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WO2022060208A1 - 안티센스 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

안티센스 올리고뉴클레오타이드 Download PDF

Info

Publication number
WO2022060208A1
WO2022060208A1 PCT/KR2021/012989 KR2021012989W WO2022060208A1 WO 2022060208 A1 WO2022060208 A1 WO 2022060208A1 KR 2021012989 W KR2021012989 W KR 2021012989W WO 2022060208 A1 WO2022060208 A1 WO 2022060208A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
modified nucleotides
oligonucleotide
nucleotides
aso
modified
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/012989
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박창희
구지혜
김지혜
홍수정
남경완
박전의
김태훈
Original Assignee
오토텔릭바이오 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오토텔릭바이오 주식회사 filed Critical 오토텔릭바이오 주식회사
Publication of WO2022060208A1 publication Critical patent/WO2022060208A1/ko

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • the present invention relates to an antisense oligonucleotide and a pharmaceutical composition comprising the same.
  • tRNA fetches the corresponding amino acid according to the mRNA information from the ribosome, and the protein is produced through the process of linking it with a peptide bond.
  • the complementary DNA or RNA binds to mRNA to form a double strand, thereby preventing protein production.
  • RNA oligonucleotide capable of inhibiting its function by binding to an mRNA (sense RNA) that can be transcribed and translated into a protein is referred to as an antisense RNA or an antisense oligonucleotide.
  • an antisense oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and the like are known as an antisense oligonucleotide targeting TGF- ⁇ , a tumor promoting factor.
  • the antisense oligonucleotide itself needs to solve the problem of rapid degradation in vivo and also improve specificity so that it binds only to the mRNA of the target gene, so that it can be developed as a drug that can treat actual diseases.
  • the present inventors have studied to develop an antisense oligonucleotide with improved ability to inhibit TGF- ⁇ protein expression.
  • a novel antisense oligonucleotide in which the structure of some sugars among known antisense oligonucleotides is modified has excellent TGF- ⁇ inhibitory effect, and , it was confirmed that the stability was high.
  • the present invention is to provide a novel antisense oligonucleotide and a pharmaceutical composition containing the same.
  • the present invention relates to a novel antisense oligonucleotide comprising at least one modified nucleoside among the oligonucleotides of 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3' of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to an antisense oligonucleotide of SEQ ID NO: 1, wherein at least one nucleoside of the oligonucleotide has a modified nucleotide.
  • nucleoside-modified nucleotide is a nucleoside is 2'-O-methoxyethyl (MOE) modified nucleotide, 2'-fluoro (F) modified nucleotide, 2'-O-methyl ( O-Me) modified nucleotides, locked nucleic acid (LNA) modified nucleotides, ethylene-bridged nucleic acid (ENA) modified nucleotides, restricted ethyl (cET: (R/S)-constrained ethyl ) modified nucleotides or polyalkylene oxide (eg, triethylene glycol (TEG)) modified nucleotides.
  • MOE methoxyethyl
  • F fluoro
  • O-Me 2'-O-methyl
  • LNA locked nucleic acid
  • ENA ethylene-bridged nucleic acid
  • cET restricted ethyl
  • R/S restricted ethyl
  • TAG triethylene glycol
  • the 2' position of the ribose pentose of the nucleoside to be modified is 2'-O-methoxyethyl (MOE) form, 2'-fluoro form, or 2' -O-methyl form, or LNA or ENA form in which the oxygen at the 2' position of the ribose pentose of the modified nucleoside is connected to the carbon at the 4' position, or the oxygen at the 2' position and the 4' position of the LNA It may be in the form of cET in which a bridge connecting carbons is replaced with a methyl group.
  • MOE 2'-O-methoxyethyl
  • the oligonucleotides of the invention comprise one or more modified nucleosides at the 5'-end and/or the 3' end.
  • each of the 5'-end or the 3'-end of the oligonucleotide of the present invention may include one or more modified nucleosides.
  • the oligonucleotides of the present invention may include nucleotides having one or more modified nucleosides at the 5'-end or the 3'-end, respectively, ie, "modified nucleotides".
  • the oligonucleotide according to the present invention is an oligonucleotide in which one or more nucleotides of the 5'-end or one or more nucleotides of the 3'-end of the oligonucleotide are modified nucleotides.
  • the oligonucleotide according to the present invention is an oligonucleotide in which one or more nucleotides of the 5'-end and one or more nucleotides of the 3'-end of the oligonucleotide are modified nucleotides.
  • the first to n-th nucleotides of the 5'-end of the oligonucleotide or the first to m-th nucleotides of the 3'-end of the oligonucleotide may be modified nucleotides.
  • the first to n-th nucleotides of the 5'-end of the oligonucleotide and the first to m-th nucleotides of the 3'-end of the oligonucleotide may be modified nucleotides.
  • n and m are each independently an integer of any one of 1 to 9, and preferably, n and m are each independently an integer of any one of 1 to 6.
  • the oligonucleotide of the present invention may further include a modified nucleotide between the modified nucleosides present at the 5'-end or the 3'-end.
  • the oligonucleotide may further include one or more modified nucleotides between the (n+1)-th nucleotide of the 5'-end and the (m+1)-th nucleotide of the 3'-end.
  • Preferred examples of the oligonucleotide of the present invention may be any one of the antisense oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 shown in Nos. 1 to 25 of the table below.
  • modified nucleotides of the oligonucleotides shown in Nos. 1 to 21 of the Table are 2'-O-methoxyethyl (MOE) modified nucleotides
  • the modified nucleotides of the oligonucleotides shown in Nos. 22 to 25 of the Table are locked nucleic acids ( LNA) is preferably an oligonucleotide that is a modified nucleotide.
  • LNA locked nucleic acids
  • the bond between nucleosides, whether or not the nucleosides are modified may be phosphodiester or phosphothioate.
  • oligonucleotide should be understood as a concept that also includes pharmaceutically acceptable salts of oligonucleotides.
  • the modification of the nucleoside as described above may be prepared through organic chemical synthesis methods known in the art to which the present invention pertains.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the modified antisense oligonucleotide as described above.
  • the present invention contains the modified antisense oligonucleotide as described above, and diseases (eg, malignant tumors, benign tumors, immune diseases, fibrosis or ophthalmic diseases, etc.) related to overexpression of TGF- ⁇ 2 protein It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating.
  • diseases eg, malignant tumors, benign tumors, immune diseases, fibrosis or ophthalmic diseases, etc.
  • the oligonucleotide of the present invention was treated in a solid cancer cell line, it was confirmed that the effect of inhibiting the expression of TGF- ⁇ 2 protein was more excellent, the effect of killing cancer cells was excellent, and the stability in plasma was also improved.
  • the oligonucleotide of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for treating diseases related to TGF- ⁇ expression, for example, malignant tumors, benign tumors, immune diseases, fibrosis, ophthalmic diseases, and the like.
  • 1 is a graph confirming the change in TGF- ⁇ 2 mRNA expression by treating A549 with 20 nM of ASO.
