WO2007015546A1

WO2007015546A1 - 間葉系幹細胞誘導剤及び組織再生促進剤並びに間葉系幹細胞の調製方法

Info

Publication number: WO2007015546A1
Application number: PCT/JP2006/315406
Authority: WO
Inventors: Katsuto Tamai; Satoru Otsuru; Yasufumi Kaneda
Original assignee: Genomix Co., Ltd
Priority date: 2005-08-04
Filing date: 2006-08-03
Publication date: 2007-02-08

Abstract

　本発明の間葉系幹細胞誘導剤は、ＢＭＰ－２を含み、血液中の間葉系幹細胞を増加させることを特徴とする。また、本発明の組織再生促進剤は、ＢＭＰ－２を含み、全身性に投与されるものであって、血液中の間葉系幹細胞を増加させることを特徴とする。さらに、本発明の間葉系幹細胞の調製方法は、ＢＭＰ－２を非ヒト動物に投与するステップと間葉系幹細胞を含む血液を採取するステップと採取した血液から間葉系幹細胞を単離するステップとを備えることを特徴とする。

Description

明細書

間葉系幹細胞誘導剤及び組織再生促進剤並びに間葉系幹細胞の調製方法

技術分野

[0001] 本発明は、間葉系幹細胞誘導剤及び組織再生促進剤並びに間葉系幹細胞の調製方法に関する。

背景技術

[0002] 間葉系幹細胞は、自己複製能と間葉系組織への多分化能を有する体性幹細胞である。生体組織では、骨髄並びに真皮 ·骨格筋'脂肪組織等の結合組織に存在し、結合組織の恒常性維持や修復に機能して!/、る。間葉系組織の再生プロセスでは、損傷を受けた部位で、間葉系幹細胞が必要とされる細胞に分化し、増殖することが知られている (非特許文献 1)。し力しながら、体内を循環する末梢血中には、間葉系幹細胞及び間葉系前駆細胞は極僅かにしか検出されない。

[0003] 一方、骨形成因子ー2 (以下、 BMP - 2)は、異所性の骨形成を誘導する因子として発見された。 BMP— 2は、間葉系幹細胞及び間葉系前駆細胞に直接作用して、 S madや p38 MAP kinase等の細胞内シグナル伝達経路の活性化を介して、骨や軟骨への分ィ匕を誘導すると考えられている (非特許文献 2及び 3)。最近では、ヒト BM P— 2遺伝子がクローニングされ、遺伝子糸且換え型ヒト BMP (rhBMP)の大量生産が可能となったため、骨欠損の修復及び再生医療への利用に期待されて!、る。

[0004] 非特許文献 1： Jiang, Y.ら、 Nature, 2002年、 418 :41—49

非特許文献 2 :Fujii, M.ら、 Mol. Biol. Cell, 1999年、 10 : 3801 - 3813 非特許文献 3 :Nakamura, K.ら、 Exp. Cell Res.、 1999年、 250 : 351 - 363 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] し力しながら、骨欠損の修復及び再生医療に BMP— 2を利用するには、直接、罹病患部に BMP— 2を局所投与する力、 in vitroで間葉系幹細胞を分ィ匕させるために、骨髄液力分離した間葉系幹細胞に BMP— 2を直接加える必要がある。 [0006] 前者の場合には、罹病患部には内出血が生じ、周辺組織に腫れや痛みが伴うので、罹病患部への局所投与は被検動物にさらなる痛みを付加することになる。さらに、損傷部位の治癒過程は、炎症期、修復期、リモデリング期の 3段階が少しずつ重なり合いながら進行するので、投与部位や投与のタイミングによっては、治癒過程の進行を遅らせることもある。一方、後者の場合には、間葉系幹細胞を骨髄から採取するため、被検動物への肉体的'時間的'経済的負担が大きぐ得られる間質系幹細胞の量にも限りがある。

[0007] 本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、極わずかにし力検出されない血液中の間葉系幹細胞を増加させる間葉系幹細胞誘導剤を提供することを目的とする。また、罹病患部に局所投与をすることなぐ全身性の投与で損傷部位の再生を導く組織再生促進剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、骨髄液の採取を伴わず、被検動物に対して負担の軽い末梢血から間葉系幹細胞を調製する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明の間葉系幹細胞誘導剤は、 BMP— 2を含み、血液中の間葉系幹細胞を増カロさせることを特徴とする。

[0009] 上記間葉系幹細胞誘導剤を動物に投与すれば、該動物の骨髄から血液中に間葉系幹細胞を動員することができ、血液力も間葉系幹細胞を採取することが可能となる。また、血液力間葉系幹細胞を採取することができると、骨髄から骨髄間質細胞を採取することが不要となり、被験動物の負担が肉低的'時間的'経済的に大きく軽減される。

[0010] 上記間葉系幹細胞誘導剤は、間葉系幹細胞が CD45陰性細胞であることが好ましい。

[0011] 上記間葉系幹細胞誘導剤を動物に投与すれば、該動物の骨髄力血液中に CD4 5陰性の間葉系幹細胞を動員することができ、血液力も CD45陰性の間葉系幹細胞を採取することが可能となる。こうして得られた CD45陰性の間葉系幹細胞は、組織の再生に利用することができ、損傷を受けた組織に局所投与することで in vivoでの組織再生を促進したり、 in vitroの細胞培養で、目的とする細胞や組織への分化を誘導することができる。

[0012] 本発明の組織再生促進剤は、 BMP— 2を含み、全身性に投与されるものであって

、血液中の間葉系幹細胞を増加させることを特徴とする。

[0013] 上記組織再生促進剤を動物に全身性に投与すれば、該動物の骨髄から血液中に間葉系幹細胞を動員することができ、損傷を受けた罹病患部に間葉系幹細胞をリクルートすることができる。

