MX2007015638A - Metodos y composiciones para el tratamiento de infecciones persistentes y cancer por inhibicion de la ruta de muerte celular programada (pd-1) - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento, prevención o reducción de infecciones persistentes, por ejemplo, infecciones crónicas, infecciones latentes e infecciones lentas y cáncer. Los métodos y composiciones de la invención también sonútiles para el alivio de uno o más síntomas asociados con estas infecciones y con cáncer.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES PERSISTENTES Y CÁNCER POR INHIBICIÓN DE LA RUTA DE MUERTE CELULAR PROGRAMADA (PD-1) INVESTIGACIÓN REALIZADA CON PATROCINIO FEDERAL Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos mediante las subvenciones AI39671 y CA84500 del Instituto Nacional de Salud (NHI o Na tional Heal th Insti tute) . El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

CAMPO DE A INVENCIÓN En general, la presente invención se relaciona con métodos y composiciones para el tratamiento de infecciones persistentes y cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Aun cuando el desarrollo de vacunas preventivas ha disminuido notablemente la tasa de mortalidad por infecciones virales, el uso de estas vacunas contra virus que causan infecciones persistentes (por ejemplo, el virus de la hepatitis C) ha tenido éxito limitado. En contraste con los virus que causan infecciones agudas y de resolución espontánea, la respuesta inmune que se genera contra los microbios causantes de infección persistente muchas veces es transitoria e insuficiente para aliviar la infección. En consecuencia, el microbio infeccioso permanece dentro del individuo infectado durante periodos de tiempo prolongados, sin que necesariamente le provoque un daño constante al hospedero . Uno de los mayores impedimentos en la erradicación de los microbios causantes de infección persistente es la habilidad de estos microbios para evadir el sistema inmune del organismo hospedero. Por ejemplo, ciertos virus y parásitos disminuyen la expresión de moléculas del hospedero necesarias para el reconocimiento eficiente de células infectadas por parte de las células T. Las infecciones persistentes también causan deficiencia funcional de las células T CD8+ específicas de antígeno, vitales para el control y erradicación de infecciones virales. Aunque se ha promovido la combinación de vacunas terapéuticas con citocinas auxiliares, las respuestas inmunes resultantes no han erradicado satisfactoriamente el patógeno. Por lo tanto, se requieren mejores métodos para tratar, prevenir o aliviar infecciones persistentes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento, prevención o reducción de una infección persistente o de cáncer o como alternativa la reducción de uno o más de sus síntomas. La invención tiene como base el descubrimiento de que las células T CD8+ específicas de antígeno se vuelven funcionalmente tolerantes ("agotadas") al agente infeccioso después de la inducción del polipéptido de muerte celular programada 1 (PD-1). En consecuencia, al reducir la expresión o actividad del PD-1, PD-L1 o PD-L2, aumenta la proliferación de células T CD8+ funcionalmente tolerantes, la producción de citocinas y la velocidad de depuración de un agente infeccioso (por ejemplo, viral, bacteriano, fúngico, parasitario o cáncer) por lo que se intensifica la respuesta inmune específica al agente infeccioso. Por consiguiente, la invención proporciona un método para aliviar o prevenir un síntoma de una infección persistente (por ejemplo, una infección viral, una infección bacteriana, una infección por hongos, una infección micoplásmica y una infección parasitaria) o de cáncer, al administrar a un individuo que lo necesite (por ejemplo, a un ser humano) un compuesto que reduce la actividad o expresión de un miembro de la familia de análogos al tipo CD-28 (por ejemplo, PD-1, CTLA-4, BTLA y un fragmento funcional o una variante del mismo) o ligandos de la familia de análogos al tipo CD-28 (por ejemplo, PD-L1 o PD-L2). Como alternativa, al individuo se le administra una célula T o una célula B específicas de antígeno que ha estado en contacto con un compuesto que reduce la expresión o actividad de un polipéptido PD-1 en la célula. Por ejemplo, la célula T o la célula B específicas de antígeno son específicas para un antígeno viral. La célula T o la célula B se deriva de una fuente autóloga o se deriva de otro individuo de la misma o de diferente especie que el individuo que se trata. Por otra parte, la invención presenta un método para aumentar la actividad citotóxica de una célula T (por ejemplo, una célula T anérgica o una célula T que ha aumentado su tolerancia a los antígenos) al poner en contacto la célula T con un compuesto que reduce la actividad o expresión de un polipéptido PD-1. En los aspectos de la invención mencionados en lo anterior, las infecciones virales persistentes se derivan de agentes infecciosos como el virus de la hepatitis, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotrófico T humano (VLTH) , virus de herpes, virus Epstein-Barr o virus de papiloma humano. Las infecciones virales persistentes también pueden incluir infecciones causadas por un virus latente. Los tipos de cáncer incluyen trastornos linfoproliferativos como el linfoma angioinmunoblástico y el linfoma de Hodgkin de linfocito nodular. De preferencia, el compuesto de la invención aumenta una respuesta inmune antígeno específica al aumentar la actividad citotóxica de la célula T (por ejemplo, un aumento en la producción de citocinas citotóxicas como IFN?,TNFa o IL-2, un aumento en la proliferación de célula T o un aumento en la depuración viral) en el individuo que se trata. Por ejemplo, el compuesto reduce la expresión o actividad de un ligando 1 de PD (PD-Ll) o un ligando 2 de PD (PD-L2) o reduce la interacción entre PD-1 y PD-Ll o la interacción entre PD-1 y PD-L2. Los compuestos ilustrativos incluyen anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll y un anticuerpo anti-PD-L2), moléculas RNAi (por ejemplo, moléculas anti-PD-1 RNAi, anti-PD-Ll RNAi y anti-PD-L2 RNAi), moléculas antisentido (por ejemplo, anti-PD-1 ARN antisentido, anti-PD-Ll ARN antisentido y anti-PD-L2 ARN antisentido) , proteínas negativas dominantes (por ejemplo, proteína PD-1 negativa dominante, proteína PD-Ll negativa dominante y proteína PD-L2 negativa dominante) e inhibidores de moléculas pequeñas. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos desinmunizados y proteínas de fusión Ig. Un anticuerpo anti-PD-Ll incluye el clon EH12.

Además del compuesto que reduce la expresión o actividad de PD-1, al individuo que se trata también se le puede administrar una vacuna que puede incluir o no un auxiliar o un refuerzo cebador. Como opción, al individuo que se le administra un segundo compuesto, por ejemplo, un compuesto antiviral (por ejemplo, vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganclovir, inhibidor análogo de nucleósidos de transcriptasa inversa ( nucleoside-analog reverse transcriptase o NRTI) como AXT (zidovudina), ddl (didanosina) , ddC ( zalcitabina) , d4T (stavudina) o 3TC (lamivudina), inhibidores no nucleósidos de transcriptasa inversa ( non -nucleoside reverse transcriptase inhibi tor o NNRTI) como nevirapina o delavirdina, inhibidor de proteasa como saquinavir, ritonavir, indinavir o nelfinavir, rivabirina e interferón) , un compuesto antibacteriano, un compuesto antifúngico y un compuesto antiparasitario. El segundo compuesto puede ser también un compuesto que reduzca la expresión o actividad de antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4) o atenuador de los linfocitos B y T (BTLA) . Otros compuestos ilustrativos que se le pueden administrar la individuo son los anticuerpos anti-CTLA-4, anticuerpos anti-BTLA, anticuerpos anti-CD-28, anticuerpos anti-ICOS, anticuerpos anti-ICOS-L, anticuerpos anti-B7-l, anticuerpos anti-B7-2, anticuerpos anti-B7-H3 y anticuerpos anti-B7-H4. La presente invención también proporciona un método para identificar un compuesto candidato que modula la actividad o expresión de un polipéptido PD-1, el método consta de los siguientes pasos: (a) poner en contacto una célula que exprese un gen PD-1 (por ejemplo, el gen de fusión PD-1) con un compuesto candidato; (b) medir la expresión o actividad del PD-1 en la célula (por ejemplo, midiendo la expresión del ARNm o proteína del PD-1); y (c) comparar la expresión o actividad del PD-1 en la célula con la correspondiente expresión o actividad en una célula control que no ha entrado en contacto con el compuesto. Un aumento o disminución en la expresión o actividad del PD-1 indica que el compuesto candidato es útil para modular la expresión o actividad de un polipéptido PD-1. Como alternativa, el método de tamizaje puede incluir los siguientes pasos: (a) poner en contacto una célula T que sobreexprese un gen PD-1 con un compuesto candidato, (b) determinar la actividad citotóxica de la célula T, (c) comparar la actividad citotóxica de la célula T con la actividad correspondiente en una célula control que no ha estado en contacto con el compuesto. Un aumento o disminución de esta actividad identifica al compuesto candidato como útil para modular la expresión o actividad de un polipéptido PD-1. La actividad citotóxica incluye la producción de citocinas, la proliferación de células T y la depuración viral. La invención también proporciona un método de tamizaje que consta de los siguientes pasos: (a) poner en contacto un polipéptido PD-1 con un compuesto candidato; (b) determinar si el compuesto candidato interactúa con el polipéptido PD-1; y (c) identificar un compuesto candidato como un compuesto útil para modular la expresión o actividad del PD-1. De preferencia, el compuesto candidato identificado interactúa con el polipéptido PD-1 y reduce su actividad. El compuesto candidato identificado con estos métodos de tamizaje reduce la interacción entre el PD-1 y el PD-Ll o entre el PD-1 y el PD-L2. Las células empleadas en cualquiera de los métodos que se describen en la presente incluyen células de mamífero como las células de roedores o células humanas . La célula es una célula inmune, por ejemplo, una célula T. De preferencia, el polipéptido PD-1 utilizado en estos métodos de tamizaje es un polipéptido PD-1 humano. También se presenta aquí un método para diagnosticarle a un individuo que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer, el método consta de los siguientes pasos: (a) obtener de un individuo una muestra que contiene células inmunes (por ejemplo, células T o B) , y (b) medir la expresión o actividad del PD-1 en la muestra. Un aumento en la expresión o actividad del PD-1 en comparación con esta expresión o actividad en una muestra de control, indica que el individuo padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer de preferencia, el paso (b) implica identificar células inmunes específicas de antígeno, por ejemplo, un antígeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico. También se describe un método para seleccionar un tratamiento para un individuo que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer. Este método consta de los siguientes pasos: (a) obtener de un individuo una muestra que contenga células inmunes (por ejemplo, células T o células B) ; y (b) medir la expresión o actividad del PD-1 en las células inmunes, de manera que un aumento en la expresión o actividad del PD- 1 en comparación con esta expresión o actividad en una muestra control indique que el individuo padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer, y (c) seleccionar un tratamiento para el individuo al que se le diagnostica que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer, de manera que el tratamiento incluya un compuesto que reduce la expresión o actividad del PD-1. De preferencia, el paso (b) implica identificar células inmunes específicas de antígeno, por ejemplo antígeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico. Las muestras derivados de los individuos incluyen muestras de sangre, biopsias de tejido y muestras de médula ósea. Por otra parte, las células de control pueden obtenerse de un individuo que no padezca ni este en riesgo de padecer una infección persistente. La invención también proporciona una composición que contiene: (a) un compuesto que reduce el nivel o actividad del PD-1; y (b) un segundo compuesto, por ejemplo, un compuesto antibacteriano, un compuesto antifúngico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, un analgésico, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-BTLA, un anticuerpo anti-CD-28, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOS-L, un anticuerpo anti-B7-l, un anticuerpo anti-B7-2, un anticuerpo anti-B7-H3 o un anticuerpo anti-B7-H . La invención también proporciona un estuche que contiene: (a) un compuesto que reduce el nivel o actividad del PD-1; y (b) instrucciones para suministrarle el compuesto a un individuo. Como alternativa, el estuche contiene: (a) un primer compuesto que reduce el nivel o actividad del PD-1; (b) un segundo compuesto, por ejemplo, un compuesto antibacteriano, un compuesto antifúngico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, un analgésico, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-BTLA, un anticuerpo anti-CD-28, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOS-L, un anticuerpo anti-B7-l, un anticuerpo anti-B7-2, un anticuerpo anti-B7-H3 o un anticuerpo anti-B7-H4; y (c) instrucciones para suministrarle el primero y el segundo compuestos a un individuo. La presente invención ofrece importantes ventajas con respecto a las terapias comunes para el tratamiento, prevención y reducción o como alternativa alivio de uno o más síntomas de infecciones persistentes. La administración de un agente terapéutico que reduce el nivel o actividad del PD-1 aumenta la citotoxicidad de las células CD8+ que a su vez aumentan la respuesta inmune al agente infeccioso que tiene la capacidad de establecer una infección persistente. Por otra parte, los métodos para seleccionar el compuesto candidato presentados en esta invención permiten la identificación de terapéuticas novedosas que modifican el proceso de deterioro y no sólo mitigan los síntomas. A menos que se indique de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente, tienen el mismo significado que comúnmente conoce el experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aun cuando se puedan utilizar métodos y materiales similares a los que se describen en la presente para llevar a la práctica la invención, en adelante se describen métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí se consideran, en su totalidad, parte de la presente como referencia. En caso de conflicto, la presente especificación, incluidas las definiciones servirá de control. Por otra parte, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no tienen un propósito limitativo. A partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones, serán evidentes otras particularidades y ventajas de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura ÍA es una gráfica de barras que muestra los niveles del ARNm de PD-1 en células T específicas de DbGP33-41 y/o DbGP276-286 de ratones transgénicos no sometidos previamente a experimentación, ratones infectados inmunes (aproximadamente 30 días después de la infección) al virus Armstrong de coriomeningitis linfocitaria (LCMV o lymphoci tic choriomeníngí tis virus ) o ratones infectados con LCMV-C1- 13 (aproximadamente 30 días después de la infección) con déficit de CD4, según se determina mediante análisis de matrices génicas . La Figura IB es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestra la expresión en superficie del PD-1 en células T CD8+ tetrámero+ en ratones infectados inmunes a LCMV Armstrong y ratones infectados con LCMV-C1-13 con déficit de CD4. Las células T CD8+ anérgicas expresan altos niveles del polipéptido PD-1 en la superficie celular aproximadamente 60 días después de infección crónica con el virus LCMV-Cl-13 (marcado como "crónico"), pero las células T CD8+ específicas del virus no expresan el polipéptido PD-1 después de la depuración de una infección LCMV Armstrong aguda (marcado como "inmune"). La Figura ÍC es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que demuestra la presencia de PD-Ll en esplenocitos de ratones infectados crónicamente y ratones no infectados. Se demuestra que la expresión de PD-Ll es la más alta en los esplenocitos que están infectados por el virus. La Figura 2A es una serie de gráficas dispersivas que muestran que cuando los ratones infectados con Cl-13 se tratan a partir del día 23 al 37 después de la infección hubo un aumento de aproximadamente 3 veces respecto al número de células T CD8+ específicas de DbNP396-404 y DbGP33-41 en comparación con los controles que sin tratar. Con el fin de determinar cualquier cambio en la función, se midió la producción de IFN? y TNFa como respuesta a 8 diferentes epítopes LCMV. La Figura 2B es una gráfica dispersiva que muestra que cuando todas las especificidades conocidas de las células T CD8+ se miden, hay un aumento equivalente a 2.3 veces en el número total de células T CD8 específicas de LCMV. La Figura 2C es una serie de gráficas de citometría de flujo que muestran la producción de IFN? y TNFa como respuesta a ocho diferentes epítopes de LCMV. La Figura 2D es una gráfica dispersiva que muestra que en los ratones tratados más células T CD8 específicas del virus tienen la capacidad de producir TNFa. La Figura 2E es una serie de gráficas de barra que muestran que el bloqueo del PD-Ll también da como resultado un aumento en el control viral en bazo, hígado, pulmón y suero. La Figura 3A es una gráfica que demuestra el aumento en células T CD8+ específicas de DbGP33-41 y DbGP276-286 (marcadas como "GP33" y "GP276") en ratones infectados con Cl-13 que tienen déficit de CD4, tratados con anti-PD-Ll (marcado como "aPD-Ll") a partir del día 46 al día 60 después de la infección, en comparación con el control (marcado como "unta"), que demuestra que los ratones tratados con anti-PD-Ll contenían aproximadamente 7 veces más células T CD8+ esplénicas específicas de DbGP276-286 y aproximadamente 4 veces más de células T CD8+ esplénicas específicas de DbGP33-41 que los ratones sin tratar. La Figura 3B es una serie de imágenes que demuestran el aumento en la frecuencia de células T CD8+ específicas de DbGP33-41 y DbGP276-286 en el bazo de ratones infectados con Cl-13 deficientes en CD4 tratados con anti-PD-Ll (marcado como "aPD-Ll Tx") a partir del día 46 al día 60 después de la infección en comparación con el control (marcado como "untx") . La Figura 3C es una serie de imágenes que demuestran un aumento en la proliferación de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 en ratones tratados con PD-Ll, determinada mediante incorporación de BrdU y expresión de Ki67. La Figura 3D es una gráfica que muestra que los ratones que tienen altos niveles de expansión de células T CD8+ manifiestan una apreciable respuesta en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC o peripheral blood mononuclear cells ) , como se muestra al comparar las células CD8+ específicas de DbGP276-286 en las PBMC y las células T CD8+ específicas de DbGP276-286 en el bazo. La Figura 4A es una serie de gráficas que demuestran el aumento de células T CD8+ específicas de DbGP33-41 y DbGP276-286 productoras de IFN?, en ratones tratados con anti-PD-Ll, en comparación con los controles. También se detectaron altas frecuencias de células T CD8+ específicas de DbNP396-404, KbNP205-212, DbNP166-175 y DbGP92-101, en ratones tratados con anti-PD-Ll. La Figura 4B es una gráfica que demuestra que en los ratones tratados con anti-PD-Ll, 50% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 producen IFN? en comparación con un 20% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 en los ratones de control. La Figura 4C es una serie de imágenes que demuestran que los ratones crónicamente infectados tratados con anti-PD-Ll producen niveles más altos de TNFa que los ratones crónicamente infectados sin tratar, pero producen niveles de TNFa todavía menores que los ratones inmunes infectados con el virus LCMV Armstrong. La Figura 4D es una gráfica que demuestra que el tratamiento con anti-PD-Ll de los ratones infectados con LCMV-C1-13, renueva la actividad lítica ex vivo de las células T específicas del virus, en comparación con los ratones infectados sin tratar, determinada mediante un ensayo de liberación de 51Cr. La Figura 4E es una serie de gráficas que demuestran la reducción de valores virales en varios órganos después del tratamiento con a-PD-Ll de los ratones infectados con LCMV-C1-13. Los valores virales disminuyeron aproximadamente 3 veces en el bazo, 4 veces en el hígado, 2 veces en el pulmón y 2 veces en el suero después de 2 semanas de un tratamiento con anti-PD-Ll, en comparación con los ratones sin tratar. La Figura 5A es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestra la expresión en superficie del PD-1 y que utiliza 10 tetrámeros VIH específicos para epítopes dominantes dirigidos a la infección por VIH clade C crónica. Los porcentajes indican el porcentaje de células tetrámero+ que son PD-1+. La Figura 5B es una serie de gráficas que demuestran que el porcentaje y el MFI del PD-1 tiene un importante aumento regulado en las células T CD8 específicas del VIH en comparación con la población total de células T CD8 (p<0.0001) en individuos que no habían recibido tratamiento previo de terapia antirretroviral y el PD-1 aumenta en la población total de células T CD8 en individuos infectados con VIH en comparación con los controles seronegativos a VIH (p=0.0033 y p<0.0001, respectivamente) . Se incluyeron en el análisis tinciones de 120 tetrámeros de VIH de 65 individuos infectados con VIH y 11 controles seronegativos a VIH. La Figura 5C es una serie de gráficas que muestran la mediana del porcentaje y la MFI de la expresión de PD-1 en células tetrámero+ por especificidad de epítope. La Figura 5D es una gráfica que representa la variación en el porcentaje de células PD-1+ en diferentes poblaciones específicas de epítope dentro de individuos con múltiples respuestas detectables. Las barras horizontales indican la mediana del porcentaje de células de tetrámero VIH+ PD-1+ en cada individuo. La Figura 6A es una serie de gráficas que demuestran que no hay correlación entre el número de células T CD8+ específicas de VIH, determinado por tinción de tetrámeros y carga viral plasmática, mientras que sí existe una correlación positiva entre el porcentaje y la MFI de PD-1 en células de tetrámero+ y la carga viral plasmática (p=0.0013 y p<0.0001, respectivamente) . La Figura 6B es una serie de gráficas que muestran que no hay correlación entre el número de células de tetrámero VIH y la cifra de CD4, mientras que sí hay una correlación inversa entre el porcentaje y la MFI de PD-1 en células de tetrámero+ VIH y la cifra de CD4 (p=0.0046 y p=0.0150, respectivamente). La Figura 6C es una serie de gráficas que demuestran que el porcentaje y MFI de PD-1 en la población total de células T CD8 se correlaciona positivamente con la carga viral plasmática (p=0.0021 y p<0.0001, respectivamente). La Figura 6D es una serie de gráficas que representan que el porcentaje y la media de la intensidad de fluorescencia (MFI o mean fl uorescence in tensi ty) de la expresión de PD-1 en la población total de células T CD8 se correlaciona inversamente con las cifras de CD4 (p=0.0049 y p=0.0006, respectivamente). La Figura 7A es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestra la tinción fenotípica representativa de células T CD8+ específicas de B*4201 TL9 de un individuo SK222 en el cual 98% de las células T CD8+ específicas de B 201 TL9 son PD-1+. La Figura 7B es una gráfica que ilustra un resumen de datos fenotípicos de personas en quienes >95% de células T CD8+ específicas de VIH son PD-1+ se analizaron de 7 a 19 muestras para cada uno de los marcadores fenotípicos indicados. La barra horizontal indica la mediana del porcentaje de células de tetrámero+ PD-1+ que fueron positivas para el marcador indicado. La figura 8A es una serie de imágenes de un experimento de citometría de flujo que muestra los datos representativos del ensayo de proliferación de un individuo positivo a B*4201. Después de 6 días de estimulación con el péptido, el porcentaje de células T CD8 específicas de B 201 TL9 aumentó de 5.7% a 12.4% en presencia de un anticuerpo bloqueador anti-PD-Ll. La Figura 8B es una gráfica de líneas que representa los datos resumidos del ensayo de proliferación, la cual indica un aumento importante en la proliferación de células T CD8 específicas de VIH en presencia de un anticuerpo bloqueador anti-PD-Ll (n=28, p=0.0006, prueba t para datos emparejados). La Figura 8C es una gráfica de barras que muestra los efectos diferenciales del bloqueo PD-1/PD-L1 en la proliferación de células T CD8 específicas de VIH por paciente individual. Las barras blancas indican el aumento de células de tetrámero+ en presencia de péptido solo, las barras negras indican el aumento de células de tetrámero+ en presencia de péptido más anticuerpo bloqueador anti-PD-Ll. Los individuos en quienes se realizaron ensayos CFSE para más de un epítope se indican con los símbolos de asterisco, cuadrado o triángulo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En las últimas décadas el uso de antibióticos ha reducido notablemente la tasa de mortalidad ocasionada por infecciones microbianas. El éxito de las modalidades de tratamiento antimicrobiano ha estado limitado por la capacidad de ciertos agentes infecciosos para evadir el sistema inmune del organismo hospedero y a su vez establecer una infección persistente. Por ejemplo, la respuesta inmune que se genera contra virus como el de la hepatitis y el VIH no es suficiente para depurar el agente infeccioso, el cual permanece en el individuo infectado. En estas infecciones, las células T CD8+ específicas de antígeno se vuelven funcionalmente tolerantes al agente infeccioso y entran en un estado conocido como "anergia" o "agotamiento". Las células T anérgicas pierden su actividad citotóxica, es decir, su habilidad para producir citocinas, proliferar y depurar el agente infeccioso. La presente invención tiene como base el sorpresivo descubrimiento de que la anergia de las células T es concurrente con una inducción de la expresión de PD-1 y que la expresión de PD-1 se correlaciona con ciertos tipos de trastornos linfoproliferativos . Por consiguiente, la invención presenta métodos para aumentar la citotoxicidad de las células T al poner en contacto una célula T con un agente que reduce la expresión o actividad del PD-1, ligando de PD-1 (PD-Ll) o ligando 2 de PD-1 (PD-L2) . De manera más específica, la invención proporciona métodos para tratar o prevenir una infección persistente o trastornos linfoproliferativos (por ejemplo, cáncer como el linfoma angioinmunoblástico y el linfoma de Hodgkin de linfocito nodular predominante) al administrarle a un individuo un agente que reduce la expresión o actividad del PD-1. La reducción de la expresión o actividad de PD-1, PD-Ll o PD-L2 da como resultado un aumento de la actividad de las células T citotóxicas, aumentando la respuesta inmune específica hacia el agente infeccioso. Los resultados que aquí se presentan muestran que la administración de anticuerpos bloqueadores anti-ligando-1 de muerte programada (PD-Ll) en ratones con infección persistente, aumentó la actividad citotóxica de las células T anérgicas . Específicamente, la alteración de la señalización de PD-1 indujo la expresión de células T CD8+, intensificó la producción de citocinas y aumentó la depuración viral. Por otra parte, las células T CD8+ generadas durante infecciones persistentes en ratones deficientes en CD4 proliferaron y recuperaron mucho de su función con el tratamiento anti-PD-Ll. Para que las células T respondan a proteínas exógenas, las células presentadoras de antígeno (APCs) tienen que emitir dos señales a los linfocitos T en reposo. La primera señal, que confiere especificidad a la respuesta inmune, es transducida a través del receptor de célula T (TCR) después del reconocimiento del péptido antigénico exógeno presentado en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La segunda señal, denominada coestimulación, induce la proliferación de las células T y las hace funcionales. La coestimulación ni es específica de antígeno ni está restringida por el MHC y se deriva de uno o más polipéptidos de superficie celular distintos expresados por las APC. Si las células T se estimulan sólo a través del receptor de célula T, sin recibir una señal coestimuladora adicional, se vuelven insensibles, anérgicas o mueren, lo que da como resultado un descenso de la respuesta inmune. Las proteínas CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), expresadas en las APC son polipéptidos coestimuladores críticos. Aun cuando la B7-2 tiene una función predominante durante las respuestas inmunes primarias, la B7-1 se incrementa después en el transcurso de una respuesta inmunitaria y prolonga las respuestas de células T primarias o coestimular las respuestas de las células T secundarias. Los polipéptidos B7 son capaces de proporcionar señales coestimuladoras o inhibidoras a las células inmunes para promover o inhibir las respuestas de las células inmunes. Por ejemplo, cuando se unen a un receptor coestimulador, el PD-Ll (B7-4) induce coestimulación de células inmunes o inhibe la coestimulación de células inmunes cuando están presentes en forma soluble. Cuando se unen a un receptor inhibitorio, las moléculas B7-4 pueden transmitir una señal inhibidora a una célula inmune. Los miembros ejemplificativos de la familia B7 incluyen B7-1, B7-2, B7-3 (reconocidos por el anticuerpo BB-1) B7h (PD-Ll) y B7-4 y fragmentos solubles o derivados de los mismos. Los miembros de la familia B7 se unen a uno o más receptores en una célula inmune, por ejemplo, CTLA-4, CD-28, ICOS, PD-1 y/u otros receptores y dependiendo del receptor, tienen la habilidad de transmitir una señal inhibidora o una señal coestimuladora a una célula inmune. El CD-28 es un receptor que se expresa constitutivamente en células T en reposo. Después de la señalización a través del receptor de la célula T, la ligación del CD-28 y la transducción de una señal coestimuladora hace que las células T proliferen y segreguen IL-2. El CTLA-4 (CD152), un receptor homólogo del CD28, está ausente en las células T en reposo pero su expresión es inducida después de la activación de las células T. El CTLA-4 tiene una función en la regulación negativa de las respuestas de las células T. El ICOS, un polipéptido relacionado con el CD-28 y el CTLA-4, participa en la producción de IL-10. El PD-1, el receptor al cual se unen el PD-Ll y el PD-L2, también es inducido rápidamente en la superficie de las células T. El PD-1 también se expresa en la superficie de las células B (como respuesta a un anti-IgM) y en un subconjunto de timocitos y células mieloides . La adición del PD-1 (por ejemplo, por reticulación o por agregación) da lugar a la transmisión de una señal inhibidora en una célula inmune, ocasionando una reducción de las respuestas inmunes concomitante con un aumento en la anergia de la célula inmune. Los miembros de la familia PD-1 se unen a uno o más receptores, por ejemplo, PD-Ll y PD-L2 en las células presentadoras de antígenos. Los PD-Ll y PD-L2, los cuales son polipéptidos ligandos de PD-1, son miembros de la familia de polipéptidos B7. Cada ligando de PD-1 contiene una secuencia de señal, un dominio IgV, un dominio IgC, un dominio transmembrana y una cola citoplásmica corta. Estos ligandos se expresan en placenta, bazo, ganglios linfáticos, timo y corazón. El PD-L2 también se expresa en páncreas, pulmón e hígado, mientras que el PD-Ll se expresa en hígado fetal, células T activadas y células endoteliales. Los dos ligandos de PD-1 aumentan en monocitos activados y células dendríticas.

