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WO2013168310A1 - オキソ脂肪酸及び希少脂肪酸の製造法 - Google Patents

オキソ脂肪酸及び希少脂肪酸の製造法 Download PDF

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Publication number
WO2013168310A1
WO2013168310A1 PCT/JP2012/078747 JP2012078747W WO2013168310A1 WO 2013168310 A1 WO2013168310 A1 WO 2013168310A1 JP 2012078747 W JP2012078747 W JP 2012078747W WO 2013168310 A1 WO2013168310 A1 WO 2013168310A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid
cis
fatty acid
oxo
trans
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/078747
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
順 小川
重信 岸野
昌 清水
靖記 米島
Original Assignee
国立大学法人京都大学
日東薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人京都大学, 日東薬品工業株式会社 filed Critical 国立大学法人京都大学
Priority to US14/400,116 priority Critical patent/US9719115B2/en
Publication of WO2013168310A1 publication Critical patent/WO2013168310A1/ja
Priority to US15/629,716 priority patent/US10294501B2/en
Priority to US16/369,271 priority patent/US10975397B2/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6431—Linoleic acids [18:2[n-6]]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a fatty acid. More specifically, an unsaturated fatty acid is used as a raw material, a multi-stage enzymatic reaction, or a method for producing an oxo fatty acid characterized by combining a chemical oxidation reaction and an enzymatic reaction method, and the production of a rare fatty acid from the oxo fatty acid. Regarding the law.
  • Conjugated fatty acids represented by conjugated linoleic acid have been reported to have various physiological activities such as lipid metabolism improving action, anti-arteriosclerotic action, and body fat reducing action (non-patent literature).
  • 1-3 is a functional lipid that is attracting attention for use in various fields including pharmaceuticals and functional foods (Patent Documents 1 and 2).
  • CLA is produced by microorganisms present in the ruminant's stomach, so it is known to be contained in dairy and meat products and slightly present in vegetable oils, but the detailed mechanism of its production is known. Not.
  • the inventors of the present invention used three types of enzymes (CLA-HY, CLA-DC, CLA-DH) present in Lactobacillus plantarum to convert linoleic acid into conjugated linoleic acid. It was reported that it was essential (Patent Document 1). However, the existence of a specific series of reaction mechanisms and intermediates in these enzyme reactions has not been clarified.
  • oxo fatty acids such as 9-oxo-octadecadienoic acid and 13-oxo-octadecadienoic acid contained in tomato have been reported to improve lifestyle-related diseases such as lipid metabolism improvement ( Patent Document 3, Non-Patent Documents 4, 5), interest in the physiological activity of oxo fatty acids is also increasing.
  • Oxo fatty acids have a carbonyl group at a specific position of an unsaturated fatty acid, but it is necessary to identify multiple double bonds in the molecule and introduce a carbonyl group at a specific position. It has been difficult to synthesize functional oxo fatty acids from fatty acids.
  • rare fatty acids such as CLA1, CLA2 and the like are produced from specific oxo fatty acids.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing oxo fatty acids, and to provide a method for producing rare fatty acids such as hydroxylated fatty acids, conjugated fatty acids and partially saturated fatty acids from the produced oxo fatty acids. .
  • the present inventors have revealed the whole picture of the unsaturated fatty acid metabolic pathway of lactic acid bacteria, and found oxo fatty acids, hydroxylated fatty acids, conjugated fatty acids and partially saturated fatty acids as intermediates of the metabolic system, and are involved in their production.
  • a novel enzyme (CLA-ER) was identified.
  • the present inventors used a known enzyme (CLA-HY, CLA-DC, CLA-DH) and a novel enzyme (CLA-ER) from linoleic acid to cis-9, trans-11.
  • CLA-HY a known enzyme
  • CLA-DC CLA-DC
  • CLA-DH a novel enzyme
  • CLA-ER novel enzyme from linoleic acid to cis-9, trans-11.
  • -Conjugated linoleic acid c9, t11-CLA (CLA1)
  • trans-9 trans-9
  • trans-11-conjugated linoleic acid t9, t11-CLA (CLA2)
  • oleic acid trans-10-octadecenoic acid (t10-18) 1 etc.
  • Intermediates of the reaction include 10-oxo-cis-12-octadecenoic acid (hereinafter also referred to as “KetoA”), 10-oxooctadecanoic acid (hereinafter also referred to as “KetoB”), 10-oxo-trans-11- Oxyfatty acids such as octadecenoic acid (hereinafter also referred to as “KetoC”) are produced, and a chemical oxidation method using chromic acid is introduced in place of some enzyme reactions (oxidation of hydroxylated fatty acids) Then, it discovered that conversion efficiency improved notably.
  • KetoA 10-oxo-cis-12-octadecenoic acid
  • KetoB 10-oxooctadecanoic acid
  • KetoC 10-oxo-trans-11- Oxyfatty acids
  • octadecenoic acid hereinafter also referred to as “KetoC”
  • oxo fatty acids which can be supplied in large quantities for the first time in the present invention, as raw materials, from KetoA to KetoC, from KetoC to KetoB, from KetoC to 10-hydroxy-trans-11-octadecenoic acid (hereinafter, “ HYC ”), KetoB to 10-hydroxy-octadecanoic acid (hereinafter also referred to as“ HYB ”), HYC to CLA1 or CLA2, HYB to oleic acid or trans-10-octadecenoic acid, 10-hydroxy-cis-12- According to a previously unknown reaction pathway, linoleic acid or trans-10, cis-12-conjugated linoleic acid (t10, c12-CLA (CLA3)) is produced from octadecenoic acid (hereinafter referred to as “HYA”). It has also been found that rare fatty acids such as hydroxylated fatty acids,
  • the present invention is as follows: [1] From an unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having a cis-type double bond at the 9-position, a hydroxylated fatty acid having 18 hydroxyl groups is derived from the hydroxylated fatty acid by a hydration enzyme reaction. A method for producing an oxo fatty acid having 18 carbon atoms having a carbonyl group at the 10-position by dehydrogenase reaction or chemical oxidation.
  • An unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having a cis-type double bond at the 9-position is oleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, stearidonic acid, cis-9, trans-11-octa
  • the method according to [3], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus plantarum FERM BP-10549 strain.
  • An 18-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at the 10-position and a cis-type double bond at the 12-position is 10-oxo-cis-12-octadecenoic acid, 10-oxo-cis-6, cis- 12-octadecadienoic acid, 10-oxo-cis-12, cis-15-octadecadienoic acid or 10-oxo-cis-6, cis-12, cis-15-octadecatrienoic acid, [5] the method of. [7] The method according to [5] or [6], wherein the isomerase is derived from lactic acid bacteria.
  • An 18-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at the 10-position and a trans-type double bond at the 11-position is 10-oxo-trans-11-octadecenoic acid, 10-oxo-cis-6, trans- 11-octadecadienoic acid, 10-oxo-trans-11, cis-15-octadecadienoic acid or 10-oxo-cis-6, trans-11, cis-15-octadecatrienoic acid, [9] the method of. [11] The method according to [9] or [10], wherein the saturating enzyme is derived from lactic acid bacteria.
  • [15] A vector comprising the nucleic acid of [14].
  • [16] A host cell transformed with the vector of [15].
  • [17] A method for producing the enzyme, comprising culturing the host cell of [16] and recovering the enzyme protein of [13] from the culture.
  • [18] The method of [9], wherein the saturating enzyme is the protein of [13].
  • [19] From a C18 oxo fatty acid having a carbonyl group at the 10-position and a trans-type double bond at the 11-position, by a dehydrogenase reaction, a hydroxyl group at the 10-position and a trans-type double bond at the 11-position A method for producing a hydroxylated fatty acid having 18 carbon atoms.
  • An 18-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at the 10-position and a trans-type double bond at the 11-position is 10-oxo-trans-11-octadecenoic acid, 10-oxo-cis-6, trans- 11-octadecadienoic acid, 10-oxo-trans-11, cis-15-octadecadienoic acid or 10-oxo-cis-6, trans-11, cis-15-octadecatrienoic acid, [19] the method of. [21] The method according to [19] or [20], wherein the dehydrogenase is derived from lactic acid bacteria.
  • 18-carbon oxo fatty acids having a carbonyl group at the 10-position and no double bond at the 11- and 12-positions are 10-oxooctadecanoic acid, 10-oxo-cis-6-octadecenoic acid, 10-oxo
  • the method of [25], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus plantarum FERM BP-10549 strain.
  • a 18-carbon hydroxylated fatty acid having a hydroxyl group at the 10-position and a trans-type double bond at the 11-position is 10-hydroxy-trans-11-octadecenoic acid, 10-hydroxy-cis-6, trans- 11-octadecadienoic acid, 10-hydroxy-trans-11, cis-15-octadecadienoic acid or 10-hydroxy-cis-6, trans-11, cis-15-octadecatrienoic acid, [27] the method of. [29] The method according to [27] or [28], wherein the dehydrating enzyme is derived from lactic acid bacteria.
  • a hydroxylated fatty acid of 18 carbon atoms having a hydroxyl group at the 10-position and no double bond at the 11- and 12-positions is 10-hydroxyoctadecanoic acid, 10-hydroxy-cis-6-octadecenoic acid, 10-hydroxy
  • the method of [31] or [32], wherein the dehydrating enzyme is derived from lactic acid bacteria.
  • the method of [33], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus plantarum FERM BP-10549 strain.
  • a hydroxylated fatty acid of 18 carbon atoms having a hydroxyl group at the 10-position and a cis-type double bond at the 12-position is 10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid, 10-hydroxy-cis-6, cis- 12-octadecadienoic acid, 10-hydroxy-cis-12, cis-15-octadecadienoic acid or 10-hydroxy-cis-6, cis-12, cis-15-octadecatrienoic acid, [35] the method of. [37] The method of [35] or [36], wherein the dehydrating enzyme is derived from lactic acid bacteria. [38] The method of [37], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus plantarum FERM BP-10549 strain.
  • the present invention found a saturating enzyme (CLA-ER), which was not conventionally known, and combined it with a known enzyme to clarify the entire pathway of unsaturated fatty acid metabolism in lactic acid bacteria.
  • CLA-ER saturating enzyme
  • rare fatty acids can also be efficiently produced from oxo fatty acids, and these oxo fatty acids, rare fatty acids, etc. are extremely useful in that they are used in various fields such as pharmaceuticals, foods and cosmetics. .
  • each reaction of the unsaturated fatty acid metabolic pathway of lactic acid bacteria is appropriately combined by an enzymatic method (and chemically as necessary for a reaction with low enzymatic reaction efficiency), so that oxo fatty acid or
  • the present invention provides a method for producing useful rare fatty acids such as hydroxylated fatty acids, conjugated fatty acids or partially saturated fatty acids.
  • An example of the overall reaction system is shown in FIG.
  • an unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having a cis-type double bond at the 9-position (hereinafter sometimes abbreviated as “cis-9 unsaturated fatty acid”) is used in a two-stage reaction.
  • a method for producing an oxo fatty acid having 18 carbon atoms having a carbonyl group at the 10-position (hereinafter sometimes abbreviated as “10-oxo fatty acid”).
  • a hydration enzyme reaction may be abbreviated as “10-hydroxy fatty acid”, which has a hydroxyl group at the 10-position, and which has a hydroxyl group at the 10-position. Generated).
  • the “substrate” in Reaction 1 is not particularly limited as long as it is an unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having a cis-type double bond at the 9-position.
  • Dienoic acid, trienoic acid, or tetraenoic acid is more preferable, and dienoic acids or trienoic acids are particularly preferable.
  • the term “fatty acid” includes not only free acids but also esters and salts with basic compounds.
  • Examples of monoenoic acid include oleic acid and ricinoleic acid.
  • Examples of dienoic acid include linoleic acid (cis-9, cis-12-18: 2), cis-9, trans-11-octadecadienoic acid (cis-9, trans-11-18: 2), and the like.
  • Examples of the trienoic acids include ⁇ -linolenic acid (cis-9, cis-12, cis-15-18: 3), ⁇ -linolenic acid (cis-6, cis-9, cis-12-18: 3) Etc.
  • Examples of tetraenoic acid include stearidonic acid (cis-6, cis-9, cis-12, cis-15-18: 4) and the like.
  • the hydrase that catalyzes reaction 1 is not particularly limited as long as it is an enzyme that can convert the above-mentioned cis-9 unsaturated fatty acid as a substrate and convert it into 10-hydroxy fatty acid.
  • Hydratase CLA-HY
  • More preferred is CLA-HY derived from Lactobacillus plantarum.
  • CLA-HY can be obtained by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-259712 and the method described in Examples described later.
