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WO1999005301A1 - Procede de transfert de genes a l'aide d'un milieu exempt de serum - Google Patents

Procede de transfert de genes a l'aide d'un milieu exempt de serum Download PDF

Info

Publication number
WO1999005301A1
WO1999005301A1 PCT/JP1998/003173 JP9803173W WO9905301A1 WO 1999005301 A1 WO1999005301 A1 WO 1999005301A1 JP 9803173 W JP9803173 W JP 9803173W WO 9905301 A1 WO9905301 A1 WO 9905301A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
retrovirus
cells
gene
culture medium
functional substance
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/003173
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Claude Bagnis
Anne-Marie Imbert
Patrice Mannoni
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co., Ltd. filed Critical Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority to EP98932527A priority Critical patent/EP0999279A4/en
Priority to AU82422/98A priority patent/AU8242298A/en
Priority to KR1020007000119A priority patent/KR100572032B1/ko
Priority to US09/463,296 priority patent/US6287864B1/en
Priority to JP50964599A priority patent/JP3754090B2/ja
Publication of WO1999005301A1 publication Critical patent/WO1999005301A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for gene transfer using a serum-free medium, and more specifically, to improve the efficiency of gene transfer to target cells in the fields of medicine, cell engineering, genetic engineering, developmental engineering, etc.
  • the present invention relates to a method for enabling efficient operations and a series of related technologies.
  • a retrovirus vector is a preferable means of gene transfer, particularly for gene therapy where long-term gene expression is desired, since it efficiently introduces the foreign gene of interest into cells and stably integrates it into its chromosomal DNA.
  • the vector is variously modified so as not to adversely affect the transfected organism.
  • the vector itself used for gene transfer replicates in cells
  • the replication function in the vector has been deleted so as not to repeat unrestricted infection (gene transfer). Since these vectors (replication-defective retrovirus vectors) cannot replicate themselves, generally a retrovirus producing cells (packaging cells) is used to prepare a retrovirus in which the vector is wrapped in virus particles. I do.
  • bone marrow cells are good target cells for somatic cell gene therapy because they can be handled in vitro and contain hematopoietic stem cells having self-renewal ability.
  • Umbilical cord blood has also been proven to contain numerous primitive progenitor cells, including hematopoietic stem cells.
  • hematopoietic stem cells are one of the most difficult cells for efficient gene transfer.
  • the most efficient gene transfer protocol for hematopoietic stem cells in mice and other animals has been to co-culture hematopoietic stem cells with retinal virus-producing cells. Therefore, clinical gene therapy in humans requires gene transfer in a cell-free system with low risk of contamination with retrovirus-producing cells.
  • fibronectin and its fragments which are components of extracellular matrix, alone improve the efficiency of gene transfer into cells by Letoorchial virus [Journal of Clinical Infinity]. Bestigation (J. Clin. Invest., Vol.93, Vol.145-1-14 57 pages (1994), Blood, Vol. 88, 855-862 pages (1996)].
  • fibronectin fragments produced by genetic engineering have similar properties, and it has been shown that foreign genes can be efficiently introduced into hematopoietic stem cells using this property (see, WO95Z26202000).
  • WO 97/183310 discloses that a functional substance other than fibronectin such as fibroblast growth factor ⁇ collagen improves gene transfer efficiency, and a function having a retrovirus binding activity. It has been shown that a similar improvement in gene transfer efficiency occurs when a mixture of a functional substance and another functional substance having the target cell binding activity is used.
  • retrovirus infection that is, gene transfer occurs by culturing target cells in a medium containing the retrovirus.
  • the medium used for this step is animal serum, often containing fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • Serum contains components that can serve as a nutrient source for cells and various growth factors, and is said to be highly effective in maintaining cells in vitro.
  • Serum is derived from animals, and the components contained therein and their contents are considered to fluctuate depending on the health condition of the animal from which the serum was collected. Therefore, culturing cells and / or using different lots of serum Reproducible results are not always obtained when gene transfer is performed.
  • serum derived from a heterologous organism other than human contains a substance having an antigenic property against human, and when cells maintained in the presence of such serum are transplanted into human. Requires an appropriate washing operation to reduce the content of the antigenic substance.
  • serum must be strictly quality controlled so that it does not contain viruses, mycoplasmas, etc.
  • the present inventors have assiduously studied that, when a serum-free medium is used, the gene transfer efficiency is improved as compared with a conventional serum-containing medium, and especially in a medium to which low-density lipoprotein is added. The inventors have found that high gene transfer efficiency can be obtained, and have completed the present invention.
  • the first invention of the present invention is to improve the efficiency of retroviral gene transfer of a target cell by co-locating the retrovirus and the target cell in a method for introducing a gene into a target cell by the retrovirus. And infecting target cells with a retrovirus in a serum-free culture medium in the presence of an effective amount of a functional substance.
  • the functional substance used in the present invention is not particularly limited.
  • a substance having a retrovirus binding site and a target cell binding site in the same molecule, or a molecule having a reto-oral virus binding site and a target cell binding site Mixtures with other molecules having the following can be used.
  • the functional substance having a retrovirus binding site include functional substances such as fibronectin, fibroblast growth factor, collagen, and polylysine, or the same.
  • a substance having a retrovirus binding activity such as a heparin-binding substance other than those described above, can be used.
  • a substance having a ligand that binds to a target cell can be used as the functional substance having a target cell binding site.
  • the functional substance suitable for the present invention includes, for example, a retrovirus binding site such as a heparin-binding site and a cell binding site such as a binding region to VLA-5 and / or VLA-4.
  • the polypeptide whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (CH-296) is a fibronectin fragment having a heparin-II binding region and a binding region to VLA-5 and VLA-4. It is.
  • the culture medium used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it does not contain serum, and a medium prepared by mixing components other than serum necessary for maintaining and growing cells is used.
  • a commercially available serum-free medium may be used.
  • These media may contain appropriate proteins and cytokines.
  • a medium containing low-density lipoprotein (LDL) is suitable for the present invention.
  • a second invention of the present invention relates to a cell into which a gene has been introduced, wherein the gene has been introduced by the method of the first invention.
  • the cell into which the gene is to be introduced is not particularly limited, and gene transfer can be performed using various available cells as targets.
  • a third invention of the present invention relates to a method for transferring a gene-introduced cell to a vertebrate, characterized by transplanting the gene-introduced cell of the second invention into a vertebrate.
  • the fourth invention of the present invention relates to a culture medium used for gene transfer. And contains an effective amount of a functional substance that does not contain serum and that can improve the retroviral gene transfer efficiency of the target cells by co-locating the retrovirus and the target cells. I do.
  • a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be used.
  • the medium of the fourth invention is not particularly limited as long as it does not contain serum.
  • a commercially available cell culture medium containing no serum particularly preferably a medium to which low-density lipoprotein is added is used. be able to.
  • the medium may contain a suitable cytokine, if necessary.
  • a recombinant retrovirus vector is usually used, and a replication-defective recombinant retrovirus vector is particularly preferable.
  • the vector is replication-deficient so that it cannot replicate in infected cells and is non-pathogenic.
  • the retrovirus in which these vectors are packaged can invade vertebrate cells, especially host cells such as mammalian cells, and stably integrate the foreign gene inserted into the vector into its chromosomal DNA. .
  • a foreign gene to be introduced into a cell is used by inserting it into a retrovirus vector under the control of an appropriate promoter--for example, the promoter of the LTR present in the retrovirus vector or a foreign promoter.
  • an appropriate promoter for example, the promoter of the LTR present in the retrovirus vector or a foreign promoter.
  • other regulatory elements cooperating with the promoter and transcription start site such as an enhancer sequence, may be present in the vector to effect transcription of the foreign gene.
