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WO2016151248A1 - Procédé d'analyse de particules - Google Patents

Procédé d'analyse de particules Download PDF

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Publication number
WO2016151248A1
WO2016151248A1 PCT/FR2016/050643 FR2016050643W WO2016151248A1 WO 2016151248 A1 WO2016151248 A1 WO 2016151248A1 FR 2016050643 W FR2016050643 W FR 2016050643W WO 2016151248 A1 WO2016151248 A1 WO 2016151248A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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sample
image
particle
reconstruction
photodetector
Prior art date
Application number
PCT/FR2016/050643
Other languages
English (en)
Inventor
Cédric ALLIER
Pierre BLANDIN
Anais ALI CHERIF
Lionel Herve
Original Assignee
Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
Horiba Abx Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives, Horiba Abx Sas filed Critical Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
Priority to US15/560,763 priority Critical patent/US10379027B2/en
Priority to KR1020177030554A priority patent/KR102479862B1/ko
Priority to EP16717422.6A priority patent/EP3274689B1/fr
Priority to CN201680022598.1A priority patent/CN107532989B/zh
Priority to JP2017550232A priority patent/JP6727229B2/ja
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    • G03H2001/0883—Reconstruction aspect, e.g. numerical focusing

Definitions

  • the invention is in the field of counting and identifying particles present in a liquid and in particular a body fluid, for example blood.
  • Body fluids, particularly blood may comprise particles, for example cells, the number and type of which is useful to know.
  • type and blood count, or blood count are commonly performed in laboratory analysis. This type of analysis makes it possible to determine the number and to identify the main constituents of the blood, in particular cells of the red blood cell line, white blood cells, or platelets. These examinations are commonly performed, using powerful automata, but we are looking for simpler, less expensive methods, to obtain comparable performance.
  • US2014 / 0327944 also describes a method for classifying particles, for example blood particles, on the basis of holograms, by comparing holograms acquired by an image sensor with a library of simulated holograms. But this process faces the same limits, namely a delicate implementation when the density of the particles is high.
  • the method must also have an extended field of view, and must be simple to implement, in particular by avoiding prior particle marking. Furthermore, the method must make it possible to reliably discriminate particles that may be in a body fluid, in particular cells of the red blood cell, white blood cell and platelet lines. In addition, a method is sought that does not require precise knowledge of the distance between the particles and the photodetector.
  • the invention addresses this problem by providing a method for identifying a particle present in a sample, for example a sample of a biological fluid, such as blood, the method comprising the following steps:
  • determining a profile representing an evolution of said characteristic quantity as a function of said reconstruction distance, along an axis parallel to said axis of propagation and passing through said position;
  • a digital reconstruction algorithm By applying a digital reconstruction algorithm is meant the application of a propagation operator to an image, generally in the form of a convolution product.
  • the characteristic quantity can be obtained by estimating, at each reconstruction distance, a complex expression of the light wave to which the matrix photodetector is exposed.
  • the characteristic quantity can be determined from the module of said complex expression, in which case it is representative of the amplitude of said light wave to which the detector is exposed.
  • the characteristic quantity can be determined from the argument of said complex expression, in which case it is representative of the phase of said light wave to which the matrix photodetector is exposed.
  • the method comprises:
  • a complex reference image the determination of a complex image, referred to as a complex reference image, by applying a digital reconstruction algorithm to the image acquired by the matrix photodetector;
  • the process can then comprise:
  • the complex reference image may be a complex image formed in a reconstruction plane, distant from the plane of the sample. It can also be a complex image formed in the detection plane.
  • the identification can be developed by comparing the evolution of said characteristic quantity with typical profiles determined during a learning phase.
  • the position of each particle, in a plane parallel to the plane of the matrix photodetector, can be determined using the image acquired by the photodetector or by means of the complex expression of the light wave to which is exposed the photodetector.
  • the light source is preferably a spatially coherent source, and for example a light-emitting diode, in which case a spatial filter is preferably disposed between the light source and the sample.
  • the light source may be temporally coherent, for example being a laser diode.
  • the matrix photodetector comprises an array of pixels capable of collecting the wave to which the photodetector is exposed.
  • the distance between the pixels and the sample may vary between 50 ⁇ and 2 cm, and preferably between 100 ⁇ and 5 mm.
  • the sample is not disposed in direct contact with the pixels of the photodetector.
  • no magnification optics are disposed between the sample and the matrix photodetector.
  • the sample may in particular comprise blood cells.
  • the particles can be identified among cell lines of white blood cells, red blood cells or platelets.
  • Another object of the invention is a device for identifying a particle, said particle being contained in a sample, the device comprising:
  • a light source arranged to produce an incident light wave, along an axis of propagation, towards said sample;
  • the matrix photodetector arranged to acquire an image of the sample, the matrix photodetector being able to be exposed to a light wave, resulting from the interference between said incident light wave and a diffraction wave formed by said particle;
  • the device comprises a processor, of the electronic computer or microprocessor type, configured to implement the following operations:
  • the device has no magnification optics between the matrix photodetector and the analyzed sample.
  • the processor may comprise or be connected to a programmable memory, comprising a sequence of instructions for implementing the previously described steps. It can in particular be able to: to determine, at each reconstruction distance, the complex expression of the optical radiation to which the detector is exposed,
  • Figure 1 shows the device according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 2A represents an image acquired by the matrix photodetector.
  • FIG. 2B represents the profile of a characteristic quantity, called complementary amplitude, of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of the distance with respect to the photodetector, according to a first example, for different types of particles.
  • FIG. 3A represents the profile of a characteristic quantity, called complementary amplitude, of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of the distance relative to the photodetector, for different white blood cells, according to this first example.
  • FIG. 3B represents the profile of a characteristic quantity, called complementary amplitude, of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of the distance with respect to the photodetector, for different red blood cells, according to this first example.
  • FIG. 4A represents a region of interest of the image acquired by the photodetector, centered on an aggregate of platelets, according to this first example.
  • FIG. 4B represents the profile of a characteristic quantity, called complementary amplitude, of the light wave to which the photodetector is exposed, for different plates forming part of the aggregate represented in FIG. 4A.
  • FIG. 5A represents the profile of a characteristic quantity, called complementary amplitude, of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of the distance with respect to the photodetector, for different types of particles, according to a second example.
  • FIG. 5B represents the profile of the phase of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of the distance z with respect to the photodetector, for different types of particles, according to a second example.
  • FIG. 6A represents the profile of a characteristic quantity, called complementary amplitude, of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of the distance with respect to the photodetector, for different types of particles, according to a third example.
  • FIG. 6B represents the profile of the phase of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of the distance with respect to the photodetector, for different types of particles, according to a third example.
  • FIGS. 7A, 7B and 7C respectively represent the profile of a composite quantity characteristic of the light wave to which the photodetector is exposed, as a function of distance, according to the first, second and third examples.
  • FIGS. 8A, 8B, 8C and 8D represent respectively:
  • a method for calculating a complex image referred to as a complex reference image, of a sample in a reconstruction plane
  • FIG. 8A a representation of an image, called complex reference image, reconstructed after several iterations of the method shown in FIG. 8A.
  • FIG. 9A is a hologram acquired by an image sensor, the sample comprising red blood cells dispersed in an aqueous solution.
  • FIGS. 9B and 9C respectively represent the module and the phase of a complex image, referred to as a reference image, this complex image being formed in a reconstruction plane.
  • FIGS. 9D and 9E are profiles respectively representing an evolution of the modulus and phase of the light wave to which the image sensor is exposed, along an axis of propagation passing through a red cell.
  • FIG. 1 represents an exemplary device that is the subject of the invention.
  • a light source 11 is able to produce a light wave 12, referred to as an incident light wave, in the direction of a sample 14, along an axis of propagation Z.
  • the sample 14 comprises a medium 10, for example a biological fluid, comprising particles 1, 2, 3, 4, 5, .., 9, which it is desired to identify among predetermined types of particles.
  • a particle can be a cell.
  • a particle may be a red blood cell, a white blood cell or a wafer.
  • a particle may also be an organic or inorganic microbead, for example a metal microbead, a polymer or glass microbead, this type of microbead being commonly used in the production of biological protocols.
  • a particle may also be a droplet, for example a lipid droplet, immersed in the medium 10. It may also be a microorganism, for example a bacterium or a yeast, or an exosome.
  • a particle has a size advantageously less than 1 mm, or even less than 500 ⁇ , and preferably a size between 0.5 ⁇ and 500 ⁇ .
  • the term particle refers to both endogenous particles, initially present in the sample examined, and exogenous particles, added to this sample prior to analysis.
  • the medium is most frequently a liquid medium, and especially a body fluid, but it can also act agar, or air, or the dry residue of a liquid.
  • the method which is the subject of the invention makes it possible to identify each particle observed.
  • identification is meant the classification of the particle into a predetermined particle class. It can be a determination of a nature of a particle among predetermined natures, or a determination of a size of a particle among predetermined natures.
  • the distance ⁇ between the light source and the sample is preferably greater than 1 cm. It is preferably between 2 and 30 cm.
  • the light source, seen by the sample is considered as point. This means that its diameter (or diagonal) is preferably less than one-tenth, better one-hundredth of the distance between the sample and the light source.
  • the light arrives at the sample in the form of plane waves, or can be considered as such.
  • the light source 11 may be punctual, or be associated with a diaphragm, or spatial filter, not shown in Figure 1, so as to appear punctual.
  • the opening of the diaphragm is typically between 5 ⁇ and 1mm, preferably between 50 ⁇ and 500 ⁇ .
  • the diaphragm may be replaced by an optical fiber, a first end of which is placed facing a light source, and a second end of which is placed facing the sample.
  • said second end can be likened to a point light source 11.
  • the sample 14 is delimited by an enclosure having a bottom 15 and a cover 13.
  • the side walls of the enclosure are not shown.
  • the chamber is a fluid chamber Neubauer C-chip.
  • the distance between the bottom 15 and the cover 13 is 100 ⁇ .
  • the thickness of the enclosure, along the axis of propagation Z is less than a few cm, for example less than 1 cm, or even less than 1 mm, for example between 50 ⁇ and 500 ⁇ .
  • the light source 11 may be temporally coherent but this is not necessary.
  • the light source is a laser diode emitting at the wavelength of 450 nm. It is located at a distance of 15 cm from the sample.
  • the sample 14 is disposed between the light source 11 and a matrix photodetector, or image sensor, 16. The latter preferably extends parallel to, or substantially parallel to, the bottom 15 of the enclosure delimiting the sample.
  • substantially parallel means that the two elements may not be strictly parallel, an angular tolerance of a few degrees, less than 10 ° being allowed.
  • the light source is of small spectral width, for example less than 100 nm, or even 20 nm and even more preferably less than 5 nm.
  • the term spectral width refers to the half-height width of the emission peak of the light source.
  • the photodetector 16 may be a matrix photodetector comprising a matrix of pixels, of the CCD type or a CMOS.
  • CMOS are the preferred photodetectors because the size of the pixels is smaller, which makes it possible to acquire images whose spatial resolution is more favorable.
  • the detector is a 12-bit APTINA sensor, reference MT9P031. It is a CMOS RGB sensor, whose inter-pixel pitch is 2.2 ⁇ .
  • the effective area of the photodetector is 5.7 x 4.3 mm 2 .
  • the photodetector extends along a detection plane P, preferably perpendicular to the propagation axis Z of the incident light wave 12.
  • the photodetector comprises a matrix of pixels, above which is disposed a transparent protection window.
  • the distance between the pixel matrix and the protection window is generally between a few tens of ⁇ at 150 or 200 ⁇ .
  • Photodetectors whose inter pixel pitch is less than 3 ⁇ are preferred, in order to improve the spatial resolution of the image.
  • the distance d between the particles 1,2, ... 9 and the pixel matrix of the photodetector 16 is, in this example, equal to 1.5 mm. But it can fluctuate depending on the thickness of the fluidic chamber used. In general, and whatever the embodiment, the distance d between a particle and the pixels of the photodetector is preferably between 50 ⁇ and 2 cm, preferably between 100 ⁇ and 2 mm.
  • the sample is plasma enriched in white blood cells, obtained according to a usual protocol, after sedimentation of the red blood cells in the presence of Dextran (Sigma Aldrich reference D4876) 6% in Alsever solution, then recovery of the rich plasma white blood cells and in platelets.
  • the plasma obtained is then diluted in a PBS buffer at physiological pH (acronym for Phosphate Buffer Saline - Saline Phosphate Buffer). The depletion of red blood cells is not complete and the enriched plasma obtained contains residual red blood cells.
  • Particles can be classified into several types of particles, including red blood cells, white blood cells or platelets. Preferably, the particles do not undergo any prior marking.
  • FIG. 2A represents an image obtained by the photodetector 16.
  • This image represents a global diffraction figure, in which elementary diffraction figures can be distinguished, each elementary diffraction figure being respectively associated with the particles.