  • the hydrating enzyme may be purified or may be roughly purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used. Furthermore, the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • Hydration enzyme reaction is carried out in a suitable buffer solution (for example, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, etc.) with cis-9 unsaturated fatty acid as a substrate and hydrase at appropriate concentrations. This can be done by mixing and incubating.
  • the substrate concentration is, for example, 1 to 100 g / L, preferably 10 to 50 g / L, more preferably 20 to 40 g / L.
  • the amount of hydrating enzyme added is, for example, 0.001 to 10 mg / ml, preferably 0.1 to 5 mg / ml, more preferably 0.2 to 2 mg / ml.
  • a “cofactor” may be used for the reaction 1, and for example, NADH, NADPH, FADH 2 and the like can be used.
  • the addition concentration may be a concentration at which the hydration reaction proceeds efficiently. Preferably it is 0.001 to 20 mM, more preferably 0.01 to 10 mM.
  • an “activator” may be used in the enzymatic reaction, for example, potassium molybdate, disodium molybdenum (VI) acid disodium, disodium molybdenum (VI) acid dihydrate, orthovanadate (V) acid.
  • the addition concentration may be a concentration at which the hydration reaction proceeds efficiently. Preferably it is 0.1 to 20 mM, more preferably 1 to 10 mM.
  • Reaction 1 is desirably performed within the range of a suitable temperature and a suitable pH of the hydrating enzyme.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the hydrating enzyme is in the form of a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing the nucleic acid encoding it is introduced.
  • a recombinant cell for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.
  • the hydration enzyme reaction can also be performed by culturing the cells by adding a substrate and, if necessary, a cofactor or an activator to a liquid medium suitable for culturing the cells.
  • an 18-carbon oxo fatty acid having a carbonyl group at the 10-position is obtained from 10-hydroxy fatty acid by dehydrogenase reaction or chemical oxidation using chromic acid. (Hereinafter sometimes abbreviated as “10-oxo fatty acid”).
  • the dehydrogenase that catalyzes reaction 2 is not particularly limited as long as it is an enzyme that uses 10-hydroxy fatty acid as a substrate and can be converted to 10-oxo fatty acid.
  • hydroxylated fatty acid-dehydrogenase derived from lactic acid bacteria CLA-DH
  • CLA-DH hydroxylated fatty acid-dehydrogenase derived from Lactobacillus plantarum.
  • CLA-DH derived from plantarum FERM BP-10549 strain.
  • CLA-DH can be obtained by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-259712 and the method described in Examples described later.
  • the dehydrogenase may be purified or roughly purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used. Furthermore, the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • the dehydrogenase reaction is carried out by mixing the substrate 10-hydroxy fatty acid and dehydrogenase at an appropriate concentration in an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, etc.). Can be performed by incubating.
  • the substrate concentration is, for example, 1 to 100 g / L, preferably 10 to 50 g / L, more preferably 20 to 40 g / L.
  • the amount of dehydrogenase added is, for example, 0.001 to 10 mg / ml, preferably 0.1 to 5 mg / ml, more preferably 0.2 to 2 mg / ml.
  • a “cofactor” may be used, and for example, NAD, NADP, FAD and the like can be used.
  • the addition concentration may be a concentration at which the oxidation reaction proceeds efficiently. Preferably it is 0.001 to 20 mM, more preferably 0.01 to 10 mM.
  • an “activator” may be used for the enzyme reaction.
  • the same compounds exemplified in the above reaction 1 can be used at the same added concentration.
  • Reaction 2 is desirably performed within the range of the preferred temperature and the preferred pH of the dehydrogenase.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the dehydrogenase is in the form of a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing a nucleic acid encoding it is introduced.
  • a recombinant cell for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.
  • the oxidation reaction can also be performed by culturing the cells by adding a substrate and, if necessary, a cofactor or an activator to a liquid medium suitable for culturing the cells.
  • the present inventors have used L. as a dehydrogenase.
  • CLA-DH derived from plantarum FERM BP-10549 was used, it was found that the conversion efficiency from 10-hydroxy fatty acid to 10-oxo fatty acid was relatively low. Then, it succeeded in obtaining very high conversion efficiency by replacing reaction 2 with chemical oxidation using chromic acid. Therefore, in the first aspect of the present invention, the second reaction is more preferably performed by chemical oxidation.
  • Examples of chemical oxidation include methods known per se, such as chromic acid oxidation, preferably Jones oxidation.
  • chromic acid salts and complexes of compounds such as chromic anhydride CrO 3 , chromic acid H 2 CrO 4 , and dichromic acid H 2 Cr 2 O 7 can be used.
  • an oxo fatty acid having 18 carbon atoms having a carbonyl group at the 10-position and a cis-type double bond at the 12-position (hereinafter abbreviated as “10-oxo, cis-12 fatty acid”) )
  • isomerase reaction 3 an oxo fatty acid having 18 carbon atoms and a trans double bond at the 11 position (hereinafter “10-oxo, trans-11 fatty acid”).
  • the “substrate” of Reaction 3 may be a 10-oxo, cis-12 fatty acid derived from an unsaturated fatty acid having 18 carbon atoms having a cis-type double bond at positions 9 and 12 according to Reactions 1 and 2 above.
  • 10-oxo-cis-12-octadecenoic acid derived from linoleic acid (KetoA), 10-oxo-cis-12, cis-15-octadecadienoic acid derived from ⁇ -linolenic acid ( ⁇ KetoA), 10-oxo-cis-6, cis-12-octadecadienoic acid ( ⁇ KetoA) derived from ⁇ -linolenic acid, 10-oxo-cis-6, cis-12, derived from stearidonic acid Examples thereof include cis-15-octadecatrienoic acid (sKetoA).
  • the substrate may be obtained by a method other than Reactions 1 and 2.
  • the isomerase that catalyzes reaction 3 is not particularly limited as long as it is an enzyme that uses the 10-oxo, cis-12 fatty acid as a substrate and can be converted to 10-oxo, trans-11 fatty acid.
  • Oxo fatty acid isomerase (CLA-DC) derived from lactic acid bacteria is preferred. More preferred is CLA-DC derived from Lactobacillus plantarum. CLA-DC derived from plantarum FERM BP-10549 strain. CLA-DC can be obtained by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-259712 and the method described in Examples described later.
  • the isomerase may be purified or roughly purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used. Furthermore, the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • the substrate 10-oxo, cis-12 fatty acid and the isomerase are appropriately mixed in an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, etc.). This can be done by mixing and incubating at concentrations.
  • the substrate concentration is, for example, 1 to 100 g / L, preferably 10 to 50 g / L, more preferably 20 to 40 g / L.
  • the amount of isomerase added is, for example, 0.001 to 10 mg / ml, preferably 0.1 to 5 mg / ml, more preferably 0.2 to 2 mg / ml.
  • an “activator” may be used for the isomerase reaction.
  • the same compounds exemplified in the above reaction 1 can be used at the same addition concentration.
  • Reaction 3 is desirably performed within the range of the preferred temperature and pH of the isomerase.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the isomerase is in the form of a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing the nucleic acid encoding it is introduced.
  • a recombinant cell for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.
  • the isomerase reaction can also be carried out by culturing the cells by adding a substrate and, if necessary, an activator to a liquid medium suitable for culturing the cells.
  • the third aspect of the present invention relates to a saturated enzyme reaction (reaction 4) from an oxo fatty acid having 18 carbon atoms (10-oxo, trans-11 fatty acid) having a carbonyl group at the 10-position and a trans-type double bond at the 11-position. ),
  • An oxo fatty acid having 18 carbon atoms with a carbonyl group at the 10-position and no double bond at the 11- and 12-positions hereinafter abbreviated as “10-oxo, 11,12-saturated fatty acid”).
  • the “substrate” in Reaction 4 is not particularly limited as long as it is a 10-oxo, trans-11 fatty acid that can be produced by the above Reaction 3, and is derived from 10-oxo-cis-12-octadecenoic acid (KetoA) 10 -Oxo-trans-11-octadecenoic acid (KetoC), 10-oxo-cis-12, cis-15-octadecadienoic acid (also referred to as “ ⁇ KetoA”) 10-oxo-trans-11, cis- 15-Octadecadienoic acid (also referred to as “ ⁇ KetoC”), 10-oxo-cis-6, cis-12-octadecadienoic acid (also referred to as “ ⁇ KetoA”), 10-oxo-cis-6, trans 11-Octadecadienoic acid (also called “ ⁇ KetoC”), 10-oxo-cis-6, cis
  • the saturation enzyme that catalyzes reaction 4 is not particularly limited as long as it is an enzyme that uses the above 10-oxo, trans-11 fatty acid as a substrate and can be converted to 10-oxo, 11,12-saturated fatty acid.
  • oxo fatty acid-enone reductase CLA-ER
  • CLA-ER oxo fatty acid-enone reductase
  • More preferred is CLA-ER derived from Lactobacillus plantarum.
  • the novel enzyme ⁇ CLA-ER '' of the present invention is (A) an enzyme protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (B) an enzyme activity comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted and / or substituted and / or inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and catalyzing the above reaction 4 Or (c) an enzyme activity that is encoded by a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a complementary strand sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and catalyzes the above reaction 4. It has a protein.
  • amino acid sequence in which the amino acid is replaced with another amino acid or (v) a protein comprising an amino acid sequence combining them And the like.
  • amino acids of similar properties for example, glycine and alanine, valine and leucine and isoleucine, serine and threonine, aspartic acid and glutamic acid, asparagine and glutamine, lysine and arginine, cysteine and methionine, phenylalanine and tyrosine, etc.
  • amino acids of similar properties for example, glycine and alanine, valine and leucine and isoleucine, serine and threonine, aspartic acid and glutamic acid, asparagine and glutamine, lysine and arginine, cysteine and methionine, phenylalanine and tyrosine, etc.
  • substitutions for example, there can be a greater number of substitutions.
  • stringent conditions means that nucleotide sequences having high identity, for example, nucleotide sequences having 70, 80, 90, 95, or 99% identity or more hybridize to each other and are identical to each other.
  • washing conditions for normal Southern hybridization 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 Examples include conditions of washing once, more preferably 2 to 3 times at a salt concentration and temperature corresponding to 0 ° C., 0.1 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • CLA-ER is an example of L. It can be isolated from plant bodies of the plantarum FERM ⁇ BP-10549 strain and culture solution by a protein separation and purification technique known per se. Alternatively, the gene encoding CLA-ER is isolated according to the method described in Example 2, subcloned into an appropriate vector, introduced into an appropriate host such as E. coli, and cultured to produce a recombinant protein. You can also.
  • CLA-ER may be purified or crudely purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used. Furthermore, the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • the vector containing the nucleic acid encoding CLA-ER of the present invention can be appropriately selected and used according to the purpose (for example, protein expression) suitable for the host cell into which the vector is introduced.
  • an expression vector it contains the nucleic acid of the present invention operably linked to a suitable promoter, and preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region downstream of the nucleic acid of the present invention.
  • a selection marker gene drug resistance gene, gene complementing an auxotrophic mutation, etc.
  • the vector may be one that is integrated into the genome of the target host cell.
  • the vector of the present invention can be introduced into a target host cell by a transformation method known per se, such as a competent cell method, a protoplast method, a calcium phosphate coprecipitation method or the like.
  • the “host cell” may be any cell as long as it can express a vector containing a nucleic acid encoding the CLA-ER of the present invention, and examples thereof include bacteria, yeast, fungi, and higher eukaryotic cells.
  • bacteria include gram positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces or gram negative bacteria such as E. coli.
  • Recombinant cells into which a vector containing a nucleic acid encoding CLA-ER has been introduced can be cultured by a method known per se suitable for host cells.
  • the “purification” of the CLA-ER of the present invention is a method known per se, for example, after crushing the cells collected by centrifugation or the like with ultrasonic waves or glass beads, etc. Remove solids, prepare crude enzyme solution, and further perform salting-out with ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, chromatographic methods such as affinity chromatography, gel electrophoresis, etc. Can be used.
  • 10-oxo, trans-11 fatty acid as a substrate and a saturation enzyme are appropriately mixed in an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, etc.). This can be done by mixing and incubating at concentrations.
  • the substrate concentration is, for example, 1 to 100 g / L, preferably 10 to 50 g / L, more preferably 20 to 40 g / L.
  • the amount of the saturating enzyme added is, for example, 0.001 to 10 mg / ml, preferably 0.1 to 5 mg / ml, more preferably 0.2 to 2 mg / ml.
  • a “cofactor” may be used for the reaction 4, for example, NADH or the like can be used.
  • the addition concentration may be a concentration at which the oxidation reaction proceeds efficiently. Preferably it is 0.001 to 20 mM, more preferably 0.01 to 10 mM.
  • an “activator” may be used for the enzyme reaction.
