WO2006121219A1

WO2006121219A1 - 上皮−間葉転換制御剤

Info

Publication number: WO2006121219A1
Application number: PCT/JP2006/309989
Authority: WO
Inventors: Toshio Hirano; Susumu Yamashita; Naofumi Kagara
Original assignee: Osaka University; Inter Cyto Nano Science Co., Ltd.
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-12
Publication date: 2006-11-16

Abstract

本発明は、上皮−間葉転換制御剤、Ｓｎａｉｌ活性制御剤、癌転移予防、創傷治癒及び器官形成促進等に有用な薬剤、並びに上皮−間葉転換制御及び／又はＳｎａｉｌ活性制御作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。具体的には、細胞内亜鉛量を制御し得る物質、具体的には亜鉛イオン、亜鉛キレーター、亜鉛トランスポーターの発現及び／又は機能を調節する物質等を有効成分として含有する上皮−間葉転換制御剤、Ｓｎａｉｌ活性制御剤、癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬、並びに細胞内亜鉛量を測定することを含む上皮−間葉転換制御及び／又はＳｎａｉｌ活性制御作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。

Description

明細書

上皮一間葉転換制御剤技術分野

本発明は S n a i 1活性及び/又は上皮一間葉転換を制御し得る薬剤に関する。特に、癌転移、創傷治癒、器官再生における上皮一間葉転換を制御することによつて、癌転移予防、創傷治癒及び器官形成促進が可能な薬剤に関する。背景技術

普段は隣り合つたどうし密着しその場を動かない細胞が、癌転移や創傷治癒 - 個体発生過程等の場合に限り動き出す現象：上皮一間葉転換（E p i t h e 1 i a l— me s e n c h yma l t r a n s i t i o n : EMT) におレヽて、ジンク（Z n) フィンガー型転写因子 S n a i 1は細胞間接着分子等の上皮系遺伝子の発現を制御するとともに、間葉系遺伝子の発現を誘導する。実際、浸潤能の高い癌細胞では S n a i 1の発現が増加しておりこれと相関してカドヘリン等の細胞間接着分子の発現は低下していることが数多く報告されている（Poser I， D orainguez D, de Herreros AG, Varna i A, Buettner R， Bosserhoff AK. Loss of E-cadherin expression in melanoma cells involves up - regulation of the t ranscriptional repressor Snail. J Biol Chem. 276 (27)： 24661-6 (2001)； Bla nco MJ, Moreno-Bueno G, Sarrio D, Locascio A, Cano A, Palacios J, Nieto MA. Correlation of Snail expression with histological grade and lymph no de status in breast carcinomas. Oncogene. 21 (20) :3241 - 6 (2002); Rosivatz E， Becker I, Specht K, Fricke E, Luber B, Busch R, Hofler H, Becker KF. Differential expression of the epithelial - mesenchymal transition regula tors snail, SIP1, and twist in gastric cancer. Am J Pathol. 161 (5) :1881 - 91 (2002)； Sugimachi K, Tanaka S, Karaeyama T, Taguchi K， Aishima S， Shim ada M, Sugimacni K, Tsuneyoshi M. Transcriptional repressor snail and pr ogression of human hepatocellular carcinoma. し丄 in Cancer Res. 9 (7) :2657一 64 (2003)参照）。今日 S n a i 1が EMTにおけるマスターレギユレータ—であることは確立された事実であるが、ある種の細胞においては S n a i 1が発現しているにも関わらず力ドヘリンの発現が持続していたり、本来核で機能すべき転写因子 S n a i 1が細胞質内に局在していたり等、 S n a i 1の局在と活性に対する制御機構は解明されていない。本発明者らは先に、亜鉛トランスポーター L

I V 1が EMTのマスターレギュレーターである Z nフィンガー型転写因子 S n a i 1の核への局在を誘導しこれを活性化して、細胞間接着分子の発現を抑えることで細胞に可動性を与えることを明らかにした（Yamashita, .S. , iyagi, C.， Fukada, T. , Kagara, Ν.， Che, Υ.一 S. & Hirano, T. Zinc transporter LIVI co ntrols epithelial - mesenchymal transition in zebrafish gastrula organizer.

Nature 429 (6989) :298- 302 (2004))。これは亜鉛トランスポーターによる亜鉛要求性因子の活性調節を解明した最初の報告であるが、その分子機構、特に S n a i 1の細胞内局在や活性を調節し EMTを制御し得る因子については未だ明らかにされていない。発明の開示

本発明は、癌、創傷治癒、器官再生における EMTの制御機構を解明することを目的とし、具体的には EMT制御剤並びに EMTのマスターレギュレーターである S n a i 1の活性制御剤の提供を目的とする。さらに、本発明は当該 EMT 制御剤及ぴノ又は S n a i 1活性制御剤の癌転移予防、創傷治癒及び器官形成促進への適用を目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、細胞内亜鉛量を制御することにより、 EMTのマスターレギュレーターである S n a i 1の細胞内局在と活性を調節できること、すなわち細胞内亜鉛量を制御することにより癌転移や創傷治癒 ·器官形成等におけ，る EMTが制御可能であることを見出して本発 ¾ を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。〔1〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質を有効成分として含有する、上皮一間葉転換制御剤；

〔2〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質が亜鉛イオンである、上記〔1〕記載の剤；〔3〕亜鉛イオンが亜鉛ィオノフォアによって細胞内に導入される、上記〔2〕記載の剤；

〔4〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質が亜鉛キレーターである、上記〔1〕記載の剤；

〔5〕亜鉛キレーターが 2， 3—ジメルカプト一 1—プロパンスルホン酸（DM

P S)、 N， N, N，， N，一テトラキス（2—ピリジルメチル）エチレンジアミン（TPEN)、エチレンジァミン（EDTA) 及び N— (6—メトキシ一 8—キノリル）一p— トルエンスルホンアミド（TSQ) からなる群より選択される少なくとも 1種である、上記〔4〕記載の剤；

〔6〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質が、亜鉛トランスポーターの発現及ぴ Z又は機能を制御する物質である、上記〔1〕記載の剤；

〔7〕亜鉛トランスポーターが L I Vフアミリーを含むヒト Z I P類、ヒト CD

F類からなる群より選択される少なくとも 1種である、上記〔6〕記載の剤；〔8〕亜鉛トランスポーターが L I V Iである、上記〔6〕記載の剤；

〔9〕亜鉛トランスポーターが Z I P 10である、上記〔6〕記載の剤；〔10〕 S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質を含む上皮一間葉転換制御剤；

〔1 1〕 S n a i 1活性制御剤である、上記〔1〕〜〔10〕に記載の剤；〔12〕癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬からなる群より選ばれる少なくとも 1種の医薬である、上記〔1〕〜〔10〕に記載の剤；

〔1 3〕癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬からなる群より選ばれる少なくとも 1種の医薬である、上記〔1 1〕に記載の剤；

〔14〕細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z_ nフィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質を有効成分として含有する、癌転移予防薬；

〔15] 細胞内亜鉛量を低下させ得る物質が亜鉛キレーターである、上記〔14〕記載の癌転移予防薬；

〔16〕亜鉛キレーターが 2， 3—ジメルカプト一 1—プロパンスルホン酸（D MP S)、 N, N， N，， N，ーテトラキス（2—ピリジルメチル）エチレンジァミン（TPEN)、エチレンジァミン（EDTA) 及び N— (6—メトキシ一 8— キノリル）一p—トルエンスルホンアミド（TSQ) からなる群より選択される少なくとも 1種である、上記〔15〕記載の癌転移予防薬；

〔17〕細胞内亜鉛量を低下させ得る物質が、亜鉛トランスポーターの発現及び /又は機能を制御する物質である、上記〔14〕記載の癌転移予防薬；

〔18] 亜鉛トランスポーターが L I Vフアミリーを含むヒト Z I P類、ヒト C DF類からなる群より選択される少なくとも 1種である、上記〔17〕記載の癌転移予防薬；

〔19〕亜鉛トランスポーターが L I VIである、上記〔17〕記載の癌転移予防薬；

〔20〕亜鉛トランスポーターが Z I P 10である、上記〔1 7〕記載の癌転移予防薬；

〔21〕細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を促進し得る物質を有効成分として含有する、創傷治癒薬及び/又は器官形成促進薬；

〔22〕細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質が亜鉛イオンである、上記〔21〕記載の創傷治癒薬及ぴ又は器官形成促進薬；

〔23〕亜鉛イオンが亜鉛ィオノフォアによって細胞内に導入される、上記〔2 2〕記載の創傷治癒薬及び Z又は器官形成促進薬；

〔24〕細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質が、亜鉛トランスポーターの発現及ぴ /又は機能を制御する物質であ、上記〔21〕記載の創傷治癒薬及び又は器. 官形成促進薬；〔25〕亜鉛トランスポーターが L I Vフアミリーを含むヒト Z I P類、ヒト C DF類からなる群より選択される少なくとも 1種である、上記〔24〕記載の創傷治癒薬及び/又は器官形成促進薬；

〔26〕亜鉛トランスポーターが L I V Iである、上記〔24〕記載の創傷治癒薬及び/又は器官形成促進薬；

〔27〕亜鉛トランスポーターが Z I P 1 0である、上記〔24〕記載の創傷治癒薬及び又は器官形成促進薬；

〔28〕インビトロで、細胞内亜鉛量を制御することを含む、上皮一間葉転換を制御する方法；

〔29〕細胞内亜鉛量の制御が亜鉛イオンによって行われるものである、上記〔2 8〕記載の方法；

〔30〕亜鉛イオンが亜鉛ィオノフォアによって細胞内に導入される、上記〔2 9〕記載の方法；

〔3 1〕細胞内亜鉛量の制御が亜鉛キレーターによって行われるものである、上記〔 28〕記載の方法；

〔32〕亜鉛キレーターが 2， 3—ジメルカプト一 1一プロパンスルホン酸（D MP S)、 N， N， N，， N，一テトラキス（2—ピリジルメチル）エチレンジァミン（TPEN)、エチレンジァミン（EDTA) 及び N— (6—メトキシ一 8— キノリル）一 p—トルエンスルホンアミド（TSQ) からなる群より選択される少なくとも 1種である、上記〔3 1〕記載の方法；

〔33〕細胞内亜鉛量の制御が亜鉛トランスポーターの発現及び/又は機能を制御することによって行われるものである、上記〔28〕記載の方法；

〔34〕亜鉛トランスポーターが L I V 1である、上記〔33〕記載の方法；〔35〕亜鉛トランスポーターが Z I P 1 0である、上記〔33〕記載の方法；〔36〕 S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御することを含む、上皮ー葉転換を制御する方法； . 〔3 7〕インビトロで、細胞内亜鉛量を制御することを含む、 S n a i 1活性を制御する方法；

〔38〕細胞内亜鉛量の制御が亜鉛イオンによって行われるものである、上記〔3 7〕記載の方法；

〔39〕亜鉛イオンが亜鉛ィオノフォアによって細胞内に導入される、上記〔3 8〕記載の方法；

〔40〕細胞内亜鉛量の制御が亜鉛キレーターによって行われるものである、上記〔37〕記載の方法；

〔41〕亜鉛キレーターが 2， 3—ジメルカプト一 1一プロパンスルホン酸（D MP S)、 N， N, N，， N，一テトラキス（2—ピリジルメチル）エチレンジァミン（TPEN)、エチレンジァミン（EDTA) 及び N— (6—メトキシ一 8— キノリル）一p—トルエンスルホンアミド（TSQ) からなる群より選択される少なくとも 1種である、上記〔40〕記載の方法；

〔42〕細胞内亜鉛量の制御が亜鉛トランスポーターの発現及ぴ Xは機能を制御することによって行われるものである、上記〔3 7〕記載の方法；

〔43〕亜鉛トランスポーターが L I V 1である、上記〔42〕記載の方法；

〔44〕亜鉛トランスポーターが Z I P 1 0である、上記〔42〕記載の方法；〔45〕 S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御することを含む、 S n a i l活性を制御する方法；

〔46〕細胞内亜鉛量を測定することを含む、上皮一間葉転換制御作用を有する化合物及ぴ又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物のスクリーニング方法；

〔47〕以下の工程を含む、上皮一間葉転換制御作用を有する化合物及び又は Sn a i 1活性制御作用を有する化合物のスクリーニング方法：

(1) 試験化合物の存在下又は非存在下で S n a i 1分子内に存在する第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛とを接触させる工程、

(2) Z nフィンガードメインと亜鉛との結合の程度を測定する工程、及ぴ .

