Canle iónica

Todas as células vivas deben adquirir do seu arredor as materias primas para a biosíntese e a produción de enerxía e deben liberar na súa contorna os produtos de refugallo do metabolismo. As células promoven intercambios de materia co exterior e están rodeadas por unha membrana plasmática que separa o seu interior do exterior. Uns poucos compostos apolares poden disolverse na bicapa lipídica e cruzar a membrana plasmática sen ningún obstáculo (difusión de partículas liposolubles tales como: oxíxeno, alcohol, entre outros). Porén, no caso de compostos polares (ex. azucre, aminoácidos, ións etc.) é esencial unha proteína de membrana para o transporte transmembrana, unha vez que a estrutura da bicapa lipídica non é doadamente permeable a este tipo de partículas. O transporte destas substancias cara a dentro e fóra da célula ou entre diferentes compartimentos intracelulares lévase a cabo por proteínas de membrana como bombas, transportadores e canles iónicas. As canles iónicas están formadas por glicoproteínas e son compoñentes esenciais na actividade de todas as células.

As canles teñen tres propiedades importantes:

• conducen ións;
• recoñecen e seleccionan os ións (as canles poden ser selectivamente permeables a un ou varios ións);
• ábrense e péchanse en resposta a estímulos eléctricos, químicos ou mecánicos.

As canles iónicas forman poros de membrana que poden abrirse e pecharse. Cando a canle iónica se abre, forma un poro acuoso que se estende a través do espesor da membrana. O fluxo de ións a través dunha canle debido a diferenzas no potencial eléctrico ou de concentracións é pasivo, é dicir, non necesita de gasto metabólico enerxético por parte da célula. Os ións flúen pasivamente a favor do seu gradiente electroquímico. A enerxía vén das forzas químicas que interveñen na difusión, osmose e equilibrio electroquímico. Así, as dúas grandes forzas que impulsan os ións a moverse son a diferenza de concentración e o gradiente eléctrico (a ambas chámaselles forza electromotriz). Xa que na rexión de maior concentración a probabilidade de que as partículas choquen entre si é maior, a migración dunha partícula desta rexión a unha de menor concentración está termodinamicamente favorecida, e dise que a partícula se move a favor dun gradiente químico ou de concentración.

As canles iónicas poden ser de dous tipos:

• de filtración, que sempre se manteñen abertas;
• de comporta, que se abren e pechan en reacción a algún tipo de estímulo.

En electrofisioloxía a apertura das canles ten lugar xeralmente por medio de activación, e o peche, por medio da desactivación ou inactivación, e na literatura inglesa adoita utilizarse para referirse a isto o termo gating (de gate, 'cancela, porta'),^[6] xa que o termo deriva da idea de que unha proteína de canle iónica consta dun poro cunha ou varias comportas, e estas deben estar abertas para que os ións pasen a través do poro. Diversos cambios celulares poden disparar a activación das comportas, en función do tipo de canle iónica de que se trate, entre outros están os seguintes: cambios na voltaxe na membrana celular (canles iónicas reguladas por voltaxe), substancias químicas (fármacos, substancias adictivas, hormonas) que interaccionan coa canle iónica (canles iónicas reguladas por ligandos), cambios na temperatura,^[7] un estreitamento ou unha deformación da membrana celular, adición dun grupo fosfato á canle iónica (fosforilación) e interacción con outras moléculas da célula (por exemplo, as proteínas G).^[8] A velocidade á que ocorre calquera destes procesos de activación/inactivación en resposta a estes estímulos coñécese como cinética da activación. Algúns fármacos e moitas toxinas actúan como "modificadores da activación" das canles iónicas modificando a cinética das comportas.