  • FIG. 2 is a graph confirming the change in TGF- ⁇ 2 mRNA expression by treating PANC-1 with ASO 20 nM.
  • 3 is a graph confirming the change in TGF- ⁇ 2 mRNA expression by treating A549 with 5 nM of ASO.
  • FIGS. 5 and 6 show changes in human TGF- ⁇ 2 mRNA level (level) when A549, PANC-1 is treated with ASO at 1 uM (Free uptake (meaning no transfection reagent)).
  • TGF- ⁇ 2 mRNA expression levels for each cell line of 4 types of carcinoma (Breast cancer, Pancreatic cancer, Lung cancer, and Melanoma).
  • Figure 11 shows changes in human TGF- ⁇ 2 mRNA level after ASO treatment in 4 types of carcinoma (Lung adenocarcinoma (A549), Pancreatic cancer (Panc-1), Breast cancer (MDA-MB-231), Melanoma (Hs294T)) .
  • carcinoma Lung adenocarcinoma (A549), Pancreatic cancer (Panc-1), Breast cancer (MDA-MB-231), Melanoma (Hs294T)
  • FIG. 12 is a diagram showing changes in body weight after administration of ASO to xenograft mice.
  • FIG. 13 is a diagram showing tumor volume after administration of ASO to xenograft mice.
  • FIG. 14 is a diagram showing the tumor suppression rate after administration of ASO to xenograft mice.
  • the oligonucleotide of the present invention was treated in a solid cancer cell line, it was confirmed that the effect of inhibiting the expression of TGF- ⁇ 2 protein was more excellent, the effect of killing cancer cells was excellent, and the stability in plasma was also improved.
  • Human lung cancer cell line A549 and human pancreatic cancer cell line PANC-1 were each treated with antisense oligonucleotide (ASO) 20 nM (w/transfection reagent), and changes in human TGF- ⁇ 2 mRNA level were confirmed.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • A549 and PANC-1 cell lines was treated with ASO 1 ⁇ M (free uptake (meaning no transfection reagent)), and then human TGF- ⁇ 2 mRNA level changes were confirmed.
  • RPMI 1640 (10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic)
  • DMEM 1% Antibiotic-Antimycotic
  • McCoy's 5A 10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic
  • the mixture containing ASO and the mixture containing the transfection reagent were mixed 1:1 and reacted at room temperature for 5 minutes. This mixture was dispensed to the cell line in which the medium was replaced, and incubated in an incubator (37° C., CO 2 5%) for 24 hours or 48 hours depending on the purpose of the test.
  • RNAiMAX total volume 6 well 200,000 to 300,000 7.5 ⁇ l 2 ml 96 wells 5,000 to 10,000 0.3 ⁇ l 100 ⁇ l
  • An appropriate number of cells were seeded according to the characteristics of the cells and the plate size, and cultured for 24 hours.
  • ASO was put in a medium containing 10% FBS according to the concentration.
  • the mixture containing ASO was dispensed on the cell-seeded plate, it was cultured in an incubator (37° C., CO 2 5%) for 24 hours or 48 hours depending on the purpose of the test.
  • cDNA was synthesized with 2 ⁇ g of the extracted RNA using a cDNA synthesis kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit, Thermo Sceientific, K1622). Synthesis was carried out under synthetic conditions according to the manufacturer's instructions, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20ng/ ⁇ l.
  • a cDNA synthesis kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit, Thermo Sceientific, K1622. Synthesis was carried out under synthetic conditions according to the manufacturer's instructions, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20ng/ ⁇ l.
  • PCR was performed by preparing a mixture under the composition and conditions as shown in Tables 4 to 6 below.
  • the supernatant was recovered and centrifuged (13,000 rpm, 1 min).
  • nucleotides in bold underlined text indicate modified nucleotides.
  • A001 is the known antisense oligonucleotide of SEQ ID NO: 1, and A001-01M to A001-021M and A001-01L, A001-04L, A001-06L and A001-10L below are modified according to the present invention Examples of antisense oligonucleotides comprising nucleotides.
  • the modified nucleotides of the oligonucleotides indicated by A001-01M to A001-021M in the table above are 2'-O-methoxyethyl (MOE) modified nucleotides, and A001-01L, A001-04L, A001-06L and
  • the modified nucleotides of the oligonucleotides designated A001-10L are oligonucleotides that are locked nucleic acid (LNA) modified nucleotides.
  • LNA locked nucleic acid
  • the bond between nucleosides in the oligonucleotides of the table above is a phosphothioate bond, whether or not the nucleoside is modified.
  • the change in the mRNA level of TGF- ⁇ 2 was compared for each candidate, and the efficacy of the ASO of the present invention was compared with A001 did
  • the culture medium for cell line A549 (Lung carcinoma) was RPMI1640+10%FBS+1% Antibiotics, and the culture medium for cell line PANC-1 (Pancreas Epithelioid carcinoma) was DMEM+10%FBS+1% Antibiotics.
  • Transfection Change the medium 24 hours after cell seeding (after removing the existing culture, add 1.8 ml of media containing no antibiotics and 10% FBS), 20 times the final concentration of ASO to be tested (400 nM) It was put in plain media without addition of anything, and the transfection reagent (Lipofectamine RNAiMAX) was also put in plain media without addition to a concentration of 7.5 ul/100 ul. The mixture containing ASO and the mixture containing the transfection reagent were mixed 1:1 and reacted at room temperature for 5 minutes (at this time, the concentration of ASO becomes 200 nM).
  • RNA extraction and quantification After removing all the culture medium 24 hours after transfection, RNA was extracted using an RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). After RNA extraction, RNA was quantified by absorptiometry using a micro-volume plate (Take 3, Biotek) and a multi plate reader (Synergy H1, Biotek).
  • cDNA was synthesized with 2 ug of the extracted RNA using a cDNA synthesis kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • a cDNA synthesis kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622. Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • Figure 2 shows the inhibition ratio of human TGF- ⁇ 2 mRNA when PANC-1 is treated with ASO 20nM (with transfection reagent).
  • Example 5 Based on the experimental results of Example 5, ASO with relatively good efficacy was selected, and cell lines (A549, PANC-1) were treated at a concentration of 5 nM ASO in the presence of a transfection reagent, and then the mRNA level of TGF- ⁇ 2 was Changes were compared by ASO to compare the efficacy of ASO to the known A001 ASO.
  • the culture medium RPMI1640+10%FBS+1% Antibiotics was used, and for the cell line PANC-1 (Pancreas Epithelioid carcinoma), the culture medium DMEM+10%FBS+1% Antibiotics was used.
  • Cells were seeded at 2x10 5 cells / 2 ml per well in a 6 well plate.
  • RNA extraction and quantification After removing all the culture medium 24 hours after transfection, RNA was extracted using an RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). After RNA extraction, RNA was quantified by absorptiometry using a micro-volume plate (Take 3, Biotek) and a multi-plate reader (Synergy H1, Biotek).
