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WO2021241728A1 - 抗ウイルス剤 - Google Patents

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WO2021241728A1
WO2021241728A1 PCT/JP2021/020382 JP2021020382W WO2021241728A1 WO 2021241728 A1 WO2021241728 A1 WO 2021241728A1 JP 2021020382 W JP2021020382 W JP 2021020382W WO 2021241728 A1 WO2021241728 A1 WO 2021241728A1
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WO
WIPO (PCT)
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strain
lactobacillus
antiviral
receipt number
number nite
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/020382
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English (en)
French (fr)
Inventor
春樹 北澤
久 麻生
和香子 大坪
Original Assignee
国立大学法人東北大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP21813425.2A priority patent/EP4159839A4/en
Priority to US17/925,333 priority patent/US20230263845A1/en
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an antiviral agent containing antiviral probiotics (preferably immunobiotics [that is, probiotics having a mucosal immunomodulatory function such as intestinal mucosa] as an active ingredient].
  • antiviral probiotics preferably immunobiotics [that is, probiotics having a mucosal immunomodulatory function such as intestinal mucosa] as an active ingredient].
  • Probiotics are living microorganisms that act on the normal bacterial flora in the body of the host mammal (especially in the intestinal tract) and improve the balance to benefit the body of the mammal.
  • Probiotics induce the production of bactericidal substances, competitive intake of nutritional components, competition of attachment sites, promotion / suppression of metabolic enzyme activity, etc. against infectious diseases of viruses and pathogenic bacteria, and have bactericidal effects. It is known to exert an immunostimulatory effect.
  • probiotics include lactic acid bacteria such as Lactobacillus, Biffidobacterium, Enterococcus, Leuconostoc, and Pediococcus.
  • lactic acid bacteria such as Lactobacillus, Biffidobacterium, Enterococcus, Leuconostoc, and Pediococcus.
  • an immunostimulatory composition containing a cytoplasmic fraction of a lactic acid bacterium cell or a cytoplasmic fraction has been reported (Patent Document 1).
  • Coagulans has an interferon (IFN) - ⁇ and IFN- ⁇ expression enhancing action and a natural killer (NK) cell activating action.
  • IFN interferon
  • NK natural killer
  • lactic acid bacteria such as Bacillus coagulans have an antiviral effect against infectious diseases of sensation virus and influenza virus
  • lactic acid bacteria such as Lactobacillus plantarum, Lactobacillus ramnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei, and Lactobacillus gasseri can be used to prevent or treat virus infection. It has been reported that it can be used (Patent Document 4). Further, it has been reported that the combined use of Labre bacterium and Enterococcus faecalis exerts an excellent preventive effect against influenza virus infectious diseases (Patent Document 5). However, no probiotics that effectively exert antiviral effects in complex infections of viruses and pathogenic bacteria have been known so far.
  • An object of the present invention is to provide an antiviral agent containing probiotics that effectively exert an antiviral effect even in a complex infection of a virus and a pathogenic bacterium as an active ingredient.
  • the present inventors are continuing diligent research to solve the above problems.
  • two kinds of factors IFN- ⁇ and Mx1 were identified as an index for evaluating the antiviral property of probiotics.
  • the expression levels of the above two types of factors were used as indicators to show antiviral properties.
  • a genus bacterial strain was selected.
  • the selected antiviral Lactobacillus bacterial strain has an effect of enhancing the expression of antiviral factors and an effect of reducing the expression of down-regulatory factors of antiviral factors, and also in the combined infection of viruses and pathogenic bacteria.
  • a specific Lactobacillus bacterial strain exhibiting wakame assimilation has a 16S rRNA gene having the same nucleotide sequence as the selected antiviral Lactobacillus bacterial strain, and has an effect of enhancing the expression of antiviral factors. Confirmed to have. Furthermore, it is a species different from Lactobacillus salivarius and has at least 90% identity with the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of Lactobacillus salivalius (that is, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) that exerted an antiviral effect. It was confirmed that the Lactobacillus plantarum (also referred to as "Lactiplantibacillus plantarum”) strain having the 16S rRNA gene also has an antiviral effect. The present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention is as follows. [1] Expression of a 16S rRNA gene having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an antiviral factor expression-enhancing effect and / or an antiviral factor down-regulatory factor An antiviral agent comprising one or two or more strains of the genus Lactobacillus having a reducing action. [2] Antiviral factors are interferon (IFN) - ⁇ , IFN- ⁇ , MX1 (MX dynamin like GTPase 1), OAS1 (2'-5'-oligoadenylate synthetase 1), RNaseL, PKR (Protein kinase R).
  • IFN interferon
  • MX1 MX dynamin like GTPase 1
  • OAS1 (2'-5'-oligoadenylate synthetase 1
  • RNaseL RNaseL
  • PKR Protein kinase R
  • antiviral factors selected from RIG-I Retinoic acid inducible gene-I
  • the down-regulatory factor of the antiviral factor is selected from A20 and Toll-interacting protein.
  • the antiviral agent according to the above [1] which is a downward control factor of the antiviral factor of 1 or 2.
  • the lactobacillus strain has an action of enhancing the expression of one or more receptors selected from TLR (Toll-like receptor) 2, TLR4, and NOD2 (Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 2).
  • TLR Toll-like receptor
  • NOD2 Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 2
  • Lactobacillus bacterium strain is deposited as Receipt No. NITE ABP-03218; Lactobacillus salivalius strain deposited as Receipt No. NITE ABP-03219; Deposited as Receipt No. NITE ABP-03221.
  • Lactobacillus salivalius strain Lactobacillus plantaram strain deposited under receipt number NITE ABP-03474; Lactobacillus plantalum strain deposited under receipt number NITE ABP-03467; deposited as receipt number NITE ABP-03468 Lactobacillus plantalum strains; Lactobacillus plantalum strains deposited as receipt number NITE ABP-03466; Lactobacillus plantalum strains deposited as receipt number NITE ABP-03471; deposits as receipt number NITE ABP-03469 Lactobacillus plantarum strains deposited; Lactobacillus plantaram strains deposited as receipt number NITE ABP-03470; Lactobacillus plantaram strains deposited as receipt number NITE ABP-03472; and receipt number NITE ABP-
  • the antiviral agent according to any one of the above [1] to [4], which is one or more selected from the Lactobacillus plantarum strain deposited as 03473; [6]
  • One or two or more of the lactobacillus bacterium strains having an expression-reducing effect (hereinafter, may be referred to as "the lactobacillus genus bacterial strain") are infected with a virus (preferably a virus infection in a combined infection of a virus and a pathogenic bacterium).
  • Methods of preventing and / or treating a viral infection including the step of administering to a subject (patient) in need of prevention and / or treatment of the disease; One or more Lactobacillus strains for use as antiviral agents; One or more Lactobacillus strains for use in anti-virus; or one or more Lactobacillus strains for use in the prevention and / or treatment of viral infections; , Use of one or more Lactobacillus strains to produce antiviral agents; Use of one or more Lactobacillus bacterial strains to produce prophylactic and / or therapeutic agents for viral infections; Can be mentioned.
  • the Lactobacillus bacterial strain has an effect of enhancing the expression of antiviral factors and an effect of reducing the expression of down-regulatory factors of antiviral factors, and effectively exerts an antiviral effect even in a complex infection of a virus and a pathogenic bacterium. Demonstrate.
  • the lactobacillus bacterium strain is a bacterial strain (that is, probiotics) that coexists in the living body (particularly, in the intestinal tract) of the host mammal, unlike vaccines and antibiotics, it has side effects. It is possible to effectively prevent / improve (treat) viral infections (preferably viral infections in complex infections of viruses and pathogenic bacteria) in humans and non-human mammals (particularly domestic animals) with little occurrence. ..
  • the Lactobacillus bacterium strain has wakame assimilation property
  • the Lactobacillus genus bacterial strain preferably antiviral immunobiotics
  • wakame (prebiotics) immunophores having wakame assimilation. Since synbiotics promote the growth of the bacterial strain, the antiviral effect of the Lactobacillus bacterial strain can be more effectively exerted.
  • FIG. 7A-C show the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 35” in the figure) before stimulation with PolyI: C for 6 hours, 3 hours, and 12 hours, respectively. It is a figure which shows the result of having analyzed the A20 expression level (FIG. 7A) and the Tollip expression level (FIGS. 7B and C) in the PIE cell line stimulated by # 58 "). “**” and “***” in the figure are statistically significantly different from the results of stimulation with PolyI: C alone (“Poly (I: C) +” in the figure). (P ⁇ 0.01 and p ⁇ 0.001).
  • FIG. 7A shows the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 35” in the figure) before stimulation with PolyI: C for 6 hours, 3 hours, and 12 hours, respectively.
  • FIG. 7A shows the result of having analyzed the A20 expression level (FIG. 7A) and the Tollip expression level (FIGS. 7B and C
  • FIG. 8A shows that the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) is stimulated or these prior to incubation with the activated rotavirus solution.
  • 6 is a fluorescent image analyzed by an indirect immunofluorescent antibody method using an anti-rotavirus antibody for a PIE cell line that was not stimulated by the strain (“control” in the figure).
  • FIG. 8B is a diagram showing the results of analysis of the proportion of rotavirus-infected cells based on the results of FIG. 8A. The proportion of rotavirus-infected cells is shown as a relative value when the control is 100.
  • FIG. 10A is stimulated with the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) before incubating with the activated rotavirus solution for 3 or 6 hours. It is a figure which shows the result of having analyzed the A20 expression level for the PIE cell line which did or did not stimulate with these strains (the "control" in the figure).
  • FIG. 10A is stimulated with the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) before incubating with the activated rotavirus solution for 3 or 6 hours. It is a figure which shows the result of having analyzed the A20 expression level for the PIE cell line which did or did not stimulate with these strains (the "control" in the figure).
  • FIG. 10A is stimulated with the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) before incubating with the activated rotavirus solution for 3 or 6 hours. It is
  • 10B shows the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) before incubating with the activated rotavirus solution for 3 hours, 6 hours, or 12 hours. It is a figure which shows the result of having analyzed the Tollip expression level of the PIE cell line which was stimulated with (") or was not stimulated by these strains ("control "in the figure). The A20 expression level and the Tollip expression level are shown as relative values when the control is 1. "*”, "**”, and "***” in the figure are statistically significantly different from the control (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ , respectively. 0.001) is shown. FIG.
  • FIG. 11A shows the PIE cell line when incubated with activated rotavirus solution alone (“virus” in the figure) or with activated rotavirus solution and ETEC-containing solution (“virus + ETEC” in the figure). It is a figure which shows the result of having analyzed the ratio of the rotavirus-infected cell of "). The proportion of rotavirus-infected cells is shown as a relative value when "virus + ETEC” is set to 100.
  • FIG. 11B shows whether to stimulate with the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) before incubating with the activated rotavirus solution and the ETEC-containing solution.
  • control For PIE cell lines stimulated with or not stimulated with these strains (“control” in the figure), three antiviral factors (IFN- ⁇ [FIG. 12A], IFN- ⁇ [ It is a figure which shows the result of having analyzed the expression level of FIG. 12B] and Mx1 [FIG. 12C]).
  • the expression levels of these antiviral factors are shown as relative values when the control is 1. "*”, "**”, and "***” in the figure are statistically significantly different from the control (p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ , respectively. 0.001) is shown.
  • 3 types of antiviral factors RNaseL [FIG. 13A], PKR [FIG. 13B], for PIE cell lines stimulated with or not stimulated with these strains (“control” in the figure).
  • RIG-1 [FIG. 13C] it is a figure which shows the result of having analyzed the expression level. The expression levels of these antiviral factors are shown as relative values when the control is 1.
  • FIG. 14A shows the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) prior to incubation with the activated rotavirus solution and the ETEC-containing solution for 3 or 6 hours. It is a figure which shows the result of having analyzed the A20 expression level about the PIE cell line which was stimulated with (") or was not stimulated by these strains ("control "in the figure).
  • FIG. 14A shows the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) prior to incubation with the activated rotavirus solution and the ETEC-containing solution for 3 or 6 hours. It is a figure which shows the result of having analyzed the A20 expression level about the PIE cell line which was stimulated with (") or was not stimulated by these strains ("control "in the figure).
  • FIG. 14A shows the # 35 strain (“# 35” in the figure) or the # 58 strain (“# 58” in the figure) prior to incubation with
  • the antiviral agent of the present invention comprises a 16S rRNA gene having at least 90% identity with the lactobacillus strain (ie, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1) identified for use as "for antivirus".
  • An agent containing one or more hereinafter, “anti-virus” It is sometimes called a “virus agent”).
  • the 16S rRNA gene is usually contained in the genomic DNA of the Lactobacillus bacterial strain.
  • the Lactobacillus bacterial strain which is an antiviral probiotic
  • a feed composition for livestock, a food or drink composition or a pharmaceutical composition examples include health foods (functional foods, nutritional supplements, health supplements, nutritionally fortified foods, nutritionally adjusted foods, supplements, etc.), health functional foods (specified health foods, nutritional functional foods, functional foods). Labeled foods, etc.) can be mentioned.
  • livestock feed and food and drink are preferable.
  • anti-virus means prevention and / or improvement of viral infections by suppressing the growth of the virus, inactivating the virus, reducing the susceptibility to the virus, and the like. It means to (treat).
  • the antiviral factor may be a factor that causes an antiviral effect in mammalian cells (eg, polypeptide, protein [specifically, cytokine, antibody], polynucleotide, saccharide, lipid), for example.
  • the above-mentioned "downregulatory factor of antiviral factor” may be a factor that causes a decrease in the expression of antiviral factor (for example, polypeptide, protein, polynucleotide, saccharide, lipid), and for example, A20 (TNFAIP3 [ Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 3], Tolllip (Toll-interacting protein), RNF125 (Ring Finger Protein 125), DUBA (Deubiquitinase A), CYLD (CYLD Lysine 63 Deubiquitinase), etc. Since the effect has been demonstrated in this example, a downregulator of one or two antiviral factors selected from A20 and Tollip can be preferably exemplified.
  • the Lactobacillus bacterial strain has one or more receptors selected from TLR (Toll-like receptor) 2, TLR4, and NOD2 (Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 2) (hereinafter, "antiviral factor receptor”). It can be characterized by the expression-enhancing action of the body).
  • TLR Toll-like receptor
  • NOD2 Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 2
  • antiviral factors down-regulatory factors of antiviral factors, and antiviral factor receptors (hereinafter, these may be collectively referred to as "antiviral factors, etc.")
  • antiviral factors etc.
  • the expression level of the antiviral factor and the like can be detected by using a method such as Western blotting method, indirect immunofluorescence method, flow cytometry, ELISA method, EIA method, RIA method and the like.
  • transcripts of genes such as antiviral factors can directly detect mRNA of genes such as antiviral factors, and cDNA synthesized using mRNA of genes such as antiviral factors as a template. Can also be detected indirectly.
  • the method for detecting mRNA of a gene such as an antiviral factor include (Reverse Transcription) -PCR method; Northern blotting method, microarray method, ISH method and the like.
  • a method for detecting cDNA synthesized using mRNA of a gene such as an antiviral factor as a template for example, LAMP method, PCR method (for example, real-time PCR method [intercalator method, 5'-nuclease method, cycling probe). Methods], ddPCR method); LCR method; sequencing method using next-generation sequencer; Southern hybridization method using the probe for cDNA detection, microarray method, ISH method; and the like.