  • the same compounds exemplified in the above reaction 1 can be used at the same added concentration.
  • Reaction 4 is preferably performed within the range of the preferred temperature and the preferred pH of the saturating enzyme.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the saturating enzyme is in the form of a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing the nucleic acid encoding it is introduced.
  • a saturated enzyme reaction can also be performed by adding the substrate and, if necessary, an activator to a liquid medium suitable for culturing the cell and culturing the cell.
  • the fourth invention relates to a dehydrogenase reaction (reaction 5) from an oxo fatty acid having 18 carbon atoms (10-oxo, trans-11 fatty acid) having a carbonyl group at the 10-position and a trans-type double bond at the 11-position. ) To produce a hydroxylated fatty acid with 18 carbon atoms and a trans double bond at the 11th position (hereinafter sometimes abbreviated as “10-hydroxy, trans-11 fatty acid”).
  • the “substrate” of reaction 5 is not particularly limited as long as it is a 10-oxo, trans-11 fatty acid that can be produced by the above reaction 3, and is derived from 10-oxo-cis-12-octadecenoic acid (KetoA) 10 -Oxo-trans-11-octadecenoic acid (KetoC), 10-oxo-cis-12, cis-15-octadecadienoic acid (also referred to as “ ⁇ KetoA”) 10-oxo-trans-11, cis- 15-Octadecadienoic acid (also referred to as “ ⁇ KetoC”), 10-oxo-cis-6, cis-12-octadecadienoic acid (also referred to as “ ⁇ KetoA”), 10-oxo-cis-6, trans 11-Octadecadienoic acid (also called “ ⁇ KetoC”), 10-oxo-cis-6, cis-12,
  • the substrate may be obtained by a method other than Reaction 3.
  • the “substrate” of Reaction 6 is not particularly limited as long as it is a 10-oxo, 11,12-saturated fatty acid that can be produced by Reaction 4, and 10-oxo-trans-11-octadecenoic acid (KetoC) 10-oxooctadecanoic acid (KetoB), 10-oxo-trans-11, cis-15-octadecadienoic acid ( ⁇ KetoC) derived from 10-oxo-cis-15-octadecenoic acid (“ ⁇ KetoB”) 10-oxo-cis-6, trans-11-octadecadienoic acid ( ⁇ KetoC) derived from 10-oxo-cis-6-octadecenoic acid (also referred to as “ ⁇ KetoB”), 10-oxo-cis -6, trans-11, cis-15-octadecat
  • a dehydrogenase that catalyzes reaction 5 or reaction 6 10-oxo, trans-11 fatty acid or 10-oxo, 11,12-saturated fatty acid is used as a substrate, 10-hydroxy, trans-11 fatty acid or 10
  • the enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that can be converted into a -hydroxy, 11,12-saturated fatty acid.
  • hydroxylated fatty acid-dehydrogenase (CLA-DH) derived from lactic acid bacteria is preferable. More preferably, it is CLA-DH derived from Lactobacillus plantarum. CLA-DH derived from plantarum FERM BP-10549 strain.
  • CLA-DH catalyzes the oxidation reaction in Reaction 2 above, but can also catalyze the reduction reaction of Reaction 5 or Reaction 6 as the reverse reaction.
  • the dehydrogenase may be purified or roughly purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used. Furthermore, the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • the reduction reaction by dehydrogenase is carried out by using 10-oxo, trans-11 fatty acid or 10-oxo, 11 as a substrate in an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, etc.). , 12-saturated fatty acid and dehydrogenase are mixed at an appropriate concentration and incubated.
  • the substrate concentration is, for example, 1 to 100 g / L, preferably 10 to 50 g / L, more preferably 20 to 40 g / L.
  • the amount of dehydrogenase added is, for example, 0.001 to 10 mg / ml, preferably 0.1 to 5 mg / ml, more preferably 0.2 to 2 mg / ml.
  • Cofactor may be used for Reaction 5 and Reaction 6, and for example, NADH, NADPH, FADH 2 and the like can be used.
  • the addition concentration may be a concentration at which the reduction reaction proceeds efficiently. Preferably it is 0.001 to 20 mM, more preferably 0.01 to 10 mM.
  • an “activator” may be used for the enzyme reaction.
  • the same compounds exemplified in the above reaction 1 can be used at the same added concentration.
  • the reaction 5 and the reaction 6 are desirably performed within the range of the preferable temperature and pH of the dehydrogenase.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the dehydrogenase is in the form of a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing the nucleic acid encoding it is introduced.
  • a recombinant cell for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.
  • the reduction reaction can also be performed by culturing the cells by adding a substrate and, if necessary, a cofactor or an activator to a liquid medium suitable for culturing the cells.
  • the fifth aspect of the present invention relates to a dehydrase reaction (reaction 7) from a hydroxyl group having a hydroxyl group at the 10-position and a 18-carbon hydroxylated fatty acid having a trans-type double bond at the 11-position (10-hydroxy, trans-11 fatty acid).
  • Conjugated fatty acid having a cis-type double bond at the 9-position and a trans-type double bond at the 11-position (hereinafter sometimes abbreviated as “cis-9, trans-11-conjugated fatty acid”) or the 9-position and the 11-position
  • a method for producing a conjugated fatty acid having a trans double bond (hereinafter sometimes abbreviated as “trans-9, trans-11 conjugated fatty acid”), having a hydroxyl group at the 10-position and a double-chain at the 11- and 12-positions
  • Partially saturated fatty acid having a cis-type double bond at the 9th position (hereinafter referred to as “reaction 8”) from hydroxylated fatty acid having 18 carbon atoms (10-hydroxy, 11,12-saturated fatty acid) , May be abbreviated as “cis-9 partially saturated fatty acid”) or partially saturated fatty acid having a trans double bond at position 10 ( Hereinafter, it may be abbreviated as “trans-10 partially
  • cis-12 fatty acid (hereinafter sometimes abbreviated as“ cis-9, cis-fatty acid ”), an unsaturated fatty acid having a cis-type double bond at positions 9 and 12 (hereinafter referred to as“ cis-9, cis-fatty acid ”). May be abbreviated as “12 unsaturated fatty acid”) or a conjugated fatty acid having a trans double bond at the 10 position and a cis double bond at the 12 position (hereinafter abbreviated as “trans-10, cis-12 conjugated fatty acid”). To provide a method of manufacturing).
  • the “substrate” of reaction 7 is not particularly limited as long as it is a 10-hydroxy, trans-11 fatty acid that can be produced by the above reaction 5, and is derived from 10-oxo-trans-11-octadecenoic acid (KetoC) 10 10-hydroxy-trans-11, cis-15-octadeca derived from 2-hydroxy-trans-11-octadecenoic acid (HYC), 10-oxo-trans-11, cis-15-octadecadienoic acid ( ⁇ KetoC) Dienoic acid (also called “ ⁇ HYC”), 10-hydroxy-cis-6, trans-11-octadecadienoic acid derived from 10-oxo-cis-6, trans-11-octadecadienoic acid ( ⁇ KetoC) ( (Also referred to as “ ⁇ HYC”), 10-oxo-cis-6, trans-11, cis-15-octadecatrienoic acid (sKetoC) -derived
  • the substrate may be obtained by a method other than Reaction 5.
  • the “substrate” of reaction 8 is not particularly limited as long as it is a 10-hydroxy, 11,12-saturated fatty acid that can be produced by the above reaction 6, and 10-hydroxy derived from 10-oxooctadecanoic acid (KetoB).
  • Octadecanoic acid (HYB), 10-hydroxy-cis-15-octadecenoic acid (also referred to as “ ⁇ HYB”), 10-oxo-cis-6-octadecene derived from 10-oxo-cis-15-octadecenoic acid ( ⁇ KetoB) 10-hydroxy-cis-6-octadecasenoic acid derived from acid ( ⁇ KetoB) (also referred to as “ ⁇ HYB”), 10-oxo-cis-6, cis-15-octadecadienoic acid (sKetoB) 10 -Hydroxy-cis-6, cis-15-octadecadienoic acid (also referred to as “sHYB”) and the like.
  • HYB Octadecanoic acid
  • ⁇ HYB 10-hydroxy-cis-15-octadecenoic acid
  • ⁇ KetoB 10-hydroxy-cis-6-octadecasenoic
  • the substrate may be obtained by a method other than Reaction 6.
  • the “substrate” of reaction 9 is not particularly limited as long as it is a 10-hydroxy, cis-12 fatty acid that can be produced by the above reaction 1 from an unsaturated fatty acid having a cis-type double bond at positions 9 and 12, for example.
  • HYA 10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid
  • ⁇ HYA 10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid
  • ⁇ HYA 10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid
  • ⁇ HYA 10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid
  • ⁇ HYA 10-hydroxy-cis-12-octadecadienoic acid
  • ⁇ HYA 10-hydroxy-cis-12-octadecadienoic acid
  • ⁇ HYA 10-hydroxy-cis-6 derived from ⁇ -linolenic acid
  • ⁇ HYA cis-12-octadecadienoic acid
  • sHYA 10-hydroxy-cis-6 derived from stearidonic acid
  • sHYA cis-12, cis-15-octadecatrienoic acid
  • the substrate may be obtained by a method other than Reaction 1.
  • the above 10-hydroxy, trans-11 fatty acid, 10-hydroxy, 11,12-saturated fatty acid or 10-hydroxy, cis-12 fatty acid is used as a substrate, and cis -9, trans-11 conjugated fatty acid or trans-9, trans-11 conjugated fatty acid, cis-9 partially saturated fatty acid or trans-10 partially saturated fatty acid, or cis-9, cis-12 unsaturated fatty acid or trans-10, cis
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can be converted into a -12-conjugated fatty acid, but for example, fatty acid-hydratase (CLA-HY) derived from lactic acid bacteria is preferable.
  • CLA-HY derived from Lactobacillus plantarum.
  • CLA-HY derived from plantarum FERM BP-10549 strain.
  • CLA-HY catalyzes the hydration reaction in the above reaction 1, but can also catalyze the dehydration reaction of reactions 7 to 9 as the reverse reaction.
  • the dehydrating enzyme may be either purified or roughly purified. Alternatively, it may be expressed in bacterial cells such as Escherichia coli, and the bacterial cells themselves may be used, or a culture solution may be used. Furthermore, the enzyme may be free or immobilized by various carriers.
  • the dehydrating enzyme reaction is carried out by using 10-hydroxy, trans-11 fatty acid, 10-hydroxy, trans-11, substrate 10-hydroxy, trans-11 fatty acid as a substrate in an appropriate buffer (eg, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, etc.). It can be performed by mixing 12-saturated fatty acid or 10-hydroxy, cis-12 fatty acid and dehydrase at an appropriate concentration and incubating.
  • the substrate concentration is, for example, 1 to 100 g / L, preferably 10 to 50 g / L, more preferably 20 to 40 g / L.
  • the amount of dehydrating enzyme added is, for example, 0.001 to 10 mg / ml, preferably 0.1 to 5 mg / ml, more preferably 0.2 to 2 mg / ml.
  • a “cofactor” may be used.
  • NADH, NADPH, FADH 2 or the like can be used.
  • the addition concentration may be a concentration at which the dehydration reaction proceeds efficiently. Preferably it is 0.001 to 20 mM, more preferably 0.01 to 10 mM.
  • an “activator” may be used for the enzyme reaction.
  • the same compounds exemplified in the above reaction 1 can be used at the same added concentration.
  • Reactions 7 to 9 are desirably performed within the range of the preferred temperature and pH of the dehydrating enzyme.
  • the reaction temperature is 5 to 50 ° C., preferably 20 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9.
  • the reaction time is not particularly limited, but is, for example, 10 minutes to 72 hours, preferably 30 minutes to 36 hours.
  • the dehydrating enzyme is in the form of a recombinant cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cell, animal cell, etc.) into which an expression vector containing the nucleic acid encoding it has been introduced.
  • a dehydration reaction can also be performed by culturing the cells by adding a substrate and, if necessary, a cofactor or an activator to a liquid medium suitable for culturing the cells.
  • oxo fatty acid hydroxylated fatty acid, conjugated fatty acid or partially saturated fatty acid (hereinafter collectively referred to as “oxo fatty acid etc.”) obtained in the present invention is based on conventionally known physiological activity, for example, pharmaceuticals, foods, cosmetics. Can be used in combination.
  • pharmaceutical dosage forms containing oxo fatty acids include scattered, granule, pill, soft capsule, hard capsule, tablet, chewable tablet, quick disintegrating tablet, syrup, liquid, suspension, suppository, ointment, cream, Gels, sticking agents, inhalants, injections and the like can be mentioned. These preparations are prepared according to conventional methods.