(3) Z nフィンガードメインと亜鉛との結合に有意に影響を与える物質を、上皮一間葉転換制御作用を有する化合物及び又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物と認定する工程；

〔4 8〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における上皮一間葉転換の制御方法；

〔4 9〕 S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における上皮一間葉転換の制御方法；

〔5 0〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における S n a i l活性の制御方法；

〔5 1〕細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における癌転移の予防方法；

〔5 2〕細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を促進し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における創傷治癒及ぴ又は器官形成促進方法；

〔5 3〕上皮一間葉転換制御剤の製造における細胞内亜鉛量を制御し得る物質の使用；

〔5 4〕上皮—間葉転換制御剤の製造における S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質の使用；

[ 5 5 ] S n a i 1活性制御剤の製造における細胞内亜鉛量を制御し得る物質の使用；

[ 5 6〕癌転移予防薬の製造における細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質の使用；

〔5 7〕創傷治癒薬及ぴノ又は器官形成促進薬の製造における細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと ¾ 鉛との結合を促進し得る物質の使用；〔5 8〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を上皮一間葉転換の制御に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ；

〔5 9〕 S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を上皮一間葉転換の制御に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ；

〔6 0〕細胞内亜鉛量を制御し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を S n a i 1活性の制御に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ；

〔6 1〕細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を癌転移の予防に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ；

〔6 2〕細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を促進し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を創傷治癒及ぴノ又は器官形成促進に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。図面の簡単な説明

図 1は、ヒト子宫頸部癌細胞 H e L aにおける、細胞内亜鉛量の調節による S n a i 1の細胞内局在変化を示した図である。

図 2は、 S n a i 1分子内 Z nフィンガードメインにおける亜鉛結合能と細胞内局在変化の関係を示した図である。

図 3は、ヒトケラチノサイト H a C a Tにおける、 E MTの間の S N A I L 1 および亜鉛の E G F誘導核内蓄を示した図である。（a ) E G F誘導 E MTの間の H a C a T細胞における、 S NA I L 1、 E—カドヘリン、およぴビメンチンの発現。 GAPDHを、ローデイングコントロールとして用いた。（b) EGF誘導 EMTの間の、 Ha C a T細胞の形態、 SNA I L細胞内局在、およぴ核染色。

(c) 系統学的関連性ならびに EGF存在下または非存在下の Ha C a T細胞における Z I Ρ類おょぴ ΖΝΤ類の発現パターン。（d) — （f ) EGF刺激 Ha C a T細胞における亜鉛特異的取り込みおよびその核内蓄積。亜鉛取り込み（d) およびその基質特異性（e) を、 ⁶⁵ Z nを用いてアツセィした。亜鉛の細胞内局在（f ) を、 Z nAF— 2 DMを用いて可視化した。各点は、代表的な実験のデータの平均である；各実験を 3連で実施し、各条件に対して 3実験を行って、 error barは土 1 S. D.を示している。

図 4は、 H a C a T細胞による EG F誘導創傷治癒の間の、 Z I P 10を介した SNA I L 1の核内蓄積の亜鉛への依存性を示した図である。（a) ― (b) コントロール s i RNA導入（C o n t r o l )、 Z I P 6ノックダウン（Z I P 6)、 Z I P 1 0ノックダウン（Z I P 1 0)、および Z I P 6 ; Z I P 10ダブルノックダウン（Z I P 6 ; Z I P 10) H a C a T細胞の、 Ζ I Ρ 6およぴ Ζ I P I 0の発現（a)、および EGF誘導 ⁶⁵Z n取り込み活性（b)。各点は代表的な実験のデータの平均であり、各実験を 3連で実施し、各条件に対して 3実験を行って、 error barは ± 1 S. D.を示している。（c) コントローノレ _s i RN A導入（C o n t r o l )、 Z I P 6ノックダウン（Z I P 6)、 Z I P 10ノックダウン（Z I P 10)、 Z I P 6 ； Z I P 10ダブルノックダウン（Z I P 6 ； Z I P 1 0) および TP EN処理（TP EN) H a C a T細胞の運動性遊走性の挙動を、インビトロ創傷治癒アツセィ（WHA) で角爭析した。 SNA I L 1を免疫染色により、亜鉛を蛍光マーカー Z n A F— 2 DMにより標識化した。矢印は、遊走性細胞の先端を示している。各実験を少なくとも 3回実行し、典型的な結果の 1実験を示している。

図 5は、マウス S n a i 1 1の Z nフィンガードメインにおける亜鉛配位が、その核内蓄積に必須であることを示した図である。（a)—（c) LMB存在下（b). または非存在下（a) の EGF刺激 H a C a T細胞における GF P融合マウス S n a i l 1の様々な変異体の細胞内局在（c)。 C 2H2モチーフ（C 2H2)を、各フィンガードメインにおける亜鉛配位活性を消滅させるために G 2 G 2モチーフ（G 2G2) に変異導入した。 WT、野生型。（d) - (e) LMB有り（e) または無し（d)の EG F刺激 H a C a T細胞におけるマウス S n a i 1 1の様々な変異体の核 GF Pを顕著に示す細胞の割合を測定した。各点は代表的な実験のデータの平均である；各実験を 3連で実施し、各条件に対して 3実験を行って、 error barは土 1 S. D.を示している。

図 6は、癌の進行における EMTの亜鉛依存性調節を示した図である。（a) Z I P 10および E—力ドヘリンの内因性発現は、様々な浸潤性/転移性癌細胞株 (He L a、 MDA— MB— 23 1、および MD A— MB— 435 S)、ならびに非転移性細胞株（MCF 7、 T47D、 ZR 75— 1、および ZR 75— 30) において逆に相関していた。 Z I P 10、 Z I P 6、 E—力ドヘリン、およびビメンチンの発現レベルを、 RT— P CRにより解析した。 GAPDHを、ローディングコントロールとして用いた。（b ) コントロール s i RNA導入 (C o n t r o l)、 Z I P 6ノックダウン（Z I P 6)、 Z I P 10ノックダウン（Z I P 10)、および Z I P 6 ; Z I P 10ダブルノックダウン（Z I P 6 ; Z I P 1 0) He L a細胞のトランスゥエル遊走ァッセィにより解析した、浸潤性特性 H e L a細胞。各点は代表的な実験のデータの平均である；各実験を 3連で実施し、各条件に対して 3実験を行って、 error barは土 1 S. D.を示している。発明を実施するための最良の形態

「上皮一間葉転換（EMT)」は、胚発生、臓器や組織の再生、癌転移'進行等の過程において、上皮細胞が細胞間接着を弱めて分散し、間葉細胞としての侵襲性細胞様の挙動を示す様になる、細胞の表現型の変化をいう（Thiery JP. Epith elial - mesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer. 2 (6) :442-54 .(2002) )₀ 本発明にお:いて EMTの制御とは、上記した細胞の表現型の変化を抑制するか又は促進することである。すなわち、本発明において「制御」とは、正及び負のいずれの調節をも意味する。本発明において S n a i 1活性の制御とは、 E M Tのマスターレギュレーターとしての機能を制御することを意味し、具体的には S n a i lタンパク質の核内又は細胞質への移行（S n a i 1の細胞内局在）の制御、細胞間接着制御及びそれに伴う E M T制御を意味する。本発明において「細胞内亜鉛 *の制御」とは細胞内亜鉛、特に細胞内に存在する Z nフィンガードメイン内の亜鉛の量を増加させる、あるいは減少させるという文言通りの意味に加え、最終的に細胞内で亜鉛量が増減することによって与えられる E MTへの影響及び Z又は S n a i 1活性への影響と同様な影響を与えることができる作用をも意味し、そのような場合には細胞内亜鉛量の多少には拘束されない。本発明において、細胞內亜鉛量の制御の対象となる細胞は、 S n a i 1フアミリーを発現し、上皮一間葉転換が起こる細胞であれば特に限定されず、具体的には、腎細胞（例えば MD C K等）、ケラチノサイト等の上皮細胞、乳癌細胞等が挙げられる。 S n a i 1分子の発現は天然に発現しているものであっても遺伝子工学技術を用いて強制発現させたものであっても構わない。本明細書では制御の対象となる細胞を便宜上「対象細胞」と称することもある。

「細胞内亜鉛量を制御し得る物質」としては「亜鉛イオン」、「亜鉛キレーター」、「亜鉛ィオノフォア」、「亜鉛トランスポーターの発現及び又は機能を調節する物質」等が挙げられるが、「亜鉛イオン」や「亜鉛ィオノフォア」はそれを添加することにより対象細胞内の亜鉛量を直接増加させることができ、一方、「亜鉛キレ一ター」はそれを添加することにより対象細胞内の亜鉛量、特に細胞内の Z nフィンガードメィン内の亜鉛の量を直接低減することができる。「亜鉛トランスポーターの発現及び/又は機能を調節する物質」は、亜鉛トランスポーターの発現及ぴ又は機能を調節することによって、対象細胞の E MT制御及ぴ又は S n a i 1活性制御において細胞內亜鉛量の増減によってもたらされるのと同様な現象を誘導することができる。すなわち、亜鉛の作用を間接的に制御することができる。「亜鉛トランスポーターの発及び又は機能を調節する物質」において、発現あるいは機能を促進する方向に調節する物質であれば当該細胞内での亜鉛トランスポーターの亜鉛に対する応答性をより高め、発現あるいは機能を抑制する方向に調節する物質であれば該応答性をより抑制することができる。又、「亜鉛要求性タンパク質の発現及び Z又は機能を調節する物質」も、細胞内亜鉛量のバランスに影響を及ぼすので、本発明の「細胞内亜鉛量を制御し得る物質」として利用することができる。

「亜鉛イオン」は亜鉛ィオノフォアによって対象細胞内に導入される。すなわち亜鉛イオンは亜鉛ィオノフォアとの錯体の形で対象細胞内に導入される。亜鉛ィオノフォアとしては当分野で通常用いられている、好ましくは市販されている種々の化合物が挙げられる。亜鉛ピリチオン、複素環ァミン、ジチォカルパメート、ビタミン類等が例示される。

「亜鉛キレーター」とは、対象細胞内で亜鉛と錯体を形成することによって細胞内から亜鉛を除去することができる物質であって、例えば、 2， 3—ジメルカプト一 1—プロパンスルホン酸（DM P S )、 N， N， N，， N，ーテトラキス（2 一ピリジルメチル）エチレンジアミン（T P E N)、エチレンジアミン（E D T A)、 N— ( 6—メトキシ一 8—キノリル）一 ρ—トルエンスルホンアミド（T S Q ) 等が挙げられる。いずれも商業的に入手可能である。また、本発明の E MT、 S n a i l活性制御剤並びに本発明の癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬（以下、単に本発明の医薬と称することもある）に有効成分として含められる細胞内亜鉛量を制御し得る物質としての亜鉛キレーターの量は、それぞれ細胞内での亜鉛量の制御が可能な範囲で適宜決定される。また、含める亜鉛キレーターは 1種類であっても 2種類以上であってもよい。 2種類以上含める場合にはその種類に応じて配合量を適宜設定する。

