MX2008009224A - Polipeptidos de aminoacidos no naturales, que tienen inmunogenicidad modulada - Google Patents

Abstract

La presente invención se dirige, entre otras cosas a modular la inmunogenicidad de polipéptido al sustituir uno o más aminoácidos no naturalmente codificados por cualquiera de uno o más de aminoácidos de origen natural en el polipéptidos o agregar un aminoácidos no natural, y también se dirige a la producción de polipéptidos con propiedades biológicas o farmacológicas mejoradas, tales como vida media terapéutica mejoradas o inmunogenicidad modulada.

Description

POLIPEPTIDOS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES, QUE TIENEN INMUNOGENICIDAD MODULADA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de y beneficio de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/760,672, presentada en enero 19, 2006, la especificación y descripción de la cual aquí se incorporan en su totalidad para todos los propósitos. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a polipéptidos modificados con al menos un aminoácido no naturalmente codificado que tiene inmunogenicidad modulada. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Diversas proteínas naturales y recombinantes tienen utilidad médica y farmacéutica. Una vez que se han purificado, separado y formulado, pueden administrarse parenteralmente para diversas indicaciones terapéuticas. Sin embargo, las proteínas administradas parenteralmente pueden ser inmunogénicas, pueden ser relativamente insolubles en agua y pueden tener una corta vida media farmacológica.

Consecuentemente, puede ser difícil el lograr niveles en sangre terapéuticamente útiles de las proteínas en los pacientes. Schelle ens, H. en Clinical Therapeutics 2002; 24 (11) : 1720-1740, que se incorpora aquí por referencia, discute factores que pueden influenciar la inmunogenicidad de proteínas terapéuticas así como los efectos clínicos potenciales de formación de anticuerpo tales como respuestas alérgicas o anafilácticas, reducción en eficacia de la proteína terapéutica, y desarrollo de autoinmunidad a proteína endógena. De esta manera, la inmunogenicidad puede limitar la eficacia y seguridad de agentes terapéuticos de proteínas en múltiples formas. La eficacia terapéutica puede reducirse directamente por la formación de anticuerpos neutralizantes. La eficacia también puede reducirse indirectamente, puesto que ligar ya sea anticuerpos neutralizantes o no neutralizantes puede alterar la vida media en suero. Inmunorespuestas indeseadas pueden tomar la forma de reacciones en sitio de inyección, incluyendo pero no limitadas a reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado. Respuesta inmunogénica también puede alterar las farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la droga. adhwa, M. et al. J of Immunol Methods 2003; 278:1-17; Adair, F. et D. Ozanne, BioPharm 2002 Feb; p. 30-6; Chamberlain, P. et A.R. Mire-Sluis in Dev Biol Basel 2003; 1 12:3-11 y Chamberlain, P. The Regulatory Review 2002; 5(5):4-9, que se incorpora aquí por referencia, describe proteína que se han reportado que son inmunogénicas. La reducción de inmunogenicidad puede ser una consideración importante debido a que incluso proteínas humanas recombinantes pueden inducir una respuesta inmune humoral (Atkins M B, et al. (1986) J. Clin. Oncol. 4, 1380-1391; Gribben J G, et al. (1990) Lancet 335, 434-437, que se incorpora aquí por referencia) . Estos problemas pueden superarse al conjugar las proteínas con polímeros tales como poli (etilen glicol) . Davis et al., en la patente de los E.U.A. No. 4,179,337 que se incorpora aquí por referencia, describe conjugar polietilen glicol (PEG) con proteínas tales como enzimas e insulina, a fin de resultar en conjugados en donde la proteína será menos inmunogénica y retendrá una proporción substancial de su actividad fisiológica en comparación con versiones no conjugadas. Nakagawa, et al., en la patente de los E.U.A. No. 4,791,192, que se incorpora aquí por referencia, describe conjugar PEG con proteína de activación de isleta para reducir sus efectos secundarios e inmunogenicidad. Veronese et al., Applied Biochem and Biotech, 11 : 141-152 (1985) describe activar polietilen glicoles con fenil cloroformiatos para modificar una ribonucleasa y un superóxido dimutasa. Katre et al., en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,766,106 y 4,917,888, que se incorporan aquí por referencia, también describe solubilizar proteínas por conjugación con polímero. PEG y otros polímeros se conjugan con proteínas recombinantes para reducir la inmunogenicidad y aumentar la vida media. Ver Nitecki, et al., en la patente de los E.U.A. No. 4,902,502, Enzon, Inc., Solicitud Internacional No. PCT/US90/03133 , Nishimura et al., Solicitud de Patente Europea 154,316 y Tomasi, Número de Solicitud Internacional PCT/US85/02572 , todos los cuales aquí se incorporan por referencia. Knauf et al., J. Biol. Chem., 263: 15064-15070 (1988) reportan un estudio del comportamiento farmacodinámico en ratas de diversas especies modificadas con glicerol polioxilalquilado y polietilen glicol de interleucina-2. Ver también Abuchowski A, et al. (1977) J. Biol. Chem 252, 3582- 3586 y Abuchowski A, et al. (1977) J. Biol. Chem 252, 3578-3581, que se incorporan aquí por referencia. Conjugados formados entre drogas y PEG también se han desarrollado (Caliceti P, et al. (1993) Fármaco 48, 919-932; Conover C D5 et al. (1997) Anticancer-Res 17, 3361-3368; Greenwald R B, et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. 6S 551-562; Pendri A, et al. (1998) Anticancer-Drug-Des 13, 387-395, que aquí se incorpora por referencia) . Además, conexión covalente de PEG con liposomas se ha encontrado que reduce la ingestión no específica así como incrementa la estabilidad de liposoma y vida media (Kirpotin D, et al. (1997) Biochemistry 36, 66-75; Cabanes A, et al. (1998) Clin. Cáncer Res. 4, 499-505; Meyer O, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 15621-15627, que se incorpora aquí por referencia) . Modificación con PEG se ha mostrado que reduce la inmunogenicidad de enzimas (Abuchowski A, et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3582-3586; Chaffee S, et al. (1992) J. Clin. Invest . 89, 1643-1651), anticuerpos (Kitamura K, et al. (1991) Cáncer Res 51, 4310-4315), toxinas (Wang Q C, et al. (1993) Cáncer Res 53, 4588-4594; He X H, et al. (1999) Life Sci 65, 355-368) , proteínas humanas recombinantes (Katre N V (1990) . J. Immunol 144, 209-213) y otras proteínas (Chinol M, et al. (1998) Br. J. Cáncer 78, 189-197); todas las referencias se incorporan aquí por referencia. Las interferonas se han modificado por la adición de polietilen glicol (ver las patentes de los E.U.A. Nos. 4,917,888; 5,382,657; WO 99/55377; WO 02/09766; WO 02/3114). En algunos casos se ha observado la modificación con PEG para reducir la fracción de pacientes que desarrollan anticuerpos neutralizantes al bloquear estéricamente acceso a los agretopes de anticuerpo (ver por ejemplo, Hershfield et . al. PNAS 1991 88:7185-7189 (1991); Bailón et al. Bioconjug. Chem. 12: 195- 202(2001); He et al. Life Sci. 65: 355-368 (1999)). La protección de epítopo mediante modificación con PEG de polipéptidos a través de enlaces covalentes estables también se describe por Pool, R. Science 248:305, que se incorpora por referencia. Se ha mostrado que la conexión de polímeros con polipéptidos puede aumentar sus vidas medias en suero. La Publicación de Patente Europea No. 0 442 724 A2 , que se incorpora aquí por referencia, describe derivados de interleucina-6 modificados con PEG, que tienen una vida media en suero extendida. La conexión de drogas a polímeros también se ha reportado que aumenta su solubilidad en agua, estabilidad durante almacenamiento y reducir su inmunogenicidad (solicitudes de patentes publicadas EP 0 539 167 y WO 94/13322, que se incorporan aquí por referencia). Conjugados de IL-2 y sus muteínas con polímeros, también se han reportado que tienen reducida inmunogenicidad, aumentada solubilidad e incrementadas vidas medias (patentes de los E.U.A. Nos. 5,362,852, 5,089,261, 5,281,698 y solicitud de patente publicada WO 90/07938, todas las cuales aquí se incorporan por referencia) . La conexión covalente del polímero hidrofílico poli (etilen glicol), abreviado PEG, es un método para incrementar la solubilidad en agua, biodisponibilidad, incrementar la vida media en . suero , incrementar la vida media terapéutica, modular la inmunogenicidad, modular la actividad biológica o extender el tiempo de circulación de muchas moléculas biológicamente activas, incluyendo proteínas, péptidos y particularmente moléculas hidrofóbicas. PEG se ha empleado extensamente en productos farmacéuticos, en implantes artificiales y en otras aplicaciones en donde son de importancia la biocompatibilidad, falta de toxicidad, y falta de inmunogenicidad. A fin de llevar al máximo las propiedades deseadas de PEG, el peso molecular total y estado de hidratación de polímero o polímeros de PEG conectados a la molécula biológicamente activa, debe ser suficientemente elevado para impartir las características ventajosas típicamente asociadas con la conexión de polímero PEG, tal como incrementada solubilidad en agua y vida media en circulación, mientras que no impacta adversamente la bioactividad de la molécula precursora. Los derivados PEG frecuentemente están enlazados con moléculas biológicamente activas a través de funcionalidades químicas reactivas, tales como residuos lisina, cisteína e histidina, las porciones de extremo N y carbohidrato. Proteínas y otras moléculas, a menudo tienen un número limitado de sitios reactivos disponibles para conexión de polímero. A menudo, los sitios más convenientes para modificación mediante conexión de polímero juegan un papel significante en enlace de receptor, y son necesarios para retención de la actividad biológica de la molécula. Como resultado, una conexión indiscriminada de cadenas de polímero con dichos sitios reactivos en una molécula biológicamente activa, a menudo lleva a una reducción significante o incluso pérdida total de actividad biológica de la molécula modificada con polímero. R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271 : 21969-21977. Para formar conjugados que tienen peso molecular de polímero suficiente para impartir las ventajas deseadas a una molécula objetivo, enfoques de la técnica previa típicamente han involucrado una conexión al azar de numerosos brazos de polímero a la molécula, de esta manera incrementando el riesgo de una reducción o incluso pérdida total de bioactividad de la molécula precursora. Sitios reactivos que forman los sitios para conexión de derivados PEG con proteínas son dictados por la estructura de la proteína. Proteínas incluyendo enzimas, están compuestas de diversas secuencias de alfa-aminoácidos, que tienen la estructura general H2N-CHR-COOH. La porción alfa amino (H2N-) de un aminoácido se reúne a la porción carboxilo (-C00H) de un aminoácido adyacente para formar enlaces amida, que pueden representarse como - (NH-CHR-CO)n —, en donde el subíndice "n" puede ser igual a cientos o miles. El fragmento representado por R puede contener sitios reactivos para actividad biológica de proteína y para conectar derivados PEG. Por ejemplo, en el caso del aminoácido lisina, existe una porción -NH2 en la posición épsilon así como en la posición alfa. El -NH2 épsilon está libre para reacción bajo condiciones de pH básico. Gran parte de la técnica en el campo de derivatización de proteínas con PEG, se ha dirigido a desarrollar derivados de PEG para conexión a la porción épsilon -NH2 de los residuos lisina presentes en proteínas. "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Estos derivados PEG tienen todos la limitación común, sin embargo, de que no pueden instalarse selectivamente a menudo numerosos residuos lisina presentes en las superficies de las proteínas. Esto puede ser una limitación significante en casos en donde un residuo lisina es importante para actividad de proteína, existiendo en un sitio de enzima activo por ejemplo, o en casos en donde un residuo lisina juega un papel en mediar la interacción de la proteína con otras moléculas biológicas, como en el caso de sitios de enlace de receptor. Una segunda e igualmente importante complicación de métodos existentes para modificación con PEG de proteína, es que los derivados PEG pueden someterse a reacciones secundarias indeseadas con residuos diferentes a aquellos deseados. Histidina contiene una reacción imino reactiva, representada estructuralmente como -N(H)-, pero muchas especies químicamente reactivas que reaccionan con épsilon NH2 también pueden reaccionar con -N(H)-. Similarmente, la cadena lateral ' del aminoácido cisteína contiene un grupo sulfhidrilo libre, representado estructuralmente como -SH. En algunos casos, los derivados PEG dirigidos al grupo épsilon -NH2 de la lisina también reaccionan con los residuos cisteína, histidina u otros. Esto puede crear mezclas complejas, heterogéneas de moléculas bioactivas derivatizadas con PEG y tiene el riesgo de destruir la actividad de la molécula bioactiva que es el objetivo. Sería conveniente el desarrollar derivados PEG que permitan a un grupo funcional químico ser introducido en un solo sitio con la proteína que entonces active el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros PEG a la molécula bioactiva en sitios específicos de la superficie de la proteína que son tanto bien definidos como pronosticables . Además de residuos lisina, se ha dirigido esfuerzo considerable en la técnica hacia el desarrollo de reactivos PEG activados que hacen blanco a otras cadenas laterales aminoácido, incluyendo cisteína, histidina y el extremo N. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 6,610,281 que se incorpora aquí por referencia, y "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp . 1-17. Un residuo cisteína puede introducirse selectivamente en sitio en la estructura de proteínas utilizando mutagénesis dirigida por sitio y otras técnicas conocidas en la especialidad, y la porción sulfhidrilo libre resultante puede reaccionarse con derivados PEG que contienen grupos funcionales tiol reactivos. Este enfoque se complica sin embargo, porque la introducción de un grupo sulfhidrilo libre puede complicar la expresión, plegado y estabilidad de la proteína resultante. De esta manera, sería conveniente el tener un medio para introducir un grupo funcional químico en moléculas bioactivas que permitan el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros PEG a la proteína, mientras que simultáneamente sea compatible con (es decir, no participe en reacciones secundarias indeseables con) sulfhidrilos y otros grupos funcionales químicos típicamente encontrados en proteínas. Como puede verse de un muestreado de la especialidad, muchos de estos derivados que se han desarrollado para conexión a las cadenas laterales de proteínas, en particular, la porción -NH2 en la cadena lateral aminoácido lisina y la porción -SH en la cadena lateral cisteína, ha demostrado ser problemáticos en su síntesis y uso. Algunos forman enlaces inestables con la proteína que está sujeta a hidrólisis y por lo tanto se decompone, degrada y de otra forma es inestable en ambientes acuosos, tales como en la corriente sanguínea. Algunos forman enlaces más estables, pero están sujetos a hidrólisis antes de que se forme el enlace, lo que significa que el grupo reactivo en el derivado PEG puede inactivarse antes que se pueda conectar la proteína. Algunos son algo tóxicos y por lo tanto son menos adecuados para utilizar in vivo . Algunos son muy lentos para reaccionar para ser útiles prácticamente. Algunos resultan en una pérdida de actividad de proteína al conectarse con sitios responsables por la actividad de proteína. Algunos no son específicos en los sitios a los cuales se conectan, lo que también puede resultar en una pérdida de actividad deseable y en una falta de reproducibilidad de resultados. A fin de superar los retos asociados con modificar proteínas con porciones poli (etilen glicol), se han desarrollado derivados PEG que son más estables (por ejemplo, patente de los E.U.A. No. 6,602,498, que se incorpora aquí por referencia) o que reaccionan selectivamente con porciones tiol en moléculas y superficies (por ejemplo en la patente de los E.U.A. No. 6,610,281, que aquí se incorpora por referencia). Claramente hay una necesidad en la técnica por derivados PEG que son químicamente inertes en ambientes fisiológicos hasta que se requiera para reaccionar selectivamente para formar enlaces químicos estables. Recientemente, una tecnología totalmente nueva en las ciencias de proteínas se ha reportado, que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con modificaciones específicas de sitio de proteínas. Específicamente, se han agregado nuevos componentes a la maquinaria biosintética de proteínas del procariota Escherichia coli (E. coli ) (e.g., L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) y el eucariota Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (e.g., J. Chin et al., Science 301 :964-7 (2003)), que ha permitido la incorporación de aminoácidos no genéticamente codificados en proteínas in vivo . Una cantidad de nuevos aminoácidos con novedosas propiedades químicas, físicas o biológicas, incluyendo etiquetas de fotoafinidad y aminoácidos fotoisomerizables, aminoácidos de fotoentrelazamiento (ver por ejemplo, Chin, J. W. , et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024; y, Chin, J, W., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027), ceto aminoácidos, aminoácidos que contienen átomo pesado y aminoácidos glicosilados, se ha incorporado eficientemente y con alta fidelidad de proteínas en E. coli y en levadura en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Ver por ejemplo, J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(1 1):1 135-1 137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Todas las referencias se incorporan aquí en su totalidad por referencia. Estos estudios han demostrado que es posible introducir en forma selectiva y rutinaria grupos funcionales químicos, tales como grupos cetona, grupos alquino y porciones azida, que no se encuentran en las proteínas, que son químicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos, genéticamente codificados comunes, y que pueden utilizarse para reaccionar eficiente y selectivamente para formar enlaces covalentes estables. La capacidad para incorporar aminoácidos no genéticamente codificados en proteínas, permite la introducción de grupos funcionales químicos que pueden proporcionar alternativas valiosas a los grupos funcionales de origen natural, tales como épsilon -NHb de lisina, el sulfhidrilo -SH de cisteína, el grupo imino de histidina, etc. Ciertos grupos químicos funcionales se conocen inertes a los grupos funcionales que se encuentran en los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes, pero reaccionan en forma limpia y eficiente para formar enlaces estables. Grupos azida y acetileno, por ejemplo se conocen en la técnica para someterse a una reacción de cicloadición de Huisgen [3+2] en condiciones acuosas en la presencia de una cantidad catalítica de cobre. Ver por ejemplo, Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057- 3064; y, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Al introducir una porción azida en una estructura de proteína, por ejemplo se es capaz de incorporar un grupo funcional que sea químicamente inerte en aminas, sulfhidrilos, ácidos carboxílicos, grupos hidroxilo encontrados en proteínas, pero que también reaccionan de manera uniforme y eficiente con una porción de acetileno para formar un producto de ciclo adición. De manera importante, en la ausencia de la porción acetileno, la azida permanece químicamente inerte y no reactiva en la presencia de otras cadenas laterales de proteína y bajo condiciones fisiológicas. La presente invención atiende, entre otras cosas, a modular la inmunogenicidad de polipéptidos al substituir uno o más aminoácidos no naturalmente codificados por cualquiera uno o más aminoácidos de origen natural en el polipéptido o agregar un aminoácido no natural y también atiende la producción de polipéptidos con propiedades biológicas o farmacológicas mejoradas, tales como vida media terapéutica mejorada o inmunogenicidad modulada. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificados que tienen inmunogenicidad modulada. En algunas modalidades, el polipéptido comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados reduce la inmunogenicidad del polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido que comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados mejora la inmunogenicidad del polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados tiene inmunogenicidad modulada para uno o más epítopos específicos del polipéptido, en comparación con el polipéptido nativo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados tiene disminuida inmunogenicidad para uno o más epítopos específicos del polipéptido en comparación con el polipéptido nativo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados tiene incrementada inmunogenicidad para uno o más epítopos específicos del polipéptido en comparación con el polipéptido nativo. Esta invención también proporciona métodos para modular inmunogenicidad de polipéptidos al substituir uno o más aminoácidos no naturalmente codificados por cualquiera uno o más aminoácidos de origen natural en el polipéptido o agregar un aminoácido no natural en el polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido con inmunogenicidad modulada comprende una o más modificaciones post-transducción. En algunas modalidades, el polipéptido con inmunogenicidad modulada se conecta con un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado presente en el polipéptido con inmunogenicidad modulada, se enlaza con un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol). En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado se liga con el polímero soluble en agua con un enlazador o se une al polímero soluble en agua. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) es un polímero bifuncional.

En algunas modalidades, el polímero bifuncional se enlaza con un segundo polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una substitución, adición o eliminación que modula la inmunogenicidad del polipéptido cuando se compara con la inmunogenicidad del polipéptido correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una substitución, adición o eliminación que modula la vida media en suero o tiempo de circulación del polipéptido, cuando se compara con la vida media en suero o tiempo de circulación del polipéptido correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una substitución, adición o eliminación que aumenta la solubilidad acuosa del polipéptido, cuando se compara con solubilidad acuosa del polipéptido correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una substitución, adición o eliminación que ' aumenta la solubilidad del polipéptido producido en una célula huésped, cuando se compara con la solubilidad del polipéptido correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, las substituciones de aminoácido en el polipéptido pueden ser con aminoácidos de origen natural o que no sean de origen natural, siempre que la substitución como mínimo sea con un aminoácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, un grupo acetilo, un grupo aminooxi , un grupo hidrazina, un grupo hidrazida, un grupo semicarbazida, un grupo azida, o un grupo alquino. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo substituido, o arilo substituido; R2 es H, un alquilo, arilo, alquilo substituido, y arilo substituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo con modificación de extremo amino, y R4 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo aminooxi. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo hidrazida. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo hidrazina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo semicarbazida.

En algunas modalidades, el residuo aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo azida. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado tiene la estructura: en donde n es 0-10; Rj. es un alquilo, arilo, alquilo substituido, arilo substituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo alquino. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado tiene la estructura: (CH2)n tX(CH2)mCCH en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo substituido, o arilo substituido; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10, R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi . En algunas modalidades, el polipéptido enlazado al polímero soluble en agua se elabora al reaccionar un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene carbonilo, con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. En algunas modalidades, el grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida se enlaza a la molécula poli (etilen glicol) a través un enlace amida. En algunas modalidades, el grupo aminooxi se enlaza a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace carbamato. En algunas modalidades, el polipéptido enlazado al polímero soluble en agua se elabora al reaccionar una molécula de (polietilen glicol) que comprende un grupo carbonilo con un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. En algunas modalidades, el polipéptido enlazado al polímero soluble en agua se elabora al reaccionar un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene alquino con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende una porción azida. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se enlaza a la molécula poli (etilen glicol) a través de un enlace amida. En algunas modalidades, el polipéptido enlazado al polímero soluble en agua se elabora al reaccionar un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene azida con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende una porción alquino. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se enlaza a la molécula poli (etilen glicol) a través de un enlace amida. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 50 kDa. En algunas modalidades, la molécula poli (etilen glicol) es un polímero ramificado. En algunas modalidades, cada ramificación del polímero ramificado poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre 1 kDa y 100 kDa, o entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 50 kDa. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua enlazado al polipéptido, comprende una porción polialquilen glicol. En algunas modalidades, el residuo aminoácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido, comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida, o un grupo alquino. En algunas modalidades, el residuo aminoácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido comprende una porción carbonilo y el polímero soluble en agua comprende una porción aminooxi, hidrazida, hidrazina, o semicarbazida. En algunas modalidades, el residuo aminoácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido, comprende una porción alquino y el polímero soluble en agua comprende una porción azida. En algunas modalidades, el residuo aminoácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido comprende una porción azida y el polímero soluble en agua comprende una porción alquino. La presente invención también proporciona composiciones que comprende un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que tiene inmunogenicidad modulada y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado se enlaza a un polímero soluble en agua. La presente invención también proporciona células que comprenden el polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende un codón selector. En algunas modalidades, las células comprenden una ARN sintetasa ortogonal y/o un ARNt ortogonal para substituir un aminoácido no naturalmente codificado en el polipéptido. La presente invención también proporciona métodos para producir un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado con inmunogenicidad modulada. En algunas modalidades, los métodos comprenden cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptido, una ARN sintetasa ortogonal y/o un ARNt ortogonal bajo condiciones para permitir expresión del polipéptido; y purificar el polipéptido a partir de las células y/o medio de cultivo. La presente invención también proporciona métodos para modular inmunogenicidad de polipéptidos. En algunas modalidades, los métodos comprenden substituir un aminoácido no naturalmente codificado por cualquiera uno o más aminoácidos en polipéptidos de origen natural y/o enlazar el polipéptido con un enlazador, un polímero, un polímero soluble en agua, o una molécula biológicamente activa. En algunas modalidades, la inmunogenicidad del polipéptido se incrementa, disminuye o se hace blanco con una o más porciones inmunogénicas específicas o epítopos del polipéptido nativo. La presente invención además proporciona una composición de hormona que contiene un hormona de crecimiento (GH = growth hormone) enlazada cuando menos a un polímero soluble en agua por un enlace covalente, en donde el enlace covalente es un enlace oxima. La GH puede incluir uno o más aminoácidos no naturalmente codificados, tales como un aminoácido no naturalmente codificado que incluye un grupo carbonilo, por ejemplo una cetona, tal como un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenil alanina. En algunas modalidades el enlace oxima está entre el aminoácido no naturalmente codificado y el polímero soluble en agua. La GH puede substituirse con una para-acetilfenilalanina en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404, que se incorpora por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua incluye una o más moléculas de polietilen glicol (PEG) . El PEG puede ser lineal, por ejemplo, un PEG lineal de MW de aproximadamente 0.1 y aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 y aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 y aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, el PEG es un PEG ramificado, por ejemplo un PEG ramificado que tiene un peso molecular entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 y aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades la GH se enlaza por una pluralidad de uniones covalentes con una pluralidad de polímeros solubles en agua, en donde al menos uno de los enlaces covalentes son enlaces oxima. En algunas de estas modalidades, la GH es una hormona de crecimiento humano (GH, por ejemplo una hGH) , por ejemplo una GH, por ejemplo una hGH con una secuencia que es al menos aproximadamente 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404; en algunas modalidades la secuencia es la de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404. En algunas modalidades en donde GH, por ejemplo hGH, se enlaza a una pluralidad de polímeros solubles en agua, la GH comprende una pluralidad de aminoácidos no naturalmente codificados. En ciertas modalidades, la invención proporciona una composición GH que contiene una GH, por ejemplo hGH que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404, en donde la GH, por ejemplo hGH se enlaza mediante una unión oxima con un PEG lineal de 30 kDa, y en donde el enlace oxima se forma con una para-acetilfenilalanina substituida en la posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404. Todavía en otras modalidades, la invención proporciona un método para producir un polipéptido con inmunogenicidad modulada enlazado mediante un enlace oxima a un polímero soluble en agua que comprende contactar un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que comprende un grupo carbonilo con una PEG oxiamina bajo condiciones adecuadas para formación de un enlace oxima. El aminoácido no naturalmente codificado puede contener un grupo cetona, por ejemplo un carbonilo. El aminoácido no naturalmente codificado puede ser para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades que contiene una para-acetilfenilalanina, la para-acetilfenilalanina está substituida en una posición en la GH, por ejemplo hGH correspondiente al aminoácido 35 en SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404. En algunas modalidades, la PEG oxiamina es una monometoxiPEG (MPEG). En algunas modalidades, la oxiamina MPEG es lineal, por ejemplo una MPEG lineal de aproximadamente 20-40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la oxiamina MPEG es un hidrocloruro de monometoxi-PEG-2 -aminooxi etilamina carbamato lineal de 30 kDa. La solicitud de patente de los E.U.A. No. 11/316,534, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, detalla los esquemas de síntesis para este PEG. En algunas modalidades, la GH, por ejemplo hGH que comprende un aminoácido no naturalmente codificado se elabora al introducir (i) un ácido nucleico que codifica un polipéptido en donde el ácido nucleico se ha modificado para proporcionar un codón selector para incorporar el aminoácido no naturalmente codificado; y (ii) el aminoácido no naturalmente codificado; a un organismo cuya maquinaria celular es capaz de incorporar el aminoácido no naturalmente codificado en una proteína, en respuesta al codón selector del ácido nucleico de (i) . En algunas modalidades, las condiciones de reacción para formar el enlace oxima incluyen mezclar MPEG y polipéptido incluyendo pero no limitadas a GH, por ejemplo hGH para producir una mezcla MPEG-polipéptido con una proporción de MPEG: polipéptido de aproximadamente 5 a 10, un pH de aproximadamente 4 a 6; y ligera agitación de la mezcla MPEG-polipéptido por aproximadamente 10 a 50 horas a temperatura ambiente . Polipéptidos de la presente invención que tienen inmunogenicidad modulada pueden ser útiles para una amplia variedad de utilidades incluyendo pero no limitados a reducción o eliminación de inmunogenicidad de un polipéptido inmunogénico, vacunas para inducir o estimular inmunogenicidad de un inmunógeno, bloquear enlace de anticuerpo con un polipéptido, o tratamiento de enfermedades autoinmunes . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - Una ilustración esquemática de la proteína de enlace de ácido graso (FABP) -hGH transgen de fusión se muestra. Figura 2 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) -hGH, se ilustra. Las placas se revistieron con (met) -hGH.

Figura 3 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) -hGH, se ilustra. Las placas se revistieron con (met) Y35pAF-hGH. La Figura 4 — Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) -hGH se ilustra. Las placas se revistieron con PEG- (met) Y35pAF- hGH. Figura 5 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) Y35pAF-hGH se ilustra. Las placas se revistieron con (met) -hGH. Figura 6 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) Y35pAF-hGH se ilustra. Las placas se revistieron con (met)Y35pAF- hGH. Figura 7 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) Y35pAF-hGH se ilustra. Las placas se revistieron con PEG- (met) Y35pAF-hGH. Figura 8 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH se ilustra.

Las placas se revistieron con (met) - hGH. Figura 9 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH se ilustra. Las placas se revistieron con (met) Y35pAF-hGH. Figura 10 — Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH se ilustra. Las placas se revistieron con PEG- (met) Y35pAF-hGH. Figura 11 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) -hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con (met) -hGH. Figura 12 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) -hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con (met)Y35pAF-hGH. Figura 13 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) -hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con PEG- (met)Y35pAF-hGH. Figura 14 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (non-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con (met) -hGH. Figura 15 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (no-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con (met)Y35pAF-hGH. Figura 16 - Respuesta en anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (no-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Placas se revistieron con PEG- (met)Y35pAF-hGH. Figura 17 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (no-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con (met) -hGH. Figura 18 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (no-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con (met) Y35pAF-hGH. Figura 19 - Respuesta de anticuerpo de hGH sin tratamiento previo (no-tg) (Panel A) y ratones transgénicos (Panel B) inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund, se ilustra. Las placas se revistieron con PEG- (met)Y35pAF-hGH. Figura 20 - Un compendio de los datos de inmunogenicidad (título de anticuerpo) en ratones, se muestra. Figura 21 - Se ilustra análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF de albúmina de suero conejo conjugado. Figura 22 - Una comparación de respuestas de inmunización en conejos, se muestra entre DNP (Panel A), p-acetilfenilalanina (Panel B) , Phe (Panel C) , y Tyr (Panel D) . DEFINICIONES Habrá de entenderse que está invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, construcciones y reactivos particulares aquí descritos y como tal puede variar. También habrá de entenderse que la terminología empleada aquí es con propósitos de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención, que será limitado solo por las reivindicaciones anexas. Como se emplea aquí, y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un/una", y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que el contexto claramente lo indique de otra forma. De esta manera, por ejemplo referencia a una "hGH" es una referencia a una o más de estas proteínas e incluye sus equivalentes que se conocen por aquellos con destreza en la especialidad, y así en adelante. Los métodos, composiciones, estrategias y técnicas aquí descritas no se limitan a un particular tipo, clase o familia de polipéptidos o proteínas. Sin duda, virtualmente cualesquiera polipéptidos pueden diseñarse o modificarse para incluir al menos un aminoácido no naturalmente codificado y modificado con otra molécula, incluyendo pero no limitado a PEG, como se describe aquí. A manera de ejemplo solamente, el polipéptido puede ser homólogo a una proteína terapéutica seleccionada del grupo que consiste de: alfa- 1 antitripsina, angiostatina, factor antihemolítico, anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipéptido natriurético atrial, péptido atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP- 10, GCP-2, NAP-4, SDF-I, PF4 , MIG, calcitonina, ligando c-kit, citocina, CC quimiocina, proteína quimioatrayente de onocito- 1, proteína quimioatrayente de monocito- 2, proteína quimioatrayente de monocito- 3, proteína inflamatoria de monocito-1 alfa, proteína inflamatoria monocito-1 beta, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58S47, D31065, T64262, CD40, ligando CD40, ligando c-kit, colágeno, factor de estímulo de colonia (CSF= colony stimulating factor) , factor de complemento 5a, inhibidor de complemento, receptor de complemento 1, citocina, péptido activador de neutrófilo epitelial-78, MIP- 16, MCP-I, factor de crecimiento epidérmico (EGF= epidermal growth factor) , péptido activador de neutrófilo epitelial, eritropoyetina (EPO) , toxina exfoliante, Factor IX, Factor Vilo, Factor VIII, Factor X, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF= fibroblast growth factor) , fibrinógeno, fibronectina, proteína de haz cuatro helicoidal, FLT, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidasa, gonadotropina, factor de crecimiento, receptor de factor de crecimiento, grf, proteína hedgehog, hemoglobina, factor de crecimiento de hepatocitos (hGF= hepatocyte growth factor) , hirudina, hormona de crecimiento humano (hGH= human growth hormone) , albúmina de suero humano, ICAM-I, receptor ICAM-I, LFA-I, receptor LFA-I, insulina, factor de crecimiento de tipo de insulina (IGF= insulin-like growth factor), IGF-I, IGF-II, interferona (IFN) , IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, cualquier molécula tipo interferona o miembro de la familia interferona, interleucina (IL) , IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-I 1, IL- 12, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF= keratinocyte growth factor) , lactoferrina, factor inhibidor de leucemia, luciferasa, neurturina, factor inhibidor de neutrófilos (NIF= neutrophil inhibitory factor) , oncostatina M, proteína osteogénica, producto oncógeno, paracitonina, hormona paratiroide, PD-ECSF, PDGF, hormona péptido, pleiotropina, proteína A, proteína G, pth, exotoxina pirogénica A, exotoxina pirogénica B, exotoxina pirogénica C, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biosintética pequeña, receptor de complemento soluble I, I-CAM soluble 1, receptor de interleucina soluble, receptor TNF soluble, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinasa, superantígenos, enterotoxina de estafilococos, SEA, SEB, SECl , SEC2 , SEC3 , SED, SEE, receptor de hormona esteroide, superóxido dismutasa, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1, activador de plasminógeno de tejido, factor de crecimiento de tumor (TGF= tumor growth factor) , factor de necrosis de tumor, factor de necrosis de tumor alfa, factor de necrosis de tumor beta, receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR= tumor necrosis factor receptor), proteína VLA-4, proteína VCAM-I, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF= vascular endothelial growth factor) , urocinasa, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, reí, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor LDL, y corticoesterona . De esta manera, la siguiente descripción de la hormona de crecimiento, se proporciona para propósitos ilustrativos y a manera de ejemplo solamente y no como un límite al alcance de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas aquí descritas. Además, referencia a los polipéptidos hGH en esta solicitud se pretende utilizar el término genérico como un ejemplo de cualquier polipéptido.

Referencia a posiciones particulares de aminoácido en hGH para sustitución de aminoácidos no naturalmente codificados, es para propósitos ilustrativos y a manera de ejemplo solamente y no como un límite para el alcance de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas aquí descritas. De esta manera, habrá de entenderse que las modificaciones y químicas aquí descritas con referencia a los polipéptidos o proteína hGH pueden ser igualmente aplicados a cualquier polipéptido o a cualquier miembro de la familia de supergenes GH, incluyendo pero no limitado a aquellos específicamente aquí citados. A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad a la cual pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden emplearse en la práctica o prueba de la invención, ahora se describen los preferidos métodos, dispositivos y materiales. Todas las publicaciones y patentes aquí mencionados se incorporan por referencia con el propósito de describir e ilustrar por ejemplo las construcciones y metodologías que se describen en las publicaciones, que pueden ser utilizadas en conexión con la invención actualmente descrita. Las publicaciones discutidas aquí se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí habrá de considerarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteponer a la fecha dicha descripción por virtud de invención previa o por cualquier otra razón. El término "sustancialmente purificado" (a) se refiere a un polipéptido que puede estar sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína como se encuentra en su ambiente de origen natural, es decir una célula nativa o célula huésped en el caso de polipéptidos producidos en forma recombinante. Polipéptido que puede estar sustancialmente libre de material celular incluyen preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1% (por peso seco) de proteína contaminante. Cuando el polipéptido o su variante se produce en forma recombinante por las células huésped, la proteína puede estar presente a aproximadamente 30%, aproximadamente 25%, aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2%, o aproximadamente 1 % o menos del peso seco de las células. Cuando el polipéptido o su variante se produce en forma recombinante por las células huésped, la proteína puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5 g/L, aproximadamente 4 g/L, aproximadamente 3 g/L, aproximadamente 2 g/L, aproximadamente 1 g/L, aproximadamente 750 mg/L, aproximadamente 500 mg/L, aproximadamente 250 mg/L, aproximadamente 100 mg/L, aproximadamente 50 pig/L, aproximadamente 10 tng/L, o aproximadamente 1 mg/L o menos del peso seco de las células. De esta manera, polipéptido "sustancialmente purificado" como se produce por los métodos de la presente invención, puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, específicamente un nivel de pureza de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, y más específicamente un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 95%, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99% o mayor como se determina por métodos apropiados tales como análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, y electroforesis capilar. Una "célula huésped recombinante" o "célula huésped", se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, independientemente del método empleado para inserción, por ejemplo ingestión directa, transducción, acoplamiento de f, u otros métodos conocidos en la especialidad para crear células huésped recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado por ejemplo un plásmido, o en forma alterna puede estar integrado en el genoma anfitrión. Como se emplea aquí, el término "medio" o "medios" incluye cualquier medio de cultivo, solución, sólido, semisólido o soporte rígido que pueda soportar o contener cualquier célula huésped incluyendo células huésped bacterianas, células huésped de levadura, células huésped de insecto, células huésped de planta, células huésped eucarióticas, células huésped de mamífero, células CHO, células huésped procarióticas, E. coli o células huésped de Pseudomonas, y contenidos celulares. De esta manera, el término puede abarcar medio en donde la célula huésped se ha desarrollado, por ejemplo medio en el cual el polipéptido se ha secretado, incluyendo medio ya sea antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede abarcar amortiguadores o reactivos que contienen lisados de células huésped, tal como en el caso en donde el polipéptido se produce en forma intracelular y las células huésped se lisan o rompen para liberar el polipéptido.

"Agente reductor", como se emplea aquí, con respecto a plegado de proteína, se define como cualquier compuesto o material que mantiene grupos sulfhidrilo en el estado reducido y reduce enlace disulfuro intra-inter-moleculares. Agentes reductores convenientes incluyen pero no están limitados a ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol , ditioeritritol , cisteina, cisteamina (2- aminoetantiol) , y glutationa reducida. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que una amplia variedad de agentes reductores son adecuados para utilizar en los métodos y composiciones de la presente invención. "Agente oxidante", como se emplea aquí con respecto a plegado de proteína, se define como cualquier compuesto o material que es capaz de retirar un electrón de un compuesto que se oxida. Agentes oxidantes convenientes incluyen pero no están limitados a glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado, y oxígeno. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, que una amplia variedad de agentes oxidantes son adecuados para utilizar en los métodos de la presente invención. "Agente desnaturalizante" o "desnaturalizante" como se emplea aquí, se define como cualquier compuesto o material que provocará un desdoblado reversible de una proteína. La fuerza de un agente desnaturalizante o desnaturalizante estará determinada tanto por las propiedades como la concentración del agente desnaturalizante o desnaturalizante particular. Desnaturalizantes o agentes desnaturalizantes convenientes pueden ser caótropos, detergentes, solventes orgánicos, solventes miscibles en agua, fosfolípidos, o una combinación de dos o más de estos agentes . Caótropos convenientes incluyen pero no están limitados a urea, guanidina, y tiocianato de sodio. Detergentes útiles incluyen pero no están limitados a fuertes detergentes tales como dodecil sulfato de sodio, o polioxietilen éteres (por ejemplo detergentes Tween o Tritón) , Sarcosilo, detergentes no iónicos ligeros (por ejemplo, digitonina) , detergentes catiónicos ligeros tales como N->2,3- (Dioleioxi) -propil-N,N,N-trimetilamonio, detergentes iónicos ligeros (por ejemplo colato de sodio o deoxicolato) o detergentes zwitteriónicos, incluyendo pero no limitados sulfobetaínas (Zwittergent) , 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-1 -propano sulfato (CHAPS), y 3- (3- clolamidopropil) dimetilamonio-2-hidroxi-l -propano sulfonato (CHAPSO) . Solventes orgánicos, miscibles en agua tales como acetonitrilo, alcanoles inferiores (en especial Q C4 alcanoles tales como etanol o isopropanol) , o alcandioles inferiores (en especial C2 - C4 alcandioles tales como etilen-glicol) pueden emplearse como desnaturalizantes. Fosfolípidos útiles en la presente invención pueden ser fosfolípidos de origen natural tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, y fosfatidilinositol o derivados fosfolípidos sintéticos o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina. "Plegado" como se emplea aquí describe cualquier proceso, reacción o método que transforme polipéptidos que contienen enlace disulfuro de un estado inadecuadamente plegado o desplegado o desdoblado a una conformación adecuadamente plegada o nativa con respecto a enlace disulfuro. "Co-plegamiento" como se emplea aquí, se refiere específicamente a procesos reacciones y métodos de plegamiento que emplean cuando menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y resulta en la transformación de propiedades inadecuadamente plegadas o desplegadas a polipéptidos adecuadamente plegados, nativos. Como se emplea aquí, "hormona de crecimiento" o "GH" habrá de incluir aquellos polipéptidos y proteínas que tienen cuando menos una actividad biológica de una hormona de crecimiento de cualquier especie de mamífero incluyendo pero no limitada a (hGH) humano, (bGH) ovino, porcino, y de otros animales de ganado o de granja, incluyendo pero no limitados a gallinas, así como análogos de GH, isoformas de GH, miméticos de GH, fragmentos de GH, proteínas de GH híbridas, proteínas de fusión, oligómeros y multímeros, homólogos, variantes de patrón de glicosilación, variantes, variantes de combinación y muteínas de los mismos, independientemente de la actividad biológica de los mismos y además independientemente del método de síntesis o su fabricación incluyendo pero no limitado a, recombinante (ya sea producido de ADNc, ADN genómico, ADN sintético u otra forma de ácido nucleico) in vi tro, in vivo, por microinyección de moléculas de ácido nucleico, métodos sintéticos transgénicos y activados por genes. Similarmente, el término "polipéptido" incluye las formas como se describieron. El término "polipéptido" abarca polipéptidos que comprenden una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Sustituciones ejemplares de hGH incluyen por ejemplo sustitución de lisina en la posición 41 o la fenilalanina en la posición 176 de hGH nativa. En algunos casos, la sustitución puede ser un residuo isoleucina o arginina, si la sustitución esta en la posición 41 o un residuo de tirosina se la posición es 176. La posición FIO puede estar sustituida por ejemplo con, A, H o I. La posición M14 puede estar sustituida por ejemplo con, W, Q o G. Otras sustituciones ejemplares incluyen cualesquiera sustituciones o sus combinaciones incluyendo pero no limitadas a: R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T; R167E, D171S, E174S, F176Y; FlOA, M14W, H18D, H21N; FlOA, M14W, H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T; FlOA, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, E174S, F176Y, I179T; F10H, M14G, H18N, H21N; FlOA, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, T175T, I179T; o FlOI, M14Q, H18E, R167N, D171S, I179T. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 6,143,523, que se incorpora aquí por referencia. Sustituciones ejemplares en una amplia variedad de posiciones de aminoácidos en polipéptidos de origen natural, se han descrito, incluyendo sustituciones que aumentan la actividad agonista, aumentan la resistencia a proteasa, convierten el polipéptido en un agonista, etc. y están abarcados por el término "polipéptido" . GH agonista, por ejemplo secuencias hGH incluyen por ejemplo la secuencia hGH de origen natural que comprende las siguientes modificaciones H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, I179T. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 5,849,535, que se incorpora aquí por referencia. Secuencias hGH agonistas adicionales incluyen H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S; o H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 6,022,711, que se incorpora aquí por referencia. Polipéptidos hGH comprenden sustituciones at Hl 8 A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A mejoran afinidad para el receptor hGH en el sitio I. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 5,854,026, que se incorpora aquí por referencia. Secuencias hGH con incrementada resistencia a proteasas incluyen pero no están limitadas a hGH polipéptidos que comprenden una o más sustituciones de aminoácido dentro del bucle C-D. En algunas modalidades, las sustituciones incluyen pero no están limitadas a R134D, T135P, K140A, y cualquiera de sus combinaciones. Ver por ejemplo Alam et al. (1998) J. Biotechnol. 65:183-190. Antagonistas de hormona de crecimiento humano incluyen por ejemplo aquellos con una sustitución en G120 (por ejemplo, G120R, G120K, G120W, G120Y, G120F, o G120E) y en ocasiones además incluyen las siguientes sustituciones: H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174A. Ver por ejemplo las patentes de los E.U.A. Número 6,004,931, que se incorpora aquí por referencia. En algunas modalidades, antagonistas hGH comprenden al menos una sustitución en las regiones 106-108 o 127-129 que provocan que GH actúe como un antagonista. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 6,608,183, que se incorpora aquí por referencia. En algunas modalidades, el antagonista hGH comprende un aminoácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente en la región de enlace de sitio II de la molécula hGH. En algunas modalidades, el polipéptido hGH además comprende las siguientes sustituciones: H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179T con una sustitución en G120. (Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 5,849,535) . Para la secuencia de aminoácidos de GH humano de origen natural de longitud íntegra completo, así como la secuencia de aminoácidos GH de origen natural maduro y mutante de origen natural, ver SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 respectivamente aquí. En algunas modalidades, polipéptidos GH, por ejemplo polipéptidos hGH de la invención son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 o cualquier otra secuencia de un polipéptido de hormona de crecimiento. Por ejemplo, en algunas modalidades, polipéptidos GH por ejemplo polipéptidos hGH de la invención son al menos de aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% idénticos a SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3 de la Publicación de la Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 o cualquier otra secuencia de un polipéptido de hormona de crecimiento. En algunas modalidades, polipéptidos GH, por ejemplo polipéptidos hGH de la invención son al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% idénticos a SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. Una cantidad de mutantes de origen natural de hGH se han identificado. Esos incluyen hGH-V (Seeburg, DNA 1: 239 (1982); Patentes de los E.U.A. Números 4,446,235, 4,670,393 y 4,665,180, que se incorporan aquí por referencia) y hGH de 20-kDa que contienen una eliminación de residuos de 32-46 de hGH (SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404) (Kostyo et al., Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987); Lewis, U. , et al.h, J. Biol. Chern. , 253:2679-2687 (1978)). Hormona de crecimiento placentario se describe por Placental Igout, A., et at , Nucleic Acids Res. 17(10) :3998 (1989)). Además, numerosas variantes hGH que surgen de procesamiento post transcripción, post-traducción, secretorio, metabólico y otros procesos fisiológicos, se han reportado que incluyen variantes proteolíticamente escindidas o encadenados (Baumann, G. , Endocrine Reviews 12: 424 (1991)). Dímeros hGH enlazados directamente mediante enlace disulfuro Cys-Cys se describen en Lewis, U. J. , et al, J. Biol. Chem. 252: 3697-3702 (1977); Brostedt, P. and Roos, P., Prep. Biochem. 19: 217-229 (1989)). Moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes hGH y polipéptidos hGH mutantes son bien conocidas e incluyen pero no están limitadas a aquellas descritas en las patentes de los E.U.A. Números 5,534,617; 5,580,723; 5,688,666; 5,750,373 5,834,250; 5,834,598; 5,849,535; 5,854,026; 5,962,41 1 5,955,346; 6,013,478; 6,022,711; 6,136,563; 6,143,523 6,428,954; 6,451,561; 6,780,613 y la Publicación de la Solicitud de Patente de los E.U.A. Número 2003/0153003; que aquí se incorporan por referencia. Similarmente, el término "polipéptido" incluye los equivalentes mencionados anteriormente para polipéptidos conocidos. Preparaciones comerciales de hGH se venden bajo los nombres: HumatropMR (Eli Lilly & Co.), NutropinMR (Genentech), NorditropinMR (Novo-Nordisk) , GenotropinMR (Pfizer) y Saizen/SerostimMR (Serono) . El término "polipéptido" también incluye las sales y prodrogas farmacéuticamente aceptables, y prodrogas de las sales, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biológicamente activos, variantes fisiológicamente activos y esteroisómeros del polipéptido de origen natural así como agonistas, miméticos y variantes antagonistas del polipéptido y sus fusiones polipéptido de origen natural. Fusiones que comprende aminoácidos adicionales y el término amino, término carboxilo o ambos están abarcados por la expresión "polipéptido". Funciones ejemplares incluyen pero no están limitadas por ejemplo a metionilo polipéptido incluyendo pero no limitando a hormona de crecimiento en donde una metionina esta enlazada con el término N del polipéptido que resulta de la expresión recombinante del polipéptido, fusiones para el propósito de purificación (incluyendo pero no limitadas a poli-histidina o epítopos de afinidad) , fusiones con péptidos de enlace de albúmina suero y fusiones con proteínas de suero tales como albúmina de suero. La Patente de los E.U.A. Número 5,750,373, que se incorpora aquí por referencia, describe un método para seleccionar proteínas novedosas tales como hormona de crecimiento y variantes de fragmento de anticuerpo que tienen proteínas de las alteradas para sus moléculas receptoras respectivas. El método comprende fusionar un gen que codifica una proteína de interés al dominio terminal carboxi de la proteína de revestimiento de gen III del fago filamentoso Ml 3. Diversas referencias describen modificación de polipéptidos por conjugación o glicosilación de polímero. El término "polipéptido" incluye polipéptidos conjugados a un polímero tal como PEG y pueden comprender una o más derivatizaciones adicionales de cisteína, lisina u otros residuos. Además, el polipéptido puede comprender un enlazador o polímero, en donde el aminoácido al cual se conjuga el enlazador polímero puede ser un aminoácido no natural de acuerdo con la presente invención, o puede estar conjugado con un aminoácido naturalmente codificado utilizando técnicas conocidas en la especialidad tales como acoplamiento con lisina o cisteína. Conjugación de polímero de polipéptidos incluyendo pero no limitados a hGH se ha reportado. Ver por ejemplo las Patentes de los E.U.A. Números 5,849,535, 6,136,563 y 6,608,183, que se incorporan aquí por referencia. La Patente de los E.U.A. Número 4,904,584 describe polipéptidos agotados de lisina modificados con PEG en donde al menos un residuo lisina se ha eliminado o reemplazado con cualquier otro residuo aminoácido. WO 99/67291 describe un proceso para conjugar una proteína con PEG, en donde al menos un residuo aminoácido en la proteína se elimina y la proteína se contacta con PEG bajo condiciones suficientes para lograr conjugación a la proteína. WO 99/03887 describe variantes modificadas con PEG de polipéptidos que pertenecen a la superfamilia de de hormona de crecimiento, en donde se ha sustituidos un residuo cisteína con un residuo no aminoácido no esencial ubicado en una región especificada del polipéptido. WO 00/26354 describe un método para producir una variante de polipéptido glicosilado con alerginicidad reducida, que como se compara con un polipéptido precursor correspondiente comprende al menos un sitio de glicosilación adicional. La Patente de los E.U.A. Número 5,218,092, que se incorpora aquí por referencia, describe modificación de factor de estímulo de colonia granulocitos (G-CSF granulocyte colony stimulating factor) y otros polipéptidos a fin de introducir por lo menos una cadena de carbohidrato adicional en comparación con el polipéptido nativo. El término "polipéptido" también incluye polipéptido glicosilado así como si pero no limitado a polipéptidos glicosilados en cualquier posición aminoácido, formas glicosiladas N-enlazadas u 0 enlazadas del polipéptido. Variantes que contienen cambios de nucleótidos sencillo también se consideran como variantes biológicamente activas del polipéptido. Además, variantes de combinación también se incluyen. El término "polipéptido" también incluye heterodímeros, homodímeros, heteromultímeros y homomultímeros de polipéptido, de cualquiera uno o más polipéptido o cualquier otro polipéptido como proteína, carbohidrato, polímero, pequeña molécula enlazador ligando u otra molécula biológicamente activa de cualquier tipo enlazadas por medios químicos o expresadas como una proteína de fusión así como análogos polipéptido que contienen por ejemplo eliminaciones específicas u otras modificaciones sin embargo mantienen actividad biológica. Todas las referencias a posiciones de aminoácidos de GH5 por ejemplo hGH aquí descritas, se basan en la posición en SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404, a menos que se especifique de otra forma (es decir cuando se establece que la comparación se basa en SEQ ID NO: 1 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404, 3 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, u otra secuencia hGH) . Aquellos con destreza en la técnica apreciarán que posiciones de aminoácido correspondientes a posiciones en SEQ ID NO: 1, 2 o 3 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404 o cualquier otra secuencia GH, pueden ser fácilmente identificadas en cualquier otra GH, por ejemplo moléculas hGH tal como GH, o fusiones, variantes, fragmentos hGH, etc. Por ejemplo, programas de alineamiento de secuencia tales como BLAST pueden utilizarse para alinear e identificar una posición particular en una proteína que corresponde con la posición en SEQ ID NO: 1, 2, o 3 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 u otras secuencias GH. Sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos aquí descritos en referencia a SEQ ID NO: 1, 2, o 3 la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 u otra secuencia GH se pretende que también se refieran a sustituciones, eliminaciones o adiciones en posiciones correspondientes en GH, o fusiones variantes, fragmentos, etc. de hGH descritos aquí o conocidos en la especialidad y se abarcan expresamente por la presente invención. El término "polipéptido" abarca polipéptidos que comprenden una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Polipéptidos de la presente invención pueden comprender modificaciones con uno o más aminoácidos naturales en conjunto con una o más modificaciones de aminoácidos no naturales. Sustituciones ejemplares en una amplia variedad de posiciones de aminoácidos en polipéptidos de origen natural se han descrito pero no limitado a sustituciones que modulan una o mas de las actividades biológicas del polipéptido tal como, pero no limitado a incrementada actividad agonista, incrementada solubilidad de polipéptido, disminuida susceptibilidad a proteasa, convertir el polipéptido en un antagonista, etc. y se abarcan por el término "polipéptido".