  • oxo fatty acids and the like are hardly soluble in water, they can be dissolved in non-hydrophilic organic solvents such as vegetable oils and animal oils, or emulsifiers, dispersants or interfaces.
  • a homogenizer high pressure homogenizer
  • a homogenizer is used to disperse and emulsify in an aqueous solution.
  • Additives that can be used for formulation include animal and vegetable oils such as soybean oil, safflower oil, olive oil, germ oil, sunflower oil, beef tallow, sardine oil, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, sorbitol, etc.
  • Surfactant such as polyhydric alcohol, sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, purified water, lactose, starch, crystalline cellulose, D-mannitol, lecithin, gum arabic, sorbitol solution, sugar Examples include excipients such as liquids, sweeteners, colorants, pH adjusters, and fragrances.
  • the liquid preparation may be dissolved or suspended in water or other suitable medium at the time of taking. Tablets and granules may be coated by a known method.
  • Intravenous administration When administered in the form of an injection, it can be administered intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, transdermally, intraarticularly, within the bursa, intravesicular, intraperiosteally, sublingually, orally.
  • intravenous administration or intraperitoneal administration is preferred.
  • Intravenous administration may be either drip administration or bolus administration.
  • Examples of the form of “food” containing oxo fatty acid and the like obtained in the present invention include supplements (dispersed, granules, soft capsules, hard capsules, tablets, chewable tablets, quick-disintegrating tablets, syrups, liquids, etc.), beverages (tea) , Carbonated drinks, lactic acid drinks, sports drinks, etc.), confectionery (gummy, jelly, gum, chocolate, cookies, candy, etc.), oils, fat and oil foods (mayonnaise, dressing, butter, cream, margarine, etc.).
  • the above foods include various nutrients, various vitamins (vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, vitamin C, vitamin D, vitamin E, vitamin K, etc.) and various minerals (magnesium, zinc, Iron, sodium, potassium, selenium, etc.), dietary fiber, dispersants, emulsifiers and other stabilizers, sweeteners, taste ingredients (citric acid, malic acid, etc.), flavors, royal jelly, propolis, agarics, etc. it can.
  • Lactobacillus plantarum FERM BP-10549 is a patented biological deposit center (IPOD, AIST) of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD, AIST) from March 7, 2006. Fundamental Organization Patent Biological Deposit Center (IPOD, NITE)); 1-6 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki 305-8566, Japan
  • Cloning of the gene of the enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (CLA-ER: oxo fatty acid-enone reductase) (1) Acquisition of genomic DNA 180 g of wet cells of Lactobacillus plantarum FERM BP-10549 It was suspended in ml of TEN buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1 mM EDTA; 10 mM NaCl). To this was added 9 ml of SET buffer (20% Sucrose; 50 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)) and 135 mg of lysozyme.
  • TEN buffer 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1 mM EDTA; 10 mM NaCl.
  • SET buffer 20% Sucrose; 50 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
  • the obtained precipitate was dried in a vacuum desiccator for 20 minutes and then dissolved in a small amount of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA). 20 ⁇ l of RNase A solution was added thereto and incubated at 37 ° C. for 15 hours. Then, 1.2 ml of chloroform was added, and the mixture was centrifuged at 3,500 ⁇ g for 20 minutes at room temperature to recover the upper layer. To this was added 6 ml of chloroform, and centrifuged at 3,500 ⁇ g for 20 minutes at room temperature to recover the upper layer.
  • TE buffer 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA
  • this gene fragment contains one ORF (SEQ ID NO: 1) of 654 bp starting from the start codon ATG and ending with the stop codon TAA.
  • This gene was determined to be CLA-ER gene.
  • the CLA-ER gene encoded a protein consisting of 217 amino acids shown in SEQ ID NO: 2.
  • the gene fragment of about 0.6 kbp amplified as a result of PCR was inserted into pET101 / D-TOPO to construct an expression vector (pCLA-ER).
  • pCLA-ER was transformed into Rosetta 2 (DE3) strain to obtain a transformed strain Rosetta / pCLA-ER strain.
  • the obtained Rosetta / pCLA-ER strain was cultured at 37 ° C. in 10 ml LB medium (1% bactotryptone (Difco), 0.5% yeast extract, medium containing 1% sodium chloride (pH 7.0)) containing 1 mg ampicillin. And aerobic culture at 300 rpm for 15 hours to prepare a preculture.
  • each transformed Escherichia coli expressing CLA-HY, CLA-DH, and CLA-DC was prepared.
  • CLA-HY expression transformed E. coli was used as the hydrating enzyme and dehydrase
  • CLA-DC expression transformed E. coli was used as the isomerase
  • CLA-DH expression transformed E. coli was used as the dehydrogenase.
  • Each collected fraction was analyzed by LC / MS and gas chromatography, and fractions containing only HYA were collected and concentrated on a rotary evaporator. A portion of the final product obtained was methyl esterified, and the purity of HYA was evaluated by gas chromatography. As a result, HYA having a purity of 98% or more was obtained.
  • KetoA production test was conducted from HYA.
  • the total volume of the reaction solution was adjusted to 1 ml with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing purified dehydrogenase (enzyme amount: 83 ⁇ g), 0.5 mM NAD + , 0.01 mM FAD, and 0.1% HYA.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) while anaerobically shaking for 4 hours at 120 rpm.
  • KetoA from HYA using chromic anhydride (CrO 3 ) A chromic acid solution was prepared by adding 2.3 ml of sulfuric acid and 7.7 ml of water to 2.67 g of chromic anhydride and 90 ml of acetone. To the Erlenmeyer flask, 2 g of HYA and 40 ml of acetone were added, and the above chromic acid solution was added dropwise with stirring with a stirrer on ice. When the solution turned from blue to brown, the addition of the chromic acid solution was stopped and the reaction was stopped using isopropyl alcohol.
  • the deposited precipitate was filtered using a filter paper, put into a separatory funnel, 150 ml of diethyl ether and 300 ml of milli-Q water were added and shaken well, and the diethyl ether layer was washed several times with milli-Q water.
  • An appropriate amount of sodium sulfate (anhydrous) was added to the washed diethyl ether layer and stirred to remove residual water.
  • the added anhydrous sodium sulfate was filtered using a filter paper, and the obtained diethyl ether layer was concentrated by a rotary evaporator to extract reaction products and unreacted substrates. A portion of the extract was used to evaluate the purity of KetoA by LC / MS. As a result, it was confirmed that about 95% of the extract was KetoA.
  • KetoA production using chromic anhydride and KetoA production using CLA-DH expressed in E. coli is 0.06 from 1 ml reaction system containing 1 mg of HYA. The conversion efficiency was 6% because mg KetoA was produced.
  • the KetoA production method using chromic anhydride with about 95% of the total fatty acids extracted from 2 g of HYA being KetoA, has a conversion rate of about 95%, greatly improving KetoA production efficiency. succeeded in.
  • Each collected fraction was analyzed by LC / MS and gas chromatography, and fractions containing only ⁇ HYA were collected and concentrated on a rotary evaporator. A portion of the final product obtained was methyl esterified, and the purity of ⁇ HYA was evaluated by gas chromatography. As a result, ⁇ HYA having a purity of 99% or more was obtained.
  • chromic anhydride (CrO 3 )
  • a chromic acid solution was prepared by adding 90 ml of acetone to a mixture of 2.67 g of chromic anhydride and 7.7 ml of water.
  • 2 g of ⁇ HYA and 40 ml of acetone were added, and the above chromic acid solution was added dropwise while stirring on ice with a stirrer.
  • the addition of the chromic acid solution was stopped and the reaction was stopped using isopropyl alcohol.
  • the deposited precipitate was filtered using a filter paper, put into a separatory funnel, 150 ml of diethyl ether and 300 ml of milli-Q water were added and shaken well, and the diethyl ether layer was washed several times with milli-Q water.
  • An appropriate amount of sodium sulfate (anhydrous) was added to the washed diethyl ether layer and stirred to remove residual water.
  • the added anhydrous sodium sulfate was filtered using a filter paper, and the obtained diethyl ether layer was concentrated by a rotary evaporator to extract reaction products and unreacted substrates.
  • the purity of ⁇ KetoA was evaluated by LC / MS. As a result, it was confirmed that about 80% of the extract was ⁇ KetoA.
  • Example 15 Purification of ⁇ KetoA from the extract obtained in Example 15 (mixture containing ⁇ KetoA) Silica gel (Wakogel® C-100) 20 to 30 times the weight of the extract obtained in Example 15 (mixture containing ⁇ KetoA) ) was swollen with hexane, packed in a glass column, and sodium sulfate (anhydrous) was overlaid.
  • ⁇ HYA from ⁇ -linolenic acid using hydrase expressed in Escherichia coli was performed using hydrated enzyme-induced transformed Escherichia coli.
  • the reaction solution was hydrated enzyme-induced transformed Escherichia coli (wet cell weight 0.7 g), NADH (33 mg), FAD (0.8 mg), ⁇ -linolenic acid (1 g), 100 mM containing BSA (0.2 g)
  • the total volume was adjusted to 10 ml with potassium phosphate buffer (pH 6.5). The reaction was carried out at 37 ° C.
  • Each collected fraction was analyzed by LC / MS and gas chromatography, and fractions containing only ⁇ HYA were collected and concentrated on a rotary evaporator. A part of the final product obtained was methylesterified, and the purity of ⁇ HYA was evaluated by gas chromatography. As a result, ⁇ HYA having a purity of 99% or more was obtained.
  • chromic anhydride (CrO 3 )
  • a chromic acid solution was prepared by adding 90 ml of acetone to a mixture of 2.67 g of chromic anhydride and 7.7 ml of water.
  • 2 g of ⁇ HYA and 40 ml of acetone were added, and the above chromic acid solution was added dropwise while stirring on ice with a stirrer.
  • the addition of the chromic acid solution was stopped and the reaction was stopped using isopropyl alcohol.
  • the deposited precipitate was filtered using a filter paper, put into a separatory funnel, 150 ml of diethyl ether and 300 ml of milli-Q water were added and shaken well, and the diethyl ether layer was washed several times with milli-Q water.
  • An appropriate amount of sodium sulfate (anhydrous) was added to the washed diethyl ether layer and stirred to remove residual water.
  • the added anhydrous sodium sulfate was filtered using a filter paper, and the obtained diethyl ether layer was concentrated by a rotary evaporator to extract reaction products and unreacted substrates. A part of the extract was used to evaluate the purity of ⁇ KetoA by LC / MS. As a result, it was confirmed that about 95% of the extract was ⁇ KetoA.
  • rHYA 10,12-dihydroxyoctadecanoic acid
  • the production test of rHYA from ricinoleic acid was performed using hydrated enzyme-induced transformed Escherichia coli.
  • the reaction solution was hydrated enzyme-induced transformed Escherichia coli (wet cell weight 0.7 g), NADH (33 mg), FAD (0.8 mg), ricinoleic acid (1 g), 100 mM phosphoric acid containing BSA (0.2 g)
  • the total volume was adjusted to 10 ml with potassium buffer (pH 6.5). The reaction was carried out at 37 ° C.
  • KetoC from KetoA using isomerase expressed in E. coli After emulsification of KetoA (1 g), BSA (0.2 g), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) (4 ml) with ultrasound, Dispense into 10 test tubes. To each test tube was added isomerase-expressing transformed Escherichia coli suspended in 2 ml / g of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) to make a total volume of 1 ml. The reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) for 15 hours under anaerobic shaking at 225 rpm.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) for 15 hours under anaerobic shaking at 225 rpm.
  • KetoC was obtained with a purity of 98% or more.
  • reaction product and unreacted substrate were extracted. Further, 3 ml of hexane was added to the remaining liquid and stirred well, and after centrifugation, the hexane layer was recovered again. The collected hexane layers were collected and concentrated by a rotary evaporator, and reaction products and unreacted substrates were extracted. A part of the extract was used to evaluate the purity of ⁇ KetoC by high performance liquid chromatography. As a result, it was confirmed that about 65% of the extract was ⁇ KetoC.
  • reaction product and unreacted substrate were extracted. Further, 3 ml of hexane was added to the remaining liquid and stirred well, and after centrifugation, the hexane layer was recovered again. The collected hexane layers were collected and concentrated by a rotary evaporator, and reaction products and unreacted substrates were extracted. A part of the extract was used to evaluate the purity of ⁇ KetoC by LC / MS. As a result, it was confirmed that about 95% of the extract was ⁇ KetoC.
  • KetoC from KetoA using isomerase expressed in E. coli After emulsification of KetoA (1 g), BSA (0.2 g), 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) (4 ml) with ultrasound, Dispense into 10 test tubes. To each test tube was added isomerase-expressing transformed Escherichia coli suspended in 2 ml / g of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) to make a total volume of 1 ml. The reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) for 15 hours under anaerobic shaking at 225 rpm.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) for 15 hours under anaerobic shaking at 225 rpm.