  • the introduced gene can contain a terminator sequence downstream thereof.
  • the foreign gene to be introduced may be natural or artificially created, or a DNA molecule of different origin linked by ligation or other means known in the art. It may be.
  • any gene desired to be introduced into cells can be selected.
  • foreign genes include enzymes and proteins associated with the disease to be treated, antisense nucleic acids or ribozymes or false primers (see, for example, WO 90/13641), intracellular antibodies (for example, WO94Z0261). No. 0), and those encoding growth factors and the like can be used.
  • the retroviral vector used in the present invention may have an appropriate marker gene that enables selection of cells into which the gene has been introduced.
  • the marker gene for example, a drug resistance gene that confers resistance to an antibiotic on a cell, or a reporter gene that can identify a cell into which a gene has been introduced by detecting enzyme activity can be used.
  • Vectors that can be used include, for example, known MFG vectors (ATCC),
  • these vectors are known packaging cell lines, for example, the known PG13 (AT CC CRL-10686), PG13 / LNc8 (AT CC CRL-1 0685), PA31 (AT CC CRL—9078) and the cell lines described in US Pat. No. 5,278,056, GP + E—86 (AT CCCRL 9642), GP + en V Am—12 (AT CC CRL 9641), Proceedings The National Academy of Sciences 'Op Science' 'Ob' The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 85, pp. 6460-664 (1988).
  • the vector can be prepared as a packaged virus particle by using a cell line such as Psi-Crip.
  • a serum-free medium is used as a medium.
  • serum-free medium refers to a medium for culturing animal cells that does not contain serum derived from animals including humans and is composed of substances whose chemical components are clearly defined.
  • a serum-containing medium to which a purified and identified substance that is a component of serum is added is included in the serum-free medium.
  • the basic components of such a medium include energy sources such as amino acids, sugars, and organic acids, vitamins, buffer components for adjusting pH, and inorganic salts. It may also contain a pH indicator such as phenol red.
  • Such basic media include known media such as Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Iscove's modified Dulbecco's medium
  • IMDM IMDM
  • Gibco BRL Gibco BRL
  • cytokines can be added and used for the purpose of promoting or suppressing the growth and differentiation of target cells.
  • cytokines include interleukins (IL-13, IL-16, etc.), colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF, etc.), stem cell factor (SCF), erythropoietin and various cells.
  • growth factors There are growth factors, and many of them are commercially available from humans.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • Low-density lipoprotein is commercially available from human and can be obtained, for example, from Sigma.
  • high gene transfer efficiency can be obtained.
  • gene transfer can be performed with even higher efficiency.
  • the present invention is characterized in that retroviruses and target cells can be co-located to improve retrovirus gene transfer efficiency of target cells, and that retroviruses are transmitted to target cells in the presence of a functional substance. I do.
  • Genetic transfected cells can be obtained with high efficiency by allowing effective amounts of these functional substances to coexist when infecting cells with the letto-oral virus.
  • these functional substances include WO95Z26200 Functional materials described in Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. Hei.
  • an effective amount is an amount effective to cause transformation of a target cell by the introduction of the gene into the target cell by the Letoorchial virus, and is more appropriate depending on the functional substance used and the type of the target cell. Choose the amount. This amount can be determined, for example, by measuring the gene transfer efficiency by the method described herein.
  • the gene transfer efficiency means the transformation efficiency.
  • the functional substance having a retrovirus binding site used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a heparin-1 II binding region of fibronectin, fibroblast growth factor, collagen, polylysine, However, substances functionally equivalent to these functional substances, for example, a functional substance having a heparin binding site can also be used. Further, a mixture of the functional substance, a polypeptide containing the functional substance, a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, and the like can be used.
  • the functional substance having a target cell binding site used in the present invention is not particularly limited, but is a substance having a ligand that binds to a target cell.
  • the ligand include cell-adhesive proteins, hormones, and cytochromes. Examples include tocaine, antibodies to cell surface antigens, polysaccharides and glycoproteins, sugar chains in glycolipids, and metabolites of target cells.
  • a polypeptide containing the functional substance, a polymer of the functional substance, a derivative of the functional substance, a functional equivalent of the functional substance, and the like can also be used.
  • the functional substances as described above can be obtained from naturally occurring substances, and can be artificially produced (for example, produced by genetic recombination technology or chemical synthesis technology). It can also be made by a combination of and an artificially made substance.
  • W0 9 7 Z 1 8 3 As described in Japanese Patent Publication No. 18, when performing gene transfer using these functional substances, a functional substance having a retrovirus binding site and another functional substance having a target cell binding site are used. They can be used as a mixture, or can be used by selecting or preparing a functional substance having a reticulovirus binding site and a target cell binding site on the same molecule.
  • fibronectin, a fragment thereof, or a mixture thereof can be used, and these functional substances are of natural origin or produced by chemical synthesis.
  • Journal of Biochemistry (J. Biol. Chem.) Vol. 256, No. 7277 (1981), Journal of Cell Biology (J. Cell) Biol.), Vol. 102, p. 449 (1986), Journal of Cell Biology, vol. 105, p. 489 (1989) It can be produced in substantially pure form from naturally occurring materials.
  • fibronectin or fibronectin fragment as described herein means that they are substantially free of other proteins that are naturally present with fibronectin.
  • fibronectin fragments that can be used herein, or useful information regarding the production of such fragments, can be found in Journal of Biochemistry (J. Biochem.), Vol. 110, Vol. Pp. 291 (1991) (this is further reported on the above recombinant fragment); EMBO J., Vol. 4, pp. 1755-1759 (1) 985) (which reports the structure of the human fibronectin gene); and Biochemistry, Vol. 25, pp. 4936-494 (1 986) Tove mouth (Reporting on the heparin-II binding region of Nectin).
  • the fibronectin or fibronectin fragment described herein can also be produced from a genetically modified product, for example, as generally described in US Pat. No. 5,198,423.
  • a fibronectin fragment containing the heparin-1 II region which is a retrovirus binding site, such as CH-296 (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) used in the Examples below, and H-271 , H-296, CH-271, etc., and methods for obtaining them are described in detail in this patent specification.
  • fragments that can be routinely derived from these fragments can be prepared by modifying the plasmid retained in Escherichia coli by a known gene recombination technique.
  • H-296 represents a polypeptide binding region to VLA-4
  • CH-271 represents a peptide binding region to VLA-5
  • CH-296 represents a peptide binding region to VLA-5. It has both [Nature Medicine, Nature Medicine, Vol. 2, pp. 876-882 (1996)].
  • the gene transfer efficiency in a serum-free medium is improved in the presence of fibronectin and the above-mentioned fibronectin fragment CH-296.
  • fibronectin fragment having a cell binding activity with the above-mentioned H-271 which is a fibronectin fragment having a retrovirus binding region.
  • H-271 which is a fibronectin fragment having a retrovirus binding region.
  • the same gene transfer efficiency can be obtained by mixing and using the fragment C-271.
  • Gene-introduced cells can be obtained efficiently by infecting cells with a retrovirus in a serum-free medium in the presence of an effective amount of the above-mentioned fibronectin, fibronectin fragment or a mixture thereof.
  • Fibronectin, a fibronectin fragment or a mixture thereof may be used, for example, in a state immobilized on the surface of a culture vessel used for retrovirus infection.
  • Retroviral infection can be carried out by conventional methods, for example, by incubation at 37 ° C and 5% carbon dioxide. The time of this condition incubation may be appropriately changed depending on the target cell and the purpose.