Antagonistas GH humanos incluyen pero no están limitados a aquellos con sustituciones en: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123 y 127 o una adición en la posición 1 (es decir en el extremo N) o cualquier combinación de las mismas (SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, o el aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 1 o 3 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404 o cualquier otra secuencia de GH) . En algunas modalidades, antagonistas hGH comprenden cuando menos una sustitución en las regiones 1-5 (sección N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre hélice A y hélice B, el bucle A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, el bucle B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, el bucle C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (extremo C) que provocan que GH actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios de incorporación ejemplares de un aminoácido no naturalmente modificado incluyen residuos dentro de la región amino terminal de hélice A y una porción de la hélice C. En otra modalidad, la sustitución de G 120 con un aminoácido no naturalmente codificado tal como p-azido-L-fenialanina o O-propargil-L-tirosina . En otras modalidades, las sustituciones anteriormente citadas se combinan con sustituciones adicionales que provocan que el polipéptido hGH sea un antagonista hGH. Por ejemplo, un aminoácido no naturalmente codificado se sustituye en una de las posiciones identificadas aquí y una sustitución simultánea se introduce en G120 (G120R, G 120K, G 120W, G 120Y, G 120F o G 120E) . En algunas modalidades, el antagonista hGH comprende un aminoácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente en una región de enlace de receptor de la molécula hGH. En algunas modalidades, los polipéptidos además comprenden una adición, sustitución o eliminación que modula la actividad biológica del polipéptido. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden modular una o más propiedades o actividades del polipéptido. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden modular la afinidad para el receptor de polipéptido o socio de enlace, modular (incluyendo pero no limitado a, incrementos, decrementos) de diferenciación de receptor, estabilizar dímeros receptores, modular la conformación de una o más actividades biológicas de un socio de enlace, modular la vida media de circulación, modular la vida media terapéutica, modular la estabilidad del polipéptido, modular la escisión por proteasas, modular dosis, modular liberación o biodisponibilidad, facilitar la purificación o mejorar o alterar una ruta de administración particular. Similarmente, polipéptidos pueden comprender secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (incluyendo pero no limitados a FLAG o poli-His) u otras secuencias asadas en afinidad (incluyendo pero no limitadas a FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero no limitadas a biotina) que mejora la detección (incluyendo pero no limitadas a GFP) , purificación u otros rasgos del polipéptido. El término "polipéptido" también abarca homodímeros, heterodímeros, homomultímeros y heteromultímeros que están enlazados, incluyendo pero no limitados a aquellos enlazados directamente mediante cadenas laterales de aminoácido no naturalmente codificadas, ya sean a las mismas o diferentes cadenas laterales de aminoácidos no naturalmente codificadas, a cadenas laterales de aminoácidos naturalmente codificadas o indirectamente mediante un enlazador. Enlazadores ejemplares incluyen pero no están limitados a compuestos orgánicos pequeños, polímeros solubles en agua de una variedad de longitudes tales como poli (etilen glicol) o polidextrano o polipéptidos de diversas longitudes. Un "aminoácido no naturalmente codificado" se refiere a un aminoácido que o es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden usarse en forma sinónima con el término "aminoácido no naturalmente codificado" son "aminoácidos no natural" "aminoácido no natural in-natural" "aminoácido que no es de origen natural" y diversas versiones con guiones o sin guiones de los mismos. El término "aminoácido no naturalmente codificado" también incluye pero no está limitado a aminoácidos que ocurren por modificación (por ejemplo modificaciones pos-traducción) de un aminoácido naturalmente codificado (incluyendo pero no limitado a los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína) pero ellos mismos no están naturalmente incorporados en una cadena polipéptido de crecimiento por el complejo de traducción. Ejemplos de esos aminoácidos que no son de origen natural incluyen pero no están limitados a N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina y O-fosfotirosina. Un "grupo de modificación de extremo amino" se refiere a cualquier molécula que puede conectarse a un extremo amino de un polipéptido. Similarmente, un "grupo de modificación de extremo carboxi" se refiere a cualquier molécula que puede agregarse al extremo carboxi de un polipéptido. Grupos de modificaciones de extremo incluyen pero no están eliminados a diversos polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas tales como albúmina de suero u otras porciones que aumentan la vida media en suero de péptidos. El término "grupo funcional", "porción activa", "grupo de activación", "grupo saliente", "grupo reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "porción químicamente reactiva" como se emplean en la especialidad y aquí para referirse a porciones o unidades distintas, definibles de una molécula. Los términos son algo sinónimos en las especialidades químicas y se utilizan aquí para indicar las porciones de moléculas que realizan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas. El término "enlace" o "enlazador" se emplea aquí para referirse a grupos o enlaces que normalmente se forma como resultado de una reacción química y típicamente son enlaces coovalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo pero no limitados a bajo condiciones fisiológicas por períodos prolongados de tiempo, probablemente incluso en forma indefinida. Enlaces hidrolíticamente estables o degradables significan que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas incluyendo por ejemplo sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significan que el enlace puede ser degradado por una o más enzimas. Como se entiende en la especialidad, PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la estructura principal de polímero o en el grupo enlazador entre la estructura principal del polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula de polímero. Por ejemplo, enlaces éster formados por la relación de ácidos carboxílicos PEG o ácidos carboxílicos PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo, en general hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen pero no están limitados a enlaces carbonato; enlaces ti ina que resultan de reacción de una amina y un aldehido; enlaces fosfato éster formados al reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrasona que son producto de reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces acetal que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces ortoéster que son el producto de reacción de un formato y un alcohol; enlaces péptido formados por un grupo amina, incluyendo pero no limitados a, en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucléotido formados por un grupo fosforamidita, incluyendo pero no limitados a en un extremo de un polímero y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucléotido.

El término "molécula biológicamente activa", "porción biológicamente activa" o "agente biológicamente activo" cuando se utiliza aquí, significan cualquier sustancia que pueda afectar cualesquiera propiedades físicas o bioquímicas de un sistema biológico, ruta, molécula o interacción referente a un organismo, incluyendo pero no limitado a virus, bacterias, bacteriófago, transposón, prión, insectos, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se emplea aquí, moléculas biológicamente activas incluyen pero no están limitadas a cualquier sustancia pretendida para diagnóstico o curado mitigación, tratamiento o prevención de enfermedad en humanos u otros animales, o para de otra forma mejorar el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen pero no están limitadas a péptidos, proteínas, enzimas, drogas de molécula pequeña, vacunas, inmunógenos, drogas, drogas duras o drogas fuertes, drogas suaves o drogas que generan débiles síntomas de abstinencia o nulos, carbohidratos, átomos o moléculas inorgánicas, colorantes, lípidos, nucleósidos, radionúclidos, oligonucleótidos, toxoides, toxinas, células procarióticas y eucarióticas, virus, polisacáridos, ácidos nucleicos y sus porciones obtenidos o derivados de virus, bacterias, insectos, animales o cualquier otra célula o tipo de célula, liposomas, micropartículas y micelios. Clases de agentes biológicamente activos que son adecuadas para utilizar con la invención incluyen pero no están limitadas a drogas, prodrogas, radionúclidos, agentes de formación de imagen, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes antiflamatorios, agentes antitumor, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esteroidales, toxinas derivadas microbialmente y semejantes. Un "polímero bifuncional" se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otras porciones (incluyendo pero no limitadas a grupos laterales aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo en un componente biológicamente activo particular, y otro grupo reactivo con un grupo en un segundo componente biológico, puede utilizarse para formar un conjugado que incluye el primer componente biológicamente activo, el enlazador bifuncional y el segundo componente biológicamente activo. Muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para conectar diversos compuestos con péptidos, se conocen. Ver por ejemplo la solicitud de patente Europea Número 188,256; las patentes de los E.U.A. Números 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338, y 4,569,789, que se incorporan aquí por referencia. Un "polímero multifuncional" se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otras porciones (incluyendo pero no limitados a grupos laterales aminoácido) para formar enlaces covalentes o no covalentes. Un polímero bifuncional o polímero multifuncional puede ser de cualquier longitud o peso molecular deseados, y puede seleccionarse para proporcionar un espaciamiento o conformación particular deseado entre una o más moléculas enlazadas con la molécula. Cuando grupos sustituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escrito de izquierda a derecha, igualmente abarcan los sustituyentes químicamente idénticos que resultarán de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo la estructura -CH20- es equivalente a la estructura -0CH2-. El término "sustituyentes" incluye pero no está limitado a "sustituyentes no interferentes" . "Sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que producen compuestos estables. Sustituyentes o radicales no interferentes convenientes incluyen pero no están limitados a halo, C?-C?0 alquilo, C2-C?0 alquenilo, C2-C?0 alquinilo, Ci-Cio alcoxi, Ci.-Ci2 aralquilo, Cx-C?2 alcarilo, C3-C?2 cicloalquilo, C3-C12 cicloalquenilo, fenilo, fenilo sustituido, toluoilo, xilenilo, bifenilo, C2-C?2 alcoxialquilo, C2-C?2 alcoxiarilo, C -C?2 ariloxialquilo, C7-C?2 oxiarilo, C?-C6 alquilsulfinilo, Ci-Cio alquilsulfonilo, -- (CH2)m--0-- (C1-C10 alquil) en donde m es de 1 a 8, arilo, sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, --N02, --CN, --NRC (0) - (Ci-Cio alquilo), -C (0) - (Ci-C?0 alquilo), C2-C!0 alquilo tioalquilo, -C(0)0-- (Ci-Cio alquilo), -OH, -S02, =S, -COOH, -NR2, carbonilo, --C(O) - (Ci-Cio alquilo) -CF3, --C(O)- CF3 , --C(0)NR2, --(d-C10 arilo) -S- (C6-C10 arilo) , -C (0) - (Ci-Cio arilo), - - (CH2) m - -0-- (-- (CH2)m--0-- (Ci-Cio alquilo) en donde cada m es de 1 a 8, --C(0)NR2, --C(S)NR2, --S02NR2, --NRC(0)NR2, --NRC(S)NR2, sus sales y semejantes. Cada R como se emplea aquí es H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o sustituido arilo, aralquilo o alcarilo . El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo, y bromo. El término "alquilo" por si mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se establezca de otra forma, una cadena recta o ramificada, o radical hidrocarburos cíclico, o su combinación, que puede estar totalmente saturado, mono- o poli -insaturado y puede incluir radicales di- y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (C?-Ci0 significa uno o diez átomos de carbono) . Ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen pero no están limitados a grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros por ejemplo de n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y semejantes. Un grupo alquilo insaturado es aquel que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen pero no están limitados a vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienilo) , 2,4-pentadienilo, 3- (1 , 4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3 -butinilo, y los superiores homólogos e isómeros. El término "alquilo" a menos que sea en otra forma, también se pretende que incluya aquellos derivados de alquilo definidos con más detalle a continuación, tales como "heteroalquilo" . Grupos alquilo que se limitan a grupos hidrocarburos se denominan "homoalquilo" . El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de alcano, como se ejemplifica, pero no limitado por las estructuras -CH2CH2- y -CH2CH2CH2CH2- , y además incluye aquellos grupos descritos a continuación como "heteroalquileno". Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono que son una modalidad particular de los métodos y composiciones aquí descritas. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, en general que tiene 8 o menos átomos de carbono.

Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se emplean en su sentido convencional y se refieren a aquellos grupos alquilo conectados al resto de la molécula mediante un átomo de oxígeno, un grupo amino, o un átomo de azufre, respectivamente. El término "heteroalquilo" por sí mismo o en combinación con otro término, significa a menos de que se establezca de otra forma, una cadena recta o ramificada estable, o radical hidrocarburo cíclico, o sus combinaciones, que consisten del número establecido de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de O, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden oxidarse y el heteroátomo de nitrógeno puede opcionalmente cuaternizarse . El o los heteroátomos 0, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo se conecta al resto de la molécula. Ejemplos incluyen pero no están limitados a -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3) -CH3, - CH2-S-CH2-CH3 , -CH2-CH2-S (O) -CH3 , -CH2-CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, -Si(CH3)3, - CH2-CH=N-OCH3 , y -CH=CH-N(CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos tales como por ejemplo -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0-Si(CH3)3. Similarmente, el término "heteroalquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente, significa un radical divalente derivado de heteroalquilo como se ejemplifica pero no limitado por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para grupos heteroalquileno, heteroátomos iguales o diferentes también pueden ocupar ya sea cualquiera o ambos de los extremos de cadena (incluyendo pero no limitados a alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamina, alquilendiamina, aminooxialquileno, y semejantes) . Aún más, para grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, no se implica orientación del grupo de enlace por la dirección en la que la fórmula del grupo enlace es escrita. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'- se representa tanto con -C(0)2R'- como -R3C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" por si mismos o en combinación con otros términos, representan a menos de que se establezca de otra forma, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. De esta manera, un cicloalquilo o heterocicloalquilo puede incluir enlaces de anillo saturados, parcialmente insaturados y totalmente insaturados. Adicionalmente, para heterocicloalquilo un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo se conecta al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen pero no están limitados a ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3- ciciohexenilo, cicioheptilo, y semejantes. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen pero no están limitados a 1- (1, 2, 5, 6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3- morfolinilo, tetrahidrofurano-2 -ilo, tetrahidrofurano-3-ilo, tetrahidrotieno-2-ilo, tetrahidrotieno-3- ilo, I-piperazinilo, 2-piperazinilo, y semejantes. Adicionalmente, el término abarca estructuras de anillo bicíclicas y tricíclicas. Similarmente, el término "heterocicloalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo y el término "cicloalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de cicloalquilo. Como se emplea aquí, el término "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero que es soluble en solventes acuosos. El enlace de polímeros solubles en agua con polipéptidos puede resultar en cambios, incluyendo pero no limitados a vida media en suero incrementada o modulada, o vida media terapéutica incrementada modulada respecto a la forma no modificada, immunogenicidad modulada, características de asociación física moduladas tales como agregación y formación de multímeros, enlace de receptor alterado, enlace alterado con uno o más socios de enlace y dimerización o multimerización de receptor alterado. El polímero soluble en agua puede o no tener su propia actividad biológica y puede utilizarse como un enlazador para conectar polímeros con otras sustancias, incluyendo pero no limitado a uno o más polipéptidos, una o más moléculas biológicamente activas. Polímeros convenientes incluyen pero no están limitados a polietilen glicol, polietilen glicol propionaldehído, sus derivados mono C1-C10 alcoxi o ariloxi (descritos en la patente de los E.U.A. Número 5,252,714 que se incorpora aquí por referencia) , monometoxi-polietilen glicol, polivinilo pirrolidina, polivinilo alcohol, poliaminoácidos, anhídrido diviniléter maléico, N-(2-Hidroxipropil) -metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluyendo dextrano sulfato, polipropilen glicol, copolímero de propilen óxido/etileno óxido, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo pero no limitados a metilcelulosa y carboximetil celulosa, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquilen glicol y sus derivados, copolímeros de polialquileno glicoles y sus derivados, poliviniletil éteres, y alfa-beta-poli [(2- hidroxietil) -DL-aspartamida, y semejantes y sus mezclas. Ejemplos de estos polímeros solubles en agua incluyen pero no están limitados a polietilen glicol y albúmina de suero. Como se emplea aquí, el término "polialquilen glicol" o "poli (alquilen glicol)" se refiere a polietilen glicol (poli (etilen glicol)), polipropilen glicol, polibutilen glicol, y sus derivados. El término "polialquilen glicol" y/o "polietilen glicol" abarca tanto polímeros lineales como ramificados y pesos moleculares promedio entre 0.1 kDa y 100 kDa. Otras modalidades ejemplares se citan por ejemplo en catálogos de proveedores comerciales tales como el catálogo de Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001) . El término "arilo" significa, a menos que se establezca de otra forma un sustituyente hidrocarburo pol-insaturado, aromático, que puede ser de un solo anillo o múltiples anillos (incluyendo pero no limitado a desde uno a tres anillos) que están fusionados en conjunto o enlazados en forma covalente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0, y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre están opcionalmente oxidados y el o los átomos e nitrógeno están opcionalmente cuaternizados . Un grupo heteroarilo puede conectarse al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, -l-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4- imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenilo-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4- isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazoIilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2- benzimidazolilo, -indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2 -quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, o 6-quinolilo. Sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo anteriormente anotados se eligen del grupo de sustituyentes aceptables descritos a continuación. Por brevedad, el término "arilo" cuando se utiliza en combinación con otros términos (incluyendo pero no limitados a ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluyen tanto anillos arilo y heteroarilo como se definió anteriormente. De esta manera, el término "arilalquilo" se pretende que incluya aquellos radicales en donde se conecta un grupo arilo a un grupo alquilo (incluyendo pero no limitado a benzilo, fenetilo, piridilmetilo y semejantes) incluyendo aquellos grupos alquilo en donde un átomo de carbono (incluyendo pero no limitado a un grupo metileno) se ha reemplazado por ejemplo por un átomo de oxígeno (incluyendo pero no limitado a fenoxi metilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo, y semejantes) . Cada uno de los términos anteriores (incluyendo pero no limitados a "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") se pretende que incluyan tanto formas sustituidas como sin sustituir del radical indicado. Sustituyentes ejemplares para cada tipo de radical se proporcionan a continuación. Sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos a menudo referidos como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados pero no limitados a: -OR1 , =0, =NR' , =N-0R', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(0)R', -C(0)R', -C02R', -CONR'R", -OC(0)NR5R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', - NR55C(0)2R', -NR-C (NR ' R"R ' " ) =NR" " , NR-C(NR'R")=NR' ", -S(0)R', -S(0)2R', - S(0)2NR'R", -NRS02R', -CN y -N02 en una cantidad en el intervalo de 0 a (2m'+l), n donde m' es el número total de átomos de carbono en dicho radical. R', R" , R'" y R" " cada uno independientemente se refieren a hidrógeno, heteroalquilo sustituido y sin sustituir, arilo sustituido y sin sustituir, incluyendo pero no limitado a arilo sustituido con 1-3 átomos de halógeno, grupos alquilo alcoxi o tioalcoxi sustituidos o sin sustituir o grupos aril alquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo cada uno de los grupos R se eligen independientemente como cada uno de los grupos R', R" , R" ' y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se conectan al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6-, o 7- miembros. Por ejemplo, -NR'R" se pretende que incluya pero no está limitado a 1-pirroiidinilo y 4-morfolinilo. De la discusión anterior de sustituyentes, una persona con destreza en la técnica comprenderá que el término "alquilo" se pretende que incluya grupos incluyendo átomos de carbono ligados a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero no limitados a -CF3 y — CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitados a -C(0)CH3, -C(0)CF3, C(0)CH2OCH3, y semejantes). Similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y seleccionados de, pero no limitados a: halógeno, -OR', =0, =NR', =N-0R5, -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R'", -0C(0)R', -C(0)R', -C02R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR ' -C (0) NR"R"' , -NRC(0)2R', -NR-C(NR'R"R" ' )=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(0)R', -S(0)2R', S(0)2NR'R", -NRS02R', -CN y -N02, -R', -N3, - CH(Ph)2, fluoro (C?-C4) alcoxi, y fluoro (C?-C4) alquilo, en una cantidad en el intervalo de cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en donde R', R" , R'" y R"" se eligen independientemente de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo cada uno de los grupos R se elige independientemente como cada uno de los grupos R', R" , R'" y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente. Como se emplea aquí, el término "vida media en suero modulada" significa el cambio positivo o negativo en la vida media en circulación de un polipéptido modificado respecto a su forma no modificada. Vida media en suero se mide al tomar muestras de sangre en diversos puntos en tiempo y después de administración de polipéptido y determinar la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración en suero con el tiempo permite cálculo de la vida media en suero. Incrementada vida media en suero convenientemente tiene al menos aproximadamente dos veces pero un aumento menor puede ser útil, por ejemplo cuando permite un régimen de dosificación satisfactorio o evita un efecto tóxico. En algunas modalidades, el aumento es al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces o al menos aproximadamente diez veces. El término "vida media terapéutica modulada" como se emplea aquí, significa el cambio positivo o negativo en la vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido modificado respecto a su forma no modificada. Vida media terapéutica se mide al medir propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en diversos puntos de tiempo, después de administración. Incrementada vida media terapéutica convenientemente permite un régimen de dosis benéfico particular, una dosis total benéfica particular o evita un efecto indeseable. En algunas modalidades, la vida media terapéutica incrementada resulta de incrementada potencia, incrementado o disminuido enlace de la molécula modificada a su objetivo, incrementada o disminuida descomposición de la molécula por enzimas tales como proteasas, o un incremento o un decremento en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada. El término "inmunogeniccidad" significa la capacidad de una proteína para producir una respuesta inmune, incluyendo pero no limitada a producción de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes, formación de complejos inmunes, activación de complemento, activación de mastocitos, inflamación y anafilaxis. Una respuesta inmune puede ser humoral (anticuerpo que secreta B-linfocito) , mediada por célula (T-linfocito) , o ambos. El término "inmunogenicidad" también abarca alergenicidad. La alergenicidad se define como la capacidad de una sustancia para producir una inmunorespuesta IgE ante inmunización o exposición a la sustancia. Los alérgenos son sustancias que inducen el estado hipersensible de alergia y estimulan la formación de anticuerpos en algunos sujetos. Alérgenos pueden ser de origen natural o de origen sintético e incluyen pero no están limitados a polen, desechos de insectos, alimentos, suero de sangre, esporas de moho, polvo, caspa o descamación de animales, y drogas. El término "inmunogenicidad modulada" como se emplea aquí significa el cambio positivo o negativo en la capacidad para activar el sistema inmune, ya sea mediado por células o humoral, cuando se compara con la proteína del tipo silvestre. Por ejemplo, una proteína variante puede decirse que tiene inmunogenicidad modulada, si produce anticuerpos neutralizantes y/o no neutralizantes que en el título superior o inferior o en más o menos sujetos que el polipéptido de tipo silvestre o no produce anticuerpos neutralizantes y/o no neutralizantes. La cantidad anticuerpos neutralizantes y/o anticuerpos no neutralizantes puede aumentar o disminuirse. Si un polipéptido de tipo silvestre produce una respuesta inmune en un por ciento de sujetos, una variante con inmunogenicidad reducida, por ejemplo producirá una respuesta inmune en un porcentaje menor de sujetos o en ninguno de los sujetos. Una proteína variante también puede decirse que tiene reducida inmunogenicidad, si por ejemplo, muestra enlace disminuido con uno o más alelos MHC o si induce activación de células T en una fracción disminuida de sujetos respecto a proteína del tipo silvestre. Sin estar limitados por ningún mecanismo de acción particular, ingreso de antígeno, enlace de célula T, o enlace de anticuerpos, puede ser afectado por modificaciones que aumentan o disminuyen la inmunogenicidad de la proteína. El término "aislado", cuando se aplica a una proteína o ácido nucleico, denota que el ácido nucleico o proteína está libre de al menos algunos de los componentes celulares con los cuales se asocia en el estado natural, o que el ácido nucleico o proteína se ha concentrado a un nivel mayor que la concentración de su producción in vivo o in vitro. Puede estar en un estado homogéneo. Sustancias aisladas ya pueden estar en un estado seco o semiseco, o en solución incluyendo pero limitadas a una solución acuosa. Puede ser un componente de una composición farmacéutica que comprende portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptable adicionales. Pureza y homogeneidad típicamente se determina utilizando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto desempeño. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de marcos de lectura abiertas que flanquea al gen y codifican una proteína diferente al gen de interés. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína del lugar sustancialmente a una banda en un gen electroforético. Particularmente, puede significar que el ácido nucleico o proteína es al menos 85% puro, al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 90% o más puro. El término "ácido nucleico" se refiere a deoxiribonucleótidos, deoxiribonucleósidos, ribonucleósidos, o ribonucleótidos y sus polímeros ya sea en forma de una sola o doble hebra. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos que los naturales que tienen propiedades de enlaces similares que el ácido nucleico de referencia y se metaboliza en una forma similar a nucleótidos de origen natural. A menos que se limite específicamente otra forma, el término también se refiere a análogos oligonucleótido que incluyen ácido peptidonucleico (PNA =peptidonucleic acid) , análogos de ADN utilizados en tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos, y semejantes) . A menos que se indique otra forma, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente sus variantes modificadas en forma conservadora (incluyendo pero no limitadas a sustituciones codón degeneradas) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, sustituciones de codón degenerado puede lograrse al generar secuencias en donde la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituyen con residuos de base mixta o deoxinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et ah, J. Biol. Chem. 260/2605-2608 (1985) ;Rossolini et al, Mol. Cell. Los términos "polipéptido", "peptido" y "proteína" se emplean aquí en forma intercambiable para referirse a un polímero de residuos aminoácido. Esto es, una descripción dirigida a un polipéptido, aplica igualmente una descripción de un péptido de una descripción de una proteína y viceversa. Los términos aplican a polímeros de aminoácido de origen natural así como polímeros de aminoácido en donde uno o más residuos aminoácido son un aminoácido no naturalmente codificado. Cómo se emplean aquí, los términos abarcan cadenas aminoácido de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud íntegra, en donde los residuos aminoácido se ligan por enlaces péptido covalente. El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y no natural, así como análogos aminoácidos y aminoácidos miméticos que funcionan en una forma similar a los aminoácidos de origen natural . Aminoácidos naturalmente codificados son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, y valina) y pirrolisina y selenocisteina . Análogos aminoácidos se refiere a compuestos que tiene la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural; es decir un carbono a que se ligan a un hidrógeno como un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tal como homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonío. Estos análogos tienen grupos R modificadas (tales como norleucina) o estructuras principales péptido modificadas, pero retiene la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural . Aminoácidos pueden ser referidos aquí ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de tres letras recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Nucleótidos, igualmente pueden ser referidas por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados . "Variantes modificadas en forma conservadora" se aplican tanto a secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleico particulares "variantes modificadas de manera conservadora" se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas, O en donde el ácidos nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, consecuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. De esta manera, en toda posición en donde está especificada una alanina por un codón, el codón puede ser alterado con cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas en forma conservadora. Toda secuencia de ácido nucleico aquí que codifica polipéptido también describe toda variante silenciosa posible del ácido nucleico. Una persona con destreza ordinaria la especialidad reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el único codón para metionina in TGG, que ordinariamente es el único codón para triptofano) pueden modificarse para dar por resultado una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con esto, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifican polipéptido, es implícita en cada secuencia descrita. En cuanto a secuencias aminoácido, una persona con destreza ordinaria la técnica reconocerá que sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, agrega o elimina un solo aminoácido un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variantes modificada en forma conservadora" en donde la alteración resulta en la eliminación de un aminoácido, adición de un aminoácido, sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar, son conocidas por aquellos con destreza ordinaria en especialidad. Estas variantes modificadas en forma conservadora son además de y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención. Tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar, se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Los siguientes ocho grupos, cada uno contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , ácido Glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (1) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; 6) fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteína (C) , Metionina (M) (ver por ejemplo Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co . ; 2nd edition (Diciembre 1993) Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido o ácidos nucleicos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Secuencias son "sustancialmente idénticas" y tiene un porcentaje de residuos aminoácido o nucleótidos que son los mismos (es decir aproximadamente 60% de identidad, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 99% de identidad sobre una región especificada) cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia (u otros algoritmos disponibles a las personas con destreza ordinaria en la especialidad) o por alineamiento manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. La identidad puede existir sobre una región que es al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos en longitud, o sobre una región que es 75-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o cuando no se especifica través de toda la secuencia de un poli nucleótido o polipéptido. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como la secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, secuencias de prueba de referencia se alimentan ene una computadora, se designan coordinados de sus secuencia y de ser necesario se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Parámetros de programa pre-definidos puedan emplearse, o pueden designarse parámetros alternos. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula el por ciento de identidad de secuencia para la secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia con base en los parámetros de programa . Una "ventana de comparación" como se emplea aquí, incluye referencia a un segmento de cualquiera de la cantidad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en donde una secuencia puede compararse con la secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean forma óptima dos secuencias. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen por aquellos con destreza ordinaria en especialidad. Alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse incluyendo pero no limitado a por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por el método de búsqueda de similaridad de Pearson and Lipman (1988) Pr oc . Nat 'I. Acad. Sci. USA 85:2444, o implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wl), o por alineamiento manual e inspección visual (ver por ejemplo, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) ) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al (1997) Nuc . Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol 215:403-410, respectivamente. El pPrograma para realizar análisis BLAST está disponible al público a través de National Center for Biotechnology Information disponible en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinar la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótido) utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores predefinido una longitud de palabra de 3 y expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST típicamente se realiza por el filtro de "baja complejidad" desactivado. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias (ver por ejemplo Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de similaridad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad más pequeña de suma (P (N) ) , que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual ocurrirá por azar una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera un ácido nucleico similar a una secuencia de referencia si la probabilidad más pequeña de suma en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia puede ser menor que aproximadamente 0.2, o menor que aproximadamente 0.01, o menor que aproximadamente 0.001. La frase "hibridiza en forma selectiva (o específica) con" se refiere al enlace, duplejado, o hibridización de una molécula sólo con una secuencia de nucleótido particular bajo severas condiciones de hibridización cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (incluyendo pero no limitada a AND o ARN de biblioteca o celular total) . La frase "condiciones de hibridización severas" se refieren a hibridización de secuencias de ADN, ARN, APN, u otros mímicos de ácidos nucleicos o sus combinaciones, bajo condiciones de baja concentración iónicas y alta temperatura como se conoce en la técnica. Típicamente, bajo condiciones severas, una sonda hibridazará a su secuencia objetivo en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo pero no limitado a AND o ARN de biblioteca o celular total) pero no hibridiza a otras secuencias en la mezcla compleja. Condiciones severas son dependientes de secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Secuencias más largas hibridizan específicamente a superiores temperaturas. Una guía extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). En general, condiciones severas se eligen que sean de aproximadamente 5-10 grados C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de concentración iónica definida. La Tn, es la temperatura (bajo definidos concentración iónica, pH, y concentración nucleica) en la cual el 50% de las sondas complementarias al objetivo hibridizan a la secuencia objetivo el equilibrio (como las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio) . Condiciones severas pueden ser aquellos en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.0 M de ion sodio, típico aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración ion sodio (u otros sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 grados C para cortas sondas (incluyendo pero no limitadas a, 10 a 50 nucleótidos) y que al menos aproximadamente 60 grados C para sondas largas (incluyendo pero no limitadas, a más que 50 nucleótidos) . Condiciones severas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridización selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos dos veces el fondo, de manera opcional 10 veces la hibridización de fondo. Condiciones de hibridización ejemplares severas pueden ser como sigue: 50% formamida, 5X SSC5 y 1% SDS, incubación a 42°C, o 5X SSC, 1% SDS, incubación a 65°C, con lavado en 0.2X SSC, y 0.1% SDS a 65 °C. Estos lavados pueden realizarse por S, 15, 30, 60, 120, o más minutos. Como se emplea aquí, el término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya tales como animales (incluyendo pero no limitados a mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.), ciliados, plantas (incluyendo pero no limitados monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.), hongos, levaduras, flagelados, microsporidea, protistas, etc. Como se emplea aquí, el término "no-eucariota" de refiere a organismos no eucarióticos. Por ejemplo, un organismo no eucariótico puede pertenecer al dominio filogenético eubacteria (incluyendo pero no limitado a, Escherichia coli , Thermus thermophilics, Bacillus stearothermophilus , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), o el dominio filogenético Archaea (incluyendo pero no limitado a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium tales como las especies Haloferax volcanii y Halobacie?um NRC-I, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.) . El término "sujeto" como se emplea aquí, se refiere a un animal, en algunas modalidades un mamífero y en otras modalidades un humano, que es el objeto de tratamiento, observación o experimento. El término "cantidad efectiva" como se emplea aquí, se refiere a aquella cantidad del polipéptido aminoácido no natural modificado que se administra, que aliviará en cierta medida uno o más de los síntomas de la enfermedad, condición o desorden que se trata. Composiciones que contienen el polipéptido aminoácido no natural modificado aquí descrito, puede administrarse para tratamientos profilácticos de mejora y/o terapéuticos. Los términos "mejora" o "mejorar" significan incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración un efecto deseado. De esta manera, respecto a mejorar el efecto de agentes terapéuticos, el término "mejorar" se refiere a la capacidad en incrementar o prolongar, ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad de mejora efectiva" como se emplea aquí, se refiere a una cantidad adecuada para mejorar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se utiliza en un paciente, cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad y curso de la enfermedad desorden o condición, terapia previa, el estado de salud del paciente y respuesta a las drogas, y el juicio del médico que se encarga del tratamiento. El término "modificado", como se emplea aquí, se refiere a cualesquiera cambios realizados a un polipéptido determinado, tales como cambios a la longitud del polipéptido, la secuencia de aminoácidos, estructura química, modificación de co-reducción, o modificación de postraducción de un polipéptido. La forma de término "(modificado)", significa que los polipéptidos que se discuten están opcionalmente modificados, esto es los polipéptidos bajo discusión pueden estar o no modificados. El término "modificado post-traducción" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o no natural, que ocurre a dicho aminoácido después de que se ha incorporado en una cadena polipéptido. El término abarca, a manera de ejemplo solamente, modificaciones de co-traducción in vivo, modificaciones de co-traducción in vitro (tales como en un sistema de traducción libre de células) , modificaciones de post-traducción in vivo y modificaciones de pos-traducción in vi tro. En aplicaciones profilácticas, composiciones que contienen el polipéptido aminoácido no natural modificado se administran a un paciente susceptible a o de otra forma en riesgo de una enfermedad, desorden o condición particular. Esta cantidad se define como una "cantidad profilácticamente efectiva" . En este uso las cantidades precisas también dependen del estado de salud del paciente, peso y semejantes. Se considera bien dentro de la destreza de la técnica que se determine dichas cantidades profilácticamente efectivas mediante experimentación rutinaria (por ejemplo una prueba clínica con escala de dosis) . El término "protegido" se refiere a la presencia de un "grupo protector" o porción que evita reacción del grupo funcional químico reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo o grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonil (t-Boc) y 9- fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico tal como ácido butanóico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser un grupo bencilo o alquilo tal como metilo, etilo, o ter-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la técnica también pueden emplearse o con los métodos y composiciones aquí descritos, incluyendo grupos foto-lábiles tales como Nvoc y MeNvoc . Otros grupos protectores conocidos en la especialidad también pueden emplearse en o con los métodos y composiciones aquí descritos . A manera de ejemplo solamente, grupos bloqueadores/protectores pueden seleccionarse de: Alilo 1-butilo Cbz alloc Me Et 1-butilo TBDMS Teoc Boc pMBn tritilo acetilo Fmoc Otros grupos protectores se describen por Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed. , John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En aplicaciones terapéuticas, composiciones que contienen el polipéptido aminoácido no natural modificado, se administran a un paciente que ya sufre de una enfermedad, condición o desorden, en una cantidad suficiente para curar o al menos parcialmente frenar los síntomas de la enfermedad de estado de una condición. Dicha cantidad se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva" y dependerá de la severidad del curso de la enfermedad, desorden o condición, terapia previa, el estado de salud del paciente y respuesta a las drogas y el juicio del médico que se encarga del tratamiento. Se considera bien dentro de la destreza en la técnica que se pueden determinar dichas cantidades terapéuticamente efectivas mediante experimentación rutinaria (por ejemplo una prueba clínica con escala de dosis) .

El término "tratamiento" se emplea para referirse ya sea tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. Polipéptidos aminoácidos no naturalmente codificados aquí presentados, pueden incluir compuestos isotópicamente etiquetados con uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número de masa diferente de la masa atómica o número de masa usualmente encontrada en la naturaleza. Ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los presentes compuestos incluyendo isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, flúor y cloro tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 1SN, 180, 170, 35S5 18F, 3eCl , respectivamente. Ciertos compuestos isotópicamente etiquetados aquí descritos por ejemplo aquellos en donde isótopos radioactivos tales como 3H y 14C se incorporan, pueden ser útiles en ensayos de distribución de tejido de sustrato y/o en droga. Además, sustitución con isótopos tales como deuterio, es decir, 2H puede dar por resultado ciertas ventajas terapéuticas que resultan de mayor estabilidad metabólica, por ejemplo incrementada vida media in vivo o reducidos requerimientos de dosis. Todos los isómeros incluyendo pero no limitados a diaesterómeros, enantiómeros, y mezclas de los mismos, se consideran como parte de las composiciones aquí descritas. En modalidades adicionales o extra, los polipéptidos aminoácidos no naturalmente codificados se metabolizan ante administración a un organismo que requiere producir metabolito que se utiliza entonces para producir un efecto deseado, incluyendo un efecto terapéutico deseado. En modalidades extra o adicionales están metabolitos activos o polipéptidos aminoácidos no naturalmente codificados. En algunas situaciones, polipéptidos aminoácidos no naturalmente codificados pueden existir como tautómeros. Además, los polipéptidos aminoácidos no naturalmente codificados aquí descritos pueden existir en formas solvatadas y no solvatadas con solventes farmacéuticamente aceptables como agua etanol y semejantes. Las formas solvatadas también se consideran aquí descritas. Aquellos con destreza ordinaria en la técnica reconocerán que algunos de los compuestos presentes pueden existir en varias formas tautoméricas. Todas estas formas tautoméricas se consideran como parte de las composiciones aquí descritas. A menos que se indique de otra forma, métodos convencionales de espectroscopia de masa, RMN, HPLC, química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología dentro de la destreza de la especialidad, se emplean. DESCRIPCIÓN DETALLADA 1. Introducción Una de las estrategias más difundidas para reducir la inmunogenicidad y/o alergenicidad de polipéptidos, ha sido el proteger epítopos del polipéptido que dan lugar a la respuesta inmune o alérgica indeseada con moléculas de polímero, tales como poli (etilen glicol) (PEG), conjugado con el polipéptido. La patente de los E.U.A. Número 5,856,451, que se incorpora aquí por referencia, describe polipéptidos modificados con alergenicidad reducida; los polipéptidos comprenden un polipéptido precursor con un peso molecular en el intervalo de 10-100 kDa conjugado con un polímero con un peso molecular en el intervalo de 1-60 kDa. El polipéptido puede ser una variante de la proteína precursora que tiene grupos de conexión adicionales, tales como grupos amino no presentes en la proteína precursora. WO 96/40792, que se incorpora aquí por referencia, describe un método específico de modificar con PEG proteínas para reducir alergenicidad y/o inmunogenicidad. WO 97/30148, que se incorpora aquí por referencia describe un método para reducir alergenicidad de una proteína, en donde la proteína se conjuga con cuando menos dos moléculas de polímero. WO 98/35026, que se incorpora aquí por referencia describe conjugados de polipéptido-polímero que tienen agregado (s) y/o retirado (s) uno o más grupos de conexión selectos para acoplar moléculas de polímero en la superficie de la estructura tridimensional del polipéptido. Utilizando mutagénesis dirigida de sitio, grupos de conexión para las moléculas de polímero pueden agregarse en sitios predeterminados de la superficie del polipéptido en un intento por incrementar el número de moléculas de polímero, que pueden conectarse y/o para retirar grupos de conexión en o cerca de sitio activo del polipéptido supuestamente para evitar excesiva modificación con PEG cerca del sitio activo, que puede llevar a actividad disminuida del polipéptido. Otro método para modificar polipéptidos se describe en WO 92/10755, que se incorpora aquí por referencia, en donde se ha sugerido reducir la alergenicidad de proteínas por identificación de epítopos y subsecuente destrucción del epítopo por modificación de residuos aminoácido que constituyen el epítopo. La patente de los E.U.A. Número 5,218,092, que se incorpora aquí por referencia describe polipéptidos con al menos un carbohidrato nuevo o adicional conectado, los polipéptidos supuestamente tienen estabilidad incrementada en comparación con el polipéptido no modificado correspondiente. La o las moléculas carbohidrato adicionales se proporcionan al agregar uno o más sitios de N-glicosilación adicionales a la estructura principal de polipéptido, y expresar el polipéptido en una célula huésped de glicosilación. WO 00/26354, que se incorpora aquí por referencia, describe un método para reducir alergenicidad de proteínas, en particular enzimas en donde la reducción en alergenicidad es mediada al incrementar la glicosilación de la proteína a través de uno o más sitios de glicosilación adicionales. Aparte de dar lugar a una respuesta inmune, una desventaja conocida adicional asociada con el uso de drogas basadas en polipéptido, es que estas drogas a menudo rápidamente se degradan o eliminan en el cuerpo. Se ha reportado que la conjugación de polipéptido con moléculas de polímero puede incrementar la vida media funcional in vivo . Por ejemplo, la patente de los E.U.A. Número 4,935,465, que se incorpora aquí por referencia, describe un tiempo de liberación prolongado de un polipéptido modificado con PEG debido al tamaño incrementado del conjugado PEG del polipéptido en cuestión. WO 98/48837, que se incorpora aquí por referencia, se refiere a conjugados de polipéptidos-polialquilen óxido de enlace antígeno de cadena sencilla con reducida antigenicidad y vida media incrementada en la corriente sanguínea. El polipéptido de enlace de antígeno de cadena sencilla a modificarse puede incluir uno o más Cys o Lys insertados capaces de conjugación de polialquilen óxido en ciertos sitios predeterminados. Ver Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4): 249-304 (1992) . WO 96/12505, que se incorpora aquí por referencia, describe conjugados de un polipéptido con un compuesto lipofílico de bajo peso molecular, que se reportan tienen propiedades farmacológicas mejoradas. Se ha reportado que la modificación con PEG de polipéptidos puede resultar en reducida función del polipéptido. La protección del sitio activo del polipéptido durante modificación con PEG se ha sugerido en un intento para evitar esta reducción en actividad. Más específicamente, WO 94/13322, que se incorpora aquí por referencia, describe un proceso para la preparación de un conjugado entre un polímero y una primer sustancia que tiene una actividad biológica mediada por su dominio, en donde durante conjugación, el dominio de la primer sustancia se protege por una segunda sustancia que se retira después de que se ha llevado a cabo la conjugación. Al utilizar este método, la actividad biológica de la primera sustancia se preserva completamente en contraste con los procesos de conjugación convencionales, que pueden llevar a conjugados de polímero con reducida actividad biológica. WO 93/15189, que se incorpora aquí por referencia se refiere a un método para preparar aductos de PEG-enzima proteolítica en donde la enzima proteolítica se enlaza con un inhibidor macromolecularizado cuando se reacciona con PEG para bloquear el sitio activo de la enzima y de esta manera evitar que PEG se ligue en o cerca del sitio activo. WO 97/1 1957, que se incorpora aquí por referencia, describe un proceso para mejorar la función in vivo de un polipéptido, en particular factor VIII, al proteger objetivos expuestos del polipéptido, en cuyo método el polipéptido se inmoviliza por interacción con un adsorbente específico de grupo que transporta ligandos fabricados por síntesis orgánica química, un polímero biocompatible se activa y conjuga al polipéptido inmovilizado y el conjugado se eluye del adsorbente. WO 97/47751, que se incorpora aquí por referencia, describe diversas formas para modificaciones de una ADNsa, por ejemplo por conjugación a un polímero, una porción azúcar o un agente de derivatización orgánico. WO 99/40198, que se incorpora aquí por referencia, describe diversas variantes de estafiloquinasa, modificadas para resultar en inmunogenicidad reducida. La Patente de los E.U.A. Número 4,904,584, que se incorpora aquí por referencia, describe polipéptidos agotados con lisina modificada con PEG, en donde al menos un residuo lisina se ha reemplazado con cualquier otro residuo aminoácido. WO 99/67291, que se incorpora aquí por referencia, describe un proceso para conjugar una proteína con PEG, en donde al menos un residuo aminoácido en la proteína se elimina y la proteína se pone en contacto con PEG bajo condiciones suficientes para conjugar el PEG con la proteína. WO 99/03887, que se incorpora aquí por referencia, describe variantes modificadas con PEG de polipéptidos que pertenecen a la súper familia de hormona de crecimiento, en donde un residuo cisteína se ha sustituido por un residuo aminoácido no esencial ubicado en una región especificada del polipéptido. Todos los métodos de la técnica previa anteriormente descritos, se basan en utilizar un enfoque de puntaje dirigido para modificar los polipéptidos de interés. Utilizando dicha técnica de mutagénesis dirigida a sitio, grupos conectados a polímeros se agregan o retiran, de esta manera permitiendo construcción de conjugados de polímero-polipéptido, en donde las moléculas de polímero se conectan en ciertos sitios predeterminados, típicamente en la superficie del polipéptido a modificar. WO 98/27230, que se incorpora aquí por referencia, describe el uso de una técnica de premezclado para modificar proteínas. Entremezclado de Exon, humanización de anticuerpos monoclonales y mutagénesis específica de sitio son los métodos que se han sugerido para eliminar epítopos inmunogénicos . Varios factores pueden contribuir a inmunogenicidad de proteínas, incluyendo pero no limitados a secuencia de proteínas, la ruta y frecuencia de administración y la población de pacientes. La agregación se ha vinculado con la inmunogenicidad de interferona alfa [Braun et . al. Pharm. Res. 1997 14: 1472-1478]. Otro estudio sugiere que la presencia de alelos de DR15 MHC aumenta la susceptibilidad a formación de un tipo de anticuerpo neutralizante; de manera interesante, los mismos alelos también confieren susceptibilidad a esclerosis múltiple [Stickler et . al. Genes Iraraun. 2004 5: 1-7] . Ya que la agregación puede contribuir a la inmunogenicidad de polipéptidos tales como interferona (tales como interferona beta) variantes de ingeniería para mejorada solubilidad también pueden poseer reducida inmunogenicidad. Variantes agotadas de cisteína se han generado para minimizar formación de enlace bisulfuro inter- o intra-moleculares indeseados (Patentes de los E.U.A. Números 4,518,584; 4,588,585; 4,959,314 que se incorporan aquí por referencia); estas variantes muestran una tendencia reducida para agregación. Variantes de interferona beta con estabilidad mejorada se han reclamado, en donde el núcleo hidrofóbico se optimiza utilizando métodos de diseño racional (WO 00/68387, que se incorpora aquí por referencia) ; en algunos casos la solubilidad puede mejorarse por mejoras en la estabilidad. Formulaciones alternas que promueven estabilidad y solubilidad de interferona también se han descrito (Patentes de los E.U.A. Números 4,675,483; 5,730,969; 5,766,582; WO 02/38170 que se incorporan aquí por referencia) . Interferona beta muteínas con solubilidad mejorada se han reclamado, en donde varios residuos leucina y fenilalanina se reemplazan con residuos serina, treonina, o tirosina (WO 98/48018 que se incorpora aquí por referencia) . La Publicación de Patente de los E.U.A. Número 20050181446, que se incorpora aquí por referencia, describe enfoques al azar para introducir modificaciones en áreas de epítopo y el establecimiento de una biblioteca de mutantes diversificados, cada uno que tiene uno o más aminoácidos cambiados introducidos y seleccionar estas variantes, que muestran buena retención de función y al mismo tiempo una reducción significante en antigenicidad. Esta biblioteca diversificada puede establecerse por un intervalo de técnicas conocida por la persona con destreza en la especialidad (Reetz M T; Jaeger K E, en "Biocatalysis— from Discovery to Application" editado por Fessner W D, Vol. 200, pp. 31 -57 (1999); Stemmer, Nature, vol. 370, p.389-391, 1994; Zhao and Arnold, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, vol. 94, pp . 7997-8000, 1997; o Yano et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, vol. 95, pp 5511- 5515, 1998). Éstas incluyen pero no están limitadas a mutagénesis modificada, en donde ciertas posiciones de la secuencia de proteínas se someten al azar al llevar a cabo mutagénesis PCR utilizando uno o más cebadores oligonucleótido que se sintetizan utilizando una mezcla de nucleótidos para ciertas posiciones (Lanio T, Jeltsch A, Biotechniques, Vol. 25(6), 958,962,964-965 (1998)). Las mezclas de oligonucleótidos empleados dentro de cada triplete pueden diseñarse de manera tal que el ácido correspondiente del producto de gen mutado se distribuye al azar dentro de alguna función de distribución predeterminada. Se han descrito algoritmos, que facilitan este diseño (Jensen L J et al., Nucleic Acids Research, Vol. 26(3), 697-702 (1998)). Otros métodos se han desarrollado para modular la inmunogenicidad de proteínas, incluyendo un enfoque para romper la activación de célula T al retirar agréfopos en la CMHC, evadir enlace anticuerpo o receptor de célula T. La diversidad de moléculas MHC comprende sólo aproximadamente 103 alelos, mientras que el repertorio de anticuerpos se estima que es aproximadamente 108 y el repertorio de receptores de célula T es todavía más grande. Al identificar y retirar o modificar péptidos de enlace MHC clase II dentro de una secuencia de proteínad, la base molecular de inmunogenicidad puede ser evadida. La eliminación de estos agrétopos para el propósito de generar proteínas menos inmunogénicas se ha descrito previamente; ver por ejemplo WO 98/52976, WO 02/079232, y WO 00/3317 que se incorporan aquí por referencia. La eliminación o modificación de epítopo de célula T y predicción de epítopos de célula T, también se han descrito por Adair, F. et D. Ozanne, BioPharm 2002 Feb; p. 30-6 y Mucha JM et al. BMC Immunology 2002; 3:2. Una vez que los pacientes desarrollan anticuerpos a proteínas terapéuticas, el curso de tratamiento puede descontinuarse, la proteína puede estar sustituida con una versión diferente de la proteína, el tratamiento con drogas inmunosupresoras puede ser iniciado, puede inducirse tolerancia inmune u otros cursos de acción pueden tomarse. Polipéptidos que comprenden al menos un aminoácido no natural se proporcionan en la invención. En ciertas modalidades de la invención, el polipéptido con al menos un aminoácido no natural incluye cuando menos una modificación post-traducción. En una modalidad, la modificación posttraducción como mínimo comprende conexión de una molécula, incluyendo pero no limitada a una etiqueta, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotoentrelazador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido antisentido, un sacárido dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido nucleico inhibidor, un biomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de espín, un fluoróforo, una porción que contiene metal, una porción radioactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo que interactúa en forma covalente o no covalente con otras moléculas, una porción fotoenjaulada, una porción excitable por radiación actínica, una porción fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo fotoescindible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazada con carbono, un agente redox activo, un tioá-cido, una porción tóxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso en electrones, un grupo magnético, un grupo de intercalado, un cromósforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrones, o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseable, que comprende un segundo grupo reactivo con al menos un aminoácido no natural que comprende un primer grupo reactivo que utiliza metodología química que se conoce por una persona con destreza ordinaria en la especialidad, conveniente para los grupos reactivos particulares. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es una reacción alquinilo (incluyendo pero no limitada al aminoácido no natural p-propargiloxifenilalanina, en donde el grupo propargilo también en ocasiones se refiere como una porción acetileno) y el segundo grupo reactivo es una porción azido y se utilizan metodologías de química de cicloadición y [3+2] . En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es la porción azido (incluyendo pero no limitado a, en el aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo proporciona alquinilo. En ciertas modalidades del polipéptido modificado de la presente invención, al menos un aminoácido no natural (incluyendo pero no limitado a aminoácido no natural que contiene un grupo funcional ceto) que comprende cuando menos una modificación post-traducción, se utiliza en donde al menos una modificación post-traducción comprende una porción sacárido. En ciertas modalidades, la modificación post-traducción se hace in vivo en una célula eucariótica o en una célula no eucariótica. Un enlazador, polímero, polímero soluble en agua u otra molécula puede conectar la molécula al polipéptido. La molécula puede enlazarse directamente al polipéptido. En ciertas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-traducción que se realiza in vivo por una célula huésped, en donde la modificación post-traducción no se hace normalmente por otro tipo de célula huésped. En ciertas modalidades, la proteína incluye cuando menos una modificación post-traducción que se hace in vivo por una célula eucariótica, en donde la modificación post-traducción normalmente no se realiza por una célula no eucariótica. Ejemplos de modificaciones post-traducción incluyen pero no están limitadas a glicosilación, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace glicolípido y semejantes. En una modalidad, la modificación post-traducción comprende conexión de un oligosacárido a una asparagina por un enlace GlcNAc (incluyendo pero no limitado a, cuando el oligosacárido comprende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc, y semejantes). En otra modalidad, la modificación post-traducción comprende conexión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o trionina por un enlace GalNAc-serina, GalNAc-treonina, GlcNAc-serina, o un GlcNAc. En ciertas modalidades, una proteína o polipéptido de la invención puede comprender una secreción o secuencia de localización, una etiqueta epítopo, una etiqueta de FLAG, una etiqueta polihistidina, una fusión GST y/o semejantes. Ejemplos de secuencias de señal de secreción incluyen pero no están limitados a secuencia de señal de secreción procariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica 5 ' -optimizada para expresión bacteriana, una secuencia de señal de secreción novedosa, una secuencia de señal de secreción pectato liasa, secuencia de señal de secreción Omp A y una secuencia de señal de secreción fago. Ejemplos de secuencias de señal de secreción incluyen pero no están limitados a, STII (procariótico) , Fd Gilí y Ml 3 (fago) , Bgl2 (levadura) y la secuencia de señal derivada del un transposón. La proteína o polipéptido de interés puede contener cuando menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales. En ciertas modalidades, al menos uno, pero menos que todos de un aminoácido particular presente en una versión de origen natural gue ocurre de la proteína sue sustituye con un aminoácido no natural. La presente invención proporciona métodos y composiciones con base en polipéptidos incluyendo pero no limitados a miembros de la familia de súper genes GH, en particular hGH, que comprenden al menos un aminoácido no naturalmente modificado. Introducción de al menos un aminoácido no naturalmente codificado en un polipéptido, puede permitir la aplicación de químicas de conjugación que involucran reacciones químicas específicas, incluyendo pero no limitadas a, con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados (mientras que no reacciona con los 20 aminoácidos de origen común. En algunas modalidades, el polipéptido comprende el aminoácido no naturalmente codificado, se enlaza con un polímero soluble en agua tal como polietilen glicol (PEG) , mediante la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. Esta invención proporciona un método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas con derivados PEG, que involucra la incorporación selectiva de aminoácidos no genéticamente codificados incluyendo pero no limitados a, aquellos aminoácidos que contienen grupos funcionales o sustituyentes que no se encuentran en los 20 aminoácidos incorporados naturalmente, incluyendo pero no limitados a, una porción de acetona azida o acetileno, en proteínas en respuesta a un codón selector y la modificación subsecuente de esos aminoácidos con un derivado PEG convenientemente reactivo. Una vez incorporadas, las cadenas laterales aminoácido pueden entonces modificarse al utilizar metodologías de química que se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad convenientes para los grupos o sustituyentes funcionales particulares presentes en el aminoácido no naturalmente codificado. Metodologías químicas conocidas de una amplia variedad son adecuadas para utilizar en la presente invención para incorporar un polímero soluble en agua en la proteína. Estas metodologías incluyen pero no están limitadas a una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] ver, por ejemplo, Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4. (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1 109; y, Huisgen, R. in 1 ,3-Dipolar Cvcloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Nueva York, p. 1-176) con, incluyendo pero no limitado a, derivados acetileno o azida, respectivamente . Debido a que el método de cicloadición Huisgen [3+2] involucra una cicloadición en vez de una reacción de sustitución nucleofílica, proteínas pueden modificarse con selectividad extremadamente elevada. La reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente región selectiva (1,4 > 1,5) por la adición de cantidades catalíticas de sales Cu (I) a la mezcla de reacción. Ver, por ejemplo, Tornoe, et al., (2002) J. Ore. Chem. 67:3057-3064; y, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41 :2596-2599; y WO 03/101972. Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención a través de una cicloadición [3+2] incluye virtualmente cualquier molécula con un grupo o sustituyente funcional conveniente incluyendo pero no limitado a un derivado azido o acetileno. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido no natural con un grupo acetileno, incluyendo pero no limitado a p-propargiloxifenilalanina, o grupo azido, incluyendo pero no limitado a p-azido-fenilalanina, respectivamente. El anillo de cinco miembros que resulta de la cicloadición Huisgen [3+2] , en general no es reversible en ambientes reductores y es estable contra hidrólisis por periodos prolongados en ambientes acuosos. Consecuentemente, las características físicas y químicas de una amplia gama de sustancias pueden modificarse bajo condiciones demandantes acuosas con los derivados PEG activos de la presente invención. En forma más importante, debido a que las porciones azido y acetileno son específicas entre sí (y por ejemplo no reaccionan con cualquiera de los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes) proteínas pueden modificarse en uno o más sitios específicos con selectividad extremadamente elevada. La invención también proporciona derivados solubles en agua e hidrolíticamente estables de derivados PEG y polímeros hidrofílicos relacionados que tienen una o más porciones acetileno o azida. Los derivados de polímero PEG que contienen porciones acetileno son altamente selectivos para acoplar con porciones azida que se han introducido selectivamente en proteínas en respuesta a un codón selector. Similarmente, derivados de polímero PEG que contienen porciones azida son altamente efectivos para acoplar con porciones acetileno que se han introducido selectivamente en proteínas en respuesta a un codón selector. Más específicamente, las porciones azida comprenden pero no están limitadas a alquil azidas, aril azidas y derivadas de estas azidas. Los derivados de las alquil y aril azidas pueden incluir otros sustituyentes siempre que se mantenga la reactividad específica de acetileno. Las porciones acetileno comprenden alquil o aril acetilenos y sus derivados. Los derivados de alquil y aril acetilenos pueden incluir otros sustituyentes siempre que la reactividad específica de azida se mantenga. La presente invención proporciona conjugados de sustancias que tienen una amplia variedad de grupos sustituyentes o porciones funcionales, con otras sustancias incluyendo pero no limitadas a una etiqueta; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; un fotoentrelazador; un radionúclido; un compuesto citotóxico; una droga; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido; un dendrímero soluble en agua; una ciclodextrina; un ácido ribonucleico inhibitorio, un biomaterial ; una nanopartícula; una etiqueta de espín; un fluoróforo; una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa en forma covalente o no covalente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada, una porción excitable por radiación actínica; una porción fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazado con carbono; un agente redox activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente etiquetada; una celda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimio-luminiscente; un grupo denso en electrones; un grupo magnético; un grupo intercalado; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una pequeña molécula; un punto cuántico; un nanotransmisor; un radionucleótido; un radiotransmisor; un agente de captura de neutrones o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto de sustancia conveniente. La presente invención también incluye conjugados de sustancias que tienen porciones azida o acetileno con derivados de polímeros PEG que tienen porciones acetileno o azida correspondientes. Por ejemplo, un polímero PEG que contiene una porción azida puede acoplarse a una molécula biológicamente activa en una posición en la proteína que contiene un aminoácido no genéticamente codificado que contiene una funcionalidad de acetileno. El enlace por el cual el PEG y la molécula biológicamente activa se acoplan, incluyen pero no están limitados al producto de cicloadición Huisgen [3+2] .