  • antiviral factors in the present specification, “enhancement of expression of antiviral factors”, “reduction of expression of downregulatory factors of antiviral factors”, and “enhancement of expression of antiviral factor receptors” are used to refer to mammalian cell lines.
  • the expression level of the antiviral factor was higher, respectively. It means “increased”, “decreased expression level of downregulatory factor of antiviral factor”, and “increased expression level of antiviral factor receptor”.
  • the above-mentioned mammalian cell line is a target virus of the antiviral agent, a substance that induces virus pseudo-infection (for example, Polyinosinic-polycytidylic acid [PolyI]. : C]) and / or may be stimulated with pathogenic bacteria.
  • An arbitrary threshold (cutoff value) can be set as to whether the expression level of the antiviral factor or the like has increased or decreased, and the threshold can be set as, for example, the antivirus in the comparative control.
  • Mean value of expression level of sex factors and the like mean value + standard deviation (SD); mean value + 2SD; mean value + 3SD; median; interquartile range and the like can be mentioned.
  • the thresholds are sensitivity (ratio at which a mammalian cell line cultured in the presence of the Lactobacillus bacterium strain can be correctly determined to be positive) and specificity (mammalian cells cultured in the absence of the Lactobacillus genus bacterial strain).
  • mammalian cell line examples include a human intestinal epithelial cell line (Cac Cincinnati-2), a porcine intestinal epithelial cell line (PIE [Porcine Intestinal Epitheliocyte] cell line), and a bovine intestinal epithelial cell line (BIE [Bovine Intestinal Epitheliocyte] cell line). ) Stocks can be mentioned.
  • the target virus of the antiviral agent is not particularly limited, and is, for example, a DNA virus (double-stranded DNA virus, single-stranded DNA virus, etc.), RNA virus (double-stranded RNA virus, single-stranded RNA (+)).
  • a double-stranded RNA virus is preferable because the effect on the double-stranded RNA model virus has been demonstrated in this example described later.
  • the target virus includes, for example, an influenza virus (single-strand RNA (-)-strand virus), a norovirus (single-strand RNA (+)-strand virus), a rotavirus (double-strand RNA virus), and the like.
  • Rave virus (single-strand RNA (+)-strand virus), measles virus (positive-strand RNA (+)-strand virus), RS virus (positive-strand RNA (-)-strand virus), herpes virus (double-strand DNA virus) ), Hepatitis A virus (positive-strand RNA (+)-strand virus), hepatitis B virus (double-strand DNA virus), hepatitis C virus (positive-strand RNA (+)-strand virus), hepatitis E virus (Single-strand RNA (+)-strand virus), adenovirus (double-strand DNA virus), hoof virus (positive-strand RNA (+)-strand virus), mad dog disease virus (positive-strand RNA (-)-strand virus), Human immunodeficiency virus (single-strand RNA (+)-strand virus), corona virus (single-strand RNA (+)-strand virus), etc.
  • rotavirus can be preferably exemplified.
  • Influenza virus includes type A, type B, type C, triinfluenza virus and various subtypes thereof, and coronavirus includes a general coronavirus that causes colds and a new type of corona.
  • Viruses eg, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus [SARS and SARS-CoV-2], Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus [MERS], COVID-19
  • SARS and SARS-CoV-2 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus [SARS and SARS-CoV-2], Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus [MERS], COVID-19
  • the target of application of the antiviral agent may be a mammal that requires prevention and / or improvement (treatment) of a viral infection, and in this example described later, it is also effective in a complex infection of a virus and a pathogenic bacterium.
  • Preferably exemplify mammals in need to prevent and / or ameliorate (treat) viral infections in a combined viral and pathogenic bacterial infection, as they have been demonstrated to exert antiviral effects. be able to.
  • pathogenic bacteria include, for example, mycoplasma, enterohemorrhagic Escherichia coli (eg, enterohemorrhagic Escherichia coli [EPEC], enterohemorrhagic tissue invading Escherichia coli [EIEC], toxinogenic Escherichia coli [ETEC], intestinal aggregate adhesion.
  • enterohemorrhagic Escherichia coli eg, enterohemorrhagic Escherichia coli [EPEC], enterohemorrhagic tissue invading Escherichia coli [EIEC], toxinogenic Escherichia coli [ETEC], intestinal aggregate adhesion.
  • EAggEC enterohemorrhagic Escherichia coli
  • EHEC enterohemorrhagic Escherichia coli
  • lytic bacteria and the like can be mentioned.
  • the mammals include humans and non-human mammals (eg, monkeys, mice, rats, dogs, cats, livestock [eg, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, deer]) and the like. It can be mentioned, and humans and livestock can be preferably exemplified.
  • non-human mammals eg, monkeys, mice, rats, dogs, cats, livestock [eg, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, deer]
  • livestock eg, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, deer
  • the lactobacillus bacterium strain has a 16S rRNA gene having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and has an antiviral factor expression enhancing action and / or an antiviral factor downward control.
  • it is a bacterial strain of the genus Lactobacillus having an action of reducing the expression of the factor, it may be a living bacterial strain or a dead bacterial strain.
  • the Lactobacillus genus bacterial strain is different from the Lactobacillus salivarius strain or the Lactobacillus plantaram strain, or the Lactobacillus salivalius strain or the Lactobacillus plantalum strain whose effect has been demonstrated in the present Examples described later (for example).
  • Lactobacillus hayakitensis [Lactobacillus hayakitensis], Lactobacillus agilis, Lactobacillus aviarius subsp. , Has a 16S rRNA gene having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and has an effect of enhancing the expression of antiviral factors and / or an effect of reducing the expression of down-regulatory factors of antiviral factors. It also includes Lactobacillus strains.
  • the Lactobacillus genus bacterial strain is specifically deposited as the Lactobacillus salivarius strain (# 35 strain) deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03218; the international deposit receipt number NITE ABP-03219.
  • Lactobacillus salivalius strain (# 58 shares); deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03221; and Lactobacillus salivalius strain (# 131 shares); and deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03220. Lactobacillus salivalius shares (# 71 shares); and Lactobacillus plantaram shares (# 16 shares) deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03474; deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03467.
  • Lactobacillus plantaram stock (# 6VG132 stock); Lactobacillus plantaram stock (# 6ML6109 stock) deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03468; deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03466 Lactobacillus plantaram stock (# 6ML686 shares); Lactobacillus plantaram stock (# 3CS123 shares) deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03471; deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03469 Lactobacillus plantaram stock (# 6VG141 stock); Lactobacillus plantaram stock (# 2CS82 stock) deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03472; deposited as international deposit receipt number NITE ABP-03472 Lactobacillus plantalum strain (# 1FeB18 strain); and Lactobacillus plantalum strain (# 4FeB195 strain) deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03473; Lactobacillus salivarius strain (
  • Lactobacillus salivalius stock (# 1) deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03221 31 shares); Lactobacillus plantarum shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03474 (# 16 shares); Lactobacillus plantaram shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03467 (the # 16 shares) 6VG132 shares); Lactobacillus plantarum shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03468 (# 6ML6109 shares); Lactobacillus plantaram shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03466 (the # #).
  • 6ML686 shares Lactobacillus plantarum shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03471 (# 3CS123 shares); Lactobacillus plantaram shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03469 (the # 3). 6VG141 shares); Lactobacillus plantarum shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03470 (# 2CS82 shares); Lactobacillus plantaram shares deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03472 (the # 2). 1FeB18 strain); and one or more selected from the Lactobacillus plantarum strain (the # 4FeB195 strain) deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03473; can be preferably exemplified.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 means that one or several nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, inserted, added or inverted. , 90% or more of the entire nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is identical.
  • a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are substituted, deleted, inserted, added or inverted is defined as, for example, in the range of 1 to 149, preferably in the range of 1 to 100.
  • the "at least 90% identity” is preferably 91% or more, more preferably 92% or more, still more preferably 93% or more, still more preferably 94% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • the identity is particularly more preferably 96% or more, particularly still more preferably 97% or more, particularly even more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more (about 100%).
  • Nucleotide sequence identity is called BLASTX or BLASTP based on the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993) by Carlin and Altschul.
  • BLASTN Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990
  • the Lactobacillus bacterial strain further includes those having wakame assimilation.
  • “wakame assimilation” means the ability to synthesize substances necessary for Lactobacillus bacteria such as proteins, nucleic acids, sugars, and lipids using wakame as a carbon source or nitrogen source.
  • the antiviral agent is roughly classified into a liquid type and a non-liquid type.
  • the liquid type antiviral agent the culture solution of the Lactobacillus genus bacterial strain is purified, and if necessary, appropriate physiological saline or fluid replacement or pharmaceutical additives are added and filled in ampoules or vials.
  • the non-liquid type antiviral agent is an ampoule, vial, etc. by adding an appropriate freeze-protecting agent (for example, glycerol, dimethylsulfoxide [DMSO], trehalose, dextran) to the liquid type antiviral agent. It can be produced by freezing or freeze-drying after filling in.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the method of applying (administering) the antiviral agent can be either an oral application method (oral administration) or a parenteral application method (parenteral administration), and a parenteral application method (non-oral administration).
  • oral administration include intravenous administration and local administration.
  • the additives include conventional pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, isotonic agents, additives, and coating agents.
  • Solubilizers, lubricants, gliding agents, solubilizing agents, lubricants, flavoring agents, sweeteners, solvents, gelling agents, nutritional agents and the like can be exemplified.
  • Specific examples of such compounding components include water, wakame component, physiological saline, animal fat and oil, vegetable oil, lactose, starch, gelatin, crystalline cellulose, gum, talc, magnesium stearate, hydroxypropyl cellulose, and poly.
  • the antiviral agent contains a wakame component (prebiotic) which is a nutrient source of the Lactobacillus bacterial strain as an additive, and the Lactobacillus is contained.
  • Bacterial strains of the genus preferably antiviral immunobiotics
  • those comprising immunosin biotics by prebiotics can be preferably exemplified.
  • the seaweed component may be a seaweed powder obtained by crushing a dried seaweed product, or a seaweed component extract obtained by further extracting the seaweed powder with water or the like. ..
  • the applicable (administration) amount of the Lactobacillus bacterial strain contained in the antiviral agent varies depending on the sex, age, body weight, physical condition, etc. of the subject (mammal) to be ingested, and therefore cannot be unconditionally specified. It is 10 4 to 10 12 cfu (Colony Forming Unit) per 1 kg of body weight per day, preferably 10 6 to 10 10 cfu. It should be noted that such an amount may be ingested once or may be ingested in several divided doses.
  • the amount of the Lactobacillus genus bacterial strain contained in the livestock feed composition is, for example, 10 4 to 10 12 cfu / g per 1 g of the livestock feed composition. It is preferably 10 6 to 10 10 cfu.
  • Example 1 Search for antiviral factors We searched for factors that can be used as indicators for evaluating the antiviral properties of probiotics.
  • Test cells For the PIE cell line, cells cloned from the small intestine of a primary piglet of a ternary hybrid (LWD; landrace ⁇ large white ⁇ durock) were used.
  • the PIE cell line is a DMEM liquid medium (high glucose, L-glutamine) containing 10% FCS (fetal bovine serum) and 1% streptomycin / penicillin using a 250 mL flask (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen. , Containing sodium pyruvate; manufactured by GIBCO) (hereinafter, simply referred to as "DMEM liquid medium").
  • FCS fetal bovine serum
  • the epithelial buffer was removed and incubated in PBS containing 0.25% trypsin and 0.02% EDTA for 5 minutes at 37 ° C.
  • DMEM liquid medium was added, and the detached cells were collected and then centrifuged (12000 rpm ⁇ 5 minutes) to remove the culture supernatant.
  • DMEM liquid medium was newly added, and the cells were collected. After counting the number of cells, cells were seeded such that 1 ⁇ 10 6 cells per flask. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was removed by suction with an aspirator, and DMEM liquid medium was newly added for culturing.
  • the cells were stored at ⁇ 80 ° C. for each generation using a cell bunker (registered trademark) (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.). In addition, cell culture was performed under the conditions of 5% CO 2 /20% O 2 and 37 ° C.
  • the PIE cell line was stimulated with Poly I: C, which is a double-stranded RNA virus model that induces virus pseudo-infection, and the expression of cytokine-related factors was analyzed. Specifically, the analysis was performed according to the following procedures [1] to [5]. [1] The PIE cell line was inoculated on a 12-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 5 days.
  • RNA concentration and purity were measured with a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • cDNA was synthesized from the obtained total RNA using the Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (manufactured by Takara) according to the protocol attached to the product.
  • cytokine-related factors IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , Mx1, OAS1, RNaseL, PKR, RIG-I, TLR2, TLR3, TLR4, NOD1, NOD2, MCP-1 [Also called CCL2], IL-6, IL-8 [also called CXCL8], IL-12, IL-18, TNF ⁇ , A20, BCL-3, Tollip, IRAK-M, MKP-1, and SIGIRR) and ⁇ .
  • the primer set (sense primer and antisense primer) shown in Table 1 below, Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG with ROX (manufactured by Invitrogen), and ABI PRISM Quantitative PCR analysis using a 7300 real-time PCR system (manufactured by Applied Biosystem) was performed according to the protocol attached to the product.
  • the expression level of various cytokine-related factors by Poly I: C stimulation is the formula (Poly I: C stimulation [expression level of mRNA of various cytokine-related factor genes / expression level of mRNA of ⁇ -actin gene] / Poly I: C unstimulated. [Expression level of mRNA of various cytokine-related factor genes / Expression level of mRNA of ⁇ -actin gene]).
  • the Lactobacillus bacterial strain was selected using the IFN- ⁇ expression level 3 hours after PolyI: C stimulation and the Mx1 expression level 12 hours after PolyI: C stimulation as indicators. I decided to use it.
  • Example 2 Selection of the Lactobacillus bacterial strain using antiviral property as an index
  • the Lactobacillus bacterial strain was selected using the expression levels of two antiviral factors (IFN- ⁇ and Mx1) as indicators.
  • the PIE cell line was stimulated with the prepared 116 kinds of Lactobacillus salivalius strain-containing solution, and then stimulated with Poly I: C to express two kinds of antiviral factors (IFN- ⁇ and Mx1).
  • the Lactobacillus bacterial strain was selected using the level as an index. Specifically, the analysis was performed according to the following procedures [1] to [4]. [1] The PIE cell line was inoculated on a 12-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 3 days.
  • the PIE cell line was similarly cultured in DMEM liquid medium free of the Lactobacillus salivalius strain.
  • the cells were replaced with DMEM liquid medium containing 50 ng / mL Poly I: C (catalog number P9582, manufactured by SIGMA), and cultured for 3 hours and 12 hours. By doing so, Poly I: C stimulation was performed.
  • the IFN- ⁇ expression level and Mx1 expression level stimulated by various lactobacillus salivarius strains are the formulas (before stimulating with Poly I: C, when stimulated with various lactobacillus salivarius strains [IFN- ⁇ gene or Mx1 gene mRNA]. Expression level / ⁇ -actin gene mRNA expression level]) / Based on [IFN- ⁇ gene or Mx1 gene mRNA expression level / ⁇ -actin gene mRNA expression level]) when stimulated with Poly I: C (See the vertical axis in FIG. 2).
  • the # 35 strain is a Lactobacillus salivarius strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and has the following characteristics.