  • G is the target cell. If the cells are in the early stage, the virus is not infected by the retrovirus, so it is preferable to induce the cell cycle by pre-stimulation, and for this purpose, the target cells are transformed with an appropriate target cell growth factor prior to retrovirus infection. Culture in the presence.
  • a target cell growth factor such as interleukin (IL) 16 or stem cell factor is used for pre-stimulation when a gene is introduced into bone marrow cells or hematopoietic stem cells.
  • stem cells hematopoietic cells, non-adhesive low-density mononuclear cells, adherent cells, bone marrow cells, hematopoietic stem cells, peripheral blood Stem cells, umbilical cord blood cells, fetus Embryonic hematopoietic stem cells, embryogenic stem cells, embryonic cells, primordial germ cells, oocytes, oocyte cells, ova, spermatocytes, sperm, CD34 + cells, C-1 kit + cells, pluripotent hematopoietic progenitor cells, monopotent hematopoietic progenitor cells, erythroid progenitor cells, lymphocyte mother cells, mature blood cells, lymphocytes, B cells, T cells, fibroblasts, neuroblasts, neurons , Endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, myo
  • blood progenitor cells such as hematopoietic stem cells, CD34 + cells, C-kit + cells, and pluripotent hematopoietic progenitor cells are used as target cells.
  • hematopoietic stem cells CD34 + cells
  • C-kit + cells pluripotent hematopoietic progenitor cells
  • fibronectin-fibronectin fragment as a functional substance, in particular, a fibronectin fragment having a binding region to VLA-5 and / or VLA-4 as a cell binding site, Genes can be efficiently transferred into cells expressing VLA-5 and VLA-4, such as hematopoietic stem cells and CD34 + cells.
  • cells into which a gene has been introduced by the method of the present invention can be transplanted into a living body, and thereby gene therapy for expressing a foreign gene in a living body can be performed.
  • the transfected cells obtained by the method of the present invention do not contain proteins and impurities derived from serum of a heterologous animal, and thus are suitable for transplantation into a living body.
  • gene therapy using hematopoietic stem cells as target cells can be performed by the following operation. First, a material containing hematopoietic stem cells, such as bone marrow tissue, peripheral blood, and umbilical cord blood, is collected from a donor. These materials can be used as they are for the gene transfer operation.
  • a mononuclear cell fraction containing hematopoietic stem cells is prepared by a method such as density gradient centrifugation, or CD 34 Purify hematopoietic stem cells using cell surface marker molecules such as and / or C-kit.
  • the material containing these hematopoietic stem cells is subjected to preliminary stimulation using an appropriate cell growth factor or the like, if necessary, and then the recombinant retroviral vector into which the target gene has been inserted by the method of the present invention. Infect.
  • the transfected cells thus obtained can be transplanted into a recipient, for example, by intravenous administration.
  • the recipient is preferably Donna itself, but allogeneic transplantation is also possible. For example, when umbilical cord blood is used as a material, allogeneic transplantation is performed.
  • Gene therapy that targets hematopoietic stem cells complements genes that are missing or abnormal in a patient.
  • gene therapy for ADA deficiency-Gaucher disease is an example.
  • a drug resistance gene may be introduced into hematopoietic stem cells in order to alleviate the damage of hematopoietic cells caused by a chemotherapeutic agent used for treating cancer leukemia.
  • the gene transfer method of the present invention by using the gene transfer method of the present invention, cells into which a gene has been transferred with high efficiency can be obtained. Since the cells thus obtained do not contain serum derived from a heterologous organism, they can be transplanted into a living body without any special operation. Furthermore, compared to the culture medium used in the conventional method, there is no change in the types and contents of the components in the culture medium, so that gene transfer with high reproducibility can be performed.
  • the polypeptide derived from human fibronectin, CH-296 contains a recombinant plasmid pCH102 containing DNA encoding the polypeptide. It was prepared from E. coli, Escheri chia coli HB101 / p CH102 (FERM BP-2800) by the method described in US Pat. No. 5,198,423.
  • Phosphate buffered saline was adjusted to 50 ⁇ g / m 1 for fibronectin (Sigma) and 100 ⁇ g / ml for CH-296 described in Example 1. Dissolved in water (PBS, manufactured by Bio-ITSUTA Corporation) It was then filtered through a 0.22 / m filter (Minisart 'filter 0.22 m, Sartorius). 1 2 ⁇ El plates plus 1 m 1 of CH- 296 solution or fibronectin solution per Ueru of (Falcon), and incubated for 2 hours at room temperature, was immobilized.
  • the solution used for immobilization was replaced with PBS containing 2 ml of 2% serum albumin (BSA, manufactured by Sigma) at 2 ml / well, incubated for 30 minutes at room temperature, and then diluted to 25 mM.
  • the plate was washed twice with Hanks' buffered salt solution (manufactured by Gibco BRL) containing (HEPES, manufactured by Gibco BRL).
  • interleukin - 6 IL- 6, Amgen Inc.
  • S CF stem cell factor
  • the titer of the virus solution thus obtained was reported according to the method described in [Cancer Gene Therapy, Vol. 4, pp. 5-8 (1997)], in accordance with the method of Rat 2 cells (ATCC CRL- 1 764) was measured using a, 1. 7 X 1 0 7 pfu / m 1 in that with RPMI medium containing 10% FCS, also containing 40 ⁇ g / m 1 LD L bIT- 9500 medium was 1.8 ⁇ 10 6 ⁇ ⁇ u / m 1.
  • CD34 + cells were obtained from human peripheral blood mobilized by chemotherapy and G-CSF [Human 'Gene' Therapy, Volume 5, 1325-1333 (1994)]. Isolation was performed using a separation method (magnetic 'activited' cell sorting, manufactured by Milteni Biotech). The purity of the obtained CD34 + cells is 95%.
  • CD34 + cells were primed prior to retroviral infection. That is, the CD34 + cells prepared in Example 4 were subjected to 10% FCS in the presence of 10 ng / ml IL-3, 10 ng / ml IL-6, and 100 ng / ml SCF. Was incubated for 48 hours in a RPMI medium containing BDL-9500 medium containing 40 g / ml of LDL. 3 ⁇ 10 5 pre-stimulated CD 34+ cells were suspended in the virus solution prepared in Example 3. As the virus solution, a solution prepared in the same medium as that used for the preliminary stimulation of each CD34 + cell was selected and used.
  • This cell suspension was immobilized on the wells of unfixed 12-well plates (untreated wells), and on the fibronectin-immobilized wells prepared in Example 2 and CH-296.
  • the cells were added to each of the transformed wells, and the cells were cultured at 37 ° C. for 2 hours in the presence of 5% carbon dioxide.
  • Polybren (4 gZml, Sigma) was added to the untreated wells and the fibronectin-immobilized wells.
  • a new virus solution (containing the above concentrations of IL-3, IL-6, and SCF) was added, and the cells were further cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 22 hours.
  • the cells are recovered using a cell dissociation buffer and suspended in 1 ⁇ 1 medium containing 10% ⁇ 03 or in BIT-9500 medium containing 40 ⁇ g / ml of LDL. Cultured for hours.
  • CD34 + cells contain 10 ng / ml of IL-3, 10 ng / ml of IL-6 and 100 ng / ml of SCF in the presence of 5% 10%! ⁇ ? ⁇ 11 medium Prestimulation was performed for 24 hours in BIT-9500 medium containing medium or 40 ⁇ g Zm1 LDL.