  • cDNA was synthesized with 2 ug of the extracted RNA using a cDNA synthesis kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • a cDNA synthesis kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622. Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • 3 is a graph confirming the change in TGF- ⁇ 2 mRNA expression by treating A549 with 5 nM of ASO.
  • the culture medium RPMI1640+10%FBS+1% Antibiotics was used, and for the cell line Panc-1 (Pancreas Epithelioid carcinoma), the culture medium DMEM+10%FBS+1% Antibiotics was used.
  • RNA extraction and quantification After removing all the culture medium 24 hours after transfection, RNA was extracted using an RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). After RNA extraction, RNA was quantified by absorptiometry using a micro-volume plate (Take 3, Biotek) and a multi-plate reader (Synergy H1, Biotek).
  • cDNA was synthesized with 2 ug of the extracted RNA using a cDNA synthesis kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • a cDNA synthesis kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622. Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • the medium was replaced (after removing the existing culture medium, 1.8 ml of a medium containing 10% FBS without antibiotics was added).
  • the ASO to be tested was serially diluted with plain media without any addition so as to be 20 times the concentration to be treated (50-1600 nM).
  • the transfection reagent (Lipofectamine RNAiMAX) was also put in plain media to which nothing was added to a concentration of 7.5 ul/100 ul.
  • the mixture containing ASO and the mixture containing the transfection reagent were mixed 1:1 and reacted at room temperature for 5 minutes (at this time, the concentration of ASO becomes 10 times the concentration to be treated).
  • RNA extraction and quantification After collecting the culture medium 48 hours after transfection, RNA was extracted using an RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). After RNA extraction, RNA was quantified by absorptiometry using a micro-volume plate (Take 3, Biotek) and a multi-plate reader (Synergy H1, Biotek).
  • cDNA was synthesized with 2ug of the extracted RNA using a cDNA synthesis kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • a cDNA synthesis kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622. Synthesis conditions were carried out according to the manufacturer's instruction, and after PCR was completed, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • ASO spiked plasma was sampled and the amount of remaining ASO was analyzed by HPLC.
  • ASO containing nucleotides modified according to the present invention was maintained at 50% or more until 24 hours.
  • the amount of ASO detected even after 24 hours was about 80% or more.
  • the nucleotide according to the present invention has improved stability.
  • the transfection reagent (Lipofectamine RNAiMAX) was also put in plain media to which nothing was added to a concentration of 7.8 ul/100 ul.
  • RNA extraction and quantification After collecting the culture medium 48 hours after transfection, RNA was extracted using an RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136). After RNA extraction, RNA was quantified by absorptiometry using a micro-volume plate (Take 3, Biotek) and a multi-plate reader (Synergy H1, Biotek).
  • cDNA was synthesized with 2ug of the extracted RNA using a cDNA synthesis kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622). Synthesis conditions were performed according to the manufacturer’s instructions. After completion of PCR, cDNA was diluted with distilled water (DW) to 20 ng/ul.
  • DW distilled water
  • TGF- ⁇ 2 protein expression quantitative assay (ELISA):
  • TGF- ⁇ 2 mRNA expression levels for each cell line of 4 types of carcinoma (Breast cancer, Pancreatic cancer, Lung cancer, and Melanoma).
  • Figure 11 shows changes in human TGF- ⁇ 2 mRNA level after ASO treatment in 4 types of carcinoma (Lung adenocarcinoma (A549), Pancreatic cancer (Panc-1), Breast cancer (MDA-MB-231), Melanoma (Hs294T)) .
  • carcinoma Lung adenocarcinoma (A549), Pancreatic cancer (Panc-1), Breast cancer (MDA-MB-231), Melanoma (Hs294T)
  • the human TGF-b2 mRNA level was significantly reduced compared to the control group for 4 cell lines.
  • mice/group Balb/c nude mouse, male (5 weeks old), 6 mice/group
  • mice were acclimatized for one week after wearing, and tumor cells (A549) were transplanted 13 days before group separation (day 0).
  • Groups were separated 13 days after tumor cell transplantation.
  • the tumor size was about 80-100 mm 3 .
  • Treatment A total of 5 times (day 0, 2, 4, 7, 9) was administered at a dose of 15 mg/kg, 10 ml/kg by subcutaneous injection (s.c.) or intraperitoneal injection (i.p.).
  • the experimental schedule is as follows:
  • the oligonucleotide of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for treating diseases related to TGF- ⁇ expression, for example, malignant tumors, benign tumors, immune diseases, fibrosis, ophthalmic diseases, and the like.

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Abstract

안티센스 올리고뉴클레오타이드를 개시한다.

Description

안티센스 올리고뉴클레오타이드
본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
세포 내의 DNA 염기 서열 정보는 mRNA로 전사(transcription)된 후, 리보솜에서 mRNA의 정보에 따라 tRNA가 대응되는 아미노산을 가져오고, 이를 펩타이드 결합으로 연결시키는 과정을 통하여 단백질이 생산된다.
이러한 유전자 발현 과정 중에, 만일 mRNA와 상보적인 염기서열을 가진 한가닥 DNA 또는 RNA가 존재하게 된다면, 이 상보적 DNA 또는 RNA는 mRNA와 결합하여 이중사슬을 형성하게 되어, 단백질 생산을 막을 수 있다.
상기와 같이 전사되어 단백질로 번역될 수 있는 mRNA(센스 RNA)와 이중사슬로 결합하여 그 기능을 저해시킬 수 있는 상보적 관계의 DNA 또는 RNA의 올리고뉴클레오타이드를 안티센스 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드라 칭한다.
현재, 종양촉진 인자인 TGF-β를 타겟으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서 서열번호 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등이 공지되어 있다.
안티센스 뉴클레오타이드를 사용하여, 표적 유전자(예를 들어, 바이러스와 같은 병원체 또는 발암 유전자)의 기능을 저해시켜 질병을 치료하려는 연구가 진행되고 있다.
그러나, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 자체가 생체 내에서 신속하게 분해되는 문제를 해결하고, 또한 표적 유전자의 mRNA에만 결합하도록 특이성을 향상시켜야 실제 질병을 치료할 수 있는 의약품으로서 개발될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 TGF-β 단백질 발현의 억제 능력이 향상된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 개발하기 위하여 연구한 결과, 공지의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 일부 당의 구조를 변형시킨 신규의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 TGF-β 억제 효과가 우수하고, 안정성이 높다는 점을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 신규의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 의약 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 5'-CGGCATGTCTATTTTGTA-3'의 올리고뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 신규의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오사이드가 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.