[0014] 上記組織再生促進剤は、組織が骨、脳、肝臓、皮膚又は血管内皮であることが好ましぐ骨であることが特に好ましい。

[0015] 間葉系幹細胞は、 in vitroの細胞培養系で、上記組織に分ィ匕させることが可能であり、上記組織に損傷が生じた場合には、間葉系幹細胞を骨髄から血液中に動員し

、上記組織の再生を促進することができる。

[0016] 例えば、骨折の治療にお!、ては、上記組織再生促進剤を全身性に投与することで

、血液を通じて間葉系幹細胞を骨折部位にリクルートメントすることができ、骨折部位で該間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化することで骨折の治療を促進することができる

[0017] 本発明の間葉系幹細胞の調製方法は、 BMP— 2を非ヒト動物に投与するステップと、間葉系幹細胞を含む血液を採取するステップと、採取した血液から間葉系幹細胞を単離するステップと、を備えることを特徴とする。

[0018] 上記の間葉系幹細胞の調製方法によれば、非ヒト動物の血液から間葉系幹細胞を調製することが可能となる。また、上記調製方法によれば、被検動物への肉体的負担が軽いため、同一個体力も繰り返し間葉系幹細胞を調製することができ、骨髄液から調製するよりも頻回かつ簡便に間葉系幹細胞を得ることができる。

[0019] 上記の間葉系幹細胞の調製方法は、間葉系幹細胞を培養するステップを更に含むことが好ましい。

[0020] 間葉系幹細胞を培養するステップを含むことにより、採取した血液が少量の場合であっても、間葉系幹細胞を必要量まで増やすことができる。

[0021] 上記の間葉系幹細胞を培養するステップでは、間葉系幹細胞を骨髄細胞と共培養することが好ましい。間葉系幹細胞を骨髄細胞と共培養すれば、間葉系幹細胞の分化を抑制することができる。

発明の効果

[0022] 本発明の間葉系幹細胞誘導剤を動物に投与すれば、該動物の骨髄から血液中に間葉系幹細胞を動員することができ、血液力間葉系幹細胞を採取することが可能となる。また、血液力間葉系幹細胞を採取することができると、骨髄から骨髄間質細胞を採取することが不要となり、被験動物の負担が肉体的'時間的'経済的に大きく軽減される。

[0023] 本発明の組織再生促進剤を動物に投与すれば、該動物の骨髄力血液中に間葉系幹細胞をリクルートメントして増やすことができ、損傷を受けた罹病患部に間葉系幹細胞をリクルートすることができる。また、 BMP— 2を全身性に投与することによつて血液力間葉系幹細胞を採取することができると、局所注入用に骨髄から骨髄間質細胞を採取することが不要となり、被験動物の負担が肉体的'時間的'経済的に大きく軽減される。

[0024] 本発明の間葉系幹細胞の調製方法によれば、非ヒト動物の血液から間葉系幹細胞を調製することが可能となる。また、本方法では、各ステップを繰り返すことで、同一個体から繰り返し間葉系幹細胞を調製することができる。

図面の簡単な説明

[0025] [図 1]放射線照射した C57BLZ6マウスの背中に移植された BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットに骨髄由来間葉系幹細胞がリクルートメントされ、異所性の骨形成が誘発されたことを示す写真である。図中のスケールバーは、 50 /z mである。

[図 2]マウスの背中に移植された BMP— 2含有コラーゲン 'ペレット又はその周囲に構築された脈管構造を示す写真である。図 2A中のスケールバーは 50 /ζ πι、図 2Β中のスケールバーは 150 μ mである。

[図 3]GFPトランスジエニックマウスの骨髄由来間葉系幹細胞のフローサイトメーターによる分析結果を示す図と該骨髄由来間葉系幹細胞の分化能を示す写真である。

[図 4]ヌードマウスの背中に移植された BMP— 2含有コラーゲン ·ペレットに骨髄由来間葉系幹細胞がリクルートメントされ、異所性の骨形成が誘発されたことを示す写真である。図中のスケールバーは 50 /z mである。 [図 5]GFPトランスジエニックマウスの背中に移植された BMP— 2含有コラーゲン ·ぺレットにより血液中に動員された骨髄由来間葉系幹細胞をヌードマウスに移植し、さらに該ヌードマウスの背中に BMP— 2含有コラーゲン ·ペレットを移植した結果、ヌードマウスの BMP— 2含有コラーゲン ·ペレットに異所性の骨形成が誘発されたことを示す写真である。図中のスケールバーは 50 mである。

[図 6]BMP— 2含有コラーゲン.ペレットを移植したマウスの抹消血単核細胞のうち、 CD45ネガティブ細胞が異所性の骨形成を誘発することを示す図及び写真である。図中のスケーノレバーは、である。

[図 7]BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植したマウスの抹消血単核細胞中に動員される CD45ネガティブ細胞のフローサイトメーターによる分析結果を示す図である。

[図 8]BMP— 2含有コラーゲン ·ペレットを移植したマウス由来抹消血単核細胞に発現する骨芽細胞特異的マーカー遺伝子の発現を、 BMP— 2刺激の有無で比較した結果を示す写真である (左， RT— PCRによる分析;右，細胞の形態変化)。

[図 9]BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植されたマウスの抹消血単核細胞をフロ一サイトメーターにより分析した結果を示す図である。

[図 10]BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植していないマウスの抹消血単核細胞をフローサイトメーターにより分析した結果を示す図である。

圆 11]脛骨骨折マウスに骨髄細胞を移植した結果、骨髄由来間葉系幹細胞が骨折部位にリクルートメントされ、骨芽細胞の分ィ匕が認められたことを示す写真である。図中のスケーノレバーは、である。