「亜鉛トランスポーターの発現及び/又は機能を調節する物質」とは亜鉛トランスポーターの発現及び又は機能を結果的に調節することができればその作用機序は特に限定されず、遺伝子レベルでの調節であってもタンパク質レベルでの調節であってもよい。遺伝子レルでの調節としては、転写調節、遺伝子発現調節等が挙げられる。タンパク質レベルでの調節としては、代謝調節、リン酸化、脱リン酸化、糖付加、脂質付加、亜鉛との配位結合、分解、ュビキチン化、ァセチル化等が挙げられる。「亜鉛トランスポーター」としては、例えば、 L I Vファミリーを含むヒト Z I P類（BAB 70848、 h Z i p 4、 B I GM 103、 K I AAO 06 2、 K I A A 1 265、 h L i v— 1、 AAHO 88 53、 h K E4、 X P_208649、 h Z I P l、 h Z I P 2、 h Z I P 3、 BAA 9 2 100、 B AC 04504, h Z I P I O等）、ヒト CDF類（hZ n t— 5、 h Z n t— 7、 h Z n t— 1、 h Z n t— 6、 h Z n t— 3、 h Z n t— 2、 h Z n t— 8、 h Z n t— 4、 h Z n t— 3、 h Z n t— 9等）等が挙げられる。 L I V 1は、当初はエストロゲン制御を受ける乳がんタンパク質として同定され、最近になって LZT(Z I P亜鉛トランスポーターの L I V- 1サブファミリー）と称される Z I P亜鉛トランスポーターサブフアミリー（Z r t―、 I r t様タンパク質）に属し（Taylor, K. M. & Nicholson, R. I. The LZT proteins; the LIV-1 subfamily of zinc transporters. Biochim. Biophys. Acta 1611 (1-2)： 1 6-30 (2003))、亜鉛トランスポーターとして機能することが明らかになった（Ta ylor, K. Μ.， Morgan, H. E.， Johnson, A. , Hadiey, L. J. & Nicholson, R. I. Structure-function analysis of LIV-1, the breast cancer-associated prot ein that belongs to a new subfamily of zinc transporters. Biochera. J. 37 5(pt 1) :51—9 (2003))。他に CD F (c a t i o n d i f f u s i o n f a c i l i t a t o r)、 Z I P l 0等が挙げられる。

例えば、亜鉛トランスポーターである L I V 1は、 STAT 3により発現調節を受ける（Yamashita, S. , Miyagi, C. , Fukada, Τ.， Kagara, N. , Che, Y.— S. & Hirano, T. Zinc transporter LIVI controls epithelial - mesenchymal trans ition in zebrafish gastrula organizer. Nature 429 (6989) :298-302 (2004) )₀ また、例えば、亜鉛トランスポーターである Z I P 10は、 EGFにより発現調節を受ける。

「亜鉛トランスポーターの発及ぴ Z又は機能を調節する物質」は、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。また、低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ここで低分子化合物とは分子量 3000未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物およびその誘導体や無機化合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモー歹一等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物およびその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量 3000以上程度の化合物であって、タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられ、望ましくはタンパク質である。これらの低分子化合物あるいは高分子化合物は、公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであつてもよく、また半合成等によっても得ることができる。

亜鉛トランスポーターは、その亜鉛輸送機能により、細胞内亜鉛量を制御することが可能である。例えば細胞外から細胞内への亜鉛の輸送を担い、且つ Sn a i 1分子の核内への移行を誘導する L I V 1の発現及ぴ又は機能を調節する物質が、細胞内亜鉛量を制御し得る物質として用いられ、具体的には以下のものが挙げられる。

(1) 下記 a) 〜d) のいずれかに記載の DN A

a) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（L I V1タンパク質）をコードする DNA

b ) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列からなる DNA (L I V 1遺伝子） c) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸配列が置換、欠失、揷入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質（L I V 1に類似するタンパク質）をコードする DNA

d ) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする DNA _r

(2) 下記 a) 〜d) のいずれかに記載の DNAが揷入されたベクター a) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA

b) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列からなる DN A

c) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸配列が置換、欠失、揷入及び/又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA

d ) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列とストリンジェントな条件でハイプリダイズする DNA

(3) 下記 a) 〜d) のいずれかに記載の DNAによってコードされたタンパク質

a) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA

b) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列からなる DN A

c) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸配列が置換、欠失、挿入及び Z又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNA

d) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列とストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNA

(4) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列からなる DN Aを標的配列としたアンチセンスオリゴヌクレオチド

(5) 配列番号 1、 3又は 5記載の配列からなる DN Aの一部と同一又は類似する配列を有する二本鎖 RN A

(6) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体

(7) 配列番号 2、 4又は 6記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と会合し、その機能を調節する物質（天然物、非天然物を含む） .

(1) 〜（3) は亜鉛トランスポーターの発現及ぴ又は機能を正に調節する (発現を増強する、及びノ又は機能を活性化する）物質であり、（4 ) 及び（5 ) は亜鉛トランスポータ一の発現及びノ又は機能を負に調節する（発現を減少させる、及びノ又は機能を抑制する）物質である。

L I V 1タンパク質の調製は、当業者に周知の各種方法によって行うことが可能である。例えば、配列番号 1、 3又は 5に記載の塩基配列からなる D N A ( L I V 1遺伝子）が揷入されたベクターを保持した形質転換体にタンパク質を生産させ、精製することによって調製できる。使用するベクターはタンパク質生産に用いる翻訳系により適宜選択することができる。また L I V 1は、乳房、前立腺、脳下垂体、脳等のホルモン系組織に発現することが知られている（Taylor, K. M. & Nicholson, R. I. The LZT proteins ; the LIV-1 suofamily of zinc transp orters. Biochim. Biophys. Acta 1611 (1-2) : 16- 30 (2003) )。抗 L I V Iタンパク質抗体を周知方法で調製し、該抗体でァフィュティカラムを作製すれば、 L I V 1を発現する細胞抽出物から L I V 1タンパク質を精製することができる。亜鉛トランスポーターとして機能し得る範囲内で、 L I V 1に類似するタンパク質もまた細胞内亜鉛量を制御し得る物質であって、例として、配列番号 2、 4 又は 6に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸配列が置換、欠失、挿入及び又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号 1、 3又は 5に記載の塩基配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aによってコードされるタンパク質を挙げることができる。

L I V 1に類似するタンパク質の調製は、例えば、 L I V 1をコードする塩基配列を利用してハイプリダイゼーシヨンを行い、得られた相同性の高い D N Aによって形質転換体を作製し、該形質転換体に所望のタンパク質を生産させる方法をとることができる。相同性の高い D N Aを得る方法の一例として、配列番号 1、 3又は 5に記載された塩基配列の一部をプローブとし、ヒトゃヒト以外の脊椎動物の細胞等からストリンジェントなハイプリダイゼーション条件下でハイプリダィズする方法を挙げることがで考る。 _ 上記ストリンジェントなハイプリダイゼーシヨン条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば 25%ホルムアミド、より厳しい条件では 50%ホノレムアミド、 4 XS SC、 5 OmM H e p e s p H 7. 0、 10 Xデンハルト溶液、 20 // g/niL変性サケ精子 DNAを含むハイプリダイゼーシヨン溶液中、 42°Cで一晚プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、標識したプローブを添加し、 42°Cでー晚保温することによりハイプリダイゼーシヨンを行う。その後の洗浄における洗浄液及び温度条件は「1 X S S C、 0. 1 % S D S、 37°C」程度で、より厳しい条件としては「0. 5 X S SC、 0. 1 % S D S、 42°C」程度で、さらに厳しい条件としては「0. 2 X S SC、 0. 1 %S DS、 6 5°C」程度で実施することができる。このようにハイプリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有する D N Aの単離を期待し得る。但し S SC、 SD Sおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えばプローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダィゼーシヨン反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。

このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離される DNAがコードするポリペプチドは、通常、 L I V Iとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも 40%以上、好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 80 %以上、さらに好ましくは 90 %以上、さらに好ましくは 95 %以上、さらに好ましくは 9 7 %以上（例えば 98〜 99 %)の配列の相同性を指す。ァミノ酸配列の同一性は、例えば K a r l i n a n d A l t s c h u lによるァルゴリズム B LAST (P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA 8 7 ： 2264- 2268, 1 990、 P r o c . N a t l . Ac a d. S c i . USA 90 : 5873-58 77, 1 9 93)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて B LASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（A l t s c h u l e t a 1. J . M o 1. B i o l . 21 5 : 40. 3— 41 0, 1 990)。 B LASTXによってアミノ酸配列を解析する場合にはノラメーターは ί列え s c o r e = 50、 wo r d l e n g t h = 3とする。 B LASTと Ga p p e d B LA S Tプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知であ ( h t t p ： Zz www. n c b i . n 1 m. n i h . g o v.)

L I V 1に類似するタンパク質の調製は、別の公知手段によることも可能である。例えば、ェキソヌクレアーゼを用いる d e l e t i o n mu t a n t作製法、カセット変異法等の s i t e - d i r e c t e d mu t a g e n e s i s によって L I V I DNAを人為的に改変させ、該改変 L I V 1 DNAを用いて、所望タンパク質を調製することができる。

亜鉛トランスポーターの発現及びノ又は機能を調節する物質として利用可能な物質の別の好適な例として、配列番号 1、 3又は 5記載の配列からなる DNAを挙げることができる。上記 DNAはタンパク質 L I V 1をコードしている。

上記 DNAは、配列番号 1、 3又は 5記載の配列の一部をプローブとし、当業者に周知のハイブリダィゼーシヨン技術によって、 L I V 1が発現している細胞の cDN Aから調製することができる。また、配列番号 1、 3又は 5記載の配列の一部をプライマーとし、 mRNAからRT— PCRを実施して得ることもできる。あるいは市販の DN A合成機を用いて人工的に合成してもよい。

さらに、上記 DNAに類似する DNAもまた、「亜鉛トランスポーターの発現及ぴ又は機能を調節する物質」の一例である。該類似する DNAとして、配列番号 1、 3又は 5記載の配列とストリンジェントな条件でハイブリダィズする DN Aを挙げることができる。この DNAの調製法は既に上述したとおりである。上述した各 DN Aを使用するときは、適当なベクターに揷入して用いることができる。ベクターに揷入したものも本発明の態様の一つである。使用するべクタ一は、目的に応じて適当なベクターを選択することができる。具体的には、哺乳動物由来のベクター（例えば、 p cDNA3 (インビトロジェン社製）や！ EF -BO S (Nu c l e i c Ac i d s . R e s., 18 (1 7), p. 5322， 1 990)、 p EF、 p CDM8、 p C X N)、昆虫細胞由来のベクター（例えば「B a c― t o— B A C b a c u l o v i r u s e x p r e s s i o n s y s t em」（インビトロジェン社製）、 B a c P AK8),植物由来の発現べクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来のベクター（例えば、 pH S V、 pMV、 p A d e x L c w), レトロウィルス由来のベクター（例えば、 p Z I P n e o)、酵母由来のベクター（例えば「P i c h i a Ex p r e s s i o n K i t J (ィンビトロジェン社製）、 NV 1 1 , S P— Q 01 ).、枯草菌由来のベクター（例えば p P L 608、 p KTH50)、大腸菌ベクター（M 1 3系ベクター、 pUC系ベクター、 p BR 322、 p B l u e s c r i p t^ p C R — S c r i p t) 等を挙げることができる。本発明において、哺乳動物細胞内で発現可能なベクターを用いることが好ましく、又、発現ベクターを用いることが好ましい。ベクターを細胞へ導入するには、例えば、リン酸カルシウム法' (V i r o l o g y， Vo l . 52, p. 456， 1 973)、 DEAEデキストラン法、カチォニックリポソーム DOTAP (口ッシュ■ダイァグノスティックス社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法（Nu c l e i c Ac i d s R e s . , Vo l . 1 5， p. 1 3 1 1， 1 98 7)、リポフエクション法（ J . C 1 i n. B i o c h em. N u t r . , Vo l . 7 , p. 1 75, 1 989)、ウイルスによる感染導入方法（pMX、 MS CV等； S c Am. , ρ . 34， 1 994)、パーティクルガン等から選択することにより行うことができる。