여기에서, 뉴클레오사이드가 변형된 뉴클레오타이드는, 뉴클레오사이드가 2'-O-메톡시에틸(MOE) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(F) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸(O-Me) 변형된 뉴클레오타이드, 잠긴핵산(LNA: locked nucleic acid) 변형된 뉴클레오타이드, 에틸렌 가교 핵산(ENA: ethylene-bridged nucleic acid) 변형된 뉴클레오타이드, 제한된 에틸(cET: (R/S)-constrained ethyl) 변형된 뉴클레오타이드 또는 폴리알킬렌 옥사이드(예를 들어, 트리에틸렌 글리콜(TEG)) 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. (이하에서는, 특별한 언급이 없는 한, 위와 같이 뉴클레오사이드가 변형된 뉴클레오타이드를 "변형된 뉴클레오타이드"라 칭하기로 한다)
예를 들어, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 변형되는 뉴클레오사이드의 리보스 5탄당의 2' 위치가 2'-O-메톡시에틸(MOE) 형태, 2'-플루오로 형태, 또는 2'-O-메틸 형태이거나, 변형되는 뉴클레오사이드의 리보스 5탄당의 2' 위치의 산소가 4' 위치의 탄소와 연결되는 LNA 또는 ENA 형태이거나, 상기 LNA의 2' 위치의 산소 및 4' 위치의 탄소를 연결하는 브릿지가 메틸기로 치한된 cET 형태일 수 있다.
상기 예시한 변형 뉴클레오사이드의 구조는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure PCTKR2021012989-appb-I000001
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 5'- 단부 및/또는 3' 단부에 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부 또는 3'-단부에 각각 1개 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부 또는 3'-단부에 각각 1개 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오사이드를 갖는 뉴클레오타이드, 즉 "변형된 뉴클레오타이드"를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 3'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드이다.
또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드 및 3'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명에서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 첫번째 내지 n번째 뉴클레오타이드 또는 상기 올리고뉴클레오타이드의 3'-단부의 첫번째 내지 m번째 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다
또한, 본 발명에서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 첫번째 내지 n번째 뉴클레오타이드 및 상기 올리고뉴클레오타이드의 3'-단부의 첫번째 내지 m번째 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드일 수 있다
여기에서 n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 9 중 어느 하나의 정수이며, 바람직하게는 n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 6 중 어느 하나의 정수이다.
또한, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 상기 5'-단부 또는 3'-단부에 존재하는 변형된 뉴클레오사이드 사이에 변형된 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.
즉, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 (n+1)번째 뉴클레오타이드 및 3'-단부의 (m+1)번째 뉴클레오타이드 사이에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 바람직한 예는 하기 표의 1번 내지 25번으로 나타낸 서열번호 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나일 수 있다.
하기 표 1에서 밑줄로 표시된 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드를 나타낸다.
Figure PCTKR2021012989-appb-T000001
상기 표의 1번 내지 21번으로 나타낸 올리고뉴클레오타이드의 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸(MOE) 변형된 뉴클레오타이드이고, 표의 22번 내지 25번으로 나타낸 올리고뉴클레오타이드의 변형된 뉴클레오타이드는 잠긴핵산(LNA) 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드인 것이 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드에서, 뉴클레오사이드 사이의 결합은, 당해 뉴클레오사이드가 변형된 것인지 여부와 상관없이, 포스포디에스테르이거나 또는 포스포티오에이트일 수 있다.
Figure PCTKR2021012989-appb-I000002
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 양이온과 함께 염을 형성할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드의 약학적으로 허용가능한 염도 포함하는 개념으로 이해되어야 한다.
본 발명에서 상기한 바와 같은 뉴클레오사이드의 변형은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 유기화학적 합성 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 상기와 같이 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 의약조성물에 관한 것이다.
예를 들어, 본 발명은 상기와 같이 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, TGF-β2 단백질의 과발현과 관련있는 질병(예를 들어, 악성 종양, 양성 종양, 면역질환, 섬유증 또는 안과질환 등)을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 고형암 세포주에 처리하였을 때, TGF-β2 단백질의 발현 억제 효과가 더 우수하게 나타나고, 암세포의 사멸 효과도 우수하였으며, 혈장에서의 안정성도 개선됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 TGF-β의 발현과 관련있는 질병, 예를 들어, 악성 종양, 양성 종양, 면역질환, 섬유증, 안과질환 등을 치료하기 위한 의약 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 A549를 ASO 20nM 로 처리하여 TGF-β2 mRNA 발현 변화를 확인한 그래프이다.
도 2는 PANC-1을 ASO 20nM 로 처리하여 TGF-β2 mRNA 발현 변화를 확인한 그래프이다.
도 3은 A549를 ASO 5nM 로 처리하여 TGF-β2 mRNA 발현 변화를 확인한 그래프이다.
도 4는 PANC-1을 ASO 5nM 로 처리하여 TGF-β2 mRNA 발현 변화를 확인한 그래프이다.
도 5 및 도 6은 A549, PANC-1에 ASO를 1uM (Free uptake(형질주입 시약이 없는 것을 의미함)) 처리 시 Human TGF-β2 mRNA 레벨(level) 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 A549를 ASO로 농도 별로 처리 후, human TGF-β2 mRNA 레벨과 protein 분비 레벨 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 뉴클레오타이드를 변형하기 전의 뉴클레오타이드 백본 차이에 따른 안정성 개선 효과 여부를 확인한 실험 결과이다.
도 9는 뉴클레오타이드를 변형한 후의 혈장 내 안정성 개선 효과를 확인한 실험 결과이다.
도 10은 4종 암종 (Breast cancer, Pancreatic cancer, Lung cancer, Melanoma) 세포주별 TGF-β2 mRNA 발현 레벨을 비교한 것이다.
도 11은 4종 암종 (Lung adenocarcinoma (A549), Pancreatic cancer (Panc-1), Breast cancer (MDA-MB-231), Melanoma (Hs294T))에 ASO 처리 후 human TGF-β2 mRNA 레벨 변화를 나타낸 것이다.
도 12는 제노그라프트 마우스에 ASO를 투여한 후, 체중 변화를 나타낸 도면이다.
도 13은 제노그라프트 마우스에 ASO를 투여한 후, 종양 부피를 나타낸 도면이다.
도 14는 제노그라프트 마우스에 ASO를 투여한 후, 종양 억제 비율을 나타낸 도면이다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 고형암 세포주에 처리하였을 때, TGF-β2 단백질의 발현 억제 효과가 더 우수하게 나타나고, 암세포의 사멸 효과도 우수하였으며, 혈장에서의 안정성도 개선됨을 확인하였다.
이하에서는, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 사상이나 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
0. 실험 개요
가. 인간 폐암 세포주인 A549 및 인간 췌장암 세포주인 PANC-1 각각을 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 20 nM (w/형질주입 시약)로 처리한 후, human TGF-β2 mRNA 레벨 변화를 확인하였다.
나. A549 및 PANC-1 세포주 각각을 ASO 5 nM (w/형질주입 시약)로 처리한 후, human TGF-β2 mRNA 레벨 변화를 확인하였다.
다. A549 및 PANC-1 세포주 각각을 ASO 1 μM (free uptake(형질주입 시약이 없는 것을 의미함))로 처리한 후, human TGF-β2 mRNA 레벨 변화를 확인하였다.
