MX2007004374A - Proteina quimerica. - Google Patents

Abstract

Una proteina de fusion que contiene un primer segmento que esta ubicado en el termino amino de la proteina de fusion y que se une especificamente a una primera citocina o factor de crecimiento y la neutraliza, y un segundo segmento que esta ubicado en el termino carboxilo de la proteina de fusion y se une especificamente a un segundo receptor de citocina que con frecuencia es abundante en sitios de enfermedad, tal como el sitio inflamatorio rico en receptor de IL-1. Ademas, dicho segundo segmento usualmente es el antagonista del receptor, tal como el antagonista del receptor de IL-1 y sus analogos funcionales equivalentes. Tambien se describe acidos nucleicos que codifican la proteina de fusion, vectores y celulas huesped que tienen los acidos nucleicos, y composicion y metodos relacionados para apuntar a enfermedades inflamatorias e indicios co-existentes con inflamacion.

Description

PROTEINA QUIMÉRICA Solicitud relacionada Esta solicitud reclama el derecho de prioridad de la solicitud de patente estadounidense provisional número de serie US/618, 476, presentada el 12 de octubre de 2004; de la solicitud de patente estadounidense provisional número de serie US 60/628,994, presentada el 17 de noviembre de 2004; y de la solicitud de patente estadounidense provisional titulada "IL-1 ra como compañero de fusión para la angiogénesis dirigida", presentada el 1 de febrero de 2005, cuyo contenido está incorporado aquí mediante referencia en su totalidad. Campo de la invención La presente invención está dirigida a agentes terapéuticos con proteína quimérica útiles en el tratamiento de diversas enfermedades, tales como inflamación, asma y cáncer. Antecedentes de la invención La inflamación es la reacción de defensa del cuerpo a daños tales como los ocasionados por daño mecánico, infección o estimulación de antígenos. Una reacción inflamatoria se puede expresar patológicamente cuando se induce la i/iflamación mediante un estímulo inapropiado tal como un auto antígeno, expresada en una manera exagerada, o que persiste mucho después de la eliminación de los agentes dañinos. La inflamación con frecuencia coexiste con indicios relacionados con asma y angiogénesis. Se ha desarrollado una cantidad de proteínas terapéuticas para inhibir las reacciones inflamatorias, tratar el asma relacionada con inflamación , y reducir la angiogénesis patológ ica. Sin embargo, muchas de ellas no son satisfactorias debido a baja eficacia , efectos secundarios o inestabilidad . Breve descri pción de la invención Esta invención se refiere al uso del antagon ista del receptor de I L-1 (I L-1 ra) o su equivalente funcional como compañero de fusión para proteínas bioactivas o terapéuticas. Los ejemplos de las proteínas bioactivas o terapéuticas incluyen , sin limitarse a ellos, neutralizadores de factor de necrosis tumoral (FNT) , neutralizadores de I L-1 8, neutralizadores de I L-4/I L-1 3, neutralizador de VG EF, neutralízador de angiopoyetina, y otros útiles en el tratamiento de indicios relacionados con inflamación , asma y angiogénesis.. U n aspecto de esta invención incorpora una proteína de fusión que contiene un primer segmento que está ubicado en el terminal amino de la proteína de fusión y se une específicamente a una primera citocina o factor de crecimiento y lo neutraliza; y un segundo segmento que está ubicado en el terminal carboxilo de la proteína de fusión y se une específicamente a un receptor de una segunda citocina o a un factor de crecimiento, por ejemplo, receptores de I L-1 que son abundantes en sitios inflamatorios. Los dominios están ligados operativamente, y la primera o la segunda citocina es abundante en un sitio inflamatorio. La proteína de fusión recién descrita puede ser glicosilada.

Además puede incluir un segmento enlazante que une el primer segmento y el segundo segmento. El segmento enlazante es capaz de dimerizarse. En un ejemplo, el segmento enlazante contiene el fragmento Fc de una inmunoglobulina o un equivalente funcional de ella. Preferiblemente, la ¡nmunoglobulina es una IgA, IgE, IgD, IgG, o IgM. Más preferiblemente, la ¡nmunoglobulina es IgG o su fragmento Fc, por ejemplo, SEQ ID NO.: 2. La cadena de inmunoglobulina contiene SEQ ID NO: 9, 11, 12, 14, 23, o 24; o un equivalente funcional de ella. En la proteína de fusión recién descrita, el primer segmento se puede unir a VEGF, Ang, FNT, IL 18, IL4, o IL6, o a un equivalente funcional de él y neutralizarlo. Por ejemplo, el primer segmento contiene la secuencia de una cadena de una inmunoglobulina que se una específicamente a VEGF, angiopoyetinas, FNT, I L-18, IL-4, IL-13 o IgE; o un equivalente funcional de él y la neutraliza. El primer segmento también puede contener la secuencia de un receptor de VEGF, Ang, FNT, IL18, IL4, IL-13 o IgE, por ejemplo, SEQ ID NO.: 3, 6, 15, o 19. En la proteína de fusión recién descrita, el segundo segmento se puede unir específicamente a un receptor de IL-1. El segundo segmento puede ser un antagonista de IL-1, tal como un segmento que contenga la secuencia de IL-1ra (SEQ ID NO.: 1) o un análogo equivalente funcional de ella. De acuerdo con esto, la proteína de fusión antes descrita puede contener SEQ ID NO: 5, 8, 10, 13, 17, 18, 21, 22, 24, o 25. Otro aspecto de esta invención incorpora un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia que codifica la proteína de fusión antes descrita. Esta puede contener una secuencia que codifica una de las SEQ I D NO: 1 -25. Dentro del alcance de esta invención está una composición que contiene (i) la proteína de fusión descrita anteriormente o un ácido nucleico que la codifica y (ii) un portador aceptable farmacéuticamente. También dentro del alcance de esta invención está un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto. El método incluye identificar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de adquirir una condición caracterizada por una respuesta inflamatoria excesiva, una respuesta inmunitaria, y una respuesta de angiogénesis; y administrar al sujeto una cantidad efectiva de la proteína de fusión antes descrita o un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. El sujeto puede ser uno que ha recibido o que contempla que va a recibir un trasplante alogénico o xenógeno. Los ejemplos de la condición incluyen una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad alérgica, o un cáncer. En el caso en que la condición es cáncer dependiente de angiogénesis, se prefiere una proteína de fusión que contiene SEQ ID NO: 24. En otro aspecto, la invención incorpora un método para aumentar la vida media de una proteína recombinante en un sujeto. El método incluye unir la proteína recombinante a un segmento que contiene SEQ ID NO.: 1 o un equivalente funcional de ella para formar una proteína de fusión quimera; y determinar la vida media de la proteína de fusión en un sujeto. La proteína recombínante se une a una citocina o a un factor de crecimiento. La invención también incorpora un método para aumentar la eficacia de una proteína recombinante en un sujeto. El método incluye unir la proteína recombinante a un segmento que contiene SEQ I D NO: 1 o un equivalente funcional de ella para formar una proteína de fusión quimera; y determinar la eficacia de la proteína de fusión en un sujeto. En una modalidad, la proteína de fusión quimera se une y neutraliza simultáneamente al receptor de I L-1 y a las citocinas o factor de crecimiento en el sitio de inflamación o en un sitio de enfermedad rico en receptor de I L-1 en un sujeto. En otra modalidad, la proteína de fusión quimera neutraliza o antagoniza las actividades tanto de la I L-1 como de la cítocina o factor de crecimiento en el sitio de inflamación o en un sitio de enfermedad rico en receptor de I L-1 en un sujeto. En todavía otra modalidad, la invención incorpora un método para suministrar una proteína terapéutica a un sitio objetivo en un sujeto, el método incluye unir la proteína terapéutica a un segmento que contiene SEQ ID NO: 1 o un equivalente funcional de ella para formar una proteína de fusión quimera; y administrar la proteína de fusión quimera a un sujeto que necesita de ello. La proteína terapéutica es apuntada hacia un sitio inflamatorio que es rico en receptor de IL-1 . En una modalidad, el segmento que contiene SEQ ID NO: 1 o un equivalente funcional de ella se une al receptor de I L-1 , y la proteína recombinante es una proteína terapéutica que se une a una citocina o a un factor de crecimiento y lo neutraliza. Un polipéptido aislado se refiere a un polipéptido sustancialmente libre de moléculas asociadas naturalmente, es decir, es al menos 75% (es decir, cualquier cantidad entre 75% y 100%, inclusive) puro por peso seco. La pureza se puede medir mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía de columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o HPLC. Un polipéptido aislado de la invención se puede purificar a partir de una fuente natural (para los polipéptidos de tipo natural), producida mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante métodos químicos. Un ácido nucleico se refiere a una molécula de ADN (por ejemplo, un ADNc o ADN genómico), una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm), o un ADN o análogo de ARN . Un ADN o análogo de ARN se puede sintetizar a partir de análogos nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario. Un "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico cuya estructura no es idéntica a la de cualquier ácido nucleico de origen natural o a la de cualquier fragmento de un ácido nucleico genómico de origen natural. El término por lo tanto cubre, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de una molécula de ADN genómico de origen natural, pero que no está flanqueado por ambas secuencias codificadoras que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el cual se origina de forma natural, (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota en una forma tal que la molécula resultante no es idéntica a cualquier vector de origen natural o ADN genómico; (c) una molécula separada tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido mediante reacción de la cadena de polimerasa (PCR) , o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que es parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica una proteína de fusión. El ácido nucleico descrito anteriormente se puede usar para expresar el polipéptido de esta invención. Para este propósito, se puede ligar operativamente al ácido nucleico a secuencias reguladoras apropiadas para generar un vector de expresión . Un vector se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha estado ligada. El vector puede ser capaz de replicación autónoma o de integrarse en un ADN huésped. Los ejemplos del vector incluyen un plásmido, cósmido o vector viral. El vector incluye un ácido nucleico en una forma apropiada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Preferiblemente el vector incluye una o más secuencias reguladoras ligadas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Una "secuencia reguladora" incluye promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como también secuencias reguladoras y/o inducibles específicas para tejidos. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célu la huésped que va a ser transformada, el nivel de expresión de proteína o ARN deseado, y similares. El vector de expresión se puede introd ucir en células huésped para producir un polipéptido de esta invención . También dentro del alcance de esta invención está una célula huésped q ue contiene el ácido nucleico descrito anteriormente. Los ejemplos incluyen células de E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresión baculovirus) , células de levad u ra, o células de mamífero. Véase por ejemplo, Goeddel , ( 1 990) Gene Expression Tech nology: Methods in Enzymology 1 85, Academic Press, San Diego, CA. Para producir un polipéptido de esta invención , se puede cultivar u na célula huésped en un medio bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido codificado por un ácido n ucleico de esta invención , y purificar el polipéptido de la célula cultivada o el medio de la célula. Alternativamente, el ácido n ucleico de esta invención puede ser transcrito in vitro , por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7. Un "equivalente funcional" de un factor proteinoso se refiere a un polipéptido derivado de la proteína , por ejemplo, una proteína que tiene una o más mutaciones, inserciones, deleciones, truncaciones en un punto, una proteína de fusión , o una combinación de ellas. Ésta mantiene sustancialmente la actividad del factor, por ejemplo, la capacidad para unirse a u na citocina, a un factor de crecimiento, o a un receptor de ellos. Los detalles de una o más modalidades de la invención se presentan en la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones. Breve descripción de los dibujos Figura 1: Primera generación de clones de producción de TNFRII-Fc y quimera TNFRII-Fc-ILI ra: Expresión en placa de 24 receptáculos en medio libre de suero; tinción directa de proteína con azul Coomasie; todas las proteínas recombinantes son visibles en el rango de 0.5-1.0 ug; con carga de 10-15 microlitros por carril. Figura 2: Purificación por afinidad de quimera FNTRII-Fc-IL- 1ra: SDS PAGE en condiciones reducida y no reducida; tinción de proteína con azul Coomasie. Figura 3: Un ejemplo de nuestra capacidad para solucionar problemas: reducción de un problema de degradación para FNTRII- Fc-IL-1ra quimera alterando el primer paso de purificación - análisis con HPLC de FNTRII-Fc-IL-1 ra quimera parcialmente degradada con FNTRII-Fc control. Figura 4: Purificación por afinidad de IL-4R-Fc, IL-4R-Fc-IL-1ra y IL-18bp-Fc-IL-1ra. Figura 5: La prueba de neutralización de FNT alfa basada en células indica que de manera similar a la FNTRII-Fc del mercado (Enbrel), la FNTRII-Fc-IL-1 ra quimera neutraliza la actividad de eliminación del FNT alfa en células L979.