[図 12]脛骨骨折マウスの抹消血単核細胞に誘導された CD45ネガティブ細胞をフロ一サイトメーターにより経時的に分析した図である。

[図 13]脛骨骨折マウス（GFPトランスジエニックマウス）の抹消血単核細胞を、別の脛骨骨折マウス (ヌードマウス）に移植した結果、骨髄由来間葉系幹細胞力ヌードマウスの骨折部位にリクルートメントされ、骨芽細胞の分ィ匕が認められたことを示す写真である。図中のスケーノレバーは、である。

発明を実施するための最良の形態 [0026] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

[0027] (間葉系幹細胞誘導剤）

本発明の間葉系幹細胞誘導剤は、 BMP— 2を含むものであって、血液中の間葉系幹細胞を増加させることを特徴として、る。

[0028] 間葉系幹細胞誘導剤とは、動物に投与することにより、血液中に間葉系幹細胞を動員し、血液中に含まれる間葉系幹細胞の数を増やすものを!ヽぅ。

[0029] 間葉系幹細胞とは、自己複製機能と複数の間葉系細胞に分化する多分化能を有する細胞のことをいう。

[0030] ここで、細胞系譜解析においては、間葉系幹細胞は、間葉系細胞に分化する前段階として、間葉系前駆細胞と区別されるが、本発明の間葉系幹細胞誘導剤は、血液中に間葉系幹細胞の数を増加させるだけでなぐ間葉系前駆細胞の数を増加させる作用を有するものである。現在、間葉系幹細胞を特異的に識別するマーカーが存在せず、再生医療の分野においては、骨髄間葉系細胞、骨髄間質細胞及び間葉系前駆細胞を含めて間葉系幹細胞と呼ばれている。したがって、本発明の「間葉系幹細胞」とは、間葉系細胞に分化する能力を備えた未分化の細胞のことを意味する。尚、本発明の間葉系幹細胞誘導剤が、血液中の間葉系前駆細胞の数を増加させた場合には、その前段階である間葉系幹細胞の数も増加させているため、細胞系譜解析の立場に立っても、間葉系幹細胞誘導剤として機能したと判断しても矛盾がない。

[0031] 「間葉系幹細胞を動員する」とは、間葉系幹細胞が存在している骨髄から、血液中に運び出されることをいう。

[0032] BMP— 2は、前述の通り、異所性の骨形成を誘導する因子として発見されたタンパク質であり、生体においては、間葉系幹細胞及び間葉系前駆細胞に直接作用して、骨芽細胞への分化を誘導し、骨や軟骨の形成を誘導する作用を有して!/、る。

[0033] 間葉系幹細胞誘導剤としての BMP— 2は、タンパク質 (例えば、リコンビナントタンパク質、組織由来の精製タンパク質等)として動物に投与して使用されるが、該タンパク質を動作可動に翻訳できるよう〖こ BMP— 2遺伝子を組み込んだ発現ベクター等であってもよい。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター等が挙げられる力動物に投与して BMP— 2を発現できるものであれば、 BMP— 2の mRNAやその铸型となる DN Aそのものも含まれる。

[0034] BMP— 2の起源となる動物種については、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ィヌ、ゥサギが例示できるが、投与する動物と同じ動物種であることが好ましい。

[0035] 本発明の間葉系幹細胞誘導剤の使用方法としては、被検動物に適した用量を該動物に投与すればよいが、投与経路としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、腹腔内注射、経口投与、皮膚投与、眼投与、鼻腔投与等が挙げられる。好ましい投与路経路は静脈内注射又は筋肉内注射である。注射のための無菌組成物は、注射用蒸留水などの注射用水溶液を用いて通常の製剤実施に従つて処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば D—ソルビトール、 D—マンノース、 D—マン二トール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート 80™、 HCO?50と併用してもよい。また、徐放化するために、適当な担体、例えば多穴性コラーゲン 'ディスクの様な担体に染込ませて移植することもできる。

[0036] また、本発明の間葉系幹細胞誘導剤は、血液中で増加する間葉系幹細胞が CD4 5陰性細胞であることを特徴として、る。

[0037] CD45陰性細胞とは、 CD45抗原を細胞の表面に発現していない細胞であって、非造血系の未分化細胞が該当し、間葉系幹細胞及び間葉系前駆細胞は原則として CD45陰性細胞である。

[0038] CD45抗原は、チロシンホスファターゼであり、白血球共通抗原 (LCA)としても知られている。 CD45は、赤血球、血小板及びそれらの前駆細胞を除いた、総てのヒト造血系由来細胞に存在し、 T細胞及び B細胞活性ィ匕に必須のタンパク質である。

[0039] (組織再生促進剤）

本発明の組織再生促進剤は、 BMP— 2を含み、全身性に投与されるものであって、血液中の間葉系幹細胞を増加させることを特徴として、る。 [0040] 組織再生促進剤とは、動物の組織が損傷を受けた場合に、その修復を誘発したり、既に修復が開始された組織の修復作業を促進して組織の再生を導くものをいう。

[0041] 「全身性に投与される」とは、損傷を受けた患部に局所投与するのではなぐ血管等を通じて投与することによって、体全体に組織再生促進剤を循環させることをいう。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、腹腔内注射、経口投与、皮膚投与、眼投与、鼻腔投与等が挙げられるが、好ましい投与路経路は静脈内注射又は筋肉内注射である。

[0042] 上記の組織再生促進剤が組織の再生を促進する組織は、主に骨、脳、肝臓、皮膚又は血管内皮であるが、骨格筋、軟骨、脂肪、靭帯、腱等の間葉系組織の再生をも促進できる。

[0043] (間葉系幹細胞の調製方法）

次に、本発明の間葉系幹細胞の調製方法について説明する。

[0044] 本発明の間葉系幹細胞の調製方法は、 BMP— 2を非ヒト動物に投与する投与ステップと、間葉系幹細胞を含む血液を採取する採取ステップと、採取した血液から間葉系幹細胞を単離する単離ステップとを備えることを特徴とする。