라. 형질주입 시약이 있는 조건에서 ASO를 농도별로 처리한 후, human TGF-β2 mRNA 및 단백질 분비(protein secretion)의 용량의존적 억제 효과를 확인하였다.
마. ASO를 인간의 혈장 시료에 스파이킹(spiking)한 후, 안정성을 측정하였다.
바. 4종의 암세포주를 ASO 40 nM (w/형질주입 시약)로 처리한 후, mRNA 레벨 및 분비물 레벨의 변화를 확인하였다.
사. 폐암 A549 제토그라프트(xenograft) 마우스 모델에서 A001-01M의 항암 효과를 평가하였다.
1. 실험 방법 (공통사항)
가. 세포 배양
하기 표 2와 같이 세포 타입에 따라, RPMI 1640 (10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic), DMEM (10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic) 또는 McCoy’s 5A (10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic) 등의 배지를 사용하였으며, 세포는 37℃, CO2 5.0% 환경에서 배양하였다.
조직 세포주 진단명 배양배지
폐 A549 암종 (carcinoma) RMPI 1640
췌장 Panc-1 상피 암종 (Epithelioid carcinoma) DMED
직장 HCT116 결직장암 (Colorectal carcinoma) McCoy's 5A
유방 MDA-MB-231 선암 (Adenocarcinoma) RPMI 1640
피부 Hs294T 흑색종 (Melanoma) DMEM
나. 형질주입 시약 (Lipofectamine RNAiMAX)을 사용한 형질주입
세포의 특성 및 플레이트 크기에 따라 적절한 수의 세포를 시딩하고, 24시간 배양한 후에 배지를 교체하였다. ASO를 농도에 맞추어 FBS가 포함되어 있지 않은 배지에 넣고, 형질주입 시약도 FBS가 포함되어 있지 않은 배지에 넣었다.
ASO가 들어간 혼합물과 형질주입 시약이 들어간 혼합물을 1:1로 섞어 5분간 상온에서 반응시켰다. 배지를 교체한 세포주에 이 혼합물을 분주하고, 시험목적에 따라 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이터(37℃, CO2 5%)에서 배양하였다.
세포 시딩 및 형질주입 시약은 하기 표 3과 같다:
플레이트 세포 수 리포펙타민 RNAiMAX 전체 부피
6 웰 200,000 ~ 300,000 7.5㎕ 2 ㎖
96 웰 5,000 ~ 10,000 0.3㎕ 100 ㎕
다. 형질주입 시약없이 형질주입
세포의 특성 및 플레이트 크기에 따라 적절한 수의 세포를 시딩하고, 24시간 배양하였다.
ASO를 농도에 맞추어 10% FBS가 포함된 배지에 넣었다.
ASO가 들어간 혼합물을 세포가 시딩된 플레이트에 분주한 후, 시험목적에 따라 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이터(37℃, CO2 5%)에서 배양하였다.
2. TGF - β2 mRNA 정량 분석
가. RNA 추출 및 정량
형질주입 후 24시간 또는 48시간 경과하였을 때에, 배양액을 모두 제거하고, RNA 정제(preparation) 키트(Rneasy Plus Mini kit, Qiagen, Cat# 74136)를 이용하여 RNA를 추출하고, 이후 마이크로-부피 플레이트(Take 3, Biotek)와 멀티 플레이트 리더(Reader)(Synergy H1, Biotek)를 이용하여 흡광측정법으로 RNA를 정량하였다.
나. cDNA 합성
추출한 RNA 2㎍으로 cDNA 합성 키트(RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit, Thermo Sceientific, K1622)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성은 제조사의 지시사항에 따른 합성 조건 하에서 진행하였고, PCR 완료 후에 cDNA를 20ng/㎕가 되도록 증류수(DW)로 희석하였다.
TGF-β2 mRNA 정량 분석을 위하여 real-time PCR을 진행하였다. 레퍼런스 유전자로는 인간 SRSF9 가 사용되었다.
하기 표 4 내지 6과 같은 조성, 조건으로 혼합물을 제조하여 PCR을 진행하였다.
[표 4] PCR 혼합물 조성
Figure PCTKR2021012989-appb-I000003
[표 5] 프라이머 정보
Figure PCTKR2021012989-appb-I000004
[표 6] PCR 조건
Figure PCTKR2021012989-appb-I000005
3. TGF-β2 단백질 발현 정량 분석 (ELISA)
적절한 수의 세포를 시딩하고, 24시간 후에 ASO를 형질주입하였다(형질주입 시약은 없는 조건).
형질주입하고 48시간 경과 시에, 상층액을 회수하고, 이를 원심분리하였다 (13,000rpm, 1분).
상층액만 회수하여 TGF-β2 ELISA 키트(R&D)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 정량 분석을 시행하였다.
4. ASO 물질의 제조
하기 표의 ASO 물질을 통상적인 방법으로(예를 들어, 국제공개번호 WO 03/085110호 등에 기재된 방법을 참조하여) 제조하였다:
Figure PCTKR2021012989-appb-T000002
상기 표 7에서 밑줄로 표시된 굵은 글씨체의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드를 나타낸다.
상기 표 7에서 A001은 공지의 서열번호 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, 그 아래의 A001-01M 내지 A001-021M 및 A001-01L, A001-04L, A001-06L과 A001-10L은 본 발명에 따라 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 예이다.
구체적으로, 상기 표의 A001-01M 내지 A001-021M 으로 나타낸 올리고뉴클레오타이드의 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸(MOE) 변형된 뉴클레오타이드이고, 표의 A001-01L, A001-04L, A001-06L과 A001-10L 로 나타낸 올리고뉴클레오타이드의 변형된 뉴클레오타이드는 잠긴핵산(LNA) 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드이다. 상기 표의 올리고뉴클레오타이드에서 뉴클레오사이드 사이의 결합은, 당해 뉴클레오사이드가 변형된 것인지 여부와 상관없이, 포스포티오에이트 결합이다.
실험예 5. A549 및 PANC -1 세포주에 대한 ASO 20nM 처리 결과
형질주입 시약이 있는 조건에서 ASO를 20nM 농도로 세포주 (A549, PANC-1)에 처리한 후, TGF-β2의 mRNA 레벨의 변화를 후보물질 별로 비교하고, 본 발명의 ASO의 효능을 A001과 비교하였다.
세포주 A549 (Lung carcinoma)의 배양배지는 RPMI1640+10%FBS+1% Antibiotics 이고, 세포주 PANC-1 (Pancreas Epithelioid carcinoma)의 배양배지는 DMEM+10%FBS+1% Antibiotics 이었다.
6 well plate 에 well 당 2x105 cells / 2 ml 의 세포를 시딩하였다.
