también puede ser un análogo o derivado de un polipéptido o fragmento RSV del mismo al cual se una inmunoespecíficamente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo . El término "completamente humano" usado por ejemplo en relación a secuencias de ADN, AR o proteínas describe secuencias que son entre 98 a 100% humanas. El término " inmunoglobulina" se usa comúnmente como una designación colectiva de la mezcla de anticuerpos encontrados en sangre o suero, pero también se puede usar para designar una mezcla de anticuerpos derivados de otras fuentes. El término "refleja la respuesta inmune humoral" cuando se usa en relación a un anticuerpo policlonal se refiere a una composición de anticuerpos en donde las secuencias de ácido nucleico que codifican para los miembros de anticuerpo individuales se derivan de un donador con una frecuencia incrementada de células de plasma que produce anticuerpos específicos anti-RSV. Este donador puede ser ya sea recuperación de una infección de RSV, que haya tenido cercano contacto con un individuo infectado por RSV o haya sido sujeto a vacunación por RSV <para ejemplos de vacunas de RSV véase por ejemplo, Magno y Barik, 2004, Rev. Med. Virol . 14:149-168). Para reflejar la afinidad y especificidad de anticuerpos desarrollados en un donador después de infección o ataque, las secuencias que codifican para la cadena variable pesada (VH) y la cadena ligera variable (VL) deben ser mantenidas en los pares o combinaciones de genes presentes originalmente en el donador (pares cognados) cuando son aisladas. Para reflejar la diversidad de una respuesta inmune humoral en un donador todas las secuencias que codifiquen para anticuerpos que se unan a RSV se seleccionan con base en un procedimiento de tamizado. Las secuencias aisladas son analizadas con respecto a la diversidad de las regiones variables, en particular las regiones CDR, pero también con respecto a la familia VH y VL. Con base en estos análisis una población de pares cognados que representa la div-ersidad total de los anticuerpos de unión a RSV se seleccionan. Este anticuerpo policlonal tiene típicamente al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1000 ó 104 miembros distintos. Se dice que una composición .es " fármacológicamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor -lo mismo aplica por supuesto para excipientes, portadores, portadores y diluyentes que formen parte de una composición. El término "anticuerpo policlonal" describe una composición de diferentes (diversas) moléculas de anticuerpo que es capaz de unirse a o reaccionar con varios determinantes/epítopes antigénicos específicos diferentes en el mismo o en diferentes antígenos, en donde cada anticuerpo individual en la composición es capaz de reaccionar con un epítope particular. Normalmente, la variabilidad de un anticuerpo policlonal se ubica en las llamadas regiones variables del anticuerpo policlonal, en particular en las regiones CDRl , CDR2 y CDR3. En la presente invención un anticuerpo policlonal puede ser ya sea producido en un recipiente de una línea de células policlonales, o puede ser una mezcla de diferentes anticuerpos policlonales. Una mezcla de anticuerpos monoclonales no es como tal considerada un anticuerpo policlonal, toda vez que se producen en lotes individuales y no necesariamente de la misma línea de células lo cual dará como resultado por ejemplo diferencias de modificación después de la traducción. Sin embargo, si una mezcla de anticuerpos monoclonal-es proporcionan la misma cobertura de antígenos/epítopes que un anticuerpo policlonal de la presente invención será considerado como un equivalente del anticuerpo policlonal. Cuando se dice que un miembro de un anticuerpo policlonal se una específicamente a o tiene reactividad específica contra un antígeno/sitio antigénico/epítope, se intenta decir en la presente que la constante de unión está debajo de 100 nM, de preferencia debajo de 10 nM, todavía muy preferiblemente debajo de 1 nM. El término "anticuerpo recombinante" se usa para describir una molécula de anticuerpo o varias moléculas que es /son expresadas de una célula o línea de células transfectada con un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación del anticuerpo que no está asociada naturalmente con la célula. Si las moléculas de anticuerpo en una composición de anticuerpos recombinantes son diversas o diferentes, el término "anticuerpo policlonal recombinante" o "rpAb" aplica de acuerdo con la definición de un anticuerpo policlonal . El término "línea de células policlonales recombinantes" o "línea de células policlonales" se refiere a una mezcla/población de células que expresan proteínas que son transíectadas con un repertorio de secuencias de ácido nucleico variantes (por ejemplo, un repertorio de secuencias de ácido nucleico que codifican para anticuerpo) , las cuales no están asociadas naturalmente con las células transíectadas . De preferencia, la transfección se lleva a cabo de tal manera que las células individuales, las cuales constituyen juntas la línea de células policlonales recombinantes , cada una porte una copia transcripcionalmente activa de una sola secuencia de ácido nucleico de interés distinta, la cual codifique para un miembro del anticuerpo policlonal recombinante de interés. Se prefiere todavía más que sólo una sola copia de las secuencias de ácido nucleico distinta sea integrada en un sitio específico en el genoma. Las células que constituyen la línea de células policlonales recombinantes se seleccionan por su capacidad para conservar la copia (copias) integradas de las diferentes secuencias de ácido nucleico de interés, por ejemplo mediante selección con antibióticos. Las células que pueden constituir tal línea de células policlonales pueden ser por ejemplo bacterias, hongos, células eucarióticas tales como levadura, células de insecto, células vegetales o células de mamífero, especialmente líneas de célula de mamífero inmortales tales como células CHO, células COS, células VHK, células de mieloma (por ejemplo, células sp2/0, NSO) , NIH, 3T3, YB2/0 y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293 o PER.C6. Los términos "secuencias que codifican para pares VH y VL" o "pares de secuencias que codifican para VH y VL" indican moléculas de ácido nucleico, en donde cada molécula comprende una secuencia que codifica para la expresión -de una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, de tal forma que éstas puedan ser expresadas como un para de la molécula de ácido nucleico si el promotor y/o regiones IRES adecuadas están presentes y enlazadas operablemente a las secuencias . La molécula de ácido nucleico también puede codificar para parte de las regiones constantes o la región constante completa de la cadena pesada y/o la cadena ligera, permitiendo la expresión de un fragmento Fab, un anticuerpo de longitud completa u otros fragmentos de anticuerpo si las regiones promotoras y/o IRES adecuadas están presentes y enlazadas operablemente a las secuencias . Se dice que un anticuerpo policlonal recombinante es administrado en una "cantidad terapéuticamente efectiva" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa, por ejemplo previene o atenúa una infección por RSV en un animal o humano . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A: Alineación de las secuencias de aminoácidos de la proteína -G completa de las cepas prototípicas , Long (subtipo A) y 18537 (subtipo B) . La región de señal /trans-membrana está encerrada en un cuadro con una línea punteada. Los dos dominios variables entre los aminoácidos 101-133 y 208-299 identificador por Cañe et al. 1991 J. Gen. Virol . 72:2091-2096 son identificados con un subrayado. El fragmento central de la proteína G ha sido expresado como una proteína de fusión en E. coli y está encerrado en un cuadro negro. Las dos secuencias -de aminoácidos se muestran en SEQ ID NOs : 711 (subtipo A) y 712 (subtipo B) . (FIG. IB) Alineación del fragmento central, como se indica en (FIG. 1A) . La ubicación de la región conservada de 13 aminoácidos (residuos de aminoácido 164-176) y la región rica en proteína G cisteína (GCRR) se indican entre paréntesis. Los puentes de disulfuro en la GCRR (idénticos para ambos subtipos) se indican con corchetes. Las dos secuencias de aminoácidos se muestran en SEQ ID NOS: 713 (subtipo A) y 714 (subtipo B) . Figura 2A: Contorno esquemático de la RT-PCR de extensión por traslape multiplexado (FIG. 2B) y las etapas de clonación. (FIG. 2A) Dos conjuntos de cebadores CH + VH 1-8 y VKl-6 + CKl, específicos para familias de genes VH y VK respectivamente, fueron usados para la primera etapa de PCR. Una región homologa entre los cebadores VH y VK da como resultado la generación de un producto de PCR de traslape. En la segunda etapa este producto es amplificado en la PCR anidada. Los cebadores incluyen también sitios de reconocimiento para enzimas de restricción que facilitan la clonación. (FIG. 2B) Los pares de codificación VH y VK enlazados cognados generados son agrupados e insertados -en un vector de expresión de IgG de mamífero <por ejemplo, figura 3) mediante el uso de los sitios de restricción Xhol y Notl de flanqueo. Posteriormente un promotor bidireccional se inserta en el sitio de restricción Ascl-Nhel entre las secuencias de codificación VH y VK enlazadas para facilitar la expresión de anticuerpos de longitud -completa. Los cebadores de PCR usados se indican por flechas horizontales. CHl : dominio 1 constante de la cadena pesada, CL: dominio constante, LC: cadena ligera; Ab: anticuerpo; P1-P2: promotores bi-direccionales . Figura 3 : Presentación esquemática de un vector de expresión de anticuerpo de longitud completa de mamífero 00-VP-530. El vector comprende los siguientes elementos: Amp y Amp pro=gen de resistencia a ampicilina y su promotor. pUC origen = origen pUC de replicación. Pl = promotor de mamífero que conduce la expresión de la cadena ligera. P2 = promotor de mamífero que conduce la expresión de la cadena pesada. IGHV líder = líder de cadena humana pesada humana genómico. VH = secuencia de codificación de región variable de cadena pesada. IgGl = Secuencia que codifica para región constante de cadena pesada del isotipo Gl de inmunoglobulina genómica. B-globina de conejo A = secuencia polyA de beta-globina de conejo. Líder kappa = secuencia que codifica para líder kappa de murino. LC = secuencia de cadena ligera <jue codifica para secuencia. Término SV40 = secuencia terminadora de virus de simio 40. FRT = Sitio objetivo de reconocimiento de Flp. Neo = gen de resistencia a neomicina. -SV40 polyA = secuencia de señal polyA de virus simiano 40. Figura 4: Caracterización de la especificidad a epítopes de anticuerpo obtenido del clon 8-01 (Ab801) usando análisis Biacore. La unión del anticuerpo 801 se probó en competencia por pares para la unión a proteína F, usando tres anticuerpos, 9c5 (2), 133-h (3) y Palivizumab (4), los cuales se unen al sitio antigénico Fl, C y II, respectivamente. La célula de referencia ilustra la unión a proteína F de Ab801 (1) no competido. Los tiempos de inyección de los cuatro anticuerpos se indican por una flecha. La respuesta se indica en unidades de resonancia relativas (RU) . La flecha larga de dos puntas indica la magnitud de la respuesta no competida y la flecha corta de dos puntos indica la magnitud de la secuencia inhibida 9c5. Figuras 5A-5B: Muestran resultados de la neutralización in vitro de las cepas de subtipo A y B RSV. Las diluciones de mezclas de anticuerpos anti-F fueron probadas para su capacidad para neutralizar RSV Long (FIO. 5A) y cepas RSV Bl (FIG. 5B) . La mezcla de anticuerpos, anti-F(I), obtenida de clones 810, 818, 819, 825 y 827 se muestra como triángulos ( A ) y mezclas de anticuerpos, anti-F(II), obtenida de clones 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884 y 894 se muestra como cuadrados (¦) . Palivizumab se muestra como diamantes (?) y un control negativo igualado a isotipo (anti-Rhesus D) se muestra como círculos (·) . La absorbancia se midió a 490 nm y se correlaciona con la replicación de RSV. Figura 6: Muestra los resultados de un ensayo de inhibición de fusión de RSV in vi tro. Diluciones de mezclas de anticuerpos fueron probadas para su capacidad para neutralizar la cepa RSV Bl . Mezcla de anticuerpos, anti-F(I)G, obtenida de los clones 810, 818, 819, 825, 827, 793, 796, 838, 841, 856 y 888 se muestra como cuadrados no reíLeños (?) y la mezcla de anticuerpos anti-F(II)<3, obtenida de los clones 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884, 894, 793, 796, 838, 841, 856 y 888 se muestra como triángulos no rellenos (?) . Palivizumab se muestra como diamantes (?) . La absorbancia se midió a 490 nm y se correlaciona con la replicación de RSV. Figura 7: Muestra resultados de una neutralización in vi tro de RSV por combinaciones de clones de anticuerpo anti-G medida por el PRNT en presencia de complemento activo. Diluciones de composiciones de anticuerpo individuales (descritas en la tabla 8) fueron incubadas con la cepa de RSV Long en presencia del complemento de conejo y posteriormente se les dejó infectar células HEp-2. Después de 24 horas de incubación, se detectó el grado de infección usando inmunodetección de placas específicas para RSV. Anti-RSV rpAb 13 se muestra como triángulos vacíos (?) , anti-RSV rpAb 35 como triángulos ( A ) , anti-RSV rpAb 36 como cuadrados (¦) , anti-RSV rpAb 41 como círculos (·) y anti-RSV rpAb 45 como cuadrados vacíos (?) . Los datos se presentan como % de inf-ección -en comparación con control ± SD.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antígenos objetivo y composiciones de anticuerpos policlonales Un anticuerpo policlonal de la presente invención está compuesto de un número de moléculas de anticuerpo distintas en la misma composición. Cada molécula se selecciona con base en su capacidad para unirse a un antígeno asociado a RSV. Un anticuerpo policlonal de la presente invención comprende reactividad de unión que corresponde a la reactividad de unión compilada de las diferentes moléculas de anticuerpo que constituyen la composición de anticuerpos policlonales . Un anticuerpo policlonal anti-RSV de la presente invención comprende de preferencia una reactividad de unión compilada tanto contra proteínas G como F y todavía más preferido contra varios epítopes para minimizar el riesgo de desarrollo de mutantes de escape y lograr capacidad neutralizante más alta posible. Al menos cinco sitios antigénicos mayores que son reconocidos por anticuerpos neutralizantes han sido identificados en la proteína F (López et al., 1998. J. virol . 72:6922-8). Todos los sitios antigénicos han sido asignados a la cadena Fi, e incluyen el sitio I, II, IV, V y VI, en donde sitio I y sitio II también pueden ser llamados B y A, respectivamente. El sitio II se ubica en una región resistente a proteasa en el segmento N- terminal, y los sitios IV, V y VI en el extremo C-terminal de la región rica en cisteína de la proteína. El sitio I se ubica en medio de este grupo de cisteínas. Un sitio antigénico adicional en la proteína F es el sitio C en el cual el epítope F2 que incluye las posiciones de aminoácido 241 y 242 se ubica. Además, existen anticuerpos monoclonales que se unen a un sitio antigénico llamado Fl, que comprende los epítopes llamados Fia, Flb y Fie. Actualmente este sitio antigénico no ha sido asignado a un sitio particular en la proteína F. La mayoría de estos sitios /epítopes dan origen a anticuerpos ampliamente neutralizantes, pero algunos anticuerpos específicos para el sitio antigénico 1 han mostrado ser específicos del subtipo A. Los anticuerpos que se unen al sitio 1 tienen también un efecto marginal en la neutralización de virus. El epítope reconocido por Palivizumab se ubica en el sitio antigénico II como se juzga por la ubicación de las mutaciones de escape seleccionadas en la posición de aminoácido 272 (Zhao et al. 2004. J. Infect. Dis. 190:1941-6). Además, tres tipos de epítopes han sido identificados en la proteína G: I) epítopes conservados que están presentes en todas las cepas de SV, II) epítopes específicos de grupo que están presentes en todos los virus que pertenecen al mismo subtipo y III) epítopes específicos de cepa o variables que están presentes sólo en un subconjunto de cepas que pertenecen al mismo subtipo. Los epítopes específicos de grupo y conservados han sido asignados a la parte central de la proteína G que contiene un grupo de cuatro cisteínas (residuos de aminoácido 173, 176, 182 y 186) y un segmento de aminoácidos corto (residuos 164-176) de secuencia idéntica entre todos los aislados de RSV humanos. El grupo de cisteína es mantenido por enlaces de disulfuro entre la posición 173-183 y 176-182 y constituye la parte central de la región rica en cisteína de la proteína (GCRR) que varía del residuo de aminoácido 171-187, de esta manera la GCRR se traslapa con la región conservada de 13 aminoácidos. La glicoproteína G parece jugar un papel tanto en la inducción de inmunidad protectora como patogénesis de enfermedad. Por ejemplo, estudios en ratones han mostrado que la glicoproteína G ceba para una respuesta a células T Th2 CD4+, caracterizadas por la producción de IL-4, IL-5, IL-13 y eosinófilos pulmonares. El reclutamiento y activación de eosinófilos son promovidos por varios factores, tales como IL-4 e IL- . Además, la expresión de la proteína RSV G durante infección aguda en ratones ha estado asociada con una respuesta inmune innata modificada caracterizada por expresión reducida de citocinas Thl (por ejemplo, IL-2 y gamma interferón) , expresión alterada de AR m de quimiocina (por ejemplo, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, MIP-2, IP-10, MCP-1), y tráfico -de células NK reducido al pulmón infectado. En particular la GCRR ha mostrado jugar un papel importante en modular la respuesta inflamatoria e innata, de esta manera retrasando potencialmente la depuración de RSV (Polack et al. 2005. PNAS 102:8996-9001). La GCRR comprende un motivo CX3C en las posiciones de aminoácido 182 a 186. La reducción en las velocidades respiratorias en ratones infectados con RSV ha mostrado estar asociada con el motivo CX3C , toda vez que anticuerpos contra este motivo detienen la reducción en los ritmos respiratorios (Tripp et al. 2003. J. Virol. 77:6580-6584 y US 2004/0009177 (solicitud No. 10/420,387)). Los epítopes específicos de cepas se localizan de preferencia en el tercio C-terminal variable del polipéptido G, aunque un epítope específico de cepa ha sido asignado a una N-terminal de región variable del grupo de cisteína en el ectodominio de proteína G (Martínez et al. 1997. J. Gen. Virol. 78:2419-29). Las figuras 1A-1B muestran una alineación de las proteínas G de la cepa Long (subtipo A) la figura 1A y la cepa 18537 (subtipo B) la figura IB, indicando las diferentes regiones de la proteína G. Generalmente, anticuerpos anti-proteína G monoclonales tienen efectos marginales en la neutralización de RSV. Sin embargo, se ha reportado que mezclas de anticuerpos anti-G monoclonales incrementan la neutralización de RSV in vitro así como in vivo (Walsh et al. 1989. J. Gen. Virol. 70:2953-61 y Martínez y Melero 1998 J. Gen. Virol. 79:2215-20) . El mayor efecto de combinar anticuerpos anti-G monoclonales se logra aparentemente cuando los anticuerpos se unen a diferentes ep topes, aunque una fracción del virus permaneció aún resistente a neutralización. Además, se ha demostrado que combinaciones de -dos anticuerpos anti-F diferentes con diferentes especificidades de epitopes asi como combinaciones de un anticuerpo especifico anti-F y un anti-G mostraron un efecto neutralizante in vitro incrementado en RSV (Anderson et al. 1988. J. Virol. 62:4232-4238). Algunas ventajas obtenidas al mezclar anticuerpos monoclonales parecen deberse a las propiedades individuales de los anticuerpos monoclonales, tales como un efecto antagonista, por ejemplo, al bloqueo del sitio activo. Otros efectos parecen ser sinérgicos por razones que actualmente no se entienden. Los mecanismos de la neutralización de RSV son complejos y no se entienden completamente. El gran número de epitopes diferentes, conservados, específicos de subtipo así como epitopes específicos de cepas, identificados en las proteínas F y G solas, así como la generación potencial de mutantes de escape sugiere ^ue un amplio espectro de especificidades de anticuerpo se requiere para resolver todos los mecanismos de neutralización que pudieran jugar un papel en la prevención de la infección por RSV. De esta manera, sería muy difícil, de una forma racional, seleccionar la mezcla de anticuerpos monoclonales que fuera capaz de prevenir infección por RSV con cepas de RSV tanto en subtipo A como B, así como mutantes de escape y cepas nuevas -que se originen de las cepas de RSV conocidas actualmente. Un aspecto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-RSV policlonal con una considerable diversidad y amplia especificidad anti-RSV. El anticuerpo policlonal anti-RSV de la presente invención no depende de la disponibilidad de donadores en el momento de su producción y la variación entre lotes es considerablemente más baja que la observada para productos de inmunoglobulina anti-RSV derivados de donador (por ejemplo RSV IVIG) . En un anticuerpo policlonal anti-RSV de la presente invención todos los miembros de anticuerpo individuales son capaces de unirse a un antígeno asociado con RSV y el anticuerpo policlonal es capaz de neutralizar el subtipo A y B de RSV. Se prefiere que cada anticuerpo distinto del anticuerpo policlonal se una a un epítope que no se una por ninguno de los otros miembros del anticuerpo policlonal. Un anticuerpo policlonal anti-RSV de la presente invención se unirá a antígenos RSV de una manera multivalente, lo cual da como resultado normalmente una neutralización sinérgica, fagocitosis mejorada de células infectadas por macrófagos y una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada (ADCC) contra -células infectadas asi como contra activación de compl-emento incrementada. Además, un anticuerpo policlonal de la presente invención no es "diluido" por proteínas de no unión lo cual es -el caso para RSV IVIG, cuando una dosis de 750 mg -de proteína total/kg se requiere para ser eficiente. El porcentaje de anticuerpos específicos de RSV dentro de la proteína total de 750 mg se desconoce, pero no es probable que constituya máximo 15, cuando mucho probablemente menos. Así, cuando la potencia in vi tro de Palivizumab fue calculada como 25-30 veces más alta que aquella de RSV IVIG (Johnson et al. 1997. J. Infect. Dis . 176:1215-24), esto es opacado por una actividad específica reducida de la RSV IVIG. De esta manera, si sólo 1% de las moléculas de inmunoglobulina contenidas en el RSV-IVIG son específicas para RSV, entonces la dosis activa del anticuerpo policlonal RSV-IVIG es de sólo 7.5 mg/kg la cual es más baja que aquella del anticuerpo monoclonal Palivizumab. Por estas razones se espera que un anticuerpo específico de RSV policlonal recombinante de la presente invención sea significativamente más potente que un anticuerpo monoclonal, y que por lo tanto sea posible de administrar una dosis más pequeña de un anticuerpo policlonal de la presente invención, en comparación con las dosis efectivas de Palivizumab y RSV IVIG. Así, un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención también se considera adecuado para la profilaxis y tratamiento de adultos en alto riesgo, en particular receptores de transplante de médula ósea, individuos ancianos e individuos con enfermedad pulmonar crónica. Una ventaja adicional de un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención es que la concentración de los miembros de anticuerpo individuales es significativamente más baja que la concentración de un anticuerpo monoclonal (incluso si la dosis usada es la misma) , por consiguiente la posibilidad de que el anticuerpo individual sea reconocido como extraño por el sistema inmunológico del individuo bajo tratamiento se reduce, e incluso si un anticuerpo individual es eliminado por una respuesta inmune en el paciente, esto no es probable que afecte la capacidad neutralizante o la velocidad de depuración del anticuerpo anti-RSV policlonal, toda vez que los miembros de anticuerpo restantes permanecen intactos . Una modalidad de la presente invención es un anticuerpo anti-RSV policlonal recombinante capaz de neutralizar RSV subtipo A y B, y en donde el anticuerpo policlonal comprende miembros de anticuerpo distintos los cuales en unión se unen específicamente al menos a tres epítopes diferentes sobre por lo menos una proteína de cápside de RSV. De preferencia, la proteína F es unida específicamente por al menos tres miembros -de anticuerpo distintos, y los epítopes se ubican de preferencia en diferentes sitios antigenicos. Una modalidad más de la presente invención es un anticuerpo anti-RSV recombinante policlonal capaz de neutralizar RSV. subtipo A y B, y en donde el anticuerpo policlonal comprende miembros de anticuerpos distintos los cuales juntos proporcionan reactividad específica al menos contra dos proteínas de cápside de RSV. Las dos proteínas de cápside pueden seleccionarse de la proteína G RSV, proteína F de RSV y proteína SH de RSV. De preferencia, el anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención comprende reactividad anti-G y anti-F. La reactividad anti-G y anti-F de este anticuerpo policlonal está comprendida de preferencia de al menos dos anticuerpos anti-G distintos y al menos un anticuerpo anti-F distinto. De preferencia, al menos tres anticuerpos distintos se unen a diferentes epítopes, cubriendo de esta manera al menos tres epítopes diferentes, y juntos los anticuerpos son capaces de neutralizar las cepas de RSV subtipo A y subtipo B igualmente bien. Se prefiere todavía más que la reactividad anti-G y anti-F de un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención comprenda cualquier combinación de las reactividades anti-G y anti-F descritas abajo. Se prefiere más un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención que comprende una reactividad anti-F y anti-G contra todos los sitios/epítopes antigénicos mencionados abajo. Para obtener la especificidad más amplia posible de un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención, se desea que uno o más de preferencia todos los sitios antigénicos sean cubiertos por más de un anticuerpo distinto. En consecuencia, se prefiere que varios epítopes en el mismo antígeno o sitio antigénico se unan por elementos distintos de un anticuerpo policlonal de la presente invención . Con respecto a la reactividad anti-G de un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención, -esta reactividad es dirigida de preferencia contra epítopes conservados. Se prefiere todavía más que la reactividad anti-G sea comprendida de un primer anticuerpo anti-G capaz de unirse específicamente a un epítope conservado en la proteína G, y un segundo anti-cuerpo anti-G capaz de unirse específicamente a la región rica en cisteína de la proteína G (GCRR) . El anticuerpo anti-RSV policlonal comprende de preferencia al menos dos anticuerpos anti-G distintos, en donde al menos un primer anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítope conservado en la proteína G, y al menos un segundo anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítope conservado diferente o a un epítope específico de grupo que reconozca ya sea subtipo A o subtipo B. De preferencia, el anticuerpo policlonal comprende al menos tres anticuerpos anti-G distintos en donde el primer anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un epítope conservado en la proteína G, y el segundo anticuerpo es capaz de unirse específicamente a una proteína G de subtipo A y el tercer anticuerpo -es capaz de unirse específicamente a una proteína G de subtipo B. La región rica en cisteína de la proteína G {GCRR) se traslapa parcialmente con la región de aminoácido 13 hacia el extremo 5' en donde se ubican los epítopes conservados y una región en donde se ubican los epítopes específicos de grupo. Así, los anticuerpos capaces de unirse específicamente a un epítope conservado así como anticuerpos específicos de grupo pueden unirse a la -GCRR si el epítope que reconocen se ubica en la GCRR. De preferencia, al menos uno de los anticuerpos distintos caracterizados por su unión a un epítope conservado o a un epítope específico de cepa reconocen también la GCRR. Los anticuerpos que se unen al motivo CX3C de la GCRR se prefieren especialmente desde un punto de vista de neutralización de virus. Sin embargo, los anticuerpos que se unen a motivos CX3C también pueden unirse a un número de otros antígenos humanos no relacionados, tales como fractalcina y otras quimiocinas CX3C humanas y producir entonces efectos secundarios indeseables significando que serán un enfoque racional probar estos anticuerpos para reactividad cruzada (por ejemplo como se demuestra para ciertos anticuerpos en los ejemplos) y posteriormente para probar los mismos anticuerpos en sistemas modelo adecuados. En cualquier índice, siempre será necesario probar un farmacéutico dado, tal como un anticuerpo de la presente invención, en una prueba clínica antes de que pueda establecerse con un grado de certidumbre que están ausentes efectos secundarios, menores o por lo menos aceptables. Además de la reactividad anti-G específica de grupo y conservada una reactividad anti-G adicional dirigida contra ep topes específicos de cepa también puede comprenderse en el anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención. Se prefiere la reactividad anti-G específica de cepa dirigida contra los epitopes específicos de cepa más abundantes presentes en las cepas de virus que han resultado en infección por RSV dentro de los últimos 5 años. En la presente invención epitopes específicos de cepas se entiende como epitopes que sólo están presentes en un número limitado de cepas de RSV. La adición de anticuerpos anti-G específicos de cepa y/o específicos de grupo puede proporcionar diversidad adicional a un anticuerpo anti-RSV de la presente invención, y puede inducir sinergia cuando se combine con anticuerpos con reactividad para la región conservada de la proteína G. De preferencia, los anticuerpos anti-G de la presente invención neutralizan RSV directamente, bloquean la entrada del virus en la célula, evitan la migración de la célula, inhiben respuestas inflamatorias y/o previenen la formación de sincitios . Con respecto a la reactividad anti-F de un anticuerpos anti-RSV policlonal de la presente invención, esta reactividad es dirigida de preferencia contra al menos un epítope sobre uno o más de los sitios antigénicos I, II, IV, V, VI, C o Fl. En modalidades adicionales de la presente invención al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o todos estos sitios/epítopes antigénicos son cubiertos por diferentes anticuerpos en un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención. De preferencia, los anticuerpos anti-F de la presente invención neutralizan RSV directamente y/o bloquean la entrada del virus en la célula y/o previenen la formación de sincitios. En las composiciones de anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención cuando la composición no comprende reactividad de unión dirigida contra todos los sitios antigénicos en la prote na F, la presencia de al menos un anticuerpo anti-F distinto que se une específicamente a un epítope del sitio antigénico II se prefiere. Se prefiere todavía más que el anticuerpo anti-F específico de sitio II se una al mismo epítope o sitio antigénico que el anticuerpo Palivizumab. Además de los anticuerpos específicos de sitio II uno o más anticuerpos anti-F específicos de sitio IV se desean, tal como un anticuerpo que se une de preferencia al mismo epítope que RSVF2-5. Los anticuerpos anti-F específicos de subtipo también se conocen en la técnica. Sin embargo, ya que la proteína F muestra el 91% de similitud de aminoácidos entre los dos subgrupos A y B, los anticuerpos anti-F específicos de subtipo son menos abundantes que para anticuerpos anti-G. Estos anticuerpos anti-F específicos de cepa no obstante contribuirán a -obtener una especificidad lo más amplia posible, y por lo tanto también son componentes deseados de un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención. Además de los antígenos de proteína -G y F de RSV mencionados arriba, el virus RS expresa una tercera proteína de cápside, la proteína hidrofóbica pequeña (SH) . Sueros hiperinmunes desarrollados contra péptidos de las proteínas SH han mostrado ser incapaces de neutralizar RSV in vitro (Akerlind-Stopner et al, 1993 J. Med. Virol . 40:112-120). Sin embargo, ya que la proteína es principalmente expresada en células infectadas, se cree que los anticuerpos contra la proteína SH tendrán un efecto en la división de fusión y serán potencialmente relevantes para protección in vivo contra infecciones por RSV. Esto es soportado por el hecho de que las cepas de RSV que carecen del gen SH se replican 10 veces menos eficientemente en el tracto respiratorio superior (Bukreyev et al. 1997 J. Virol. 71:8973-82). Una modalidad adicional de la presente invención es un anticuerpo anti-RSV policlonal capaz de neutralizar RSV subtipo A y B y que comprende reactividad anti-SH, y una reactividad anti-G o anti-F. El término C que varía del aminoácido 41 a 64/65 (subtipo A/B) de la proteína SH es expuesto sobre la superficie celular. Por consiguiente, la reactividad anti-SH contra un epítope ubicado en esta área es deseable. El término C de la proteína SH varía de subtipo A y B, y se desea por lo tanto incluir reactividad anti-SH tanto contra el subtipo A como B en un anticuerpo policlonal de la presente invención. Esta reactividad SH puede ser provista por al menos dos anticuerpos anti-SH distintos en donde el primer anticuerpo es capaz de unirse específicamente a SH subtipo A y el segundo anticuerpo es capaz de unirse específicamente a SH subtipo B. En una modalidad de la presente invención un anticuerpo anti-RSV policlonal comprende reactividad específica contra SH subtipo A y/o B así como reactividad específica contra la proteína G. La reactividad contra la proteína G puede ser compuesta de cualquiera de las reactividades mencionadas arriba. En una modalidad alternativa la reactividad específica contra SH subtipo A y/o B puede combinarse con cualquiera de las reactividades anti-F descritas arriba para constituir un anticuerpo anti-RSV policlonal . En una modalidad preferida de la presente invención un anticuerpo anti-RSV policlonal comprende reactividad contra todas las tres proteínas de cápside, F, G y SH. La reactividad comprendida en un anticuerpo anti-RSV policlonal de la presente invención puede constituir cualquier combinación posible de anticuerpos distintos con reactividad de unión específica contra los antígenos/sitios antigénicos y/o epítopes resumidos en la tabla 1, siempre y cuando la combinación sea capaz de neutralizar RSV subtipo A y B. De preferencia la combinación contiene reactivi-dad contra al menos dos proteínas de cápside RSV. De preferencia, los miembros de anticuerpo distintos individuales de un anticuerpo pollclonal de acuerdo con la presente invención, tienen propi-edades neutralizantes y/o anti-inflamatorias de su propia fuente. Los anticuerpos sin estas propiedades particulares pueden no obstante jugar un papel también en la depuración de RSV por ejemplo a través de activación de complemento. Tabla 1 Resumen de antígenos asociados a RSV, sitios antigénicos y De preferencia, un anticuerpo policlonal de la presente invención se produce como un solo lote o como pocos lotes a partir de una línea de células poli-clónales que no expresen naturalmente moléculas de anti-cuerpo (también llamada expresión de anticuerpo policlonal recombinante) . Una de las ventajas de producir un anticuerpo policlonal recombinante -en comparación con mezclar anticuerpos monoclonal-es , es la capacidad de producir un número ilimitado de diferentes moléculas de anticuerpo al mismo tiempo. A un costo similar a aquél de producir un solo anticuerpo monoclonal . Así, .es posible incluir anticuerpos con reactividad hacia un gran número de antígenos asociados a RSV, sin incrementar el costo de producto final significativamente. En particular con un objetivo tan complejo como el RSV, cuando la biología no se entiende completamente, los anticuerpos individuales que hayan mostrado neutralizar o proteger contra RSV solo, pueden cuando se combinen con otros anticuerpos inducir un efecto sinérgico. Así, puede ser una ventaja incluir anticuerpos distintos, además de aquellos descritos arriba, en una composición de anticuerpos policlonales , en donde el único criterio sea que el anticuerpo individual se una a un antígeno asociado a RSV (por ejemplo, evaluado al unirse a células infectadas por RSV) . De preferencia todas las composiciones de anticuerpos anti-RSV policlonales descritas arriba son composiciones de anticuerpos anti-RSV policlonales recombinantes (anti-RSV rpAb) . Una manera de adquirir anticuerpos potencialmente relevantes que se unan a antígenos objetivo de RSV que no hayan sido verificados como antígenos relevantes, pero que no obstante puedan serlo, es la de generar una composición de anticuerpos policlonales que esté compuesta de anticuerpos individuales desarrollados por la respuesta inmune de un donador que haya sido infectado con RSV (respuesta inmune completa) . Además de obtener anticuerpos que representen una respuesta inmune completa contra RSV, una selección positiva para anticuerpos que se unan a antígenos que sea probable que sean de particular relevancia en la protección, neutralización y/o eliminación de infecciones por RSV, puede llevarse a cabo.