Figura 6: La prueba de neutralización de I L-1 indica que tanto la I L-1 ra del mercado (Kineret) como la FNTRI I-Fc-I L-1 ra quimera, neutralizan la actividad biológica de la I L-1 sobre la proliferación de células D 10. Figura 7: Análisis de neutralización de I L-4 humana, de I L-4R- Fc-I L-1 ra y de I L-4R- Fc control. Figura 8: Análisis de neutralización de IL-1 de I L-4R-Fc-IL-1 ra.

Figura 9: Actividad neutralizante de I L-18 de I L-18bp-Fc-I L-1 ra.

Figura 10: Actividad neutralizante de I L-1 de I L-18bp-Fc-I L-1 ra. Figura 1 1 : Actividad neutralizante de I L-1 de VEGFRI-Fc-I L-1 ra en células D10. Figura 12: Actividad neutralizadora de VEGF VEGFRI-Fc-IL-1 ra en células HUVE. Figura 13: Análisis de fijación al receptor de I L-1 -Descripción detallada de la invención Esta invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la IL-1 ra o su equivalente funcional, como compañero de fusión, extiende las vidas biológicas y la eficacia de una cantidad de proteínas bioactivas, por ejemplo, proteínas anti inflamación, proteínas anti asma, y proteínas anti angiogénesis. Los ejemplos de estas proteínas incluyen neutralizadores de factor de necrosis tumoral (FNT), neutralizadores de IL-18, neutralizadores de I L-4/I L-13, neutralizador de VEGF, neutralizadores de angiopoyetina.