  • KetoC was obtained with a purity of 98% or more.
  • KetoB production test was performed using saturating enzyme.
  • Saturated enzyme-induced transformed Escherichia coli wet cell weight 33 mg
  • 0.5 mM NADH, 0.01 mM FAD KetoC
  • 100 mg potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 1 mg BSA The total volume was 1 ml.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) while anaerobically shaking at 200 rpm for 17 hours.
  • oxygen adsorbent Aneropack Mitsubishi Chemical
  • the HYC production test was conducted using the purified dehydrogenase obtained from Example 6. The total amount of the reaction solution was adjusted to 0.8 ml with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing purified dehydrogenase (enzyme amount: 83 ⁇ g), 0.5 mM NADH, 0.01 mM FAD, 0.005% KetoC. The reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) while anaerobically shaking for 4 hours at 120 rpm.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. in the presence of the oxygen adsorbent Aneropack (Mitsubishi Chemical) while anaerobically shaking for 4 hours at 120 rpm.
  • lipids were extracted from the reaction solution by the Bridayer method, converted to methyl ester, and then the production of HYC was evaluated by gas chromatography. As a result, production of HYC (0.02 mg) was confirmed from KetoC.
  • lipids were extracted from the reaction solution by Bridayer method, converted to methyl ester, and then the production of HYB was evaluated by gas chromatography. As a result, production of HYB (0.08 mg) from KetoB was confirmed.
  • lipids were extracted from the reaction solution by the Bridayer method, converted to methyl ester, and then the production of oleic acid and trans-10-octadecenoic acid was evaluated by gas chromatography. As a result, production of oleic acid (0.02 mg) and trans-10-octadecenoic acid (0.1 mg) was confirmed from HYB.
  • lipids were extracted from the reaction solution by the Bridayer method, converted to methyl ester, and then the production of linoleic acid and CLA3 was evaluated by gas chromatography. As a result, the production of linoleic acid (0.26 mg) and trans-10, cis-12-CLA (0.07 mg) was confirmed from HYA.
  • the oxo fatty acids can be efficiently produced, the oxo fatty acids can be applied to various fields such as pharmaceuticals and foods.
  • the method of the present invention is also extremely useful in that various rare fatty acids can be produced using oxo fatty acids as raw materials.

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Abstract

　本発明は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）をはじめとする乳酸菌等に由来する４種の酵素（脂肪酸－ヒドラターゼ、水酸化脂肪酸－デヒドロゲナーゼ、オキソ脂肪酸－イソメラーゼ、オキソ脂肪酸－エノンレダクターゼ）を用いた、オキソ脂肪酸、並びに共役脂肪酸、水酸化脂肪酸、部分飽和脂肪酸等の希少脂肪酸の製造方法を提供する。さらに、本発明は、化学的酸化反応を一部併用することによる、より効率的なオキソ脂肪酸等の製造方法も提供する。

Description

オキソ脂肪酸及び希少脂肪酸の製造法
　本発明は、脂肪酸の製造法に関する。詳細には、不飽和脂肪酸を原料に、多段階酵素反応、又は、化学的酸化反応と酵素反応法とを組み合わせることを特徴とするオキソ脂肪酸の製造法、及び、オキソ脂肪酸からの希少脂肪酸の製造法に関する。
　共役リノール酸（conjugated linoleic acid, CLA）に代表される共役脂肪酸は、脂質代謝改善作用、抗動脈硬化作用、体脂肪減少作用等、様々な生理活性を有することが報告されており（非特許文献１－３）、医薬・機能性食品等を始めとして様々な分野への利用に注目されている機能性脂質である（特許文献１、２）。CLAは、反芻動物の胃に存在する微生物により生成されるため乳製品や肉製品に含まれることや植物油にわずかに存在することが知られているが、その生成の詳細なメカニズムについては知られていない。
　本発明者らは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）の菌体内に存在する３種類の酵素（CLA-HY,CLA-DC,CLA-DH）が、リノール酸を共役リノール酸へ変換する反応に必須であることを報告した（特許文献１）。しかしながら、これらの酵素反応における具体的な一連の反応メカニズムや中間体等の存在は明らかになっていなかった。
　加えて、近年トマトに含有される９－オキソ－オクタデカジエン酸や１３－オキソ－オクタデカジエン酸等のオキソ脂肪酸に、脂質代謝改善等の生活習慣病を改善する活性が報告されており（特許文献３、非特許文献４、５）、オキソ脂肪酸の生理活性に対する関心も高まっている。オキソ脂肪酸は、不飽和脂肪酸の特定の位置にカルボニル基を有しているが、分子内に複数存在する二重結合を識別し、特定の位置にカルボニル基を導入する必要があるため、不飽和脂肪酸から機能性オキソ脂肪酸を合成することは困難となっている。また、特定のオキソ脂肪酸から、CLA1、CLA2等を始めとする希少脂肪酸が製造されることも知られていない。
特開２００７－２５９７１２号公報 特開２００７－２５２３３３号公報 特開２０１１－１８４４１１号公報
Ha YL, (1987), Carcinogenesis, vol.8, no.12, p.1881-1887 Clement Ip, (1991), Cancer Res., (1991), vol.51, p.6118-6124 Kisun NL, (1994), Atherosclerosis, vol.108, p.19-25 Kim Y-I,(2011), Mol. Nutr. Food Res., vol.55, p.585-593 Kim Y-I,(2012),PLoS ONE, vol.7, no.2, e31317
　本発明の目的は、オキソ脂肪酸を効率的に製造する方法の提供、並びに、生産したオキソ脂肪酸から、水酸化脂肪酸、共役脂肪酸及び部分飽和脂肪酸等の希少脂肪酸を製造する方法を提供することである。
　本発明者らは、乳酸菌の不飽和脂肪酸代謝経路の全貌を明らかにし、該代謝系の中間体として、オキソ脂肪酸、水酸化脂肪酸、共役脂肪酸及び部分飽和脂肪酸を見出すとともに、これらの生成に関与する新規酵素（CLA-ER）を同定した。
　具体的には、本発明者らは、既知の酵素（CLA-HY,CLA-DC,CLA-DH）と新規酵素（CLA-ER）とを用いて、リノール酸からシス-9，トランス-11-共役リノール酸（c9,t11-CLA（CLA1））、トランス-9，トランス-11-共役リノール酸（t9,t11-CLA（CLA2））、オレイン酸、トランス-10-オクタデセン酸（t10-18:1）等が生成される一連のメカニズムを明らかにした（図１参照）。その反応の中間体として、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸（以下、「KetoA」ともいう）、10-オキソオクタデカン酸（以下、「KetoB」ともいう）、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸（以下、「KetoC」ともいう）等のオキソ脂肪酸が生成されること、さらに、一部の酵素反応（水酸化脂肪酸の酸化反応）の代わりに、クロム酸を用いる化学的酸化法を導入すると、変換効率が顕著に向上することも見出した。
　加えて、本発明者らは、本発明で初めて大量供給が可能となったオキソ脂肪酸を原料とし、KetoAからKetoC、KetoCからKetoB、KetoCから10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸（以下、「HYC」ともいう）、KetoBから10-ヒドロキシ-オクタデカン酸（以下、「HYB」ともいう）、HYCからCLA1又はCLA2、HYBからオレイン酸又はトランス-10-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸(以下、「HYA」という)からリノール酸又はトランス-10，シス-12－共役リノール酸(t10,c12-CLA(CLA3))が生成されるという、従来知られていなかった反応経路により、水酸化脂肪酸、共役脂肪酸又は部分飽和脂肪酸といった希少脂肪酸を生成することができることも見出した。以上の知見に基づき、本発明が完成された。
　即ち、本発明は下記のとおりである：
［１］9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸から、水和酵素反応により、10位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を誘導し、該水酸化脂肪酸から、脱水素酵素反応又は化学的酸化により、10位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
［２］9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、α-リノレン酸、ステアリドン酸、シス-9,トランス-11-オクタデカジエン酸又はリシノール酸である［１］の方法。
［３］水和酵素及び脱水素酵素が乳酸菌由来である［１］又は［２］の方法。
［４］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［３］の方法。
［５］10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から、異性化酵素反応により、10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
［６］10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸である、［５］の方法。
［７］異性化酵素が乳酸菌由来である［５］又は［６］の方法。
［８］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［７］の方法。
［９］10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から飽和化酵素により、10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
［１０］10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、［９］の方法。
［１１］飽和化酵素が乳酸菌由来である［９］又は［１０］の方法。
［１２］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［１１］の方法。
［１３］以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ［９］の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ［９］の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
［１４］［１３］の酵素タンパク質をコードする核酸。
［１５］［１４］の核酸を含むベクター。
［１６］［１５］のベクターで形質転換された宿主細胞。
［１７］［１６］の宿主細胞を培養し、該培養物から［１３］の酵素タンパク質を回収することを含む、該酵素の製造方法。
［１８］飽和化酵素が、［１３］のタンパク質である［９］の方法。
［１９］10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から、脱水素酵素反応により、10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を製造する方法。
［２０］10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、［１９］の方法。
［２１］脱水素酵素が乳酸菌由来である［１９］又は［２０］の方法。
［２２］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［２１］の方法。
［２３］10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸から、脱水素酵素反応により、10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸を製造する方法。
［２４］10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソオクタデカン酸、10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸又は10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸である、［２３］の方法。
［２５］脱水素酵素が乳酸菌由来である［２３］又は［２４］の方法。
［２６］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［２５］の方法。
［２７］10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、9位にシス型二重結合及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸又は9位及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸を製造する方法。
［２８］10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、［２７］の方法。
［２９］脱水酵素が乳酸菌由来である［２７］又は［２８］の方法。
［３０］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［２９］の方法。
［３１］10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、9位にシス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸又は10位にトランス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸を製造する方法。
［３２］10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシオクタデカン酸、10-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸である、［３１］の方法。
［３３］脱水酵素が乳酸菌由来である［３１］又は［３２］の方法。
［３４］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［３３］の方法。
［３５］10位に水酸基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、９位及び12位にシス型二重結合を有する共役脂肪酸又は10位にトランス型二重結合及び12位にシス型二重結合を有する共役脂肪酸を製造する方法。
［３６］10位に水酸基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸である、［３５］の方法。
［３７］脱水酵素が乳酸菌由来である［３５］又は［３６］の方法。
［３８］乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）FERM BP-10549菌株である［３７］の方法。
　本発明は、従来知られていなかった飽和化酵素（CLA-ER）を見出し、既知の酵素と組み合わせて、乳酸菌の不飽和脂肪酸代謝経路の全貌を明らかにした。そして、多段階的な酵素反応により、オキソ脂肪酸を生成することができること、当該反応の一部を化学的酸化反応に代えることで、より効率的な変換を行うことができ、オキソ脂肪酸を大量に生成することができる。また、オキソ脂肪酸からも、希少脂肪酸を効率的に製造することができ、これらのオキソ脂肪酸、希少脂肪酸等は、医薬・食品・化粧品等の様々な分野で使用される点でも、極めて有用である。
本発明のオキソ脂肪酸及び希少脂肪酸の製造法の全体像を示す図である。出発材料としてリノール酸を用いた場合を例に示している。
　以下、本発明の詳細を説明する。
　本発明は、乳酸菌の不飽和脂肪酸代謝経路の各反応を、酵素法にて（また酵素反応の効率が低い反応については、必要に応じて化学的に）適宜組み合わせて行うことにより、オキソ脂肪酸や、水酸化脂肪酸、共役脂肪酸又は部分飽和脂肪酸等の有用な希少脂肪酸を製造する方法を提供する。オーバーオールの反応系の一例を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　第１の本発明は、9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸（以下、「cis-9不飽和脂肪酸」と略記する場合がある）から、２段階の反応により、10位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）を製造する方法を提供する。第１の反応（反応１）では、cis-9不飽和脂肪酸から、水和酵素反応により10位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）が生成する。
　反応１の「基質」は、9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸であれば特に制限されず、例えばモノエン酸（18:1）、ジエン酸（18:2）、トリエン酸（18:3）、テトラエン酸（18:4）、ペンタエン酸（18:5）などが挙げられる。ジエン酸、トリエン酸、又はテトラエン酸がより好ましく、ジエン酸類、又はトリエン酸類が特に好ましい。尚、本明細書において「脂肪酸」という場合、遊離の酸のみならず、エステル体、塩基性化合物との塩等をも包含する。
　モノエン酸としては、例えば、オレイン酸、リシノール酸等が挙げられる。
　ジエン酸としては、例えば、リノール酸（cis-9,cis-12-18:2）、シス-9,トランス-11-オクタデカジエン酸（cis-9,trans-11-18:2）等が挙げられる。
　トリエン酸類としては、例えば、α－リノレン酸（cis-9,cis-12,cis-15-18:3）、γ－リノレン酸（cis-6,cis-9,cis-12-18:3）等が挙げられる。
　テトラエン酸としては、例えば、ステアリドン酸（cis-6,cis-9,cis-12,cis-15-18:4）等が挙げられる。
　反応１を触媒する水和酵素としては、上記のcis-9不飽和脂肪酸を基質として利用し、10-hydroxy脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の脂肪酸－ヒドラターゼ（CLA-HY）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-HYであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-HYである。CLA-HYは、特開2007-259712号公報に記載される方法や、後述の実施例に記載される方法により取得することができる。水和酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　水和酵素反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質であるcis-9不飽和脂肪酸と水和酵素とを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４０ｇ／Ｌである。水和酵素の添加量は、例えば、０．００１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２～２ｍｇ／ｍｌである。
　反応１には「補因子」を用いてよく、例えば、NADH、NADPHやFADH2等を用いることができる。その添加濃度は水和反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは０．００１～２０ｍＭ、より好ましくは０．０１～１０ｍＭである。
　さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、モリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、及びタングステン(VI)酸ナトリウム二水和物からなる群から選ばれる１又は２以上の化合物が挙げられる。その添加濃度は水和反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは０．１～２０ｍＭ、より好ましくは１～１０ｍＭである。
　反応１は、水和酵素の好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の好ましい一実施態様においては、水和酵素は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて補因子や活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、水和酵素反応を行うこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　第１の本発明における第２の反応（反応２）では、10-hydroxy脂肪酸から、脱水素酵素反応もしくはクロム酸を用いた化学的酸化により、10位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）が生成する。