  • the # 35 strain is the NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD) (Address: Kazusa, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818). Kazusakamatari Room 2-5-8 122 [# 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japan]) as international deposit receipt number NITE ABP-03218 on May 19, 2020. It has been deposited internationally.
  • NPMD NITE Patent Microorganisms Depositary
  • A Cell morphology: bacillus, spore formation: (-), motility: (-)
  • B Colony morphology (Observation of colony morphology smeared on MRS agar medium and aerobically cultured at 37 ° C.
  • the # 58 strain is a Lactobacillus salivarius strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and has the following characteristics.
  • # 58 strain was transferred to the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: Room 2-5-8 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818). It has been internationally deposited under the international deposit receipt number NITE ABP-03219 on May 19, 2020.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • Cell morphology bacillus, spore formation: (-), motility: (-)
  • B Colony morphology (Observation of colony morphology smeared on MRS agar medium and aerobically cultured at 37 ° C.
  • Example 3 Evaluation of Immunomodulatory Ability of Lactobacillus Bacterial Strain
  • the PIE cell line was stimulated with only the selected # 35 strain or the # 58 strain, and the immune response of the cells was analyzed.
  • the analysis of the immune response of the cells was performed according to the following procedures [1] to [3].
  • the PIE cell line was inoculated on a 12-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 3 days.
  • the expression levels of various receptors (see FIG. 3) and the expression levels of various antiviral factors (see FIGS. 4 and 5) stimulated by the # 35 strain or the # 58 strain are based on the formula (stimulation of the # 35 strain or the # 58 strain). [Expression level of mRNA of various receptor genes or various antiviral factor genes / Expression level of mRNA of ⁇ -actin gene] / [Various receptor genes or various antiviral factor genes] by unstimulated strain (0 hours) Expression level of mRNA / expression level of ⁇ -actin gene mRNA]).
  • Example 4.2 Evaluation of immunomodulatory ability of the Lactobacillus bacterial strain against a double-stranded RNA model virus 1 For the # 35 and # 58 strains, the # 35 strain or the # 58 strain before stimulating the PIE cell line with Poly I: C to evaluate the immunomodulatory ability against the double-stranded RNA model virus. The expression of antiviral factors was analyzed.
  • A20 / TNFAIP3 is known to be a negative regulator that plays a particularly important role during virus infection, and it has been reported that rotavirus infection is significantly suppressed in cells in which A20 expression is knocked down.
  • Tolllip Toll-interacting protein
  • Tolllip is a negative regulator that interacts with IRAK-1 to inhibit phosphorylation and negatively control the signaling of TLR2 and TLR4, and is responsible for the expression of IFN- ⁇ and IFN- ⁇ .
  • the analysis of the immune response of the cells was performed according to the following procedures [1] to [4].
  • the PIE cell line was inoculated on a 12-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 3 days.
  • PIE cell lines were similarly cultured in DMEM liquid medium free of these strains.
  • Example 4 shows that when the # 35 strain or the # 58 strain is administered to cells infected with double-stranded RNA virus, it is a downregulator of antiviral factors such as A20 and Tollip. It is shown that the expression level of (negative regulator) is reduced and the expression enhancing effect of antiviral factors is exerted.
  • Example 6 Confirmation of the virus infection reducing effect of the Lactobacillus strains Since the # 35 strain and the # 58 strain were shown to enhance the antiviral immune response, these strains have the effect of reducing the virus infection. To confirm that, a rotavirus infection test was performed.
  • Test virus strain The livestock infectious group A rotavirus OSU strain using pigs as a host was distributed by the National Institute of Animal Health, Animal Health Research Division.
  • the rotavirus infection test and the subsequent indirect fluorescent antibody method using the anti-rotavirus antibody were carried out according to the following procedures [1] to [7].
  • the PIE cell line was inoculated on a 96-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / mL, and cultured in DMEM liquid medium for 8 days.
  • the # 35 strain and the # 58 strain were added to the medium so as to have a multiplicity of infection (MOI) per well, respectively, and cultured (stimulated) for 48 hours.
  • MOI multiplicity of infection
  • PIE cell lines were similarly cultured in DMEM liquid medium free of these strains.
  • the cells were washed 3 times with FCS-free DMEM liquid medium, and 100 ⁇ L (1 MOI) of the activated rotavirus solution prepared according to the method described in the above item [Preparation of activated rotavirus solution] was added to each well. Equivalent) was added at a time and incubated for 16 hours under the conditions of 5% CO 2 /20% O 2 and 37 ° C.
  • the activated rotavirus solution was removed, 100 ⁇ L of an 80% acetone solution at 4 ° C. was added to each well, and the cells were incubated at 4 ° C.
  • rotavirus A antibody anti-human RVAWa strain guinea pig serum, distributed by the National Institute of Animal Health, Animal Health Research Division. The primary antibody reaction was carried out. Specifically, rotavirus A antibody was diluted 800-fold with PBS, 50 ⁇ L was dispensed into each well, and then incubated at 37 ° C. for 40 minutes.
  • a secondary antibody reaction was carried out using Alexa488-labeled anti-guinea pig IgG antibody (Cat. Ab150185, manufactured by abcam).
  • such antibody was diluted 400-fold with PBS at 1: 400, 50 ⁇ L was dispensed into each well, and then incubated at 37 ° C. for 40 minutes.
  • 50 ⁇ L of PBS containing 30% glycerin was dispensed into each well, and then a fluorescence signal derived from Alexa488 was emitted using a fluorescence microscope (IX70-FL manufactured by Olympus Corporation). Detected (see FIG. 8A) and calculated the percentage of cells positive for such fluorescence signal, i.e., rotavirus-positive (infected) cells (see FIG. 8B).
  • Example 7 Evaluation of immunomodulatory ability of the Lactobacillus bacterial strain at the time of virus infection 1
  • the PIE cell line was stimulated with the # 35 strain or the # 58 strain and then infected with rotavirus to infect the antivirus. Expression analysis of sex factors was performed.
  • the rotavirus infection test and the subsequent analysis of the expression of antiviral factors were performed according to the following procedures [1] to [4].
  • the PIE cell line was inoculated on a 96-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 5 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 10 days.
  • the # 35 strain and the # 58 strain were added to the medium so as to have 100 MOI per well, and cultured (stimulated) for 48 hours. As a control for unstimulating these strains, PIE cell lines were similarly cultured in DMEM liquid medium free of these strains.
  • Example 8 Evaluation of immunomodulatory ability of the Lactobacillus bacterial strain at the time of virus infection 2
  • the PIE cell line was stimulated with the # 35 strain or the # 58 strain, and then infected with rotavirus to infect the antivirus.
  • the rotavirus infection test and the subsequent analysis of A20 and Tollip expression were performed according to the following procedures [1] to [4].
  • the PIE cell line was inoculated on a 96-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / mL, and cultured in DMEM liquid medium for 8 days.
  • the # 35 strain and the # 58 strain were added to the medium so as to have 100 MOI per well, and cultured (stimulated) for 48 hours. As a control for unstimulating these strains, PIE cell lines were similarly cultured in DMEM liquid medium free of these strains.
  • Example 9 Confirmation of the effect of reducing the combined infection of rotavirus and ETEC by the lactobacillus genus bacterial strain In actual life, not only the infection of the virus alone but also the combined infection with the pathogenic bacterium occurs. Therefore, a complex infection system of rotavirus and entero toxigenic E. coli (ETEC) was constructed. First, a rotavirus infection was established between the infection of rotavirus alone and the combined infection of rotavirus and ETEC. We examined whether there was a difference in efficiency, and then analyzed whether the # 35 strain and the # 58 strain were effective against the combined infection of rotavirus and ETEC.
  • ETEC entero toxigenic E. coli
  • ETEC-containing liquid The ETEC strain (distributed by the National Institute of Animal Health, National Institute of Animal Health) was drawn on an agar medium containing 5% sheep defibered blood and cultured at 37 ° C. for 20 hours. The formed colonies are cultivated, inoculated into 5 mL of tryptone soya broth liquid medium (manufactured by Nippon BD), and left to stand at 37 ° C for 5 to 8 days for ciliary restoration culture. went. Then, the fungus was caught from the mycelial membrane forming part, inoculated into 11 mL of TSB, and cultured with shaking at 37 ° C. for 20 hours.
  • the cells were collected by centrifugation, washed 3 times with PBS, and heat-sterilized at 100 ° C. for 15 minutes. Then, the cells were washed with PBS and suspended in DMEM liquid medium so that the cell concentration was 1.5 ⁇ 10 10 cells / mL to prepare an ETEC-containing solution.
  • the rotavirus / ETEC combined infection test and the subsequent indirect immunofluorescence method using an anti-rotavirus antibody were carried out according to the following procedures [1] to [4].
  • the PIE cell line was inoculated on a 96-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 8 days.
  • the # 35 strain and the # 58 strain were added to the medium so as to have 100 MOI per well, and cultured (stimulated) for 48 hours.
  • PIE cell lines were similarly cultured in DMEM liquid medium free of these strains.
  • the cells were washed 3 times with FCS-free DMEM liquid medium, and the activated rotavirus solution prepared according to the method described in the item [Preparation of activated rotavirus solution] of Example 6 above was added to each well.
  • Example 10 Evaluation of immunomodulatory ability of the Lactobacillus bacterial strain at the time of virus and bacterial infection 1
  • the PIE cell line was stimulated with the # 35 strain or the # 58 strain and then converted into rotavirus. After infection, the expression of antiviral factors and down-regulatory factors of antiviral factors was analyzed.
  • the virus / pathogenic bacterial complex infection test and the subsequent expression analysis of antiviral factors and downregulatory factors of antiviral factors were carried out according to the following procedures [1] to [4].
  • the PIE cell line was inoculated on a 96-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 5 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 10 days.
  • the # 35 strain and the # 58 strain were added to the medium so as to have 100 MOI per well, and cultured (stimulated) for 48 hours. As a control for unstimulating these strains, PIE cell lines were similarly cultured in DMEM liquid medium free of these strains.
  • Example 11 Selection of the Lactobacillus bacterial strain using wakame assimilation as an index Regarding the bacterial metabolites that assimilate seaweed, organic acids produced from algae hydrous carbon activate intestinal microorganisms in humans and marine invertebrates. (See “Front Immunol. 2014 Jan 14; 4: 512.” And “New Phytol. 2010 Oct; 188 (1): 82-97.”). Furthermore, as a prebiotic-related study, there is a report that metabolites obtained by microbial fermentation of red algae exert antioxidative, anticoagulant, and immunomodulatory effects (Reference "Phytomedicine. 2012 Jun 15; 19”. (8-9): 797-803. ").
  • Lactobacillus salivarius strains that grow in a liquid medium containing wakame components
  • Lactobacillus salivalius strain # 131 referred to as “the # 131 strain” in the present specification
  • Lactobacillus salivalius strain # 71 referred to as “the # 71 strain”
  • the # 131 strain is a Lactobacillus salivarius strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, similar to the # 35 strain and the # 58 strain, and is the # 35 strain and the # 58 strain. Has the same characteristics as. That is, the # 131 strain has the following characteristics.
  • the # 131 strain will be placed in 2020 at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818). It has been deposited internationally as the international deposit receipt number NITE ABP-03221 on May 19.
  • A Cell morphology: bacillus, spore formation: (-), motility: (-)
  • B Colony morphology (Observation of colony morphology smeared on MRS agar medium and aerobically cultured at 37 ° C.
  • the # 71 strain is a Lactobacillus salivalius strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, similar to the # 35 strain and the # 58 strain, and is the # 35 strain and the # 58 strain. Has the same characteristics as. That is, the # 71 strain has the following characteristics.
  • the # 71 strain will be placed in 2020 at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818). It was deposited internationally as the international deposit receipt number NITE ABP-03220 on May 19.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • Cell morphology bacillus, spore formation: (-), motility: (-)
  • B Colony morphology (Observation of colony morphology smeared on MRS agar medium and aerobically cultured at 37 ° C.
  • Example 12 Evaluation of the immunomodulatory ability of the # 131 strain against the double-stranded RNA model virus
  • the # 131 strain has an antiviral immune response enhancing effect, similar to the # 35 strain and the # 58 strain.
  • the PIE cell line was stimulated with the # 131 strain, and the expression of antiviral factors was analyzed.
  • the analysis of the immune response of the cells was performed according to the following procedures [1] to [4].
  • the PIE cell line was inoculated on a 12-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured in DMEM liquid medium for 3 days.
  • the [2] present # 131 strain, in addition to the medium so as to be 5.0 ⁇ 10 7 cells / mL per well, were cultured for 48 hours (stimulation).
  • the PIE cell line was similarly cultured in DMEM liquid medium free of the # 131 strain.
  • the IFN- ⁇ expression level stimulated by the # 131 strain is the formula (before stimulating with Poly I: C, the expression level of the mRNA of the IFN- ⁇ gene when stimulated with the # 131 strain. / ⁇ -actin gene mRNA expression level] / Calculated based on [IFN- ⁇ gene mRNA expression level / ⁇ -actin gene mRNA expression level] when stimulated with Poly I: C.
  • the expression levels of various antiviral factors when both the # 131 strain and Poly I: C were unstimulated were also calculated (see FIG. 16).
  • the # 131 strain had the same effect of enhancing the expression of antiviral factors as the # 35 strain and the # 58 strain.
  • the # 35 strain and the # 58 strain, and the # 131 strain and the # 71 strain are both Ligilactobacillus salivalius strains having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It was suggested that the Ligilactobacillus salivarius strain having the 16S rRNA gene consisting of one nucleotide sequence has both antiviral and wakame assimilation properties.
  • Example 13 Confirmation of virus infection reduction effect of this Lactobacillus bacterial strain (2) Even a strain of Lactobacillus spp. That is different from Lactobacillus salivarius has high sequence identity with the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of Lactobacillus salivalius that exerted an antiviral effect (that is, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1). It was analyzed whether or not what had had an antiviral effect. Specifically, nine types of Lactobacillus plantarum strains included in the Lactobacillus spp.
  • the # 16 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52, and is the National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: ⁇ 292). -0818 It was deposited internationally as the international deposit receipt number NITE ABP-03474 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture.
  • the # 16 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • the # 6ML686 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: It has been internationally deposited as the international deposit receipt number NITE ABP-03466 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818.
  • the # 6ML686 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • A Cell morphology: bacillus, spore formation: (-), motility: (-)
  • B Colony morphology (Observation of colony morphology smeared on MRS agar medium and aerobically cultured at 37 ° C.
  • the # 6ML6109 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: It has been internationally deposited as the international deposit receipt number NITE ABP-03468 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • the # 6ML6109 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • the # 6VG132 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: ⁇ 292). -0818 It has been internationally deposited as the international deposit receipt number NITE ABP-03467 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture.
  • the # 6VG132 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • the # 6VG141 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: ⁇ 292). -0818 It has been internationally deposited as the international deposit receipt number NITE ABP-03469 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture.
  • the # 6VG141 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • the # 2 CS82 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: It has been internationally deposited as the international deposit receipt number NITE ABP-03470 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818.
  • the # 2 CS82 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • A Cell morphology: bacillus, spore formation: (-), motility: (-)
  • B Colony morphology (Observation of colony morphology smeared on MRS agar medium and aerobically cultured at 37 ° C.