[0045] 投与ステップでは、 BMP— 2をヒト又は非ヒト動物に投与すればよぐここで「非ヒト動物」とは、例えば、マウス、ラット、サル、ィヌ、ゥサギが例示できる力投与する BM P— 2の起源は投与する動物と同じ動物種であることが好ましい。また、投与の方法としては、上記の通り、被検動物に適した用量を適した投与経路で投与すればよいが、好ま、投与路経路は静脈内注射又は筋肉内注射である。

[0046] 採取ステップでは、上記の投与ステップによって間葉系幹細胞が動員された血液を採取すればよいが、採血の方法は無菌的であれば特に制限されない。例えば、注射器、真空採血管、採血用キヤビラリ一等を用いて、静脈、動脈、目又は心臓等力も採血することができる。

[0047] 採血時期は、 BMP— 2の投与後、血液中での間葉系幹細胞濃度が高められた一定の時期であることが好ましい。この時期は、動物種、投与した BMP— 2濃度及び投与経路に依存して異なる力経時的に採血を行い、フローサイトメーターで末梢血中の CD45陰性細胞数を分析することにより決定することができる。尚、 BMP— 2の投与による CD45陰性細胞数の増加は、間葉系幹細胞の増加を意味する。

[0048] 単離ステップでは、まず、採取した血液から末梢血単核細胞を、フイコール'コンレィ（フイコール.ハイパック）比重遠心法、リンフォクイック法又はナイロンカラム法で単離し、その後、フローサイトメーター又は免疫磁気ビーズ法で CD45陰性細胞を分離することができる。尚、単離ステップでは、用途に応じて、末梢血単核細胞を分離するのみでもよい。

[0049] さらに、上記の間葉系幹細胞の調製方法は、更に間葉系細胞を培養する培養ステップを含めることができる。

[0050] 培養ステップでは、上記の方法により調製した間葉系幹細胞を、当該細胞培養の分野で公知の適する方法で培養することができる力次のような方法で行うことが好ましい。

[0051] まず、分離した間葉系幹細胞を、約 2 X 10⁶個となるように、 10%FBS含有 DMEM 培地を含む基底膜細胞外基質でコートしたプレート（直径 10cm)に播種し、 3日目に非接着細胞を除くために培地を換え、以後 3日に 1回培地を交換して培養する。

[0052] その後、上記の初代培養がコンフルェントになったところで、トリプシン（0. 05%) + EDTA(0. 2mM)で細胞を剥がし、 1 X 10³〜5 X 10³細胞 Zcm²の密度になるように、 bFGF (IngZml)を予め含む上記培地に細胞を播種することを繰り返して継代培養する。

[0053] 上記間葉系幹細胞は、増殖しな!、ように処理した骨髄細胞をフィーダ一として共培養することにより、培養中に分ィ匕することを抑制することが可能である。骨髄細胞を増殖しないように処理する方法としては、ダルタルアルデヒド処理、放射線処理等が挙げられる力ダルタルアルデヒド処理が好まし！/、。

実施例

[0054] 本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[0055] (骨髄移植）

移植用の骨髄細胞は、 C57BLZ6マウスに Green Fluorescence Protein (GF

P)遺伝子が導入された GFPトランスジエニックマウス（8〜： L0週間齢)の骨髄から無菌的に調製した。尚、この GFPトランスジヱニックマウスは、大阪大学微生物病研究所遺伝子機能解析分野の岡部勝教授より分与されたものである。 GFPは、緑色の蛍光性のタンパク質であり、 GFPトランスジエニックマウスの骨髄細胞には、 GFPが恒常的に発現している。したがって、該骨髄細胞を骨髄移植に用いれば、 GFPを指標に移植した骨髄細胞を追跡できる。

[0056] レシピエントマウスには、 8〜10週齢の C57BLZ6マウスを用い、 lOGyの放射線を照射後、 5 X 10⁶個の GFP骨髄細胞を尾静脈から注入することにより骨髄移植を実施した。

[0057] 尚、 CD45ネガティブ ZGFPポジティブの骨髄細胞を移植する際には、 GFPトランスジエニックマウスの骨髄細胞を、 8°Cで 20分間、抗マウス CD45抗体マイクロビーズ (Miltenyi Biotec社製）と反応させ、磁気細胞ソーター（MACS ;Miltenyi Biote c社製)で CD45ポジティブ細胞を分離し、 CD45ネガティブ細胞を精製して用いた。

[0058] (BMP— 2含有コラーゲン.ペレットの作成と移植）

1) BMP— 2含有コラーゲン.ペレットの作成

まず、リコンビナント'ヒト BMP— 2 (rhBMP— 2 ;ァステラス製薬）を、 1 /z gZ /i lになるように、 5mmolZlのグルタミン酸、 2. 5%グリシン、 0. 5%サッカロース及び 0. 0 l%Tween—80を含有する緩衝液に縣濁した。その後、 3 1の rhBMP— 2懸濁液を 22 1のリン酸塩緩衝液 (PBS)で希釈し、多穴性コラーゲン 'ディスク（直径 6mm、厚さ lmm;エティコン社、ジョンソン 'エンド'ジョンソン株式会社）に染み込ませ、凍結乾燥して BMP - 2含有コラーゲン ·ペレットを作成した。

[0059] 対照群に用いるリン酸緩衝液 (PBS)含有コラーゲン 'ペレットは、 rhBMP— 2縣濁液の代わりに PBSを用いて、同様に作成した。

[0060] 総ての手順は無菌的に行い、作成したコラーゲン ·ペレットは、使用するまで 20 °Cに保存した。

[0061] 2)コラーゲン 'ペレットの移植

BMP— 2含有コラーゲン 'ペレット又は対照群に用いる PBS含有コラーゲン 'ペレツトは、上記の骨髄移植マウス、 C57BLZ6マウス又はヌードマウス等の背中の筋膜下に移植した。異所性の骨の蛍光写真は、移植 3週間後に、デジタル顕微鏡 (マルチビユー了一'システム VB— S20；キーエンス社)で撮影した。