Está bien establecido en la técnica que PEG puede utilizarse para modificar las superficies de biomateriales (ver por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 6,610,281; Mehvar, R. , J. Pharm Pharm Sci., 3(1): 125- 136 (2000) que se incorpora aquí por referencia) . La invención también incluye biomateriales que comprenden una superficie que tiene uno o más sitios azida o acetileno reactivos y uno más de los polímeros que contienen azida o acetileno de la invención acoplados a la superficie mediante un enlace °de cicloadición Huisgen [3+2] . Biomateriales y otras sustancias también pueden ser acopladas a los derivados polímero activados con acetileno o azida, a través de un enlace diferente al enlace azida o acetileno, tal como a través de un enlace que comprende una porción de ácido carboxílico, amina, alcohol o triol, para dejar a la porción azida o acetileno disponibles para reacciones subsecuentes. La invención incluye un método para sintetizar los polímeros que contienen azida y acetileno de la invención. En el caso del derivado PEG que contiene azida, la azida puede ligarse directamente a un átomo de carbono del polímero. En forma alterna, el derivado PEG que contiene azida puede prepararse al conectar un agente de enlace que tiene la porción azida a un extremo con un polímero activado convencional, de manera tal que el polímero resultante tiene la porción azida en su extremo. En el caso del derivado PEG que contiene acetileno, el acetileno puede unirse directamente a un átomo de carbono del polímero. En forma alterna, el derivado PEG que contiene acetileno puede prepararse al conectar un agente de enlace que tiene la porción acetileno en un extremo con un polímero activado convencional, de manera tal que el polímero resultante tiene la porción acetileno en su extremo. Más específicamente, en el caso del derivado PEG que contiene azida, un polímero soluble en agua que tiene al menos una porción hidroxilo activa se somete a una reacción para producir un polímero substituido que tiene una porción más reactiva, tal como un grupo saliente mesilato, tresilato, tosilato o halógeno. La preparación y uso de derivados PEG que contienen haluros de sulfonil ácido, átomos de halógeno y otros grupos salientes como se conoce por aquellas personas con destreza ordinaria en la especialidad. El polímero substituido resultante se somete entonces a una reacción para sustituir por la porción más reactiva una porción azida en el extremo del polímero. En forma alterna, un polímero soluble en agua que tiene cuando menos una porción electrofílica o nucleofílica activa se somete a una reacción con agente de enlace que tiene una azida en un extremo, de manera tal que un enlace covalente se forma entre el polímero PEG y el agente de enlace y la porción azida se ubica en el extremo del polímero. Porciones nucleofílicas y electrofílicas incluyendo aminas, tioles, hidrazidas, hidrazinas, alcoholes, carboxilatos, aldehidos, cetonas, tioésteres y semejantes, como se conoce por aquellas con destreza ordinaria en la especialidad. Más específicamente, en el caso del derivado PEG que contiene acetileno, un polímero soluble en agua que tiene cuando menos una porción hidroxilo activa se somete a una reacción para desplazar un halógeno u otro grupo saliente activado desde un precursor que contiene una porción acetileno. En forma alterna, un polímero soluble en agua que tiene cuando menos una porción nucleofílica o electrofílica activa se somete a una reacción con un agente de enlace que tiene un acetileno en un extremo, de manera tal que un enlace covalente se forma entre el polímero PEG y el agente de enlace y la porción acetileno se ubica en el extremo del polímero. El uso de porciones de halógeno, grupo saliente activado, proporciones nucleofílica y electrofílica en el contexto de síntesis orgánica y la preparación y uso de derivados PEG está bien establecido para los practicantes en la especialidad. La invención también proporciona un método para la modificación selectiva de proteínas para agregar otras substancias a la proteína, incluyendo pero no limitadas a polímeros solubles en agua tales como PEG y derivados PEG que contiene una porción azida o acetileno. Los derivados PEG que contienen azida o acetileno puede utilizarse para modificar las propiedades de superficies y moléculas en donde son importantes la biocompatibilidad, estabilidad, solubilidad y falta de inmunogenicidad, mientras que al mismo tiempo proporcionan un medio más selectivo para conectar los derivados PEG con proteínas que previamente se conocían en la especialidad. II. Familia de Súper gen de Hormona de Crecimiento como Ejemplo Los métodos, composiciones, estrategias y técnicas aquí descritas no se limitan a un tipo particular, clase o familia de polipéptidos o proteínas. Sin duda, virtualmente cualesquiera polipéptidos pueden diseñarse o modificarse para incluir al menos un aminoácido no naturalmente codificado aquí descrito. Las siguientes proteínas incluyen aquellas modificadas por genes de la familia súper genes de hormonas de crecimiento (GH) (Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990); Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992); Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Silvennoinen, 0. and Ihle, J. N. , SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)): hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placentario, eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TP0)5 interleucina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12 (subunidad p35) , IL-13, IL-15, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar (CNTF ciliary neurotrophic factor) , factor inhibidor de leucemia (LIF leukemia inhibitory factor) , alfa interferona, beta interferona, epsilon interferona, gamma interferona, omega interferona, tau interferona, factor de estímulo de colonia de granulocitos (G-CSF = granulocyte-colony stimulating factor) , factor de estímulo de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor) , factores de estímulo de colonia de macrófagos (M-CSF = macrophage colony stimulating factor) y cardiotrofina-1 (CT-I) ("la familia de súper gen GH") . Se anticipa que miembros adicionales de esta familia de genes se identificarán en el futuro a través de clonación y secuenciado de genes. Miembros de la familia de súper genes GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares, se habré el lecho de que generalmente tienen limitada ' identidad de secuencia de aminoácidos o ADN. Las características estructurales compartidas permiten que nuevos miembros de la familia de genes se identifiquen fácilmente y los métodos y composiciones de aminoácidos no naturales aquí descritos aplican similarmente. Dada la extensión de homología estructural entre los miembros de familia de súper genes GH, aminoácidos no naturalmente codificados pueden incorporarse en cualesquiera miembros de la familia de súper genes GH utilizando la presente invención. Cada miembro de esta familia de proteínas comprende un has de cuatro hélices. Estructuras de una cantidad de citocinas, incluyendo G-CSF (Zink et al., FEBS Lett. 314:435 (1992); Zink et al., Biochemistry 33:8453 (1994); Hill et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993), GM-CSF (Diederichs, K. , et al. Science 154: 1779-1782 (1991); Walter et al, J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)), IL-2 (Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992), IL-4 (Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035 (1991); Powers et al., Science 256:1673-1677 (1992)), y IL-5 (Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)) se han determinado por estudios de RMN y difracción de rayos X y muestran una marcada conservación con la estructura GH, a pesar de una falta de homología de secuencia primaria significante. IFN se considera como un miembro de esta familia con base en modelado y otros estudios (Lee et al., J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995); Murgolo et al., Proteins 17:62 (1993); Radhakrishnan et al., Structure 4: 1453 (1996); Klaus et al., J. Mol. Boíl. 274:661 (1997) ) . EPO se considera como un miembro de esta familia con base en modelado y estudios de mutagénesis (Lee et al., J. Boil. Chem. 268: 15983-15993 (1993); Wen et al., J. Boil . Chem. 269: 22839-22846 (1994)). Todas las citocinas y factores de crecimiento anteriores ahora se considera que comprenden una gran familia de genes.

Además de compartir estructuras secundarias y terciarias similares, miembros de esta familia comparten la propiedad de que deben oligomerizar a receptores de superficie celular para activar rutas de señalización intracelular. Algunos miembros de familia GH, incluyendo pero no limitados a; GH y EPO, ligan a un solo tipo de receptor y provocan que forme homodímeros . Otros miembros de familia, incluyendo pero no limitados a, IL-2, IL-4, y IL-6, ligan más de un tipo receptor y provocan que los receptores formen heterodímeros o agregados de orden superior (Davis et al . , (1993), Science 260: 1805-1808; Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951; Mott and Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995)). Estudios de mutagénesis han mostrado que, como GH, estas otras citocinas y factores de crecimiento contienen sitios de enlace de múltiples receptores, típicamente dos, y ligan sus receptores cognado secuencialmente (Mott and Campbell, Current Opinión in Structural Biology 5: 114-121 (1995); Matthews et al., (1996) Proc. Nati. Acad. ScL USA 93: 9471-9476). Como GH, los sitios de enlace de receptor primarios para estos otros miembros de familia ocurren primordialmente en las cuatro hélices alfa y el bucle A-B. Los aminoácidos específicos en los haces helicoidales que participan en enlace receptor difieren entre los miembros de familia. La mayoría de los receptores de superficie celular que interactúan con miembros de la familia de súper genes GH se relacionan estructuralmente y comprenden una segunda familia de múltiples genes. Ver, por ejemplo la Patente de los E.U.A. número 6,608,183, que se incorpora aquí por referencia. Una conclusión general alcanzada a partir de estudios de mutación de diversos miembros de la familia de súper genes GH es que los bucles que unen las hélices alfa, generalmente tienden a no estar involucrados en enlace receptor. En particular, el bucle B-C corto parece ser no esencial para el enlace receptor en la mayoría sino en todos los miembros de familia. Por esta razón, el bucle B-C puede ser susceptible aminoácidos no naturalmente codificados como se describe aquí en miembros de la familia de súper genes GH. Los bucles A-B, el bucle C-D (y el bucle D-E de miembros de interferona/tipo IL-10 de la súper familia GH) también pueden estar substituidos con un aminoácido que no es de origen natural. Aminoácidos próximos a hélice A y distantes a la hélice final también tienden a no estar involucrados en enlace receptor y también puede ser sitios para introducir aminoácido que no es de origen natural. En algunas modalidades, aminoácido que no es de origen natural se substituyen en cualquier posición dentro de una estructura de bucle, incluyendo pero no limitado a, los primeros 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más aminoácidos de los bucles A-B, B-C, C-D o D-E. En algunas modalidades, uno o más aminoácido que no naturalmente codificados se substituyen dentro los últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o más aminoácidos de los bucles A-B, B-C, C-D o D-E. Ciertos miembros de la familia GH, incluyendo pero no limitados a, EPO, IL-2, IL-3, IL-4, 1L-6, G-CSF, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12 p35, IL-13, IL- 15 y beta interferona contienen azúcares N-enlazadas y/u O-enlazadas. Los sitios de glicosilación en las proteínas ocurren casi en forma exclusiva en las región de bucle y no en los haces alfa helicoidales. Debido a que las regiones bucle en general no están involucradas en enlace receptor y debido a que son sitios para la conexión covalente de grupos azúcar, pueden ser sitios útiles para introducir substituciones de aminoácido que no son de origen natural en las proteínas. Aminoácidos que comprenden los sitios de glicosilación N- y O-enlazados en las proteínas, pueden ser sitios para substituciones de aminoácido que no son de origen natural debido a que estos aminoácidos están expuestos en superficie. Por lo tanto, la proteína natural puede tolerar grupos azúcar voluminosos conectados a las proteínas en estos sitios y los sitios de glicosilación tienden a estar ubicados lejos de los sitios de enlace receptor. Miembros adicionales de la familia de súper genes GH es probable que se descubran en el futuro. Nuevos miembros de la familia de súper genes GH pueden ser identificados a través de análisis de estructura secundaria y terciaria auxiliados por computadora de las secuencias de proteína pronosticadas, y por técnicas de selección diseñadas para identificar moléculas que ligan a un objetivo o blanco particular. Miembros de la familia de súper genes GH típicamente poseen cuatro o cinco hélices antipáticas unidas por aminoácidos no helicoidales (las regiones bucle) . Las proteínas pueden contener una secuencia de señal hidrofóbica en su extremo para promover secreción de la célula. Estos miembros posteriormente descubiertos de la familia de súper genes GH también se incluyen dentro de esta invención. Una solicitud relacionada es la Solicitud de Patente Internacional con título "Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses" publicas como WO 05/074650 en agosto 18, 2005, que se incorpora aquí por referencia. Un miembro de la familia de súper genes GH es una hormona de crecimiento humano (hGH) . La hormona de crecimiento humano participa en gran parte en regulación del crecimiento y desarrollo de la hormona normal. Esta hormona pituitaria de una sola cadena de origen natural consiste de 191 residuos aminoácido y tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kDa. hGH exhibe una multitud de efectos biológicos, incluyendo crecimiento lineal (somatogénesis) , lactación, activación de macrófagos, y efectos tipo insulina y efectos diabetogénicos, entre otros (Chawla, R., et al, Ann. Rev. Med. 34:519-547 (1983); Isaksson, 0., et al, Ann. Rev. Physiol, 47:483-499 (1985); Hughes, J. and Friesen, H. , Ann. Rev. Physiol., 47:469-482 (1985) ) . La estructura de hGH es bien conocida (Goeddel, D., et al, Nature 281: 544-548 (1979)), y la estructura tridimensional de hGH se ha resuelto por cristalografía de rayos X (de Vos, A., et al, Science 255:306-312 (1992)). La proteína tiene una estructura globular compacta, que comprende cuatro haces alfa helicoidales antipático, denominados A-D que empiezan desde el extremo N, que se unen por bucles. hGH también contiene cuatro residuos cisteina, que participan en dos enlaces disulfuro intramoleculares: C53 está apareado con C165 y Cl 82 está apareado con C189. La hormona no se glicosila y se ha expresado en forma secretada en E. coli (Chang, C, et al., Gene 55:189-196 (1987)). Una cantidad de mutantes de origen natural de hGH se han identificado. Estos incluyen hGH-V (Seeburg, DNA 1: 239 (1982); Patentes de los E.U.A. Números 4,446,235, 4,670,393, y 4,665,180, que se incorporan aquí por referencia) y hGH de 20-kDa que contiene una eliminación de residuos de 32-46 a hGH (Kostyo et al, Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987); Lewis, U. , et al, J. Boil. Chem., 253:2679-2687 (1978)). Además, numerosas variantes hGH, que surgen de procesamiento post-transcripción, post-traducción, secretorio, metabólico, y otros procesos fisiológicos, se han reportado (Baumann, G. , Endocrine Reviews 12: 424 (1991)). Los efectos biológicos de hGH se derivan de su interacción con receptores celulares específicos. La hormona es un miembro de una familia de proteínas homologas que incluyen lactogenos placentarios y prolactinas. hGH es inusual entre los miembros de familia, sin embargo, ya que exhibe especificidades de especies amplias y liga ya sea a receptor somatogénico clonado (Leung, D., et al, Nature 330:537-543 (1987)) o prolactina (Boutin, J. , et al, Cell 53:69-77 (1988)). Con base en estudios estructurales y bioquímicos, mapas funcionales para los dominios de enlace lactogénico y somatogénico se han propuesto (Cunningha , B. and Wells, J., Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 3407 (1991)). El receptor hGH es un miembro de la familia de receptor de factor de crecimiento/citosina/hematopoyético, que incluye varios otros receptores de factor de crecimiento, tales como los receptores de interleucina (IL)-3, -4 y -6, el receptor de factor de estímulo de colonia de macrófago-granulocito (GM-CSF = granulocyte macrophage colony-stimulating factor) , el receptor eritropoyetina (EPO) , así como el receptor G-CSF. Ver, Bazan, Proc. Nati. Acad. Sci USA 87: 6934-6938 (1990). Miembros de la familia de receptor de citocina contienen cuatro residuos cisteina conservados y un motivo triptofano-serina-X-triptofano-serina ubicado justo fuera de la región de transmembrana. Las secuencias conservadas se consideran involucradas en interacciones proteína-proteína. Ver, por ejemplo, Chiba et al, Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992) . La interacción entre hGH y dominio extracelular de su receptor (hGHbp) está entre las interacciones receptor-hormona más completamente comprendido. Datos cristalográficos de rayos X de alta resolución (Cunningham, B., et al, Science, 254:821-825 (1991)) han mostrado que hGH tienen dos sitios de enlace receptor y ligan dos moléculas de receptor secuencialmente utilizando sitios distintos en la molécula. Los dos sitios de enlace receptor se refieren como sitio I y Sitio II. El sitio I incluye el extremo terminal carboxi de hélice D y partes la hélice A y el bucle A-B, mientras que el sitio II abarca la región amino terminal de hélice A y una porción de hélice C. El enlace de GH a su receptor ocurre secuencialmente, con el enlace de sitio I primero. El sitio II acopla entonces a un segundo receptor GH, resultando en dimerización y activación de receptor de las rutas de señalización intracelulares que llevan a respuesta celular a la hormona. Una muteína hGH en donde una substitución G 12OR se ha introducido en el sitio II es capaz de ligar a un solo receptor hGH, pero es incapaz de dimerizar dos receptores. La muteina actúa como un antagonista hGH in vi tro, supuestamente el ocupar sitios de receptor sin activar rutas de señalización intracelulares (Fun, G. , et al, Science 256:1677-1680 (1992) ) . De esta manera, la descripción de la familia de súper genesde hormona de crecimiento se proporciona para ilustrativos y a manera de ejemplo solamente y no como limite del alcance de los métodos, composiciones, estrategias y técnicas aquí descritas. Además, referencia a polipéptidos GH en esta solicitud se pretende para utilizar el término genérico como un ejemplo de cualquier polipéptido. De esta manera, se entiende que las modificaciones y químicas aquí descritas con referencia a polipéptidos o proteína hGH puede aplicarse igualmente a cualquier polipéptido incluyendo pero no limitado a, un miembro de la familia de súper gen GH, incluyendo aquellos citados específicamente aquí. III. Métodos de Ácido Nucleico Recombinante General Para Utilizar Con La Invención En numerosas modalidades de la presente invención, ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de interés se aislaran, clonaran y a menudo serán alterados utilizando métodos recombinantes. Estas modalidades se utilizan, incluyendo pero no limitadas a, para expresión de proteína o durante la generación de variantes, derivados, cassettes de expresión, u otras secuencias derivadas de un polipéptido. En algunas modalidades, la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención es enlazada operativamente con un promotor heterólogo. Aislamiento de hGH y producción de GH en células huésped se describen en, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. números 4,601,980, 4,604,359, 4,634,677, 4,898,830, 5,424,199, 5,795,745, 5,854,026, 5,849,535; 6,004,931; 6,022,711; 6,143,523 y 6,608,183, que se incorporan aquí por referencia. Una secuencia nucleótido que codifica a un polipéptido comprende un aminoácido no naturalmente codificado puede sintetizarse con base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido precursor, incluyendo pero no limitado a, tener la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la Publicación de patente de los E.U.A. número US 2005/0170404 (hGH) y después cambia la secuencia de nucleótido para efectuar introducción (es decir, incorporación o substitución) o remoción (es decir eliminación o substitución) del o de los residuos aminoácido relevantes. La secuencia de nucleótidos puede modificarse convenientemente por mutagénesis dirigida por sitio de acuerdo con métodos convencionales. En forma alterna, la secuencia de nucleótidos puede prepararse por síntesis química, incluyendo pero no limitada a, utilizar un sintetizador de oligonucleótidos, en donde los oligonucleótidos se diseñan con base la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y de preferencia seleccionar esos codones que se favorecen en la célula huésped en donde se producirá el polipéptido recombinante.

Por ejemplo, varios pequeños oligonucleótidos que codifican para porciones del polipéptido deseado, pueden sintetizarse y ensamblarse por PCR, ligación o reacción de cadena de ligación. Ver, por ejemplo, Barany, et al., Proc. Nati Acad. Set. 88: 189-193 (1991); la Patente de los E.U.A. número 6,521,427, que se incorpora aquí por referencia. Esta invención utiliza técnicas rutinarias en el campo de genética recombinante. Textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A - Laboratory Manual (3rd ed. 2001) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual (1990) ; and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). Textos generales que describen técnicas de biología molecular incluyen Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzvmologv volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual f2nd Ed.), Vol. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementado hasta 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes referentes a, incluyendo pero no limitados a, la generación de genes o polinucleótidos que incluyen codones selectores para producción de proteínas que incluyen aminoácidos no naturales, ARNst ortogonales, sintetasas ortogonales y sus pares . Diversos tipos de mutagénesis se utilizan en la invención para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitado a, para producir sintetasas novedosas o ARNts, para mostrar moléculas de ARNt, montar polinucleótidos que codifican sintetasas, para producir bibliotecas de ARNts, para producir bibliotecas de sintetasas, para producir codones selectores, para insertar codones selectores que codifican aminoácidos no naturales en una proteína o polipéptido de interés. Incluyen pero no están limitados a mutagénesis punto aleatoria dirigida a sitio, recombinación homologa, entremezclado de ADN u otros métodos de mutagénesis recursiva, construcción quimérica, mutagénesis utilizando plantillas que contienen uracilo, mutagénesis dirigida a oligonucleótido, mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato, mutagénesis que usan ADN dúplex o semejantes, o cualquier combinación de las mismas. Métodos convenientes adicionales incluyen reparación de apareamiento incorrecto punto, mutagénesis utilizando cepas de anfitrión de deficiente reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis de eliminación, mutagénesis por síntesis de gen total, reparación de ruptura de doble hebra, y semejantes. Mutagénesis, incluyendo pero no limitado a, que involucra construcciones quiméricas, y también incluirá en la presente invención. En una modalidad, la mutagénesis puede ser guiada por información conocida de la molécula de origen natural o molécula de origen natural imitada o alterada, incluyendo pero no limitada a, secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura secundaria, terciaria o cuaternaria, estructura de cristal o semejantes. Los textos y ejemplos que aquí se encuentran describen estos procedimientos . Información adicional se encuentra en las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Ling et al., Approaches to DNA mutagénesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagénesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Boil. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagénesis, Ann. Rev. Genet. 19:423- 462 (1985) ; Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagénesis, Science 229: 1193-1201 (1985); Cárter, Site-directed mutagénesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagénesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagénesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagénesis using M13 -derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagénesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagénesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate, Methods in Enzvmol . 154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucí. 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Nati. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), infección por vectores virales, penetración balística de alta velocidad por pequeñas partículas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz o perlas o partículas pequeñas, o en la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)), y/o semejantes. Las células huésped de diseño o de ingeniería pueden ser cultivadas en medio nutriente convencional modificado así apropiado para estas actividades como, por ejemplo, etapas de monitoreo o tamizado, promotores de activación o transformantes de selección. Estas células pueden ser cultivadas opcionalmente en los organismos transgénicos. Otras referencias útiles, incluyendo pero no limitadas a para aislamiento y cultivo de células (por ejemplo, para subsecuente aislamiento de ácido nucleico) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York and the references cited therein; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos objetivo en las células están disponibles, cualquiera de los cuales pueden utilizarse en la invención. Estos incluyen: fusión de las células de recipientes con protoplastos bacteriales que contiene el ADN, electroporación, bombardeo de proyectiles e infección con vectores virales (discutido más a continuación), etc. Células bacteriales pueden utilizarse para amplificar el número de plásmidos que contienen construcciones de ADN de esta invención. Las bacterias se desarrollan a fase log y los plásmidos dentro de las bacterias puede aislarse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad (ver, por ejemplo, Sambrook). Además, están comercialmente disponibles equipos para la purificación de plásmidos de bacterias, (ver por ejemplo, EasyPrepMR, FlexiPrepMR, ambos de Pharmacia Biotech; StrataCleanMR de Stratagene; y, QIAprepMR de Qiagen) . Los plásmidos aislados y purificados después se manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, utilizados para transfectar células o incorporados en vectores relacionados para infectar organismos. Vectores típicos contienen terminadores de trascripción y traducción, secuencias de inicio de trascripción y traducción y promotores útiles para regular la expresión del ácido nucleico objetivo particular. Los vectores opcionalmente comprenden cassettes de expresión genéricos que contienen cuando menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten replicación del cassette en eucariotas o procariotas o ambos (incluyendo pero no limitados a vector de lanzadera) y marcadores de selección tanto para sistemas procarióticos como eucarióticos. Vectores son adecuados para replicación e integración en procariotas, eucariotas o ambos. Ver, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature. 328:731 (1987); Schneider, E., et al, Protein Expr. Purif. 6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra) . Un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para clonación se proporciona, por ejemplo, por ATCC, por ejemplo, el ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al (eds) publicado por ATCC. Procedimientos básicos adicionales para secuenciado, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes también se encuentran en Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y virtualmente cualquier ácido nucleico etiquetado, ya sea estándar o no estándar) puede ordenarse a la medida o estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comercial, tale como el Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponible en la red mundial como mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponible en la red mundial en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en la red mundial como expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros.

CODONES SELECTORES Codones selectores de la invención expanden el marco de codones genético de la maquinaria biosintetica de proteínas. Por ejemplo, un codón selector incluye, pero no se limitado a, un codón de tres bases único, un codón sin sentido, tal como un codón de parada, incluyendo pero no limitado a, un codón ámbar (UAG) , a un codón ocre, o un codón ópalo (UGA) , un codón no natural, un codón de cuatro o más bases, un codón raro, o semejantes. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la técnica que hay un amplio intervalo en el número de codones selectores que pueden introducirse en un gen o polinucleótido deseado, incluyendo no limitados a, uno o más, dos o más, tres o más, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un solo polinucleótido que codifica cuando menos una porción del polipéptido. En una modalidad, los métodos involucran el uso de un codón selector que es un codón de parada para la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales in vivo . Por ejemplo, un O-ARNt se produce que reconoce el codón de parada, incluyendo pero no limitado a, UAG, y se aminoacila por una 0-RS con un aminoácido no natural deseado. Este 0-ARNt no se reconoce por las aminoacil-ARNt sintetasas del anfitrión de origen natural. Mutagénesis dirigida de sitio convencional puede utilizarse para introducir el codón de parada, incluyendo pero no limitado a, TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Ver, por ejemplo, Sayers, J.R. , et al. (1988), 5 '-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagénesis, Nucleic Acids Res, 16:791-802. Cuando la 0-RS, 0-ARNt y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés se combinan in vivo, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada. La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede realizarse sin perturbación significante de la células eucarióticas anfitriona. Por ejemplo, debido a que la eficiencia supresión para el codón UAG depende de la competencia entre el 0-ARNt, incluyendo pero no limitado al ARNt supresor ámbar, un factor de supresión eucariótico (incluyendo pero no limitado a, eRF) (que liga a un codón de parada e inicia la liberación del péptido de crecimiento del ribosoma) , puede modularse la eficacia de supresión por, incluyendo pero no limitado a, incrementar el nivel de expresión de 0-ARNt, y/o el ARNt supresor. Aminoácidos no naturales también pueden codificarse con codones raros. Por ejemplo, cuando la concentración de arginina en una reacción de síntesis de proteína in vitro se reduce, el codón arginina raro, AGG, ha demostrado ser eficiente para inserción de Ala por ARNt sintético acilado con alanina. Ver por ejemplo, Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993) . En este caso, el ARNt sintético compite con el ARNt Arg de origen natural, que existe como una especie menor en Escherichia coli . Algunos organismos no utilizan todos los codones triplete. Un codón no asignado AGA en Micrococcus luteus se ha utilizado para inserción de aminoácidos en un extracto de traducción/trascripción in vi tro. Ver por ejemplo, Kowal and Oliver, Nucí. Acid. Res. 25:4685 (1997). Componentes de la presente invención pueden generarse para utilizar estos codones raros in vivo . Codones selectores también comprenden codones extendidos, incluyendo pero no limitados a, cuatro o más codones base tales como cuatro, cinco, seis o más codones base. Ejemplos de cuatro codones base incluyen pero no limitado a AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y semejantes. Ejemplos de cinco codones base incluyen pero no están limitados a AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y semejantes. Una característica de la invención incluye utilizar codones extendidos con base en supresión de desplazamiento de marco. Cuatro o más codones base pueden insertar, incluyendo pero no limitado a, uno o aminoácidos no naturales múltiples en la misma proteína. Por ejemplo, en la presencia de 0-ARNts imitados incluyendo pero no limitados a, un supresor de desplazamiento de marco especial ARNts, con bucles anticodon, por ejemplo con al menos bucles anticodón de 8-10 nt, los cuatro o más codones base se leen como un solo aminoácido. En otras modalidades, los bucles anticodón pueden decodificar, incluyendo pero no limitado a cuando menos un codón de cuatro bases al menos un codón de cinco bases o al menos un codón de seis bases o más. Ya que hay 256 codones de cuatro bases posibles, múltiples aminoácidos no naturales pueden ser codificados en la misma célula utilizando un codón de cuatro o más bases. Ver, Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia co?i, J. Mol. Biol. 307: 755- 769. Por ejemplo, codones de cuatro bases se han empleado para incorporar aminoácidos no naturales en proteínas utilizando métodos biosinteticos in vi tro. Ver por ejemplo, Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; and Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:34. CGGG y AGGU, se utilizaron para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado NBD de lisina en estreptavidina in vi tro con dos ARNts supresores de desplazamiento de marco acilados químicamente. Ver, por ejemplo, Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc 121:12194. En un estudio in vivo, Moore et al. examino la capacidad de derivados ARNtLeu con anticodones NCUA para suprimir codones UAGN (N puede ser U, A, G, o C) , y encontró que UAGA cuádruple puede descodificarse por un ARNtLeu con un anticodón UCUA con una eficiencia de 13 a 26% con poca descodificación en el marco de 0 o -1. Ver, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. En una modalidad, codones extendidos con base en codones raros o codones sin sentido pueden utilizarse en la presente invención, lo que puede reducir supresión de desplazamiento de marco y lectura de sentido erróneo en otros sitios indeseados. Para un sistema determinado, un codón selector también puede incluir uno de los tres codones base naturales, en donde el sistema endógeno no utiliza (o utiliza raramente) el codón base natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece un ARNt que reconoce el codón de tres bases natural y/o sistema en donde el codón de tres bases es un codón raro . Codones selectores opcionalmente incluyen pares base no naturales. Estos pares base no naturales expanden adicionalmente el alfabeto genético existente. Un par base extra aumenta el número de codones triplete de 64 a 125. Propiedades de terceros pares base incluyen apareamiento base estable y selectivo, eficiente incorporación enzimática en ADN con alta fidelidad por una polimerasa, y la extensión de cebador continuo eficiente después de síntesis del par base no natural naciente. Descripciones de pares base no naturales que pueden adaptarse para métodos y composiciones incluyen, por ejemplo Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20:177-182. Ver, también Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626- 14630. Otras publicaciones relevantes se citan a continuación. Para uso in vivo, el nucleósido no natural es permeable a membrana y es fosforilado para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética incrementada es estable y no se destruye por enzimas celulares. Esfuerzos previos por Benner y otros aprovecharon los patrones de enlace de hidrógeno que son diferentes de aquellos en pares Watson-Crick canónicos, el ejemplo más notable de los cuales es el par iso-C:iso-G. Ver, por ejemplo Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8322; and Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general crean un mal apareamiento en cierto grado con bases naturales y no pueden ser replicadas enzimáticamente, Kool y colaboradores demostraron que interacciones de empaque hidrofóbicas entre bases pueden reemplazar enlace de hidrógeno para dirigir la formación de par base. Ver, Kool, (2000) Curr. Qpin. Chem. Biol., 4:602; and Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. En un esfuerzo por desarrollar un par base no natural que satisfaga todos los requerimientos anteriores, Schultz, Romesberg y colaboradores han sintetizado y estudiado sistemáticamente una serie de bases hidrofóbicas no naturales. Un auto-apareamiento PICS:PICS se encuentra más estable que los pares naturales, y puede incorporarse eficientemente en ADN por fragmento Klenow de ADN polimerasa I de Escherichia coli (KF) . Ver, por ejemplo McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11585-6; y Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274. Un auto-apareamiento 3MN:3MN puede sintetizarse por KF con eficiencia y selectividad suficientes para función biológica. Ver, e.g., Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803. Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para mayor replicación. Una ADN polimerasa mutante recientemente ha evolucionado o ha surgido que puede utilizarse para replicar el auto-apareamiento PICS. Además, un auto-apareamiento 7AI puede ser replicado. Ver, por ejemplo Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439. Un par metalobase novedoso, Dipic:Py, también se ha desarrollado, que forma un par estable al ligar Cu(II). Ver, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714. Debido a que codones extendidos y codones no naturales son intrínsicamente ortogonales a codones naturales, los métodos de la invención pueden aprovechar esta propiedad para generar ARNts ortogonales para ellos . Un sistema de desviación de traducción también puede emplearse para incorporar un aminoácido no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de desviación de traducción, una gran secuencia se incorpora en un gen pero no se traduce en proteína. La secuencia contiene una estructura que sirve como una guía para inducir al ribosoma en saltar sobre la secuencia y reanudar la traducción corriente abajo de la inserción. En ciertas modalidades, la proteína o polipéptido de interés (o su porción) en los métodos y/o composiciones de la invención se codifica por un ácido nucleico. Típicamente, el ácido nucleico comprende al menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos cinco codones selectores, al menos seis codones selectores, al menos siete codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores, diez o más codones selectores. Genes que codifican proteínas o polipéptidos de interés pueden mutagenizarse utilizando métodos conocidos para una persona con destreza ordinaria en la especialidad y descritos aquí para incluir, por ejemplo uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido no natural . Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para incluir uno o más codones selectores, proporcionando la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales. La invención incluye cualquier semejante variante, incluyendo pero no limitado a, mutante, versiones de cualquier proteína, por ejemplo incluyendo al menos un aminoácido no natural. Similarmente, la invención también incluye ácidos nucleicos correspondientes, es decir cualquier ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifican uno o más aminoácidos no naturales. Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés tal como un hGH polipéptido pueden fácilmente imitarse para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. La cisteína se emplea ampliamente para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua, proteínas o una amplia variedad de otras moléculas, en una proteína de interés. Métodos adecuados para la incorporación de cisteína en una posición deseada de un polipéptido, se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, tales como aquellos descritos en la patente de los E.U.A. No. 6,608,183, que se incorpora aquí por referencia, y técnicas de mutagénesis estándar. IV. Aminoácidos No Naturalmente Codificados Una muy amplia variedad de aminoácidos no naturalmente codificados es adecuada para utilizar en la presente invención. Cualquier cantidad de aminoácidos no naturalmente codificados pueden introducirse en un polipéptido. En general, los aminoácidos no naturalmente codificados introducidos en forma substancial químicamente inertes hacia los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes (es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, trip?ofano, tirosina, y valina) . En algunas modalidades, los aminoácidos no naturalmente codificados incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan eficiente y selectivamente con grupos funcionales que no se encuentran en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitados a grupos azido, cetona, aldehido y aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, un polipéptido que incluye un aminoácido no naturalmente codificado que contiene un grupo funcional azido, puede reaccionarse con un polímero (incluyendo pero no limitado a, poli (etilen glicol) o en forma alterna un segundo polipéptido que contiene una porción alquino para formar un conjugado estable que resulta de la reacción selectiva de los grupos funcionales azida y alquino para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2] . La estructura genérica de un alfa-aminoácido se ilustra como sigue (Fórmula I) : Un aminoácido no naturalmente codificado típicamente es cualquier estructura que tiene la fórmula anteriormente citada en donde el grupo R es cualquier substituyente diferente al empleado en los veinte aminoácidos naturales, y puede ser conveniente para utilizar en la presente invención. Debido a que los aminoácidos no naturalmente codificados de la invención típicamente difieren de los aminoácidos naturales solo en la estructura de la cadena lateral, los aminoácidos no naturalmente codificados forman enlaces amida con otros aminoácidos, incluyendo pero no limitados a, codificados en forma natural o no natural, en la misma manera en la que se forman en polipéptidos de origen natural. Sin embargo, los aminoácidos no naturalmente codificados tienen grupos de cadena lateral que los distingue de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R opcionalmente comprende un grupo alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxi, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina, amino o semejantes o cualquier combinación de los mismos. Otros aminoácidos de origen no natural de interés que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos que comprenden un entrelazador fotoactivable, aminoácidos etiquetados espín, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de enlace de metal, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos radioactivos, aminoácidos con grupos funcionales novedosos, aminoácidos que interactúan en forma covalente o no covalente con otras moléculas, aminoácidos foto-enjaulados y/o fotoisomerizable, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glicosilados tales como una serina substituida con azúcar, otros aminoácidos modificados con carbohidrato, aminoácidos que contienen ceto, aminoácidos que comprenden polietilen glicol o poliéter, aminoácidos substituidos con átomo pesado, aminoácidos químicamente escindibles y/o foto-escendibles, aminoácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con aminoácidos naturales, incluyendo pero no limitados a, poliésteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo pero no limitados a más de aproximadamente 5 o más de aproximadamente 10 átomos de carbonos, aminoácidos que contienen azúcar enlazados con carbono, aminoácidos redox-activos, aminoácidos que contienen amino tioácido, y aminoácidos que comprenden una o más porciones tóxicas. Aminoácidos no naturalmente codificados ejemplares que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención y que son útiles para reacciones con polímeros solubles en agua, incluyen pero no están limitados a aquellos con grupos reactivos carbonilo, aminooxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquino. En algunas modalidades, aminoácidos no naturalmente codificados comprenden una porción sacárido. Ejemplos de estos aminoácidos incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L- galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y 0-mannosaminil-L-serina. Ejemplos de estos aminoácidos también incluyen ejemplos en donde el enlace -N o -0 de origen natural entre el aminoácido y el sacárido se reemplaza por un enlace covalente no comúnmente encontrado en la naturaleza -incluyendo pero no limitado a un alqueno, una oxima, un tioéter, una amida y semejantes. Ejemplos de estos aminoácidos también incluyen sacáridos que no se encuentran comúnmente en proteínas de origen natural tales como 2-deoxi-glucosa, 2-deoxigalactosa y semejantes. Muchos de los aminoácidos no naturalmente codificados que se proporcionan aquí están comercialmente disponibles, por ejemplo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Novabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania), o Peptech (Burlington, MA, USA). Aquellos que no están comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente como se dispone aquí o utilizando métodos estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Para técnicas de síntesis orgánica, ver por ejemplo, Organic Chemistry por Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York) ; and Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York) . Ver, también las patentes de los E.U.A. Nos. 7,045,337 y 7,083,970, que se incorporan aquí por referencia. Además de aminoácidos no naturales que contienen cadenas laterales novedosas, aminoácidos no naturales pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención que también opcionalmente comprenden estructuras principales modificadas, incluyendo pero no limitadas a, como se ilustra por las estructuras de la Fórmula II y III: II en donde Z típicamente comprende OH, NH , SH, NH-R', o S-R'; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, típicamente comprenden S u 0, y R y R', que son opcionalmente iguales o diferentes, se eligen típicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos no naturales que tienen la Fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, aminoácidos no naturales de la invención opcionalmente comprenden substituciones en el grupo amino carboxilo como se ilustra por las Fórmulas II y III. Aminoácidos no naturales de este tipo incluyen, pero no están limitados a, a-hidroxi ácidos, a-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, incluyendo pero no limitados a cadenas laterales que corresponden a los veinte aminoácidos naturales comunes o cadenas laterales o no naturales. Además, substituciones en el a-carbono opcionalmente incluyen pero no están limitadas a aminoácidos a-a-disubstituidos L, D, tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, y semejantes. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos prolina así como análogos prolina con 3, 4 ,6, 7, 8, y 9 miembros de anhidro, ß y ? aminoácidos tales como ácido ß-alanina y ?-amino butírico. Muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y semejantes, y son adecuados para utilizar en la presente invención. Análogos de tirosina incluyen pero no están limitados a, tirosinas para-substituidas, tirosinas orto-substituidas, y tirosinas meta substituidas, en donde la tirosina substituida comprende, incluyendo pero no limitado a, un grupo ceto (incluyendo pero no limitado a, un grupo acetilo) , un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo de cadena recta o ramificada C6-C20, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo 0-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o semejantes. Además, anillos arilo de múltiples substituciones también se contemplan. Análogos glutamina que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, a-hidroxi derivados, derivados ?-substituidos, derivados cíclicos, y derivados de glutamina substituidos con amida. Análogos fenilalanina ejemplares que pueden ser convenientes para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a fenilalaninas para-substituidas, fenilalaninas orto-substituidas, y fenilalaninas meta-substituidas, en donde el substituyente comprende, incluyendo pero no limitado a un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehido, un azido, un yodo, un bromo, un grupo ceto (incluyendo pero no limitado a un grupo acetilo) , un grupo benzoilo, un grupo alquinilo o semejantes. Ejemplos específicos de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, una p-acetil-L-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcß-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L- fenilalanina, una isopropil -L-fenilalanina, y una p-propargiloxi-fenilalanina, y semejantes. Ejemplos de estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención, se proporcionan por ejemplo en WO 2002/085923 con título "In vivo incorporation of unnatural amino acids". Ver también Kiick et al, (2002) Incorporation ofazides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, que se incorpora aquí por referencia, para análogos metionina adicionales. En una modalidad, composiciones de un polipéptido que incluyen un aminoácido no natural (tal como p- (propargiloxi) -fenilalanina) se proporcionan. Diversas composiciones que comprenden p- (propárgiloxi) -fenilalanina y, incluyendo pero no limitado a, proteínas y/o células, también se proporcionan. En un aspecto, una composición que incluye el aminoácido no natural p- (propargiloxi) -fenilalanina, además incluye un ARNt ortogonal . El aminoácido no natural puede unirse (incluyendo pero no limitado a, en forma covalente) el ARNt ortogonal, incluyendo pero no limitado a, ligado covalentemente al ARNt ortogonal a través de un enlace amino-acilo, ligado covalentemente a un 3 ' OH o 2 ' OH de un azúcar ribosa terminal del ARNt ortogonal, etc. Las porciones químicas mediante aminoácidos no naturales que puedan incorporarse en proteínas, ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de la proteína. Por ejemplo, la reactividad única de un grupo funcional ceto permite modificación selectiva de proteínas con cualquiera de una cantidad de reactivos que contienen hidrazina o hidroxilamina in vi tro e in vivo. Un aminoácido no natural-átomo pesado por ejemplo puede utilizarse para desplazar en fase datos de estructura de rayos X. La introducción específica del sitio de átomos pesados utilizando aminoácidos no naturales también proporciona selectividad y flexibilidad para seleccionar posiciones para átomos pesados. Aminoácidos no naturales fotoreactivos (incluyendo pero no limitados a aminoácidos con benzofenona y arilazidas (incluyendo pero no limitados a cadenas laterales, fenilazida) , por ejemplo permite fotoentrelazamiento de proteínas in vivo e in vi tro . Ejemplos de aminoácidos no naturales fotoreactivos incluyendo pero no están limitados a p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. La proteína con los aminoácidos no naturales fotoreactivos puede entonces entrelazarse a voluntad por excitación del control temporal que proporciona el grupo fotoreactivo. En un ejemplo, el grupo metilo de un amino no natural puede estar sustituido con uno isotópicamete etiquetado, incluyendo pero no limitado a, grupo metilo, como una sonda de estructura y dinámica local, incluyendo pero no limitado a con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia de vibración. Grupos funcionales alquinilo o azido, por ejemplo permiten la modificación selectiva de proteínas con moléculas a través de una reacción de cicloadición [3+2] . Un aminoácido no natural incorporado en un polipéptido en el extremo amino puede componerse de un grupo R que es cualquier sustituyente diferente a aquel empleado en los 20 aminoácidos naturales y un segundo grupo reactivo diferente del grupo NH2 normalmente presente en a aminoácidos (ver Fórmula I) . Un aminoácido no natural similar puede incorporarse en el extremo carboxilo con un segundo grupo reactivo diferente del grupo COOH normalmente presente en a aminoácidos (ver Fórmula I) . Los aminoácidos no naturales de la invención pueden seleccionarse o diseñarse para proporcionar características adicionales no disponibles en los 20 aminoácidos naturales. Por ejemplo, puede diseñarse o seleccionarse un aminoácido no natural para modificar las propiedades biológicas de una proteína en la cual se incorporan. Por ejemplo, las siguientes propiedades pueden ser modificados opcionalmente por inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, solubilidad, estabilidad, por ejemplo, resistencia térmica, hidrolítica, oxidativa, resistencia a degradación enzimática, y semejantes, la facilidad de purificación de procesamiento, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, actividad catalítica, potencial redox, vida media, capacidad para reaccionar con otras moléculas, por ejemplo, en forma covalente o no covalente, y semejantes . ESTRUCTURA Y SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES: GRUPOS CARBONILO, TIPO CARBONILO, CARBONILO ENMASCARADO, CARBONILO PROTEGIDO Y GRUPOS HIDROXILAMINA. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un polipéptido incluyendo pero no limitado a un polipéptido enlazado a un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace oxima. Muchos tipos de aminoácidos no naturales codificados son adecuados para la formación de enlaces oxima. Estos incluyendo pero no está limitados a aminoácidos no naturalmente codificados que contienen un grupo cabonilo, dicarbonilo o hidroxilamina. Estos aminoácidos se describen las solicitudes de patente de los E.U.A. Números 60/638,418; 60/638,527; y 60/639,195, con título "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides, " presentadas en diciembre 22, 2004, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Estos aminoácidos también se describen en las Solicitudes de Patentes de los E.U.A. Números 60/696,210; 60/696,302; y 60/696,068, con título "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides," presentadas en julio 1, 2005, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Aminoácidos no naturalmente codificados también se describen en las Patentes de los E.U.A. Números 7,045,337 y 7,083,970, que se incorporan aquí por preferencia en su totalidad. Algunas modalidades de la invención utilizan polipéptido que están sustituidas en una o más posiciones con un aminoácido para-acetilfenilalanina . La síntesis de p-acetil- (+/-) - fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describen en Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), que se incorpora aquí por referencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo o dicarbonilo pueden ser preparados similarmente por una persona con destreza ordinaria especialidad. Además, síntesis ejemplares no limitantes de aminoácido no natural que se incluyen aquí se presentan en las FIGURAS 4, 24-34 y 36-39 de la Patente de los E.U.A. Número 7,083,970, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Aminoácidos con un grupo reactivo electrofílico permiten una variedad de reacciones para enlazar moléculas mediante reacciones de adición nucleofílicas entre otras. Estos grupos reactivos electrofílicos incluyen un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo) , un grupo tipo carbonilo (que tiene reactividad similar a un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo) y es estructuralmente similar a un grupo carbonilo) , un grupo carbonilo enmascarado (que puede convertirse fácilmente en un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo) ) , o un grupo carbonilo protegido (que tiene reactividad similar a un grupo carbonilo (incluyendo un grupo ceto y un grupo dicarbonilo) ante desprotección) . Esos aminoácidos incluyen aminoácidos que tiene la estructura de la Fórmula (IV) : (IV), en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(O)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquilen o alquileno sustituido) - - C(0)N(R')-. -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido) - -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido) - -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0- -S(0)kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, N(R')C(S)N(R )-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R ' ) 2-N (R' ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; J es R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; cada R" es independientemente H, alquilo, alquilo sustituido o un grupo protector, o cuando más de un grupo R" está presente, dos R" opcionalmente forman un heterocicloalquilo; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Cada uno de R3 y R independientemente es H, halógeno, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido o R3 y R o dos grupos R3 opcionalmente forman un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; o los grupos -A-B-J-R juntos forman un cicloalquilo o heterocicloalquilo bicíclico o tricíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo o un grupo carbonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido; o un grupo carbonilo enmascarado, incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; o el grupo -J-R junto forman un cicloalquilo o heterocicloalquilo monocíclico o bicíclico que comprende al menos un grupo carbonilo, incluyendo un grupo dicarbonilo, grupo carbonilo protegido, incluyendo un grupo dicarbonilo protegido o grupo carbonilo enmascarado incluyendo un grupo dicarbonilo enmascarado; con la condición de que cuando A es fenileno y cada R3 es H, está presente; y que cuando A es — (CH2)4- y cada R3 es H5 B no es -NHC (O) (CH2CH2)-; y que cuando A y B están ausentes y cada R3 es H, R no es metilo. Además, compuestos que tienen la estructura de la Fórmula (V) se incluyen: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)- , -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, - C(0)N(R')-, -CON (R '> (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R ')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R*)C(0)0-, -S(0)kN(R') -, -N(R')C(0)N(R') -5 -N(R')C(S)N(R') , -N(R')S(0)kN(R') -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C (R ' ) =N-N (R) , C(R')=N-N= -C(R')2-N=N- y -C (R ' ) 2-N (R) -N (R ' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido, polinucléotido; y R2 es opcional y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; con la condición de que cuando A es fenileno, B está presente; y que cuando A es - (CH2V, B no es - NHC (O) (CH2CH2)-; y que cuando A y B están ausentes R no es metilo. Además, aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (VI) se incluyen: (VI), en donde : B es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno sustituido inferior, alquenileno inferior, alquenileno sustituido inferior, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido inferior, -0-, -o- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(0)0-, -S (0) kN (R' ) - , -N(R» ) C (O)N(R' ) - , -N(R')C(S)N(R') -, -N(R')S(0)kN(R) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N- y -C (R ' ) 2-N (R • ) -N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; y R2 es opcional y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; cada Ra se elige independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR' y -S(0) R', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos se incluyen: y en donde estos compuestos son grupo amino protegido opcionalmente, protegido carboxilo o su sal. Además, cualquiera de los aminoácidos no naturales siguientes pueden incorporarse en un aminoácido polipéptido no natural. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (VI) , se incluyen: en donde : B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido), -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)- , -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, - C(0)N(R')-, -CON (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-. -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C0- (alquileno o alquileno substituido)-, -N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R') -, -N(R')C(0)N(R') -, N(R')C(S)N(R') -, -N(R')S(0)kN(R') -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R>, -C(R')=N-N=, -C (R ' ) 2-N=N- y -C (R ' ) 2-N (R- >N (R ' ) - , en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo substituido; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; y R2 es opcional y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; cada R3 es se elige independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, C(0)N(R% -OR1, y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; y n es O a 8; con la . condición de que cuando A es -(CH2)4-, B no es -NHC(O) (CH2CH2) -. Además, los siguientes aminoácidos se incluyen: en donde estos compuestos están opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos o su sal. Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los aminoácidos no naturales siguientes pueden ser incorporados en un aminoácido polipéptido no natural. Además, los siguientes aminoácidos tienen la estructura de la Fórmula (VIII) se incluyen: (VIII), en donde A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (O) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R') -, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido) - - C(0)N(R')-, -C0N(R' K alquileno o alquileno sustituido) - -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido) - -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0- -S(0)kN(R') -, -N(R')C(0)N(R') -, N(IV)C(S)N(R )-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(IV)-N=, -C(R')=N-, - C(R')=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N=, -C(TV)2-N=N- y -C(R*)2-N(R'>N(R'), en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido; Ri es opcional cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácidos, polipéptido o polinucléotido. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (IX) se incluyen: B es opcional, y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, -S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido) - - C(0)N(R')-, -CON (R) - (alquileno o alquileno sustituido) - -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido) - -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0- -S(0)kN(R' ) -, -N(R' )C(0)N(R' ) -, -N (R ' ) C (S) N (R) -, -N(R')S(0)kN(R) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-S -C (R ' ) =N-N (R ' ) - , -C(R')=N-N=, -C(R' )2-N=N-, y -C (R1 ) 2-N (R' >N (R' ) - , en donde cada R' independientemente es H, alquilo o sustituido; Ri es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; en donde cada Ra se elige independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')25 -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR', y -S(0)kR', en donde R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos se incluyen: en donde estos compuestos opcionalmente están amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos. Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los aminoácidos no naturales siguientes pueden incorporarse en un aminoácido polipéptido no natural. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (X) se incluyen: en donde B es opcional, y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustitido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -O-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(O)-(alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CS (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0-, -S (O) kN (R' ) - , -N(R' ) C (O)N(R' ) - , -N(R' )C(S)N(R) -, -N(R' )S(0XN(R' ) -, -N(R')-N= -C(R')=N-, C(R')=N-N(R) -, -C(R')=N-N= -C (R ' ) 2-N=N- , y -C (R ' ) 2-N (R ' ) N (R ' ) -, en donde cada R1 es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se elige independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R%?? -OR', y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8. Además, se incluyen los siguientes aminoácidos: en donde estos compuestos están opcionalmente amino protegidos., opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o su sal. Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales pueden incorporarse en un aminoácido polipéptido no natural. Además de estructuras monocarbonilo, los aminoácidos no naturales descritos aquí pueden incluir grupos tales como dicarbonilo, tipo dicarbonilo, dicarbonilo enmascarado y grupos dicarbonilo protegido. Por ejemplo, los siguientes aminoácidos tienen la estructura de la Fórmula (XI) se incluyen: en donde A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; B es opcional, y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -O- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, -S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C (0) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)- , -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, - C(0)N(R')-, -CON (R) - (alquileno o alquileno sustituido) - -CSN(R')-, -CSN(R' )- (alquileno o alquileno sustituido) - -N(R')C0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' )C(0)0- -S(0)kN(R') -, -N(R')C(0)N(R') -, N(R' )C(S)N(R )-, -N(R')S(0)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-3 - C(R')=N-N(R) -, -C(R')=N-N=, -C (R ' ) 2-N=N- , y -C (R ' ) 2-N (R ' ) - N(R')-, en donde R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido. Además, los siguientes aminoácidos tienen la estructura de la Fórmula (XII) se incluyen: B es opcional y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)ic??, en donde k es 1, 2 o 3, S (0) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)- , -N(R')-, -NR1 - (alquileno o alquileno sustituido)-, - C(0)N(R')-, -CON (R) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R1 )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N (R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(0)0-, -S(0)kN(R' ) -, -N(R' ) C (O)N(R' ) - , - N(R')C(S)N(R') -, -N(R')S(0)kN(R') -, -N(R')-N= -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R') -, -C(R')=N-N=, -C (R ' ) 2-N=N- , y -C (R ' >2-N (R ' >-N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; en donde cada Ra es independientemente seleccionado del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1 , 2 o 3 , -C(0)N(R')2, -OR', y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo, o alquilo sustituido. Además, los siguientes amino ácidos se incluyen: en donde estos compuestos están opcionalmente amino protegidos, opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o una sal de los mismos". Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales pueden incorporarse en un aminoácido polipéptido no natural. Además, los siguientes aminoácidos tienen la estructura de la Fórmula (XIII) se incluyen: en donde B es opcional, y cuando está presente es un enlazador seleccionado del grupo que consiste de alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior sustituido, -0-, -0- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S-, -S- (alquileno o alquileno sustituido)-, -S(0)k- en donde k es 1, 2 o 3, S (O) k (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)-, -C(0)- (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(S)-, -C (S) - (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')-, -NR' - (alquileno o alquileno sustituido)-, -C(0)N(R')-, -CON(R')- (alquileno o alquileno sustituido)-, -CSN(R')-, -CSN (R' )- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R' ) CO- (alquileno o alquileno sustituido)-, -N(R')C(0)0- , -S (O) kN (R) - , -N (R> ) C (O) N (R' ) - , - N(R')C(S)N(R') -, -N(R' )S(0)kN(R' ) -, -N(R')-N=, -C(R')=N-, - C(R' )=N-N(R' ) -, -C(R')=N-N= -C (R ' ) 2-N=N- , y -C (R ' ) 2-N (R ' ) - N(R')-, en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; cada Ra se elige independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, -N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -OR', y -S(0)kR' en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido; y n es 0 a 8. Además, se incluyen los siguientes aminoácidos: en donde estos compuestos están opcionalmente amino protegidos opcionalmente carboxilo protegidos, opcionalmente amino protegidos y carboxilo protegidos, o su sal. Además, estos aminoácidos no naturales y cualquiera de los siguientes aminoácidos no naturales, pueden incorporarse en un aminoácido polipéptido no natural. Además, los siguientes aminoácidos tienen la estructura de la Fórmula (XIV) se incluyen: en donde: A es opcional, y cuando está presente es un alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S, o S (0) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIV-A) se incluyen: R,HN pav-A) en donde : A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIV-B) se incluyen: en donde : A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N (R' ) (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XV) se incluyen: en donde : A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S (0) ; y n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se elige independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo o cualquiera R8 y R9 pueden en conjunto formar =0 o un cicloalquilo, o cualquier adyacentes grupos R8 pueden en conjunto formar un cicloalquilo. Además, los siguientes aminoácidos tienen la estructura de la Fórmula (XV-A) se incluyen: en donde : A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo protector éster, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; n es O, 1, 2, 3 , 4 o 5 ; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se elige independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo o cualquiera R8 y R9 pueden en conjunto formar =0 o un cicloalquilo, o cualquiera a grupos adyacentes R8 pueden en conjunto formar un cicloalquilo. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XV-B) se incluyen: A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; n es O, 1, 2, 3, 4 o 5; y cada R8 y R9 en cada grupo CR8R9 se elige independientemente del grupo que consiste de H, alcoxi, alquilamina, halógeno, alquilo, arilo o cualquier R8 y R9 puede en conjunto formar =0 o un cicloalquilo, o cualquiera adyacentes grupos R8 pueden en conjunto formar un cicloalquilo. Además, los siguientes aminoácidos tienen la estructura de la Fórmula (XVI) se incluyen: en donde : A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; Xi es C, S o S (0) ; y L es alquileno, alquileno sustituido, N(R' ) (alquileno) o N (R' ) (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVI -A) se incluyen: en donde : A es opcional, y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustitido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional, y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucleótido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Además, los siguientes aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVI -B) , se incluyen: en donde : A es opcional y cuando está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; R es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo substituido; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; y R es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; L es alquileno, alquileno sustituido, N(R') (alquileno) o N(R') (alquileno sustituido), en donde R' es H, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. Además, aminoácidos que tienen estructura de la Fórmula (XVII), se incluyen: (xvii), en donde : A es opcional y cuando un está presente es alquileno inferior, alquileno inferior sustituido, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior sustituido, alquenileno inferior, alquenileno inferior sustituido, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno sustituido, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior sustituido, arileno, arileno sustituido, heteroarileno, heteroarileno sustituido, alcarileno, alcarileno sustituido, aralquileno o aralquileno sustituido; M es (b) en donde (a) indica enlace al grupo A y (b) indica enlace a los grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 se eligen independientemente de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R4 opcionalmente forman un cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo substituido; T3 es una enlace C(R) (R), 0 o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido. Además, aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XVIII) se incluyen: en donde M es -C (R3 ) en donde (a) indica enlace al grupo A y (b) indica enlace a grupos carbonilo respectivos, R3 y R4 se eligen independientemente H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, o R3 y R4 o dos grupos R3 o dos grupos R opcionalmente forman una cicloalquilo o un heterocicloalquilo; R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo substituido; T3 es una enlace C (R) (R) , 0 o S y R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; Ri es opcional y cuando está presente es H, un grupo amino protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; y R2 es opcional, y cuando está presente es OH, un grupo éster protector, resina, aminoácido, polipéptido o polinucléotido; Cada R3 se eligen independientemente del grupo que consiste de H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, N(R')2, -C(0)kR' en donde k es 1, 2 o 3, -C(0)N(R')2, -0R' y -S(0)kR', en donde cada R' es independientemente H, alquilo o alquilo sustituido. Además, aminoácidos que tienen la estructura de la Fórmula (XIX) se incluyen: en donde : R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; y T3 es 0 o S . Además, aminoácidos que tienen estructura de la Fórmula (XX) se incluyen: en donde: R es H, halógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo substituido; Además, los siguientes aminoácidos que tienen las estructuras de la Fórmula (XXI) se incluyen: Las síntesis de p-acetil- (+/-) - fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describen en Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), incorporada referencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo o dicarbonilo pueden ser preparados en forma similar por una persona con destreza ordinaria especialidad. Las FIGURAS 4, 24-34 y 36-39 de la Patente de los E.U.A. Número 7,083,970, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido no natural se modifica químicamente para generar un grupo funcional carbonilo o dicarbonilo reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad aldehido útil para reacciones de conjugación, puede generarse a partir de una funcionalidad que tienen grupos amino e hidroxilo adyacentes. Cuando la molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo una serina o treonina N-terminal (que normalmente puede estar presente no puede exponerse mediante digestión química o enzimática) puede emplearse para generar una funcionalidad aldehido bajo condiciones de escisión oxidativa ligeras utilizando peryodato. Ver por ejemplo Gaertner, et . al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioco?jug. Chem. 3: 138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, métodos conocidos en la especialidad se restringen al aminoácido en el extremo N del péptido o proteína. En la presente invención, un aminoácido no natural que contiene grupos hidroxilo y amino adyacentes puede incorporarse en el polipéptido como una funcionalidad aldehido "enmascarada". Por ejemplo, 5-hidroxilisina contiene un grupo hidroxilo adyacente a la épsilon amina. Condiciones de retos son para generar el aldehido típicamente involucran la adición de exceso molar de meta peryodato de sodio bajo condiciones ligeras para evitar oxidación en otros sitios dentro de polipéptido. El pH de la reacción de oxidación típicamente es de aproximadamente 7.0. Una reacción típica involucran la adición de 1.5 exceso molar de meta peryodato de sodio a una solución amortiguada del polipéptido seguido por incubación por aproximadamente 10 minutos en obscuridad. Ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 6,423,685. La funcionalidad carbonilo o dicarbonilo puede reaccionarse selectivamente con un reactivo que contiene hidroxilamina bajo condiciones ligeras en la solución acuosa para formar el enlace oxima correspondiente que es estable bajo condiciones fisiológicas. Ver por ejemplo Jencks, . P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 1 17: 3893- 3899 (1995). Aún más, la reactividad única de los grupos carbonilo o dicarbonilo permite modificación selectiva en la presencia de las otras cadenas laterales aminoácidos. Ver por ejemplo, Cornish, V. ., et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K. , et al., Science 276:1125-1128 (1997). ESTRUCTURA Y SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES: AMINOÁCIDOS QUE CONTIENEN HIDROXILAMINA. La Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/638,418 se incorpora aquí por referencias su totalidad. De esta manera, descripciones que se proporcionan en la Sección V (con título "Aminoácidos no naturales"), Parte B (con título "Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids: Hydroxylamine- Containing Amino Acids"), en la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/638,418 aplican completamente los métodos, composiciones (incluyendo Fórmulas I -XXXV) , técnicas y estrategias para producir, purificar, caracterizar y utilizar aminoácidos no naturales, aminoácidos polipéptidos no naturales y aminoácidos polipéptidos no naturales modificados los créditos aquí en la misma proporción como si dichas proporciones se presentarán completamente aquí . SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES: Muchos de los aminoácidos no naturales adecuados por utilizar en la presente invención están comercialmente disponibles de Sigma (USA) o Aldrich (Milwaukee, Wl , USA). Aquellos que no están comercialmente disponibles se sintetizan opciónalmente como se dispone aquí o se proporciona en diversas publicaciones utilizando técnicas estándar reconocidas por aquellos con destreza ordinaria la especialidad. Para técnicas de síntesis orgánica, ver por ejemplo Organic Chemistry por Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York) ; and Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York) . Publicaciones adicionales que describen la síntesis de aminoácidos no naturales incluyen por ejemplo WO 2002/085923 con título "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis ofGlutamine and of ?- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates . J. Chem. Soc. 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti- Tumor Agents. J.

Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [ [4- (diethylamino) -1-methylbutyl] amino] quinolim (Chloroquine) . J.

Ore. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M. , Vil ont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Ore. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Puré Pipecolates from L-Asparagine.

Application to the Total Synthesis of (+) -Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Qrg. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino- Adipic Acids, L-alpha- aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; y, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of bela-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Ver también la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2004/0198637 con título "Protein Arrays", que aquí se incorpora preferencia. A. Grupos reactivos carbonilo Aminoácidos con un grupo reactivo carbonilo permiten una variedad de reacciones con moléculas de enlace (incluyendo pero no limitadas a PEG u otros moléculas solubles en agua) mediante adición nucleofílicas o reacciones de condensación aldol entre otras. Aminoácidos que contienen carbonilo ejemplares podrá presentarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; R2 es H, alquilo, arilo, alquilo sustituido, y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de extremo amino, y R4 es H, es un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo y R2 es un alquilo simple (es decir, metilo, etilo o propilo) y la porción cetona se ubica en la posición para respecto a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo y R2 es un alquilo simple (es decir, metilo, etilo, propilo) y la porción cetona se ubica en la posición meta respecto a la cadena lateral alquilo. Las síntesis de p-acetil- (+/-) - fenilalanina y m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describen en Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), que se incorpora aquí por preferencia. Otros aminoácidos que contienen carbonilo pueden prepararse similarmente por una persona con destreza ordinaria en la técnica. En algunas modalidades, un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado se modifica químicamente para generar un grupo funcional carbonilo reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad aldehido útil para reacciones de conjugación, puede generarse a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacentes. Cuando la molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo una serina o treonina N-terminal (que normalmente puede estar presente o puede exponerse mediante digestión enzimática o química) puede emplearse para generar una funcionalidad aldehido bajo condiciones de escisión oxidativa ligeras utilizando peryodato. Ver por ejemplo Gaertner, et . al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J. , Bioco?jug. Chem. 3:138-146 (1992); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, métodos conocidos en técnica se restringen al aminoácido en el extremo N del péptido o proteína. En la presente invención, un aminoácido no naturalmente de codificado que contiene grupos hidroxilo y amino adyacentes, puede incorporarse en el polipéptido como una funcionalidad aldehido "enmascarada". Por ejemplo, 5-hidroxilisina contiene un grupo hidroxilo adyacente a la epsilon amina. Condiciones de reacción para generar el aldehido típicamente involucran adición de exceso molar de meta peryodato de sodio bajo condiciones ligeras para evitar oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación típicamente es de aproximadamente 7.0. Una reacción típica involucra la adición de 1.5 exceso molar de meta per yodato de sodio a una solución amortiguada del polipéptido, seguido por incubación por aproximadamente 10 minutos en obscuridad. Ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 6,423,685, que se incorpora aquí por referencia. La funcionalidad carbonilo puede reaccionarse selectivamente con un reactivo que contiene hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, o semicarbazida bajo condiciones ligeras en solución acuosa para formar los enlaces correspondiente hidrazona, oxima o semicarbazona, respectivamente, que son estables bajo condiciones fisiológicas. Ver por ejemplo Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Aún más, la reactividad única del grupo carbonilo permite modificación selectiva en la presencia de otras cadenas laterales aminoácido. Ver por ejemplo Cornish, V. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G. , Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal , L. K. , et al., Science 276:1125-1128 (1997) . B. Grupos reactivos hidrazina, hidrazida o semicarbazida. Aminoácidos no naturalmente codificados que contienen un grupo nucleofílico tal como hidrazina, hidrazida o semicarbazida, permitan reacción con una variedad de grupos electrofílieos para formar conjugados (incluyendo pero no limitados a con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Aminoácidos que contienen hidrazina, hidrazida o semicarbazida ejemplares pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no está presente; X, es O, N, o S o no está presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, n es 4, Ri no está presente y X es N. En algunas modalidades, n es 2, Rx no está presente y X no está presente. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es 0, y el átomo de oxígeno se ubica para con respecto al grupo alifático en el anillo arilo. Aminoácidos que contienen hidrazida, hidrazina y semicarbazida están disponibles de fuentes comerciales. L-glutamato- ^ -hidrazida está disponible de Sigma Chemical (St. Louis, MO) . Otros aminoácidos no disponibles comercialmente pueden prepararse por una persona con destreza ordinaria en la técnica. Ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 6,281,211, que se incorpora aquí por referencia.

Polipéptidos que contienen aminoácidos no naturalmente codificados que contienen funcionalidades hidrazida, hidrazina o semicarbazida pueden reaccionarse eficientemente y en forma selectiva con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad a química similar. Ver por ejemplo Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). La reactividad única de grupos funcionales hidrazida, hidrazina y semicarbazida los hace significativamente más reactivos hacia aldehidos, cetonas y otros grupos electrofílieos en comparación con grupos nucleofílicos presentes en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitados al grupo hidroxilo de serina o treonina o los grupos amino de lisina y el extremo N) . C. Aminoácidos que contienen aminooxi. Aminoácidos que no están codificados naturalmente que contienen un grupo aminooxi (también denominado una hidroxilamina) permiten reacción con una variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo pero no limitados a con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Como las hidrazinas, hidrazidas o semicarabzidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxi permite que reaccione eficientemente y en forma selectiva con una variedad de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Ver por ejemplo Shao, J. and Tarn, J. , J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Ace. Chem. Res. 34: 727-736 (2001) . Mientras que el resultado de reacción por un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, sin embargo, resulta una oxima generalmente de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contienen carbonilo tal como una cetona. Aminoácidos ejemplares que contienen grupos aminooxi pueden presentarse como sigue: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no está presente; X, es O, N, o S o no está presente; m es 0-10; Y = C(O) o no está presente; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, un grupo de modificación de extremo amino y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es O, m es 1 e Y esta presente. En algunas modalidades, n es 2 , Rx y X no están presentes, m es 0 e Y no está presente. Aminoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse a partir de precursores de aminoácidos fácilmente disponibles (homoserina, serina y treonina) . Ver, por ejemplo M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003) . Ciertos aminoácidos que contienen aminooxi, tales como ácido L-2-amino-4- (aminooxi) butírico) , se han aislado de fuentes naturales (Rosenthal, G, Life Sci. 60: 1635-1641 (1997) . Otros aminoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse por una persona con destreza ordinaria en la especialidad. D. Grupos reactivos azida y alquino La reactividad única de grupos funcionales azida y alquino los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas. Azidas orgánicas, particularmente azidas alifáticas y alquinos en general son estables hacia condiciones químicas reactivas comunes. En particular, tanto los grupos funcionales azida como alquino son inertes hacia la cadena lateral (es decir grupos R) de los 20 aminoácidos comunes encontrados en polipéptidos de origen natural. Cuando se ponen en proximidad inmediata, sin embargo, la naturaleza "cargada a resorte" de los grupos azida y alquino se revela y reaccionan selectiva y eficientemente mediante reacción de cicloadición Huisgen [3+2] para generar el triazol correspondiente. Ver, por ejemplo Chin J. , et al, Science 301 :964-7 (2003); Wang, Q, et al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W. , et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) . Debido a que la reacción de cicloadición Huisgen involucra una reacción de cicloadición selectiva (ver, por ejemplo Padwa, A., en COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M. , 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. en 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176) , en vez de una substitución nucleofílica, la incorporación de aminoácidos no naturalmente codificados que contienen cadenas laterales que contienen azida y alquino permite a los polipéptidos resultantes ser modificados selectivamente en la posición del aminoácido no naturalmente codificado. Reacción de cicloadición que involucra polipéptido que contiene azida o alquino puede llevarse a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones acuosas por la adición de Cu (II) (incluyendo pero no limitado a, en la forma de una cantidad catalítica de CuS04) en la presencia de un agente reductor para reducir Cu (II) en Cu (I), in si tu , en cantidad catalítica. Ver, por ejemplo Wang, Q. , et al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W. , et al, J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al, Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Agentes reductores ejemplares incluyen, incluyendo pero no limitado a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe+, Co2+, y un potencial eléctrico aplicado.

En algunos casos, cuando se desea una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] entre una azida y un alquino, el polipéptido comprende un aminoácido no naturalmente codificado que comprende una porción alquino y el polímero soluble en agua a conectar al aminoácido, comprende una porción azida. En forma alterna, la reacción inversa (es decir, con la porción azida en el aminoácido y la porción alquino en el polímero soluble en agua) también puede realizarse . El grupo funcional azida también puede reaccionar selectivamente con el polímero soluble en agua que contiene un aril éster y apropiadamente funcionalizado con una porción aril fosfina para generar un enlace amida. El grupo aril fosfina reduce la azida in si tu y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con un enlace éster próximo para generar la amida correspondiente. Ver, por ejemplo, E.

Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000) . El aminoácido que contiene azida ya puede ser una alquil azida (incluyendo pero no limitada a ácido 2-amino-6-azido-l-hexanoico) o un aril azida (p-azido-fenilalanina) . Polímeros solubles en agua ejemplares que contienen un aril éster y una porción fosfina pueden representarse como sigue : en donde X puede "s€er O,CN, fS o"no está presente, Ph es fenilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser H, alquilo, arilo, grupos alquilo sustituido y arilo sustituido. Grupos R ejemplares incluyen pero no están limitados a -CH2, -C(CH3) 3, -0R', -NR'R", -SR', -halógeno, -C(0)R', -CONR'R", -S(0)2R', - SÍOsNR^", -CN y -N02. R', R" , R'" y R" " cada uno independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, incluyendo pero no limitados a, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o sin sustituir, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos arilalquilo. Cuando compuestos de la invención incluyen más de un grupo R, por ejemplo cada uno de los grupos R se elige independientemente al igual que los grupos R', R" , R'" y R"", cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se conectan al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6- o 7-miembros. Por ejemplo, -NR'R" se pretende que incluya, pero no está limitado a 1-pirrolidinil y 4 -morfolinilo. De la discusión anterior de substituyentes, una persona con destreza en la especialidad comprenderá que el término "alquilo" se pretende que incluya grupos incluyendo átomos de carbono ligados a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero no limitados a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitados a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, C(0)CH2OCH3, y semejantes). El grupo funcional azida también puede reaccionarse selectivamente con un polímero soluble en agua que contiene un tioéster y apropiadamente funcionalizado con una porción aril fosfina para generar un enlace amida. El grupo aril fosfina reduce la azida in si tu y la amina resultante reacciona entonces de manera eficiente con el enlace tioéster para generar la amida correspondiente. Polímeros solubles en agua ejemplares que contienen una porción tioéster y una fosfina pueden representarse como sigue: FhjPtHjC? ,T^S Y Y^X- W en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no está presente, Ph es fenilo, y W es un polímero soluble en agua. Aminoácidos que contienen alquino ejemplares pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Rx es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no está presente; X es 0, N, S o no está presente; m es 0-10, R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X no está presente, m es 0 y la porción acetileno se ubica en la posición para respecto a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es O, m es 1 y el grupo propargiloxi está ubicado en la posición para respecto a la cadena lateral alquilo (es decir, O-propargil -tirosina) . En algunas modalidades, n es 1, Ri y X no están presentes y m es 0 (es decir, proparilglicina) . Aminoácidos que contienen alquino están comercialmente disponibles. Por ejemplo, propargilglicina está comercialmente disponible de Peptech (Burlington, MA) . En forma alterna, aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse de acuerdo con métodos estándar. Por ejemplo, p-propargiloxifenilalanina puede sintetizarse por ejemplo como se describe por Deiters, A., et al . , J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003) , y 4-alquinil-L-fenilalanina puede sintetizarse como se describe en Kayser, B., et at , Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Otros aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse por una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Aminoácidos que contienen azida ejemplares pueden representarse como sigue: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X no está presente, m es 0 y la porción azida se ubica en la posición para respecto a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 0-4 y Ri y X no está presente, y m = 0. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es 0, m es 2 y la porción ß-azidoetoxi se ubica en la posición para respecto a la cadena lateral alquilo. Aminoácidos que contienen azida están disponibles de fuentes comerciales. Por ejemplo, 4-azidofenilalanina puede obtenerse de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL) . Para aquellos aminoácidos que contienen azida que no están comerciallmente disponibles, el grupo azida puede prepararse en forma relativamente fácil utilizando métodos estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, incluyendo pero no limitados a, por desplazamiento de un grupo saliente conveniente (incluyendo pero no limitado a, haluro, mesilato, tosilato) o por abertura de una lactona convenientemente protegida. Ver, por ejemplo, Advanced Organic Chemistry por March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York) . E. Grupos reactivos aminotiol La reactividad única de grupos funcionales aminotiol beta sustituidos los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas que contienen grupos aldehido por formación de la tiazolidina. Ver, por ejemplo J. Shao and J. Tarn, J. Am. Chem. Soc. 1995, 1 17 (14) 3893-3899. En algunas modalidades, aminotiol aminoácidos beta-sustituidos pueden incorporarse en polipéptidos y después reaccionarse con polímeros solubles en agua que comprenden una funcionalidad aldehido. En algunas modalidades, un polímero soluble en agua, conjugado de droga u otra carga útil puede acoplarse a un polipéptido que comprende un aminotiol aminoácido beta-sustituido mediante formación de la tiazolidina. ABSORCIÓN CELULAR DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES La absorción de aminoácidos no naturales por una célula es un aspecto que se considera típicamente cuando se diseña y eligen aminoácidos no naturales, incluyendo pero no limitados a, para incorporación en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de a-aminoácidos sugiere que sus compuestos es poco probable que sean permeables a células. Aminoácidos naturales se absorben en la célula eucariótica mediante una colección de sistemas de transporte basados en proteína. Puede realizarse un rápido monitoreo que estime que aminoácidos no naturales, de haber son absorbidos por células. Ver, por ejemplo los ensayos de toxicidad en la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2004/0198637 con título "Protein Arrays" que se incorpora aquí por referencia; y Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Aunque la absorción se analiza fácilmenten con diversos ensayos, una alternativa a diseñar amino ácidos no naturales que son susceptibles a rutas de absorción celular es proporcionar rutas biosintéticas para crear aminoácidos in vivo .

BIOSINTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES Muchas rutas biosintéticas ya existen en células para la producción de aminoácidos y otros compuestos. Mientras que el método biosintético para un aminoácido no natural particular puede no existir en la naturaleza, incluyendo pero no limitado a, en una célula, la invención proporciona estos métodos. Por ejemplo, rutas biosintéticas para aminoácidos no naturales se generan opcionalmente en la célula huésped al agregar nuevas enzimas o modificar rutas de células huésped existentes. Nuevas enzimas adicionales son opcionalmente enzimas de origen natural o enzimas de evolución artificial. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en un ejemplo en WO 2002/085923 con título "In vivo incorporation of unnatural amino acids") se basa en la adición de una combinación de enzimas conocidas de otros organismos. Los genes para estas enzimas pueden introducirse en una célula eucariótica al transformar la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan una ruta enzimática para sintetizar el compuesto deseado. Ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente, se proporcionan en los siguientes ejemplos. Secuencias de enzimas adicionales se encuentran por ejemplo, en Genbank. Enzimas de evolución artificial también se agregan opcionalmente en una célula en la misma forma. De esta manera, la maquinaria y recursos celulares de una célula se manipulan para producir aminoácidos no naturales. Una variedad de métodos están disponibles para producir enzimas novedosas para utilizar en rutas biosintéticas o para la evolución de rutas existentes. Por ejemplo, recombinación recursiva, incluyendo pero no limitada a, como se desarrolló por Maxygen, Inc. (disponible en la Red Mundial en maxygen.com), se emplea opcionalmente para desarrollar enzimas y rutas novedosas. Ver, por ejemplo Stemmer (1994) , Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4) : 389-391 ; y, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 91:10747-10751. Similarmente DesignPathMR, desarrollado por Genencor (disponible en la Red Mundial en genencor.com) se emplea opcionalmente para ingeniería de ruta metabólica, incluyendo pero no limitada a diseñar una ruta para crear 0-metil-L-tirosina en una célula. Esta tecnología reconstruye rutas existentes en organismos huéspedes o anfitriones utilizando una combinación de nuevos genes, incluyendo pero no limitado a, aquellos identificados a través de genómica funcional, y evolución y diseño molecular. Diversa Corporation (disponible en la Red Mundial como diversa.com) también proporciona tecnología para rápidamente monitorear bibliotecas de genes y rutas de genes incluyendo pero no limitado a crear nuevas rutas. Típicamente, el aminoácido no natural producido por una ruta biosintética de ingeniería de la invención, se produce en una concentración suficiente para una biosíntesis de proteína eficiente, incluyendo pero no limitada a una cantidad celular natural, pero no a un grado tal que afecte la concentración de los otros aminoácidos o agote los recursos celulares. Concentraciones típicas producidas in vivo de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 mM. Una vez que una célula se transforma con un plásmido que comprende los genes empleados para producir enzimas deseadas para una ruta específica y un aminoácido no natural se genera, selecciones in vivo se emplean opcionalmente para optimizar más la producción del aminoácido no natural tanto para síntesis de proteína ribosomal como crecimiento celular. POLIPÉPTIDOS CON AMINOÁCIDOS NO NATURALES La incorporación de un aminoácido no natural puede realizarse por una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitados a, ajustar a la medida cambios en la estructura y/o función de proteína, cambiar tamaño, acidez, nucleofilicidad, enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad, acessibilidad de sitios objetivos proteasa, hacer blanco a una porción (incluyendo pero no limitada a un arreglo de proteína) , agregar una molécula biológicamente activa, conectar un polímero, conectar un radionúclido, modular la vida media en suero, modular penetración de tejido (por ejemplo tumores), modular transporte activo, modular especificidad o distribución de tejido célula u órgano, modular inmunogenicidad, modular resistencia proteasa, etc. Proteínas que incluyen un aminoácido no natural pueden tener propiedades biofísicas o catalíticas mejoradas o incluso totalmente nuevas. Por ejemplo, las siguientes propiedades se modifican opcionalmente por inclusión de un aminoácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, habilidad catalítica, vida media (incluyendo pero no limitada a vida media en suero) , habilidad para reaccionar con otras moléculas, incluyendo pero no limitadas a, en forma covalente o no covalente y semejantes. Las composiciones incluyendo proteínas, que incluyen cuando menos un aminoácido no natural son útiles para, incluyendo pero no limitado a, agentes terapéuticos novedosos, agentes de diagnóstico, enzimas catalíticas, enzimas industriales, proteínas de enlace (incluyendo pero no limitadas a anticuerpos) , e incluyendo pero no limitado al estudio de estructura y función de proteínas. Ver, por ejemplo Dougherty, (2000) Non-natural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652.

En un aspecto de la invención, una composición incluye cuando menos una proteína con cuando menos uno, incluyendo pero no limitado a, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes, incluyendo pero no limitados a, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más aminoácidos no naturales diferentes. En otro aspecto, una composición incluye una proteína con al menos uno, pero menos que todos, de un aminoácido particular presente en la proteína que está sustituido con el aminoácido no natural. Para una proteína determinada, más de uno de aminoácidos no naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser idénticos o diferentes (incluyendo pero no limitados a, la proteína puede incluir dos o más tipos diferentes de aminoácidos no naturales, o puede incluir dos del mismo aminoácido no natural) . Para una proteína determinada con más de dos aminoácidos no naturales, los aminoácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes o una combinación de un aminoácido no natural múltiple del mismo tipo con al menos un aminoácido no natural diferente. Proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural son una característica de la invención.

La invención también incluye polipéptidos o proteínas con al menos un aminoácido no natural producido utilizando las composiciones y métodos de la invención. Un excipiente (incluyendo pero no limitado a, un excipiente farmacéuticamente aceptable) también puede estar presente con la proteína. Al producir proteínas o polipéptidos de interés con al menos un aminoácido no natural en células eucarióticas, proteínas o polipéptidos típicamente incluirán modificaciones post-traducción eucarióticas. En ciertas modalidades, una proteína incluye cuando menos un aminoácido no natural y al menos una modificación post-traducción que se elabora in vivo por una célula eucariótica, en donde la modificación post-traducción no se elabora por una célula procariótica. Por ejemplo, la modificación post-traducción incluye, pero no está limitada a, glicosilación, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glicolípido, glicosilación, y semejantes. En un aspecto, la modificación post-traducción incluye conexión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a, (GlcNAc- Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) a una asparagina por un enlace GlcNAc-asparagina. Ver Tabla 1 que cita algunos ejemplos de oligosacáridos N-enlazados de proteínas eucarióticas (residuos adicionales también pueden estar presentes, que no se muestran) . En otro aspecto, la modificación post-traducción incluye conexión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a una serina o treonina por un enlace GalNAc-serina o GalNAc-treonina, o un enlace GlcNAc-serina o una GlcNAc-treonina. Tabla 1: Ejemplos de oligosacáridos a través de enlace GlcNAc COMPLEX Manßl-4GlcNAcßl-4GlcNAcßl-Asn XILOSE Manßl-4GlcNAcßl-4GlcNAcßl-Asn ##### Todavía en otro aspecto, la modificación post-traducción incluye procesamiento proteolítico de precursores (incluyendo pero no limitado a, precursor de calcitonina, precursor de péptido relacionado a gen de calcitonina, hormona pre-proparatiroide, pre-proinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocortina, pro-opiomelanocortina y semejantes) , ensamblado en una proteína de múltiples subunidades o conjunto macromolecular, traducción a otro sitio en la célula (incluyendo pero no limitado a organelos, tales como retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, el núcleo, liposomas, peroxisomas, mitocondria, cloroplastos, vacuolas, etc., o a través de la ruta secretoria) . En ciertas modalidades, la proteína comprende una secuencia de secreción o localización, una etiqueta de epítopo, una etiqueta FLAG, una etiqueta polihistidina, una fusión GST, o semejantes. Las patentes de los E.U.A. Nos. 4,-963,495 y 6,436,674, que se incorporan aquí por referencia, detallan construcción diseñadas para mejorar la secreción de GH, por ejemplo hGH polipéptidos . Una ventaja de un aminoácido no natural es que presenta porciones químicas adicionales que pueden emplearse para agregar moléculas adicionales. Estas modificaciones pueden realizarse in vivo en una célula eucariótica o no eucariótica o in vitro. De esta manera, en ciertas modalidades, la modificación post-traducción es a través del aminoácido no natural. Por ejemplo, la modificación posttraducción puede ser a través de una reacción nucleofílica-electrofílica. La mayoría de las reacciones actualmente empleadas para la modificación selectiva de proteínas involucra la formación de enlaces covalentes entre socios de reacción nucleofílicos y electrofílicos, incluyendo pero no limitados a la reacción de a-halocetonas con cadenas laterales histidina o cisteína. La selectividad en estos casos se determina por el número y acceso de los residuos nucleofílicos en la proteína. En proteínas de la invención, otras reacciones más selectivas pueden emplearse tales como la reacción de un ceto-aminoácido no natural con hidrazidas o compuestos aminooxi, in vitro e in vivo . Ver, por ejemplo Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science. 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. ScL 99: 11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Nati. Acad. ScL 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry. 42:6735-6746; and, Chin, et al., (2003) Science. 301:964-7, todas las cuales se incorporan por referencia. Esto permite el etiquetado selectivo virtualmente de cualquier proteína con un grupo de reactivos incluyendo fluoróforos, agentes de entrelazamiento, derivados sacárido y moléculas citotóxicas. Ver también la patente de los E.U.A. No. 6,927,042 con título "Glycoprotein synthesis", que aquí se incorpora por referencia. Modificaciones post-traducción, incluyendo pero no limitadas a, a través de un azido aminoácido, también pueden realizarse a través de la ligación Staudinger (incluyendo pero no limitada a, con reactivos triarilfosfina) . Ver por ejemplo Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective odification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24. Esta invención proporciona otro método altamente eficiente para la modificación selectiva de proteínas, que involucra la incorporación genética de aminoácidos no naturales, incluyendo pero no limitados a, que contienen una porción azida o alquinilo en proteínas, en respuesta a un codón selector. Estas cadenas laterales aminoácido pueden entonces modificarse por, incluyendo pero no limitado a, una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] (ver, e.g., Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis. Vol. 4. (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; and, Huisgen, R. in 1,3 -Dipolar Cycloaddition Chemistry. (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) con, incluyendo pero no limitado a derivados alquinilo o azida, respectivamente. Debido a que este método involucra una cicloadición en vez de una sustitución nucleofílica, pueden modificarse proteínas con selectividad extremadamente alta. Esta reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4 > 1,5) por adición de cantidades catalíticas de sales Cu (I) a la mezcla de reacción. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41 =2596-2599. Otro método que puede emplearse es el intercambio de ligandos en un compuesto bis-arsénico con un motivo tetracisteína, ver por ejemplo, Griffin, et al., (1998) Science 281 :269-272. Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención a través de una cicloadición [3+2] incluye virtualmente cualquiera molécula con un derivado azida o alquinilo. Moléculas incluyen, pero no están limitadas a colorantes, fluoróforos, agentes de entrelazamiento, derivados sacárido, polímeros (incluyendo pero no limitados a, derivados de polietilen glicol), foto-entrelazadores, compuestos citotóxicos, etiquetas de afinidad, derivados de biotina, resinas, perlas, una segunda proteína o polipéptido (o más), polinucleótido (s) (incluyendo pero no limitados a, ADN, ARN, etc.), queladores de metal, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos, y semejantes. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido no natural con un grupo alquinilo, incluyendo pero no limitados a p-propargiloxifenilalanina, o grupo azido, incluyendo pero no limitado a, p-azido-fenilalanina, respectivamente.

V. Generación in vivo de polipéptidos gue comprenden aminoácidos no codificados genéticamente Los polipéptidos de la invención pueden generarse in vivo utilizando ARNt y ARNt sintetasas modificadas para agregar a o sustituir aminoácidos que no están codificados en sistemas de origen natural . Métodos para generar ARNts y ARNt sintetasas que utilizan aminoácidos que no están codificados en sistemas de origen natural, se describen por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 7,045,337 y 7,083,970, que se incorporan aquí por referencia. Estos métodos involucran generar una maquinaria de traducción que funciona independientemente de las sintetasas y ARNts endógenos al sistema de traducción (y por lo tanto en ocasiones se refieren como "ortogonales"). Típicamente, el sistema de traducción comprende un ARNt ortogonal (0-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) . Típicamente, la 0-RS de preferencia aminoacila el 0- ARNt con al menos un aminoácido que no es de origen natural en el sistema de traducción y el 0-ARNt reconoce al menos un codón selector que no se reconoce por otros ARNts en el sistema. El sistema de traducción de esta manera inserta el aminoácido no naturalmente codificado en una proteína producido en el sistema, en respuesta a un codón selector codificado, de esta manera "sustituyendo" un aminoácido en una posición en el polipéptido codificado.

Una amplia variedad de ARNts ortogonales y aminoacil ARNt sintetasas se ha descrito en la técnica para insertar aminoácidos sintéticos particulares en polipéptidos, y en general son adecuados para utilizar en la presente invención. Por ejemplo, 0-ARNt/aminoacil-ARNt sintetasas ceto específicas se describen en Wang, L. , et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) and Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22) : 6735-6746 (2003). Ejemplares 0-RS o sus porciones se codifican por secuencias polinucleótido e incluyen secuencias de aminoácidos descritas en las patentes de los E.U.A. Nos. 7,045,337 y 7,083,970, cada una incorporada aquí por referencia. Moléculas de O-ARNt correspondientes para utilizar con las 0-RSs también se describen en las patentes de los E.U.A. Nos. 7,045,337 y 7,083,970, que se incorporan aquí por referencia. Un ejemplo de un sistema O-ARNt/aminoacil -ARNt sintetasa específico de azida se describe en Chin, J. W. , et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Secuencias 0-RS ejemplares para p-azido-L-Phe incluyen pero no están limitadas a, secuencias de nucleótido SEQ ID NOs: 14-16 y 29-32 y secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs : 46-48 y 61-64 como se describe en la patente de los E.U.A. No. 7,083,970 que se incorporan aquí por referencia. Secuencias O-ARNt ejemplares adecuadas para utilizar en la presente invención incluyen, pero no están limitadas a secuencias nucleótido SEQ ID NOs: 1-3 como se describe en la patente de los E.U.A. No. 7,083,970 que se incorpora aquí por referencia. Otros ejemplos de pares O-ARNt/aminoacil-ARNt sintetasas específicos para aminoácidos no naturalmente codificados particulares se describen en la patente de los E.U.A. No. 7,045,337 que se incorpora aquí por referencia. O-RS y O-ARNt que incorporan tanto aminoácidos que contienen ceto- y azido en S . cerevisiae, se describen en Chin, J. W. , et al, Science 301:964-967 (2003). Diversos otros pares ortogonales se han reportado.

Glutaminilo (ver por ejemplo, Liu, D. R. , and Schultz, P. G. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785), aspartilo (ver por ejemplo, Pastrnak, M. , et al., (2000) Helv??. Chim. Acta 83:2277-2286), y tirosilo (ver por ejemplo, Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo. Jonh 124:1065-1068; y Kowal, A. K. , et al., (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273) derivados de ARNt ' s y sintetasas de S . cerevisiae se han descrito para la incorporación potencial de aminoácidos no naturales en E. coli . Sistemas derivados de las glutaminil sintetasas (ver por ejemplo, Kowal , A. K. , et al . , (2001) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273) y tirosil (ver por ejemplo, Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1633-1641) de E . coli se han descrito para uso en S . cerevisiae . El sistema tirosil de E. coli se ha empleado para la incorporación de 3 -yodo-L-tirosina in vivo, en células de mamífero. Ver, Sakamoto, K. , et al., (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699. El uso de O-ARNt/aminoacil -ARNt sintetasa involucra selección de un codón específico que codifica el aminoácido no naturalmente codificado. Mientras que cualquier codón puede utilizarse, en general es conveniente seleccionar un codón que se utiliza raramente o nunca se utiliza en la célula en donde se expresa O-ARNt/aminoacil-ARNt sintetasa. Por ejemplo, codones ejemplares incluyen codón sin sentido tales como codones de parada (ámbar, ocre y ópalo) , codones de cuatro o más bases y otros codones de tres bases naturales que son raramente usados o no son usados. Codones selectores específicos pueden introducirse en posiciones apropiadas en la secuencia de codificación de polinucleótido utilizando métodos de mutagénesis conocidos en la especialidad (incluyendo pero no limitado a mutagénesis específica de sitio, mutagénesis de cassette, mutagénesis de selección de restricción, etc.). Métodos para generar componentes de la maquinaria biosintetica de proteína, tales como O-RSs, O-ARNts, y pares ortogonales O-ARNt/0-RS que pueden emplearse para incorporar un aminoácido no naturalmente codificado como se describe en Wang, L., et al, Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W. , et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Métodos y composiciones para la incorporación in vivo de aminoácidos no naturalmente codificados se describen en la Patente de los E.U.A. números 7,045,337, que se incorpora aquí por referencia. Métodos para seleccionar un par octogonal ARNt-ARNt sintetasa para utilizar el sistema de traducción in vivo de un organismo también se describen en las Patentes de los E.U.A. números 7,045,337 y 7,083,970 que se incorpora aquí por referencia. La Publicación de PCT número WO 04/035743 con titulo "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins, " que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, describe pares ortogonales RS y ARNt para la incorporación de ceto aminoácidos. La Publicación de PCT número WO 04/094593 con titulo "Expanding the Eukaryotic Genetic Code," que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, describe pares ortogonales RS y ARNt para la incorporación de aminoácidos no naturalmente codificados en células huésped eucarióticas. Métodos para producir cuando menos un aminoacil-ARNt sintetasa (O-RS) ortogonal recombinante comprende: (a) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivados de al menos un aminoacil-ARNt sintetasa (RS) de un primer organismo, incluyendo pero no limitado a un organismo procariotico, tal como Methanococcus jannaschii , Methanohacteriu thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus, o semejantes, o un organismo eucariótico; (b) seleccionar (y/o monitorear) la biblioteca de RSs (RSs opcionalmente mutantes) por miembros que aminoacilan un ARNt ortogonal (O-ARNt) en la presencia de un aminoácido no naturalmente codificado y un aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) ; y/o, (c) seleccionar (opcionalmente a través de selección negativa) del conjunto para RSs activas (incluyendo pero no limitadas a, RSs mutantes) que aminoacilan preferencialmente el O-ARNt en la ausencia del aminoácido no naturalmente codificado, de esta manera proporcionando la O-RS recombinante como mínimo; en donde el 0-RS recombinante como mínimo de preferencia o aminoacila la O-ARNt con el aminoácido no naturalmente codificado. En una modalidad, la RS es una RS inactiva. La RS inactiva puede generarse al rautar una RS inactiva. Por ejemplo, la RS inactiva puede generarse al mutar cuando menos aproximadamente 1 , al menos aproximadamente 2 , al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5 , al menos aproximadamente 6 , o al menos aproximadamente 10 o más aminoácidos a diferentes aminoácidos, incluyendo pero no limitados a, alanina. Bibliotecas de RSs mutantes pueden generarse utilizando diversas técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo pero no limitado a diseño racional con base en estructura RS tridimensional de proteínas, o mutagénesis de RS nucleótidos en una técnica de diseño al asar o aleatoria. Por ejemplo, las RSs mutantes pueden generarse por mutaciones específicas de sitio, mutaciones al asar, mutaciones recombinantes generadores de diversidad, construcciones quiméricas, diseño racional y por otros métodos aquí descritos o conocidos en la técnica. En una modalidad, seleccionar (y/o monitorear) la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs mutantes) por miembros que son activos, incluyendo pero no limitados a, que aminoacilan un ARNt ortogonal (O-ARNt) en la presencia de un aminoácido no naturalmente codificado y un aminoácido natural incluyen: introducir un marcador de monitoreo o selección positivo, incluyendo pero no limitado a, un gen de resistencia a antibiótico, o semejantes y la biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células, en donde el marcador de monitoreo y/o selección positiva comprende cuando menos un codón selector, incluyendo pero no limitado a, codón ámbar, ocre u ópalo; desarrollar la pluralidad de células en la presencia de un agente de selección; identificar células que sobreviven (o muestran una respuesta específica) en la presencia de un agente de selección y/o monitoreo al suprimir el codón selector como mínimo en el marcador de criba o selección positiva, de esta manera proporcionando un subconjunto de células positivamente seleccionadas que contienen el conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) . Opcionalmente, puede variarse la concentración de agente de monitoreo y/o selección. En un aspecto, el marcador de selección positiva es un gen cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) y el codón selector es un codón de parada ámbar en el gen CAT. Opcionalmente, el marcador de selección positiva es un gen ?-lactamasa y el codón selector es un codón de parada ámbar en el gen ?-lactamasa . En otro aspecto, el marcador de monitoreo positivo comprende un marcador de monitoreo fluorescente o lu inescente o un marcador de monitoreo basado en afinidad (incluyendo pero no limitado a, un marcador de superficie celular) . En una modalidad, el monitoreo de selección negativa del conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) que de preferencia aminoacilan el O-ARNt en la ausencia del aminoácido no naturalmente codificado incluye: introducir un marcador de monitoreo o selección negativo con el conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) de la selección o monitoreo positivo en una pluralidad de células de un segundo organismo, en donde el marcador de monitoreo o selección negativa comprende cuando menos un codón selector (incluyendo pero no limitado a, un gen de resistencia antibiótico, incluyendo pero no limitado a un gen cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) ) ; e identificar células que sobre viven o muestran una respuesta de un monitoreo específica en un primer medio suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado y un agente de monitoreo o selección, pero fallan en sobre vivir o mostrar la respuesta específica en un segundo medio no suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado y el agente de selección o monitoreo, de esta manera proporcionando células supervivientes o células monitoreadas con al menos una 0-RS recombinante. Por ejemplo, un protocolo . de identificación CAT opcionalmente actúa como un monitoreo negativo y/o selección positiva para determinar recombinantes O-RS apropiados. Por ejemplo, un conjunto de clones se replica opcionalmente en placas de crecimiento que contienen CAT (que comprenden al menos un codón selector) ya sea con o sin uno o más aminoácidos no naturalmente codificados. Colonias que se desarrollan exclusivamente en placas que contienen aminoácidos no naturalmente codificados de esta manera que contienen O-RS recombinantes. En un aspecto, la concentración del agente de selección (y/o monitoreo) se varia. En algunos aspectos, el primer y segundo organismo es diferente. De esta manera, el primer y/o segundo organismo opcionalmente comprende: un procariota, un eucariota, un mamífero, un Escherichia coli , un hongo, una levadura, un arqueobacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un protista, etc. En otras palabras, el marcador de monitoreo comprende un marcador de monitoreo luminiscente o fluorescente o un marcador de monitoreo basado en afinidad. En otra modalidad, el monitoreo o selección (incluyendo pero no limitados a, selección negativa) de conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) incluidas: aislar el conjunto de RSs mutantes activas de la etapa de selección positiva (b) ; introducir un marcador de monitoreo o selección negativa comprende cuando menos un codón selector (incluyendo pero no limitado a un gen marcador tóxico, incluyendo pero no limitado a un gen ribonucleasa bamasa que comprende cuando menos un codón selector) y el conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) de una pluralidad de células de un segundo organismo; e identificar células que sobre viven o muestran una respuesta de un monitoreo específica en un primer medio no suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado, pero fallan en sobre vivir o mostrar una respuesta de monitoreo específica en un segundo medio no suplementado con el aminoácido no naturalmente codificado, de esta manera proporcionando células súper vivientes o monitoreadas la O-RS recombinante como mínimo, en donde la O-RS recombinante como mínimo es especifica para el aminoácido no naturalmente codificado. En un aspecto, el codón selector como mínimo comprende aproximadamente dos o más codones selectores. Estas modalidades opcionalmente puede incluir en donde el codón selector como mínimo comprende dos o más codones selectores, y en donde el primer y segundo organismo son diferentes (incluyendo pero no limitado a, cada organismo opcionalmente, incluyendo pero no limitando a, un procariota, un eucariota, un mamífero, un Escherichia coli , un hongo, una levadura, una archaebacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, una protista, etc.). También, algunos aspectos incluyen en donde el marcador de selección negativo comprende un gen ribonucleasa barnasa (que comprende al menos un codón selector) . Otros aspectos incluyen en donde el marcador de monitoreo opcionalmente comprende un marcador de monitoreo fluorescente o luminiscente o un marcador de monitoreo basado en afinidad. En las modalidades presentes, los monitoreos y/o selecciones opcionalmente incluyen variación de la severidad de monitoreo y/o selección. En una modalidad, los métodos para producir cuando menos un aminocacil-ARNt sintetasa (O-RS) ortogonal recombinante pueden además comprender: (d) aislar la O-RS recombinante como mínimo; (e) generar un segundo conjunto de O-RS (opcionalmente mutadas) derivadas de al menos una O-RS recombinante; y, (f) repetir las etapas (b) y (c) hasta que una O-RS mutada se obtiene que comprende una habilidad para aminoacilar preferencialmente la O-ARNt. Opcionalmente, las etapas (d) - (f) se repiten, incluyendo pero no limitadas a, cuando menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, el segundo conjunto de O-RS mutadas derivado de al menos una O-RS recombinante puede generarse por mutagénesis, incluyendo pero no limitada a, mutagénesis la asar, mutagénesis específica de sitio, recombinación o una combinación de las mismas . La severidad de las etapas de selección/monitoreo, incluyendo pero no limitadas a, la etapa de selección/monitoreo positivo (b) , la etapa de selección/monitoreo negativo (c) o ambas etapas de selección/monitoreo positivas y negativas (b) y (c) , en las métodos anteriormente descritos, opcionalmente incluyen variar la severidad de selección/monitoreo. En otra modalidad, la etapa de selección/monitoreo positiva (b) , la etapa de selección/monitoreo negativa (c) , o ambas etapas de selección/monitoreo positivas y negativas (b) y (c) comprenden utilizar un reportero, en donde el reportero se detecta por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS fluorescence-activated cell sorting) o en donde el reportero se detecta por luminiscencia. Opcionalmente, el reportero se exhibe en una superficie celular, en una exhibición de fago o semejantes y selecciona con base en actividad catalítica o afinidad que involucra el aminoácido no naturalmente codificado o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada se exhibe en una superficie celular, en una exhibición de fago o semejantes. Métodos para producir un ARNt ortogonal (O-ARTN) recombinante incluye: (a) generar una biblioteca de ARNts mutantes derivadas de al menos un ARNt, incluyendo pero no limitado a, un ARNt supresor, de un primer organismo; (b) seleccionar (incluyendo pero no limitado a, seleccionan negativamente) o monitorear la biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por una aminoacil -ARNt sintetasa (RS) de un segundo organismo, en la ausencia de un RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de ARNts (opcionalmente mutantes) ; (c) seleccionar o monitorear el conjunto de ARNts (opcionalmente mutantes) por miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida, de esta manera proporcionando el O-ARNt recombinante; en donde el O-ARNt recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce eficiencia por la RS del segundo organismo y aminoacila preferencialmente por la O-RS. En algunas modalidades, el ARNt como mínimo es un ARNt supresor y/o comprende un codón de tres bases único de bases naturales y/o no naturales, o un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural, un codón que comprende al menos cuatro bases, un codón ámbar, un codón ocre, o un codón de parada ópalo. En una modalidad, el O-ARNt recombinante posee una mejora de ortogonalidad. Se apreciará que en algunas modalidades, O-ARNt es importado opcionalmente en un primer organismo de un segundo organismo sin necesidad por modificación. En diversas modalidades, el primer y segundo organismos son ya iguales o diferentes y se seleccionan opcionalmente de, incluyendo pero no limitado a, procariotas (incluyendo pero no limitados a, Methcmococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli , Halobacterium, etc. ) , eucariotas, mamíferos, hongos, levadura, arqueobacterias, eubacteria, plantas, insectos, protistas, etc. Adicionalmente, el ARNt recombinante se aminoacila opcionalmente por un aminoácido no naturalmente codificado, en donde el aminoácido no naturalmente codificado se biosintetiza in vivo ya sea en forma natural o a través de manipulación genética. El aminoácido no naturalmente codificado se agrega opcionalmente a un medio de crecimiento para al menos el primer o segundo organismos. En un aspecto, la selección (incluyendo pero no limitada a, selección negativa) o monitoreo de la biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por la aminoacil-ARNt sintetasa (la etapa (b) ) incluye: introducir un gen marcador toxico, en donde el gen marcador toxico comprende cuando menos uno de los de codones selectores (o un gen que lleva la producción de un agente toxico o estático o un gen esencial al organismo en donde este gen marcador comprende al menos un codón selector) y la biblioteca de ARNt (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; y seleccionar células supervivientes, en donde la célula superviviente contienen el conjunto de ARNts (opcionalmente mutantes) comprende al menos un ARNt ortogonal o ARNt no funcional. Por ejemplo, células supervivientes pueden seleccionarse al utilizar un ensayo de densidad celular con proporción de comparación. En otro aspecto, el gen de marcador toxico puede incluir dos o más codones selectores. En otra modalidad de los métodos, el gen marcador toxico es un gen ribonucleasa barnasa, en donde el gen ribonucleasa barnasa comprende al menos un codón ámbar. Opcionalmente, el gen ribonucleasa barnasa puede incluir dos o más codones ámbar. En una modalidad, la selección o monitoreo del conjunto de ARNts (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminoacilan por un RS ortogonal (O-RS) introducido puede incluir: introducir un gen marcador de selección o monitoreo positivo, en donde el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a droga (incluyendo pero no limitado a, gen ?-lactamasa, que comprende uno de los codones selectores, tal como al menos un codón de parada ámbar) o un gen esencial al organismo, o un gen que lleva a la desintoxicación de un agente toxico, junto con el O-RS, y el conjunto de ARNts de (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; e identificar células súper vivientes o monitoreadas en la presencia de un agente de selección o monitoreo, incluyendo pero no limitado a, un antibiótico, de esta manera proporcionando un conjunto de células que poseen el ARNt recombinante como mínimo, en donde el ARNt recombinante como mínimo se aminoacila por la O-RS e inserta en un aminoácido en un producto de traducción codificado por el gen de marcador positivo, en respuesta a cuando menos un codón selector. En otra modalidad, la concentración del agente de selección y/o monitoreo se varia. Se proporcionan métodos para generar pares 0-ARNt/O-RS específicos. Los métodos incluyen: (a) generar un biblioteca de ARNts mutantes derivos de al menos un ARNt de un primer organismo; (b) seleccionar o monitorear negativamente la biblioteca para ARNts (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por un aminoacilARNt-sintetasa (RS) de un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de ARNts (opcionalmente mutantes) ; (c) seleccionar o monitorear el conjunto de ARNts (opcionalmente mutantes) para miembros que se aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida, de esta manera proporcionando cuando menos un 0-ARNt recombinante. El O-ARNt recombinante reconoce un codón selector y no se reconoce eficiencia por la RS del segundo organismo y de preferencia se aminoacila por la O-RS. El método también incluye (d) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de al menos una aminoacil- ARNt sintetasa (RS) de un tercer organismo; (e) seleccionar o monitorear la biblioteca de RSs mutantes por miembros que preferencialmente aminoacilan el O-ARNt recombinante en la presencia de un aminoácido no naturalmente codificado y un aminoácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) ; y (f) seleccionar o monitorear negativamente el conjunto para RSs activas (opcionalmente mutantes) que de preferencia aminoacilan el 0-ARNt recombinante como mínimo en la ausencia del aminoácido no naturalmente codificado, de esta manera proporcionando el par 0-ARNt/O-RS específico como mínimo, en donde el par 0-ARNt/0- RS específico como mínimo comprende al menos una 0-RS recombinante que es específica para el aminoácido no naturalmente codificado y el O-ARNt recombinante como mínimo. Pares 0-ARNt/O-RS específicos producidos por los métodos se incluyen. Por ejemplo, el par O-ARNt/O-RS específico puede incluir, incluyendo pero no limitado a, un par mutARNTyr-mutTyrRS, tal como un par mutARNTyr-SS12TyrRS, un par mutARNLeu-mutLeuRS, un par mutARNThr-mutThrRS, un par mutARNGlu-mutGluRS, o semejantes. Adicionalmente, estos métodos incluyen en donde el primer y tercer organismo son los mismos (incluyendo pero no limitados a Methanococcus jannaschii) . Métodos para seleccionar un par ortogonal ARNt-aminoacil ARNt sintetasa para utilizar en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo también se incluyen en la presente invención. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un ARNt y una aminoacil-ARNt sintetasa (RS) aislada o derivada del primer organismo en un primer conjunto de células del segundo organismo; introducir el gen marcador y el ARNt en un conjunto de células duplicadas de un segundo organismo; y seleccionar células supervivientes en el primer conjunto que fallan en sobrevivir en el conjunto de células duplicadas o monitorear células que muestran una respuesta de monitoreo específica que falla en dar dicha respuesta en el conjunto de células duplicado, en donde el primer conjunto y el conjunto de células duplicado se desarrollan en la presencia de un agente de selección o de monitoreo, en donde las células supervivientes o monitoreadas comprenden el par ortogonal ARNt-ARNt sintetasa para utilizar en el sistema de traducción in vivo del segundo organismo. En una modalidad, comparar y seleccionar o monitorear incluye un ensayo de complementación in vivo. La concentración del agente de selección o de monitoreo puede variarse. Los organismos de la presente invención comprenden una variedad de organismos y una variedad de combinaciones. Por ejemplo, el primer y segundo organismos de los métodos de la presente invención pueden ser iguales o diferentes. En una modalidad, los organismos en forma opcional son un organismo procariótico incluyendo pero no limitado a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A. fulgidus , P. furios?s , P. horikoshii , A, pernix, T. termófilos o semejantes. En forma alterna, los organismos opcionalmente comprenden un organismo eucariótico, incluyendo pero no limitado a plantas (incluyendo pero no limitado a plantas complejas tales como monocotiledonias, o dicotiledonias) , algas, protistas, hongos (incluyendo pero no limitados a, levadura, etc.), animales (incluyendo pero no limitados a mamíferos, insectos, artrópodos, etc.) o semejantes. En otra modalidad, el segundo organismo es un organismo procariótico, incluyendo pero no limitado a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , A . fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. termófilos o semejantes. En forma alterna, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, incluyendo pero no limitado a una levadura, una célula de animal, una célula de planta, un hongo, una célula de mamífero, o semejantes. En diversas modalidades, el primer y segundo organismo son diferentes. VI. Ubicación de aminoácidos que no son de origen natural en polipéptidos . La presente invención contempla incorporación de uno o más aminoácidos que no son de origen natural en polipéptidos. Uno o más aminoácidos que no son de origen natural pueden incorporarse en una posición particular que no interrumpe la actividad del polipéptido. Esto puede lograrse al hacer sustituciones "conservadoras" incluyendo pero no limitadas a, sustituir aminoácidos hidrofóbicos con aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos voluminosos por aminoácidos voluminosos, aminoácidos hidrofílicos por aminoácidos hidrofílicos y/o insertar el aminoácido de origen no natural en un sitio que no se requiere para actividad. Por ejemplo, regiones de GH, por ejemplo, hGH pueden ilustrarse como sigue, en donde las posiciones de aminoácido en hGH se indican en la hilera media (SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) : **Hélice A Hélice B Hélice C Hélice D [1-5] - [6-33] - [34-74] - [75-96] - [97-105] - [106-129] - [130-153] - [154-183] - [184-191] término bucle A-B bucle B-C bucle C-D bucle término C Una variedad de enfoques bioquímicos y estructurales pueden emplearse para seleccionar los sitios deseados para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado dentro del polipéptido. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la técnica que cualquier posición de la cadena polipéptido es adecuada para selección para incorporar un aminoácido no naturalmente codificado y la selección puede basarse en diseño racional o por selección al azar para cualquiera o ningún propósito deseado particular. La selección de sitios deseados puede ser para producir una molécula que tiene cualquier propiedad o actividad deseada, incluyendo pero no limitada a agonistas, súper agonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de enlace receptor, modeladores de actividad de receptor, moduladores de enlace a socios de enlace, moduladores de actividad de socio de enlace, moduladores de conformación de socios de enlace, formación de dímero o multímero, sin cambio en actividad o propiedad en comparación con la molécula nativa, o manipular cualquier propiedad física o química del polipéptido tal como solubilidad, agregación, inmunogenicidad o estabilidad. Por ejemplo, ubicaciones en el polipéptido requeridas para actividad biológica de los polipéptidos pueden identificarse utilizando métodos de análisis de inmutación punto, exploración de alanina o de exploración de homólogos conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Cunningham, B. and Wells, J. , Science, 244:1081- 1085 (1989) (identificar 14 residuos que son críticos para GH, por ejemplo, bioactividad hGH) y Cunningham, B., et al. Science 243: 1330-1336 (1989) (identificar epítopos receptores y anticuerpos utilizando mutagénesis de exploración de homólogos) . Las Patentes de los E.U.A. Números 5,580,723; 5,834,250; 6,013,478; 6,428,954; y 6,451,561, que se incorporan aquí por referencia, describen métodos para el análisis sistemático de la estructura y función de polipéptidos tales como hGH al identificar dominios activos que influencian la calidad del polipéptido con la sustancia objetivo. Residuos diferentes a aquellos identificados como críticos para actividad biológica por mutagénesis de exploración de alanina u homólogos, pueden ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado dependiendo de la actividad deseada que se busca para el polipéptido. En forma alterna, los sitios identificados como críticos para actividad biológica también pueden ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado, de nuevo dependiendo de la actividad deseada que se busca para el polipéptido. Otra alternativa sería simplemente hacer sustituciones en serie en cada posición en la cadena polipéptido con un aminoácido no naturalmente codificado y observar el efecto de las actividades del polipéptido. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la técnica que cualquiera medio, técnica o método para seleccionar una posición para sustitución con un aminoácido no natural en cualquier polipéptido, son adecuados para utilizar en la presente invención. La estructura y actividad de mutantes de origen natural de polipéptidos que contienen eliminaciones también pueden examinarse para determinar regiones de la proteína que probablemente son tolerantes de sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado. Ver por ejemplo, Kostyo et al, Biochem. Biophys. Acta, 925: 314 (1987); Lewis, U. , et al, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978) para hGH. De manera similar, la digestión de proteasa y anticuerpos monoclonales pueden emplearse para identificar regiones de polipéptidos tales como hGH que son responsables para enlazar su receptor. Ver por ejemplo, Cunningham, B., et al. Science 243: 1330-1336 (1989); Mills, J. , et al, Endocrinology, 107:391-399 (1980); Li, C, Mol. Cell. Biochem., 46:31-41 (1982) (indicando que aminoácidos entre los residuos 134-149 pueden eliminarse sin pérdida de actividad) . Una vez que los residuos que probablemente serán intolerantes a sustitución con aminoácidos no naturalmente codificados se han eliminado, el impacto de las sustituciones propuestas en cada una de las posiciones restantes puede examinarse a partir de la estructura de cristal tridimensional del polipéptido y sus proteínas de enlace. Ver de Vos, A., et al, Science, 255:306-312 (1992) para hGH; todas las estructuras de cristal de hGH están disponibles en el Banco de Datos de Proteínas (Protein Data Bank) (incluyendo 3HHR, IAXl , y IHWG) (PDB, disponible en la Red Mundial en rcsb.org), una base de datos centralizada que contiene datos estructurales tridimensionales de grandes moléculas de proteínas y ácidos nucleicos. Pueden elaborarse modelos investigando la estructura secundaria y terciaria de polipéptidos, si no están disponibles datos estructurales tridimensionales. De esta manera, aquellos con destreza ordinaria en la especialidad pueden identificar fácilmente posiciones de aminoácidos que pueden ser sustituidas con aminoácidos no naturalmente codificados. En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención comprenden uno o más aminoácidos que no son de origen natural ubicados en una región de la proteína que no rompen las hélices o estructuras secundarias de hoja beta del polipéptido. Residuos ejemplares de incorporación de un aminoácido no naturalmente codificado, pueden ser aquellos que se excluyen de regiones de enlace de receptor potenciales o regiones para ligar a socios de enlace (incluyendo pero no limitados a Sitio I Sitio II para hGH) pueden ser total o parcialmente expuestas a solvente, tienen interacciones mínimas o sin enlace de hidrógeno con residuos cercanos, pueden exponerse en forma mínima a residuos reactivos cercanos y pueden estar en regiones que son altamente flexibles (incluyendo pero no limitadas a Bucle C-D para hGH) o estructuralmente rígidas (incluyendo pero no limitadas a Hélice B para hGH) como se pronostica por la estructura de cristal tridimensional, estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del polipéptido, ligado o no ligado a su receptor, o acoplado o no acoplado a otro polipéptido u otra molécula biológicamente activa. Residuos para incorporación de un aminoácido no naturalmente codificado y opcional conjugación a moléculas tales como PEG incluyen pero no están limitadas a, residuos que modulan la formación de agregados o solubilidad, mejoran purificación, evitan oxidación de proteínas, modifican la estructura epitópica de la proteína y evitan desa idización. La publicación de Patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, que se incorpora aquí por referencia, describe la cantidad de sitios para la incorporación de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados en hGH y sitios en los cuales el aminoácido que no es de origen natural puede ligarse a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, cuando menos uno de los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en el polipéptido contiene un grupo carbonilo, por ejemplo un grupo cetona. En ciertas modalidades, al menos uno de los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en el polipéptido es para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades en donde el polipéptido contiene prioridad de aminoácidos no naturalmente codificados, más de uno de los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en el polipéptido es para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades en donde el polipéptido contiene una pluralidad de aminoácidos no naturalmente codificados, sustancialmente todos los aminoácidos no naturalmente codificados incorporados en el polipéptido son para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades el o los polímeros solubles en agua enlazados al polipéptido incluyen una o más moléculas de polietilen glicol (PEGs) . El polímero, por ejemplo, PEG, puede ser lineal o ramificado. Típicamente, polímeros lineales, por ejemplo PEGs, utilizados en la invención pueden tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. Típicamente, polímeros ramificados, por ejemplo, PEGs, utilizados en la invención pueden tener un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. Polímeros tales como PEGs se describen más aquí. En ciertas modalidades, el enlace entre el polipéptido y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG es un enlace oxima. Ciertas modalidades de la invención abarcan composiciones que incluyen un polipéptido, enlazado con al menos un polímero soluble en agua por un enlace covalente, en donde el enlace covalente es un enlace oxima. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG, por ejemplo un PEG lineal. En algunas modalidades, que abarcan al menos un PEG lineal unido por enlace oxima con un polipéptido, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima a un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades que abarcan cuando menos un PEG ramificado unido con un polipéptido, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG unido por un enlace oxima con un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, el polipéptido es una GH, por ejemplo, hGH y en ciertas de estas modalidades, la GH, por ejemplo hGH tiene una secuencia que es al menos aproximadamente 80% idéntica a SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número -US 2005/0170404; en algunas modalidades el polipéptido tiene una secuencia que es la secuencia de SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404. En algunas modalidades, el polipéptido contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado; en algunas de estas modalidades, al menos un enlace oxima está entre en el aminoácido no naturalmente codificado y al menos un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado contiene un grupo carbonilo, tal como un grupo cetona; en algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado es para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la para- acetilfenilalanina está sustituida en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404. De esta manera en algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido unido cuando menos a un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace covalente, en donde el enlace covalente es un enlace oxima. En ciertas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG y el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima con un polipéptido, el PEG tiene una MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, el polímero soluble en agua es un PEG que es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan en PEG ramificado unido por un enlace oxima o polipéptido el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido en donde el polipéptido contiene un aminoácido no naturalmente codificado, en donde el polipéptido está enlazado con al menos un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace covalente y en donde el enlace covalente es un enlace de oxima entre el aminoácido no naturalmente codificado y el polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado se incorpora en el polipéptido, por ejemplo hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima con un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. Ciertas modalidades que abarcan un PEG ramificado unido por un enlace oxima con un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido en donde el polipéptido contiene un aminoácido no naturalmente codificado que es un aminoácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo en donde el polipéptido se enlaza cuando al menos a un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace covalente y en donde el enlace covalente es un enlace de oxima entre el aminoácido que contiene carbonilo no naturalmente codificado y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. En algunas modalidades, el aminoácido que contiene carbonilo no naturalmente codificado se incorpora en la GH, por ejemplo hGH, en la posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima con un polipéptido, el PEG tiene MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG ramificado unido por en enlace oxima a un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido que contiene un aminoácido no naturalmente codificado que incluye un grupo cetona, en donde el polipéptido se enlaza con al menos un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace covalente y en donde el enlace covalente es un enlace oxima entre el aminoácido no naturalmente codificado que contiene un grupo cetona y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. En algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado contiene un grupo cetona se incorpora en la GH, por ejemplo, hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En ciertas modalidades en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal PEG. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal unido por un enlace oxima a un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG ramificado unido por un enlace oxima a un polipéptido, PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido que contiene un aminoácido no naturalmente codificado que es una para-acetilfenilalanina, en donde la GH enlazada con al menos un polímero soluble en agua, por ejemplo un PEG, por un enlace covalente y en donde el enlace covalente es un enlace oxima entre la para-acetilfenilalanina y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina se incorpora en la GH, por ejemplo, hGH, en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404. En ciertas modalidades, en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG lineal. En estas modalidades, el PEG lineal tiene un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 IcDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades que abarcan un PEG lineal y unido por un enlace oxima a un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades en donde el polímero soluble en agua es un PEG, el PEG es un PEG ramificado. En estas modalidades, el PEG ramificado tiene un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, que abarcan un PEG ramificado unido por un enlace oxima a un polipéptido, el PEG tiene un MW de aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades, la invención proporciona una GH, por ejemplo, hGH que incluye SEQ ID NO : 2 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH esta sustituida en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404 que es una para-acetilfenilalanina unida por un enlace oxima a un PEG lineal de MW de aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo hGH, unida por un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, por ejemplo hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (es decir en el extremo N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 1 13, 115, 116, 119, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir en el extremo carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene el menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace de oxima con el menos un PEG, por ejemplo, un PEG lineal, en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO : 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 131, 134, 143, 145, o cualquier combinación de los mismos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima a cuando menos un PEG, por ejemplo, un PEG lineal, en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 145, o cualquier combinación de las mismas, de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404, que aquí se incorporan por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima con el menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO : 1 o 3 de la publicación de patentes de los E.U.A. Número 2005/0170404. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas posiciones correspondientes a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En modalidades en donde el PEG es un PEG lineal, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH unida mediante un enlace oxima al menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal en donde la GH, por ejemplo hGH incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituido en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: antes de la posición 1 (es decir en el extremo N), 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 1 19, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir el extremo carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo, un PEG lineal en donde GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituido en uno o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404) . En algunas modalidades la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH unida mediante un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404) . En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 131, 134, 143, 145, o cualquier combinación de los mismos de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima con al menos un PEG, por ejemplo, un PEG lineal que en donde la GH, por ejemplo hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 30, 35, 74, 92, 103, 145, o cualquier combinación de las mismas de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH por ejemplo, hGH, unida mediante un enlace oxima cuando al menos un PEG, por ejemplo, un PEG lineal en donde la GH, por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene cuando al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a: 35, 92, 143, 145, o cualquier combinación de las mismas de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de hormona que incluye una GH, por ejemplo hGH unida mediante enlace oxima con el menos un PEG, por ejemplo un PEG lineal, en donde la GH por ejemplo, hGH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, y en donde la GH, por ejemplo, hGH contiene al menos un aminoácido no naturalmente codificado que es para-acetilfenilalanina sustituida en una o más posiciones incluyendo pero no limitadas a posiciones correspondientes a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En modalidades en donde el PEG es un PEG lineal, el PEG puede tener un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 kDa, o aproximadamente a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido en donde el polipéptido contiene cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado, en donde el polipéptido está enlazado con una pluralidad de polímeros solubles en agua, por ejemplo una pluralidad de PEGs, por enlaces covalentes en donde uno o más enlaces covalentes es un enlace oxima entre al menos uno de los aminoácidos no naturalmente codificados y el polímero soluble en agua, por ejemplo PEG. El polipéptido puede estar enlazado con al menos 2-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo, PEGs, o aproximadamente 2-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo, PEGs, o aproximadamente 2-25 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 2-10 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 2-5 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 5-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 5-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo, PEGs, o aproximadamente 5-25 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 5-10 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 10-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 10-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 10-20 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 20-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 20-50 polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, o aproximadamente 50-100 polímeros solubles en agua, por ejemplo, PEGs. El uno o más aminoácidos no naturalmente codificados pueden incorporarse en el polipéptido en cualquier posición aquí descrita. En algunas modalidades, al menos un aminoácido no naturalmente codificado se incorpora en la GH, por ejemplo hGH en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. En algunas modalidades, los aminoácidos no naturalmente codificados incluyen cuando menos un aminoácido no naturalmente codificado que es un aminoácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo, por ejemplo una cetona que contiene un aminoácido no naturalmente codificado tal como para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, el polipéptido incluye una para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la para-acetilfenilalanina se incorpora en la GH, por ejemplo, hGH en una posición correspondiente a la posición 35 de SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404, en donde la para-acetilfenilalanina está enlazada con uno de los polímeros por ejemplo uno de los PEGs, por un enlace oxima. En algunas modalidades, al menos uno de los polímeros solubles en agua, por ejemplo, PEGs, se une al polipéptido por un enlace covalente con al menos uno de los aminoácidos no naturalmente codificados. En algunas modalidades, el enlace covalente es un enlace oxima. En algunas modalidades, una pluralidad de polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, se unen el polipéptido por enlaces covalentes con un pluralidad de aminoácidos no naturalmente codificados. En algunas modalidades, al menos uno de los enlaces covalentes es un enlace oxima; en algunas modalidades, una pluralidad de los enlaces covalentes son enlaces oxima; en algunas modalidades, sustancialmente todos los enlaces son enlaces oxima. La pluralidad de polímeros solubles en agua, por ejemplo PEG, pueden ser lineales, ramificados o cualquier combinación de los mismos. En modalidades que incorporan uno o más PEGs lineales, los PEGs lineales tienen un MW de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 1 a aproximadamente 60 IcDa, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En modalidades que incorporan uno o más PEGs ramificados, los PEGs ramificados tienen un MW de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 kDa, o aproximadamente 30 a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 40 kDa. Se apreciará que modalidades que emplean una pluralidad de polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, en general emplearán dichos polímeros a menores MWs que modalidades en donde se utiliza un solo PEG. De esta manera en algunas modalidades, el MW total de la pluralidad de PEGs es aproximadamente 0.1-500 kDa, o aproximadamente 0.1-200 kDa, o aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-1000 kDa, o aproximadamente 1-500 kDa, o aproximadamente 1-200 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-1000 kDa, o aproximadamente 10-500 kDa, o aproximadamente 10-200 kDa, o aproximadamente 10-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-1000 kDa, o aproximadamente 20-500 kDa, o aproximadamente 20-200 kDa, o aproximadamente 20-100 kDa, o aproximadamente 20-80 kDa, aproximadamente 20-60 kDa, aproximadamente 5-100 kDa, aproximadamente 5-50 kDa, o aproximadamente 5-20 kDa. Antagonistas de GH humana incluyen pero no están limitados aquellos con sustituciones en: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 1 15, 116, 119, 120, 123, y 127 o una adición en la posición 1 (es decir, en el extremo N) , o cualquier combinación de los mismos (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 1, 3, de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 o cualquier otra secuencia de GH) . Una amplia variedad de aminoácidos no naturalmente codificados puede ser sustituida por, o incorporada en una posición determinada en un polipéptido. En general, un aminoácido no naturalmente codificado particular se elige para incorporación con base en un examen de la estructura cristalina tridimensional de un polipéptido con su receptor, una preferencia para sustituciones conservadoras (es decir aminoácidos no naturalmente codificados basados en arilo tales como p-acetilfenilalanina o O-propargiltirosina que sustituyen por Phe, Tyr o Trp) , y la química de conjugación específica que se desee introducir en el polipéptido (por ejemplo la introducción de 4 -asidofenilalanina si desea efectuar una cicloadición Huisgen [3+2] con un polímero soluble en agua que contiene una porción alquino o una formación de enlace amida con un polímero soluble en agua que contiene un aril éster que a su vez incorpora una porción fosfina) . En una modalidad, el método además incluye incorporar en la proteína el aminoácido no natural en donde el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo; y poner en contacto la proteína con la molécula (incluyendo pero no limitada a una etiqueta, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotoentrelazador, un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido antisentido, un sacárido, dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibitorio, un gliomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de espín, un fluoróforo, una porción que contiene metal, una porción radioactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo que interactúa en forma covalente o no covalente con otras moléculas, una porción fotoenjaulada, una porción excitable con radiación actínica, una porción fotomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina con una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo de escisión química, un grupo fotoescindible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado con carbono, un agente redox activo, un amino tioácido, una porción tóxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso en electrones, un grupo magnético, un grupo intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una pequeña molécula, un punto cuántico, un nanotransmisor, un radionucleótido, un radiotransmisor, un agente de captura de neutrones, o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia conveniente (que comprenda un segundo grupo reactivo) . El primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo reactivo para conectar la molécula al aminoácido no natural a través de una cicloadición [3+2] . En una modalidad, el primer grupo reactivo es una porción alquinilo o asido y el segundo grupo reactivo es una porción asido o alquinilo. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es la porción alquinilo (incluyendo pero no limitada en aminoácido no natural p-propargiloxifenilalanina) y el segundo grupo reactivo es la porción asido. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es la porción asido (incluyendo pero no limitada a en el aminoácido no natural p-asido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es la porción alquinilo) . En algunos casos, la o las sustituciones de aminoácidos no naturalmente codificadas se combinarán con otras adiciones, sustituciones o eliminaciones dentro del polipéptido para afectar otras características biológicas del polipéptido. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden aumentar la estabilidad (incluyendo pero no limitadas a resistencia a degradación proteolítica) del polipéptido o incrementada afinidad del polipéptido para su receptor. En algunas modalidades, la GH, por ejemplo hGH polipéptido comprende una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de FlOA, F10H, F10I; M14W, M14Q, M14G; H18D; H21N; G120A; R167N; D171S; E174S; F 176 Y, I179T o cualquier combinación de los mismos en SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404. Otras sustituciones para hGH se describen en la publicación de la patente de los E.U.A.