　反応２を触媒する脱水素酵素としては、10-hydroxy脂肪酸を基質として利用し、10-oxo脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の水酸化脂肪酸－デヒドロゲナーゼ（CLA-DH）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-DHであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DHである。CLA-DHは、特開2007-259712号公報に記載される方法や、後述の実施例に記載される方法により取得することができる。脱水素酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　脱水素酵素反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質である10-hydroxy脂肪酸と脱水素酵素とを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４０ｇ／Ｌである。脱水素酵素の添加量は、例えば、０．００１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２～２ｍｇ／ｍｌである。
　反応２には「補因子」を用いてよく、例えば、NAD、NADPやFAD等を用いることができる。その添加濃度は酸化反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは０．００１～２０ｍＭ、より好ましくは０．０１～１０ｍＭである。
　さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
　反応２は、脱水素酵素の好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の一実施態様においては、脱水素酵素は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて補因子や活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、酸化反応を行うこともできる。
　後述の実施例９及び１１に示されるとおり、本発明者らは、脱水素酵素としてＬ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DHを用いた場合、10-hydroxy脂肪酸から10-oxo脂肪酸への変換効率が比較的低いことを見出した。そこで、反応２をクロム酸を用いた化学的酸化に置き換えることにより、極めて高い変換効率を得ることに成功した。従って、第１の本発明において、第２の反応は化学的酸化により行うことがより好ましい。
　化学的酸化としては、自体公知の方法、例えばクロム酸酸化、好ましくはジョーンズ酸化等が挙げられる。クロム酸としては、無水クロム酸CrO3、クロム酸H2CrO4、二クロム酸H2Cr2O7といった化合物の塩や錯体を使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　第２の本発明は、10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo,cis-12脂肪酸」と略記する場合がある）から、異性化酵素反応（反応３）により、10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo,trans-11脂肪酸」と略記する場合がある）を製造する方法を提供する。
　反応３の「基質」としては、上記反応１及び２により、9位及び12位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸から誘導される10-oxo,cis-12脂肪酸であれば特に制限されず、リノール酸から誘導される10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸（KetoA）、α－リノレン酸から誘導される10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（αKetoA）、γ－リノレン酸から誘導される10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（γKetoA）、ステアリドン酸から誘導される10-オキソ-シス-6, シス-12, シス-15-オクタデカトリエン酸（sKetoA）等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応１及び２以外の方法により得られたものであってもよい。
　反応３を触媒する異性化酵素としては、上記の10-oxo,cis-12脂肪酸を基質として利用し、10-oxo,trans-11脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来のオキソ脂肪酸－イソメラーゼ（CLA-DC）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-DCであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DCである。CLA-DCは、特開2007-259712号公報に記載される方法や、後述の実施例に記載される方法により取得することができる。異性化酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　異性化酵素反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質である10-oxo,cis-12脂肪酸と異性化酵素とを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４０ｇ／Ｌである。異性化酵素の添加量は、例えば、０．００１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２～２ｍｇ／ｍｌである。
　異性化酵素反応には「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
　反応３は、異性化酵素の好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の好ましい一実施態様においては、異性化酵素は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、異性化酵素反応を行うこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　第３の本発明は、10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（10-oxo,trans-11脂肪酸）から、飽和化酵素反応（反応４）により、10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸」と略記する場合がある）を製造する方法を提供する。
　反応４の「基質」としては、上記反応３により生成し得る10-oxo,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸（KetoA）から誘導される10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸（KetoC）、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（「αKetoA」ともいう）から誘導される10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（「αKetoC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（「γKetoA」ともいう）から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（「γKetoC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（「sKetoA」ともいう）から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（「sKetoC」ともいう）等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応３以外の方法により得られたものであってもよい。
　反応４を触媒する飽和化酵素としては、上記の10-oxo,trans-11脂肪酸を基質として利用し、10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、本発明において単離された乳酸菌由来のオキソ脂肪酸－エノンレダクターゼ（CLA-ER）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-ERであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-ERである。
　本発明の新規酵素「CLA-ER」は、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ上記反応４を触媒する酵素活性を有するタンパク質、あるいは
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ上記反応４を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
　上記（ｂ）に関し、より具体的には、（i）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1～20個、好ましくは1～10個、より好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。性質の似たアミノ酸（例えば、グリシンとアラニン、バリンとロイシンとイソロイシン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等）同士の置換等であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。
　上記のようにアミノ酸が欠失、置換又は挿入されている場合、その欠失、置換、挿入の位置は、上記酵素活性が保持される限り、特に限定されない。
　上記（ｃ）において「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば70、80、90、95又は99％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1xSSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1xSSC、0.1％SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1xSSC、0.1％SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2～3回洗浄する条件等が挙げられる。
　CLA-ERは、例えば、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549株の菌体や培養液から、自体公知のタンパク質分離精製技術により単離することができる。あるいは、実施例２に記載された方法に従ってCLA-ERををコードする遺伝子を単離し、適当なベクターにサブクローニングし、大腸菌などの適当な宿主に導入して培養し、組換えタンパク質として製造することもできる。CLA-ERは精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　本発明のCLA-ERをコードする核酸を含むベクターは、目的（例えば、タンパク質の発現）に応じて、ベクターを導入する宿主細胞に適したものを適宜選択し、使用することができる。発現ベクターである場合、適切なプロモーターに機能可能に連結された本発明の核酸を含み、好ましくは本発明の核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）も含むこともできる。また、発現したタンパク質の分離・精製に有用なタグ配列をコードする配列等を含んでもよい。また、ベクターは、対象宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。そして、本発明のベクターは、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法等、自体公知の形質転換法で、対象宿主細胞内に導入することができる。
　本発明において「宿主細胞」は、本発明のCLA-ERをコードする核酸を含むベクターを発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌及び高等真核細胞等が挙げられる。細菌の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。CLA-ERをコードする核酸を含むベクターが導入された組換え細胞は、宿主細胞に適した自体公知の方法により培養することができる。
　本発明のCLA-ERの「精製」は、自体公知の方法、例えば、遠心分離等で集菌した菌体を、超音波又はガラスビーズ等で摩砕した後、遠心分離等により細胞片等の固形物を除き、粗酵素液を調製し、さらに、硫安、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィー等のクロマトグラフ法、ゲル電気泳動法等を用いることができる。
　飽和化酵素反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質である10-oxo,trans-11脂肪酸と飽和化酵素とを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４０ｇ／Ｌである。飽和化酵素の添加量は、例えば、０．００１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２～２ｍｇ／ｍｌである。
　反応４には「補因子」を用いてよく、例えば、NADH等を用いることができる。その添加濃度は酸化反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは０．００１～２０ｍＭ、より好ましくは０．０１～１０ｍＭである。
　さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
　反応４は、飽和化酵素の好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の好ましい一実施態様においては、飽和化酵素は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、飽和化酵素反応を行うこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　第４の本発明は、10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（10-oxo,trans-11脂肪酸）から、脱水素酵素反応（反応５）により、10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy,trans-11脂肪酸」と略記する場合がある）を製造する方法、又は、10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸（10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸）から、脱水素酵素反応（反応６）により、10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸」と略記する場合がある）を製造する方法を提供する。
　反応５の「基質」としては、上記反応３により生成し得る10-oxo,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸（KetoA）から誘導される10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸（KetoC）、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（「αKetoA」ともいう）から誘導される10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（「αKetoC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（「γKetoA」ともいう）から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（「γKetoC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（「sKetoA」ともいう）から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（「sKetoC」ともいう）等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応３以外の方法により得られたものであってもよい。
　一方、反応６の「基質」としては、上記反応４により生成し得る10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸（KetoC）から誘導される10-オキソオクタデカン酸（KetoB）、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（αKetoC）から誘導される10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸（「αKetoB」ともいう）、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（γKetoC）から誘導される10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸（「γKetoB」ともいう）、10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（sKetoC）から誘導される10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸（「sKetoB」ともいう）等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応４以外の方法により得られたものであってもよい。
　反応５又は反応６を触媒する脱水素酵素としては、10-oxo,trans-11脂肪酸又は10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸を基質として利用し、10-hydroxy,trans-11脂肪酸又は10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の水酸化脂肪酸－デヒドロゲナーゼ（CLA-DH）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-DHであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DHである。CLA-DHは、上記反応２における酸化反応を触媒するが、逆反応として、反応５又は反応６の還元反応を触媒することもできる。
　脱水素酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　脱水素酵素による還元反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質である10-oxo,trans-11脂肪酸又は10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸と脱水素酵素とを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４０ｇ／Ｌである。脱水素酵素の添加量は、例えば、０．００１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２～２ｍｇ／ｍｌである。
　反応５及び反応６には「補因子」を用いてよく、例えば、NADH、NADPHやFADH2等を用いることができる。その添加濃度は還元反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは０．００１～２０ｍＭ、より好ましくは０．０１～１０ｍＭである。
　さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
　反応５及び反応６は、脱水素酵素の好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の好ましい一実施態様においては、脱水素酵素は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて補因子や活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、還元反応を行うこともできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　第５の本発明は、10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（10-hydroxy,trans-11脂肪酸）から、脱水酵素反応（反応７）により、9位にシス型二重結合及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸（以下、「cis-9,trans-11共役脂肪酸」と略記する場合がある）もしくは9位及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸（以下、「trans-9,trans-11共役脂肪酸」と略記する場合がある）を製造する方法、10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸（10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸）から、脱水酵素反応（反応８）により、9位にシス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸（以下、「cis-9部分飽和脂肪酸」と略記する場合がある）もしくは10位にトランス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸（以下、「trans-10部分飽和脂肪酸」と略記する場合がある）、又は10位に水酸基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy,cis-12脂肪酸」と略記する場合がある）から、脱水酵素反応（反応９）により、9位及び12位にシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸（以下、「cis-9,cis-12不飽和脂肪酸」と略記する場合がある）もしくは10位にトランス型二重結合及び12位にシス型二重結合を有する共役脂肪酸（以下、「trans-10,cis-12共役脂肪酸」と略記する場合がある）を製造する方法を提供する。
　反応７の「基質」としては、上記反応５により生成し得る10-hydroxy,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸（KetoC）から誘導される10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸（HYC）、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（αKetoC）から誘導される10-ヒドロキシ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（「αHYC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（γKetoC）から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（「γHYC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（sKetoC）から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（「sHYC」ともいう）等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応５以外の方法により得られたものであってもよい。