  • Example 5 Each of the 250 transfected cells obtained in Example 5 was placed in a semi-solid medium containing 0.9% methylcellulose, 30% FCS, 1% BSA, 0.1 mM mercaptoethanol, and 2 mM glutamine (Mesocult H 4230, stem cells, Techno mouth ges) was added to each plate containing 0.5 ml
  • the culture medium contains 2 units of Zm1 Elis Mouth Poetin (manufactured by Amgen), 10 ng Zm1 GM-CSF (manufactured by Amdin), and 10 ng / m1 G-CSF (manufactured by Amgen). , 10 ⁇ gZml SCF, 10 ng / ml IL-3, and 10 ng / ml IL-6.
  • the gene transfer efficiency was determined from the enzymatic activity of one galactosidase expressed from the n1sLacZ gene. After directly staining the above plate cultured for 21 days with X-Ga1 (5-bromo-4,3-chloro-1,3-indolyl-j3-D-galactoside), the number of blue-stained colonies was counted. The ratio to the total number of knees was examined.
  • Table 1 shows the percentage of X—Ga1 positive colonies thus obtained.

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Description

明 細 書 無血清培地を用いた遺伝子導入方法 発明の分野
本発明は、 無血清培地を用いた遺伝子導入方法、 さらに詳しくは、 医 学、 細胞工学、 遺伝子工学、 発生工学などの分野において標的細胞への 遺伝子導入効率を向上させ、 標的細胞の形質転換を効率良く行うことを 可能にする方法およびそれに関連する一連の技術に関する。 発明の背景
多数のヒ ト疾病についてその機構が解明され、 また、 組換え D N A技 術および細胞への遺伝子導入技術が急速に進歩したことより、 近年、 重 篤な遺伝病を治療するための体細胞遺伝子治療法のプロ トコールの開発 が進められている。 また、 最近では遺伝病のみならず、 A I D Sのよう なウィルス感染症やガンの治療にも遺伝子治療を適用しようという試み がなされている。
これまでに米国食品医薬品局 （F D A) が承認したヒ トでの遺伝子導 入試験の大部分は、 組換えレトロウィルスベクターを用いて細胞への遺 伝子導入を行うものである。 レトロウィルスベクターは目的の外来遺伝 子を細胞内に効率的に導入し、 その染色体 D N A中に安定に組み込むの で、 特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好まし い遺伝子導入手段である。 該ベクタ一は遺伝子導入された生物に悪影響 を与えないように様々な工夫が施されている。
例えば、 遺伝子導入に用いられたベクター自体が細胞内で複製を行い、 無制限な感染 （遺伝子導入） を繰り返さないよう、 ベクター中の複製機 能は欠損させてある。 これらのベクター （複製能欠損レトロウイルスべ クタ一） は自己複製できないため、 一般的にはレトロウイルス産生細胞 (パッケージング細胞） を使用して該ベクタ一がウィルス粒子に包まれ たレトロウイルスを調製する。
一方、 骨髄細胞はインービトロ （in vi tro) での取り扱いが可能なこ と、 および自己複製能を有する造血幹細胞を含有していることから、 体 細胞遺伝子治療法の良好な標的細胞である。 また、 臍帯血液も造血幹細 胞を含む多数の原始前駆細胞を含有していることがこれまでに証明され ている。 これらの標的細胞に遺伝子を導入して生体に移植する遺伝子治 療を行うことにより、 導入された遺伝子が血液細胞中で長期にわたり発 現され、 疾病を生涯治癒することができる。
しかし、 多数のグループによって研究が進められているにもかかわら ず、 造血幹細胞は高効率の遺伝子導入の難しい細胞の一つである。 これ まで、 マウスやその他の動物の造血幹細胞に関して最も効率のよい遺伝 子導入のプロ トコ一ルは、 造血幹細胞をレト口ウィルス産生細胞ととも に共培養するという方法であつたが、 安全性についての懸念から、 ヒ ト における臨床的な遺伝子治療法にはレトロウイルス産生細胞の混入の危 険性の低い無細胞系での遺伝子導入が望まれている。 残念ながら、 レト 口ウィルス産生細胞との共培養を行わずに造血幹細胞に効率的に遺伝子 を導入することは容易ではない。
最近、 細胞外マトリッタスの成分であるフイブロネクチンやそのフラ グメントが、 単独でレト口ウィルスによる細胞への遺伝子導入効率を向 上させることが報告されている [ジャーナル ·ォブ · クリ二カル ·ィン べスティゲーション （J. Clin. Invest.、 第 9 3卷、 第 1 4 5 1〜 1 4 5 7頁 （ 1 9 9 4年） 、 ブラッド （Blood) 、 第 8 8卷、 第 8 5 5〜 8 6 2頁 （1 9 9 6年） ] 。 また、 遺伝子工学的に生産されたフイブロネク チンフラグメントも同様の性質を有しており、 これを利用して造血幹細 胞に効率よく外来遺伝子を導入させることが可能であることも示された (WO 9 5 Z 2 6 2 0 0号） 。
さらに、 WO 9 7 / 1 8 3 1 8号公報には、 線維芽細胞増殖因子ゃコ ラーゲン等のフイブロネクチン以外の機能性物質が遺伝子導入効率を向 上させること、 およびレトロウイルス結合活性を有する機能性物質と標 的細胞結合活性を有する他の機能性物質とを混合して使用した場合にも 同様な遺伝子導入効率の向上が起こることが示されている。
これらの機能性物質による遺伝子導入効率の向上は、 該物質がレト口 ウィルスと標的細胞とを近接した状態に共配置し、 両者の相互作用の機 会が増加することに起因すると考えられている。 発明の目的
上記のようなレ トロウィルスを用いた遺伝子導入においては、 レ トロ ウィルスを含む培地中で標的細胞を培養することにより、 レトロウィル スの感染、 すなわち、 遺伝子の導入が起こる。 このステップに使用され る培地としては動物血清、 多くの場合にはゥシ胎児血清 （F C S ) を含 有するものが使用されている。 血清中には細胞の栄養源となりうる成分 や各種成長因子が含まれており、 生体外での細胞の維持には高い効果を 有するとされている。
血清は動物由来のものであり、 そこに含まれる成分やその含量等は該 血清が採取された動物個体の健康状態等によって変動すると考えられる。 したがって、 ロッ 卜の異なる血清を使用して細胞の培養および または 遺伝子導入が行われた場合には再現性のある結果を得られるとは限らな い。 また、 例えば、 ヒ ト以外の異種生物由来の血清は、 ヒ トに対して抗 原性を有する物質を含有しており、 このような血清存在下で維持された 細胞をヒ トに移植する際には抗原性物質の含量が低下するような適当な 洗浄操作が必要である。 さらに、 血清はウィルスやマイコプラズマ等を 含まないように厳重な品質管理がなされていなければならない。
このように、 血清を含有する培地を使用する遺伝子導入法は問題を有 しており、 その解決が望まれている。 発明の概要