Además, si anticuerpos contra un antígeno particular, sitio antigénico o epítope que se crea sea de relevancia en la protección, neutralización y/o eliminación de RSV no son identificados en la respuesta inmune completa del donador, estos anticuerpos pueden desarrollarse por inmunización/vacunación de un donador con ese antígeno particular (respuesta inmune seleccionada) . Generalmente, la neutralización es evaluada por ensayos de neutralización in vi tro tales como reducción de placa, microneutralización o ensayos de fusión/inhibición (por ejemplo, Johnson et al. 1997. J. Infect. Dis. 176:1215-24). Por consiguiente, un anticuerpo o composición de anticuerpos que tenga un ef-ecto significativo en uno de estos ensayos, cuando se compara con un control negativo se considera que es neutralizante. La protección se evaluó generalmente mediante experimentos de ataque in vivo, por ejemplo en el modelo de rata de algodón (por ejemplo, Johnson et al. 1997. J. Infect. Dis. 176:1215-24) o el modelo de murino (por ejemplo, Taylor et al. 1984, Immunology 52, 137-142 y Mejias, et al. 2005. Antimicrob. Agents Chemother. 49:4700-4707). Los experimentos de ataque in vivo pueden ser ya sea llevados a cabo en una forma profiláctica, en donde los anticuerpos sean administrados antes del ataque viral o como un tratamiento, en donde los anticuerpos se administren después del ataque viral o como una combinación de ambos .

Una composición de anticuerpos policlonales de la presente invención puede estar compuesta de anticuerpos capaces de unirse a un antígeno de RSV que no necesariamente se conozca o no necesariamente sea una a proteína de cápside (el anticuerpo se une a células infectadas, pero no a antígenos o sitios antigénicos seleccionados) , pero en donde los anticuerpos se adquieran de una respuesta inmune compl-eta después de una infección por RSV, por ejemplo al obtener secuencias de ácido nucleico que codifiquen para los anticuerpos distintos de uno o más donadores con una infección por RSV o que se recuperen de una infección por RSV. Segundo, los anticuerpos de la misma respuesta inmune completa, los cuales hayan sido seleccionados con base en su capacidad para unirse a un antígeno, sitio antigénico y/o epítope particular, pueden ser incluidos en un anticuerpo policlonal de la presente invención. Tercero, anticuerpos distintos codificados a partir de pares VH y VL obtenidos de uno o más donadores que hayan sido inmunizados/vacunados con un antígeno relacionado a RSV particular de esta manera desarrollando una respuesta inmune "seleccionada" en estos donadores, pueden ser incluidos en una composición de anticuerpos policlonales de la presente invención. Así, anticuerpos derivados mediante cualquiera de las técnicas mencionadas en la presente invención pueden combinarse en un solo anticuerpo policlonal. De preferencia los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos de la presente invención se obtienen de donadores humanos y los anticuerpos producidos son anticuerpos completamente humanos . La motivación detrás de las composiciones de anticuerpos policlonales de la presente invención es: si un donador infectado con RSV desarrolla una respuesta inmune o humoral contra un antígeno, estos anticuerpos es probable que, al menos hasta cierto grado, contribuyan a la depuración viral, y de esta manera califiquen para su inclusión en un producto de anticuerpo policlonal. Un aspecto más de la presente invención es producir un anti-RSV rpAb en donde la composición de miembros de anticuerpo distintos refleje la respuesta inmune humoral con respecto a diversidad, afinidad y especificidad contra antígenos de cápside de RSV. De preferencia, el reflejo de la respuesta humoral se establece al asegurar que uno o más de los siguientes criterios sean satisfechos i) las secuencias de ácido nucleico que codifican para las regiones VH y VL de los miembros de anticuerpo individuales en este anti-RSV rpAb se derivan de un donador o donadores que han desarrollado una respuesta inmune humoral contra RSV, por ejemplo después de infección con RSV; ii) las secuencias de codificación de VH y VL son aisladas de los donadores de tal forma que el apareo original de la secuencia de codificación de VH y VL presentes en los donadores se mantenga, iii) los pares VH y VL, que codifican para los miembros individuales del rpAb, se seleccionan de tal forma que las regiones CDR sean tan diversas como sea posible o iv) la especificidad de los miembros individuales del anti-RSV rpAb se seleccione de tal forma que la composición de anticuerpos colectivamente se una a antígenos que desarrollen respuestas a anticuerpo significativas en mamíferos. De preferencia, la composición de anticuerpos se une colectivamente a antígenos, sitios antigénicos y/o epítopes que producen títulos de anticuerpos significativos en una muestra de suero del donador o donadores. Estos antígenos, sitios antigénicos y/o epítopes se resumen en la tabla 1 arriba, pero también pueden constituir antígenos, sitios antigénicos y/o epítopes desconocidos así como antígenos que no sean de cápside, como los descritos arriba. De preferencia los donadores son humanos, y el anticuerpo policlonal es un anticuerpo completamente humano . La presente invención ha identificado una serie de pares VH y VL que pueden ser expresados como anticuerpos de longitud completa, fragmento Fab u otros fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a un antígeno asociado a RSV. Los pares VH y VL específicos son identificados por el número de clon en la tabla 5 en el ejemplo 2. Un anticuerpo que contiene un par VH y VL como -el identifica-do -en la tabla 5 es de preferencia un anticuerpo completamente humano. Sin embargo, si se desea, también se pueden producir anticuerpos quiméricos . Un anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV preferido de la presente invención está compuesto de miembros distintos que comprenden regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y cadena ligera seleccionadas del grupo de pares VH y VL listados en la tabla 5. De preferencia, las regiones CDR se mantienen en el apareo indicado en la tabla 5 y se insertan en un armazón deseado. Como alternativa, las regiones CDR de la cadena pesada (CDRH) de un primer clon se combina con las regiones CDR de la cadena ligera (CDRL) de un segundo clon (revoltura de pares VH y VL) . Las regiones CDR también pueden ser revueltas dentro de la cadena ligera o cadena pesada, por ejemplo al combinar la región CDRLl de un primer clon con la región CDRL2 y CDRL3 de un segundo clon. Esta revoltura se lleva a cabo de preferencia entre clones que se unen al mismo antígeno . Las regiones CDR de la presente invención también pueden ser sujetas a maduración por afinidad, por ej-emplo mediante mutaciones por puntos . Aislamiento y selección de pares de codificación de cadena pesada variable y cadena ligera variable El proceso de generar una composición de anticuerpos policlonales recombinantes anti-RSV implica el aislami-ento de secuencias que codifican para cadenas pesadas variables (VH) y cadenas ligeras variables (VL) de una fuente adecuada, generando de esta manera un repertorio de pares de codificación VH y VL. Generalmente, una fuente adecuada para obtener secuencias de codificación VH y VL son fracciones de células que contienen linfocitos tales como muestras de sangre, bazo o médula ósea de un animal o humano que sea infectado con RSV o que se recupere de una infección por RSV, o de un animal o humano inmunizado/vacunado con una cepa de RSV o proteínas o ADN derivados de esta cepa. De preferencia, fracciones que contienen linfocitos se recogen de humanos o animales transgénicos con genes de inmunoglobulina humana. La fracción colectada de células que contienen linfocitos puede ser enriquecida más para obtener una población particular de linfocitos, por ejemplo células de linaje de linfocitos B. De preferencia, el enriquecimiento se lleva a cabo usando clasificación de células por esferas magnéticas (MACS) y/o clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) , sacando ventaja de proteínas marcadoras de superficie celular específicas de linaje por ejemplo para células B, blastos de plasma y/o células de plasma. De preferencia, la fracción de células que contiene linfocitos es enriquecida con respecto a células B, blastos plasmáticos y/o células plasmáticas. Se prefiere todavía más que células con alta expresión de CD38 y expresión CD19 y/o CD45 intermedia sean aisladas de sangre. Estas células son algunas veces llamadas células de plasma circulantes, células de plasma tempranas o blastos de plasma.

Para facilidad, simplemente son llamadas células de plasma en la presente invención, aunque los demás términos también pueden usarse indistintamente. El aislamiento de secuencias de codificación de VH y VL se puede llevar a cabo ya sea de la forma clásica en donde secuencias de codificación de VH y VL se combinan aleatoriamente en un vector para generar una biblioteca combinatoria de pares de secuencias de codificación de VH y VL. Sin embargo, en la presente invención se prefiere reflejar la diversidad, afinidad y especificidad de los anticuerpos producidos en una respuesta inmune humoral después de la infección por RSV. Esto implica el mantenimiento de los pares VH y VL presentes originalmente en el donador, generando asi un repertorio de pares de secuencias en donde cada para codifica para una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que corresponden a un par VH y VL presente originalmente en un anticuerpo producido por el donador del cual se aislan las secuencias. Esto se conoce también como un par cognado de secuencias de codificación de VH y VL y el anticuerpo es llamado un anticuerpo cognado. De preferencia, los pares de codificación de VH y VL de la presente invención, combinatorios o cognados, se obtienen de donadores humanos, y por lo tanto las secuencias son completamente humanas . Existen varios enfoques diferentes para la generación de pares cognados de secuencias de codificación de VH y VL, un enfoque incluye la amplificación y aislamiento de secuencias de codificación de VH y VL de células individuales clasificadas de una fracción de células que conti-ene linfocitos. Las secuencias de codificación de VH y VL pueden ser amplificadas por separado y apareadas en una segunda etapa o pueden ser apareadas durante la amplificación Coronelía et al. 2000. Nucleic Acids Res. 28:E85; Babcook et al 1996. PNAS 93:7843-7848 y O 05/042774). Un segundo enfoque incluye la amplificación en células y el apareo de las secuencias de codificación de VH y VL (Embleton et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20:3831-3837; Chapal et al. 1997. BioTechniques 23:518- 524) . Un tercer enfoque es el método de anticuerpos de ' linfocitos seleccionados (SLAM) el cual combina un ensayo de placa hemolítica con clonación de ADNc de VH y VL (Babcook et al. 1996. PNAS 93:7843-7848). Para obtener un repertorio de pares de secuencias de codificación de VH y VL que simule la diversidad de pares de secuencias de VH y VL en el donador, un método de alta emisión con tan poca revoltura (combinación aleatoria) de los pares VH y VL como sea posible, se prefiere, por ejemplo como el descrito en WO 05/042774 (incorporada en la presente a manera de referencia) . En una modalidad preferida de la presente invención un repertorio de pares de codificación de VH y VL, en donde los pares de miembros reflejan los pares de genes responsables de la respuesta inmune humoral que resulta de una infección por RSV, se genera de acuerdo con un método que comprende las etapas de i) proporcionar una fracción de células que contengan linfocitos de un donador infectado con RSV o que se recupere de una infección por RSV; ii) enriquecer opcionalmente células B o células de plasma de la fracción de células; iii) obtener una población de células individuales aisladas, que comprende distribuir células de la fracción de células individualmente a una pluralidad de recipientes; iv) amplificar y efectuar el enlace de los pares de codificación de VH y VL, en un procedimiento de RT-PCR de extensión de traslape por multiplexión, usando una plantilla derivada de las células individuales aislada y v) llevar a cabo opcionalmente una PCR anidada de los pares de codificación de VH y VL enlazados. De preferencia, los pares de codificación de VH y VL cognados aislados se sujetan a un procedimiento de tamizado como el descrito abajo. Una vez que los pares de secuencias de VH y VL han sido generados, se lleva a cabo un procedimiento de tamizado para identificar secuencias que codifican para pares VH y VL con reactividad de unión hacia un antígeno asociado a RSV. De preferencia, el antígeno asociado a RSV es una proteína de cápside de RSV, en particular proteína G de RSV, proteína F de RSV y proteína SH de RSV. Si los pares de secuencias VH y VL son combinatorios se puede aplicar un procedimiento de despliegue de fagos para enriquecer los pares VH y VL que codifiquen para fragmentos de anticuerpo que se unan a RSV antes del tamizado. Para reflejar la diversidad, afinidad y especificidad de los anticuerpos producidos en una respuesta inmune humoral después de infección con RSV, la presente invención ha desarrollado un procedimiento de tamizado para los pares cognados, para obtener así la diversidad más amplia posible. Para propósitos de tamizado el repertorio de pares de codificación de VH y VL cognados se expresan individualmente ya sea como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, scFv o Fab) o como anticuerpos de longitud completa usando ya sea un vector de tamizado bacteriano o mamífero transíectado en una célula huésped adecuada. El repertorio de Fabs /anticuerpos se tamiza para reactivi-dad a partículas de virus de una o más cepas de RSV". De preferencia, al menos dos cepas, una de subtipo A y una de subtipo B son usadas. Las cepas del subtipo A son por ejemplo la cepa Long (ATCC VR-26), A2 (ATCC VR-1540) o aislado subtipo A tipo Long más recientes. Las cepas de subtipo B son por ejemplo 18537 (ATCC VR-1580) , Bl (ATCC VR-1400), 9320 (ATCC VR-955) o aislados tipo 18537 más recientes. En paralelo, el repertorio de Fabs /anticuerpos es tamizado contra antígenos seleccionados tales como proteína G recombinante, proteína F recombinante y péptidos derivados de antígenos de RSV. Los péptidos antigénicos pueden por ejemplo ser seleccionados de la región conservada .de la proteína G (aminoácidos 164-176) y la región nuclear de cisteína (aminoácidos 171-187 de cepas del subtipo A así como del subtipo B) de la proteína G y, la región extracelular de la proteína SH (aminoácidos 42-64 de subtipo A y 42-65 de subtipo B) . De preferencia los péptidos son biotinilados para facilitar la inmovilización sobre esferas o placas durante el tamizado. Medios de inmovilización alternativos pueden usarse también. Los antígenos se seleccionan con base en el conocimiento de la biología del RSV y los anticuerpos efectores neutralizantes y/o protectores esperados capaces de unirse a sus antígenos pueden ser provistos potencialmente . Este procedimiento de tamizado puede igualmente aplicarse a bibliotecas de despliegue de fagos combinatorias. Las proteínas G y/o F recombinantes usadas para el tamizado pueden expresarse en bacterias, -células de insecto, células de mamífero u otro sistema de expresión adecuado. La proteína -G y/o F puede ser ya sea expresada como una proteína soluble (sin la región de transmembrana) o se pueden fusionar a una tercera proteína, para incrementar la estabilidad. Si la proteína G y/o F es expr-esada como un marcador de fusión, el socio de fusión puede ser cortado antes del tamizado. De preferencia, las proteínas G y/o F representativas tanto del subtipo A y subtipo B son expresadas y usadas para el tamizado. Además, proteínas G específicas de cepa pueden expresarse y usarse para el tamizado. Además del tamizado primario descrito arriba, se puede llevar a cabo un tamizado secundario, para asegurar que ninguna de las secuencias seleccionadas codifiquen falsos positivos. En el segundo tamizado todos los pares VH y VL de unión a RSV/ant geno identificados en el primer tamizado se tamizan de nuevo contra ambas de las cepas -de virus y los antigenos seleccionados . Generalmente, los ensayos inmunológicos son adecuados para el tamizado llevado a cabo en la presente invención. Estos ensayos se conocen bien en la técnica y constituyen por ejemplo ELISPOTS, ELISA, FLISA, ensayos de membrana (por ejemplo Western blots) , disposiciones sobre filtros y FACS . Los ensayos pueden llevarse a cabo ya sea sin ninguna etapa de enriquecimiento anterior, utilizando polipéptidos producidos a partir de las secuencias que codifiquen para los pares VH y VL. En caso de que el repertorio de pares de codificación de VH y VL sean pares cognados, no se requiere ningún enriquecimiento mediante, por ejemplo despliegue de fagos antes del tamizado. Sin embargo, en el tamizado de bibliotecas combinatorias, los inmunoensayos se llevan a cabo de preferencia en combinación con o después de métodos de enriquecimiento tales como despliegue de fagos, despliegue de ribosomas, despliegue de superficie bacteriana, despliegue de levaduras, despliegue de virus eucarióticos , despliegue de ARN o despliegue covalente (revisado en Fitz<3erald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258).