「亜鉛トランスポーターの発現及びノ又は機能を調節する物質」として、例えば L I V 1を.コードする DN Α又は mRN Αを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを挙げることができる。 L I V 1をコードする DNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、内在する L I V 1遺伝子の発現を妨げ、細胞外から細胞内への亜鉛輸送を抑制する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、配列番号 1、 3又は 5記載の配列からなる DNA又は該 DNAから生成される mRNAを標的配列とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを挙げることができる。一例としては、配列番号 7又は 8に記載するオリゴヌクレオチドをげることができる。これ以外にも、上記配列番号 1、 3又は 5に記載の配列からなる DN A等のいずれかの箇所にハイプリダイズし L I V 1の発現を有効に阻害できれば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれ、上記配列番号 1、 3又は 5に記載の配列からなる D N A又は対応する m R N Aと完全に相補的でなくてもよい。

上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的に応じ、適当なベクターに揷入して用いることができる。例えば遺伝子治療に応用する目的であれば、レトロゥイノレスベクター、アデノウイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベクター等のゥィルスベクターや、カチォニックリボソーム、リガンド DN A複合体等の非ウイルスベクター等の中から、適宜選択可能である。また、キャリアーを用いずに、裸のプラスミド DNA (n a k e d p DNA) として大容量の水溶液とともに投与する方法をとることも考えられる。

別の「亜鉛トランスポーターの発現及び /又は機能を調節する物質」として L I V 1をコードする DNAの一部と同一又は類似する配列を有する二本鎖 RNA を挙げることができる。標的遺伝子配列と同一又は類似した配列を有する二本鎖 RNAは、標的遺伝子の発現を妨げる RN A干渉（RNA i n t e r f e r e n c e ； RNA i ) を引き起こし得る。 RNA iは、二本鎖 RNA (d s RNA) を細胞内に導入した際に、その RN A配列に対応する細胞内の mRN Aが特異的に分解され、タンパク質として発現されなくなる現象をいう。 L I V I遺伝子の発現を妨げ、細胞外から細胞内への亜鉛輸送を抑制する。二本鎖を形成する領域は、すべての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端等）がー本鎖等になっていてもよい。従って、本発明の二本鎖 RNAにおいても、二本鎖でない領域が含まれていてよい。 RNA iに用いられるオリゴ RNAは 10〜100 b pの RNAが用いられることが多く、通常 1 9〜23 b pの RNAが用いられる。 RNA i法は、 Na t u r e, Vo l . 39 1, . 806, 1 998、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . US A Vo l . 95, . 1 5502, 1 998、 Na t u r e, Vo l . 395, . p. 854, 1 998、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA V o 1. 96, . 5049, 1 9 99、 C e l l , Vo l . 95, p. 1 01 7， 1 998、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA Vo l . 96, p. 145 1， 1 999、 P r o c . Na t l . Ac a d. S c i . USA Vo l . 95， p. 1 3959， 1 9 98、 Na t u r e C e l l B i o l .， Vo l . 2, p. 70, 2000等の記載に従って行うことができる。

「亜鉛トランスポーター」が L I V 1以外（例えば、 Z I P 1 0等）の場合にも、該亜鉛トランスポーターの既知のァミノ酸配列あるいは塩基配列をもとにして、 L I V 1の場合と同様にして各種の DNA、ベクター、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖 RNA、抗体等を調製することができる。各種ァミノ酸配列及び塩基配列の情報は、 N C B I等で閲覧可能な種々のデータベースから入手することができる。えば、 Z I P 10のアミノ酸配列及び塩基配列の情報は、 NCB Iから入手することができる（ァクセッション番号； N M— 020342 (配列番号： 69)、 NP— 065075 (配列番号： 70)、 N M— 1 7265 3、NP— 766241、NM— 2006 71、NP— 9569 65)。

「亜鉛要求性タンパク質の発現及び Z又は機能を調節する物質」とは亜鉛要求性タンパク質の発現及ぴ z又は機能を結果的に調節することができればその作用機序は特に限定されず、遺伝子レベルでの調節であつてもタンパク質レベルでの調節であってもよい。遺伝子レベルでの調節としては、転写調節、遺伝子発現調節等が挙げられる。タンパク質レベルでの調節としては、代謝調節、リン酸化、脱リン酸化、糖付加、脂質付加、亜鉛との配位結合、分解、ュビキチン化、ァセチル化等が挙げられる。本発明でいう、「亜鉛要求性タンパク質」は、その発現及ぴ Z又は機能が調節されることによって、対象細胞内の亜鉛量に影響を及ぼし、結果的に EMT制御並びに S n a i 1活性制御に影響を及ぼすタンパク質であつて、例えば Z nフィンガーを有するタンパク質、 R I NGフィンガーを有するタンパク質、 L IMドメインを有するタンパク質、 PHD亜鉛フィンガーを有するタンパク質等が挙げられる。 Z nフィンガーは、システィンやヒスチジンといつ' たァミノ酸が亜鉛と配位することによって初めて高次構造を有することができるユニークな核酸結合能を有するモチーフであり、 Z nフィンガーを有するタンパク質としては、 P KC a (Korichneva I, Hoyos B, Chua R, Levi E, Hammer 1 in g U. Zinc release from protein kinase C as the common event during activ ation by lipid second messenger or reactive oxygen. J. Biol. Chera. 277(4 6) :44327-31 (2002))、 GEF— H I (Krendel M, Zenke FT, Bokoch GM. Nucle otide exchange factor GEF - HI mediates cross-talk between microtubules an d the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology 4(4) :294-301 (2002))、 HD AC (Kawaguchi Y， Kovacs JJ, McLaurin A, Vance JM, Ito A, Yao TP. The d eacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and ceil viability in res ponse to misfolded protein stress. Cell 115(6) :727-738 (2003))、 S Q S T M 1 (Joung I， Strorainger JL, Shin J. Molecular cloning of a phosphotyro sine-independent ligand of the p561ck SH2 domain. Proc Natl Acad Sci USA, 93(2) :5991-5995 (1996)) 等が例示される。 R I NGフィンガーは、亜鉛フィンガーの変形ともいえ、タンパク質間の相互作用に関与しているものと示唆されており、 R I NGフィンガーを有するタンパク質としては、ュビキチン一タンパク質リガーゼ E 3 (u b i q u i t i n— p r o t e i n l i g a s e E 3 ) 活性を有するものや、ュビキチン共役タンパク質 E 2 (u b i q u i t i n- c o n j u g a t i n g e n z yme s E 2)、 TRAF 6 (TNF CKのシグナル達分子； Kobayashi N, Kadono Y， Naito A, Matsumoto K, Yamamoto T, Tan aka S, Inoue J. Segregation of TRAF6 - mediated signaling pathways clarif i es its role in osteoclastogenesis. The EMBO J. 20 (6) : 1271-1280 (2001))との結合を示すものが報告されている。 L IMドメインは、 6つのシスティンと 1 つのヒスチジンの位置が保存された 60アミノ酸からなり、 Z nフィンガーとよく似た構造をとるものの DN A結合能は知られていない。 PKCとの結合を介在するドメインとしても機能する。 L IMドメインを有するタンパク質としては、細胞骨格制御に関与する P a X i 1 1 i n (Brown MC， Perrotta JA, Turner CE.. Identification of LIM3 as the principal determinant of paxillin focal a dhesion localization and characterization of a novel motif on paxillin d irecting vinculin and focal adhesion kinase binding. J. Cell Biol.' 135 (4) : 1109-1123 (1996) )、 Z y x i n (Sadler I， Crawford AW, Michelsen JW, Beckerle MC. Zyxin and cCRP: two interactive LIM domain proteins associa ted with the cytoskeleton. J. Cell Biol. 119 (6)： 1573-1587 (1992) ) 等が例示される。 P H D Z nフィンガーは、クロマチンを媒介した転写調節に関与すことが示唆される核タンパクである Z nフィンガー様ドメインであり、 D N A結合能を有するものと予測されている。 P H D Z nフィンガーを有するタンパク質としては、ヒストンのァセチル化に関与する J a d e— 1 (Panchenko MV, Zh ou MI, Cohen HT. von Hippel-Lindau partner Jade - 1 is a transcriptional c o - activator associated with histone acetyltransf erase activity. J. Biol. Chem. 279 (53) : 56032-56041 (2004) ) 等が例示される。

R a f - 1は細胞外シグナルを R a s _ G T Pから E R K _カスケ一ドへと導くプロテインキ ·^ "一ゼであり R a f — 1は C D Fフアミリーの一つである Z n T 一 1亜鉛ェクスポーターにより活性化され、逆に亜鉛により不活性化される。即ち R a s - E R K p a t h w a yを担う R a f — 1活性は Z n T - 1を介して亜 ΙίΗこより IJ御されてヽる (Jirakulaporn T, Muslin AJ. Cation diffusion faci litator proteins modulate Raf-1 activity. J Biol Chem. 279 (26) : 27807 - 15 (2004)、 Bruinsma JJ, Jirakulaporn T, Muslin AJ, Kornfeld K. Zinc ions an d cation diffusion facilitator proteins regulate Ras - mediated signaling. Dev Cell. 2 (5) : 567- 78 (2002) )。

「亜鉛要求性タンパク質の発現及び/又は機能を調節する物質」は、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。また、低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ここで低分子化合物とは分子量 3 0 0 0未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物およびその誘導体や無機合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造. される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモーター等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物およびその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量 3 0 0 0以上程度の化合物であって；タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられ、望ましくはタンパク質である。これらの低分子化合物あるいは高分子化合物は、公知のもの,であれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであつてもよく、また半合成等によっても得ることができる。

「亜鉛要求性タンパク質の発現及び Z又は機能を調節する物質」としては、例えば各タンパク質の既知のァミノ酸配列や塩基配列を基にして、上記 L I V 1同様にして得られる各種の D N A、ベクター、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖 R N A、抗体等が挙げられる。

「亜鉛イオン」、「亜鉛ィオノフォア」、「亜鉛キレーター」、「亜鉛トランスポーターの発現及び/又は機能を調節する物質」及ひ：「亜鉛要求性タンパク質の発現及び Z又は機能を調節する物質」はいずれも、ヒトをはじめゥシ、ゥマ、ィヌ、マウス、ラット等の哺乳動物において、細胞内、具体的には E M T及び Z又は S n a i 1活性を示す細胞内で亜鉛量を制御すること並びにそれと同様の影響を細胞に与えることが可能である。細胞内亜量を低下させ得る物質は S n a i 1の核への移行及ぴ活性化の抑制を介して E M Tを抑制し、細胞内亜鉛量を上昇させる物質は S n a i 1の核への移行及ぴ活性化の促進を介して E M Tを増強させることができる。 E MTは、癌転移、創傷治癒、器官形成時に観察され、従って、 E M Tを抑制する本発明の E MT制御剤は癌転移予防薬として有用である。また、 E M Tを増強する本発明の E M T制御剤は、創傷治癒薬及ぴノ又は器官形成促進薬として有用である。