Algunhas canles ábrense ou péchanse aleatoriamente independentemente do valor do potencial de membrana e dise que a súa apertura é independente da voltaxe. En contraste, outras canles están normalmente pechadas, pero a súa probabilidade de apertura pode incrementarse de maneira substancial por cambios no potencial de membrana (canles iónicas sensibles a voltaxe); por interaccións específicas con ligandos extracelulares ou intracelulares (canles activadas por ligandos); ou por estímulos físicos (mecanorreceptores e canles sensibles á calor).^[9]

Cando as canles iónicas están pechadas (sen posibilidade de condución), son impermeables aos ións e non conducen a corrente eléctrica. Cando as canles iónicas están abertas, si conducen a corrente eléctrica, e permiten entón que algúns ións pasen a través delas e, por tanto, a través da membrana plasmática da célula. Estes fluxos de ións xeran unha corrente eléctrica a través da membrana. A dirección en que se moven está determinada polo gradiente electroquímico que representa a suma do gradiente químico a través da membrana plasmática e o campo eléctrico que experimenta o ión. A activación é o proceso no que unha canle iónica se transforma e pasa de calquera dos seus estados de condución a calquera dos seus estados de non condución.

Na descrición habitual das canles iónicas activadas por voltaxe do potencial de acción, distínguense catro procesos: activación, desactivación, inactivación e reactivación (tamén chamada recuperación da inactivación). Nun modelo de canle iónica con dúas comportas (unha comporta de activación e outra de inactivación) no cal ambas as dúas deben estar abertas para que os ións sexan conducidos a través da canle, a activación é o proceso de apertura da comporta de activación, que ocorre en resposta ao feito de que a voltaxe dentro da membrana celular (o potencial de membrana) vólvese máis positivo con respecto ao exterior da célula (despolarización); a desactivación é o proceso oposto, é dicir, o peche da comporta en resposta ao feito de que a voltaxe do interior da membrana vólvese máis negativa (repolarización. A inactivación é o peche da comporta de inactivación; igual que na activación, a inactivación ocorre en resposta a que a voltaxe dentro da membrana se volve máis positiva, pero a miúdo ocorre que se atrasa, en comparación coa activación. A recuperación da inactivación é o oposto á inactivación. Así, tanto a inactivación coma a desactivación son procesos que fan que a canle perda a capacidade de condución, pero son procesos diferentes no sentido de que a inactivación se dispara cando o interior da membrana se volve máis positivo, mentres que a desactivación se dispara cando o potencial da membrana se volve máis negativo.

As canles iónicas poden clasificarse en función do tipo de estímulo para a súa apertura ou peche en:

• canles activadas por voltaxe;
• canles activadas por ligandos;
• canles mecanosensibles.

 

As canles iónicas abren en resposta a cambios no potencial eléctrico a través da membrana plasmática, que é unha bicapa lipídica. A súa principal función é a transmisión de impulsos eléctricos (xeración do potencial de acción) debido a cambios na diferenza de cargas eléctricas derivadas das concentracións de anións e catións entre ambos os lados da membrana. O peche e apertura das canles iónicas son controlados por un sensor que pode ser eléctrico, químico ou mecánico. As canles activadas por voltaxe conteñen un sensor que contén varios aminoácidos con carga positiva que se moven no campo eléctrico da membrana durante a apertura ou peche da canle. O cambio na diferenza de potencial eléctrico a ambos os lados da membrana provoca o movemento do sensor. O movemento do sensor de voltaxe crea un movemento de cargas (chamado corrente de comporta) que cambia a enerxía libre que modifica a estrutura terciaria da canle, abríndoa ou pechándoa. Algunhas destas canles teñen un estado refractario coñecido como inactivación cuxo mecanismo depende dunha subunidade distinta das responsables da apertura e peche.

A fase de rápida despolarización do potencial de acción das neuronas e células musculares (esqueléticas, lisas e cardíacas) e, en xeral, das células excitables, depende da entrada de Na⁺ a través de canles activadas por cambios de voltaxe. Esta entrada de Na⁺ produce unha despolarización do potencial de membrana que facilita, á súa vez, a apertura de máis canles de Na⁺ e permite que se chegue ao potencial de equilibrio para este ión en 1-2 mseg. Cando as células se encontran en repouso, a probabilidade de apertura das canles de Na⁺ é moi baixa, aínda que durante a despolarización produza un drástico aumento da súa probabilidade de apertura.^[10]