[0062] (脛骨骨折モデルマウス）

脛骨骨折モデルマウスは、以下のようにして作成した。まず、膝前面の皮膚に縦切開を入れ、脛骨近位 (脛骨粗面近位)カゝら 30Gの注射針を髄内に刺入し脛骨遠位部まで挿入した。その後、 3点ベンディング法で閉鎖的に脛骨骨幹部に骨折を作製し、創痍を縫合した。こうして作成した脛骨骨折モデルマウスは、一定期間の飼育を行つた後、実験に用いた（Hiltunen A.、 Vuorio E.、 Aro H. T.、 A standardize dexperimental fracture in the mouse tibia.、 J. Orthop. Res.、 1993年、 11(2):305— 12)。

[0063] (脈管構造の観察）

血管を染色するために、マウスに BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植した日から 3週間目に、 FITCアルブミン (シグマ社)を尾静脈カゝら注入した。その後、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを摘出し、ティッシュテック OCTコンパウンドに包埋し、クラィォスタツト（Leica Microsystems社）で厚さ 6 μ mに薄切し、顕微鏡で観察した。

[0064] (免疫組織化学）

異所性に形成された骨又は骨折部位の骨は外科的に摘出し、 4°Cで 48時間、 4% パラホルムアルデヒドで固定した後、 4°Cで 6日間、 EDTA溶液で脱灰した。 EDTA 溶液は、 1日おきに新しい液に取り変えた。脱灰した骨は、 12時間 15%のサッカロースを含む PBSに浸漬し、引き続き 12時間 30%のサッカロースを含む PBSに浸漬した。その後、骨は適当な大きさにカットし、ティッシュテック OCTコンパウンド (サクラファインテックジャパン社）に包埋し、ドライアイス上で急速凍結した。

[0065] 免疫蛍光染色を行うための凍結切片は、クライオスタツト（Leica Microsystems 社)で厚さ 6 mに薄切した。スライドガラス上の切片は、洗浄後、健常ャギ血清に 1 時間浸すことにより非特異的吸着をブロックし、抗マウス'ォステオカルシン'ポリクローナル抗体 (タカラノィォ社)と反応させた。その後、切片は Alexa Fluor546でラベルした抗ゥサギ IgG抗体（Molecular Probes社）と 2時間反応させ、洗浄後、 4, 6—ジアミノー 2—フエ-ルインドール (DAPI)と室温で 10分間反応させ、顕微鏡で観祭した。 [0066] 組織中の GFPを検出するためには、スライドガラス上の切片を抗 GFPポリクローナル抗体（MBL社）で反応させ、洗浄後、ジァミノべンジジン（diaminobenzidine;DA B)で検出した。対比染色は、へマトキシリンとェォジン (以下、 HE染色)で行った。

[0067] BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットの周辺組織と内皮前駆細胞の免疫染色は、スライドガラス上の切片を、健常ャギ血清に 1時間浸すことにより非特異的吸着をブロックし、引き続き抗マウス CD31モノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen 社）と反応させた。その後、切片は、 Alexa Fluor 546でラベルした抗ラット IgG抗体 (Molecular Probes社）と 2時間反応させ、洗浄後、 DAPIで染色し、顕微鏡で観した。

[0068] (in vitro分化）

BMP— 2で誘導された末梢血単核細胞中の CD45ネガティブ細胞は、骨髄細胞（フィーダ一として使用）を 2%のダルタルアルデヒドで固定したシャーレを用い、 10% FCS、 100U/mlストレプトマィシン/ぺ-シリン及び300ng/mlのBMP— 2を含む DMEM培地で、 3週間培養した。これにより、細胞の分化が観察された。

[0069] (全 RNAの抽出と RT— PCR)

全 RNAは、 RNeasyキット（Qiagen社）を用い、製造元のプロトコルに従って調製した。逆転写反応は、スーパースクリプト逆転写酵素 (Invitrogen社)を用いて行い、 P CRによる増幅は、以下のプライマーセットを使って行った。 CBFA1 : 5， -CCGCA CGACAACCGCACCAT- 3 ' (フォワード）及び 5， - CGCTCCGGCCCAC AA ATCTC— 3，（リバース）、ォステオポンチン： 5， - TC ACC ATTCGG ATG AGTC TG— 3，（フォワード）と 5， - ACTTGTGGCTCTGATGTTCC - 3 ' (リバース）、 A LP : 5， - CGCCAGAGTACGCTCCCGCC - 3 ' (フォワード）と 5，一 TGTACCC TGAGATTCGT— 3，（リバース）とォステオ力ノレシン： 5， - TCTGCTC ACTCTG CTGAC— 3，（フォワード）と 5，一 GGAGCTGCTGTGACATCC— 3，（リバース）

[0070] (フローサイトメトメ一ターによる分析）

分離した末梢血単核細胞と間葉系幹細胞は、フルォレセイン'イソチォシアン酸塩 ( FITC)と結合した抗マウス CD45抗体、フィコエリトリン（PE)と結合した抗マウス CD1 lb、 CD31、 CD34、 CD44、 Flk— 1、 Sea— 1抗体（BD Biosciences Pharmin gen社）、ピオチンと結合した抗マウス Gr— 1、 CXCR4、精製した抗マウス CD 140a 抗体（PDFGRa、： BD Biosciences Pharmingen社）、精製した抗ヒト BMPR— Π 抗体 (R&D Systems社）を含んでいる 100 μ 1の PBSに縣濁し、 30分間、 4°Cの喑所でインキュベートした。