  • Each elemental diffraction pattern comprises a disk-shaped central area around which concentric, alternately dark and clear rings extend.
  • Such an elementary figure allows the selection of a particle to be identified, as well as the determination of the coordinates (x, y) of said particle in the detection plane P, said radial coordinates. These coordinates are for example the center of the elementary diffraction pattern corresponding to said particle.
  • Each elementary diffraction pattern is formed by the interference between the incident light wave 12 produced by the source 11, upstream of the sample, and a wave resulting from the diffraction of the incident wave by a particle.
  • the photodetector 16 is exposed to a light wave 22 formed by the superposition:
  • a processor 20 receives the images of the matrix photodetector 16, and performs a reconstruction of characteristic quantities of the light wave 22 to which the matrix photodetector is exposed, along the axis of propagation Z.
  • the microprocessor 20 is connected to a memory 23 able to store instructions for implementing the calculation steps described in this application. It can be connected to a screen 25. The In particular, reconstruction is performed between the matrix photodetector and the observed sample.
  • the processor 20 may be able to execute a sequence of instructions stored in a memory, for the implementation of the steps of the identification method.
  • the processor may be a microprocessor, or any other electronic computer capable of processing the images provided by the matrix photodetector, to perform one or more steps described in this description.
  • the image / acquired by the matrix photodetector shown in FIG. 2A represents the spatial distribution of the intensity I (x, y) of the light wave 22, where x and y designate the coordinates in the plane P of the photodetector. .
  • the propagation operator h (x, y, z) has the function of describing the propagation of light between the photodetector 16 and a coordinate point (x, y, z). It is then possible to determine the amplitude u (x, y, z) and the phase ç x, y, z) of this light wave at this distance I z I, called the reconstruction distance, with:
  • the application of the propagation operator makes it possible in particular to estimate the complex expression at a distance
  • the complex value of the light wave 22 is then reconstructed before the latter reaches the detector. This is called back propagation.
  • this backpropagation is implemented by applying a propagation operator h (x, y, -
  • the terms upstream and downstream are to be understood according to the direction of propagation of the incident wave 12.
  • a mathematical preprocessing is previously applied to the measured intensity I (x, y) before the holographic reconstruction. This improves the quality of results, including reducing artifacts when applying the propagation operator.
  • I (x, y) intensity measured by the photodetector at the (x, y) coordinate
  • Average (/) mean of the intensity measured in a region of interest of the image /, including said coordinate (x, y). This region of interest may correspond to the entire image formed by the photodetector. This pre-treatment is similar to a normalization of the intensity measured by the intensity of the incident light wave (12), the latter being estimated by the operator Average (/).
  • the propagation operator is the Fresnel-Helmholtz function, such that:
  • x 'and y' denote the coordinates in the plane of the photodetector
  • x and y denote the coordinates in the reconstruction plane, the latter being situated at a distance
  • z denotes the coordinate of the image reconstructed along the propagation axis Z of the incident light wave (12).
  • the coordinates (x n , y n ), in a plane parallel to the plane of the photodetector 16, of each particle n examined, are determined either by means of the acquired image I (x, y) or from a image û z at a given reconstruction height z.
  • FIG. 2B represents, for different types of particles, the evolution of the complementary amplitude û (x n , y n , z), as previously defined, as a function of the distance
  • particles 1 to 4 white blood cells designated by the acronym WBC,
  • red blood cells designated by the acronym BC
  • particles 7 to 9 platelets, designated by the letter PLT.
  • reconstruction varies between 1500 ⁇ .
  • each particle (1, ..., 9) was observed under a microscope, observation under the microscope serving as a reference measurement, allowing a certain identification.
  • the curve û (z) representing the evolution of the complementary amplitude as a function of the reconstruction distance has a minimum less than a threshold of amplitude ⁇ threshoid, followed by a rise towards the baseline BL, this ascent presenting marked oscillations;
  • the curve û (z) has a minimum between baseline BL and amplitude threshold ⁇ threshoid, followed by a monotonous rise towards baseline BL;
  • the curve û (z) follows the baseline BL and remains confined between two values BL ⁇ ⁇ .
  • û (x n , y n ) representing the evolution amplitude complementary to a plurality of reconstruction heights z, and use this profile to perform an identification of the particle between a red blood cell, a white blood cell and a wafer.
  • This profile can in particular be compared to a library of profiles made, during a learning phase, on known particles.
  • the profile û (z) representing the evolution of the complementary amplitude, along the axis of propagation Z (z coordinate axis) constitutes a signature of the type of the observed particle.
  • a complex image of a particle is not formed by carrying out a holographic reconstruction at a predetermined distance from the sample, but a characteristic of the wave 22, resulting from the diffraction of the sample, is reconstructed.
  • FIGS. 3A and 3B show complementary amplitude profiles û (z) of the wave 22 to which the detector is exposed, obtained respectively for 50 WBC white cells and 240 RBC red cells. Sufficient repeatability of the profiles is observed to allow a robust classification of the particles on the basis of this profile. These profiles were obtained under experimental conditions similar to those of the preceding example.
  • the sample used to make the measurements shown in Figure 3A is an enriched plasma similar to the sample described in connection with Figures 2A and 2B.
  • FIG. 3B The sample used to carry out the measurements shown in FIG. 3B comprises whole blood diluted in a phosphate phosphate buffer previously mentioned, dilution factor 1/400.
  • FIG. 4B represents complementary amplitude profiles û (z), along the Z axis, obtained for 4 platelets 101, 102, 103, 104, on a sample of enriched plasma type as previously described. Microscopic observation showed that platelets 101, 102, 103 and 104 were aggregated.
  • FIG. 4A represents a region of interest of the image I acquired by the photodetector 16. It makes it possible to identify the coordinates (xioi, yioi), (xio2, yio2), (xio3, yio3), (xio4, yio4) of each plate of the aggregate. These profiles were obtained under experimental conditions similar to those of the first example. It is observed that the profile û (z) is similar whether the platelets are aggregated or not, and remains confined around a baseline BL, in a gap BL ⁇ ⁇ . Thus, according to the identification method that is the subject of the invention, the platelets are correctly identified whether they are aggregated or not.
  • the distance ⁇ between the light source and the detector is 8 cm.
  • the sample is an enriched plasma as previously described.
  • a reconstruction of the complex expression U (x, y, z) of the wave 22 has been carried out at a plurality of distances z of the detector, and then at coordinates (x, y) of different particles, the complementary amplitude and the phase of the radiation.
  • the nature of the observed particles was confirmed by microscopic observation.
  • FIGS. 5A and 5B respectively represent the complementary amplitude û (x, y, z) and the phase ⁇ ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ) as a function of the distance z for different particles.
  • FIG. 5A it can be seen that:
  • the curve û (z) representing the evolution of the complementary amplitude as a function of the reconstruction distance has a marked minimum less than a threshold of amplitude ⁇ threshoid, followed by a ascent towards the base line BL, this ascent presenting marked oscillations;
  • the curve û (z) has a minimum between the base line BL and the amplitude threshold ⁇ threshoid, then the curve follows a monotonous rise towards the baseline BL;
  • the curve û (z) follows the baseline BL and remains confined between two values BL ⁇ ⁇ .
  • the curve ⁇ ( ⁇ ) representing the evolution of the phase ⁇ as a function of the reconstruction distance z has a maximum greater than a first phase threshold c threshoid 1 , then a lower minimum at a second threshoid phase threshold 2 , followed by a rise towards the baseline BL;
  • the ⁇ ( ⁇ ) curve has a maximum greater than said first threshoid phase threshold 1 and then a minimum greater than said second threshoid phase threshold 2 , then the curve follows a monotonous rise towards the baseline BL;
  • the curve ⁇ ( ⁇ ) representing the evolution of the phase ⁇ as a function of the reconstruction distance remains confined between the two values c threshoid 1 and c threshoid 2 .
  • the measured values remain between said first and second phase thresholds.
  • the procedure and the sample are similar to the previous example.
  • FIGS. 6A and 6B respectively represent the complementary amplitude û (x, y, z) and the phase ⁇ ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ) as a function of the distance z for different particles.
  • FIG. 6A it can be seen that:
  • the curve û (z) representing the evolution of the amplitude u as a function of the reconstruction distance z has a marked minimum less than a threshold of complementary amplitude ⁇ threshoid, followed by a rise towards the baseline BL, this rise having marked oscillations;
  • the curve û (z) has a minimum between the base line BL and the amplitude threshold ⁇ threshoid, then the curve follows a monotonous rise towards the baseline BL;
  • the curve û (z) follows the baseline BL and remains confined between two values BL ⁇ ⁇
  • the curve ⁇ ( ⁇ ) representing the evolution of the phase ⁇ as a function of the reconstruction distance z has a maximum greater than a first phase threshold c threshoid 1 , then a lower minimum at a second threshoid phase threshold 2 , followed by a rise towards the baseline BL;
  • the ⁇ ( ⁇ ) curve has a maximum greater than said first threshoid phase threshold 1 and then a minimum greater than said second threshoid phase threshold 2 , then the curve follows a monotonous rise towards the baseline BL;
  • the curve ⁇ ( ⁇ ) representing the evolution of the phase ⁇ as a function of the reconstruction distance z remains confined between two values c threshoid 1 , threshoid 2 -The measured values remain between said first and second phase thresholds.
  • the sample observed is an enriched plasma as previously described.
  • the analyzed particles are three white blood cells (WBC) and one red blood cell (BC). It is observed that, irrespective of the source, the fluctuations of the profile k z) are more important for white blood cells than for red blood cells.
  • first composite threshold kthreshoid 1 and a second composite threshold kthreshoid 2 it is possible to determine a first composite threshold kthreshoid 1 and a second composite threshold kthreshoid 2 , such that when the profile kz) remains lower than the first composite threshold kthreshoid 1 and greater than the second composite threshold kthreshoid 2 , the particle analyzed is a red blood cell. When the profile crosses one of these thresholds, the examined particle is identified as a white blood cell.
  • the application of a digital propagation operator h to an image / acquired, or hologram, by a matrix photodetector 16 may have certain limits, because the acquired image does not include any information relating to the phase. Also, prior to the profiling, it is preferable to have information relating to the phase of the light wave 22 to which the photodetector 16 is exposed. This information relating to the phase can be obtained by reconstructing an image. complex U z of the sample 14, according to methods described in the prior art, so as to obtain an estimate of the amplitude and the phase of the light wave 22 at the plane P of the matrix photodetector 16 or in a reconstruction plan P z located at a distance ⁇ z ⁇ of the latter. The inventors have developed a method based on the calculation of a complex reference image, described in connection with FIG. 8A. This process comprises the following steps:
  • this step is performed by applying the propagation operator h, previously described, to the acquired image / (steps 110 to 170).
  • This complex image is referred to as a reference image because it serves as a basis for the formation of the profile on the basis of which the particle is characterized.
  • Step 180 Selection of a radial position (x, y) of a particle in the detection plane or in a plane parallel thereto (step 180), either by using the complex reference image U re f or the image / acquired by the photodetector 16.
  • this characterization can be performed by comparing the profile obtained with standard profiles obtained during a calibration phase, using standard samples. (step 200).
  • Steps 110 to 170 constitute a preferred way of obtaining a reference complex image, noted U re f, this image representing a spatial distribution of the complex expression of the wave 22 in a reconstruction plane P z .
  • a reference complex image noted U re f
  • this image representing a spatial distribution of the complex expression of the wave 22 in a reconstruction plane P z .
  • Step 100 image acquisition
  • the image sensor 16 acquires an image / of the sample 14, and more precisely of the light wave 22 transmitted by the latter, to which the image sensor is exposed.
  • Such an image, or hologram, is shown in FIG. 8B. This image was made using a sample 14 comprising red blood cells bathed in a saline buffer, the sample being contained in a fluid chamber of thickness 100 ⁇ arranged at a distance d of 1500 ⁇ from a CMOS sensor, according to the previously described device.
  • Step 110 Initialization
  • This step is an initialization of the iterative algorithm described below. in connection with steps 120 to 180, the exponent k designating the rank of each iteration.
  • the image is normalized by a term representative of the intensity of the light wave 12 incident on the sample 14.
  • the image UQ _1 obtained in the plane of the sample is propagated in a reconstruction plane P Z , by the application of a propagation operator as previously described, so as to obtain an image complex U Z , representative of the sample 14, in the reconstruction plane P Z.
  • the propagation is carried out by convolution of the image UQ _1 by the propagation operator h_ z , so that:
  • U k _1 is the complex image in the detection plane P set. day during the previous iteration.
  • the reconstruction plane P z is a plane remote from the detection plane P, and preferably parallel to the latter.
  • the reconstruction plane P z is a plane P 14 along which the sample 14 extends. Indeed, an image reconstructed in this plane makes it possible to obtain a generally high spatial resolution. It may also be another plane, located a non-zero distance from the detection plane, and preferably parallel to the latter, for example a plane extending between the matrix photodetector 16 and the sample 14.