Definiciones En el sentido que se utiliza en la presente, el término "infección persistente" se refiere a una infección en la que el agente infeccioso (por ejemplo, virus, bacteria, parásito, micoplasma u hongos) no se depura o elimina del hospedero infectado, incluso después de la inducción de una respuesta inmune. Las infecciones persistentes pueden ser infecciones crónicas, infecciones latentes o infecciones lentas. Aun cuando las infecciones agudas son relativamente breves (duran de unos cuantos días a unas pocas semanas) y son superadas por el organismo mediante el sistema inmunitario, las infecciones persistentes pueden durar meses, años o incluso toda la vida. Estas infecciones también pueden recurrir frecuentemente durante un largo periodo de tiempo con etapas asintomáticas e infección productiva sin actividad citolítica o incluso sin producir daño excesivo en las células hospederas. Los agentes infecciosos causales también pueden ser detectados en el hospedero (por ejemplo, dentro de células específicas o individuos infectados), aun después de la respuesta inmune ha desaparecido, mediante técnicas estándar. La infección persistente se diagnostica en los mamíferos conforme a cualquier método estándar conocido en la técnica y descrito, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6, 368,832, 6, 579,854 y 6, 808,710 y las publicaciones de solicitud de patente Núms. 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363 y 20020106730, las cuales se consideran parte de la presente, como referencia. Por ejemplo, a un individuo se le puede diagnosticar una infección persistente por clamidia después de detectar especies de clamidia en una muestra biológica de este individuo a través de análisis PCR (reacción en cadena de polimerasa) . No es necesario que a los mamíferos se les haya diagnosticado una infección persistente para que reciban tratamiento conforme a esta invención. Los agentes microbianos capaces de establecer una infección persistente incluyen virus (por ejemplo, virus de papiloma, virus de hepatitis, virus de inmunodeficiencia humana y virus de herpes), bacterias (por ejemplo, Escherichia coli y Clamydia spp.), parásitos (por ejemplo, Plasmodimum, Leishmania spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Toxoplasma spp.) y hongos. En el sentido que se utiliza en la presente la expresión "aliviar un síntoma de una infección persistente" se refiere a mejorar cualquiera de las afecciones o síntomas asociados con la infección persistente antes o después de que se ha presentado. Como alternativa, el alivio de un síntoma de una infección persistente puede ser la disminución de la carga microbiana infecciosa (por ejemplo, viral, bacteriana, fúngica, micoplásmica o parasitaria) en el individuo en comparación con la correspondiente carga en un control sin tratar. En comparación con un control sin tratar equivalente esta reducción o grado de prevención es por lo menos de 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95% ó 100% según se determina mediante cualquier técnica estándar. De preferencia, la infección persistente está eliminada por completo cuando se detecta mediante cualquier método estándar conocido en la técnica, en cuyo caso se considera que la infección persistente se ha tratado. Un paciente que se trata por una infección persistente es aquel a quien un médico le ha diagnosticado este padecimiento. El diagnóstico y seguimiento o vigilancia pueden incluir, por ejemplo, detectar el nivel de carga microbiana en una muestra biológica (por ejemplo, una biopsia de tejido, una prueba en sangre u orina) , detectar el nivel de marcador sustituto de la infección microbiana en una muestra biológica, detectar síntomas asociados con las infecciones persistentes o detectar células inmunes que participan en la respuesta inmune típica de las infecciones persistentes (por ejemplo, detección de las células T específicas de antígeno que son anérgicas). Un paciente que se somete a la prevención de una infección persistente puede haber recibido o no el diagnóstico correspondiente. Una persona relacionada con la técnica comprenderá que estos pacientes pudieron haberse sometido a las mismas pruebas estándar que se describen en lo anterior o pueden haber sido identificados, sin ningún examen, como alguien con alto riesgo debido a la presencia de uno o más factores de riesgo (por ejemplo, historia familiar o exposición al agente infeccioso) . En el sentido que se utiliza en la presente, el término "PD-1" se refiere a un polipéptido que forma un complejo con las proteínas PD-Ll o PD-L2 y por lo tanto participa en las respuestas inmunes, por ejemplo, la coestimulación de las células T. Las proteínas PD-1 de la invención son prácticamente idénticas a las PD-1 que se encuentran en forma natural (véase, por ejemplo, Ishida et al . , EMBO J. 11:3887-3895, 1992, Shinohara et al . , Genomics 23:704-706, 1994; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5, 698,520, la cual se considera parte de la presente, como referencia) . La señalización de PD-1 puede reducir, por ejemplo, la citotoxicidad de las células T CD8+ al reducir la proliferación de células T, la producción de citocinas o la depuración viral. Según esta invención, el polipéptido PD-1 reduce la actividad citotóxica de las células T CD8+ al menos 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó más de 100% por debajo de los niveles del control, determinada mediante cualquier método estándar. El término "gen PD-1" se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína PD-1. El término "gen de fusión PD-1" se refiere a un promotor de PD-1 y/o a una región codificante PD-1 total o parcial unida operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico heterólogo. En modalidades preferidas, la segunda secuencia de ácido nucleico heterólogo es un gen reportero, es decir, un gen cuya expresión se puede analizar; los genes reporteros incluyen, entre otros, aquellos que codifican glucuronidasa (GUS) , luciferasa, cloranfenicol transacetilasa (CAT) , proteína fluorescente verde (GFP), fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa . La expresión "reducir la expresión o actividad del PD-1" se refiere a reducir el nivel de actividad biológica del PD-1 con relación al nivel de actividad biológica del PD-1 en un control sin tratar. Según esta invención, este nivel o actividad se reduce al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o incluso más de 100%, con respecto a un control sin tratar. Por ejemplo, la actividad biológica del PD-1 se reduce si disminuye la unión del PD-1 a PD-Ll y/o PD-L2, por lo que se produce una reducción en la señalización del PD-1 y por lo tanto hay un aumento de la citotoxicidad de las células T CD8+. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "actividad" con respecto a un polipéptido PD-1 incluye cualquier actividad que sea inherente a la proteína PD-1 en estado natural, por ejemplo, la habilidad para modular una señal inhibidora en una célula inmune activada, por ejemplo, asociando un ligando natural en una célula presentadora de antígeno. Esta modulación de la señal inhibidora en una célula inmune da como resultado la modulación de la proliferación de la secreción de citocina en una célula inmune. El PD-1 también puede modular una señal coestimuladora al competir con un receptor coestimulador por la unión a una molécula B7. De este modo, el término "actividad de PD-1" incluye la habilidad de un polipéptido PD-1 para unirse a su ligando natural, la habilidad para modular señales inhibidoras o coestimuladoras y la habilidad para modular la respuesta inmune. Por consiguiente, la reducción de la actividad de PD-1 incluye reducir la interacción de PD-1 con PD-Ll o PD-L2. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, bloqueando PD-Ll o PD-L2. El término "célula inmune" se refiere a una célula de origen hematopoyético y que tiene una función en la respuesta inmune. Las células inmunes incluyen linfocitos (por ejemplo, células B y células T), linfocitos citolíticos naturales y células mieloides (por ejemplo, monocitos, macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos) . El término "célula T" se refiere a una célula T CD4+ o a una célula T CD8+. El término célula T incluye tanto a las células TH1 como a las células TH2. El término "citotoxicidad de la célula T" incluye cualquier respuesta inmune mediada por la activación de células T CD8+. Las respuestas inmunes ilustrativas incluyen la producción de citocinas, la proliferación de células T CD8+, producción de granzima o perforina y la depuración del agente infeccioso. El término "insensibilidad" incluye la refractividad o falta de respuesta de las células inmunes a la estimulación, por ejemplo, a la estimulación a través de receptor activador o una citocina. La insensibilidad se puede presentar, por ejemplo, por la exposición a inmunosupresores o la exposición a altas dosis de antígeno. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "anergia" o "tolerancia" incluye la refractividad a la estimulación mediada por un receptor de activación. Esta refractividad es por lo general específica de antígeno y persiste después de que ha terminado la exposición al antígeno tolerizante. Por ejemplo, la anergia en las células T (en contraste con la insensibilidad) se caracteriza por la ausencia de producción de citocinas, por ejemplo, IL-2. La anergia de la célula T se presenta cuando las células T se exponen a un antígeno y reciben una primera señal (una señal mediada por un receptor de célula T o por CD-3) en ausencia de una segunda señal (una señal coestimuladora) . En estas condiciones, la reexposición de las células al mismo antígeno (incluso si la reexposición se da en presencia de una molécula coestimuladora) da como resultado la imposibilidad de producir citocinas y por lo tanto de proliferar. Sin embargo, las células T anérgicas generan respuestas a antígenos no relacionados y pueden proliferar si se cultivan con citocinas (por ejemplo, IL-2) . Por ejemplo, la anergia de las células T también se puede observar por la falta de producción de IL-2 en los linfocitos T según se determina mediante ELISA o por un ensayo de proliferación que utiliza una línea celular indicadora. Como alternativa, se puede usar un constructo de gen reportero. Por ejemplo, las células T anérgicas no pueden iniciar la transcripción génica de IL-2 inducida por un promotor heterólogo bajo el control del reforzador génico 5' IL-2 o por un multímero de la secuencia API que se puede encontrar dentro del reforzador (Kang et al . , Science 257:1134, 1992). Las células T anérgicas específicas de antígeno pueden tener una reducción mínima de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% en la actividad citotóxica con respecto a la correspondiente célula T de control específica de antígeno. El término "anticuerpo purificado" se refiere a un anticuerpo que por lo menos en un 60% en peso está libre de proteínas y moléculas orgánicas de origen natural con las que normalmente está asociado. De preferencia, la preparación es por lo menos 75%, con mayor preferencia 90% y con la máxima preferencia 99%, en peso, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico de PD-1, PD-Ll o PD-L2. Un anticuerpo purificado se puede obtener, por ejemplo, por cromatografía de afinidad utilizando una proteína producida de manera recombinante o motivos de péptidos conservados y técnicas estándar. El término "se une específicamente" se refiere a un anticuerpo que reconoce y se une a un antígeno como los polipéptidos PD-1, PD-Ll o PD-L2 pero que prácticamente no reconoce ni se une a otras moléculas no antigénicas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que naturalmente incluya la proteína. Un anticuerpo preferido que se une a los polipéptidos PD-1, PD-Ll o PD-L2 se expone en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6, 808,710 y las publicaciones de solicitud de patente Núms. 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363 y 20020106730, las cuales se consideran parte de la presente, como referencia . El término "anticuerpos neutralizantes" se refiere a anticuerpos que interfieren con cualquiera de las actividades biológicas de un polipéptido PD-1, en particular, la habilidad de un polipéptido PD-1 para reducir una respuesta inmune como la citotoxicidad de las células T. El anticuerpo neutralizante puede reducir la habilidad de un polipéptido PD-1 para reducir la respuesta inmune, de preferencia en 50%, con mayor preferencia en 70% y con la máxima preferencia en 90% o más. Se puede usar cualquier prueba estándar para medir las respuestas inmunes, incluidas las que aquí se describen, para evaluar los anticuerpos potencialmente neutralizantes . El término "prácticamente idéntico" con referencia a una proteína o polipéptido, se refiere a una proteína o polipéptido que exhiba por lo menos 75%, pero de preferencia 85%, con mayor preferencia 90% y con la máxima preferencia 95% o incluso 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia. Para proteínas o polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación será por lo general de 20 aminoácidos, de preferencia al menos de 30 aminoácidos, con mayor preferencia de al menos 40 aminoácidos y con la máxima preferencia de 50 aminoácidos o la longitud total de la proteína o polipéptido. Los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas o polipéptidos "prácticamente idénticos" constituyen un ejemplo de ácidos nucleicos "prácticamente idénticos"; es sabido que por la degeneración del código genético, los ácidos nucleicos incluyen alguna secuencia que codifica esas proteínas o polipéptidos. Por otra parte, una secuencia de ácido nucleico "prácticamente idéntica" también incluye un polinucleótido que se híbrida con una molécula de ácido nucleico de referencia en condiciones de muy rigurosas. El término "condiciones muy rigurosas" se refiere a cualquier grupo de condiciones que se caracterizan por alta temperatura y baja fuerza iónica y permiten una hibridación comparable a la que resulta del uso de una sonda de ADN con una longitud mínima de 40 nucleótidos, en un amortiguador que contiene NaHP0 0.5 M, pH 7.2, SDS (dodeciisulfato de sodio) 7%, EDTA 1 mM y BSA 1% (fracción V), a una temperatura de 65°C o un amortiguador que contiene formamida 48%, 4.8XSSC, Tris-Cl 0.2 M, pH 7.6, solución de Denhardt IX, sulfato de dextrana 10% y SDS 0.1%, a una temperatura de 42°C. Otras condiciones de hibridación rigurosa, por ejemplo, PCR, transferencia Northern, transferencia Southern o hibridación in si tu, secuenciación de ADN, etc., son muy conocidas para el experto de la técnica de la biología molecular. Véase, por ejemplo, F. Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1998, el cual se considera parte de la presente, como referencia. El término "prácticamente puro" se refiere a un ácido nucleico, polipéptido u otra molécula que se ha separado de los componentes con los que se encuentra en estado natural. Por lo general, el polipéptido es prácticamente puro cuando está por lo menos al 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% en peso, libre de las proteínas y moléculas orgánicas con las que se encuentra asociado en estado natural. Por ejemplo, un polipéptido prácticamente puro se puede obtener por extracción a partir de una fuente natural, por extracción de un ácido nucleico recombinante en una célula que normalmente no expresa esa proteína o por síntesis química. El término "ADN aislado" se refiere a que el ADN está libre de los genes que, en el genoma natural del organismo del que se deriva este ADN, flanquean el ADN. De este modo, el término "ADN aislado" abarca, por ejemplo, el ADNc, ADN genómico clonado y el ADN sintético . La expresión "una cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto, solo o combinado, requerida para reducir o prevenir hipertensión o para tratar o prevenir una infección crónica en un mamífero. La cantidad eficaz del o los compuestos activos varía dependiendo de la vía de administración, edad, peso corporal y de la salud general del individuo. Finalmente, el médico o veterinario que atiende el caso decidirá la cantidad apropiada y el esquema de dosificación. La expresión "compuesto candidato" se refiere a una sustancia química de origen natural o artificial. La compuestos candidatos pueden incluir, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, moléculas orgánicas sintéticas, moléculas orgánicas de origen natural, moléculas de ácidos nucleicos, moléculas de ácidos nucleicos de péptidos y componentes derivados de los mismos. Por ejemplo, un compuesto candidato útil según la presente invención reduce la unión de PD-1 a PD-Ll, PD-L2 o a los dos . El término "composición farmacéutica" se refiere a cualquier composición que contiene al menos un agente activo terapéutica o biológicamente activo y que es adecuado para administrarlo al paciente. Cualquiera de estas formulaciones se puede preparar mediante métodos aceptados y muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20 th. ed. (Ed. A.R. Gennaro) , Mack Publishing Co . , Easton, Pa., 2000.

