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WO2004074480A1 - 変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 - Google Patents

変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 Download PDF

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Publication number
WO2004074480A1
WO2004074480A1 PCT/JP2004/002007 JP2004002007W WO2004074480A1 WO 2004074480 A1 WO2004074480 A1 WO 2004074480A1 JP 2004002007 W JP2004002007 W JP 2004002007W WO 2004074480 A1 WO2004074480 A1 WO 2004074480A1
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WO
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oligonucleotide
probe
self
signal amplification
assembly
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/002007
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mitsugu Usui
Toshihiko Fujikawa
Original Assignee
Eisai Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai Co., Ltd. filed Critical Eisai Co., Ltd.
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Priority to JP2005502795A priority patent/JP4255472B2/ja
Priority to EP04713241A priority patent/EP1595953B1/en
Priority to AT04713241T priority patent/ATE552339T1/de
Priority to CA2516360A priority patent/CA2516360C/en
Publication of WO2004074480A1 publication Critical patent/WO2004074480A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the self-assembly reaction first, using a pair of oligonucleotide probes (referred to as HCP in the present invention) in which mutually complementary parts are composed of n (n ⁇ 3) force points, The oligonucleotides are self-assembled by hybridization so that they intersect alternately, and the double-stranded self A self-assembly reaction for forming an aggregate can be used.
  • HCP oligonucleotide probes
  • n n ⁇ 3 force points
  • Each oligonucleotide of the pair of oligonucleotides No. 3 and No. 4 is divided into two regions, a 3'-side region and a 5'-side region, and the 3, 3 and 5'-side regions of each oligonucleotide are divided into two regions.
  • a second system including a plurality of pairs of cross-linking probes each having a non-complementary base sequence, and cross-linking the cross-linking probe with a dimer formed from the dimer-forming probe.
  • a self-assembly reaction that allows the oligonucleotide to self-assemble to form a double-stranded self-assembly by hybridizing the probe with a base sequence that allows for the formation of a double-stranded self-assembly can be used.
  • the pair of dimer-forming probes and the pair of cross-linking probes are used so that any one of the probes, more preferably, one of the pair of dimer-forming probes can be used as the first probe. It is preferable to configure.
  • the nucleotide sequence of the above-described probe is determined by combining the No. 1—oligonucleotide 3 ′ side region of the first system, the No. 3—oligonucleotide 3 ′ side region of the second system, and the No. 1 2—The 5 'region of the oligonucleotide and the No. 4-oligonucleotide of the second system; the 5' region of the oligonucleotide, the 3 'region of the No. 4_oligonucleotide of the second system
  • the N 0.2 of the first system the 3 ′ region of the oligonucleotide, the No. of the second system; the 3—5 ′ region of the oligonucleotide and the No. 1
  • the 5'-side region of one oligonucleotide can be a complementary base sequence.
  • a single-stranded DNA or a double-stranded DNA can be used as the overnight get DNA.
  • single-stranded DNA is directly used as the target DNA, but double-stranded DNA can also be used by dissociating the double-stranded DNA.
  • DNA that has been amplified using a gene amplification method that converts the DNA into a type II for example, the ⁇ 1 ⁇ 1 method.
  • DNA amplified using a gene amplification method for example, RT-PCR method or the like
  • RNA as a type II can be used, and is included in the present invention. It is what is done.
  • the presence of the self-assembly can be detected by hybridizing the above-mentioned self-assembly with a labeled probe previously labeled with a chromogenic enzyme, a luminescent enzyme, or a radioisotope.
  • a fluorescent substance having the property of binding to nucleic acid is added to the self-assembly, and the presence of the self-assembly can be detected by a photochemical change of the fluorescent substance.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the principle of step 110 in the first example of the process order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing, in principle, step 1 16 in the first example of the process order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic view showing, in principle, Steps 126 in a second example of the signal amplification method of the present invention in order of steps.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing, in principle, step 200 in the reference example in which the mutation site of the evening get DNA is not complementary to the end of the capture probe.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing in principle Step 202 in the reference example when the mutation site of the target DNA is not complementary to the end of the capture probe.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing in principle Step 204 in the reference example in the case where the mutation site of the target DNA is not complementary to the end of the capture probe.
  • FIG. 13 is a schematic view showing in principle the step 1336 in the third example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing in principle the step 152 in the fifth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 19 is a schematic diagram showing in principle the step 154 in the fifth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 22 is a schematic diagram showing in principle the step 162 in the sixth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 23 is a schematic diagram showing, in principle, step 163 in the sixth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 24 is a schematic diagram showing, in principle, step 164 in the sixth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 25 is a schematic view showing in principle the step 165 in the sixth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 26 is a schematic diagram showing in principle the step 166 in the sixth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • FIG. 27 is a photograph showing the result of Example 1.
  • FIG. 28 is a photograph showing the result of Example 2.
  • the pair of HCPs (16a, 18a) are labeled with a fluorescent substance (22) in advance as shown in FIG. — 1 (16a) has a region complementary to the evening get DNA (10a), and hybridizes to the evening get DNA (10a) adjacent to the capture probe (12a). Is configured.
  • FIG. 5 shows a state in which the target DNA (10a) is dissociated, and the capture probe (12a) to which HCP-1 (16a) is linked is bound to the support (14).
  • a pair of HCPs (16a, 18a) are added to form a self-assembly (20a) by a self-assembly reaction, thereby amplifying the signal (step). 1 1 6).
  • FIG. 7 and FIG. 8 are schematic diagrams showing, in principle, a second example of the order of steps of the signal amplification method of the present invention.
  • the second example is a signal amplification method using the PAL SAR method using a pair of HCPs (16a, 18a), and a region complementary to the evening get DNA (10a).
  • An example is shown in which a pair of HCPs (16a, 18a), which are not labeled with the fluorescent substance (22), are used.
  • step 120 After ligation reaction, the capture probe (12a) and the HCP-1 (16a) are ligated, and the target DNA (10a) is removed (step 120). A pair of HCPs (16a, 18a) are added to form a self-assembly (20b) by a self-assembly reaction (steps 122), and as shown in Fig. 7, The intercalation overnight (24) is inserted into the self-assembly (20b) (step 124), and the signal can be amplified as shown in Fig. 8 (step 126). Step 122 and step 124 can be performed simultaneously.
  • the ligation reaction When the target DNA (10b) is dissociated (step 206) as shown in Fig. 12 (step 204), only the capture probe (12a) is bound to the support (14). Then, the self-assembly (20a) formed by adding a pair of HCPs (16a, 18a) does not bind to the capture probe (12a) and is removed by washing or the like. Therefore, no signal amplification is performed.
  • FIG. 13 and FIG. 14 are schematic diagrams which basically show a third example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • the third example shows a case where the mutant site (11a) of the evening-get DNA (10a) is complementary to the end (13a) of the capture probe (12a).
  • one of the oligonucleotide probes forming the self-assembly was the same as the first probe.However, it is not necessarily required that the first probe and the oligonucleotide probe be the same. Probes that are configured so that at least one of them can be bound can be used.
  • the capture probe previously bound to the support was used.
  • the step of binding the capture probe and the support may be any time up to the step of removing the target DNA.
  • there is no particular limitation For example, after binding of the capture probe and the target DNA, after the capture probe, the overnight get DNA, and the first probe are all bound, and after the ligation reaction.
  • the evening DNA (10 e, 10 f, and 10 g) and the first probe (34 e, 34 f, and 34 g) were combined with the capture probe (12 e , 1 2 f and 1 2 g) (Step 15 2). Even when the mutation site is not complemented, the binding is performed in the same manner except for the terminal portion. However, this figure shows only the case where the terminal portion is complementary.
  • the target DNA (10 e, 10 f, and 10 g) and the unreacted probe are removed after the ligation reaction (step 154).
  • a pair of HCPs (16e, 18e) can be added to form a self-assembly (20e) and amplify the signal (step 156).
  • the base at the end of the capture probe may be appropriately selected as necessary. It is not particularly limited.
  • FIG. 21 to FIG. 26 are schematic views showing in principle the sixth example of the step order of the signal amplification method of the present invention.