本発明の E M T制御剤、 S n a i 1活性制御剤並び癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬は、上記し一連の有効成分（亜鉛イオン、亜鉛ィオノフォ. ァ、亜鉛キレーター、亜鉛トランスポーターの発現及び又は機能を調節する物質、亜鉛要求性タンパク質の発現及ぴ Z又は機能を調節する物質）に加え、所望により薬学的に許容される賦形剤、添加剤を含む。薬学的に許容される賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。又、有効成分として異なる種類の「細胞内亜鉛量を制御する物質」を併用することもできる。

薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラタトース、ぺクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチノレセノレロース、ナトリウムカノレボキシメチノレセノレロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。 - さらに、錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、腸溶性コーティング錠、フィルムコーティング錠あるいは二層錠、多層錠とすることができる。散剤は、 .薬学的に許容される散剤の基剤と共に製剤化される。基剤としては、タノレク、ラタトース、澱粉等が挙げられる。ドロップは水性又は非水性の基剤と一種またはそれ以上の薬学的に許容される拡散剤、懸濁化剤、溶解剤等と共に製剤化できる。カプセルは、有効成分となる化合物を薬学的に許容される担体と共に中に充填することにより製造できる。当該化合物は薬学的に許容される賦形剤と共に混合し、または賦形剤なしで力プセルの中に充填することができる。カシエ剤も同様の方法で製造できる。本発明を座剤として調製する場合、植物油 (ひまし油、オリープ油、ピーナッツ油等）や鉱物油（ワセリン、白色ワセリン等）、ロウ類、部分合成もしくは全合成グリセリン脂肪酸エステル等の基剤と共に通常用いられる手法によって製剤化される。

注射用液剤としては、溶液、懸濁液、乳剤等が挙げられる。例えば、水溶液、水一プロピレングリコール溶液等が挙げられる。液剤は、水を含んでも良い、ポリエチレングリコールおよびノまたはプロピレンダリコールの溶液の形で製造することもできる。

経口投与に適切な液剤は、有成分となる化合物を水に加え、着色剤、香料、 . 安定化剤、甘味剤、溶解剤、增粘剤等を必要に応じて加え製造することができる。また経口投与に適切な液剤は、当該化合物を分散剤とともに水に加え、粘重にすることによつても製造できる。增粘剤としては、例えば、薬学的に許容される天然または合成ガム、レジン、メチルセルロース、ナトリウムカルポキシメチルセルロースまたは公知の懸濁化剤等が挙げられる。

局所投与剤としては、上記の液剤および、クリーム、エアロゾル、スプレー、粉剤、ローション、軟膏等が挙げられる。上記の局所投与剤は、有効成分となる化合物と薬学的に許容される希釈剤および担体と混合することによつて製造できる。軟膏おょぴクリームは、例えば、水性または油性の基剤に増粘剤および Zまたはゲル化剤を加えて製剤化する。該基剤としては、例えば、水、液体パラフィン、植物油等が挙げられる。増粘剤としては、例えばソフトパラフィン、ステアリン酸ァノレミニゥム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコーノレ、ポリエチレングリコール、ラノリン、水素添加ラノリン、蜜蠟等が挙げられる。局所投与剤には、必要に応じて、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プ口ピル、クロロクレゾール、ベンザルコニゥムク口リド等の防腐剤、細菌増殖防止剤を添加することもできる。ローションは、水性又は油性の基剤に、一種類またはそれ以上の薬学的に許容される安定剤、懸濁化剤、乳化剤、拡散剤、増粘剤、着色剤、香料等を加えることができる。

かくして得られる本発明の E MT制御剤、 S n a i 1活性制御剤並び癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬は、経口または非経口的に投与される。経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。非経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤等）、直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与することができる。

経口剤または直腸投与剤としては、例えばカプセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、カシエ剤、座剤、液剤等が挙げられる。注射剤としては、例えば、無菌の溶液又は懸濁液等が挙げられる。局所投与剤としては、例えば、クリーム、軟膏、ローション、経皮剤（通常のパ？/チ剤、マトリクス剤）等が挙げられる。 . 投与量、投与回数は使用する細胞内亜鉛量を制御し得る物質の種類、患者の症状、年齢、体重、投与形態等によって異なり適宜設定され得る。

本発明の「癌転移予防薬」の対象となり得る癌としては、乳癌、子宮頸癌、胃癌等の癌が挙げられ、特に有用なのは乳癌等の転移癌である。本発明の「創傷治癒薬」の対象となり得る創傷としては、熱傷、消化管潰瘍等の創傷が挙げられ、特に有用なのは潰瘍治癒である。 E MTのマスターレギュレーターである S n a i 1の核への移行、活性化を誘導する L I V 1の発現を制御する S T A T 3は腎臓や肝臓における管腔形成に必須であることから、 E M T制御作用を有する物質は器官形成促進薬として有用である。

さらに、細胞内亜鉛量を制御することによって E MT制御及び/又は S n a i 1活性を制御することができる、という本発明者らが得た知見により、細胞内亜鉛量を測定することによって E MT制御作用及び Z又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物をスクリ一二ングすることが可能となる。例えば以下の工程により本スクリーニング方法は実施される。

( 1 ) E M T制御及び Z又は S n a i 1活性制御を所望する細胞を 2群に分け一方を試験化合物で処理する工程（未処理の残る一方を対照とする）

( 2 ) 処理後の細胞、及び未処理の対照細胞についてそれぞれ細胞内亜鉛量を測定する工程

( 3 ) 対照細胞内の亜鉛量と比較して有意に亜鉛量に変動があったものを選択し E MT制御作用及ぴ又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物と認定するェ程。

E M T制御及ぴ Z又は S n a i 1活性制御を所望する細胞とは、 S n a i 1が活性化され、 E M Tが起こる細胞であれば特に限定されず、具体的には、正常腎細胞、ケラチノサイト等の上皮細胞、乳癌細胞等が挙げられる。適当に 2群に分け一方を試験化合物で処理する。もう一方は処理せず対照細胞として使用する。さらに亜鉛量に影響を及ぼすことが知られている化合物、例えば亜鉛キレーターである T P E N等をポジティブな対照化合物として用いてもよい。

細胞内亜鉛量の測定は、通常当分野で実施されている方法を利用して、またそれに準じて行うことができる。例えば原子吸光法（フレーム法）による直接測定、特異プローブ（例えば蛍光試薬）を用いた蛍光分光光度計によって測定することができる。

又、 S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインが S n a i 1の細胞内局在に関与している、という本発明者らが得た知見により、試験化合物の存在下又は非存在下における Z nフィンガードメインと亜鉛との結合の程度を測定することによって、 E MT制御作用及び又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物をスクリーユングすることが可能となる。例えば以下の工程により本スクリーニング方法は実施される。

( 1 ) 試験化合物の存在下又は非存在下で S n a i 1分子内に存在する第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛とを接触させる工程、

( 2 ) Z nフィンガードメインと亜鉛との結合の程度を測定する工程、及ぴ

( 3 ) Z nフィンガードメインと亜鉛との結合に有意に影響を与える物質を、 E MT制御作用を有する化合物及び/又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物と認定する工程。

S n a i 1分子に存在する第 3番目の Z nフィンガードメインとは、具体的には配列番号 8の 2 1 0番目のシスティン〜 2 3 0番目のヒスチジンまでのアミノ酸から構成されるポリぺプチドである。本ポリぺプチドは、天然から分離、抽出、精製等の公知の手法により得られるものであっても、該ポリペプチドをコードする遺伝子の配列（配列番号 7 ) をもとに遺伝子工学技術を用いた合成、化学合成あるいはそれらの組合せ等により得られるものであっても構わない。また、ポリペプチドとして単離されたものであっても、細胞内で発現させた状態で用いられるものであっても構わない。また、亜鉛との結合性が失われない範囲で S n a i 1分子内に存在する第 3番目の亜鉛フィンガードメインは、そのアミノ酸配列において 1〜数個のアミノ酸の置換、欠失、揷入及び /又は付加が行われていても良い。，

S n a i 1分子内に存在する第 3番目の Z nフィンガードメイン（以下、 Z n フィンガードメインとも称する）が亜鉛と結合すると、 S n a i 1分子の核内移行が誘導される、という性質を利用して Z nフィンガードメインと亜鉛との結合の程度を測定することができる。すなわち、標識化した Z nフィンガードメインを含む S n a i 1分子又はその断片を用い、試験化合物の存在下又は非存在下、亜鉛の存在下で、該標識化 S n a i 1分子又はその断片の核内への移行が観察されれば、 Z nフィンガードメインは亜鉛と結合していると考えられ、核内への移行が観察されなければ、 Z nフィンガードメインと亜鉛とは結合していないと考えられる。対照と比較した場合に S n a i 1分子の核内移行に有意に影響を与えるものを、本発明の E MT制御作用を有する化合物及ぴ又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物と認定することができる。

Z nフィンガードメインを含む S n a i 1分子又はその断片の標識は、当分野で通常行われている方法、例えば放射標識や蛍光標識等が用いられるが、特に細胞内で発現させた状態でアツセィする場合にはリアルタイムで核内への移行を観察することができる蛍光標識が好ましい。

試験化合物は、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。また、低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ここで低分子化合物とは分子量 3 0 0 0未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物およびその誘導体や無機化合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモーター等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物およびその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量 3 0 0 0以上程度の化合物であって、タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられ、望ましくはタンパク質である。これらの低分子化合物あるいは高分子化合物は、公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。，これらは、天然由来であっても、また遺伝子:！学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。

細胞の試験化合物での処理時間は、用いる細胞や試験化合物の種類や濃度によつて適宜設定される。 T PEN等のポジティブな対照化合物を用いる場合にはその対照化合物で処理した場合に亜鉛量に変動が確認されることを目安にして行うことができる。細胞を処理する試験化合物の濃度もまた、用いる細胞や試験化合物の種類、処理時間によって適宜設定される。実施例

以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。本出願全体を通して引用されたすベての刊行物は参照として本明細書に組み入れられる。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。実施例 1 ：ヒト子宫頸部癌細胞 He L aにおける GF P— S n a i 1の細胞内局在と細胞内亜鉛量の調節によるその変化