Número 2005/0170404, que se incorpora por referencia en su totalidad. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden incrementar la solubilidad (incluyendo pero no limitadas a, cuando se expresan en E. coli u otras células huésped) del polipéptido. En algunas modalidades, adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden incrementar la solubilidad de polipéptido después de expresión en E. coli u otras células huésped recombinantes. En algunas modalidades, se eligen sitios para sustitución con un aminoácido naturalmente codificado o no natural además de otro sitio para incorporación de un aminoácido no natural que resulta en incrementar la solubilidad de polipéptido después de expresión en E. coli u otras células huésped recombinantes. En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden otra adición, sustitución o eliminación que modula la afinidad para el receptor de polipéptido, proteínas de enlace, ligando asociado, modulados (incluyendo pero no limitados a aumentos y disminuciones) dimerización de receptor, estabiliza dímeros receptores modula vida media en circulación, modula liberación o biodisponibilidad, facilita purificación o mejora o altera una ruta particular de administración. Por ejemplo, además de introducir uno o más aminoácidos no naturalmente codificados como se establece aquí, una o más de las siguientes sustituciones se introducen: FlOA, F10H o F10I; M14W, M14Q, O M14G; H18D; H21N; R167N; D171S; E174S; F176Y y I179T para incrementar la afinidad de la GH, por ejemplo, variante hGH para su receptor. Similarmente, polipéptidos pueden comprender secuencias de escisión química o enzimáticas, las secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (incluyendo pero no limitados a FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluyendo pero no limitadas a, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero no limitadas a biotina) que mejoran detección (incluyendo pero no limitadas a GFP) , purificación, transporte a través de tejidos o membranas celulares, liberación o activación de prodrogas, reducción de tamaño de polipéptido u otros rasgos o características del polipéptido. En algunas modalidades, la sustitución de un aminoácido no naturalmente codificado genera un antagonista polipéptido. Un subconjunto de sitios ejemplares para incorporación de una o más aminoácidos no naturalmente codificados incluye: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 1 15, 116, 119, 120, 123, 127, o una adición antes de la posición 1 (SEQ ID NO: 2, o el aminoácido correspondiente en SEQ ID NO: 1, 3, de la publicación de patente de los E.U.A. Número 2005/0170404 o cualquier otra secuencia de GH) . En algunas modalidades, GH, por ejemplo, antagonistas hGH comprenden al menos una sustitución en las regiones 1-5 (extremo N) , 6-33 (Hélice A) , 34-74 (la región entre hélice A y hélice B, el bucle A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, el bucle B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, el bucle C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (extremo C) y el que provocan que GH actúe como un antagonista. En otras modalidades, los sitios ejemplares de incorporación de un aminoácido no naturalmente codificado incluyen residuos dentro de la región terminal amino de la hélice A y una porción de la hélice C. En otra modalidad, las sustitución de G 120 con un aminoácido no naturalmente codificado tal como p-asido-L-fenialanina o O-propargil-L-tirosina. En otras modalidades, las sustituciones anteriormente citadas se combinan con sustituciones adicionales que provocan que la GH, por ejemplo hGH polipéptido sea una GH, por ejemplo hGH antagonista. Por ejemplo, un aminoácido no naturalmente codificado se sustituye en una de las posiciones identificadas aquí y se introduce una sustitución simultánea en G 120 (por ejemplo, G 120R, G 120K, G120W, G120Y, G120F, o G120E) . En algunas modalidades, la GH, por ejemplo hGH antagonista comprende un aminoácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente en una región de enlace receptor de la GH, por ejemplo, molécula hGH. En algunos casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más aminoácidos se sustituyen con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados. En algunos casos, el polipéptido además incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sustituciones de uno o más aminoácidos no naturalmente codificados por aminoácidos de origen natural. Por ejemplo, en algunas modalidades, uno o más residuos en las siguientes regiones de GH, por ejemplo, hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados: 1-5 (extremo N) ; 32-46 (extremo terminal N de bucle A-B) ; 97-105 (bucle B-C) ; y 132-149 (bucle C-D) ; y 184-191 (extremo C) . En algunas modalidades, uno o más residuos en las siguientes regiones de GH, por ejemplo, hGH se sustituyen con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados: 1-5 (extremo N) , 6-33 (hélice A) , 34-74 (región entre hélice A y hélice B, el bucle A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, el bucle B-C) , 106-129 (hélice C) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, el bucle C-D) , 154-183 (hélice D) , 184-191 (extremo C) . En algunas modalidades, el uno o más residuos no naturalmente codificados se enlazan con uno o más PEGs lineales o ramificados de menor peso molecular (aproximadamente - 5-20 kDa en masa o menos) , de esta manera mejorando la afinidad de enlace y vida media en suero comparable respecto a las especies conectadas a un solo PEG de superior peso molecular. VI. Expresión de no-eucariotas y eucariotas Para obtener alto nivel de expresión de un polinucleótido clonado, típicamente se subclona polinucleótidos que codifican un polipéptido de la invención en un vector de expresión que contiene un fuerte promotor para dirigir transcripción, un terminador de transcripción/traducción y si es para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de enlace ribosoma para el inicio de traducción. Promotores bacterianos convenientes se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica y describen por ejemplo en Sambrook et al. and Ausubel et al. Sistemas de expresión bacterial para expresar polipéptidos de la invención están disponibles en, incluyendo pero no limitados a E. coli , Bacillus sp. , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al, Nature 302:543-545 (1983)). Equipos para estos sistemas de expresión están comercialmente disponibles. Sistemas de expresión eucariótica para células de mamíferos, levadura y células de insecto se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica y también están comercialmente disponibles. En casos en donde ARNts ortogonales y aminoacil ARNt sintetasas (descritos anteriormente) se utilizan para expresar los polipéptidos de la invención, se eligen células huésped para expresión con base en solubilidad para utilizar los componentes ortogonales. Células huésped ejemplares incluyen bacterias Gram positivas (incluyendo pero no limitadas a B. brevis, B. subtilis, o Estreptómicas) y bacterias Gram negativas (E. coli , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida) , así como células de levadura y otras eucarióticas. Células que comprenden pares 0-ARNt/O-RS pueden emplearse como se describe aquí. Una célula huésped eucariótica o una célula huésped no eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad para sintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. En un aspecto, la composición opcionalmente incluye, incluyendo pero no limitado a, al menos 10 microgramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 microgramos, al menos 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al menos 250 microgramos, al menos 500 microgramos, al menos 1 miligramo, al menos 10 miligramos, al menos 100 miligramos, al menos un gramo, o más de la proteína que comprende un aminoácido no natural, o una cantidad que pueda lograrse con métodos de producción de proteínas in vivo (detalles en producción y purificación de proteínas recombinantes se proporcionan aquí) . En otro aspecto, la proteína opcionalmente está presente en la composición a una concentración de, incluyendo pero no limitada, al menos 10 microgramos de proteína por litro, al menos 50 microgramos de proteína por litro, al menos 75 microgramos de proteína por litro, al menos 100 microgramos de proteína por litro, al menos 200 microgramos de proteína por litro, al menos 250 microgramos de proteína por litro, al menos 500 microgramos de proteína por litro, al menos 1 miligramo de proteína por litro, o al menos 10 miligramos de proteína por litro o más, en, incluyendo pero no limitado a, un lisado celular, un amortiguador, un amortiguador farmacéutico u otra sustancia líquida (incluyendo pero no limitada, en un volumen de, incluyendo pero no limitado a, en cualquier punto desde aproximadamente 1 ni a aproximadamente 100 L o más) . La producción de grandes cantidades (incluyendo pero no limitadas a más que las típicamente posibles con otros métodos, incluyendo pero no limitadas a, traducción in vitro) de una proteína en una célula eucariótica, incluyendo al menos un aminoácido no natural, es una característica de la invención. Una célula huésped eucariótica o una célula huésped no eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad para biosintetizar proteínas que comprenden aminoácidos no naturales en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, proteínas que comprenden un aminoácido no natural pueden producirse a una concentración de, incluyendo pero no limitada a cuando menos 10 //g/litro, cuando menos 50 //g/litro, cuando menos 75 //g/litro, cuando menos 100 //g/litro, cuando menos 200 //g/litro, cuando menos 250 //g/litro, o cuando menos 500 //g/litro, cuando menos lmg/litro, cuando menos 2mg/litro, cuando menos 3 mg/litro, cuando menos 4 mg/litro, cuando menos 5 mg/litro, cuando menos 6 mg/litro, cuando menos 7 mg/litro, cuando menos 8 mg/litro, cuando menos 9 mg/litro, cuando menos 10 mg/litro, cuando menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro o más de proteína en extracto celular, lisado celular, medio de cultivo como un amortiguador y/o semejantes . I. Sistemas de Expresión, Cultivo y Aislamiento Polipéptidos pueden expresarse en cualquier cantidad de sistemas de expresión convenientes incluyendo por ejemplo levadura, células de insecto, células de mamífero y bacterias. Se proporciona a continuación una descripción de sistemas de expresión ejemplares. Levadura Como se emplea aquí, el término "levadura" incluye cualquiera de las diversas levaduras capaces de expresar un gen que codifica un polipéptido. Estas levaduras incluyen pero no están limitadas a levaduras ascosporogenosas (Endomycetales) , levaduras basidiosporogenosas y levaduras que pertenecen al grupo Fungi imperfect ! (Blastomicetos) . Las levaduras ascosporogenosas se dividen en dos familias, Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae . Esta última comprende cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (por ejemplo, género Schizosaccharomyces) , Nadsonioideae , Lipomycoideae y Saccharomycoideae (por ejemplo, géneros Pichia, Kl?yveromyces y Saccharomyces) . Las levaduras basidiosporogenosas incluyen los géneros Leucosporidium, Rhodospondium, Sporidioholus, Filobasidium, y Filobasidiella . Levaduras que pertenecen al grupo Fungi Imperfecti (Blastomycetes) se dividen en dos familias Sporobolomycetaceae (por ejemplo, género Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (por ejemplo, el género Candida) . De interés particular para utilizar con la presente invención son especies dentro de los géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces , Hansenula, Torulopsis, y Candida, incluyendo pero no limitadas a, P. pasto?s , P. guillerimondii , S . cerevisiae, S . carlsbergensis , S . diaslaticus, S. douglasii , S . kluyveri , S, norbensis, S . oviform e s , K. lactis, K. fragilis , C. albicans, C. mal tosa, y H. polymorpha . La selección de levadura conveniente para expresión de polipéptido está dentro de la destreza de una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Para seleccionar anfitriones de levadura para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que muestran que tiene por ejemplo buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica, buena capacidad de secreción, buena producción de proteínas soluble y robustez total . Levaduras en general están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitadas a, the Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) , y la American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). El término "anfitrión de levadura" o "célula huésped de levadura" incluyen levadura que puede ser o ha sido utilizada como un recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped de levadura original que ha recibido los vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. Se entiende que la progenie de una sola célula precursora no necesariamente puede ser completamente idéntico en morfología o en complemento ADN total o genómico al precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula precursora que es suficientemente similar al precursor a caracterizar por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido, se incluye en la progenie pretendida por esta definición. Vectores de expresión y transformación, incluyendo replicones extracromosomales o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en muchos anfitriones de levadura. Por ejemplo, vectores de expresión se han desarrollado para S. cerevisiae ( Sikorski et al., GENETICS (1989) 122: 19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153: 163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MTL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); H. polymorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MTL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J.

BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); P. pasto?s (U.S. Patent Nos. 5,324,639; 4,929,555; and 4,837,148; Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., NATURE (1982) 300:706); y Y. lipolytica; A . nidulans (Ballance et al,, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 1 12:284-89; Tilburn et al., GENE (1983) 26:205-221; and Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); A . niger (Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); T. reesia (EP 0 244 234); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Ne?rospora , Penicillium, Tolypocladíum (WO 91/00357), cada uno incorporado por referencia aquí. Secuencias de control para vectores de levadura se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad e incluyen pero no están limitadas a regiones promotoras de genes tales como alcohol dehidrogenasa (ADH) (EP 0 284 044) ; enolasa; glucocinasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; gliceraldehido-3-fosfato-dehidrogenasa (GAP o GAPDH) ; hexocinasa; fosfofructocinasa; 3-fosfoglicerato mutasa; y piruvato cinasa (PyK) (EP 0 329 203) . El gen de levadura PH05, que codifica fosfatasa acida, también puede proporcionar útiles secuencias promotoras (Miyanohara et al., PROC, NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1). Otras secuencias promotoras convenientes para utilizar con anfitriones de levadura pueden incluir los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073); y otras enzimas glicolíticas, tales como piruvato decarboxilasa, triosefosfato isomerasa, y fosfoglucosa isomerasa (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149). Promotores de levadura inducibles tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento pueden incluir las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2; isocitocromo C; fosfatasa acida; metalotioneina; gliceraldehido-3- fosfato dehidrogenasa; enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno; y enzimas responsables por utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores convenientes para utilizar en expresión de levadura se describen adicionalmente en EP 0073 657.' Mejoradores de levadura también pueden utilizarse con promotores de levadura. Además, promotores sintéticos también pueden funcionar como promotores de levadura. Por ejemplo, las secuencias de activación corriente arriba (UAS= upstream activating sequences) a un promotor de levadura pueden unirse con la región de activación de transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de estos promotores híbridos incluyen la secuencia regulatoria ADH enlazada a la región de activación de transcripción GAP. Ver las patentes de los E.U.A. Números 4,880,734 y 4,876,197, que se incorporan aquí por referencia. Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten de las secuencias regulatorias de los genes ADH2 , GAL4 , GALIO, o PH05 , combinadas con la región de activación o transcripción de un gen de enzima glicolítica tal como GAP o PyK. Ver EP 0 164 556. Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no levadura que tiene la capacidad para ligar ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Otros elementos de control gue pueden comprender parte de los vectores de expresión de levadura, incluyen terminadores, por ejemplo, de GAPDH o los genes enolasa (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385). Además, el origin de replicación del origen de plásmido 2 µ es adecuado para levadura. Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura. Ver Tschumper et al., GENE (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (1979) 7:141. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una sepa mutante de levadura que carece la habilidad de desarrollarse en triptofano. Similarmente, sepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2. Métodos para introducir ADN exógeno en anfitriones de levadura se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, y típicamente incluyen, pero no están limitados a, ya sea a la transformación de esferoplastos o de células huésped de levadura intacta tratadas con cationes alcalinos. Por ejemplo, transformación de levadura puede llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829 and Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. Sin embargo, otros métodos para introducir ADN en células tales como por inyección nuclear, electroporación, o fusión de protoplastos también pueden ser utilizados como se describe generalmente en SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001). Células huésped de levadura pueden entonces cultivarse utilizando técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Otros métodos para expresar proteínas heterologas en células huésped de levadura se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Ver en general la Publicación de patente de los E.U.A. número 20020055169, las Patentes de los E.U.A. números 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; y 5,089,398; las Patentes de Reexaminada de los E.U.A. números RE37,343 y RE35.749; solicitudes de patentes publicadas del PCT WO 99/07862; WO 98/37208; y WO 98/26080; solicitudes de patentes Europeas EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; y EP 0 164 556. Ver también Gellissen et al., ANTON1E VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2 ): 79-93 ; Romanos et al., YEAST (1992) 8 (6) : 423-488 ; Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7, cada una incorporada por referencia aquí. Las sepas anfitrionas de levadura pueden desarrollarse en fermentadores durante la etapa de amplificación utilizando métodos de fermentación por lotes con alimentación estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Los métodos de fermentación pueden ser adaptados para tomar en cuenta diferencias en una ruta de utilización de carbón de anfitrión de levadura particular o modo de control de expresión. Por ejemplo, la fermentación de un anfitrión de levadura de Saccharomyces puede requerir una sola alimentación de glucosa, fuente de nitrógeno compleja (por ejemplo, hidrolizado de caseína), y múltiple suplementación de vitamina. En contraste, la levadura metilotrofica P. pastoris puede requerir alimentaciones de glicerol, metanol, y mineral en trazas, pero solo sales de amonio (nitrógeno) simples para óptimos crecimiento y expresión. Ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. número 5,324,639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; and Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987), 29:1113, incorporada aquí por referencia. Estos métodos de fermentación, sin embargo, pueden tener ciertas características comunes independientes de la sepa anfitriona empleada. Por ejemplo, un nutriente limitante de crecimiento, típicamente carbono, puede agregarse al fermentador durante la fase de amplificación para permitir crecimiento máximo. Además, métodos de fermentación en general emplean un medio de fermentación diseñado para contener cantidades adecuadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fosforo, y otros nutrientes menores (vitaminas, minerales en trazas y sales, etc.) . Ejemplos de medios de fermentación adecuados para utilizar Pichia se describe en las Patentes de loa E.U.A. números 5,324,639 y 5,231,178, que se incorpora aquí por referencia. Células de insectos infectadas con Baculovirus. El término "anfinfitrión insecto" o "célula huésped de insecto" se refiere a un insecto que puede, o ha sido utilizado como un recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenia de la célula huésped de insecto original que sea transfectada. Se entiende que la progenia de una sola célula precursora puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN total o genomico al precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenia de las células precursoras que son suficientemente similares al precursor para caracterizar por la propiedad relevante, tal como una presencia de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido, se incluye en la progenia pretendida por esta definición. La selección de células de insecto convenientes para expresión de polipéptidos se conoce por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Varias especies de insectos están bien descritas en la técnica y comercialmente disponibles incluyendo Aedes aegypti , Bombyx mori , Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, and Trichoplusia ni . Para seleccionar anfitriones de insectos para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que muestran tener, ínter alia , buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica y robustez total . Los insectos en general están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo, pero no limitados a, el Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) ; y la American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . En general, los componentes de un sistema de expresión de insectos infectados con báculo virus incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de báculo virus como un sitio recepción conveniente para inserción del gen heterologo a expresar; un báculo virus tipo silvestre con secuencias homologas al fragmento específico de báculo virus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación del gen heterologo en el genoma de báculo virus) ; y células huésped de insectos y medio de crecimiento apropiados. Los materiales, métodos y técnicas utilizadas para construir vectores, transfectar células, placas de selección, células de desarrollo en cultivo, y semejantes, se conocen en la técnica y están disponibles manuales que describen estas técnicas . Después de insertar el gen heterologo en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo silvestre se transfectan en una célula huésped de insecto en donde se recombinan el vector y genoma viral . El virus recombinante empacado se expresa y se identifican y purifican placas recombinantes. Materiales y métodos para sistemas de expresión de células de insecto/báculo virus están comercialmente disponibles en forma de equipo, por ejemplo, Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) . Las técnicas en general conocidas por aquellas con destreza ordinaria en la especialidad y totalmente descritas por SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987), aquí incorporado por referencia. Ver también, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992) ; and O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992) . La producción de diversas proteínas heterologas utilizando sistemas de expresión de células de insecto/báculo virus se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ver, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. números 6,368,825; 6,342,216; 6,338,846; 6,261,805; 6,245,528, 6,225,060 6,183,987, 6,168,932; 6,126,944; 6 6,,009966,,330044; 6,013,433 5,965,393 5,939,285; 5,891,676; ,871,986 5,861,279 5,858,368, 5,843,733; 5,762,939; ,753,220 5,605,827 5,583,023 5,571,709; 5,516,657; ,290,686 WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, que se incorporan aquí por referencia.

Vectores que son útiles en sistemas de expresión de células de insecto/báculo virus se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, vectores de transferencia y expresión de insectos derivados del virus de polihedrosis nuclear Autografacalifornica báculo virus (AcNPV) , que es un vector de expresión viral independiente-auxiliar. Vectores de expresión virales derivados de este sistema usualmente utilizan el fuerte promotor de gen polihedrina viral para dircigir expresión de los genes heterologos . Ver en general, O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992) . Antes de insertar el gen anterior en el genoma de báculo virus, los componentes anteriormente descritos, que comprende un promotor, líder (de ser necesario) , secuencia de codificación de interés, y secuencia de terminación de trascripción, típicamente se ensamblan en una construcción de substitución intermedia (vector de transferencia) . Construcciones de sustitución intermedia a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento cromosomal extra (por ejemplo, plásmidos) capases de mantenimiento estable en un anfitrión, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema replicación, de esta manera permitiendo que se mantenga en un anfitrión conveniente para clonación y amplificación. Más específicamente, el plásmido puede contener la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177) y un gen de resistencia a ampicilina procariótica (amp) y origen de replicación para selección y propagación en E. coli . Un vector de transferencia comúnmente empleado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. Muchos otros vectores, conocidos por aquellos con destreza en la técnica también se han diseñado incluyendo, por ejemplo, pVL985, que altera el codón de partida polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI de 32 pares base corriente debajo de ATT. Ver Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Otros vectores comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, PBlueBac4.5/V5-HÍS; pBlueBacHis2 ; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . Después de inserción del gen heterologo, el vector de transferencia y el genoma báculo viral de tipo silvestre se co-transfectan en un anfitrión de célula de insecto. Métodos para introducir ADN heterologo en el sitio deseado en el virus báculo virus se conoce en la técnica. Ver SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31. Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de polihedrina, por recombinación de doble cruzada homologa; inserción también puede ser en un sitio de enzima restricción diseñado en el gen de báculo virus deseado. Ver Miller et al., B10ESSAYS (1989) 11(4) .91. La transfección puede lograrse por electroporación. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) ; Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. En forma alterna, pueden emplearse liposomas para transfectar las células de insecto con el vector de expresión recombinante y báculo virus. Ver, por ejemplo, Liebman et al., BiOTECHNiQUES (1999) 26(1) :36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18:45; TlLKINS ETAL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37) :22376; Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37) :22376-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68(2) :766; and Peng et al., BiOTECHNiQUES (1993) 14(2) :274. Liposomas comercialmente disponible incluyen, por ejemplo, Cellfectin® and Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA) . Además, puede emplearse transfección de fosfato de calcio. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) ; Kitts, NAR (1990) 18(19) :5667; and Mann and King, J. GEN.

VIROL. (1989) 70:3501. Vectores de expresión de báculo virus usualmente contienen un promotor de báculo virus. Un promotor de báculo virus es cualquier secuencia de ADN capaz de ligar a una ARN polimeraza de báculo virus e iniciar la trascripción corriente abajo (3S) de una secuencia de codificación (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que usualmente se coloca próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de trascripción típicamente incluye un sitio de enlace ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor de báculo virus también puede tener un segundo dominio denominado un intensificador, que si está presente, usualmente es distante al gen estructural. Aún más, la expresión ya puede ser regulada o constitutiva. Genes estructurales, transcritos en forma abundante en tiempos posteriores en el ciclo de infección, proporciona secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluye secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de polihedron viral (FRIESEN EX AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR B10L00Y OF BACULOVIRUSES (1986) ; EP 0 127 839 and 0 155 476) y el gen que codifica la proteína plO (Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765) . El vector de expresión de báculo virus recientemente formado se empaca en un báculo virus recombinante infeccioso y subsecuentemente placas de crecimiento pueden purificarse por técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ver Miller et al., BlOESSAYS (1989) 11(4) :91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) . Vectores de expresión de báculo virus recombinante se han desarrollado para infección en varias células de insectos. Por ejemplo, báculo virus recombinante se han desarrollado para, inter alia, Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125) , Bombyx morí (ATCC No. CRL-8910) , Drosophila elanogaster (ATCC No. 1963), Spodoptera frugiperda, and Trichoplusia ni. Ver en general, NATURE (1986) 321:718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56:153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Ver en general, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Más específicamente, las líneas celulares utilizadas para sistemas de vectores de expresión de báculo virus vector comúnmente incluyen, pero no están limitadas a, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC No. CRL-1711), Sf21 (Spodoptera frugiperdá) (Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-013 (Carlsbad, CA) ) , Tri-368 (Trichopulsia ni), and High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni) . Células y medios de cultivo están comercialmente disponibles tanto para expresión directa como fusión de polipéptidos heterologos en un báculo virus/expresión y tecnología de cultivo de células generalmente se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. E. Coli, especies de pseudomonas, y otras procariotas . Técnicas de expresión bacterianas se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Una amplia variedad de vectores están disponibles para utilizar en anfitriones bacterianos. Los vectores pueden ser una sola copia o de vectores de bajas o altas múltiples copias. Los vectores pueden servir para clonación y/o expresión. En vista de la amplia literatura concerniente a vectores, la disponibilidad comercial de muchos vectores e incluso manuales que describen vectores y sus mapas y características de restricción, no se requiere aquí discusión extensa. Como es bien conocido los vectores normalmente involucran marcadores que permiten selección, estos marcadores pueden proporcionar resistencia de agente citotóxico, prototrofia o inmunidad. Frecuentemente, una pluralidad de marcadores está presente, que proporciona diferentes características. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de ligar ARN de polimeraza bacteriana e iniciar la trascripción corriente abajo (31) de una secuencia de codificación (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que usualmente se coloca próxima al extremo 5 ' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de trascripción típicamente incluye un sitio de enlace ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacteriano puede también tener un segundo dominio denominado un operador, que puede superponerse a un sitio de enlace de ARN polimeraza adyacente en el que empieza la síntesis de ARN. El operador permite transcripción regulada negativa (inducible) , ya que una proteína represora de gen puede ligar el operador y de esta manera inhibir transcripción de un gen específico. Expresión constitutiva puede ocurrir en la ausencia de elementos regulatorios negativos, tales como el operador. Además, regulación positiva puede lograrse por una secuencia de enlace de proteína de activador de gen, que está presente usualmente esta próxima a (51) a la secuencia de enlace ARN polimeraza. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es la proteína activadora de catabolito (CAP catabolite activator protein) , que ayuda a iniciar transcripción del operon lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18: 173]. Expresión regulada por lo tanto puede ser ya positiva o negativa, de esta manera ya mejorando o reduciendo la trascripción. Secuencias que codifican enzimas de ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras que se derivan de enzimas que metabolizan azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056] y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas que biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel et al., Nuc . ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; Patente de los E.U.A. Número 4,738,921; Pub. EP Números 036 776 y 121 775, que se incorporan aquí por referencia] . El sistema promotor ß -galactosidasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Inferieron 3 (Ed. I. Gresser) ] , sistemas promotores bacteriófago lambda PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128] y T5 [Patente de los E.U.A. también proporcionan secuencias promotoras útiles.

Métodos preferidos de la presente invención utilizan promotores fuertes, tales como promotor T7 para inducir polipéptidos a altos niveles. Ejemplos de estos vectores se conocen por aquellos con destreza ordinaria la especialidad e incluyen las series pET29 de Novagen y los vectores pPOP descritos en WO99/05297, que se incorpora aquí por referencia. Estos sistemas de expresión producen altos niveles de polipéptidos en el anfitrión sin comprometer la viabilidad de células huésped o parámetros de crecimiento. pET19 (Novagen) es otro vector conocido la técnica. Además, promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, secuencias de activación de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden unirse con la secuencias operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [Patente de los E.U.A. Número 4,551,433, que se incorpora aquí por referencia]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido trp-lac que comprende tanto la secuencias del promotor trp como lac operon que se regulan por el represor lac [Amann et al . , GENE (1983) 25: 167; de Boer et al., PROG. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21] . Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad para ligar a ARN polimerasa bacteriana e iniciar transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacteriano también puede acoplarse con una a ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema promotor/bacteriófago T7 ARN polimerasa es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Nati. Acad. Sci. (1985) 82: 1074]. Además, un promotor híbrido también puede comprender un promotor bacteriófago y una región de operador E. coli (EP Pub. Número 267 851) . Además de una secuencia promotora en funcionamiento, un sitio enlace ribosoma eficiente también es útil para expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli , el sitio de enlace del ribosoma se denominan la secuencia Shine- Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótido de longitud situado a 3-11 nucleótidos corriente arriba del codón de inicio [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. La secuencia de SD se considera que promueve enlace de ARNm al ribosoma por apareamiento de bases entre la secuencias SD y el 3 ' y de ARNm E. coli 16S [Steitz et al. "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con sitio de enlace ribosoma débil [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989] . El término "anfitrión bacteriano" o "célula huésped bacteriana" se refiere a una bacteria que puede ser o ha sido utilizada como un recipiente para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula huésped bacteriana original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie en una sola célula precursora puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN total o genómico con el precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula precursora que es suficientemente similar al precursor para caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido, se incluye en la progenie pretendida por esta definición. La selección de bacterias anfitrionas convenientes para expresión de polipéptidos, se conoce por aquellos con destreza ordinaria especialidad. Para seleccionar anfitriones bacterianos para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que han mostrado tener ínter alia , buena capacidad de formación de cuerpos de inclusión, baja actividad proteolítica y robustez total. Anfitriones bacterianos en general están disponibles una variedad de fuentes incluyendo pero no limitados a Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) ; y la American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). Fermentación industrial/farmacéutica en general utiliza bacterias derivadas de cepas K (por ejemplo W3110) o de bacterias derivadas de cepas B (por ejemplo BL21) . Estas cepas son particularmente útiles debido que sus parámetros de crecimiento son extremadamente bien conocidos y robustos. Además, estas cepas no son patogénicas, que lo que es comercialmente importante por razones de seguridad y ambientales. Otros ejemplos de anfitriones de E. coli convenientes incluyen pero no están limitados a cepas de BL21, DH10B o sus derivados. En otra modalidad de los métodos de la presente invención, el anfitrión de E. coli es una cepa proteasa menos incluyendo pero no limitada a OMP- y LON- . La cepa de célula huésped puede ser una especie de F ' seudomonas, incluyendo pero no limitada a Pseudomonas ßuorescens, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida . Pseudomonas ßuorescens biovar 1, designadas cepa MB101, se conoce que es útil para producción recombinante y están disponibles para procesos de producción de proteínas terapéuticas. Ejemplos de un sistema de expresión de Pseudomonas incluye en el sistema disponible de The Dow Chemical Company como una cepa anfitriona (Midland, MI disponible en la Red Mundial como dow.com). Patentes de los E.U.A. Números 4,755,465 y 4,859,600, que se incorporan aquí por referencia, describe el uso de cepas de Pseudomonas como una célula huésped para producción de GH, por ejemplo hGH. Una vez que se ha establecido una cepa de célula huésped recombinante (es decir la construcción de expresión se ha introducido en la célula huésped y células huésped con la construcción de expresión adecuada se aislan) , la cepa de 0 célula huésped recombinante se cultiva bajo condiciones apropiadas para producción de polipéptidos. Como será aparente por una persona con destreza en la técnica, el método de cultivo de la cepa de célula huésped recombinante dependerá de la naturaleza de la construcción de expresión utilizada y la identidad de la célula huésped. Cepas huésped recombinante normalmente se cultivan utilizando métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en especialidad. Células huésped recombinantes típicamente se cultivan en medio líquido que contienen fuentes asimilables de carbón, nitrógeno y sales inorgánicas y opcionalmente contienen vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento y otros suplementos de cultivo proteináceos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en especialidad. Medio líquido para cultivo de células huésped opcionalmente puede contener antibióticos o antifungales para evitar el crecimiento de microorganismos y/o compuestos indeseables, incluyendo pero no limitados a antibióticos para seleccionar células huésped que contienen el vector de expresión. Células huésped recombinante pueden cultivarse en formato de lotes o continuos ya sea con cosechado de células (en el caso en donde el polipéptido se acumula intracelularmente) o cosecha de sobrenadante de cultivo ya sea en formatos por lotes o continuos. Para producción en células huésped procarióticas, se prefieren cultivo por lotes y cosecha de células. Los polipéptidos de la presente invención normalmente se purifican después de expresión en sistemas recombinantes. El polipéptido puede purificarse células huésped o medio de cultivo por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Polipéptidos producidos en células huésped bacterianas pueden ser débilmente solubles o insolubles (en la forma de cuerpos de inclusión) . En una modalidad de la presente invención, sustituciones de aminoácidos pueden ser fácilmente elaboradas en el polipéptido que se elige para el propósito de incrementar la solubilidad de la proteína producida en forma recombinante utilizando los métodos aquí descritos así como aquellos conocidos en especialidad. En el caso de una proteína insoluble, la proteína puede recolectarse de lisado de células huésped por centrifugación y además puede ser seguido por homogenización de las células. En el caso de proteína débilmente soluble, compuestos incluyen pero no está limitados a polietilen imina (PEÍ) pueden agregar cepa inducir la precipitación de proteína parcialmente soluble. La proteína precipitada puede entonces ser recolectada convenientemente por centrifugación. Células huésped recombinantes pueden romperse u homogenizarse para liberar los cuerpos de inclusión del interior de las células utilizando una variedad de métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en especialidad. Ruptura u homogenización de células huésped pueden realizarse utilizando técnicas bien conocidas incluyendo pero no limitadas a ruptura de células enzimática, sonicación, homogeneización dounce, o ruptura con liberación de alta presión. En una modalidad del método de la presente invención, la técnica de liberación de alta presión se utiliza para romper las células huésped de E. coli para liberar los cuerpos de inclusión de los polipéptidos.