La proteína de fusión del terminal N para una proteína bioactiva, frecuentemente conduce a la pérdida de actividad completa, particularmente para compañeros de fusión de proteínas de tamaño g rande. Por ejemplo, las pro-enzimas y las pro-hormonas no son activas debido a la fusión de propéptidos en su terminal N . Estas pro-enzimas digestivas y pro-hormonas se hacen biológicamente activas solamente hasta que sus propéptidos son desprendidos. Además, la proteína de fusión de tamaño grande con frecuencia conduce a una baja producción de expresión . I nesperadamente, las proteínas I L-1 ra fusionadas pueden ser prod ucidas en un n ivel de producción comercial en células huésped de mamífero. La fusión no interfiere con la actividad de fijación al receptor I L-1 de I L-1 ra y las actividades neutralizantes, o con la fijación y actividad de neutralización de u na proteína bioactiva a la cual está fusionado. También inesperadamente, la I L-1 ra (por ejemplo, glicosílada elaborada por un mamífero) o su equivalente funcional , no sólo extiende las vidas biológ icas de las proteínas bioactivas, sino q ue también las dirige a un sitio inflamatorio rico en receptor de I L-1 . iL-1 ra La I L-1 es una citocina producida por las células de origen macrófago/monocito. Se prod uce en dos formas: I L-1 alfa e I L-1 beta . La proteína I L-1 inicia sus efectos biológicos en las células uniéndose a receptores de I L-1 (I L-1 R) específicos. El I L-1 R generalmente se expresa en la membrana plasmática de las células que responden a la I L-1 . El antagonista del receptor de I L-1 (I L-1 ra) es una proteína humana que actúa como un inhibidor natural de I L-1 . La I L-1 ra se ha usado para suprimir actividades biológicas ocasionadas por I L-1 . Éste se fija en los receptores de l L-1 unidos a la membrana celular, y evita que la I L-1 se fije a los mismos receptores de I L-1 - El receptor de I L-1 se expresa mayormente en sitios inflamatorios (Deleuran et al, 1 992; Laken VD et al , 1997) y linfocitos (Dower SK et al, 1990). Así, la I L-1 ra puede dirigir una proteína terapéutica (por ejemplo, un agente neutralizador de FNT que se describe más adelante) fusionada a él, hacia un sitio inflamatorio rico en receptor de l L-1 -Debido a este efecto apuntador, son necesarias dosis reducidas efectivas de la proteína terapéutica, reduciendo así los efectos secundarios o mejorando la eficacia. Además, la sinergia entre la I L-I ra y el compañero de fusión conduce a un efecto terapéutico mayor que el de cada una de las dos proteínas sola o en combinación, debido, al menos en parte, a que la proteína de fusión va hacia el mismo lugar. La I L-1 ra y su equivalente funcional se pueden usar para practicar esta invención. El equivalente funcional de IL-1 ra se refiere a un polipéptido derivado de la IL-1 ra (SEQ ID NO: 1 ) tal como se describe en la sección de Resumen. Sustancialmente tiene la actividad de IL-1 ra, es decir, por ejemplo, fijarse a receptores de IL-1 y evitar que la I L-1 se una a los mismos receptores de IL-1. La I L-I ra y su equivalente funcional contienen al menos un dominio antagonista del receptor de interleucina-1 , el cual se refiere a un dominio capaz de unirse específicamente a miembros de la familia del receptor de I L-1 y evitar la activación de receptores celulares para la I L-1 y los miembros de su familia. La familia del receptor de IL-1 contiene varios miembros receptoras. De acuerdo con esto, hay varios agonistas y antagonistas diferentes de la familia de I L-1 . Estos antagonistas de I L-1 pueden no unirse necesariamente a los mismos miembros de la familia del receptor de I L-1 - Aquí, la I L-1 ra se usa para representar todos los antagonistas de l L-1 que se unen a miembros de la familia del receptor de IL y/o neutralizan las actividades de los miembros de la familia de I L-1 - Un equivalente funcional de I L-1 ra contiene un dominio antagonista del receptor de interleucina-1 . Este dominio se refiere a un dominio capaz de unirse específicamente a los miembros de la familia del receptor de l L-1 y prevenir la activación de receptores celulares para la l L-1 y los miembros de su familia. Los ejemplos de antagonista del receptor de interleucina-1 incluyen I L-1 ra (patente estadounidense número 6,096,728), l L-1 HY1 o miembro 5 de la familia de I L-1 (patente estadounidense número 6,541 ,623), I L-1 Hy2 o miembro 10 de la familia de I L-1 (patente estadounidense número 6,365,726), I L-1 ra beta (US 6,399,573), otros miembros antagonistas de I L-1 y sus equivalentes funcionales, es decir, polipéptidos provenientes de IL-1 ra por ejemplo, proteínas que tiene una o más mutaciones, inserciones, deleciones, truncaciones, en un punto, o combinación de ellas. Éstas mantienen sustancialmente la actividad de unirse específicamente al receptor de J L-1 y evitar la activación de receptores celulares para la IL-1 . Pueden contener SEQ I D NO: 1 o un fragmento de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la IL-1 ra es un polipéptido de mamífero glicosilado. La actividad de un antagonista del receptor de interleucina-1 se puede determinar mediante un análisis de neutralización de IL-1 basado en células, usando células D10 dependientes de I L-1 (véase el Ejemplo 3), y otros análisis de neutralización de miembros de la familia de I L-1 - Preferiblemente, la IL-1ra o su equivalente funcional es un polipéptído glicosilado. La IL-1ra originaria es glicosilada con dos sitios de glicosilación de tipo N-ligada (patente estadounidense número 6096728). Estos dos sitios de glicosilación de tipo N-ligada son importantes para la actividad de la IL-1ra in vivo, particularmente para su vida biológica, y su propiedad enlazante de proteína en suero. Kineret, una IL-1ra producida por E-coli, carece de modificación post-traduccional. Como resultado, tiende a unirse a proteínas en suero humanas de manera significativa, y tiene menor eficacia in vivo. Una actividad antagonista de IL-1a o su equivalente funcional puede determinarse mediante análisis de neutralización de f L-1 basado en células, usando células D10 dependientes de I L-1 (véase el Ejemplo 3), y otros análisis de neutralización de miembros de la familia de I L-1 estándar. La fusión de IL_1ra con cualquier agente de proteína aumenta el peso molecular y conduce a vida biológica aumentada ¡n vivo. La fusión de IL-1 ra con otras moléculas mediante la inmunoglobulina Fc (por ejemplo, lgG1 Fc), puede aumentar más el peso molecular. Debido a la capacidad de dimerización de la inmunoglobulina Fc, su presencia puede duplicar el nivel de las proteínas fusionadas en un sitio de interés. FNT El factor de necrosis tumoral alfa (FNT alfa) y el factor de necrosis tumoral beta (FNT beta) son proteínas secretadas por mamíferos, capaces de ind ucir una amplia variedad de efectos en una gran cantidad de tipos de células. Las grandes similitudes en las características estructurales y funcionales de estas dos citocinas han dado como resultado su descripción colectiva como #FNT". El FNT in icia sus efectos biológicos en las células uniéndose a un receptor de FNT (FNTR) específico expresado en la membrana plasmática de células que responden a FNT. SE conocen dos formas distintas de FNTR: FNTR de tipo I (FNTR I) , el cual tiene un peso molecular de aproximadamente 55 kiloDalton (kD), y FNTR de tipo I I (FNTRl l) , el cual tiene un peso molecu lar de aproximadamente 75 kD. El FNTRI y el FNTRl l se unen cada uno tanto al FNT alfa como al FNT beta. El papel del FNT en las enfermedades inflamatorias ha sido bien establecido. El FNTRl l fusionado al fragmento Fc de lgG 1 humana (marca comercial Enbrel) ha sido usado para tratar ciertos trastornos dependientes de FNT tales como artritis reumatoide y psoriasis. El FNTRI soluble (Onercept, Serono) ha sido sometido a prueba en ensayos clínicos para el tratamiento de la psoriasis. Se ha identificado a los antagonistas de FNT. Estos antagonistas, tales como FNTRl l y FNTRI solubles, se une al FNT y evitan que el FNT se una a los receptores de FNT. Estas proteínas se pueden usar para suprimir actividades biológicas ocasionadas por el FNT. Los agentes neutralizadores de FNT basados en proteínas se pueden fusionar con IL-1 ra o su equivalente funcional. Como la IL-1 , el FNT es un mediador importante de la reacción de inflamación. Los agentes neutralizadores de FNT que se acaban de mencionar incluyen FNT y sus equivalentes funcionales. Cada uno de ellos incluye uno o más dominios neutralizadores de FNT, un dominio capaz de neutralizar FNT, es decir, inhibir la actividad de FNT. Un dominio neutralizador de FNT puede incluir un dominio extracelular de FNTII humano, un dominio extracelular de FNTRI , o regiones variables de anticuerpos anti FNT. Los ejemplos incluyen el dominio extracelular del receptor de FNT de tipo I I (FNTRl l), la proteína enlazante 1 de FNT (rhTBP-1 ) o el receptor de FNT de tipo I (FNTRI), anticuerpo anti-FNT humanizado (por ejemplo, Humira, Abbot Laboratories) y anticuerpo anti FNT quimérico (por ejemplo, Remicade de Johnson & Johnson). Dado que el FNT alfa y la l L-1 son dos participantes principales en las enfermedades inflamatorias, se puede usar una fusión o un quimérico de un antagonista de FNT y una IL-1 ra o su equivalente funcional para bloquear ambas rutas de FNT alfa e IL-1 , y por lo tanto se pueden usar para tratar enfermedades relacionadas con inflamación aguda y crónica más efectivamente que cada uno individualmente. La actividad neutralizadora de FNT de la proteína quimérica se puede determinar usando células dependientes de FNT tales como la célula L979 (ATTC). Más específicamente, las células dependientes de FNT se pueden matar mediante dosis efectivas de FNT alfa recombinante. Esta actividad dependiente de FNT puede neutralizarse mediante la adición de estos neutralizadores de FNT en la reacción. La actividad de estos neutralizadores de FNT también puede ser determinada usando análisis de unión de FNT in vitro. El uso concurrente de IL-1 ra y del receptor de FNT de tipo I (no de tipo I I) ha sido propuesto para el tratamiento de enfermedades mediadas por FNT alfa e I L-1 . Sin embargo, una prueba clínica con 242 pacientes y 24 semanas de duración, publicada por Immunex I ne y Amgen I ne en 2003 había concluido que el uso concurrente de Enbrel y Kineret con dosis individual no reducida (25 mg de Enbrel bisemanal y 10 mg de Kineret diarios con proporción molar de aproximadamente 1 : 12) no aumentó la eficacia, sino que condujo a una incidencia más alta de infección y neutropenia que la de la monoterapia con Enbrel o Kineret. IL-18 e IL-4 La I L-1 ra descrita anteriormente o un equivalente funcional de ella también puede ser fusionada con otras proteínas antí inflamación, anti asma, o anti angiogénesis. Los ejemplos incluyen: (i) agentes neutralizadores de IL- 18 tales como proteína fijadora de I L-18 (I L-18bp), dominio extracelular del receptor de IL-18 (IL- 18R) y anticuerpo anti I L-18 humanizado; (ii) agentes neutralizadores de IL-4 tales como dominio extracelular del receptor de I L-4 (IL-4R) (nombre comercial Nuvance, Immunex) y anticuerpo anti I L-4 humanizado (Protein Design Labs); (ni) anticuerpos anti VEGF y dominio extracelular Tie2 del neutralizador de angiopoyetina soluble. Como se describe aquí, la adición de IL-1ra en el término C de estas proteínas (1) aumenta sus pesos molares; (2) añade dos sitios más de glicosilación cuando se producen en un huésped mamífero; (3) las apunta a un suministro dirigido al sitio de inflamación rico en receptor de IL-1; (4) bloquea la I L-18 , I L-4, VBEGF, o angiopoyetina e I L-1 simultáneamente en una proporción molar de 1:1. La IL-18bp recombinante ha sido sometida a prueba en pruebas clínicas (Serono) para tratar psoriasis con indicios inflamatorios. Se ha demostrado un buen perfil de seguridad de esta IL-18bp. La fusión de IL-1ra en su término C puede aumentar significativamente su vida biológica. El apuntamiento al sitio inflamatorio por medio de la fusión de IL-1ra puede aumentar significativamente su eficacia. La doble neutralización de IL- 18 e I L-1 mediante fusión con IL-1ra también puede tener sinergia para el tratamiento de enfermedades dependientes de inflamación tales como psoriasis (Yudoh K et al (2004). De manera mucho más interesante, la IL-18 y la i L-1 usan el mismo receptor de la familia de I L-1 y casi la misma ruta de transducción de señal. El bloqueo doble de I L-1 e I L-18 bloquea casi por completo los procesos enteros de inflamación mediada por la familia del receptor de IL-1. El bloqueo doble de I L-1 e IL- 18 mediante una proteína quimérica de esta invención representa el agente terapéutico inflamatorio más efectivo. También se puede usar un equivalente funcional de ¡L-18bp para practicar esta invención . La IL-18bp o su equivalente funcional contiene un dominio neutralizador de I L-18, un dominio capaz de neutralizar I L-18, es decir, inhibir la actividad de IL-18. Por ejemplo, un dominio neutralizador de I L-18 puede incluir un dominio extracelular del receptor de I L-18 humana (patente estadounidense número 6,589,764), una I L-18bp, un anticuerpo anti I L-18, o una proteína antagonista de I L-18 mutante. La actividad neutralizadora de I L-18 de una proteína quimérica de esta invención se puede determinar usando células KG-I dependientes de I L-18. Por ejemplo, la IL-18 induce la secreción de I FN-g por parte de las células KG-I (en la presencia de FNTa) en una manera dependiente de la dosis. Esta secreción de I FN-g dependiente de I L-18 puede ser inhibida mediante dosis efectivas de neutralizadores de I L-18. La actividad de estos neutralizadores de I L-18 también puede ser determinada mediante análisis de unión de IL-18 al receptor de I L-18. El receptor de I L-4 recombinante ha sido sometido a prueba en pruebas clínicas para el tratamiento del asma. Se ha demostrado un perfil de gran seguridad. Sin embargo, su eficacia no es satisfactoria. De manera interesante, se informó que la I L-1 se requiere para la activación ce células Th2 específicas para el alérgeno y el desarrollo de respuesta hipersensíble de las vías respiratorias (Iwakura Y et al, 2003). Además, la coexistencia o co dependencia entre el asma y la inflamación crónica y la interacción entre ellas, son muy comunes en los centros de salud. El bloqueo de IL-1 tiene un claro efecto terapéutico en el asma al menos en modelos animales. Es muy posible que bloquear simultáneamente la I L-4 y la l L-1 en una proporción molar de 1 : 1 mediante una fusión del receptor de I L-4 soluble con 1L-1 ra mejore significativamente la eficacia para tratar el asma grave. El apuntamiento al sitio inflamatorio de la I L-1 ra además puede aumentar el valor terapéutico del receptor de l L-4 soluble para el tratamiento de asma grave compuesta por la inflamación. Además, la fusión de I L-1 ra puede aumentar significativamente la vida biológica del receptor de IL-4 soluble. Un receptor de I L-4 soluble o su equivalente funcional pueden fusionarse en I L-1 ra. El receptor de I L-4 o su equivalente funcional contiene un dominio neutralizador de IL-4, un dominio capaz de neutralizar la IL-4, es decir, inhibir la actividad de la IL-4. Por ejemplo, un dominio neutralizador de IL-4 puede incluir un dominio extracelular del receptor de IL-4 humana, anticuerpos anti IL-4, o un antagonista de proteína IL-4 mutante que tenga una mutación doble R121 D/Y124D (Schnarr et al. 1997). De manera interesante, la subunidad IL-4R no sólo se une a la IL-4, sino que también se une a la IL- 13 debido a la naturaleza de subunidad común compartida de los receptores de I L-4 e I L-13. La actividad neutralizadora de una proteína quimérica de esta invención puede determinarse mediante análisis basados en células TF-1 dependientes de IL-4. Por ejemplo, la proliferación de las células TF-1 dependiente de I L-4 humana puede inhibirse añadiendo dosis efectivas de neutralizadores de I L-4. La actividad de los neutralizadores de I L-4 también puede ser determinada mediante análisis de unión de I L-4 al receptor de I L-4. VEGF y Anqiopovetina Los enfoques descritos anteriormente también pueden aplicarse a los antagonistas de VEG F y Angiopoyetina, así como también a sus equivalentes funcionales. El VEGF es importante para la angiogénesis. El anticuerpo Anti-VEGF (nombre comercial Avastin , Genentech Ine) se ha usado para tratar indicios de cáncer. De manera similar, el dominio extracelular del receptor de VEGF soluble fusionado con IgGIFc también se ha usado para neutralizar el VEGF para indicios relacionados con angiogénesis. Un equivalente funcional de VEGF contiene un dominio neutralizador de VEGF, un dominio capaz de neutralizar VEGF, es decir, inhibir la actividad de VEGF. Por ejemplo, un dominio neutralizador de VEGF puede incluir un dominio extracelular de VEGF humano y región variable de un anticuerpo anti VEGF. La actividad neutralizadora de VEGF de una proteína quimérica de esta invención, se puede determinar usando células H UVEC dependientes de VEGF. Por ejemplo, el VEGF humano induce la proliferación de células HUVEC. Esta proliferación de células HUVEC dependientes de VEGF puede ser inhibida mediante dosis efectivas de neutralizadores de VEGF. La actividad de los neutralizadores de VEGF también se puede determinar usando análisis de unión de VEGF al receptor de VEGF.