As canles de K⁺ constitúen o grupo máis heteroxéneo de proteínas estruturais de membrana. Nas células excitables, a despolarización celular activa as canles de K⁺ e facilita a saída de K⁺ da célula, o que conduce á repolarización do potencial de membrana. Ademais, as canles de K⁺ xogan un importante papel no mantemento do potencial de repouso celular, a frecuencia de disparo das células automáticas, a liberación de neurotransmisores, a secreción de insulina, a excitabilidade celular, o transporte de electrólitos polas células epiteliais, a contracción do músculo liso e a regulación do volume celular. Tamén existen canles de K⁺ cuxa activación é independente de cambios do potencial de membrana que determinan o potencial de repouso e regulan a excitabilidade e o volume extracelular. A mosca do vinagre (Drosophila melanogaster) foi a clave para coñecer a topoloxía e a función das canles de K⁺. A identificación da primeira canle de K⁺ foi consecuencia do estudo electrofisiolóxico do mutante Shaker (~tremador) de D. melanogaster, denominado así porque presenta movementos espasmódicos das extremidades ao ser anestesiada con éter. Unha función importante das canles de K⁺ é a activación linfocitaria na resposta inmune do organismo.

Nas células en repouso, a concentración intracelular de Ca²⁺ é 20 000 veces menor que a súa concentración no medio extracelular; por outro lado, o interior da célula é electronegativo (-50 a -60 mV), é dicir, que existe un gradiente electroquímico que favorece a entrada de ións Ca²⁺ na célula. Porén, nunha célula en repouso, a membrana celular é moi pouco permeable ao Ca²⁺, polo que a entrada do mesmo a favor deste gradiente é reducida. Agora ben, durante a activación celular, a concentración intracelular de Ca²⁺ aumenta como consecuencia da entrada de Ca²⁺ extracelular a través da membrana, a través de canles dependentes de voltaxe. A entrada de Ca²⁺ a través das canles dependentes de voltaxe da membrana celular participa na regulación de numerosos procesos biolóxicos: a xénese do potencial de acción e a duración deste, o acoplamiento excitación-contracción, a liberación de neurotransmisores, hormonas e factores de crecemento, a sinaptoxénese, a osteoxénese, os procesos de diferenciación celular, a hipertrofia e o remodelado, entre outros.

As canles de Cl^- xogan un papel moi importante na regulación da excitabilidade celular, o transporte transepitelial e a regulación do volume e do pH celulares e poden ser activados por cambios de voltaxe, ligandos endóxenos (Ca, AMPc, proteínas G) e forzas físicas (dilatación celular). A primeira canle dependente de voltaxe desta familia, denominada CLC-0, foi clonada do órgano eléctrico da raia Torpedo marmorata. Posteriormente, clonáronse outras 9 canles, codificadas polos xenes CLCN1-7, CLCNKa e CLCNKb. As canles ClC-0, Clc-1, ClC-2 e ClC-Ka/b localízanse na membrana celular, mentres que as restantes canles se encontran nas membranas das mitocondrias e doutros orgánulos celulares. As canles localizadas na membrana celular estabilizan o potencial de membrana nass células excitables (ex. no músculo esquelético) e son responsables do transporte transepitelial de auga e electrólitos, mentres que as canles intracelulares poden contrabalancear a corrente producida polas bombas de protóns. A función máis importante das canles de Cl^-, na sinapse neuronal, é provocar unha hiperpolarización pola súa entrada na neurona postsináptica pasada a súa activación, e así interromper o impulso nervioso para preparar a neurona postsináptica para o seguinte impulso. Outra función importante das canles de Cl^- ocorre nos glóbulos vermellos do sangue: nos tecidos a entrada de Cl^- en eritrocitos forza a saída de bicarbonato destes, co que entra CO₂ ao eritrocito. Nos pulmóns, a saída de Cl^- do eritrocito forza a entrada de bicarbonato do sangue, co que sae CO₂ ao torrente sanguíneo pulmonar. Deste modo transpórtase máis cantidade de CO₂ dos tecidos aos pulmóns.