  • the # 1FeB18 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: It has been internationally deposited as the international deposit receipt number NITE ABP-03472 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • the # 1 FeB18 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • the # 3 CS123 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: ⁇ 292). -0818 It was deposited internationally as the international deposit receipt number NITE ABP-03471 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture.
  • the # 3 CS123 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • the # 4FeB195 strain is a lactobacillus plantarum strain having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 58, and is a National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: It has been internationally deposited as the international deposit receipt number NITE ABP-03473 on April 23, 2021 at Room 2-5-8 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818.
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • the # 4FeB195 strain has the following characteristics, similar to the above-mentioned four types of Lactobacillus salivalius strains (the # 35 strain, the # 58 strain, the # 131 strain, and the # 71 strain).
  • Lactobacillus plantarum strains are all Lactobacillus genus bacterial strains having a 16S rRNA gene having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the rotavirus infection test and subsequent analysis of rotavirus infection level and rotavirus-infected cells were performed according to the following procedures [1] to [7].
  • the PIE1-3 cell line was inoculated on a 96-well plate (manufactured by Sumitomo Bakelite) coated with type I collagen so as to have 3 ⁇ 10 4 cells / mL, and cultured in DMEM liquid medium for 8 days. bottom.
  • the above nine types of Lactobacillus plantarum strains were added to the medium so as to have 1 MOI per well, and cultured (stimulated) for 48 hours.
  • PIE1-3 cell lines were similarly cultured in DMEM liquid medium free of these strains.
  • the cells were washed 3 times with FCS-free DMEM liquid medium, and the activated rotavirus solution prepared according to the method described in the item [Preparation of activated rotavirus solution] of Example 6 above was added to each well. 100 ⁇ L per unit (equivalent to 1 MOI) was added and incubated for 12 hours under 5% CO 2 /20% O 2 and 37 ° C. conditions.
  • RNA concentration and purity were measured with a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • cDNA was synthesized from the obtained total RNA using the Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (manufactured by Takara) according to the protocol attached to the product.
  • the primer set sense primer and antisense primer shown in Table 2 below was used.
  • the expression level of NSP5 by stimulation with the above 9 types of lactobacillus plantarum strains is the formula ([expression level of NSP5 gene mRNA / expression level of ⁇ -actin gene mRNA] by stimulation with the above 9 types of lactobacillus plantarum strains] / above. It was calculated based on [expression level of NSP5 gene mRNA / expression level of ⁇ -actin gene mRNA] by 9 kinds of lactobacillus plantarum strains unstimulated (see FIG. 17).
  • the present invention contributes to the prevention or treatment of viral infections in the livestock industry and human medicine.

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Abstract

本発明は、ウイルス及び病原性細菌の複合感染においても、効果的に抗ウイルス効果を発揮するプロバイオティクスを有効成分として含有する抗ウイルス剤を提供することを課題とする。　配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用及び／又は抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有するラクトバシラス属細菌株を１又は２種以上含有するものを、抗ウイルス剤として用いる。

Description

抗ウイルス剤
　本発明は、抗ウイルス性プロバイオティクス（好ましくは、イムノバイオティクス［すなわち、腸管粘膜などの粘膜免疫調節機能を有するプロバイオティクス］を有効成分として含有する抗ウイルス剤に関する。
　プロバイオティクスは、宿主である哺乳動物の生体内（特に腸管内）の正常細菌叢に作用し、そのバランスを改善することにより哺乳動物の生体に利益をもたらす生きた微生物である。プロバイオティクスは、ウイルスや病原性細菌の感染症に対して、殺菌性物質の産生、栄養成分の競合的摂取、付着部位の競合、代謝酵素活性の促進・抑制等を誘導し、殺菌効果や免疫能賦活効果を発揮することが知られている。
　プロバイオティクスの具体例としては、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ビフィドバクテリウム（Biffidobacterium）属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、リューコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス(Pediococcus)属等の乳酸菌が知られている。具体的には、乳酸菌菌体の細胞質画分や細胞質画分を含有する免疫賦活組成物が報告されている（特許文献１）。また、ラブレ菌（Lactobacillus brevis subsp. coagulans）の凍結乾燥粉末が、インターフェロン（ＩＦＮ）－α及びＩＦＮ－γの発現増強作用や、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化作用を有することが報告されている（特許文献２）。また、バシラス・コアグランス（Bacillus coagulans）等の有胞子性乳酸菌は、感冒ウイルスやインフルエンザウイルスの感染症に対して抗ウイルス効果を有することが報告されている（特許文献３）。また、ラクトバシラス・プランタラム（plantarum）、ラクトバシラス・ラムノーザス（rhamnosus）、ラクトバシラス・ファーメンタム（fermentum）、ラクトバシラス・パラカゼイ（paracasei）、ラクトバシラス・ガセリ（gasseri）等の乳酸菌を、ウイルス感染の予防や治療に使用できることが報告されている（特許文献４）。また、ラブレ菌と、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）とを組み合わせて使用することにより、インフルエンザウイルスの感染症に対して、優れた予防効果を発揮することが報告されている（特許文献５）。しかしながら、ウイルス及び病原性細菌の複合感染において、効果的に抗ウイルス効果を発揮するプロバイオティクスについてはこれまで知られていなかった。
特開平５－２５２９００号公報 特開平６－２０６８２６号公報 特開２００８－１３５４３号公報 特表２００９－５１１４７０号公報 特開２０１２－１３６４５０号公報
　本発明の課題は、ウイルス及び病原性細菌の複合感染においても、効果的に抗ウイルス効果を発揮するプロバイオティクスを有効成分として含有する抗ウイルス剤を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、まず、プロバイオティクスの抗ウイルス性を評価するための指標として、２種類の因子（ＩＦＮ－β及びＭｘ１）を同定した。次いで、ブタ腸管より単離された１１６種類のラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）（「Ligilactobacillus salivarius」ともいう）株の中から、上記２種類の因子の発現レベルを指標とし、抗ウイルス性を示すラクトバシラス属細菌株を選抜した。また、選抜した抗ウイルス性ラクトバシラス属細菌株が、抗ウイルス性因子の発現増強作用、及び抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有し、ウイルス及び病原性細菌の複合感染においても、効果的に抗ウイルス効果を発揮することを見い出した。さらに、ワカメ資化性を示す特定のラクトバシラス属細菌株が、選抜した抗ウイルス性ラクトバシラス属細菌株と同一のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用を有することを確認した。さらに、ラクトバシラス・サリバリウスとは別の種であり、かつ、抗ウイルス効果を発揮したラクトバシラス・サリバリウスの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１のヌクレオチド配列）と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）（「Lactiplantibacillus plantarum」ともいう）株についても、抗ウイルス効果を有することを確認した。本発明は、これら知見に基づき、完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用及び／又は抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有するラクトバシラス属細菌株を、１又は２種以上含むことを特徴とする抗ウイルス剤。
〔２〕抗ウイルス性因子が、インターフェロン（ＩＦＮ）－β、ＩＦＮ－λ、Ｍｘ１（MX dynamin like GTPase 1）、ＯＡＳ１（2'-5'-oligoadenylate synthetase 1）、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（Protein kinase R）、及びＲＩＧ－Ｉ（Retinoic acid inducible gene-I）から選択される１又は２以上の抗ウイルス性因子であり、抗ウイルス性因子の下方制御因子が、Ａ２０及びＴｏｌｌｉｐ（Toll-interacting protein）から選択される１又は２の抗ウイルス性因子の下方制御因子であることを特徴とする上記〔１〕に記載の抗ウイルス剤。
〔３〕ラクトバシラス属細菌株が、ＴＬＲ（Toll-like receptor）２、ＴＬＲ４、及びＮＯＤ２（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 2）から選択される１又は２以上の受容体の発現増強作用を有することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗ウイルス剤。
〔４〕ウイルスが２本鎖ＲＮＡウイルスであることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
〔５〕ラクトバシラス属細菌株が、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１８として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１９として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２１として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７４として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６７として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６８として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６６として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７１として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６９として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７０として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７２として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；及び、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７３として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；から選択される１又は２種以上であることを特徴とする上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
〔６〕ラクトバシラス属細菌株が、ワカメ資化性を示すことを特徴とする上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
〔７〕家畜用飼料又は飲食品であることを特徴とする上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
〔８〕受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１８として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１９として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２１として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７４として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６７として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６８として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６６として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７１として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６９として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７０として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７２として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；又は、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７３として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株。
　また本発明の実施の他の形態として、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ　ｒＤＮＡ）を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用及び／又は抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有するラクトバシラス属細菌株（以下、「本件ラクトバシラス属細菌株」ということがある）の１又は２種以上を、ウイルス感染症（好ましくは、ウイルス及び病原性細菌の複合感染におけるウイルス感染症）の予防及び／又は治療を必要とする対象（患者）に投与するステップを含む、ウイルス感染症を予防及び／又は治療する方法；や、
抗ウイルス剤として使用するための、１又は２種以上の本件ラクトバシラス属細菌株；や、
抗ウイルスにおける使用のための、１又は２種以上の本件ラクトバシラス属細菌株；や、ウイルス感染症の予防及び／又は治療における使用のための、１又は２種以上の本件ラクトバシラス属細菌株；や、
抗ウイルス剤を製造するための、１又は２種以上の本件ラクトバシラス属細菌株の使用；や、
ウイルス感染症の予防及び／又は治療剤を製造するための、１又は２種以上の本件ラクトバシラス属細菌株の使用；
を挙げることができる。
　本件ラクトバシラス属細菌株は、抗ウイルス性因子の発現増強作用や抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有し、ウイルス及び病原性細菌の複合感染においても、効果的に抗ウイルス効果を発揮する。また、本件ラクトバシラス属細菌株は、宿主である哺乳動物の生体内（特に、腸管内）において共生する細菌株（すなわち、プロバイオティクス）であることから、ワクチンや抗生物質とは異なり、副作用がほとんど生じることなく、ヒトや非ヒト哺乳動物（特に、家畜）におけるウイルス感染（好ましくは、ウイルス及び病原性細菌の複合感染におけるウイルス感染症）を効果的に予防・改善（治療）することができる。さらには、本件ラクトバシラス属細菌株がワカメ資化性を有するものである場合、ワカメ資化性の本件ラクトバシラス属細菌株（好ましくは、抗ウイルス性イムノバイオティクス）とワカメ（プレバイオティクス）によるイムノシンバイオティクスは、前記細菌株の増殖を促進するため、本件ラクトバシラス属細菌株による抗ウイルス効果をより効果的に発揮することができる。
Poly I:Cで刺激したブタ腸管上皮細胞株（ＰＩＥ［Porcine Intestinal Epitheliocyte］細胞株）における２種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β［図１Ａ］及びＭｘ１［図１Ｂ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。Poly I:Cによる刺激後の時間を示す。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、０時間の結果に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 Poly I:Cで刺激する前に、１１６種類のラクトバシラス・サリバリウス株で刺激したＰＩＥ細胞株における２種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β［縦軸］及びＭｘ１［横軸］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。図中の各プロット（●）が、各種ラクトバシラス・サリバリウス株を示す。図中の矢印が、本件＃３５株を示し、図中の矢頭が、本件＃５８株を示す。 本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激したＰＩＥ細胞株における５種類の受容体（ＴＬＲ２［図３Ａ］、ＴＬＲ３［図３Ｂ］、ＴＬＲ４［図３Ｃ］、ＮＯＤ１［図３Ｄ］、及びＮＯＤ２［図３Ｅ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、０時間の結果に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激したＰＩＥ細胞株における４種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β［図４Ａ］、ＩＦＮ－λ［図４Ｂ］、Ｍｘ１［図４Ｃ］、及びＯＡＳ１［図４Ｄ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、０時間の結果に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激したＰＩＥ細胞株における３種類の抗ウイルス性因子（ＲＮａｓｅＬ［図５Ａ］、ＰＫＲ［図５Ｂ］、及びＲＩＧ－Ｉ［図５Ｃ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、０時間の結果に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 Poly I:Cで刺激する前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激したＰＩＥ細胞株における５種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β［図６Ａ］、Ｍｘ１［図６Ｂ］、ＯＡＳ１［図６Ｃ］、ＲＮａｓｅＬ［図６Ｄ］、及びＰＫＲ［図６Ｅ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、Poly I:Cのみで刺激した結果（図中の「Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋」）に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 図７Ａ～Ｃは、それぞれ６時間、３時間、及び１２時間、Poly I:Cで刺激する前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激したＰＩＥ細胞株におけるＡ２０発現レベル（図７Ａ）及びＴｏｌｌｉｐ発現レベル（図７Ｂ及びＣ）を解析した結果を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、PolyI:Cのみで刺激した結果（図中の「Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋」）に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 図８Ａは、活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、抗ロタウイルス抗体を用いた間接蛍光抗体法により解析した蛍光画像である。