　反応８の「基質」としては、上記反応６により生成し得る10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソオクタデカン酸（KetoB）から誘導される10-ヒドロキシオクタデカン酸（HYB）、10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸（αKetoB）から誘導される10-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸（「αHYB」ともいう）、10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸（γKetoB）から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6-オクタデカセン酸（「γHYB」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸（sKetoB）から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸（「sHYB」ともいう）等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応６以外の方法により得られたものであってもよい。
　反応９の「基質」としては、例えば、9位及び12位にシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸から、上記反応１により生成し得る10-hydroxy,cis-12脂肪酸であれば特に制限されず、リノール酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸（HYA）、α-リノレン酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（「αHYA」ともいう）、γ-リノレン酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（「γHYA」ともいう）、ステアリドン酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（「sHYA」ともいう）等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応１以外の方法により得られたものであってもよい。
　反応７～９を触媒する脱水酵素としては、上記の10-hydroxy,trans-11脂肪酸、10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸又は10-hydroxy,cis-12脂肪酸を基質として利用し、cis-9,trans-11共役脂肪酸もしくはtrans-9,trans-11共役脂肪酸、cis-9部分飽和脂肪酸もしくはtrans-10部分飽和脂肪酸、又はcis-9,cis-12不飽和脂肪酸もしくはtrans-10,cis-12共役脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の脂肪酸－ヒドラターゼ（CLA-HY）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-HYであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-HYである。CLA-HYは、上記反応１における水和反応を触媒するが、逆反応として、反応７～９の脱水反応を触媒することもできる。
　脱水酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
　脱水酵素反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等）中で、基質である10-hydroxy,trans-11脂肪酸、10-hydroxy,trans-11,12-飽和化脂肪酸又は10-hydroxy,cis-12脂肪酸と脱水酵素とを適当な濃度で混合し、インキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２０～４０ｇ／Ｌである。脱水酵素の添加量は、例えば、０．００１～１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２～２ｍｇ／ｍｌである。
　反応７～９には「補因子」を用いてよく、例えば、NADH、NADPHやFADH2等を用いることができる。その添加濃度は脱水反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは０．００１～２０ｍＭ、より好ましくは０．０１～１０ｍＭである。
　さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
　反応７～９は、脱水酵素の好適温度、好適ｐＨの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は５～５０℃、好ましくは２０～４５℃である。また、反応液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５～９である。反応時間も特に制限はないが、例えば１０分～７２時間、好ましくは３０分～３６時間である。
　本発明の好ましい一実施態様においては、脱水酵素は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて補因子や活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、脱水反応を行うこともできる。
　本発明で得られるオキソ脂肪酸、水酸化脂肪酸、共役脂肪酸又は部分飽和脂肪酸（以下、包括して「オキソ脂肪酸等」という）は、従来公知の生理活性に基づいて、例えば、医薬、食品、化粧料に配合して使用され得る。
　オキソ脂肪酸等を含有する医薬の剤型としては、散在、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、オキソ脂肪酸等は水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いる。
　製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ－マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料等を挙げることができる。なお、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。
　注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。
　本発明で得られるオキソ脂肪酸等を含有する「食品」の形態としては、例えば、サプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）等が挙げられる。
　上記食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。
　本発明で得られるオキソ脂肪酸等を含有する「化粧料」としては、クリーム、乳液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、入浴剤などが挙げられ、香料等を混合してもよい。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549の培養方法
　4℃にて保管している2%寒天を含むMRS高層培地よりラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549を15 ml のMRS液体培地（Difco製; pH 6.5）に植菌し、28℃で20時間、120 rpmにて前培養を行った。本培養は、以下に示すリノール酸溶液を7.7 ml含む550 ml のMRS液体培地に前培養を全量植菌し、28℃で24時間、120 rpmにて行った。リノール酸溶液は、50 mgのリノール酸に10 mgの牛血清アルブミンを加え、1 mlの0.1 Mリン酸カリウムバッファー（pH 6.5）に懸濁し、10分間の超音波により均一にした後、0.45 μmのフィルターを用い除菌したものを用いた。培養後、3,000 rpm、4℃にて10分間遠心分離することにより集菌し、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549の菌体を得た。
　尚、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549株は、平成１８年（２００６）年３月７日より独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（IPOD, AIST）（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター (IPOD, NITE)）；〒305-8566　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６に寄託されている。
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する酵素（CLA-ER：オキソ脂肪酸－エノンレダクターゼ）の遺伝子のクローニング
　(1) ゲノムDNAの取得
　ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549の湿菌体14 gを180 mlのTENバッファー（10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1 mM EDTA; 10 mM NaCl）に懸濁した。これに9 mlのSETバッファー（20% Sucrose; 50 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)）、135 mgのリゾチームを加え37℃で10分間インキュベートしたのち、90 mlのTENバッファー、9 mlの25% SDS、18 mlの5 M NaCl、180 mlのフェノール、32 mlのクロロホルムを加えゆっくりと完全に混合した。その後、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。続いて、上層と等量のクロロホルムを加え完全に混合し、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。これに等量のエタノールを加え、完全に混合し、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿を20分間真空デシケーターにて乾燥した後、少量のTEバッファー（10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA）に溶解した。これに20 μlのRNaseA溶液を添加し、37℃で15時間インキュベートした後、1.2 mlのクロロホルムを加え、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し上層を回収した。これに6 mlのクロロホルムを加え、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。さらに6 mlのイソプロパノールを加え完全に混合した後、30分室温にてインキュベートし、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿物を70%エタノールにて洗浄した後、真空デシケーターにて乾燥し、TEバッファーに溶解し、ゲノムDNAを得た。
　(2) PCRによるCLA-ER遺伝子の取得
　公表されているラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の全ゲノム遺伝子配列においてCLA-DCのすぐ下流に存在するopen-reading-frame (ORF)をターゲットにした。該ORFの開始コドンの5'側9～28塩基上流の配列をもとに、センスプライマー（配列番号３）を、また、終止コドンの3'側13～31塩基下流の配列を基にアンチセンスプライマー（配列番号４）を設計した。これらのプライマーを用い、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行った。PCRの結果増幅された遺伝子断片約0.7 kbpの塩基配列の解読を行った結果、本遺伝子断片には開始コドンATGから始まり終止コドンTAAで終わる654 bpの一つのORF（配列番号１）が含まれていることが判明し、本遺伝子をCLA-ER遺伝子とした。本CLA-ER遺伝子は配列番号２に示す２１７残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。
（CLA-ER）の大腸菌での発現
　大腸菌発現用ベクターpET101/D-TOPO (Invitrogen)とロゼッタ2(DE3)株からなる宿主ベクター系を用いた。ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549のCLA-ER遺伝子の開始コドンATGの前にCACCを付加し、開始コドンならびにそれを含む3'末端側23塩基の配列に基づいて設計したセンスプライマー（配列番号５）と、終止コドンのTAAを削除した5'末端側26塩基の配列に基づいて設計したアンチセンスプライマー（配列番号６）を用い、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの結果増幅された約0.6 kbpの遺伝子断片をpET101/D-TOPOに挿入し、発現ベクター(pCLA-ER)を構築した。pCLA-ERをロゼッタ2(DE3)株に形質転換し、形質転換株ロゼッタ/pCLA-ER株を得た。得られたロゼッタ/pCLA-ER株を1 mgアンピシリンを含む10 ml LB培地（1%バクトトリプトン(Difco)、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウムを含む培地(pH 7.0)）にて37℃、15時間、300 rpmで好気的に培養し、前培養とした。これを75 mgアンピシリンを含む750 ml LB培地に前培養液10 ml植菌し、2時間、37℃、100 rpmで好気的に培養した後、1 M IPTGを750 μl添加し、さらに20℃にて15時間、100 rpmで好気的に培養した。培養後3,000 rpmにて10分間遠心分離し、ロゼッタ/pCLA-ER株の湿菌体を得た。飽和化酵素は、CLA-ER発現形質転換大腸菌を用いた。
各形質転換大腸菌の調製法
　岸野らの報告（Biochemical and Biophysical Research Communications 416(2011)188-193）に基づき、CLA-HY, CLA-DH, CLA-DC各発現形質転換大腸菌を作製した。水和酵素及び脱水酵素はCLA-HY発現形質転換大腸菌、異性化酵素はCLA-DC発現形質転換大腸菌及び、脱水素酵素はCLA-DH発現形質転換大腸菌を用いた。
脱水酵素形質転換大腸菌からの脱水酵素の精製
　培養により得られた菌体を3 mlのバッファーC（40 mM イミダゾール、50 mM リン酸カリウムバッファー(pH 8.0)、0.5 M NaCl）に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。破砕後、10,000 x gにて60分間4℃にて超遠心分離し、上層を回収した。続いてFPLCを用いてアフィニティーカラム（HisTrap HP）及び透析（透析液は50 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)）により精製を行った。
脱水素酵素形質転換大腸菌からの脱水素酵素の精製
　培養により得られた菌体を3 mlのBugBuster Master Mix（Novagen）に懸濁し、室温で20分間インキュベートした。インキュベート後、10,000 x gにて60分間4℃にて超遠心分離し、上層を回収した。続いてFPLCを用いてゲル濾過カラム（Superdex 200 Hiload 26/60）、イオン交換カラム（MonoQ 10/100）、ゲル濾過カラム（Superdex 200 10/300）及び透析（透析液はバッファーC）により精製を行った。
大腸菌で発現させた水和酵素を用いたリノール酸からHYAの生成
　水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いリノール酸からHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 3 g）、NADH (600 mg)、FAD (15 mg)、リノール酸 (5 g)、BSA(1 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を160 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に36時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液(160 ml)に対して1.6 mlの5N HCl、200 mlのクロロホルム、200 mlのメタノールを加えスターラーで撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し150 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約80%がHYAであることを確認した。
実施例７より得られた抽出物(HYAを含む混合物)からHYAの精製
　実施例７より得られた抽出物(HYAを含む混合物)の10倍重量のシリカゲル（Wakogel(R)C-100）をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム（無水）を重層した。ヘキサン：ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例７より得られた抽出物(HYAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約2 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、未反応の基質や菌体由来の脂質を除去した後、溶出液をヘキサン：ジエチルエーテル=6:4に変更し、さらに溶出させた。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、HYAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてHYAの純度を評価した。その結果、純度98%以上のHYAを得た。
大腸菌で発現させたCLA-DHを用いたHYAからKetoAの生成
　実施例６により得られた精製脱水素酵素を用いHYAからKetoA生成試験を行った。反応液は、精製脱水素酵素 (酵素量83μg)、0.5 mM NAD+、0.01 mM FAD、0.1% HYAを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 8.0)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出しメチルエステル化した後ガスクロマトグラフィーにてKetoAの生成を評価した。その結果、HYAからKetoA(0.06 mg)の生成を確認した。
無水クロム酸(CrO3)を用いたHYAからKetoAの生成
　無水クロム酸2.67 gに硫酸2.3 ml、水7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作製した。三角フラスコに、2 gのHYAと、40 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を１滴ずつ加えた。溶液が青色から抹茶色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止した。析出した沈殿をろ紙を用いて濾過し、分液ロートに入れさらにジエチルエーテルを150 ml及びミリQ水300 mlを加えてよく振り、ジエチルエーテル層を数回ミリQ水で洗浄した。洗浄後のジエチルエーテル層に硫酸ナトリウム（無水）を適量加えて撹拌し残存水分を除去した。添加した無水硫酸ナトリウムをろ紙を用いて濾過し、得られたジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてKetoAの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がKetoAであることを確認した。
　無水クロム酸を用いたKetoA生産と、大腸菌で発現させたCLA-DHを用いたKetoA生産の比較
　精製脱水素酵素を用いたKetoA生産法は、1 mgのHYAを含む1 mlの反応系から0.06 mgのKetoAが生成したことより、変換効率は6%であった。
　それに対し無水クロム酸を用いたKetoA生産法は、2 gのHYAから抽出した全脂肪酸のうち約95%がKetoAであったことより、変換率は約95%となり、大幅なKetoA生産効率の向上に成功した。
実施例１０より得られた抽出物(KetoAを含む混合物)からKetoAの精製
　実施例１０より得られた抽出物(KetoAを含む混合物)の20～30倍重量のシリカゲル（Wakogel(R)C-100）をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム（無水）を重層した。ヘキサン：ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例１０より得られた抽出物(KetoAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約2 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、KetoAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてKetoAの純度を評価した。その結果、純度98%以上のKetoAを得た。
大腸菌で発現させた水和酵素を用いたα-リノレン酸からαHYAの生成
　水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いα-リノレン酸からαHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 0.7 g）、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、α-リノレン酸(1 g)、BSA(0.2 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてαHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約35%がαHYAであることを確認した。
実施例１３より得られた抽出物(αHYAを含む混合物)からαHYAの精製
　実施例１３より得られた抽出物(αHYAを含む混合物)の20～30倍重量のシリカゲル（Wakogel(R)C-100）をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム（無水）を重層した。ヘキサン：ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例１３より得られた抽出物(αHYAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約3 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、未反応の基質や菌体由来の脂質を除去した後、溶出液をヘキサン：ジエチルエーテル=6:4に変更し、さらに溶出させた。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、αHYAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてαHYAの純度を評価した。その結果、純度99%以上のαHYAを得た。
無水クロム酸(CrO3)を用いたαHYAからαKetoAの生成
　無水クロム酸2.67 gに硫酸2.3 ml、水7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作製した。三角フラスコに、2 gのαHYAと、40 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を１滴ずつ加えた。溶液が青色から抹茶色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止した。析出した沈殿をろ紙を用いて濾過し、分液ロートに入れさらにジエチルエーテルを150 ml及びミリQ水300 mlを加えてよく振り、ジエチルエーテル層を数回ミリQ水で洗浄した。洗浄後のジエチルエーテル層に硫酸ナトリウム（無水）を適量加えて撹拌し残存水分を除去した。添加した無水硫酸ナトリウムをろ紙を用いて濾過し、得られたジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてαKetoAの純度を評価した。その結果、抽出物の約80%がαKetoAであることを確認した。
実施例１５より得られた抽出物(αKetoAを含む混合物)からαKetoAの精製