As canles iónicas abren en resposta á unión de determinados neurotransmisores ou outras moléculas. Este mecanismo de apertura é debido á interacción dunha substancia química (neurotransmisor ou hormona) cunha parte da canle chamada receptor, que crea un cambio na enerxía libre e cambia a conformación da proteína, abrindo a canle. Os ligandos regulan a apertura das canles dos receptores.^[11] Estas canles denomínanse dependentes de ligandos e son importantes na transmisión sináptica. As canles dependentes de ligando teñen dous mecanismos de apertura:

• por unión do neurotransmisor ao receptor asociado á canle (receptores ionotrópicos, receptores activados directamente);
• por unión do neurotransmisor ao receptor que non está asociado á canle. Isto provoca unha fervenza de eventos encimáticos, unha vez que a activación de proteínas G promove a apertura da canle debido á actuación de encimas fosforiladores.

No caso das canles activadas por ligando, o sensor é unha rexión da proteína da canle que está exposta ao exterior ou ao interior da membrana, que une con grande afinidade unha molécula específica que orixina a apertura ou peche da canle.

Son canles iónicas reguladas por un impulso mecánico que abren en resposta a unha acción mecánica. As canles mecanosensibles, como as que se encontran nos corpúsculos de Pacini, ábrense polo estiramento que sofre a membrana celular ante a aplicación de presión ou tensión. O mecanismo sensor nesta última clase de canles non está aínda claro; porén, propúxose que os ácidos graxos da membrana actúan como os axentes sensores mediante a activación de fosfolipases unidas á membrana ou tamñen se propuxo que participa o citoesqueleto que se encontra inmediatamente por debaixo da canle.

Outro modo de clasificar as canles é pola duración da súa resposta o estímulo. Deste modo algunhas das canles son transitorias:

• Canles de potencial receptor transitorio: Este grupo de canles, normalmente denominados canles TRP, denomináronse polo seu papel na fototransdución visual en Drosophila. Esta familia de canles, que contén 28 membros, ten mecanismos de acción deversos. Algunhas canles TRP permanecen abertas constitutivamente, mentres que outras están reguladas por voltaxe, o Ca²⁺ intracelular, o pH, o estado redox, a osmolaridade e o estiramento mecánico. Estas canles tamén varían de acordo cos ións que conducen, algunhas son selectivas para o Ca²⁺ mentres que outras son menos selectivas. Esta familia é subdividida en 6 subfamilias baseándose na homoloxía: TRP canónico (TRPC), receptores vainilloides (TRPV), melastatina (TRPM), policistinas (TRPP), mucolipinas (TRPML) e anquirina transmembrana proteína 1 (TRPA).

A canles iónicas son especialmente importantes na transmisión do impulso eléctrico no sistema nervioso. De feito, a maior parte das toxinas que algúns organismos desenvolveron para paralizar o sistema nervioso de depredadores ou presas (como por exemplo o veleno producido por escorpións, arañas, serpes e outros) funcionan causando o peche das canles iónicas. A alta afinidade e especificidade destas toxinas permitiu o seu uso como ligandos para a purificación das proteínas que constitúen as canles iónicas. Moitos axentes terapéuticos median os seus efectos pola interacción con estas proteínas, como por exemplo algúns axentes ansiolíticos, antihipertensivos, antiarrítmicos etc.

As canles iónicas preséntanse nunha gran variedade de procesos biolóxicos que requiren cambios rápidos nas células, como no corazón, esqueleto, contracción do músculo, transporte de ións e nutrientes a través de epitelios, activación de linfocitos T ou liberación de insulina polas células beta do páncreas. As canles iónicas son un obxectivo clave na busca de novos fármacos.

• O transporte de ións a través destas canles é extremadamente rápido. A través deles poden fluír máis dun millón de ións por segundo (10⁷-10⁸ ións/seg.) O fluxo é mil veces maior que a velocidade de transporte dunha proteína transportadora, polo que o transporte iónico é bastante eficiente.
• Elevada selectividade. As canles iónicas son selectivas dos tipos de ións que permiten que pasen. O tipo de ión que se lle permite pasar depende da configuración electroquímica das subunidades da proteína, especialmente do lado inferior do poro: é común que un tipo de canle iónica permita o paso de varios tipos de ións, especialmente se comparten a mesma carga (positiva ou negativa).
• Nalgúns casos a súa apertura e peche pode ser regulado en resposta a estímulos específicos.^[12]