図８Ｂは、図８Ａの結果を基に、ロタウイルス感染細胞の割合を解析した結果を示す図である。ロタウイルス感染細胞の割合は、対照を１００としたときの相対値として示す。図中の「＊」及び「＊＊」は、対照に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）ことを示す。 ３時間、６時間、又は１２時間、活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、４種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β［図９Ａ］、ＩＦＮ－λ［図９Ｂ］、Ｍｘ１［図９Ｃ］、及びＲＮａｓｅＬ［図９Ｄ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。これら抗ウイルス性因子の発現レベルは、対照を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、対照に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 図１０Ａは、３時間又は６時間、活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、Ａ２０発現レベルを解析した結果を示す図である。図１０Ｂは、３時間、６時間、又は１２時間、活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、Ｔｏｌｌｉｐ発現レベルを解析した結果を示す図である。Ａ２０発現レベル及びＴｏｌｌｉｐ発現レベルは、対照を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、対照に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 図１１Ａは、ＰＩＥ細胞株を、活性化ロタウイルス液単独でインキュベートするか（図中の「ウイルス」）、あるいは、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートしたとき（図中の「ウイルス＋ＥＴＥＣ」）のロタウイルス感染細胞の割合を解析した結果を示す図である。ロタウイルス感染細胞の割合は、「ウイルス＋ＥＴＥＣ」を１００としたときの相対値として示す。図１１Ｂは、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、ロタウイルス感染細胞の割合を解析した結果を示す図である。ロタウイルス感染細胞の割合は、対照を１００としたときの相対値として示す。図中の「＊＊＊」は、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．００１）ことを示す。 ３時間、６時間、又は１２時間、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、３種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β［図１２Ａ］、ＩＦＮ－λ［図１２Ｂ］、及びＭｘ１［図１２Ｃ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。これら抗ウイルス性因子の発現レベルは、対照を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、対照に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 ３時間、６時間、又は１２時間、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、３種類の抗ウイルス性因子（ＲＮａｓｅＬ［図１３Ａ］、ＰＫＲ［図１３Ｂ］、及びＲＩＧ－１［図１３Ｃ］）の発現レベルを解析した結果を示す図である。これら抗ウイルス性因子の発現レベルは、対照を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、対照に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 図１４Ａは、３時間又は６時間、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、Ａ２０発現レベルを解析した結果を示す図である。図１４Ｂは、３時間、６時間、又は１２時間、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートする前に、本件＃３５株（図中の「＃３５」）又は本件＃５８株（図中の「＃５８」）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ細胞株について、Ｔｏｌｌｉｐ発現レベルを解析した結果を示す図である。Ａ２０発現レベル及びＴｏｌｌｉｐ発現レベルは、対照を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」、「＊＊」、及び「＊＊＊」は、対照に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、及びｐ＜０．００１）ことを示す。 本件＃１３１株（図中の「＃１３１」）又は本件＃７１株（図中の「＃７１」）を、ワカメ成分調製寒天培地中で培養したときのコロニー数及び培地のｐＨを測定した結果を示す図である。 Poly I:Cで刺激する前に、本件＃１３１株で刺激したＰＩＥ細胞株における抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β）発現レベルを解析した結果（右側のグラフ）を示す図である。図中の「＊」は、Poly I:Cのみで刺激した結果（左側のフラフ）に対して、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。 活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、７種類の本件ラクトバシラス属細菌株（本件＃１６株［図中の「＃１６」］、本件＃６ＶＧ１３２株［図中の「＃６ＶＧ１３２」］、本件＃６ＭＬ６１０９株［図中の「＃６ＭＬ６１０９」］、本件＃６ＭＬ６８６株［図中の「＃６ＭＬ６８６」］、本件＃３ＣＳ１２３株［図中の「＃３ＣＳ１２３」］、本件＃６ＶＧ１４１株［図中の「＃６ＶＧ１４１」］、及び本件＃２ＣＳ８２株［図中の「＃２ＣＳ８２」］）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ１－３細胞株について、ＮＳＰ５発現レベルを解析した結果を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、対照に対して、それぞれ統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）ことを示す。 活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、２種類の本件ラクトバシラス属細菌株（本件＃１ＦｅＢ１８株［図中の「＃１ＦｅＢ１８」］、及び本件＃４ＦｅＢ１９５株［図中の「＃４ＦｅＢ１９５」］）で刺激するか、あるいは、これら株による刺激を行わなかった（図中の「対照」）ＰＩＥ１－３細胞株について、ロタウイルス感染細胞の割合を解析した結果を示す図である。ロタウイルス感染細胞の割合は、対照を１としたときの相対値として示す。図中の「＊」は、対照に対して、統計学的に有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。
　本発明の抗ウイルス剤は、「抗ウイルスのため」という用途に特定された、本件ラクトバシラス属細菌株（すなわち、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用及び／又は抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有するラクトバシラス属細菌株）を１又は２種以上含有する剤（以下、「本件抗ウイルス剤」ということがある）である。ここで、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子は、通常、本件ラクトバシラス属細菌株のゲノムＤＮＡ中に含まれる。
　本件抗ウイルス剤は、抗ウイルス性プロバイオティクスである本件ラクトバシラス属細菌株を、単独で家畜用飼料や、飲食品又は医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（家畜用飼料組成物や、飲食品組成物又は医薬組成物）として使用してもよい。上記飲食品としては、例えば、健康食品（機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、栄養調整食品、サプリメント等）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）を挙げることができる。本件抗ウイルス剤としては、家畜用飼料や飲食品が好ましい。
　本明細書において、「抗ウイルス」とは、ウイルスの増殖を抑制したり、ウイルスを不活化したり、ウイルスに対する感受性を低減したりすること等の作用により、ウイルス感染症を予防及び／又は改善（治療）することを意味する。
　上記抗ウイルス性因子としては、哺乳動物細胞において抗ウイルス作用を引き起こす因子（例えば、ポリペプチド、タンパク質［具体的には、サイトカイン、抗体］、ポリヌクレオチド、糖類、脂質）であればよく、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、Ｍｘ１（MX dynamin like GTPase 1）、ＯＡＳ１（2'-5'-oligoadenylate synthetase 1）、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（Protein kinase R）、ＲＩＧ－Ｉ（Retinoic acid inducible gene-I）、ＩＳＧ１５（IFN stimulated gene 15kDa）、ＭＤＡ５（Melanoma differentiation-associated gene 5）、ＩＰＳ－１（Interferon-β promoter stimulator-1）等を挙げることができ、後述する本実施例においてその効果が実証されているため、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ、及びＲＩＧ－Ｉから選択される１又は２以上の抗ウイルス性因子を好適に例示することができる。
　上記「抗ウイルス性因子の下方制御因子」としては、抗ウイルス性因子の発現低下を引き起こす因子（例えば、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖類、脂質）であればよく、例えば、Ａ２０（ＴＮＦＡＩＰ３［Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 3］ともいう）、Ｔｏｌｌｉｐ（Toll-interacting protein）、ＲＮＦ１２５（Ring Finger Protein 125）、ＤＵＢＡ（Deubiquitinase A）、ＣＹＬＤ（CYLD Lysine 63 Deubiquitinase）等を挙げることができ、後述する本実施例においてその効果が実証されているため、Ａ２０及びＴｏｌｌｉｐから選択される１又は２の抗ウイルス性因子の下方制御因子を好適に例示することができる。
　本件ラクトバシラス属細菌株は、ＴＬＲ（Toll-like receptor）２、ＴＬＲ４、及びＮＯＤ２（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 2）から選択される１又は２以上の受容体（以下、「抗ウイルス性因子受容体」ということがある）の発現増強作用により特徴付けることができる。
　本明細書において、抗ウイルス性因子、抗ウイルス性因子の下方制御因子、及び抗ウイルス性因子受容体（以下、これらを総称して「抗ウイルス性因子等」ということがある）の発現とは、抗ウイルス性因子等それ自体の発現、及び／又は、抗ウイルス性因子等をコードする遺伝子（すなわち、抗ウイルス性因子等遺伝子）の転写産物（具体的には、ｍＲＮＡ）の発現を意味する。抗ウイルス性因子等の発現レベルは、例えば、ウエスタンブロッティング法、間接蛍光抗体法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法等の方法を用いて検出することができる。また、抗ウイルス性因子等遺伝子の転写産物の発現レベルは、抗ウイルス性因子等遺伝子のｍＲＮＡを直接的に検出することができるし、抗ウイルス性因子等遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡを間接的に検出することもできる。抗ウイルス性因子等遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法としては、例えば、（Reverse Transcription）－ＰＣＲ法；ノーザンブロッティング法、マイクロアレイ法、ＩＳＨ法等の方法を挙げることができる。また、抗ウイルス性因子等遺伝子のｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡを検出する方法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法［インターカレーター法、５’－ヌクレアーゼ法、サイクリングプローブ法等］、ｄｄＰＣＲ法）；ＬＣＲ法；次世代シークエンサーを用いたシークエンシング法；本件ｃＤＮＡ検出用プローブ等を用いたサザンハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ＩＳＨ法；等を挙げることができる。
　本明細書において、「抗ウイルス性因子の発現増強」、「抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減」、及び「抗ウイルス性因子受容体の発現増強」とは、哺乳動物細胞株を本件ラクトバシラス属細菌株の存在下で培養したときに、比較対照である、哺乳動物細胞株を本件ラクトバシラス属細菌株の非存在下で培養したときと比べ、それぞれ、「抗ウイルス性因子の発現レベルが上昇すること」、「抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現レベルが低下すること」、及び「抗ウイルス性因子受容体の発現レベルが上昇すること」を意味する。上記哺乳動物細胞株は、本件ラクトバシラス属細菌株の存在下又は非存在下で培養する前後において、本件抗ウイルス剤の対象ウイルス、ウイルス疑似感染を惹起する物質（例えば、Polyinosinic-polycytidylic acid［Poly I:C］）、及び／又は病原性細菌で刺激したものであってもよい。抗ウイルス性因子等の発現レベルが上昇したかどうかや、低下したかどうかは、閾値（カットオフ値）は任意のものを設定することができ、かかる閾値としては、例えば、比較対照における抗ウイルス性因子等の発現レベルの平均値；平均値＋標準偏差（ＳＤ）；平均値＋２ＳＤ；平均値＋３ＳＤ；中央値；四分位範囲等を挙げることができる。また、閾値は、感度（本件ラクトバシラス属細菌株の存在下で培養した哺乳動物細胞株を、正しく陽性と判定できる割合）及び特異度（本件ラクトバシラス属細菌株の非存在下で培養した哺乳動物細胞株を、正しく陰性と判定できる割合）が高くなるように、哺乳動物細胞株を本件ラクトバシラス属細菌株の存在下で培養したときの発現レベルのデータと、哺乳動物細胞株を本件ラクトバシラス属細菌株の非存在下で培養したときの発現レベルのデータを基に、統計解析ソフトウェアを用いたＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を用いて算出することもできる。
　上記哺乳動物細胞株としては、例えば、ヒト腸管上皮細胞（Ｃａｃо－２）株、ブタ腸管上皮細胞株（ＰＩＥ［Porcine Intestinal Epitheliocyte］細胞株）、ウシ腸管上皮細胞（ＢＩＥ［Bovine Intestinal Epitheliocyte］細胞株）株を挙げることができる。
　本件抗ウイルス剤の対象ウイルスとしては、特に制限されず、例えば、ＤＮＡウイルス（２本鎖ＤＮＡウイルス、１本鎖ＤＮＡウイルス等）、ＲＮＡウイルス（２本鎖ＲＮＡウイルス、１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス、１本鎖ＲＮＡ（－）鎖ウイルス等）などを挙げることができ、後述する本実施例において、２本鎖ＲＮＡモデルウイルスに対する効果が実証されているため、２本鎖ＲＮＡウイルスが好ましい。対象ウイルスとしては、より具体的には、例えば、インフルエンザウイルス（１本鎖ＲＮＡ（－）鎖ウイルス）、ノロウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、ロタウイルス（２本鎖ＲＮＡウイルス）、風疹ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、麻疹ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、ＲＳウイルス（１本鎖ＲＮＡ（－）鎖ウイルス）、ヘルペスウイルス（２本鎖ＤＮＡウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（２本鎖ＤＮＡウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、Ｅ型肝炎ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、アデノウイルス（２本鎖ＤＮＡウイルス）、口蹄疫ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、狂犬病ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（－）鎖ウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）、コロナウイルス（１本鎖ＲＮＡ（＋）鎖ウイルス）などを挙げることができ、後述する本実施例において、その効果が実証されているため、ロタウイルスを好適に例示することができる。なお、インフルエンザウイルスには、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、トリインフルエンザウイルス及びそれらの各種亜型が含まれ、コロナウイルスには、風邪の原因となる一般的なコロナウイルスの他、新型のコロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス［ＳＡＲＳ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２］、中東呼吸器症候群コロナウイルス［ＭＥＲＳ］、ＣＯＶＩＤ－１９）も含まれる。
　本件抗ウイルス剤の適用対象としては、ウイルス感染症の予防及び又は改善（治療）を必要とする哺乳動物であればよく、後述する本実施例において、ウイルス及び病原性細菌の複合感染においても効果的に抗ウイルス効果を発揮することが実証されているため、ウイルス及び病原性細菌の複合感染におけるウイルス感染症を予防及び／又は改善（治療）することを必要とする哺乳動物を好適に例示することができる。
　本明細書において、病原性細菌としては、例えば、マイコプラズマ、下痢原性大腸菌（例えば、腸管病原性大腸菌［ＥＰＥＣ］、腸管組織侵入性大腸菌［ＥＩＥＣ］、毒素原性大腸菌［ＥＴＥＣ］、腸管凝集接着性大腸菌［ＥＡｇｇＥＣ］、腸管出血性大腸菌［ＥＨＥＣ］)、溶連菌等を挙げることができる。
　本明細書において、哺乳動物としては、ヒトや、非ヒト哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家畜［例えば、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ］）等を挙げることができ、ヒトや家畜を好適に例示することができる。
　本件ラクトバシラス属細菌株としては、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用及び／又は抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有するラクトバシラス属細菌株であれば、生きた状態の細菌株であっても死滅した状態の細菌株であってもよい。本件ラクトバシラス属細菌株は、後述する本実施例でその効果が実証されているラクトバシラス・サリバリウス株又はラクトバシラス・プランタラム株や、ラクトバシラス・サリバリウス株又はラクトバシラス・プランタラム株とは種が異なるものの（例えば、ラクトバチルス・ハヤキテンシス［Lactobacillus hayakitensis］、ラクトバチルス・アジリス［Lactobacillus agilis］、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アラフィノーサス［Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus］、ラクトバチルス・アビアリウス亜種アビアリウス［Lactobacillus aviarius subsp. aviarius］）、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用及び／又は抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有するラクトバシラス属細菌株も包含する。本件ラクトバシラス属細菌株としては、具体的には、国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１８として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１９として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃５８株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２１として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃１３１株）；及び、国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２０として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃７１株）；並びに、国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７４として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１６株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６７として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＶＧ１３２株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６８として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＭＬ６１０９株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６６として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＭＬ６８６株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７１として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃３ＣＳ１２３株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６９として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＶＧ１４１株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７０として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃２ＣＳ８２株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７２として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１ＦｅＢ１８株）；及び、国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７３として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃４ＦｅＢ１９５株）；を挙げることができ、後述する本実施例において抗ウイルス効果が実証されているため、国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１８として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１９として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃５８株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２１として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃１３１株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７４として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１６株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６７として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＶＧ１３２株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６８として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＭＬ６１０９株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６６として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＭＬ６８６株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７１として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃３ＣＳ１２３株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６９として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃６ＶＧ１４１株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７０として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃２ＣＳ８２株）；国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７２として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１ＦｅＢ１８株）；及び、国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７３として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株（本件＃４ＦｅＢ１９５株）；から選択される１又は２種以上を好適に例示することができる。