También se ha sugerido que el receptor soluble de angiopoyetina Tie2 es un agente terapéutico anti angiogénesis contra el cáncer o contra la artritis reumatoide relacionada con angiogénesis. La coexistencia y la co dependencia de la angiogénesis y de la inflamación han sido observadas largamente en el ámbito clínico. El ejemplo más común es la artritis reumatoide en donde la angiogénesis y la inflamación coexisten . El receptor soluble de angiopoyetina Tie2 o un equivalente funcional de él, contiene un dominio neutralizador de angiopoyetina, el cual es un dominio capaz de neutralizar la angiopoyetina, es decir, inhibir la actividad de la angiopoyetina 1 . Por ejemplo, un dominio neutralizador de angiopoyetina puede incluir un dominio extracelular de Tie2 humana y de anticuerpos anti Tie2 o angiopoyetina. La actividad neutralizadora de Tie-2 de una proteína quimérica de esta invención puede ser determinada mediante células HUVEC dependientes de Tie-2. Por ejemplo, la angiopoyetína 1 humana induce la fosforilación intracelular de las células HUVEC. Esta fosforilación de las células H UVEC dependiente de puede ser inhibida mediante dosis efectivas de neutralizadores de Tie-2. La actividad de los neutralizadores de Tie-2 también se puede determinar usando análisis de unión de Tie-2 a angiopoyetina 2. Se sabe que la I L-1 es un importante estimulador de angiogénesis patológica. La neutralización de I L-1 mediante IL-1 ra o su equivalente funcional inhibe la angiogénesis y el crecimiento tumoral en un modelo animal, lo que sugiere que la inflamación potencia la angiogénesis. Por ejemplo, el tipo de cáncer de mama más agresivo es el cáncer de mama inflamatorio. ES mucho más probable que el uso de la fusión de IL-1ra y un agente de angiogénesis (por ejemplo, anticuerpo anti-VEGF, dominio extracelular del receptor de VEGF soluble, o dominio extracelular de Tie2 soluble) tiene una eficacia significativamente mejor que la del agente anti angiogénesís solo en el tratamiento de condiciones relacionadas con cáncer o artritis reumatoide. Junto con los agentes terapéuticos mencionados anteriormente, otros agentes que pueden ser fusionados a la IL-1ra o a su equivalente funcional se indican a continuación: 1. E25 (olizumab). El E25 es un anticuerpo anti IgE humanizado (Novartis) para tratar asma alérgica, rinitis alérgica estacional. 2. H5G1.1. El H5G1.1 es un anticuerpo anti-C5 humanizado (Alexíon Pharmaceuticals), que puede usarse para tratar psoriasis y enfermedades auto inmunitarias. 3. TP10. El TP10 es un complemento soluble del receptor 1 (sCR1) para el tratamiento de síndrome de distensión respiratoria aguda y trasplante de órganos (AVANT Immunotherapeutics). 4. ABX-IL8. El ABX-IL8 es un anticuerpo monoclonal anti IL-8 (Abgenix), que se puede usar para tratar psoriasis. 5. CTLA4lg. El CTLA4lg es un receptor soluble recombinante (Bristol-Myers Squibb), que se puede usar para inmunosupresión. En una fusión de uno de los agentes descritos anteriormente y su compañero equivalente funcional I L-1 ra, los dos compañeros de fusión tienen actividades sinérgicas o complementarias una con la otra. La IL-1 ra se fija a los receptores de i L-1 y dirige el agente terapéutico fusionado hacia el sitio de inflamación rico en receptor de l L-1 - También neutraliza la actividad de I L-1 . La fusión de IL-1 ra y cualquiera otra de estas proteínas se puede usar para tratar inflamación, asma y trastornos relacionados con angiogénesis o trastornos relacionados con proliferación de células endoteliales. Los trastornos relacionados con angiogénesis se refieren a cualquier trastorno que requiera angiogénesis o que muestre angiogénesis anormal. Los ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, cánceres, tumores sólidos, metástasis tumoral, tumores benignos tales como hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades oculares angiógenas, tales como retinopatía diabética, retinopatía de la premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto corneano, glaucoma neo vascular, fibroplasia retrolental y rubeosis, síndrome de Osíer-Webber, angiogénesis miocárdica, neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma y granulación de heridas. Como se usa aquí, los trastornos relacionados con proliferación de células endoteliales ¡ncluyen, sin limitarse a ellos, adhesiones intestinales, ateroesclerosis, escleroderma y escaras hipertróficas. Las proteínas de fusión que se describen aquí también se pueden usar para tratar los trastornos que se acaban de enumerar, mediante la prevención de la neovascularización requerida para la implantación de embriones. Preferiblemente, una proteína de fusión de esta invención incluye un dominio de dimerización. Un "dominio de dimerízación" se refiere a un dominio capaz de acoplar dos polipéptidos. Por ejemplo, un dominio de dimerización puede incluir un fragmento Fc de IgG (por ejemplo, una región constante de cadena pesada de IgG) . Un ejemplo de tal fragmento Fc incluye SEQ I D No:2. El fragmento Fc de IgG se dimeriza a través de sus residuos cisteína para la formación de uniones disulfuro entre cadenas (covalentes). Algunas veces la dimerización no covalente también ocurre sin implicar unión disulfuro. El fragmento Fc de IgG dimerizado es capaz de presentar, por ejemplo, dos moléculas de FNTRl l funcional o de I L-4R o I L-18bp soluble o de Tie-2 soluble en su terminal N y dos moléculas funcionales de IL-1 ra en su terminal C. Este arreglo aumenta las oportunidades de unión del receptor con el ligando in vivo para neutralizar el FNT alfa o la IL-4 o la I L- 18 o la angiopoyetina y los receptores de I L-1 . La actividad de una dimerización covalente mediante unión disulfuro puede ser determinada usando electroforesis con SDS PAGE reducida y no reducida. El peso molecular de la proteína se debe reducir a la mitad cuando se utiliza la condición reducida. La dimerización no covalente puede determinarse usando condiciones naturales y desnaturalizadas para la electroforesis. En este caso, el peso molecular de la proteína se tiene que reducir a la mitad cuando se utiliza la condición desnaturalizada. En un polipéptido de la invención , el dominio neutralizador de FNT o el dominio neutralizador de I L-4/1 L-13 o el dominio neutralizador de I L-18 o el dominio neutralizador de VEGF o el dominio neutralizador de angiopoyetína, el dominio de dimerización, y el dominio antagonista del receptor de I L-1 están ligados operativamente. Como se usa aquí, "ligado operativamente" se refiere a la configuración estructural del polipéptido que no interfiere con las actividades de cada dominio. Por ejemplo, un dominio neutralizador de I L-4 mantiene su capacidad de neutralizar la I L-4; un dominio antagonista del receptor de interleucina-1 mantiene su capacidad de unirse específicamente al receptor de I L-1 prevenir la activación de receptores celulares para la I L-1 ; y un dominio de dimerización mantiene su capacidad de acoplar dos polipéptidos de la invención y presentar, por ejemplo, dos dominios extracelulares del receptor de IL-4 funcionales en su terminal N y dos moléculas de IL-1 ra funcionales en su término C. La fusión de IL-1 ra en el término C de uno de los neutralizadores de FNT, neutralizadores de IL-18, neutralizadores de IL-4, neutralizadores de VEGF, o neutralizadores de angiopoyetina descritos anteriormente, (1 ) aumenta el peso molecular; (2) añade dos sitios más de glicosilación en la molécula de I L-1 ra cuando se produce en un huésped mamífero; (3) apunta un neutralizador al suministro dirigido al sitio de inflamación rico en receptor de 1L-1 ; y (4) bloquea la I L-1 y cualquiera de FNT, IL-18, IL-4, IL-13, IgE, VEGF, y angiopoyetina simultáneamente con una proporción molar de 1 : 1 . El bloqueo doble resultante tiene mejor eficacia para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y proporciona un bloqueo más completo para procesos de enfermedad inflamatoria. El bloqueo doble de I L-4/IL-13/VEGF/angiopoyetina y I L-1 simultáneamente, tiene una mejor y más completa eficacia para el tratamiento de las enfermedades en donde la coexistencia y la co dependencia de la inflamación y el asma o la angiogénesis juegan un papel importante en los procesos de enfermedad. Un polipéptido de esta invención se puede obtener como un polipéptido sintético o recombinante. Para preparar un polipéptido recombinante, un ácido nucleico que lo codifica puede ser enlazado con otro ácido nucleico que codifica un compañero de fusión, por ejemplo, Glutationa-S-Transferasa (GST), etiqueta de epítopo 6x-His, o proteína 3 del gen M 13. El ácido nucleico resultante de la fusión expresa en células huésped apropiadas una proteína de fusión que puede ser aislada mediante métodos conocidos en la materia. Se puede usar una variedad de huéspedes y sistemas de vector de expresión. Estos incluyen, sin limitarse a ellos, microorganismos tales como bacterias transformadas con ADN bacteriófago recombinante, ADN plásmido, o vectores de expresión de ADN cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes, y líneas de células humanas infectadas con virus recombinante o vectores de expresión de plásmido. El aislamiento y purificación de polipéptidos recombinantes o sus fragmentos puede llevarse a cabo mediante medios convencionales, incluyendo cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas que involucran anticuerpos monoclonales o policlonales. La proteína de fusión aislada puede ser tratada además, por ejemplo, mediante digestión enzimática, para eliminar el compañero de fusión y obtener el polipéptido recombinantes de esta invención. Composiciones y métodos de tratamiento También está dentro del alcance de esta invención un método para tratar un trastorno caracterizado por una respuesta inmunitaria excesiva o trastornos relacionados con angiogénesís, administrando a un sujeto que necesita de ello una cantidad efectiva de la proteína de fusión de esta invención. Los sujetos que se van a tratar puede ser identificados como que tienen o están en riesgo de adquirir, una condición caracterizada por una respuesta inmunitaria no deseada o excesiva, por ejemplo, pacientes que sufren de enfermedades auto inmunitarias, rechazo de trasplantes, enfermedades alérgicas, o cánceres derivados de células inmunitarias. Este método se puede llevar a cabo solo o en conjunto con otros fármacos o terapia. El término "tratar" se refiere a administración de una composición a un sujeto con el propósito de curar, aliviar, mitigar, remediar, prevenir o mejorar un trastorno, el síntoma del trastorno, el estado de enfermedad secundario para el trastorno, o la predisposición hacia el trastorno. Una "cantidad efectiva" es una cantidad de la composición que es capaz de producir un resultado deseable médicamente en un sujeto tratado. El resultado deseable médicamente puede ser objetivo (es decir, medible mediante alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicación de un efecto o de cómo se siente). Los ejemplos de enfermedades que se pueden tratar incluyen inflamación aguda y crónica, diabetes mellitus, artritis incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis psoriásíca). esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eczematosa), psoriasis, síndrome de Sjógren, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, diabetes de tipo I , enfermedades inflamatorias intestinales, colitis ulcerosa, asma, asma alérgica, lupus eritematoso cutáneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, erupciones por fármacos, reacciones de reversión de lepra, eritema nodosum Ieprosum, uveítis autoinmunitaria, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de audición sensorineural progresiva bilateral idiopática, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens-Johnson, enfermedad celiaca idiopática, liquen plano, fibrosis pulmonar intersticial, enfermedad de injerto contra huésped, casos de trasplante (incluyendo trasplante usando tejidos alogénicos o xenogénicos), tales como trasplante de médula ósea, trasplante de hígado, o el trasplante de cualquier órgano o tejido, alergias tales como alergia atópica, SIDA, neoplasmas de células T tales como leucemias o linfomas, hepatitis - aguda, enfermedades relacionadas con angiogénesis (tales como artritis reumatoide y cáncer) y enfermedades cardiovasculares. Un sujeto apto para ser tratado se puede identificar con uno que necesita tratamiento para uno o más de los trastornos indicados arriba. La identificación de un sujeto que necesita de dicho tratamiento puede ser a juicio de un sujeto o de un profesional de atención sanitaria, y puede ser subjetivo (por ejemplo, opinión) u objetivo (por ejemplo, medible mediante una prueba o método de diagnóstico). En un enfoque ¡n vivo, una composición terapéutica (por ejemplo, una composición que contiene una proteína de fusión de la invención) se le administra al sujeto. Generalmente, la proteína es suspendida en un portador aceptable farmacéuticamente (por ejemplo, salina fisiológica) y se administra oralmente o mediante infusión intravenosa, o inyectada, o implantada subcutáneamente, intramuscularmente, intratecalmente, intraperitonealmente, intrarrectalmente, intravaginalmente, intranasalmente, ¡ntragástricamente, intratraquealmente o intrapulmonarmente. La dosis requerida depende de la selección de la vía de administración; la naturaleza de la formulación; la naturaleza de la enfermedad del sujeto; la talla del sujeto; peso, área superficial, edad, y sexo; otros fármacos que estén siendo administrados; y el juicio del médico que atiende al paciente. Las dosis apropiadas están en el rango de 0.01 -100.0 mg/kg. SE espera que haya variaciones en la dosis necesaria en vista de la variedad de composiciones disponibles y de las diferentes eficiencias de las diversas vías de administración . Por ejemplo, se podría esperar que la administración oral requiera dosis más altas que la administración mediante inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosis pueden ser ajustadas usando rutinas empíricas estándar para su optimización , tal como se sabe bien en la técnica. La encapsulación de la composición en un vehículo de suministro apropiado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos ¡mplantables) puede aumentar la eficiencia de suministro, particularmente para suministro oral. También dentro del alcance de esta invención está una composición farmacéutica que contiene un portador aceptable farmacéuticamente y una cantidad efectiva de una proteína de fusión de la invención. La composición farmacéutica se puede usar para tratar las enfermedades descritas aquí anteriormente. El portador aceptable farmacéuticamente incluye un solvente, un medio de dispersión, un recubrimiento, un agente antibacteriano y antifúngico, y un agente ¡sotónico y de demora de absorción. La composición farmacéutica de la invención se puede formular en formas de dosis para diferentes vías de administración utilizando métodos convencionales. Por ejemplo, se puede formular en una cápsula, un sello de gel, o una tableta para administración oral. Las cápsulas pueden contener cualesquiera materiales estándar aceptables farmacéuticamente, tales como gelatina o celulosa. Las tabletas se pueden formular de acuerdo con procedimientos convencionales comprimiendo mezclas de la composición con un portador sólido y un lubricante. Los ejemplos de portadores sólidos incluyen almidón y bentoníta de azúcar. La composición también puede administrarse en la forma de una tableta con recubrimiento duro o en una cápsula que contenga un enlazante, por ejemplo, lactosa o manitol, un rellenador convencional, y un agente para formación de tabletas. La composición farmacéutica puede ser administrada por vía parenteral . Los ejemplos de formas de dosis parenterales incluyen soluciones acuosas, salina isotónica o 5% de glucosa del agente activo, u otro excipiente bien conocido aceptable farmacéuticamente. Las ciclodextrinas, u otros agentes solubilizantes bien conocidos para las personas familiarizadas con la técnica, se pueden utilizar como excipientes farmacéuticos para el suministro del agente terapéutico. La eficacia de una composición de esta invención se puede evaluar tanto in vitro como in vivo. Véase, por ejemplo, los ejemplos siguientes. De manera resumida, la composición se puede someter a prueba para determinar su capacidad para reprimir las respuestas inmunitarias in vitro. Para estudios in vivo, la composición se puede inyectar en un animal (por ejemplo, un modelo en ratón) y luego tener acceso a sus efectos terapéuticos. Con base en los resultados, se puede determinar un rango de dosis y una ruta de administración apropiados. Los ejemplos siguientes se deben interpretar como meramente ilustrativos, y no limitativos, del resto de la descripción en manera alguna. Sin elaboración adicional, se cree que una persona hábil en la técnica, basándose en la descripción que se presenta aquí, puede utilizar la presente invención en toda su extensión. Todas las publicaciones citadas aquí están incorporadas aquí mediante referencia en su totalidad. Nuestros resultados también indican que las moléculas fusionadas con IL-1ra elaboradas en huéspedes mamíferos, contienen IL-1ra glicosilada, y tienen un peso molecular más grande que el de las moléculas no fusionadas con IL-1ra. Ellas tienen vidas biológicas más largas, y dosis de inyección efectiva menos frecuente. Debido a su naturaleza dirigida al sitio de la inflamación y a la baja dosis efectiva y menor frecuencia de dosificación, las moléculas fusionadas con IL-1ra pueden tener menos efectos secundarios cuando se comparan con los de las moléculas no fusionadas con IL-1ra o con el uso concurrente de las moléculas no fusionadas con IL-1ra y con IL-1ra. Eiemplo 1 Se generaron diversos vectores de expresión. Los vectores codifican respectivamente a las siguientes proteínas: A) FNTRII-Fc-IL-1ra (SEQ ID NO: 5), FNTRI-Fc-IL-1 ra (SEQ ID NO: 8) y FNTRII-Fc (SEQ ID NO: 4) control o FNTRI-Fc (SEQ ID NO:7); B) Humira (D2E7)-IL-1ra (SEQ ID NO: 10 y 11), Remicade (cA2)-IL-1ra (SEQ ID NO: 13 y 14) y Humira dimerizada de control (D2E7) (SEQ ID NO: 9 y 11), y Remicade (cA2) (SEQ ID NO: 12 y 14); C) IL-18bp (SEQ ID NO: 15), IL-18bp-Fc dimerizada (SEQ ID NO: 16), y IL-18bp-Fc-IL-1 ra dimerizada (SEQ ID NO: 17); D) dominio extracelular IL-4R soluble (SEQ ID NO: 19), IL-4R-Fc (SEQ ID NO:19), y IL-4R-Fc-IL-1 ra (SEQ ID NO:21); E). VEGFRI-Fc-IL-1ra y de cadena ligera (SEQ ID NO: 24 y 23), y IL-1ra anti VEGF de cadena pesada y de cadena ligera (SEQ ID NO: 25 y 23). La mayoría de las construcciones que codifican proteínas (SEQ ID NO: 4-25) fueron secuenciadas y expresadas en líneas celulares de mamífero. Las SEQ ID NO: 4-25 se expresan usando ya sea codones naturales u optimizados y secuencia de señal de secreción artificial o natural en huéspedes mamíferos adaptados para suspensión. Los productos de anticuerpo dimerizado fueron detectados mediante gel para SDS PAGE no calentado y detección Western. Se encontró que los títulos de expresión de FNTRII-Fc (SEQ ID NO:4) y de FNTRII-Fc-IL-1 ra (SEQ ID NO:5) en medio libre de suero en placas de 24 receptáculos, eran de 50 mg-100 mg/L (Figura 1), respectivamente. Se encontró una expresión mayor de FNTRII-Fc-IL-1ra que de FNTRII-Fc en células CHOK1 adaptadas para suspensión (según estimación mediante tinción de proteína directa con azul Coomasie para medio condicional). Este resultado indica que las proteínas quiméricas fusionadas con IL-1ra pueden ser producidas en un huésped mamífero en un nivel suficientemente alto como para su producción comercial.