A importancia das canles iónicas nos procesos fisiolóxicos apréciase claramente polos efectos de mutacións en proteínas de canles iónicos específicos.^[13] Os defectos xenéticos na canle de Na⁺ regulada por voltaxe da membrana plasmática do miocito causan doenzas nas que os músculos periodicamente se paralizan (tal como ocorre na parálise periódica hipercaliémica) ou vólvense ríxidos (como na paramiotonía conxénita). A fibrose quística é o resultado dunha mutación que modifica un aminoácido na proteína CFTR, unha canle de ións Cl^-; aquí o proceso defectuoso non é a neurotransmisión, senón a secreción por varias células glandulares exócrinas cuxas actividades están ligadas aos fluxos de ións Cl^-. Moitas toxinas presentes na natureza actúan a miúdo sobre canles iónicas, e a potencia destas toxinas ilustra aínda máis a importancia do funcionamento normal das canles iónicas. A tetradotoxina (producida polo peixe globo, Sphaeroides rubripes) e a saxitoxina (producida polo dinoflaxelado mariño Gonyaulax, causante de mareas vermellas) actúan uníndose ás canles de Na⁺ reguladas por voltaxe das neuronas impedindo deste modo os potenciais de acción normais. O peixe globo é un ingrediente da exquisitez xaponesa fugu, que só a poden cociñar chefs adestrados especialmente para preparar o alimento separando o veleno mortal. Comer marisco que se alimentou de Gonyaulax pode ser tamén letal; o marisco non é sensible á saxitoxina, pero si a concentra no seu corpo, polo que pasan a ser moi velenosos para os organismos da súa cadea trófica. O veleno da serpe mamba negra contén dendrotoxina, que interfire con canles de K⁺ de entrada regulada por voltaxe. A tubocurarina, compoñente activo do curare (usado como veleno para facer frechas velenosas no Amazonas) e outras dúas toxinas de velenos de serpe, cobrotoxina e bungarotoxina, bloquean o receptor de acetilcolina ou impiden a apertura da súa canle iónica. Ao bloquearen os sinais que van dos nervios aos músculos, todas estas toxinas provocan parálise e moi posiblemente a morte. No lado positivo, a extremadamente elevada afinidade da bungarotoxina para o receptor da acetilcolina foi útil experimentalmente: a toxina marcada radioactivamente foi utilizada para cuantificar o receptor durante a súa purificación. Nos últimos anos describíronse diversas enfermidades conxénitas asociadas á presenza de mutacións nos xenes que codifican as subunidades das canles iónicas, as canalopatías.^[14] Utilizando técnicas de bioloxía molecular e de electrofisioloxía puidéronse clonar e expresar os xenes que codifican as subunidades das canles iónicas e caracterizar as correntes nas canles nativas ou mutadas. Hoxe sabemos que as mutacións das canles Na⁺, Ca²⁺, K⁺ e Cl^- son responsables de cadros de epilepsia, ataxia, dexeneración neuronal, entre outros.

• Mutacións no xene Shaker de Drosophila. Causan un defecto nas canles iónicas reguladas por voltaxe, facendo máis lenta a repolarización da célula.
• Parálise periódica hipercalémica equina e parálise periódica hipercalémica humana, causadas por un defecto nas canles de sodio dependentes de voltaxe.
• Paramotonía conxénita e miotonías agravadas por potasio.
• Epilepsia xeneralizada con ataques febrís + (GEFS+).
• Ataxia episódica, caracterizada por episodios esporádicos de grave descoordinación con ou sen mioquimia, que poden ser provocadas por estrés, sobresaltos ou grande esforzo por facer exercicio.
• Migraña hemipléxica familiar.
• Ataxia espiñocerebelar tipo 13.
• Síndrome de QT longa, que é unha arritmia ventricular cardíaca causada por mutacións nun ou máis dun conxunto de polo menos dez xenes, a maioría dos cales codifican canles de potasio e todos afectan á repolarización cardíaca.
• Síndrome de Brugada, outra arritmia ventricular causada por mutacións nun xene de canle de sodio regulado por voltaxe.
• Fibrose quística, causada por mutacións no xene CFTR, que é unha canle de cloruros.
• Mucolipidose tipo IV, causada por mutacións no xene que codifica a canle TRPML1.
• As mutacións e sobreexpresión de canles iónicas son eventos importantes observados nas células cancerosas. No glioblastoma multiforme, a regulación á alza de canles de potasio gBK e canles de cloruro ClC-3 permite que as células do glioblastoma migren dentro do cerebro, o cal pode levar a que aparezan padróns de crecemento difusos destes tumores.^[15]