  • the sixth system is characterized in that the ligation reaction is performed at two sites, and the HCP-1 (16 h) and the capture probe (12 h) are linked to the first probe (34 h).
  • HC P-1 (16 h), the first probe (34 h), and the capture probe (12 h) are designed to be adjacent to each other.
  • both the second probe and the HCP—pair have the same gene type except that the tip region of the first probe is complementary to each target DNA.
  • a common oligonucleotide 'probe can be used. '
  • Figure 21 shows the first probe (34 h), the second probe (36), the target DNA (1 Oh), and the capture probe (12 h) immobilized on the support (14). ) (Step 160).
  • the first probe (34h) has a sequence complementary to the target DNA (10h) and has one sequence of HCP_1 (16h), and the second probe (36) — Has the same sequence as 2 (18 h) in two places.
  • the first probe (34h) hybridizes with both the second probe (36) and the target DNA (10h) (step 162).
  • HCP-1 (16 h) is heated and hybridized, and HCP-1 (16 h) and the second probe (36) are hybridized to form HCP-1 (16 h).
  • a radioisotope such as 125 I or 32 P
  • a luminescent substance such as digoxigenin, acridinium ester or Cy3
  • a dye having the property of binding By adding a dye having the property of binding to nucleic acids, it is also possible to detect overnight get DNA. As shown in FIGS. 8 and 16, it is preferable to detect the target DNA using a fluorescent substance having a property of binding to a nucleic acid such as an interlator.
  • the nucleic acid constituting the above-described oligonucleotide probe is usually composed of DNA or RNA, but may be a nucleic acid analog.
  • nucleic acid analogs for example, peptide nucleic acids (PNA, for example, International Patent Publication No. See fret. ) And Locked Nucleic Acid (LNA, for example, KoshkinAA et al. Tetrahedron 1998.54, 3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253., And Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97 , 5633-5638.).
  • PNA peptide nucleic acids
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • a pair of oligonucleotide probes is usually composed of the same kind of nucleic acid, but, for example, a DNA probe and an RNA probe may be paired. That is, the type of the nucleic acid of the probe can be selected from DNA, RNA, or a nucleic acid analog (for example, PNA or LNA). Also, the composition of nucleic acid in one probe does not need to be composed of only one kind of DNA, for example, only DNA. If necessary, use oligonucleotide probe composed of DNA and RNA (chimeric probe). It is also possible and included in the present invention.
  • any sample that may contain the nucleic acid can be used as the sample for measuring a target gene in the present invention.
  • the target gene may be appropriately prepared or isolated from a sample, and is not particularly limited. Examples include biological samples such as blood, serum, urine, feces, cerebrospinal fluid, tissue fluid, and cell culture. Samples containing or possibly containing viruses, bacteria, fungi, and the like. Also, a nucleic acid obtained by amplifying a target gene in a sample by a known method can be used.
  • the ⁇ corner at the tip indicates the 3 'end
  • the black dot at the beginning indicates the 5' end.
  • Capture probe Capture probe
  • 1st probe 1a 5, (phosphorylated) -CCAGGTGGAGCACCCAG CATA TGTAGCAGAGCGTAAGTCATGTCCACC-3 '(Alexa532 label)
  • Equal amounts of each capture probe (10 Opmo I / L) and a spotting solution (manufactured by MATSUNAM GLASS) were mixed to prepare four types of probe solutions.
  • the pins were washed with sterile water and cold ethanol and air-dried.
  • the slide glass after the sbot was placed in a wet box, shielded from light, and allowed to stand still.
  • Ligase used was thermostable ligase (Tth DNA ligase). Ligase (30 U) was added to a volume of 30 L using the buffer solution (buffer) attached to the ligase, and 25 ⁇ L of this solution was reacted in one chamber. The reaction conditions are 65. C 15 minutes.
  • the slide glass was lightly washed with 0.2 XSSC solution, and alkali-treated with 0.25 M NaOH solution for 10 minutes to remove unreacted and excess probes. . Also, 0.
  • the plate was washed twice with an SDS solution, once with a 1 ⁇ SSC solution, and once with a 0.2 ⁇ SSC solution, and air-dried.
  • HCP-1-1 and HCP-1-2 each having a Cy 3 label at the 5 'end were added to a final concentration of 1 pmo1 / aL.
  • 95 5 ° 25 L of this solution thermally dissociated in 2 minutes is reacted at 68 ° C for 2 hours in a chamber on a slide glass that has been washed and air-dried after alkali denaturation.
  • slides were washed twice with 2XSSC + 0.1% SDS solution, once with 1XSSC solution, 0.2X It was washed once with an SSC solution, air-dried, and the fluorescence of Cy3 on the slide glass was observed with a fluorescence microscope. The results are shown in FIG.
  • the signal was amplified only when the mutation site in the target gene was complementary to the capture probe.
  • CP-2 -C 5, (amino group) -GCGCGGACATGGAGGACGTGC-3 'CP-3-C: 5, (amino group) -ATGCCGATGACCTGCAGAAG -3' CP-3 -T: 5 '(amino group) -ATGCCGATGACCTGCAGAAGT-3 'CP-4-G: 5, (amino group)-CTTGAATTCCAAGAGCACACCi-3' CP-4-A: 5 '(amino group) -CTTGAATTCCAAGAGCACACA-3' CP-5-C: 5 '(amino group) -GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC- 3 'CP _ 5— T: 5' (amino group) -GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGT-3 'CP— 6— A: 5, (amino group) -TGCTGGCTGAAATGGCAATGA-3' CP— 6— G: 5 '(amino group) -TGCTGG
  • Target gene—3 (complementary to the 3′-side region C P—3—T):

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Abstract

ＰＡＬＳＡＲ法によりＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにＰＡＬＳＡＲ法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供する。ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、ＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させるようにした。

Description

明 細 書 変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 ， 技術分野