  • Step 130 Calculating an indicator in several pixels
  • a quantity e k (x, y) associated with each pixel of a plurality of pixels (x, y) of the complex image U k , and preferably in each of these pixels, is calculated.
  • This quantity depends on the value U k (x, y) of the image U k , or of its module, at the pixel (x, y) at which it is calculated. It can also depend on a dimensional derivative of the image in this pixel, for example the module of a dimensional derivative of this image.
  • the magnitude s k (x, y) associated with each pixel is a modulus of a difference of the image U k , at each pixel, and the value 1.
  • Such a quantity can be obtained according to the expression :
  • Step 140 establishing a noise indicator associated with the image U k .
  • step 130 we have calculated quantities s k (x, y) in several pixels of the complex image U k . These quantities can form a vector E fe , whose terms are the quantities s k (x, y) associated with each pixel (x, y).
  • an indicator said noise indicator, is calculated from a vector standard E fe .
  • a norm is associated with an order, so that the norm
  • the inventors have indeed considered that the use of a standard of order 1, or of order less than or equal to 1, is particularly suitable. to such a sample, as explained below.
  • the magnitude s k (x, y) calculated from the complex image U k , at each pixel (x, y) of the latter, is summed so as to constitute a noise indicator s k associated with the complex image U k .
  • s k ⁇ (3 ⁇ 4 y) k (x, y) Due to the use of a standard of order 1, or of order less than or equal to 1, the value of the noise indicator s k decreases when the complex image U k is more and more representative of the sample.
  • the algorithm proceeds with a gradual adjustment of the phase (p k (x, y) in the detection plane P, so as to progressively minimize the indicator s k .
  • the image U k in the detection plane is representative of the light wave 22 in the detection plane P, both from the point of view of its intensity and of its phase.
  • the steps 120 to 160 are aimed at establishing, iteratively, the value of the phase ⁇ p k (x, y) of each pixel of the image U k , minimizing the indicator s k , the latter being obtained on the image U k obtained by propagation of the image U k _1 in the reconstruction plane P z .
  • the minimization algorithm may be a gradient descent algorithm or a conjugate gradient descent algorithm, the latter being described below.
  • Step 150 Adjust the value of the phase in the detection plane.
  • Step 150 aims to determine a value of the phase ⁇ p k (x, y) of each pixel of the complex image U k so as to minimize the indicator s k + 1 resulting from a propagation of the image complex U k in the reconstruction plane P z , during the next iteration k + 1.
  • a phase vector ⁇ is established, each term being the phase ⁇ p k (x, y) of a pixel (x, y) of the complex image U k .
  • the dimension of this vector is (N P i X , 1), where N P i X denotes the number of pixels considered.
  • This vector is updated during each iteration, by the following update expression:
  • ⁇ Po (x, y) ⁇ Po -1 (x ⁇ y) + a k p k (x, y) where:
  • k is an integer, denoted by the term "step”, and representing a distance
  • p k is a vector of direction, of dimension (N P i X , 1), each term of which p (x, y) forms a direction of the gradient Vs k of the indicator s k .
  • V k is a gradient vector, of dimension (N P i X , 1), each term of which represents a variation of the indicator s k as a function of each of the degrees of freedom of the unknowns of the problem, i.e. say the terms of the vector ⁇ ⁇ . ;
  • PFE-i is an ith t r d e leadership had established in the previous iteration
  • ⁇ ⁇ is scale factor applied to the direction vector p fe_ 1 .
  • Im represents the imaginary part operator and r 'represents a coordinate (x, y) in the detection plane.
  • the scaling factor ⁇ ] ⁇ can be expressed in such a way that:
  • the step a k may vary according to the iterations, for example between 0.03 during the first iterations and 0.0005 during the last iterations.
  • the updating equation makes it possible to obtain an adjustment of the vector ⁇ , which results in an iterative update of the phase ⁇ (x, y) in each pixel of the complex image UQ.
  • This complex image UQ, in the detection plane, is then updated by these new values of the phase associated with each pixel.
  • Step 160 Reiteration or algorithm output.
  • step 160 consists in repeating the algorithm, by a new iteration of steps 120 to 160, on the basis of the complex image UQ updated during the step 150.
  • the convergence criterion can be a predetermined number K of iterations, or a minimal value of the gradient Vs k of the indicator, or a difference considered negligible between two phase vectors ⁇ j "o _ 1 , ⁇ Po consecutive.
  • Step 170 Obtain the reference complex image.
  • the complex reference image U re f is the complex image UQ resulting from the last iteration in the detection plane P.
  • this alternative is however less advantageous because the spatial resolution in the detection plane P is lower than in the reconstruction plane P Z , especially when the reconstruction plane P Z corresponds to a plane P 14 along which the sample 14 extends.
  • the spatial resolution of this image allows a good identification of the radial coordinates (x, y) of each particle.
  • Step 180 Selection of radial coordinates particle.
  • the radial coordinate term designates a coordinate in the detection plane or in the reconstruction plane. It is also conceivable to make this selection from the hologram / 0 or from the complex image U Q obtained in the detection plane following the last iteration.
  • FIG. 8C shows the selection of a particle, surrounded by a dashed outline.
  • Step 185 Applying a Propagation Operator
  • the complex reference image U re f is propagated according to a plurality of reconstruction distances, using a propagation operator h as previously defined, so as to have a plurality of complex images. , say secondary, U re f iZ reconstructed at different distances from the detection plane P or the reconstruction plane P z .
  • the values z min and z max are the minimum and maximum coordinates, along the Z axis, according to which the complex reference image is propagated.
  • the complex images are reconstructed according to a plurality of coordinates z between the sample 14 and the image sensor 16.
  • the complex images can be formed on either side of the sample 14.
  • These secondary complex images are established by applying a holographic reconstruction operator h to the reference image U re f.
  • the latter is a complex image correctly describing the light wave 22 to which the image sensor is exposed, in particular at its phase, following the iterations of steps 120 to 160. Therefore, the secondary images U re f iZ form a good descriptor of the propagation of the light wave 22 along the axis of propagation Z.
  • Step 190 Form a profile During this step, from each secondary complex image U re f iZ , a characteristic quantity, as previously defined, of the light wave 22 is determined so as to determine a profile representing the evolution of said characteristic quantity according to the propagation axis Z.
  • the characteristic quantity may be, for example the module or the phase, or their combination.
  • FIG. 8D represents the evolution of the phase ⁇ p (z) of the light wave 22 along the axis of propagation Z.
  • the particle can then be characterized from the profile formed in the previous step.
  • the characterization is then performed by a comparison or classification of the profile formed on the basis of the standard profiles.
  • FIGS. 9A-9E Another example is shown in Figures 9A-9E.
  • the sample comprises red blood cells diluted in an aqueous solution comprising a buffer PBS (Saline Phosphate Buffer) diluted 1/400.
  • the sample 14 was placed in a fluid chamber 15 with a thickness of 100 ⁇ m, placed at a distance of 8 cm from the light-emitting diode previously described, whose spectral band is centered on 450 nm.
  • the sample is placed at a distance of 1.5 mm from the previously described CMOS image sensor.
  • the opening of the spatial filter 18 is 150 ⁇ .
  • Figure 9A shows the image / acquired by the image sensor.
  • a red blood cell has been identified, the latter being surrounded by dots on each of these images.
  • the radial coordinates (x, y) of this red blood cell have been extracted. From the complex secondary images A re f Z , a profile u (z) representative of the module and a profile ⁇ ( ⁇ ) representative of the phase of the light wave 22 reaching the image sensor 16 have been formed.
  • each point of the profile is respectively obtained by determining the module and the phase of a secondary image to said radial coordinates.
  • FIGS. 9D and 9E respectively represent the profile of the module and the phase of the red blood cell thus selected.
  • the reconstruction plane is located at 1380 ⁇ from the detection plane, which corresponds to the abscissa 76 in FIGS. 9D and 9E.
  • the described method is not limited to blood and can be applied to other body fluids, eg urine, cerebrospinal fluid, bone marrow, etc. Moreover, the method can be applied to non-bodily fluids, in particular for the analysis of pollutants or toxins in water or other aqueous solution.
  • the method also applies to the detection and identification of particles placed in a non-liquid medium, for example an agar or the dry residue of a body fluid, for example a blood smear resulting in an extensive deposition of dry blood. on a blade.
  • a non-liquid medium for example an agar or the dry residue of a body fluid, for example a blood smear resulting in an extensive deposition of dry blood. on a blade.
  • the particles are isolated from each other by dry residues or air.
  • the particles may be endogenous (for example blood particles) or exogenous (microbeads, droplets).
  • endogenous for example blood particles
  • exogenous microbeads, droplets
  • the examples described above expose simple identification criteria, based on the evolution of the profile of a characteristic quantity as a function of the reconstruction distance, and comparisons using pre-established thresholds. The validity of the criteria is related to the medium in which the particles are placed, as well as to the sample preparation protocol. Other criteria may apply to particles having undergone a different preparation protocol.
  • the identification criteria can be defined during a learning phase, carried out on standard samples, comprising known particles.

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Abstract

L'invention est un procédé pour identifier une particule contenue dans un échantillon comportant l'illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière, cette dernière produisant une onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon, puis l'acquisition, à l'aide d'un photodétecteur matriciel, d'une image de l'échantillon, l'échantillon étant disposé entre ladite source de lumière et le photodétecteur, de telle sorte que le photodétecteur matriciel est exposé à une onde lumineuse comprenant des interférences entre l'onde lumineuse incidente et une onde de diffraction produite par chaque particule. Le procédé est caractérisé en ce qu'il comporte l'application d'un algorithme de reconstruction numérique à l'image acquise par le photodétecteur, pour estimer une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse parvenant au détecteur, à une pluralité de distances du photodétecteur. L'évolution de la grandeur caractéristique en fonction de la distance permet d'identifier la particule.

Description

Procédé d'analyse de particules
Description
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention se situe dans le domaine du comptage et de l'identification de particules présentes dans un liquide et en particulier un fluide corporel, par exemple du sang.
ART ANTERIEUR
Les liquides corporels, en particulier le sang, peuvent comprendre des particules, par exemple des cellules, dont il est utile de connaître le nombre et le type. Dans le sang, par exemple, les analyses de type numération et formule sanguine, ou hémogrammes, sont des examens couramment pratiqués en laboratoire d'analyse. Ce type d'analyse permet de déterminer le nombre et d'identifier les principaux constituants du sang, en particulier des cellules de la lignée des globules rouges, des globules blancs, ou des plaquettes. Ces examens sont couramment pratiqués, à l'aide d'automates performants, mais on recherche des méthodes plus simples, moins onéreuses, permettant d'obtenir des performances comparables.
Un des axes de recherche est l'utilisation de méthodes optiques simples, telle l'imagerie sans lentille. L'observation de particules biologiques par imagerie sans lentille connaît un certain développement depuis la fin des années 2000. Cette technique consiste à intercaler un échantillon entre une source de lumière et un photodétecteur matriciel, ou capteur d'image. L'image recueillie sur le photodétecteur est formée par des interférences entre l'onde incidente, produite par la source de lumière et l'onde diffractée par les particules composant l'échantillon. Cette image est fréquemment désignée par le terme « hologramme ». Ainsi, pour chaque particule, on peut enregistrer au niveau du capteur un motif de diffraction, ou figure de diffraction, qui lui est propre. Appliquée à des échantillons biologiques, cette technique a été décrite dans le document WO2008090330. Il est alors possible d'effectuer une analyse simple de chaque particule, en comparant la figure de diffraction qu'elle engendre avec des figures de diffraction préalablement établies, correspondant à des particules connues. Mais cette méthode peut trouver des limites lorsque la concentration des particules augmente. En effet, le comptage et l'identification de particules sur la seule base des figures de diffraction détectées par le capteur d'image montre une certaine limite lorsque la concentration de particules dans l'échantillon augmente. En particulier, lorsque l'échantillon est du sang, et que les particules sont des globules rouges, au-delà de 100000 particules par μΙ, leur dénombrement n'est plus fiable, comme cela a été reporté dans la publication Seo Sungjyu, « High-throughput lensfree blood analysis on a chip », Anal Chem, 2010 June 1. Il est possible d'appliquer des traitements mathématiques dits de reconstruction holographique numérique afin d'établir une image, dite image complexe, de chaque particule présente dans l'échantillon. Cette méthode consiste à retro-propager l'onde lumineuse dans le plan objet, dans lequel sont situées les particules, ce dernier étant placé à une distance connue de l'imageur. La publication citée ci- dessus montre qu'une telle reconstruction holographique permet d'effectuer un comptage de globules rouges, présents en concentration élevée dans un échantillon. Cette publication montre que, sur l'image complexe reconstruite, les globules blancs, ayant subi un marquage préalable, ont une signature différente de celle des globules rouges.