　本発明において、「配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性」とは、配列番号１のヌクレオチド配列における１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位され、配列番号１のヌクレオチド配列全体の９０％以上の配列が同一であることを意味する。ここで、「１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたヌクレオチド配列」とは、例えば１～１４９個の範囲内、好ましくは１～１００個の範囲内、より好ましくは１～７５個の範囲内、さらに好ましくは１～５０個の範囲内、より好ましくは１～４０個の範囲内、さらに好ましくは１～３０個の範囲内、より好ましくは１～１５個の範囲内の数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたヌクレオチド配列を意味する。
　本発明において、「少なくとも９０％の同一性」としては、好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、特に好ましくは９５％以上、特により好ましくは９６％以上、特にさらに好ましくは９７％以上、特にさらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上（約１００％）の同一性である。ヌクレオチド配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくＢＬＡＳＴＸ又はＢＬＡＳＴＰと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）に基づくＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。ＢＬＡＳＴＮを用いてヌクレオチド配列を解析する場合は、パラメーターは、例えば、score＝100、word length＝12とする。
　本件ラクトバシラス属細菌株は、さらにワカメ資化性を有するものも包含する。ここで「ワカメ資化性」とは、ワカメを炭素源又は窒素源として、タンパク質、核酸、糖類、脂質等のラクトバシラス属細菌に必要な物質を合成する能力を意味する。
　本件抗ウイルス剤は、液体タイプと非液体タイプとに大別される。液体タイプの本件抗ウイルス剤は、本件ラクトバシラス属細菌株の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩水若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。一方、非液体タイプの本件抗ウイルス剤は、液体タイプの本件抗ウイルス剤に、適当な凍結保護剤（例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、トレハロース、デキストラン）を添加してアンプルやバイアル瓶などに充填した後、凍結するか、あるいは、凍結乾燥することにより製造することができる。
　本件抗ウイルス剤の適用（投与）方法としては、経口的に適用する方法（経口投与）、非経口的に適用する方法（非経口投与）共に可能であり、非経口的に適用する方法（非経口投与）としては、例えば、静脈内投与、局所投与を挙げることができる。
　本明細書において、添加剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分を例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、ワカメ成分、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。本件ラクトバシラス属細菌株がワカメ資化性を有するものである場合、本件抗ウイルス剤としては、本件ラクトバシラス属細菌株の栄養源であるワカメ成分（プレバイオティクス）を添加剤として含有し、本件ラクトバシラス属細菌株（好ましくは、抗ウイルス性イムノバイオティクス）とプレバイオティクスによるイムノシンバイオティクスを含むものを好適に例示することができる。上記ワカメ成分としては、ワカメ乾燥物を破砕処理することにより得られるワカメ粉体であっても、かかるワカメ粉体を、さらに水等で抽出することにより得られるワカメ成分抽出液であってもよい。
　本件抗ウイルス剤に含まれる本件ラクトバシラス属細菌株の適用（投与）量としては、摂取させる対象（哺乳動物）の性別、年齢、体重、体調等により異なるため、一概に特定できないが、例えば、１日あたり、体重１ｋｇ当たり１０４～１０１２ｃｆｕ（Colony Forming Unit）、好ましくは１０６～１０１０ｃｆｕである。なお、かかる量を１回で摂取させてもよく、数回に分けて摂取させてもよい。また、本件抗ウイルス剤が家畜用飼料組成物の場合、家畜用飼料組成物に含まれる本件ラクトバシラス属細菌株の量は、例えば、家畜用飼料組成物１ｇ当たり１０４～１０１２ｃｆｕ／ｇ、好ましくは１０６～１０１０ｃｆｕである。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、試薬は特に断りのない限り、和光純薬工業社製の特級又は一級試薬を用い、水は全てミリＱグレート水を用いた。
実施例１．抗ウイルス性因子の探索
　プロバイオティクスの抗ウイルス性を評価するための指標となる因子の探索を行った。
１－１　材料及び方法
［供試細胞］
　ＰＩＥ細胞株は、三元交雑種（ＬＷＤ；landrace×large white×durock）の初生仔ブタ小腸よりクローニングされた細胞を用いた。
［細胞培養］
　ＰＩＥ細胞株は、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた２５０ｍＬフラスコ（住友ベークライト社製)を用いて、１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）及び１％ ストレプトマイシン／ペニシリンを含むＤＭＥＭ液体培地（高グルコース、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム含有；GIBCO社製）（以下、単に「ＤＭＥＭ液体培地」という）にて培養した。 コンフルエントに達したところで、ＰＢＳで２回洗浄し、上皮用緩衝液（０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム・１２水和物、０．４５Ｍ スクロース、０．３６％ ＥＤＴＡ－４Ｎａ、及び０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液)中で３７℃、５分間インキュベートした後、上皮用緩衝液を除去し、０．２５％ トリプシン及び０．０２％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で、３７℃で５分間インキュベートした。ＤＭＥＭ液体培地を加え、剥離した細胞を回収後、遠心処理（１２０００ｒｐｍ×５分間)を行い、培養上清を除去した。新たにＤＭＥＭ液体培地を加え、細胞を回収した。 細胞数を計測後、フラスコ当たり１×１０６ cellsとなるように細胞を播種した。２４時間培養後、培養上清をアスピレーターにより吸引除去し、新たにＤＭＥＭ液体培地を添加し培養を行った。なお、細胞はセルバンカー（登録商標）（日本全薬工業社製）を用いて世代ごとに－８０℃で保存した。また、細胞培養は、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で行った。
［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］
　ＰＩＥ細胞株に対して、ウイルス疑似感染を惹起する２本鎖ＲＮＡウイルスモデルであるPoly I:Cによる刺激を行い、サイトカイン関連因子の発現解析を行った。具体的には、以下の手順〔１〕～〔５〕に従って解析を行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に５日間培養した。
〔２〕培地を、５０ｎｇ／ｍＬのPoly I:C（catalog number P9582、SIGMA社製)を含むＤＭＥＭ液体培地へ交換し、０、３、６、及び１２時間培養することにより、Poly I:Cによる刺激を行った。なお、Poly I:C未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、Poly I:C不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕培地を除去後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞溶解液（TRIzol試薬［Invitrogen社製］）を用いて、定法に従って細胞における全ＲＮＡを得た。ＲＮＡの濃度及び純度は、NanoDrop ND-1000スペクトロフォトメーター（Thermo Fisher Scientific社製）で測定した。
〔４〕得られた全ＲＮＡから、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara社製）を用い、製品添付のプロトコールに従って、ｃＤＮＡを合成した。
〔５〕合成したｃＤＮＡを鋳型とし、２４種類のサイトカイン関連因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＭＣＰ－１［ＣＣＬ２ともいう］、ＩＬ－６、ＩＬ－８［ＣＸＣＬ８ともいう］、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦα、Ａ２０、ＢＣＬ－３、Ｔｏｌｌｉｐ、ＩＲＡＫ－Ｍ、ＭＫＰ－１、及びＳＩＧＩＲＲ）及びβアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを解析するために、以下の表１に示すプライマーセット（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）と、Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG with ROX（Invitrogen社製）と、ABI PRISM 7300リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystem社製）とを用いた定量ＰＣＲ解析を、製品添付のプロトコールに従って行った。Poly I:C刺激による各種サイトカイン関連因子の発現レベルは、式（PolyI:C刺激による［各種サイトカイン関連因子遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］／Poly I:C未刺激による［各種サイトカイン関連因子遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）を基に算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
１－２　結果
［Poly I:C刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］
　Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株における上記２４種類のサイトカイン関連因子遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを解析した結果、２種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β及びＭｘ１）の発現レベルが、Poly I:C刺激後３時間以降に有意に増加し、特にＩＦＮ－βの発現レベルは、Poly I:C刺激後３時間目が最も高く、また、Ｍｘ１の発現レベルは、Poly I:C刺激後１２時間目が最も高かった（図１Ａ及びＢ参照）。
　これらの結果から、本件ラクトバシラス属細菌株の選抜には、Poly I:C刺激後３時間目のＩＦＮ－βの発現レベルと、Poly I:C刺激後１２時間目のＭｘ１の発現レベルを指標として用いることにした。
実施例２．抗ウイルス性を指標とした本件ラクトバシラス属細菌株の選抜
　２種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β及びＭｘ１）の発現レベルを指標として、本件ラクトバシラス属細菌株の選抜を行った。
２－１　方法
［ラクトバシラス・サリバリウス含有液の調製］
　ブタ腸管より単離された１１６種類のラクトバシラス・サリバリウス株を、それぞれＭＲＳ液体培地（Difco社製）に植菌し、３７℃で１６時間培養後、３回継代培養し、ＰＢＳで洗浄した。７２℃で１．５時間熱殺菌した後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ液体培地に、２．５×１０９ cells／ｍＬの濃度となるように再懸濁し、１１６種類のラクトバシラス・サリバリウス株含有液を調製した。
［本件ラクトバシラス属細菌株の選抜］
　ＰＩＥ細胞株に対して、調製した１１６種類のラクトバシラス・サリバリウス株含有液による刺激を行った後、Poly I:Cによる刺激を行い、２種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β及びＭｘ１）の発現レベルを指標として、本件ラクトバシラス属細菌株の選抜を行った。具体的には、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って解析を行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に３日間培養した。
〔２〕調製した１１６種類のラクトバシラス・サリバリウス株含有液を、それぞれ、各ウェル当たり５．０×１０７ cells／ｍＬとなるように培地に加え、２日間培養（刺激）した。なお、ラクトバシラス・サリバリウス株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、ラクトバシラス・サリバリウス株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕培地を除去し、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した後、５０ｎｇ／ｍＬのPoly I:C（catalog number P9582、SIGMA社製)を含むＤＭＥＭ液体培地へ交換し、３時間及び１２時間培
養することにより、Poly I:C刺激を行った。なお、Poly I:C未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、Poly I:C不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔４〕培地を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、２種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β及びＭｘ１）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。各種ラクトバシラス・サリバリウス株刺激によるＩＦＮ－β発現レベルやＭｘ１発現レベルは、式（Poly I:Cで刺激する前に、各種ラクトバシラス・サリバリウス株で刺激したときの［ＩＦＮ－β遺伝子又はＭｘ１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）／Poly I:Cで刺激したときの［ＩＦＮ－β遺伝子又はＭｘ１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）を基に算出した（図２の縦軸参照）。
２－２　結果
　Poly I:Cで刺激する前に、１１６種類のラクトバシラス・サリバリウス株で刺激したＰＩＥ細胞株における２種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β及びＭｘ１）の発現レベルを解析した結果、ラクトバシラス・サリバリウス株＃３５（本明細書において、「本件＃３５株」ということがある）、及びラクトバシラス・サリバリウス株＃５８（本明細書において、「本件＃５８株」ということがある）で刺激した場合の発現レベルが、最も高かった（図２の矢印及び矢頭参照）。
　この結果から、本件＃３５株及び本件＃５８株を、本件ラクトバシラス属細菌株として選抜した。
１）本件＃３５株は、配列番号１のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・サリバリウス株であり、以下の特徴を有する。また、本件＃３５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ；National Institute of Technology and Evaluation）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ；NITE Patent Microorganisms Depositary）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室［#122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japan］）に、２０２０年５月１９日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１８として国際寄託されている。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態(ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
２）本件＃５８株は、配列番号１のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・サリバリウス株であり、以下の特徴を有する。また、本件＃５８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２０年５月１９日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１９として国際寄託されている。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態(ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
実施例３．本件ラクトバシラス属細菌株の免疫調節能の評価
　ＰＩＥ細胞株に対して、選抜した本件＃３５株又は本件＃５８株のみで刺激し、細胞の免疫応答を解析した。
３－１　方法
　細胞の免疫応答の解析は、以下の手順〔１〕～〔３〕に従って解析を行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に３日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり５．０×１０７ cells／ｍＬとなるように培地に加え、０時間（未刺激）、３時間、６時間、１２時間、２４時間、及び４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕培地を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、５種類の受容体（ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＮＯＤ１、及びＮＯＤ２）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル、及び７種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ、及びＲＩＧ－Ｉ）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。本件＃３５株又は本件＃５８株刺激による各種受容体発現レベル（図３参照）及び各種抗ウイルス性因子発現レベル（図４及び５参照）は、式（本件＃３５株又は本件＃５８株刺激による［各種受容体遺伝子又は各種抗ウイルス性因子遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］／前記株未刺激（０時間）による［各種受容体遺伝子又は各種抗ウイルス性因子遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）を基に算出した。
３－２　結果
　本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激したＰＩＥ細胞株における上記５種類の受容体の発現レベルを解析した結果、グラム陽性菌の菌体表層成分を認識する３種類の受容体（ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、及びＮＯＤ２）の発現レベルが、有意に増加した（図３参照）。具体的には、ＴＬＲ２の発現レベルは、本件＃３５株及び本件＃５８株による刺激後、それぞれ６時間及び１２時間増加し、ピークを迎え、その後減少したのに対して、ＴＬＲ４及びＮＯＤ２の発現レベルは、本件＃３５株及び本件＃５８株による刺激後、少なくとも４８時間増加した（図３参照）。
　これらの結果から、本件＃３５株や本件＃５８株を構成する菌体細胞膜成分が、上記３種類の受容体によって、リガンドとして認識されている可能性が示唆された。
　また、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激したＰＩＥ細胞株における上記７種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ、及びＲＩＧ－Ｉ）の発現レベルを解析した結果、すべての抗ウイルス性因子、すなわち、２種類のＩＦＮ（ＩＦＮ－β及びＩＦＮ－λ］と、５種類のＩＦＮ誘導性因子（Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ、及びＲＩＧ－Ｉ）の発現レベルが、有意に増加した（図４及び５参照）。特に、ＩＦＮ－βの発現レベルは、本件＃３５株や本件＃５８株による刺激後、６時間目で顕著に増加し、また、ＩＦＮ－λの発現レベルは、本件＃３５株や本件＃５８株による刺激後、４８時間目で顕著に増加した（図４参照）。