本発明は、ライゲーション反応及び自己集合体を形成する自己集合反応を 用いて、 DNAチップ、 DNAマイクロアレイ、 マイクロウェル又は球状ビ —ズ (本発明では、 DNAチップ、 DN Aマイクロアレイ、 マイクロウェル 又は球状ビーズを DN Aチップと総称する。） の変異遺伝子の検出感度を向 上させることができるシグナル増幅方法に関する。 背景技術
従来の遣伝子変異検出は、オリゴヌクレオチド同士を夕一ゲットに結合さ せ DNAリガ一ゼを用いて連結させる OLA ( Oligonucleotide Ligation Assay)法（例えば..米国特許第 4, 9 8 8 , 6 1 7号明細書及び D. Nickerson. Proc Natl. Acad. ScL, vol.87, pp.8923-8927 (1990). 参照。）、 標識した d d N T P を用い一塩基伸長させる T D I ( Template-directed dye- terminator incorporation) 法 (例 J¾、 Chen A et al" Nucleic Acias Research, vol.25, No.2, pp.347-353 (1997). 参照。）、 インベーダー法 （例 えば、 米国特許第 5, 9 8 5, 5 5 7号明細書参照） 等、 様々な方法を利用 しているが、 上記の方法は、 マルチプレックスやコスト、 汎用性などに課題 を持つ。
また、表面を特殊加工したスライドガラスなどの支持体に多数の D N Aプ ローブを高密度に固定し、標識したターゲットもしくはシグナル検出用プロ —ブをハイプリダイゼーシヨンさせシグナルを検出する技術は、従来から用 いられてきたサザンプロット法と比較して、感度が十分の一と低く（例えば、 村松正明ら、 「DNAマイクロアレイと最新 P CR法」 秀潤社、 85-86，2000. 参照。）、 反応時間が長いという課題があった。
上記の問題を鑑み、本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法 を報告した （例えば、 特許第 3267 576号公報参照。）。 こ-の方法は、 3 箇所の領域から構成される一対のオリゴヌクレオチド（HoneyComb Probe、 以下、 HCPと称する。） を用いる方法であり、 第一 HCPと第二 HCPの 各々の 3箇所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場 合、領域の 1箇所のみとハイプリダイズする様に塩基配列を工夫したもので ある。 この工夫により、 一対の HC Pを反応させた場合、 互いにハイブリダ ィズし、 HCPの自己集合反応により集合体を形成させることができる （以 下、 この自己集合反応による集合体の形成法を P A L S A R法と称する。）。 発明の開示
上記した従来技術の現状に鑑み、 本発明者らは、 上記した P AL S AR法 を用いて、 変異遺伝子の検出感度を高くすべく、 鋭意研究を重ねた結果、 本 発明に到達したものである。
本発明は、 P AL S AR法により DNAチップにおける変異遺伝子の検出 感度を向上させ、 効率よくシグナルの増幅を確立させ、 さらに PAL S AR 法に用いるオリゴヌクレオチド*プローブのデザインを工夫することにより 簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のための シグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記問題を解決するため、本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅 方法の第 1の態様は、 DNAリガーゼを用いたライゲーシヨン反応と、 オリ ゴヌクレオチドのニ本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する 自己集合反応とを有し、 DN Aチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上 させるものである。 本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 2の態様は、捕捉 用プローブと第 1プローブを夕一ゲット D N Aにハイプリダイズさせる第 1工程、 夕ーゲット D N Aの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、 D N Aリガーゼを用いたライゲーシヨン反応により前記捕捉用プローブと 前記第 1プローブを連結させる第 2工程、前記夕ーゲット D N Aを除去させ る第 3工程、 及び複数のオリゴヌクレオチド ·プローブを添加し、 該オリゴ ヌクレオチド ·プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、 シグ ナルを増幅させる第 4工程を有し、前記捕捉用プローブと前記第 1プローブ の塩基配列が、 前記第 1工程において、 前記捕捉用プローブの末端が前記夕 —ゲット D N Aの変異部位に位置し且つ該末端と前記第 1プローブが隣接 する状態でタ一ゲット D N Aとァニーリングするように構成されており、前 記複数のオリゴヌクレオチド 'プローブの少なくとも一つが前記第 1プロ一 プと相補的な領域を有することを特徴とする。上記シグナル増幅方法により、 D N Aチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることができる。上 記第 1工程において、捕捉用プローブと第 1プローブの夕ーゲット D N Aへ の結合は、捕捉用プローブと第 1プロ一プをターゲット D N Aに同時に結合 させても良く、 捕捉用プローブをターゲット D N Aに結合させた後、 第 1プ ローブと夕ーゲット D N Aを結合させても良く、第 1プローブを夕ーゲッ 1、 D N Aに結合させた後、捕捉用プローブとターゲット D N Aを結合させても 良く、 結合順序は特に限定されない。
上記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列を、 あらかじめ上記第 1プローブと相補的な配列にすることが好適である。
上記自己集合反応として、 第 1に、 互いに相補的な部分が n ( n≥ 3 ) 力 所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブ （本発明では、 H C Pと称する。） を用いて、 互い違いに交差するようにハイブリダィゼ一 ションさせることにより、 オリゴヌクレオチドが自己集合し、 二本鎖の自己 集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。一種類の変異遺 伝子を検出する場合、上記一対の H C Pの一方が上記第 1プローブとして用 いることができるように構成することが好ましい。
上記自己集合反応として、 第 2に、 N o . 1及び N o . 2の一対のオリゴ ヌクレオチドの各ォリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域、 中央領域、 及び 5 ' 側 領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的 な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、 3 '側領域及び 5 ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブ を複数対含む第 1の系と、
N o . 3及び N o . 4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチド を 3 ' 側領域及び 5 ' 側領域の 2つの領域に分け、 各ォリゴヌクレオチドの 3，側領域及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プ 口一ブを複数対含む第 2の系とを有し、該架橋プロ一ブを該ダイマ一形成用 プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該 プローブをハイプリダイゼ一シヨンさせることにより オリゴヌクレオチド が自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用できる。 上記一対のダイマー形成用プロ一ブ及び上記一対の架橋プローブを、該プロ —ブのいずれか一つ、より好ましくは一対のダイマー形成用プローブの一方 が上記第 1プローブとして用いることができるように構成することが好適 である。
上記プローブの塩基配列を、 第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、 第 1 の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の N o . 4 - オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域,、 第 2の系の N o . 4 _オリゴヌクレオチ ドの 3 ' 側領域と第 1の系の N 0 . 2—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、 第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 1の系の N o . 1一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とするこ とができる。
上記プローブの塩基配列を、第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N 0. 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、 第 1 の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の N o . 3— オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、 第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチ ドの 3， 側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、 第 1の系の N o. 1—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の No. 4一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とするこ とができる。
上記夕一ゲット DN Aに一本鎖の DN A又は二本鎖の DN Aを用いるこ とができる。上記シグナル増幅方法において、 直接ターゲット DNAとして 用いられるのは、 一本鎖の DNAであるが、 二本鎖を解離することにより、 二本鎖の DNAも使用することができる。例えば、 DNAを铸型にした遺伝 子増幅法 （例えば， ？じ尺法ゃ1^ 1 法等） を用いて増幅された DNAを使 用することが可能である。 また、 標的遺伝子が RN Aである場合、 RNAを 铸型にした遺伝子増幅法 （例えば、 RT— P CR法等） を用いて増幅された D N Aを使用することも可能であり、 本発明に含まれるものである。
上記 DN Aチップが、夕一ゲット DN Aを捕捉するための捕捉用プローブ を結合する支持体を有し、 該支持体として、 マイクロプレート型、 スライド グラス型、 微粒子型、 又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好 適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチ ックゃポリスチレン等を使用することができる。 また、 スライドグラス型の 支持体では、 ガラスやプラスチック等の素材を使用することができる。電気 伝導性の基板型の支持体には、 金電極や I TO電極 （indium oxide電極） などを使用することができる。 上記自己集合体に対して、 あらかじめ発色系酵素、 発光系酵素、 又はラジ オアイソトープ等で標識した標識プローブをハイブリダィゼーシヨンさせ て自己集合体の存在を検出することが可能である。
上記自己集合体に対して、 核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、 その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出するこ とが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するォリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識 し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出すること が可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するォリゴヌクレオチドをラジオアイソト —プで標識し、上記自己集合体の存在をラジオアイソト一プにより検出する ことが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は 発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化に より検出することが可能である。