配列番号 7の S n a i lと GFP (G r e e n F l u o r e s c e n t P r o t e i n) との融合タンパク質を発現するようなプラスミドを常法に従って構築し、それをリボフェクトァミン法により He L a細胞に 4時間トランスフエクシヨンした。血清（10%FCS) 存在下 DMEM培地中で 24時間培養したところ、 GFP— S n a i l発現を確認した。 GF P— S n a i 1は核に局在していた。これを 50 の亜鉛キレーター T P EN (Mo 1 e c u 1 a r P r o b e社）で 2時間処理すると GF P— S n a i 1の局在が細胞質へ移行した（図 1)。細胞内亜鉛量を減少させる、あるいは S n a i 1分子内の亜鉛をキレートすることにより S n a i 1の細胞内局在が制御可能であることが示された。実施例 2 ： S n a i 1分子内フィンガードメインにおける亜鉛結合能と細胞, 内局在変化実施例 1で H e L a細胞に発現させた G F P— S n a i 1は核に局在し、細胞內亜鉛量を減少させる（例えば亜鉛キレート剤 T PENでの処理）ことによって細胞質に移行した。そこで S n a i 1分子内に 4つ存在する Z nフィンガードメイン C 2 H 2モチーフを、各々 STRATGENEの Qu i c k Ch a n g e S i t e— D i r e c t e d Mu t a g e n e s i s k i tを用いて G 2G 2に変異させ、亜鉛存在下での細胞内での局在を調べた（図 2)。これらの変異は Z nフィンガードメインの Z n結合能が欠失した状態にあると考えられる。結果、第 3番目の Z nフィンガードメインに変異が導入された S n a i 1分子のみ亜鉛による核への移行が抑制されていた（細胞質内に局在していた）。即ち、第 3番目の Z nフィンガードメインのみが S n a i 1の細胞内局在に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。実施例 3 ：核局在型 S n a i l と細胞萆局在型 S n a i lにおける亜鉛の結合状態

細胞内亜鉛による S n a i 1の局在及び活性制御機構をさらに検討するために、核局在型 S n a i l と細胞質局在型 S n a i lにおける亜鉛の結合状態を解析した。 GF P— S n a i 1を強制発現させた核局在型 S n a i lを示す細胞と細胞質局在型 S n a i 1を示す細胞とをそれぞれ亜鉛存在下で培養し、 GF P— S n a i 1中の亜鉛含量を計測すると細胞質局在型 S n a i 1は核局在型 S n a i l に比べて亜鉛含量が低いことがわかった。 S n a i 1は Z nフィンガードメイン内の亜鉛を結合解離させることによりその局在を変化させていると考えられる。実施例 4

(方法）

細胞培養、 RNA i、および亜鉛キレート化

ヒトケラチノサイト細胞株 Ha C a T (Boukarap, P. et al. , J Cell Biol, 106,. 761-71 (1988)) を、 10 % F B Sを添加した DMEM中で維持した。細胞を、因子を含まない培地で 24時間飢餓状態にし、次いで、 100 n g/m lのヒト E G Fを含む培地で 24時間または表示の時間刺激した。ヒト Z I P 6および Z I P 1 0、ならびにコント口一ノレ ( s i CONTROL No n- t a r g e t i n g s i RNA # 1 ) に対する s i RNAを、 Dh a rma c o nから得た。 R NA iのための標的配列は： Z I P 6に対して、 5'- GAAGUUAUCUGUAAUCUUGUU-3' (配列番号： 9 )、 5' -GAAGUGACCUCAACUGUGUUU-3' (配列番号： 1 0 ) 、 5， -UGAAGGAACUCACUUUCUAUU - 3，（配列番号： 1 1 )、 5， -UGACUUUGCUGUUCUACUAUU-3' (配列番号： 1 2) ; Z I P 10に対して、 5， -GAACGUCACUCAGUUAUUAUU- 3，（配列番号： 1 3 )、 5， -GGAAGAAUAUGAUGCUGUAUU-3' (配列番号： 1 4 ) 、 5， -CCACAAACCUGAUCGUGUAUU-3' (配列番号： 1 5 )、 5， - GAAAGGACUUGUUGCUCUAUU - 3， (配列番号： 1 6) であった。 RNA干渉（RNA i ) スクリーニングを、製造元のプロトコルに従って行った。亜鉛をキレートするために、 TPEN (Mo 1 e c u l a r P r o b e s) を、観察の 24時間前に培養液に添加した（DM S O中 10 / M)。

プラスミド

GF P融合全長マウス S n a i l l (1 -264) および C末端欠失マウス S n a i l l (1— 1 5 1) に対する発現コンストラタトについては、前述の通りである（Yamashita, S. et al.， Nature, 429, 298-302 (2004))。 C 2 H 2/G 2 G 2 Z nフィンガー変異を、全長マウス S n a i 1 1 (1 - 264) の第 1番目の Z nフィンガードメインにおける C 1 56、 C 1 59、 H 1 72、および H 1 76、第 2番目の Z nフィンガードメインにおける C 1 82、 C 1 85、 H I 98、および H 202、第 3番目の Z nブインガードメインにおける C 2 10、 C 21 3、 H226、およぴ H 230、ならびに第 4番目の Z nフィンガードメインにおける C 238、 C 241、 H252、および H254に、 Qu i c k— Ch a n g e s i t e— d i r e c t e d mu t a g e n e s i s k ι t C S t r a t a g e n e) を用いて寧入した。全ての S n a i 1 1変異体を p C S 2. 発現ベクター内にクローン化し、 3，末端にインフレームで GF Pでタグをつけた。 S n a i 1 1コンストラタトによる細胞の一過性トランスフエクシヨンを、使用説明書に従って L i p o f e c t am i n e -P l u s試薬（ I n v i t r o g e n) を用いて行った。核外移行を阻害するために、レブトマイシン B (S i g ma)を、観察の 3時間前に培養液に添加した（エタノール中 5 n g/m 1 )。従来の RT— P CR

従来の RT— P CRに用いたプライマーは、以下の通りである：

SNA I L 1 ； 5' -AAGGACCCCACATCCTTCTC-3' (センス；配列番号： 1 7)、 5' -TCGGGGCATCTCAGACTCTA-3' (アンチセンス；配列番号： 1 8)、

E—カドヘリン； 5， -GTCATTGAGCCTGGCAATTT- 3，（センス；配列番号： 1 9)、 5， -GCTTGAACTGCCGAAAAATC- 3，（ァンチセンス；配列番号： 20)。

ビメンチン； 5， -CCTTGAACGCAAAGTGGAAT-3' (センス；配列番号： 2 1)、

5' -GCTTCAACGGCAAAGTTCTC-3' (アンチセンス；配列番号： 2 2)。

GAPDH ； 5' - TGAAGGTCGGAGTCAACGGAT - 3，（センス；配列番号： 2 3)、 5' -CATGTGGGCCATGAGGTCCAC-3' (アンチセンス；配列番号： 24)。

Z I P 1 ； 5， -CCTATCTCCCTCCTCCCATC- 3，（センス；配列番号： 2 5)、

5， - GGGTAACAGGTCCCAAAACA- 3，（ァンチセンス；配列番号： 2 6)、

Z I P 2 ； 5， -TCCACAGCCATGGACATTTA- 3，（センス；配列番号： 2 7)、

5， - TAGCTAGCTCCCGTGGAAGA- 3，（アンチセンス；配列番号： 2 8)、

Z ΓΡ 3 ； 5， - GCGACTCGGAGTATGAGAGC- 3，（センス；配列番号： 2 9)、

5' -ACCTTGAGCAGACGGTCACT-3' (アンチセンス；配列番号： 3 0 )、

Z I P 4 ； 5' -CCCAGAGTTGAGGCTACTGC-3' (センス；配列番号： 3 1)、

5' -AGGGCAGGGTATCAGAAGGT-3' (アンチセンス；配列番号： 3 2)、

Z I P 5 ； 5， - TCCTCCTGGGAGATGGTCTA- 3，（センス；配列番号： 3 3)、

5， - AGGGTTATGGCAAGCATGAG- 3，（アンチセンス；配列番号： 34)、

Z I P 6 ； 5， - TCTGTCACAAATCCCCTTCA- 3，（センス；配列番号： 3 5)、

5， -GGAGGGCTCTTGTGAGTCTG-3' (ァンチセンス；配列番号： 3 6)、

Z I P 7 ； 5， - GGCTGGCAGTCTTACAGAGG- 3，（センス；配列番号： 3 7)、 5' -CCCCTCGATTCAAACACAGT-3' (アンチセンス；配列番号： 3 8)、 Z I P 8 ； 5' -AGATTCCACGAAAAGCTGGA-3' (センス；配列番号： 3 9)、 5' -TTGTTGGGCTTTGTCAATCA-3' (アンチセンス；配列番号： 40)、 Z I P 9 ； 5， -GATCCAGAAGCAGCAAGGTC- 3，（センス；配列番号： 4 1)、 5， -GATGAGAGGGATGAGGCAAC-3' (ァンチセンス；配列番号： 4 2)、

Z I P 1 0 ； 5， - CCTGGTTCCTGAAGATGAGG- 3，（センス；配列番号： 4 3) 5' -CATGGCAGAGAGGAGGTTGT-3' (アンチセンス；配列番号： 44)、 Z I P 1 1 ； 5，— CACAACGTTCCAGAGGGTCT— 3，（センス；配列番号 : 4 5) 5' -CCAACGTCCAGTGACATCAT-3' (アンチセンス；配列番号： 4 6)、 Z I P 1 2 ； 5， - CCCACATGAAATGGGAGACT- 3，（センス；配列番号 : 4 7) 5' -TCATGGTGTTGGAAACCAAA-3' (アンチセンス；配列番号： 4 8)、 Z I P 1 3 ； 5， - CGCTTCCTMGACCCTTTCC- 3' (センス；配列番号 : 4 9) 5' -TCTGAAAACATCCACGGTGA-3' (アンチセンス；配列番号： 5 0)、 Z I P 1 4 ； 5， -GCGCAGAGGTCAGTCCTAGT- 3，（センス；配列番号： 5 1) 5' -CGCTACCCAAACAGAGAAGC-3' (アンチセンス；配列番号： 5 2 )、

ZNT 1 ； 5， - GTGTGAACTTGCCTGCAGAA- 3，（センス；配列番号： 5 3)、 5' -GCTTTCCAAAACAGTCACAGC-3' (アンチセンス；配列番号： 54)、 ZNT 2 ； 5， - TGATCCTGGTGTTGATGGAA - 3，（センス；配列番号： 5 5)、 5' -CCCTGGCTGTAGTCAGATGG-3' (アンチセンス；配列番号： 5 6)、 ZNT 3 ； 5' -CATCTCCCCATGGTTCATGT-3' (センス；配列番号： 5 7)、 5' -GGAGTCCTCCCTCTTTCAGG-3' (アンチセンス；配列番号： 5 8)、 ZNT4 ； 5' -ACAAGATTGCTGACCCCATC-3' (センス；配列番号： 5 9)、 5， CAGCTGTCAGGGATTCCATT- 3，（アンチセンス；配列番号： 60)、 ZNT 5 ； 5， - AGTCTCAGTTGGAGGGCTGA- 3，（センス；配列番号： 6 1)、 5' -AGCAGAATGACGCCAAAAAT-3' (アンチセンス；配列番号： 6 2 )、

ZNT 6 ； 5， - ACCTACACCAACACCCAAGC- 3，（センス；配列番号： 6 3)、 5' -GAAGGAGATCAGACTCCCAAAA-3' (アンチセンス；配列番号： 64)、 ZNT 7 ； 5， - TCCAGATGTCCACCATGAGA- 3，（センス；配列番号： 6 5)、

5， -TGCAACTGCTGTACCCTCTG-3' (ァンチセンス；配列番号： 66)、

ZNT 8 ； 5' - GGCCACAATCACAAGGAAGT- 3，（センス；配列番号： 6 7)、

5， - AGCAATTTCTCTCCGAACCA-3' (アンチセンス；配列番号： 68)

免疫染色

免疫染色を、 A l e x a 488 En h a n c e k i t (Mo l e c u l a r P r o b e s) を用いて行った。核を DAP I (Mo l e c u l a r P r o b e s) で対比染色した。

インビトロ創傷治癒および細胞遊走ァッセィ '