Coa técnica do patch clamp pódense medir as correntes iónicas a través dunha canle de membrana individual. Para iso únese un capilar cunha punta fina modificada de 1 µm de diámetro sobre a membrana celular; por medio dun lixeiro baleiro colócase a membrana celular densa no bordo do cristal e íllase así un pequeno dominio ou "parche" da membrana (en inglés patch) do medio circundante. Por manipulación mecánica póddense separar os fragmentos da membrana celular e entón medilos individualmente. Un eléctrodo no capilar cheo de tampón é suficiente para conectar o aparello de medida. Mantendo un potencial definido (en inglés to clamp, grapar) pódese medir a corrente de ións a través do dominio de membrana illado con alta resolución de tempo (µs). Para iso, as condicións do lado citosólico ou do lado extracelular da membrana pódense variar arbitrariamente e medir a súa influencia sobre a corrente de ións. Así se cuantifica a corrente de ións a través dun receptor nicotínico de acetilcolina nuns 4 pA (10⁻¹² amperes), o que significa un fluxo duns 2-3 x 10⁴ ións de Na⁺ por milisegundo.

 

O concepto de canle iónica foi proposta na década dos 50 por Alan Hodgkin e Andrew Huxley nos seus estudos clásicos sobre a natureza do impulso nervioso no axón xigante da lura. No seu modelo cuantitativo propuxeron que as correntes de Na⁺ e K⁺ estaban localizadas en sitios particulares na membrana aos cales lles chamaron “parches activos”. Actualmente sabemos que estes parches activos son as canles de Na⁺ e K⁺ activadas por voltaxe. A partir de entón e nos últimos 50 anos, incrementouse enormemente o coñecemento das canles iónicas a nivel molecular. Un grande avance no coñecemento das canles iónicas deuse tamén co desenvolvemento da técnica do “patch clamp” por Erwin Neher e Bert Sakmann. Estes dous investigadores usaron un microelectrodo de vidro coa punta puída e aplicárono á superficie dunha célula, de maneira que se puidese illar un parche pequeno de membrana. A voltaxe a través deste parche mantívose estable por un amplificador de retroalimentación e deste xeito puideron medir as correntes que fluían a través das canles presentes nel. Esta técnica pola que lle deron o premio Nobel aos seus creadores, revolucionou o estudo das canles iónicas, xa que permitiu reducir o “ruído” ou interferencia e rexistrar a actividade dunha soa canle e actualmente cada ano publícanse miles de traballos realizados con esta técnica. Recentemente, realizouse outro grande avance no estudo das canles iónicas pola que se outorgou o premio Nobel aos seus autores. O grupo de Roderick MacKinnon logrou cristalizar por primeira vez unha canle iónica e estudala con difracción de raios X obtendo imaxes cunha resolución de 3.2 Å.

• Canle de calcio
• Canle de sodio
• Receptor nicotínico

• Neurociencia (II edición) Dale Purves, George J. Augustine, David Fitzpatrick, Lawrence. C. Katz, Anthony-Samuel LaMantia, James O. McNamara, S. Mark Williams, editores. Publicado por Sinauer Associates, Inc. (2001) textos en liña
• Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular, and Medical Aspects (VI edición) por George J Siegel, Bernard W Agranoff, R. W Albers, Stephen K Fisher e Michael D Uhler publicado por Lippincott, Williams & Wilkins (1999): textos en liña

• Federación Española de Fibrosis Quística
• Propagación do potencial de acción Arquivado 15 de abril de 2013 en Wayback Machine.