上記オリゴヌクレオチドは-, D N A , R N A、 P N AまたはL N Aのぃず れかから選ばれる塩基から構成される。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1〜第 4の例におけるス テツプ 1 0 0を原理的に示す模式図である。
図 2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1〜第 4の例におけるス テツプ 1 0 2を原理的に示す模式図である。
図 3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 0を原理的に示す模式図である。
図 4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 2を原理的に示す模式図である。
図 5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 4を原理的に示す模式図である。
図 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステップ 1 1 6を原理的に示す模式図である。
図 7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステップ 1 2 4を原理的に示す模式図である。
図 8は、本発明のシグナル増幅方法のェ程順の第 2の例におけるステップ 1 2 6を原理的に示す模式図である。
図 9は、夕一ゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補して いない塲合の参考例におけるステップ 2 0 0を原理的に示す模式図である。 図 1 0は、ターゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補し ていない場合の参考例におけるステップ 2 0 2を原理的に示す模式図であ る。
図 1 1は、ターゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補し ていない場合の参考例におけるステップ 2 0 4を原理的に示す模式図であ る。
図 1 2は、ターゲット D N Aの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補し ていない場合の参考例におけるステップ 2 0 6を原理的に示す模式図であ る。
図 1 3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 3の例におけるステツ プ 1 3 6を原理的に示す模式図である。
図 1 4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 3の例におけるステツ プ 1 3 8を原理的に示す模式図である。
図 1 5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 4の例におけるステツ プ 1 4 6を原理的に示す模式図である。 図 1 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 4の例におけるステツ プ 1 4 8を原理的に示す模式図である。
図 1 7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツ プ 1 5 0を原理的に示す模式図である。
図 1 8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツ プ 1 5 2を原理的に示す模式図である。
図 1 9は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツ プ 1 5 4を原理的に示す模式図である。
図 2 0は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例におけるステツ プ 1 5 6を原理的に示す模式図である。
図 2 1は、本発明のシグナル増幅方法のェ程順の第 6の例におけるステツ プ 1 6 0を原理的に示す模式図である。
図 2 2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツ プ 1 6 2を原理的に示す模式図である。
図 2 3は..本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツ プ 1 6 3を原理的に示す模式図である。
図 2 4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツ プ 1 6 4を原理的に示す模式図である。
図 2 5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステッ プ 1 6 5を原理的に示す模式図である。
図 2 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例におけるステツ プ 1 6 6を原理的に示す模式図である。
図 2 7は、 実施例 1の結果を示す写真である。
図 2 8は、 実施例 2の結果を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態 以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実 施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り 種々の変形が可能であることはいうまでもない。
図 1〜図 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例を原理的に 示す模式図である。第 1の例は、ターゲット DNA (1 0 a)の変異部位（ 1 1 a) が捕捉用プローブ （12 a) の末端 （1 3 a) と相補している場合を 示す。 さらに、 第 1の例は、 互いに相補的な 3領域から構成され、 自ら自己 集合して集合体を形成することができる一対のオリゴヌクレオチド ·プロ一 ブ [即ち、 一対の HC P ； HC P— 1 (5'-Χ-Υ-Ζ-3') ( 1 6 a) 及び HC P - 2 (5'-Χ'-Υ'-Ζ'-3') (1 8 a)] を用いた PAL S AR法を利用したシグナ ル増幅方法であり、 該一対の H CP (1 6 a, 1 8 a) は、 図 3に示した如 く、 あらかじめ蛍光物質 （22) で標識されており、 HCP— 1 (1 6 a) は夕一ゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を持ち、 捕捉用プローブ （1 2 a) と隣接して夕ーゲット DNA (1 0 a) にハイプリダイズするように 構成されている。
図 1に示した如く、 支持体 ( 14) 上にターゲット DN A (1 0 a) に相 補的な領域を有し且つ該夕一ゲット DNA ( 1 0 a) の遺伝子変異部位 （ 1 1 a) が末端 （ 1 3 a) に位置する捕捉用プローブ （1 2 a) を結合させ、 ターゲット DN A (1 0 a) を加える (ステップ 1 00 )。 次に図 2に示し た如く、 ターゲット DNA ( 1 0 a) を捕捉した後 （ステップ 1 02)、 図 3に示した如く、 そのターゲット DN A ( 1 0 a) と相補的な領域を持ち、 自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質（22) で標識さ れた片方の HC P— 1 (1 6 a) を捕捉用プローブ （1 2 a) と隣り合った 形で結合させる （ステップ 1 1 0)。
タ一ゲット DNA (1 0 a) の変異部位 （1 1 a) と捕捉用プローブ （1 2 a) の末端 （ 1 3 a) とが相補されているため、 図 4に示した如く、 ライ ゲーション反応により、 捕捉用プローブ （1 2 a) と HCP— 1 (1 6 a) が連結される （ステップ 1 1 2)。 ライゲーシヨン反応後、 図 5に示すよう に、 ターゲット DN A ( 1 0 a) を除去する （ステップ 1 14)。 図 5は、 ターゲット DNA ( 1 0 a) を解離させ、 HCP— 1 (1 6 a) を連結させ た捕捉用プローブ （1 2 a) が支持体 （14) に結合している状態を示す。 図 6に示したごとく、 一対の HC P (1 6 a, 1 8 a) を加えて、 自己集 合反応により自己集合体 （20 a) を形成させ、 シグナルを増幅することが でさる (ステップ 1 1 6)。
図 7及び図 8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例を原理的 に示す模式図である。 第 2の例は、 一対の HC P ( 1 6 a, 1 8 a) を用い た PAL SAR法を利用したシグナル増幅方法であり、且つ夕一ゲット DN A (1 0 a) と相補的な領域を持ち、 蛍光物質 (22) で標識されていない 一対の HC P ( 1 6 a, 1 8 a) を用いる例を示す。
上記した第 1の例と同様にして、ステップ 1 00及びステップ 10 2を行 つた後. そのターゲット DNA ( 1 0 a) と相補的な領域を持ち、 自ら自己 集合して集合体を形成することができる片方の HCP— 1 ( 1 6 a) を捕捉 用プローブ （ 1 2 a) と隣り合った形で結合させる。
ライゲ一ション反応により、 捕捉用プローブ （1 2 a) と HCP— 1 (1 6 a) を連結させた後、 ターゲット DN A ( 1 0 a) を除去する (ステップ 1 20 )。 一対の HC P (1 6 a, 1 8 a) を加えて、 自己集合反応により 自己集合体 （20 b) を形成させた後 （ステップ 1 2 2)、 図 7に示したご とく、 形成された自己集合体（20 b) に対してインターカレ一夕一（24) を揷入し （ステップ 1 24)、 図 8に示した如く、 シグナルを増幅すること ができる （ステップ 1 26)。 なお、 ステップ 1 22とステップ 1 24を同 時に行うことも可能である。
図 9〜図 1 2は、 ターゲット DNA (1 0 b) の変異部位 （l i b) が捕 捉用プローブ （12 a) の末端 （1 3 a) と相補していない場合の参考例を 原理的に示す模式図である。図 9に示した如く、夕ーゲッ卜 DNA (1 0 b) を捕捉した後 （ステップ 20 0)、 図 1 0に示した如く、 その夕一ゲット D NA (1 0 b) と相補的な領域を持ち、 自ら自己集合して集合体を形成する ことができる蛍光物質 （22) で標識された片方の HC P— 1 (1 6 a) を 捕捉用プローブ（1 2 a) と隣り合った形で結合させる（ステップ 202)。 次に図 1 1に示した如く、 ターゲット DNA ( 1 0 b) の変異部位（l i b) と捕捉用プロ一ブ （ 1 2 a) の末端 （1 3 a) とが相補されないため、 ライ ゲーション反応が行われず (ステップ 204)、 図 1 2のようにターゲット DNA ( 1 0 b) を解離させると (ステツプ 206 )、 捕捉用プローブ （ 1 2 a) のみ支持体 ( 14) に結合した状態となり.，その後、 一対の HC P ( 1 6 a, 1 8 a) を加えることにより形成される自己集合体 ( 20 a) は、 捕 捉用プローブ (1 2 a) に結合せず、 洗浄等により除去されるため、 シグナ ル増幅は行われない。
図 1 3及び図 14は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 3の例を原 理的に示す模式図である。 第 3の例は夕ーゲット DNA ( 1 0 a) の変異部 位 （1 1 a) が捕捉用プローブ (1 2 a) の末端 ( 1 3 a) と相補している 場合を示す。 さらに、 第 3の例は、 自らダイマーを形成する一対のダイマ一 形成用プロ一ブ [ダイマー形成用プローブ一 1， 2 (5'-X-a_b-3'， 5'-d-a'-e_3，) ( 2 6, 28 )] 及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを 架橋することが可能な一対の架橋プローブ [架橋プローブ一 1 , 2 (5'-d，-b'-3'， 5'-X'-e'-3，） （ 3 0, 3 2)] を用いた P A L S A R法を利用し たシグナル増幅方法であり、 あらかじめ蛍光物質 （22) で標識された一対 のダイマー形成用プロ一ブ （ 26, 2 8 ) により形成されたダイマーを用い た場合の例を示す。 なお、 該ダイマー形成用プローブ— 1 (26) は、 夕一 ゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を持ち、 且つ捕捉用プローブ （1 2 a) と隣接してターゲット DNA (1 0 a) にハイブリダィズするように構 成されている。 .