[0071] その後、細胞は、 4°Cの喑所で 30分間、ストレプトアビジン PE、ストレプトアビジン P erCP (BD Biosciences Pharmingen社）、抗ラット IgG抗体又は抗ャギ IgG抗体 (Molecular Probes社）と反応させた。フローサイトメーターによる分析は、 FACSc an (Becton Dickinson社）で、 CellQuestソフトウェアを用いて行った。

[0072] (実施例 1) BMP— 2による骨髄由来間葉系前駆細胞のリクルートメントと異所性の骨の形成：

lOGyの放射線を照射した C57BLZ6マウス（8〜10週齢、雌）に、 GFPトランスジエニックマウス（C57BLZ6、 8〜10週間齢、雄)から無菌的に採取した骨髄細胞を尾静脈から注入し、その後、このマウスの背中に BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植した。

[0073] その結果、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットの移植 3週間目には、移植した BMP —2含有コラーゲン 'ペレット（図 1A)に GFPの蛍光を認め（図 1B)、そこに異所性の骨の形成を確認した（図 1C、図 1D)。図 1Cは、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットの X線写真を示し、図 1Dは、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットの組織切片を HE染色した像である。

[0074] さらに、ォステオカルシンと GFPの免疫蛍光染色により、新しい骨に沿って存在する裏打ち細胞が骨芽細胞であり（図 1E)、この骨芽細胞は GFPを同時に発現していることが判明した（図 1F)。尚、図 1Gは、 DAPIで染色した核を示し、図 1Hは、ォステォカルシン、 GFP及び DAPIで三重染色した像を示す。

[0075] これらの結果より、多数の骨髄由来間葉系前駆細胞が異所性に形成された骨及びその周辺部にリクルートメントされることが判明し、このリクルートメントには、形成された骨及びその周囲に十分な脈管構造ネットワークが形成される必要のあることが示唆された。 [0076] (実施例 2)異所性の骨及びその周囲に形成された脈管構造とその役割：異所性の骨及びその周辺部に形成された脈管構造を可視化するために、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植したマウスに、 FITCでラベルしたアルブミンを静脈注射し、血管の内腔を染色した。

[0077] 図 2Aの左の写真は、異所性の骨の HE染色像を示し、右の写真は FITC染色像を示す。また、図 2Bは、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植した場合と PBS含有コラーゲン 'ペレットを移植した場合における、移植 3日目の各コラーゲン 'ペレットの HE染色像、並びに CD31と DAPIの免疫蛍光染色及びこれらの二重染色を示す。

[0078] その結果、異所性の骨とその周囲には脈管構造を示す有意な蛍光が認められ、機能的な脈管ネットワークが構築されることが示唆された (図 2A)。このことは、脈管内皮細胞のマーカーである CD31の発現が異所性の骨及びその周囲で認められ、コントロールの PBS含有コラーゲン.ペレットでは認められなかったことからも支持される（図 2B)。

[0079] 次に、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレット及びその周囲に誘導された脈管構造が、間葉系幹細胞をリクルートメントするためのルートとして機能するか否かを確認した。

[0080] まず、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植したヌードマウスに、 GFPトランスジエニックマウスの骨髄細胞力分離した CD45ネガティブ ZGFPポジティブの骨髄細胞（以下、 GFP間葉系幹細胞）を 2週間毎日尾静脈力も注入し、その後の BMP— 2 含有コラーゲン ·ペレットを組織学的に解析した。

[0081] 尚、静脈注射した GFP間葉系幹細胞は、表面マーカーのフローサイトメーターによる分析の結果と、ァリザリンレッド染色及びオイルレッド O染色の結果より、 Sea— 1、 C D34及び CD44を強く発現し（図 3A)、骨芽細胞と脂肪細胞に分ィ匕する能力を備えて、ることを確認して、る（図 3B)。

[0082] この結果、 GFP間葉系幹細胞は、ヌードマウスの BMP— 2含有コラーゲン.ペレットに形成された異所性の骨に沿って線形的に配置することが判明した（図 4A—E)。尚、図 5Aは、該 BMP— 2含有コラーゲン.ペレットの組織切片の HE染色像、図 5B〜E は、それぞれ該組織切片のォステオカルシン、 GFP及び DAPI〖こよる染色像、並びにこれらの三重染色像を示す。 [0083] 以上の結果を合わせると、 BMP— 2により誘発される異所性の骨形成には、新しく形成された脈管構造による機能的脈管ネットワークと骨髄由来間葉系前駆細胞のリクルートメントが大きく寄与していることが示唆された。

[0084] (実施例 3) BMP— 2刺激による骨髄力血液中への骨髄由来間葉系細胞の動員：

BMP— 2による刺激が、骨髄力抹消血中への骨髄由来間葉系細胞の動員を誘導する力否かについて調べた。

[0085] まず、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植した GFPトランスジエニックマウスから末梢血単核細胞を 7日間毎日分離し、その日ごと、 1 X 10⁶個の該末梢血単核細胞を、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植したヌードマウスの尾静脈から注入した。該末梢血単核細胞を最後に注入した日から 2週間経過した後、移植した BMP— 2 含有コラーゲン 'ペレットを回収して糸且織学的に調べた。

[0086] 図 5Aは、上記の末梢血単核細胞を 7日間毎日移植したヌードマウスの BMP— 2含有コラーゲン.ペレットの組織切片の HE染像、図 5B〜Eは、それぞれ該組織切片のォステオカルシン、 GFP及び DAPIにより染色像、並びにこれらの三重染色像を示す。

[0087] その結果、注入した末梢血単核細胞由来の GFPポジティブ骨芽細胞は、異所性の骨に沿って線形的に配置することが判明し（図 5)、筋肉組織における BMP— 2刺激が骨髄由来間葉系細胞を末梢血中に動員する弓 Iき金になって、ることが示唆された