Métodos de tratamiento La citotoxicidad de las células T se incrementa al poner en contacto una célula T con un compuesto que reduce la expresión o actividad del PD-1. La célula T es una célula T ingenua, una célula T de memoria o una célula T activada. Como alternativa, la célula T es una célula T específica de antígeno. Las células T específicas de antígeno son anérgicas o tolerantes al agente infeccioso. La citotoxicidad de la célula T se caracteriza por un aumento en la proliferación celular y la liberación de citocinas. Los métodos son útiles para aliviar los síntomas de una variedad de infecciones y tipos de cáncer. Una infección o cáncer se trata, se previene o bien, se alivia un síntoma, al administrarle a un individuo un inhibidor de PD-1. El individuo es un mamífero, por ejemplo, una persona, un primate, ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo y un cerdo. El individuo padece o está en riesgo de desarrollar una infección. Un individuo que padece o está en riesgo de desarrollar una infección es según los métodos estándar, susceptible a una infección particular. La infección, por ejemplo, bacteriana, viral, fúngica, micoplásmica o parasitaria, es una infección persistente. La infecciones persistentes al contrario que las infecciones agudas no se eliminan en forma eficaz por la inducción de una respuesta inmune. El agente infeccioso y la respuesta inmune llegan a un equilibrio, de tal manera que el individuo infectado permanece así durante un largo periodo de tiempo sin que necesariamente manifieste síntomas. Las infecciones persistentes incluyen, por ejemplo, infecciones latentes, crónicas y lentas . En una infección crónica, el agente infeccioso se puede detectar en el organismo en todo momento. Sin embargo, los signos y síntomas de la enfermedad pueden estar presentes o ausentes durante un periodo de tiempo prolongado. Ejemplos de infección crónica incluyen, hepatitis B (causada por el VHB) y la hepatitis C (causada por el VHC) , adenovirus, citomegalovirus, virus Epstein-Barr, virus 1 de herpes simplex, virus 2 de herpes simplex, virus herpes 6 humano, virus varicela-zoster, virus de hepatitis B, virus de hepatitis D, virus de papiloma, parvovirus B19, poliomavirus BK, poliomavirus JC, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus I de leucemia de célula T humana y virus II de leucemia de célula T humana. Las infecciones persistentes parasitarias pueden surgir como resultado de una infección por Leishmania, Toxoplasma, Trypanosoma, Plasmodium, Schistosoma y Encephalitozoon . En una infección latente, el agente infeccioso (por ejemplo, un virus), al parecer, está inactivo y latente de manera que el individuo no siempre manifiesta signos o síntomas. En una infección viral latente, el virus permanece en equilibrio con el hospedero durante largos periodo de tiempo antes de que los síntomas aparezcan otra vez, sin embargo, los virus reales no se pueden detectar hasta que se da la reactivación de la enfermedad. Los ejemplos de infecciones latentes incluyen las infecciones causadas por VSH-1 (herpes labial), VSH (herpes genital) y VZV (varicela-zóster ) .

En una infección lenta, los agentes infecciosos gradualmente aumentan en número durante un largo periodo de tiempo en el cual no se observan signos o síntomas importantes. Los ejemplos de infecciones lentas incluyen el SIDA (ocasionado por el VIH-1 y VIH-2), lentivirus que causan tumores en animales y priones. Por otra parte, es frecuente que las infecciones persistentes surjan como complicaciones posteriores de las infecciones agudas. Por ejemplo, la panencefalitis esclerosante (PEES) puede desarrollarse después de una infección de sarampión aguda o también se puede presentar la encefalitis regresiva derivada de una infección de rubéola. Los tipos de cáncer incluyen, por ejemplo, el linfoma angioinmunoblástico o el linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular. El linfoma angioinmunoblástico (AIL o angioímmunoblastic lymphoma ) es un tipo agresivo (de rápido avance) de linfoma no Hodgkin de célula T caracterizado por ganglios linfáticos alargados e hipergamaglubulinemia (aumento de anticuerpos en la sangre) . Otros síntomas pueden incluir erupción, fiebre, pérdida de peso, prueba de Coomb positiva o sudores nocturnos. Este tumor maligno por lo general se presenta en adultos. La edad de los pacientes por lo general es de 40 a 90 años (la mediana alrededor de 65) y con mayor frecuencia son adultos. A medida que el LAI avanza, se pueden desarrollar hepatoesplenomegalia, anemia hemolítica e hipergamaglubulinemia policlonal. Aproximadamente en 40 a 50% de los pacientes está implicada la piel. El linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular es un neoplasma de célula B que al parecer se deriva de células B de centro germinativo con genes mutantes de inmunoglobulina no funcional. Igual que el linfoma angioinmunoblástico, las células neoplásicas están asociadas con una red de células dendríticas foliculares. La expresión de PD-1 se observa en células T que están muy relacionadas con las células CD20+ neoplásicas de linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular, <J en un patrón similar al que se observa para las células T CD57+. El CD57+ se ha identificado como otro marcador de células T asociadas con centro germinal de células T asociadas junto con CXCR5, descubrimientos que respaldan la conclusión de que las células neoplásicas en el linfoma de Hodgkin de predominio linfocítico nodular tienen estrecha relación con centros germinales de células T asociadas. Un inhibidor de PD-1 es cualquier agente que tiene la capacidad de reducir la expresión o actividad de PD-1, PD-Ll o PD-2 en una célula. La expresión o actividad del PD-1 se reduce por lo menos en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con la correspondiente expresión o actividad en una célula de control . La célula de control es una célula que no se h tratado con inhibidor PD-1. La expresión o actividad del PD-1 se determina por cualquier método estándar conocido en la técnica, incluidos los que aquí se describen. Como opción, el inhibidor de PD-1 inhibe o reduce la unión del PD-1 a PD-Ll, PD-L2 o a los dos. Los inhibidores de PD-1 incluyen polipéptidos, polinucleótidos, antagonistas de molécula pequeña o ARNsi. Un polipéptido inhibidor de PD-1 incluye, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que reduce la expresión o señalización del PD-1. Los anticuerpos ilustrativos incluyen anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-Ll, anticuerpos anti-PD-L2, anticuerpos anti-CTLA-4, anticuerpos anti-BTLA, anticuerpos anti-CD-28, anticuerpos anti-ICOS, anticuerpos anti-ICOS-L, un anticuerpo anti-B7-l, anticuerpo anti-B7-2, anticuerpos anti-B7-H3 o anticuerpos anti-B7-H . Como alternativa, el inhibidor de PD-1 es una proteína negativa dominante o un ácido nucleico que codifica una proteína negativa dominante que interfiere con la actividad biológica del PD-1 (es decir, la unión del PD-1 a PD-Ll, PD-L2 o a los dos) . Una proteína negativa dominante es una molécula de aminoácido que tiene una secuencia que tiene por lo menos 50%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% de identidad de secuencia con al menos 10, 20, 30, 35, 50, 100 o más de 150 aminoácidos de la proteína tipo silvestre a la que corresponde la proteína negativa dominante. Por ejemplo, un PD-1 negativo dominante tiene una mutación que no le permite unirse al PD-Ll. La proteína negativa dominante se puede administrar como un vector de expresión. El vector de expresión puede ser un vector viral o un vector no viral (por ejemplo, retrovirus, adenovirus recombinante asociado o un vector adenoviral recombinante). Como alternativa, la proteína negativa dominante se puede administrar directamente en forma sistémica como proteína recombinante o al área infectada utilizando técnicas de microinyección. Las moléculas pequeñas incluyen, entre otras, péptidos, peptidomiméticos (por ejemplo, peptoides), aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos e inorgánicos (incluidos los compuestos heteroorgánicos y organometálicos) con un peso molecular menor de aproximadamente 5000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos con un peso molecular menor de aproximadamente 2000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos con un peso molecular menor de aproximadamente 1000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos con un peso molecular menor de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, esteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de estos compuestos. El inhibidor de PD-1 es una molécula antisentido, una molécula ARN de silenciamiento (ARNsi) o un antagonista de molécula pequeña que se dirige a la expresión o actividad del PD-1. El término "ARNsi" se refiere a una molécula de ARN bicatenario que impide la traducción de un determinado ARN. Se usan las técnicas estándar para introducir el ARNsi en la célula, que incluyen aquellas en las que el ADN es un molde a partir del cual se transcribe un ARNsi. El ARNsi incluye una secuencia sentido de ácido nucleico de PD-1, PD-Ll o PD-L2, una secuencia de ácido nucleico antisentido de PD-1, PD-Ll o PD-L2 o de los dos. Como opción, el ARNsi se construye de tal manera que un solo transcrito tenga las secuencias de sentido y las antisentido complementarias del gen blanco, por ejemplo, una horquilla. La unión del ARNsi a un transcrito de PD-1, PD-Ll o PD-L2 en la célula blanco da lugar a una reducción de la producción de PD-1, PD-Ll o PD-L2 en la célula. La longitud del oligonucleótido es al menos de 10 nucleótidos y puede ser tan larga como el transcrito de PD-1, PD-Ll o PD-L2 natural. De preferencia, el oligonucleótido tiene una longitud de 19 a 25 nucleótidos. Con la máxima preferencia, el oligonucleótido tiene una longitud menor de 75, 50 ó 25 nucleótidos. Otros inhibidores de PD-1 adecuados se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6, 808,710 y las publicaciones de solicitud de patente Núms. 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363 y 20020106730, las cuales se consideran parte de la presente, como referencia . La dosis preferida del inhibidor de PD-1 es una dosis biológicamente activa. Una dosis biológicamente activa es una dosis que induce un aumento en la actividad citotóxica de la célula T CD8+ que aumenta la respuesta inmune específica al agente infeccioso. De preferencia, el inhibidor de PD-1 tiene la capacidad de reducir la expresión o actividad del PD-1 en células inmunes específicas de antígeno (por ejemplo, células T como las células T CD8+) en una proporción mínima de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de 100% por debajo de los niveles correspondientes al control sin tratar. Los niveles o actividad del PD-1 en las células inmunes se determinan por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, análisis de transferencia Western, inmunoquímica, ELISA, análisis de transferencia Northern. Como alternativa, la actividad biológica del PD-1 se determina evaluando la unión de PD-1 a PD-Ll, PD-L2 o a los dos. La actividad biológica del PD-1 se determina según su habilidad para aumentar la citotoxicidad de las células T CD8+, que incluyen, por ejemplo, la producción de citocina, depuración del agente infeccioso y proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno. De preferencia, el agente que reduce la expresión o actividad del PD-1 aumenta la respuesta inmune específica al agente infeccioso en una proporción mínima de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de 100% por arriba de los niveles correspondientes al control sin tratar. Por lo tanto, el agente de la presente invención es cualquier agente que tenga una o más de estas actividades. Aunque el agente de la invención de preferencia se exprese en células T CD8+, se deberá entender que cualesquier célula que pueda influir la respuesta inmune a infecciones persistentes es también adecuada para los métodos de la invención e incluyen, por ejemplo, las células B. Opcionalmente, al individuo se le administran uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, compuestos antivirales (por ejemplo, vidarabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir, análogo nucleósido inhibidor de la transcriptasa inversa (NRTI o nucleoside-analog reverse transcriptase inhibi tor) (por ejemplo, AZT (zidovudina), ddl (didanosina) , ddC (zalcitabina) , d4T (stavudina) o 3TC (lamivudina), inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa (NNRTI o non nucleoside reverse transcriptase inhibitor) (por ejemplo, (nevirapina o delavirdina) , inhibidor de proteasa (saquinavir, ritonavir, indinavir o nelfinavir) , ribavirin o interferón) , compuestos antibacterianos, compuestos antifúngicos, compuestos antiparasitarios, compuestos antiinflamatorios, agentes antineoplásicos o analgésicos . El agente terapéutico adicional se administra antes, al mismo tiempo o después de la administración del inhibidor de PD-1. Por ejemplo, el inhibidor del PD-1 y el agente adicional se administran en formulaciones separadas en un intervalo de 1, 2, 4, 6, 10, 12, 18 ó más de 24 horas. Opcionalmente, el agente adicional se formula junto con el inhibidor del PD-1. Cuando el otro agente se presenta en una composición diferente, se pueden usar vías de administración diferentes. El agente se administra en las dosis eficaces conocidas para tratar, reducir o prevenir una infección. Las concentraciones del inhibidor del PD-1 y del agente adicional dependen de diferentes factores, entre los que se incluyen, la forma de administración, el punto al que se dirigen, el estado fisiológico del mamífero y alguna otra medicación que se administre. De este modo, la posología de tratamiento se deberá ajustar para optimizar la seguridad y la eficacia y esto se deja a la capacidad del técnico experimentado. La determinación de la posología adecuada y el esquema de administración para una situación particular quedan dentro de la experiencia en la técnica. De manera opcional, al individuo también se le administra una vacuna que produzca una respuesta inmune protectora contra el agente infeccioso que causa la infección persistente. Por ejemplo, el individuo recibe una vacuna que genere una respuesta inmune contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), tuberculosis, influenza o hepatitis C. Vacunas ilustrativas se describen, por ejemplo, en la publicación de Berzofsky et al . (J. Clin. Invest. 114:456-462, 2004). Si se desea, la vacuna se administra con un refuerzo o con auxiliares. Los inhibidores de PD-1 se administran en una cantidad suficiente para aumentar la citotoxicidad de células T, por ejemplo, células T CD8+. Un aumento en la citotoxicidad de las células T da lugar a un aumento en la respuesta inmune y una reducción de la infección persistente. Una respuesta inmune se mide, por ejemplo, por un aumento en la proliferación de las células inmunes, por ejemplo, las células T o las células B, un aumento en la producción de citocinas y un aumento en la depuración del agente infeccioso. Esta reducción incluye el alivio de uno o más de lo síntomas asociados con la infección persistente. La administración del inhibidor del PD-1 reduce la infección persistente o alivia uno o más de los síntomas asociados con la infección persistente en una proporción mínima de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con un individuo sin tratar. El tratamiento es eficaz si da lugar a un beneficio clínico, por ejemplo, una disminución de la carga del agente infeccioso en el individuo. Cuando el tratamiento se aplica con fines profilácticos, el término "eficaz" significa que el tratamiento retarda o previene la infección. La eficacia se puede determinar mediante cualquier método conocido para diagnóstico o tratamiento de la infección particular.