上記した第 1の例と同様にして、ステップ 1 00及びステップ 1 02を行 つた後、 そのターゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を持ち、 蛍光物質 (22)で標識された一対のダイマー形成用プローブ一 1 , 2 ( 26, 28) より形成されたダイマ一を捕捉用プローブ（1 2 a) と隣り合った形で結合 させる （ステップ 1 30)。 次に、 ライゲ一シヨン反応により、 捕捉用プロ —ブ (1 2 a) とダイマ一形成用プロ一ブー 1 (26) を連結し (ステップ 1 3 2)、 ターゲット DNA (1 0 a) を解離させた後 (ステップ 1 34)、 図 1 3に示した如く、 ダイマー形成用プロ一ブー 1， 2 ( 2 6, 28) より 形成されたダイマー及び架橋プローブ一 1， 2 (30， 32) を添加し、 上 記プロ一ブ（26， 28， 30及び 32 ) をハイブリダイゼ一シヨンさせ（ス テツプ 1 36)、 図 14に示した如く、 ダイマ一形成用プロ一ブ （26, 2 8) と架橋プローブ （30， 32) の自己集合反応により自己集合体 （20 c ) を形成させ、 シグナル増幅させることができる （ステップ 1 38)。 図 1 5及び図 1 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 4の例を原 理的に示す模式図である。第 4の例は、 自らダイマーを形成する一対のダイ マー形成用プローブ [ダイマ一形成用プローブ— 1， 2 ( 26, 28)] 及 び該ダイマ一形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可 能な一対の架橋プローブ （ 30， 32) を用いた PAL SAR法を利用した シグナル増幅方法であり、一対のダイマー形成用プローブにより形成された ダイマ一を用いて、 ダイマ一形成用プロ一ブ （26, 28) 及び架橋プロ一 ブ （ 30, 32) を標識しない場合の例である。
上記した第 1の例と同様にして、ステップ 100及びステップ 1 02を行 つた後、 そのターゲット DNA (1 0 a) と相補的な領域を有する一対のダ イマ一形成用プローブ一 1， 2 ( 2 6, 28 ) より形成されたダイマ一を捕 捉用プローブ （1 2 a) と隣り合った形で結合させる （ステップ 140)。 ライゲーション反応により、 捕捉用プロ一ブ （1 2 a) とダイマー形成用 プローブ— 1 (26) を連結させた後、 夕一ゲット DNA (1 0 a) を除去 する （ステップ 142)。 一対のダイマ一形成用プローブ （ 26, 28) よ り形成されたダイマー及び一対の架橋プローブ （ 30 , 32) を加えて、 自 己集合反応により自己集合体（20 d)を形成させた後（ステップ 144)、 図 1 5に示したごとく、 形成された自己集合体 ( 20 d ) に対してィンター カレーター （24) を挿入し （ステップ 146)、 図 1 6に示した如く、 シ グナルを増幅することができる （ステップ 148)。 なお、 ステップ 144 とステップ 146を同時に行うことも可能である。
上記した例では、 自己集合体を形成するオリゴヌクレオチド ·プローブの 一つを第 1プローブと同一とした場合の例を示したが、必ずしも同一である 必要はなく、第 1プローブとオリゴヌクレオチド ·プローブの少なくとも一 つが結合できるように構成されているプローブを用いることができる。 上記した例では.,予め支持体に結合させておいた捕捉用プローブを用いた が、 捕捉用プローブと支持体とを結合させる段階は、 夕ーゲット DNAを除 去する段階までであればいつでもよく、 特に限定されない。 例えば、 捕捉用 プローブとターゲット DN Aを結合させた後、 捕捉用プローブ、 夕一ゲット DNA、 第 1プローブが全て結合した後、 及びライゲ一シヨン反応後等が挙 げられる。
図 1 7〜図 20は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 5の例を原理 的に示す模式図である。第 5の例は、词時に複数の変異遺伝子を検出する方 法であり、 各ターゲット DNA ( 1 0 e , 1 0 f ， 1 0 g) の相補的配列を 先端に持ち、 2箇所の H CP領域を含む第 1プローブ （34 e， 34 f , 3 4 g) と、 一対の HC P ( 1 6 e， 1 8 e) を用いる例を示す。 第 1プロ一 ブは標的とする遺伝子の数だけ必要であり、 この例では 3種類の遺伝子（1 4
0 e， 1 0 f 及び 1 0 g) の例を示しているため、 先端領域の異なる 3種類 の第 1プローブ （ 34 e , 34 f 及び 34 g) を用いる。 第 1プローブの先 端領域を除く 2領域は共通の H CPの配列を有しているため、第 1プローブ の種類に関わらず H CPは一対のみでシグナルを増幅することができる。 図 1 7に示したごとく支持体（ 14)上にターゲット DNA— 1 (1 0 e) に相補的な領域を有し且つ該ターゲット DNAの遺伝子変異部位 （l i e) が末端 （1 3 e) に位置し、 該末端の塩基がそれぞれ異なる 4種の捕捉用プ ローブ （1 2 e；)、 ターゲット DNA— 2 ( 1 0 f ) に相補的な領域を有し 且つ該ターゲット DN Aの遺伝子変異部位 （ 1 1 ί) が末端 （1 3 ί) に位 置し、 該末端の塩基がそれぞれ異なる 4種の捕捉用プローブ （1 2 f )、 並 びに夕ーゲッ卜 DNA— 3 (1 0 g) に相補的な領域を有し且つ該夕一ゲッ ト DN Aの遺伝子変異部位 (l l g) が末端 ( 1 3 g) に位置し、 該末端の 塩基がそれぞれ異なる 4種の捕捉用プローブ（1 2 g) を別々に結合させる (ステップ 1 50)。 なお、 図 1 7〜図 20において、 末端のみ異なる捕捉 用プローブ及び該末端はそれぞれ同一符号で示した。次に図 1 8に示した如 く、 夕ーゲット DNA (1 0 e， 1 0 f 及び 1 0 g ) 及び第 1プローブ （3 4 e , 34 f 及び 34 g) を捕捉用プローブ （1 2 e， 1 2 f 及び 1 2 g) に応じて結合させる （ステップ 1 5 2)。 変異部位が相補されていない場合 でも末端部分を除き同様に結合するが、この図には末端部分が相補されてい る場合のみを示した。次に図 1 9に示した如く、 ライゲーション反応後ター ゲット DNA ( 1 0 e , 1 0 f 及び 1 0 g) 及び未反応プロ一ブを除去する (ステップ 1 54)。
図 20に示した如く、 一対の H C P (1 6 e， 1 8 e) を加え、 自己集合 体（2 0 e)を形成させシグナルを増幅することができる（ステップ 1 56)。 なお、 第 5の例では、遺伝子変異部位について 4塩基全てを分析する場合を 示したが、 捕捉用プローブ末端の塩基は必要に応じて適宜選択すればよく、 特に限定されないものである。
図 2 1〜図 2 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 6の例を原理 的に示す模式図である。 第 6の系は、 ライゲーシヨン反応を 2箇所で行い、 第 1プローブ（34 h) に HCP— 1 ( 1 6 h) と捕捉用プローブ（1 2 h) を連結させるという特徴を持つ。 HC P— 1 ( 1 6 h)、 第 1プロ一ブ （ 3 4 h)、 捕捉用プローブ （1 2 h) は、 お互いに隣接するように設計されて いる。 同時に複数の変異遺伝子を検出する場合、 第 5の例と同様、 第 1プロ ーブの先端領域を各ターゲット DN Aに相補的にする以外は、第 2プローブ、 HC P—対とも遺伝子の種類に関わらず共通のオリゴヌクレオチド'プロ一 ブを用いることができる。 '
図 2 1は、 第 1プローブ ( 34 h)、 第 2プローブ (36)、 タ一ゲッ卜 D N A (1 O h) 及び支持体 (14) 上に固定された捕捉用プロ一ブ ( 1 2 h) を示す (ステップ 1 60)。 第 1プローブ ( 34 h ) はターゲット DNA (1 0 h)に相補的な配列を有し且つ HC P _ 1 (1 6 h)の配列を 1箇所有し、 第 2プローブ （3 6) は HCP— 2 ( 1 8 h ) と同じ配列を 2箇所有する。 図 22に示したごとく .. 第 1プローブ ( 34 h ) は第 2プローブ (36) と ターゲット DNA(1 0 h)の両者とハイプリダイズする（ステップ 1 62)。 図 23に示した如く、 HCP— 1 ( 1 6 h ) を加ぇハイブリダイゼ一ション を行い、 HCP— 1 ( 1 6 h) と第 2プローブ (3 6) がハイブリダィズす ることにより HCP— 1 ( 1 6 h) と第 1プローブ （ 34 h) が隣接する。 この結果、 第 1プローブ （34 h) の両末端がそれぞれ捕捉用プローブ （1 2 h) と HCP— 1 ( 1 6 h) に隣接した状態となる （ステップ 1 6 3)。 なお、 ステップ 1 62とステップ 1 6 3は、 同時に行うことも可能である。 図 24、 図 25に示した如く、 捕捉用プローブ （ 1 2 h) の末端部分 （ 1 3 h) が夕一ゲット DNA ( 1 0 h) の変異部位 （ 1 1 h) と相補している場 合ライゲーション反応後 （ステップ 1 64)、 ターゲット DNA (1 0 h)、 6 第 2プローブ （3 6) 及び未反応プローブを除去することにより、 捕捉用プ ローブ （1 2 h)、 第 1プローブ （34 h)、 HC P— 1 ( 1 6 ) が 1本に 連結された状態となる （ステップ 1 6 5)。 図 2 6に示す如く一対の HC P ( 1 6 h, 1 8 h) を加えることにより、 自己集合体 （2 0 h) が形成され (ステップ 1 6 6)、 シグナルを増幅することができる。