本発明者らは、 鋭意研究の結果、 意外にも無血清培地を用いた場合に 従来の血清含有培地に比べて遺伝子導入効率が向上すること、 また、 低 密度リポプロテインを添加した培地では特に高い遺伝子導入効率が得ら れることを見いだし、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明の第 1の発明は、 レトロウイルスによる標的細胞へ の遺伝子導入方法において、 レトロウィルスと標的細胞とを共配置させ ることにより標的細胞のレトロウィルスによる遺伝子導入効率を向上さ せることができる有効量の機能性物質の存在下に、 無血清培養培地中で レトロウイルスを標的細胞に感染させることを特徴とする。
本発明に使用される機能性物質には特に限定はなく、 例えば、 レトロ ウィルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する物質また はレト口ウィルス結合部位を有する分子と標的細胞結合部位を有する他 の分子との混合物を使用することができる。 レトロウイルス結合部位を 有する機能性物質としては、 例えば、 フイブロネクチン、 線維芽細胞増 殖因子、 コラーゲン、 ポリ リジンといった機能性物質またはこれらと同 等のレトロウイルス結合活性を有する物質、 例えば、 上記以外のへパリ ン結合性物質を使用することができる。 また、 標的細胞結合部位を有す る機能性物質としては、 例えば、 標的細胞に結合するリガンドを有する 物質を使用することができる。
本発明に好適な機能性物質としては、 例えば、 へパリン一 Π結合領域 のようなレトロウイルス結合部位と、 例えば、 V L A— 5および/また は V L A— 4への結合領域のような細胞結合部位とを有するフイブロネ クチンフラグメントが挙げられる。 例えば、 配列表の配列番号 1にアミ ノ酸配列を示したポリペプチド （C H— 2 9 6 ) はへパリン一 II結合領 域、 V L A— 5および V L A— 4への結合領域を有するフイブロネクチ ンフラグメントである。
また、 本発明の方法に使用される培養培地は血清を含有しないもので あれば特に限定はなく、 血清以外の細胞の維持、 生育に必要な成分を混 合して作製された培地を使用することができ、 例えば、 市販の無血清培 地であってもよい。 これらの培地は適当なタンパク質やサイ トカイン類 を含んでいてもよい。 特に本発明には低密度リポプロテイン （L D L ) を含有する培地が好適である。
本発明の第 2の発明は遺伝子が導入された細胞に関し、 第 1の発明の 方法により、 遺伝子を導入されていることを特徴とする。 遺伝子の導入 される細胞には特に限定はなく、 入手可能な種々の細胞を標的として遺 伝子導入を行うことができる。
また、 本発明の第 3の発明は遺伝子導入された細胞の脊椎動物への移 植方法に関し、 第 2の発明の遺伝子導入細胞を脊椎動物に移植すること を特徴とする。
さらに、 本発明の第 4の発明は遺伝子導入に使用される培養培地に関 し、 血清を含有せず、 かつレトロウイルスと標的細胞とを共配置させる ことにより標的細胞のレトロウィルスによる遺伝子導入効率を向上させ ることができる有効量の機能性物質を含有することを特徴とする。
第 4の発明に使用される機能性物質としては上記したものが使用でき、 特に好適には、 例えば、 配列表の配列番号 1にアミノ酸配列を示したポ リぺプチドを使用することができる。
また、 第 4の発明の培地は血清を含有しないものであれば特に限定は なく、 例えば、 血清を含有しない市販の細胞培養培地、 特に好適には、 低密度リポプロテインを添加した培地を使用することができる。 さらに、 必要に応じて適当なサイ トカイン類を含有する培地であってもよい。 発明の詳細な説明
本発明の遺伝子導入方法には、 通常、 組換えレトロウイルスベクタ一 が使用され、 特に、 複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適で ある。 該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を 欠損させてあり、 非病原性である。 これらのベクターがパッケージング されたレトロウイルスは脊椎動物細胞、 特に、 哺乳動物細胞のような宿 主細胞に侵入し、 その染色体 D N A中にベクターに挿入された外来遺伝 子を安定に組み込むことができる。
本発明では、 細胞に導入しょうとする外来遺伝子は適当なプロモータ ―、 例えば、 レトロウイルスベクター中に存在する L T Rのプロモータ 一や外来プロモーターの制御下に、 レトロウィルスベクター内に挿入し て使用することができる。 また、 外来遺伝子の転写を達成するためには プロモーターおよび転写開始部位と共同する他の調節要素、 例えば、 ェ ンハンサー配列がベクター中に存在していてもよい。 さらに、 好ましく は、 導入された遺伝子はその下流にターミネータ一配列を含有すること ができる。
導入される外来遺伝子は天然のものでも、 または人工的に作製された ものでもよく、 あるいは起源を異にする DN A分子が、 ライゲーシヨン や当該技術分野で公知の他の手段によって結合されたものであってもよ レ、。
レトロウィルスベクターに挿入される外来遺伝子は、 細胞中に導入す ることが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。 例えば、 外来遺伝 子は治療の対象となる疾患に関連している酵素やタンパク質、 アンチセ ンス核酸もしくはリボザィムまたはフォルスプライマ— （例えば、 WO 90/ 1 3641号参照） 、 細胞内抗体（例えば、 WO94Z026 1 0 号参照）、 増殖因子等をコードするものを使用することができる。
本発明で用いるレトロウイルスベクタ一は、 遺伝子導入された細胞の 選択を可能にする適当なマーカ一遺伝子を有していてもよい。 マーカー 遺伝子としては、 例えば、 細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤 耐性遺伝子や、 酵素活性の検出によって遺伝子導入された細胞を見分け ることができるレポーター遺伝子が利用できる。
使用できるベクターには、 例えば、 公知の MFGベクター （ATCC
No. 68754) や a— SGC (ATCC N o. 68755) 等 のレトロウイルスベクターがある。 また、 本明細書の下記の実施例にお いて使用した MFG— n 1 s L a c Zベクター [ヒューマン · ジーン ' セラピー （Human Gene Therapy) 、 第 5卷、 第 1 3 25〜 1 333頁
(1 994年） ] はマーカ一遺伝子として ]3—ガラク トシダーゼ遺伝子 を含有している。 したがって、 該ベクターによって遺伝子導入された細 胞は、 該遺伝子産物の酵素活性を適当な基質、 例えば、 5—プロモー 4 一クロ口 一 3—インドリノレ一 ]3—D—ガラク トシド （X— G a 1 ) を用 いて調べることにより、 確認することができる。
また、 これらのベクターは公知のパッケージング細胞株、 例えば、 公 知の PG 1 3 (AT C C CRL- 1 0686) 、 PG 1 3/LN c 8 (AT C C CRL- 1 0685) 、 PA 3 1 7 (AT C C CRL— 9078) や米国特許 5, 278, 056号に記載の細胞株、 G P + E— 86 (AT C C C R L 9642 ) や G P + e n V Am— 1 2 (AT C C CRL 9641) 、 プロシーディングス .ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー 'ォプ ·サイエンス 'ォブ 'ザ · U S A (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、 第 85卷、 第 6460〜 6464頁 （1 988年） に記 載の P s i— C r i p等の細胞株を使用することにより、 該ベクターが パッケージングされたウィルス粒子として調製することができる。