Administración terapéutica La invención incluye el administrar a un individuo una composición que contenga un compuesto que reduzca la expresión o actividad del PD-1 (denominado en la presente "inhibidor de PD-1" o "compuesto terapéutico" ) . Una cantidad eficaz de un compuesto terapéutico es, de preferencia, de aproximadamente 0.1 mg/kg a 150 mg/kg. Las dosis eficaces varían, como lo reconocerá un experto en la técnica, dependiendo de la vía de administración, el uso y tipo de excipientes y la coadministración con otros tratamientos terapéuticos que incluyan el uso de otros agentes antiinfecciosos o agentes terapéuticos para tratar, prevenir o aliviar un síntoma de una infección particular o de cáncer. Un esquema terapéutico se lleva a cabo, utilizando los métodos estándar, al identificar a un mamífero, por ejemplo, un paciente humano que sufra de (o con riesgo de desarrollar) una infección o cáncer, utilizando métodos estándar . El compuesto farmacéutico se administra a este individuo mediante los métodos conocidos en la técnica. De preferencia, el compuesto se administra por vía oral, rectal, nasal, tópica o parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa. El compuesto se administra de manera profiláctica o después de la detección de una infección. Opcionalmente, el compuesto se formula como componente de una mezcla de agentes terapéuticos destinados a tratar una infección. Ejemplos de formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas del principio activo en una solución salina isotónica, una solución de glucosa al 5% u otro excipiente común farmacéuticamente aceptable. Los agentes solubilizantes comunes como la PVP (polivinilpirrolidona) o las ciclodextrinas, también se utilizan como excipientes farmacéuticos para el suministro de compuestos terapéuticos. Los compuestos terapéuticos que aquí se describen se formulan en composiciones destinadas otras vías de administración, mediante los métodos convencionales. Por ejemplo, para la administración oral, el inhibidor de PD-1 se formula en una cápsula o tableta. Las cápsulas pueden contener cualesquier material común farmacéuticamente aceptable como gelatina o celulosa. Las tabletas se pueden formular según los procedimientos convencionales por compresión de la mezcla de un compuesto terapéutico con un portador sólido y un lubricante. Los ejemplos de portadores sólidos incluyen almidón y bentonita modificada con azúcar. El compuesto se administra en forma de una tableta de cubierta dura o una cápsula que contenga un ligante, por ejemplo, lactosa o manitol, una carga convencional y un agente de tableteado. Entre otras formulaciones se incluyen Ungüentos, supositorios, pastas, atomizadores, parches, cremas, geles, esponjas reabsorbibles o espumas. Estas formulaciones se producen mediante los métodos conocidos en la técnica. Si el compuesto terapéutico es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico terapéutico se administra in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico y administrándolo para que se haga intracelular (por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral, por inyección directa, por el uso de bombardeo de micropartículas, por recubrimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándolo enlazado a un péptido tipo homeobox que se sepa que entra al núcleo (véase, Joliot et al . , 1991. Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 88:1864-1868), y lo similar. Como alternativa, un ácido nucleico terapéutico se introduce intracelularmente y se incorpora al ADN de la célula hospedero para expresión, por recombinación homologa o permanece en forma episomal. Para la administración local del ADN, se usan vectores estándar para terapia génica. Estos vectores comprenden los vectores virales, que incluyen los que se derivan de los virus de hepatitis de replicación deficiente (por ejemplo, VHB y VHC) , retrovirus (véase, por ejemplo, el documento WO 89/07136; Rosenberg et al . , 1990, N. Eng. J. Med. 323 (9): 570-578), adenovirus (véase, por ejemplo, Morsey et al . , 1993, J. Cell. Biochem., Supp. 17E) virus adenoasociados (Kotin et al . , 1990, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 87:2211-2215), virus de herpes simplex de replicación deficiente (VHS; Lu et al . , 1992 Abstract, pág. 66, Abstracts of the Meeting on Gene Therapy, Sept. 22-26, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) y cualesquier versión modificada de estos vectores. La invención puede utilizar cualquier otro sistema se suministro que lleve a cabo la transferencia in vivo de ácidos nucleicos en células eucariontes. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden empacar en liposomas, por ejemplo, liposomas catiónicos (Lipofectin) , sistemas de suministro mediado por receptores, vectores de ácidos nucleicos no virales, eritrocitos fantasma o microesferas (por ejemplo, micropartículas; véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4,789,734, 4,925,673, 3,625,214; Greogoriadis, 1979, Drug Carriers in Biology and Medicine, págs. 287-341 (Academic Press), también se puede administrar ADN puro. El ADN el la terapia génica se puede administrar al paciente por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal. El ADN o un agente inductor se administra en un portador farmacéuticamente aceptable, es decir, un vehículo biológicamente compatible que sea adecuado para administrarlo a un animal, por ejemplo, una solución salina fisiológica. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad que sea capaz de producir un resultado médico deseable, por ejemplo, la disminución de un producto génico de PD-1 en un animal tratado. Esta cantidad la puede determinar un técnico con experiencia ordinaria. Como es sabido en el campo de la técnica médica, la posología para cualquier paciente dado, depende de muchos factores, que incluyen la talla del paciente, el área superficial corporal, la edad, compuesto particular que se administra, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y la administración concurrente de otros medicamentos. La dosificación puede variar, aunque una dosis preferida para la administración intravenosa de ADN es de aproximadamente 106 a 1022 copias de la molécula de ADN.

Por lo general, los plásmidos se administran a un mamífero en una cantidad aproximada de 1 nanogramo 5000 microgramos de ADN. De preferencia, las composiciones contienen aproximadamente 5 nanogramos a 1000 microgramos de ADN, 10 nanogramos a 800 microgramos de ADN, 0.1 microgramos a 500 microgramos de ADN, 1 microgramo a 350 microgramos de ADN, 25 microgramos a 250 microgramos de ADN o 100 microgramos a 200 microgramos de ADN. Como alternativa, la administración de vectores adenovirales recombinantes que codifican el inhibidor de PD-1 en un mamífero se puede hacer a una concentración mínima de 105, 106, 107, 108, 109, 1010 ó 1011 unidades formadoras de placa (ufp) . Los productos génicos de PD-1 se administran al paciente por vía intravenosa en un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una solución salina fisiológica. Se pueden utilizar los métodos estándar para suministro intracelular de péptidos, por ejemplo, empacados en liposomas. Estos métodos son muy conocidos para las personas con experiencia ordinaria en la técnica. Es de esperarse que se administre una dosis aproximada de 1 a 100 moles de polipéptido de la invención por kg de peso corporal por día. Las composiciones de la invención son útiles para administración parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal. Los inhibidores de PD-1 son eficaces al contacto directo del compuesto con el tejido afectado. Por consiguiente, el compuesto se puede administrar tópicamente. Como alternativa, los inhibidores de PD-1 se pueden administrar en forma sistémica. Por otra parte, los compuestos se pueden administrar por implantación (en forma directa sobre un órgano (por ejemplo, el intestino o el hígado) o por vía subcutánea) de un sólido o una matriz reabsorbible que lentamente libere el compuesto en los tejidos circundantes o adyacentes del individuo. Por ejemplo, para el tratamiento de una infección gastrointestinal, el compuesto se puede administrar en forma sistémica (por ejemplo, por vía intravenosa, rectal u oral) o local (por ejemplo, directamente en el tejido gástrico). Como alternativa, una oblea o una esponja reabsorbible impregnadas de inhibidor de PD-1 se coloca en contacto directo con en el tejido gástrico. El inhibidor de PD-1 se libera in vivo lentamente por difusión del principio activo a partir de la oblea y la erosión de la matriz polimérica. Como otro ejemplo, la infección del hígado (es decir, hepatitis) se trata al infundir en la vasculatura del hígado una solución que contenga el inhibidor de PD-1. Para el tratamiento de infecciones neurológicas, el inhibidor de PD-1 se puede administrar por vía intravenosa o intratecal (es decir, por infusión directa en el líquido cefalorraquídeo) . Para administración local, una oblea o una esponja reabsorbible impregnadas de inhibidor de PD-1, se ponen en contacto directo con tejido del SNC. El compuesto o mezcla de compuestos se liberan lentamente in vivo por difusión del principio activo a partir de la oblea y la erosión de la matriz polimérica. Como alternativa, el compuesto se infunde en el cerebro o el líquido cefalorraquídeo utilizando los métodos estándar, Por ejemplo, un anillo de perforación quirúrgica del cráneo con catéter integrado que se utiliza como puerto de inyección, se coloca para fijar el cráneo en la perforación quirúrgica que se le hizo. El acceso al reservorio de líquido conectado al catéter se hace medinate una aguja o estilete insertado a través del septum colocado en la parte superior del anillo de perforación. La unidad de catéter (descrita, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5, 954,687) permite una trayectoria de flujo de fluidos adecuada para la transferencia de fluidos entre una ubicación determinada, cerca o dentro del cerebro que hace posible la administración del medicamento durante un periodo de tiempo.

Para infecciones cardiacas, el compuesto se puede suministrar, por ejemplo, en el tejido cardiaco (es decir, miocardio, pericardio o endocardio) , por inyección intracoronaria directa a través de la pared del tórax o bien utilizando métodos que utilizan como base un catéter percutáneo estándar y guía fluoroscópica . De este modo, el inhibidor se puede inyectar directamente en el tejido o se puede infundir a partir de una malla o stent o un catéter insertados en una luz corporal. Para administrar el compuesto se puede usar una variedad de catéteres de perfusión o coronarios. Como alternativa, el compuesto se aplica como recubrimiento o se impregna en un stent que se coloca en un vaso coronario . Las infecciones pulmonares se pueden tratar, por ejemplo, administrando el compuesto por inhalación. Los compuestos se suministran en forma de un rocío en aerosol a partir de un recipiente o despachador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas como el dióxido de carbono o un nebulizador . Un conocedor de la técnica comprenderá que los pacientes tratados según la invención pueden haberse sometido a las mismas pruebas para diagnosticarles una infección persistente o pueden haberse identificado sin examen como alguien con alto riesgo debido a la presencia de uno o más factores de riesgo (por ejemplo, exposición a un agente infeccioso, predisposición genética o tener una condición patológica que predisponga a infecciones secundarias) . La reducción de los síntomas o daños provocados por la infección persistente también puede incluir, entre otros efectos, el alivio de síntomas, la disminución del grado de enfermedad, estabilización de la enfermedad (es decir, sin empeoramiento), retraso o dilación del avance de la enfermedad y mejora o mitigación del estado de la enfermedad. El tratamiento se puede aplicar en casa con la estrecha supervisión del médico responsable o en las instalaciones de asistencia médica .

Métodos para medir la respuesta inmune Los métodos para medir la respuesta inmune después del tratamiento según la presente invención, son muy conocidos en la técnica. La actividad de las células T se puede evaluar, por ejemplo, mediante ensayos que detecten la producción de citocinas, ensayos que midan la proliferación de células T, ensayos que midan la depuración del agente microbiano y ensayos que midan la citotoxicidad de las células T CD8+. Estos ensayos se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6, 808,710 y las publicaciones de solicitud de patente Núms. 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363 y 20020106730, las cuales se consideran parte de la presente, como referencia . De manera opcional, la habilidad de un inhibidor de PD-1 para aumentar la citotoxicidad de las células T CD8+ se evalúa mediante ensayos que midan la proliferación de las células T CD8+ (por ejemplo, incorporación de timidina, ensayos BrdU y de tinción con marcadores del ciclo celular (por ejemplo, Ki67 y CFSE), descritos, por ejemplo, por Dong et al . (Nature 5:1365-1369, 1999) . En un ejemplo, la proliferación de las células T se monitorea cultivando las células T purificadas que expresan al PD-1 con un inhibidor de PD-1, una señal de activación primaria como la que se describió anteriormente y 3H-timidina. El nivel de la proliferación de las células T se determina por medición de la incorporación de timidina. La citotoxicidad de las células T CD8+ también se evalúa mediante ensayos de lisis (por ejemplo, ensayos de liberación de 51Cr o ensayos que detectan la liberación de perforina o granzima) , ensayos que detectan la activación de caspasa o ensayos que miden la liberación del agente microbiano del individuo infectado. Por ejemplo, la carga viral en una muestra biológica del individuo infectado (por ejemplo, de suero, bazo, hígado, pulmón o de tejido hacia el cual el virus es trópico) se puede medir antes o después del tratamiento. También se puede medir la producción de citocinas como IFN?, TNFa e IL-2. Por ejemplo, las células T purificadas se cultivan en presencia de la proteína inhibidora de PD-1 y una señal de activación primaria. El nivel de varias citocinas en el sobrenadante se puede determinar mediante ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzimas sandwich u otros ensayos convencionales descritos, por ejemplo, en la publicación de Dong et al . (Nature 5:1365-1369, 1999). Si se desea, la eficacia del inhibidor de PD-1 se evalúa a través de su habilidad para inducir coestimulación de las células T. Por ejemplo, un método para la coestimulación in vi tro comprende el proporcionar células T purificadas que expresen el PD-1 con una señal de activación primera o primaria mediante un anticuerpo monoclonal anti-CD3 o un éster forbol o mediante un antígeno en combinación con un MHC clase II. La capacidad que tiene un compuesto candidato para reducir la expresión o actividad del PD-1 y por lo tanto de generar la señal coestimuladora o secundaria necesaria para modular la función inmune, para estas células T, se puede evaluar por cualquiera de los ensayos convencionales muy conocidos en la técnica. Una respuesta de célula B se evalúa mediante un ensayo específico de antígeno ELISA (por ejemplo, LCMV, VIH, tuberculosis o malaria), ELISPOT de célula plasmática, ensayo de memoria de célula B, fenotipificación de célula B y análisis de centros germinales por inmunohistoquímica .

Ensayos de tamizaje La presente invención proporciona métodos de tamizaje para identificar los compuestos que pueden inhibir la expresión o actividad del PD-1. Los compuestos útiles incluyen cualquier agente que inhiba la actividad biológica o reduzca el nivel celular del PD-1. Por ejemplo, los compuestos candidatos pueden reducir la unión del PD-1 al PD-Ll o PD-L2 o a los dos. Utilizando estos agentes como compuestos de avance, por ejemplo, estos métodos de tamizaje también permiten la identificación de otros nuevos inhibidores específicos de PD-1 que funcionan para tratar, reducir o prevenir infecciones persistentes o como alternativa, que alivian uno o más síntomas asociados con estas infecciones. El método de tamizaje puede incluir técnicas de alto rendimiento . El término "compuesto candidato" se refiere a una sustancia química que puede ser de origen natural o un derivado artificial. Los compuestos candidatos pueden incluir, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, moléculas orgánicas sintéticas, moléculas orgánicas de origen natural, moléculas de ácido nucleico, moléculas de ácido nucleico de péptidos, y componentes derivados de los mismos. Por ejemplo, un compuesto candidato útil según la presente invención, reduce la unión del PD-1 a PD-Ll o a PD-L2 o a los dos. Existen varios métodos para llevar a cabo estos ensayos de tamizaje. Según un enfoque, los compuestos candidato se agregan en concentraciones variables al medio de cultivo de células que expresan PD-1. El término "gen de PD-1" se refiere a un ácido nucleico que codifica para una proteína PD-1. El término "gen de fusión de PD-1" se refiere a un promotor de PD-1 y/o toda o parte de una región codificante de PD-1 unida operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico heterólogo. En modalidades preferidas, la segunda secuencia de ácido nucleico heterólogo es un gen reportero, es decir, un gen cuya expresión se puede evaluar; los genes reporteros incluyen, entre otros, los que codifican glucuronidasa (GUS) , luciferasa, cloranfenicol transacetilasa (CAT) , proteína fluorescente verde (GFP) , fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa . La expresión genética del PD-1 se mide, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern (Ausubel et al . , véase lo anterior), utilizando un fragmento preparado a partir de la molécula de ácido nucleico de PD-1 como una sonda de hibridación o por PCR en tiempo real con cebadores apropiados. El nivel de expresión genética en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel medido en un medio de cultivo control que carece de la molécula candidato. Si se desea, el efecto del compuesto candidato, como alternativa, se puede medir por el nivel de polipéptido PD-1 utilizando el mismo enfoque general y técnicas inmunológicas estándar, por ejemplo, transferencia Western o inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para PD-1. Por ejemplo, se pueden usar inmunoanálisis para detectar o monitorear el nivel del PD-1. Los anticuerpos monoclonales o policlonales que puedan unirse al PD-1 se pueden usar en cualquier formato de inmunoensayo estándar (por ejemplo, ELISA o RÍA) para medir los niveles de PD-1. El PD-1 también se puede medir mediante espectrometría de masas, cromatografía de líquidos de alta resolución, técnicas espectrofotométricas o fluorométricas, o combinaciones de las mismas.