本発明のシグナル増幅方法において、 一対のオリゴヌクレオチド ·プロ一 ブにあらかじめ検出のための標識物質として、 125 Iや32 P等のラジオアイ ソトープ、 ジゴキシゲニンやァクリジニゥム ·エステル等の発光物質や C y 3 · Cy 5等の蛍光物質、 4—メチルゥンベリフェリルリン酸等の蛍光物質 を利用するためのピオチン等、 蛍光共鳴エネルギー転移 (F RET) を利用 するためのドナ一蛍光色素とァクセプ夕一蛍光色素を付加させておき、ター ゲット DNAを検出することも可能である。
核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、夕一ゲット DN Aを検出することも可能である。 図 8及び図 1 6に示した如く、 インター力 レーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲッ 卜 DNAを検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する 性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、 SYBR Green 1 stain, SYBR Ltreen II stam、 SYBR Green Gold stain, Vista Green stain, Gelstar stain、 Radiant Red stain、 PicoGreen > RiboGreen , OllGreen, Hoechst 33258 (Bis-Benzimide), Propidium Iodide > YO-PRO-1 Iodide, YO-PEO-3 Iodide (以上、 Molecular Probe 社製）、 臭化工チジゥム、 Distamycin A、 TOTO、 Psoralen, ァク リ ジニゥムオレンジ（Acridine Orange)、 AOAO(homodimer)等が使用できる。
上記したオリゴヌクレオチド ·プローブを構成する核酸は、 通常 DNA又 は RNAで構成されるが、 核酸類似体でも構わない。 核酸類似体として、 例 えば、 ペプチド核酸 （PNA、 例えば、 国際公開第 9 2 / 2 0 7 0 2号パン フレット参照。） や Locked Nucleic Acid (LNA、 例えば、 KoshkinAAet al. Tetrahedron 1998.54, 3607-3630. 、 Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc.1998.120, 13252-13253. 、 及び Wahlestedt C et al. PNAS.2000.97, 5633-5638. 参照。） が挙げられる。 また、 一対のオリゴヌクレオチド ·プロ ーブは、 通常、 同じ種類の核酸で構成されるが、 例えば DN Aプローブと R NAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、 プローブの核酸の種類 は DNA、 RNA又は核酸類似体 （例えば PNAや LNA等） から選択する ことができる。 又、 一つのプローブ内での核酸組成は一種類、 例えば DNA のみから構成される必要がなく、 必要に応じて、 例えば、 DNAとRNAか ら構成されるオリゴヌクレオチド ·プローブ （キメラプローブ) を使用する ことも可能であり、 本発明に含まれる。
本発明における標的遺伝子測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあら ゆる試料が適用できる。標的遺伝子は試料より適宜調製または単離したもの でもよく、 特に限定されない。 たとえば、血液、 血清、 尿、糞便、脳脊髄液、 組織液、 細胞培養物等の生体由来試料 ウィルス、 細菌、 カビ等の含有また は感染した可能性のある試料等が挙げられる。 また、 試料中の標的遺伝子を 公知の方法で増幅した核酸も使用可能である。
なお、図において、先端銳角部は 3'末端を示し、起端黒丸印は 5'末端を示す ものである。
(実施例）
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に.説明するが、これらの実施 例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうま でもない。
(実施例 1 )
1. 目的 P A L S A R法を用いて変異末端部位の塩基の違いによる変異遺伝子の 検出を試みた。
2 . 材料
以下に実施例 1で用いたォリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列を示す。 5 ( 1 ) キヤプチヤープローブ （捕捉用プローブ）
C P _ 1— A： 5' (ァミノ基） -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTA-3' C P— 1一 T ： 5，（ァミノ基） -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTT- 3' C P— 1— G ： 5' (ァミノ基) -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTG- 3' C P— 1— C ： 5，（ァミノ基） -GG GGAAGAGCAGAGATATACGTG- 3' 10 ( 2 ) ターゲット遺伝子— 1 (Hemochromatosis遺伝子の塩基配列をもと に合成。 変異部位 ( 8 4 5番目アミノ酸) を下線で示した。)
ターゲット遺伝子— 1— T ：
5'-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG TACGTATATCTCTGCTCTTCC-3' タ一ゲッ卜遺伝子— 1— A：
丄 b 0 Ur jU
Figure imgf000020_0001
し 丄 丄し丄し丄 し丄し丄丄しし o
夕一ゲット遺伝子— 1 一 C ：
5'-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG CACGTATATCTCTGCTCTTCC-3' ターゲット遺伝子— 1 - G ：
5'-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG GACGTATATCTCTGCTCTTCC-3' 20 ( 3 ) 第 1プローブ
第 1プローブ一 1 a ： 5，（リン酸化) -CCAGGTGGAGCACCCAG CATA TGTAGCAGAGCGTAAGTCATGTCCACC-3' (Alexa532標識）
( 4 ) H C P
H C P - 1 _ 1 ：
25 5' (Cy3標識） -CCAGGTGGAGCACCCA GCATATGTAGCAGAGC GTA AGTCATGTCCACC-3' HCP- 1 - 2 ：
5' (Cy3標識） -TGGGTGCTCCACCTGG GCTCTGCTACATATGC GGT GGACATGACTTAC-3'
ハイブリダィゼ一シヨン溶液として、 [終濃度 6 XS S C、 0. 1 mg/ mLサケの精子 DNA、 5 Xデンハルト溶液、 0. 2 %SD S]を調製した。 キヤプチャ一プローブを固定する基盤としてアミノ修飾オリゴ DNA固 定マイクロアレイ用コ一トスライドグラス（MAT S UN AM I GL AS S社製) を用い、 スポッ夕一として、 DNAマイクロアレイヤー 32ピン型 (G r e i n e r b i o— o n e社製） を用いた。
3. 方法
3— 1. スライドグラスの作製
a) キャプチヤープローブのスボッティング
各キヤプチヤープローブ ( 1 0 O pmo I / L) とスボッティング溶液 (MATSUNAM I G L A S S社製） を等量混ぜ、 4種のプローブ溶液 を調製した。得られたプローブ溶液をスライ ドグラス上に N= 4となるよう スポットした。 異なるプローブ溶液をスボッ 卜する際は、 滅菌水、 及び冷ェ 夕ノールにてピンを洗浄風乾した。 スボット後のスライ ドグラスは、 湿潤箱 に入れ遮光し、 ー晚静置した。
b) キヤプチヤープローブの固定
ブロッキング溶液 （MAT S UN AM I GL AS S社製) 1つ、 滅菌水 2つ、 冷メタノール 1つをそれぞれ染色バッ トに用意し、 ブロッキング溶液 にて 20分、 各滅菌水にて 3分、 冷メタノールにて 3分、 順次、 スポッティ ング後のスライ ドグラスを浸し、 固定後風乾させ、 スライドグラスを作成し た。
3— 2. 検出
a) ハイブリダィゼ一シヨン反応 4組のハイプリダイゼーション溶液に各ターゲット遺伝子をそれぞれ 3 0 pmo 1 ( 30 L) となるよう添加し、 第 1プローブ 30 pmo l (3 O L) を加えた。 9 5° (：、 2分にて熱解離させた各溶液 2 5 Lを、 前記 キヤプチヤープローブを固定したスライドグラス上のチャンバ一内にて 4 2。 、 2時間反応させ、 キヤプチヤープローブ、 夕一ゲット遺伝子、 第 1プ ローブを八イブリダイズさせた。反応後のスライドは、 2 XS S C+ 0. 1 % SDS溶液で 2回、 1 X S S C溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回 洗浄し風乾させた。
b) ライゲ一ション反応及びアルカリ変性
リガーゼは耐熱性リガーゼ （Tth DNA ligase) を用いた。 このリガーゼ 添付の緩衝液 (buffer) を用いて、 液量 3 0 Lにリガーゼ (3 0 U) を添 加し、 この溶液の 2 5 ^ Lをチャンバ一内にて反応させた。 反応条件は、 6 5。C 1 5分とした。
ライゲーション反応後、 スライドグラスを 0. 2 X S S C溶液にて軽く洗 浄し、 0. 2 5M N a OH溶液にて 1 0分間アルカリ処理を行い、 未反応 プロ一プ及び余剰プロ一ブを除去した。 また、 N aOH溶液の中和には 0.