Le document US2014/0327944 décrit également une méthode de classification de particules, par exemple des particules sanguines, sur la base d'hologrammes, en comparant des hologrammes acquis par un capteur d'image à une bibliothèque d'hologrammes simulés. Mais ce procédé se heurte aux même limites, à savoir une mise en œuvre délicate lorsque la densité des particules est élevée.
Des procédés permettant de reconstruire une image complexe de cellules, en l'occurrence des spermatozoïdes, sont également décrits dans les documents US2012/0148141, ou WO2014/012031. Mais ces méthodes permettent d'estimer des propriétés desdites cellules, ainsi que leur trajectoire, à partir de l'image complexe reconstruite. Il en est de même du document US2009/0290156, qui décrit une classification de particules sur la base d'une image complexe desdites particules, ainsi qu'un suivi de la trajectoire desdites particules. Or, le recours à une image complexe d'un échantillon peut être insuffisant pour identifier une particule. On recherche un procédé d'identification de particules, et en particulier de cellules sanguines, pouvant s'appliquer à des échantillons dans lesquels la concentration en particules est élevée. Le procédé doit par ailleurs présenter un champ d'observation étendu, et doit être simple à mettre en œuvre, en évitant notamment un marquage préalable de particules. Par ailleurs, le procédé doit permettre de discriminer de façon fiable les particules susceptibles de se trouver dans un fluide corporel, en particulier les cellules des lignées des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes. Par ailleurs, on recherche une méthode ne nécessitant pas une connaissance précise de la distance entre les particules et le photodétecteur.
EXPOSE DE L'INVENTION
L'invention répond à ce problème, en proposant un procédé pour identifier une particule présente dans un échantillon, par exemple un échantillon d'un liquide biologique, tel du sang, le procédé comportant les étapes suivantes :
illumination dudit écha ntillon à l'aide d'une source de lumière, la source de lumière produisant u ne onde lumineuse incidente se propageant vers l'échantillon selon un axe de propagation ;
- acquisition, à l'aide d'un photodétecteur matriciel, d'une image de l'échantillon, l'échantillon étant disposé entre ladite source de lumière et ledit photodétecteur, de telle sorte que le photodétecteur matriciel est exposé à une onde lumineuse comprenant des interférences entre l'onde lumineuse incidente et une onde de diffraction produite par chaque particu le ;
le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes :
détermination d'une position de ladite particule dans un plan parallèle à un plan selon lequel s'étend le photodétecteur matriciel ;
application d'un algorithme de reconstruction numérique à ladite image acquise, de façon à estimer au moins une grandeur caractéristique de ladite onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel, à une pluralité de distances de reconstruction de ce dernier ;
détermination d'un profil, représentant une évolution de ladite grandeur caractéristique en fonction de ladite distance de reconstruction, selon un axe parallèle audit axe de propagation et passant par ladite position ;
- identification de la particule en fonction dudit profil.
Par application d'un algorithme de reconstruction numérique, on entend l'application d'un opérateur de propagation à une image, généralement sous la forme d'un produit de convolution.
La grandeur caractéristique peut être obtenue en estimant, à chaque distance de reconstruction une expression complexe de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel. La grandeur caractéristique peut être déterminée à partir du module de ladite expression complexe, auquel cas elle est représentative de l'amplitude de ladite onde lumineuse à laquelle est exposé le détecteur. La grandeur caractéristique peut être déterminée à partir de l'argument de ladite expression complexe, auquel cas elle est représentative de la phase de ladite onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel.
Selon un mode de réalisation, le procédé comporte :
- la détermination d'une image complexe, dite image complexe de référence, par application d'un algorithme de reconstruction numérique à l'image acquise par le photodétecteur matriciel ;
à partir de ladite image complexe de référence, l'estimation d'au moins une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel, à une pluralité de distances de reconstruction de ce dernier.
Le procédé peut alors comporter :
l'application d'un opérateur de propagation à l'image complexe de référence, de façon à calculer des images complexes dites secondaires, selon une pluralité de distances du plan de reconstruction ou du plan selon lequel s'étend le photodétecteur matriciel ; - la détermination d'une grandeur caractéristique à chacune desdites distances, à partir de chaque image complexe secondaire.
L'image complexe de référence peut être une image complexe formée dans un plan de reconstruction, distant du plan de l'échantillon. Il peut également s'agir d'une image complexe formée dans le plan de détection.
L'identification peut être élaborée en comparant l'évolution de la dite grandeur caractéristique à des profils types déterminés au cours d'une phase d'apprentissage.
La position de chaque particule, dans un plan parallèle au plan du photodétecteur matriciel, peut être déterminée à l'aide de l'image acquise par le photodétecteur ou à l'aide de l'expression complexe de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur.
La source de lumière est de préférence une source spatialement cohérente, et par exemple une diode électroluminescente, auquel cas un filtre spatial est de préférence disposé entre la source de lumière et l'échantillon. La source de lumière peut être temporellement cohérente, en étant par exemple une diode laser.
Le photodétecteur matriciel comporte une matrice de pixels, aptes à collecter l'onde à laquelle est exposé le photodétecteur. La distance entre les pixels et l'échantillon peut varier entre 50 μιη et 2 cm, et de préférence entre 100 μιη et 5 mm. De préférence l'échantillon n'est pas disposé au contact direct des pixels du photodétecteur. De préférence, aucune optique de grossissement n'est disposée entre l'échantillon et le photodétecteur matriciel.
L'échantillon peut notamment comporter des cellules sanguines. Dans ce cas, les particules peuvent être identifiées parmi les lignées cellulaires des globules blancs, des globules rouges ou plaquettes.
Un autre objet de l'invention est un dispositif pour identifier une particule, la dite particule étant contenue dans un échantillon, le dispositif comprenant :
une source de lumière agencée pour produire une onde lumineuse incidente, selon un axe de propagation, en direction dudit échantillon ;
un support, pour maintenir l'échantillon entre ladite source de lumière et un photodétecteur matriciel ;
le photodétecteur matriciel, agencé pour acquérir une image de l'échantillon, le photodétecteur matriciel étant apte à être exposé à une onde lumineuse, résultant de l'interférence entre ladite onde lumineuse incidente et une onde de diffraction formée par ladite particule ;
caractérisé en ce que le dispositif comporte un processeur, de type calculateur électronique ou microprocesseur, configuré pour mettre en œuvre les opérations suivantes :
détermination d'une position de ladite particule dans un plan parallèle au plan du photodétecteur matriciel ;
application d'un algorithme de reconstruction numérique à ladite image acquise, de façon à estimer au moins une grandeur caractéristique de ladite onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel, à une pluralité de distances de reconstruction de ce dernier ;
détermination d'un profil, représentant l'évolution de ladite grandeur caractéristique en fonction de ladite distance de reconstruction, selon un axe parallèle audit axe de propagation et passant par ladite position ;
identification de la particule en fonction dudit profil.
De préférence, le dispositif ne comporte pas d'optique de grossissement entre le photodétecteur matriciel et l'échantillon analysé.
Le processeur peut comporter ou être relié à une mémoire programmable, comprenant une séquence d'instructions permettant la mise en œuvre des étapes précédemment décrites. Il peut en particulier être apte à : déterminer, à chaque distance de reconstruction, l'expression complexe du rayonnement optique auquel est exposé le détecteur,
estimer la dite grandeur caractéristique, à chaque distance de reconstruction, en déterminant le module ou l'argument de ladite amplitude complexe.
FIGURES
La figure 1 représente le dispositif selon un mode de réalisation de l'invention.
La figure 2A représente une image acquise par le photodétecteur matriciel.
La figure 2B représente le profil d'une grandeur caractéristique, dite amplitude complémentaire, de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance par rapport au photodétecteur, selon un premier exemple, pour différents types de particules.
La figure 3A représente le profil d'une grandeur caractéristique, dite amplitude complémentaire, de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance par rapport au photodétecteur, pour différents globules blancs, selon ce premier exemple.
La figure 3B représente le profil d'une grandeur caractéristique, dite amplitude complémentaire, de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance par rapport au photodétecteur, pour différents globules rouges, selon ce premier exemple.
La figure 4A représente une région d'intérêt de l'image acquise par le photodétecteur, centrée sur un agrégat de plaquettes, selon ce premier exemple.
La figure 4B représente le profil d'une grandeur caractéristique, dite amplitude complémentaire, de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, pour différentes plaquettes faisant partie de l'agrégat représenté sur la figure 4A.
La figure 5A représente le profil d'une grandeur caractéristique, dite amplitude complémentaire, de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance par rapport au photodétecteur, pour différents types de particules, selon un deuxième exemple. La figure 5B représente le profil de la phase de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance z par rapport au photodétecteur, pour différents types de particules, selon un deuxième exemple.
La figure 6A représente le profil d'une grandeur caractéristique, dite amplitude complémentaire, de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance par rapport au photodétecteur, pour différents types de particules, selon un troisième exemple.
La figure 6B représente le profil de la phase de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance par rapport au photodétecteur, pour différents types de particules, selon un troisième exemple. Les figures 7A, 7B et 7C représentent respectivement le profil d'une grandeur composite caractéristique de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur, en fonction de la distance, selon les premier, deuxième et troisième exemples.
Les figures 8A, 8B, 8C et 8D représentent respectivement :
- un procédé permettant le calcul d'une image complexe, dite image complexe de référence, d'un échantillon dans un plan de reconstruction ;
un hologramme acquis par le photodétecteur matriciel ;
une représentation d'une image, dite image complexe de référence, reconstruite après plusieurs itérations du procédé représenté sur la figure 8A.
- un profil obtenu sur la base d'images complexes secondaires formées à partir de l'image complexe de référence.
La figure 9A est un hologramme acquis par un capteur d'image, l'échantillon comportant des globules rouges dispersées dans une solution aqueuse. Les figures 9B et 9C représentent respectivement le module et la phase d'une image complexe, dite de référence, cette image complexe étant formée dans un plan de reconstruction. Les figures 9D et 9E sont des profils représentant respectivement une évolution du module et de la phase de l'onde lumineuse auquel le capteur d'image est exposé, le long d'un axe de propagation passant par un globule rouge.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
La figure 1 représente un exemple de dispositif objet de l'invention. Une source de lumière 11 est apte à produire une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, en direction d'un échantillon 14, selon un axe de propagation Z. L'échantillon 14 comporte un milieu 10, par exemple un liquide biologique, comportant des particules 1, 2, 3, 4, 5,.., 9, que l'on souhaite identifier parmi des types de particules prédéterminés. Une particule peut être une cellule. En particulier, lorsque le milieu 10 est du sang, ou une solution comportant du sang, une particule peut être un globule rouge, un globule blanc ou une plaquette.
Une particule peut également être une microbille, organique ou inorganique, par exemple une microbille métallique, une microbille de polymère ou de verre, ce type de microbille étant couramment mis en œuvre dans la réalisation de protocoles biologiques. Une particule peut également être une gouttelette, par exemple une gouttelette lipidique, baignant dans le milieu 10. Il peut également s'agir d'un microorganisme, par exemple une bactérie ou une levure, ou d'un exosome. D'une façon générale, une particule a une taille avantageusement inférieure à 1 mm, voire inférieure à 500 μιη, et de préférence une taille comprise entre 0.5 μιη et 500 μιη. Ainsi, le terme particule désigne à la fois des particules endogènes, initialement présentes dans l'échantillon examiné, et des particules exogènes, ajoutées à cet échantillon avant l'analyse.
Le milieu 10 est le plus fréquemment un milieu liquide, et notamment un liquide corporel, mais il peut également d'agir d'une gélose, ou de l'air, ou le résidu sec d'un liquide.
Le procédé objet de l'invention permet d'identifier chaque particule observée. Par identification, on entend la classification de la particule dans une classe de particules prédéterminée. Il peut s'agir d'une détermination d'une nature d'une particule parmi des natures prédéterminées, ou d'une détermination d'une taille d'une particule parmi des natures prédéterminées. La distance Δ entre la source de lumière et l'échantillon est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. De préférence, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieure au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Ainsi, la lumière parvient à l'échantillon sous la forme d'ondes planes, ou pouvant être considérées comme telles.
La source de lumière 11 peut être ponctuelle, ou être associée à un diaphragme, ou filtre spatial, non représenté sur la figure 1, de façon à apparaître ponctuelle. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 μιη et 1mm, de préférence entre 50 μιη et 500 μιη.
Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à une source lumineuse, et dont une deuxième extrémité est placée face à l'échantillon. Dans ce cas, ladite deuxième extrémité peut être assimilée à une source de lumière ponctuelle 11.
L'échantillon 14 est délimité par une enceinte, comportant un fond 15 et un couvercle 13. Les parois latérales de l'enceinte ne sont pas représentées. Dans l'exemple considéré, l'enceinte est une chambre fluidique Neubauer C-chip. La distance entre le fond 15 et le couvercle 13 est de 100 μιη. D'une façon générale, l'épaisseur de l'enceinte, selon l'axe de propagation Z, est inférieure à quelques cm, par exemple inférieure à 1 cm, voire inférieure à 1 mm, par exemple comprise entre 50 μιη et 500 μιη.