Eiemplo 2 Se aumentó la escala y se llevó a cabo la purificación de FNTRI I-Fc-IL-1 ra, I L-4R-ECD-Fc-I L-1 ra y I L-18bp-Fc-IL-1 ra. SE cultivaron líneas celulares en una suspensión libre de suero adaptada en medio CHO-CD4 (Irvine Scientific) y en medio de alimentación en casa, y se aumentó la escala en un bioreactor de 3 litros (Eplikon). Se produjo FNTRII-Fc-IL-1 ra (SEQ ID No: 5), IL-4R-ECD-Fc-I L-1 ra (SEQ ID No: 20), y IL-18bp-Fc-I L-1 ra (SEQ I D No: 17) en niveles comerciales. Estas proteínas fueron purificadas mediante captura directa de proteína A, seguida por intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica (Figuras 2, 3 y 4). Se formularon proteínas a granel, se liofilizaron y se analizaron con SEC-H PLC. Eiemplo 3 Se analizaron las actividades de FNTRI I-Fc-IL-1 ra, I L-4R-Fc-IL-1 ra, IL-18bp-Fc-I L-1 ra, y VEGFRI-Fc-IL-1 ra mediante bioanálisis.

Para el análisis de neutralización de I L-1 basado en células, se utilizaron células D10 dependientes de I L-1 (ATCC) para someter a prueba la actividad de bloqueo de IL-1 ra (Kineret), FNTRII-Fc-IL-1 ra, IL-4R-Fc-IL-1 ra, y I L-18bp-Fc-lL-1 ra contra la proliferación de células D10 dependiente de I L-1 recombinante humana. De manera resumida, la ¡nterleucina 1 alfa humana indujo la proliferación de células D10 de manera dependiente de la dosis. Se determinó la concentración, en la cual la IL-1 a indujo el 50% del crecimiento total de la célula, es decir, la EC50. El rango normal de EC50 para hlL-1 a en células D10 fue de 1 - 5 pg/mL. Cuando las células fueron preincubadas con antagonista del receptor de I L-1 en una dosis efectiva, la I L-1 ra in hibió la proliferación celular mediante el bloqueo de los receptores de I L-1 en la superficie celular. Este efecto de bloqueo también fue dependiente de la dosis. Cuando la concentración de antagon istas del receptor fue baja , ésto no bloqueó los receptores en la superficie celular. Luego, se restauró la proliferación celular inducida por i L-1 - La concentración del antagonista del receptor, al 50% de la actividad de I L-1 bloqueada, fue la EC50 del antagonista . La proteína recombinante (FNTRI I-Fc-I L-1 ra, I L-4R-Fc-I LIra, I L- 1 8bp-Fc-I L-1 ra, o VEGFRI-Fc-1 L-1 ra) actuó como un FNTRl l , I L-1 8 , I L-4, o neutralizador de VEG F soluble, así como también como antagonista del receptor de I L-1 . Los bioanálisis basados en célu las confirmaron la actividad biológica de estas moléculas quiméricas (Figuras 6, 8, 1 0, y 1 1 ) . Para el análisis de neutralización de FNT se usaron células L929 (línea celular conectiva de ratón , ATCC) para someter a prueba la actividad bloq ueadora de FNTRl l contra el FNT alfa. De manera resumida, el FNT alfa (FNT-a) se utilizó para ind ucir muerte celular rápida en una forma dependiente de la dosis. Se encontró que la EC50 del FNT-a (una concentración en la cual el FNT-a indujo el 50% de la muerte celular total) fue de menos de 50 pg/mL. Cuando se pre incubaron moléculas de FNT-a con altas concentraciones de receptor de FNT soluble (sFNTR), el receptor soluble se unió al FNT-a e inhibió su unión a los receptores en la superficie celular. Esto bloqueó la actividad del FNT-a de inducir la muerte celular. Este efecto de bloqueo también fue dependiente de la dosis. Cuando la concentración de sFNTR estuvo diluida hasta cierto punto, no se encontró actividad bloqueadora del FNT-a y se restauró la muerte celular. De acuerdo con esto, se determinó la EC50 del sFNTR (es decir, la concentración en la cual éste bloqueó el 50% de la actividad del FNT-a). Las diluciones en serie de FNT-alfa humano (BioSource) por duplicado fueron añadidas en una placa de análisis de 96 receptáculos sembrada previamente con una cantidad constante de células L929 en 10% de suero equino, medio DMEM complementado con L-glutamina y 1 ug/mL de actinomicina D en un volumen total de 150 uL/receptáculo. También se incluyeron receptáculos de control (que contenían células en el medio solamente). La placa de análisis fue incubada en una cámara incubadora humidificada a 37°C con 5% de CO2 durante un día. Luego se fijaron las células en cada receptáculo en 10% de paraformaldehído y se tiñeron con solución de violeta cristal al 1 %. La tinción fue solubilizada con ácido acético al 30%. La densidad óptica (D.O.) de cada receptáculo de la placa de análisis, la cual es directamente proporcional a la cantidad total de células, fue leída luego en un lector de placas con una longitud de onda de 540 nm. La curva de citotoxicidad se gráfico con la D.O. contra las concentraciones de FNT-alfa. Las diluciones en serie de FNTRII-Fc (Enbrel) y FNTRII-Fc-IL-1 ra en duplicados se mezclaron con concentración fija de FNT-alfa humano en 10% de suero equino, medio DM EM complementado con L-glutamina y 1 ug/mL de actinomicina D en una placa para análisis de 96 receptáculos. La placa de análisis se pre incubó du rante 1 hora a 37 °C. La mezcla en cada receptáculo de la placa de análisis fue transferida en otra placa de 96 receptácu los que fue sembrada previamente con u na cantidad constante de células L929. La concentración final de FNT-alfa en cada receptáculo fue de 500 pg/mL en un volumen total de 1 50 u L/receptáculo. La placa de análisis fue incubada en cámara h umidificada en incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 día. Las células en cada receptáculo se fijaron luego con 1 0% de paraformaldeh ído y se tiñeron con solución de violeta cristal al 1 % . La tinción se solubílizó con ácido acético al 30% . La densidad óptica (D .O .) de la placa de análisis se leyó luego en un lector de placas con una longitud de onda de 540 nm. Las curvas de neutralización fueron graficadas con D.O. contra las concentraciones de FNTRI I-Fc y FNTRI I-Fc-I L-1 ra. Los resultados muestran que el FNT alfa ind ujo de manera dependiente de la dosis la muerte de células L929. La D.O. de las células que contienen fondo con actinomicina D solamente fue de 0.5. La curva de dosis del FNT-alfa humano disminuyó desde el nivel inicial de 0.5 hasta el nivel más bajo de 0. 1 . La D.O. no disminuyó adicíonalmente a partir de la concentración de FNT-alfa a 1 00 pg/mL y más, indicando la fase de saturación del FNT alfa humano. Todos los experimentos se llevaron a cabo en duplicados y la CV% en cada punto fue < 9% . La EC50 del FNT-alfa determinada bajo esta condición fue de 8 pg/mL. Se encontró que tanto el FNTRI I-Fc (Enbrel) como el FNTRI I-Fc-IL-1 ra inhibieron la actividad del FNT-alfa humano de manera dependiente de la dosis en células L929. La O. D del nivel inicial (para las células en presencia del FNT-alfa humano (500 pg/mL) y actinomicina D) fue de 0.1 . En presencia de diferentes combinaciones de FNTRI I-Fc-IL-1 ra, las D.O. aumentaron desde 0.1 hasta el nivel basal de 0.5, lo que indica una neutralización total. Tanto el FNTRI I-Fc como el FNTRI I-Fc-IL-1 ra neutralizaron totalmente la actividad del FNT-alfa en una concentración de 50 ng/mL. Todas las diluciones fueron sometidas a prueba por duplicado y la CV% en cada punto fue de < 10%. La EC50 del FNTRI I-Fc (Enbrel) y del FNTRI I-Fc-I L-1 ra bajo estas condiciones fueron de 3-4 ng/mL and 10 ng/mL. Para el análisis de neutralización de IL-4 se utilizó proliferación de células TF-1 inducida por I L-4. Se incubaron las células TF-1 con medio que contenía I L-4 humana de diferentes concentraciones y luego se cultivaron en una placa de 96 receptáculos en incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 días. Se le añadió MTS a los cultivos y se incubaron durante 5 horas. Se leyó la densidad óptica (DO) de la placa a 490 nm en un lector de placas. Se gráfico la curva de proliferación de células (DO contra concentración de IL-4 humana). Para la neutralización , las diluciones en serie de I L-4R-Fc y de IL-4R-Fc-1 L-1 ra fueron preincubadas con concentración constante de IL-4 humana (2 ng/mL) en medio de cultivo en una placa de 96 receptáculos a 37 °C durante 1 hora. Se añadieron células TF-1 de la misma cantidad en cada receptáculo de la placa de 96 receptáculos el final de la incubación. Luego se incubó la placa en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 días. Se le añadió MTS y se incubó durante 5 horas. La DO de la placa se leyó en un lector de placas a 490 nm. Se gráfico la curva de inhibición del crecimiento celular con DO contra IL-4R-Fc y concentración de IL- 4R-Fc-IL-1ra. Los resultados (Figura 7), tomados junto con los resultados del análisis de neutralización de IL-1 (Figura 8), muestran que la IL-4R-Fc-IL-1ra fue funcional, y que tanto la IL-4R como la I L-1 neutralizaron la actividad. Para el análisis de neutralización de IL-18 se usó secreción de IFN-g inducida por I L-18 humana de células KG1 (en la presencia de FNTa) en una manera dependiente de la dosis. La EC50 de la I L-18 humana (la concentración en la cual ésta induce el 50% de la secreción máxima de IFNg de células KG-1) normalmente está entre 20 y 40 ng/mL. Cuando se pre incubó la proteína fijadora I L-18 (IL-18bp) con I L-18 humana antes de aplicarla al cultivo celular, la IL-18bp se unió a la IL-18 y bloqueó su actividad. Este efecto de bloqueo fue dependiente de la dosis. La concentración de la proteína fijadora, en la cual el 50% de la secreción máxima de IFNg es bloqueada, es su EC50. Diluciones en serie de IL-18bp-Fc-IL-1 ra y de IL-18bp-Fc por duplicado, fueron pre incubadas con concentración constante de IL- 1 8 h umana (R & D System , 50 ng/m L) en medio de cultivo en una placa para análisis de 96 receptáculos a 37 °C d urante 1 hora. El duplicado de las diluciones en serie de la I L-1 8 humana por sí solo fue incluido en la placa como control positivo. La misma cantidad de células KG-1 (ATCC, CCL246) con cantidad constante de FNTa (BioSou rce I nc.) se añadió en cada receptácu lo de la placa para análisis de 96 receptáculos al final de la incubación . La placa de análisis fue incubada además en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 horas. Se transfirió 50 u L/receptáculo del medio de cultivo desde cada receptáculo de la placa para análisis hasta la placa para ELISA. Se sometió aprueba ELISA (BioSource I nc.) la I FNg humana de acuerdo con las instrucciones del equipo. Se leyó la densidad óptica (DO) de la placa en un lector de placa a 450nm. Se g ráfico la curva de secreción de I FNg inducida por I L-1 8humana con concentraciones de DO contra I L-1 8. Se gráfico la curva de neutralización de I L-1 8bp con las concentraciones de DO contra I L-1 8bp-Fc-I L-1 ra y I L-1 8bp-Fc de control. El resultado de los análisis basados en células se muestra en la figura 9. Tomado junto con el resultado del análisis de neutralización de I L-1 (Figura 1 0) , la quimera funcional I L-1 8bp-Fc-I L-1 ra se produjo exitosamente. Ésta mantuvo la actividad neutralizante tanto de la I L-1 8 como de la l L-1 . El VEGF (vascular factor de crecimiento endotelial vascular) induce la proliferación de células H UVE (vena endotelial umbilical humana) en una forma dependiente de la dosis. La EC50 del VEGF h