Las secuencias de codificación de pares VH y VL seleccionadas en el tamizado se someten generalmente a secuenciación, y se analizan con respecto a diversidad de las regiones variables. En particular la diversidad en las regiones CDR es de interés, pero también la representación de la familia VH y VL es de interés. Con base en estos análisis, secuencias que codifican para pares VH y VL que representan la densidad total de los anticuerpos de unión a RSV aislados de uno o más donadores son seleccionadas. De preferencia, se seleccionan secuencias con diferencias en todas las regiones CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3 y CDRLl , CDRL2 y CDRL3 ) . Si hay secuencias con una o más regiones CDR idénticas o muy similares que pertenezcan a diferentes familias de VH y VL, éstas también se seleccionan. De preferencia, al menos la región CDR3 de la cadena pesada variable (CDRH3 ) difiere entre los pares de secuencia seleccionados . Potencialmente, la selección de pares de secuencias VH y VL se puede basar solemnemente en la variabilidad de la región CDRH3. Durante el cebado y amplificación de las secuencias, pueden ocurrir mutaciones en las regiones estructurales de la región variable, en particular en la primera región estructural. De preferencia, los errores que ocurren en la primera región estructural se corrigen para de esta manera asegurar que las secuencias corresponden completamente o al menos 98% a aquéllas del donador, por ejemplo, de tal forma <jue las secuencias sean completamente humanas . Cuando se asegure que la diversidad total de la colección de secuencias seleccionadas que codifican para pares VH y VL sea altamente representativa de la diversidad observada a nivel genético en una respuesta humoral a infección por RSV, se espera que la especificidad total de anticuerpos expresados de una colección de pares de codificación VH y VL seleccionados también sea representativa con respecto a la especificidad de los anticuerpos producidos en los donadores infectados con RSV. Una indicación de si la especificidad de los anticuerpos expresados a partir de una colección de pares de codificación VH y VL seleccionados son representativas de la especificidad de los anticuerpos desarrollados por donadores infectados puede obtenerse al comparar los títulos de anticuerpos hacia las cepas de virus así como los antígenos seleccionados de la sangre de donador con la especificidad de los anticuerpos expresados a partir de una colección de pares de codificación VH y VL seleccionados. Además, la especificidad de los anticuerpos expresados a partir de una colección de pares de codificación VH y VL seleccionados puede analizarse más. El grado de especificidad se correlaciona con el número de antígenos diferentes hacia los cuales la reactividad de unión pueda detectarse. En una modalidad más de la presente invención la especificidad de los anticuerpos individuales expresados de una colección de pares de codificación VH y VL seleccionados se analiza por mapeo de epítopes . El mapeo de epítopes puede llevarse a cabo por un número de metodologías, las cuales no necesariamente excluyen otras. Una manera de mapear la especificidad de epítopes de un clon de anticuerpo es evaluar la unión a péptidos de longitudes variables derivados de la estructura primaria del antígeno objetivo. Estos péptidos pueden ser tanto lineales como conformacionales y pueden usarse en un número de formatos de ensayo, incluyendo ELISA, FISA y resonancia plasmónica superficial (SPR, Biacore) . Más aún, los péptidos pueden seleccionarse racionalmente usando datos de secuencia y estructura disponibles para representar por ejemplo regiones extracelulares o regiones conservadas del antígeno objetivo, o se pueden diseñar como un panel de péptidos traslapantes que representen una parte seleccionada o todo el antígeno (Meloen RH, Puijk WC, Schaaper WMM, Epitope mapping by PESCAN. En: Immunology Methods Manual. Ed Iwan Lefkovits 1997, Academic Press, pp. 982-988) . La reactividad específica de un clon de anticuerpo con uno o más de estos péptidos generalmente será una indicación de la especificidad del epitope. Sin embargo, los péptidos en muchos casos reflejan deficientemente los epítopes reconocidos por anticuerpos desarrollados contra antígenos proteináceos , tanto debido a una falta de conformación como debido al área de superficie -enterrada más grande generalmente de interacción entre un anticuerpo y un antigeno de proteínas en comparación con un anticuerpo y un péptido. Un segundo método para el mapeo de epitopes, el cual permite la definición de especificidades directamente en el antígeno de proteínas, es mediante enmascaramiento de epítope selectivo usando anticuerpos existentes y bien definidos . La unión reducida de un segundo anticuerpo de sondeo hacia el antígeno luego del bloqueo generalmente es indicadora de epitopes compartidos o traslapantes. El mapeo de epitopes mediante enmascaramiento selectivo puede llevarse a cabo mediante un número de inmunoensayos , incluyendo, pero no restringidos a, ELISA y Biacore, los cuales se conocen bien en la técnica (por ejemplo, Ditzel et al. 1997. J. Mol. Biol . 267:684-695; Aldaz-Carroll et al. 2005. J. Virol . 79:6260-6271) . Otro método potencial para la determinación de la especificidad de epitopes de anticuerpos anti-virus es la selección de mutantes de escape y virales en presencia de anticuerpos . La secuenciación de los genes de interés a partir de estos mutantes de escape generalmente revelará qué aminoácidos en los antígenos son importantes para el reconocimiento por el anticuerpo y de esta manera constituyen (parte de) el epítope. De preferencia, los miembros individuales que serán comprendidos en un anti-RSV rpAb de la presente invención se seleccionan de tal forma que la especificidad de la composición de anticuerpos cubra colectivamente RSV tanto subtipo A como B, así como la proteína F y G de antígenos asociados a RSV y de preferencia también SH. Producción de un anticuerpo policlonal recombinante a partir de pares de codificación VH y VL sel-eccionados Un anticuerpo policlonal de la presente invención se produce a partir de una línea de células de expresión policlonal en uno o pocos biorreactores o equivalentes de los mismos. Siguiendo este enfoque el anti-RSV rpAb se puede purificar del reactor como una sola preparación sin tener que separar los miembros individuales que constituyan al anti-RSV rpAb durante el proceso. Si el anticuerpo policlonal se produce en más de un biorreactor, los sobrenadantes de cada biorreactor pueden ser agrupados antes de la purificación, o el anti-RSV rpAb purificado puede obtenerse al agrupar los anticuerpos obtenidos -de sobrenadantes purificados individualmente de cada biorreactor . Una forma de producir un anticuerpo policlonal recombinante se describe en WO 2004/061104 y WO 2?06 /?07850 (PCT/DK2005/000501) <estas referencias se incorporan aquí a manera de referencia) . El método descrito en la ahí, se basa en integración específica de sitio de la secuencia de codificación de anticuerpos en , el genoma de las células huésped individuales, asegurando que las cadenas de proteínas VH y VL se mantengan en su apareo original durante la producción. Además, la integración específica de sitio minimiza los efectos de la posición y por lo tanto las propiedades de crecimiento y expresión de las células individuales en la línea de células policlonales se espera que sean muy similares. Generalmente, el método incluye lo siguiente: i) una célula huésped con uno o más sitios de reconocimiento por recombinasas ; ii) un vector de expresión con al menos un sitio de reconocimiento por recombinasas compatible con aquél de la célula huésped; iii) generación de una colección de vectores de expresión al transferir los pares de codificación de VH y VL seleccionados del vector de tamizado a un vector de expresión de tal forma que un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo puede expresarse del vector (esta transferencia podría no ser necesaria si el vector de tamizado es idéntico al vector de expresión) ; iv) transfección de la célula huésped con la colección de vectores de expresión y un vector que codifica para una recombinasa capaz de combinar los sitios de reconocimiento de recombinasa en el genoma de la célula huésped con aquél en el vector; v) obtener/generar una línea de células policlonales a partir de la célula huésped transfectada y vi) expresar y recoger el anticuerpo policlonal de la línea de células policlonales. De preferencia se usan células de mamífero tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0 o NSO) , fibroblastos tales como NIH 3T3, y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293 o PER.C6. Sin embargo, también pueden emplearse células eucarióticas o procarióticas no de mamífero tales como células vegetales, células de insecto, células de levadura, hongos, E. coli, etc. Una célula huésped adecuada comprende uno o más sitios de reconocimiento de recombinasa adecuados en su genoma. La célula huésped debe contener también un modo de selección que esté enlazado operablemente al sitio de integración, para que sea capaz de seleccionar integrantes (es decir, células que tengan una copia integrada de un vector de expresión de anti-RSV Ab o fragmento de vector de expresión en el sitio de integración) . La preparación de células que tienen un sitio FRT en una ubicación predeterminada en el genoma se describió por ejemplo en US 5,677,177. De preferencia, una célula huésped sólo tiene un solo sitio de integración, el cual se ubica en un sitio que permite la alta expresión del integrante (un llamado punto caliente) . Un vector de expresión adecuado comprende un sitio de reconocimiento de recombinación que coincide con el sitio de reconocimiento de recombinasa de la célula huésped. De preferencia el sitio de reconocimiento por recombinasa está enlazado a un gen de selección adecuado -diferente al gen de selección usado para la construcción de la célula huésped.

Los genes de selección se conocen bien en la técnica, e incluyen al gen de glutamina sintetasa (-GS) , gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) y neomicina, en donde GS o DHFR pueden usarse para la amplificación génica de la secuencia VH y VL insertada. El vector también puede contener dos sitios de reconocimiento de recombinasa diferentes para permitir el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) de la secuencia de codificación de anticuerpos en lugar de la integración completa del vector. RMCE se describe en Langer et al 2002. Nucleic Acids Res. 30, 3067-3077; Schlake y Bode 1994, Biochemistry 33, 12746-12751 y Belteki et al 2003. Nat . Biotech. 21, 321-324. Los sitios de reconocimiento por recombinasa adecuados se conocen bien -en la técnica, e incluyen FRT, lox y sitios attP/attB. De preferencia el vector de integración es un vector de codificación de isotipos, en donde las regiones constantes <que incluyen de preferencia intrones) están presentes en el vector antes de la transferencia del par de codificación VH y VL -del vector de tamizado (o las regiones constantes ya están presentes en el vector de tamizado si el tamizado se lleva a cabo en anticuerpos de longitud completa) . Las regiones constantes presentes en el vector pueden ser ya sea la región constante de la cadena pesada completa (CHi a CH3 o a CH4) o la región constante que codifique para la parte Fe del anticuerpo (CH2 a -CH3 o a CH4) . La región constante de la cadena ligera kappa o lambda también puede estar presente antes de la transferencia. La elección del número de regiones constantes presentes, si las hay, depende del tamizado y sistema de transferencia usados. Las regiones constantes de la cadena pesada pueden seleccionarse a partir de los isotipos IgGl, lgG2, IgG3 , lgG4, IgAl, IgA2, IgM, IgD e IgE. Los isotipos que se prefieren son IgGl y/o IgG3. Además, el vector de expresión para la integración especifica de sitio del áci-do nucleico que codifica para anticuerpo anti-RSV contiene promotores adecuados o secuencias equivalentes que dirigen altos niveles de expresión de cada una de las cadenas VH y VL. La figura 3 ilustra una forma posible para diseñar el vector de expresión, aunque son posibles numerosos otros diseños. La transferencia de los pares de codificación VH y VL seleccionados del vector de tamizado puede llevarse a cabo mediante corte y ligación con enzimas de restricción convencionales, de tal forma que cada molécula de vector de expresión contenga un par de codificación VH y VL. De preferencia, los pares de codificación VH y VL se transfieren individualmente, pueden, no obstante, transferirse en masa si se desea. Cuando todos los pares de codificación VH y VL seleccionados son transferidos al vector de expresión se obtiene una colección o una biblioteca de vectores de expresión. Formas alternativas de transferencia pueden usarse también si se desea. Si el vector de tamizado es idéntico al vector de expresión, la biblioteca de vectores de expresión está constituida de los pares de secuencia VH y VL seleccionados durante el tamizado, los cuales están situados en el vector de tamizado/expresión. Los métodos para transfectar una secuencia de ácido nucleico en una célula huésped se conocen en la técnica. Para asegurar la integración específica de sitio, una recombinasa adecuada debe ser provista a la célula huésped también. Esto se logra de preferencia mediante co-transfección -de un plásmido que codifica para la recombinasa. Las recombinasas adecuadas son por ejemplo Flp, Cre o fago (|>C31 integrasa, usadas juntas con un sistema de célula huésped/vector -con los sitios de reconocimiento de recombinasa correspondientes. La célula huésped puede ser ya sea transíectada a granel, significando que la biblioteca de vectores de expresión es transfectada en la línea de células en una sola reacción obteniendo de esta manera una línea de células policlonales . Como alternativa, la colección de vectores de expresión puede ser transfectada individualmente en la célula huésped, generando de esta manera una colección de líneas de -células individuales (cada línea de células produce un anticuerpo con una especificidad particular) . Las líneas de células generadas después de la transfección (individuales o policlonales) son después seleccionadas para integrantes específicos de sitio, y adaptadas para crecer en suspensión y medio libre de suero, si es que no ya tienen estas propiedades antes de la transfección. Si la transfección se lleva a cabo individualmente, las lineas de células individuales se analizan más con respecto a sus propiedades de crecimiento y producción de anticuerpos. De preferencia, líneas de células con velocidades de proliferación similares y niveles de expresión de anticuerpo similares se seleccionan para la generación de la línea de células policlonales. La línea de células policlonales se genera entonces al mezclar las líneas de células individuales en una relación predefinida. Generalmente, un banco de células maestras policlonales (pMCB) , un banco de células de investigación policlonales (pRCB) y/o un banco de células de trabajo policlonales (pWCB) es desarrollado a partir de la línea de células policlonales. La línea de células policlonales se genera al mezclar las líneas de células individuales en una relación predefinida. La línea de células policlonales se distribuye en ampollas de esta manera generando un banco de células de investigación policlonales (pRCB) o banco de células maestras (pMCB) de las cuales un banco de células de trabajo policlonales pWCB) puede generarse al expandir células del banco de células de investigación o maestras. El banco de células de investigación es principalmente para estudios de prueba de concepto, en los cuales la línea de células policlonales podría no comprender tantos anticuerpos individuales como la línea de células policlonales en el banco de células maestras. Normalmente, el pMCB es expandido más para desarrollar una pWCB para propósitos de producción. Una vez que -el pWCB se agota una nueva ampolla del pMCB puede expandirse para desarrollar un nuevo pWCB. Una modalidad de la presente invención es una línea de células policlonales capaz de expresar un anticuerpo anti-RSV policlonal recombinante de la presente invención. Una modalidad más de la presente invención es una línea de células policlonales en donde cada célula individual es capaz de expresar un solo par de codificación VH y VL) y la línea de células policlonales como un todo es capaz de expresar una colección de pares de codificación VH y VL, en donde cada par VH y VL codifica para un anticuerpo anti-RSV. De preferencia la colección de pares de codificación VH y VL son pares cognados generados de acuerdo con los métodos de la presente invención. Un anticuerpo policlonal recombinante de la presente invención es expresado al cultivar una ampolla de una pWCB en un medio adecuado durante un periodo de tiempo que permita la expresión suficiente de anticuerpo y en donde la línea de células policlonales permanezca estable (la ventana es de aproximadamente entre 15 días y 50 días) . Métodos de cultivo tales como lotes de alimentación o perfusión pueden usarse. El anticuerpo policlonal recombinante se obtiene del medio de cultivo y se purifica mediante técnicas de purificación convencionales . La cromatografía de afinidad combinada con etapas de purificación subsecuentes tales como cromatografía de intercambio iónico, interacciones hidrofóbicas y filtración en gel se ha usado frecuentemente para la purificación de IgG. Después de la purificación, la presencia de todos los miembros individuales en la composición de anticuerpos policlonales es evaluada, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio de iones. La caracterización de una composición de anticuerpos policlonales se describe -en detalle -en WO 2006/007853 (PCT/DK2005/000504) (incorporada en la presente a manera de referencia) . Un método alternativo para expresar una mezcla de anticuerpos en un huésped recombinante se describe en WO 04/009618. Este método produce anticuerpos con diferentes cadenas pesadas asociados con la misma cadena ligera de una sola línea de células. Este enfoque puede ser aplicable si el anti-RSV rpAb se produce de una biblioteca combinatoria. Composiciones terapéuticas Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo un anti-RSV rpAb o un Fab policlonal recombinante anti-RSV u otro fragmento de anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV. De preferencia, el ingrediente activo de esta composición es un anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV como el descrito en la presente invención. Estas composiciones están diseñadas para la prevención y/o tratamiento de infecciones por RSV. De preferencia, la composición farmacéutica se administra a un humano, un animal doméstico o una mascota. La composición farmacéutica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. Anti-RSV rpAb o fragmentos policlonales del mismo pueden administrarse dentro de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, en formas de dosis única. La práctica farmacéutica o convencional puede emplearse para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar a pacientes infectados con RSV, o a pacientes quienes pudieran estar en alto riesgo si son infectados con RSV. En una modalidad preferida la administración es profiláctica. En otra modalidad preferida la administración es terapéutica, significando que se administra después del inicio de síntomas relacionados con infección por RSV. Cualquier ruta de administración adecuada puede emplearse, por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial , subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intranasal , por aerosol, supositorio o administración oral. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral las formulaciones pueden estar en forma de tabletas, cápsulas, goma de mascar o pasta, y para formulaciones intranasales , en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de una manera conocida per s-e, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de disolución, liofilización, mezclado, granulación o confec ión. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (véase, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (206 ed.), ed. A.R. <Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds . J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York, NY) . De preferencia soluciones o suspensiones del ingrediente activo, especialmente soluciones o suspensiones acuosas isotónicas se usan para preparar las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En el caso de composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un portador, por ejemplo manitol, estas soluciones o suspensiones pueden, si es posible, producirse antes de usar. Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservadores, estabilizadores, agentes humectantes y/o emulsionantes , solubili-zador.es, sales para regular la presión osmótica y/o reguladores -de pH, y se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo por medio de procesos convencionales de disolución o liofilización. Estas soluciones o suspensiones pueden comprender sustancias incrementadoras de viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatina. Las composiciones para inyección se preparan de manera común bajo condiciones estéril-es; lo mismo aplica también a introducir las composiciones en ampollas o frascos y sellar los recipientes. Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden obtenerse al combinar el ingrediente activo con portadores sólidos, si se desea granulando la mezcla resultante y procesando la mezcla, si se desea o es necesario, después de la adición de excipientes adecuados, en tabletas, pildoras o cápsulas, las cuales pueden ser recubiertas con goma laca, azúcar o ambas. También es posible que se les incorpore en portadores plásticos que permitan -que los ingredientes activos se difundan o sean liberados en cantidades medidas. Las composiciones farmacéuticas comprenden de alrededor de 1% a aproximadamente 95%, de preferencia alrededor de 20% a aproximadamente 90% de ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden ser, por ejemplo, en forma de dosis única, tal como en forma de ampollas, frascos, supositorios, tabletas, pildoras o cápsulas. Las formulaciones se pueden administrar a individuos humanos en cantidades terapéutica o profilácticamente efectivas (por ejemplo, cantidades que prevengan, eliminen o reduzcan una condición patológica) para proporcionar terapia para una enfermedad o condición. La dosis de agente terapéutico que se prefiere administrar es probable que dependa de variables tales como la severidad -de la infección por RSV, el estado de salud general del paciente particular, la formulación de los excipientes del compuesto y su ruta de administración. Usos terapéuticos de las composiciones de acuerdo con la invención Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden usarse para el tratamiento, reducción o profilaxis de una enfermedad en un mamífero. Las condiciones que pueden tratarse o prevenirse con las presentes composiciones farmacéuticas incluyen prevención y tratamiento de pacientes infectados con RSV, o en riesgo de infectarse con RSV, en particular pacientes quienes pudieran estar en alto riesgo de ser infectados con RSV. Pacientes en alto riesgo son por ejemplo bebés y niños pequeños. En particular bebés prematuros y niños con un problema subyacente tal como enfermedad pulmonar crónica o enfermedad cardíaca congénita están en el riesgo más alto de serias enfermedades tales como bronquiolitis y neumonía después de la infección por RSV. Asimismo adultos en alto riesgo, tales como adultos inmunocomprometidos , particularmente receptores de transplantes de médula ósea, individuos ancianos e individuos con enfermedad pulmonar crónica, pueden ser de preferencia sujetos a tratamiento profiláctico o terapéutico con una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención. Una modalidad de la presente invención es un método para prevenir, tratar o reducir uno o más síntomas asociados con una infección por RSV en un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de la present-e invención al mamífero. Una modalidad más de la presente invención es el uso de un anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de la presente invención en la preparación de una composición para el tratamiento, disminución o prevención de uno o más síntomas asociados con una infección por RSV en un mamífero. De preferencia, el mamífero en las modalidades anteriores es un humano, animal doméstico o una mascota. En una modalidad más el mamífero, sujeto al método de prevenir, tratar o reducir uno o más síntomas asociados con una infección por RSV, tiene de preferencia un peso corporal de más de 40 kg. En modalidades en las que el sujeto es un humano, -es de preferencia un bebé prematuro, un niño con .enfermedad pulmonar crónica o enfermedad cardiaca congénita. En modalidades alternativas el humano es un adulto inmunocomprómetido, en particular un receptor de transplante de médula ósea, un individuo anciano o un individuo con enfermedad pulmonar crónica. Uso de diagnóstico Otra modalidad de la presente invención está dirigida a kits de diagnóstico. Los kits de acuerdo con la presente invención comprenden un anti-RSV rpAb preparado de acuerdo con la invención cuya proteína puede ser marcada con un marcador detectable o no marcada para detección sin marcador. El kit se puede usar para identificar individuos infectados con RSV. Moléculas de anticuerpo de la presente invención y aspectos relacionados con las mismas Se debe notar que las moléculas de anticuerpo nuevas descritas en la presente se cree que contribuyen al estado de la técnica por su propia cuenta. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas en la presente así como a fragmentos y análogos de estos anticuerpos, en donde los fragmentos o análogos incorporan al menos las CDRs de los anticuerpos descritos aquí . Por ejemplo se ha encontrado por los presentes inventores que algunas de las moléculas de anticuerpo completamente humanas que han sido aisladas de donadores humanos incluyen sitios de unión que exhiben perfiles cinéticos mejorados extremadamente altos sobre los anticuerpos monoclonales de la técnica anterior conocidos cuando se trata de unión a antigenos. As , incluso a pesar de que se ponga mucha atención en las composiciones de anticuerpos policlonales en la presente descripción, toda la materia que se refiere a la utilización de anticuerpos policlonales descrita en la presente es también relevante para cualquiera de las moléculas de anticuerpo individuales descritas aquí -es decir, todas las descripciones que se refieren a formulación, dosis, administración, etc., que se refieren a composiciones de anticuerpos policlonales de la presente invención apliquen mutatis mutandis a las moléculas de anticuerpo individuales, fragmentos de anticuerpo y análogos de anticuerpo descritos aquí, de preferencia también las secuencias de estructura. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a una molécula de anticuerpo anti-RSV humana aislada seleccionada de las moléculas de anticuerpo mostradas en la tabla 5 en la presente, o un fragmento que se una específicamente de la molécula de anticuerpo o un análogo de anticuerpo semi-sintético o sintético, el fragmento de unión o análogo comprende al menos las regiones de determinación de compLementariedad (CDRs) de la molécula de anticuerpo aislada.

Comúnmen e, las regiones estructurales de las regiones variables del anticuerpo humano nativo estarán incluidas también en los fragmentos o análogos, ya que la especificidad a antígeno de los anticuerpos se sabe que depende de la organización 3D de las CDRs y regiones estructurales. La expresión "molécula de anticuerpo aislada" intenta denotar una colección de anticuerpos distintos que son aislados de contaminantes naturales, y los cuales exhiben la misma secuencia de aminoácidos (es decir, regiones variables y constantes idénticas) . Típicamente la molécula de anticuerpo, fragmento o análogo se deriva de los anticuerpos listados en la tabla 8, o incluye secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada incluidas en una de SEQ ID NOs : 1-44 y en las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera acompañantes que tienen un SEQ ID NO que es 88 veces más alto que la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs : 144. Esto signifi-ca que la molécula de anticuerpo, fragmento o análogo incluirá los pares cognados de regiones variables encontradas en las mismas de los 44 clones descritos arriba. Como se mencionó arriba, un número de las presentes moléculas de anticuerpo exhiben afinidades muy altas, por lo que la invención se refiere también a una molécula de anticuerpo aislada, a un fragmento de anticuerpo o a un análogo -de anticuerpo sintético o semi-sintético, el cual comprende CDRs idénticas a las CDRs en un Fab derivado de un anticuerpo humano, el Fab tiene una constante de disociación, KD, para la prote na G de RSV de cuando mucho 500 nM cuando se mide llevando a cabo análisis de resonancia plasmónica superficial en un Biacore 3000, usando proteína G de RSV recombinante y inmovilizada sobre la superficie sensora a una densidad muy baja para evitar limitaciones en el transporte de masa. La molécula de anticuerpo aislada, fragmento de anticuerpo o anticuerpo sintético o semi-sintético exhibe típicamente una KD más baja de cuando mucho 400 nM, tal como cuando mucho 300 nM, cuando mucho 200 nM, cuando mucho 100 nM, cuando mucho 1 nM, cuando mucho 900 pM, cuando mucho 800 M, cuando mucho 700 pM, cuando mucho 600 pM, cuando mucho 500 pM, cuando mucho 400 pM, cuando mucho 300 pM, cuando mucho 200 pM, cuando mucho 100 pM, cuando mucho 90 pM y cuando mucho 80 pM. Los detalles que se refieren a las mediciones Biacore se proporcionan en los ejemplos. Otra modalidad de la invención se refiere a una molécula de anticuerpo aislada, a un fragmento de anticuerpo o a un anticuerpo sintético o semi-sintético, que comprende un sitio de unión a antígeno idéntico al sitio de unión a antígeno en un Fab derivado de un anticuerpo humano, el Fab tiene una constante de disociación, KD, para la proteína F de RSV de cuando mucho 500 nM cuando se mide llevando a cabo análisis de resonancia plasmónica superficial en un Biacore 3000, usando proteína F de RSV recombinante inmovilizada sobre la superficie sensora a una densidad muy baja para evitar limitaciones en el transporte de masa. Este anticuerpo, fragmento de anticuerpo o anticuerpo sintético o semi-sintético aislado exhibe típicamente un KD de cuando mucho 400 nM, tal como cuando mucho 300 nM, -cuando mucho 200 nM, cuando mucho 100 nM, cuando mucho 1 nM, cuando mucho 900 pM, cuando mucho 800 pM, cuando mucho 700 pM, cuando mucho 600 pM, cuando mucho 500 pM, cuando mucho 400 pM, cuando mucho 300 pM, cuando mucho 200 pM, cuando mucho 100 pM, cuando mucho 90 pM, cuando mucho 80 pM, cuando mucho 70 pM, cuando mucho 60 pM, cuando mucho 50 pM, cuando mucho 40 pM, cuando mucho 30 pM, cuando mucho 25 pM, cuando mucho 20 pM, -cuando mucho 15 pM, cuando mucho 10 pM, cuando mucho 9 pM, cuando mucho 8 pM, cuando mucho 7 pM, cuando mucho 6 pM y cuando mucho 5 pM. Una molécula de anticuerpo especialmente útil o fragmento que se une específicamente o análogo de anticuerpo sintético o semi-sintético comprende las CDRs de un anticuerpo humano producido en el clon No. 810, 818, 819, 824, 825, 827, 858 u 894. Como se mencionó arriba, estas moléculas de anticuerpo útiles de la pres-ente invención pueden formularse de la misma manera y para las mismas aplicaciones jue las formulaciones policlonales de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición de anticuerpos que comprende una molécula de anticuerpo, específicamente un fragmento de unión o análogo de anticuerpo sintético o semi-sintético descrito en esta sección mezclado con un portador, excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender más de una especificidad de unión, y puede por ejemplo incluir dos moléculas de anticuerpo distintas de la invención y/o fragmentos de unión específicamente y/o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos de la invención. La composición puede comprender incluso al menos tres moléculas de anticuerpo distintas y/o fragmentos de anticuerpo y/o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos, fragmentos que se unen específicamente o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos de la invención, y puede por lo tanto constituir una composición que comprenda en 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 moléculas de anticuerpo distintas y/o fragmentos y/o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos . Las composiciones especialmente interesantes incluyen al menos una molécula de anticuerpo, fragmento o análogo de la invención que se una a la proteína F de RSV y al menos un anticuerpo, fragmento o análogo de la invención que se une a la proteína G de RSV. También una parte -de la presente invención .es un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica para la secuencia de aminoácidos de al menos una CDR definida -de una molécula de anticuerpo de la presente invención, tal como un fragmento de ácido nucleico, el cual al menos codifica para las CDRs de un anticuerpo producido por uno de los clones listados en la tabla 5. El fragmento de ácido nucleico es típicamente ADN, pero también puede ser ARN. Otra modalidad es un fragmento de ácido nucleico aislado, que codifica para las secuencias de CDR de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en cualquiera de SEQ ID NOs 1-44, o un fragmento de ácido nucleico aislado, que codifica para las secuencias CDR -de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera mostrada -en cualquiera de SEQ ID NOs: 89-132. Los fragmentos de ácido nucleico que se prefieren de la invención codifican para las secuencias de CDR de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en cualquiera de SEQ ID NOs : 1-44 y mostrada en las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena ligera acompañante que tienen un SEQ ID NO que es 88 veces más alto que la secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NOs : 144. Esto significa por supuesto que el fragmento de ácido nucleico codificará para los pares cognados de regiones variables encontradas en las mismas de los 44 clones descritos arriba. El fragmento de ácido nucleico puede por lo tanto incluir -secuencias de codificación comprendidas en SEQ ID NOs: 45-88 y/o 133-176. Convenientemente los fragmentos de ácido nucleico se introducen en un vector, el cual es también parte de la presente invención. Este vector puede ser -capaz de replicación autónoma, y se selecciona típicamente del grupo que consiste en un plásmido, un fago, un cósmido, un minicromosoma y un virus . En caso de que el vector de la invención sea un vector de expresión, tendrá de preferencia el siguiente contorno (véase también un vector ejemplar en la figura 3) : - en la dirección 5 ' —>3 ' y el enlace operable al menos un promotor para conducir la expresión de un primer fragmento de ácido nucleico descrito arriba, el cual codifica al menos para una CDR de cadena ligera junto con cualquier región estructural necesaria, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifique para un péptido líder, el primer fragmento de ácido nucleico, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifique para regiones constantes de un anticuerpo y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifique para un primer terminador, y/o - en la dirección 5'?3' y el enlace operable al menos un promotor para conducir la expresión de un segundo fragmento de ácido nucleico de la invención, que codifica al menos para una CDR de cadena pesada junto con cualquier región estructural necesaria, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifique para un péptido líder, el segundo fragmento de ácido nucleico, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifique para regiones constantes y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifique para un segundo terminador . Este vector es especialmente útil si se puede usar para transformar establemente una célula huésped, la cual puede ser posteriormente cultivada para obtener así el producto de expresión recombinante . De esta forma, el vector que se prefiere es uno que cuando es introducido en una célula huésped es integrado en el genoma de la célula huésped. Por consiguiente, la invención se refiere también a una célula transformada que porta el vector de la invención descrito en esta sección y también una línea de células estable que porta este vector y la cual exprese el fragmento de ácido nucleico de la invención descrito en esta sección. Tanto la célula transformada como la línea de células secreta o porta opcionalmente su producto de expresión recombinante (es decir, la molécula de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o análogo de la invención) sobre su superf i c ie .