La source de lumière 11 peut être temporellement cohérente mais cela n'est pas nécessaire. Dans ce premier exemple, la source de lumière est une diode Laser émettant à la longueur d'onde de 450 nm. Elle est située à une distance de 15 cm de l'échantillon. L'échantillon 14 est disposé entre la source de lumière 11 et un photodétecteur matriciel, ou capteur d'image, 16. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au fond 15 de l'enceinte délimitant l'échantillon.
Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 10° étant admise.
De préférence, la source de lumière est de faible largeur spectrale, par exemple inférieure à 100 nm, voire 20 nm et encore de préférence inférieure à 5 nm. Le terme largeur spectrale désigne la largeur à mi-hauteur du pic d'émission de la source de lumière. Le photodétecteur 16 peut être un photodétecteur matriciel, comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Les CMOS sont les photodétecteurs préférés car la taille des pixels est plus faible, ce qui permet d'acquérir des images dont la résolution spatiale est plus favorable. Dans cet exemple, le détecteur est un capteur 12 bits APTINA, référence MT9P031. Il s'agit d'un capteur CMOS RGB, dont le pas inter-pixels est de 2,2 μιη. La surface utile du photodétecteur est de 5,7 x 4,3 mm2.
Le photodétecteur s'étend selon un plan de détection P, de préférence perpendiculaire à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12.
De préférence, le photodétecteur comprend une matrice de pixels, au-dessus de laquelle est disposée une fenêtre de protection transparente. La distance entre la matrice de pixels et la fenêtre de protection est généralement comprise entre quelques dizaines de μιη à 150 ou 200 μιη. Les photodétecteurs dont le pas inter pixel est inférieur à 3 μιιι sont préférés, afin d'améliorer la résolution spatiale de l'image.
La distance d entre les particules 1,2,...9 et la matrice de pixels du photodétecteur 16 est, dans cet exemple, égale à 1,5 mm. Mais elle peut fluctuer selon l'épaisseur de la chambre fluidique utilisée. D'une manière générale, et cela quel que soit le mode de réalisation, la distance d entre une particule et les pixels du photodétecteur est préférentiellement comprise entre 50 μιη et 2 cm, de préférence comprise entre 100 μιη et 2 mm.
On remarque l'absence d'optique de grossissement entre le photodétecteur matriciel 16 et l'échantillon 14. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du photodétecteur 16. Dans ce premier exemple, l'échantillon est du plasma enrichi en globules blancs, obtenu selon un protocole usuel, après sédimentation des globules rouges en présence de Dextran (Sigma Aldrich référence D4876) 6% en solution Alsever, puis récupération du plasma riche globules blancs et en plaquettes. Le plasma obtenu est alors dilué dans un tampon PBS à pH physiologique (acronyme de l'anglais Phosphate Buffer Saline - Tampon Phosphate Salin). La déplétion des globules rouges n'est pas totale et le plasma enrichi obtenu comporte des globules rouges résiduels.
Les particules peuvent être classifiées parmi plusieurs types de particules, et notamment les globules rouges, les globules blancs ou les plaquettes. De préférence, les particules ne subissent aucun marquage préalable.
La figure 2A représente une image obtenue par le photodétecteur 16. Cette image représente une figure de diffraction globale, dans laquelle on distingue des figures de diffraction élémentaires, chaque figure de diffraction élémentaire étant respectivement associée aux particules. Chaque figure de diffraction élémentaire comprend une zone centrale en forme de disque, autour de laquelle s'étendent des anneaux concentriques, alternativement sombres et clairs. Une telle figure élémentaire permet la sélection d'une particule à identifier, ainsi que la détermination des coordonnées (x, y) de ladite particule dans le plan de détection P, dites coordonnées radiales. Ces coordonnées sont par exemple le centre de la figure de diffraction élémentaire correspondant à ladite particule. Chaque figure de diffraction élémentaire est formée par l'interférence entre l'onde lumineuse incidente 12 produite par la source 11, en amont de l'échantillon, et une onde résultant de la diffraction de l'onde incidente par une particule. Ainsi, le photodétecteur 16 est exposé à une onde lumineuse 22 formée par la superposition :
- de l'onde lumineuse 12 émis par la source 11, en amont de l'échantillon 14,
- de l'onde lumineuse diffractée par chacune des particules ou autres éléments diffractants, présents dans l'échantillon 14.
Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, reçoit les images du photodétecteur matriciel 16, et effectue une reconstruction de grandeurs caractéristiques de l'onde lumineuse 22 à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel, le long de l'axe de propagation Z. Le microprocesseur 20 est relié à une mémoire 23 apte à stocker des instructions pour la mise en œuvre des étapes de calcul décrites dans cette demande. Il peut être relié à un écran 25. La reconstruction est notamment réalisée entre le photodétecteur matriciel et l'échantillon observé.
Le processeur 20 peut être apte à exécuter une séquence d'instructions stockées dans une mémoire, pour la mise en œuvre des étapes du procédé d'identification. Le processeur peut- être un microprocesseur, ou tout autre calculateur électronique apte à traiter les images fournies par le photodétecteur matriciel, pour exécuter une ou plusieurs étapes décrites dans cette description.
L'image /, acquise par le photodétecteur matriciel, représentée sur la figure 2A représente la distribution spatiale de l'intensité I(x, y), de l'onde lumineuse 22, x et y désignant les coordonnées dans le plan P du photodétecteur.
Selon les principes bien connus de la reconstruction holographique numérique, décrits dans la publication yle et al, « Digital in-line holography of biological spécimens », Proc. Of SPIE Vol.6311 (2006), en effectuant un produit de convolution entre l'intensité I(x, y) mesurée par le photodétecteur, et un opérateur de propagation h(x, y, z) , il est possible de reconstruire une expression complexe U(x, y, z) de l'onde lumineuse 22 en tout point de coordonnées (x, y, z) de l'espace, et en particulier dans un plan situé à une distance | z | du photodétecteur.
L'opérateur de propagation h(x, y, z) a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le photodétecteur 16 et un point de coordonnées (x, y, z). Il est alors possible de déterminer l'amplitude u(x, y, z) et la phase ç x, y, z) de cette onde lumineuse à cette distance I z I , dite distance de reconstruction, avec :
u(x, y, z) = abs [U(x, y, z)] ,
- φ χ, y, z) = arg [U (x, y, z)]
Les opérateurs abs et arg désignent respectivement le module et l'argument.
L'application de l'opérateur de propagation permet en particulier d'estimer l'expression complexe à une distance |z| du photodétecteur, en amont de ce dernier. On reconstruit alors la valeur complexe de l'onde lumineuse 22 avant que cette dernière n'atteigne le détecteur. On parle alors de rétro-propagation. En attribuant la coordonnée z = 0 au plan de détection P, cette rétro-propagation est mise en œuvre en appliquant un opérateur de propagation h(x, y,— |z|). Les termes en amont et en aval sont à comprendre selon le sens de propagation de l'onde incidente 12. Si I(x, y) = I(x, y, z = 0) correspond à l'intensité du signal mesuré par le photodétecteur, une relation entre l'intensité mesurée I(x, y) et l'expression complexe de l'onde lumineuse U(x, y), au niveau du plan de détection P est donnée par : I(x, y) = \ U(x, y) \ 2.
L'expression complexe de l'onde lumineuse (22), à une coordonnée (x, y, z) est donnée par U (x, y, z) = J/(x, y) * h(x, y, z), le symbole * désignant un produit de convolution. avec : z < 0 dans le demi-espace délimité par le plan de détection P, comprenant l'échantillon 14
z > 0 dans le demi-espace délimité par le plan de détection P et ne comprenant pas l'échantillon 14.
Dans le demi espace délimité par le plan de détection P et comprenant l'échantillon 14, l'expression complexe de l'onde lumineuse peut également s'écrire :
U(x, y, z) = jl{x, y) * h(x, y, - \z\)
De préférence un pré-traitement mathématique est préalablement appliqué à l'intensité mesurée I(x, y) avant la reconstruction holographique. Cela permet d'améliorer la qualité des résultats, notamment en réduisant les artéfacts lors de l'application de l'opérateur de propagation.
Ainsi, on détermine une intensité î(x, y), dite intensité normalisée, telle que
7(x, y) = (I(x, y)— Average (I))/Average(I) avec
I(x, y) = intensité mesurée par le photodétecteur à la coordonnée (x, y),
Average (/) = moyenne de l'intensité mesurée dans une région d'intérêt de l'image /, incluant ladite coordonnée (x, y). Cette région d'intérêt peut correspondre à l'image entière formée par le photodétecteur. Ce pré-traitement s'apparente à une normalisation de l'intensité mesurée par l'intensité de l'onde lumineuse incidente (12), cette dernière étant estimée par l'opérateur Average (/).
Puis on détermine l'expression complexe de l'onde (22) à partir de l'intensité normalisée I(x, y) selon l'équation U(x, y, z) = J ï(x, y) * h x, y, z) comme préalablement explicité. La reconstruction numérique peut notamment reposer sur le modèle de diffraction de Fresnel.
Dans cet exemple, l'opérateur de propagation est la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que :
, . x
h(x, y, z) = —e TT exp(jn^-).
où désigne la longueur d'onde. Ainsi, U(x, y, z) = -j- eJ'27r (Y Jï(x' , y') ex (jn ^~x'^ ^y~y'^)dx'dy'
où
x' et y' désignent les coordonnées dans le plan du photodétecteur, x et y désignent les coordonnées dans le plan de reconstruction, ce dernier étant situé à une distance |z| du photodétecteur, - z désigne la coordonnée de l'image reconstruite selon l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente (12).
A partir des valeurs de l'expression complexe U (x, y, z), il est possible d'extraire des grandeurs caractéristiques de l'onde lumineuse 22 résultant de la diffraction, par les particules (1,2..9), du de l'onde lumineuse incidente 12 émise par la source 11. Comme précédemment évoqué, on peut évaluer l'amplitude u(x, y, z) ou la phase cp x, y, z), mais il est également possible d'évaluer toute fonction de l'amplitude ou de la phase.
On peut, par exemple, évaluer une grandeur caractéristique, dite amplitude complémentaire, û(x, y, z) telle que :
û(x, y, z) = abs(l — U (x, y, z))
A partir de chaque expression complexe reconstruite U(x,y,z), il est possible de constituer : une image uz de l'amplitude de l'onde 22, selon un plan parallèle au plan du détecteur, à une distance |z| de ce dernier, avec uz(x, y) = abs [U(x, y, z)], une image φζ de la phase de l'onde 22, selon un plan parallèle au plan du détecteur, à une distance |z| de ce dernier, avec φζ (x, ) = arg [U(x, y, z)], - une image i½ de l'amplitude complémentaire, telle que précédemment définie, de l'onde 22, selon un plan parallèle au plan du détecteur, à une distance |z| de ce dernier, avec i½(x, y, z) = abs [1— U(x, y, z)].
Dans ce premier exemple, - on reconstruit une image uz de l'amplitude complémentaire à une pluralité de coordonnées zi...zM, selon l'axe de propagation Z, M étant ici égal à 21,
- à partir de chaque image ΊΣ^ , avec 1 < m < M , on extrait la valeur û (xn,yn, zm), ,yn) représentant les coordonnées de la particule n dans un plan parallèle au pla n du photodétecteur 16,
- on obtient différentes valeurs de û (xn,yn,z), avec zm<z<zm=+i par interpolation entre deux grandeurs û (xn,yn,zm) et û (xn,yn,zm+i) précédemment déterminées.
Les coordonnées (xn,yn), dans un plan parallèle au plan du photodétecteur 16, de chaque particule n examinée, sont déterminées soit à l'aide de l'image acquise I(x, y) soit à partir d'une image ûz à une hauteur z de reconstruction donnée.
La figure 2B représente, pour différents types de particules, l'évolution de l'amplitude complémentaire û (xn,yn,z), telle que précédemment définie, en fonction de la distance | z | de reconstruction, pour 9 particules différentes :
particules 1 à 4 : globules blancs désignés par l'acronyme WBC,
particules 5 et 6 : globules rouges, désignés par l'acronyme BC,
particules 7 à 9 : plaquettes, désignées par le lettre PLT.
La distance | z | de reconstruction varie entre
Figure imgf000016_0001
1500 μιη.
Parallèlement à ces opérations, chaque particule (1,...,9) a été observée au microscope, l'observation au microscope servant de mesure de référence, permettant une identification de façon certaine.