Cuando se manejan cuerpos de inclusión de polipéptido, puede ser ventajoso reducir al mínimo el tiempo de homogenización en repeticiones a fin de llevar al máximo rendimiento de cuerpos de inclusión sin pérdidas debido factores tales como solubilización, corte mecánico o proteolisis. Polipéptido insoluble o precipitado puede entonces ser solubilizado utilizando cualquiera de una cantidad de agentes de solubilización convenientes conocidos en la técnica. El polipéptido puede ser solubilizado con hidrocloruro de guanidina o urea. El volumen del polipéptido solubilizado deberá ser reducido al mínimo de manera tal que grandes lotes puedan producirse utilizando tamaños de lotes convenientemente manejables. Este factor puede ser significante en un ambiente comercial de gran escala en donde el anfitrión recombinante puede desarrollarse en lotes que son de miles de litros en volumen. Además, cuando se fabrica el polipéptido en un ambiente comercial de gran escala, en particular para usos farmacéuticos en humanos, el evitar productos químicos severos que puedan dañar la maquinaria y recipiente, o el propio producto de proteína, habrán de evitarse, de ser posible. Se ha mostrado en el método de la presente invención que el agente de desnaturalización más ligero urea, puede utilizarse para solubilizar los cuerpos de inclusión de polipéptido en lugar del agente de desnaturalización más severo, hidrocloruro de guanidina. El uso de urea reduce significativamente el riesgo de daño a equipo de acero inoxidable utilizado en el proceso de fabricación y purificación del polipéptido mientras que solubiliza eficientemente los cuerpos de inclusión de polipéptido. En el caso de proteína soluble, el polipéptido puede ser secretado en el espacio periplásmico o en el medio de cultivo. Además, polipéptido soluble puede estar presente en el citoplasma de las células huésped. Puede ser conveniente el concentrar polipéptido soluble antes de realizar etapas de purificación. Técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad pueden utilizarse para concentrar polipéptido soluble por ejemplo a partir de lisados celulares o medio de cultivo. Además, técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria la térmica pueden utilizarse para romper células huésped y liberar polipéptido soluble del citoplasma o espacio periplásmico de las células huésped. Cuando el polipéptido se produce como una proteína de fusión, la secuencia de fusión puede ser retirada. El retirar una secuencia de fusión puede lograrse por ruptura química o enzimática. La eliminación enzimática de secuencias de fusión puede lograrse utilizando métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en especialidad. La selección de enzima para retirar la secuencia de fusión se determinará por la identidad de la fusión, y las condiciones de reacción se especificarán por la selección de enzima como será aparente por una persona con destreza ordinaria la especialidad. Ruptura química puede lograrse utilizando reactivos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en especialidad, incluyendo pero no limitados a bromuro de cianógeno, TEV proteasa y otros reactivos. El polipéptido escindido puede ser purificado de la secuencia de fusión escindida por métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en especialidad. Estos métodos se determinarán por la identidad y propiedades de la secuencia de fusión y el polipéptido, como será aparente una persona con destreza ordinaria en especialidad. Métodos para purificación poder incluir pero no están limitados a cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio de iones o diálisis o cualquier combinación de las mismas. El polipéptido también puede ser purificado para retirar ADN de la solución de proteína. ADN puede retirarse por cualquier método conveniente conocido en especialidad, tal como precipitación o cromatografía de intercambio de iones, pero puede retirarse por precipitación con un agente de precipitación de ácido nucleico tal como, pero no limitado a sulfato de protamina. El polipéptido puede ser separado del ADN precipitado utilizando métodos bien conocidos estándar incluyendo pero no limitados a centrifugación o filtración. El retirar moléculas de ácido nucleico anfitrionas es un factor importante en un ambiente en donde el polipéptido se va a utilizar para tratar a humanos y los métodos de la presente invención reducen el ADN de células huésped a niveles farmacéuticamente aceptables. Métodos para fermentación a pequeña escala o gran escala, también pueden emplearse en expresión de proteínas, incluyendo pero no limitados a fermentadores, matraces de agitación, bioreactores de lecho fluidizado, bioreactores de fibras huecas, sistemas de cultivo de botellas giratorias y sistemas bioreactores de tanque agitado. Cada uno de estos métodos puede realizarse en un proceso de modo por lotes, lotes de alimentación o continuos. Polipéptidos de GH humana de la invención en general pueden recuperarse utilizando métodos estándar en especialidad. Por ejemplo, medio de cultivo o lisado celular puede ser centrifugado o filtrado para retirar desechos celulares. El sobrenadante puede ser concentrado o diluido a un volumen deseado o diafiltrado en un amortiguador conveniente para acondicionar la preparación para mayor purificación. Mayor purificación del polipéptido de la presente invención incluye separar formas desamidadas y recortadas de la variante polipéptido de la forma intacta. Cualquiera de los siguientes procedimientos ejemplares pueden emplearse para purificación de polipéptido de la invención: cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de aniones o cationes (utilizando, incluyendo pero no limitado a DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC) ; HPLC de fase inversa; filtración en gel (utilizando, incluyendo pero no limitado a un SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño; cromatografía de quelato de metal; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol; precipitación de sulfato de amonio; cro atoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo pero no limitados a enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitada a la precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE, o extracción. Proteínas de la presente invención, incluyen pero no están limitadas a proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, péptidos que comprenden aminoácidos no naturales, anticuerpos para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, socios de enlace para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, etc., pueden purificarse, ya sea en forma parcial o substancial a homogeneidad, de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por y utilizados por aquellos con destreza en la especialidad. De acuerdo con esto, polipéptidos de la invención pueden ser recuperados y purificados por cualquiera de una cantidad de métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, incluyendo pero no limitados a, sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción con ácido o base, cromatografía en columna, cromatografía en columna de afinidad, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, electroforesis en gel y semejantes. Pueden emplearse etapas de plegado de proteína, según se desee, para producir proteínas maduras correctamente plegadas. Cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de afinidad u otros métodos convenientes, pueden emplearse en las etapas de purificación final en donde se desea alta pureza. En una modalidad, anticuerpos elaborados contra aminoácidos no naturales (o proteínas o péptidos que comprenden aminoácidos no naturales) se utilizan como reactivos de purificación, incluyendo pero no limitados a, purificación basada en afinidad de proteínas o péptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturales. Una vez purificados, parcialmente o a homogeneidad, según se desee, los polipéptidos opcionalmente se emplean para una amplia variedad de utilidades, incluyendo pero no limitados a, componentes de ensayo, agentes terapéuticos, profilaxis, diagnósticos, reactivos de investigación, y/o como inmunógenos para producción de anticuerpos. Además de otras referencias aquí anotadas, se conoce una variedad de métodos de plegado de proteína/purificación por aquellos con destreza ordinaria en la técnica, incluyendo pero no limitados a, aquellos establecidos en R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Proteína Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990) ; Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal , (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden, (1998) Protein. Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998) , Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias ahí citadas. Una ventaja de producir una proteína o polipéptido de interés con un aminoácido no natural en una célula huésped eucariótica o célula huésped no eucariótica es que típicamente las proteínas o polipéptidos se plegarán en sus conformaciones nativas. Sin embargo, en ciertas modalidades de la invención, aquellos con destreza en la técnica reconocerán que, después de síntesis, expresión y/o purificación, proteínas o péptidos pueden poseer una conformación diferente de las conformaciones deseadas de los polipéptidos relevantes. En un aspecto de la invención, la proteína o polipéptido expresado opcionalmente se desnaturaliza y después renaturaliza. Esto se logra utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a, al agregar una chaperonina a la proteína o polipéptido de interés, al solubilizar las proteínas en un agente caotrópico tal como guanidina HCl, utilizando proteína disulfuro isomerasa, etc. En general, ocasionalmente es conveniente el desnaturalizar y reducir polipéptidos expresados y después provocar que los polipéptidos vuelvan a plegar en la conformación preferida. Por ejemplo, guanidina, urea, DTT, DTE, y/o una chaperonina pueden agregarse a un producto de traducción de interés. Métodos para reducir, desnaturalizar y renaturalizar proteínas se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica (ver, las referencias anteriores y Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065- 14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem.. 205: 263-270). Debinski, et al., por ejemplo describen la desnaturación y reducción de proteínas de cuerpos de inclusión en guanidina-DTE. Las proteínas pueden plegarse en un amortiguador redox que contiene, incluyendo pero no limitado a, glutationa oxidada y L-arginina. Reactivos de plegado pueden hacerse circular o de otra forma ponerse en contacto con uno o más polipéptido u otro producto de expresión, o vice-versa. En el caso de producción procariótica de polipéptido, el polipéptido así producido puede ser mal plegado y de esta manera carece de actividad biológica o la tiene reducida. La bioactividad de la proteína puede restaurarse por "replegamiento" . En general, polipéptido mal plegado se repliega por solubilización (en donde el polipéptido también es insoluble) , desdoblar y reducir la cadena polipéptido utilizando, por ejemplo uno o más agentes caotrópicos (por ejemplo urea y/o guanidina) y un agente reductor capaz de reducir enlaces disulfuro (por ejemplo ditiotreitol, DTT o 2-mercaptoetanol, 2 -ME). A una concentración moderada de caotropo, se agrega entonces un agente oxidante (por ejemplo, oxígeno, cistina o cistamina) , lo que permite la reformación de enlaces disulfuro. Polipéptidos pueden ser replegados utilizando métodos estándar conocidos en la especialidad, tales como aquellos descritos en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,511,502, 4,511,503, y 4,512,922, que aquí se incorporan por referencia. El polipéptido también puede ser coplegado con otras proteínas para formar heterodímeros o heteromultímeros . Después de replegar o coplegar, el polipéptido además puede ser purificado. Purificación del polipéptido puede lograrse utilizando una variedad de técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, incluyendo cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de líquido de alto desempeño de fase inversa, cromatografía de afinidad y semejantes o cualquier combinación de las mismas. Purificación adicional también puede incluir una etapa de secado o precipitación de la proteína purificada. Después de purificación, polipéptidos pueden ser intercambiados en diferentes amortiguadores y/o concentrados por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a, diafiltración y diálisis. Polipéptido que se proporciona como una sola proteína purificada puede someterse a agregación y precipitación. El polipéptido purificado puede ser al menos 90% puro (como se mide por cromatografía de líquido de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC = reverse phase high performance liquid chromatography) , RP-HPLC, o electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE = sodium dodecyl sulfate-poliacrylamide gel electrophoresis) o al menos 95% puro, o al menos 98% puro, o al menos 99% o más puro . Independientemente del valor numérico exacto de la pureza del polipéptido, el polipéptido puede ser suficientemente puro para utilizar como un producto farmacéutico o para mayor procesamiento, tal como conjugación con un polímero soluble en agua tal como PEG. Ciertas moléculas pueden emplearse como agentes terapéuticos en la ausencia de otros ingredientes activos o proteínas (diferentes a excipientes, portadores y estabilizantes, albúmina de suero y semejantes) , o pueden complejarse con otra proteína o un polímero. Métodos de Purificación General. Cualquiera de una variedad de etapas de aislamiento puede realizarse en el lisado celular, extracto, medio de cultivo, cuerpos de inclusión, espacio periplásmico de las células huésped, citoplasma de las células huésped, u otro material, que comprenden polipéptido o en cualquier mezcla de polipéptido que resulta de cualesquiera etapas de aislamiento incluyendo pero no limitadas a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración de gel, cromatografía de líquido de alto desempeño ("HPLC"), HPLC de fase inversa ("RP-HPLC"), adsorción de lecho expandido, o cualquier combinación y/o repetición de las mismas y en cualquier orden apropiado. Equipo y otros materiales necesarios utilizados para realizar las técnicas aquí descritas están comercialmente disponibles. Bombas, recolectores de fracciones, monitores, registradores o grabadoras y sistemas completos están disponibles por ejemplo de Applied Biosystems (Foster City, CA) , Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA) , and Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, NJ) . Materiales cromatográficos incluyendo pero no limitados a materiales de matriz de intercambio, medios y amortiguadores también están disponibles de estas compañías. Equilibrio y otras etapas en los procesos de cromatografía en columna aquí descritos tales como lavado y elución, pueden ser logrados más rápidamente utilizando equipo especializado tal como una bomba. Bombas comercialmente disponibles incluyen, pero no están limitadas a, HILO AD® Pump P-50, Peristaltic Pump P-I, Pump P-901, y Pump P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Ejemplos de recolectores de fracciones incluyen el Recolector de Fracción RediFrac, Recolectores de Fracciones FRAC- 100 y FRAC-200 y Recolector de Fracción SUPERFRAC® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . También están disponibles mezcladores para formar gradientes de concentración lineal y pH. Mezcladores comercialmente disponibles incluyen el Mezclador de Gradiente GM-I y Mezcladores En-Línea (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . El ' proceso cromatográfico puede supervisarse utilizando cualquier monitor comercialmente disponible. Estos monitores pueden emplearse para recolectar información como UV, pH y conductividad. Ejemplos de detectores incluyen Monitor UV-I, UVICORD® S II, Monitor UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC- 900, Monitor pH/C-900, y Monitor de Conductividad (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Sin duda, sistemas completos están comercialmente disponibles incluyendo los diversos sistemas AKT A® de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) . En una modalidad de la presente invención, por ejemplo el polipéptido puede ser reducido y desnaturalizado al primero desnaturalizar el polipéptido purificado resultante en urea, seguido por dilución en amortiguador TRIS que contiene un agente reductor (tal como DTT) a un pH conveniente. En otra modalidad, el polipéptido se desnaturaliza en urea en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 2 M a aproximadamente 9 M, seguido por dilución en amortiguador TRIS a un pH en el intervalo de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. La mezcla de plegado de esta modalidad puede ser entonces incubada. En una modalidad, la mezcla de plegado se incuba a temperatura ambiente por cuatro a veinticuatro horas. La mezcla de polipéptido reducido y desnaturalizado puede entonces ser adicionalmente aislada o purificada. Como se establece aquí, el pH de la primer mezcla polipéptido puede ajustarse antes de realizar cualesquiera etapas de aislamiento subsecuentes. Además, la primer mezcla de polipéptido o cualquier mezcla subsecuente del mismo puede concentrarse utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Aún más, el amortiguador de elución que comprende la primer mezcla de polipéptido o cualquier mezcla subsecuente del mismo puede intercambiarse por un amortiguador adecuado para la siguiente etapa de aislamiento utilizando técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Cromatografía de Intercambio de Iones . En una modalidad y como una etapa opcional, adicional, puede realizarse cromatografía de intercambio de iones en la primer mezcla de polipéptido. Ver en general ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) ) . Columnas de intercambio de iones comercialmente dispoibles incluyen las columnas HITRAP' , HIPREP® y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Estas columnas utilizan intercambiadores de aniones fuertes tales como Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance y Q SEPHAROSE® XL; intercambiadores de fuertes cationes tales como SP SEPHAROSE High Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow, and SP SEPHAROSE® XL; intercambiadores de aniones débiles tales como DEAE SEPHAROSE Fast Flow; e intercambiadores de cationes débiles tales como CM SEPHAROSE Fast Flow (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Cromatografía en columna de intercambio de aniones o cationes puede realizarse en el polipéptido en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar polipéptido substancialmente purificado. La etapa de cromatografía de intercambio de cationes puede realizarse utilizando cualquier matriz de intercambio de catión es conveniente. Matrices de intercambio de catión útiles incluyen pero no están limitadas a, materiales de matriz de intercambio de cationes fibrosos, porosos, no-porosos, microgranulares, con perlas o reticulados o entrelazados. Estos materiales de matriz en el intercambio de cationes incluyen pero no están limitados a celulosa, agarosa, dextrano, poliacrilato, polivinilo, poliestireno, sílice, poliéter, o compuestos de cualquiera de los anteriores. La matriz de intercambio de cationes puede ser cualquier intercambiador de cationes conveniente incluyendo intercambiadores de cationes fuertes y débiles. Intercambiadores de cationes fuertes pueden permanecer ionizados sobre un amplio intervalo de pH y de esta manera puede ser capaces de ligar el polipéptido sobre un amplio intervalo de pH. Intercambiadores de cationes débiles, sin embargo pueden perder ionización como una función de pH. Por ejemplo, un intercambiador de cationes débiles puede perder carga cuando el pH cae por debajo de aproximadamente pH 4 o pH 5. Adecuados intercambiadores de cationes fuertes incluyen, pero no están limitados a grupos funcionales cargados tales como sulfopropil (SP) , metil sulfonato (S) o sulfoetil (SE) . La matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuertes, de preferencia que tienen intervalo de pH de enlace polipéptido de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 6.0. En forma alterna, el intercambiador de cationes fuertes puede tener un intervalo de pH de enlace polipéptido de aproximadamente pH 2.5 a aproximadamente pH 5.5. La matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuerte que tiene un pH de enlace polipéptido de aproximadamente 3.0. En forma alterna, la matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuerte, de preferencia que tiene un intervalo de pH de enlace polipéptido de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. La matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuertes que de preferencia tiene un intervalo de pH de enlace polipéptido de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.5. En forma alterna, el intercambiador de cationes fuertes puede tener un intervalo de pH de enlace polipéptido de aproximadamente pH 8.0 a aproximadamente pH 12.0.

Antes de cargar el polipéptido, puede equilibrarse la matriz de intercambio de cationes, por ejemplo utilizando varios volúmenes de columna de un ácido débil diluido, por ejemplo cuatro volúmenes de columna de ácido acético 20 mM, pH 3. Después de equilibrio, el polipéptido puede agregarse y la columna puede lavarse una de varias veces, antes de elución de polipéptido substancialmente purificado, también utilizando una solución de ácido débil tal como una solución de ácido acético o ácido fosfórico débil. Por ejemplo, 2-4 volúmenes de columna aproximadamente de ácido acético de 20 mM, pH 3, pueden emplearse para lavar la columna. Lavados adicionales utilizando por ejemplo, 2-4 volúmenes de columna de acetato de sodio 0.05 M, pH 5.5, o acetato de sodio 0.05 M en mezcla con cloruro de sodio 0.1 M, pH 5.5, también pueden emplearse. En forma alterna, utilizando métodos conocidos en la técnica, la matriz de intercambio de cationes puede ser equilibrada utilizando varios volúmenes de columna de una base débil diluida. En forma alterna, polipéptido substancialmente purificado puede eluirse por contacto de la matriz de intercambio de cationes con un amortiguador que tiene un pH o concentración iónica suficientemente baja para desplazar el polipéptido de la matriz. El pH del amortiguador de elución puede estar en el intervalo de aproximadamente pH 2.5 a aproximadamente pH 6.0. Más específicamente, el pH del amortiguador de elución puede estar en el intervalo de aproximadamente pH 2.5 a aproximadamente pH 5.5, aproximadamente pH 2.5 a aproximadamente pH 5.0. El amortiguador de elución puede tener un pH de aproximadamente 3.0. Además, la cantidad de amortiguador de elución puede variar ampliamente y en general estará en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 volúmenes de columna. Después de adsorción del polipéptido a la matriz de intercambio de cationes, puede eluirse polipéptido substancialmente purificado por contacto de la matriz con un amortiguador que tiene un pH o concentración iónica suficientemente elevada para desplazar el polipéptido desde la matriz. Amortiguadores convenientes para utilizar en elusión con alto pH de polipéptido substancialmente purificado pueden incluir, pero no están limitados a, amortiguadores citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES, y MES en el intervalo en concentración desde al menos aproximadamente 5 mM a cuando menos aproximadamente 100 mM. Cromatografía de Fase Inversa RP-HPLC puede realizarse para purificar proteínas siguiendo protocolos convenientes que son conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ver, por ejemplo, Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-1 19; Kunitaní et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402. RP-HPLC puede realizarse en el polipéptido para aislar polipéptido substancialmente purificado. En este aspecto, resinas derivatizadas con sílice con funcionalidades alquilo con una amplia variedad de longitudes, incluyendo pero no limitadas a, resinas con al menos a C3 a cuando menos aproximadamente C30 a cuando menos aproximadamente C20, o a cuando menos aproximadamente C3 a cuando menos aproximadamente C?8, pueden emplearse. En forma alterna, puede utilizarse una resina polimérica. Por ejemplo, resina TosoHaas Amberchrome CGlOOOsd puede emplearse que es una resina de polímero de estireno. Resinas ciano o poliméricas con una amplia variedad de longitudes de cadena alquilo también pueden emplearse. Además, la columna RP-HPLC puede lavarse con un solvente tal como etanol . La columna fuente RP es otro ejemplo de una columna RP-HPLC. Un amortiguador de elusión conveniente que contiene un agente de apareamiento de iones y un modificador orgánico tal como metanol, isopropanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo o etanol, puede emplearse para eluir el polipéptido de la columna RP-HPLC. Los agentes de apareamiento de iones más comúnmente empleados incluyen, pero no están limitados a, ácido acético, ácido fórmico, ácido perclorico, ácido fosfórico, ácido trifluoroacetico, ácido heptafluorobutirico, trietilamino, tetrametilamonio, tetrabutilamonio y acetato de trietilamonio. La elusión puede realizarse utilizando uno o más gradientes o condiciones isocraticas, con condiciones de gradiente preferidas para reducir el tiempo de separación y disminuir el ancho pico. Otro método involucra el uso de dos gradientes con diferentes intervalos de concentración de solvente. Ejemplos de amortiguadores de elusión convenientes para utilizar aquí pueden incluir pero no están limitados a, soluciones de acetato de amonio y acetonitrilo. Técnicas de Purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofobica. La cromatografía de interacción hidrofobica (HIC Hydrophobic interaction chromatography) puede ejecutarse en el polipéptido. Ver en general HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) que se incorpora aquí por referencia.

Matrices HIC convenientes pueden incluir, pero no están limitadas a, matrices substituidas con alquilo- o arilo-, tales como matrices substituidas con butilo-, hexilo-, octilo- o fenilo- incluyendo matrices de agarosa, azarosa entrelazada, sefarosa, celulosa, sílice, dextrano, poliestireno, poli (metacrilato) y resinas de modo mixto, incluyendo pero no limitadas a, una resina de polietilenamina o una matriz de poli (metacrilato) substituida butilo- o fenilo- . Fuentes comercialmente disponibles para cromatografía en columna de interacción hidrofobica incluyen pero no están limitadas a columnas, HITRAP , HIPREP , y F HILOAD (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) .

Brevemente, antes de carga la columna HIC puede equilibrarse utilizando amortiguadores estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, tales como solución de ácido acético/cloruro de sodio o sulfato de amonio que contiene HEPES. Sulfato de amonio puede emplearse como el amortiguador para cargar la columna HIC. Después de cargar el polipéptido, la columna puede lavarse utilizando amortiguadores y condiciones estándar para retirar materiales indeseados pero reteniendo el polipéptido en la columna HIC. El polipéptido puede ser eluido con aproximadamente 3 a aproximadamente 10 volúmenes de columna de un amortiguador estándar, tal como amortiguador HEPES que contiene EDTA y menor concentración de sulfato de amonio que el amortiguador de equilibrio, o un amortiguador ácido acético/cloruro de sodio, entre otros. Un gradiente de sal lineal decreciente utilizando, por ejemplo, un gradiente de fosfato de potasio, también puede emplearse para eluir las moléculas. El eluyente puede entonces concentrarse, por ejemplo por filtración tal como diafiltración o ultra filtración. La diafiltración puede utilizarse para retirar la sal empleada para eluir el polipéptido. Otras Técnicas de Purificación. Todavía otra etapa de aislamiento utilizando, por ejemplo, filtración en gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) que se incorpora aquí por referencia, cromatografía de hidroxiapatita (matrices convenientes incluyen, pero no están limitadas a, HA-Ultrogel, de alta resolución (Calbiochem), Hidroxiapatita cerámica CHT (BioRad) , Hidroxiapatita Bi-gel HTP (BioRad) ) , HPLC, absorción de lecho expandido, ultra filtración, diafiltración, liofilización, y semejantes, pueden realizarse en la primer mezcla de polipéptido o cualquier mezcla subsecuente del mismo, para retirar cualesquiera sales en exceso y reemplazar el amortiguador con un amortiguador conveniente para la siguiente etapa de aislamiento o incluso formulación del producto de droga final . El rendimiento de MANUAL polipéptido, incluyendo polipéptido substancialmente purificado, puede supervisarse en cada etapa descrita aquí utilizando técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Estas técnicas también pueden emplearse para estimar el rendimiento del polipéptido substancialmente purificado siguiendo la última etapa de aislamiento. Por ejemplo, el rendimiento de polipéptido puede supervisarse utilizando cualquiera de varias columnas de cromatografía de líquido con alta presión de fase inversa, que tiene una variedad de longitudes de cadena alquilo tales como ciano RP-HPLC, CisRP-HPLC; así como HPLC de intercambio de cationes y HPLC filtración en gel. En modalidades específicas de la presente invención, el rendimiento de polipéptido después de cada etapa de purificación puede ser al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 99.9%, al menos aproximadamente 99.99%, del polipéptido en el material de partida para cada etapa de purificación. La pureza puede determinarse utilizando técnicas estándar tales como SDS-PAGE, o la medir polipéptido utilizando ensayos de transferencia Western y ELISA. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos policlonales contra proteínas aisladas de fermentación de levadura de control negativa y la recuperación de intercambio de cationes. Los anticuerpos también pueden emplearse para sondear la presencia de proteínas de células huésped contaminantes. Material de RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de gel de sílice, las superficies de las cuales transportan cadenas C4 -alquilo. La separación de polipéptido de las impurezas proteinaceas se basa en diferencias en la fuerza de interacciones hidrofobicas. La elusión se realiza con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. HPLC preparativa se realiza utilizando una columna de acero inoxidable (llena con 2.8 a 3.2 litros de gel de sílice Vydac C4) . El eluato de hidroxiapatita ultrogel se acidifica al agregar ácido trifluoroacético y carga en la columna Vydac C4. Para lavado y elusión, se emplea un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. Las fracciones se recolectan y neutralizan inmediatamente con amortiguador fosfato. Las fracciones polipéptido que están dentro de los límites IPC se recolectan. Material DEAE Sepharose (Pharmacia) que consiste de grupos dietilaminoetil (DEAE) - que están ligados covalentemente a la superficie de perlas de Sepharose. El enlace de polipéptido a los grupos DEAE esta mediado por interacciones iónicas. Ácido acetonitrilo y trifluoroacético pasan a través de la columna sin retenerse. Después de que estas substancias son lavadas por arrastre, se retiran impurezas en trazas al lavar la columna con amortiguador acetato a un pH bajo. Después, la columna se lava con amortiguador fosfato neutro y se eluye polipéptido con un amortiguador con incrementada concentración iónica. La columna se empaca con DEAE Sepharose fast flor. El volumen de columna se ajusta para asegurar una carga de polipéptido en el intervalo de polipéptido 3-10 mg/ml en gel. La columna se lava con agua y amortiguador de equilibrio (fosfato de sodio/potasio) . Las fracciones recolectadas del eluato HPLC se cargan y la columna se lava con amortiguador de equilibrio. Después, la columna se lava con amortiguador de lavado (amortiguador de acetato de sodio) seguido por lavado con amortiguador de equilibrio. Subsecuentemente, se eluye polipéptido de la columna con amortiguador de alusión (cloruro de sodio, fosfato de sodio/potasio) y recolecta en una sola fracción de acuerdo con el perfil de elusión. El eluato de la columna DEAE Sepharose se ajusta a la conductividad especificada. La sustancia de droga resultante se filtra estéril en botellas de Teflón y almacena a -70 grados C . Métodos adicionales que pueden emplearse, incluyen pero no están limitados a, etapas para retirar endotoxinas. Las endotoxinas son lipopoli-sacáridos (LPSs) ubicados en la membrana exterior de células huésped Gram-negativa, tales como, por ejemplo, Escherichia coli . Métodos para reducir niveles de endotoxinas se conocen por una persona con destreza ordinaria en la especialidad e incluyen, pero no están limitados a, técnicas de purificación utilizando soportes de sílice, polvo de vidrio o hidroxiapatita, fase inversa, afinidad, exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio de- aniones, cromatografía de interacción de hidrofobica, una combinación de estos métodos, y semejantes. Modificaciones o métodos adicionales pueden requerir retirar contaminantes tales como proteínas co-migrantes del polipéptido de interés. Métodos para medir niveles de endotoxinas se conocen por una persona con destreza ordinaria en la especialidad e incluyen, pero no están limitados a, ensayos de lisado de amebocito limulus (LAL) . El ensayo EndosafeMR-PTS es un sistema de un solo tubo, colorimétrico, que utiliza cartuchos previamente cargados con reactivo LAL, substrato cromogénico, y endotoxina estándar de control junto con un espectrofotómetro manual. Métodos alternos incluyen, pero no están limitados a, un método LAL cinético que es turbidmetrico y utiliza un formato de 96 pozos. Una amplia variedad de métodos y procedimientos pueden utilizarse para estimar el rendimiento y pureza de una proteína que comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados, incluyendo pero no limitados al ensayo Bradford, SDS-PAGE, teñido con plata SDS-PAGE, teñido comasse SDS-PAGE, espectrometría de masas (incluyendo pero no limitado a, MALDI-TOF) y otros métodos para caracterizar proteínas que se conocen por una persona con destreza ordinaria en la técnica. Métodos adicionales, incluyen pero no están limitados a: SDS-PAGE acoplado con métodos de tinsión de proteína, inmunotransferencia, espectrometría de masas-ionización/ deserción de láser asistida por matriz (MALDI-MS matrix assisted láser desorption/ionization-mass spectrometry) , espectrometría de masa/cromatografía de líquidos, enfoque isoeléctrico, intercambio de aniones analítico, cromato enfoque, y dicroísmo circular. VIII. Expresión en Sistemas Alternos Se han empleado varias estrategias para introducir aminoácidos no naturales en proteínas en células huésped no recombinantes, células huésped mutagenizadas o en sistemas libres de células. Estos sistemas son también adecuados para utilizar en producir los polipéptidos de la presente invención. Derivatización de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr resulta en la conversión de lisina en N2-acetil-lisina. Síntesis química también proporciona un método directo para incorporar aminoácidos no naturales. Con el reciente desarrollo de ligación enzimática y ligación química nativa de fragmentos péptidos, es posible producir más grandes proteínas. Ver, por ejemplo, P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). Ligación de péptidos química y ligación química nativa se describen en la Patente de los E.U.A. número 6,184,344, la Publicación de patente de los E.U.A. número 2004/0138412, la Publicación de patente de los E.U.A. número 2003/0208046 y WO 02/098902 y WO 03/042235, que se incorpora aquí por referencia. Un método biosintético in vitro en general en donde un ARNt supresor químicamente asilado con el aminoácido no natural deseado se agrega a un extracto in vitro capaz de soportar biosíntesis de proteína, se ha utilizado para incorporar específicamente en sitio más de 100 aminoácidos no naturales en una variedad de proteínas virtualmente de cualquier tamaño. Ver, por ejemplo, V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); CJ. Noren, SJ. Anthony-Cahi11 , M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); y, J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989). Un amplio intervalo de grupos funcionales se ha introducido en proteínas para estudios de estabilidad de proteína, plegado de proteína, mecanismo de enzima, y transducción de señal. Un método in vivo, denominado incorporación de presión selectiva, se desarrolló para explotar la promiscuidad de sintetasa de tipo silvestre. Ver, por ejemplo, N Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J. , 13:41 (1999). Una sepa autotrófica, en donde la ruta metabólica relevante que suministra la célula con un aminoácido natural particular se desactiva, se desarrolla en medio mínimo que contiene concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras que la trascripción del gene objetivo se reprime. Al inicio de una fase de crecimiento estacionario, el aminoácido natural se aboca y reemplaza con el análogo aminoácido no natural. Inducción de expresión de la proteína recombinante resulta en la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, utilizando esta estrategia, o, m y p-fluorofenilalaninas se han incorporado en proteínas, y exhiben dos hombros característicos en el espectro de UV que puede ser fácilmente identificados, ver, por ejemplo, C. Minks, S. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); trifluorometionina se ha empleado para reemplazar metionina en lisozima bacteriófago T4 para estudiar su interacción con ligandos quitoligosacáridos por 19F RNM, ver, por ejemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry. 36:3404 (1997); y trifluoroleucina se ha incorporado en lugar de leucina, resultando en incrementar estabilidad térmica y química de una proteína cremallera leucina. Ver, por ejemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Aneew Chem. Int. Ed. Engl. 40:1494 (2001). Aún más, selenometionina y tellurometionina se incorporan en diversas proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía rayos X. Ver, por ejemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBQ J., 9:1665 (1990); J. 0. Boles, K. Lewinski , M. Kunkle, J. D. Odom, B.

Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat. Struct . Biol. 1:283 (1994) ; N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J.

Kellermann and R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); y, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol. Biol. 270:616 (1997) . Análogos de metionina con funcionalidades alqueno o alquino también se han incorporado en forma eficiente, permitiendo modificación adicional de proteínas por medios químicos. Ver, por ejemplo, J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc. 122:1282 (2000); y, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); Patente de los E.U.A. número 6,586,207, Publicación de patente de los E.U.A. número 2002/0042097, que se incorporan aquí por referencia. El éxito de este método depende del reconocimiento de análogos aminoácidos no naturales por aminoacil -ARNt sintetasas, que en general, requieren alta selectividad para asegurar la fidelidad de traducción de proteínas. Una forma de expansión del alcance de este método es relajar la especificidad del substrato de aminoacil -ARNt sintetasas, que se ha logrado en un número limitado de casos. Por ejemplo, el reemplazo de Ala294 por Gly en fenilalañil -ARNt sintetasa Escherichia coli (PheRS) aumenta el tamaño de una cavidad de enlace de substrato, y resulta en la acilación de ARNtPhe por p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe) . Ver, M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry. 33:7107 (1994). Una cepa de Escherichia coli que aloja este PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina o p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Ver, por ejemplo M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett.. 364:272 (1995); and, N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Similarmente, una mutación punto Phel30Ser cerca del sitio de enlace aminoácido de tirosil -ARNt de Escherichia coli se muestra que permite que se incorpore azatirosina más eficientemente que la tirosina. Ver, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura. J. Biol. Chem.. 275:40324 (2000). Otra estrategia para incorporar aminoácidos no naturales en proteíneas in vivo es modificar sintetasas que tienen mecanismos de revisión. Estas sintetasas no pueden discriminar y por lo tanto activar aminoácidos que son estructuralmente similares a los aminoácidos naturales cognato. Este error se corrige en un sitio separado, que desacila el aminoácido mal cargado del ARNt para mantener la fidelidad de traducción de proteína. Si la actividad de revisión de la sintetasa se desactiva, análogos estructurales que están mal activados pueden escapar a la función de edición y pueden ser incorporados. Este enfoque se ha demostrado recientemente con valil-ARNt sintetasa (ValRS) .

Ver, V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science. 292:501 (2001). ValRS puede mal aminoacilar tRNAVal con Cys, Thr, o aminobutirato (Abu) ; estos aminoácidos no-cognado se hidrolizan subsecuentemente por el dominio de edición. Después de mutagénesis al azar del cromosoma Escherichia coli , se eligió una cepa mutante de Escherichia coli que tiene una mutación en el sitio de edición de ValRS . Este ValRS defectuoso en edición carga incorrectamente tRNAVal con Cys. Debido a que Abu semeja estéricamente al grupo de Cys (- SH group of Cys se reemplaza con -CH3 en Abu) , ValRS mutante también incorpora Abu en las proteínas cuando esta cepa mutante Escherichia coli se desarrolla en la presencia de Abu. Análisis espectrométrico de masas muestra que aproximdamente 24% de valinas se reemplazan por Abu en cada posición valina en la proteína nativa. Síntesis en fase sólida y métodos semisintéticos también han permitido la síntesis de una cantidad de proteínas que contienen aminoácidos novedosos. Por ejemplo, ver las siguientes publicaciones y referencias citadas, que son como sigue: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K. , Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem. 88 (24) : 5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Ace Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T. , Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M. , Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HTV protease, Science, 256 (5054) :221-225 (1992); Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 1 1(3):255- 301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3) :151-157 (1987); and, Jackson, D. Y., Burnier, J. , Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with No natural Catalytic Residues, Science, 266 (5183) : 243 (1994). Modificación se ha empleado para introducir una variedad de cadenas laterales no naturales, incluyendo cofactores, etiquetas de espin y oligonucleótidos en proteínas, in vi tro. Ver, por ejemplo Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science. 238(4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzy atic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation ofenyzme active sites, Science, 226 (4674) : 505- 511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem. 243 (24): 6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site, Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc. 88:3153-3154 (1966); and, Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 242(4881): 1038-1040 (1988). En forma alterna, métodos biosintéticos que emplean aminoacil -ARNts químicamente modificados se han empleado para incorporar varias sondas biofísicas en proteínas sintetizadas irz vitro. Ver las siguientes publicaciones y referencias citadas: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem. 62:483-514 (1993); and, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition partióle, Proc. Nati. Acad. Sci, 83 (22) :8604-8608 (1986). Previamente, se ha mostrado que aminoácidos no naturales pueden ser incorporados específicamente en sitio en proteínas in vi tro por la adición de ARNts supresor aminoacilado químicamente a reacciones de síntesis de proteínas programadas con un gen que contiene una mutación sin sentido ámbar deseada. Utilizando estos enfoques, se puede substituir una cantidad de los veinte aminoácidos comunes con homólogos estructurales cercanos, por ejemplo fluorofenilalanina por fenilalanina, utilizando cepas auxotrópicas para un aminoácido particular. Ver, por ejemplo Noren, C.J., Anthony-Cahill , Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of non-natural amino acids into proteins, Science. 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D. , Glabe, C.G., Dix, T.A. , Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc. 111 : 8013-8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); Ellman, J.A., Mendel, D. , Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing non-natural amino acids site- specifically into proteins. Methods in Enz .. vol. 202, 301-336 (1992); and, Mendel, D. , Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophvs . Biomol Struct . 24, 435-62 (1995) . Por ejemplo, un ARNt supresor se prepara que reconoce el codón de parada UAG y se aminoacila químicamente con un aminoácido no natural. Mutagénesis dirigida de sitio convencional se utiliza para introducir el codón de parada TAG, en el sitio de interés en el gen de proteína. Ver, por ejemplo Sayers, J.R. , Schmidt, W. Eckstein, F. 5-31 Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagenesis, Nucleic Acids Res. 16 (3) : 791-802 (1988) . Cuando el ARNt supresor acilado y el gen mutante se combinan en un sistema de traducción/transcripción in vi tro, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG que dio una proteína que contiene ese aminoácido en la posición especificada. Experimentos utilizando [3H] -Phe y experimentos con los a -hidroxi ácidos demostraron que solo el aminoácido deseado se incorpora en la posición especificada por el codón UAG y que este aminoácido no se incorpora en cualquier otro sitio en la proteína. Ver, por ejemplo Noren, et al, supra; Kobayashi et al .5 (2003) Nature Structural Biology 10 (6) :425-432 ; and, ElIman, J.A. , Mendel, D., Schultz, P.G. Sile-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science. 255(5041): 197-200 (1992) . Un ARNt puede ser aminoacilado con un aminoácido deseado por cualquier método o técnica, incluyendo pero no limitado a aminoacilación química o enzimática. La aminoacilación puede lograrse por aminoacil ARNt sintetasas o por otras moléculas enzimáticas, incluyendo pero no limitadas a ribozimas. El término "ribozima" es intercambiable con "RNA catalítico" . Cech and coworkers (Cech, 1987, Science, 236:1532- 1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demuestran la presencia de ARNs de origen natural que pueden actuar como catalizadores (ribozimas) . Sin embargo, aunque estos catalizadores naturales de ARN solo se ha mostrado que actúan en substratos de ácido ribonucleico para escisión y combinación, el reciente desarrollo de la evolución artificial de ribozimas ha expandido el repertorio de catálisis a diversas reacciones químicas. Estudios han identificado moléculas de ARN que pueden catalizar enlaces aminoacil -ARN en sus propios extremos (2 ' ) 3 ' -termini (Illangakekare et al., 1995 Science 267:643- 647), y una molécula ARN que puede transferir un aminoácido de una molécula ARN a otra (Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444). La publicación de la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0228593, que se incorpora aquí por referencia, describe métodos para construir ribozimas y su uso en aminoacilación de ARNts con aminoácidos naturalmente codificados y no naturalmente codificados. Formas inmovilizadas en substrato de moléculas enzimáticas que pueden aminoacilar ARNts, incluyen pero no están limitadas a, ribozimas pueden permitir una purificación por afinidad eficiente de los productos aminoacilados . Ejemplos de substratos convenientes incluyen agarosa, sefarosa y perlas magnéticas. La producción y uso de una forma inmovilizada con substrato de ribozima para aminoacilación se describe en Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 y la publicación de la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0228593, que se incorpora aquí por referencia. Métodos de aminoacilación química incluyen, pero no están limitados a, aquellos introducidos por Hecht and coworkers (Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545; Heckler, T. G. ; Roesser, J. R. ; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S.

M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M. ; Alford, B. L. ; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517) and by Schultz, Chamberlin, Dougherty and others (Cornish, V. W. ; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellrnan, J. A.; Schultz, P. G. J.

Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722; Noren, C. J. ; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G. ; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 1 1 1, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D.

A. Chem. Biol. 1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34), que se incorporan aquí por referencia, para evitar el uso de sintetasas en aminoacilación. Estos métodos u otros métodos de aminoacilación pueden emplearse para aminoacilar moléculas de ARNt. Métodos para generar ARN catalítico pueden involucrar el generar conjuntos separados de secuencias de ribozima al azar, realizar evolución dirigida en los conjuntos, monitorear los conjuntos para actividad de aminoacilación deseable, y seleccionar secuencias de estas ribozimas que exhiben actividad de aminoacilación deseada. Ribozimas pueden comprender motivos y/o regiones que facilitan la actividad de acilación, tal como un motivo GGU, y una región rica en U. Por ejemplo, se ha reportado que regiones ricas en U pueden facilitar el reconocimiento de un substrato aminoácido, y un motivo GGU puede formar pares base con los extremos 3' de un ARNt. En combinación, el GGU motivo y la región rica en U facilitan el reconocimiento simultáneo tanto del aminoácido como ARNt simultáneamente y de esta manera facilitan la aminoacilación del extremo 3 ' del ARNt . Las ribozimas pueden ser generadas por selección in vi tro utilizando r24mini parcialmente aleatorizado conjugado con ARNtAsncccG> seguida por diseño sistemático de una secuencia consenso que se encuentra en los ciónos activos. Una ribozima ejemplar obtenida por este método se denomina "Fx3 ribozyme" y se describe en la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0228593, los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia, actúa como un catalizador versátil para la síntesis de diversos aminoacil -ARNts cargados con aminoácidos no naturales cognado.

Inmovilización en un substrato puede emplearse para permitir purificación por afinidad eficiente de los ARNts aminoacilados. Ejemplos de substratos convenientes incluyen pero no están limitados a, agarosa, sefarosa y perlas magnéticas. Las ribozimas pueden ser inmovilizadas en resinas al aprovechar la estructura química de ARN, tal como 3'-cis-diol en la ribosa de ARN puede oxidarse con peryodato para dar por resultado el dialdehído correspondiente para facilitar la inmovilización del ARN en la resina. Diversos tipos de resinas pueden emplearse incluyendo resinas hidrazida económicas en donde la aminación reductiva hace la interacción entre la resina y la ribozima un enlace irreversible. Síntesis de aminoacil-ARNts puede ser facilitada significativamente por esta técnica de aminoacilación en columna. Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4 describe un sistema de aminoacilación basada en columna . Aislamiento de los ARNts aminoacilados puede lograrse a una variedad de formas. Un método conveniente es eluir los ARNts aminoacilados de una columna con un amortiguador tal como solución de acetato de sodio con EDTA 10 mM, un amortiguador que contiene N- (2-hidroxietil)piperazina-N' - (ácido 3 -propansulfónico) 50 mM, KCl, 12.5 mM pH 7.0, EDTA 10 mM, o simplemente agua amortiguada con EDTA (pH 7.0) .

Los ARNts aminoacilados pueden agregarse a reacciones de traducción a fin de incorporar el aminoácido con el cual el ARNt se aminoacila en una posición de selección en un polipéptido elaborado por la reacción de traducción. Ejemplos de sistemas de traducción en donde los ARNts aminoacilados de la presente invención pueden emplearse, incluyen pero no están limitados a lisados celulares. Los lisados celulares proporcionan componentes de reacción necesarios para traducción in vitro de un polipéptido a partir de un ARNm de alimentación. Ejemplos de estos componentes de reacción incluyen pero no están limitados a proteínas ribosomales, ARNr, aminoácidos, ARNts, GTP, ATP, factores de inicio y alargado de traducción y factores adicionales asociados con traducción. Adicionalmente, sistemas de traducción pueden ser traducciones por lotes o traducción por compartimientos. Sistemas de traducción por lotes combinan componentes de reacción en un solo compartimiento mientras que los sistemas de traducción en compartimiento separan los componentes de reacción de traducción de los productos de reacción que pueden inhibir la eficiencia de traducción. Estos sistemas de traducción están disponibles comercialmente. Además, puede emplearse un sistema de traducción/transcripción acoplado. Los sistemas de traducción/transcripción acoplados permiten tanto transcripción de un ADN de alimentación en un ARNm correspondiente, que a su vez se traduce por componentes de reacción. Un ejemplo de una traducción/transcripción acoplada comercialmente disponible es el sistema Rapid Translation System (RTS, Roche Inc.) . El sistema incluye una mezcla que contiene lisado de E. coli para proporcionar componentes de traducción tales como ribosomas y factores de traducción. Adicionalmente, una ARN polimerasa se incluye para la transcripción del ADN de alimentación en una plantilla de ARNm para utilizar en traducción. RTS puede utilizar co parta entalización o separación de compartimientos de los componentes de reacción mediante una membrana intercalada entre compartimientos de reacción, incluyendo un compartimiento de suministro/desecho y un compartimiento de transcripción/traducción. La aminoacilación de ARNt puede realizarse por otros agentes, incluyendo pero no limitada a transferasas, polimerasas, anticuerpos catalíticos, proteínas multi-funcionales, y semejantes. Lu et al. in Mol. Cell. 2001 Oct ; 8 (4) : 759-69 describen un método en donde una proteína se liga químicamente con un péptido sintético que contiene aminoácidos no naturales (ligación de proteína expresada) . Técnicas de microinyección también han empleado aminoácidos no naturales incorporados en proteínas. Ver, por ejemplo M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Science, 268:439 (1995); and, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Un oocito de Xenopus se coinyectó con dos especies de ARN hecho in vitro: Un ARNm que codifica la proteína objetivo con un codón de parada UAG en la posición de aminoácido de interés y un ARNt supresor ámbar aminoacilados con el aminoácido no natural deseado. La maquinaria de traducción del oocito entonces insertar el aminoácido no natural en la posición especificada por UAG. Este método ha permitido los estudios de función-estructura in vivo de proteínas de membrana integral, que en general no son susceptibles a sistemas de expresión in vitro. Ejemplos incluyen la incorporación de n aminoácido fluorescente en receptor taquiquinina neuroquinina-2 para medir distancias por transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, ver por ejemplo, G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J. Biol. Chem.. 271:19991 (1996); la incorporación de aminoácidos biotinilados para identificar residuos expuestos en superficie en canales de iones, ver, por ejemplo J. P. Gallivan, H. A. Lester and D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); el uso de análogos tirosina enjaulados para supervisar cambios en conformación en un canal de iones en tiempo real, ver por ejemplo J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); y el uso de alfa hidroxi aminoácidos para cambiar estructuras principales de canal de iones para sondear sus mecanismos de compuerta. Ver, por ejemplo P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lester, CeJl , 96:89 (1999); and, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat. Neurosci ..4 : 239 (2001). La capacidad para incorporar aminoácidos no naturales directamente en proteínas in vivo, ofrece una amplia variedad de ventajas, incluyendo pero no limitadas, a, altos rendimientos de proteínas mutantes, facilidad técnica, el potencial por estudiar las proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos y usos de diagnóstico. La capacidad para incluir aminoácidos no naturales con diversos tamaños, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidades y otras propiedades en proteínas, puede expander enormemente nuestra capacidad para manipular en forma racional y sistemática las estructuras de proteínas, tanto para sondear la función de la proteína como para crear nuevas proteínas u organismos con propiedades novedosas. En un intento por incorporar específicamente en sitio para-F-Phe, un supresor ámbar de levadura tRNAPheCUA/fenilalanina-ARNt sinteasa, se utilizó en una cepa de Escherichia coli auxotrófica Phe resistente a p-F-Phe. Ver por ejemplo R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998). Puede ser posible el obtener expresión de un polinucleótido de la presente invención utilizando un sistema de traducción (in-vitro) libre de células. Los sistemas de traducción pueden ser celulares o libres de células y pueden ser procarióticos o eucarióticos. Sistemas de traducción celular incluyen pero no están limitados a preparaciones de células enteras, tales como células permeabilizadas o cultivos celulares en donde una secuencia de ácido nucleico deseada puede ser transcrita en ARNm y el ARNm traducirse. Sistemas de traducción libres de células están comercialmente disponibles y son bien conocidos muchos tipos y sistemas diferentes. Ejemplos de sistemas libres de células incluyen pero no están limitados a lisados procarióticos tales como lisados de Escherichia coli , y lisados eucarióticos tales como extractos de germen de trigo, lisados de células de insecto, lisados de reticulocitos de conejo, lisados de oocitos de conejo y lisados de células humanas. Extractos o lisados eucarióticos pueden ser preferidos cuando la proteína resultante se glicosila, fosforila o de otra forma se modifica debido a que muchas de estas modificaciones son sólo posibles en sistemas eucarióticos. Algunos de estos extractos y lisados están disponibles comercialmente (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, 111.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). Extractos membranosos, tales como los extractos pancreáticos caninos que contienen membranas microsomales, también están disponibles que son útiles para traducir proteínas secretorias. En estos sistemas, que pueden incluir ya sea ARNm como una plantilla (traducción in vitro) o ADN como una plantilla (transcripción y traducción in-vitro combinadas) , la síntesis in vitro se dirige por los ribosomas. Se ha aplicado esfuerzo considerable al desarrollo de sistemas de expresión de proteínas libres de células. Ver por ejemplo Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioenginee?ng, 74 :309-316 (2001); Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M. , and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioenginee?ng, 66, 180-188, (1999); y Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862- 868, (1998) ; Publicación de Patente de los E.U.A. Número 6,337,191; Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785, que se incorporan aquí por referencia. Otro enfoque que puede aplicarse a la expresión de polipéptidos que comprenden un aminoácido no naturalmente codificado incluyen una técnica de fusión ARNm-péptido. Ver por ejemplo R. Roberts and J. Szostak, Proc. Nati Acad. Sci. (USA) 94: 12297-12302 (1997); A. Frankel, et ah, Chemistry & Biology 10: 1043-1050 (2003). En este enfoque, una plantilla de ARNm enlazada a puromicina se traduce en péptido en el ribosoma. Si una o más moléculas de ARNt se han modificado, aminoácidos no naturales pueden incorporarse en el péptido por igual. Después de que se ha leído el último codón ARNm la puromicina captura el extremo C del péptido. Si el conjugado ARNm-péptido resultante se encuentra que tiene propiedades interesantes en un ensayo in vitro, su identidad puede revelarse fácilmente a partir de la secuencia de ARNm. De esta manera, se pueden supervisar o monitorear bibliotecas de polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificado para identificar polipéptidos que tiene propiedades deseadas. Más recientemente, traducciones de ribosoma in vitro con componentes purificados se han reportado, que permiten la síntesis de péptidos sustituidos con aminoácidos no naturalmente codificados. Ver por ejemplo A. Forster et at, Proc. Nati Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003). Sistemas de traducción reconstituido también pueden emplearse. Mezclas de factores de traducción purificados también se han utilizado exitosamente para traducir ARNm en proteína así como combinaciones de lisados o lisados suplementados con factores de traducción purificada tales como factor de inicio-1 (IF- 1), IF-2, 1F-3 ( a o ß ) , factor de elongación T (EF-Tu) , o factores de terminación. Sistemas libres de células también poden acoplarse a sistemas de transcripción/traducción en donde ADN se introduce al sistema, transcribe en ARNm y el ARNm se traduce como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993), que aquí se incorpora específicamente por referencia. ARN transcrito en sistema de transcripción eucariótico puede estar en la forma de un ARN heteronuclear (hnARN) o terminaciones de extremo 5' (7-metil guanosina) y extremo 3' ARNm maduro con cola poli A, que puede ser una ventaja en ciertos sistemas de traducción. Por ejemplo, ARNms terminados en extremo se traduce con alta eficiencia en el sistema de lisado de reticulocitos . IX. Polímeros Macromoleculares Acoplados a Polipéptidos. Diversas modificaciones en los polipéptidos de aminoácidos no naturales descritos aquí pueden efectuarse utilizando las composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí descritas. Estas modificaciones incluyen la incorporación de adicional funcionalidad en el componente aminoácidos no natural del polipéptido, incluyendo pero no limitado a una etiqueta; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; un fotoentrelazador; un radionuclido; un compuesto citotóxico; una droga; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quelador de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucléotido anisentido; un sacárido; un dendrímero soluble en agua; una ciclodextrina; un ácido ribonucleico inhibitorio; un biomaterial; un nanopartícula; una etiqueta de espín; un fluorofóro, una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa en forma covalente o no covalente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción excitable por radiación 'actínica; una porción fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazada con carbono; un agente redox activo; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente etiquetada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminescente; un grupo denso en electrones; un grupo magnético; un grupo de intercalado; un cro ofóro; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta a detectable; una pequeña molécula; un punto cuántico; un nanotransmisor; un radionucleótido; un radiotransmisor; un agente de captura de neutrones; o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o substancia deseable. Como un ejemplo no limitante ilustrativo de las composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí descritas, la siguiente descripción se enfocará en agregar polímeros macromoleculares al aminoácido no natural polipéptido con el entendido de que las composiciones, métodos, técnicas y estrategias para ellos descritos también aplican (con modificaciones apropiadas de ser necesario y para los cuales una persona con destreza en la técnica podrá hacer con las presentes descripciones) para agregar otras funcionalidades, incluyendo pero no limitadas a aquéllas citadas anteriormente. Una amplia variedad de polímeros macromoleculares y otras moléculas pueden enlazarse a polipéptido de la presente invención para modular propiedades biológicas del polipéptido y/o proporcionar nuevas propiedades biológicas a la molécula. Estos polímeros macromoleculares pueden enlazarse al polipéptido mediante un ácido naturalmente codificado, mediante un aminoácido no naturalmente codificado o cualquier sustituyente funcional de un aminoácido natural o no natural, o cualquier grupo sustituyente o funcional agregado a un aminoácido natural o no natural . El peso molecular del polímero puede ser de un amplio intervalo, incluyendo pero no limitado a entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular del polímero por estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da5 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Dai 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero esta entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 50 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero esta entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero esta entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular del polímero esta entre aproximadamente 5,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da.