형질주입: 세포 시딩 24시간 후 배지를 교체하고(기존 배양액 제거 후, antibiotics를 포함하지 않고, 10% FBS가 포함된 media를 1.8 ml 넣어 줌), 시험할 ASO를 최종 농도의 20배 (400nM)가 되도록 아무것도 첨가되지 않은 plain media에 넣고, 형질주입 시약 (Lipofectamine RNAiMAX)도 7.5 ul/100 ul 농도가 되도록 아무것도 첨가되지 않은 plain media에 넣었다. ASO가 들어간 혼합물과 형질주입 시약이 들어간 혼합물을 1:1로 섞어 5분간 상온에서 반응시켰다(이 때 ASO의 농도는 200 nM이 됨). 반응시킨 ASO 및 형질주입 시약 혼합물의 최종 농도가 20nM이 되도록, 배지를 교체한 세포주에 200 ul씩 분주한 후 24시간 동안 배양하였다 (CO2 incubator (37℃, CO2 5.0%))
TGF-β2 mRNA 정량 분석:
- RNA 추출 및 정량 : 형질주입 24시간 후에 배양액을 모두 제거한 후, RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 추출 후 micro-volume plate (Take 3, Biotek)와 multi plate reader (Synergy H1, Biotek)를 이용하여 흡광측정법으로 RNA 정량하였다.
- cDNA synthesis : 추출한 RNA 2 ug으로 cDNA 합성 kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622)를 이용하여 cDNA 합성하였다. 합성 조건은 manufacturer’s instruction에 따라 진행하고, PCR 완료 후 cDNA를 20 ng/ul가 되도록 증류수(DW)로 희석하였다.
- TGF-β2 mRNA 정량 분석을 위한 real-time PCR 진행 : Reference gene으로 human SRSF9 을 사용하여, 상기 표 4 내지 6과 동일한 조성 및 조건으로 PCR 혼합물을 제조하여, PCR을 진행하였다.
- Human TGF-β2의 mRNA 발현 억제율(inhibition rate, %)을 비처리 세포( untreated cell: 세포주에 ASO없이 형질주입 시약만 처리)에 대한 상대적인 비율로 계산하여 결과를 확인하였다.
도 1은 A549를 ASO 20nM (형질주입 시약과 함께) 처리 시 Human TGF-β2 mRNA 레벨 변화를 확인한 것이다.
도 2는 PANC-1을 ASO 20nM (형질주입 시약과 함께) 처리 시 human TGF-β2 mRNA 억제 비율을 나타낸 것이다.
실험 결과는 하기 표 8과 같다:
Figure PCTKR2021012989-appb-T000003
실험예 6. A549, PANC -1 세포주에 ASO를 5 nM (w/ 형질주입 시약) 처리 후 human TGF - β2 mRNA 레벨 변화 확인
실시예 5의 실험 결과를 토대로 하여 효능이 상대적으로 좋은 ASO를 선별하고, 형질주입 시약이 있는 조건에서 ASO 5nM 농도로 세포주(A549, PANC-1)를 처리한 후, TGF-β2의 mRNA 레벨의 변화를 ASO 별로 비교히여, ASO의 효능을 공지의 A001 ASO와 비교하였다.
세포주 A549 (Lung carcinoma)는 배양배지 RPMI1640+10%FBS+1% Antibiotics를 사용하고, 세포주 PANC-1(Pancreas Epithelioid carcinoma)는 배양배지 DMEM+10%FBS+1% Antibiotics를 사용하였다.
6 well plate 에 well 당 2x105 cells / 2 ml 로 세포를 시딩하였다.
형질주입:
- 세포 시딩 24시간 후 배지를 교체하고(기존 배양액 제거 후, antibiotics를 포함하지 않고, 10% FBS가 포함된 배지를 1.8 ml 넣어 줌), 시험할 ASO를 최종 농도의 20배(100nM)가 되도록 아무것도 첨가되지 않은 plain media에 넣고, 형질주입 시약(Lipofectamine RNAiMAX)도 7.5 ul/100 ul 농도가 되도록 아무것도 첨가되지 않은 plain media에 넣었다.
- ASO가 들어간 혼합물과 형질주입 시약이 들어간 혼합물을 1:1로 섞어 5분간 상온에서 반응시켰다(이 때 ASO의 농도는 50 nM이 됨).
- 반응시킨 ASO 및 형질주입 시약 혼합물의 최종 농도가 5 nM이 되도록, 배지를 교체한 세포주에 200 ul씩 분주한 후 24시간 동안 배양하였다(CO2 incubator (37℃, CO2 5.0%))
TGF-β2 mRNA 정량 분석:
- RNA 추출 및 정량 : 형질주입 24시간 후에 배양액을 모두 제거한 후, RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 추출 후 micro-volume plate (Take 3, Biotek)와 multi plate reader (Synergy H1, Biotek)를 이용하여 흡광측정법으로 RNA를 정량하였다.
- cDNA synthesis : 추출한 RNA 2 ug으로 cDNA 합성 kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 조건은 manufacturer’s instruction에 따라 진행하고, PCR 완료 후 cDNA를 20 ng/ul가 되도록 증류수(DW)로 희석하였다.
- TGF-β2 mRNA 정량 분석을 위한 real-time PCR 진행 : Reference gene으로 human SRSF9 을 사용하였다. 상기 표 4 내지 6과 동일한 조성 및 조건으로 PCR 혼합물을 제조하여, PCR을 진행하였다.
- Human TGF-β2의 mRNA 발현 억제율 (inhibition rate, %)을 untreated cell (세포주에 ASO없이 형질주입 시약만 처리)에 대한 상대적인 비율로 계산하여 결과를 확인하였다.
도 3은 A549를 ASO 5nM 로 처리하여 TGF-β2 mRNA 발현 변화를 확인한 그래프이다.
도 4는 PANC-1을 ASO 5nM 로 처리하여 TGF-β2 mRNA 발현 변화를 확인한 그래프이다.
실험 결과는 하기 표 9와 같다:
Figure PCTKR2021012989-appb-T000004
실험예 7. A549, PANC -1 세포주에 ASO를 1 uM (free uptake) 처리 후 human TGF-β2 mRNA 레벨 변화 확인
실험예 5 및 6의 실험 결과를 토대로 효능이 상대적으로 좋은 ASO를 선별하고, 형질주입 시약이 없는 조건(free uptake)에서 ASO 1 uM 농도로 세포주(A549, PANC-1)를 처리한 후, TGF-β2의 mRNA 레벨의 변화를 후보물질 별로 비교하였다.
실험방법:
세포주 A549 (Lung carcinoma)는 배양배지 RPMI1640+10%FBS+1% Antibiotics를 사용하고, 세포주 Panc-1 (Pancreas Epithelioid carcinoma)는 배양배지 DMEM+10%FBS+1% Antibiotics를 사용하였다.
2x105 cells / 1.8 ml / well in 6-well plate의 세포를 시딩하였다.
형질주입:
- 세포 시딩 후 24시간 배양하였다.
- ASO를 최종 처리할 농도의 10배 (10 uM) 농도가 되도록 10% FBS가 포함된 배지에 넣었다.
- ASO가 들어간 혼합물을 세포가 시딩된 plate에 최종 농도가 1 uM이 되도록 200 ul씩 분주한 후, 24시간 동안 배양하였다(CO2 incubator (37℃, CO2 5.0%)).