H a C a T細胞を、 F C Sの存在下でサブコンフルェントに達するまで培養し、

24時間飢餓状態にし、インビポ創傷治癒アツセィに供した。無細胞エリアを、単層を黄色ピぺットチップで搔爬することにより導入した。さらなる 24時間の無細胞エリアへの細胞遊走を、飢餓または 100 η g/m 1 EG Fの存在下で評価した。細胞遊走アツセィを、製造元のプロトコルに従って 5. 0 111孔径 T r a n s w e 1 1 i n s e r t (C o s t a r ) ¾■用いて？Tつ,こ。

亜鉛アツセィ

⁶⁵ Z n取り込みアツセィのために、細胞を 50% コンフルェントまで生育し、

37°Cで表示の時間 100 n g/m 1のヒト E G Fおよび特定の濃度の⁶⁵ Z n C l ₂ (O a k R i d g e N a t i o n a l L a b o r a t o r y) を含む D MEM中で培養し、 PB Sで 3回洗浄し、次いで回収した。細胞関連放射活性を、 P a c k a r d Au t o— G a mm a 5650 c o u n t e rで'濱定した。亜鉛おょぴ他の金属の塩化物塩（C a C 1₂、 C d C 1₂、 C o C 1₂、 C u C 1 ₂、 F e C 1₂、 Hg C 1₂、 Mg C 1₂、 Mn C 1₂、および N i C 1₂) の保存液を、 5- /zMの濃度で培養培地に添加した。各 CPMを、細胞数で基準化した。細胞内亜鉛の分布を可視化するために、観察の 30分前に Z nAF— 2 DM (D a i i c h i P u r e Ch em i c a l s) を最終濃度 5 μ Μで培地に添加するこ. とにより、細胞をロードした。蛍光像を、 F I TCフィルターセットを用いて得た。

(結果）

原腸形成、創傷治癒、および癌の進行における EMTの間、 SNA I L 1転写因子は、上皮系遺伝子 E—力ドへリンの転写抑制に関与し、ゆえにこの細胞間接着分子のレベルを低下させ、細胞がその隣接細胞から剥離し遊走することが可能となる (Batlle, E. et al. , Nat Cell Biol, 2, 84 - 9 (2000) ； Cano, A. et al. , Nat Cell Biol, 2, 76-83 (2000) ； Thiery, J. P. & Sleeman, J. P., Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 131-42 (2006))。多くの細胞系において E—力ドヘリンと S N A I L 1 mRNAレベルの間には考慮すべき逆の相関があるのだが、時として、 E 一力ドヘリンおよび SNA I LI mRNAは、同じ系で発現している（Dominguez, D. et al., Mol Cell Biol, 23, 5078—89 (2003))。ここで、ヒトケラチノサイト系 Ha C a T (Boukamp, P. et al. J Cell Biol 106, 761-71 (1988)) が SNA I L Iを発現しており、 E—力ドヘリンの高い発現レベルを示したが、間葉系遺伝子ビメンチンは検出不可能であり、この系の上皮様形態を反映している（図 3 aおよび 3 b ； D I C) ということを発見した。 EGFに応答して、 Ha C a T 細胞は、 E—カドヘリンをダウンレギュレートし、ビメンチンをアップレギユレートし、および SNA I L 1の発現を上昇させることなしに間葉様の表現型をとり（図 3 aおよび 3 b ； D I C)、 EGFが SNA I L 1タンパク質の活性を翻訳後に調節することを示唆している。 S n a i 1 1の活性はその細胞内配置に制御されているので（Dominguez, D. et al. , Mol Cell Biol, 23, 5078-89 (2003))、 Ha C a T細胞における SNA I L 1の細胞内局在に対する E G Fの効果を調べた（図 3 b)。 EGF刺激無しで、細胞系の上皮様の形態と一致して、 SNA I L 1は細胞質に局在していた。それに対して、 EGFは SNA I L 1の核内蓄積おょぴ細胞の間葉様の形態の採択を誘発した。これらのデータは、 Ha C a T細胞における SNA I L 1の活性は、その細胞内配置により制御されており、それは細胞外刺激に応答して決定するいうことを示唆した。 . マウスケラチノサイトによる EG F依存性創傷治癒において、 S t a t 3は、これらの細胞の増殖ではなく遊走に必要なシグナルを伝達する（Sano, S. etal., Embo J, 18, 4657-68 (1999))。さらに、 S t a t 3シグナリングは、亜鉛ト'ランスポーター L i V 1/Z i p 6を介して S n a i 1 1の核局在を制御し、ゼブラフィッシュの原腸形成の間に能動的に遊走するオーガナイザー細胞の EMTを誘導する（Yamashita, S. et al. , Nature, 429, 298 - 302 (2004))。これらの事実は、 SNA I L 1の細胞内局在の亜鉛トランスポーター依存性調節は、哺乳類のケラチノサイトによる創傷治癒の EMTにおいて役割を果たし得るということを暗示している。この考えを検証するために、細胞質への亜鉛流入において機能すると考えられている Z I P類（Z I P 1— 14) (Eide, D. J. , Pf lugers Arch, 447, 796-800 (2004)) および細胞質からの亜鉛流出を媒介する Z N T類（ZNT 1— 8) (Palmiter, R. D. & Huang, L. , Pf lugers Arch, 447, 744-51 (2004)) の発現を検討するために、 EGF刺激 Ha C a T細胞を用いた（図 3 c)。亜鉛トランスポーターの Z I Pファミリ一の最も密接に関連したメンバーである（それらのアミノ酸配列に基づく系統樹解析におけるそれらの近接を参照；図 3 c) Z I P 6および Z I P 10の発現は、 EG F刺激に応答して H a C a T細胞においてァップレギュレートされた。これらの結果は、 Z I P 6および Z I P 10は、 Ha C a T細胞による創傷治癒の EGF誘導 EMTにおいて、 SNA I L 1の核局在に機能し得るという考えを支持した。したがって、ヒト Z I P 6および Z I P 1 0に対する s i RNAを用いて、 Z I P 6および Z I P 1 0ノックダウン H a C a T細胞を産生した（図 4 a)。これらの細胞を用いて、インビトロ創傷治癒アツセィを行い、 EGF刺激下で SNA I L 1の細胞内局在を解析した（図 4 c：)。 Z I P 10ノックダウン Ha C a T細胞による E G F誘導インビトロ創傷治癒は、著しく障害され（図 4 c ； Z I P 10および Z I P 6 ； Z I P 10)、一方、コントロールの Ha C a T細胞は正常に遊走し、創傷は E G F刺激後完全に治癒した (図 4 c ；コントロール）。 Z I Ρ 6ノックダウン H a C a T細胞を用いると、遊走性細胞の先端でいくばくかの乱があったものの、創傷は EGF刺激後に治癒. した（図 4 c ； Z I Ρ 6)。これに一致し、 H a C a T細胞における Z I P 10のノックダウンは、 SNA I L 1の EG F誘導核内蓄積を強力に減少させた（図 4 c ； Z I P 10および Z I P 6 ； Z I P 1 0)。これらの結果は、 Z I P 10は、 H a C a T細胞による創傷治癒の EG F誘導 EMTの間の SNA I L 1の核内蓄積において、必須の機能を有することを示した。さらに、今回の結果は、 SNA I L 1の核局在の Z I P媒介調節は、ゼブラフィッシュ原腸形成だけでなくヒトケラチノサイトによる成長因子媒介創傷治癒にも含まれることを示し、 EMTの一般的メカニズムであることを示唆している。

一旦上記結果が得られたら、まだ答えが得られていない最も重要な疑問は、膜分子である Z I Pがどのように SNA I L 1の核局^ Ϊを調節するのか、そして亜鉛がこの過程に含まれるのか否かということである。これらの疑問に答えるために、まず⁶⁵ Z n取り込みアツセィを用いて Ha C a T細胞における亜鉛代謝を解析した。 EGF刺激 H a C a Τ細胞は、一連のアツセィの間、休止 Ha C a T細胞よりも有意に多くの⁶⁵ Z nを取り込んだ（図 3 d)。 EGF誘導⁶⁵ Z n取り込みは、他の金属ではなく過剰の非放射性亜鉛により阻害され（図 3 c：)、 EGFが Ha C a T細胞による亜鉛の取り込みを特異的に誘導することを示している。重要なことに、低レベルの亜鉛取り込みのみが、 Z I P 10ノックダウン H a C a T細胞において検出された（図 4 b'：)。 Z I Ρファミリーメンバーが細胞質への亜鉛流入を媒介していることを考慮すると（Eide， D. J., Pflugers Arch, 447, 796-800 (2004))、これらの結果は、 H a C a T細胞による E G F誘導亜鉛取り込みは Z I P 10に依存しているということを明確に示している。さらに、 EGF 刺激 Ha C a T細胞における SNA I Lの核内蓄積での Z I P 10の必須な役割と併せると、これらの結果は、細胞外刺激に応答しての SNA I Lの核内蓄積は、少なくともある程度、 Z I P類により能動的に輸送された亜鉛に依存しているということを強く示唆した。

Z I P類を介した亜鉛の EG F媒介取り込みが、 Ha C a T細胞における SN A I Lの細胞内局在を制御する否かを検討するために、次に、蛍光亜鉛指示薬 Z n AF- 2 (Hirano, T. , Kikuchi, Κ.， Urano, Y. , T, H. & Nagano, Τ.， J Am Chera Soc, 122， 12399-400 (2000)) を用いて、細胞内における亜鉛の細胞内分布を解析した（図 3 f および 3 c：)。 Z nAF— 2は、亜鉛に極めて特異的であり；亜鉛金属タンパク質と三元複合体を形成すると考えられており、そこで亜鉛は媒介物として作用し；この複合体の形成がこれらのタンパク質の細胞内分布の直接評価を可能とする (Kay, A. R. & Toth, K. , J Neurophysiol, 95, 1949-56 (2006) )₀ 上皮様の形態おょぴ SNA I Lの細胞質内分布を有する休止 H a C a T細胞において、亜鉛は一様に分布していた。 EGF刺激後、細胞内タンパク質に結合した亜鉛の量は増加し、亜鉛は Ha C a T細胞の核内に蓄積し（図 3 f )、 SNA I L 1の核局在と相関していた。この再分布は、 SNA I L 1の EG F誘導核内蓄積が消滅している Z I P 1 0ノックダウン H a C a T細胞では観察されなかった (図 4 c ； Z I Ρ 10および Z I Ρ 6 ； Z I Ρ 10)。 £0 刺激^1 a C a T細胞における亜鉛および SNA I L 1の Z I P 10依存性核共局在は、亜鉛が SNA I L 1の核局在に含まれ得ることを示唆した。実際、膜透過性亜鉛キレーター N， Ν,Ν' ,Ν，ーテトラキス（2—ピリジルメチル）エチレンジァミン（ΤΡΕΝ) を用いた細胞の細胞内亜鉛枯渴は、 EG F誘導 SNA I L 1核内蓄積を消滅させ、それらによる創傷治癒を障害した（図 4 bおよび 4 c ； TPEN + )₀