Ejemplo 1 Este ejemplo es una colección de los métodos aplicados para ilustrar la presente invención a. Clasificación de blastos de plasma lambda-negativos de sangre de donador Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron aisladas de sangre tomada de donadores usando Lymphoprep (Axis Shield) y centrifugación gradiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las PBMC aisladas fueron ya sea criopreservadas en FCS; 10% de DMSO a -150°C o usadas directamente. La fracción de células B se etiquetó con un anticuerpo anti-CDl9 y se aisló de la fracción de PBMC usando clasificación de células magnética (MACS) . Las PBMC (lxlO6 células) fueron incubadas con un anticuerpo conjugado anti-CDl9-FITC (BD Pharmingen) durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en r-egulador de pH MACS (Miltenyl Bistec) . Anti-FITC MicroBeads (Mifcenyl Bistec) se mezclaron con las células marcadas y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. El procedimiento de lavado se repitió antes de que la suspensión de esferas de célula se aplicara a una columna LS MACS (Miltenyl Bistec) . La fracción de células CD19 positivas fue eluida de la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante y almacenadas ya sea en FCS-10% de DMSO, o clasificadas por células individuales directamente.

Los blastos de plasma fueron seleccionados de la fracción de células B CD19+ mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) con base en el perfil de expresión de proteínas de superficie celular CD19, CD38 y CD45. CD19 es un marcador de células B -que también es expresado en precursores de células de plasma, mientras que CD38 es expresado altamente en blastos de plasma y células de plasma. Los blastos de plasma aparentemente ti-enen una expresión un poco más baja de CD19 y CD45 que el resto de las células CD19+, lo cual permite la separación de una población individual . Las células fueron lavadas en regulador de pH FACS (PBS; 1% de BSA) y teñidas durante 20 minutos con anti-CD19-FITC, anti-CD38-APC, anti-Lambda-PE (BD Pharmingen) . La tinción de la cadena ligera lambda fue incluida para permitir así la exclusión de células que no puedan servir como plantilla para la PCR (véase sección C) . Las células teñidas fueron lavadas y resuspendidas en regulador de pH FACS . La velocidad de flujo de las células durante el FACS se ajustó a aproximadamente 200 eventos/segundo y la concentración de células fue 5xl05/ml para obtener un alto rescate de células de plasma. El siguiente conjunto de puertas fue usado. Cada puerta es una hija de la anterior. Puerta 1: Puerta FSC/SSC. La población de linfocitos que tenía 1 FSC más alta fue seleccionada, asegurando así clasificación de células vivas.

Puerta 2: SSCh/SSCw. Esta puerta aseguró la clasificación de células individuales '{discriminación por dobletes) . Puerta 3: Los eventos que representan los blastos de plasma fueron cerrados en la gráfica de punto CD38/CD19 como intermediario CD38 Alto/CDl9. Puerta 4: Ya que el procedimiento de PCR descrito en la sección c sólo amplifica cadenas ligeras kappa, los eventos lambda-negativos fueron encerrados en una gráfica de puntos Iambda/CD19. Como una alternativa o además de la puerta 3, los blastos de plasma también pudieron ser identificados como CD38 altos y CD45 intermedios en una gráfica de puntos CD45/CD38. Esto requerirá la coloración de las células con anti-CD45-PerCP. La población resultante que satisfizo esos cuatro criterios fue clasificada por células individuales en placas de PCR de 96 pocilios que contenían un regulador de pH de clasificación (véase sección c) . Las placas que contenían las células fueron almacenadas a -80°C. b. ELISpot Se usó ELISpot para calcular el porcentaje de blastos de plasma que expresaban anticuerpos anti-RSV en muestras de células obtenidas, es decir, células FEMC, células CD19+ purificadas por MAS o una población de blastos de plasma clasificados por FACS. Placas de 96 pocilios con una superficie de nitrocelulosa (Millipore) se recubrieron con una solución de 25 ug/ml de partículas Long de RSV inactivadas (HyTest) . Los pocilios fueron bloqueados mediante incubación con RPMI, 2% de leche en polvo y se dejaron a 4°C durante alrededor de 5 horas seguidos por 1 hora de incubación a 37°C. Las placas fueron lavadas y las muestras de células se añadieron en medio de cultivo RPMI a cada pocilio seguidas por incubación en condiciones de cultivo de tejido estándares durante 24 horas. Los anticuerpos específicos de RSV secretados se unirán a las partículas de virus inmovilizadas que rodean la célula productora de anticuerpos. Las células fueron removidas por lavado tres veces en PBS; 0.1% de Teen 20 y tres veces en PBS. IgG anti-humana conjugada a HRP (H+L) -(CalTag) e IgA anti-humana conjugada a HRP (Serotee) fueron añadidas y dejadas reaccionar con los anticuerpos inmovilizados durante 1 hora a 37°C. Se repitió el procedimiento de lavado y se añadió el substrato cromógeno (3-amino-9-etilcarbazol solubilizado en ?,?-EMF <di-metilformamida) ) . El desarrollo de color se terminó después de 4 minutos mediante la adición de H2O. Los puntos rojos fueron identificados como los sitios en los que se habían localizado células secretoras de anticuerpos específicos de antígeno. c. Enlace de pares VH y VL cognados El enlace de secuencias de codificación VH y VL se llevó a cabo en las células individuales obtenidas como se describe -en la sección a, facilitando el apareo de cognados de las secuencias de codificación VH y VL. El prc<^dimiento utilizó un procedimiento de PGR de dos etapas a base de una RT-PCR de extensión de traslape por multiplexión de una etapa por una PCR anidada. Las mezclas de cebadores usadas .en el presente ejemplo sólo amplifican cadenas ligeras kappa. Los cebadores capaces de amplificar cadenas ligeras lambda pudieran, sin embargo, ser añadidos a la mezcla de cebadores de multiplexión y a la mezcla de cebadores de PCR anidada si se requiere. Si se añaden cebadores lambda, el procedimiento de clasificación en la sección a debe ser adaptado de tal forma que las células positivas lambda no sean excluidas . El principio para el enlace de las secuencias VH y VL cognadas se ilustra en las figuras 2A-2B. Las placas -de PCR de 96 pocilios producidas en la sección a fueron descongeladas y las células clasificadas sirvieron co o plantilla para la RT-PCR de extensión de traslape por multiplexión. El regulador de pH de clasificación añadido a cada pocilio antes de la clasificación de células individuales contenía regulador de pH de reacción -{OneStep RT-PCR Buffer; Qiagen) , cebadores para RT-PCR < véase tabla 2) e inhibidor de RNasa (R asin, Promega) . Esto se complementó con OneStep RT-PCR Enzyme Mix (25x dilución; Qiagen) y dNTP mix (200 uM cada una) para obtener la concentración final dada en un volumen de reacción de 20 µ? . Las placas fueron incubadas durante 30 minutos a 55 °C para permitir la transcripción inversa del ARN de cada célula . Después de la RT , las placas se sometieron al siguiente ciclo de PCR : 10 min . a 94°C , 35x ( 40 seg . a 94°C , 40 seg . a 60 °C , 5 min . a 72 °C ) , 10 min . a 72 °C . Las r-eacc iones de PCR se llevaron a cabo -en ciclizador térmico H20BIT con una Canasta de Sello Desprendible para 24 placas de 96 pocilios (ABgene) para facilitar una alta emisión . Las placas de PCR fueron clasificadas a -20°C después de la ciclización .

Tabla 2 Mezcla de cebadores para RT-PCR de extensión de traslape por xnultiplexión W=A/T, R=A/G, S=G/C Para la etapa de PCR anidada, placas de PCR de 96 pocilios se prepararon con la siguiente mezcla en cada pocilio (r-ea ciones de 20 µ?) para obtener la concentración final dada: regulador de pH lx FastStart (Roche), mezcla dNTP (200 u cada una) , mezcla de cebadores anidados (véase tabla 3) , Phusion DNA Polymerase (0.08 U; Finnzymes) y FastStart High Fidelity Enzyme Blend (0.8 U; Roche). Como plantilla para la PCR anidada, 1 µ? se transfirieron de las reacciones -de PCR de extensión por traslape de multiplexión. Las placas de PCR anidadas fueron sujetas al siguiente ciclo de PCR: 35x(30 seg. a 95°C, 30 seg. a 60°C, 90 seg. a 72°C), 10 min. a 72°C. Las reacciones seleccionadas aleatoriamente fueron analizadas en un gel de agarosa al 1% para verificar la presencia de un fragmento de extensión por traslape de aproximadamente 1070 pb. Las placas fueron almacenadas a -20°C hasta el procesamiento adicional de los fragmentos de PCR. Tabla 3 Conjunto de cebadores anidados d. Inserción de pares de codificación VH y VL cognados en un vector de tamizado Para identificar anticuerpos con especificidad de unión a partículas o antígenos RSV, las secuencias de codificación VH y VL obtenidas como se describió en la sección c fueron expresadas como anticuerpos de longitud -completa. Esto incluyó una inserción del repertorio de par-es de codificación VH y VL en un vector de expresión y transformación en una célula huésped. Se empleó un procedimiento y clonación de dos etapas para la generación de un repertorio de vectores de expresión que contenían los pares de codificación VH y VL enlazados. Estadísticamente, si el repertorio de vectores de expr-esión contiene diez veces los plásmidos recombinantes -como el número de productos de PCR VH y VL en pares cognados usados para la generación del repertorio de tamizado, existe 99% de probabilidad de que todos los pares de genes únicos sean representados. Así, si 400 fragmentos génicos de extensión por traslape se obtuvieron en la sección c, se generó un repertorio de al menos 4,000 clones para el tamizado. Brevemente, los repertorios de pares de codificación VH y VL enlazados de la PCR anidada en la sección c fueron agrupados (sin mezclar pares de diferentes donadores) . Los fragmentos de PCR fueron cortados con AND endonucleasas Xhol y No l en los sitios de reconocimiento introducidos en los términos de los productos de PCR. Los fragmentos cortados y purificados fueron ligados en un vector de expresión IgG de mamífero digerido con Xhol/Notl (figura 3) mediante procedimientos de ligación estándares. La mezcla de ligación fue sometida a electroporacion en E. coli y se añadió a placas 2xYT que contenían el antibiótico adecuado y se incubaron a 37 °C durante la noche. El repertorio de vectores amplificados se purificó de células recuperadas de las placas usando métodos de purificación de ADN estándares (Qiagen) . Los plásmidos fueron preparados para la inserción de fragmentos líderes promotores mediante corte usando endonucleasas Ascl y Nhel . Los sitios de restricción para estas enzimas fueron ubicados entre los pares de genes de codificación VH y VL-Después de la purificación del vector, un fragmento líder promotor de mamífero bidireccional digerido con Ascl-Nhel se insertó en los sitios de restricción Ascl y iVh-el mediante procedimientos de ligación estándares. El vector ligado fue amplificado en E. coli y el plásmido se purificó usando métodos estándares . El repertorio generado de vectores de tamizado se transformó en E. coli mediante procedimientos convencionales. Las colonias obtenidas se consolidaron en placas maestras de 384 pocilios y almacenaron. El número de colonias desplegados excedió el número de productos de PCR ingresados al menos en 3 veces, dando así 95% de probabilida<ies de la -presencia de todos los pares -g ni-cos V únicos obtenidos en la sección c. e. Tamizado Las colonias bacterianas dispuestas en la sección d fueron inoculadas en medio de cultivo en placas de 384 pocilios similares y cultivadas durante la noche. El ADN para la transfección se preparó de cada pocilio en la placa de cultivo de células. El día anterior a la transfección placas de 384 pocilios fueron sembradas con células CHO Flp-In (Invitrogen) a 3,000 células/pocilio en 20 µ? de medio -de cultivo. Las células fueron transfectadas con el ADN usando Fugene6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego de 2-3 días de incubación los sobrenadantes que contenían anticuerpos de longitud completa fueron cosechados y almacenados para propósitos de tamizado. El tamizado se llevó a cabo usando el sistema Applied Biosystems 8200 FMAT™ System, un FLISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado por fluorescencia) soluble a base de esferas homogéneas tSwartzman et al. 1999, Anal. Biochem. 271:143-151). Un número de antígenos, incluyendo partículas de virus, proteína G recombinante y péptidos biotilinados derivados de antígenos de RSV, se usaron para el tamizado. Los ' péptidos fueron derivados de la región conservada (aminoácidos 164-176) y la región nuclear de cisteína (aminoácidos 171-187, cepa Long y 18537) de la proteína G y la región extracelular de la proteína SH {aminoácidos 42-64 de la cepa A2 y 42-65 de la cepa 18537) . Partículas virales inactivadas de la cepa RSV Long (HyTest) se inmovilizaron en esferas de poliestireno al incubar 300 µ? de esferas de 5% p/v (6.79 um de diámetro, Spherotech Inc.) con 300 µ? de solución de virus (concentración de proteínas: 200 ug/ml) . La proteína G recombinante soluble (aminoácidos 66-292 de la secuencia de la cepa 18537) se inmovilizó en forma similar directamente sobre esferas de poliestireno, mientras que los péptidos biotilinados fueron capturados sobre esferas de poliestireno y estrepavidina pre-recubiertas (6.0-8.0 um de diámetro, Gerlinde Kisher) a concentraciones saturadoras . La mezcla de recubrimiento se incubó durante la noche y se lavó dos veces en PBS. Las esferas fueron resuspendidas en 50 mi de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (PBS/BSA) y 5 µ? de conjugado Alexa 647 de IgG anti-humano de cabra (Molecular probes) . Diez µ? de la mezcla de recubrimiento resuspendida se añadieron a 20 µ? de sobrenadante que contenía anticuerpos en placas de 384 pocilios compatibles con FMAT y se incubaron durante aproximadamente 12 horas, después de lo cual la fluorescencia en la superficie de la esfera en pocilios individuales fue medida. Un evento de fluorescencia se reconoció como positivo si su intensidad era de al menos seis desviaciones estándares por arriba de la línea de base de fondo . Los clones que resultaron en aciertos primarios fueron retirados de las placas maestras originales y colectados en placas nuevas. Se aisló el ADN de estos clones y se sometió para secuenciación de ADN de los genes V. Las secuencias fueron alineadas y todos los clones únicos fueron seleccionados. Los clones seleccionados se validaron más. Brevemente, 2xl06 células Freestyle 293 (Invitrogen) fueron transíectadas con 1.7 ]ig de ADN de los clones seleccionados y 0.3 ug de plásmido pAdVantage {Promega) en 2 mi de medio Freestyle (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de dos días, los sobrenadantes fueron probados para la expresión de IgG y reactividad con los antígenos diferentes usados para el tamizado primario así como proteína F purificada recombinante y un fragmento de E. coli producido de la proteína G (aminoácidos 127-203 de la secuencia 18537) por FLISA y/o ELISA. Los sobrenadantes de anticuerpos fueron probados en diluciones en serie permitiendo una clasificación de los clones de acuerdo con la reactivi-dad antigénica . f. Reparación de clones Cuando se usa un enfoque de PCR de multiplexion como el descrito en la sección c, cierto grado de cebado cruzado entre familias de genes V se espera debido al alto grado de homología. El cebado cruzado introduce aminoácidos que no ocurren naturalmente en -el armazón de inmunoglobulina con varias consecuencias potenciales, por ejemplo, cambios estructurales e inmunogenicidad incrementada, todos resultando en una actividad terapéutica reducida. Para eliminar estas desventajas y asegurar que clones seleccionados reflejen la respuesta inmune humoral natural, estas mutaciones de cebado cruzado se corrigieron en un proceso llamado reparación de clones. En la primera etapa del procedimiento de reparación de clones, la secuencia de VH fue amplificada por PCR con un conjunto de cebadores que contenía la secuencia que correspondía al gen VH del que se originó -el clon de interés, de esta manera corrigiendo cualquier mutación introducida por cebado cruzado. El fragmento de PCR fue digerido con Xhol y AscI y ligado de nuevo en el vector de expresión de mamífero digerido con Xhol/AscI (figura 3) usando procedimientos de ligación convencionales. El vector ligado se amplificó en E. coli y el plásmido se purificó mediante métodos -estándares. La secuencia de VH fue secuenciada para verificar la corrección y el vector se digirió con Nhel/Notl para prepararlo para su inserción en la cadena ligera. En la segunda etapa la cadena ligera completa se amplificó por PCR con un conjunto de cebadores que contenía la secuencia que correspondía al gen VL del cual se originó el clon de interés, de esta manera corrigiendo cualquier mutación introducida por cebado cruzado. El fragmento de PCR fue digerido con Nhel/Notl y ligado en el vector que contenía VH preparado arriba. El producto de ligación se amplificó en E. coli y el plásmido se purificó mediante métodos estándares. Posteriormente, la cadena ligera fue secuenciada para verificar la corrección. En caso de que la región constante kappa de un clon seleccionado contuviera mutaciones, introducidas durante la amplificación de los genes como se describió en la sección c, se reemplazó por una región constante no mutada. Esto se hizo en una PCR de traslape en donde el gen VL reparado (amplificado sin la región constante) fue fusionado a una región constante con secuencia correcta (obtenida en una PCR separada) . La secuencia completa "se amplificó y se clonó en el vector que contenía VH como se describió arriba y la cadena ligera reparada fue secuenciada para verificar la corrección. g. Generación de una línea de células policlonales La generación de una línea de células de expresión policlonales produciendo un anticuerpo policlonal recombinante es un procedimiento de varias etapas que incluye la generación de líneas de células de expresión individuales que expresan cada una un anticuerpo único a partir de una sola secuencia génica VH y VL. La línea de células policlonales se obtiene al mezclar las líneas de células individuales y distribuyendo la mezcla en ampollas generando así un banco de células -de investigación policlonales (pRCB) o banco de células maestras (pMCB) del cual un banco de células de trabajo policlonales (pWCB) puede generarse al expandir células del banco de células maestras o de investigación. Generalmente, las líneas de células policlonales del pRCB se usan directamente sin generar un pWCB. Las etapas individuales en el proceso de generar una línea de células policlonales se describen abajo. g-1 Transfección y selección de líneas de células de mamífero Se usó la línea de células Flp-In CHO (Invitrogen) como una línea de células de partida. Para obtener una línea de células más homogénea la línea de células Flp-In CHO de origen fue subclonada mediante dilución limitada y varios clones fueron seleccionados y expandidos . Con base en el comportamiento de crecimiento un clon, CHO-Flp-In (019) , fue seleccionado como línea de células de partida. Las células CHO-Flp-In (019) fueron cultivadas como células adherentes en HAM-F12 con 10% de suero de becerro fetal (FCS) . Las preparaciones de plásmidos individuales que contenían cada una un par de codificación VH y VL seleccionado y reparado obtenido en la sección F, fueron o-transíectadas con Flp recombinasa que codificaba para plásmido en células ~19xl06 CHO-Flp-In (019) (para detalles adicionales, véase WO 04/061104) en un matraz T175 usando Fugene6 (Roche) . Las células fueron tripsinadas luego de 24 horas y transferidas a una fábrica de células de dos capas (1260 cm2) (Nunc) . Las líneas de células recombinantes fueron seleccionadas al cultivar en presencia de 500 ug/ml de Geneticina, la cual se añadió 48 horas después de la transfección. Aproximadamente dos semanas más tarde aparecieron clones . Los clones fueron contados y las células fueron tripsinadas y en adelante cultivadas como grupos de clones que expresaban uno de los anticuerpos específicos de RSV. g-2 Adaptación a cultivo de suspensión libre de suero Los cultivos de células que expresaban anticuerpo anti-RSV adherentes individuales fueron tripsinados, centrifugados y transferidos a matraces agitadores separados (250 mi) con l.lSxlO6 -células/ml en medio libre de suero adecuado {Excell302, JRH Biosciences; 500 ug/ml de Geneticina, agente contra formación de coágulos (1:250) y 4 mM de L-glutamina) . El crecimiento y morfología de células fueron seguidos durante varias semanas. Luego de 4-6 semanas las líneas de células mostraron normalmente un comportamiento de crecimiento adecuado y estable con duplicación de los tiempos debajo de 3 horas y las líneas de células individuales adaptadas fueron entonces criopreservadas en varias ampollas. Los anticuerpos individuales expresa-dos durante la adaptación se purificaron de los sobrenadantes usando el método descrito en la sección i) . El anticuerpo purificado se usó para la caracterización de especificidad a antígeno y propiedades bioquímicas como se describe abajo. g-3 Caracterización de líneas de células Todas las líneas de células individuales fueron caracterizadas con respecto a la producción y proliferación de anticuerpos. Esto se llevó a cabo con los siguientes ensayos: Producción: La producción de anticuerpos recombinantes de las líneas de células de expresión individuales fue seguida durante la adaptación por ELISA específica a kappa . Las placas de ELISA fueron recubiertas durante la noche con anticuerpo purificado Fe de cabra-anti-humano (Serotec) en regulador de pH de carbonato, pH 9.6. Las placas se lavaron 6 veces con regulador de pH de lavado <PBS; 0.05% de Tween 20) y se bloquearon por incubación durante 1 hora en regulador de pH de lavado que contenía 2% de leche descremada. Los sobrenadantes de medios de cultivo de células fueron añadidos y la incubación se extendió durante 1 hora. Las placas fueron lavadas 6 veces en regulador de pH -de lavado y los anticuerpos secundarios <gota-anti—human kappa HRP, Serotec) fueron añadidos y la incubación se repitió. Después de agitación vigorosa el lavado de ELISA fue llevado a cabo con substrato TMB y la reacción se detuvo mediante la adición de H2SO4. Las placas se leyeron a 450 nm. Además, se usó coloración intracelular para determinar el nivel de expresión general así como para determinar la homogeneidad de la población de células en relación a la expresión de anticuerpos recombinantes . 5xl05 células fueron lavadas en regulador de pH FACS frío (PBS; 2% de FCS) antes de la fijación por incubación en CellFix (BD-Biosciences) durante 20 minutos. Las células fueron granuladas y permeabilizadas en metanol enfriado con hielo durante 10 minutos y lavadas dos veces en regulador de pH FACS. La suspensión se marcó fluorescentemente y s-e añadió un anticuerpo (Goat F(ab')2 Fragment, Anti-human IgG(H+L)-PE, Beckman Coulter) . Después de 20 minutos en hielo las células fueron lavadas y resuspendidas en regulador de pH FACS seguido por análisis FACS. Proliferación: Alícuotas de las suspensiones de células se tomaron dos a tres veces a la semana y el número -de células, tamaño y viabilidad de las células se determinaron por medio de análisis con Vi-Cell XR (analizador de viabilidad -de células, Beckman Coult-er) . El tiempo de duplicación para los cultivos de células se calculó usando los números de células derivadas de las mediciones de VI-Cell. g-4 Caracterización de la especificidad a antígeno de los anticuerpos individuales La especificidad a antígenos y epítopes de los anticuerpos expresados individualmente se evaluaron para de esta manera permitir la generación de un anti-RSV rpAb con una especificidad bien caracterizada. Como ya se describió en la sección e, los anticuerpos identificados durante el tamizado fueron validados al evaluar su especificidad de unión a antígenos RSV individuales (proteína G recombinante , proteína F recombinante o purificada) o fragmentos péptidos de los mismos (región conservada y motivo de núcleo de cisteína de la proteína G, subtipo A y B, y el dominio extracelular de la proteína SH, subtipos A y B) mediante FLISA, ELISA y resonancia plasmónica superficial (SPR; Biacore) . Las especificidades a epítopes fueron determinadas en ELISA por competencia con anticuerpos comerciales bien caracterizados, algunos de los cuales se muestran en la tabla 4. No necesariamente todos los anticuerpos mostrados en la tabla 4 se usaron en la caracterización de cada anticuerpo individual de la presente invención, y potencialmente otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que hayan sido caracterizados con respecto al antigeno, sitio antigénico y/o epí tope al que se unen pueden usarse también. Brevemente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo usa-dos para el bloqueo de epítopes se incubaron con el antígeno inmovilizado (partículas Long de RSV, HyTest) en gran exceso, es decir concentraciones 1?0 veces a aquellas que daban 75% de unión máxima, determinado empíricamente (Ditzel et al., J. Mol. Biol . 1997, 267:684-695) . Después del lavado, los clones de anticuerpo individuales fueron incubados con el antígeno bloqueado a varias concentraciones y cualquier IgG humana unida fue detectada usando el conjugado cabra-HRP anti-huma-no (Serotec) de acuerdo con protocolos de ELISA estándares. Las especificidades de epítopes se caracterizaron más mediante competencia por pares entre diferentes clones de anticuerpo en Biacore usando concentraciones saturadotas (determinadas empíricamente) tanto de anticuerpos de bloqueo como de sondeo. La proteína F o G purificada inmovilizada por acoplamiento a amina directa (Biacore) se usó como antígeno. En el mapeo de epítopes tanto a base de ELISA como Biacore, la unión reducida después del bloqueo de epítopes se comparó con la unión no competida.