TGF-β2 mRNA 정량 분석:
- RNA 추출 및 정량 : 형질주입 24시간 후에 배양액을 모두 제거한 후, RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 추출 후 micro-volume plate (Take 3, Biotek)와 multi plate reader (Synergy H1, Biotek)를 이용하여 흡광측정법으로 RNA를 정량하였다.
- cDNA synthesis : 추출한 RNA 2 ug으로 cDNA 합성 kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 조건은 manufacturer’s instruction에 따라 진행하고, PCR 완료 후 cDNA를 20 ng/ul가 되도록 증류수(DW)로 희석하였다.
- TGF-β2 mRNA 정량 분석을 위한 real-time PCR 진행 : Reference gene으로 human SRSF9 을 사용하고, 상기 표 4 내지 6과 동일한 조성 및 조건으로 PCR 혼합물을 제조하여, PCR을 진행하였다.
- Human TGF-β2의 mRNA 발현 억제율 (inhibition rate, %)을 비처리된 세포에 대한 상대적인 비율로 계산하여 결과를 확인하고, 하기 표 10 및 도 5와 도 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2021012989-appb-T000005
실험예 8. 형질주입 시약이 있는 조건에서 ASO를 농도별로 처리 후, human TGF-β2 RNA 및 protein 분비의 용량의존적 억제 확인
형질주입 시약이 있는 조건에서 ASO를 농도별 (5-160 nM)로 세포주 (A549)에 처리한 후, TGF-β2의 mRNA 레벨과 분비 레벨의 변화를 확인하였다.
실험방법:
세포주 A549 (Lung carcinoma)는 배양배지 RPMI1640+10%FBS+1% Antibiotics를 사용하였다.
2x105 cells / 2 ml / well in 6-well plate로 세포를 시딩하였다.
형질주입:
- 세포 시딩 24시간 후. 배지를 교체하였다(기존 배양액 제거 후, 1.8 ml의 antibiotics를 포함하지 않고, 10% FBS가 포함된 배지를 넣어 줌). 시험할 ASO를 처리할 농도의 20배가 되도록 (50-1600nM) 아무것도 첨가되지 않은 plain media로 연속 희석하였다(serial dilution).
- 형질주입 시약 (Lipofectamine RNAiMAX)도 7.5 ul/100 ul 농도가 되도록 아무것도 첨가되지 않은 plain media에 넣었다.
- ASO가 들어간 혼합물과 형질주입 시약이 들어간 혼합물을 1:1로 섞어 5분간 상온에서 반응시켰다(이 때 ASO의 농도는 처리할 농도의 10배가 됨).
- 반응시킨 ASO 및 형질주입 시약 혼합물의 최종 농도가 되도록, 배지를 교체한 세포주에 200 ul씩 분주한 후 48시간 동안 배양하였다. (CO2 incubator (37℃, CO2 5.0%))
TGF-β2 mRNA 정량 분석:
- RNA 추출 및 정량 : 형질주입 48시간 후에 배양액을 따로 모아 둔 후, RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 추출 후 micro-volume plate (Take 3, Biotek)와 multi plate reader (Synergy H1, Biotek)를 이용하여 흡광측정법으로 RNA를 정량하였다.
- cDNA synthesis : 추출한 RNA 2ug으로 cDNA 합성 kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 조건은 manufacturer’s instruction에 따라 진행하고, PCR 완료 후 cDNA를 20 ng/ul가 되도록 증류수(DW)로 희석하였다.
- TGF-β2 mRNA 정량 분석을 위한 real-time PCR 진행 : Reference gene으로 human SRSF9 을 사용하였다. 상기 표 4 내지 6과 동일한 조성 및 조건으로 PCR 혼합물을 제조하여, PCR을 진행하였다.
TGF-β2 단백질 발현 정량 분석 (ELISA)
- 따로 모아둔 배양약을 원심 분리하여 상층액만 회수하여 TGF-β2 ELISA kit (R&D)로 manufacturer’s instruction에 따라 정량 분석을 진행하였다.
실험 결과를 표 11 및 도 7에 나타내었다.
Figure PCTKR2021012989-appb-T000006
A001-01M에 의하여 human TGF-β2 mRNA 레벨이 감소하면서 단백질 분비 레벨이 감소함을 확인하였다.
실험예 9. ASO를 인간 혈장에 스파이킹한 후 안정성 측정
실험방법:
인간의 혈장에 ASO의 최종 농도가 5 uM이 되도록 스파이킹(spiking)하고, 37℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 시간별(0, 1, 2, 4, 18시간)로 ASO 스파이킹한 후혈장을 샘플링하여 잔존하는 ASO의 양을 HPLC로 분석하였다. 0시간에 검출된 ASO의 양을 기준으로 남아있는 ASO 양의 비율을 계산하였다.
실험 결과를 도 8에 도시하였다. 포스포디에스테르 뉴클레오타이드인 경우, 4시간 이후에는 ASO가 검출되지 아니하였다. 포스포티오에이트 뉴클레오타이드인 경우, 18시간까지도 약 50%가 남아있는 것으로 검출되었다. 따라서, 포스포티오에이트가 백본인 경우에, 혈장 중에서의 안정성이 향상된다는 것을 확인할 수 있었다.
실험방법:
인간의 혈장에 ASO의 최종 농도가 5uM이 되도록 스파이킹하여, 37℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 시간별로(0, 4, 24시간) ASO 스파이킹한 플라스마를 샘플링하여 남아있는 ASO의 양을 HPLC로 분석하였다.
0시간에 검출된 ASO의 양을 기준으로 남아있는 ASO 양의 비율을 계산하였다.
실험 결과
실험 결과를 도 9에 도시하였다.
본 발명에 따라 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 ASO는 24시간까지 50% 이상을 유지하였다.
특히, A001-04M를 제외한 다른 대부분의 ASO들은 24시간 후에도 검출되는 ASO의 양이 약 80% 이상이었다.
따라서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드는 안정성이 개선됨을 알 수 있다.
실험예 10. 4종 암세포주에 ASO를 40 nM (w/ 형질주입 시약) 처리 후 mRNA 레벨, 분비 레벨 변화 확인
실험내용 : 형질주입 시약이 있는 조건에서 ASO를 40 nM 농도로 하기 표 12의 4종 세포주 (A549, Panc-1, MDA-MB-231, Hs294T)에 처리한 후, TGF-β2의 mRNA 레벨 및 단백질 분비 레벨의 변화를 확인하였다.
Figure PCTKR2021012989-appb-T000007
실험방법:
- 2x105 cells / 2 ml / well in 6-well plate로 세포를 시딩하였다.
형질주입:
- 세포 시딩 24시간 후 배지를 교체하고(기존 배양액 제거 후, 1.8 ml의 antibiotics를 포함하지 않고, 10% FBS가 포함된 media를 넣어 줌), 시험할 ASO를 처리할 농도의 20배가 되도록 (800 nM) 아무것도 첨가되지 않은 plain media로 연속 희석하였다.