On observe que pour l'échantillon étudié dans cet exemple:
pour les particules 1 à 4, qui sont des globules blancs WBC, la courbe û (z) représentant l'évolution de l'amplitude complémentaire en fonction de la distance de reconstruction présente un minimum inférieur à un seuil d'amplitude ûthreshoid, suivi d'une remontée vers la ligne de base BL, cette remontée présentant des oscillations marquées ;
pour les particules 5 et 6, corresponda nt à des globules rouges RBC, la courbe û (z) présente un minimum compris entre la ligne de base BL et le seuil d'amplitude ûthreshoid, suivi d'une remontée monotone vers la ligne de base BL ;
pour les particules 7 à 9, correspondant à des plaquettes PLT, la courbe û(z) suit la ligne de base BL et reste confinée entre deux valeurs BL ± ε. Ainsi, pour chaque particule n détectée, dont la position selon un plan parallèle au plan du détecteur est (xn,yn), il est possible d'établir un profil û (xn,yn,z) représentant l'évolution de l'amplitude complémentaire à une pluralité de hauteurs de reconstruction z, et d'utiliser ce profil pour effectuer une identification de la particule entre un globule rouge, un globule blanc et une plaquette.
Ce profil peut notamment être comparé à une bibliothèque de profils réalisés, au cours d'une phase d'apprentissage, sur des particules connues. Autrement dit, le profil û (z) représentant l'évolution de l'amplitude complémentaire, selon l'axe de propagation Z (axe des coordonnées z), constitue une signature du type de la particule observée. Contrairement à l'art antérieur, on ne forme pas une image complexe d'une particule en procédant à une reconstruction holographique à une distance prédéterminée de l'échantillon, mais on reconstruit une caractéristique de l'onde 22, résultant de la diffraction d'une particule avec l'onde incidente 12, le long de la direction propagation de l'onde incidente, à une pluralité de distances du photodétecteur. L'information obtenue est plus riche et permet une classification nette entre différents types de particules.
Les figures 3A et 3B représentent des profils d'amplitude complémentaire û (z), de l'onde 22 à laquelle est exposé le détecteur, obtenus respectivement pour 50 globules blancs WBC et 240 globules rouges RBC. On observe une répétabilité suffisante des profils pour permettre une classification robuste des particules sur la base de ce profil. Ces profils ont été obtenus dans des conditions expérimentales analogues à celles de l'exemple précédent.
L'échantillon utilisé pour réaliser les mesures représentées sur la figure 3A est un plasma enrichi similaire à l'échantillon décrit en lien avec les figures 2A et 2B.
L'échantillon utilisé pour réaliser les mesures représentées sur figure 3B comporte du sang total dilué dans un tampon phosphate salin PBS précédemment évoqué, facteur de dilution 1/400. La figure 4B représente des profils d'amplitude complémentaire û (z), selon l'axe Z, obtenus pour 4 plaquettes 101, 102, 103, 104, sur un échantillon de type plasma enrichi tel que précédemment décrit. L'observation au microscope a montré que les plaquettes 101, 102, 103 et 104 étaient agrégées.
La figure 4A représente une région d'intérêt de l'image I acquise par le photodétecteur 16. Elle permet d'identifier les coordonnées (xioi,yioi), (xio2,yio2), (xio3,yio3), (xio4,yio4) de chaque plaquette de l'agrégat. Ces profils ont été obtenus dans des conditions expérimentales analogues à celles du premier exemple. On observe que le profil û (z) est similaire que les plaquettes soient agrégées ou non, et reste confiné autour d'une ligne de base BL, dans un écart BL ± ε. Ainsi, selon le procédé d'identification objet de l'invention, les plaquettes sont correctement identifiées qu'elles soient agrégées ou non.
Dans un deuxième exemple, la source de lumière 11 est une diode électroluminescente blanche couplée à un filtre Oméga optical 485-DF-22, centré sur la longueur d'onde λ=485ηιη et de largeur à mi-hauteur égale à 22 nm. La distance Δ entre la source de lumière et le détecteur est égale à 8 cm. L'échantillon est un plasma enrichi tel que précédemment décrit. Selon cet exemple, on a effectué une reconstruction de l'expression complexe U(x, y, z) de l'onde 22 selon une pluralité de distances z du détecteur, puis on a déterminé, à des coordonnées (x, y) de différentes particules, l'amplitude complémentaire et la phase du rayonnement. On a alors établi des profils û(z) et φ(ζ) de l'amplitude complémentaire et de la phase en fonction de z. De même que dans les exemples précédents, la nature des particules observées a été confirmée par une observation au microscope.
Les figures 5A et 5B représentent respectivement l'amplitude complémentaire û(x, y, z)et la phase φ(χ, γ, ζ) en fonction de la distance z pour différentes particules. Sur la figure 5A, on observe que :
- pour les particules correspondant à des globules blancs WBC, la courbe û(z) représentant l'évolution de l'amplitude complémentaire en fonction de la distance de reconstruction présente un minimum marqué inférieur à un seuil d'amplitude ûthreshoid, suivi d'une remontée vers la ligne de base BL, cette remontée présentant des oscillations marquées ;
- pour les particules correspondant à des globules rouges BC, la courbe û (z) présente un minimum compris entre la ligne de base BL et le seuil d'amplitude ûthreshoid, puis la courbe suit une remontée monotone vers la ligne de base BL ;
pour les particules correspondant à des plaquettes PLT, la courbe û (z) suit la ligne de base BL et reste confinée entre deux valeurs BL ± ε.
Ainsi, pour chaque particule n détectée, dont la position selon un plan parallèle au plan du détecteur est (xn,yn), il est possible d'établir un profil û (xn,yn,z) représentant l'évolution de l'amplitude complémentaire û , telle que précédemment définie, de l'onde 22 à laquelle est exposée le détecteur, à une pluralité de hauteurs de reconstruction z, et d'utiliser ce profil pour effectuer une classification de la particule entre un globule rouge RBC, un globule blanc WBC et une plaquette PLT.
La classification est donc possible avec une source de lumière différente d'une source Laser. Sur la figure 5B, on observe que :
pour les particules correspondant à des globules blancs WBC, la courbe φ(ζ) représentant l'évolution de la phase φ en fonction de la distance de reconstruction z présente un maximum supérieur à un premier seuil de phase c threshoid1, puis un minimum inférieur à un deuxième seuil de phase c threshoid2, suivi d'une remontée vers la ligne de base BL ;
pour les particules correspondant à des globules rouges RBC, la courbe φ(ζ) présente un maximum supérieur audit premier seuil de phase c threshoid1 puis un minimum supérieur audit deuxième seuil de phase c threshoid2, puis la courbe suit une remontée monotone vers la ligne de base BL ;
- pour les particules correspondant à des plaquettes PLT, la courbe φ(ζ) représentant l'évolution de la phase φ en fonction de la distance de reconstruction reste confinée entre les deux valeurs c threshoid1 et c threshoid2 . Les valeurs mesurées demeurent entre lesdits premier et deuxième seuils de phase.
Ainsi, pour chaque particule n détectée, dont la position selon un plan parallèle au plan du détecteur est (xn,yn), il est possible d'établir un profil φ(χη,γη,ζ) représentant l'évolution de la phase du rayonnement auquel est exposé le détecteur, à une pluralité de hauteurs de reconstruction z, et d'utiliser ce profil pour effectuer une classification de la particule entre un globule rouge, un globule blanc et une plaquette.
Selon un troisième exemple, la source de lumière 11 est une diode électroluminescente blanche couplée à un filtre Oméga optical 610-DF-20, centré sur la longueur d'onde λ=610ηιη et de largeur à mi-hauteur 20 nm, placée à une distance Δ, égale à 8 cm, de l'échantillon. Le mode opératoire et l'échantillon sont similaires à l'exemple précédent.
Les figures 6A et 6B représentent respectivement l'amplitude complémentaire û(x, y, z)et la phase φ(χ, γ, ζ) en fonction de la distance z pour différentes particules. Sur la figure 6A, on observe que :
pour les particules correspondant à des globules blancs WBC, la courbe û(z) représentant l'évolution de l'amplitude u en fonction de la distance de reconstruction z présente un minimum marqué inférieur à un seuil d'amplitude complémentaire ûthreshoid, suivi d'une remontée vers la ligne de base BL, cette remontée présentant des oscillations marquées ;
pour les particules correspondant à des globules rouges RBC, la courbe û (z) présente un minimum compris entre la ligne de base BL et le seuil d'amplitude ûthreshoid, puis la courbe suit d'une remontée monotone vers la ligne de base BL ;
pour les particules correspondant à des plaquettes PLT, la courbe û(z) suit la ligne de base BL et reste confinée entre deux valeurs BL ± ε
Ainsi, pour chaque particule n détectée, dont la position selon un plan parallèle au plan du détecteur est (xn,yn), il est possible d'établir un profil û (xn,yn,z) représentant l'évolution de l'amplitude complémentaire, telle que précédemment définie, du rayonnement auquel est exposé le détecteur, à une pluralité de hauteurs de reconstruction z, et d'utiliser ce profil pour effectuer une classification de la particule entre un globule rouge RBC, un globule blanc WBC et un plaquette PLT.
Sur la figure 6B, on observe que :
pour les particules correspondant à des globules blancs WBC, la courbe φ(ζ) représentant l'évolution de la phase φ en fonction de la distance de reconstruction z présente un maximum supérieur à un premier seuil de phase c threshoid1, puis un minimum inférieur à un deuxième seuil de phase c threshoid2, suivi d'une remontée vers la ligne de base BL ;
pour les particules correspondant à des globules rouges RBC, la courbe φ(ζ) présente un maximum supérieur audit premier seuil de phase c threshoid1 puis un minimum supérieur audit deuxième seuil de phase c threshoid2, puis la courbe suit une remontée monotone vers la ligne de base BL ;
- pour les particules correspondant à des plaquettes PLT, la courbe φ(ζ) représentant l'évolution de la phase φ en fonction de la distance de reconstruction z reste confinée entre deux valeurs c threshoid1 , threshoid2 -Les valeurs mesurées demeurent entre lesdits premier et deuxième seuils de phase.
Les deux exemples précédents montrent qu'un profil en amplitude complémentaire û (z) ou en phase φ(ζ) permettent de caractériser les particules.
Il est également possible de constituer un paramètre optique dit composite, noté k, combinant l'amplitude complémentaire et la phase, sous la forme d'un ratio, par exemple Les figures 7 A, 7B et 7C représentent l'évolution dudit paramètre optique composite le long de l'axe de propagation Z, en mettant en œuvre les configurations respectives du premier exemple (source Laser à 405nm), du deuxième exemple (source de lumière de type LED blanche combinée à un filtre centré sur λ = 485nm) et du troisième exemple (source de lumière de type LED blanche combinée à un filtre centré sur λ = 610nm). Dans chacune des configurations, l'échantillon observé est un plasma enrichi tel que précédemment décrit.
Sur chaque courbe, les particules analysées sont trois globules blancs (WBC) et un globule rouge ( BC). On observe que, quelle que soit la source, les fluctuations du profil k z) sont plus importantes pour les globules blancs que pour les globules rouges.
En particulier, il est possible de déterminer un premier seuil composite kthreshoid1 et un deuxième seuil composite kthreshoid2, de telle sorte que lorsque le profil k z) reste inférieur au premier seuil composite kthreshoid1 et supérieur au deuxième seuil composite kthreshoid2, la particule analysée est un globule rouge. Lorsque le profil franchit un de ces seuils, la particule examinée est identifiée comme étant un globule blanc.
L'application d'un opérateur de propagation numérique h à une image / acquise, ou hologramme, par un photodétecteur matriciel 16 peut avoir certaines limites, du fait que l'image acquise ne comporte pas d'information relative à la phase. Aussi, préalablement à l'établissement du profil, il est préférable de disposer d'une information relative à la phase de l'onde lumineuse 22 à laquelle est exposé le photodétecteur 16. Cette information relative à la phase peut être obtenue en reconstruisant une image complexe Uz de l'échantillon 14, selon des méthodes décrites dans l'art antérieur, de façon à obtenir une estimation de l'amplitude et de la phase de l'onde lumineuse 22 au niveau du plan P du photodétecteur matriciel 16 ou dans un plan de reconstruction Pz situé à une distance \ z \ de ce dernier. Les inventeurs ont mis au point un procédé basé sur le calcul d'une image complexe de référence, décrit en lien avec la figure 8A. Ce procédé comprend les étapes suivantes :
Acquisition d'une image / de l'échantillon 14 par le photodétecteur matriciel 16, cette image formant l'hologramme (étape 100).
- Calcul d'une image complexe, dite de référence, Uref de l'échantillon 14 dans un plan de reconstruction Pz ou dans le plan de détection P, cette image complexe de référence comportant des informations de phase et d'amplitude de l'onde lumineuse 22 à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel 16 ; cette étape est effectuée en appliquant l'opérateur de propagation h, précédemment décrit, à l'image acquise / (étapes 110 à 170). Cette image complexe est désignée comme étant une image de référence car elle sert de base à la formation du profil sur la base duquel la particule est caractérisée.
Sélection d'une position radiale (x, y) d'une particule dans le plan de détection ou dans un plan parallèle à ce dernier (étape 180), soit en utilisant l'image complexe de référence Uref, soit l'image / acquise par le photodétecteur 16.