25 M HC 1溶液を用いた。 変性後のスライドは、 2 XS S C+ 0. 1 %
S D S溶液で 2回、 1 X S S C溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回、 洗浄し風乾させた。
C ) 自己集合体形成反応
八ィブリダイゼーション溶液に、 5 ' 末端をそれぞれ C y 3標識した一対 の HCP (HCP— 1— 1及び HC P - 1 - 2) を終濃度 1 pmo 1 /a L となるよう加えた。 9 5° (：、 2分にて熱解離させたこの溶液 25 Lを、 ァ ルカリ変性後の洗浄風乾させたスライ ドグラス上のチャンバ一内にて 6 8 °C、 2時間反応させ、 自己集合体を形成させた。 反応後のスライドは、 2 XS S C+ 0. 1 % S D S溶液で 2回、 1 X S S C溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回、洗浄し風乾させスライドグラス上の C y 3の蛍光を蛍 光顕微鏡で観察した。 結果を図 2 7に示す。
図 2 7に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相 補的な場合のみシグナルが増幅された。
(実施例 2 )
1. 目的
1 2種類の遺伝子におけるマルチプレックス （multiplex) 検出の検討を 行った。
2. 材料
以下に実施例 2で用いたオリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列を示す c ( 1 ) キヤプチャ一プローブ
CP- 1 -G ： 実施例 1の C P - 1—Gと同一。
C P— 1 - A ： 実施例 1の C P— 1— Aと同一。
CP— 2— T ： 5，（ァミノ基） -GCGCGGACATGGAGGACGTG!E-3，
CP- 2 -C ： 5，（ァミノ基） -GCGCGGACATGGAGGACGTGC-3' CP— 3— C : 5，（ァミノ基） -ATGCCGATGACCTGCAGAAG -3' C P - 3 - T ： 5' (アミノ基) -ATGCCGATGACCTGCAGAAGT-3' C P - 4— G ： 5，（ァミノ基） - CTTGAATTCCAAGAGCACACCi- 3' C P— 4— A : 5' (ァミノ基） -CTTGAATTCCAAGAGCACACA-3' C P - 5 - C ： 5' (ァミノ基) -GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC-3' C P _ 5— T ： 5' (ァミノ基) -GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGT-3' C P— 6— A ： 5，（ァミノ基） -TGCTGGCTGAAATGGCAATGA-3' CP— 6— G : 5' (ァミノ基） -TGCTGGCTGAAATGGCAATGO:-3' C P— 7— A ： 5' (ァミノ基） -TGTTCTGGGTACTACAGCAGA-3' CP— 7— G : 5，（ァミノ基） -TGTTCTGGGTACTACAGCAGa-3' C P— 8— C ： 5' (ァミノ基） -TGGATGATTTGATGCTGTCC£-3， CP— 8— T : 5' (ァミノ基） -TGGATGATTTGATGCTGTCCIl-3， CP— 9— G : 5' (ァミノ基） -AATGCCAGAGGCTGCTCCCC -3， CP— 9— C : 5' (ァミノ基） -AATGCCAGAGGCTGCTCCCC£-3， CP— 1 0— C : 5，（ァミノ基） -AGCTGTTCGTGTTCTATGAT£-3， CP— 1 0— G : 5，（ァミノ基） -AGCTGTTCGTGTTCTATGAT(i-3' C P— 1 1 _ G ： 5，（ァミノ基) -ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG- 3' CP— 1 1— T : 5，（ァミノ基） -ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3' C P— 1 2— A : 5' (ァミノ基) -TATTCTCGACACAGCAGGTCA-3' CP— 1 2— T : 5，（ァミノ基） -TATTCTCGACACAGCAGGTCT-3' (2) 第 1プロ一ブ
第 1プローブ一 1 b ：
5' (リン酸化) -CCAGGTGGAGCACCCAGGCC GAACTATGC C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 2 ：
5， (リン酸化） -GCGGCCGCCTGGTGCAGTAC GAACTATG C C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 3 ：
5，（リン酸化） -GCCTGGCAGTGTACCAGGCC GAACTATG CCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG C C C GTAC ATGC GTTGTAATG - 3' 第 1プローブ一 4 :
5' (リン酸化） -GTCTTCAGTGAAGCTGCAGG GAACTATG C C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プロ一ブ— 5 ：
5，（リン酸化） -CGATTTCATCATCACGCAGC GAACTATGC CGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 6 ： 5' (リン酸化） -AAGTTGAACTAGCTAGAATG GAACTATGC C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 7 ：
5' (リン酸化） -AGGGTATGCGGAAGCGAGCA GAACTATGCC GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 8 ：
5，（リン酸化） -CGGACGATATTGAACAATGG GAACTATGCC GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG C C C GTAC ATG CGTTG TAATG - 3' 第 1プローブ一 9 ：
5，（リン酸化） -CGTGGCCCCTGCACCAGCAG GAACTATGCCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ— 1 0 ：
5， (リン酸化） -ATGAGAGTCGCCGTGTGGAG GAACTATG C C GATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プロ一ブー 1 1 ：
5' (リン酸化） -TGGCGTAGGCAAGAGTGCCT GAACTATGCCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3' 第 1プローブ一 1 2 ：
5' (リン酸化） -AGAGGAGTACAGTGCAATGA GAACTATGCCGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3'
( 3 ) 夕一ゲット遺伝子
ターゲット遺伝子— 3 ( 3 ' 側領域 C P— 3—Tと相補的） ：
5'-GGCCTGGTACACTGCCAGGC ACTTCTGCAGGTCATCGGCAT-3' ターゲット遺伝子一 6 ( 3 ' 側領域 C P— 6— Aと相補的） ：
5'-CATTCTAGCTAGTTCAACTT TC ATTG C C ATTTC AGC C AG C A- 3' ターゲット遺伝子— 7 ( 3， 側領域 C P— 7 _ Gと相補的） ： 5' TGCTCGCTTCCGCATACCCT C CTGCTGTAGTAC C C AGAAC A- 3' ターゲット遺伝子— 9 (3 ' 側領域 C P— 9一 Gと相補的） ：
5'-CTGCTGGTGCAGGGGCCACG CGGGGAGCAGCCTCTGGCATT-3' ターゲット遺伝子— 1 0 (3 ' 側領域 CP— 1 0—Cと相補的） ： 5'-CTCCACACGGCGACTCTCAT GATCATAGAACACGAACAGCT-3' ターゲット遺伝子一 1 2 (3 ' 側領域 CP— 1 2 _Tと相補的） ： 5'-TCATTGCACTGTACTCCTCT AGACCTGCTGTGTCGAGAATA-3' (4) HC P
HC P - 2 - 1 ：
5， (Cy3標識） - GAACTATGC CGATAAC CGTG GTATAGTACGCTTGCA CGTG C C CGTAC ATG C GTTGTAATG - 3'
H C P - 2 - 2 ：
5， (Cy3標識) -CACGGTTATCGGCATAGTTC CACGTGCAAGCGTACT ATAC CATTACAACG CATGTACGGG - 3'
なお、 上記キヤプチヤープローブ、 第 1プローブの 3 ' 側領域及び夕ーゲ ッ卜遺伝子は-.それぞれ下記の遺伝子の塩基配列をもとに合成したものであ る。
Hemochromatosis遺伝子： C P— 1及び第 1プローブ一 1 (変異部位 8 4 5番塩基）， C P— 1 0、 第 1プローブ一 1 0及び夕一ゲット遺伝子一 1 0 (変異部位 1 8 7番塩基）、 ApolipoproteinE 遺伝子： C P— 2及び第 1 プローブ一 2 (変異部位 1 1 2番目アミノ酸）， C P_ 3、 第 1プローブ一 3及び夕一ゲッ ト遺伝子一 3 (変異部位 1 5 8番目アミ ノ酸）、 ApolipoproteinBlOO 遺伝子 ： C P — 4 及び第 1 プローブ一 4 、 Methylenetetrahydrofolate reductase遺伝子： し P— o及び第 1フローブ — 5、 Medium Chain Acyl-CoenzvmeA Dehydrogenase逭 ナ： C P—り、 第 1プローブ— 6及びターゲット遺伝子— 6、 Angiotensinogen遺伝子： C P - 7、 第 1プロ一ブー 7及び夕一ゲット遺伝子— 7、 p53遺伝子： CP— 8及び第 1プロ一ブー 8 (変異部位 47番目アミノ酸）， CP— 9、 第 1プ ローブ一 9及びターゲット遺伝子一 9 (変異部位 72番目アミノ酸）、 KRAS 遺伝子： CP— 1 1及び第 1プロ一ブー 1 1 (変異部位 1 2番目アミノ酸）、 CP _ 1 2及び第 1プロ一ブー 12 (変異部位 6 1番目アミノ酸）。
ハイプリダイゼーション溶液、スライドグラス及びスポッターは実施例 1 と同様のものを用いた。
3. 方法
3 - 1. スライドグラスの作製
各キヤプチヤープローブ (C P 1 0 O mo 1 / /2 L ) とスポッティング 溶液 （MAT S UN AM I GLAS S社製） を等量混ぜ、 24種のプロ一 ブ溶液を調製した。このプローブ溶液をスライドグラス上に N= 1となるよ う 1 2遺伝子分、 計 24ケ所スポットした。 なお、 異なるプローブ液をスポ ットする際は、 滅菌水、 及び冷エタノールにてピンを洗浄風乾した。 スポッ ト後のスライドグラスは 湿潤箱に入れ遮光し ー晚静置した。
その後、 実施例 1と同様にキヤプチヤープローブの固定を行い、 スライド グラスを作製した。
S— Δ . 検出