本発明の方法には培地として無血清培地が使用される。 本明細書に記 載の無血清培地とは、 ヒ トを含む動物由来の血清を含有せず、 化学的に 成分の明らかになつている物質によって構成されている動物細胞の培養 のための培地を意味する。 なお、 血清を構成する成分であって精製、 同 定された物質が添加された培地は、 本発明においては無血清培地に包含 される。 このような培地の基本的な成分としてはアミノ酸、 糖類、 有機 酸のようなエネルギー源、 ビタミン類、 pH調整のための緩衝成分、 無機 塩類等があげられる。 また、 フエノールレッ ドのような pH指示薬を含有 していてもよい。 このような基本的培地には公知の培地、 例えば、 ダル べッコ改変イーグル培地 （DMEM) 、 イスコブ改変ダルベッコ培地
( I MDM) 等が使用でき、 これらは、 例えば、 ギブコ BRL社から巿 販品として入手することができる。
これらの培地には、 遺伝子導入の標的となる細胞の種類やその他の目 的に応じて種々の成分を添加して用いることができる。 例えば、 標的細 胞の生育や分化を促進または抑制する目的で各種のサイ トカイン類を添 加して使用することができる。 このようなサイ トカインとしては、 イン ターロイキン類 （ I L一 3、 I L一 6等） 、 コロニー刺激因子類 （G— CSF、 GM— CS F等） 、 幹細胞因子 （S CF) 、 エリスロポエチン や種々の細胞増殖因子等があり、 その多くのものについてヒ ト由来のも のが市販されている。 これらのサイ トカイン類を使用するにあたっては、 目的に応じた作用を有するものを選択し、 また、 必要に応じてこれらを 組み合わせて使用すればよい。
さらに、 本発明者らは低密度リポプロテイン （Low Density Lipoprote in, LDL) を培地に添加した場合に、 特に良好な遺伝子導入効率が得 られることを明らかにした。 低密度リポプロテインはヒ ト由来のものが 市販されており、 例えば、 シグマ （S i gma) 社より入手することが できる。 下記実施例に示すように、 低密度リポプロテインを含有する無 血清培地中でレトロウイルス上清による細胞への遺伝子導入を行った場 合には、 従来使用されていた血清を含有する培地に比べて高い遺伝子導 入効率が得られる。 また、 下記の機能性物質を共存させた場合にはさら に高い効率で遺伝子導入を行うことが可能である。
本発明はレトロウイルスと標的細胞とを共配置させることにより標的 細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入効率を向上させることができる 機能性物質の共存下にレトロウィルスを標的細胞に感染させることを特 徴とする。
これらの機能性物質の有効量をレト口ウィルスを細胞に感染させる際 に共存させておくことにより、 高い効率で遺伝子導入細胞を得ることが できる。 これらの機能性物質としては、 例えば、 WO95Z26200 号公報および WO 9 7 / 1 8 3 1 8号公報に記載された機能性物質を使 用することができる。
本明細書において、 有効量とはレト口ウィルスによる標的細胞への遺 伝子導入により標的細胞の形質転換が生じるのに有効な量であり、 用い る機能性物質および標的細胞の種類により適切な量を選択する。 この量 は、 例えば、 本明細書記載の方法により遺伝子導入効率を測定し、 決定 することができる。 また、 遺伝子導入効率とは形質転換効率を意味する。 本発明に使用されるレトロウィルス結合部位を有する機能性物質とし ては、 特に限定はなく、 例えば、 フイブロネクチンのへパリン一II結合 領域、 線維芽細胞増殖因子、 コラーゲン、 ポリ リジン等があり、 また、 これらの機能性物質と機能的に同等な物質、 例えば、 へパリン結合性部 位を有する機能性物質も使用することができる。 また、 該機能性物質の 混合物、 該機能性物質を含有するポリペプチド、 該機能性物質の重合体、 該機能性物質の誘導体等を使用することができる。
また、 本発明に使用される標的細胞結合部位を有する機能性物質も、 特に限定はないが、 標的細胞に結合するリガンドを有する物質であり、 該リガンドとしては細胞接着性のタンパク質、 ホルモンやサイ トカイン、 細胞表面の抗原に対する抗体、 多糖類や糖タンパク、 糖脂質中の糖鎖、 標的細胞の代謝物などが挙げられる。 また、 該機能性物質を含有するポ リペプチド、 該機能性物質の重合体、 該機能性物質の誘導体、 該機能性 物質の機能的同等物等を使用することもできる。
上記のような機能性物質は天然起源の物質から得ることができ、 また、 人為的に作製する （例えば、 遺伝子組換え技術や化学合成技術によって 作製する） ことができ、 さらに、 天然起源の物質と人為的に作製された 物質との組合せにより作製することもできる。 また、 W0 9 7 Z 1 8 3 1 8号公報に記載のように、 これらの機能性物質を使用して遺伝子導入 を実施する場合にはレトロウイルス結合部位を有する機能性物質と標的 細胞結合部位を有する他の機能性物質とを混合して使用するか、 あるい はレト口ウィルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子上に有する 機能性物質を選択または作製して使用することができる。
本発明の方法においては、 例えば、 フイブロネクチンやそのフラグメ ント、 またはこれらの混合物を使用することができるが、 これらの機能 性物質は天然起源のもの、 または化学的合成により作製されたものであ ることができ、 例えば、 ジャーナル ·ォブ'バイオケミストリー （J. Bi ol. Chem. ) 第 256卷、 第 727 7頁 （1 98 1年） 、 ジャーナル ·ォ ブ ·セル ·バイオロジー （J. Cell. Biol.) 、 第 1 02卷、 第 449頁 (1 986年） 、 ジャーナル ·ォブ ·セル ·バイオロジー、 第 105卷、 第 48 9頁 （1 98 7年） に記載された方法によって、 天然起源の物質 から実質的に純粋な形態で製造することができる。 この点に関して、 本 明細書記載のフイブロネクチンまたはフイブロネクチンフラグメントと は、 これらが天然においてフイブロネクチンと一緒に存在する他のタン パク質を実質的に含有していないことを意味する。
さらに、 本明細書で使用できるフイブロネクチンフラグメント、 また はこのようなフラグメントの作製に関する有用な情報は、 ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリー （J. Biochem. ) 、 第 1 1 0卷、 第 284〜2 9 1頁 （1 99 1年） （これは上記の組換フラグメントに関してさらに 報告している） ；ェンボ ·ジャーナル （EMBO J. ) 、 第 4卷、 第 1 7 55 〜 1 7 59頁 （1 98 5年） （これはヒ トフイブロネクチン遺伝子の構 造を報告している） ； およびバイオケミストリ一 （Biochemistry) 、 第 25卷、 第 49 36〜 494 1頁 （1 986年） （これはヒ トフイブ口 ネクチンのへパリン— II結合領域について報告している） 中に記載され ている。
本明細書に記載のフイブロネクチンまたはフイブロネクチンフラグメ ントは、 例えば、 米国特許第 5, 1 98, 423号に一般的に記載されて いるようにして、 遺伝子組換え体より製造することもできる。 特に、 レ トロウィルス結合部位であるへパリン一 II領域を含むフイブロネクチン フラグメント、 たとえば、 下記実施例で使用される CH— 296 (配列 表の配列番号 1にそのアミノ酸配列を示す） 、 および H— 271、 H- 296、 CH— 271等の組換えポリペプチド、 ならびにこれらを取得 する方法はこの特許明細書に詳細に記載されている。 これらのフラグメ ントは上記公報に記載されているように、 日本国茨城県つくば市東 1丁 目 1番 3号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に F E RM P— 10721 (H- 296) (原寄託日 ：平成 1年 5月 1 2日） 、 FER M B P- 2799 (CH- 27 1) (原寄託日 ： 平成 1年 5月 1 2 日） 、 FERM BP— 2800 (CH- 296) (原寄託日 ：平成 1 年 5月 1 2日） および FERM BP— 2264 (H- 27 1) (原寄 託日 ：平成 1年 1月 30日） の受託番号のもとで寄託された大腸菌を培 養することによって入手することができる。 また、 これらのフラグメン トから定型的に誘導できるフラグメントは上記の大腸菌に保持されてい るプラスミ ドを公知の遺伝子組換え手法で改変することにより、 作製す ることができる。 なお、 上記のフイブロネクチンフラグメントのうち、 H- 296は V LA— 4への結合領域ポリべプチドを、 CH— 27 1は VLA— 5への結合領域ペプチドを、 また、 CH— 296はその両方を 有している [ネイチヤー . メデイシン （Nature Medicine) 、 第 2巻、 第 876〜 882頁 （1 996年） ] 。 下記実施例に記載のとおり、 フイブロネクチンや上記のフィブロネク チンフラグメント C H— 2 9 6存在下では無血清培地中での遺伝子導入 効率が向上する。 また、 W0 9 7 1 8 3 1 8号公報に記載のように、 例えば、 レトロウィルス結合領域を有するフイブロネクチンフラグメン トである上記の H— 2 7 1 と細胞結合活性を有するフイブロネクチンフ ラグメントである C一 2 7 1 とを混合して使用することによつても同様 の遺伝子導入効率を得ることができる。