Application de l'opérateur de propagation h à l'image complexe de référence Uref de façon à calculer des images complexes UrefiZ, dites secondaires, le long de l'axe de propagation Z (étape 185).
A partir de chaque image complexe secondaire UrefiZ, estimation d'une grandeur caractéristique de l'onde lumineuse 22, à la position radiale (x, y) de la particule préalablement sélectionnée, et à une pluralité de distances du plan de reconstruction Pz (ou du plan de détection P), puis formation d'un profil représentant une évolution de ladite grandeur caractéristique selon l'axe de propagation Z (étape 190).
Caractérisation de la particule en fonction de ce profil. Comme précédemment indiqué, cette caractérisation peut être effectuée par une comparaison du profil obtenu avec des profils étalons obtenus lors d'une phase de calibration, à l'aide d'échantillons étalons. (étape 200).
L'algorithme présenté sur la figure 8A est détaillé ci-dessous, les résultats obtenus au cours de certaines étapes étant illustrés sur les figures 8B à 8D. Les étapes 110 à 170 constituent une façon préférée d'obtenir une image complexe de référence, notée Uref, cette image représentant une distribution spatiale de l'expression complexe de l'onde 22 dans un plan de reconstruction Pz. L'homme du métier comprendra que d'autres algorithmes permettant de reconstruire une telle image complexe, et par exemple les algorithmes cités en lien avec l'art antérieur, sont également envisageables.
Etape 100 : acquisition d'image
Au cours de cette étape, le capteur d'image 16 acquiert une image / de l'échantillon 14, et plus précisément de l'onde lumineuse 22 transmise par ce dernier, à laquelle est exposé le capteur d'image. Une telle image, ou hologramme, est représentée sur la figure 8B. Cette image a été réalisée en utilisant un échantillon 14 comportant des globules rouges baignant dans un tampon salin, l'échantillon étant contenu dans une chambre fluidique d'épaisseur 100 μιη disposé à une distance d de 1500 μιη d'un capteur CMOS, selon le dispositif précédemment décrit. Etape 110 : initialisation
Au cours de cette étape, on définit une image initiale UQ =0 de l'échantillon 14, à partir de l'image / acquise par le capteur d'image 16. Cette étape est une initialisation de l'algorithme itératif décrit ci-après en lien avec les étapes 120 à 180, l'exposant k désignant le rang de chaque itération. Le module UQ = 0 de l'image initiale UQ = 0 peut-être obtenu en appliquant l'opérateur racine carrée à l'image acquise / par le capteur d'image, auquel cas UQ =0 = ϊ0 '. Dans cet exemple, on procède à une normalisation de l'image / par un terme représentatif de l'intensité de l'onde lumineuse 12 incidente à l'échantillon 14. Ce dernier peut être, par exemple, la racine carrée d'une moyenne / de l'image /, auquel cas chaque pixel I(x, y) de l'image acquise est divisé par ladite moyenne, de telle sorte que UQ = 0 =
l
La phase < o =0 de l'image initiale UQ = 0 est soit considérée comme nulle en chaque pixel (x, y), soit prédéterminée selon une valeur arbitraire. En effet, l'image initiale UQ =0 résulte directement de l'image / acquise par le photodétecteur matriciel 16. Or, cette dernière ne comporte pas d'information relative à la phase de l'onde lumineuse 22 transmise par l'échantillon 14, le capteur d'image 16 n'étant sensible qu'à l'intensité de cette onde lumineuse. Etape 120 : propagation
Au cours de cette étape, l'image UQ _1 obtenue dans le plan de l'échantillon est propagée dans un plan de reconstruction PZ, par l'application d'un opérateur de propagation tel que précédemment décrit, de façon à obtenir une image complexe UZ , représentative de l'échantillon 14, dans le plan de reconstruction PZ. La propagation est réalisée par convolution de l'image UQ _1 par l'opérateur de propagation h_z, de telle sorte que :
Figure imgf000023_0001
le symbole * désignant un produit de convolution. L'indice - z représente le fait que la propagation est réalisée dans un sens opposé à l'axe de propagation Z. On parle de rétro- propagation. Lors de la première itération (k =1), Uk =0 est l'image initiale déterminée lors de l'étape 110. Au cours des itérations suivantes, Uk _1 est l'image complexe dans le plan de détection P mise à jour au cours de l'itération précédente.
Le plan de reconstruction Pz est un plan distant du plan de détection P, et de préférence parallèle à ce dernier. De préférence, le plan de reconstruction Pz est un plan P14 selon lequel s'étend l'échantillon 14. En effet, une image reconstruite dans ce plan permet d'obtenir une résolution spatiale généralement élevée. Il peut également s'agir d'un autre plan, situé une distance non nulle du plan de détection, et de préférence parallèle à ce dernier, par exemple un plan s' étendant entre le photodétecteur matriciel 16 et l'échantillon 14.
Etape 130 : Calcul d'un indicateur en plusieurs pixels
Au cours de cette étape, on calcule une grandeur ek(x, y) associée à chaque pixels d'une pluralité de pixels (x, y) de l'image complexe Uk , et de préférence en chacun de ces pixels. Cette grandeur dépend de la valeur Uk(x, y) de l'image Uk , ou de son module, au pixel (x, y) à laquelle elle est calculée. Elle peut également dépendre d'une dérivée dimensionnelle de l'image en ce pixel, par exemple le module d'une dérivée dimensionnelle de cette image.
Dans cet exemple, la grandeur sk(x, y) associée à chaque pixel est un module d'une différence de l'image Uk, en chaque pixel, et la valeur 1. Une telle grandeur peut être obtenue selon l'expression :
Figure imgf000024_0001
Etape 140 : établissement d'un indicateur de bruit associé à l'image Uk .
Lors de l'étape 130, on a calculé des grandeurs sk (x, y) en plusieurs pixels de l'image complexe Uk. Ces grandeurs peuvent former un vecteur Efe, dont les termes sont les grandeurs sk(x, y) associées à chaque pixel (x, y). Dans cette étape, on calcule un indicateur, dit indicateur de bruit, à partir d'une norme du vecteur Efe. D'une façon générale, à une norme est associée un ordre, de telle sorte que la norme ||x||p d'ordre p d'un vecteur x de dimension n de coordonnées {x1 x2i■■■■½,) est telle que : ||x||p = (∑ =1 |xj avec p > 0.
Dans le cas présent, on utilise une norme d'ordre 1, autrement dit p = 1. Les inventeurs ont en effet estimé que le recours à une norme d'ordre 1, ou d'ordre inférieur ou égal à 1, est particulièrement adapté à un tel échantillon, comme expliqué ci-après. Au cours de cette étape, la grandeur sk (x, y) calculée à partir de l'image complexe Uk, à chaque pixel (x, y) de cette dernière, est sommée de façon à constituer un indicateur de bruit sk associé à l'image complexe Uk .
Ainsi, sk = ∑(¾ y) k (x, y) Du fait de l'utilisation d'une norme d'ordre 1, ou d'ordre inférieur ou égal à 1, la valeur de l'indicateur de bruit sk diminue lorsque l'image complexe Uk est de plus en plus représentative de l'échantillon. En effet, lors des premières itérations, la valeur de la phase (pk (x, y), en chaque pixel (x, y) de l'image Uk est mal estimée. La propagation de l'image de l'échantillon du plan de détection P vers le plan de reconstruction Pz s'accompagne alors d'un bruit de reconstruction important, comme évoqué en lien avec l'art antérieur. Ce bruit de reconstruction se présente sous la forme de fluctuations apparaissant sur l'image reconstruite. Du fait de ces fluctuations, un indicateur de bruit sk, tel que précédemment défini est d'autant plus élevé que la contribution du bruit de reconstruction, sur l'image reconstruite, est importante. En effet, les fluctuations dues au bruit de reconstruction tendent à augmenter la valeur de cet indicateur. Un aspect important de cette étape consiste à déterminer, dans le plan de détection P, des valeurs de phase <pk(x, y) de chaque pixel de l'image de l'échantillon Uk , permettant d'obtenir, lors d'une itération suivante, une image reconstruite Uk+1 dont l'indicateur sk+ 1 est inférieur à l'indicateur sk.
Lors de la première itération, comme précédemment expliqué, on ne dispose que d'une information pertinente sur l'intensité de l'onde lumineuse 22, mais non sur sa phase. La première image reconstruite i/ = 1dans le plan de reconstruction Pz est donc affectée d'un bruit de reconstruction important, du fait de l'absence d'information pertinente quant à la phase de l'onde lumineuse 22 dans le plan de détection P. Par conséquent, l'indicateur sk=1 est élevé. Au cours des itérations suivantes, l'algorithme procède à un ajustement progressif de la phase (pk (x, y) dans le plan de détection P, de façon à minimiser progressivement l'indicateur sk.
L'image Uk dans le plan de détection est représentative de l'onde lumineuse 22 dans le plan de détection P, aussi bien du point de vue de son intensité que de sa phase. Les étapes 120 à 160 visent à établir, de façon itérative, la valeur de la phase <pk(x, y) de chaque pixel de l'image Uk, minimisant l'indicateur sk, ce dernier étant obtenu sur l'image Uk obtenue par propagation de l'image Uk _1 dans le plan de reconstruction Pz. L'algorithme de minimisation peut être un algorithme de descente de gradient, ou de descente de gradient conjugué, ce dernier étant décrit ci-après.
Etape 150 : Ajustement de la valeur de la phase dans le plan de détection.
L'étape 150 vise à déterminer une valeur de la phase <pk(x, y) de chaque pixel de l'image complexe Uk de façon à minimiser l'indicateur sk+1 résultant d'une propagation de l'image complexe Uk dans le plan de reconstruction Pz, au cours de l'itération suivante k+1. Pour cela, un vecteur de phase φ est établi, dont chaque terme est la phase <pk(x, y) d'un pixel (x, y) de l'image complexe Uk. La dimension de ce vecteur est (NPiX, 1), où NPiX désigne le nombre de pixels considérés. Ce vecteur est mis à jour au cours de chaque itération, par l'expression de mise à jour suivante :
<Po (x, y) = <Po -1(x< y) + akpk(x, y) où :
ak est un entier, désigné par le terme « pas », et représentant une distance ;
pk est un vecteur de direction, de dimension (NPiX, 1), dont chaque terme p(x, y) forme une direction du gradient Vsk de l'indicateur sk.
Cette équation peut être exprimée sous forme vectorielle, comme suit :
<Po = <Po 1 + «fePfe
On peut montrer que :
Figure imgf000026_0001
où :
V k est un vecteur de gradient, de dimension (NPiX, 1), dont chaque terme représente une variation de l'indicateur sk en fonction de chacun des degrés de liberté des inconnues du problème, c'est-à-dire les termes du vecteur φ^. ;
pfe-i est u n vecteu r de direction établi lors de l'itération précédente ;
β]ί est facteur d'échelle appliqué au vecteur de direction pfe_ 1.
Chaque terme Vsk(x, y) du vecteur de gradient Ve, est tel que
Figure imgf000026_0002
où Im représente l'opérateur partie imaginaire et r' représente une coordonnée (x, y) dans le plan de de détection.
Le facteur d'échelle β]ί peut être exprimé de telle sorte que : Le pas ak peut varier selon les itérations, par exemple entre 0.03 au cours des premières itérations et 0.0005 lors des dernières itérations.
L'équation de mise à jour permet d'obtenir un ajustement du vecteur φ , ce qui entraîne une mise à jour itérative de la phase φ (x, y) en chaque pixel de l'image complexe UQ . Cette image complexe UQ , dans le plan de détection, est alors mise à jour par ces nouvelles valeurs de la phase associée à chaque pixel. Notons que le module de l'image complexe UQ n'est pas modifié, ce dernier étant déterminé à partir de l'image acquise par le photodétecteur matriciel 16, de telle sorte que UQ (X, y) = UQ =0(x, y). Etape 160 : Réitération ou sortie d'algorithme.
Tant qu'un critère de convergence n'est pas atteint, l'étape 160 consiste à réitérer l'algorithme, par une nouvelle itération des étapes 120 à 160, sur la base de l'image complexe UQ mise à jour lors de l'étape 150. Le critère de convergence peut être un nombre K prédéterminé d'itérations, ou une valeur minimale du gradient Vsk de l'indicateur, ou une différence considérée comme négligeable entre deux vecteurs de phase <j»o_ 1, <Po consécutifs. Lorsque le critère de convergence est atteint, on dispose d'une estimation considérée comme correcte d'une image complexe de l'échantillon, dans le plan de détection P ou dans le plan de reconstruction PZ.
Etape 170 : Obtention de l'image complexe de référence.
A l'issue de la dernière itération, le procédé peut comprendre une propagation de l'image complexe UQ résultant de la dernière itération dans le plan de reconstruction PZ, de manière à obtenir une image complexe de référence Uref = UZ . De façon alternative, l'image complexe de référence Uref est l'image complexe UQ résultant de la dernière itération dans le plan de détection P. Lorsque la densité des particules est élevée, cette alternative est cependant moins avantageuse car la résolution spatiale dans le plan de détection P est moins élevée que dans le plan de reconstruction PZ, notamment lorsque le plan de reconstruction PZ correspond à un plan P14 selon lequel s'étend l'échantillon 14.