Tabla 4 Anticuerpos monoclonales para el mapeo de epítopes de anticuerpos anti-F y anti-G La columna "Antigeno" indica el antígeno asociado a RSV unido por el Mab/Fab, y si una especificidad de subtipo se conoce esto se indica entre paréntesis La columna "epítope" (aa) " indica el nombre del ep tope reconocido por .el MAb/Fab, además en posiciones de aminoácidos () que resultan en mutantes de escape de RSV, o fragmentos de péptidos /proteína hacia los cuales se ha mostrado unión, son indicados. Las referencias numeradas (Ref.) dadas en la tabla 4 corresponden a: 1. Anderson et al., J. Clin. Microbiol. 1986, 23 :475-480. 2. Anderson et al., J. Virol . 1988, 62:1232-4238. 3. Beeler & van Wyke Coelingh, J. Virol. 1989, 63:2941-2950. 4. Crowe et al., JID 1998, 177:1073-1076. 5. Sominina et al., Vestn Ross Akad Med Nauk 1995, 9:49-54. 6. Collins et al . , Fields Virology, 7. Crowe et al., Virology 1998, 252:373-375. Zhao & Sullender, J. Virol. 2004, 79:3962 9. Sullender, Virology 1995, 209:70-79. 10. Morgan et al., J. Gen. Virol. 19¾7, 68:2781- 2788. 11. McGill et al., J. Immunol . Methods 297:143-152. 12. Arbiza et al., J. Gen. Virol . 1992, 73:2225- 2234. 13. López et al. J. Virol. 1998, 72:6922-6928. 14. Walsh et al., J. Gen. Virol. 1989, 70:2953-2961. 15. Walsh et al., J. Gen. Virol. 1998, 79:479-487. Además, los clones de anticuerpos también fueron caracterizados en términos de unión a células HEp-2 epiteliales de laringe humanas <ATCC CLL-23) infectadas con cepas de RSV diferentes {Long y Bl) mediante FACS . Brevemente, las células HEp-2 fueron infectadas ya sea con RSV Long (No. De ATCC VR-26) o la cepa RSV Bl número de ATCC VR-1400) en medio libre de suero a una relación de 0.1 pfu/célula durante 24 (cepa Long) o 48 horas (cepa Bl) . Después del desprendimiento y lavado de las células fueron desechadas en placas de 96 pocilios e incubadas con diluciones (4 pM-200 uM) de los anticuerpos anti-RSV individuales durante 1 hora a 37°C. Las células fueron fijadas en formal-dehído al 1% y el anticuerpo unido a superficie celular se detectó mediante incubación con conjugado <le IgG anti-humana-PE F(ab)2 de cabra (Beckman Coulter) durante 30 minutos a 4°C. La unión a células HEp-2 infectadas en falso se analizó similarmente . Los clones seleccionados identificados como específicos de proteína G también fueron probados para reactivi-da-d cruzada con fractalcina humana recombinante (CX3CL1; R&D systems) mediante ELISA. Se usó CX3CL1 anti-humano/anticuerpo monoclonal fractalcina (R&D Systems) como un control positivo. g-5 Caracterización de la cinética de unión de los anticuerpos individuales El análisis de la cinética de los anticuerpos de la invención se llevó a cabo usando análisis de resonancia plasmónica superficial en un Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) , usando antígenos recombinantes inmovilizados sobre la superficie sensora a densidad muy baja para evitar limitaciones en el transporte de masa. El análisis se llevó a cabo con fragmentos Fab preparados a partir de clones de anticuerpo individuales usando el kit de preparación ImmunoPure Fab (Pierce) . Brevemente, un total de 200 unidades de resonancia (RU) de proteína recombinante F o un total de 50 RU de proteína recombinante D se conjugaron a una superficie de microcircuito C 5 usando el kit Amine Coupling <Biacore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos Fab fueron inyectados sobre la superficie del microcircuito -en diluciones en serie, iniciando a una concentración optimizada que no dio como resultado valores RUmax por arriba de 25 cuando se probó en el fragmento con proteína inmovilizada. La constante de velocidad de asociación (Ka) y constante de disociación (Kd) fueron evaluadas globalmente usando los modelos predefinidos de asociación y disociación 1:1 <Langmuir) en el software BIAevaluation 4.1 (BIAcore) . Al llevar a cabo los análisis de cinética en fragmentos Fab, se asegura que los datos obtenidos realmente reflejen las afinidades de unión hacia proteína RSV. Si se usan anticuerpos completos, los datos reflejarían avideces de unión, lo cual no puede traducirse fácilmente en una medida significativa de la naturaleza exacta de las características de unión de los anticuerpos contra el antígeno. g-6 Caracterización de las propiedades bioquímicas de anticuerpos individuales La heterogeneidad es un fenómeno común en anticuerpos y proteínas recombinantes . Las modificaciones a anticuerpos ocurren típicamente durante la expresión, por ejemplo, modificaciones después de traducción tipo -Sigíleosilación, f agmentación proteolítica y heterogenei-dad N-y C-terminal que resultan en heterogeneidad de tamaño o carga. Además, modificaciones tales como oxidación de metionina y desamidacion pueden ocurrir durante un almacenamiento a corto o a largo plazo subsecuente. Ya que estos parámetros tienen que ser bien definidos para anticuerpos terapéuticos, fueron analizados antes de la generación de la línea de células policlonales . Los métodos usados para la caracterización de anticuerpos individuales purificados (ver sección I) incluyeron SDS-PAGE ^condiciones reductoras y no reductoras) , cromatografía de intercambio catiónico débil (IEX) , cromatografía de exclusión de -tamaño (SEC) y RP-HPLC (condiciones reductores y no reductores) . El análisis SDS-PAGE.bajo condiciones reductoras y no reductoras y SEC indicó que los anticuerpos purificados estaban de hecho intactos con cantidades pequeñas de formas fragmentadas y agregadas . El análisis de perfil IEX de los anticuerpos purificados dio como resultado perfiles con picos individuales o cromatogramas con varios picos, indicando heterogeneidad de carga en estos anticuerpos particulares . Las preparaciones de anticuerpos que dieron como resultado varios picos en el análisis IEX y/o migración aberrante ya sea de la cadena ligera o pesada en geles SDS, o perfiles RP-HPLC inusuales fueron analizados en detalle para términos N intactos mediante secuenciación N-terminal y para heterogeneidad causada por diferencias en los perfiles de oligosacáridos . Además, anticuerpos s-eleccionados fueron analizados para la presencia de sitios de N-glicosilación adicionales en las cadenas variables usando tratamiento enzimático y análisis SDS-PAG subsecuente. g-7 Establecimiento de una línea de células policlonales para la producción de anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV De la colección de lineas de células de expresión establecidas, se selecciona un subconjunto que se mezclará para la generación de una l nea de células policlonales y la investigación policlonal/banco de células maestras (pRCB/pMCB) . Los parámetros de selección pueden definirse de acuerdo con el uso del anticuerpo policlonal que se producirá a partir de la línea de células policlonales y -el rendimiento de las líneas de células individuales. Se consideran generalmente los siguientes parámetros: · Características de las líneas de células; para optimizar la estabilidad de la línea de células policlonales, líneas de células individuales con tiempos de duplicación de entre 21 y 30 horas y productividad de anticuerpo arriba 1 pg/célula/día se prefieren. · Reactividad; los antígenos /sitios antigénicos y epítopes en los que deberá ejercer reactividad el anti-RSV rpAb son cuidadosamente considerados . • Química de proteínas ; -de preferencia anticuerpos con características bioquímicas bien definidas están incluidos en el anti-RSV rpAb final. Las líneas de células individuales seleccionadas que expresaban cada una un anticuerpo anti-RSV reoombinante son descongeladas y expandidas a 37°C en medio libre de suero en matraces agitadores para alcanzar al menos 4xl08 células de cada clon que tiene una población que duplica el tiempo de 21-34 horas. Las viabilidades están de preferencia en el intervalo de 93% a 96%. La línea de células policlonales se prepara al mezclar 2xl06 células de cada línea de célula. La línea de células policlonales se distribuye en ampolletas congeladas que contienen 5.6xl07 células y se criopreserva .

Esta colección de frascos con una línea de células policlonales es llama-da el banco de células maestras/investigación policlonales (prCB/pMCB) del cual el banco de células de trabajo policlonales (pWCB) puede generarse al expandir una ampolleta del pRCB/pMCB para alcanzar un número suficiente de células que sean tendidas en un banco de células de trabajo policlonales <pWCB) de aproximadamente 200 ámpulas con la misma densidad celular que las ámpulas de pRCB/pMCB. Las muestras de los bancos de células se prueban para micoplasma y esterilidad. h. Expresión de un anticuerpo anti-RSV poli-clonal reco binante Lotes de anticuerpos anti-RSV policlonales recombinantes se producen en biorreactores de 5 litros (B. Braun Biotech Internacional, Melsungen, Alemania). Brevemente, frascos del pRCB o pWCB se descongelan y expanden en matraces agitadores (Corning) . Las células en tren de siembra se cultivan en medio ExCell 302 con G418 y con agen-te anti- formación de grumos a 37°C, 5% de C02. Los biorreactores son inoculados con 0.6xl06 células/ml suspendidas en 3 litros de medio ExCell 302 sin -G418 y sin agente contra formación de grumos. Los números de células/células viables se monitorean diariamente mediante conteo CASY o ViCell. A 50 horas, 2,000 mi de medio ExCell 302 se suplementan y luego 92 horas un desplazamiento hacia abajo de la temperatura de 37°C a 32°C es llevado a cabo. El sobrenadante del cultivo de células se cosecha después de 164 horas y se somete a purificación como se describe en la sección i) . i. Purificación de anticuerpos anti-RSV individual-es y anticuerpos anti-RSV policlonales Los anticuerpos expresados como se describe en la sección g.g-2 y h, todos del isotipo IgGl, fueron purificados por afinidad usando una columna MabSelect SuRe (proteína A) . Los anticuerpos individuales interactuaron con proteína A inmovilizada a pH 7.4, mientras que las proteínas contaminantes fueron lavadas de la columna. Los anticuerpos unidos fueron eluidos subsecuentemente de la columna al reducir el pH de 2.7. Las fracciones que contenían anticuerpos, determinadas a partir de mediciones de absorbancia a 280 nm, fueron agrupadas y se cambió el pH usando una columna G-25 en 5 mM de acetato de sodio, 150 mM de NaCl, pH 5 y se almacenaron a -20°C. j. Ensayos de neutralización in vi tro j-1 Preparación de RSV vivo para uso in vitro Células HEp-2 epiteliales de laringe humana (ATCC CLL-23) fueron sembradas en matraces de 175 cm2 a lxlO7 células/matraz . Las células fueron infectadas ya sea con la cepa RSV Long (número de ATCC VR-26), la RSV Bl (Número de ATCC VR-1400) o la RSV B Wash/18537 (Advanced Biotechnologies Inc.) en medio libre -de suero en 3 mi a una relación de 0.1 pfu/célula. Las células fueron infectadas durante 2 horas a 37°C 5% de C02 seguidas por la adición de 37 mi de medio MEM completo. Las células fueron incubadas hasta que fueran visibles efectos citopáticos. Las células fueron desprendidas por raspado y los medios y células fueron sonificados durante 20 segundos y hechos alícuotas, congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80°C. j-2 Prueba de neutralización de reducción de laca (PRNT) Células HEp-2 fueron sembradas en placas de cultivo de 96 pocilios a 2xl04 células/pocilio, e incubadas durante la noche a 37 °C; 5% de C02. Las sustancias de prueba fueron diluidas en MEM libre de suero y se les dejó preincubar con RSV en ausencia o presencia de complemento (suero de complemento de conejo, Sigma) durante 30 minutos a 37°C. Esta mezcla se aplicó a la monocapa de células HEp-2 y se incubó durante 24 horas a 37°C; 5% de C02. Las células fueron fijadas con 80% acetona; 20% de PBS durante 20 min. Después de lavar, anticuerpo anti-RSV de cabra biotinilado (AbD Serotec) fue añadido (1:200) en PBS con 1% de BSA y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavado, se añadió HRP-avidina y se dejó incubar durante 30 minutos. Las placas fueron reveladas mediante incubación con substrato de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) durante 25 min. (RSV Long) ó 45 min. (RSV Bl) . Las placas fueron contadas en un Bioreader (Bio-Sys GmbH) . Los valores EC50 (concentraciones efectivas requeridas para inducir una reducción -del 50% en el número de placas) fueron calculados cuando fue aplicable para permitir una comparación de las potencias . j-3 Ensayo de inhibición de fusión El ensayo de inhibición de fusión se llevó a cabo esencialmente como el ensayo de neutralización de reducción de placa excepto que RSV se dejó infectar antes de la adición de sustancias de prueba. En la práctica, se añadió virus en medio libre de suero a la monocapa de células HEp-2 durante 1.5 horas. Se retiraron los sobrenadantes y las sustancias de prueba se añadieron en medio MEM completo con o sin complemento (suero de complemento de conejo, Sigma) . Las placas fueron incubadas durante la noche y procesadas como se describió arriba para el ensayo de neutralización de reducción de placa. j-4 Ensayo de microneutralización Además que el PRT y ensayo de inhibición de fusión descritos en las secciones j-2 y j-3, un ensayo de microneutralización a base de la detección de proteínas RSV fue empleado para la determinación de la neutralización e inhibición de fusión de RSV. Para la prueba de neutralización, las sustancias de prueba se diluyeron en MEM libre de suero y se les dejó preincubar con RSV en ausencia o presencia de complemento (sueros de complemento de conejo, Sigma) en placas de cultivo de 96 pocilios durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células HEp-tripsinadas fueron añadidas a 1.5xl04 células/pocilio e incubadas durante 2-3 días a 37°C; 5% de C02. Las células fueron lavadas y fijadas con 80% de acetona; 20% de PBS durante 15 minutos a 4°C y secadas. Las placas fueron después bloqueadas con PBS con 0.5% de gelatina durante 30 minutos a temperatura ambiente y teñidas con un grupo de anticuerpos monoclonales de murino contra proteínas RSV (NCL-RSV3, Novocas ra) , diluidas 1:200 en PBS con 0.5% de gelatina y 0.5% de Tween 20, durante 2 horas a temperatura ambi-ente. Después de lavar, el conjugado de Inmunoglobulina HRP antiratón de Conejo Policlonal (P0260; DakoCytomation) , dilui-do 1:1000 en PBS con 0.5% de gelatina y 0.5% de Tween 20 fue añadido y dejado incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas y reveladas mediante la adición de orto-fenilendiamina . La reacción se detuvo mediante la adición de H2SC>4 y las placas se leyeron en un lector de placas ELISA a 490 nm. El ensayo de inhibición de fusión se llevó a cabo esencialmente como la prueba de microneutralización con excepción de que se añadió virus a células y se incubó -durante 1.5 horas a 37 °C; 5% de 02 antes de que las sustancias de prueba, diluidas en MEM completo, fueran añadi-das . Las placas se incubaron durante 2-3 días a 37°C; 5% de C02 y se revelaron como se describió arriba. k. Ensayos de protección in vivo k-1 Modelo de ataque de ratón Ratones BALB/c hembra de 7-8 semanas de edad fueron inoculados intraperitonealmente con una preparación de anticuerpos de 0.2 mi el día -1 del estudio. Ratones tratados con placebo fueron inoculados similarmente i.p. con 0.1 mi de regulador de pH PBS . En el día 0 del estudio, los ratones fueron anestesiados usando isofluorano inhalado e inoculados intranasalmente con 10"6-10"7 de cepa RSV A2 en 50 µ? o con lizado de células {inoculo falso) . Los animales se dejaron 30 segundos aspirar el inoculo mientras eran mantenidos verticales hasta que se recuperaran completamente de la anestesia . Cinco días después del ataque, los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbiton de sodio. Después de la muerte, se tomó sangre mediante sangrado de los vasos axilares para la preparación de sueros. Se removieron los pulmones y se homogeneizaron en 2.5 mi de regulador de pH con arena estéril. Homogenados de pulmón fueron centrifugados para sedimentar la arena y restos celulares y los sobrenadantes fueron hechos alícuotas y almacenados a -70°C. La carga viral -se determinó mediante cuantificación del número de copias de ARN de RSV en las muestras de pulmón usando PCR de transcriptasa inversa (RT-) . Se extrajo ARN de las muestras de homogenado pulmonar usando el sistema de extracción automatizado MagNA Puré LC Total Nucleic Acid kit (Roche Diganostics) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La detección de ARN de RSV se llevó a cabo mediante RT-PCR en tiempo real de un solo tubo usando el instrumento LightCycler y reactivos (Roche Diagnostics) con cebadores y sondas marcadas con fluoróforos específicas para el gen N del subtipo A de RSV como se describe por Whiley et al. (J. Clinical Microbiol . 2002, 40: 4418-22). Las muestras con números de copia de ARN de RSV conocidas fueron analizadas similarmente para derivar una curva estándar. Los niveles de diferentes citocinas y quimiocinas en muestras de tejido pulmonar se determinaron mediante un inmunoensayo multiplexado comercial en Rules-Based Medicine (Austin, TX) usando su perfil de multi-analitos de roedor (MAP) . k-2 Modelo de ataque de rata de algodón Ratas de algodón hembra de 6-8 semanas de edad (Sigmodon hispidus) fueron inoculadas intraperitonealmente con 0.5 mi de preparación de anticuerpos o placebo (PBS) el día -1 de estudio. 24 Horas más tarde, los animales son ligeramente anestesiados con isofluorano y se les da un ataque nasal de 10"6-10"7 pfu de la cepa A2 de RSV o medio de control (inoculo falso) . Un volumen total de 100 µ? de inoculo se administra y se distribuye uniformemente en ambas nares. Después de la conclusión del ataque intranasal cada animal se mantiene en la posición vertical durante un mínimo de 30 segundos para permitir una inspiración completa del inoculo. Cinco días después del ataque, los animales son sacrificados mediante inyección peritoneal letal de pentobarbi ton y sangrados mediante punción cardiaca. Muestras de suero se obtienen y se congelan a -80°C y cada animal es disectado bajo condiciones asépticas para la remoción de pulmones y tejido nasal. Las muestras de tejido se homogeneizan y los sobrenadantes se almacenan en alícuotas a -80°C. La carga viral en las muestras de tejido se determina por cuantificación del número de copias de ARN de RSV mediante un ensayo -en ti-empo real Taq-Man a base del método de Van Elden et al. (J Clin Microbiol . 2003, 41 (9 ): 4378-4381) . Brevemente, se extrae ARN de las muestras de homogenado de pulmón usando el método RNeasy (-Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN extraído es transcripto inversamente en ADNc y posteriormente amplificado mediante PCR usando el sistema Superscript III Platinum One Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen) con cebadores y sondas mar-cadas específicas para el gen N del subtipo A de RSV. Las muestras con concentraciones de RSV conocidas se analizan similarmente para derivar una curva estándar.

Ejemplo 2 En el presente ejemplo se ilustran el aislamiento, tamizado, selección y agrupación de clones que contienen pares VH y VL cognados expresados como anticuerpos de longitud completa con especificidad anti-RSV. Donadores Un total de 89 donadores fueron reclutados entre los empleados y padres de los niños quienes fueron hospitalizados en el Departamento de Pediatría del Hospital Hvidovre (Dinamarca) durante la temporada de RSV. Se tomó una muestra de sangre inicial de 18 mi, las células B CD19+ fueron purificadas (ejemplo 1, Sección a) y tamizadas para la presencia de anticuerpos anti-RSV usando ELISpot (ejemplo 1, sección b) y la frecuencia de células de plasma se determinó mediante análisis FACS. Se encontró que once donadores daban positivo en el tamiz de las muestras de sangre iniciales y una segunda muestra de sangre de 450 mi fue tomada de diez de ellos. Los blastos plasmáticos fueron clasificados por una sola célula de acuerdo con el ejemplo 1, sección a. Se llevó a cabo un ELISpot en una fracción de las células B CD19 positivas . Cuatro donadores con frecuencias ELISpot en la segunda donación de sangre de entre 0.2 y 0.6% de células de plasma específicas de RSV (IgG+ e IgA+) de la población de células de plasma total fueron identificados. Estas frecuencias se consideran lo suficientemente altas como para proceder al enlace de repertorios de pares VH y VL cognados.

Aislamiento de pares de codificación VH y VL cognados Los ácidos nucleicos que codifican para los repertorios de anticuerpos fueron aislados de las células de plasma clasificadas por célula individual de los cinco donadores, mediante RT-PCR de extensión por traslape multiplexado (ejemplo 1, sección c) . La RT-PCR de extensión de traslape multiplexado crea un enlace físico entre el fragmento génico de la región variable de la cadena pesada (VH) y la cadena ligera de longitud completa (LC) . El protocolo fue diseñado para amplificar genes de anticuerpos de todas las familias de genes VH y la cadena ligera kappa, al usar dos conjuntos de cebadores, uno para la amplificación de VH y uno para la amplificación de LC. Después de la transcripción inversa y la PCR de extensión de traslape multiplexada, las secuencias enlazadas se sujetan a una segunda amplificación por PCR con un conjunto de cebadores anidados. Cada donador fue procesado individualmente y 1480 a 2450 productos de traslape fueron generados por la RT-PCR de extensión de traslape multiplexada. La colección generada de pares de codificación VH y VL enlazados y cognados de cada donador fueron agrupadas e insertadas en un vector de expresión de IgG de mamífero (figura 3) como se describió en el ejemplo 1, sección d) . Los repertorios generados fueron transformados en E. coli y consolidados en 20 placas maestras -de 384 pocilios y almacenados. Los repertorios constituían entre IxlO6 clones por donador. Tamizado Sobrenadantes que contenían anticuerpo IgG fueron obtenidos de células CHO transfectadas transitoriamente con ADN preparado de clones bacterianos de las placas maestras. Los sobrenadantes fueron tamizados como se describió en el ejemplo 1, sección e. Aproximadamente 600 aciertos primarios fueron secuenciados y alineados. La mayoría estuvieron en grupos de dos o más miembros, pero fueron también clones que sólo fueron aislados una vez, los llamados singletones. Los clones representativos de cada grupo y los singletones fueron sujetos a estudios de validación como los descritos en el e emplo 1, sección e) . Un número de los aciertos primarios fueron excluidos de caracterización adicional debido a características de secuencia no deseadas tales como cisteínas no apareadas, mutaciones no conservadoras, las cuales son .errores de PCR potenciales, inserciones y/o supresión de varios codones, y truncados. Un total de 85 clones únicos pasaron la validación. Estos se resumen en la tabla 5. Cada número de clon especifica un par VH y VL particular. La familia de genes IGHV e IGKV se indica para cada clon y especifica las regiones estructurales (FR) de los clones seleccionados. La secuencia de aminoácidos de las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de un anticuerpo expresado de cada clon se muestran, en donde CDRHl, CDRH2, CDRH3 indican las regiones CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada y GDRLl, CDRL2 y CDRL3 indican las regiones de CDR 1, 2 y 3 de la cadena ligera. La secuencia de cadena pesada y ligera variable completa puede establecerse a partir de la información en la tabla 5.

Detalles adicionales para las columnas individuales de la tabla 5 se dan abajo. Los nombres de las familias de genes IGHV e IGKV, fueron asignados de acuerdo con la nomenclatura HUGO/IMGT oficial (IMGT; Lefranc & Lefranc, 2001, The Immunoglobulin FactsBook, Academia Press) . La numeración y alineaciones son de acuerdo con Chothia (Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol . 273:927-48). El clon 809 tiene una inserción de 2 codones 5' a CDRHl, lo cual se traduce probablemente en un asa CDR extendida. El clon 831 tiene una supresión de codón en la posición 31 en CDRHl. La columna "Ag" indica el antígeno asociado a RSV reconocido por el anticuerpo producido del clon nombrado, como se determina por ELISA, FLISA y/o Biacore. "+" Indica que el clon se une a partículas de RSV y/o células infectadas con RSV, pero que el antígeno no ha sido identificado. La columna "Epítope" indica el sitio antigénico o epítope reconocido por el anticuerpo producido a partir del clon nombrado (véase tabla 4 y abajo) . "U" indica que el epítope es desconocido. UCI y UCII se refieren a grupo I y II desconocidos. Los anticuerpos que pertenecen a estos racimos tienen perfiles de reactividad similares pero actualmente no han sido asignados a un epítope particular. Algunos anticuerpos reconocen epítopes complejos, tales como A&C . Los .epítopes indicados en () sólo han sido identificados en ELISA.