Como alternativa, los métodos de tamizaje de la invención, se pueden usar para identificar compuestos candidato que disminuyan la actividad biológica del PD-1 al reducir la unión del PD-1 a PD-Ll o PD-L2 o a los dos, en una proporción mínima de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% con respecto a un control sin tratar. Por ejemplo, un compuesto candidato se puede analizar en cuanto a su capacidad para disminuir la actividad del PD-1 en células que naturalmente expresan PD-1, después de transfección con ADNc para PD-1 o en soluciones que contienen PD-1 carentes de células, tal como se describe más adelante. El efecto de un compuesto candidato en la unión o activación del PD-1 se puede evaluar por ensayos de unión radioactivos y no radioactivos, ensayos de competencia y ensayos de señalización de receptores. Como ejemplo específico, se cultivan células de mamífero (por ejemplo, células de roedores) que expresen un ácido nucleico que codifica para PD-1, en presencia de un compuesto candidato (por ejemplo, un péptido, polipéptido, una molécula orgánica sintética, una molécula orgánica de origen natural, una molécula de ácido nucleico, o componentes de las mismas) . Las células pueden ser de las que expresan PD-1 en forma endógena o manipularse genéticamente, mediante alguna técnica estándar conocida en la técnica, (por ejemplo, transfección e infección viral) para sobreexpresar PD-1. El nivel de expresión del PD-1 se mide en estas células por análisis de transferencia Western y después se compara con el nivel de expresión de la misma proteína en células de control que no han estado en contacto con el compuesto candidato. Un compuesto que promueva una disminución del nivel de actividad del PD-1 como resultado de la disminución de su síntesis o de su actividad biológica, se considera útil en la invención. En un ejemplo particular, un compuesto que interfiere con la unión del PD-1 a PD-Ll o PD-L2 o a los dos (por lo que reduce la actividad biológica del PD-1), dando lugar a un aumento de la respuesta inmune, es útil según la presente invención. Dada su habilidad para disminuir la actividad biológica del PD-1, esta molécula se puede usar, por ejemplo, como un agente terapéutico para tratar, reducir o prevenir una infección persistente o alternativamente para aliviar uno o más síntomas asociados con estas infecciones. Como ejemplo específico, un compuesto candidato se puede poner en contacto con dos proteínas, la primera proteína es un polipéptido prácticamente idéntico al PD-1 y la segunda proteína es PD-Ll o PD-L2 (es decir, una proteína que se une al polipéptido PD-1 en condiciones que permiten la unión y que dan como resultado una respuesta inmune reducida) . Según este particular método de tamizaje, la interacción entre estas dos proteínas se mide después de la adición del compuesto candidato. Una disminución en la unión del PD-1 al segundo polipéptido después de la adición del compuesto candidato (con respecto a esta unión en ausencia del compuesto) , identifica al compuesto candidato como un compuesto que tiene la habilidad de inhibir la interacción entre las dos proteínas. Por último, el ensayo de tamizaje de la invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, en un sistema sin células o utilizando un sistema híbrido de dos levaduras. Si se desea, una de las proteínas o el compuesto candidato se pueden inmovilizar en un soporte, tal como se describió anteriormente, o puede tener un grupo detectable. Como alternativa o además, los compuestos candidato se pueden seleccionar según la especificidad de unión a PD-1 y que por tanto lo inhiben. La eficacia de este compuesto candidato depende de su habilidad para interactuar con el PD-1. Esta interacción se puede analizar fácilmente utilizando cualquiera de las técnicas de unión estándar y de ensayos funcionales (por ejemplo, aquellas descritas por Ausbel et al . , véase lo anterior). Por ejemplo, un compuesto candidato se puede analizar in vi tro en cuanto a su interacción y unión con el PD-1 y su habilidad para modular respuestas inmunes se puede evaluar mediante cualquiera de los ensayos estándar (por ejemplo, los que se describen en la presente). Por ejemplo, un compuesto candidato que se une al PD-1 se puede identificar mediante una técnica cromatográfica . Por ejemplo, un PD-1 recombinante se puede purificar con técnicas estándar a partir de células manipuladas genéticamente para expresar el PD-1 (por ejemplo, las que se describieron anteriormente) y se puede inmovilizar en una columna. Como alternativa, el PD-1 de origen natural se puede inmovilizar en una columna. Una solución de compuestos candidato se pasa entonces a través de una columna y un compuesto específico para el PD-1 se identifica con base en su capacidad para unirse al PD-1 y se inmoviliza en la columna. Para aislar el compuesto, la columna se lava y se eliminan las moléculas que no se unieron específicamente, luego, el compuesto de interés se libera de la columna y se recolecta. Los compuestos aislados por este método (o cualquier otro método apropiado) , si se desea, se pueden purificar más (por ejemplo, por cromatografía de líquidos de alta resolución) . Se puede probar el tamizaje de nuevos inhibidores y la optimización de compuestos de avance, por ejemplo, evaluando su habilidad para modular la actividad citotóxica de las células T o la respuesta inmune, mediante técnicas estándar. Por otra parte, estos compuestos candidato se pueden analizar en cuanto a su habilidad para funcionar como agentes antimicrobianos (por ejemplo, como se describe en la presente) . Los compuestos aislados mediante este enfoque también se pueden emplear, por ejemplo, como agentes terapéuticos para tratar, reducir o prevenir infecciones persistentes o como alternativa para aliviar uno o más síntomas asociados con estas infecciones. Los compuestos que se identifican como compuestos que se unen al PD-1 con una constante de afinidad menor o igual a 10 mM se consideran especialmente útiles en la invención. Los agentes terapéuticos potenciales incluyen moléculas orgánicas, péptidos, pseudopéptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a una secuencia de ácido nucleico o polipéptido que codifica para PD-1 y que por ello inhibe o extingue su actividad. Los agentes antimicrobianos potenciales también incluyen moléculas pequeñas que se unen al punto de unión de este polipéptido y que debido a esto impiden la unión a moléculas de unión celular, de tal manera que se impide la actividad biológica normal. Otros agentes antimicrobianos potenciales incluyen moléculas antisentido.

Métodos de diagnóstico y pronóstico El cáncer, por ejemplo, el linfoma de células T angioinmunoblástico o el linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular se detectan determinando la cantidad de un polipéptido PD-1 en una muestra de prueba (es decir, una muestra extraída de un paciente) . Un cambio en el nivel de polipéptido PD-1 con respecto a una muestra de control es indicativo de cáncer en el individuo. El cambio puede ser un aumento o una disminución del polipéptido PD-1 con relación a una muestra de control. La muestra de control se prepara (es decir, se fracciona) de manera similar a la muestra de prueba. Una muestra es, por ejemplo, sangre, suero, ascitis, orina u otros fluidos corporales. De preferencia, la muestra es una célula T o una célula B. La cantidad de PD-1 se determina en la muestra de prueba y se compara con la expresión del nivel de control normal. Por nivel de control normal se entiende el nivel de expresión de un polipéptido PD-1 que normalmente se encuentra en un individuo que no padece cáncer. Un aumento del nivel de PD-1 en la muestra proveniente del paciente, indica que el individuo padece o está en riesgo de desarrollar cáncer. En contraste, cuando los métodos se aplican en forma profiláctica, un nivel similar o una disminución en el nivel del polipéptido PD-1 en la muestra extraída del paciente, indica que el individuo no padece no está en riesgo de desarrollar cáncer. Un aumento del nivel de polipéptido PD-1 en la muestra derivada del paciente, indica que el individuo padece o está en riesgo de desarrollar cáncer. La alteración de la cantidad del polipéptido PD-1 es estadísticamente significativo. El término "estadísticamente significativo" significa que la alteración es mayor de lo que podría esperarse por el cambio solo. La significación estadística se determina por el método conocido en la técnica. Por ejemplo, la significación estadística se determina por el valor p. El valor p es una medida de la probabilidad de que se presente una diferencia entre los grupos durante un experimento. ( P ( z=zobservada) ) . Por ejemplo, un valor "p" de 0.01 significa que hay una probabilidad en 100 de que se de el resultado. Mientras menor es el valor "p" es más probable que la diferencia entre los grupos haya sido causada por el tratamiento. Una alteración es estadísticamente significativa si el valor "p" es al menos de 0.05. De preferencia, el valor p es 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001 o menor. La "exactitud diagnóstica" de una prueba, ensayo o método con relación a la capacidad de la prueba, ensayo o método para distinguir entre pacientes que tienen cáncer o están en riesgo de padecerlo tiene como base la "presencia clínicamente significativa" de un polipéptido PD-1 en un paciente. La expresión "presencia clínicamente significativa" se refiere a que la presencia del polipéptido PD-1 en el paciente (normalmente en una muestra extraída del paciente) es mayor o menor que el umbral (o valor límite) para ese polipéptido PD-1 y por lo tanto indica que el paciente tiene cáncer para el cual la presencia suficientemente alta de esa proteína es un marcador. Los términos "alto grado de exactitud diagnóstica" y "muy alto grado de exactitud diagnóstica" se refieren a la prueba o ensayo para el polipéptido PD-1 con un determinado umbral que indique correctamente (con exactitud) la presencia o ausencia de cáncer. Una prueba perfecta tendría una exactitud perfecta. De este modo, para individuos que tienen diabetes, la prueba indicaría sólo resultados de prueba positivos y no reportaría ninguno de los individuos que fueran "negativos" (no habría "falsos negativos") . En otras palabras, la "sensibilidad" de la prueba (la proporción de positivos verdaderos) sería 100%. Por otra parte, para individuos que no tuvieran diabetes, la prueba indicaría sólo los resultados de prueba negativos y no reportaría ninguno de los individuos como "positivos" (no habría "falsos positivos"). En otras palabras, la "especificidad" (la proporción de negativos verdaderos) sería de 100%. Véase, por ejemplo, O'Marcaigh AS, Jacobson RM, "Estimating The Predictive Valué of a Diagnostic Test, How to Prevent Misleading or Confusing Results", Clin. Ped. 1993, 32 ( 8 ): 485-491, que analiza la especificidad, sensibilidad y los valores pronóstico negativos y positivos de una prueba, por ejemplo, una prueba de diagnóstico clínico. Al cambiar el umbral o valor límite de una prueba (o ensayo) normalmente cambia la sensibilidad y especificidad pero en una relación cualitativamente inversa. Por ejemplo, si se disminuye el umbral, más individuos en la población evaluada tendrán, por lo general, resultados de prueba arriba del umbral o del valor límite. Debido a que los individuos que tienen los resultados arriba del umbral o valor límite, se reportan como individuos que tienen la enfermedad, padecimiento o síndrome para el cual se realiza la prueba, la disminución del umbral o valor límite hará que más individuos se reporten con resultados positivos (o sea, que tienen cáncer) . De este modo, la prueba indicará que tiene cáncer una mayor proporción de aquellos que lo tienen. Sin embargo, al mismo tiempo, habrá más falsos positivos porque la prueba indicará en más gente que no tiene la enfermedad, padecimiento o síndrome (es decir, gente que realmente es "negativa"), valores de polipéptido PD-1 arriba del umbral y por lo tanto se reportará como positivo (es decir, que tiene la enfermedad, padecimiento o síndrome) en lugar de que la prueba los reporte como negativos. Por consiguiente, la especificidad (proporción negativa real) de la prueba disminuirá . Del mismo modo, la elevación del umbral o valor límite tenderá a disminuir la sensibilidad y aumentar la especificidad. Por lo tanto, para evaluar la exactitud y utilidad de la prueba médica, ensayo o métodos propuestos para evaluar el estado del paciente, siempre se tendrá que tomar en cuenta la sensibilidad y la especificidad y tener cuidado de considerar el valor límite al cual se reportan la sensibilidad y la especificidad porque éstas pueden variar significativamente en el intervalo de valores límite. Sin embargo, existe un indicador que permite la representación de la sensibilidad y la especificidad de una prueba, ensayo o método a través del intervalo completo de valores límite con solo un valor. Este indicador se deriva de la curva "características de operación del receptor" ("ROC") para la prueba, ensayo o método de que se trata. Véase, por ejemplo, Shultz, "Clinical Interpretation of Laboratory Procedures", capítulo 14 de Teitz, Fundamentáis of Clinical Chemistry, Burtis y Ashwood (eds.), 4th ed. 1996, W.B. Saunders Company, páginas 192-199; y Zweig et al . , "ROC Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Patients With Coronary Artery Disease", Clin. Chem., 1992, 38(8): 1425-1428. Una curva ROC es una gráfica x-y de sensibilidad en el eje "y", en una escala de cero a uno (es decir, 100%), contra un valor igual a uno menos especificidad en el eje "x", en una escala de cero a uno (es decir, 100%) . En otras palabras, es una gráfica de la proporción de positivos verdaderos contra la proporción de falsos positivos para esa prueba, ensayo o método. Para construir la curva ROC de la prueba, ensayo o método en cuestión, los pacientes se evalúan mediante un método perfectamente exacto o "estándar oro" que es independiente de la prueba, ensayo o método en cuestión, para determinar si los pacientes son negativos o positivos verdaderos para la enfermedad, estado o síndrome (por ejemplo, la angiografía coronaria es una prueba estándar oro para detectar la presencia de ateroesclerosis coronaria) . Los pacientes también se examinan utilizando la prueba, ensayo o método en cuestión y para valores límite variables los pacientes se reportan como positivos o negativos según el prueba, ensayo o método. La sensibilidad (proporción de positivos verdaderos) y el valor igual a uno menos la especificidad (cuyo valor es equivalente a la proporción de falsos positivos), se determinan para cada valor umbral o límite y cada par de valores x-y se gráfica como un solo punto en el diagrama x-y. La "curva" que conecta estos puntos es la curva ROC. El área bajo la curva ("ABC") es el indicador que permite la representación con un solo valor de la sensibilidad y especificidad de una prueba, ensayo o método a través de todo el intervalo de valores umbral o límite. El ABC máxima es uno (en una prueba perfecta) y el área mínima es la mitad. Mientras más cerca esté de uno el ABC, mejor será la exactitud de la prueba. La expresión "alto grado de exactitud diagnóstica" se refiere a una prueba o ensayo (como la prueba de la invención para determinar la presencia clínicamente significativa del polipéptido PD-1, mediante la cual se indica la presencia de diabetes) en la que el ABC (área bajo la curva ROC para la prueba o ensayo) es por lo menos de 0.70, de preferencia por lo menos de 0.75, con mayor preferencia por lo menos de 0.80, de preferencia por lo menos de 0.85, con mayor preferencia por lo menos de 0.90 y con la máxima preferencia por lo menos de 0.95. La expresión "muy alto grado de exactitud diagnóstica" se refiere a una prueba o ensayo en la que el ABC (área bajo la curva ROC para la prueba o ensayo) es por lo menos de 0.875, de preferencia por lo menos de 0.90, con mayor preferencia por lo menos de 0.925, de preferencia por lo menos de 0.95, con mayor preferencia por lo menos de 0.975 y con la máxima preferencia por lo menos de 0.98. De manera opcional, también se determina la expresión de otros biomarcadores conocidos para un cáncer en particular como otra indicación de si el individuo es o no portador de cáncer. Por ejemplo, se detectan CD10, bcl-6, CD20, CD57 o CXCR5. El polipéptido PD-1 y los biomarcadores adicionales se detectan de cualquier forma que sea adecuada, pero por lo general se detectan poniendo una muestra derivada del paciente en contacto con un anticuerpo que se une a PD-1 o biomarcador y luego detectando la presencia o ausencia de un producto de reacción. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, quimérico o un fragmento de los anteriores, como se comentó con detalle anteriormente; la etapa de detección del producto de reacción se puede llevar a cabo mediante cualquier método adecuado de inmunoanálisis. La muestra del individuo es por lo general un fluido biológico como se describe en lo anterior y puede ser la misma muestra de fluido biológico que se utiliza para el método descrito anteriormente. La expresión de un polipéptido PD-1 también permite monitorear el curso del tratamiento del cáncer. En este método, se obtiene una muestra biológica de un individuo sujeto a tratamiento, por ejemplo, tratamiento quirúrgico, quimioterapéutico u hormonal, para cáncer. Si se desea, las muestras biológicas se obtienen del individuo en varios tiempos, antes, durante o después del tratamiento. La expresión del PD-1 se determina y se compara contra una referencia, por ejemplo, un control del cual se conoce el estado del cáncer. La muestra de referencia se ha expuesto al tratamiento. Como alternativa, la muestra de referencia no se ha expuesto al tratamiento. De manera opcional, este monitoreo se lleva a cabo de manera preliminar con procedimientos de vigilancia quirúrgica de revisión y procedimientos de vigilancia quirúrgica posteriores. Por ejemplo, se pueden recolectar muestras de individuos que han recibido tratamiento quirúrgico inicial para el cáncer y tratamiento posterior con agentes antineoplásicos para el mismo y monitorear el avance del tratamiento. Si la muestra de referencia es de un individuo que no tiene cáncer, la similitud o una disminución de 1 cantidad del polipéptido PD-1 en la muestra de prueba y la muestra de referencia, indica que el tratamiento es eficaz. Sin embargo, un aumento en la cantidad de polipéptido PD-1 en la muestra de prueba y la muestra de referencia indica un resultado o pronóstico clínico menos favorable . El término "eficaz" significa que el tratamiento produce una disminución en la cantidad de polipéptido PD-1 o una disminución del tamaño, prevalencia o potencial metastásico de un tumor en un individuo. La evaluación del cáncer se hace utilizando protocolos clínicos estándar. La eficacia se determina junto con cualquier método conocido para diagnóstico o tratamiento del tumor particular. La expresión de un polipéptido PD-1 también permite la identificación de pacientes que son sensibles al tratamiento sistémico, por ejemplo, quimioterapéutico, hormonal o terapia de radiación. En este método, la muestra biológica de un individuo se obtiene antes de que se someta a tratamiento quirúrgico para cáncer. La expresión de un polipéptido PD-1 se determina entonces y se compara con una muestra biológica obtenida de un paciente después de la extirpación quirúrgica del cáncer. Probablemente, el paciente será sensible al tratamiento sistémico si la cantidad de polipéptido PD-1 disminuye después de la extirpación quirúrgica del cáncer. Por el contrario, un paciente no será sensible al tratamiento sistémico si la cantidad de polipéptido permanece constante o aumenta después de la extirpación quirúrgica del cáncer. La expresión del polipéptido PD-1 o de otros biomarcadores de cáncer, se determina a nivel de proteína o ácido nucleico mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar la expresión génica se puede aplicar el análisis de hibridación de Northern que utiliza sondas que reconocen específicamente una o más de estas secuencias. Como alternativa, la expresión se mide utilizando ensayos PCR de transcripción inversa, por ejemplo, mediante cebadores específicos para la secuencia de genes de expresión diferenciada. La expresión también se determina a nivel de proteína, es decir, por medición de los niveles de péptidos codificados por los productos génicos aquí descritos o las actividades de lo mismos. Estos métodos son muy conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo, inmunoanálisis con base en anticuerpos de proteínas codificadas por los genes. Se puede usar cualquier material biológico para la detección y/o cuantificación de la proteína o de su actividad. Como alternativa, se puede seleccionar un método adecuado para determinar la actividad de proteínas codificadas por los genes marcadores según la actividad de cada proteína analizada. De preferencia, el individuo es un mamífero. El mamífero es, por ejemplo, una persona, un primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca. Por lo general, los individuos son hombres o mujeres. Al individuo previamente se le ha diagnosticado como portador de cáncer y es posible que ya se haya sometido a un tratamiento. Como alternativa, al individuo no se le ha diagnosticado previamente como portador de cáncer. La presente invención es útil con todos los pacientes que estén en riesgo de padecer cáncer. Aunque cada tipo de cáncer tiene su propio conjunto de factores, el riesgo de desarrollar cáncer aumenta con la edad, el género, la raza y la historia médica personal y familiar. Otros factores de riesgo están muy relacionados con el estilo de vida, al mismo tiempo ciertas infecciones, la exposición ocupacional y algunos factores ambientales también pueden estar relacionados con el desarrollo de cáncer. El diagnóstico de cáncer por lo general se hace a través de la identificación de una masa al hacer un examen, aunque también se puede hacer por otros medios como el diagnóstico radiológico o el ultrasonido. El tratamiento, por lo general, implica la cirugía citorreductora seguida de un tratamiento con agentes antineoplásicos como docetaxel, vinorelbina, gemcitabina, capecitabina o combinaciones de ciclofosfamida, metotrexato y fluorouracilo; ciclofosfamida, doxorubicina y fluorouracilo; doxorubicina y ciclofosfamida; doxorubicina y ciclofosfamida con paclitaxel; doxorubicina seguida de CMF; o ciclofosfamida, epirubicina y fluorouracilo . Por otra parte, muchos pacientes requerirán terapia de radiación. Los inmunoanálisis realizados conforme a la presente invención pueden ser ensayos homogéneos o heterogéneos. En un ensayo homogéneo la reacción inmunológica por lo general implica el anticuerpo específico (por ejemplo, el polipéptido PD-1), un analito marcado y la muestra de interés. La señal que procede de la etiqueta o marca se modifica directa o indirectamente al unirse el anticuerpo al analito marcado. Tanto la reacción inmunológica como la detección de la intensidad de la misma se llevan a cabo en una solución homogénea. Las etiquetas inmunoquímicas que pudieran emplearse incluyen radicales libres, radioisótopos, colorantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos o coenzimas. En un enfoque de ensayo heterogéneo, los reactivos, por lo general, son la muestra, el anticuerpo y los medios para producir una señal detectable. Se pueden usar muestras como las que se describieron anteriormente. El anticuerpo, por lo general, se inmoviliza sobre un soporte, por ejemplo, una perla, una placa o un portaobjetos y se pone en contacto con el espécimen que supuestamente contiene el antígeno en una fase líquida. Luego, el soporte se separa de la fase líquida y ya sea que se examine la fase de soporte o la fase líquida en cuanto a una señal detectable que emplea medios para producir dicha señal. La señal está relacionada con la presencia del analito en la muestra. Los medios para producir una señal detectable incluyen el uso de etiquetas radioactivas, etiquetas fluorescentes o etiquetas enzimáticas. Por ejemplo, si el antígeno a detectar tiene un segundo punto de unión, un anticuerpo que se una a ese punto se puede conjugar a un grupo detectable y adicionarse a la solución de reacción en fase líquida antes de la etapa de separación. La presencia del grupo detectable en el soporte sólido indica la presencia del antígeno en la muestra de prueba. Ejemplos de inmunoanálisis adecuados son los radioinmunoanálisis, métodos de inmunofluorescencia o inmunoanálisis ligados a enzimas. Para los expertos en la técnica serán familiares los formatos de inmunoanálisis específicos y sus variaciones, que pueden ser útiles para llevar a cabo los métodos expuestos en la presente. Véase, en general, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay (1980) (CRC Press Inc., Boca Ratón, Fia.); véase también la Patente de los Estados Unidos Núm. 4, 727,022 de Skold et al . titulada "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application", la Patente de los Estados Unidos Núm. 4, 659,678 de Forrest et ai. titulada "Immunoassay of Antigens", la Patente de los Estados Unidos Núm. 4, 376,110 de David et al . , titulada "Immunometric Assays using Monoclonal Antibodies", la Patente de los Estados Unidos Núm. 4, 275,149 de Litman et al . titulada "Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays", la Patente de los Estados Unidos Núm. 4, 233,402 de Maggio et al . , titulada "Reagents and Methods Employing Channeling" y la Patente de los Estados Unidos Núm. 4, 230,767 de Boguslaski et al . titulada "Heterogeneus Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as Label". Los anticuerpos se conjugan a un soporte sólido adecuado para un ensayo diagnóstico (por ejemplo, perlas, placas, portaobjetos o pozos formados con materiales como látex o poliestireno) según técnicas conocidas, como la precipitación. Los anticuerpos, según se describe en la presente, se pueden conjugar también con grupos detectables como las radioetiquetas (por ejemplo, 35 S, 125 I, 131 I), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasas alcalinas) y etiquetas fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína) de conformidad con la técnicas conocidas. Los estuches de diagnóstico para llevar a cabo los métodos descritos aquí, se producen de diferentes maneras. En una modalidad, el estuche de diagnóstico comprende (a) un anticuerpo (por ejemplo, polipéptido PD-1) conjugado en un soporte sólido y (b) un segundo anticuerpo de la invención conjugado a un grupo detectable. Los reactivos también pueden incluir agentes auxiliares como amortiguadores y estabilizantes de proteínas, por ejemplo, polisacáridos y lo similar. El estuche de diagnóstico también puede incluir, en caso necesario, otros miembros del sistema productor de la señal del cual el grupo detectable es un elemento (por ejemplo, sustratos enzimáticos), agentes para reducir la interferencia de fondo en una prueba, reactivos de control, aparatos para realizar la prueba, y lo similar. Como alternativa, un estuche contiene (a) un anticuerpo y (b) un elemento de unión específico para el anticuerpo conjugado al grupo detectable. También se pueden incluir los agentes auxiliares descritos en lo anterior. Este estuche se empaca en cualquier forma adecuada, por lo general, con todos los elementos en un solo recipiente junto con una hoja de instrucciones impresas para realizar la prueba. Esta invención, en parte, tiene como base los experimentos descritos en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos tienen como fin ilustrar la invención y no deberán interpretarse como limitativos de la misma.