La figure 8C représente une image du module u^=8 de chaque pixel de l'image complexe de référence i/ =8obtenue dans un plan de reconstruction PZ à l'issue de 8 itérations. La résolution spatiale de cette image permet une bonne identification des coordonnées radiales (x, y) de chaque particule. Etape 180 : Sélection des coordonnées radiales particule.
Au cours de cette étape, on sélectionne les coordonnées radiales (x, y) d'une particule à partir de l'image de référence Uref = U^=30, par exemple à partir de l'image de son module uref= Uz= 30 ou de l'image de sa phase <pref= <Pz= 3°- Comme précédemment évoqué, le terme coordonnée radiale désigne une coordonnée dans le plan de détection ou dans le plan de reconstruction. Il est également envisageable d'effectuer cette sélection à partir de l'hologramme /0 ou à partir de l'image complexe UQ obtenue dans le plan de détection suite à la dernière itération. Cependant, lorsque le nombre de particules augmente, il est préférable d'effectuer cette sélection sur l'image formée dans le plan de reconstruction, du fait de sa meilleure résolution spatiale, en particulier lorsque le plan de reconstruction correspond Pz au plan de l'échantillon P14. Sur la figure 8C, on a représenté la sélection d'une particule, entourée par un contour en pointillés.
Etape 185 : Application d'un opérateur de propagation
Au cours de cette étape 185, l'image complexe de référence Uref est propagée selon une pluralité de distances de reconstruction, en utilisant un opérateur de propagation h tel que précédemment défini, de façon à disposer d'une pluralité d'images complexes, dites secondaires, UrefiZ reconstruites à différentes distances du plan de détection P ou du plan de reconstruction Pz. Ainsi, cette étape comprend la détermination d'une pluralité d'images complexes UrefiZ telles que : Uref.z = Uref * h-z avec zmin— z— zmax-
Les valeurs zminet zmax sont les coordonnées minimales et maximales, selon l'axe Z, selon lesquelles l'image complexe de référence est propagée. De préférence, les images complexes sont reconstruites selon une pluralité de coordonnées z entre l'échantillon 14 et le capteur d'image 16. Les images complexes peuvent être formées de part et d'autre de l'échantillon 14. Ces images complexes secondaires sont établies par application d'un opérateur de reconstruction holographique h à l'image de référence Uref. Or, cette dernière est une image complexe décrivant correctement l'onde lumineuse 22 auquel est exposé le capteur d'image, en particulier au niveau de sa phase, suite aux itérations des étapes 120 à 160. Par conséquent, les images secondaires UrefiZ forment un bon descripteur de la propagation de l'onde lumineuse 22 selon l'axe de propagation Z.
Etape 190 : Formation d'un profil Au cours de cette étape, à partir de chaque image complexe secondaire UrefiZ, on détermine une grandeur caractéristique, telle que précédemment définie, de l'onde lumineuse 22 de façon à déterminer un profil représentant l'évolution de ladite grandeur caractéristique selon l'axe de propagation Z. La grandeur caractéristique peut être, par exemple le module ou la phase, ou leur combinaison. La figure 8D représente l'évolution de la phase <p(z) de l'onde lumineuse 22 le long de l'axe de propagation Z.
Etape 200 : Caractérisation
La particule peut ensuite être caractérisée à partir du profil formé lors de l'étape précédente. De préférence, on dispose d'une base de données de profils étalons formés au cours d'une phase d'apprentissage à l'aide d'échantillons étalons connus. La caractérisation est alors effectuée par une comparaison ou d'une classification du profil formé sur la base des profils étalons.
Ce mode de réalisation a été testé sur des échantillons comportant des globules rouges. Un autre exemple est présenté sur les figures 9A à 9E. Dans ces exemples, l'échantillon comporte des globules rouges dilués dans une solution aqueuse comportant un tampon PBS (Tampon Phosphate Salin) dilué au 1/400. L'échantillon 14 a été placé dans une chambre fluidique 15 d'épaisseur 100 μιη, disposée à une distance de 8 cm de la diode électroluminescente précédemment décrite, dont la bande spectrale est centrée sur 450 nm. L'échantillon est placé à une distance de 1.5 mm du capteur d'image CMOS précédemment décrit. L'ouverture du filtre spatial 18 s'élève à 150 μιη. La figure 9A représente l'image / acquise par le capteur d'image. Les images du module et de la phase de l'image complexe Uz =8 reconstruite, dans le plan de l'échantillon P10, sont respectivement représentées sur les figures 9B et 9C. Ces images ont été obtenues en 8 itérations.
L'image Uz =8 constitue une image de référence Uref, à laquelle l'opérateur de propagation h précédemment décrit a été appliqué, de façon à disposer d'une pluralité d'images complexes secondaires Aref Z selon l'axe de propagation Z. Par ailleurs, sur l'image du module ou sur l'image de la phase de l'image de référence, on a identifié un globule rouge, ce dernier étant entouré par des pointillés sur chacune de ces images. Les coordonnées radiales (x, y) de ce globule rouge ont été extraites. A partir des images complexes secondaires Aref Z, on a formé un profil u(z) représentatif du module et un profil φ{ζ) représentatif de la phase de l'onde lumineuse 22 atteignant le capteur d'image 16. La valeur de chaque point du profil est respectivement obtenue en déterminant le module et la phase d'une image secondaire auxdites coordonnées radiales. Les figures 9D et 9E représentent respectivement le profil du module et de la phase du globule rouge ainsi sélectionné. Le profil a été déterminé entre des coordonnées zmin = 1000 μιη et zmax = 2000 μιη avec un pas en z de 5 μιη. Le plan de reconstruction est situé à 1380 μιη du plan de détection, ce qui correspond à l'abscisse 76 sur les figures 9D et 9E. La méthode décrite ne se limite pas au sang et peut être appliquée à d'autres fluides corporels, par exemple l'urine, le liquide céphalorachidien, la moelle osseuse, etc. Par ailleurs, la méthode peut s'appliquer à des liquides non corporels, en particulier pour l'analyse de polluants ou de toxines dans l'eau ou autre solution aqueuse.
La méthode s'applique également à la détection et à l'identification de particules placées dans un milieu non liquide, par exemple une gélose ou le résidu sec d'un liquide corporel, par exemple un frottis sanguin aboutissant à un dépôt étendu de sang sec sur une lame. Dans ce dernier cas, les particules sont isolées les unes des autres par des résidus secs ou de l'air.
Par ailleurs, comme précédemment indiqué, les particules peuvent être endogènes (par exemple des particules sanguines) ou exogènes (microbilles, goutellettes). Les exemples décrits ci-avant exposent des critères d'identification simples, basés sur l'évolution du profil d'une grandeur caractéristique en fonction de la distance de reconstruction, et de comparaisons à l'aide de seuils pré-établis. La validité des critères est liée au milieu dans lequel sont placées les particules, ainsi qu'au protocole de préparation de l'échantillon. D'autres critères peuvent s'appliquer à des particules ayant subi un protocole de préparation différent. Ainsi, pour un type d'échantillon donné, les critères d'identification peuvent être définis au cours d'une phase d'apprentissage, réalisée sur des échantillons étalons, comportant des particules connues.
De plus, d'autres méthodes de classification, plus complexes, et plus robustes, peuvent être mises en œuvre, sans sortir du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour identifier une particule (1, 2,...9, 101...104) contenue dans un échantillon (14), le procédé comportant les étapes suivantes : a) illumination dudit échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), la source de lumière produisant une onde lumineuse incidente (12) se propageant vers l'échantillon (14) selon un axe de propagation (Z) ; b) acquisition, à l'aide d'un photodétecteur matriciel (16), d'une image de l'échantillon, l'échantillon étant disposé entre ladite source de lumière et le photodétecteur matriciel, de telle sorte que le photodétecteur matriciel est exposé à une onde lumineuse (22) comprenant des interférences entre l'onde lumineuse incidente (12) et une onde de d iffraction produite par chaque particule ; le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : c) détermination d'une position de ladite particule dans un plan parallèle (x,y) à un plan (P) selon lequel s'étend le photodétecteur matriciel (16) ; d) application d'un algorithme de reconstruction numérique à ladite image acquise, de façon à estimer au moins une grandeur caractéristique (u, ΰ, φ, k) de ladite onde lumineuse (22) à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel (16), à une pluralité de distances ( | z | ) de reconstruction de ce dernier ; e) détermination d'un profil, représentant une évolution (u(z), ΰ(ζ), φ(ζ), k(z)) de ladite grandeur caractéristique en fonction de ladite distance, selon un axe parallèle a udit axe de propagation (Z) et passant par ladite position (x,y) ; f) identification de la particule en fonction dudit profil.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la dite grandeur caractéristique est obtenue en estimant, à chaque distance de reconstruction, une expression complexe (U(x,y,z)) de l'onde lumineuse (22) à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la grandeur caractéristique est déterminée à partir d u module ou de l'argument de ladite expression complexe (U(x,y,z)).
4. Procédé selon la revendication l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'identification est élaborée en comparant l'évolution de la dite grandeur caractéristique à des profils types déterminés au cours d'une phase d'apprentissage.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel la position de chaque particule, dans un plan parallèle au plan du photodétecteur matriciel, est déterminée à l'aide de l'image acquise par le photodétecteur ou à l'aide de l'expression complexe (U(x,y,z)) de l'onde lumineuse (22) à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comportant :
la détermination d'une image complexe de référence (i re/), dans un plan de reconstruction ou dans le plan de détection, par application d'un algorithme de reconstruction numérique à l'image acquise par le photodétecteur matriciel (16) ; à partir de ladite image complexe de référence, l'estimation d'au moins une grandeur caractéristique (u, ΰ, φ, k) de l'onde lumineuse (22) à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel (16), à une pluralité de distances ( | z | ) de reconstruction de ce dernier.
7. Procédé selon la revendication 6, comportant :
l'application d'un opérateur de propagation ( ) à l'image complexe de référence (Ure/), de façon à calculer des images complexes dites secondaires (f/re/jZ), selon une pluralité de distances du plan de reconstruction ou du plan selon lequel s'étend le photodétecteur matriciel ;
la détermination d'une grandeur caractéristique à chacune desdites distances, à partir de chaque image complexe secondaire (f/re/jZ).
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source de lumière est une source spatialement cohérente.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la source de lumière est une diode électroluminescente ou une diode laser.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel aucune optique de grossissement n'est disposée entre l'échantillon et le photodétecteur matriciel.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon comporte des cellules sanguines.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, les particules étant identifiées parmi les lignées cellulaires des globules blancs, des globules rouges ou des plaquettes.
13. Dispositif pour identifier une particule, la dite particule étant contenue dans un échantillon (14), le dispositif comprenant : une source de lumière (11) agencée pour produire une onde lumineuse incidente (12), selon un axe de propagation (Z), en direction dudit échantillon (14) ; un support, pour maintenir l'échantillon (14) entre ladite source de lumière (11) et un photodétecteur matriciel (16) ; - le photodétecteur matriciel (16) étant agencé pour acquérir une image de l'échantillon, en étant exposé à une onde lumineuse (22), résultant de l'interférence entre ladite onde lumineuse incidente (12) et une onde de diffraction formée par ladite particule ; le dispositif étant caractérisé en ce qu'il comporte processeur (20), et notamment un microprocesseur configuré pour mettre en œuvre les étapes suivantes : - détermination d'une position de ladite particule dans un plan parallèle (x, y) à un plan
(P) selon lequel s'étend le photodétecteur matriciel (16) ; application d'un algorithme de reconstruction numérique à ladite image acquise, de façon à estimer au moins une grandeur caractéristique (u, û, φ,/c) de ladite onde lumineuse (22) à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel (16), à une pluralité de distances ( | z | ) de reconstruction de ce dernier ; détermination d'un profil, représentant l'évolution (u(z), ΰ(ζ), φ(ζ), k z)) de ladite grandeur caractéristique en fonction de ladite distance de reconstruction, selon un axe parallèle audit axe de propagation et passant par ladite position (x, y) ; identification de la particule en fonction dudit profil.
14. Dispositif selon la revendication 13, dans lequel le dispositif ne comporte pas d'optique de grossissement entre le photodétecteur matriciel et l'échantillon analysé.
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, dans lequel le processeur est apte à :
déterminer, à chaque distance de reconstruction, l'expression complexe (U(x, y, z)) du rayonnement optique auquel est exposé le détecteur ; estimer la dite grandeur caractéristique, à chaque distance de reconstruction, déterminant le module ou l'argument de ladite amplitude complexe (U(x, y, z)).
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US15/560,763 US10379027B2 (en) 2015-03-24 2016-03-23 Method for identifying blood particles using a photodetector
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