Tabla 5 : Resumen de secuencias y especificidad cada clon validado único CDRB3 Gen .CDRLl CDRL2 CDRL3 £pltope IGHV 5 6 9 0 0 2 3 3 5 8 9 9 012abc34567B9012345 234567890abcdefghijV-lanl23 45678901abcdef234 0123456 89012345ab678 ??? YRGNTNYNPSLKS CARDVGYGGGQYFAM ¦ DVW i-11 RASQSVNS- HIA NTFNRVT CQQRSNWPPALTF FURY—DGSTQDYVDSVKG CAKttTOYYGSRSYSVTYYYGH—DVW 1-39 RASQRISN- HLN GASTLQS CQQSYRTPP—INF RTT — FDITNYQKFQG ¡CABRGAV .V5AAEDPYYYGM—OVW 2-28 RSSQSLLHS-NGNNYLO IASNRAS CMQSLQT ETF WINT—SSGGTNYAQKFQG CAREDGTMGTNSWYGWT -DPW 3-20 RASQSVSSS YLA GASSRAT CQQYDSSLSTWTF Yt —GGTTIYYADSVKG CARGLILALPTATVELGAF- DIW 1-39 PASQSITG YLN ATSTLQS CQQSYNT LTF WINA—YNDNTYYSPSLQG CARSYBSQTDILTGRYKGPGtWFDNM 1-12 RASEGISS WIA AASTLQS CQQTNSFP—TF YIF HSGTTYY PSLKS CARDVDDFPVWGMNRYL ' ALW 3-20 RASQSVSSS YLA GASTCAT CQQYGRTP—YTF IISY—DGNNVHYAOSVG CAKDDVATDIAAYYYF DVW 2-29 RSSQSLLRS-DGKTFLY EVSSRFS CMQGLKIR—TF jWISA—DNGNTYYAQNFQD CVRGGVVraRVYYYYGM— DVW 1-9 RASQGISS YLA AASTLQS CQQVDTYP—LTF ?G?G—NTGDPAYAQOFTG 'CAWFGEFGLP DYW 1-16 RASQDINN YLA AASSLQS CQQYKSLP—FTF VlS —DGRNKYFADSVKG CARGSVQWLHLGLF DNW 1-5 RASQSVSS WVA EAS LES CQQYHSYSG-YTF VI H—OGSNKNYLDSVKG [CARTPYEFWSGYYF ¦ DFW 1D-13 RASQGITD— -SLA AASRLES CQQYSKSP—ATF VIYY—EGSNEYYADSVKG CARKWLGM ¦ ¦ DFW 2-28 RSSQSLLNS-NGFNYVD LGSNRAS CMQALET —LTF YIGT—GGSDIYYGOSVKG ICARARPGYICV = OFW 1-9 RASQGISS YIA VAStLES CQQSKSFP—PtF ??? SSGSTFVNASLKS CARGGTLYTTGGEH ' ?G» 3-20 RASQTVSSS YLV GASTRAT CQQYGGSG—LTF ATST—OGGSYYADSIiKG CARRFWGFGNFF DYW 3-20 RASQSVSSG YLA GASGRAT CQQYFGSP—YTF Y1Y YRGSTYYNESLKS CAREGRHSGSGOYYSFF DYW 1-39 RASQGINT YLN AASSLQS CQQSANSP—HTF ÍVYP—GDSDTTYSPSFQG CVRRGGFCTATGCYAGHKF DPW 3-20 RASQSISSG—¦ YLA GASKRAT CQQYGSSL—WTF RID WDDDKYYSTSLKT CARIVFHTSGGYYNPYM DVW 1-39 RASQTIAS YLS TASSLQS CQHSYirtP—YTF ?G??—ADSDTRYSPSFQG CARPAYDSGWHF ——EHW 3D-15 RASQSVGS KLA GASTRAT |CQQYNHWFP—YTF RIIP—VFOTTNYAQKFQG CLRGSTRGWDtDGF- -DIW 1D-17 RASQGISN- YLV AASSLQS ICLQHNISP—YTF V¾JP—NGGSTTSAQKFQD CARQRSVTGGFDAtfLLIEDAS—NfB 4-1 RSSETVLYTSKKQSYLA WASTRES CQQFFRSP—ETF MILP—ISGTTNY&QTFQS CARVFREFSTSTLDPYYF DYW 3-20 RASQSVSSS YA AASRRAT CQHYGNSL—FTF ????—GDSDTRNSPSPQG CVRQGGYYDRGYHEKYAF DIW 1-5 RASOSISS— WIA KSSILES CQHYNSYS—GTF VISY—OGAHEYAESVKG tsMS»ssialEBrat(f osw 1-5 RASQSIGS RIA DASSLES CQQYNRDSP-WTF VIRA—SGDSEtYADSVRG CA IGQRRYCSGDBCYGHF DYW 2-28 RSSQSLLHS-DGRYYVD IASNRAS CMQGLHTP—WTF IISL—DGIXTHYADSVKG CAKDHIGGTAYFEWTVPF DSW 3-15 WASQTIGG NIA GASTRAT CQQYNW YTF RIO BDDDKAFRTSLKT CARTQVFASGGYYLYYL DHW 1-39 RASQTIAS YVN AASNLQS CQQSYSYRA-LTF FIY DSGSTYYNPSLRS CARDLGYGGNSYSHSYVYGl. DVW 3-11 RASQSVSS SLA DASYRVT CQQRSNWPPGLTF IIYP—GOSTTTYTPSFQG CARQGRGF GLW 1D-33 QASQDITY YLS DVSNLER CQfYDFLP—TF SIF HSGTTFHPSLKS CARVHGGGF— —DHW 1D-33 QASQDIGD SIN DASNLET CQHYVNLPPSFTF HÍY FGGNTNYKPSWS CARDSSNWPAGY ¦—EDW 10-13 RPSQDISS ALA GASTLDY CQQFNtYP—FTF [«IS —SSGKKYAPKFQG CAKDGGTYVPYSDAF —DFW 4-1 SSQSVLYHSCtHKNYIA IASTREY CQQYYQTP—LTF FFDP—EDGDTGYAOFQG CAÍVAAAGNF— —DMW 1-39 RASQFISS YLH AASTLQS CQQSYTNP—TF LINA—GfcGOTRFSQKFQG CARIAITMVRNPF —DIW 1-5 RASQSIGS WIA KESNLES CQQYKND WtF RIO DDDKFYNTSLQT CARTGIYDSSGYYLYYT DYW 1-39 RASQSIAS YLN AASSLHS CQHSYSTR—FTF BISA—YNGNTYYIÚKLQG CARDRVGGSSSEVLSRAKNYGL-DVW 1-5 RASQSVTS ' EIA KAS3LES CQQYNSFP—YTF SIN —GHGQTKYSQRFQG CARRASQYGEVYGVYF DYW 1-5 RASQNIYR WIA DASTLES CQQYNSLS—PTF AISY—DSSNKQYADSVKG CAKDDFOTSMWFFMSR AFW 1-12 RAQDIDN- •??? GASKLQT CQQAKSFP—FTF tfVSA—HNGNTYYAEKFHD CVRGÍWBQQLVPCLSFWF- DYW 1-12 RASÚGISK- ¦RIA GASSLQH OQQAOSFP—ETF IÍSSV—YNGDTNYAQXFflG CARDBHWLIPAAPFGGK DVW 1-9 RASQGISS- -YLA AASTLQS CQQLHSYP—RTF SIY DSGTYYTPSLKS CARGSPGDAF DIW 1-12 RASQGIGT—' HLA AASRLQS CQQAYSFB—RTF lSY—OGH YYADSVJCG CAAQTPYFNESSGLV ¦ PDW 1-27 RASQGISN YLA AASTLQS CQKYNSAP—QTF Las secuencias de aminoácidos -de arriba a abajo en la columna llamadas CDRHl se muestran en el mismo orden en SEQ ID NOS: 201-285. Las secuencias de aminoácidos de arriba a abajo en la columna llamada CDRH2 se muestran en el mismo orden en SEQ ID NOS: 286-370: Las secuencias de aminoácidos de arriba a abajo en la columna llamada CDRH3 se muestran en el mismo orden en SEO ID Nos: 371-455. Las secuencias de aminoácidos de arriba a abajo en la columna llamada CDRLl se muestran en el mismo orden en SEQ ID Nos: 456-540. Las secuencias de aminoácidos de arriba a abajo en la columna llamada CDRL2 se muestran en el mismo orden en SEQ ID NOS: 541-625. Las secuencias de aminoácidos de arriba abajo en la columna llamada CDRL3 se muestran en el mismo orden en SEQ ID Nos: 626-710. Caracterización de especificidad de antígenos Durante la validación de la especificidad de antígenos de los clones se determinó hasta cierto punto por la unión a partículas virales, proteína G y F soluble así como fragmentos de la proteína -G. Para clones con reactividad anti-F la especificidad de los anticuerpos individuales expresada a partir de los clones fue evaluada más para de esta manera determinar el sitio antigénico y, si es posible, 1 el epí ope unido por los clones individuales {véase ejemplo 1, sección g-4) . La figura 4 ilustra la caracterización de la especificidad de epítope del anticuerpo obtenido del clon 801 usando análisis Biacore. El análisis muestra que <cuando la proteína F es bloqueada por 133-lH o Palivizumab (sitio antigénico C y II, respectivamente) antes de la inyección del anticuerpo 801 en la célula Biacore, se puede detectar un alto grado de unión a anticuerpo 801. La unión de anticuerpo 801 competida se reduce un poco cuando se compara con la unión de anticuerpo 801 no competida. La reducción -es no obstante tan baja que -es más probable que se deba al impedimento -estérico que a la competencia directa por el sitio de unión. El bloqueo de la proteína F -con el anticuerpo 9c5 (sitio antigénico Fl) antes de la inyección del anticuerpo 801 en la célula Biacore muestra una inhibición casi completa de la unión del anticuerpo 801 a la proteína F. Se concluye por lo tanto que el anticuerpo 801 se une a proteína F en el sitio Fl, o muy cerca de éste. Para clones con reactividad anti-G la especificidad ele los anticuerpos individuales expresada a partir de los clones se evaluó más para determinar si -el anticuerpo individual se une al dominio central de la proteína G, a la región conservada, o al GCRR, y también si el epítope se conserva o .es específico de subtipo. Esto se elaboró mediante ELISA y/o FLISA usando los siguientes fragmentos de proteína *G: G(B) : residuo 66-292 de la cepa 18537 -de RSV expresada en células DG44 CHO) G(B) -Fragmento: residuo 127-203 de la -cepa 1S537 de RSV (expresada en E. coli) GCRR A: Residuos 171-187 de la cepa Long de RSV (sintetizada con puentes de cisteína formados selectivamente) GCRR B: Residuos 171-187 de la cepa 18537 de RSV (sintetizada con puentes de cisteína formados selectivamente) G conservada: Residuos 164-176 Análisis de epítopes adicionales también se llevaron a cabo en los clones reactivos a antiH3 mediante ensayos de competencia como los descritos en el ejemplo 1, sección g-4. Además, uno de los clones identificados en un segundo procedimiento de tamizado como el descrito en el ejemplo 1, sección e, produce un anticuerpo específico SH. Además, un número de clones se unen a uno o más de las cepas RSV probadas, pero el antígeno no ha sido determinado. Datos que se refieren a la especificidad -de antígeno para todos los clones validados se resumen en la tabla 5. Ninguno de los clones validados se unen a células epiteliales de laringe humanas, -como tampoco lo hace ninguno de los clones específicos -G probados (793, 816, 835, 841, 853, 855, 856 y 888) se unen a fractalcina humana -(CX3CL1) . Caracterización de cinéti-ca de unión La afinidad de unión para antígenos RSV recombinantes se determinó mediante resonancia plasmó-nica superficial -para un número de clones de anticuerpos. El análisis se llevó a cabo con fragmentos Fab preparados mediante corte enzimático de los anticuerpos de longitud completa. Los datos para un número de clones de anticuerpo de alta afinidad con valores ¾ en el intervalo picomolar a nanomolar se presentan en la tabla 6. Los fragmentos Fab derivados de Palivizumab disponible comercialmente {Synagis) se analizaron similarmente para referencia. Tabla 6 Constantes de unión cinética y afinidades de clones seleccionados Generación de un banco -celular de clones que expresan un anticuerpo individual Un subconjunto de 47 pares de codificación VH y VL cognados únicos que corresponden a los clones nos. 735, 736, 744, 793, 795, 796, 799, 800, 801, 804, 810, 811, 812, 814, 816, 817, 818, 819, 824, 825, 827, 828, 829, 830, 831, 835, 838, 841, 853, 855, 856, 857, 858, 859, 861, 863, 868, 870, 871, 880, 881, 884, 885, 886, 888, 894 y 955 en la tabla 5 se seleccionaron para la generación -de lineas de células de expresión individual estables que expresan cada una un anticuerpo único a partir de una sola secuencia génica VH y VL. Las secuencias completas {ADN y aminoácidos deducida) de 44 clones seleccionados (los identificados arriba excepto 828, 885 y 955) se muestran en SEQ ID NOS: 1-176. Los 44 clones son caracterizados al producir las siguientes secuencias VH, las cuales son como las mostradas en SEQ ID NOS: 1-44: Clon . No.735: QVQLQESGPGLVKPSEfTL5LTCTVSNGAIGDYDWSWIROSPG GLEWIGNINY GNTNYNPSLKS VTM SLRT^MQFS LSSATAADTA\A CAROVGY^QYFA DVWSPGTTVTVSS Clon No.736: QVQLVESGGGWQPGGSLRL5CTASGF FSTYG HWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSTQDYVDSVKGRF TISRDNSKNMVWQMNSLRVEDTAVYYCA DMDYYGSRSYSVTY^ Clon , No.744: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSGYYMHWVRQAPGQGLEW GWINTSSGGTNYAQ FQG RNTTMTRDTSIíTrAHMELRRLRSDDTAVYYC^REDGTMGTNSWñ'GWFDPWGQGTLVTVSS Clon No.793: QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC SGFPFGDYYMSWIRQAPG GLEWVAYINRGGTnYYADSVKGRFT ISRDNAKNSU^QMNSLRAGDTALYYCARGUU\LP ATVELGAFDIWGQGTMVTVSS Clon No.795: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCWSGASISSGDYYWSWIRQSPRKGLEWIGYIFHSGTTYYNPSL SRAV ISLDTS NQFSLRLTSVTAADTANAYCARDVDDFPVWGMNRYLALWGRGTLVTVSS Clon No.796: QVQLVESGGGWQPGRSLRISCAASGFSFSHFGMHWVRQVPGKGLEWVAIISYDGNNVHYADSVKGRF TISRDNSKNTLFLQMNSLROOD GVYYCA DDVATOLAAYYYFDVWGRGTLVTVSS 1 7 Clon No. 799: QVQLVESGGGVVQPG SLKLSCEASGFNFNNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYOGRNKYFADSV GR FIISRODSRNTVFLQMNSLRVEDTAVYYCARGSVQVWUHLGLFDNWGQG LVTVSS Clon No. 800: QVQLV£SGGAVVQPGRSLRLSCEVSGFSFSDYGMNWVRQGPGKGLEWVAVIWHDGSNKNYLDSV GR FTVSRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTA\^CARTPY£FWSGYYFOFWGQGTLVTVSS Clon No. 801: QVQLV£SGGGVVQPGRSU¾LSCMSGFPFNSYAMHWVR 5APGKGLEWVAVIYYeGSNEYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCAR WLG DFWGQGTLV VSS Clon No. 804: EVQLVESGGGLVRPGGSLRL^SASGFTFSNYAMHWVR JAPGKRLEYVSATSTOGGSTYYADSLK<-TfT ISRDNS NTLYLQMSSL5TEDTAIYYCARRFWGFGNF DYWGRG1TLVTVSS Clon- No. 810: QVQLV(^GAEVKKSGSSV VSCRASGGTreNYAINVWRQAPGQGLEWVGRIIPVFDTTNYAQKfQGRV TITADRSTNTAIMQLSSLRPQDTA YYCLRGSTRGWDTDGFDIWGQGTMVTVSS Clon No. 811: QVQLVQSGAWETPGASV VSCKASGYIFGNYYIHWVRQAPGQGLEWMAVINPNGGSTTSAQKFQDRI TWRDTSTTTWLEVDNLRSEDTATYYC^RQRSVTOGFDAWLLIPDASNTWGQGTMVTVSS Clon No. 812: QVQLVQSGAEM KPGSSVKVSCKASGGSFSSYSISWVRQAPGRGLEWVGMILPISGTTNYAQTFQGRVI ISADTSTSTAY ELTSLTSEDTAVYFCARVFREFSTSTLOPYYFDYWGQGTLV7VSS Clon No. 814: QVQLVESGGGWQPG SVRLSCVGSGFRLMDYAMHWVRQAPG GLDWVAVISYCX5ANEYYAESV GR FTVSRDNSDNTLYLQM SLRAEDTAVYFCARAGRSSMNEEVIMYFDNWGLGTLVTTVSS Clon No. 816: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSTYAMT VRQAPGKGL-EWVSVIRASGDSEIYADSVRGRI ISRDNS NTVFLQMDSUlVEDTAVYFCANIGQRRYCSGDHCYGHfDYWGQGTLVTVSS Clon No. 817: QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFGFNTHGMHWVRQAPG GLE LSIISLDGIKTHYAOSVKGRF SRDNSKNTVFLQLSGLRreDTAVYYCAKDHIGGTNAYF£V\nVPFDGWGQGTLVTVSS Clon No. 818: QVTLR€SGPAVV PTETLTLT<¾FSGFSLNAGRVGVSWIRQPF<3QAPEWLARIDWDDDI<AFRTSLI<TR1S IS DSSKNQWLTLSNMDPADTATYYCARTQVFASGGYYLYYLDHWGQGTLVTVSS Clon.. No.819: QVQLQESGPGLV PSQTI^LTCTVSSGAISGADYYWSWIRQPPGKGLEWVG YDSGSTYYNPSLRSRV TISIDTSKKQFSLKLTSVTAADTAVYYCARDLGYGGNSYSHSYYYGLOVWGRGT TVSS Clon. No.824: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGNnV^WIRQPPG GLEWIGHIYFGGNTNYNPSLQSRVTlS VDTSRNQFSLKLNSVT DTAVYYCARDSSNWPAGYEOWGQGTLVTVSS Clon No.825: QVQLVQSGAEVK PGASVKVSC VSGYTFTSNGLSWVRQAPGQGFEWLGWiSASSGN YAPKFQGR LTTDISTSTAYMEUlSLRSDDTAVYYCAKDGGTWPYSDAFDFV^QGTMVm/SS i Clon No.827: QVQLVQSGAEV PGASVKVSCRVSGHTFTALS HWMRQGPGGGLEWMGFFDPEDGDTGYAQKFQGR VTMTEDTATGTAYMELSSLTSDDTAVYYCATVAAAGNFDNWGQGTLVTVSS Clon No.829: QVTLKESGPALVKATQTLTLTCTFSGFSLSRNRMSVSWIRQPTOKALEWLARÍDWDDDKFYNTSLQTRLT ¡ IS DTSKNQVVLT TNMDPVDTATYYCARTGIYDSSGYYLYYFDYWGQGTLVTVSS Clon: No.830: QVQL QSGAE KVPGASVK SCI<ASGYTFG?G SW RQAPG(^LEWMGWISAY^ 5N r?.Q ^-QGR WMTTDTSTSTAYMELRGLRSDDTAMYYCARDRVGGS SEVL^RA NYGLDVWGQGTTVTVSS Clon; No.831: i QVQLVQSGAEV PGASVKVSCKASANIFTYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINVGNGQT YSQRFQGRV TITRDTSATTAY EI-STLRSEDTAVYYCARRASQYGEVYGNYFDYWGQGTLVTVSS Clon No.835: QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSC ASGYTFISYGFSWVRQAPGQGLeWMGWSSVYNGDTNYAQ FHGR VNMTTDTSTNTAYMELRGLRSDDTAVYFCARORNWLLPAAPFGGMDVWGQGTMVTVSS Clon No.838: QVQLVESGGGWQPGTSLRLSOVASGFTFSTFGMHWVRQAPG GLEWVAVISYOGNKKYYADSVKGRF ?SRD S TLYLQV SLR EDTAVYYCAAQTPYFNeSSGL PDWGQGTLVT SS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT ISFGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTDYAQRLQORV RDTATSTAYLELRSU<SDOTAVYY rRDES LRGVTEGFGPrDYW3QGTL\m¾S Clon No.853: EVQLVQSGAEVKKPGQSL ISCKTSGYIFTNYWIGVVVRQRPGI GLEWMGVIFPADSDARYSPSFQGQVT ISADKSIGTAYLQWSSLKASDTAIYYCARPKYYFDSSGQFSEMYYfDFWGQGTLVTVSS Clon- No. 855: QVQLVQSGPEVKKPGASV VSCKASGYVLTNYAFSWVRQAPGQGLEWLGWISGSNGNTYYAEKfQGRV TMTTOTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCARDLLRSTYFDYWGQGTLVTVSS Clon No. 856: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC ASGYTFSNYGFSWVRQAPGRGLEW GWISAYNGNTYYAQNL-CJGR VT TTDTSTTTAYMVLRSLRSDDTAMYYCARDGNTAGVD WSRDGFDIWGQGTMVTVSS Clon No. 857: EVQLL£SGGGLVQPGGPLRL5C^ASGFSFSSYAMNWIRLAPG GLEWVSGISGSGGSTYYGOSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVmCA EPWIDIWASVISPmDGMDVWGQGTTVTVSS Clon No. 858: QVQLVQSGAEV KPGSSVKVSCKASGGSFDGYTISWLRQAPGQGLEWMGRWPTLGFPNYAQKFQGRV TVTADRSTNTAYLEI^RLTSEDTAVYYCARMNLGSHSGRPGFDMWGQGTLVTVSS Clon No. 859: QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAVSGSSFSKYGIHWVRQAPG GLEWVAVISYOGSKKYFTDSV GRF TIARDNSQNTVFLQ NSLRAEDTAVYYC^TGGGVNVTSWSOVEHSSSLGYWGLGTLVTVSS Clon No. 861: QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVARWNDGSN YYADSV GR mSRDNSK^LYLQMNSLRAEDTAN^ O DEVYOSS YYLYYFOSWGQGTLVTVSS Clon No. 863: EVQLLESGGGLVQPGGSUlLSCAASGFTFSSYT SWVRQAPG GLEWVSSISASTVL YYADSVKGRFn SRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAKDYDFWSGYPGGQYWFFOLWGRGTLVTVSS Clon No. 868: QVQLQESGPGLVTPSETLSVTCTVSNYSIONAYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIHHSGSAYYNSSLKSRA SIDTSKNQFSLNLRSVTAADTAVYYCARDTILTFGEPHWFDPWGQGTLVTVSS Clon : No. 870: QVQLQESGPGLV PSETL5LTCTVSGDSISNYYWSWIRQPPGKGLEWIGEISNTWSTNYNPSLKSRVTIS LDMP NQLSLKL5SVTAADTAVYYCARGLFYDSGGYYLFYFQH GQGTLVTVSS Clon No. 871 : QVQLVESGG 3WQPGRSLRVSCAASGFTFSNYGMHWVRQAP-3KGLEWVAVIWYDDSNKQYGDSVKG RFTISRDNS STLYLQMDRU¾VEDTAVYYCARASEYSISWRHRGVLDYWGQGTLVTVSS Clon No. 880: QITLKESGPTLVRPTQTLTLTCTFSGFSLSTS LGVGWIRQPPG ALEWLALVDWDDDRRYRPSL SRLTV T DTS NQWLTMTN DPVDTATYYCAHSAYYTSSGYYLQYFHHWGPGTLVTVSS Clon No. 881 : EVQLVESGGGWQPGGSL LSCEVSGFTFNSVEMT V QAPG GLEWVSHIGNSGSMIYYADSV G F TISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCARSDYYDSSGYYLLYLDSWGHGTLVTVSS Clon No. 884: QVQLVQSGAEVR PGASV VSCKASGHTnNFA HWVRQAPGQGLEWMGYINAVNGNTQYSQ fQGR VTFTRDTSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNNGGSAIIFYYWGQGTLVTVSS Clon No. 886: QVQLVESGGG VQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISNDGSN YYAOSV GR F ISRDNSKKTMYLQMNSLRAEDTAWFCAKTTDQRU.VDWFDPWGQGTLVTV5S Clon No. 888: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTASGGSINSSNFYWGWIRQPPGKGLEWIGSI ^SGTTYYNPSLKSRVTI SVDTSKNQFSL I^PVTAADTAWHCARHGFRYCNNGVCSINUDAFDIWGQGTMVTVSS Clon No. 894: QVQLVESGGGWQPGKSLRLSCAASGFRFSDYGMH WRQAPS Gl-EWVAVI HOGSNrRYAOSVRGR FSISRDNSKNTLYLQMNSMRADDTAFYYCARVPFQIWSGLYFDHWGQGTLVTVSS •Estas secuencias de aminoácidos VH están en los clones codificados por las siguientes secuencias de áci-do nucleico, las cuales también se muestran en SEQ ID Nos 45-88: Clon No. 735: caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaag<xttcggagacc tgtcc< acgtgcartgtgtctaatggcgccatc ggcgactacgactggagctggattcgtcagtc ccagggaagggactggagtggattgggaacataaattacagagggaa acc aactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatgtccctacgcacgtccacgatgcagttctcGCtgaagctgagctctgcgaccg ctgcggacacggccgtctattactgtgcgagagatgtaggctacggtggcgggcagtatttegcgatggacgtctggagcccaggg accacggtcaccgtctcgagt Clon No. 736: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtacagcgtctggattcaccttc agtacctatggcatgcactgggtccgccaggctcccggcaaggggctggaatgggtggcatttatacggtatgatggaagtac ca agactatgtagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaatatggtgtatgtgcagatgaacagcctgag agttgaggacacggctgtc attactgtgcgaaagacatggattac atggtt gcggag tat ctgtcacc actactacggaatgg acgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt Clon No. 744: caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttc agcggctattatatgcactgggtgcgacaggoccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaacactag agtggtggcac aaactatgcgcagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtecatcagcacagcccacatggaac gaggaggctg agatctgacgacacgg xgtgtattattgtgcgagagaggacggcaccatgggtactaatagttggtatgg tggttcgacccctgg ggccagggaacoctggtcaccgtctcgagt Clon No. 793: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcxtggggggtccctgagactrtcctgtgcggaíctggattccccttcg gtgactactacatgagctggatccgccaggctccagggaaggga tggagtgggttgcatacattaatagaggtggcactacca a tactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatc ccagggacaacgccaagaact xrtgtttctgcáaatgaacagcctgaga gccggggacacggccctctattactgtgcgagagggctaattctagcarta cgartgctacggttgagttaggagcttttgatatctg gggccaagggacaatggtcaccgt tcgagt Clon No. 795: caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacaga cctgtccctcacctgcactgtctctggtgcctccatca gcagtggtgattattactggagttggatccgtcagtctccaaggaagggcctggagtggattgggtacatcttccacagtgggacca cgtactacaacccgtccctcaagagtcgagctgtcatctcac±ggacacgtc :aagaaccaa ctccctgaggctgacgtctgtgact gccgcagacacggccgtctattattgtgccagagatgtcgacgattttcccgtttggggtatgaatcgatatc±tgcc tctggggccg gggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 796: caggtgcagctggtggagtctgggggagg :gtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcc ctggattcag ttc agtcactttggcatgcactgggtccgccaggttccaggcaaggggctggagtgggtggcaattatatcatatgatgggaataatgta cactatgccgactccgtaaagggccgattcaccatctccagagacaattx:caagaacacgctg ttctgcaaatgaacagcctgaga gatgacgacacgggtgtgtattactgtgcgaaggacgacgtggcgacagatttggctgcctactactact cgatgtc±ggggccgt ggcaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 799: ' caggtgcagctggtggagtctgggggcggcgtggtccagcctgggaggtccctgaaactctcttgtgaagcctctggattcaacttc aataattatggcatgcactgggtccgccaggcaccaggcaaggggctggagtgggtgg agttatttcatatgacggaagaaataa gtattttgctgactccgtgaagggccgattcatcatctccagagacgattccaggaacacagtgtttctgcaaatgaacagcctgcga gttgaagatacggccgtctattactgtgcgagaggcagcgtacaagt tggctacatttgggactttttgacaactggggccaggga accctggtcaccgtctcgagt Clor, No. 800: caggtgcagrtggtggagtctgggggagccgtggtccagcctgggaggtc ctgagactctec gtgaagtgtctggattcagtttc agtgactatggcátgaactgggtccgocagggtc aggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggcatgacggaagtaata aaaa tatctagactccgtgaagggccgattcaccgtctccagagacaattccaagaacacattgtttc gcaaatgaacagcctgag agccgaagacacggctgtatattactgtgcgaggacgccttacgagttttggagtggctat actttgacttctggggccagggaacc ctggtcaccgtctcgagt Clon No. 801: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtctagcrtgggaggtecctgagactctcrtgtg agcgtctggattccccttc aatagctatgccatgcactgggtccgccaggc ccaggcaaggggctggagtgggtggcagtgatatattatgaagggagtaatga atattatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacactctgtatttgcaaatggatagcctgaga gccgaggacacggctgtctattactgtgcgaggaagtggctggggatggacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgag Clon No. 804: gaggtgcagctggtggagtctgggggaggrttggtccggcctggggggtccctgagacto.^^ gtaactatgctatgcactgggtccgccaggctccagggaagagactggaatatgtftcagctactagtactgatggggggagcacat actacgcagactccctaaagggcacattcaccatctccagagacaattccaagaacacac gtatcttcaaatgagcagtctca^tac tgaggacacggctattta tactgcgcccgccgattctggggatttggaaact t ttgactactggggccggggaacectggtcaccg tctcgagt Clon No. 810: caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagtccgggtcctcggtgaaggtctectgcagggcttctggaggcaccttc ggcaattatgctatcaactgggtgcgacaggcGCctggacaagggcttgagtgggtgggaaggateatccctgtctttgatacaaca aactacgcacagaagttccagggcagagtcacga accgcggacaga ccacaaaca agccateatgcaactgagcagtc gc gacctcaggacacggccatgtattattgtttgagaggttccacccgtgg tgggatactgatggt tgatatctggggccaagggac aatggtcaccgtctcgagt Clon No. 811 : caggttcagctggtgcagtctggggctgtcgtggagacgcctggggcctcagtgaaggtóEctgcaaggcatctggatacatcttc ggcaactactatatccactgggtgcggcaggctxctggacaagggcttgagtggatgg agttatcaatcccaatggtggtagcac aacttccgcacagaag tccaagacagaatcaccgtgaccagggacacgtccacgaccactgtcta ttggaggt gacaacctgag atctgaggacacggccacatattattgtgcgagacagagatctgtaacagggggctttgacgcgtggctt taatcccagatgc tct aatacctggggccaggggacaatggtcaccgtcbcgagt Clon No. 812: caggtgcagctggtgcagtc ggggctgagatgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggctc ttc agcagctattctatcagrtgggtgcgacaggccK±ggacgagggcttgagtgggtgggaatgat<x*gcc atetetgg acaaca aactacgcacagacatttcagggcagagtcatcattagcgcggacacatccacgagca agcctacatggagctgaccagcctcac atctgaagacacggccgtgtatttctgtgcgagagtctttagagaatttagcacctcgaccrttgacxcetacta tttgactactgggg ccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon- No. 814: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccag^ctgggaagtccgtgagacíctcctgtgtaggct tggcttcagg ic atggactatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggactggattgggtggcagttatttcatatgatggagc aatgaa tactacgcagagtccgtgaagggccgattcaocgtctccagaga aat cagacaacactctgtatctacaaatgaagagcctgaga gctgaggacacggctgtgtatt rtgtgcgagagcgggccgttect ¾atgaatgaagaagttattatgta£tttgacaactggggcct gggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 816: gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtccagcrtggggggtecctgagact^ gtacctacgccatgacctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagtcattcgtgctagtggtgatagtgaaa tctacgcagartccgtgaggggccggttcaaatctccagagacaattecaagaacacggtgtttetgcaaatggacagcctgagag tcgaggacacggcxgtatatttctgtgcgaatataggc^gcgtcggtattgtagtggtgatcactgctacggacactttgactactgg ggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 817: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccaacctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcggcttc aacacccatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtggctgtcaattatctcacttgatgggattaagacc cactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacggtgtttctacaattgagtggcctgaga cctgaagacacggctgtata tactgtgcgaaagatcatattggggggacgaacgcata tttgaatggacagtcccgtttgacggct ggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 818: caggtcaccttgagggagtctggtccagcggtggtgaagcccacagaaacgctcactctgacctgcgccttctctgggttctcactca acgccggtagagtgggtgtgagttggatccgtcagcccccagggcaggccccggaatggcttgcacgcattga tgggatgatgat aaagcgttccgcacatctctgaagaccagactcagcatc ccaaggactcctccaaaaaccaggtggtccttacactgagcaacatg gaccctgcggacacagccacatattactgtgcccggacacaggtcttcgcaagtggaggctactacttgtactaccttgaccactggg gccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 819: caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactgtctctagtggcgccatc agtggtgctgattactactggagttggatccgccagcccccagggaagggcctggagtgggttgggttcatctatgacagtgggagc acctactacaacccgtccctcaggagtcgagtgaccatatcaatagacacgtccaagaagcagttctccctgaagctgacctctgtga ctgccgcagacacggccgtgtattactgtgccagagatctaggctacggtggtaactcttactcccactcctactactacggtttggac gtctggggccgagggaccacggtcaccgtctcgagt Clon No. 824: caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatc ggaaattactactggggctggatccggcagcccccagggaagggacttgagtggattgggcatatctacttcggtggcaacaccaa ctacaaccc tccctccagagtcgagtcaccatttcagtcgacacgtccaggaaccagttctccctgaagttgaactctgtgaccgccg cggacacggccgtgtattactgtgcgagggatagcagcaactggcccgcaggctatgaggactggggccagggaaccctggtcac cgtctcgagt Clon No. 825: caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttctggttacaccttta ccagtaatggtctcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggtttgagtggctgggatggatcagcgctagtagtggaaacaa aaagtatgccccgaaattccagggaagagtcaccttgaccacagacatttccacgagcacagcctacatggaactgaggagtctga gatctgacgatacggccgtatattactgtgcgaaagatgggggcacctacgtgccctattctgatgcctttgatttctggggccaggg gacaatggtcaccgtctcgagt Clon No. 827: caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcagggtt ccggacacactttc actgcattatccaaacactggatgcgacagggtcctggaggagggcttgagtggatgggattttttgatcctgaagatggtgacaca ggctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacagccacaggcacagcctacatggagctgagcagcctg acatctgacgacacggccgtatattattgtgcaacagtagcggcagctggaaactttgacaactggggccagggaaccctggtcac cgtctcgagt Clon No. 829: caggtcaccttgaaggagtctggtcrtgcgctggtgaaagccacacagaccctgacactgacctgcaccttctctgggttttcactcag taggaatagaatgagtgtgagctggatccgtcagcccccagggaaggccctggagtggcttgcacgcattgattgggatgatgata aattc acaacacatctctgcagaccaggctcaccatctccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatgg accctgtggacacagccacctattactgcgcacggactgggatatatgatagtagtggttattacctctactactttgactactggggc cagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 830 : caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaaggtgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacaccttta ccacttacggtgtcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggttggatcagcgcttacaatggtaacacat actatctacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgcggggcctgag gtctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatcgtgttgggggcagctcgtccgaggttctatcgcgggccaaaaactacgg tttggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt Clon No. 831 : caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagttaaggtttcctgcaaggcttctgcaaacatcttca cttatgcaatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcaacgttggcaatggtcagacaaaa tattcacagaggttccagggcagagtcaccattaccagggacacgtccgcgactacagcctacatggagctgagcaccctgagatct gaggacacggctgtgtattac gtgcgaggcgtgcgagccaatatggggaggtctatggcaactactttgactactggggccaggg aaccctggtcaccgtctcgagt Clon' No. 835 : caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaggcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttcaggttacaccttt atcagctatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggagcagcgtttacaatggtgacac aaactatgcacagaagttccacggcagagtcaacatgacgac gacacatcgacgaacacggcctacatggaactcaggggcctg agatctgacgacacggccgtgta ttctgtgcgagggatcgcaatgttgttctacttccagctgctccttttggaggtatggacgtctgg ggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt Clon No. 838: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagccggggacttccctgagactctcctgtgcagcct tggattcaccttca gtacgtttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaaataagaaa tactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaagtgaacagcctgaga gtcgaggacacggctgtgtattactgtgcggcccaaactccatatttcaatgagagcagtgggttagtgccggactggggccagggc accctggtcaccgtctcgagt Clon No. 841 : caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacaccttt atcagttttggcatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggacttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacac agactatgcacagaggctccaggacagagtcaccatgactagagacacagccacgagcacagcctac tggagctgaggagcctg aaatctgacgacacggccgtgtactattgcactagagacgagtcgatgcttcggggagttactgaaggattcggacccattgactac tggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 853 : gaagtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagccggggcagtctctgaagatctcctgtaaga ttctggatacatcttt accaactactggatcggctgggtgcgccagaggcccgggaaaggcctggagtggatgggggtcatctttcctgctgactctgatgcc agatacagcccgtcgttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcggtactgcctacctgcagtggagtagcctgaag gcctcggacaccgccatatattactgtgcgagaccgaaatattact tgatagtagtgggcaattrtccgagatgtactactttgacttc tggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 855 : caggttcagctggtgcagtctggacctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttatgtgttga ccaactatgccttcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggctgggatggatcagcggctccaatggtaacaca tactatgcagagaagttccagggccgagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagtctga gatctgacgacacggccgtttatttctgtgcgagagatcttctgcggtccacttactttgactactggggccagggaaccctggtcacc gtctcgagt Clon No. 856: caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttc ggttacacc ttt ccaactacggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacaca tactatgcacagaacctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgaccacagcctacatggtactgaggagcctgag atctgacgacacggccatgtattactgtgcgagagatggaaatacagcaggggttgatatgtggtcgcgtgatggttttgatatctgg ggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt Clon No. 857: gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggcccctgaggctctcctgtgtagcctctggattcagc tta gcagctatgccatgaactggatccgcctggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggtattagtggtagcggtggtagcactt actacggagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgc gtatctgcaaatgaacagcc gaga gccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagagccgtggatcgatatagtagtggcatctgttatatccccctactactacgacg gaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt Clon No. 858 : caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcctctggaggatccttc gacggctacactatcagctggctgcgacaggcccctggacaggggcttgagtggatgggaagggtcgtccctacacttggttttcca aactacgcacagaagttccaaggcagagtcaccgttaccgcggacagatccaccaacacagcctacttggaattgagcagactgac atctgaagacacggccgtatat±actgtgcgaggatgaatctcggatcgcatagcgggcgccccgggttcgacatgtggggccaag gaaccctggtcaccgtctcgagt Clon · No. 859 : caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccttgagactctcctgtgcagtgtctggatccagcttc agtaaatatggcatacactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcgtatgatggaagtaaaa agtatttcacagactccgtgaagggccgattcaccatcgccagagacaattcccagaacacggtttttctgcaaatgaacagcctga gagccgaggacacggctgtctattactgtgcgacaggagggggtgttaatgtcacctcgtggtccgacgtagagcactcgtcgtcctt aggctactggggcctgggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 861 : caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttc agtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcatttatatggaatgatggaagtaataa atactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgag agctgaggacacggctgtgtattactgtgtgaaagatgaggtctatgatagtagtggttattacctgtactactttgactcttggggcc agggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 863 : gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacgttta gctcctataccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaagtattagtgctagtactgttctcacata ctacgcagactccgtgaagggccgcttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgagtagcctgagagc cgaggacacggccgtatattactgtgcgaaagattacgatttttggagtggctatcccgggggacagtactggttcttcgatctctgg ggccgtggcaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 868 : caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgacgccttcggagaccctgtccgtcacttgcactgtctctaattattccatcg acaatgcttactactggggctggatccggcagcccccagggaagggtctggagtggataggcagtatccatcatagtgggagcgcc tactacaattcgtccctcaagagtcgagccaccatatctatagacacgtccaagaaccaattc cg tgaacctgaggtctgtgaccgc cgcagacacggccgtatattactgtgcgcgcgataccatcctcacgttcggggagccccactggttcgacccctggggccagggaac cctggtcaccgtctcgagt Clon No. 870 : caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccttgtccctcacctgcactgtctcaggtgactccatc agtaattactactggagttggatccggcagcccccagggaagggactggagtggattggagaaatatctaacacttggagcaccaa ttacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatctc±agacatgcccaagaaccagttgtccctgaagctgagctctgtgaccgctg cggacacggccgtatattactgtgcgagagggcttttctatgacagtggtggttactacttgttttacttccaacactggggccagggc accctggtcaccgtctcgagt Clon No. 871 : caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagagtctcctgtgcagcgtctggattcaccttc agtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatgacagtaataa acagtatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagagtacgctgtatctgcaaatggacagactga gagtcgaggacacggctgtgtat±attgtgcgagagcctccgagtatagtatcagctggcgacacaggggggtccttgactactggg gccagggaaccctggtcaccgtctcgagt cion¡ No. 880 : cagatcaccttgaaggagtctggtcctacgctggtgagacccacacagaccctcacactgacctgcaccttctctgggttctcactcag cactagtaaactgggtgtgggctggatccgtcagcccccaggaaaggccctggagtggcttgcactcgttgattgggatgatgatag gcgctacaggccatctttgaagagcaggctcaccgtcaccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatgg accctgtggacacagccaca attactgtgcacacagtgcctactatactagtagtggttattaccttcaatacttccatcactggggcc cgggcaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 881 : gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtacagcctggaggctcc tgagactctc tgtgaagtctccggattcaccttc aatagttatgaaatgacctgggtccgccaggccccagggaaggggctggagtgggtttcacacattggtaatagtggttc atgata tactacgctgactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactatatctgcaaatgaacagcctgaga gtcgaggacacggctgtttattactgtgcgaggtcagattactatgatagtagtggttattatctcctctacttagactcctggggccat ggaaccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 884: caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaggaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcttctggacatactttc attaactttgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaggggcttgagtggatgggatacatcaacgctgtcaatggtaacaca cagtattcacagaagttccagggcagagtcacctttacgagggacacatccgcgaacacagcctacatggagctgagcagcctgag atctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagaaacaatgggggctctgctatcattttttactactggggccagggaaccctggtc accgtctcgagt Clon No. 886: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcagcttc agtagc±atggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcaaatgatggaagtaataa atactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaaaacgatgtatctgcaaatgaacagcctgag agctgaggacacggctgtgtatttctgtgcgaagacaacagaccagcggctattagtggactggttcgacccctggggccagggaa ccctggtcaccgtctcgagt Clon No. 888: cagctgcagctgcaggagtcgggcccagga tggtgaagccatcggagaccctgtccctcacctgcactgcctctggtggctccatc aacagtagtaatttctactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatcttttatagtgggacc aceta ctacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagccctgtga ccgccgcagacacggctgtctatcactgtgcgagacatggcttccggtattgtaataatggtgtatgc±ctataaatctcgatgcttttg atatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt Clon. No.894: caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtcgtccagcctggaaagtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcagattc agtgactacggcatgcactgggtccggcaggctccaagcaaggggctggagtgggtggcagttatctggcatgacggaagtaata taaggtatgcagactccgtgaggggccgattttccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatttgcaaatgaacagcatga gagccgacgacacggctttttattattgtgcgagagtcccgttccagatttggagtggtctttattttgaccactggggccagggaacc ctggtcaccgtctcgagt En los mismos clones, las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras (es decir, cadenas ligeras que incluyen regiones constantes y variables) tienen las siguientes secuencias de aminoácidos, las cuales se muestran también en SEQ ID NOs: 89-132: Clon No. 735: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNSHLAWYQQKPGQAPRLLIYNTFNRVTGIPARFSGSGSGTDF TmSSLATEDFGVYYCQQRSNWPPALTFGGGT VEI RTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTAS VCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYtKHKVYA fcV i HyüLSS V i ^|-(M RGEC Clon No. 736: D1Q TQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQRISNHLNWYQQKPG APKLLIFGASTLQSGAPSRFSGSGSGT DFTLTITNVQPDDFATYYCQQSYRTPPINFGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREA VQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVT SF NRGEC Clon No. 744: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT D FTLTI S RLEPEDFAVYYCQQYDSSLSTWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQL SGTASWCLLN N F YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC Clon No. 793 : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQS-TGYLNWYQQKPGKAP LLIYATSTLQSEVPSRFSGSGSGTD FTmSSLQPEDFATYYCQQSYNTLTFGGGT VEIKRTVAAPSVnFPPSDEQL SGTAS VCLLNNFYPRE AIWQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE H VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC Clon No. 795: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIHGASTGATGTPDRFSGSGSGT DFTmSTLEPEDFAVYYCQQYGRTPYTFGQGTKLEN RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS ADYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No. 796: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLRSDG TFLYWYLQKPGQSPQPL YEVSSRFSGVPDRFSGS GSGADFTLNISRVETEDVGIYYC QGUORRTFGPGT VEI RTVAAP^ NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC Clon No. 799: DIQMTQSPSTLSASVGDRVT SCRASQSVSSWVAWYQQKPG APKLUSEASNLESGVPSRFSGSGSGT EFTL?SSLQPEDFATYYCQQYHSYSGYTFGQGT LEIKR AAPSV?FPPSDEQLKSGTAS\ VCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC Clon No. 800: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGITDSLAWYQQKPGKAP VLLYAASRLESGVPSRFSGRGSGTD FTL?SSLQPEDFATYYCQQYSKSPATFGPGTKVEIRRT AA S ?FPPSDEQL SGTAS CLL FYPRE A VQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC Clon , No. 801 : DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGFNYVDWYLQ PGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALETPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC Clon No. 804: EIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSVSSGYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASGRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYFGSPYTFGQGTKLEL RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFN RGEC Clon No. 810 : NIQ TQSPSAMSASVGDRVTTTCRASQGISNYLVWFQQKPGKVPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT EFTmSSLQPEDFATYYCLQHNISPYTFGQGT LETKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR EA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE H VYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC Clon No. 811 : DI MTQSPDSLAVSLGERA? CRSSET LYTS QSYLAWYQQ A QP KLLLYWASTRESGVPARFSG SGSGTDFTLAISSLQAEDVAVYYCQQFFRSPFTFGPGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREA VQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC Clon No. 812 : EIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQSVSSSYIAWYQQKPGQAPRLVIYAASRRATGVPDRFSGSGSAT DFTmSRLEPEDLAVYYCQHYGNSLFTFGPGTKVDV RTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No. 814: DIQ TQSPSTLSASVGDRVnTCRASQSIGSRLAWYQQQPGKAPKFUYDASSLESGVPSRFSGSGSGTE FT^SSLQPEDU\TYYCQQYNRDSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEkHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No. 816: DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGRYYVDWYLQKPGQSPHLL1YL-ASNRASGVPDRFTGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLHTPWTFGQGT VDIKRTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNPi'PREA VQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDS YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC ???· No.817: EIV TQSPATLSASPGERATLSCWASQTIGGNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGVPARFSGSGSGTE FTLAISSLQSEDFAVYYCQQY NWYTFGQGT LEL RTVAAPSV FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR EA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVT SFNR GEC Clon No.818: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQnASYVNWYQQKPGRAPSLLIYAASNLQSGVPPRFSGSGSGTD FTLTISGLQPDDFATYYCQQSYSYRALTFGGGTKVEI RTVAAPSVRFPPSDEQL SGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No.819: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQTPGQAPRLLIYDASYRVTGIPARFSGSGSGIDF TLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPGLTFGGGT VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No.824: AIQLTQSPSSLSASVGDTVTVTCRPSQDISSALAWYQQ PG PP LLIYGASTLDYGVPLRFSGTASGTHF TLTISSLQPEDFATYYCQQFNTYPFTFGPGT VDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSPi'SLSSTLTLS ADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C Clon No.825: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC SSQSVLYNSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIHLASTREYGVPDRFSG SGSGTDFAUISSLQAEDVAVYYCQQYYQTPLTFGQGT VEIKRTVAAPSVF1FPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSPi'SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV T SFNRGEC Clon No.827: DIQMTQSPSSI-AASVGDRVnTCRASQnSSYLHWYQQRPGKAP LL YAASTLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTNPYTFGQGT LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL SGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DST SLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No. 829: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIASYLNWYQQ PG AP LLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTD FTLnSSLQPEOFATYYCQHSYSTRFTFGPGTKVD\/KRJ\'AAPSVFIFPPSDEQU<SGTASVVCLLNNFYPR E^ VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNR GEC Clon No. 830 : DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVTSELAWYQQKPGKAPNFLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTE FTL SSLQPDDFATYYCQQYNSFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST SLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC Clorv No. 831 : DIQMTQSPSTLSASVGDRLTITCRASQNIYNWLAWYQQKPGKAP LLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTE FTLTISSLQPDDFAPrTCQQYNSLSPTFGQGTKVEI RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EA ^QW VDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE HKWACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC Clon No. 835: DIQLTQSPSFLSASLEDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLLDAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEF TLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVDI RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPRE A VQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS ADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC Clon No. 838 : DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVP LLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTD FTmSSLQPEDVATYYCQKYNSAPQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC Clon No. 841 : DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSVLYSSNN NYLAWYQQKPGQPPKLLVYWASTRASGVPDRFS GSGSGTDFTLTLSSLQAEDVAVYYCQQFHSTPRTFGQGT VEI RTVAAPSVRFPPSDEQLKSGTASWC LLNNFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVT SFNRGEC Clon No. 853 : EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQ PGQAPRLLIYGASSRAAG PDRFSGSGSGT DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGNSPLTFGGGTEVEI RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVT SFN RGEC Clon No. 855 : DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQAISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISGLQPEDFATYYCQQADTFPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP R^ VQW VDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE H WACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No.856: DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSNDGNTYLDWYLQ PGQSPQLLIYTFSYRASGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC QRIEFPYTFGQGT LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS ADYE HKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC Clon No.857: DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNEYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYWGSNRASGVPDRFSGS GSGTDFTL ISRVEAEDVGVYYCMQTLQTPRTFGQGT VEI RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC Clon No.858: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQDISNYL WYQQKPGKAP LUFDAT LETGVPTRFIGSGSGTD FTVTITSLQPEDVATYYCQHFANLPYTFGQGT LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPRE AKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDS DSTfSLSSTLTLS ADYE H VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC Clon No.859: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQ PGKVP LLVFAASTLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNSAPLTFGGGTKVEI RTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVT SFN RGEC Clon No.861: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIIASYLNWYQQKPGRAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPIFTFGPGT VNIKRTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQ VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC Clon No.863: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRTSQSVSSYLAWYQQ PGQAPRLUYDASNRATGIPARFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGE C Clon No.868: EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSI NNLAWYQVKPGQAPRLLTSGASARATGIPGRFSGSGSGTD FTLnSSLQSEDIAVYYCQEYNNWPLLTFGGGTKVEIQRTVAAPSVFIFPPSDEQL SGTASVVCLLNNFYP REEA VQW VDNALQSGNSQES\n"EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No. 870: DIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCRASQRIASYLNWYQQKPGRAPKLUFAASSLQSGVPSRFSGSGSGTD FTmSSLQPEDYATYYCQQSYSTPIYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS VCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQES\n-EQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC Clon No. 871 : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDASNLESEVPSRFSGRGSGTD FTFSISSLQPEDIATYFCQQYDNFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLXSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC Clon No. 880 : DIQMTQS SSLAASVGD TGTC ASQ?ASY NWYQQ PG APNLLIYAASSLQSGV S FSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFASYFCQQSYSFPYTFGQGT LDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC Clon No. 881 : DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPG AP LUYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPRLTFGGGTKVDITRTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REA VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Clon No. 884: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQTISVFLNWYQQ PGKAPKLLJYAASSLHSAVPSRFSGSGSGTD FTLnSSLQPEDSATYYCQESFSSSTFGGGTKVEIKRTVAAPSVnFPPSDEQL SGTASWCLLNNFYPRE A VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC Clon No. 886: EIV TQSPATLSVSPGETATLSCRASQSVSSNLAWYQHKPGQAPRLLIHSASTRATGIPARFSGSGSGTE FTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNMWPPWTFGQGTKVEI RTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS ADYEKHIO/YACEVTHQGLSSPVT SF NRGEC Clon · No. 888 : DIVMTQSPLSLPVTPGAPASISCRSSQSLLRTNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSIRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTSITFGQGTRLEI RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC Clon No. 894: EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNNLAWYQQRPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTE FTLnSSLQSEDFAVYYCQQYD WPETFGQGTKVDIKRTVAAPSVnFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYP REAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQDS DSTYSLSSTLTLSKADYEKH VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC Los fragmentos de ácido nucleico que codifican para adena ligera en estos clones tienen las siguientes secuencias e ácido nucleico, las cuales también se proporcionan como SEQ D NOs: 133-176: Clon No 735: gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtccttgtctccaggagaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgtta acagccacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctataatacattcaatagggtcactggcatccc agccagg tcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagccttgcgactgaagattttggcgtttattactgtc agcagcgtagcaactggcctcccgccctcactttcggcggagggaccaaagtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtct tcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc atcccagagaggccaaag tacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctaca gcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagt tacgcctgcgaagtcacccatcagggc tgag ctc cccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt Clon No 736: gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggagacagagtcaccttcacttgccgggccagtcagaggatta gcaaccatttaaattggtatcaacaaaagccagggaaagcccctaaactcctgatc ttggtgcatccactcttcaaagtggggcccc atcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcactaatgtacaacctgacgattttgcaacttactactgtca acagagttacagaactcccccgatcaac tcggccaagggacacgc tggacattaagcgaactgtggctgcaccatc gtcttcatc 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No 888 : gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccctggagcgccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctg cgtactaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctattcgggcc tccggggtccctgacaggttcagtggcagtggctcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttgg ggtttattactgcatgcaatctctacaaacttcgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacgaactgtggctgcacca tctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagagg ccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagca cctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcaggg cctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt Clon No 894: gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctccgggggaaagagccaccctctcctgcagggctagtcagagtgttg gcaacaacttagcctggtaccagcagagacctggccaggctcccagactcctcatctatggtgcgtccaccagggccactggtatcc cagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtc gaggattttgcagtttattactgt cagcagtatgataagtggcctgagacgttcggccaggggaccaaggtggacatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatc ttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctc±gttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtaca gtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaac cccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgc ccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt En todos los 44 clones descritos arriba, los anticuerpos codificados incluyen la misma cadena pesada de IgG constante, la cual tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 178) : SAST GPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT VDKRVEPKSCD THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP PKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEV FNWYVDGVEVHNAKT PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY CKVSNK ALPAPIEKTISKA GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG La secuencia genómica que codifica para esta cadena pesada tiene la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 177): aotqcrtcraccaaaaaccrJtcqatrttcr.rj^^ -a ,r ^qqtqqacaaQflaaattaqtqaqagqccaqcacaqqqaqqqaqqqtqtctqctqqaaqccagqct cagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagtcccagtccagggcagcaaggcaggccccgt tgcctcttcacccggaggcc tctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctgggcaggcacaggctaggtgcccctaaccca ggccc gcacacaaaggggcaggtgctgggctcagac tgccaagagccatatccgggaggaccc gcccctgacctaagcccac cccaaaggccaaactctccactccctcagrtcggacac ttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctc gcagajjccca a^fr^qhnaca-iaagfca aratacccagratqcccaqataaQecaQcccaQQCc cQccrtccaactcaaQacaoQacaQdtQC ^aafarot QaraqflataiaaoararataataccaagacaaaorrQraanaqa ?acaaaapGGnnG †nGG ^qoa? .cagCCgga? ^TirnraQaaQaorrt-i En esta secuencia los exones se indican con doble subrayado. Además, los nucleótidos de codificación de Ser iniciales agt (subrayado negritas) se crean como una consecuencia de la introducción en el vector de expresión digerido con Xhol y de un producto de PCR digerido con Xhol que codifican para el sitio de cadena pesada variable en el vector de expresión de IgG. Los pares de codificación VH y VL descritos arriba fueron seleccionados de acuerdo con la especificidad de unión a varios antigenos y péptidos en ELISA y/o FLISA, mapeo de epitopes, diversidad de antigenos y diversidad de secuencias. Los pares de genes de cognados seleccionados fueron sujetos a reparación de clones (ejemplo 1, sección f) si se identificaban errores. Las construcciones de expresión individuales fueron co-transfectadas con un plásmido de expresión de Flp-recombinasa en la linea de células receptoras CHO-Flpln ( Invitrogen) , seguida por selección de antibiótico de integrantes. Las transíecciones , selección y adaptación a cultivo libre de suero se llevaron a cabo como se describió en el ejemplo 1, sección g-1 y g-2. El cultivo de suspensión libre de suero transfectado establemente adoptó lineas de células de expresión individuales y fueron criopreservadas en varias ampolletas, para generar un banco de células de lineas de células productoras de anticuerpos individuales.