ハイブリダィゼ一シヨン溶液に、 6種類のタ一ゲット遺伝子をそれぞれ 3 O pmo l ( 30 L) ずつ添加し、 さらに 1 2種類の第 1プローブすべて をそれぞれ 3 O pmo 1 ( 30 /i L) ずつ加えた。 9 5。C、 2分にて熱解離 させたこれらの溶液 2 5 Lを、.前記キヤプチヤープローブ 24本を固定し たスライドグラス上のチャンバ一内にて 42 °C, 2時間反応させ、 キヤプチ ャ一プローブ、 ターゲット遺伝子、 第 1プローブをハイブリダィズさせた。 反応後のスライ ドは、 2 XS S C+ 0. 1 % S D S溶液で 2回、 1 X S S C 溶液にて 1回、 0. 2 X S S C溶液にて 1回洗浄し風乾させた。 その後、 H C Pとして H C P— 2― 1及び H C P— 2— 2を用いた以外は 実施例 1と同様にして実施例 1と同様にして、 ライゲ一シヨン反応、 アル力 リ処理及び自己集合体形成反応を行い、スライドグラス上の蛍光を蛍光顕微 鏡で観察した。 結果を図 2 8に示す。
図 2 8に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相 補的な場合のみシグナルが増幅された。 産業上の利用可能性
以上述べた如く、 本発明によれば、 P A L S A R法により D N Aチップに おける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立さ せ、 さらに P A L S A R法に用いるオリゴヌクレオチド ·プローブのデザィ ンを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした 変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . D N Aリガーゼを用いたライゲーション反応と、 オリゴヌクレオチドの 二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを 有し、 D N Aチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることを特徴 とする変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
2 .捕捉用プローブと第 1プローブをターゲット D N Aにハイプリダイズさ せる第 1工程、
ターゲット D N Aの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、 D N Aリ ガーゼを用いたライゲーション反応により前記捕捉用プローブと前記第 1 プローブを連結させる第 2工程、
前記ターゲット D N Aを除去させる第 3工程、 及び
複数のオリゴヌクレオチド ·プローブを添加し、 該オリゴヌクレオチド ·プ ローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させる 第 4工程を有し、
前記捕捉用プローブと前記第 1プローブの塩基配列が、前記第 1工程におい て、前記捕捉用プローブの末端が前記夕一ゲット D N Aの変異部位に位置し 且つ該末端と前記第 1プローブが隣接する状態で夕一ゲット D N Aとァニ —リングするように構成されており、
前記複数のオリゴヌクレオチド ·プローブの少なくとも一つが前記第 1プロ ーブと相補的な領域を有することを特徴とする変異遺伝子検出のためのシ グナル増幅方法。
3 . 前記自己集合反応が、 互いに相補的な部分が n ( n≥3 ) 力所の数から 構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブを用いて、互い違いに交差 するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチド が自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させるものであることを特徴とす る請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。
4 . 前記自己集合反応が、 N o . 1及び N o . 2の一対のオリゴヌクレオチ ドの各オリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域、 中央領域、 及び 5 ' 側領域の 3つ の領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列
5 としてダイマ一プローブを形成するとともに、 3 ' 側領域及び 5 ' 側領域を ' 互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマ一形成用プローブを複数対 含む第 1の系と、
N o . 3及び N o . 4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチド を 3 ' 側領域及び 5， 側領域の 2つの領域に分け、 各オリゴヌクレオチドの 10 3 '側領域及び 5 '側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プ ローブを複数対含む第 2の系とを有し、
該架橋プロ一ブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架 橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチ 15 ドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴と する請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。
5 . 前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の N o . 1一オリゴヌクレオチドの 3 側領域と第 2の系の N o 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、
20 第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 側領域と第 2の系の N 0 4一オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、
第 2の系の N o . 4—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 1の系の N o 2一才リゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、
第 2の系の N o . 3 _オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 1の系の N o 25 1一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とするこ とを特徴とする請求項 4記載のシグナル増幅方法。
6. 前記プローブの塩基配列を、
第 1の系の No. 1—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の No. 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、
第 1の系の No. 2_オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の No. 3—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、
第 1の系の No. 2—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の No. 4—ォリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、
第 1の系の No. 1一オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の No. 4一オリゴヌクレオチドの 5 '側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とするこ とを特徴とする請求項 4記載のシグナル増幅方法。
7.前記ターゲット D N Aに一本鎖の D N A又は二本鎖の DNAを用いるこ とを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
8. 前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、 あらかじ め前記第 1プローブと相補的な配列にすることを特徴とする請求項 1〜 7 のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
9. 前記捕捉用プローブが、支持体に結合していることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
1 0. 前記支持体が、 マイクロプレート型、 スライドグラス型、 微粒子型、 又は電気伝導性の基板型の支持体であることを特徴とする請求項 9記載の シグナル増幅方法。
1 1. 前記自己集合体に対して、標識プロ一ブをハイブリダイゼーションさ せることにより、前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項
1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
1 2. 前記標識プローブが、 発色系酵素、 発光系酵素、 又はラジオアイソト —プで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項 1 1記載のシ グナル増幅方法。
1 3. 前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加 え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出する ことを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
14.あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標 識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出するこ とを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
1 5.あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオァイソ ト一プで標識し、前記自己集合体の存在をラジオァイソト一プにより検出す ることを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅方 法。
1 6.あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又 は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出 することを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項記載のシグナル増幅 方法。
1 7. 前記オリゴヌクレオチドが、 DNA, RNA, PNAまたはLNAの いずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項 1〜.1 6のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。
PCT/JP2004/002007 2003-02-21 2004-02-20 変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 WO2004074480A1 (ja)

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