マウス S n a i 1 1の C末端半分は、 4つの C 2 H 2型 Z nフィンガードメィンを含み、 S n a i l 1の核局在に必須である（Dorainguez, D. et al. , Mol Cell Biol, 23, 5078-89 (2003))。この点に対する全ての結果は、 Z I P類を介した E GF誘導亜鉛取り込みは、 SNA I L 1の Z nフィンガードメインとの相互作用を介して SNA I L 1の核局在を調節することを示唆している。この仮説を検証するために、マウス S n a i 1 1の 4つの Z nフィンガードメイン全てに C 2 H 2/G 2G 2変異を導入し（図 5 c ； 1 234)、その亜鉛結合活性を消滅させた (Nomura, A. & Sugiura, Υ·， Inorg Chem, 41, 3693-8 (2002))。次いで、 EG F刺激 H a C a T細胞における S n a i l 1.の細胞内局在を検討した（図 5 aおょぴ 5 d)。核内蓄積に対する S a i 1 1の亜鉛（図 5 aおよび 5 d ;TPEN). およびそれ自身の C末端半分（図 5 aおよび 5 d ； Δ C) の要求と一致して、 1 2 34変異体は細胞質内に配置しており、核内には配置しておらず（図 5 aおよび 5 d ; 1 2 34)、 S n a i l 1の C末端半分での亜鉛配位が S n a i l 1の核內蓄積に重要であることを示している。

S n a i l 1の核局在に関与する部位をさらに限定するために、 1、 2または 3つの Z nフィンガーにおける C 2 H 2/G 2 G 2変異を施した一連のコンストラタトを調製し（図 5 c)、 EGF刺激 Ha C a T細胞における変異体の細胞内配置を解析した。第 1番目、第 2番目、または第 4番目の Z nフィンガードメイン (図 5 c ； 1、 2、または 4) でなく、第 3番目の Z nフィンガードメインにおける単独の C 2 H 2/G 2 G 2変異（図 5 c ； 3) 力 EGF刺激 Ha C a T細胞における S n a i 1 1の核局在を阻害した（図 5 aおよび 5 d)。さらに、変異した第 3番目の Z nフィンガードメインを含む C 2H2/G 2 G 2変異の任意の組合せ（図 5 a、 5 cおよぴ 5 d ; 1 3、 2 3、 3 4、 1 2 3、 1 34、または 2 34) は、 EGF刺激 Ha C a T細胞における変異体の核内蓄積を消滅させ、 S n a i 1 1の第 3番目の Z nフィンガードメインの亜鉛配位能力が、 S n a i 1 1の核内蓄積に必須であることを示している。相互に、第 3番目を除く任意の Z nフィンガードメインにおけるどの C 2 H2/G 2 G 2変異の組合せも（図 5 a、 5 cおよび 5 d ; l、 2、 4、 1 2、 1 4、 24、または 1 24) 変異体の核への局在を混乱しなかった。何よりも、変異体 1 24の核局在（図 5 a、 5 c および 5 d ; 1 24) は、 S n a i l lの第 3番目の Z nブインガードメインによる亜鉛の配位が、 E G F刺激 H a C a T細胞における S n a i 1 1の核局在に必要十分であるということを明確に立証した。最後に、核外輸送受容体 CRM 1 (Fukuda, M. et al. , Nature, 390, 308 - 11 (1997) ； Xu, L. & Massague, J.， Nat Rev Mol Cell Biol, 5， 209-19 (2004)) の特異的阻害剤であるレプトマイシン B の存在下において（図 5 bおよび 5 e ； LMB)、変異体の第 3番目の Z nフィンガードメインを保有しているコンストラクト（図 5 b、 5 cおよび 5 e ; 3、 1 3、 2 3、 34、 1 2 3、 1 34、 2 34、または 1 2 3 4) でさえ、核に局在. ィ匕し、第 3番目の Z nフィンガーは S n a i 1 1の核内係留に必須だけれども、 S n a i l 1の核への転位には含まれていないということを示している。

ヒトケラチノサイトによる創傷治癒の EMTの亜鉛依存性調節が、癌の進行においても起るか否かを検討するために、 He L a、 MD A— MB— 23 1、および MDA— MB— 43 5 S細胞を含む様々な浸潤性おょぴ転移性癌細胞系、ならぴに MCF 7、 T47D、 ZR 75— 1、および Z R 75— 30細胞のような非転移性細胞系における Z I P 1 0および Z I P 6の発現を解析した。ケラチノサイトにおける観察と一致して、 Z I P 10のアップレギュレーションは、 E—力ドヘリンのダウンレギュレーションおよぴビメンチンのァップレギュレーションと相関していた、しかしながら Z I P 6の発現は間葉様の表現型と関連していなかった（図 6 a)。これらの結果は、 Z I P 6の発現レベルは乳癌における悪性細胞の表現型と関連しないという以前の所見（Kasper, G. et al. , Int J Cancer, 117, 961-73 (2005)) と一致し、 Z I P 10は、癌の進行における EMTの亜鉛依存性調節における主要な Z I Pであるということを示唆している。

従って、次に He L a細胞における細胞遊走での、 2 1 ? 10ぉょぴ2 1 6 の役割を検討した（図 6 b)。コントロールの H e L a細胞は高い遊走活性を示しており、 Z I P 6ではなく Z I P 1 0の枯渴がそれを阻害した。これらの結果は、 Z I P 1 0が生理学的だけでなく病理学的状態においても EMTを調節していることを示しており、あるヒト癌においては亜鉛が EMTに欠かせないことを示唆した。実際、 TPENによる細胞内亜鉛の枯渴は、 He L a細胞の遊走を阻害し (図 6 b ； TPEN)、明らかに癌の進行に亜鉛が関与している。

本結果は、亜鉛がィンビトロでの創傷治癒およびィンビトロおよびインビポでの癌の進行の間の EMTのレギュレーターであることを確立し、亜鉛が亜鉛トランスポーターを介して細胞外刺激を亜鉛金属タンパク質に変換するセカンドメッセンジャーとして作用し得ることを示唆した。亜鉛は、 Z I P類により能動的に輸送されそして SNA I L 1の Z nフィンガードメインで配位され、その核外輸送を妨げ、そして核における SNA I L 1のレベルの増加につながり、ゆえに E MTの誘導を可能にしている。これらの結果は、亜鉛トランスポーター Z I P依存性シダナリングの分子的な説明おょぴ E G F刺激により誘導された Z nフィンガータンパク質 SNA I Lの核内蓄積におけるその関連性、並びに他の亜鉛金属タンパク質により用いられる細胞内亜鉛シグナリングを理解するための概念的基礎を提供する。産業上の利用可能性 .

亜鉛ィオンや亜鉛ィオンキレーターを用いたり、亜鉛トランスポーターの発現や機能を調節したりすることで細胞内亜鉛量を制御することによって、 EMTのマスターレギュレーターである S n a i 1の細胞内局在と活性が制御でき、それによって、 EMTを制御することが可能となる。 EMT制御が可能な本発明の薬剤は、癌転移の予防や、創傷治癒並びに器官形成の促進に有用である。

本出願は、日本で出願された特願 2005- 141684 (出願日： 2005 年 5月 13日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

I. 細胞内亜鉛量を制御し得る物質を有効成分として含有する、上皮—間葉転換制御剤。

2.細胞内亜鉛量を制御し得る物質が亜鉛イオンである、請求の範囲 1記載の剤。

3. 亜鉛イオンが亜鉛ィオノフォアによって細胞内に導入される、請求の範囲 2 記載の剤。

4. 細胞内亜鉛量を制御し得る物質が亜鉛キレーターである、請求の範囲 1記載の剤。

5. 亜鉛キレーターが 2， 3—ジメルカプト一 1—プロパンスルホン酸（DMP

S)、 Ν， Ν， Ν', Ν，ーテトラキス（2—ピリジルメチル）エチレンジァミン (ΤΡΕΝ)、エチレンジァミン（EDTA) 及び Ν— (6—メトキシ一 8—キノリル）一； ρ—トルエンスルホンアミド（TSQ) からなる群より選択される少なくとも 1種である、請求の範囲 4記載の剤。

6. 細胞内亜鉛量を制御し得る物質が、亜鉛トランスポーターの発現及び Ζ又は機能を制御する物質である、請求の範囲 1記載の剤。

7. 亜鉛トランスポーターが L I Vファミリーを含むヒト Z I Ρ類、ヒト CDF 類からなる群より選択される少なくとも 1種である、請求の範囲 6記載の剤。

8. 亜鉛トランスポーターが L I V 1である、請求の範囲 6記載の剤。

9. 亜鉛トランスポーターが Z I Ρ 10である、請求の範囲 6記載の剤。

10. S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質を含む上皮一間葉転換制御剤。

I I. S n a i l活性制御剤である、請求の範囲 1〜 10のいずれか 1項に記載の剤。

1 2. 癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬からなる群より選ばれる少なくとも 1種の医薬である、請の範囲 1〜10のいずれか 1項に記載の剤。 .

1 3. 癌転移予防薬、創傷治癒薬及び器官形成促進薬からなる群より選ばれる少なくとも 1種の医薬である、請求の範囲 1 1記載の剤。

14. 細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z n フィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質を有効成分として含有する、癌転移予防薬。

1 5. 細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質 Xは S n a i 1分子内の第 3番目の Z n フィンガードメインと亜鉛との結合を促進し得る物質を有効成分として含有する、創傷治癒薬及びノ又は器官形成促進薬。

1 6. インビトロで、細胞内亜鉛量を制御することを含む、上皮一間葉転換を制御する方法。

1 7. インビトロで、細胞内亜鉛量を制御することを含む、 S n a i 1活性を制御する方法。

18. 細胞内亜鉛量を測定することを含む、上皮一間葉転換制御作用を有する化合物及びノ又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物のスクリ一ユング方法。

1 9. 以下の工程を含む、上皮—間葉転換制御作用を有する化合物及び又は S n a i l活性制御作用を有する化合物のスクリーニング方法：

(2) Z nフィンガードメインと亜鉛との結合の程度を測定する工程、及び

(3) Z nフィンガードメインと亜鉛との結合に有意に影響を与える物質を、上皮—間葉転換制御作用を有する化合物及ぴ又は S n a i 1活性制御作用を有する化合物と認定する工程。

20. 細胞内亜鉛量を制御し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における上皮一間葉転換の制御方法。

21. S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における上皮一間葉転換の制御方法。， .

22. 細胞内亜鉛量を制御し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における S n a i l活性の制御方法。

2 3 . 細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z n フィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における癌転移の予防方法。

2 4 . 細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z n フィンガードメインと亜鉛との結合を促進し得る物質の有効量を被験体に投与することを含む、該被験体における創傷治癒及ぴ又は器官形成促進方法。

2 5 . 上皮一間葉転換制御剤の製造における細胞内亜鉛量を制御し得る物質の使用。

2 6 . 上皮—間葉転換制御剤の製造における S n a i 1分子内の第 3番目の Z n フィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質の使用。

2 7 . S n a i 1活性制御剤の製造における細胞内亜鉛量を制御し得る物質の使用。

2 8 . 癌転移予防薬の製造における細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質の使用。

2 9 . 創傷治癒薬及び又は器官形成促進薬の製造における細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z nブインガードメインと亜鉛との結合を促進し得る物質の使用。

3 0 . 細胞内亜鉛量を制御し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を上皮一間葉転換の制御に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。

3 1 . S n a i 1分子内の第 3番目の Z nフィンガードメインと亜鉛との結合を制御し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を上皮一間葉転換の制御に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的ノッケージ。， .

3 2 . 細胞内亜鉛量を制御し得る物質を有効成分とレて含有する医薬、ならびに当該医薬を S n a i 1活性の制御に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。

3 3 . 細胞内亜鉛量を低下させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z n フィンガードメインと亜鉛との結合を抑制し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を癌転移の予防に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。

3 4 . 細胞内亜鉛量を上昇させ得る物質又は S n a i 1分子内の第 3番目の Z n フィンガードメインと亜鉛との結合を促進し得る物質を有効成分として含有する医薬、ならびに当該医薬を創傷治癒及び Z又は器官形成促進に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。