Ejemplo 3 Se han llevado a cabo experimentos de neutralización in vitro tanto con clones de anticuerpo individual como con combinaciones de anticuerpos purificados. Todas las mezclas de anticuerpos descritas abajo están constituidas de un número de anticuerpos anti-RSV individuales de la presente invención, las cuales fueron combinadas en una mezcla usando cantidades iguales de los diferentes anticuerpos. Prueba de anticuerpos individuales Inicialmente , la actividad neutralizante de cada anticuerpo se determinó en el PRNT en presencia de complemento contra las cepas A y B del subtipo de RSV como se describió arriba en el ejemplo 1 sección j-2. Los valores EC50 de un número de los anticuerpos purificados se muestran en la tabla 7. En forma interesante, aunque la mayoría de los anticuerpos anti-F exhibieron individualmente actividad neutralizante de virus, ningún valor EC50 pudo determinarse para la mayoría de los anticuerpos de proteína G anti-RSV, indicando que estos anticuerpos no son capaces de neutralizar la individualidad viral. Los campos en blanco indican que el análisis no se ha llevado a cabo aún. ND indica que un valor N EC5o no pudo ser determinado en el PRNT debido a una actividad neutralizante muy baja o a que carecía de actividad neutralizante.

Tabla 7 Valores EC50 de anticuerpos de proteína F y proteína F anti- RSV purificados contra RSV subtipo A y B Mezclas de anticuerpos anti-F La capacidad de mezclas de anticuerpos F de proteina anti-RSV para neutralizar cepas de RSV de subtipo A y B se comparó con el efecto neutralizante obtenido usando Palivizumab (también un anticuerpo anti-F) . La capacidad de neutralización fue evaluada usando la prueba de microneutralización o la PRNT como la descrita en el ejemplo 1, sección j. En un experimento inicial dos mezclas de anticuerpos anti-F(I) y anti-F(II), que contenían cinco y once anticuerpos anti-F distintos, respectivamente fueron comparadas contra Palivizumab usando la prueba de microneutralización. Anti-F (I) está compuesto de anticuerpos contenidos de clones 810, 818, 819, 825 y 827. Los anticuerpos 810 y 819 se unen al sitio antigénico A/II, los anticuerpos 818 al sitio B/I o Fl, el anticuerpo 825 se une a un epítope complejo que se traslapa con los sitios A y C y el anticuerpo 827 se une a otro epítope complejo (véase tabla 5) . Anti-F (II) está compuesto de anticuerpos obtenidos de los clones 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884 y 894. Anti-F (II) contiene varios aglutinantes a algunos de los sitios antigénicos definidos: los anticuerpos 810, 819 y 863 se unen a A/II, los anticuerpos 800 y 818 se unen a Fl (o B/I), anticuerpos 827 y 825 a los epítopes complejos descritos arriba, anticuerpos 735 y 894 pertenecen a un grupo desconocido e(UC)I, el anticuerpo 880 a UCII y 884 se une a otro epítope desconocido actualmente (véase tabla 5). Como se muestra en las figuras 5A y 5B, ambas composiciones anti-F (I) y F(II) son más potentes que Palivizumab con respecto a la neutralización de cepas de RSV de ambos subtipos.

Las figuras 5A y 5B muestran también que la combinación de cinco anticuerpos (anti-F(I)) parece ser más potente que la combinación de 11 anticuerpos (Anti-F ( I I ) ) . La mezcla anti-F(I) contiene algunos de los anticuerpos neutralizantes individualmente más potentes de las diferentes especificidades de epitope que han sido definidos hasta el momento. La mezcla anti-F(II) contiene los mismos cinco anticuerpos altamente potentes, pero también contiene aglutinantes adicionales a algunos de los epitopes definidos y los anticuerpos incluidos también presentan una gama más amplia de actividad neutralizante de su propia cuenta. Es entonces posible que la actividad de los anticuerpos altamente potentes se diluya en la combinación anti-F(II) debido a la competencia de unión a los epitopes neutralizantes en la proteina F. Sin embargo, ya que potencialmente hay otros efectos que el efecto neutralizante asociados con cada anticuerpo individual, por ejemplo, fagocitosis incrementada, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos incrementada (ADCC) , efectos anti-inflamatorios , activación de complemento y una probabilidad reducida de generar mutantes de escape, cuando se considera in vivo, este resultado no debe tomarse como una indicación de que una mezcla de cinco sea mejor que una mezcla de once anticuerpos cuando se use in vivo. Tanto los ensayos in vitro como las combinaciones de clones han sido refinados toda vez que este experimento inicial y un número de combinaciones de clones de anticuerpo específicos F que son altamente potentes en presencia de complemento han sido identificados. Las potencias neutralizantes, expresadas como valores EC50 (concentraciones efectivas requeridas para inducir una reducción del 50% en el número de placas) , de composiciones de anticuerpos anti-F adicionales se alistan en la tabla 8. Sin importar el número exacto de clones en las composiciones, la mayoría de las combinaciones probadas de anticuerpos específicos F son más potentes que Palivizumab con respecto a la neutralización del subtipo A de la cepa de RSV. Mezclas de anticuerpos anti-G La capacidad de mezclas de anticuerpos anti-G para neutralizar cepas RSV del subtipo A se probó usando el PRNT como el descrito en el ejemplo 1, sección j-2. Los valores EC50 de las composiciones de anticuerpo anti-G probadas se listan en la tabla 8. La mayoría de las composiciones de dos anticuerpos anti-G no exhibieron una capacidad marcadamente incrementada para neutralizar virus en comparación con los anticuerpos anti-G individuales. Algunas combinaciones de dos o tres anticuerpos anti-G nunca alcanzaron 100% de neutralización del virus, no obstante la concentración. Sin embargo, cuando anticuerpos anti-G adicionales fueron añadidos a la composición la potencia se incrementó, indicando posiblemente un efecto neutralizante sinérgico entre los anticuerpos anti-G. La figura 7 muestra un ejemplo del incremento en potencia cuando se combinan varios clones específicos G. Mezclas de anticuerpos anti-F y anti-G La capacidad de mezclas de anticuerpos de proteína F y proteína G anti-RSV para neutralizar la cepa de RSV subtipo B se comparó con el efecto neutralizante obtenido usando Palivizumab. La capacidad de neutralización se evaluó usando ya sea el ensayo de inhibición de fusión por mi c r oneu t r a 1 i z a c i ón como el descrito en el ejemplol, sección j-4 o el ensayo de neutralización por reducción de placa (ejemplo 1, sección j-2) . Inicialmente , la actividad neutralizante de dos mezclas de anticuerpos, anti-F ( I ) G yant a - F ( 11 ) G , se midió en el ensayo de inhibición de fusión por mi cr one ut r a 1 i z a c i ón . Cada una de estas mezclas contiene los anticuerpos anti-F de la composición anti-F ( I ) y anti-F(II) descrita arriba así como anticuerpos anti-G obtenidos de los clones 793, 796, 838 , 841 , 856 y 888 , en donde los anticuerpos 793, 796, 838 se unen a la región conservada de la proteína G , 841 , 856 se unen a la GCRR del subtipo A de RSV y 888 se une a la GCRR de ambos subtipos (véase tabla 5) . Como se muestra en la figura 6, ambas composiciones Anti-F(I)G y F(II)G son más potentes que Palivizumab con respecto a la neutralización de la cepa Bl de RSV. Además, la actividad neutralizante de las dos mezclas es más o menos igual. Asi, parece que cuando los anticuerpos anti-F se combinan con un número de clones específicos de proteína G, la diferencia en potencia observada previamente entre las dos mezclas de anticuerpos anti-F se reduce. Esto podría indicar un incremento general en actividad neutralizante cuando anticuerpos que reconocen una amplia gama de antígenos y epítopes en RSV son combinados . Un gran número de combinaciones diferentes tanto de anticuerpos anti-F como anti-G han entonces sido evaluadas en el PRNT en presencia o ausencia de complemento. Los valores EC50 obtenidos mediante este ensayo en presencia de complemento activo se presentan en la tabla 8. Todas las composiciones probadas incluyendo tanto anticuerpos anti-F como anti-G sí neutralizan el subtipo A de RSV y la mayoría de éstos son más potentes que Palivizumab. Los resultados muestran también que los anticuerpos con afinidades naturalmente altas podrían ser obtenidos repetidamente de donadores humanos usando la técnica de clonación de anticuerpos de la presente invención. Tabla 8 Valores EC50 de combinaciones de anticuerpos anti-RSV contra RSV subtipo A y B. Los campos en blanco indican que el análisis no se ha llevado a cabo aún. ND indica que un valor EC50 no pudo ser determinado en el PRNT debido a una actividad neutralizante muy baja o a falta de actividad neutralizante .

Ejemplo 4 Reducción de cargas virales en los pulmones de ratones infectados con RSV La capacidad protectora in vivo de combinaciones de anticuerpos purificados de la invención contra infección por RSV ha sido demostrada en el modelo de ratón BALB/c (Taylor et al. 1984. Immunology 52, 137-142; Mejias, et al. 2005. Antimicrob. Agents Chemother. 49:4700- 707) como el descrito en el ejemplo 1, sección k-1. En la tabla 9, datos de un experimento con tres diferentes anti-RSV rpAb que consisten en cantidades iguales de diferentes clones de anticuerpo de la invención (descritos en tabla 8) se presentan en comparación con datos de animales de control no infectados y animales tratados con placebo (PBS) del mismo experimento. Cada grupo de tratamiento contenia 5 ratones y las muestras fueron obtenidas el día 5 después de la infección, lo cual es aproximadamente en el pico de la replicacion de virus en este modelo. Como se muestra en la tabla 9, las combinaciones de rpAb reducen en forma efectiva la carga viral en al menos un orden de magnitud cuando se dan profilácticamente. Los números de copias se presentan como desviaciones media ± estándar. El número de copias estuvo en o debajo del limite de detección de este ensayo, es decir, 3.8 loglO copias de ARN/ml, para dos de los grupos de tratamiento. Tabla 9 Cargas virales en los pulmones de ratones después de profilaxis y ataque con RSV Niveles de citocinas y quimiocinas en muestras de pulmón de ratones infectados con RSV Muestras de pulmón de un estudio de profilaxis de ratón piloto se analizaron por un inmunoensayo multiplexado comercial para determinar posniveles de diferentes citocinas y quimiocinas después de la infección por RSV y la profilaxis de anticuerpos con rpAb 18 (tabla 8) como se describió en el ejemplo 1, sección k-l. Muestras de animales no infectados y no tratados también se analizaron para obtener datos normativos para el ratón BALB/c. todas las muestras se obtuvieron el dia cinco después de la infección. Los datos se presentan como desviaciones media ± estándar. El análisis demostró que los niveles de un número de citocinas y quimiocinas que han sido indicadas como importantes marcadores de infección por RSV y la respuesta inflamatoria subsecuente, tanto en humanos como ratones, incluyendo interferón (IFN)-y, interleucina (ID-?ß, IL-4, IL-6, IL-8 (KC/GROa) , IL-10, proteína inflamatoria de macrófagos (???)-?a, regulada después de la activación de células T normales expresada y secretada (RANTES, CCLS) y factor de necrosis tumoral (TNF)-a se incrementaron en los pulmones de animales tratados con placebo, mientras que los pulmones de los animales tratados con aproximadamente 50 mg/kg de rpAb tuvieron niveles más o menos a la par con los animales de control no infectados. Resultados similares también se obtuvieron con otras combinaciones de anti-RSV rpAb. Se debe notar que los ratones no tienen un homólogo claro para IL-8, pero tienen un homólogo funcional para GROa humano (función similar a IL-8) llamado KC . La cinética de la respuesta inflamatoria y los efectos de respuesta a dosis de profilaxis de anticuerpos permanecen por ser investigados. Tabla 10 Niveles de citocinas y quimiocinas en tejido pulmonar de ratones infectados con RSV Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV capaz de neutralizar RSV subtipo A y B, caracterizado porque comprende diferentes miembros de anticuerpos los cuales juntos se unen específicamente al menos a tres epítopes diferentes sobre al menos una proteína de cápside de RSV. 2. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende miembros de anticuerpo distintos los cuales juntos proporcionan reactividad específica contra al menos dos proteínas de cápside de RSV. 3. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las proteínas de cápside de RSV se seleccionan de proteína G de RSV, proteína F de RSV y proteína SH de RSV. . El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la reactividad de la proteína anti-cápside es reactividad anti-G y anti-F, y la reactividad se proporciona al menos por dos anticuerpos anti-G distintos y al menos un anticuerpo anti-F distinto. 5. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el primer anticuerpo anti-G es capaz de unirse específicamente a un epítope conservado en la proteína G, y el segundo anticuerpo anti-G es capaz de unirse específicamente a la región rica en cisteína de proteína G (GCRR) , y la reactividad anti-F es dirigida contra al menos uno de los sitios antigénicos I, II, IV, V, VI, C o Fl . 6. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque al menos una parte de la reactividad anti-G es dirigida contra el motivo CX3C. 7. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la reactividad anti-G es dirigida además contra al menos un epítope específico de cepa. 8. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque la reactividad anti-F es al menos dirigida contra el sitio antigénico II y el sitio antigénico iv. 9. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la reactividad de la proteína anti-cápside es dirigida contra, o con respecto a las reivindicaciones 4 a 8, es dirigida además contra la proteína SH. 10. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la composición de miembros de anticuerpo distintos refleja la respuesta inmune humoral en un donador con respecto a diversidad, afinidad y especificidad contra antigenos de cápside de RSV. 11. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los anticuerpos distintos son codificados por secuencias de ácido nucleico obtenidas de uno o más donadores humanos quienes han desarrollado una respuesta inmune humoral contra RSV, y el anticuerpo policlonal es un anticuerpo completamente humano. 12. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque los miembros de anticuerpo distintos están constituidos de pares VH y VL originalmente presentes en el donador. 13. El anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cada miembro distinto comprende regiones CDR1, CDR2 y CDR3 seleccionadas del grupo de los pares VH y VL dados en la tabla 5. 14. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende como un ingrediente activo el anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 15. Un método para prevenir, tratar o reducir uno o más síntomas asociados con una infección por RSV en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva del anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 13 o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad efectiva es cuando mucho 100 mg del anticuerpo por kg de peso corporal, tal como cuando mucho 90, cuando mucho 80, cuando mucho 70, cuando mucho 60, cuando mucho 50, cuando mucho 40, cuando mucho 30, cuando mucho 20, cuando mucho 10, cuando mucho 9, cuando mucho 8, cuando mucho 7, cuando mucho 6, cuando mucho 5, cuando mucho 4, cuando mucho 3, cuando mucho 2, cuando mucho 1, cuando mucho 0.9, cuando mucho 0,8, cuando mucho 0.7, cuando mucho 0.6, cuando mucho 0.5, cuando mucho 0.4, cuando mucho 0.3, cuando mucho 0.2 y cuando mucho 0.1 mg por kg de peso corporal . 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad efectiva es al menos 0.01 mg del anticuerpo por kg de peso corporal, tal como al menos 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad efectiva es de entre 0.1-20 mg de anticuerpo por kg de peso corporal. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-18, caracterizado porque el anticuerpo se administra al menos una vez al año, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 veces al año. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo se administra a intervalos regulares durante el periodo del año en donde hay un riesgo incrementado de adquirir una infección por RSV. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los intervalos regulares son semanalmente , bisemanalmente , mensualmente o bimestralmente . 22. Uso del anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, en la preparación de una composición para el tratamiento, reducción o prevención de uno o más síntomas asociados con una infección por RSV en un mamífero. 23. Un método para generar un repertorio de pares de codificación VH y VL, en donde los miembros reflejan pares de genes responsables de la respuesta inmune humoral que resulta de una infección por RSV, caracterizado porque comprende: proporcionar una fracción de células que contengan linfocitos de un donador infectado con RSV o de un donador que se recupere de una infección por RSV; enriquecer opcionalmente células B o células plasmáticas de la fracción de células; obtener una población de células individuales aisladas, que comprende distribuir células de la fracción celular individualmente en una pluralidad de recipientes y amplificar y llevar a cabo el enlace de los pares de codificación VH y VL, en un procedimiento de RT-PCR de extensión por traslape multiplexado, usando una plantilla derivada de las células individuales aisladas; a. opcionalmente llevar a cabo una PCR anidada de los pares de codificación VH y VL. 24. Una linea de células policlonales caracterizada porque es capaz de expresar el anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13. 25. Una linea de células policlonales caracterizada porque cada célula individual es capaz de expresar un solo par de codificación VH y VL y la linea de células policlonales completa es capaz de expresar una colección de pares de codificación VH y VL, en donde cada par de codificación VH y VL codifica para un anticuerpo anti-RSV. 26. La linea de células policlonales de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la colección de pares de codificación VH y VL se genera de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 23. 27. Una molécula de anticuerpo anti-RSV humana aislada, caracterizada porque se selecciona de las moléculas de anticuerpo mostradas en la tabla 5 en la presente, o un fragmento de unión especifico de la molécula de anticuerpo o un análogo de anticuerpo sintético o semi-sintético, el fragmento de unión o análogo comprende al menos las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de la molécula de anticuerpo aislada. 28. La molécula de anticuerpo, fragmento o análogo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque se deriva de los anticuerpos listados en la tabla 8, o la cual incluye las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena pesada incluidas en una de SEQ ID Nos: 1-44 y en las secuencias de aminoácidos de CDR de la cadena ligera acompañantes que tienen un número de identificación de secuencia que es 88 más alto que la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs : 1-44. 29. La molécula de anticuerpo, fragmento o análogo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque se deriva de los anticuerpos mostrados en la tabla 6 6 7. 30. La molécula de anticuerpo, fragmento o análogo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque es un anticuerpo mostrado en la tabla 6 ó 7. 31. Una molécula de anticuerpo aislada, un fragmento de anticuerpo o un análogo de anticuerpo sintético o semi-sintético, caracterizada porque comprende CDRs idénticas a las CDRs en un Fab derivado de un anticuerpo humano, el Fab tiene una constante de disociación, KD, para la proteina G de RSV de cuando mucho 500 nM cuando se mide llevando a cabo análisis de resonancia plasmónica superficial en un Biacore 3000, usando proteina G de RSV recombinante inmovilizada sobre la superficie sensora a densidad muy baja para evitar limitaciones en el transporte de masa. 32. La molécula de anticuerpo aislada, fragmento de anticuerpo o anticuerpo sintético o semi-sintético de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la KD es de cuando mucho 400 nM, tal como cuando mucho 300 nM, cuando mucho 200 nM, cuando mucho 100 nM, cuando mucho 1 nM, cuando mucho 900 pM, cuando mucho 800 pM, cuando mucho 700 pM, cuando mucho 600 pM, cuando mucho 500 pM, cuando mucho 400 pM, cuando mucho 300 pM, cuando mucho 200 pM, cuando mucho 100 pM, cuando mucho 90 pM y cuando mucho 80 pM. 33. Una molécula de anticuerpo aislada, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo sintético o semi-sintético, caracterizada porque comprende un sitio de unión a antigeno idéntico al sitio de unión antigeno en un Fab derivado de un anticuerpo humano, el Fab tiene una constante de disociación, KD, para la proteína F de RSV de cuando mucho 500 nM cuando se mide llevando a cabo análisis de resonancia plasmónica superficial en un Biacore 3000, usando proteína F de RSV recombinante inmovilizada sobre la superficie sensora a densidad muy baja para evitar limitaciones en el transporte de masa . 34. El anticuerpo aislado, fragmento de anticuerpo o anticuerpo sintético o semi-sintético de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la KD es de cuando mucho 400 nM, tal como cuando mucho 300 nM, cuando mucho 200 nM, cuando mucho 100 nM, cuando mucho 1 nM, cuando mucho 900 pM, cuando mucho 800 pM, cuando mucho 700 pM, cuando mucho 600 pM, cuando mucho 500 pM, cuando mucho 400 pM, cuando mucho 300 pM, cuando mucho 200 pM, cuando mucho 100 pM, cuando mucho 90 pM, cuando mucho 80 pM, cuando mucho 70 pM, cuando mucho 60 pM, cuando mucho 50 pM, cuando mucho 40 pM, cuando mucho 30 pM, cuando mucho 25 pM, cuando mucho 20 pM, cuando mucho 15 pM, cuando mucho 10 pM, cuando mucho 9 pM, cuando mucho 8 pM, cuando mucho 7 pM, cuando mucho 6 pM y cuando mucho 5 pM. 35. La molécula de anticuerpo o fragmento de unión específica o análogo de anticuerpo sintético o semi-sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-34, caracterizada porque comprende las CDRs de un anticuerpo humano producido en el clon No. 810, 818, 819, 824, 825, 827, 858 u 894. 36. Una composición de anticuerpos caracterizada porque comprende una molécula de anticuerpo, un fragmento de unión específica o análogo de anticuerpo sintético o semi-sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-35 mezclado con un portador, excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 37. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque comprende dos moléculas de anticuerpo distintas y/o fragmentos de unión específicos y/o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-35. 38. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque comprende al menos tres moléculas de anticuerpo distintas y/o fragmentos de anticuerpo y/o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos, fragmentos de unión específica o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-35, tal como una composición que comprende 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 moléculas de anticuerpo distintas y/o fragmentos y/o análogos de anticuerpo sintéticos o semi-sintéticos . 39. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36-38, caracterizada porque incluye al menos una molécula de anticuerpo, fragmento o análogo que se une a la proteína F de RSV y que incluye al menos un anticuerpo, fragmento o análogo que se une a la proteína G de RSV. 40. Un fragmento de ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica para la secuencia de aminoácidos de al menos una CDR definida en cualquiera de las reivindicaciones 27-35. 41. El fragmento de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque codifica al menos para las CDRs de un anticuerpo producido mediante uno de los clones listados en la tabla 5. 42. Un fragmento de ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica para las secuencias de CDR de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en cualquiera de SEQ ID Nos: 1-44. 43. Un fragmento de ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica para las secuencias de CDR de una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en cualquiera de SEQ ID Nos: 89-132. 44. Un fragmento de ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica para las secuencias de CDR de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada mostrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 1-44 y en las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena ligera acompañantes que tienen un número de identificación de secuencia que es 88 veces más alto que la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO. 144. 45. El fragmento de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-42, caracterizado porque incluye secuencias de codificación comprendidas en SEQ ID NOs: 45-88 y/o 133-176. 46. Un vector caracterizado porque comprende el fragmento de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-45. 47. El vector de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque es capaz de replicación autónoma. 48. El vector de conformidad con la reivindicación 44 ó 47, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un fago, un cósmido, un minicromosoma y un virus. 49. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-48, caracterizado porque comprende: - en la dirección 5'—>3' y en enlace operable al menos un promotor para conducir la expresión de un primer fragmento de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-45, que codifica al menos para una CDR de cadena ligera junto con regiones estructurales necesarias, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido líder, el primer fragmento de ácido nucleico, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para regiones constantes y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para un primer terminador, y/o - en la dirección 5'—>3' y en enlace operable al menos un promotor para conducir la expresión de un segundo fragmento de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-45, el cual codifica al menos para una CDR de cadena pesada junto con regiones estructurales necesarias, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido líder, el segundo fragmento de ácido nucleico, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para regiones constantes y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para un segundo terminador . 50. El vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-49 caracterizado porque, cuando es introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped. 51. Una célula transformada caracterizada porque porta el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-50. 52. Una línea de células estable caracterizada porque porta el vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-50 y la cual expresa el fragmento de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-45, y la cual opcionalmente secreta o porta su producto de expresión recombinante sobre su superficie. 53. Un método para elaborar una composición de moléculas de anticuerpo diversas producidas recombinantemente, caracterizado porque comprende expresar las moléculas de anticuerpo diversas a partir de células o una linea de células transfectada con vectores de expresión que comprenden la secuencia de codificación de las moléculas de anticuerpo, las cuales no están asociadas naturalmente con las células o linea de células, en donde los miembros individuales juntos son capaces de unirse al menos a tres epitopes diferentes sobre al menos una proteina de cápside de RSV, y en donde la composición policlonal es capaz de neutralizar RSV subtipo A y B. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque las moléculas de anticuerpo diversas constituyen el anticuerpo policlonal recombinante anti-RSV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.