جداسازی و همسانه سازی ژن تولید کننده انسولین انسانی جهت بیان در سیستم های مختلف تولید پروتئین های نوترکیب

سالانه افزایش بروز دیابت میزان نیاز به انسولین را افزایش می دهد. بنابراین، باید روش های اقتصادی تری برای تولید انسولین پیش بینی گردد. محدودیت در ظرفیت تولید و پرهزینه بودن، مشکلات فناوری های کنونی تولید انسولین هستند. هدف از این تحقیق،بررسی سیستم های مختلف تولید پروتئین های نوترکیب برای بهبود تولید اقتصادی انسولین می باشد. در گام اول، با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی ،cDNA ی مربوط به انسولین انسانی با استفاده از روش رونویسی معکوس از سلول های انسانی کشت شده تکثیر گردید. قطعه 336 بازی که تنها حاوی توالیهای کد کننده پروتئین IGF1 بود، پس از توالی یابی و تایید توالی، در وکتور پایه pMCS5 کلون گردید. برای بررسی بیان پروتئین در سه نوع سیستم متفاوت شامل E. coli مخمر و گیاه، این توالی در سه نوع وکتور بیان در بین پروموتر و ترمیناتور مناسب کلون شدند. برای بیان ژن در مخمر از وکتور pGBKT7 و برای بیان پروتئین در E. coli ،از وکتور بیان pGEX-2K استفاده شد که به ترتیب برای بیان پروتئین نوترکیب در مخمر و E. coli از کارآیی بالایی برخوردارند. برای بیان این ژن در گیاه، توالی کلون شده در وکتور اختصاصی انتقال ژن به کلروپلاست تنباکو قرار گرفت. برای تنظیم رونویسی ژن در کلروپلاست، از پروموتر مربوط به RNA ی ریبوزومی 16S(Prrn) و ترمیناتور زیرواحد بزرگ روبیسکو (TrbcL) از کلروپلاست تنباکو استفاده شد. از آنجا که توالیهای استفاده شده از ژنوم پلاستید تنباکو در ساختار وکتور طراحی شده بسیار شبیه به پلاستوم گیاه کاهو می باشد، بنابراین می توان از این وکتور برای انتقال ژن به کلروپلاست کاهو نیز استفاده کرد.