上記のフイブロネクチン、 フイブロネクチンフラグメントまたはこれ らの混合物の有効量の存在下、 無血清培地中で細胞にレトロウィルスを 感染させることにより、 遺伝子が導入された細胞を効率よく得ることが できる。 フイブロネクチン、 フイブロネクチンフラグメントまたはこれ らの混合物は、 例えば、 レトロウイルスの感染に用いられる培養容器の 表面に固定化された状態で使用してもよい。 レトロウィルスの感染は通 常の方法、 例えば、 3 7 °C、 炭酸ガス濃度 5 %の条件でのインキュベー ションによって行うことができる。 この条件ゃィンキュベーションの時 間は標的細胞や目的に応じて適宜変更してよい。
標的細胞が G。期の細胞である場合にはレトロウイルスが感染しないた め、 予備刺激によって細胞周期に誘導することが好ましく、 この目的で、 レトロウイルスの感染に先立って、 標的細胞を適当な標的細胞増殖因子 の存在下で培養する。 例えば、 骨髄細胞や造血幹細胞に遺伝子導入を行 う場合の予備刺激には、 インターロイキン （ I L ) 一 6や幹細胞因子等 の標的細胞増殖因子が使用される。
本発明の方法による遺伝子導入の標的となる細胞も特に制限はなく、 例えば、 幹細胞 （stem cells) 、 造血細胞、 非接着性低密度単核細胞、 接着性細胞、 骨髄細胞、 造血幹細胞、 末梢血幹細胞、 臍帯血液細胞、 胎 児性造血幹細胞、 胚形成幹細胞、 胚細胞、 プライモディアル ' ジャー ム ·セル (primordial germ cell) 、 卵母細胞、 卵原細胞、 卵子、 精母 細胞、 精子、 C D 3 4 +細胞、 C一 k i t +細胞、 多能性造血前駆細胞、 単能性造血前駆細胞、 赤血球系前駆細胞、 リンパ球母細胞、 成熟血球、 リンパ球、 B細胞、 T細胞、 線維芽細胞、 神経芽細胞、 神経細胞、 内皮 細胞、 血管内皮細胞、 肝細胞、 筋芽細胞、 骨格筋細胞、 平滑筋細胞、 ガ ン細胞、 骨髄腫細胞および白血病細胞等を使用することができる。 血液 や骨髄より得られる造血系の細胞は入手が比較的容易であり、 また、 そ の培養や維持の手法が確立されていることから、 本発明の方法を利用す るのに好適である。
特に、 導入された遺伝子の長期にわたる発現が目的の場合には造血幹 細胞、 C D 3 4 +細胞、 C— k i t +細胞、 多能性造血前駆細胞等の血 液系の前駆細胞が標的細胞に適している。
機能性物質として上記のフイブロネクチンゃフイブロネクチンフラグ メント、 特に細胞結合部位として V L A— 5および/または V L A— 4 への結合領域を有しているフイブロネクチンフラグメントを使用するこ とにより、 細胞表面に V L A— 5および V L A— 4を発現している細胞、 例えば、 造血幹細胞や C D 3 4 +細胞に効率よく遺伝子導入を行うこと ができる。
上記のように、 本発明の方法によって遺伝子を導入された細胞は生体 に移植することが可能であり、 これによつて生体内で外来遺伝子を発現 させる遺伝子治療を行うことができる。 本発明の方法によって得られる 遺伝子導入細胞は異種動物血清由来のタンパクや不純物を含有しないた め、 生体への移植に好適である。 例えば、 造血幹細胞を標的細胞とした 遺伝子治療は以下のような操作によって実施することができる。 まず、 ドナーより造血幹細胞を含有する材料、 例えば、 骨髄組織、 末 梢血液、 臍帯血液等を採取する。 これらの材料はそのまま遺伝子導入操 作に用いることも可能であるが、 通常は、 密度勾配遠心分離等の方法に より造血幹細胞が含まれる単核細胞画分を調製するか、 さらに、 C D 3 4および または C一 k i tといった細胞表面のマーカー分子を利用し た造血幹細胞の精製を行う。 これらの造血幹細胞を含有する材料につい て、 必要に応じて適当な細胞増殖因子等を用いた予備刺激を行った後、 本発明の方法により目的とする遺伝子を挿入された組換えレトロウィル スベクターを感染させる。 こうして得られた遺伝子導入された細胞は、 例えば、 静脈内投与によってレシピエントに移植することができる。 レ シピエントは、 好ましくはドナ一自身であるが、 同種異系移植を行うこ とも可能であり、 例えば、 臍帯血液を材料とした場合には同種異系移植 が行われる。
造血幹細胞を標的とした遺伝子治療としては、 患者において欠損して いるか、 異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、 例えば、 A D A 欠損症ゃゴ一シェ病の遺伝子治療がこれにあたる。 この他、 例えば、 ガ ンゃ白血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和 するために、 造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入が行われることがあ る。
また、 ガンの遺伝子治療法としては、 ガン細胞にサイ ト力イン類の遺 伝子を導入した後にその増殖能力を奪って患者の体内に戻し、 腫瘍免疫 を増強させる腫瘍ワクチン療法が研究されている [ヒューマン ·ジー ン ·セラピー （Human Gene Therapy) 、 第 5巻、 第 1 5 3〜： 1 6 4頁 ( 1 9 9 4年） ] 。 さらに、 A I D Sを遺伝子治療法によって治療しよ うという試みも行われている。 この場合には、 A I D Sの原因である H I V (ヒ ト免疫不全ウィルス） の感染する T細胞に、 H I Vの複製や遺 伝子発現を妨げるような核酸分子 （ァンチセンス核酸やリボザィム等） をコードする遺伝子を導入することが考えられている [例えば、 ジャー ナル ·ォブ · ウイロロジー （J. Virol.) 、 第 69巻、 第 4045〜 40 52頁 （1995年） ] 。
下記実施例に記載のように、 本発明の遺伝子導入方法を用いることに より、 高い効率で遺伝子導入された細胞を得ることができる。 こうして 得られた細胞は異種生物由来の血清を含まないことから、 特別な操作を 加えることなく生体に移植することが可能である。 さらに、 従来法に用 いられてきた培地に比べて培地中の成分の種類やその含量に変動がない ため、 再現性のよい遺伝子導入を行うことが可能になる。
以下に実施例を挙げて、 さらに詳しく本発明を説明するが、 本発明は 下記実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例 1
CH- 296の調製
ヒ トフイブロネクチン由来のポリペプチド、 CH— 296 (配列表の 配列番号 1にそのアミノ酸配列を示す） は該ポリべプチドをコ一ドする DN Aを含む組換えプラスミ ド p CH 102を含有する大腸菌、 Escheri chia coli HB 10 1/p CH102 (FERM BP— 2800) より、 米国特許第 5, 1 98, 423号公報に記載の方法により調製した。
実施例 2
フイブロネクチン、 CH— 296のプレートへの固定化