umano, que es la concentración que inducirá el 50% de la proliferación máxima de células H UVE, normalmente estuvo entre 2 y 6 ng/mL. Cuando se pre incubó el receptor 1 de VEG F con VEG F h umano antes de aplicarlo al cultivo celular, este receptor 1 de VEG F h umano soluble se unió al VEG F y bloqueó su actividad en las células. Este efecto de bloqueo del receptor soluble también fue dependiente de la dosis. La concentración del receptor soluble, en la cual el 50% de la proliferación de células máxima fue bloqueada, es su EC50. La proteína recombinante VEG FR1 -Fc-I L-1 ra fue construida con receptor de VEG F soluble y con antagonista del receptor de I L-1 en la misma molécu la. Por lo tanto, pudo actuar como VEGFR1 soluble, así como también como antagonista del receptor de I L-1 . Diluciones en serie de VEGFR1 -Fc-I L-1 ra por duplicado se pre incubaron con concentración constante de VEG F (BioSource, 1 0 ng/mL) en medio de cultivo en una placa para análisis de 96 receptáculos a 37 °C d urante 1 hora. Duplicados de las diluciones en serie de VEG F humana por sí solos también fueron incluidos en la placa como control positivo. La misma cantidad de células H UVE (Cambrex, CC-251 7) se añadió en cada receptáculo de una placa para análisis de 96 receptáculos al final de la incubación. Luego se incubó adicionalmente la placa para análisis en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 96 horas . Se le añadió MTS (Promega) a cada receptáculo de la placa de análisis en las últimas 4 horas de incubación . Luego se leyó la densidad óptica (D.O.) de la placa en un lector de placa con una longitud de onda de 490 nm. Se gráfico la curva de proliferación celular por VEGF con las concentraciones de DO contra VEGF. Se gráfico la curva de neutralización de VEGF-R con las concentraciones de DO contra VEGFRI-Fc-IL-1 ra. La dosis de VEGF humano estimuló de manera dependiente la proliferación de las células HUVE. La EC50 fue de 3 ng/mL. Cuando se pre incubó el VEGF a 10 ng/mL con las diluciones en serie de VEGFR1-Fc-IL-1 ra antes de aplicarlo a las células, a proliferación celular dependiente de VEGF se inhibió en una forma dependiente de la dosis. La EC50 de VEGFR1-Fc-IL-1 ra fue de 15 n/mL (Figura 12). Tomado junto con el resultado del análisis de neutralización de I L-1 (Figura 11), la quimera funcional de VEGFR1-Fc-IL-1 ra fue producida exitosamente. Ésta mantuvo tanto la actividad neutralizadora de VEGF como la de I L-1 -Eiemplo 4 Se realizó una prueba en anímales de IL-4R-Fc-IL-1ra en un modelo de asma en ratón. Se usaron ratones BALB/c hembras (6-8 semanas de edad). Brevemente, estos ratones recibieron 40 ug de OVA (Sigma) emulsificada en 2.25 mg de hidróxido de aluminio (Pierce, Rockford, IL) en un volumen total de 100 uL el día 0 y el día 14 medíante inyección i.p. Los ratones fueron repartidos divisiones de 8 horas y de 48 horas. La división de 8 horas incluye los grupos salina control-8h, OVA-8h, IL-4R-Fc/OVA-8h y IL-4R-Fc-1L-1 ra/OVA-8h, mientras que la división de 48 horas incluye los grupos salina control-48h, OVA-48h, IL-4R-Fc/OVA-48h y IL-4R-Fc-IL-1 ra/OVA-48h. El día 28, todos los grupos de la división recibieron 100 ug de OVA en 0.05 mL de salina normal por vía intranasal, excepto para los grupos de salina control. Los grupos de salina control recibieron salina normal con aluminio por vía i-p. los días 0 y 14, y 0.05mL de salina normal por vía intranasal el día 28. El día 29, los grupos de la división de 48 horas recibieron 100 ug de OVA adicionales en 0.05 mL de salina normal por vía intranasal, excepto para los grupos de salina control. Los grupos de salina control también recibieron 0.05 mL adicionales de salina normal por ruta intranasal el día 29. Administración de IL-4R-Fc y de IL-4R-Fc-IL-1ra Los grupos IL-4R-Fc/OVA-8h, IL-4R-Fc-IL-1 ra/OVA-8h, IL-4R- Fc/OVA-48h y IL-4R-Fc-IL-1 ra/OVA-48h recibieron 200ug/ratón/día los días 28. Se les administró mediante inyección i.p. 60 min antes de la exposición a OVA el día 28. Los grupos IL-4R- Fc/OVA-48h y IL-4R-Fc-IL-1 ra/OVA-48h recibieron 200ug/ratón/día adicionales el día 29. Determinación de cantidades de células en lavado bronquioalveolar (BLA) Para la división de 8 horas, 8 horas después de la exposición a OVA intranasal sola el día 28, los ratones fueron sacrificados para estudios de fluido en BAL e histología. Para la división de 48 horas, 48 horas después de dos exposiciones a OVA intranasal el día 28 y 29, los ratones fueron sacrificados. Después de extraer el pulmón izquierdo en el tallo principal bronquial, se lavó el pulmón derecho por medio de la cánula traqueal con 1 .0 mL de salina normal. Se determinó la cantidad total de leucocitos usando un hemocitómetro. Se hicieron conteos de, células diferenciales a partir de preparaciones centrifugadas, teñidas con leukostat (fisher Diagnostics, Pittsburgh, PA). Las células se identificaron como macrófagos, eosinófilos, neutrófilos y linfocitos medíante procedimientos hematológicos estándar y al menos 200 células se contaron bajo aumento de 400x. Histología pulmonar Se recolectó la tráquea y el pulmón izquierdo (lóbulos superior e inferior) y se fijaron en solución de Carnoy a 20 °C durante 15 horas. Después de sumergirlos en parafina, los tejidos fueron cortados en secciones de 5 um. Para cada ratón, se evaluaron 10 secciones de las vías respiratorias distribuidas aleatoriamente en todo el pulmón izquierdo, para determinar la gravedad de la respuesta inflamatoria celular y la oclusión por moco. La intensidad de la infiltración celular alrededor de los vasos sangu íneos pulmonares fue evaluada en una escala semicuantitativa que abarca desde 0 hasta 4+. Resultados 1 . El tratamiento con IL-4R-Fc-I L-1 ra bloquea la fase temprana de la inflamación pulmonar. Tabla- 1 . Conteos de células diferenciales en fluido de BAL 8 horas después de la exposición a OVA intranasal sola. Los conteos de células diferenciales fueron evaluados en los grupos salina control-8h, OVA-8h, IL-4R- Fc/OVA-8h y IL-4R-Fc-IL-1 ra/OVA-8h (n=5 en cada grupo; Media ± EEM están dados). 2. El tratamiento con IL-4R-Fc-IL-1ra también bloquea la inflamación pulmonar en la fase tardía. Tabla 2. Conteos de células diferenciales en fluido de BAL 48 horas después de dos exposiciones a OVA intranasal. Los conteos de células diferenciales fueron evaluados en los grupos salina control-48h, OVA-48h, IL- 4R-Fc/OVA-48h and IL-4R-Fc-IL-1 ra/OVA-48h (n=5 en cada grupo). Se proporciona la media ± EEM. P<0.01 comparado con Estudios de histología pulmonar La infiltración celular intensiva alrededor de los vasos sanguíneos pulmonares y las vías respiratorias se observó en ambos grupos OVA-8h y OVA-48h. Se observó infiltración celular reducida significativamente alrededor de los vasos sanguíneos pulmonares y las vías respiratorias en los grupos I L-4R-Fc-I L-1 ra-8h y IL-4R-Fc-I L-1 ra-48h cuando se compararon con los grupos I L-4R-Fc/OVA-8h y IL-4R-Fc/OVA-48h. El resultado sugiere que la I L-4R-Fc-ILIra fue el mejor tratamiento para el asma en este modelo animal. Eiemplo 5 Se realizó la prueba en animales de I L-18bp-lgGIFc-I L-1 ra en un modelo con ratón CÍA. Se indujo CÍA en ratones DBA/IJ de 8 a 10 semanas de edad mediante una inyección intradérmica de colágeno bovino tipo I I (Cl l) de acuerdo con una adaptación descrita recientemente del procedimiento estándar (Bañada et al., 2002). Cada ratón recibió inyecciones de 100-µlL que contenían 200 µg de Cl l y 200 µg de Mycobacterium tuberculosis ínactivado (Difco, Detroit, M l) en IFA los días 0 y 21 . Los ratones (n=5) se trataron entre los días 21 y 36 con una de las dos intervenciones terapéuticas dadas como inyecciones i.p. cada 3 días: PBS control, 3 mg/kg de I L-18bp-Fc, y 3 mg/kg de IL-18bp-Fc-IL-1 ra. Los ratones se sacrificaron el día 36 mediante dislocación cervical. Tres ratones DBA/1 J normales (controles) se sacrificaron al mismo tiempo. Se evaluó la actividad de enfermedad clínica del CÍA cada día siguiente entre los días 21 y 36 mediante dos observadores vendados usando una escala de tres puntos para cada pata: 0 = articulación normal; 1 = ligera inflamación y enrojecimiento; 2 = eritema e hinchazón g rave afectando la pata completa, con inhibición de uso; y 3 = pata o articu lación deformada , con anquilosis, rigidez de articulación y pérdida de función . La pu ntuación total para la actividad de la enfermedad clínica se basó en las cuatro patas, con una pu ntuación máxima de 1 2 para cada animal (Banda et al. , 2002) . Ambas patas delanteras y la pata derecha trasera fueron extraídas quirúrgicamente de todos los ratones el d ía 36 y se fijaron en Formalina reg ulada al 1 0% , con preparación de muestras de tejido y análisis histológico tal como se describió previamente (Bendele et al. , 2000) . Los hallazgos histológicos en las patas, tobillos y rodillas, fueron calificados por un observador experimentado, que era ciego para el tratamiento. Los datos fueron expresados como puntuaciones medias para inflamación , pann us, daño de cartílagos, y daño óseo, así como también una puntuación general, basada en las escalas de 0-5 y cinco conju ntos de articulaciones por animal, tal como se describió previamente (Bendele et al. , 2000). Resultados Efecto de IL-18bp-Fc-IL-1 ra sobre la actividad de enfermedad clínica y sobre la histología de la articulación. La incidencia del desarrollo de la artritis fue de 1 00% en todos los grupos. Comparados con el PBS control solo, los ratones tratados con cualquiera de 3 mg/kg IL-1 8bp-Fc, y 3 mg/kg IL- 18bp-Fc-I L-1 ra entre los días 21 y 36 mostraron reducción en la puntuación de la actividad de enfermedad clínica (Tabla 1 ). El análisis histológico de las articulaciones también indicó que el tratamiento con cualquiera de 3 mg/kg I L-18bp-Fc, y 3 mg/kg IL-18bp-Fc-I L-1 ra evitó el daño en las articulaciones comparado con el grupo de PBS. Se observaron diferencias significativas entre 3 mg/kg de I L-18bp-Fc, y 3 mg/kg de IL-18bp-Fc-IL-1 ra en cualquiera de las puntuaciones de actividad clínica o puntuaciones histológicas. La IL-18bp-Fc-IL-1 ra fue significativamente mejor que la IL-18bp-Fc (Tabla 1 ). Tabla 3: Actividad de enfermedad clínica de ratones CÍA tratados con IL-18bp-Fc-IL-1 ra. Se inmunizó a ratones DBA/1 J con 200 µg de Cl l en I FA, con 200 µg de M. tuberculosis añadida los días 0 y 21 . Los ratones se trataron durante 3 semanas con inyecciones i.p. cada 3 días de entre los días 21 y 36 con una de dos intervenciones terapéuticas administradas como inyección i.p. cada 3 días: PBS control, 3 mg/kg de IL-18bp-Fc, y 3 mg/kg de IL-18bp-Fc-l L-1 ra. La actividad de la enfermedad clínica of la CÍA fue determinada cada día siguiente por dos observadores entrenados, quienes eran ciegos para el tratamiento, y uno con respecto al otro, usando una escala de tres puntos para cada pata. Los datos están expresados como puntuación de la actividad de la enfermedad clínica (Media ± EEM) para cada grupo de tratamiento contra los días después de la inyección inicial de colágeno.