　これらの結果は、本件＃３５株や本件＃５８株が、ＩＦＮと、ＩＦＮによって誘導される因子の発現レベルを増加した結果、ＰＩＥ細胞株におけるウイルスに対する反応性が高まったことを示している。特に、ＴＬＲ３やＲＩＧ－Ｉは、ロタウイルスに代表される２本鎖ＲＮＡウイルスにおける２本鎖ＲＮＡを認識し、抗ウイルス作用を発揮することや、Ｍｘ１は、１本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスの増殖抑制に作用することが知られていることから、本件＃３５株や本件＃５８株が、抗ウイルス性免疫応答を増強することが十分期待される。
実施例４．２本鎖ＲＮＡモデルウイルスに対する本件ラクトバシラス属細菌株の免疫調節能の評価１
　本件＃３５株及び本件＃５８株について、２本鎖ＲＮＡモデルウイルスに対する免疫調節能を評価するために、ＰＩＥ細胞株をPoly I:Cで刺激する前に、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激し、抗ウイルス性因子の発現解析を行った。
４－１　方法
　細胞の免疫応答の解析は、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って解析を行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に３日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり５．０×１０７ cells／ｍＬとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕培地を除去し、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した後、５０ｎｇ／ｍＬのPoly I:C（catalog number P9582、SIGMA社製)を含むＤＭＥＭ液体培地へ交換し、１２時間培養することにより、Poly I:C刺激を行った。なお、Poly I:C未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、Poly I:C不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔４〕培地を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、５種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、及びＰＫＲ）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。本件＃３５株又は本件＃５８株の刺激による各種抗ウイルス性因子発現レベル（図６参照）は、式（Poly I:Cで刺激する前に、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激したときの［各種抗ウイルス性因子遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］／Poly I:Cで刺激したときの［各種抗ウイルス性因子遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）を基に算出した。また、比較対照として、前記株及びPoly I:Cの両方が未刺激での各種抗ウイルス性因子発現レベルも算出した（図６の「Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）－」参照）。
４－２　結果
　Poly I:Cで刺激する前に、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激したＰＩＥ細胞株における５種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、及びＰＫＲ）の発現レベルは、前記株未刺激で、かつPoly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株における発現レベルと比べ、有意に増加した（図６参照）。
　この結果は、本件＃３５株又は本件＃５８株が、PolyI:C刺激に対するＩＦＮ－β産生増強作用と、ＩＦＮ誘導性因子（Ｍｘ１、ＯＡＳ１、ＲＮａｓｅＬ、及びＰＫＲ）の発現増強作用を有することを示している。このため、本件＃３５株又は本件＃５８株が、２本鎖ＲＮＡウイルス感染に対して有用であることが示唆された。
実施例５．２本鎖ＲＮＡモデルウイルスに対する本件ラクトバシラス属細菌株の免疫調節能の評価２
　Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３は、ウイルス感染時に特に重要な役割を果たすネガティブレギュレーターであることが知られており、Ａ２０の発現をノックダウンした細胞において、ロタウイルスの感染が有意に抑制することが報告されている（文献「Vet Res. 2011 Nov 3;42:111. doi: 10.1186/1297-9716-42-111.」参照）。また、Ｔｏｌｌｉｐ（Toll-interacting protein）は、ＩＲＡＫ－１と相互作用してリン酸化を阻害し、ＴＬＲ２やＴＬＲ４のシグナリングを負に制御するネガティブレギュレーターであり、ＩＦＮ－βやＩＦＮ－λの発現に関わるＩＲＦ３（Interferon regulatory factor 3）の発現調節に関与することが報告されている（文献「Fish Shellfish Immunol. 2015 Dec;47(2):807-16.」参照）そこで、本件＃３５株又は本件＃５８株による抗ウイルス性因子の発現増強作用のメカニズムを解析するために、抗ウイルス性因子の下方制御因子であるＡ２０及びＴｏｌｌｉｐの発現解析を行った。
５－１　方法
　細胞の免疫応答の解析は、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って解析を行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に３日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり５．０×１０７ cells／ｍＬとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕培地を除去し、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した後、５０ｎｇ／ｍＬのPoly I:C（catalog number P9582、SIGMA社製)を含むＤＭＥＭ液体培地へ交換し、３時間、６時間、又は１２時間培養することにより、Poly I:C刺激を行った。なお、Poly I:C未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、Poly I:C不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔４〕培地を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、Ａ２０遺伝子及びＴｏｌｌｉｐ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。本件＃３５株又は本件＃５８株の刺激によるＡ２０発現レベル及びＴｏｌｌｉｐ発現レベル（図７参照）は、式（Poly I:Cで刺激する前に、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激したときの［Ａ２０遺伝子又はＴｏｌｌｉｐ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］／Poly I:C刺激で刺激したときの［Ａ２０遺伝子又はＴｏｌｌｉｐ遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）を基に算出した。また、比較対照として、前記株及びPoly I:Cの両方が未刺激でのＡ２０発現レベル及びＴｏｌｌｉｐ発現レベルも算出した（図７の「Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）－」参照）。
５－２　結果
　Poly I:Cで刺激する前に、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激したＰＩＥ細胞株におけるＡ２０及びＴｏｌｌｉｐの発現レベルは、前記株未刺激でかつ、Poly I:C刺激のＰＩＥ細胞株における発現レベルと比べ、有意に減少した（図７参照）。
　この結果は、上記実施例４の結果も考慮すると、本件＃３５株又は本件＃５８株を、２本鎖ＲＮＡウイルス感染した細胞へ投与すると、Ａ２０やＴｏｌｌｉｐ等の抗ウイルス性因子の下方制御因子（ネガティブレギュレーター）の発現レベルが減少し、抗ウイルス性因子の発現増強作用が発揮されることを示している。
実施例６．本件ラクトバシラス属細菌株のウイルス感染低減効果の確認
　本件＃３５株及び本件＃５８株が、抗ウイルス性免疫応答を増強することが示されたので、これら株が、ウイルス感染を低減する効果を有することを確認するために、ロタウイルス感染試験を行った。
６－１　材料及び方法
［供試ウイルス株］
　ブタを宿主とする家畜感染性Ａ群ロタウイルスＯＳＵ株は、農業・食品産業技術総合研究機構・動物衛生研究部門より分与されたものを用いた。
［活性化ロタウイルス液の調製］
　ロタウイルスＯＳＵ株を含むＤＭＥＭ液体培地（高グルコース、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム含有；GIBCO社製）２００μＬに、１ｍｇ／ｍＬの精製トリプリン(T8003-1G TypeＩ、SIGMA社製)を２μＬ添加した（トリプシンの最終濃度１０μｇ／ｍＬ）。よく混合した後、３７℃で３０分間インキュベートし、トリプシン処理することにより、活性化ロタウイルス液を調製した。
［ロタウイルス感染試験及び間接蛍光抗体法］
　ロタウイルス感染試験と、その後の抗ロタウイルス抗体を用いた間接蛍光抗体法は、以下の手順〔１〕～〔７〕に従って行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／ｍＬとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に８日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり１００ＭＯＩ（multiplicity of infection）となるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕細胞を、ＦＣＳ不含のＤＭＥＭ液体培地で３回洗浄し、上記項目［活性化ロタウイルス液の調製］に記載の方法に従って調製した活性化ロタウイルス液を、各ウェル当たり１００μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で１６時間インキュベートした。
〔４〕活性化ロタウイルス液を除去し、４℃の８０％アセトン液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で２０分間インキュベートし、細胞の固定処理を行った。
〔５〕アセトン液を除去し、ＰＢＳで３回細胞を洗浄した後、ロタウイルスＡ抗体（抗ヒトＲＶＡＷａ株モルモット血清、農業・食品産業技術総合研究機構・動物衛生研究部門より分与）を用いた１次抗体反応を行った。具体的には、ロタウイルスＡ抗体を、ＰＢＳで８００倍希釈し、各ウェルに５０μＬずつ分注した後、３７℃で４０分間インキュベートした。
〔６〕細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、Alexa488標識抗モルモットＩｇＧ抗体（Cat. ab150185、abcam社製）を用いた２次抗体反応を行った。具体的には、かかる抗体を1:400にＰＢＳで４００倍希釈し、各ウェルに５０μＬずつ分注した後、３７℃で４０分間インキュベートした。
〔７〕細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、３０％グリセリンを含むＰＢＳを各ウェルに５０μＬずつ分注した後、蛍光顕微鏡（オリンパス社製IX70-FL）を用いて、Alexa488由来の蛍光シグナルを検出し（図８Ａ参照）、かかる蛍光シグナルが陽性の細胞、すなわち、ロタウイルス陽性（感染）細胞の割合（％）を算出した（図８Ｂ参照）。
６－２　結果
　まず、活性化ロタウイルス液でインキュベートしたＰＩＥ細胞株が、Alexa488由来の蛍光シグナル、すなわち、ロタウイルス陽性細胞が検出されることを確認した（図８Ａ及びＢの対照参照）。次に、ＰＩＥ細胞株を活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、本件＃３５株や本件＃５８株で刺激すると、これら株の未刺激の場合と比べ、ロタウイルス陽性細胞の割合が、それぞれ６６％及び５７％まで有意に低下することが示された（図８Ａ並びにＢの＃３５及び＃５８参照）。
　この結果は、本件＃３５株や本件＃５８株が、ウイルス感染の低減（予防）効果を有することを示している。
実施例７．ウイルス感染時における、本件ラクトバシラス属細菌株の免疫調節能の評価１
　本件＃３５株及び本件＃５８株について、ウイルス感染時における免疫調節能を評価するために、ＰＩＥ細胞株を、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激後、ロタウイルスに感染させ、抗ウイルス性因子の発現解析を行った。
７－１　方法
　ロタウイルス感染試験と、その後の抗ウイルス性因子の発現解析は、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、５×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に１０日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり１００ＭＯＩとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕細胞を、ＦＣＳ不含のＤＭＥＭ液体培地で３回洗浄し、上記実施例６の項目［活性化ロタウイルス液の調製］に記載の方法に従って調製した活性化ロタウイルス液を、各ウェル当たり１００μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で３時間、６時間、又は１２時間インキュベートした。
〔４〕活性化ロタウイルス液を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、４種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｍｘ１、及びＲＮａｓｅＬ）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。
７－２　結果
　ＰＩＥ細胞株を活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、本件＃３５株や本件＃５８株で刺激すると、これら株の未刺激の場合と比べ、４種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｍｘ１、及びＲＮａｓｅＬ）の発現レベルが有意に増加した（図９参照）。
　この結果は、本件＃３５株や本件＃５８株を、ウイルス感染した細胞へ投与すると、抗ウイルス性因子の発現増強作用が発揮されることを示している。
実施例８．ウイルス感染時における、本件ラクトバシラス属細菌株の免疫調節能の評価２
　本件＃３５株及び本件＃５８株について、ウイルス感染時における免疫調節能を評価するために、ＰＩＥ細胞株を、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激後、ロタウイルスに感染させ、抗ウイルス性因子の発現を下方制御するＡ２０及びＴｏｌｌｉｐの発現解析を行った。
８－１　方法
　ロタウイルス感染試験と、その後のＡ２０及びＴｏｌｌｉｐの発現解析は、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／ｍＬとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に８日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり１００ＭＯＩとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕細胞を、ＦＣＳ不含のＤＭＥＭ液体培地で３回洗浄し、上記実施例６の項目［活性化ロタウイルス液の調製］に記載の方法に従って調製した活性化ロタウイルス液を、各ウェル当たり１００μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で３時間、６時間、又は１２時間インキュベートした。
〔４〕活性化ロタウイルス液を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、４種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｍｘ１、及びＲＮａｓｅＬ）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。
８－２　結果
　ＰＩＥ細胞株を活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、本件＃３５株や本件＃５８株で刺激すると、これら株の未刺激の場合と比べ、Ａ２０及びＴｏｌｌｉｐの発現レベルが有意に減少した（図１０参照）。
　この結果は、本件＃３５株や本件＃５８株を、ウイルス感染した細胞へ投与すると、抗ウイルス性因子の下方制御因子（例えば、Ａ２０やＴｏｌｌｉｐ）の発現レベルが減少し、抗ウイルス性因子の発現増強作用が発揮されることを示している。
実施例９．本件ラクトバシラス属細菌株によるロタウイルス及びＥＴＥＣの複合感染低減効果の確認
　実際の生活においては、ウイルス単独の感染のみならず、病原性細菌との複合感染が生じる。そこで、ロタウイルス及び毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ；Entero toxigenic E. coli）の複合感染系を構築し、まずは、ロタウイルス単独の感染と、ロタウイルス及びＥＴＥＣの複合感染との間で、ロタウイルス感染効率に差が認められるかどうかを検証し、次いで、ロタウイルス及びＥＴＥＣの複合感染に対しても本件＃３５株や本件＃５８株が有効であるかどうかを解析した。
９－１　材料及び方法
［ＥＴＥＣ含有液の調製］
　ＥＴＥＣ株（農業・食品産業技術総合研究機構・動物衛生研究部門より分与）は、５％ヒツジ脱繊維血液を含む寒天培地に画線し、３７℃で２０時間培養した。形成されたコロニーを釣菌し、５ｍＬのトリプトンソイブイヨン（ＴＳＢ；tryptone soya broth）液体培地（日本BD社製）に接種し、３７℃で５～８日間、静置にて繊毛復帰培養を行った。その後、菌膜形成部から釣菌し、１１ｍＬのＴＳＢに接種し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養後、遠心処理により集菌し、ＰＢＳで３回洗浄し、１００℃で１５分間、加熱殺菌処理を行った。その後、ＰＢＳで洗浄し、菌体濃度が１．５×１０１０ cells／ｍＬとなるようにＤＭＥＭ液体培地に懸濁し、ＥＴＥＣ含有液を調製した。
［ロタウイルス及びＥＴＥＣの複合感染試験と、間接蛍光抗体法］
　ロタウイルス・ＥＴＥＣ複合感染試験と、その後の抗ロタウイルス抗体を用いた間接蛍光抗体法は、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に８日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり１００ＭＯＩとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕細胞を、ＦＣＳ不含のＤＭＥＭ液体培地で３回洗浄し、上記実施例６の項目［活性化ロタウイルス液の調製］に記載の方法に従って調製した活性化ロタウイルス液を、各ウェル当たり１００μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、さらに、上記項目［ＥＴＥＣ含有液の調製］に記載の方法に従って調製したＥＴＥＣ含有液を、各ウェル当たり５０μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で１６時間インキュベートした。なお、ウイルス単独感染の対照として、活性化ロタウイルス液のみを加えたＰＩＥ細胞株を、同様にインキュベートした。
〔４〕活性化ロタウイルス液やＥＴＥＣ含有液を除去後、細胞の固定処理から、間接蛍光抗体法までの手順は、上記実施例６の項目［ロタウイルス感染試験及び間接蛍光抗体法］における手順〔４〕～〔７〕に従って行った。
９－２　結果
　ＰＩＥ細胞株を、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートすると、活性化ロタウイルス液単独でインキュベートした場合と比べ、ロタウイルス陽性細胞の割合が、有意に増加することが示された（図１１Ａ参照）。
　この結果は、ロタウイルス・ＥＴＥＣ複合感染により、ＰＩＥ細胞株におけるロタウイルス感染効率は、ロタウイルスの単独感染と比べ、上昇したことを示している。
　次に、ＰＩＥ細胞株を、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートする前に、本件＃３５株や本件＃５８株で刺激すると、これら株による刺激を行わなかった場合と比べ、ロタウイルス陽性細胞の割合が、有意に減少することが示された（図１１Ｂ参照）。
　この結果は、本件＃３５株や本件＃５８株が、ウイルス・病原性細菌複合感染時のウイルス感染に対しても、低減（予防）効果を効果的に発揮することを示している。
実施例１０．ウイルス及び細菌感染時における、本件ラクトバシラス属細菌株の免疫調節能の評価１
　本件＃３５株及び本件＃５８株について、ウイルス・病原性細菌複合感染時における免疫調節能を評価するために、ＰＩＥ細胞株を、本件＃３５株又は本件＃５８株で刺激後、ロタウイルスに感染させ、抗ウイルス性因子及び抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現解析を行った。
１０－１　方法
　ウイルス・病原性細菌複合感染試験と、その後の抗ウイルス性因子及び抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現解析は、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、５×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に１０日間培養した。
〔２〕本件＃３５株及び本件＃５８株を、それぞれ、各ウェル当たり１００ＭＯＩとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕細胞を、ＦＣＳ不含のＤＭＥＭ液体培地で３回洗浄し、上記実施例６の項目［活性化ロタウイルス液の調製］に記載の方法に従って調製した活性化ロタウイルス液を、各ウェル当たり１００μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、さらに、上記項目［ＥＴＥＣ含有液の調製］に記載の方法に従って調製したＥＴＥＣ含有液を、各ウェル当たり５０μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で１６時間インキュベートした。なお、ウイルス単独感染の対照として、活性化ロタウイルス液のみを加えたＰＩＥ細胞株を、同様にインキュベートした。
〔４〕活性化ロタウイルス液やＥＴＥＣ含有液を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、６種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｍｘ１、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ、及びＲＩＧ－１）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル、及び２種類の抗ウイルス性因子の下方制御因子（Ａ２０及びＴｏｌｌｉｐ）のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。
１０－２　結果
　ＰＩＥ細胞株を、活性化ロタウイルス液及びＥＴＥＣ含有液でインキュベートする前に、本件＃３５株や本件＃５８株で刺激すると、これら株の未刺激の場合と比べ、６種類の抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｍｘ１、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ、及びＲＩＧ－１）の発現レベルが有意に増加するとともに（図１２及び１３参照）、２種類の抗ウイルス性因子の下方制御因子（Ａ２０及びＴｏｌｌｉｐ）の発現レベルが有意に減少した（図１４参照）。