　実施例１５より得られた抽出物(αKetoAを含む混合物)の20～30倍重量のシリカゲル（Wakogel(R)C-100）をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム（無水）を重層した。ヘキサン：ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例１５より得られた抽出物(αKetoAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約2 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、αKetoAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてαKetoAの純度を評価した。その結果、純度98%以上のαKetoAを得た。
大腸菌で発現させた水和酵素を用いたγ-リノレン酸からγHYAの生成
　水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いγ-リノレン酸からγHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 0.7 g）、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、γ-リノレン酸(1 g)、BSA(0.2 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてγHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約85%がγHYAであることを確認した。
実施例１７より得られた抽出物(γHYAを含む混合物)からγHYAの精製
　実施例１７より得られた抽出物(γHYAを含む混合物)の20～30倍重量のシリカゲル（Wakogel(R)C-100）をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム（無水）を重層した。ヘキサン：ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例１７より得られた抽出物(γHYAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約3 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、未反応の基質や菌体由来の脂質を除去した後、溶出液をヘキサン：ジエチルエーテル=6:4に変更し、さらに溶出させた。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、γHYAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてγHYAの純度を評価した。その結果、純度99%以上のγHYAを得た。
無水クロム酸(CrO3)を用いたγHYAからγKetoAの生成
　無水クロム酸2.67 gに硫酸2.3 ml、水7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作製した。三角フラスコに、2 gのγHYAと、40 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を１滴ずつ加えた。溶液が青色から抹茶色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止した。析出した沈殿をろ紙を用いて濾過し、分液ロートに入れさらにジエチルエーテルを150 ml及びミリQ水300 mlを加えてよく振り、ジエチルエーテル層を数回ミリQ水で洗浄した。洗浄後のジエチルエーテル層に硫酸ナトリウム（無水）を適量加えて撹拌し残存水分を除去した。添加した無水硫酸ナトリウムをろ紙を用いて濾過し、得られたジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてγKetoAの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がγKetoAであることを確認した。
大腸菌で発現させた水和酵素を用いたステアリドン酸からsHYAの生成
　水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いステアリドン酸からsHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 0.7 g）、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、ステアリドン酸(0.2 g)、BSA(40 mg)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてsHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約50%がsHYAであることを確認した。
大腸菌で発現させた水和酵素を用いたリシノール酸から10,12-ジヒドロキシオクタデカン酸（rHYA）の生成
　水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いリシノール酸からrHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 0.7 g）、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、リシノール酸(1 g)、BSA(0.2 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてrHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がrHYAであることを確認した。
大腸菌で発現させた異性化酵素を用いたKetoAからKetoCの生成
　KetoA (1 g)、BSA(0.2 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)（4 ml）を超音波にて乳化後、試験管10本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約56%がKetoCであることを確認した。
HPLCを用いたKetoCの精製
　野村化学社製のDevelosil C30-UG-3 (10 X 150 mm)を用い、移動相はアセトニトリル：水：酢酸（80：20：0.002）、流速3.5 ml/min、カラム温度は30℃、検出は225 nmの吸収でモニターした。上記実施例２４で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.15 mlをカラムにアプライした。保持時間7.5分あたりで溶出されてくるKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてKetoCの純度を評価した。その結果、純度98%以上でKetoCを得た。
大腸菌で発現させた異性化酵素を用いたαKetoAからαKetoCの生成
　αKetoA (0.5 g)、BSA(0.1 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)（2 ml）を超音波にて乳化後、試験管4本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を0.5 mlずつ添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いて高速液体クロマトグラフィーにてαKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約65%がαKetoCであることを確認した。
HPLCを用いたαKetoCの精製
　野村化学社製のDevelosil C30-UG-5を用い、移動相はアセトニトリル：水：酢酸（60：40：0.002）、流速10 ml/min、カラム温度は30℃、検出は210 nmと233 nmの吸収でモニターした。上記実施例２６で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.17 mlをカラムにアプライした。リサイクルシステムを用い溶出されてくるαKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてαKetoCの純度を評価した。その結果、純度98%以上でαKetoCを得た。
大腸菌で発現させた異性化酵素を用いたγKetoAからγKetoCの生成
　γKetoA (0.5 g)、BSA(0.1 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)（2 ml）を超音波にて乳化後、試験管4本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を0.5 mlずつ添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてγKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がγKetoCであることを確認した。
HPLCを用いたγKetoCの精製
　野村化学社製のDevelosil C30-UG-5を用い、移動相はアセトニトリル：水：酢酸（60：40：0.002）、流速10 ml/min、カラム温度は30℃、検出は210 nmと233 nmの吸収でモニターした。上記実施例２６で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.17 mlをカラムにアプライした。リサイクルシステムを用い溶出されてくるγKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてγKetoCの純度を評価した。その結果、純度96%以上でγKetoCを得た。
大腸菌で発現させた異性化酵素を用いたKetoAからKetoCの生成
　KetoA (1 g)、BSA(0.2 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)（4 ml）を超音波にて乳化後、試験管10本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約56%がKetoCであることを確認した。
HPLCを用いたKetoCの精製
　野村化学社製のDevelosil C30-UG-3 (10 X 150 mm)を用い、移動相はアセトニトリル：水：酢酸（80：20：0.002）、流速3.5 ml/min、カラム温度は30℃、検出は225 nmの吸収でモニターした。上記実施例２８で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.15 mlをカラムにアプライした。保持時間7.5分あたりで溶出されてくるKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてKetoCの純度を評価した。その結果、純度98%以上でKetoCを得た。
大腸菌で発現させた飽和化酵素を用いたKetoCからKetoBの生成
　飽和化酵素を用いKetoB生成試験を行った。反応液は、飽和化酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 33 mg）、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、KetoC(5.2 mg)、1 mg BSAを含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に17時間、200 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてKetoBの生成を評価した。その結果、変換率30%でKetoBが生成していることを明らかにした。
大腸菌で発現させた異性化酵素及び飽和化酵素を用いたαKetoAからαKetoBの生成
　異性化酵素及び飽和化酵素を用いαKetoB生成試験を行った。反応液は、異性化酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 80 mg）、飽和化酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 80 mg）、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、αKetoA(2 mg)、0.4 mg BSAを含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に18時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてαKetoBの生成を評価した。その結果、変換率99%でαKetoBが生成していることを明らかにした。
大腸菌で発現させた脱水素酵素を用いたKetoCからHYCの生成
　実施例６より得られた精製脱水素酵素を用いHYC生成試験を行った。反応液は、精製脱水素酵素(酵素量83 μg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、 0.005% KetoCを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を0.8 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてにてHYCの生成を評価した。その結果、KetoCからHYC(0.02 mg)の生成を確認した。
大腸菌で発現させた脱水素酵素を用いたKetoBからHYBの生成
　脱水素酵素を用いHYB生成試験を行った。反応液は、脱水素酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体重量 50 mg）、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.02% KetoBを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてHYBの生成を評価した。その結果、KetoBからHYB(0.08 mg)の生成を確認した。
大腸菌で発現させた脱水酵素を用いたHYCからCLA1及びCLA2の生成
　実施例５より得られた精製脱水酵素を用いCLA1及びCLA2生成試験を行った。反応液は、精製脱水酵素(酵素量300 μg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.035% HYCを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を0.8 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてCLA1及びCLA2の生成を評価した。その結果、HYCからCLA1(0.05 mg)及びCLA2(0.15 mg)の生成を確認した。
大腸菌で発現させた脱水酵素を用いたHYBからオレイン酸及びtrans-10-オクタデセン酸の生成
　脱水酵素を用いオレイン酸及びtrans-10-オクタデセン酸生成試験を行った。反応液は、脱水酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体50 mg）、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.2% HYBを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてオレイン酸及びtrans-10-オクタデセン酸の生成を評価した。その結果、HYBからオレイン酸(0.02 mg)及びtrans-10-オクタデセン酸(0.1 mg)の生成を確認した。
大腸菌で発現させた脱水酵素を用いたHYAからリノール酸及びCLA3の生成
　脱水酵素を用いリノール酸及びtrans-10,cis-12-CLA生成試験を行った。反応液は、脱水酵素誘導形質転換大腸菌（湿菌体50 mg）、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.07% HYAを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック（三菱化学）存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてリノール酸及びCLA3の生成を評価した。その結果、HYAからリノール酸(0.26 mg)及びtrans-10,cis-12-CLA (0.07 mg)の生成を確認した。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、日本で出願された特願2012-108928（出願日：2012年5月10日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
　本発明の方法によれば、様々なオキソ脂肪酸を効率的に製造することができるため、当該オキソ脂肪酸の医薬・食品等様々な分野への適用が可能となる。また、本発明の方法によれば、オキソ脂肪酸を原料として、様々な希少脂肪酸の製造が可能となる点でも極めて有用である。

Claims (38)

  1. 　9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸から、水和酵素反応により、10位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を誘導し、該水酸化脂肪酸から、脱水素酵素反応又は化学的酸化により、10位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
  2. 　9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、α-リノレン酸、ステアリドン酸、シス-9,トランス-11-オクタデカジエン酸又はリシノール酸である、請求項１記載の方法。
  3. 　水和酵素及び脱水素酵素が乳酸菌由来である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である、請求項３記載の方法。
  5. 　10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から、異性化酵素反応により、10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
  6. 　10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸である、請求項５記載の方法。
  7. 　異性化酵素が乳酸菌由来である、請求項５又は６記載の方法。
  8. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である、請求項７記載の方法。
  9. 　10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から飽和化酵素により、10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
  10. 　10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、請求項９記載の方法。
  11. 　飽和化酵素が乳酸菌由来である、請求項９又は１０記載の方法。
  12. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である、請求項１１記載の方法。
  13. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの酵素タンパク質。
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ請求項９記載の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ請求項９記載の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
  14. 　請求項１３記載の酵素タンパク質をコードする核酸。
  15. 　請求項１４記載の核酸を含むベクター。
  16. 　請求項１５記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  17. 　請求項１６記載の宿主細胞を培養し、該培養物から請求項１３記載の酵素タンパク質を回収することを含む、該酵素の製造方法。
  18. 　飽和化酵素が、請求項１３記載のタンパク質である、請求項９記載の方法。
  19. 　10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から、脱水素酵素反応により、10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を製造する方法。
  20. 　10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、請求項１９記載の方法。
  21. 　脱水素酵素が乳酸菌由来である、請求項１９又は２０記載の方法。
  22. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である、請求項２１記載の方法。
  23. 　10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸から、脱水素酵素反応により、10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸を製造する方法。
  24. 　10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソオクタデカン酸、10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸又は10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸である、請求項２３記載の方法。
  25. 　脱水素酵素が乳酸菌由来である、請求項２３又は２４記載の方法。
  26. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である、請求項２５記載の方法。
  27. 　10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、9位にシス型二重結合及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸又は9位及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸を製造する方法。
  28. 　10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、請求項２７記載の方法。
  29. 　脱水酵素が乳酸菌由来である、請求項２７又は２８記載の方法。
  30. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である請求項２９記載の方法。
  31. 　10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、9位にシス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸又は10位にトランス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸を製造する方法。
  32. 　10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシオクタデカン酸、10-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸である、請求項３１記載の方法。
  33. 　脱水酵素が乳酸菌由来である、請求項３１又は３２記載の方法。
  34. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である、請求項３３記載の方法。
  35. 　10位に水酸基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、９位及び12位にシス型二重結合を有する共役脂肪酸又は10位にトランス型二重結合及び12位にシス型二重結合を有する共役脂肪酸を製造する方法。
  36. 　10位に水酸基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸である、請求項３５記載の方法。
  37. 　脱水酵素が乳酸菌由来である、請求項３５又は３６記載の方法。
  38. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム FERM BP-10549菌株である、請求項３７記載の方法。
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