Ejemplo 1: Inhibición de la trayectoria de PD-1 en ratones infectados crónicamente, por medio de anticuerpos anti-PD-Ll Se utilizaron ratones infectados con varias cepas de virus coriomeningitis linfocítica (LCMV) para estudiar el efecto de la infección viral crónica en la función de las células T CD8+. La cepa LCMV Armstrong provoca una infección aguda que se elimina en 8 días, dejando detrás una población longeva de células T CD8+ de memoria en reposo de alta funcionalidad. Por el contrario, la cepa LCMV Cl-13 establece una infección persistente en el hospedero caracterizada por una viremia que dura hasta 3 meses. El virus permanece en algunos tejidos por tiempo indefinido y las células T CD8+ específicas de antígeno se hacen funcionalmente deficientes. Las células T CD8+ DbNP396-404 se eliminan físicamente, mientras que las células T CD8+ DbGP33-41 y DbGP276-286 persisten pero pierden su capacidad de proliferar o segregar citocinas antivirales, como IFN? y TNFa. Los ratones C57BL/6 se adquirieron en el Instituto Nacional de Cáncer ( Na tional Cáncer Ins ti tute) (Fredecrick, MD) . Los ratones se infectaron por vía intravenosa con 2 x 106 ufp de LCMV-C1-13. El agotamiento de CD4 se realizó inyectando 500 µg de GK 1.5 en PBS el día de la infección y al día siguiente. Los ratones inmunes a LCMV se generaron infectándolos por vía intraperitoneal con 2 x 105 ufp de LCMV Armstrong. Se realizó análisis de matrices génicas en células T CD8+ transgénicas P14 específicas de DbGP33-41 ingenuas purificadas por FACS, células T CD8+ de memoria específicas de DbGP33-41 derivadas de ratones inmunes a LCMV Armstrong y células T CD8+ específicas de DbGP33-41 o DbGP276-286 derivadas de ratones infectados con LCMV Cl-13 deficientes en CD4+. El aislamiento del ARN y el análisis de la matriz génica se hicieron como se describe en la publicación de Kaech et al . , (Cell 111:837-51, 2002). El ARNm del PD-1 se expresó intensamente en células T CD8+ agotadas en comparación con las células T CD8+ de memoria (Figura ÍA) . Por otra parte, el PD-1 se expresó en la superficie de las células T CD8+ en los ratones infectados con LCMV Cl-13, pero no estuvo presente en la superficie de las células T CD8+ después de la eliminación del LCMV Armstrong (Figura IB). Los ratones con infección crónica también expresaron altos niveles de los ligandos de PD-1, PD-Ll, en la mayoría de los linfocitos y APC en comparación con los ratones sin infectar. De este modo, la persistencia antigénica viral y el agotamiento de las células T CD8+ son concurrentes con la inducción en la expresión del PD-1. Para comprobar la hipótesis de que el bloqueo de la ruta PD-1/PD-L1 puede reestablecer la función de las células T y aumentar el control viral durante la infección crónica por LCMV, la ruta coinhibidora PD-l/PD-Ll se interrumpió durante la infección crónica por LCMV mediante anticuerpos bloqueadores aPD-Ll . Por vía intraperitoneal y cada tercer día se administró un anticuerpo bloqueador monoclonal contra PD-Ll a ratones infectados con LCMV Cl-13 (200 µg de anticuerpos monoclonales IgG2b de rata anti-PD-Ll de ratón (clon 10F.5C5 o 10F.9G2)) del día 23 al día 37 postinfección. En el día 37, hubo aproximadamente 2.5 veces más células T CD8+ específicas de DbNP396-404 y 3 veces más células T CD8+ específicas de DbGP33-41 en ratones tratados en comparación con los controles sin tratar (Figura 2A) . La inducción de la proliferación fue específica para las células T CD8+ ya que el número de células T CD4+ en el bazo fue aproximadamente el mismo tanto en los ratones tratados como en los ratones sin tratar (~6 x 104 IAbGP61-80 de células T CD4+ por bazo) . Además de un aumento en la proliferación de las células T CD8+, la inhibición de la señalización de PD-1 da como resultado un aumento en la producción de citocinas antivirales en células T CD8+ específicas del virus. Se determinó la producción de IFN? y TNFa en las células T CD8+ para ocho diferentes epítopes. La respuesta combinada fue 2.3 veces mayor en los ratones tratados en comparación con los ratones sin tratar (Figuras 2B y 2C) . Después del tratamiento, también se observó un aumento al doble en la frecuencia de células productoras de TNFa (Figura 2D) . La depuración viral también se aceleró a medida que el virus se eliminó del suero, del bazo y del hígado de los ratones tratados. Se observaron valores virales reducidos (~10 veces) en el día 37 postinfección (14 días después del inicio del tratamiento) en el pulmón y riñon de los ratones tratados. Sin embargo, los ratones sin tratar, mostraron niveles significativos de virus en todos estos tejidos (Figura 2E). Los valores virales en suero y homogeneizados de tejidos se determinaron mediante células Vero, tal como se describe en la publicación de Ahmed et al . (J. Virol. 51:34-41, 1984).

Los resultados muestran que un inhibidor de PD-1 aumenta la proliferación de las células T CD8+ y la depuración viral y esto indica que la inhibición de la señalización del PD-1 reestablece la función de las células T CD8+. Por otra parte, la inhibición de la señalización del PD-1 también intensifica las respuestas de las células B ya que el número de células secretoras de anticuerpos específicos de LCMV también aumentó (>10 veces) después del tratamiento. Las células T CD4+ desempeñan una función clave es la generación y mantenimiento de las respuestas de las células T CD8+. Al respecto, las células T CD8+ sensibilizadas en ausencia de células T CD4+ (denominadas células T CD8+ "inútiles") son incapaces de generar respuestas inmunes normales. Por otra parte, la infección crónica por LCMV es más grave en ausencia de las células T CD4+. Por consiguiente las células T inútiles generadas durante la infección por LCMV Cl-13 manifiestan una deficiencia funcional aun más intensa que las células T generadas en presencia de células T CD . Las células T CD8+ específicas de DbNP396-404 se reducen hasta niveles indetectables y las células T CD8+ DbGP33-41 y DbGP276-286 pierden por completo la habilidad de segregar IFN? y TNFa. Las células T CD4+ se eliminaron al momento que la infección por LCMV Cl-13 y los ratones se trataron con un tratamiento de anticuerpos anti-PD-Ll del día 46 al día 60 postinfección. Las células T CD4+ específicas de LCMV no fueron detectables mediante tinción de IFN? intracelular antes o después del tratamiento. Después del tratamiento, los ratones tratados tenían aproximadamente 7 veces más de células T CD8+ DGP276-286 y 4 veces más de células T CD8+ DbGP33-41 en el bazo que los ratones de control sin tratar (Figura 3A) . El número de células T CD8+ específicas del virus, en el bazo, también aumentó (Figura 3B) . Este aumento de las células T CD8+ específicas del virus en los ratones tratados se atribuyó a un aumento en la proliferación, según se detectó mediante incorporación de BrdU. 43% de las células T CD8+ DGP276-286 incorporaron niveles intermedios de BrdU y 2% incorporaron altos niveles de BrdU en ratones sin tratar, mientras que en los ratones tratados 50% de las células T CD8+ DbGP276-286 incorporaron niveles intermedios de BrdU y 37% incorporaron altos niveles de BrdU. El análisis de BrdU se realizó agregando 1 mg/ml de BrdU en el agua de consumo durante el tratamiento y la tinción se hizo conforme al protocolo del fabricante (BD Biosciences, san Diego, CA) . Por otra parte, los ratones tratados tuvieron un porcentaje más alto de células T CD8+ que expresaron la proteína KÍ67 asociada al ciclo celular (60% contra 19% en ratones sin tratar, Figura 3C) . La respuesta al tratamiento en las células T CD8+ en la PBMC se restringió a los ratones que tenían altos niveles de expansión de células T CD8+. La inhibición del PD-1 también aumentó la producción de citocina antiviral en células t CD8+ específicas del virus, agotadas e inútiles. Después del tratamiento, el número de células T CD8+ DbGP33-41 y DbGP276-286 que producen IFN? se incrementó notablemente (Figura 4A) , aunque también se detectaron números más altos de células T CD8+ específicas de DbNP396-404, KbNP205-212, DbNP166-175 y DbGP92-101, en ratones tratados (Figura 4A) . 50% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 de ratones tratados pueden producir IFN? en comparación con el 20% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 en ratones control sin tratar (Figura 4B) . Sin embargo, los niveles de IFN? y TNFa producidos por células T contenido específicas de DbGP276-286 de ratones tratados, fueron menores que las células de memoria específicas de DbGP276-286 funcionales (Figura 4C) . La inhibición del PD-1 también aumentó la actividad lítica de las células T CD8+ específicas del virus, agotadas e inútiles. La actividad lítica ex vivo de las células T CD8+ específicas del virus, se detectó después del tratamiento, mediante un ensayo de liberación de 51Cr (Wherry et al . , 2003. J. Virol. 77:4911-27). Los valores virales se redujeron después de 2 semanas de tratamiento, aproximadamente 3 veces en el bazo, 4 veces en el hígado, 2 veces en el pulmón y 2 veces en el suero con respecto a los ratones sin tratar (Figura 4E) . Por lo tanto, estos resultados demuestran que el bloqueo de la ruta del PD-1 rompe la tolerancia periférica de las células T citotóxicas (CTL) a una infección viral crónica y que las células T CD8+ agotadas carentes del apoyo de las células T CD4+ no se inactivan de manera irreversible.

Ejemplo 2: Administración de una vacuna antiviral y un inhibidor de PD-1 Un enfoque para reforzar las respuestas de las células T durante una infección persistente, es la vacunación terapéutica. El fundamento de este enfoque es que los antígenos endógenos pudieran no presentarse de una manera óptima o inmunogénica durante la infección viral crónica y que suministrar un antígeno en forma de vacuna puede brindar un estímulo más eficaz a las células B y T específicas del virus. Utilizando el modelo LCMV crónico, se administró a los ratones un virus variolovacunal que expresa el epítope LCMV GP33 como la vacuna terapéutica (VVGP33), lo cual dio como resultado un modesto aumento de las respuestas de las células T CD8+ en algunos ratones infectados crónicamente. Cuatros de los nueve ratones con infección crónica que recibieron la vacuna terapéutica mostraron una respuesta positiva mientras que ninguno de los ratones de control tuvieron un aumento significativo en la respuesta inmune contra el GP33. Cuando esta vacunación terapéutica se combinó con un inhibidor del PD-Ll, las respuestas de las células T específicas del LCMV se reforzaron en un grado mayor en comparación con el tratamiento solo y el efecto del tratamiento combinado fue más que aditivo.

Ejemplo 3: Inhibición de la ruta del PD-1 en ratones infectados crónicamente, mediante ARNi de PD-1 El ARN de interferencia (ARNi) es capaz de silenciar la expresión génica en células de mamífero. Se introduce en las células ARN bicatenario de hebra larga (ARNds) y después se procesan y se forman moléculas de ARN de silenciamiento más pequeñas (ARNsi) que se dirigen a moléculas de ARNm específicas o a un grupo pequeño de ARNm. Esta tecnología es muy útil en situaciones en las que los anticuerpos no son funcionales. Por ejemplo, el ARNi se puede emplear en una situación en la que variantes de escición únicas producen formas solubles de PD-1 y CTLA-4. El ARN silenciador del PD-1 se inserta en un vector de expresión de ARNsi comercial, por ejemplo, los vectores de expresión pSilencer * o vectores adenovirales (Ambion, Austin, TX) . Estos vectores se ponen en contacto con células T blanco agotadas, ex vivo o in vivo (Véase, Ejemplo 4 ) .