- 형질주입 시약 (Lipofectamine RNAiMAX)도 7.8 ul/100 ul 농도가 되도록 아무것도 첨가되지 않은 plain media에 넣었다.
- ASO가 들어간 혼합물 및 형질주입 시약이 들어간 혼합물을 1:1로 섞어 5분간 상온에서 반응시켰다.(이 때 ASO의 농도는 처리할 농도의 10배가 됨)
- 반응시킨 ASO 및 형질주입 시약 혼합물의 최종 농도가 되도록, 배지를 교체한 세포주에 200 ul씩 분주한 후 48시간 동안 배양하였다. (CO2 incubator (37℃, CO2 5.0%))
TGF-β2 mRNA 정량 분석:
- RNA 추출 및 정량 : 형질주입 48시간 후에 배양액을 따로 모아 둔 후, RNA preparation kit (Rneasy Plus Mini Kit, Qiagen, Cat# 74136)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 추출 후, micro-volume plate (Take 3, Biotek)와 multi plate reader (Synergy H1, Biotek)를 이용하여 흡광측정법으로 RNA를 정량하였다.
- cDNA synthesis : 추출한 RNA 2ug으로 cDNA 합성 kit (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific, K1622)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 조건은 manufacturer’s instruction에 따라 진행하였다. PCR 완료 후 cDNA를 20 ng/ul가 되도록 증류수(DW)로 희석하였다.
- TGF-β2 mRNA 정량 분석을 위한 real-time PCR 진행 : Reference gene으로 human SRSF9 을 사용하였다. 상기 표 4 내지 6과 동일한 조성 및 조건으로 PCR 혼합물을 제조하여, PCR을 진행하였다.
TGF-β2 단백질 발현 정량 분석 (ELISA):
- 따로 모아둔 배양약을 원심 분리하여 상층액만 회수하여 TGF-β2 ELISA kit (R&D)로 manufacturer’s instruction에 따라 정량 분석을 진행하였다.
도 10은 4종 암종 (Breast cancer, Pancreatic cancer, Lung cancer, Melanoma) 세포주별 TGF-β2 mRNA 발현 레벨을 비교한 것이다.
도 11은 4종 암종 (Lung adenocarcinoma (A549), Pancreatic cancer (Panc-1), Breast cancer (MDA-MB-231), Melanoma (Hs294T))에 ASO 처리 후 human TGF-β2 mRNA 레벨 변화를 나타낸 것이다.
실험 결과는 하기 표 13과 같다:
Figure PCTKR2021012989-appb-T000008
실험 결과, 세포주를 4개에 대하여 Human TGF-b2 mRNA 레벨이 대조군에 비하여 크게 감소되었다.
실험예 11. Lung cancer (A549) 제노그라프트 마우스 모델에서 A001-01M의 항암 효능 평가
A549 xenograft model:
Mouse : Balb/c nude mouse, 수컷 (5 주령), 6마리/군
마우스 입고 후, 일주일 간 순화시키고, 군을 분리(day 0)하기 13일 전에 종양 세포(A549)를 이식하였다.
종양 세포 이식 후 13일째에 군을 분리하였다. 종양 크기는 약 80-100mm3 이었다.
처리: 총 5회 (day 0, 2, 4, 7, 9) 피하 주사(s.c.) 또는 복강내 주사(i.p.)로 15 mg/kg, 10 ml/kg 용량으로 투여하였다.
모니터링 : 주2회, 체중 및 종양 부피를 측정하였다.
실험 스케줄은 다음과 같다:
Figure PCTKR2021012989-appb-I000006
군 정보는 하기 표 14와 같다:
Figure PCTKR2021012989-appb-T000009
체중 측정 결과는 하기 표 15 및 도 12와 같다:
Figure PCTKR2021012989-appb-T000010
종양 부피 측정 결과는 하기 표 16 및 도 13과 같다:
Figure PCTKR2021012989-appb-T000011
실험 결과, 본 발명에 따른 ASO(A001-01M) 투여 시 종양 성장이 공지의 ASO(A001)에 비하여 크게 억제됨을 확인할 수 있었다(도 14 참조).
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 TGF-β의 발현과 관련있는 질병, 예를 들어, 악성 종양, 양성 종양, 면역질환, 섬유증, 안과질환 등을 치료하기 위한 의약 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Autotelic Bio Inc.
<120> Antisense Oligonucleotide
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<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antisense Oligonucleotide
<400> 1
cggcatgtct attttgta 18

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서,
    상기 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드가 변형된 뉴클레오타이드이며,
    여기에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸(MOE) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(F) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸(O-Me) 변형된 뉴클레오타이드, 잠긴핵산(LNA: locked nucleic acid) 변형된 뉴클레오타이드, 에틸렌 가교 핵산(ENA: ethylene-bridged nucleic acid) 변형된 뉴클레오타이드, 제한된 에틸(cET: (R/S)-constrained ethyl) 변형된 뉴클레오타이드 및 폴리알킬렌 옥사이드 변형된 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 올리고뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 3'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드 및 3'-단부의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 첫번째 내지 n번째 뉴클레오타이드 또는 상기 올리고뉴클레오타이드의 3'-단부의 첫번째 내지 m번째 뉴클레오타이드가 상기 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드 (여기에서 n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 9 중 어느 하나의 정수이다).
  5. 제3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 첫번째 내지 n번째 뉴클레오타이드 및 상기 올리고뉴클레오타이드의 3'-단부의 첫번째 내지 m번째 뉴클레오타이드가 상기 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 5'-단부의 (n+1)번째 뉴클레오타이드 및 3'-단부의 (m+1)번째 뉴클레오타이드 사이에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 더 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  7. 하기 표 1의 1번 내지 25번으로 나타낸 서열번호 1의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서,
    하기 표 1에서 밑줄로 표시된 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드이며,
    여기에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸(MOE) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(F) 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸(O-Me) 변형된 뉴클레오타이드, 잠긴핵산(LNA: locked nucleic acid) 변형된 뉴클레오타이드, 에틸렌 가교 핵산(ENA: ethylene-bridged nucleic acid) 변형된 뉴클레오타이드, 제한된 에틸(cET: (R/S)-constrained ethyl) 변형된 뉴클레오타이드 및 폴리알킬렌 옥사이드 변형된 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 올리고뉴클레오타이드:
    [표 1]
    Figure PCTKR2021012989-appb-I000007
  8. 제7항에 있어서,
    표 1의 1번 내지 21번으로 나타낸 올리고뉴클레오타이드의 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸(MOE) 변형된 뉴클레오타이드이고,
    표 1의 22번 내지 25번으로 나타낸 올리고뉴클레오타이드의 변형된 뉴클레오타이드는 잠긴핵산(LNA) 변형된 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이웃한 뉴클레오사이드 사이의 결합은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포티오에이트 결합인 올리고뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, TGF-β2 단백질의 과발현과 관련있는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 악성 종양, 양성 종양, 면역질환, 섬유증 또는 안과질환을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물.
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