En algunas modalidades, el peso molecular del polímero esta entre aproximadamente 10,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. La presente invención proporciona preparaciones sustancialmente homogéneas de conjugados polímeros: proteína. "Sustancialmente homogéneas" como se emplea aquí significa que las moléculas de conjugado polímero: proteína se observan que son mayores que la mitad de la proteína total . El conjugado de polímeros: proteína tiene actividad biológica y las presentes preparaciones de polipéptido modificado con PEG "sustancialmente homogéneas" que aquí se proporcionan, son aquellas que son suficientemente homogéneas para exhibir las ventajas de una preparación homogénea, por ejemplo facilidad en aplicación clínica para pronóstico de farmacocinéticas lote-a-lote. También se puede elegir el preparar una mezcla de moléculas de conjugado polímeros: proteína, y la ventaja que aquí se proporciona es que se puede seleccionar la proporción de conjugado de mono-polímeros: proteína para incluirse en la mezcla. De esta manera, si se desea, se puede preparar una mezcla de diversas proteínas con diversos números de cantidades de porciones de polímero agregadas (es decir di-, tri-, tetra-, etc.) y combinar los conjugados con el conjugados de mono-polímero: proteína que se preparan utilizando los métodos de la presente invención, y tener una mezcla con una proporción predeterminada de conjugados de mono-polímero: proteína. El polímero seleccionado puede ser soluble en agua de manera tal que la proteína a la cual se conecta no se precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero puesta ramificado o sin ramificar. Para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de polímeros incluyen pero no están limitados a polialquil éteres y sus análogos terminados en extremo alcoxi (por ejemplo polioxietilen glicol, polioxietilen/propilen glicol, y sus análogos terminados en extremo metoxi o etoxi en especial polioxietilen glicol, este último también se conoce como polietilenglicol o PEG) ; polivinilpirolidonas; polivinilalquilo éteres; polioxazolinas, polialquil oxazolinas y polihidroxialquilo oxazolinas; poliacrilamidas, polialquil acrilamidas y polihidroxialquila acrilamidas (por ejemplo polihidroxipropilmetacrilamida y sus derivados) ; polihidroxialquilo acrilatos; ácido polisiálico y sus análogos; secuencias de péptido hidrofílico; polisacáridos y sus derivados; incluyendo dextrano y derivados dextrano, por ejemplo carboximetildextrano, dextran sulfatos, aminodextrano; celulosa y sus derivados, por ejemplo carboximetil celulosa, hidroxialquil celulosa; quitina y sus derivados, por ejemplo quitosana, succinil quitosana, carboximetilquitina, carboximetilquitosana; ácido hialurónico y sus derivados; almidones; alginatos; sulfato de condroitina; albúmina; pululano y carboximetil pululano; poliaminoácidos y sus derivados, por ejemplo ácidos poliglutámicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas; copolímeros de anhídrido maleico tales como: copolímero de anhídrido estiren maleico, copolímero de anhídrido de vinil éter maleico; alcoholes polivinílico; sus copolímeros; sus terpolímeros; sus mezclas; y derivados de los anteriores. La proporción de moléculas de polietilen glicol con moléculas de proteína variada, al igual que sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima (en términos de eficiencia de reacción ya que hay exceso mínimo de proteína o polímero sin reaccionar) puede ser determinado por el peso molecular de polietilen glicol seleccionado y del número de grupos reactivos disponibles. En lo que se refiere a peso molecular, típicamente entre mayor sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas de polímero que pueden conectarse a la proteína. Similarmente, la ramificación del polímero deberá tomarse en cuenta cuando se optimizan estos parámetros. En general, entre mayor sea el peso molecular (o mayores las ramificaciones) mayor será la proporción de polímero: proteína. Como se emplea aquí, y cuando se contemplan conjugados PEG: polipéptido, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que da el beneficio deseado a un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de una cantidad factores, incluyendo la condición física total del paciente y la causa subyacente de la condición a tratar. La cantidad de polipéptido utilizado para terapia da una velocidad de cambio aceptable y mantiene respuesta deseada a un nivel benéfico.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de las presentes composiciones puede evaluarse fácilmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad utilizando materiales y procedimientos disponibles al público. El polímero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural incluyendo pero no limitada a lineal, en orquilla o ramificada. Típicamente, el polímero soluble en agua es un poli (alquilen glicol), tal como poli (etilen glicol) (PEG), pero otros polímeros solubles en agua también pueden ser empleados. A manera de ejemplo, PEG se utiliza para describir ciertas modalidades de esta invención. PEG es un polímero soluble en agua bien conocido que está comercialmente disponible o puede prepararse por polimerización de abertura de anillo de etilen glicol de acuerdo con métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad (Sandier and Kara, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161) . El término "PEG" se emplea ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilen glicol, sin consideración a tamaño o a modificación en un extremo del PEG, y puede representarse como enlazado al polipéptido de la fórmula: X0- (CH2CH20)n-CH2CH2-Y en donde n e 2 a 10,000 y X es H o una modificación terminal, incluyendo pero no limitada a CM alquilo, un grupo protector o un grupo funcional terminal. En algunos casos, un PEG utilizado en la invención termina en un extremo con un hidroxi o metoxi, es decir X es H o CH3 ("metoxi PEG"). En forma alterna, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, de esta manera formando un polímero bifuncional. Grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que se emplean comúnmente para reaccionar con los grupos funcionales que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitados a grupos maleimida, carbonatos activados (incluyendo pero no limitados a p-nitrofenil éster) , esteres activados (incluyendo pero no limitados a N- hidroxisuccinimida, p-nitrofenilo éster) y aldehidos) así como grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoácidos comunes pero que reaccionan específicamente con grupos funcionales complementarios presentes en aminoácidos no naturalmente codificados (incluyendo pero no limitados a grupos azida, grupos alquino) . Se nota que el otro extremo de PEG, que se ilustra en la fórmula anterior por Y, se conectará ya sea indirecta o directamente a un polipéptido mediante un aminoácido de origen natural o no naturalmente codificado. Por ejemplo, Y puede ser un enlace amida, carbamato o urea o un grupo amina (incluyendo pero no limitado a la epsilon amina de lisina o el extremo N) del polipéptido. En forma alterna, Y puede ser un enlace maleimida a un grupo tiol (incluyendo pero no limitado al grupo tiol de cisteina) . En forma alterna, Y puede ser un enlace con un residuo que no es accesible comúnmente mediante los 20 aminoácidos comunes. Por ejemplo, un grupo azida en el PEG puede reaccionarse con un grupo alquino en el polipéptido para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2] . En forma alterna, un grupo alquino en el PEG puede reaccionarse con un grupo azida presente en un aminoácido no naturalmente codificado para formar un producto similar. En algunas modalidades, un fuerte nucleófilo (incluyendo pero no limitado a hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) puede reaccionarse con un grupo aldehido o cetona presente en una aminoácido no naturalmente codificado para formar una hidrazona, oxima o semicarbazona, como aplique, como en algunos casos además puede reducirse por tratamiento con un agente reductor apropiado. En forma alterna, el fuerte nucleófilo puede incorporarse en el polipéptido mediante un aminoácido no naturalmente codificado y utilizado para reaccionar preferencialmente con un grupo cetona o aldehido presente en el polímero soluble en agua. Cualquier masa molecular para un PEG puede utilizarse como sea prácticamente conveniente, incluyendo pero no limitado a de aproximadamente 100 Daltons (Da) a 100,000 Da o más según se desea (incluyendo pero no limitado a en ocasiones 0.1-50 kDa o 10-40 kDa) . El peso molecular del polímero puede ser de un amplio intervalo, incluyendo pero no limitado a entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular de PEG puede estar entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a 00,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 50, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 100 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 1, 000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 5,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 10,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. PEGs de cadena ramificada incluyendo pero no limitados a, moléculas de PEG con cada cadena que tiene un MW en el intervalo de 1-100 kDa (incluyendo pero no limitado a 1-50 kDa o 5-20 kDa) también puedan emplearse. El peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada puede estar incluyendo pero no limitado entre aproximadamente 1, 000 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada puede estar aproximadamente entre 1, 000 Da y aproximadamente 100,000 Da incluyendo pero no limitado a 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da3 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da y 1,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de el PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 505000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 5,000 Da y aproximadamente 40,000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena del PEG de cadena ramificada está entre aproximadamente 5,000 Da y aproximadamente 20,000 Da. Un amplio intervalo de moléculas de PEG como se describe en, incluyendo pero no limitado a el catálogo de Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics, incorporados aquí por referencia. En general, al menos un extremo de la molécula PEG está disponible para reacción con el aminoácido no naturalmente codificado. Por ejemplo, derivados PEG que contienen porciones alquino y azida para reacción con cadenas laterales aminoácido, pueden utilizarse para conectar PEG a aminoácidos no naturalmente codificados como se describe aquí. El aminoácido no naturalmente codificado comprende una azida, entonces el PEG típicamente contendrá ya sea una porción alquino para efectuar formación del producto de cicloadición [3+2] o una especie PEG activada (es decir éster, carbonato) que contiene un grupo fosfina para efectuar la formación del enlace amida. En forma alterna, si el aminoácido no naturalmente codificado comprende un alquino, entonces el PEG típicamente contendrá una porción azida para efectuar la formación del producto de cicloadición Huisgen [3+2] . Si el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, el PEG típicamente comprenderá un nucleófilo potente (incluyendo pero no limitado a una funcionalidad hidrazida, hidrazina, hidroxilamina o semicarbazida) a fin de efectuar la formación de los correspondientes enlaces hidrazona, oxima o semicarbazona, respectivamente. En otras alternativas, una inversión de la orientación de los grupos reactivos descritos anteriormente puede utilizarse, es decir una porción azida en el aminoácido no naturalmente codificado puede reaccionarse con un derivado PEG que contiene un alquino. En algunas modalidades, la variante polipéptido con un derivado PEG contiene una funcionalidad química que es reactiva con la funcionalidad química presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. La invención proporciona en algunas modalidades derivados polímero que contienen azida y acetileno que comprende una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da. La estructura principal del polímero de polímero soluble en agua puede ser poli (etilen glicol) . Sin embargo, habrá de entenderse que una amplia variedad de polímeros solubles en agua incluyendo pero no limitados a poli (etilen) glicol y otros polímeros relacionados, incluyendo poli (dextrano) y polipropileno glicol) , también son convenientes para utilizar en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli (etileno glicol) se pretende que abarque e incluye todas estas moléculas. El término PEG incluye pero no está limitado a poli (etilen glicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG bifuncional, PEG de múltiples brazos, PEG derivatizado, PEG en orquilla, PEG ramificado, PEG secundario (es decir PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales secundarios a la estructura principal del polímero), o PEG con enlaces degradables. PEG típicamente es claro, incoloro, inoloro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora y generalmente no es tóxico. Poli (etileno glicol) se considera que es biocompatible, es decir que PEG es capaz de coexistencia con tejidos u organismos vivos sin provocarles daño. Más específicamente, PEG sustancialmente es no inmunogénico, que es decir que el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se conecta una molécula que tiene cierta función conveniente en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune, de manera tal que el organismo pueda tolerar la presencia del agente. Conjugados de PEG tienden a no producir una respuesta inmune sustancial o provocar coagulación u otros efectos indeseables. PEG tiene la fórmula ~ CH2CH20- (CH2CH20) n -- CH2CH2-, en donde n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4000, típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, es adecuada para utilizar en la presente invención. PEG tiene un peso molecular desde aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100, 000 Da en algunas modalidades de la presente invención es particularmente útil como la estructura principal del polímero. El peso molecular de PEG puede ser de un amplio intervalo incluyendo pero no limitado a entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da o más. El peso molecular de PEG puede estar aproximadamente entre 100 Da y aproximadamente 100,000 Da incluyendo pero no limitado a 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da5 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da3 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 100 Da y aproximadamente 50, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre de 100 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 1,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 5,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de PEG esta entre 10,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. La estructura principal de polímero puede ser lineal o ramificada. Estructuras principales de polímero ramificado en general se conocen en la técnica. Típicamente, un polímero ramificado tiene una porción núcleo de ramificación central y una pluralidad de cadenas de polímero lineal enlazadas con el núcleo de ramificación central. PEG comúnmente se emplea en forma ramificadas que pueden prepararse por adición de etilen oxido a diversos polioles, tales como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La porción de ramificación central también puede derivarse de diversos aminoácidos tales como lisina. El poli (etilen glicol) ramificado pueda presentarse en forma general como R(-PEG- 0H)m en donde R se deriva de una porción núcleo tal como glicerol, oligómeros de glicerol, o pentaeritritol y representa el número de brazos. Moléculas de PEG de múltiples brazos tales como aquellas descritas en las Patentes de los E.U.A. Números 5,932,462; 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; Solicitud de Patentes de los E.U.A. Números 2003/0143596; WO 96/21469; y WO 93/21259, cada una de las cuales incorpora aquí por referencia en su totalidad, también puede emplearse como la estructura principal de polímero. PEG ramificado también puede estar en la forma de un PEG en orquilla representado por PEG (-YCHZj ) n, en donde Y es un grupo de enlace y Z es un grupo terminal activado enlazado a CH por una cadena de átomos de longitud definida. Todavía otra forma ramificada, el PEG secundario, tiene grupos reactivos tales como carboxilo, sobre la estructura principal PEG en vez de en el extremo de las cadenas PEG. Además de estas formas de PEG, el polímero también puede prepararse con enlaces débiles o degradables en la estructura principal. Por ejemplo, PEG puede prepararse con enlaces éster en la estructura principal de polímero que están sujetos a hidrólisis. Como se muestra continuación, esta hidrólisis resulta en escisión del polímero en fragmentos de menor peso molecular: -PEG-C02-PEG-+H20 -» PEG-C02H+HO-PEG- Se entiende por aquellos con destreza ordinaria en la técnica que el término polietilen glicol o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en la especialidad incluyendo pero no limitadas aquellas aquí descritas. Muchos otros polímeros también son adecuados para utilizar en la presente invención. En algunas modalidades, estructuras principales de polímero que son solubles en agua con de 2 a aproximadamente 300 extremos, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros convenientes incluyen pero no están limitados a otros poli (alquilen glicol), tales como polipropileno glicol) ("PPG"), sus copolímeros (incluyendo pero no limitados a copolímeros de etilen glicol y propilen glicol) , terpolímeros de los mismos como sus mezclas y semejantes. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura principal de polímero puede variar, típicamente está en intervalo desde aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, a menudo a aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da. El peso molecular de cada cadena de la estructura principal de polímero puede estar entre aproximadamente 100 Da a aproximadamente 100,000 Da, incluyendo pero no limitado a 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6;000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da3 600 Da3 500 Da, 400 Da, 300 Da3 200 Da y 100 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura principal del polímero esta entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 50, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura principal del polímero esta entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura principal del polímero esta entre aproximadamente 1,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura principal del polímero esta entre aproximadamente 5,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. En algunas modalidades, el peso molecular de cada cadena de la estructura principal del polímero esta entre aproximadamente 10,000 Da y aproximadamente 40, 000 Da. Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista anterior para estructuras principales sustancialmente soluble en agua de ninguna manera es exhaustiva y solamente es ilustrativa, y que todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades anteriormente descritas, se contemplan como adecuados para utilizar en la presente invención. En algunas modalidades de la presente invención, los derivados de polímeros son "multifuncionales" , lo que significa que la estructura principal de polímero tiene al menos dos extremos y posiblemente tantos como aproximadamente 300 extremos, funcionalizados o activados con un grupo funcional. Derivados de polímero multifuncionales incluyen pero no están limitados a polímeros lineales que tienen dos extremos, cada extremo está unido a un grupo funcional que puede ser el mismo o diferente. En una modalidad, el derivado polímero tiene estructuras: X- A- POLY- B-N=N=N en donde: N=N=N es la porción azida; B es una porción de enlace que puede estar presente o ausente; POLY es un polímero no antigénico soluble en agua; A es una porción de enlace que puede estar presente o ausente y que puede ser igual que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional . Ejemplos de una porción de enlace para A y B se incluyen pero no están limitados a un grupo alquilo múltiple funcionalizado que contiene hasta 18 y puede contener entre 1 a 10 átomos de carbono. Un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre puede incluirse con la cadena alquilo. La cadena alquilo también puede ser ramificada en un heteroátomo. Otros ejemplos de una porción de enlace para A y B se incluyen pero no están limitados a un grupo arilo de múltiple funcionalizado que contiene hasta 10 y puede contener 5 a 6 átomos carbono. El grupo arilo puede estar sustituido con uno o más átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace convenientes incluyen aquéllos grupos de enlace descritos en las Patentes de los E.U.A. Números 5,932,462; 5,643,575; y la Publicación de Patente de los E.U.A. Número 2003/0143596, cada uno de los cuales incorpora que por referencia. Aquellos con destreza ordinaria la técnica reconocerán que la lista anterior para porciones de enlace de ninguna manera es exhaustiva y solamente es ilustrativa, y que todas las porciones enlace que tienen las cualidades descritas anteriormente se contemplan adecuadas para utilizar en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales convenientes para utilizar como X incluyen pero no están limitados a hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster activo, tales como N-hidroxisuccinimidilo esteres y 1-benzotriazolilo esteres, carbonato activo, tal como N-hidroxisuccinimidilo carbonatos y 1-benzotriazolilo carbonatos, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfon activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epoxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alqueno, cetona y azida. Como se entiende por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, la porción X selecta deberá ser compatible con el grupo azida de manera tal que la reacción con el grupo azida no ocurre. Los derivados de i polímero que contienen azida puede ser homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (es decir X) también es una porción azida, o heterobifuncional lo que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. El término "protegido" se refiera la presencia de un grupo o porción protectora que evita reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fiuorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanóico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser un grupo benzilo o alquilo, tal como metilo, etilo o tert-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la técnica también pueden utilizarse en la presente invención. Ejemplos específicos de grupos funcionales terminales en la literatura incluyen pero no están limitados a N-succinimidilo carbonato (ver por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Números 5,281,698, 5,468,478), amina (ver por ejemplo Buckmann et al. Makromol . Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (ver por ejemplo Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propionato y succinimidil butanoato (ver por ejemplo Olson et al. in Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; ver también la Patente de los E.U.A. Número 5,672,662), succinimidilo succinato (ver por ejemplo , Abuchowski et al. Cáncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984), and Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979)), succinimidilo éster (ver por ejemplo Patente de los E.U.A.

Número 4,670,417), benzotriazol carbonato (ver por ejemplo Patente de los E.U.A. Número 5,650,234), glicidil éter (ver por ejemplo Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (ver por ejemplo Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), p-nitrfenilo carbonato (ver por ejemplo Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (ver por ejemplo Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Patente de los E.U.A. Números 5,824,784, Patente de los E.U.A. Números 5,252,714), maleimida (ver por ejemplo g., Goodson et al., Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil -disulfuro (ver por ejemplo Woghiren, et al. Bioconj . Chem. 4:314(1993)), acriloilo (ver por ejemplo Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)), vinilsulfona (ver por ejemplo Patente de los E.U.A. Número 5,900,461). Todas las referencias y patentes anteriores se incorporan aquí por referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, los derivados polímeros de la invención comprenden una estructura principal polímero que tienen la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20)n -CH2CH2 -N=N=N en donde: X es un grupo funcional como se describe anteriormente; y n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000. En otra modalidad, los derivados polímero de la invención comprenden una estructura principal de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20)n -CH2CH2 - 0-(CH2)m- W-N=N=N en donde: W es una porción enlazadora, alifática o aromática que comprende entre 1-10 átomos de carbono; n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y X es un grupo funcional como se describe anteriormente; m esta entre 1 y 10. Los derivados PEG que contienen azida de la invención pueden ser preparados por una variedad de métodos conocidos en la técnica y/o como se describe aquí. En un método, mostrado continuación, una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, la estructura principal de polímero tiene un primer extremo unido a un primer grupo funcional y un segundo extremo unido a un grupo saliente conveniente, se reacciona con un anión azida (que puede estar apareado con cualquiera de una cantidad de contraiones convenientes, incluyendo sodio, potasio, terbutil amonio y así en adelante) . El grupo saliente se somete a un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por la porción azida, dando por resultado el polímero PEG que contiene azida deseada. X-PEG-L + N3" -> X-PEG- N3 Como se muestra, una estructura principal de polímero conveniente para utilizar en la presente invención tiene la fórmula X-PEG-L, en donde PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo funcional que ni reacciona con grupos acida y L es un grupo saliente conveniente. Ejemplos de grupos funcionales convenientes incluyen, pero no están limitados a, hidroxilo, hidroxilo protegido, acetal, alquenilo, amina, aminooxi, amina protegido, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxilico, ácido carboxilico protegido, maleimida, ditiopiridina y vinilpiridina y cetona. Ejemplos de grupos salientes convenientes incluyen, pero no están limitados a, cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato y tosilato. En otro método para la preparación de derivados polímero que contiene acida de la presente invención, una agente de enlace que contiene una funcionalidad acida se pone en contacto con una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, en donde el agente de enlace contiene una funcionalidad química que reaccionara selectivamente con una funcionalidad química en el polímero PEG, para formar un producto derivado de polímero que contiene acida en donde la acida se separa de la estructura de polímero principal por un grupo de enlace. Un esquema de reacción ejemplar se muestra a continuación : X-PEG-M + N-enlazador-N=N=N -» PG-X-PEG-enlazador-N=N=N en donde: PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo de terminación extremo tal como un grupo alcoxi o funcional como se describe anteriormente ; y M es un grupo funcional que no es reactivo con la funcionalidad acida pero que reaccionará en forma eficiente y selectiva con el grupo funcional N. Ejemplos de grupos funcionales convenientes incluyen, pero no están limitados a, M es un ácido carboxilico, carbonato o éster activo si N es una amina; M es una cetona si N es una porción hidrazida o aminooxy; M es un grupo saliente si N es un núcleofilo. La purificación del producto crudo pude lograrse por métodos conocidos incluyendo, pero no limitados a, precipitación del producto seguido por cromatografía, de ser necesarios . Un ejemplo más específico se muestra a continuación en el caso de PEG diamina, en donde una de las aminas se protege por una porción de grupo protector tal como ter-butil -Boc y la PEG diamina mono-protegida resultantes se reacciona con una porción de enlace que contiene la funcionalidad acida: BOcHN-PEG-NH2 + H02C- (CH2) 3-N=N=N En este caso, el grupo amina puede acoplarse al grupo de ácido carboxílico utilizando una variedad de agentes de activación tales como los reactivos cloruro de tionilo o carbodiimida y N-hidroxisucinimida o N-hidroxibenzotriazol para crear un enlace amida entre el derivado PEG monoamina y la porción enlazadora que contiene acida. Después de formación exitosa del enlace amida, el derivado que contiene acida N-ter-butil-Boc-protegido resultante puede utilizarse directamente para modificar moléculas bioactivas o además puede elaborarse para instalar otros grupos funcionales útiles. Por ejemplo, el grupo N-t-Boc puede hidrolizarse por tratamiento con ácido fuerte para generar una omega-amino-PEG-ácida. La amina resultante puede utilizarse como un asa sintética para instalar otra funcionalidad útil tal como grupos maleimida, disulfuros activados, esteres activados y así en adelante para la creación de reactivos heterobifuncionales valiosos. Derivados heterobifuncionales son particularmente útiles cuando se desea conectar diferentes moléculas a cada extremo del polímero. Por ejemplo, el omega-N-amino-N-ácida PEG permitirá el tratamiento de una molécula que tiene un grupo electrofilico activado, tal como un aldehido, cetona, éster activado, carbonato activado y así en adelante, a un extremo del PEG y una molécula que tiene un grupo acetileno con el otro extremo del PEG. En otra modalidad de la invención, el derivado de polímero tiene la estructura: X-A - POLY- B- C=C-R en donde : R puede ya ser H o un grupo alquilo, alqueno, alquioxi, o arilo o arilo substituido; B es una porción de enlace, que puede estar presente o ausente; POLI es un polímero no antigénico soluble en agua; A es una porción de enlace, que puede estar presente o ausente y que puede ser igual que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional . Ejemplos de una porción de enlace para A y B incluyen, pero no esta limitado a, un grupo alquilo de múltiples funcionalidades que contiene hasta 18, y puede contener entre 1-10 átomos de carbono. Un heteroátomo tal como nitrógeno, oxigeno o azufre puede incluirse con la cadena alquilo. La cadena alquilo también puede estar ramificada en un heteroátomo. Otros ejemplos de una porción de un enlace para A y B incluyen, pero no esta limitados a, un grupo arilo de múltiples funcionalidades que contienen hasta 10, y puede contener entre 5-6 átomos de carbono. El grupo arilo puede estar substituido con uno o más átomos de carbono, nitrógeno, oxigeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace convenientes incluyen aquellos grupos de enlace descritos en las Patentes de los E.U.A. Números 5,932,462 y 5,643,575 y la Publicación de patente de los E.U.A. número 2003/0143596, cada uno de los cuales se incorpora aquí por referencia. Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista anterior para porciones de enlace de ninguna manera es exhaustiva y se pretende solamente ilustrativa, y que una amplia variedad de porciones de enlace que tiene las calidades descritas anteriormente se contemplan como útiles en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales convenientes para utilizar como X incluyen, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster activo, tales como N-hidroxisucinimidol esteres y 1-benzotriazolil esteres, carbonato activo, tales como N-hidroxisucinimidil carbonatos y 1-benzotriazolil carbonatos, acetal, aldehido, hidratos aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sullfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epoxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, y tresilato, alqueno, cetona, y acetileno. Como se entenderá, la porción X selecta deberá ser combatible con el grupo acetileno de manera tal que la reacción con el grupo acetileno no ocurre. Los derivados de polímero que contiene acetileno pueden ser homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (es decir, X) es también una porción acetileno, o heterobifuncional que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. En otra modalidad de la presente invención, los derivados de polímero comprenden una estructura principal de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20)n -C22C22-0- (C22mm-C=CH en donde : X es un grupo funcional como se describe anteriormente ; n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y m esta entre 1 y 10. Ejemplos específicos de cada uno de los polímeros PEG heterobifuncionales se muestran a continuación. Los derivados PEG que contienen acetileno de la invención pueden prepararse utilizando métodos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad y/o como se describe aquí. En un método, una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio desde aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, de estructura principal de polímero tiene un primer extremo unido a un primer grupo funcional y un segundo extremo unido a un grupo núcleofilico conveniente, se reacciona con un compuesto que contiene tanto una funcionalidad acetileno como un grupo saliente que es adecuado para reacción cuando el grupo núcleofilico en el PEG. Cuando el polímero PEG que contiene la porción núcleofilica y la molécula que contiene el grupo saliente se combinan, el grupo saliente se somete a un desplazamiento núcleofilico y es reemplazado por la porción núcleofilica, dando por resultado el polímero que contiene acetileno deseado. X-PEG-Nu + L-A-C -> X-PEG-Nu- A-C=CR' Como se muestra, una estructura principal de polímero preferida para utilizar en la reacción tiene la fórmula X-PEG-Nu, en donde PEG es poli (etilen glicol), Nu es una porción núcleofilica y X es un grupo funcional que no reacciona con Nu, L o la funcionalidad acetileno. Ejemplos de Nu incluye, pero no esta limitado a, grupo amina, alcoxi, ariloxi, sulfhidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, aminoxi que reaccionarán primordialmente mediante un mecanismo tipo SN2. Ejemplos adicionales de grupos Nu incluyen aquellos grupos funcionales que reacciones primordialmente mediante una reacción de adición núcleofilica. Ejemplos de grupos L incluyen grupos cloruro, bromuro, yoduro, mesilato, tresilato, y tosilato que se esperan someterse a desplazamiento núcleofilico así como cetonas, aldehidos, tioésteres, olefinas, grupos carbonilo alfa-beta insaturados, carbonatos y otros grupos electrofilicos que se esperan someterse a adición por núcleofilos . En otra modalidad de la presente invención, A es un enlazador alifático de entre 1-10 átomos de carbono o un anillo arilo substituido de entre 6-14 átomos de carbono, X es un grupo funcional que no reacciona con grupos acida y L es un grupo saliente conveniente. En otro método para preparación de los derivados polímero que contienen acetileno de la presente invención, un polímero PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, que contiene ya sea un grupo funcional protegido o un agente de terminación de extremo y un grupo saliente conveniente en el otro extremo se pone en contacto por un anión acetileno. Un esquema de reacción ejemplar se muestra a continuación: X-PEG-L + -C=CR' -> X-PEG=CsCR' en donde : PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo de terminación de extremo tal como un grupo alcoxi o uno funcional como se describe anteriormente; y R' ya es H, un grupo alquilo, alcoxi, arilo o ariloxi o un grupo alquilo, alcoxilo, arilo o ariloxi substituido. En el ejemplo anterior, el grupo saliente L deberá ser suficientemente reactivo para someterse a desplazamiento tipo SN2 cuando se contacta en una concentración suficiente del anión acetileno. Las condiciones de reacción requeridas para lograr desplazamiento SN2 de grupos salientes por aniones acetilenos se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Purificación de producto crudo usualmente pude lograrse por métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, precipitación del producto seguido por cromatografía, de ser necesaria. Polímeros solubles en agua pueden enlazarse a los polipéptidos de la invención. Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse mediante un aminoácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido o cualquier grupo funcional o substituyente de un aminoácido no naturalmente codificado o naturalmente codificado, o cualquier grupo funcional o substituyente agregado a un aminoácido no naturalmente codificado o naturalmente codificado. En forma alterna, los polímeros solubles en agua se enlazan a un polipéptido que incorpora un aminoácido no naturalmente codificado mediante un aminoácido de origen natural (incluyendo pero no limitados a cisterna, lisina o el grupo amina del residuo N-termianl) . En algunos casos, los polipéptidos de la invención comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más de 10 aminoácidos no naturales, en donde uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se enlazan con uno o varios polímeros solubles en agua (incluyendo pero no limitados a, PEG y/u oligosacáridos) . En algunos casos, los polipéptidos de la invención además comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más de 10 aminoácidos naturalmente codificados enlazados a polímeros solubles en agua. En algunos casos, los polipéptidos de la invención comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificados enlazados a polímeros solubles en agua y uno o más aminoácidos de origen natural enlazados a polímeros solubles en agua. En algunas modalidades, los polímeros solubles en agua empleados en la presente invención mejoran la vida media en suero del polipéptido respecto a la forma no conjugada. El número de polímeros solubles en agua enlazados a un polipéptido (es decir, la extensión de modificación con PEG o glicosilación) de la presente invención puede ajustarse para proporcionar una característica farmacológica, farmacocinética o farmacodinámica alterada (incluyendo pero no limitada a, incrementada o disminuida) tal como la vida media in vivo . Derivados PEG que contienen un fuerte grupo núcleofilico (es decir, hidrazida, hidrazina, hidro xilaniina o semicarbazida) En una modalidad de la presente invención, un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo se modifica con un derivado PEG que contiene una porción terminal hidracina, hidroxilamina, hidracida o semicarbazida que se enlaza directamente con la estructura principal PEG.

En algunas modalidades, el derivado PEG hidroxilamina terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-0-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (es decir, peso molecular promedio está entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, el derivado PEG que contiene hidrazina- o hidracida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2VX-NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n 100-13000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) gue puede estar presente o ausente. En algunas modalidades, el derivado PEG que contiene semicarbazida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n -0- (CH2)m-NH-C(0) -NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la presente invención, un polipéptido comprende un aminoácido que contiene carbonilo se modifica con un derivado PEG que contiene una porción terminal hidroxilamina, hidracida, hidracina o semicarbazida que se enlaza a la estructura principal PEG medinate un enlace amida. En algunas modalidades, los derivados PEG hidroxilamina terminales tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) m-0-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (es decir, peso molecular promedio esta entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen hidracina- o hidracida tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n -0-(CH2)2-NH-C(0) (CH2) m-X-NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede esta presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen semicarbazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad, de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene carbonilo se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene una porción terminal hidrazina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida con cada cadena del PEG ramificado que tiene un MW en el intervalo de 10-40kDa y puede ser de 5-20 kDa. En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado, se modifica con un derivado PEG que tiene una estructura ramificada. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG hidrazida- o hidrazina-terminal tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20)n-O- (CH2)2-NH-C(0) ] 2CH (CH2) m-X-NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede estar presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen un grupo semicarbazida tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20)n-O- (CH2)2-C(0) -NH-CH2 -CH2] 2CH-X- (CH2)m-NH-C(O) -NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, 0, S, C (0) o no está presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen un grupo hidroxilamina tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-C (0) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2 ) m-0-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), X es opcionalmente NH, 05, S, C (0) o no está presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. El grado y sitios en los cuales el o los polímeros solubles en agua se enlazan al polipéptido hGH, pueden modular el enlace del polipéptido hGH al receptor de polipéptido hGH en el sitio 1. En algunas modalidades, la invención proporciona un polipéptido, por ejemplo hGH, que se enlaza a cuando menos un PEG por un enlace oxima, en donde el PEG es utilizado en la reacción para formar el enlace oxima es un hidrocloruro de monometoxi-poli (etileno glicol) -2-aminooxi etilamina carbamato de 30 kDa lineal. A manera de ejemplo solamente y no como una limitación, en los tipos o clases de reactivos de PEG que pueden emplearse con las composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí descritas. Ejemplos adicionales de polímeros solubles en agua, por ejemplo PEGs, útiles en la invención, por ejemplo PEG modificado capaz de formar un enlace oxima, puede encontrarse en las Solicitudes de Patentes de los E.U.A. Números 60/638,418; 60/638,527; y 60/639,195, con título "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides," presentada en diciembre 22, 2004, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. También se describen en las Solicitudes de Patentes de los E.U.A. Números 60/696,210; 60/696,302; y 60/696,068, un título "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides," presentadas en julio 1, 2005, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. El grado y sitios en los cuales el o los polímeros solubles en agua se enlazan a la GH, por ejemplo polipéptido hGH, pueden modular el enlace de GH, por ejemplo hGH polipéptido a la GH, por ejemplo receptor de polipéptido hGH en el sitio 1. En algunas modalidades, los enlaces se disponen de manera tal que la GH, por ejemplo hGH polipéptido liga a la GH, por ejemplo receptor hGH polipéptido en el sitio 1 con una Kd de aproximadamente 400 nM o menor, con una Kd IQ de 150 nM o menor, y en algunos casos una Kd de 100 nM o menor, como se mide por un ensayo de enlace en equilibrio, tal como lo descrito en Spencer et al, J. Biol, Chem., 263:7862-7867 (1988) for GH, e.g., hGH. Métodos y química para activación de polímeros así como para conjugación de péptidos se describen en la literatura y se conocen en la especialidad.- Métodos comúnmente empleados para activación de polímeros incluyen pero no están limitados a activación de grupos funcionales con bromuro de cianógeno, peryodato, glutaraldehído, biepoxidos, epiclorhidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haludo de sulfonilo, triclorotriazina, etc. (ver, R. F. Taylor, (1991) , PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.; Dunn, R. L., et al, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991) . Varias revisiones y monografías de la funcionalización y conjugación de PEG están disponibles, ver por ejemplo Harris, Macromol. Chem. Phys . C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in En?ymology 135: 30-65 (1987); Wong et al, Enzyme Microb. Technol . 14: 866-874 (1992); Delgado et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995) . Métodos para activación de polímeros también pueden encontrarse en WO 94/17039, Patente de los E.U.A. Número 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, Patente de los E.U.A. Número 5,219,564, Patente de los E.U.A. Número 5,122,614, WO 90/13540, Patente de los E.U.A. Número 5,281,698, y WO 93/15189, y para conjugación entre polímeros activados y enzimas incluyendo pero no limitados a Factor de Coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09027) , molécula de transporte de oxígeno (Patente de los E.U.A. Número 4,412,989), ribonucleasa y superoxido dismutasa (Veronese at al, App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia . Modificación con PEG (es decir adición de cualquier polímero soluble en agua) de polipéptidos que contienen un aminoácido no naturalmente codificado, tal como p-azido-L-fenilalanina, se lleva a cabo por cualquier método conveniente. Por ejemplo, polipéptido se modifica con PEG con un derivado mPEG terminado en alquino. Brevemente, un exceso de mPEG(5000) -0-CH2-CsCH sólido se agrega, con agitación a una solución acuosa de polipéptido que contiene p-azido-L-Phe a temperatura ambiente. Típicamente, la solución acuosa se amortigua con un amortiguador que tiene un pKa cercano al pH al cual la reacción se va a llevar acabo (en general aproximadamente pH 4-10) . Ejemplos de amortiguadores convenientes para modificación con PEG a pH 7.5, por ejemplo, incluyen pero no están limitados a, HEPES, fosfato, borato, TRIS-HC1, EPPS, y TES. El pH se supervisa y ajusta continuamente, de ser necesario. La reacción típicamente se deja que continúe por entre aproximadamente 1-48 horas. Los productos de reacción subsecuentemente se someten a cromatografía de interacción hidrofóbica para separar las variantes polipéptido modificadas con PEG del mPEG(5000) -O-CH2- C=CH y cualesquiera complejos de alto peso molecular del polipéptido modificado con PEG, que puede formar cuando PEG sin bloquear se activa en ambos extremos de la molécula, de esta manera entrelazando moléculas variantes de polipéptido. Las condiciones durante la cromatografía de interacción hidrofóbica son tales que la mPEG (5000) -0-CH2-C=CH libre fluye a través de la columna, mientras que cualesquiera complejos variantes de polipéptido modificados con PEG entrelazados eluyen después de que las formas deseadas, que contienen una molécula variante polipéptido conjugada con uno o más grupos PEG. Condiciones convenientes varían dependiendo del tamaño relativo de los complejos entrelazados contra los conjugados deseados y se determina fácilmente por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. El eluyente que contiene los conjugados deseados se concentra por ultrafiltración y desalifica por diafiltración. De ser necesario el polipéptido modificado con PEG obtenido de la cromatografía hidrofóbica puede purificarse además por uno o más procedimientos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, incluyendo pero no limitados a cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de aniones o cationes (utilizando, incluyendo pero no limitado a DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC de fase inversa; filtración en gel (utilizando, incluyendo pero no limitado a SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía con exclusión de tamaño, cromatografía de quelato de metal ultrafiltracón/diafiltración; precipitación de etanol precipitación de sulfato de amonio; cromatoenfoque cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo pero no limitados a enfoque isoléctrico) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitado a precipitación de sulfato de amonio) , o extracción. Peso molecular aparente puede estimarse por GPC por comparación con normas de proteínas globulares (Preneta, AZ in PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293- 306). La pureza del conjugado polipéptido-PEG puede estimarse por degradación proteolítica (incluyendo pero no limitado a escisión de tripsina) seguido por análisis de espectrometría de masas. Pepinsky RB., et al, J. Pharmcol . & Exp. Ther. 297(3): 1059-66 (2001) . Modificación con PEG (es decir adición de cualquier polímero soluble en agua) de polipéptidos que contienen un aminoácido no naturalmente codificado contiene un grupo carbonilo, por ejemplo tal como p-acetil-L-fenilalanina, también se lleva cabo por cualquier método conveniente. Como un ejemplo no exclusivo, un polipéptido que contiene un aminoácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo, por ejemplo p-acetil-L-fenilalanina, se modifica con PEG con un derivado mPEG de aminooxi etilamina carbamato de MW de aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. Brevemente, un exceso de PEG-oxiamina sólido por ejemplo mPEG (30 , 000) -O-CO-NH- (CH2) 2-ONH3+ (un hidrocloruro de monometoxi-poli (etilen glicol) -2 -aminooxi etilamina carbamato de 30kDa lineal, MPEG-oxiamina 30K) se agrega, con agitación a una solución acuosa de polipéptido que contiene p-acetil-L-fenilalanina a temperatura ambiente. La proporción molar de PEG: polipéptido, por ejemplo hGH puede ser aproximadamente 2-15, o aproximadamente 5-10, o aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Típicamente, la solución acuosa de un se amortigua con un amortiguador que tiene un pKa cerca del pH en el cual se va llevar a cabo la reacción (en general aproximadamente pH 2-8) . Y de un amortiguador conveniente para modificación con PEG a pH 4.0, por ejemplo incluye pero no esta limitado a amortiguador acetato de sodio/glicina ajustado a pH 4.0 por adición de ácido acético. La reacción típicamente se deja que continúe por entre aproximadamente 1-60 horas o aproximadamente 10-50 horas o aproximadamente 18-48 horas o aproximadamente 39-50 horas a temperatura ambiente con ligera agitación. Modificación con PEG puede confirmarse por gel de SDS. Los productos de reacción se someten subsecuentemente a purificación por ejemplo de MPEG-oxiamina de 30 K libre y cualesquiera complejos de alto peso molecular del polipéptido modificado con PEG que puedan formarse cuando PEG sin bloquear se activa en ambos extremos la molécula, de esta manera entrelazando moléculas variantes de polipéptido. Cualquier método de purificación conveniente puede utilizarse, por ejemplo cromatografía en columna tal como columna SourceQ que se corre con amortiguador A SourceQ y amortiguador B SourceQ. La mezcla de reacción puede diluirse con base TRIS y amortiguador SourceQ A y agua MilliQ antes de cargar en la columna. El eluyente que contiene los conjugados deseados además puede concentrase por ultrafiltración y desalificarse por diafiltración. De ser necesario, el polipéptido modificado con PEG obtenido de la cromatografía puede purificarse adicionalmente por uno o más procedimientos conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad y aquí descritos (ver por ejemplo anteriormente) . El polipéptido modificado con PEG final puede ser obtenido a una pureza mayor que 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 99.9 o 99.99%. La pureza puede determinarse por métodos conocidos en la especialidad. Métodos no limitantes ejemplares para estimar la pureza incluyen SDS-PAGE, medir polipéptido utilizando ensayos de ELISA y transferencia Western, ensayo Bradford, espectrometría de masas (incluyendo pero no limitado a MALDI-TOF) , métodos HPLC tales como RP HPLC, HPLC de intercambio de cationes y HPLC de filtración de gel y otros métodos para caracterizar proteínas que se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Un polímero soluble en agua enlazado a un aminoácido de un polipéptido de la invención además puede derivatizarse o sustituirse sin limitación. Derivados PEG que contienen azida En otra modalidad de la invención, se modifica un polipéptido con un derivado PEG que contiene una porción azida que reaccionará con una porción alquino presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. En general, los derivados PEG tendrán un peso molecular promedio en el intervalo de 1-100 kDa y en algunas modalidades de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado PEG azida terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2VN3 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (es decir peso molecular promedio esta entre aproximadamente 5-40 kDa) . En otra modalidad, el derivado PEG azida terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n -0-(CH2)m-NH-C(0)- (CH2)p-N3 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000 (es decir peso molecular promedio esta entre aproximadamente 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene alquino se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene una porción azida terminal, con cada cadena del PEG ramificado que tiene un MW en el intervalo de 10-40 kDa y puede ser de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG azida terminal tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2) m-X- (CH2) pN3 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un grupo O, "N, S O carbonilo (C=0) , en cada caso que puede estar presente o ausente. Derivados PEG que contienen alquino En otra modalidad de la invención, se modifica un polipéptido con un derivado PEG que contiene una porción alquino que reaccionará con una porción azida presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el derivado PEG alquino terminal tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) m-C=CH en donde en R es un simple en alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (es decir peso molecular promedio está entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene alquino se modifica con un derivado PEG que contiene una porción terminal azida o terminal alquino que se liga a la estructura principal PEG mediante un enlace amida. En algunas modalidades, el derivado PEG alquino terminal tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20)n -O- (CH2)m-NH-C(0) - (CH2)p-CHCH en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido que contiene azida se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene una porción alquino terminal, con cada cadena del PEG ramificado que tiene un MW en el intervalo de 10-40 kDa y puede ser de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG alquino terminal tendrá la siguiente estructura: [RO-(CH2CH2 0)n-0- (CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)tp-X-(CH2)p CsCH en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un grupo O, "N, S o carbonilo (C=0) , o no está presente. Derivados PEG que contienen fosfino En otra modalidad de la invención, un polipéptido se modifica con un derivado PEG que contiene un grupo funcional activa (incluyendo pero no limitado a éster, carbonato) que además comprende un grupo aril fosina que reaccionará con una porción azida presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. En general, los derivados PEG tendrán un peso molecular promedio en el intervalo de 1-100 kDa y en algunas modalidades de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado PEG tendrá la estructura : En donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no está presente, Ph es fenilo y W es un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el derivado PEG tendrá la estructura: En donde X puede ser O, N, S o no está presente, Ph es fenilo y W es un polímero soluble en agua, y R puede ser grupos H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido. Grupos R ejemplares incluyen pero están limitados a -CH2, -C(CH3) 3, -OR', -NR5R" , -SR', -halógeno, -C(0)R', -CONR'R", -S(0)2R', - S(0)2NRxR", -CN y -N02. R', R", R '" y R" " cada uno independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, incluyendo pero no limitado a arilo sustituido con 1-3 halógenos, grupos alquilo aloxi o tioaloxi sustituido o sin sustituir, o grupos arilalquilo sustituido o sin sustiruir. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo cada uno de los grupos R se elije independientemente como son cada uno de los grupos R', R" , R'H y R» » cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se conectan al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6-, o 7- miembros. Por ejemplo -NR'R" se entiende que incluya pero no está limitado a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. De la discusión de sustituyentes anterior, una persona con destreza en la especialidad comprenderá que el término "alquilo" se entiende que incluye grupos que incluyen átomos de carbono ligados grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero no limitados a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitados a, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (0) CH2OCH3, y semejantes) . Otros derivados PEG y técnicas de modificación con PEG generales . Otras moléculas PEG ejemplares que pueden ligarse a GH, por ejemplo hGH polipéptidos, así como métodos de modificación con PEG incluyen aquellos descritos en por ejemplo las publicaciones de Patentes de los E.U.A. Números 2004/0001838 2002/0052009 2003/0162949 2004/0013637 2003/0228274 2003/0220447 2003/0158333 2003/0143596 2003/0114647 2003/0105275 2003/0105224 2003/0023023 2002/0156047 2002/0099133 2002/0086939 2002/0082345 2002/0072573 2002/0052430 2002/0040076 2002/0037949 2002/0002250 2001/0056171 2001/0044526 2001/0021763 Patentes de los E.U.A. Números 6,646,110; 5,824,778 ,476,653 5,219,564; 5,629,384; 5,736,625; 4,902,502 5,281,698 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657 6,552,167 6,610,281; 6,515,100; 6,461 ,603; 6,436,386 6,214,966 5,990,237; 5,900,461; 5,739,208; 5,672,662 5,446,090 5,808,096; 5,612,460; 5,324,844; 5,252,714 6,420,339 6,201,072; 6,451,346; 6,306,821; 5,559,213 5,747,646 5,834,594; 5,849,860; 5,980,948; 6,004,573 6,129,912 WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316, que se incorporan aquí por referencia. Cualquiera de las moléculas PEG aquí descritas puedan emplearse en cualquier forma, incluyendo pero no limitadas a de cadena sencilla, de cadena ramificada, cadena de múltiples brazos, funcional sencilla, bi- funcional, multifuncional, o cualquier combinación de las mismas. Mejorar afinidad para albúmina de fuego Diversas moléculas también pueden fucionarse a los polipéptido de la invención para modular la vida media de polipéptidos en suero. En algunas modalidades, las moléculas se enlazar o funcionan a polipéptidos de la invención para mejorar afinidad para albúmina de suero endógena en un animal . Por ejemplo, en algunos casos, una fusión recombinante de un polipéptido y una secuencia de enlace de albúmina se elabora. Secuencia de enlace de albúmina ejemplares incluyen pero no esa limitadas al dominio de elace de albúmina de la proteína G de estreptococos (ver por ejemplo, Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) y Sjolander et al, J, Immunol . Methods 201:1 15-123 (1997) ) , o polipéptidos de enlace de albúmina tales como aquellos descritos en e.g., Dennis, et al, J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) . En otras modalidades, los polipéptidos de la presente invención se asilan con ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos grasos promueven enlace con albúmina de suero, Ver por ejemplo Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995) . En otras modalidades, los polipéptidos de la invención se fusionan directamente con albúmina de suero (incluyendo pero no limitadas a albúmina de suero humano) .

Aquellos con destreza en la especialidad de reconocerán que una amplia variedad de otras moléculas también puede enlazarse en la presente invención para modular enlace a albúmina de suero hubo otros componentes de suero. X. Glicosilación de Polipéptidos La invención incluye polipéptidos que incorporan uno o más aminoácidos no naturalmente codificados que contienen residuos sacáridos. Los residuos sacárido ya pueden ser naturales (incluyendo pero no limitados a N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo pero no limitados a 3- fluorogalactose) . Los sacáridos pueden estar enlazados a los aminoácidos no naturalmente codificados ya sea por un enlace glicosidico a N- u 0- enlazado (incluyendo pero no limitado a N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace no natural (incluyendo pero no limitado a una oxima o el glicosido C- o S- enlazado correspondiente) . Las porciones sacárido (incluyendo pero no limitadas a glicosila) pueden agregarse a polipéptidos ya sea in vivo o in vi tro . En algunas modalidades de la invención, un polipéptido comprende un aminoácido no naturalmente codificados que contienen carbonilo se modifica con un sacárido derivatizado con un grupo aminooxi para generar el polipéptido glicosilado correspondiente enlazado por un enlace oxima. Una vez conectado al aminoácidos no naturalmente codificados, el sacárido puede ser además elaborado por tratamiento con glicosiltransferasas y otras enzimas para generar un oligosacarido ligado al polipéptido Ver por ejemplo H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702- 1703 (2003) . En algunas modalidades de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contienen carbonilo, se modifica directamente con un glicano con estructura definida preparada como un derivado aminooxi. Una persona con destreza ordinaria en la especialidad reconocerá las otras funcionalidades, incluyendo azida, alquino, hidrazida, hidrazina, y semicarbazida, puedan emplearse para enlazar el sacárido con el aminoácido no naturalmente codificados. En algunas modalidades de la invención, un polipéptido que comprende un aminoácido que no está naturalmente codificado que contiene azida o alquinilo, puede entonces modificarse incluyendo pero no limitado a una reacción de ciclo de adición Huisgen [3+2] con, incluyendo pero no limitado a derivados alquinilo o azida, respectivamente. Este método permite que se modifiquen proteínas con selectividad extremadamente alta. XI. Dímeros y Multímeros Polipéptido. La presente invención también proporciona combinaciones polipéptido (incluyendo pero no limitadas a miembros de la familia súpergenes GH, por ejemplo, GH, hGH y análogos hGH) tales como homodímeros, heterodímeros, homomultí eros, o heteromultímeros (es decir, trímeros, tetrámeros, etc.) en donde un polipéptido que contiene uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se liga a otro polipéptido o su variante, ya sea en forma directa a la estructura principal polipéptido o mediante un enlazador. Debido a su incrementado peso molecular en comparación con monómeros, los conjugados dímero o multímero polipéptido pueden exhibir propiedades nuevas o deseables, incluyendo pero no limitados a diferentes farmacológicas, farmacocieticas, farmacodinamicas de vida media terapéutica modulada o vida media en plasma modulada respecto al polipéptido monomérico. En algunas modalidades, los dímeros polipéptidos de la invención modularán a la dimrización del receptor polipéptido. En otras modalidades, los dímeros o multímeros polipéptido de la presente invención actuarán como un antagonista, agonista o moduladador del receptor polipéptido. En algunas modalidades, uno o más de GH, por ejemplo moléculas hGH presentes en una GH por ejemplo Hgh que contienen dímero o multímero comprende un aminoácido no naturalmente codificados enlazado a un polipéptido soluble en agua que está presente dentro de la región de enlace de Sitio II. Como tal, cada una de la GH, por ejemplo moléculas hGH del dímero o multímero son accesibles para enlace a la GH por ejemplo receptor de polipéptido hGH mediante la interfase del Sitio I pero no están disponibles para enlace a una segunda GH, por ejemplo receptor de polipéptido hGH mediante la interfase de Sitio II. De esta manera, la GH, por ejemplo dímero o multímero polipéptido hGH puede acoplar a los sitios de enlace de Sitio I de cada una de dos GH distintas, por ejemplo receptor desde polipéptido hGH, pero como la GH, por ejemplo moléculas hGH tienen un polímero soluble en agua conectado a un aminoácido no genéticamente codificado presente en la región de sitio II, la GH, por ejemplo receptor de polipéptido hGH no pueden acoplar la región de sitio II de la GH, por ejemplo ligando de polipéptido Hgh y el dímero o multímero actúa como una GH, por ejemplo antagonista de polipéptido hGH. En algunas modalidades, una o más de las GH, o por ejemplo moléculas hGH presentes en una GH por ejemplo polipéptido hGH que contiene dímero o multímero comprende un aminoácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente dentro de la región de enlace de Sitio I, permitiendo enlace a la región de Sitio II. En forma alterna, en algunas modalidades, una o más de las GH, o por ejemplo moléculas hGH presentes en una GH por ejemplo polipéptido hGH que contiene dímero o multímero comprende un aminoácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua que está presente en un sitio que no está dentro de la región de enlace de Sitio I o Sitio II de manera tal que ambos estén disponibles para enlace. En algunas modalidades, una combinación de GH, por ejemplo moléculas hGH se utiliza que tiene Sitio I, Sitio II o ambos disponibles para enlace. Una combinación de GH, por ejemplo moléculas hGH en donde al menos uno tiene Sitio I disponible para enlace, y al menos uno tiene Sitio II disponible para enlace puedan proporcionar moléculas que tienen una actividad o propiedad deseada. Además, una combinación de GH, por ejemplo moléculas hGH que tienen tanto Sitio I como Sitio II disponibles para enlace puedan producir una GH súper agonista, por ejemplo molécula hGH. En algunas modalidades, los polipéptido se enlazan directamente, incluyendo pero no limitados a mediante un enlace Asn-Lys amida o enlace Cys-Cys disulfuro. En algunas modalidades, los polipéptido enlazados comprenderán diferentes aminoácidos no naturalmente codificados para facilitar la dimeización, incluyendo pero no limitados a un alquino en un aminoácido no naturalmente codificados de un primer polipéptido y una azida en un segundo aminoácido no naturalmente codificados de un segundo polipéptido se conjugará mediante una cicloadición Huisgen [3+2] . En forma alterna un primer polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene cetona, puede ser conjugado a un segundo polipéptido que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene hidrroxilamina y los polipéptidos se reaccionan mediante formación de la oxima correspondiente.

En forma alterna, los dos polipéptidos se unen por un enlazado. Cualquier enlazado hetero- u homo- bifuncional puede utilizarse para enlazar los polipéptidos, que pueden tener la misma o diferente secuencia primaria. En algunos casos, el enlazado empleado para conectar los polipéptidos en conjunto puede ser un reactivo PEG bifuncional. El enlazado puede tener un amplio intervalo de peso molecular o longitud molecular. Enlazadores de peso molecular más grande o más pequeño puedan utilizarse para proporcionar una relación o conformación espacial deseada entre los polipéptidos o entre uno de los polipéptidos y su socio de enlace o receptor, o entre la entidad enlazada y el receptor o socio de enlace para el polipéptido. Enlazadores que tienen más larga o más corta longitud molecular también puedan emplearse para proporcionar un espacio deseado con flexibilidad entre los polipéptidos, o un polipéptido y su receptor, o entre la entidad enlazada y el polipéptido. Similarmente, un enlazador que tienen una forma o conformación particular, puede utilizarse para impartir una conformación o forma particular a los polipéptidos o la entidad enlazada ya sea antes o después de que el polipéptido alcanza su objetivo. Esta optimización de la relación espacial entre un polipéptido y la entidad enlazado puede proporcionar propiedades nuevas moduladas o deseadas a la molécula. En algunas modalidades, la invención proporciona enlazadores bifuncionales solubles en agua que tienen una estructura de pesa que incluyen: a) una porción azida, alquino, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, o que contiene carbonilo en al menos un primer extremo de una estructura principal el polímero; y b) al menos un segundo grupo funcional en un segundo extremo de la estructura principal de polímero. El segundo grupo funcional puede ser el mismo o diferente que primer grupo funcional. El segundo grupo funcional en algunas modalidades no es reactivo con el primer grupo funcional . La invención proporciona en algunas modalidades, compuestos solubles en agua que comprenden al menos un brazo de una estructura molecular ramificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramificada puede ser dendrítica. En algunas modalidades, la invención proporciona multímeros que comprenden uno o más polipéptidos formados por reacciones con polímero activado solubles en agua que tienen la estructura: R- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-X en donde n es de aproximadamente 5 a 3,000, m es 2- 10, X puede ser un grupo azida, alquino, hidrazina, hidrazida, un aminooxi, una porción hidroxilamina, un acetilo, o que contiene carbonilo, y R es un grupo de terminación de extremo, su grupo funcional, o un grupo saliente que puede ser igual o diferente que X. R puede ser, por ejemplo, un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, aloxilo, N-hidroxisuccinimidilo ester, 1-benzotriazolilo ester, N-hidroxisuccinimidilo carbonato, 1 -benzotriazolilo carbonato, acetao aldehido, aldehido hidratos, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amino protegido, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxilico, ácido carboxilico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epoxido, glioxales, dionos, mesilatos, tosilatos, y tresilato, alqueno, y cetona. XII. Medición de Formación de Anticuerpo con Polipéptidos y Prueba Preclínica para Inmunogenicidad. Ensayos para medir y estimar la formación de anticuerpo incluyen pero no están limitados a bioensayos y ensayos de enlace. Los bioensyos incluyen pero no están limitados a ensayos que utiliza suero de sujetos animales o pacientes para detectar anticuerpos neutralizantes. La capacidad del suero para neutralizar la actividad biológica de la molécula exógena se mide. Bioensayos basados en células por ejemplo pueden medir prolifración, citotoxisidad, señalización o liberación de ciotoxina. Ensayos de enlace que detectan tanto anticuerpos neutralizantes como no neutralizantes miden la capacidad del suero para ligar a proteína exógena. Métodos para medir estos anticuerpos incluyen pero no están limitados a ELISA. La significancia de la presencia de ambos de estos anticuerpos se discute por Schellekens, H et al. Clinical Therapeutics 2002; 24(11): 1720-1740, que se incorpora aquí por referencia. Schellekens, H et al. Clinical Therapeutics 2002; 24(1 1) : 1720- 1740, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, también discute pruebas de animales en primates no humanos y en modelos de ratones transgénicos que expresan la proteína humana endógena así como métodos de prueba in vitro. Whiteley et al. in J. Clin. Invest . 1989; 84: 1550-1554, que se incorpora aquí por referencia, discute el uso de ratones transgénicos en estudios de inmunogenicidad con insulina humana. Wadhwa, M. et al . J of Immunol Methods 2003; 278: 1-17, que se incorpora aquí por referencia, discute una cantidad de técnicas para detección y medida de inmunogenicidad tales como resonancia plasmon de superficie (SPR; Biacore) , ensayos de radioimunoprecipitación (RIPA) , inmunonsayos tales como inmunoensayos de enlace de fase sólida, ELISA competitiva y puente, e inmunotransferencia. Otras técnicas incluyen pero no están limitados a elecroquimioluminicencia (ECL) . Chirino et al. DDT 2004; 9(2):82-90, que se incorpora aquí por referencia, describe ensayos de activación de célula T ex vivo para investigar la inmunogenicidad de agentes terapéuticos de proteínas. Métodos adicionales para estimar polipéptidos de la invención se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. XII . Mediciones de Actividad de Polipéptido y Afinidad de Polipéptido para el receptor de Polipéptido El receptor hGH puede prepararse como se describe en McFarland et al, Science, 245:494-499 (1989) and Leung, D., et al, Nature, 330:537-543 (1987). Actividad de polipéptido hGH puede determinarse utilizando ensayos in vi tro o in vivo estándar o conocidos. Por ejemplo, líneas celulares que proliferan en la presencia de hGH (por ejemplo, una línea celular que expresa el receptor hGH o un receptor lactogénico) puede emplearse para supervisar enlace receptor hGH. Ver, por ejemplo Clark, R., et al., J. Biol. Chem. 271 (36) :21969 (1996); Wada, et al, Mol. Endocrinol. 12:146-156 (1998); Gout , P. W., et al. Cáncer Res. 40, 2433-2436 (1980); WO 99/03887. Para un polipéptido hGH no-modificado con PEG o modificado con PEG que comprende un amino ácido no natural, la afinidad de la hormona para su receptor puede medirse al utilizar un biosensor BIAcoreMR (Pharmacia) . Ver, por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 5,849,535; Spencer, S. A., et al, J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988). Modelos de animales in vivo para probar actividad hGH incluyen aquellos descritos en por ejemplo, Clark et al, J. Biol.