Ejemplo 4: Rejuvenecimiento ex vivo de células T agotadas Las células T CD8+ agotadas específicas del virus se aislan a partir de ratones infectados crónicamente con LCMV Cl-13, utilizando perlas magnéticas o centrifugación por densidad. Las células T CD8+ transfectadas se ponen en contacto con un anticuerpo monoclonal que se dirige al PD-Ll, PD-L2 o PD-1. Como se describe en el Ejemplo 1, la inhibición de la ruta del PD-1 da como resultado el rejuvenecimiento de las células T CD8+. Por consiguiente, hay un aumento en la proliferación de las células T CD8+ y la producción de citocinas, por ejemplo. Estas células T CD8+ rejuvenecidas se vuelven a introducir en los ratones infectados y la carga viral se mide según se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 5: Tamizaje in vitro de nuevos compuestos rejuvenecedores de células T CD8+ Los compuestos que modulan la ruta del PD-1, se pueden identificar mediante ensayos in vivo y ex vivo con base en su capacidad para invertir el agotamiento de las células T CD8+ derivado de una infección viral crónica. Las células T CD8+ agotadas se extraen de ratones infectados crónicamente con LCMV Cl-13 y después se ponen en contacto con un compuesto de prueba. Se mide, la cantidad de citocinas antivirales (por ejemplo, IFN? o TNFa) liberadas de las células T que se pusieron en contacto, por ejemplo, mediante un análisis ELISA u otro método cuantitativo y se compara con la cantidad, en su caso, de la citocinas antiviral liberada de las células T agotadas que no entraron en contacto con el compuesto de prueba. Un aumento en la cantidad de citocina antiviral liberada por las células tratadas en comparación con la cantidad liberada en las células sin tratar, identifica el compuesto como un inhibidor del PD-1 que es útil para modular la actividad de las células T.

Ejemplo 6: Tamizaje in vivo de nuevos compuestos rejuvenecedores de células T CD8+ Las células T CD8+ agotadas se extraen de ratones infectados crónicamente con LCMV Cl-13. Por vía intravenosa se administra a los ratones infectados un compuesto de prueba. Se mide la cantidad de citocinas antivirales (por ejemplo, IFN? o TNFa) que se libera en el suero de los ratones tratados y sin tratar, por ejemplo, mediante un análisis ELISA u otro método cuantitativo y se hace la comparación. Un aumento en la cantidad de citocinas antivirales encontradas en el suero de ratones tratados, con respecto a la cantidad en los ratones sin tratar, identifica al compuesto de prueba como un inhibidor de PD-1. Como alternativa, el valor viral (por ejemplo, valor viral sérico) se puede determinar antes y después del tratamiento con el compuesto de prueba.

Ejemplo 7 : Chimpancés como modelo para inmunoterapia de infección persistente por VHC Los chimpancés proporcionan un modelo de la persistencia de VHC en humanos. La deficiente inmunidad de las células T da lugar a la persistencia de un virus longevo que incluye tanto un déficit en células auxiliares T CD4 específicas de VHC como una deficiente o alterada actividad de las células T CD8+ efectoras. Los chimpancés infectados en forma persistente se tratan con anticuerpos contra CTLA-4, PD-1 o con una combinación de los dos. Se determina la eficacia del bloqueo de rutas inhibitorias, combinada con la vacunación que utiliza proteínas de VHC estructurales y no estructurales, y también se determina si estas estrategias pueden aumentar la frecuencia y longevidad de las células T de memoria específica del virus. El defecto de inmunidad de las células T es exclusivamente específico del VHC en humanos y chimpancés con infección persistente. La sangre y el hígado de chimpancés infectados se examinan para evaluar la expresión de CTLA-4, PD-1, BTLA y sus ligandos y para detectar la presencia de células Treg. La actividad antiviral puede entonces reestablecerse al suministrar a los chimpancés anticuerpos monoclonales humanizados que bloquean la señalización a través de estas moléculas. Los chimpancés con infección persistente se tratan con anticuerpos aCTLA-4 humanizados (MDX-010, Medarex) o anticuerpos aPD-1. La dosis inicial de MDX-010 es de 0.3 mg/kg, a las 2 semanas 1.0 mg/kg y después 3, 10, y 30 mg/kg en intervalos de tres semanas. Después del tratamiento con anticuerpos para moléculas coinhibidoras, se determinan las respuestas inmunes celulares y humorales así como la carga de ARN de VHC. Se recolectan muestras a las semanas 1, 2, 3, 5 y 8 y luego a intervalos mensuales. Las muestras incluyen: 1) suero para el análisis de transaminasas, autoanticuerpos, anticuerpos neutralizantes para VHC y respuestas de citocinas, 2) plasma para carga viral y evolución genómica, 3) PBMC para mediciones de inmunidad in vi tro, 4) hígado natural (sin preparar) para el aislamiento de linfocitos intrahepáticos y ARN, y 5) hígado preparado (incorporado en formalina/parafina) para análisis histológico e inmunohistoquímico . También se recolectan ganglios linfáticos regionales en 2 ó 3 puntos de tiempo, para evaluar la expresión de moléculas coinhibidoras y variantes de escición por técnicas inmunohistoquímicas y moleculares. Los ensayos para evaluar la eficacia y seguridad de estas terapias, se realizarán según se describe en la presente. Para determinar si la vacunación con antígenos de VHC refuerza el efecto terapéutico de los anticuerpos contra el PD-1, los chimpancés se trataron de la forma siguiente: 1) inmunización intramuscular con glicoproteínas de envoltura recombinante El y E2 (en auxiliar MF59) y otras proteínas (núcleo más NS 3, 4 y 5 formuladas con ISCOMS) en las semanas 0, 4 y 24; 2) inmunización intramuscular con la vacuna usada en 1) pero coadministrada con anticuerpos aCTLA-4 (30 mg por cada kg de peso corporal, por vía intravenosa a las semanas 0, 4 y 24 cuando la vacuna se aplicó); 3) igual que 2) con la excepción de que los anticuerpos aPD-1 (o BTLA) se sustituyen con los anticuerpos CTLA-4; 4) igual que los grupos 2) y 3) con la excepción de que además de la vacuna, se usa una combinación de anticuerpos CTLA-4 y PD-1 (o BTLA) . Las respuestas de las células T y B específicas del VHC se monitorean a intervalos mensuales después de la inmunización durante un periodo de 1 año. Los marcadores examinados en el tetrámero+ de VHC y en las células T totales en este análisis, incluyen marcadores de diferenciación (por ejemplo, CD45RA/RO, CD62L, CCR7 y CD27), de activación (por ejemplo, CD25, CD69, CD38 y HLA-DR) , de sobreviviencia/proliferación (por ejemplo, bcl-2 y Ki67), de potencial citotóxico (por ejemplo, granzimas y perforina) y receptores de citocinas (CD122 y CD127). Existe una correlación interesante entre los niveles previos a la terapia de quimiocina IP-10 y la respuesta a PEG IFN?/ribavirina . Los niveles de IP-10 se determinan para investigar una posible correlación entre las rutas reguladoras negativas o las respuestas de células T específicas del VHC y los niveles de IP-10. La expresión de receptores y ligandos inhibidores en PBMC, se realiza mediante citometría de flujo.

Ejemplo 8: Inmunotinción de PD-1 en tejido linfoide reactivo Ma teriales Los materiales se obtuvieron en el Bringham & Women ' s Hospital, Boston, MA, de conformidad con las políticas institucionales. Todos los diagnósticos tuvieron como base las particularidades histológicas e inmunofenotípicas descritas en el sistema de clasificación de linfomas de la Organización Mundial de la Salud (Jaffe ES, et al . , 2001) y en todos los casos el material de diagnóstico fue revisado por un hematopatólogo .

Inmunotinción La inmunotinción del PD-1 se realizó en secciones de tejido fijadas en formalina e incorporadas en parafina después de la recuperación del antígeno por microondas en amortiguador de citrato 10 mM, pH 6.0 con un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 humano descrito previamente (2H7; 5), utilizando un método indirecto estándar con proxidasa avidina-biotina y desarrollo de color con diaminobencidina, tal como se describió anteriormente (Jones D., et al . 1999; Dorfman DM, et al . 2003). Los casos se consideraron inmunorreactivos para PD-1 si al menos 25% de células neoplásicas mostraban tinción positiva. La tinción de PD-1 se comparó con la del anticuerpo de control isotipo IgG de ratón diluido a una concentración idéntica de proteína en todos los casos estudiados, para confirmar la especificidad de la tinción . El anticuerpo monoclonal 2H7 para PD-1, se usó para teñir especímenes, fijados en formalina e incorporados en parafina, de tejido linfoide reactivo, timo y un grupo de casos de trastornos linfoproliferativos de células T y células B. En especímenes de amígdala que muestran cambios reactivos, que incluyen hiperplasia folicular, un subconjunto de linfocitos predominantemente pequeños en los centros germinales exhibieron tinción citoplásmica para PD-1, y se observaron células positivas PD-1 poco frecuentes en las zonas interfoliculares de las células T. El patrón de tinción de PD-1 en los centros germinales, fue casi idéntico al que se observa con un anticuerpo contra CD3, un marcador de células pan-T, mientras que un anticuerpo contra CD20, un marcador de células pan-B, tiñó la gran mayoría de células B centro germinales. Se observaron resultados similares en las secciones histológicas de ganglios linfáticos reactivos y bazo. No se observó tinción de PD-1 en timo de adulto.

Ejemplo 9: Inmunotinción de PD-1 en secciones de tejido, incorporado en parafina, de trastornos linfoproliferativos células B y de células T Se estudió un grupo de trastornos linfoproliferativos de células B y células T en cuanto a la expresión de PD-1; los resultados se resumen en el Cuadro 1. Cuarenta y dos casos de trastornos linfoproliferativos en células B se estudiaron en cuanto a la expresión DP-1, entre los que se incluyen casos representativos de linfoma linfoblástico/leucemia linfoblástica precursor de células B, así como un grupo de trastornos linfoproliferativos de células B maduras, entre los que se incluyen varios linfomas no Hodgkin de células B de origen folicular, incluidos 6 casos de linfoma folicular y 7 casos de linfoma de Burkitt. Ninguno de los trastornos linfoproliferativos de células B mostró tinción para PD-1. En algunos casos, estuvo presente tejido linfoide reactivo no neoplásico y mostró un patrón de tinción de PD-1 como el que se observa en amígdala y otros tejidos linfoides reactivos señalados antes. Del mismo modo, en 25 casos de linfoma de Hodgkin, que incluyen 11 casos de linfoma de Hodgkin clásico y 14 casos de linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico, las células neoplásicas no presentaron tinción para PD-1. Es interesante que en los 14 casos de linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico, las células T que rodeaban las células L&H positivas CD20 neoplásicas fueron inmunorreactivas para PD-1, similar al patrón de tinción observado para las células T CD57+ en el linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico. Estas células positivas a PD-1 fueron un subgrupo de la población total de células T CD3+ presentes. Se estudiaron un grupo de trastornos linfoproliferativos de células T en cuanto a la expresión de PD-1; los resultados se resumen en el Cuadro 1. Los casos representativos de linfoma linfoblástico/leucemia linfoblástica precursor de células T, un neoplasma de células T inmaduras, fueron negativos para PD-1 igual que los neoplasmas de células T posteriores al timo, incluidos los casos de leucemia prolinfocítica de células T, linfoma periférico de células T, linfoma de células T grandes anaplásicas, inespecí ficas y leucemia/linforna de células T en adulto. Por el contrario, los 19 casos de linfoma angioinmunoblástico tenían focos de células positivas a PD-1 que fueron inmunorreactivas para los marcadores de células pan-T como las CD3. Las células positivas a PD-1 se encontraron de manera consistente en focos de redes de células dendríticas foliculares CD21+ expandidas, una particularidad característica del linfoma angioinmunoblástico.

CUADRO 1. Inmunotinción de PD-1 en trastornos linfoproliferativos Abreviaturas : B-LL/LL - linfoma linf oblástico/leucemia linfoblástica precursor de células B; CLL - leucemia linfocítica crónica; MCL - linfoma de célula de corteza cerebral ; FL - linfoma folicular; MZL - linfoma de zona marginal; HCL - leucemia de célula pilosa; DLBCL linfoma de célula grande difuso; BL - linfoma de Burkitt; LPL - linfoma linfoplasmocítico; MM - mieloma múltiple; T-LL/L - linfoma linf oblástico/leucemia linfoblástica precursor de células T; T-PLL - leucemia prolinfocitica de célula T; AIL - linfoma angioinmunoblástico ; PTCL -linfoma de célula T periférica , inespecífico; ALCL linfoma de célula grande anaplásica ; ATLL leucemia/linfoma de célula T de adulto.

* Número de casos inmunorreactivos/ número total de casos * * Cél ulas posi tivas a PD-1 que forman rosetas alrededor de células L&H neoplásicas en 14/14 casos .

Ejemplo 10: Métodos generales para estudiar la expresión de PD-1 en células T CD8 humanas específicas del VIH Se usaron los siguientes métodos para realizar los experimentos detallados en los Ejemplos 11-14.

Individuos del estudio Los participantes del estudio con infección crónica por VIH-1 clade C se reclutaron de las clínicas de consulta externa en el hospital McCord, Durban Sudáfrica y el hospital St . Mary's, Mariannhill, Sudáfrica. Se obtuvo sangre periférica de 65 individuos en esta cohorte, de los cuales todos eran pacientes que no habían recibido tratamiento previo de terapia antirretroviral en el momento del análisis. Para incluirse en el estudio, los individuos se seleccionaron con base en sus alelos del antígeno leucocitario humano (HLA o human leukocyte an tigen ) expresados y compatibles con los diez tetrámeros clase I que se construyeron (véase más adelante) . La mediana de la carga viral de la cohorte fue de 42,800 copias de ARN VIH-l/ml de plasma (intervalo 163-750000) y la mediana de la cuenta absoluta de CD4 fue de 362 (intervalo 129-1179) . La información relativa a la duración de la infección no estuvo disponible. Todos los individuos presentaron para el estudio el consentimiento informado por escrito, el cual fue aprobado por los comités de revisión institucionales. Construcción de anticuerpos PD-1 y PD-Ll Los anticuerpos monoclonales para PD-Ll humano (29E.2A3, IgG2b de ratón) y PD-1 (EH12, IgGl de ratón) se prepararon tal como se describió previamente y se ha demostrado que bloquean la interacción PD-1: PD-Ll.

Tetrámeros MHC clase I Para este estudio se usaron diez tetrámeros MHC clase I de VIH, sintetizados como se describió previamente (Altman JD, et al . 1966): A*0205 GL9 (p24, GAFDLSFFL; SEQ ID NO: 1), A*3002 KIY9 (Integrasa, KIQNFRVYY; SEQ ID NO: 2), B*0801 DI8 (p24, DIYKRWII; SEQ ID NO: 3), B*0801 FL8 (Nef, FLKEKGGL; SEQ ID NO: 4), B*4201 RM9 (Nef, RPQVPLRPM; SEQ ID NO: 5), B*4201 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEQ ID NO: 6), B*4201 TL10 (Nef, TPGPGVRYPL; SEQ ID NO: 7), B*4201 YL9 (RT, YPGIKVKQL; SEQ ID NO: 8), B*8101 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEQ ID NO: 9) y Cw0304 YL9 (p24, YVDRFFKTL; SEQ ID NO: 10) . Las construcciones de plásmidos que expresan A*0205, A*3002 y Cw*0304 fueron amablemente proporcionadas por los Drs . Eugene Ravkov y John Altman, NIH Tetramer Core facility, Atlanta, Georgia.

Tinción y análisis fenotípico del tetrámero HLA clase I Células mononucleares de sangre periférica recién aisladas (PBMC, 0.5 millones) se tiñeron con tetrámero durante 20 minutos a 37°C. Las células se lavaron una vez con solución salina amortiguada con fosfato (PBS o phospha te buffered saline) , se peletizaron y se tiñeron directamente con anti-CD8 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Becton Dickinson), anti-PD-1 conjugado con ficoeritrina (clon EH12) y ViaProbe (Becton Dickinson) . Las células se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron una vez en PBS y se resuspendieron en 200 µl de PBS con paraformaldehído 1% y se adquirieron en un clasificador celular activado por fluorescencia ( FACSCalibur, Becton Dickinson). Se adquirieron un mínimo de 100,000 eventos en el FACSCalibur.

Ensayos de proliferación de CFSE Un millón de PBMC recién aisladas se lavaron dos veces en PBS, se peletizaron y se resuspendieron en 1 ml de diacetato de carboxi-fluoresceína, succinimidil éster 0.5 µM (CFSE, Molecular Probes) durante 7 minutos a 37°C. Las células se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en 1 ml de medio RIO (RPMI 1640 complementado con glutatión, penicilina, estreptomicina y suero fetal de bovino al 10% [FCS] ) y se depositaron en un pozo de una placa de 24 pozos. Los estudios iniciales revelaron que una concentración final de 0.2 µg/ml de péptido dio las respuestas proliferativas óptimas, por lo tanto, esta fue la concentración final del péptido en el pozo usado para cada análisis. Los pozos de control negativo tenían PBMC en medio solo o PBMC en un medio con anti-PD-Ll purificado (10 µg/ml) y los pozos de control positivo se estimularon con 10 µg/ml de fitohemaglutinina (PHA) . Después del día 6 de incubación en un incubador a 37°C, las células se lavaron con 2 ml de PBS y se tiñeron con tetrámeros MHC clase I conjugados con PE, ViaProbe (Becton Dickinson) y anticuerpos anti-CD8-APC . Las células se adquirieron en un FACSCalibur y se analizaron mediante el software CellQuest® (Becton Dickinson) . Las células se alojaron en linfocitos CD8+ ViaProbe". El grado de aumento en células de tetrámero+ se calculó dividiendo el porcentaje de células de tetrámero+ CD8+ en presencia de péptido entre el porcentaje de células de tetrámero+ CD8+ en ausencia de estimulación con péptido.

Análisis estadístico Se hicieron análisis de la correlación de Spearman, la prueba de Mann-Whitney y la prueba t para datos emparejados, mediante el software GraphPad Prism Versión 4.0a. Todas las pruebas fueron bilaterales y los valores p<0.05 se consideraron significativos.