　これらの結果は、本件ラクトバシラス属細菌株（本件＃３５株や本件＃５８株）を、ウイルス・病原性細菌複合感染した細胞へ投与すると、抗ウイルス性因子の下方制御因子（例えば、Ａ２０やＴｏｌｌｉｐ）の発現レベルが減少し、抗ウイルス性因子の発現増強作用が発揮されることを示している。
実施例１１．ワカメ資化性を指標とした本件ラクトバシラス属細菌株の選抜
　海藻を資化する細菌の代謝物について特に藻類含水炭素から産生される有機酸は、ヒトや海洋無脊椎動物の腸内微生物を活性化させると報告されている（文献「Front Immunol.2014 Jan 14;4:512.」及び「NewPhytol. 2010 Oct;188(1):82-97.」参照）。さらに、プレバイオティクス関連研究として、紅藻類を微生物発酵させて得られる代謝産物が、抗酸化や抗血液凝固作用、免疫調節作用を発揮するという報告もある（文献「Phytomedicine. 2012 Jun 15;19(8-9):797-803.」参照）。これらのことは、海洋生物素材を基質として利用可能な微生物が存在し、それらを発展的に応用することで、新たな利用価値が生まれることを意味している。一方、２０１０年にJan-Hendrik Hehemannらの研究チームが、“海洋細菌の中で、藻細胞壁の分解を行なう酵素を特定し、その酵素をコードする遺伝子が日本人の腸内細菌にのみ存在する”ことを報告した（文献「Anim Sci J. 2011 Apr;82(2):274-81.」参照）。かかる報告から、日本人の食生活が影響し、腸内細菌が紅藻類藻細胞壁の分解という新たに獲得した能力が腸環境に広がり、日本人の腸内微生物叢に定着したと推測した。このことは、海藻を食することにより、海藻を積極的に資化できる腸内細菌が出現することを示唆している。そこで、ワカメ残渣を投与したブタの腸管粘液における腸内細菌叢大規模解析による腸内微生物の構成を解析し、ワカメ成分調製寒天培地を用いて、ワカメ資化性ラクトバシラス属細菌株の選抜を行った。
１１－１　材料及び方法
［ワカメ成分含有液体培地の調製］
　ワカメ粉末０．１ｇ、ミリＱ水１００ｍＬを瓶に入れ、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）し、０．１％ワカメ水溶液を調製した。５０ｍＬのチューブに分注し、遠心分離処理（６０００ｒｐｍ、２０分間、４℃)後、上清を回収し、かかる上清成分（ワカメ成分）に、塩化ナトリウム及びyeast extractを、それぞれ終濃度が０．５％及び０．１％となるように添加し、０．１％ワカメ成分含有液体培地を調製した。なお、かかる０．１％ワカメ成分含有液体培地に、寒天を終濃度が１．５％となるように添加し、０．１％ワカメ成分含有寒天培地を調製した。
［ワカメ成分含有液体培地中でのラクトバシラス・サリバリウス株の培養試験］
　ブタ腸管より単離された１３６種類のラクトバシラス・サリバリウス株を、ＭＲＳ寒天培地に塗布した。７２時間後に各細菌株を、ＭＲＳ液体培地５ｍＬ中に入れ、３７℃で、２４時間インキュベートした。１００μＬの０．１％ワカメ成分含有液体培地中で２回継代培養した後、ＯＤ＝０．５となるようにＰＢＳで調整し、５ｍＬの０．１％ワカメ成分含有液体培地を添加した後、そのうちの１００μＬを０．１％ワカメ成分含有寒天培地に塗布し、６時間ごとに培地のｐＨとコロニー数を測定した（図１５参照）。
１１－２　結果
　ワカメ成分含有液体培地中で増殖するラクトバシラス・サリバリウス株として、ラクトバシラス・サリバリウス株＃１３１（本明細書において、「本件＃１３１株」ということがある）、及びラクトバシラス・サリバリウス株＃７１（本明細書において、「本件＃７１株」ということがある）を同定した。
１）本件＃１３１株は、本件＃３５株や本件＃５８株と同様に、配列番号１のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・サリバリウス株であり、本件＃３５株や本件＃５８株と同様の特徴を有する。すなわち、本件＃１３１株は、以下の特徴を有する。本件＃１３１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２０年５月１９日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２１として国際寄託されている。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態(ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
２）本件＃７１株は、本件＃３５株や本件＃５８株と同様に、配列番号１のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・サリバリウス株であり、本件＃３５株や本件＃５８株と同様の特徴を有する。すなわち、本件＃７１株は、以下の特徴を有する。本件＃７１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２０年５月１９日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２０として国際寄託されている。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態(ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
実施例１２．２本鎖ＲＮＡモデルウイルスに対する本件＃１３１株の免疫調節能の評価
　本件＃１３１株について、本件＃３５株や本件＃５８株と同様に、抗ウイルス性免疫応答の増強作用を有することを確認するために、ＰＩＥ細胞株をPoly I:Cで刺激する前に、本件＃１３１株で刺激し、抗ウイルス性因子の発現解析を行った。
１２－１　方法
　細胞の免疫応答の解析は、以下の手順〔１〕～〔４〕に従って解析を行った。
〔１〕ＰＩＥ細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／wellとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に３日間培養した。
〔２〕本件＃１３１株を、各ウェル当たり５．０×１０７ cells／ｍＬとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、本件＃１３１株未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、本件＃１３１株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕培地を除去し、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した後、５０ｎｇ／ｍＬのPoly I:C（catalog number P9582、SIGMA社製)を含むＤＭＥＭ液体培地へ交換し、１２時間培養することにより、Poly I:C刺激を行った。なお、Poly I:C未刺激の対照として、ＰＩＥ細胞株を、Poly I:C不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔４〕培地を除去後、細胞における全ＲＮＡの回収から、抗ウイルス性因子（ＩＦＮ－β）遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルの解析までの手順は、上記実施例１の項目［Poly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株におけるサイトカイン関連因子の発現解析］における手順〔３〕～〔５〕に従って行った。本件＃１３１株の刺激によるＩＦＮ－β発現レベル（図１６参照）は、式（Poly I:Cで刺激する前に、本件＃１３１株で刺激したときの［ＩＦＮ－β遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］／Poly I:Cで刺激したときの［ＩＦＮ－β遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）を基に算出した。また、比較対照として、本件＃１３１株及びPoly I:Cの両方が未刺激での各種抗ウイルス性因子発現レベルも算出した（図１６参照）。
４－２　結果
　Poly I:Cで刺激する前に、本件＃１３１株で刺激したＰＩＥ細胞株におけるＩＦＮ－βの発現レベルは、本件＃１３１株未刺激で、かつPoly I:Cで刺激したＰＩＥ細胞株における発現レベルと比べ、有意に増加した（図１６参照）。
　この結果は、本件＃１３１株は、本件＃３５株や本件＃５８株と同様に、抗ウイルス性因子の発現増強作用を有することが示された。また、本件＃３５株及び本件＃５８株、並びに、本件＃１３１株及び本件＃７１株は、共に配列番号１のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・サリバリウス株であることから、配列番号１のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・サリバリウス株は、抗ウイルス性と、ワカメ資化性の両方の性質を有することが示唆された。
実施例１３．本件ラクトバシラス属細菌株のウイルス感染低減効果の確認（２）
　ラクトバシラス・サリバリウスとは別の種のラクトバシラス属細菌株であっても、抗ウイルス効果を発揮したラクトバシラス・サリバリウスの１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１のヌクレオチド配列）と高い配列同一性を有するものが、抗ウイルス効果を有するかどうかを解析した。具体的には、本件ラクトバシラス属細菌株に包含される９種類のラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１６株、本件＃６ＶＧ１３２株、本件＃６ＭＬ６１０９株、本件＃６ＭＬ６８６株、本件＃３ＣＳ１２３株、本件＃６ＶＧ１４１株、本件＃２ＣＳ８２株、本件＃１ＦｅＢ１８株、及び本件＃４ＦｅＢ１９５株）について、ロタウイルス感染試験を行った。
　本件＃１６株は、配列番号５２のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７４として国際寄託されている。本件＃１６株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
１）本件＃６ＭＬ６８６株は、配列番号５３のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６６として国際寄託されている。本件＃６ＭＬ６８６株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
２）本件＃６ＭＬ６１０９株は、配列番号５３のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６８として国際寄託されている。本件＃６ＭＬ６１０９株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
　本件＃６ＶＧ１３２株は、配列番号５４のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６７として国際寄託されている。本件＃６ＶＧ１３２株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
　本件＃６ＶＧ１４１株は、配列番号５５のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６９として国際寄託されている。本件＃６ＶＧ１４１株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
１）本件＃２ＣＳ８２株は、配列番号５６のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７０として国際寄託されている。本件＃２ＣＳ８２株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
２）本件＃１ＦｅＢ１８株は、配列番号５６のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７２として国際寄託されている。本件＃１ＦｅＢ１８株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
　本件＃３ＣＳ１２３株は、配列番号５７のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７１として国際寄託されている。本件＃３ＣＳ１２３株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
　また、本件＃４ＦｅＢ１９５株は、配列番号５８のヌクレオチド配列からなる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス・プランタラム株であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０２１年４月２３日付で国際寄託受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７３として国際寄託されている。本件＃４ＦｅＢ１９５株は、上記４種類のラクトバシラス・サリバリウス株（本件＃３５株、本件＃５８株、本件＃１３１株、及び本件＃７１株）と同様に、以下の特徴を有する。
（ａ）細胞形態
形状：桿菌、芽胞形成：（－）、運動性：（－）
（ｂ）コロニー形態（ＭＲＳ寒天培地上に塗沫し、３７℃、２４時間好気培養したコロニーの形態を観察)
（１）グラム染色性：（＋）
（２）ガス産生：（－）
（３）カタラーゼ活性：（－）
（４）インドール産性：（－）
（５）酸素に対する態度：通性嫌気性
（６）至適生育温度：３７～４０℃
（７）至適生育ｐＨ：ｐＨ５．５～５．８
　上記９種類のラクトバシラス・プランタラム株は、いずれも配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有するラクトバシラス属細菌株である。
１３－１　材料及び方法
［材料］
　ＰＩＥ１－３細胞株は、デュロック種の離乳仔ブタ小腸よりクローニングされた細胞を用いた。
［方法］
　ロタウイルス感染試験と、その後のロタウイルス感染レベル及びロタウイルス感染細胞の解析は、以下の手順〔１〕～〔７〕に従って行った。
〔１〕ＰＩＥ１－３細胞株を、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）に、３×１０４ cells／ｍＬとなるように播種し、ＤＭＥＭ液体培地中に８日間培養した。
〔２〕上記９種類のラクトバシラス・プランタラム株を、それぞれ、各ウェル当たり１ＭＯＩとなるように培地に加え、４８時間培養（刺激）した。なお、これら株未刺激の対照として、ＰＩＥ１－３細胞株を、これら株不含のＤＭＥＭ液体培地中で同様に培養した。
〔３〕細胞を、ＦＣＳ不含のＤＭＥＭ液体培地で３回洗浄し、上記実施例６の項目［活性化ロタウイルス液の調製］に記載の方法に従って調製した活性化ロタウイルス液を、各ウェル当たり１００μＬ（１ＭＯＩ相当）ずつ加え、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で１２時間インキュベートした。
〔４〕活性化ロタウイルス液を除去後、２種類のラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１ＦｅＢ１８株及び本件＃４ＦｅＢ１９５株）で刺激したＰＩＥ１－３細胞株については、ロタウイルス感染細胞の割合を解析するために、上記実施例６の項目［ロタウイルス感染試験及び間接蛍光抗体法］における手順〔４〕～〔７〕に従って、細胞の固定処理から、間接蛍光抗体法までを行った（図１８参照）。
〔５〕また、７種類のラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１６株、本件＃６ＶＧ１３２株、本件＃６ＭＬ６１０９株、本件＃６ＭＬ６８６株、本件＃３ＣＳ１２３株、本件＃６ＶＧ１４１株、及び本件＃２ＣＳ８２株）で刺激したＰＩＥ１－３細胞株については、ロタウイルス由来遺伝子の発現レベルを指標としたロタウイルス感染レベルの解析を行った。まず、上記活性化ロタウイルス液を除去後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、細胞溶解液（TRIzol試薬［Invitrogen社製］）を用いて、定法に従って細胞における全ＲＮＡを得た。ＲＮＡの濃度及び純度は、NanoDrop ND-1000スペクトロフォトメーター（Thermo Fisher Scientific社製）で測定した。
〔６〕得られた全ＲＮＡから、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara社製）を用い、製品添付のプロトコールに従って、ｃＤＮＡを合成した。
〔７〕合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ロタウイルス由来遺伝子（ＮＳＰ５遺伝子）及びβアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを解析するために、以下の表２に示すプライマーセット（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）と、Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG with ROX（Invitrogen社製）と、ABI PRISM 7300リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystem社製）とを用いた定量ＰＣＲ解析を、製品添付のプロトコールに従って行った。上記９種類のラクトバシラス・プランタラム株刺激によるＮＳＰ５の発現レベルは、式（上記９種類のラクトバシラス・プランタラム株刺激による［ＮＳＰ５遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］／上記９種類のラクトバシラス・プランタラム株未刺激による［ＮＳＰ５遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル／βアクチン遺伝子のｍＲＮＡの発現レベル］）を基に算出した（図１７参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
１３－２　結果
　ＰＩＥ１－３細胞株を活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、７種類のラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１６株、本件＃６ＶＧ１３２株、本件＃６ＭＬ６１０９株、本件＃６ＭＬ６８６株、本件＃３ＣＳ１２３株、本件＃６ＶＧ１４１株、及び本件＃２ＣＳ８２株）で刺激すると、これら株の未刺激の場合と比べ、ロタウイルス由来のＮＳＰ５の発現レベルが有意に減少した（図１７参照）。
　また、ＰＩＥ１－３細胞株を活性化ロタウイルス液でインキュベートする前に、２種類のラクトバシラス・プランタラム株（本件＃１ＦｅＢ１８株及び本件＃４ＦｅＢ１９５株）で刺激すると、これら株の未刺激の場合と比べ、ロタウイルス感染細胞の割合が、それぞれ有意に低下することが示された（図１８参照）。
　これらの結果は、上記９種類のラクトバシラス・プランタラム株は、ウイルス感染の低減（予防）効果を有することを示している。
　本発明は、畜産業やヒト医療におけるウイルス感染症の予防又は治療に資するものである。

Claims (8)

  1. 　配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗ウイルス性因子の発現増強作用及び／又は抗ウイルス性因子の下方制御因子の発現低減作用を有するラクトバシラス属細菌株を、１又は２種以上含むことを特徴とする抗ウイルス剤。
  2. 　抗ウイルス性因子が、インターフェロン（ＩＦＮ）－β、ＩＦＮ－λ、Ｍｘ１（MX dynamin like GTPase 1）、ＯＡＳ１（2'-5'-oligoadenylate synthetase 1）、ＲＮａｓｅＬ、ＰＫＲ（Protein kinase R）、及びＲＩＧ－Ｉ（Retinoic acid inducible gene-I）から選択される１又は２以上の抗ウイルス性因子であり、抗ウイルス性因子の下方制御因子が、Ａ２０及びＴｏｌｌｉｐ（Toll-interacting protein）から選択される１又は２の抗ウイルス性因子の下方制御因子であることを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
  3. 　ラクトバシラス属細菌株が、ＴＬＲ（Toll-like receptor）２、ＴＬＲ４、及びＮＯＤ２（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor 2）から選択される１又は２以上の受容体の発現増強作用を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
  4. 　ウイルスが２本鎖ＲＮＡウイルスであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
  5. 　ラクトバシラス属細菌株が、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１８として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１９として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２１として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７４として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６７として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６８として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６６として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７１として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６９として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７０として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７２として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；及び、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７３として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；から選択される１又は２種以上であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
  6. 　ラクトバシラス属細菌株が、ワカメ資化性を示すことを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
  7. 　家畜用飼料又は飲食品であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
  8. 　受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１８として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２１９として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３２２１として寄託されているラクトバシラス・サリバリウス株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７４として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６７として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６８として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６６として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７１として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４６９として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７０として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７２として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株；又は、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３４７３として寄託されているラクトバシラス・プランタラム株。
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