Chem. 271 (36) :21969-21977 (1996). Ensayos para capacidad de dimerización de polipéptidos hGH comprenden uno o más amino ácidos no naturalmente codificados pueden realizarse como se describe en Cunningham, B., et al., Science, 254:821-825 (1991) and Fun, G., et al, Science, 256:1677-1680 (1992). Para estimar la actividad biológica de polipéptidos hGH modificados, un ensayo que mide un marcador corriente abajo de interacción hGH con su receptor puede emplearse. La interacción de hGH con su receptor endógenamente producido lleva a la tirosina a fosforilación de un solo transductor y activador de miembro de familia de transcripción, STAT5, en la línea celular de linfocito IM-9 humano. Dos formas de STAT5, STAT5A y STAT5B se identificaron a partir de una biblioteca ADNc IM-9. Ver, por ejemplo Silva et al., Mol. Endocrinol. (1996) 10 (5) : 508-518. Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia. Publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, describe ensayos adicionales para caracterizar polipéptidos hGH. Ensayos que caracterizan polipéptidos y sus receptores o socios de enlace se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. La compilación de referencias para metodologías de ensayo no es exhaustiva, y aquellos con destreza ordinaria en la técnica reconocerán otros ensayos útiles para prueba del resultado final deseado. XIII . Medición de Potencia, Vida Media In Vivo Funcional y Parámetros Farmacocinéticos Un aspecto importante de la invención es la vida media biológica prolongada que se obtiene al construir el polipéptido con o sin conjugación del polipéptido en una porción de polímero soluble en agua. La rápida disminución de concentraciones en suero de polipéptido ha hecho importante evaluar respuestas biológicas para tratamiento con polipéptido conjugado y no conjugado y sus variantes. El polipéptido conjugado y no conjugado y sus variantes de la presente invención pueden tener vidas medias en suero prolongadas también después de administración subcutánea o i.v., haciendo posible el medir, por ejemplo por método ELISA o por ensayo de monitoreo primario. Equipos ELISA o RÍA ya sea de BioSource International (Camarillo, CA) o Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX) pueden emplearse. La medición de la vida media biológica in vivo se lleva a cabo como se describe aguí . La potencia y vida media in vivo funcional del polipéptido tal como un hGH polipéptido que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, pueden determinarse de acuerdo con el protocolo descrito por Clark, R. , et al, J. Biol. Chem. 271 (36) : 21969-21977 (1996). Parámetros farmacocinéticos para un polipéptido tal como un hGH polipéptido que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, pueden evaluarse en ratas macho Sprague-Dawley normales (N=5 animales por grupo de tratamiento) . Los animales, por ejemplo recibieron ya sea una sola dosis de 25 µg/rata iv o 50 µg/rata se, y aproximadamente 5-7 muestras de sangre se toman de acuerdo con un curso de tiempo pre-definido, en general cubriendo aproximadamente 6 horas para una GH, por ejemplo un hGH polipéptido que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, no conjugado con un polímero soluble en agua y aproximadamente 4 días para una GH, por ejemplo un hGH polipéptido que comprende un amino ácido no naturalmente codificado y conjugado a un polímero soluble en agua. Datos farmacocinéticos para GH, por ejemplo hGH polipéptidos son bien estudiados en varias especies y pueden compararse directamente con los datos obtenidos para GH, por ejemplo hGH polipéptidos que comprenden un amino ácido no naturalmente codificado. Ver Mordenti J. , et al, Pharm. Res. 8(11): 1351-59 (1991) para estudios relacionados a GH, por ejemplo hGH. Parámetros farmacocinéticos también pueden evaluarse en un primate, por ejemplo monos cinomolgus. Típicamente, una sola inyección se administra ya sea en forma subcutánea o intravenosa, y se supervisan con el tiempo niveles de polipéptido en suero. La actividad específica de polipéptidos de acuerdo con esta invención puede determinarse por varios ensayos conocidos en la técnica. La actividad biológica de las muteínas de polipéptido, o sus fragmentos, obtenidas y purificadas de acuerdo con esta invención, puede probarse por métodos descritos o referidos aquí o conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. XIV. Administración y Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo pero no limitados a GH, por ejemplo hGH, sinteasas, proteínas que comprenden uno o más amino ácidos no naturales, etc.) se emplean opcionalmente para usos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a, en combinación con un portador farmacéutico conveniente. Estas composiciones, por ejemplo comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Este portador o excipiente incluye pero no está limitado a, salino, salino amortiguado, dextrosa, agua, glicerol, etanol y/o sus combinaciones. La formulación se hace para ajustarse al modo de administración. En general, métodos para administrar proteínas se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad y pueden aplicarse a la administración del polipéptidos de la invención. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene un polipéptido ligado por un enlace covalente de cuando menos un polímero soluble en agua, en donde el enlace covalente es un enlace oxima; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. El polipéptido puede ser hGH. En algunas modalidades, el polipéptido incluye un amino ácido no naturalmente codificado, tal como un amino ácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo. En algunas modalidades, el amino ácido no naturalmente codificado es un amino ácido que contiene cetona, por ejemplo para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, el GH, por ejemplo hGH, contiene un amino ácido no naturalmente codificado, por ejemplo para-acetilfenilalanina, substituido en una posición en la GH, por ejemplo hGH que corresponde al amino ácido 35 en SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404. El polímero soluble en agua puede ser un PEG. PEGs convenientes incluyen PEGs lineales y ramificados; cualquier PEG aquí descrito puede emplearse. En ciertas modalidades, el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-100 kDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la composición farmacéutica contiene una GH, por ejemplo GH, por ejemplo hGH enlazada a un PEG de 30 kDa por un enlace oxima, en donde el enlace oxima está entre una para-acetilfenilalanina en la GH ubicada en una posición correspondiente al amino ácido 35 en SEQ ID NO: 2 de la publicación de patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404 y el PEG. Composiciones terapéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de la invención se prueban opcionalmente en uno o más modelos de enfermedad en animales in vi tro y/o in vivo apropiados, para confirmar eficacia, el metabolismo de tejido y para estimar dosis, de acuerdo con métodos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. En particular, inicialmente pueden determinarse dosis por actividad, estabilidad u otras medidas convenientes de los homólogos amino ácidos no naturales a naturales (incluyendo pero no limitados a, comparación de un polipéptido modificado para incluir uno o más amino ácidos no naturales a un amino ácido natural polipéptido ), es decir en un ensayo relevante. La administración es por cualquiera de las rutas normalmente empleadas para introducir una molécula en contacto final con células de tejido o sangre. Los polipéptidos amino ácidos no naturales de la invención se administran en cualquier forma conveniente, opcionalmente con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Métodos convenientes para administrar estos polipéptidos en el contexto de la presente invención a un paciente están disponibles, y aunque más de una ruta puede emplearse para administrar una composición particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una acción o reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. Portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular empleado para administrar la composición. De acuerdo con esto, hay una amplia variedad de formulaciones convenientes de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Polipéptidos de la invención, incluyendo pero no limitados a hGH modificada con PEG, pueden administrarse por cualquier ruta convencional adecuada para proteínas o péptidos, incluyendo pero no limitados a parenteralmente, por ejemplo inyecciones, incluyendo pero no limitadas a en forma subcutánea o intravenosa o cualquier otra forma de inyecciones o infusiones. Composiciones de polipéptido pueden administrarse por una cantidad de rutas incluyendo pero no limitadas a oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, subcutánea, tópica, sublingual, o rectal . Composiciones que comprenden amino ácidos no naturales polipéptidos, modificados o no modificados, también pueden administrarse por liposomas. Estas rutas de administración y formulaciones apropiadas en general son conocidos por aquellos con destreza en la especalidad. El polipéptido que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, incluyendo pero no limitado a hGH modificada con PEG, puede emplearse solo o en combinación con otros componentes convenientes tales como un portador farmacéutico. El polipéptido que comprende un amino ácido no natural, solo en combinación con otros componentes convenientes, también puede hacerse en formulaciones en aerosol (es decir, puede ser "nebulizado") para administrarse por inhalación. Formulaciones en aerosol pueden colocarse en propulsores aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y semejantes. Formulaciones adecuadas para administración parenteral, tales como por ejemplo por rutas intra-articular (en las articulaciones) , intravenosas, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones de inyección acuosas y no acuosas isotónicas estériles, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterioestáticos y solutos que hace a la formulación isotónica con la sangre del recipiente pretendido, y suspensiones estériles no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. Las formulaciones de polipéptido pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitaria o de múltiples dosis, tales como ampolletas y frasquitos . Administración parenteral y administración intravenosa son métodos preferidos de administración. En particular, las rutas de administración ya en uso para agentes terapéuticos homólogos de amino ácidos naturales (incluyendo pero no limitados a, aquellos típicamente empleados para EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticuerpos y/o cualquier otra proteína suministrada farmacéuticamente), junto con formulaciones en uso actual, proporcionan rutas de administración preferidas y formulación para los polipéptidos de la invención. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo, u otra actividad apropiada dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia del vector particular o formulación y la actividad, estabilidad o vida media en suero del polipéptido amino ácido no natural empleado y la condición del paciente, así como el peso corporal o área superficial del paciente a tratar. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza y extensión de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompañan a la administración de un particular vector, formulación o semejantes en un paciente particular. Para determinar la cantidad efectiva del vector o formulación a administrarse en el tratamiento o profilaxis de enfermedad (incluyendo pero no limitado a, cánceres, enfermedades heredadas, diabetes, SIDA o semejantes) , el médico evalúa niveles en plasma en circulación, toxicidades de formulación, avance de la enfermedad y/o cuando sea relevante, la producción de anticuerpos de polipéptido amino ácido anti-no naturales. La dosis administrada, por ejemplo a un paciente de 70 kilogramos, típicamente está en el intervalo equivalente a dosis de proteínas terapéuticas actualmente empleadas, ajustada para la actividad alterada o vida media en suero de la composición relevante. Los vectores o formulaciones farmacéuticas de esta invención pueden suplementar condiciones de tratamiento por cualquier terapia convencional conocida, incluyendo administración de anticuerpos, administración de vacunas, administración de agentes citotóxicos, polipéptidos de amino ácidos naturales, ácidos nucleicos, análogos de nucleótidos, modificadores de respuesta biológica y semejantes. Para administración, las formulaciones de la presente invención se administra a una velocidad determinada por LD-50 o ED-50 de la formulación relevante y/u observación de cualesquiera efectos secundarios de los polipéptidos amino ácidos no naturales en diversas concentraciones, incluyendo pero no limitados a como se aplica a la masa y salud total del paciente. La administración puede lograrse mediante dosis individuales o divididas. Si un paciente que se somete a infusión de una formulación desarrolla fiebres, calosfríos o dolores musculares, recibirá la dosis apropiada de aspirina, ibuprofen, acetaminofen u otra droga para control de dolor/fiebre. Pacientes que experimentan reacciones a la infusión tales como fiebres, dolores musculares y calosfríos son previamente medicados 30 minutos antes de las infusiones futuras con cualquiera de aspirina, acetaminofen, o, incluyendo pero no limitado a, difenhidramina. Meperidina se utiliza para más severos calosfríos y dolores musculares que no responden rápidamente a los antipiréticos y antihistaminas . Infusión celular se frena o interrumpe dependiendo de la severidad de la reacción. Polipéptidos de la invención pueden ser administrados directamente a un sujeto mamífero. La administración es por cualquiera de las rutas normalmente empleadas para introducir polipéptido a un sujeto. Las composiciones de polipéptido de acuerdo a las modalidades de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, por inhalación (incluyendo pero no limitado a, mediante aerosol) , bucal (incluyendo pero no limitada a, sub-lingual) , vaginal, parenteral (incluyendo pero no limitada a, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, inracerebral , intraarterial o intravenosa), tópica (es decir, tanto superficie de la piel como de mucosas, incluyendo superficie de vías respiratorias) y transdérmica, auque la ruta más conveniente en cualquier caso determinado dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se trata. La administración ya puede ser local o sistémica. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o múltiples dosis tales como ampolletas y frasquitos. Polipéptidos de la invención pueden ser preparados en una mezcla en una forma inyectable de dosis unitaria (incluyendo pero no limitada a, solución, suspensión, o emulsión) con un portador farmacéuticamente aceptable. Polipéptidos de la invención también pueden administrarse por infusión continua (utilizando, incluyendo pero no limitando a, mini bambas tales como bombas osmóticas) , formulaciones de depósito de un solo bolo o de liberación lenta. Formulaciones convenientes para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. Soluciones y suspensiones pueden ser preparadas a partir de polvos estériles, granulos y tabletas del tipo previamente descrito. El secado por congelamiento es una técnica comúnmente empleada para presentar proteínas sirven para retirar agua de la preparación de la proteína de interés. El secado por congelamiento, o liofilización, es un proceso por el cual el material a secar primero se congela y después el hielo o solvente congelado se retira por sublimación en un ambiente de vació. Un excipiente puede incluirse en formulaciones pre-liofilizadas para mejorar la estabilidad durante el proceso de secado por congelamiento y/o mejorar la estabilidad del producto liofilizado al almacenar. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al. Pharm. Res. 8 (3) :285-291 (1991) . El secado por rocío de productos farmacéuticos también se conoce por aquellos con destreza ordinaria en la técnica. Por ejemplo, ver Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992). Además de productos farmacéuticos de moléculas pequeñas, una variedad de materiales biológicos se han secado por rocío y estos incluyen: enzimas, suero, plasma, micro-organismos y levaduras. El secado por rocío es una técnica útil debido a que puede convertir una preparación farmacéutica líquida en un polvo fino sin polvo o aglomerado en un proceso de una etapa. La técnica básica comprende las siguientes cuatro etapas: a) atomización de la solución de alimentación en rocío; b) contacto de aire-rocío; c) secado del rocío; y d) separación del producto seco del aire de secado. Las Patentes de los E.U.A. números 6,235,710 y 6,001,800, que se incorpora aquí por referencia, describen la preparación de eritopoietina recombinante mediante secado por rocío. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un portador excipiente o estabilizante farmacéuticamente aceptable. Portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular empleado para administrar la composición. De acuerdo con esto, hay una amplia variedad de formulaciones convenientes de composiciones farmacéuticas (incluyendo portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales) de la presente invención (ver por ejemplo, Remington Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985) ) . Portadores convenientes incluyen pero no están limitados a, amortiguadores que contienen sucinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina o derivados de histidina, imidazol, acetato, bicarbonato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo pero no limitados a, ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular incluyendo pero no limitados a aquellos con menos de aproximadamente 10 residuos; proteínas, incluyendo pero no limitados a, albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos incluyendo pero no limitados a, polivinilpirrolidona; amino ácidos incluyendo pero no limitados a, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina o derivados histidina, metionina, glutamato, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo pero no limitados a, trehalosa, sucrosa, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes incluyendo pero no limitados a, EDTA y edentato de sodio; iones de metal divalente incluyendo pero no limitados a, zinc, cobalto, o cobre; azúcar alcoholes incluyendo pero no limitados a, manitol o sorbitol; contra iones formadores de sal incluyendo pero no limitados a, sodio y cloruro de sodio; y/o surfactantes no iónicos incluyendo pero no limitados a, Twee^ (incluyendo pero no limitados a, Tween 80 (polisorbato 80) y Tween 20 (polisorbato 20), PluronicsMR y otros ácidos pluronicos, incluyendo pero no limitados a, y otros ácidos pluronicos, incluyendo pero no limitados a, ácido pluronico F68 (poloxamer 188) , o PEG. Surfactantes convenientes incluye por ejemplo pero no están limitados a poliéteres con base en poli (etilen oxido) -poli (propilen oxido) -poli (etilen oxido) , es decir, (PEO-PPO-PEO) , o poli (propilen oxido) -poli (etilen oxido) -poli (propilen oxido) , es decir, (PPO-PEO-PPO) , o una combinación de los mismos. PEO-PPO-PEO y PPO-PEO-PPO son comercialmente disponibles bajo los nombres comerciales Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ y R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) y además se describen en la Patente de los E.U.A. número 4,820,352 aquí incorporada en su totalidad por referencia. Otros polímeros de bloque etileno/polipropileno pueden ser surfactantes convenientes. Un surfactante o una combinación de surfactantes pude emplearse para estabilizar polipéptidos contra uno o más esfuerzos incluyendo pero no limitados a esfuerzos que resultan de agitación. Algunos de los anteriores pueden ser referidos como "agentes de carga" . Algunos también pueden ser referidos como "modificadores de tonicidad" . Conservadores antimicrobianos también puede ser aplicados para estabilidad de producto y efectividad antimicrobiana; conservadores conveniente incluyendo pero no limitados a, benzil alcohol, cloruro de benzalconio, metacresol, metil/propil parabeno, cresol, y fenol, o una combinación de los mismos. Los polipéptidos de la invención, incluyendo aquellos enlazados con polímeros solubles en agua tales como PEG también pueden administrarse por o como parte de sistemas de liberación sostenida. Composiciones de liberación sostenida incluyen, pero no están limitados a, matrices de polímero semi-permeable en la forma artículos conformados, incluyendo pero no están limitadas a, películas o micro cápsulas. Matrices de liberación sostenida incluyen desde materiales biocompatibles tales como poli (2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 267- 277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), etilen vinil acetato (Langer et al, supra) o ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutirico (EP 133,988), polilactidas (ácido polilactico) (la Patente de los E.U.A. número 3,773,919; EP 58,481), poliglicolido (polímero de ácido glicolico) , polilactida co-glicolido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicolico) polianhídridos, copolímeros de ácido L-glutamico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli (orto) esteres, polipéptidos, ácido hialuronico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílico, ácidos grasos, fosfolipidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliamino ácidos, amino ácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Composiciones de liberación sostenida también incluyen un compuesto de atropamiento liposomal. Liposomas que contienen el compuesto se preparan por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Eppstein et al, Proc. Nati Acad. ScL U.S.A., 82: 3688- 3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. ScL U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; la Patente de los E.U.A. número 4,619,794; EP 143,949; la Patente de los E.U.A. número 5,021,234; solicitud de patente Japonesa Appln. 83-118008; la Patente de los E.U.A. Números 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia.

Polipéptidos de atropamiento liposomal pueden ser preparados por métodos descritos en por ejemplo, DE 3,218,121; Eppstein et al, Proc. Nati. Acad ScL U.S.A., 82: 3688- 3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati Acad. ScL U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; la Patente de los E.U.A. número 4,619,794; EP 143,949; la Patente de los E.U.A. número 5,021,234; solicitud de patente Japonesa Appln. 83-118008; las Patentes de los E.U.A. números 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Composición y tamaño de liposomas son bien conocidos o capaces de determinarse fácilmente en forma empírica por una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Algunos ejemplos de liposomas como se describe en, por ejemplo Park JW, et al, Proc. Nati Acad. ScL USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998) ; Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cáncer therapy, in Teicher B (ed) : CÁNCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002) ; Park JW, et al, Clin. Cáncer Res. 8:1172-1181 (2002); Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3) : 109-118 (2002); Mamot C5 et al, Cáncer Res. 63: 3154-3161 (2003). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia. La dosis administrada a un paciente en el contexto de la presente invención deberá ser suficiente para provocar una respuesta beneficia en el sujeto con el tiempo. En general, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido de la presente invención administrada parenteralmente por dosis esta en el intervalo de aproximadamente 0.01 g/kg/día a aproximadamente 100 //g/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, del peso corporal del paciente, aunque esto esta sujeto a discreción terapéutica. La frecuencia de dosis también esta sujeta a discreción terapéutica, y puede ser más frecuente o menos frecuente que los productos polipéptido comercialmente disponibles aprobados para uso en humanos. En general, un polipéptido modificado con PEG de la invención puede ser administrado por cualquiera de las rutas de administración descritas anteriormente. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende cualquiera del polipéptido, descrito aquí en una composición farmacéutica que es suficientemente estable para el almacenamiento y regimenes de dosis descritos aquí. Métodos para probar la estabilidad se conocen en la técnica. XV. Usos Terapéuticos de GH, por ejemplo, hGH Polipéptidos de la Invención La GH, por ejemplo, hGH polipéptidos de la invención son útiles para el tratamiento de un amplio intervalo de desordenes. La GH, por ejemplo, polipéptidos agonistas hGH de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, para tratar deficiencia de crecimiento, desordenes inmunes, y para estimular la función cardiaca. Individuos con deficiencia de crecimiento, por ejemplo, individuos con síndrome de Turner, individuos con deficiencia de GH (incluyendo niños) , niños que experimentan un frenado o retardo en su curva de crecimiento normal aproximadamente 2 a 3 años antes de que se cierre su placa de crecimiento (en ocasiones conocida como "niños normales de corta estatura"), e individuos en donde la respuesta del factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF-I) a GH se ha bloqueado químicamente (es decir, por tratamiento de glucocorticoides) o por una condición natural tal como en un paciente adulto en donde la respuesta IGF-I a GH se reduce naturalmente. Los polipéptidos hGH de la invención pueden ser útiles para tratar individuos con las siguientes condiciones: deficiencia de hormona de crecimiento pediátrica, estatura corta idiopática, deficiencia en hormona de crecimiento de adulto, de inicio en infancia, deficiencia en hormona de crecimiento de adulto de inicio en adultos, o deficiencia de hormona de crecimiento secundaria. Adultos diagnosticados con deficiencia de hormona de crecimiento en la etapa adulta pueden haber tenido una radiación o tumor pituitario. Condiciones incluyendo pero no limitadas a, síndrome metabólico, lesión en la cabeza, obesidad, osteoporosis, o depresión, pueden resultar en síntomas tipo deficiencia de hormona de crecimiento en adultos.

Un agonista GH, por ejemplo, variante hGH puede actuar para estimular la respuesta inmune de un mamífero al incrementar su función inmune, ya sea que el incremento se deba a mediación anticuerpo o mediación celular, y si el sistema inmune es endógeno al anfitrión tratado con GH, por ejemplo, polipéptido hGH se transplanta de un donador al recipiente anfitrión dada la GH, por ejemplo polipéptido hGH (como en transplantes de medula ósea) . "Desordenes inmunes" incluye cualquier condición en la que el sistema inmune de un individuo tiene respuesta celular o de anticuerpo reducida a antígenos que lo normal, incluyendo aquellos individuos cuyos pequeños bazos con inmunidad reducida debido a tratamientos con drogas (por ejemplo, quimioterapéuticos) . Ejemplos de individuos con desordenes inmune incluyen, por ejemplo, pacientes mayores, individuos que se someten a quimioterapia o terapia de radiación, individuos que se recuperan de una enfermedad mayor o a punto de someterse a cirugía, individuos con SIDA, pacientes don deficiencias congenicas y de células B adquiridas tales como hipogamaglobulinemia, agamaglobulinemia variada común y deficiencias de inmunoglobulina selectivas (por ejemplo, deficiencia de IgA, pacientes infectados con un virus tales como rabia con un tiempo de incubación más corto que la respuesta inmune del paciente; e individuos con desordenes hereditarios tales como el síndrome diGeorge.

GH, por ejemplo, polipéptidos antagonista hGH de la invención pueden ser útiles para el tratamiento de gigantismo y acromegalia, diabetes y complicaciones (retinopatía diabética, neuropatía diabética) que surge de diabetes, enfermedades vasculares de los ojos (por ejemplo, que involucran neovascularización proliferativa) , nefropatia, y malignidades de respuesta GH. Enfermedades vasculares de ojos incluyen, por ejemplo, retinopatía (provocada por anemia de células falciformes o pre-madurez) y degeneración macular. Malignidades de respuesta GH incluyen, por ejemplo, tumor de Wilm, sarcomas (por ejemplo, sarcoma osteogenico) , canceres de mama, colon, próstata y tiroides, y canceres de tejidos que expresan ARNm receptor de GH (es decir, placenta, timos, cerebro, glándula salivar, próstata, medula ósea, músculo esquelético, traquea, medula espinal, retina, nodo linfático y de linfoma de Burkitt, carcinoma colorectal, carcinoma pulmonar, leucemia linfoblastica, y melanoma) . La GH, por ejemplo, polipéptidos agonista hGH de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, para tratar falla renal crónica, falla de crecimiento asociada con insuficiencia renal crónica (CRI = chronic renal insufficiency) , corta estatura asociada con síndrome de Turner, síndrome pediátrico Prader-Willi (PWS = pediatric Prader-Willi Syndrome) , pacientes de HIV con caquexia o desgaste, niños nacidos pequeños para edad de vegetación (SGA children born small for gestational age) , obesidad y osteoporosis . Cantidades promedio de la GH, por ejemplo, hGH puede variar y en particular deberán basarse en las recomendaciones y receta de un medico calificado. La cantidad exacta de GH, por ejemplo, hGH es cuestión de preferencias sujeta a factores tales como el tipo exacto de condición que se trata, la condición del paciente a tratar así como otros ingredientes en la composición. La invención también proporciona administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo. La cantidad a suministrar puede ser determinada fácilmente persona con destreza ordinaria en la técnica con base en la terapia con hGH. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden fabricarse en una forma convencional . En algunas modalidades, la invención proporciona un método de tratamiento que incluye administrar a un individuo que requiere tratamiento, una cantidad efectiva de una composición de hormona que comprende una hormona de crecimiento (GH) unida por enlaces covalentes por al menos un polímero soluble en agua en donde él o los enlaces covalentes son un enlace oxima. En algunas modalidades, los métodos incluyen administrar al individuo, por ejemplo, humano, un GH, por ejemplo, hGH. En algunas modalidades, la GH, por ejemplo, hGH, incluye un amino ácido no naturalmente codificado, tal como un amino ácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo. En algunas modalidades, el amino ácido no naturalmente codificado, es un amino ácido que contiene cetona, por ejemplo para-acetilfenilalanina. En algunas modalidades, la GH, por ejemplo, hGH, contiene un amino ácido no naturalmente codificado, por ejemplo, para-acetilfenilalanina, substituido en una posición en el GH, por ejemplo, hGH correspondiente al amino ácido 35 en SEQ ID NO: 2 de la Publicación de patente de los E.U.A. número US 2005/0170404. El polímero soluble en agua puede ser un PEG, PEGs convenientes incluyen PEGs lineales o ramificados; cualquier PEG aquí descrito puede emplearse. En ciertas modalidades, el PEG es un PEG lineal de aproximadamente 0.1-100 kDa, o aproximadamente 1-100 IcDa, o aproximadamente 10-50 kDa, o aproximadamente 20-40 kDa, o aproximadamente 30 kDa. En algunas modalidades, la composición farmacéutica que contiene un GH, por ejemplo, un GH, por ejemplo, hGH, enlazada a un PEG 30 kDa por un enlace oxima, en donde el enlace oxima esta entre una para-acetilfenilalanina en la GH ubicada en una posición correspondiente a amino ácido 30 en SEQ ID NO: 2 de la Publicación de patente de los E.U.A. número US 2005/0170404 y el PEG. En algunas modalidades, el individuo que es tratado sufre de deficiencia en hormona de crecimiento pediátrica, estatura corta idiopatica, deficiencia en hormona de crecimiento de adulto, de inicio infantil, deficiencia en hormona de crecimiento de adulto de inicio en adultos, o deficiencia de hormona de crecimiento secundaria. La GH, hGH puede administrarse al individuo en cualquier ruta de forma, dosis, frecuencia y duración convenientes como se describe aquí y como se muestra en la técnica. En algunas modalidades, la invención proporciona un método de tratamiento que incluye administrar a un individuo que requiere tratamiento, una cantidad efectiva de una composición de hormona que comprende una hormona de crecimiento (GH) ligada por enlaces covalentes con al menos un polímero soluble en agua, en donde el polímero soluble en agua es un polímero lineal y en donde la composición de hormona está dada a una frecuencia no mayor a aproximadamente una vez cada día salteado, una vez cada 3, 4, 5 o 6 días, una vez por semana, una vez por cada 8, 9, 10, 11, 12 o 13 días, una vez por dos semanas, una vez por cada 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días, una vez por tres semanas, una vez por 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días, una vez por mes, o menos de aproximadamente una vez por mes. Se apreciará que la frecuencia de administración puede ser alterada a discreción del individuo o en forma más típica, el profesional de tratamiento y que cualquier combinación de frecuencias puede utilizarse. En algunas modalidades, la composición de GH se administra a no más de aproximadamente una vez por semana, una vez por dos semanas, una vez por tres semanas o una vez por mes. En algunas modalidades, la composición de GH se administra a no más de aproximadamente una vez por semana, una vez por dos semanas o una vez por mes. En algunas modalidades, la composición GH se administra a no más de aproximadamente una vez por semana. En algunas modalidades, la composición de GH se administra no más de aproximadamente una vez por dos semanas. En algunas modalidades, la composición GH se administra no más de aproximadamente una vez por mes. La invención también permite administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo junto con hGH de la presente invención. La cantidad a suministrar puede ser determinada fácilmente por una persona con destreza ordinaria en la técnica con base en terapia con hGH. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada. Ejemplo 1 Ratones transgénicos que expresan hGH se utilizaron para investigar la inmunogenicidad de un metionil hGH polipéptido con una sustitución de aminoácido no natural y un hGH polipéptido que está modificado con PEG en una sustitución de aminoácido no natural. Sweetser, D. A. et al. en PNAS 1988; 85:9611-9615 y en Genes & Development 1988; 2:1318-1332 describen ratones transgénicos que expresan hGH mediante construcciones que fusionan porciones de el gen de proteína de enlace de ácido graso con el gen hGH. Dos pares de incubación de heterocigoto de ratones transgénicos hHG se adquirieron de Jackson Laboratory. Conjuntos cebadores A, C y F que amplifican diversas regiones del transgen hGH, se utilizaron para determinar la presencia del transgen hGH. Ratones se calificaron positivos para el transgen hGH cuando dos o más de los conjuntos cebadores produjeron productos PCR deseados. La Figura 1 muestra una ilustración esquemática del transgen de fusión hGH-proteína de enlace de ácido graso (FABP = fatty acid binding protein) con los tres conjuntos de imprimadores. Niveles en plasma de hGH se midieron con un equipo ELISA disponible de Diagnostic Systems Laboratories (Webster, Texas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los descendientes de primera generación que probaron positivos para el transgen hGH por PCR y mostraron el nivel hGH en plasma elevado por ELISA, se consideraron como hGH transgénicos. Transgénicos Fl después sometidos a retrocruzamiento con ratones C57BL/6 de tipo silvestre para obtener animales suficientes para el estudio. Compañeros de carnada que probaron negativos para hGH tanto por PCR como ELISA se utilizaron como animales sin tratamiento previo para comparación con hGH que expresa animales tolerantes en el estudio. Las respuestas inmunes de ratones hGH tolerantes y sin tratamiento previo se evaluaron cuando se prueban con metionilo hGH ( (met) -hGH) ; con metionilo hGH con un aminoácido no natural (p-acetilfenilalanina) sustituido en la posición 35 ( (met) -ahGH; (met) Y35pAF-hGH) ; metionilo hGH con un aminoácido no natural (p-acetilfenilalanina) sustituido en la posición 35 que está modificado con PEG en el aminoácido no natural ( (met) -ahGH-PEG; PEG- (met) Y35pAF-hGH; PEG-ahGH) o placebo. Regímenes de dosis para ratones hGH transgénicos y sin tratamiento previo se muestran en la Tabla 2 (sin adyuvante) y Tabla 3 (con adyuvante incompleto de Freund) .

Muestras de plasma se recolectaron el día 0 (fondo pre-sangrado) y días 56 (13 días después de la última inyección) . Se realizó ELISA tanto muestras del día 0 y días 56 para detectar la presencia de anticuerpo anti-hGH y niveles de hGH en plasma (Diagnostic Systems Laboratories (Webster, Texas) ) .

Muestras en plasma se recolectaron el día 0 (pre-sangrado) y día 55 (11 días después de la última inyección) . Se realizó ELISA tanto en las muestras del día 0 como el día 55 para detectar la presencia de anticuerpo anti-hGH y niveles de plasma hGH (Diagnostic Systems Laboratories (Webster, Texas) ) . Para detectar anticuerpo hGH, se revistieron placas ELISA ya sea con (met) -hGH, (met) -ahGH ( (met) Y35pAF-hGH) o (met) -ahGH-PEG (PEG- (met) Y35pAF-hGH) por 4 horas a temperatura ambiente. Las placas después lavaron una vez con PBS antes de bloquear con PBS + 5% BSA + 0.05% Tween 20 durante la noche a 4 grados C. Después de la incubación durante la noche, las placas se lavaron dos veces antes de que se agregaran muestras de plasma a diversas de diluciones. Después de que se agregaran las muestras de plasma, las placas se dejaron a temperatura ambiente por 1 hora y después se lavaron cuatro veces. IgG anti ratón cabra conjugado HRP se agrega y las placas 5 lavaron por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces. Sustrato TMB se agregó y las placas se incubaron por 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con la adición de H2S04 ÍN y se leyó la absorbancia a 450 nm. Caracterización de ratones transgénicos hGH Un total de 63 ratones se tamizaron por la presencia de transgen hGH por PCR y el nivel en plasma hGH por ELISA específico para hGH. Treinta de sesenta y tres ratones fueron confirmados no transgénicos tanto por PCR como hGH ELISA y después participaron como animales sin tratamiento previo de hGH en el estudio. Treinta y tres ratones probaron positivos para el transgen hGH por PCR. Sin embargo, dos de los treinta y tres animales positivos de transgen hGH no mostraron niveles hGH detectables en su plasma y se excluyeron del estudio. Treinta y un animales que fueron positivo para transgen hGH y nivel hGH en plasma elevado por lo tanto registraron en el estudio como animales tolerantes hGH. Respuesta a anticuerpo de ratones transgénicos y sin tratamiento previo de hGH La respuesta de anticuerpo de ratones transgénicos y sin tratamiento previo hGH (no-tg) inmunizados con (met) -hGH se muestra en las Figuras 2-4. La respuesta de anticuerpo de ratones transgénicos y sin tratamiento previo hGH inmunizados con (met) Y35pAF-hGH se muestra en las Figuras 5-7. La respuesta de anticuerpo de ratones transgénicos y sin tratamiento previo de hGH inmunizados con PEG- (met ) Y35pAF-hGH se muestra en las Figuras 8-10. La respuesta de anticuerpo de ratones transgénicos y sin tratamiento previo hGH inmunizados con (met) -hGH en adyuvante incompleto de Freund se muestra en las Figuras 11-13. La respuesta de ratones transgénicos y sin tratamiento previo de hGH inmunizados con (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund se muestra en las Figuras. La respuesta de anticuerpo de ratones transgénicos y sin tratamiento previo hGH inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH en adyuvante incompleto de Freund se muestra en las Figuras 17-19. Placas para ELISA se revistieron con (met) -hGH, (met) -ahGH ( (met)Y35pAF-hGH) o (met) -ahGH-PEG (PEG- (met) Y35pAF-hGH) . Una comparación de las Figuras 2 y 8 muestra que el hGH modificado con PEG no es inmunogénico en ratones transgénicos que expresan hGH. También, una comparación de las Figuras 11 y 17 muestra que hGH modificado con PEG no es inmunogénico en ratones transgénicos que expresan PEG cuando el hGH modificado con PEG se formula con adyuvante incompleto de Freund. Niveles en plasma de hGH al inicio y al fin del estudio se muestran en la Tabla 4 (sin adyuvante) y Tabla 5 (con adyuvante incompleto de Freund) .

La Figura 20 muestra un resumen de los datos de inmunogenicidad (título y anticuerpo) Tablas 6 y 7 resumen el título de anticuerpo para animales inmunizados sin adyuvante.

Las Tablas 8 y 9 resumen el título de anticuerpo para animales inmunizados con adyuvante incompleto de Freund.

Respuestas inmune en la presencia de adyuvante fueron más robustas que respuestas producidas en la ausencia de adyuvante. Los bajos títulos de anticuerpo producidos por (met) Y35pAF-hGH en ratones tolerantes no se observaron en ratones tolerantes inmunizados con PEG- (met) Y35pAF-hGH. Esto muestra que la modificación con PEG elimina respuestas inducidas por adyuvante en ratones tolerantes de hGH. Ninguno de los ratones tolerantes desarrollaron una respuesta de anticuerpo detectable contra PEG (met) Y35pAF-hGH en el estudio sin adyuvante. En el estudio utilizando adyuvante, ninguno de los ratones tolerantes desarrollaron una respuesta de anticuerpo detectable contra PEG- (met) Y35pAF-hGH.

Ejemplo 2 Para-acetilfenilalanina no fue inmunogénico cuando está presente en un formato de conjugación inmunogénica a conejos, como se muestra en la Figura 22, Panel B. Aún más, p-acetilfenilalanina se muestra que no es más inmunogénica que aminoácidos nativos para inducir la producción de anticuerpos de conejo. Derivados desanimados de Phe, Tyr, p-acetilfenilalanina (pAF) y DNP se acoplaron a una proteína portadora nativa a conejo, albúmina de suero de conejo (RSA = rabbit serum albumin) por el método de conjugación EDC. El grupo amino se retira para evitar que ocurra la formación di-y tri- péptido y los aminoácidos se enlazaron a las cadenas laterales sin lisina en RSA. Tres conejos/grupo se inmunizaron con 50 ug/de animal del conjugado en adyuvante incompleto de Freund. Los animales se reforzaron dos veces y se recolectaron sueros a 8 semanas posteriores a inmunización. Los sueros se probaron por ELISA contra el aminoácido conjugado con KLH correspondiente. Resultados para DNP se muestran en la Figura 22, Panel A; Phe en la Figura 22, Panel C; y Tyr en la Figura 22, Panel D. El análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF de RSA, RSA-Phe, RSA-Tyr, RSA-p-acetilfenilalanina (pAF) y RSA-DNP se muestra en la Figura 21. Para RSA, el MW en kDa fue 66.2 con aa/RSA de 0. Para RSA-Phe, el MW en kDa fue 68.4 con aa/RSA de 15. Para RSA-Tyr, el MW en kDa fue 68.3 con aa/RSA de 13.

Para RSA-pAF, el MW en kDa fue 69.6 con aa/RSA de 18. Para RSA-DNP, de MW en kDa fue 68.3 con aa/RSA de 8. Ejemplo 3 Este ejemplo describe uno de muchos conjuntos de criterios potenciales para la selección de sitios preferidos de incorporación de aminoácidos no naturalmente codificados en hGH. Este ejemplo demuestra como sitios preferidos dentro del polipéptido hGH se seleccionaron para introducción de un aminoácido no naturalmente codificado. La estructura de cristal 3HHR, compuesta por hGH en complejo con dos moléculas del dominio extracelular de receptor (hGHbp) , se utiliza para determinar posiciones preferidas en las cuales uno o más aminoácidos no naturalmente codificados pueden introducirse. Otras estructuras hGH (por ejemplo IAXI) se utilizaron para examinar variación potencial de elementos estructurales primarios y secundarios entre conjuntos de datos de estructura de cristal. Las coordenadas para estas estructuras están disponibles del Banco de Datos de Proteína (PDB = Protein Data Bank) (Bernstein et al. J. Mol. Biol. 1997, 112, pp 535) o mediante The Research Collaborator para Structural Bioinformatics PDB disponible en la Red Mundial en rcsb.org. El modelo estructural 3HHR contiene la secuencia madura completa de 22 kDa de hGH excepto por los residuos 148-153 y el residuo F 191 C-terminal que se omitieron debido a desorden en el cristal. Dos puentes disulfuro están presentes formados por C53 y C 165 y C 182 y C 185. La numeración de secuencia utilizada en este ejemplo es de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de hGH maduro (variante 22 kDa) mostrada en SEQ ID NO: 2 de la publicación de Patente de los E.U.A. Números US 2005/0170404. Los siguientes criterios se emplearon para evaluar cada posición de hGH para introducción de un aminoácido no naturalmente codificado: el residuo (a) no deberá interferir con enlace ya sea de hGHbp con base en el análisis estructural de 3HHR5 IAXI y IHWG (estructura cristalográfica de hGH conjugado con monómero o diméro) , b) no deberá ser afectado por mutagénesis de exploración de homólogo o alanina (Cunningham et al. Science (1989) 244:1081-1085 y Cunningham et al. Science (1989) 243:1330-1336), (c) deberá ser expuesto en superficie y exhibir mínimas interacciones de enlaces de hidrógeno o de van der Waals con residuos circundantes, (d) deberán ser ya eliminados o variables en variantes hGH (por ejemplo Tyr35, Lys38, Phe92, Lysl40) , (e) resultarán en cambios conservadores ante sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado y (f) puede encontrarse ya sea en regiones altamente flexibles (incluyendo pero no limitadas a bucle CD) o regiones estructuralmente rígidas (incluyendo pero no limitadas a Hélice B) . Además, adicionales cálculos se realizaron en la molécula hGH utilizando el programa Cx (Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18, pp 980) para evaluar la extensión de proyección de cada átomo de proteína. Como resultado, en algunas modalidades, uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se incorporan en pero no limitan a una o más a las siguientes posiciones de hGH antes de la posición 1: (es decir en el extremo N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 665 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 1 16, 1 19, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168, 172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir en el extremo carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO: 2 o Idos aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 1 o 3 de la Publicación de Patente de los E.U.A. Número US 2005/0170404) . En algunas modalidades uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186, y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404). En algunas modalidades uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140,141 , 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186, y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145, y 155 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: l o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 30, 74, 103 (SEQ ID NO : 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO : 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades el aminoácido que no es de origen natural en una o más de estas posiciones se enlaza con un polímero soluble en agua incluyendo pero no limitado a las posiciones: Antes de la posición 1 (es decir en el extremo N) , 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 19, 22, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 55, 57, 59, 65, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 115, 116, 1 19, 120, 122, 123, 126, 127, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141,142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 168,172, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 (es decir en el extremo carboxilo de la proteína) (SEQ ID NO : 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades el aminoácido que no es de origen natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua incluyendo pero no limitado a las posiciones: 29, 30, 33, 34, 35, 37, 39, 40, 49, 57, 59, 66, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 1 11, 122, 126, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 159, 183, 186, y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades el aminoácido que no es de origen natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua incluyendo pero no esta limitado a las posiciones: 29, 33, 35, 37, 39, 49, 57, 69, 70, 71, 74, 88, 91, 92, 94, 95, 98, 99, 101, 103, 107, 108, 111, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 154, 155, 156, 186, y 187 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades el aminoácido que no es de origen natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua incluyendo pero no limitado a las posiciones: 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145, y 155 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades el aminoácido que no es de origen natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua incluyendo pero no limitado a las posiciones: 30, 74, 103 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua: 30, 35, 74, 92, 103, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . En algunas modalidades, el aminoácido que no es de origen natural en una o más de estas posiciones se enlaza a un polímero soluble en agua: 35, 92, 143, 145 (SEQ ID NO: 2 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 1 o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) . Algunos sitios para generar un antagonista hGH incluyen: 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12,15, 16, 19, 22, 103, 109, 112, 113, 115, 116, 119, 120, 123, 127, o una adición antes de la posición 1, o cualquier combinación de las mismas (SEQ ID NO: 2 o el aminoácido correspondientes de SEQ ID NO:l o 3 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) o cualquier otra secuencia GH) . Estos sitios se seleccionaron utilizando los criterios (c) - (e) del diseño de agonista. El diseño de antagonista también puede incluir modificaciones dirigidas de sitio de sucesivos de sitio I para incrementar la afinidad de enlace a hGHbp. Ejemplo 4 Este ejemplo detalla clonación y expresión de un polipéptido hGH incluyendo un aminoácido no naturalmente codificado en E. coli .

Métodos para clonar hGH y sus fragmentos se detallan en las patentes de los E.U.A. Nos .4, 601, 980 ; 4,604,359; 4,634,677; 4,658,021; 4,898,830; 5,424,199; y 5,795,745, que se incorporan aquí por referencia. ADNc que codifica el hGH de longitud íntegra por la forma madura de hGH que carece de los secuencia de señal N-terminal se muestran en SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) respectivamente. Un sistema de traducción introducida que comprende un ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) , se utiliza para expresar hGH que contiene un aminoácido no naturalmente codificado. La O-RS de preferencia aminoacila el O-RNAt con un aminoácido no naturalmente codificado. A su vez, el sistema de traducción inserta el aminoácido no naturalmente codificado en hGH, en respuesta a un codon selector codificado. Tabla 2: O-RS y O-ANRt de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) .

SEQ ID NO: 4 ARNmtTyrCUA m. ARNt jannaschii SEQ ID NO: 5 HLAD03 : un ARNt ARNt supresor ámbar optimizado La transformación de E. coli con plásmidos que contienen el gen hGH modificado y el par ortogonal aminoacil ARNt sintetasa/ARNt (específico para el aminoácido no naturalmente codificado) permite la incorporación específica de sitio de aminoácido no naturalmente codificado en hGH polipéptido. El E. coli transformado desarrollado a 37°C en medio que contiene entre 0.01 - 100 mM del aminoácido no naturalmente codificado particular, expresa hGH modificado con alta fidelidad y eficiencia. Métodos para purificación y análisis de hGH se conocen por aquellos con destreza ordinaria en la técnica y se confirman por SDS-PAGE, análisis de transferencia Western, o espectrometría de masas con trampa de ionización de electro rocío y semejantes. Ejemplo 5 Este ejemplo detalla la introducción de un aminoácido que contiene carbonilo y subsecuente reacción con un PEG que contiene aminooxi. Este ejemplo demuestra un método para generar un hGH polipéptido que incorpora un aminoácido no naturalmente codificado que contiene cetona que reacciona subsecuentemente con PEG que contienen aminooxi de aproximadamente 5,000 MW. Cada uno de los residuos 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 103, 111, 120, 131, 133, 134, 135, 136, 139, 140, 143, 145, y 155 identificado de acuerdo con los criterios del Ejemplo 3 (hGH) se sustituye por separado con un aminoácido no naturalmente codificado que tienen las siguiente estructura: Las secuencias utilizadas para incorporación específica de sitio de p-acetil-fenilalanina en hGH son SEQ ID NO: 2 (1ÍGH) , y SEQ ID NO: 4 (ARNmutt, ARNmtt?CUA M. jannaschii ) , y 16, 17 o 18 (TyrRS LWl , 5, o 6) de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404 descrita en el Ejemplo 4 anterior. Una vez modificada, la variante de polipéptido hGH que comprende el aminoácido que contiene carbonilo, se reaccionan con un derivado PEG que contiene aminooxi de la forma : R-PEG(N) -O- (CH2)n-0-NH2 en donde R es metilo, n es 3 y N es aproximadamente 5,000 MW. El hGH purificado que contiene p-acetilfenilalanina disuelta en 10 mg/mL en MES 25 mM (Sigma Chemical, St Louis, MO) pH 6.0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 7.0, o en acetato de sodio 10 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5, se reaccionan con un exceso de 10 a 100 veces de PEG que contienen aminooxi, y después se agita por 10 - 16 horas la temperatura ambiente (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475) . PEG-hGH después se diluye en amortiguador apropiado para inmediata purificación y análisis. Ejemplo 6 Conjugación con PEG que consiste de un grupo hidroxilamina enlazado a PEG mediante un enlace amida. Un reactivo PEG que tienen la siguiente estructura se acopla a un aminoácido no naturalmente codificado que contiene cetona utilizando el procesamiento escrito en el Ejemplo 5: R-PEG(N) -0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2)n-0-NH2 en donde R es metilo, n=4 y N es aproximadamente 20,000 MW.

Las condiciones de reacción, purificación y análisis son como se describe en el Ejemplo 5. Ejemplo 7 Este ejemplo detallado conjugación de polipéptido hGH con un PEG que contiene hidrazida y subsecuente reducción in si tu . Un polipéptido hGH que incorpora un aminoácido que contiene carbonilo, se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en los Ejemplos 4 y 5. Una vez modificado, un PEG que contiene hidrazida que tienen la siguiente estructura, se conjuga al polipéptido hGH: R-PEG (N) -0- (CH2) 2-NH-C (0) (CH2) n-X-NH-NH2 en donde R = metilo, n=2 y N = 10,000 MW y X es un grupo carbonilo (C=0) . El hGH purificado que contiene /l - acetylphenylalanine se disuelve en 0.1-10 mg/mL en MES 25 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 6.0, Hepes 25 M (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 7.0 , o en acetato de Sodio 10 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5 , se reaccionan con un exceso de 10 a 100 veces de PEG que contiene hidrazida y la hidrazona correspondientes se reduce in si tu por adición del material NaCNBH3 1M (Sigma Chemical, St . Louis, MO) , disuelto en H20, a una concentración final de 10-50 mM. Las reacciones se llevan a cabo la oscuridad 4°C a RT por 18-24 horas. Las reacciones se detienen por adición de Tris 1 M (Sigma Chemical, St . Louis, MO) a aproximadamente pH 7.6 a una concentración Tris final de 50 mM o diluyen en amortiguador apropiado para purificación inmediata. Ejemplo 8 Este ejemplo detalla la introducción de un aminoácido que contiene alquino en un polipéptido hGH y derivatización con PEGm-azida. Los siguientes residuos, 35, 88, 91, 92, 94, 95, 99, 101, 131, 133, 134, 135, 136, 140, 143, 145, y 155, cada uno están sustituidos con el siguiente aminoácido no naturalmente purificado (hGH; SEQ ID NO: 2 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404) : Las secuencias utilizadas para incorporación específica de sitio de p-propargil-tirosina en hGH son SEQ ID NO: 2 (hGH), SEQ ID NO: 4 (ARNmutt, ARNmtTyrCUA M. jannaschii ) , y 9, 10 o 11 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US US 2005/0170404 descrita en el Ejemplo 4 anterior. El polipéptido hGH que contiene la propargil tirosina se expresa en E. coli y purificado utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 5. La hGH purificada que contiene propargil tirosina disuelta entre 0.1-10 mg/mL en amortiguador PB (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 0.15 M, pH = 8) y exceso de 10 a 1000 veces de PEG que contiene azida, se agrega a la mezcla de reacción. Con la cantidad que catalítica de CuS0 y alambre de Cu se agregan entonces a la mezcla de reacción. Después de que la mezcla se incuba (incluyendo pero no limitaba a aproximadamente cuatro horas a temperatura ambiente o 37°C, o durante la noche a 4°C) , H20 se agrega y la mezcla se filtra a través de una membrana de diálisis. La muestra puede ser analizada por la adición, incluyendo pero no limitada a, por procedimientos similares descritos en el Ejemplo 5. En este ejemplo, el PEG tendrá la siguiente estructura: R-PEG(N) -0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2)n-N3 en donde R es metilo, n es 4 y N es 10,000 MW. Ejemplo 9 Este ejemplo detalla la sustitución de un gran aminoácido hidrofóbico en un hGH polipéptido con propargil tirosina. Un residuo Phe, Trp o Tyr presente dentro de una de los siguientes regiones de hGH: 1-5 (extremo N) , 6-33 (elise A) , 34-74 (región entre hélice A y hélice B, el bucle A-B) , 75-96 (hélice B) , 97-105 (región entre hélice B y hélice C, el bucle B-C) , 106-129 (C hélice) , 130-153 (región entre hélice C y hélice D, el bucle C-D) , 154-183 (D hélice) , 184-191 (exteremo C) (SEQ ID NO: 2 de la publicación de la Patente de los E.U.A. No. US 2005/0170404), se sustituye con el siguiente aminoácido no naturalmente codificado como se describe en el Ejemplo 8: Una vez modificado, un PEG se conecta a la variante hGH polipéptido, que comprende el aminoácido que contiene alquino. El PEG tendrá la siguiente estructura: Me-PEG(N)-0-(CH2)2-N3 y procedimientos de acoplamiento seguirán aquellos del Ejemplo 8. Esto generará una variante de polipéptido hGH que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que aproximadamente isostérico con uno de los aminoácidos hidrofóbicos grandes de origen natural y que se modifican con un derivado PEG en un sitio distinto dentro del polipéptido. Ejemplo 10 Metionil hGH polipéptido con para-acetilfenilalanina (pAF) sustituido en la posición 35 descrito en el Ejemplo 1 se conjuga con hidrocloruro de monometoxi-PEG-2 -aminooxi etilamina carbamato (PEG de 30K) . El hGh polipéptido se expresa en células anfitrionas de E. coli utilizando p-acetilfenilalanina y construcciones que expresan un par ortogonal ANRt y una aminoacil -ARNt sintetasa. El siguiente procedimiento se realiza para formar un enlace oxima entre el hGH polipéptido y PEG. La cantidad de MPEG- Oxiamina de 30 K empleados a determinar utilizando la proporción molar de 8 para PEG:Y35pAF hGH polipéptido. El polvo de PEG se pesa y el polvo se agrega en aproximadamente tres porciones iguales a los 8.86 mg/ml de solución de Y35pAF hGH mientras que se agita lentamente a temperatura ambiente. Grandes trozos de PEG sólidos se trituran manualmente. La mezcla de reacción se incuba a 28°C por 10 minutos después de las primeras y segunda adiciones. Siguiendo la última adición, la mezcla de reacción se coloca 28°C con ligera agitación por 40 horas. Se entiende que los ejemplos y modalidades aquí descritas son para propósitos ilustrativos solamente y que diversas modificaciones localizadas de los mismos se le sugerirán a personas con destreza ordinaria en la técnica y se habrán de incluir dentro del espíritu y competencia de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes, y/u otros documentos citados en esta solicitud se incorporan por referencia en su totalidad para todos propósitos de la misma proporción como si cada individual publicación, patentes, solicitud de patentes y/u otro documento se indican individualmente he incorporado por referencia para todos propósitos .

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para modular inmunogenicidad de un polipéptido, el método comprende sustituir uno o más aminoácidos no naturalmente codificados por cualquiera uno o más aminoácidos de origen natural en el polipéptido.
2. 2. El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende una etapa adicional de modificar el polipéptido por una o más modificaciones post- traducción.
3. 3. El método de conformidad con la Reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende una etapa adicional de ligar o unir el polipéptido con un enlazador, polímero, o molecular biológicamente activa.
4. 4. El método de conformidad con la Reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido se enlaza o une a un polímero soluble en agua.
5. 5. El método de conformidad con la Reivindicación 4, caracterizado porque el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol) .
6. 6. El método de conformidad con la Reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido se enlaza o une a un polímero soluble en agua mediante un enlace oxima entre el aminoácido no naturalmente codificado y el polímero soluble en agua .
7. 7. Método para modular inmunogenicidad de un polipéptido, el método se caracteriza porque comprende: generar un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificados; cultivar células que comprenden el polinucleótido o polinucleótidos que codifican el polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificados, un ARN sintetasa ortogonal y un ARNt ortogonal bajo condiciones para permitir expresión del polipéptidos que comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados; y purificar el polipéptidos que comprenden uno o más aminoácidos no naturalmente codificados.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 7 caracterizado porque el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido no naturalmente codificado comprende una cetona.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aminoácido no naturalmente codificado es para-acetilfenilalanina.
11. 11. El método de conformidad con la Reivindicación 1 o 7, caracterizado porque el polipéptido es hormona de crecimiento humano.
12. 12. Un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados que tienen inmunogenicidad modulada.
13. 13. Un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados que tienen inmunogenicidad modulada por uno o más epítopos específicos del polipéptido, en comparación con el polipéptido nativo.
14. 14. El polipéptidos de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido tiene inmunogenicidad incrementada para uno o más epítopos específicos del polipéptido en comparación con el polipéptido nativo.
15. 15. El polipéptidos conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptidos tiene inmunogenicidad disminuida para uno o más epítopos específicos del polipéptido en comparación con el polipéptido nativo.
16. 16. Una composición que comprende el polipéptido de conformidad con la reivindicación 12 o 13 y un portador farmacéuticamente aceptable.
17. 17. Método para tratar a un sujeto que comprende administrar el sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 16.
18. 18. El uso del polipéptidos de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque se dice del grupo que consiste de: para eliminar inmunogenicidad de un polipéptido inmunogénico, como una vacuna para incluir o estimular la inmunogenicidad de un inmunógeno, para bloquear enlace de anticuerpo a un polipéptido y tratar una o más enfermedades autoinmunes.
19. 19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptidos es más inmunogénico en comparación con el polipéptido nativo.
20. 20. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido es menos inmunogénico en comparación con el polipéptido nativo.