Ejemplo 11: Expresión de PD-1 en células T CD8 específicas de VIH Se sintetizó un panel de 10 tetrámeros MHC clase I específicos para epítopes de células T CD8 del virus VIH clade C, con base en los alelos HLA prevalentes y los epítopes blanco frecuentes en Gag, Nef, Integrasa y RT (Kiepiela P, et al . 2004), que permiten la visualización directa de la expresión del PD-1 de superficie en estas células. La tipificación de HLA de alta resolución se realizó en toda la cohorte, y se seleccionó para el estudio un subgrupo de 65 personas que previamente no habían recibido terapia antirretroviral, con base en los alelos HLA relevantes. Se analizó un total de 120 epítopes individuales y la tinción de PD-1 ex vivo representativa en las células de tetrámero+, se muestra en la Figura 5A. La expresión de PD-1 fue muy evidente en estas células de tetrámero+ y fue significativamente mayor que en la población total de células T CD8 de los mismos individuos (p<0.0001); a su vez, la expresión de PD-1 tanto en las células T CD8 tetrámero+ como en la población total de células T CD8 fue significativamente mayor que en los controles seronegativos a VIH. Para ocho de los diez tetrámeros analizados, por lo menos se identificó una persona en la que el nivel de expresión de células CD8 específicas de antígeno fue de 100% (Figura 5C) . Las PBMC de 3 a 25 individuos se tiñeron para cada respuesta del tetrámero VIH y se obtuvo una mediana de los niveles de expresión de PD-1 en el intervalo de 68 a 94% de células T tetramero+ (Figura 5C) . Estos descubrimientos se confirmaron también por análisis de la media de la intensidad de fluorescencia (MFI o mean fl uorescence intensi ty) del PD-1 en las células de tetrámero+ y en la población total de células T CD8 (Figura 5B, C) . Después se determinó si había evidencia de diferencias específicas de epítope en los niveles de expresión de PD-1 en personas con varias respuestas detectables. De las 65 personas examinadas, 16 individuos tenían cada uno entre 3 y 5 respuestas positivas a tetrámero. La expresión de PD-1 fue casi idéntica y cercana a 100% para cada respuesta analizada en tres de los 16 individuos; sin embargo, los otros 13 individuos mostraron diferentes patrones de expresión de PD-1 dependiendo del epítope (Figura 5D) . Estos datos indican que la expresión de PD-1 puede expresarse diferencialmente en células T CD8 específicas de epítope contemporáneo procedentes de una sola persona, quizá consistentes con datos recientes que indican diferencias específicas de epítope en la eficacia antiviral (Tsomides TJ, et al . 1994; Yang 0, et al . 1996; Loffredo JT, et al . 2005) .

Ejemplo 12 : Relación entre la expresión de PD-1 y el avance de la enfermedad por VIH Se determinó la relación entre la expresión de PD-1 en células T CD8 específicas de VIH y carga viral plasmática y las cifras de CD4, ambos factores pronóstico del avance de la enfermedad del VIH. Consistente con estudios previos, la relación entre el número de células tetrámero positivas y la carga viral o las cifras de CD4 no mostró ninguna correlación significativa (Figura 6A, B) . Por el contrario, hubo correlaciones positivas significativas con la carga viral y en el porcentaje y MFI de la expresión de PD-1 en células de tetrámero de VIH positivas (p=0.0013 y p<0.0001, respectivamente; Figura 6A) . También hubo correlaciones inversas entre las cifra de CD4 y el porcentaje y MFI de PD-1 en células de tetrámero de VIH positivo (p=0.0046 y p=0.0150, respectivamente; Figura 6B) . Puesto que los tetrámeros analizados probablemente representan sólo una fracción de la población de células T CD8 específicas de VIH en estos individuos, también se analizó la relación entre la expresión de PD-1 en todas las células CD8 y estos parámetros. Hubo correlaciones positivas significativas entre la carga viral y el porcentaje y MFI de la expresión de PD-1 en la población total de células T CD8 (p=0.0021 y p<0.0001, respectivamente; Figura 6C) y también se observaron correlaciones inversas entre la cifra de CD4 y el porcentaje y MFI de la expresión de PD-1 en la población total de células T CD8 (p=0.0049 y p=0.0006, respectivamente; Figura 6D) . En este mismo grupo, se analizó la expresión de PD-1 en células T CD8+ específicas de CMV de 5 individuos y se observó que el PD-1 se expresó significativamente menos en estas células en comparación con las células T CD8 específicas de VIH (mediana 23% tetrámero+ PD-1+ CMV, p=0.0036, no se presentan datos) y no hubo diferencia respecto al total de células T CD8 en los mismos individuos, lo que indica que la elevada expresión de PD-1 no es una particularidad uniforme de todas las células T CD8 específicas del virus. Estos datos sugieren que el aumento en las cantidades de antígeno en la infección crónica, dan como resultado un aumento en la expresión del PD-1 en las células T CD8 y son consistentes con datos de murino en la infección crónica por LCMV en la que la expresión de PD-1 está asociada con el agotamiento funcional de las células T CD8 (Barber DL, et al . 2005) . Por otra parte, en un estudio amplio que incluye el análisis de varios epítopes, se da la primera asociación evidente entre células T CD8 específicas de VIH y la carga viral o la cifra de CD4.

Ejemplo 13: Relación entre la expresión de PD-1 y el estado y función de la memoria de las células T CD8 La expresión de PD-1 se analizó en el contexto de varios marcadores fenotípicos adicionales asociados con el estado y función de la memoria de las células T CD8\ que incluyen CD27, CD-28, CD45RA, CD57, CD62L, CD127, CCR7, perforina, granzima B y Ki67 (Figura 7). Tinciones representativas para estos marcadores en células de tetrámero* B*4201 TL9 procedentes de un individuo, se presentan en la Figura 7A y los datos globales de 13 individuos se presentan en la Figura 7B. Estos estudios se limitaron a las respuestas a tetrámero que dieron más de 95% positivo a PD-1, ya que la citometría de flujo multiparámetros de más de 4 colores no estuvo disponible en KwaZulu Natal. Las células de tetrámero+ PD-1+ VIH expresan altos niveles de CD27 y granzime B, muy bajos niveles de CD-28, CCR7 y Ki67 intracelular, bajos niveles de CD45RA y perforina y niveles intermedios de CD57 y CD62L (Figura 7B) . Estos datos indican que las células T PD-1+ específicas de VIH muestran un fenotipo de memoria efector/efector y son consistentes con reportes previos de maduración sesgada de células T CD8 específicas de VIH (Champagne P, et al . 2001; Appay V, et ai. 2002; Hess C, et al . 2004). Por otra parte, se realizó la secuenciación del virus para determinar si estas células dirigían un escape inmune (Brown JA, et al . 2003) . De 45 de estas respuestas a tetrámero positivas evaluadas, en sólo 5 los epítopes virales fueron diferentes de la secuencia consenso clade C sudafricana (no se presentan datos), lo que indica que estas células ejercen poca presión de selección in vivo . Experimentos previos en ratones que utilizaron el modelo LCMV mostraron que el bloqueo in vivo de la interacción PD-1/PD-L1 por infusión de anticuerpos bloqueadores anti-PD-Ll da como resultado un aumento en la funcionalidad de las células T CD8 específicas de LCMV, según se determina por la producción de citocinas, la capacidad de exterminar, la capacidad proliferativa y en forma más estricta, la reducción de la carga viral (Barber DL, et al . 2005).

Ejemplo 14: Efecto del bloqueo de la ruta de PD-1/PD-L1 en la proliferación de células T CD8 específicas de VIH Debido a que las células T CD8 específicas de VIH presentan una capacidad proliferativa deficiente (Migueles SA, et al . 2002; Lichterfeld M, et ai. 2004), se determinó si el bloqueo de PD-1/PD-L1 podía aumentar esta función in vi tro . Los datos representativos de un individuo positivo a B*4201 se muestran en la Figura 8A. La incubación de PBMC recién aisladas y marcadas con CFSE, en un medio solo o en un medio con un anticuerpo anti-PD-Ll, dio como resultado la conservación de una población de células T CD8 específicas de B*4201-TL9 (1.2% de células T CD8) que permanecieron CFSEhi después de seis días de cultivo. La estimulación de PBMC marcadas con CFSE durante 6 días con péptido TL9 solo, dio como resultado una expansión de 4.8 veces de células CFSE10 B*4201-TL9 tetrámero+, mientras que la estimulación de PBMC CFSE marcadas con CFSE, con péptido TL9 en presencia de un anticuerpo bloqueador anti-PD-Ll aumentó la proliferación de células específicas de TL9, que dio como resultado un aumento de 10.3 veces en células tetrámero+. Los ensayos de proliferación de CFSE se realizaron en 28 muestras en presencia y ausencia de anticuerpo bloqueador anti-PD-Ll humano purificado. Se observó un aumento significativo en la proliferación de células T CD8+ específicas de VIH en presencia de péptido más anticuerpo bloqueador anti-PD-Ll en comparación con la cantidad de proliferación posterior a la estimulación con péptido solo (Figura 8B; p=0.0006, prueba t con datos emparejados). El grado de aumento de las células tetrámero+ en presencia de anticuerpo bloqueador anti-PD-Ll varió por individuo y por epítope en un individuo dado (Figura 8C) , lo cual nuevamente sugiere diferencias específicas de epítope en el grado de agotamiento funcional de estas respuestas .

OTRAS MODALIDADES Aun cuando la invención se ha descrito de una forma detallada, esta descripción tiene la finalidad de ilustrar y no limitar el alacance de la invención, el cual está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. También quedan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones otros aspectos, ventajas y modificaciones .

Claims (50)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para aliviar o prevenir un síntoma de infección persistente o cáncer, que consiste en administrar a un individuo que lo necesita un compuesto que reduce la expresión o actividad de un péptido de muerte celular programada (PD-1) en ese individuo .
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde la infección persistente es una infección viral, una infección bacteriana, una infección fúngica, una infección micoplásmica o una infección parasitaria.
3. 3. El método según la reivindicación 2, en donde la infección viral es una infección con virus de hepatitis, un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , un virus linfotrófico T humano (VLTH) , un virus herpes, un virus Epstein-Barr o un virus de papiloma humano.
4. 4. El método según la reivindicación 2, en donde la infección parasitaria es malaria.
5. 5. El método según la reivindicación 2, en donde la infección bacteriana es tuberculosis.
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde el cáncer es linfoma angioinmunoblástico o linfoma de Hodgkin con predominio linfocítico nodular.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en donde el compuesto reduce la expresión o actividad de un ligando 1 de PD-1 (PD-Ll) o un ligando 2 de PD-1 (PD-L2) .
8. 8. El método según la reivindicación 1, en donde el compuesto reduce la interacción entre PD-1 y PD-Ll o la interacción entre PD-1 y PD-L2.
9. 9. El método según la reivindicación 1, en donde el compuesto aumenta la actividad de las células T citotóxicas en el individuo.
10. 10. El método según la reivindicación 9, en donde la actividad de la células T citotóxicas es la producción de citocinas, la proliferación de células T o la depuración del agente infeccioso.
11. 11. El método según la reivindicación 10, en donde el agente infeccioso es un virus, una bacteria, un hongo, un micoplasma o un parásito.
12. 12. El método según la reivindicación 9, en donde la célula T es una célula T específica de cáncer.
13. 13. El método según la reivindicación 10, en donde la citocinas es IFN?, TNFa o IL-2.
14. 14. El método según la reivindicación 1, en donde el compuesto es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-PD-L2, anti-PD-1 RNAi, anti-PD-Ll RNAi, anti-PD-L2 RNAi, anti-PD-1 ARN antisentido, anti-PD-Ll ARN antisentido, anti-PD-L2 ARN antisentido, una proteína PD-1 negativa dominante, una proteína PD-Ll negativa dominante y una proteína PD-L2 negativa dominante.
15. 15. El método según la reivindicación 12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo desinmunizado o una proteína de fusión Ig.
16. 16. El método según la reivindicación 1, en donde el compuesto es una molécula pequeña.
17. 17. El método según la reivindicación 1, que además consiste en administrar al individuo una vacuna.
18. 18. El método según la reivindicación 17, en donde la vacuna comprende un auxiliar o un refuerzo.
19. 19. El método según la reivindicación 1, que además consiste en administrar al individuo un segundo compuesto .
20. 20. El método según la reivindicación 19, en donde el segundo compuesto es un compuesto antiviral, un compuesto antibacteriano, un compuesto antifúngico, un compuesto antiparasitario, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antineoplásico o un analgésico.
21. 21. El método según la reivindicación 19, en donde el segundo compuesto reduce la expresión o actividad del antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4) o del atenuador de linfocito B y T (BTLA).
22. 22. El método según la reivindicación 19, en donde el segundo compuesto reduce el volumen de la célula de cáncer.
23. 23. El método según la reivindicación 19, en donde el segundo compuesto es un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-BTLA, un anticuerpo anti-CD-28, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOS-L, un anticuerpo anti-B7-l, un anticuerpo anti-B7-2, un anticuerpo anti-B7-H3 o un anticuerpo anti-B7-H4.
24. 24. El método según la reivindicación 1, en donde el individuo es una persona.
25. 25. Un método para aliviar o prevenir un síntoma de una infección persistente o de cáncer, que consiste en administrar a un individuo que lo necesite un compuesto que reduce la expresión o actividad de un miembro de la familia tipo CD28, en donde el miembro de la familia tipo CD-28 se selecciona a partir del grupo formado por PD-1, CTLA-4, BTLA y un fragmento funcional o variantes de los mismos.
26. 26. El método según la reivindicación 25, en donde la infección persistente es una infección viral.
27. 27. El método según la reivindicación 26, en donde la infección viral es una infección con virus de hepatitis, un virus de inmunodeficiencia humana (VIH), un virus linfotrófico T humano (VLTH) , un virus herpes, un virus Epstein-Barr o un virus de papiloma humano.
28. 28. El método según la reivindicación 25, en donde el compuesto aumenta la actividad de las células T citotóxicas en el individuo.
29. 29. El método según la reivindicación 28, en donde la actividad de las células T citotóxicas es la producción de citocinas, la proliferación de células T o la depuración del agente infeccioso.
30. 30. El método según la reivindicación 25, en donde el compuesto es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-PD-L2, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-BTLA, un anticuerpo anti-CD-28, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOS-L, un anticuerpo anti-B7-l, un anticuerpo anti-B7-2, un anticuerpo anti-B7-H3 o un anticuerpo anti-B7-H4.
31. 31. El método según la reivindicación 25, que además consiste en administrar al individuo una vacuna.
32. 32. El método según la reivindicación 25, que además consiste en administrar al individuo un segundo compuesto .
33. 33. Un método para aliviar o prevenir un síntoma de una infección persistente o de cáncer en un individuo, el método consiste en administrar al individuo una célula T específica de antígeno que ha estado en contacto con un compuesto que reduce la expresión o actividad de un polipéptido PD-1 en esa célula.
34. 34. El método según la reivindicación 33, en donde al individuo también se le administra una célula B específica de antígeno que ha estado en contacto con un compuesto que reduce la expresión o actividad de un polipéptido PD-1 en esa célula.
35. 35. El método según la reivindicación 33, en donde la célula T procede de una fuente autológa.
36. 36. El método según la reivindicación 33, en donde las células T se derivan de un individuo de la misma especie.
37. 37. El método según la reivindicación 33, en donde las células T se derivan de un individuo de diferente especie que el individuo que se trata.
38. 38. El método según la reivindicación 33, en donde la célula T específica de antígeno es específica para un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, un antígeno parasitario o un antígeno de cáncer.
39. 39. El método según la reivindicación 38, en donde el antígeno viral es un antígeno de un virus de hepatitis, un virus de inmunodeficiencia humana (VIH), un virus linfotrófico T humano (VLTH), un virus herpes, un virus Epstein-Barr o un virus de papiloma humano.
40. 40. Un método para aumentar la actividad citotóxica de una célula T, que consiste en poner en contacto la célula T con un compuesto que reduce la expresión o actividad de un polipéptido PD-1.
41. 41. El método según la reivindicación 40, en donde la actividad biológica se reduce al reducir la expresión o actividad del ligando de PD-1 (PD-Ll) o el ligando 2 de PD-1 (PD-2L) .
42. 42. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto reduce la interacción entre PD-1 y PD-Ll o la interacción entre PD-1 y PD-L2.
43. 43. El método según la reivindicación 40, en donde la actividad citotóxica es la producción de citocinas, la proliferación de células T o la depuración del agente infeccioso.
44. 44. El método según la reivindicación 40, en donde el compuesto es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-PD-L2, anti-PD-1 RNAi, anti-PD-Ll RNAi, anti-PD-L2 RNAi, anti-PD-1 ARN antisentido, anti-PD-Ll ARN antisentido, anti-PD-L2 ARN antisentido, una proteína PD-1 negativa dominante, una proteína PD-Ll negativa dominante o una proteína PD-L2 negativa dominante.
45. 45. El método según la reivindicación 40, que además consiste en poner en contacto la célula con un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-PD-L2, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-BTLA, un anticuerpo anti-CD-28, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOS-L, un anticuerpo anti-B7-l, un anticuerpo anti-B7-2, un anticuerpo anti-B7-H3 o un anticuerpo anti-B7-H4.
46. 46. Un método para hacer un diagnóstico en un individuo que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer, el método consiste en: (a) obtener una muestra del individuo, la muestra contiene células inmunes; y (b) medir la expresión o actividad de PD-1 en la muestra del individuo, en donde un aumento en la expresión o actividad del PD-1 en comparación con la expresión o actividad en una muestra de control, identifica al individuo como un individuo que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer.
47. 47. Un método para seleccionar un tratamiento para un individuo que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer, el método consiste en: (a) obtener una muestra del individuo que contenga células inmunes; (b) medir la expresión o actividad del PD-1 en las células inmunes, en donde un aumento en la expresión o actividad del PD-1 en comparación con la expresión o actividad en una muestra de control, identifica al individuo como un individuo que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer; (c) seleccionar un tratamiento para el individuo al que se diagnosticó que padece identifica al individuo como un individuo que padece o está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer, en donde el tratamiento comprende un compuesto que reduce la expresión o actividad del PD-1.
48. 48. El método según las reivindicaciones 46 ó 47, en donde el paso (b) implica también identificar células inmunes específicas de antígeno, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno parasitario o un antígeno fúngico.
49. 49. El método según las reivindicaciones 46 ó 47, en donde la muestra es una muestra de sangre, una biopsia de tejido o una muestra de médula ósea.
50. 50. El método según las reivindicaciones 46 ó 47, en donde las células de control proceden de un individuo que no padece ni está en riesgo de padecer una infección persistente o cáncer.