Eiemplo 6 Se llevaron a cabo pruebas in vivo de la IL-18bp-Fc-IL-1 ra en un modelo de ratón con hipersensibilidad por contacto (CHS). Inducción de CHS y tratamiento con IL-18bp quimera Se utilizaron ratones C57BL/6 (8 y 14 semanas de edad).. DNFB, acetona, azul Evans, formamida, BSA, PMA, ionomicina, brefeldina A, y LPS (Escherichia coli 026:B6) se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Se diluyó DNFB en acetona/aceite de oliva (4/1) inmediatamente antes de su uso. Los ratones fueron sensibilizados con 25 µL de solución de DNFB al 0.5% aplicada con brocha a la piel dorsal rasurada o no tratada (controles). Cinco días después, se le aplicó 10 µL de DNFB al 0.2% (una dosis no irritante) en ambos lados de la oreja derecha, y la misma cantidad de solvente solo en la oreja izquierda. Se le hizo seguimiento al espesor de la oreja diariamente desde el día 5 antes de la exposición en adelante, usando un calibrador. El hinchamiento de la oreja fue calculado como ((Tn - T5) oreja derecha) - (Tn - T5) oreja izquierda)), en donde Tn y T5 representan valores del grosor de la oreja en el día n de la investigación y en el día 5 antes de la exposición, respectivamente. Para asegurarse de que la inflamación observada era debido a inflamación específica por DNFB en lugar de una irritación no específica, se incluyó un grupo de control no sensibilizado pero expuesto en cada experimento. Se neutralizó la IL-18 y/o la I L-1 mediante inyección diaria i.p. de 250 µg de I L-18bp-Fc o I L-18bp-Fc-I L-1 ra por animal, comenzando 60 minutos antes de la exposición el día 5. Los animales de control recibieron el veh ículo salino solamente. El tratamiento durante la re exposición primaria fue detenido el día 7. Resultados El tratamiento terapéutico con IL-18bp-Fc-IL-1 ra protege contra CHS Para inducir CHS experimentalmente, los ratones fueron sensibilizados con el hapteno DNBF en sus espaldas rasuradas. Se desencadenó el CHS 5 días más tarde aplicando con brocha DNFB en las orejas. La inflamación se calificó como el aumento en inflamación del DNFB expuesto contra la oreja de control pintada solamente con solvente. La administración de I L-18bp-Fc y I L-18bp-Fc-IL-1 ra durante la fase de desencadenamiento en los días 5-7 redujo significativamente la inflamación de las orejas expuestas a DNFB en el transcurso de la duración total de la respuesta (Tabla 1 ). Se observó diferencia significativa entre I L-18bp-Fc y IL-18bp-Fc-IL-1 ra (Tabla 1 ), lo que sugiere que cualquiera del bloqueo doble con I L-1 y I L-18 juntos en el mismo sitio, o la naturaleza de I L-18bp-Fc-I L-1 ra dirigida al sitio rico en receptor de IL-1 , jugó un papel importante en la efectividad. La IL-18bp-Fc-IL-1 ra fue significativamente mejor que la IL-18bp-Fc. Tabla 4: Tratamiento con IL- 18BP durante el desencadenamiento protege contra CHS. Se sensibilizó a ratones C57BL/6 con DN FB el día 0 y se expusieron 5 días más tarde en las orejas. Se midió ia inflamación de las orejas diariamente, y se expresó como el aumento en la inflamación de los expuestos a D N FB contra los controles pintados con veh ículo. Los animales se trataron diariamente con 1 8bp q uimera o con el veh ículo solo. Los datos son la media de 5 ratones por g rupo.

Eiem plo 7 Se llevaron a cabo experimentos de fijación al receptor de I L-1 .