[0088] (実施例 4) BMP— 2により誘発される異所性の骨形成における CD45ネガティブ細胞の寄与：

骨芽細胞が非造血系血統の間葉系幹細胞を起源とするため、骨髄中の CD45ネガティブ間葉系幹細胞が BMP— 2により誘発される異所性の骨形成に寄与する力否かについて調べた。

[0089] まず、 lOGyの放射線を照射したマウスに、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植し、 2種類の骨髄細胞プール (CD45ネガティブ ZGFPネガティブ細胞及び CD45 ポジティブ ZGFPポジティブ細胞）を混ぜて移植した。末梢血単核細胞のフローサイトメ一ターによる分析の結果、骨髄細胞の移植が成功したことを示され、 GFPトランスジェニックマウス由来の骨髄細胞を移植した対照群と比較して、 CD45ネガティブ Z GFPネガティブ細胞の増加（4. 0に対して 8. 6%)と CD45ネガティブ ZGFPポジテイブ細胞の顕著な減少（2. 2%に対して 0. 7%)が認められた（図 6)。

[0090] そこで、これらの骨髄移植マウスの BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットにおける異所性の骨形成に及ぼす CD45ネガティブ細胞の影響について調べた。その結果、 CD 45ネガティブ ZGFPポジティブ細胞の割合が減少したマウスにおいても異所性の骨は形成された力 GFPトランスジエニックマウスの骨髄細胞をそのまま移植したマウスと比べて、 GFPポジティブ骨芽細胞の数が顕著に減少していた（図 6Cと図 6Gの点線で囲まれた部分の比較)。

[0091] 尚、異所性の骨の X線写真（図 6D、図 6H)及び HE染色像（図 6E、図 61)は、いずれの骨髄細胞を移植したマウスにぉ、ても異所性の骨が形成されて、ることを示す。図 6F及び図 6Jは、ォステオカルシン、 GFP及び DAPIの三重染色像を示す力 CD 45ネガティブ ZGFPネガティブ細胞と CD45ポジティブ ZGFPポジティブ細胞を混ぜて移植したマウスに形成された骨（図 6F)は、対照群である GFP骨髄細胞をそのまま移植したマウスに形成された骨（図 6J)よりも、 GFPポジティブ細胞の数が顕著に少ないことを示された。

[0092] このことは、 CD45ポジティブ骨髄細胞ではなく CD45ネガティブ骨髄細胞力 BM P— 2による異所性の骨を形成する骨芽細胞の主要な起源であることを示唆している。すなわち、これらのデータは、 BMP— 2に依存して骨髄力血液中へ動員される間葉系前駆細胞が、 CD45ネガティブ細胞であることを強く示唆して、る。

[0093] また、末梢血単核細胞の中の CD45ネガティブ細胞の増加は、 BMP— 2含有コラ一ゲン'ペレット移植後の最初の 7日以内に起こった力この増加は、急激であるが時間的に制限されるものであった（図 7A)。図 7Aには、フローサイトメーターで経時的に分析された異なる 5つの個体のデータを示す力 CD45ネガティブ細胞の占有率は、ピーク時において 60〜80%であった。

[0094] さらに、 CD45ネガティブ細胞の割合が顕著に高められた末梢血単核細胞（図 7A の実験 1の 3日目）をフローサイトメーターで分析した結果、 BMPR— IIネガティブ細胞及び Sea— 1ネガティブ細胞の割合が高められた（図 7B)。これらの結果より、末梢の筋肉組織での BMP— 2刺激が骨髄力血液中への CD45ネガティブ細胞の動員を誘発することが示唆された。

[0095] CD45ネガティブ細胞において BMPR— IIの発現が減少したことは、 CD45ネガテイブ細胞を末梢の筋肉組織にリクルートメントする際に、 BMP— 2以外の他の因子が関与している可能性を示唆している。また、 Sea— 1は、間葉系幹細胞を含むさまざまな幹細胞のマーカーであるため（図 3A)、 Sea- 1の発現が減少した CD45ネガティブ細胞は、骨髄に存在する無刺激の間葉系幹細胞と比較して異なる性質を有して、る可能性を示唆している。

[0096] (実施例 5) BMP— 2刺激で血液中に動員される CD45ネガティブ細胞の特徴についての検討：

BMP— 2刺激で血液中に動員される CD45ネガティブ細胞の特徴にっ、て検討するため、磁気細胞ソーター（MACS)で CD45ネガティブ細胞を濃縮し、マウス骨髄細胞をダルタルアルデヒドで固定したフィーダ一細胞上で培養し、骨芽細胞特異的マーカー遺伝子の発現を RT—PCRで調べた（図 8左)。その際、 BMP— 2刺激による該 CD45ネガティブ細胞の形態的変化にっヽても調べた（図 8右)。

[0097] 図 8の左側は、 RT— PCRの結果を示す電気泳動写真であって、レーン 1は培養をする前の細胞、レーン 2は培養後無処理の細胞、レーン 3は培養後 BMP— 2 (300η gZml)で刺激した細胞を示している。また、図 8の右側は、培養後、 BMP— 2 (300 ng/ml)の刺激の有無における、 CD45ネガティブ細胞の形態的変化を比較した写真である。

[0098] この結果、 CD45ネガティブ細胞は、 in vitroでの培養を開始する前において、転写調節因子である Cbf a 1を発現し、 BMP— 2刺激の有無にかかわらず、ォステオポンチンを発現していることが判明した（図 8)。また、培養した CD45ネガティブ細胞を BMP - 2 (300ng/ml)で処理すると、アルカリホスファターゼゃォステオカルシンのような骨芽細胞特異的マーカー遺伝子の発現が効率的に誘導され、細胞の形態変ィ匕が引き起こされることが判明した（図 8)。これらのデータは、骨髄から血液中に動員された CD45ネガティブ細胞が、末梢組織で骨芽細胞を提供する能力を有することを示している。 [0099] さらに、 BMP— 2含有コラーゲン 'ペレットを移植したマウスの末梢血単核細胞について、野生型マウスの末梢血単核細胞を対照群として、発現している細胞表面マーカーをフローサイトメーターで分析した結果、 CD45ネガティブ細胞には間葉系細胞マーカーである CD44の有意な発現が認められた（図 9、図 10)。