De manera resumida, se expresó primero el dominio extracelular del receptor de I L-1 humano recombinante y se purificó en casa usando células CHO de mamífero. FNTRI I-Fc-I L-1 ra, control negativo FNTRI I-Fc y control positivo I L-1 ra (Kineret) habían sido colocados recubriendo una placa de 96 receptáculos en cantidad de 1 ug/receptáculo en 100 uL de regulador de pH para recubrimiento (Sigma) . El receptor de I L-1 (0.1 ug/receptáculo) se incubó entonces en PBS a 37 °C durante 45 min utos. Se detectó la unión del receptor al ligando mediante anticuerpos de dominio extracelular del receptor de I L-1 anti h umanos de conejo (R&D Systems), seguido por IgG anti conejo de cabra conjugado con H RP (Pierce). Después de lavar con PBS-T, se desarrolló una reacción de color mezclando con TMB (Sigma, T8665). Se leyó la densidad óptica (DO) de la placa en un lector universal de microplacas EL800 de 650 nm (Bio-Tek) . SE graficaron los valores de DO contra los tiempos de dilución. La figura 13 mostró que tanto la FNTRI I-Fc-IL-1 ra como la I L-1 ra (Kineret) se fijaron al receptor de I L-1 , y que el FNTRI I-Fc (Enbrel) no. De manera interesante, la FNTRI I-Fc-I L-1 ra (elaborada de mamífero) se unió al receptor de I L-1 significativamente mejor que la I L-1 ra elaborada de E. coli (Kineret). Además, la l L-1 ra elaborada de mamífero contiene dos sitios glicosilados N-ligados, por lo que tiene menos fijación de proteína en suero y es consistentemente diferente en sus propiedades de fijación in vitro de la IL-1 ra elaborada de E. coli (Kineret). Eiemplo 8 Se realizó macado con 125-1 y prueba en animales de FNTRI I- Fc-I L-1 ra, I L-4R-Fc-I L-1 ra, y I L-18bp-Fc-I L-1 ra, así como también sus controles no fusionados con I L-1 ra. FNTRI I-Fc-I L-1 ra, I L-4R-Fc-I L-1 ra, y IL-18bp-Fc-IL-1 ra marcados con 125-1 fueron elaborados mediante el método lodogen y purificados mediante cromatografía de exclusión de tamaño (M Hui et al., 1989). El análisis de fijación del receptor de IL-1 había sido establecido usando dominio extracelular del receptor de IL recombinante de mamífero en casa (véase el Ejemplo 4 anterior). La unión del receptor de I L-1 a la FNTRI-Fc-I L-1 ra marcada con 125-Ifue comparada lado por lado con FNTRII-Fc-I L-1 ra no marcada radiactivamente. Los resultados indican que la FNTRII-Fc-IL-1 ra marcada con 125-1 es funcional en términos de la unión al receptor de IL-1. Los ratones tratados con TPA 6 mmol pintando su oreja en 200 uL de acetona desarrollaron consistentemente inflamación en la piel en 2 a 3 días. Se inyectó FNTRII-Fc-IL-1 ra marcada con 125-1 en modelos de inflamación de piel en ratones (véase más adelante) junto con FNTRIl-Fc marcado con 125-1 (Enbrel).

Sorprendentemente, los resultados indicaron que el FNTRII-Fc marcado con 125-1 fue más distribuido en el sitio inflamatorio que el FNTRII-Fc (Tabla 1). Muy probablemente, esto se debe a la afinidad de unión al receptor de IL-1. También se inyectó IL-4R-Fc-IL-1 ra y IL-18bp-Fc-IL-1 ra marcdos con 125-1 en modelos de ratón con inflamación de piel, junto con IL-4R-Fc y IL-18bp-Fc marcadas con 125-1. Se obtuvieron resultados similares (Tablas 2 y 3). Tabla 5: Distribución de FNTRII-Fc-IL-1ra v FNTRII-Fc marcadas con 125-1 (Enbrel) en tejidos cutáneos inflamados y no inflamados 4 horas después de la invección. La distribución está expresada como % de dosis inyectada por gramo de tejido (n=6).

Tabla 6: Distribución de IL-4R-Fc-IL-1ra y IL-4R-Fc marcados con 125-1 en tejidos cutáneos inflamados y no inflamados 4 horas después de la inyección. La distribución está expresada como % de dosis inyectada por gramo de tejido (n=6).

Tabla 7: Distribución de IL-18bp-Fc- IL-1ra v lLK-18bp -Fc marcados con 125-1 en tei idos cutan eos inflamados v no inflamados 4 horas después d e la invecci ón. La disl ribución está expresada como % de dos is in vectada por gramo de tejido (n= 6).

Eiemplo 9 Se estimó la inmunogenicidad de I L-4R-Fc-IL-1 ra en dos monos cynomolgus. Se había inyectado s.c. 10 mg de I L-4R-Fc-IL-1 ra por semana durante 8 semanas. Se recolectaron muestras de suero antes y después de la inyección (los días 1 y 56). Se analizaron las muestras mediante análisis de neutralización establecido para la presencia de anticuerpos anti I L-4R-Fc-IL-1 quimérica, los cuales neutralizan las bioactividades de la proteína quimérica. Con el fin de detectar además la baja concentración de anticuerpos neutralizantes, se purificaron las muestras de suero por afinidad mediante proteína A y anticuerpos anti IgM humana. NO se detectó ningún anticuerpo que neutralizara las bioactividades de I L-4 y de I L-1 de la proteína quimérica en los monos tratados usando tanto suero no diluido como IgG e IgM . Los resultados sugieren que la IL-4R-Fc-IL-1 ra no es inmunógena para el mono y el humano.

Claims (32)

REIVI N DICACION ES

1 . U na proteína de fusión que contiene un primer segmento que está ubicado en el terminal amino de la proteína de fusión y se u ne específicamente a una primera citocina o factor de crecimiento y lo neutraliza ; y u n segundo segmento que está ubicado en el terminal carboxilo de la proteína de fusión y se une específicamente a un receptor de una segunda citocina o a un factor de crecimiento, caracterizado además porque los dominios están ligados operativamente, y el receptor de la seg unda citocina es abundante en un sitio inflamatorio o sitio de enfermedad .

2. La proteína de la reivindicación 1 , que además comprende un segmento enlazante que une el primer segmento y el segundo segmento, caracterizado además porque el segmento enlazante es capaz de dimerizarse.

3. La proteína de la reivindicación 2, caracterizada además porque el segmento enlazante contiene el fragmento Fc de una ¡nmu noglobu lina o un equivalente funcional de ella.

4. La proteína de la reivindicación 3, caracterizada además porque la ¡nmu noglobulina es IgA, IgE, IgD, IgG , o Ig M .

5. La proteína de la reivindicación 4, caracterizada además porque la inmunoglobulina es IgG .

6. La proteína de la reivindicación 5, caracterizada además porque el fragmento Fc contiene SEQ ID NO. : 2.

7. La proteína de la reivindicación 1 , caracterizada además porque el prímer segmento se fija a VEGF, Ang, FNT, ILI 8, 1L4, or IL13, o un equivalente funcional de ella y lo neutraliza.

8. La proteína de la reivindicación 7, caracterizada además porque el primer segmento contiene la secuencia de una cadena de una inmunoglobulina que se une específicamente a VEGF, angiopoyetinas, FNT, IL-18, I L-4, I L-13 o IgE o un equivalente funcional de él, y lo neutraliza.

9. La proteína de la reivindicación 8, caracterizada además porque la cadena de inmunoglobulina contiene SEQ ID NO: 9, 11, 12, 14, 23, o 24; o un equivalente funcional de ella.

10. La proteína de la reivindicación 7, caracterizada además porque el primer segmento contiene la secuencia de un receptor o una proteína fijadora de VEGF, Ang, FNT, IL-18, IL-4, y de IL-13.

11. La proteína de la reivindicación 10, caracterizada además porque el primer segmento contiene SEQ ID NO.: 3, 6, 15, o 19.

12. La proteína de la reivindicación 1, caracterizada además porque la proteína es glicosilada

13. La proteína de la reivindicación 1, caracterizada además porque la segunda citocina es IL- 1.

14. La proteína de la reivindicación 13, caracterizada además porque el segundo segmento es un antagonista de IL-1.

15. La proteína de la reivindicación 14, caracterizada además porque el segundo segmento contiene la secuencia de IL-1ra (SEQ ID NO.: 1) o un análogo equivalente funcional de ella.

16. La proteína de la reivindicación 14, caracterizada además porque la proteína contiene SEQ ID NO: 5, 8, 10, 13, 17. 18, 21, 22, 24, o 25.

17. Un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.

18. El ácido nucleico de la reivindicación 17, caracterizado además porque el ácido nucleico contiene una secuencia que codifica una de las SEQ ID NO: 1-25.

19. Un vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 17.

20. Una célula huésped que contiene un ácido nucleico de la reivindicación 17.

21. Un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 20 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico, y purificar el polipéptido de la célula cultivada o el medio de la célula

22. Una composición que contiene una proteína de fusión de la reivindicación 1 o un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión; y un portador aceptable farmacéuticamente.

23. Un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto, el método comprende: identificar a un sujeto que tiene o que está en riesgo de adquirir una condición caracterizada por una respuesta inmunitaria excesiva; y administrar al sujeto una cantidad efectiva de una proteína de fusión de la reivindicación 1 o un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión.

24. El método de la reivindicación 23, caracterizado además porque el sujeto a recibido o se contempla que recita un trasplante alogénico o xenogéníco.

25. El método de la reivindicación 23, caracterizado además porque la condición es una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad alérgica, o un cáncer dependiente de angiogénesis.

26. El método de la reivindicación 25, caracterizado además porque la condición es un cáncer y la proteína de fusión contiene SEQ ID NO: 22, 24, y 25.

27. Un método para aumentar la vida media de una proteína recombinante en un sujeto, el método comprende: unir la proteína recombinante a un segmento que contiene SEQ ID NO.: 1 o un equivalente funcional de ella para formar una proteína de fusión quimera; y determinar la vida media de la proteína de fusión en un sujeto, en donde la proteína recombinante se fija a una citocina o a un factor de crecimiento y lo neutraliza.

28. Un método para aumentar la eficacia de una proteína recombinante en un sujeto, el método comprende: unir la proteína recombinante a un segmento que contiene SEQ ID NO: 1 o un equivalente funcional de ella para formar una proteína de fusión quimera; y determinar la eficacia de la proteína de fusión en un sujeto.

29. Un método para suministrar una proteína terapéutica a un sitio objetivo en un sujeto, el método comprende: unir la proteína terapéutica a un segmento que contiene SEQ I D NO: 1 o un equivalente funcional de ella para formar una proteína de fusión quimera; y administrar la proteína de fusión quimera a un sujeto que necesita de ello, caracterizado además porque la proteína terapéutica es apuntada hacia un sitio inflamatorio que es rico en receptor de I L-1 .

30. El método de la reivindicación 28, caracterizado además porque el segmento que contiene SEQ I D NO: 1 o un equivalente funcional de ella se fija al receptor de I L-1 , y la proteína recombinante es una proteína terapéutica que se une a una citocina o a un factor de crecimiento y lo neutraliza.

31 . El método de la reivindicación 30, caracterizado además porque la proteína de fusión quimera se une y neutraliza simultáneamente tanto al receptor de IL-1 como a las citocinas y factor de crecimiento en un sitio de inflamación o en un sitio de enfermedad rico en receptor de IL-1 en un sujeto.

32. El método de la reivindicación 30, caracterizado además porque la proteína de fusión quimera neutraliza o antagoniza las actividades tanto de la I L-1 como de la citocina o factor de crecimiento en un sitio de inflamación o en un sitio de enfermedad rico en receptor de IL-1 en un sujeto.