[0100] しかしながら、 CD45、 CD1 lb及び Gr—1のような造血系血統マーカー並びに CD 34、 Flk— 1及び CD31のような内皮細胞血統マーカーは、いずれも検出されなかつた（図 9)。

[0101] 興味深いことに、循環する骨髄由来間葉系幹細胞は、ケモカインである間質細胞由来因子（SDF—1)のレセプター、 CXCR4を顕著に発現していた（図 9)。 SDF—1 ケモカインは、骨髄で CXCR4ポジティブ幹細胞に作用し、 SDF— 1を発現する末梢組織に CXCR4ポジティブ幹細胞をリクルートメントすることが知られている。 SDF- 1 の発現は、 BMP— 2を注入した局所の周辺糸且織で上昇することが明らかになつたので (データ非表示）、血液中を循環している骨髄由来間葉系幹細胞を BMP— 2含有コラーゲン.ペレットにリクルートメントするために、 SDF— 1が寄与している可能性が示唆された。

[0102] (実施例 6)脛骨骨折マウスの骨折治癒における骨髄由来間葉系幹細胞の役割：脛骨骨折マウス (ヌードマウス）に、 14日間、 GFP間葉系幹細胞を尾静脈から注入した結果、 GFP間葉系幹細胞が骨折した損傷部位にリクルートされ、骨の再生が促進されることが確認された（図 11)。

[0103] 図 4の上段は、 GFP間葉系幹細胞を注射したヌードマウスの骨折部位の組織切片を、下段は対照群として PBSを注射したヌードマウスの骨折部位の組織切片を示す。それぞれ、左から GFP、 DAPI及びこれらの二重染色の免疫蛍光染色像、並びに GFPを DABで発色させた免疫化学染色像を示す。

[0104] 次に、脛骨骨折マウスの末梢血中への CD45ネガティブ細胞の動員について、フロ一サイトメーターで経時的に分析した。その結果、末梢血中の CD45ネガティブ細胞の数は一時的ではあるが顕著に上昇することが再現性よく確認された（図 12A)。また、末梢血中の CD45ネガティブ細胞数の増加は、 CXCR4ポジティブ細胞の増加と相関していた（図 12B)。このことは、骨折による誘発される細胞の性質と BMP— 2刺激で誘発された骨髄由来間葉系幹細胞の性質が顕著に類似することを示唆している

[0105] そこで、脛骨の骨折で誘発された CD45ネガティブ細胞が骨髄由来間葉系幹細胞の特徴的機能を有するかどうかを調べるために、脛骨を骨折させた GFPトランスジェニックマウスの末梢血単核細胞（以下、 GFP末梢血単核細胞）を、 14日間毎日、脛骨を骨折させたヌードマウスに尾静脈力注入した。

[0106] 図 13の上段は、上記の GFP末梢血単核細胞を 14日間毎日注入された上記ヌードマウスの骨折部位の組織切片を、下段は対照群としての PBSを注射したヌードマウスの骨折部位の組織切片を示す。それぞれ、左力 GFP、 DAPI及びこれらの二重染色の免疫蛍光染色像、並びに GFPを DABで発色させた免疫化学染色像を示す。

[0107] その結果、上記の GFP末梢血単核細胞を移植されたヌードマウスの骨折部位には、 GFPポジティブ骨芽細胞が顕著に蓄積されていることが示された（図 13)。一方、対照群として PBSを移植したヌードマウスの骨折部位には、 GFPポジティブ骨芽細胞は検出されなカゝつた。すなわち、骨折で誘発された末梢血単核細胞中の CD45ネガティブ細胞は、骨髄由来間葉系前駆細胞の特徴を持ち、骨折部位にリクルートされて骨芽細胞に分化することが示された。

産業上の利用可能性

[0108] 本発明の間葉系幹細胞誘導剤を動物に投与すれば、該動物の骨髄から血液中に間葉系幹細胞を動員することができ、血液力間葉系幹細胞を採取することが可能となる。また、血液力間葉系幹細胞を採取することができると、骨髄から骨髄間質細胞を採取することが不要となり、被験動物の負担が肉体的'時間的'経済的に大きく軽減される。

Claims

請求の範囲

[1] 骨形成因子 2を含む間葉系幹細胞誘導剤であって、血液中の間葉系幹細胞を増加させることを特徴とする間葉系幹細胞誘導剤。

[2] 前記間葉系幹細胞は、 CD45陰性細胞である、請求項 1に記載の間葉系幹細胞誘導剤。

[3] 骨形成因子— 2を含む全身性に投与される組織再生促進剤であって、血液中の間葉系幹細胞を増加させることを特徴とする組織再生促進剤。

[4] 前記組織は、骨、脳、肝臓、皮膚又は血管内皮である、請求項 3に記載の組織再生促進剤。

[5] 前記組織は、骨である、請求項 3に記載の組織再生促進剤。

[6] 骨形成因子— 2を非ヒト動物に投与するステップと、

間葉系幹細胞を含む血液を採取するステップと、

採取した血液力間葉系幹細胞を単離するステップと、

を備える、間葉系幹細胞の調製方法。

[7] 更に、間葉系幹細胞を培養するステップを含む、請求項 6に記載の間葉系幹細胞の調製方法。

[8] 前記間葉系幹細胞を培養するステップは、間葉系幹細胞を骨髄細胞と共培養するステップである、請求項 7に記載の間葉系幹細胞の調製方法。