フイブロネクチン （シグマ社製） は 50 μ g/m 1 となるように、 ま た、 実施例 1に記載の CH- 296は 100 μ g/m lとなるように、 そ れぞれリン酸緩衝生理食塩水 （PB S、 バイオゥイツタカ一社製） に溶 かし、 0.22 / mのフィルター （ミニザルト ' フィルター 0. 22 m、 ザルトリウス社製） で濾過した。 1 2—ゥエルプレート （ファルコン社 製） の 1ゥエル当たり 1 m 1の CH- 296溶液またはフイブロネクチン 溶液を加え、 室温で 2時間インキュベートし、 固定化を行った。 固定化 に供した溶液を 1ゥエル当たり 2m 1の 2% ゥシ血清アルブミン （B S A、 シグマ社製） を含む PB Sに交換して、 さらに、 30分室温でイン キュペートした後、 25mMへぺス （HEPE S、 ギブコ BRL社製） を含むハンクスの緩衝塩溶液 （ギブコ BRL社製） で、 プレートを 2回 洗浄した。
実施例 3
ウィルス上清液の調製
レトロウイノレスベタター MFG— n 1 s L a c Z [ヒュ一マン ·ジー ン .セラピー（Human Gene Therapy)、 5卷、 1325— 1333頁 （19 94年） ] を産生する P s i— C r i p細胞 [プロシーディングス ·ォ ブ .ザ .ナショナル 'アカデミー .ォブ 'サイエンス .ォブ ·ザ · U S
A (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、 第 85卷、 第 6460〜 6464 頁 （ 1 988年） ] 由来の細胞である A 7. 2 1細胞の培養には、 1 0%子ゥシ血清 （J RH バイオサイエンス社製） 、 1 00単位/ m l ぺニシリ ン— 1 00 μ g/m 1ス トレプトマイシン （ギブコ B RL社 製） を含む DMEM培地 （バイオゥイツタカ一社製） を用いた。 3 X 1 06個の八7. 21細胞を 1 00mm径の組織培養用のディッシュ （ファ ルコン社製） に植えて 1晚培養した後、 培地を取り除き、 1 0%ゥシ胎 児血清 （FCS、 バイオゥイツタカ一社製） を含む 5m lの RPM I培 地 （バイオウイッタカ一社製） 、 または 40 μ g/m 1低密度リポプ口 ティン （LD L、 シグマ社製） を含む 5 m 1の B I T— 9500培地 (ステム 'セル 'テクノロジーズ社製） に置換した。 24時間培養後、 培養上清を集め、 0.45 μπιのフィルタ一 （ミニザルト · フィルター 0. 45 μ m, ザルトリウス社製） で濾過した後、 インターロイキン- 3 (I L— 3、 アムジェン社製） を 10 n g//m l、 インターロイキン- 6 (I L— 6、 アムジェン社製） を1011 8 /1111、 幹細胞因子 （S CF、 了 ムジェン社製） を 100 n g/m l となるようにそれぞれ添加した。
こう して得られたウィルス液のタイターを既報 [キャンサー · ジー ン ·セラピー（Cancer Gene Therapy), 4卷、 5〜8頁 （1 997年） ] の方法に従い、 Ra t 2細胞 （ATCC CRL- 1 764) を用いて 測定したところ、 10% FCSを含む RPMI培地を用いたもので 1. 7 X 1 07 p f u/m 1、 また、 40 μ g /m 1 LD Lを含む B I T— 9500培地を用いたもので 1. 8 X 106 ρ ί u/m 1であった。
実施例 4
CD 34 +細胞の単離
CD 34 +細胞は化学療法および G— C S Fで動員したヒ ト末梢血 [ヒューマン ' ジーン 'セラピー（Human Gene Therapy)、 5卷、 1 32 5 - 1 333頁 （1 994年） ] より、 免疫磁気分離法 （マグネティッ ク 'ァクティべィテッ ド 'セル · ソーティング、 ミルテニ ·バイオテッ ク社製） を用いて単離した。 得られた CD 34 +細胞の純度は 95%で あつァこ。
実施例 5
CD 34 +細胞への遺伝子導入
(1) 上清法による遺伝子導入
CD 34 +細胞は、 レトロウィルスの感染に先立って予備刺激を行つ た。 すなわち、 実施例 4で調製した CD 34+細胞を 1 0 n g/m 1の I L— 3、 1 0 n g /m 1の I L— 6、 100 n g /m 1の S C Fの存在 下、 1 0%F C Sを含む R PM I培地中、 あるいは 40 g/m 1の L D Lを含む B I T- 9500培地中で 48時間ィンキュベートした。 3 X 105個の予備刺激された CD 34+細胞を実施例 3で調製したウィル ス液に懸濁した。 なお、 ウィルス液はそれぞれの CD 34 +細胞の予備 刺激に使用されたものと同じ培地で調製されたものを選んで使用した。 この細胞懸濁液を何も固定化されていない 1 2—ゥエルプレートのゥェ ル （無処理ゥエル） 、 および実施例 2で作製されたフイブロネクチンが 固定化されたゥエル、 CH— 296が固定化されたゥエルのそれぞれに 添加し、 細胞を 5%炭酸ガス存在下、 37°Cで、 2時間培養した。 無処 理ゥエル、 およびフイブロネクチンが固定化されたゥエルにはポリブレ ン （4 gZm l、 シグマ社製） を添加した。 2時間後、 新たなウィル ス液 （上記の濃度の I L— 3、 I L— 6、 S CFを含む） を添加し、 5%炭酸ガス存在下、 37°Cで、 さらに 22時間培養した。 培養後、 細 胞を細胞解離緩衝液を用いて回収し、 10%?03を含有する1 ?^ 1 培地中あるいは 40 μ g/m 1の LD Lを含む B I T— 9500培地に 懸濁して 24時間培養した。
(2) 共培養法による遺伝子導入
共培養を始める前日、 Α7. 2 1細胞を 10 μ g/m 1のァメタイシ ン （Ch o a y— S a n o f i社製） で 2時間処理した後、 トリプシン /EDTA (ギブコ BRL社製） を用いて細胞を回収した。 この細胞懸 濁液 2 X 105個細胞相当を 12—ゥエルプレートに添加した。 CD 34 +細胞は、 1 0 n gZm 1の I L— 3、 10 n g m 1の I L— 6、 1 00 n gZm 1の S C Fの存在下、 10% じ 5を含む！^?^11培地 中あるいは 40 μ gZm 1の LD Lを含む B I T— 9500培地中で 2 4時間予備刺激をした。 1 05個の予備刺激された CD 34 +細胞をそれ ぞれ上記の A 7. 21細胞の添加されたゥエルに添加し、 1 0 n g/m 1の I L一 3、 10 n g/m 1の I L— 6、 100 n g /m 1の S C F、 4 / g/m 1のポリプレンの存在下、 予備刺激に使用した培地 （1 m l ウエル） 中で培養した。 72時間後、 非接着細胞を集め、 IMDM培 地 （パイォゥイツタカ一社製） に懸濁した。
実施例 6
遺伝子導入の評価
実施例 5で得られた遺伝子導入細胞 250個ずつを 0.9%メチルセル ロース、 30%FCS、 1%BSA、 0. 1 mM メルカプトエタノール、 2mMグルタミンを含む半固形培地 （メソカルト H 4230、 ステム · セル ·テクノ口ジーズ社製） 0.5m lを含むプレ一トにそれぞれ加えた
(操作は、 各 3連で行った） 。 なお、 培地には 2単位 Zm 1のエリス口 ポェチン （アムジェン社製） 、 1 0 n gZm 1の GM— C S F (アムジ ヱン社製） 、 10 n g/m 1の G— C S F (アムジヱン社製） 、 10 η gZm lの SCF、 1 0 n g /m 1の I L— 3、 l O n g/m lの I L ― 6を添加した。
遺伝子導入効率は n 1 s L a c Z遺伝子より発現される 一ガラク ト シダーゼの酵素活性から求めた。 21 日間培養した上記のプレートを直 接 X— G a 1 (5—ブロモー 4一クロ口一 3—インドリル一 j3— D—ガ ラク トシド） で染色した後、 青く染色されたコロニーを計数し、 その全 コ口ニーに対する割合を調べた。
こうして得られた X— G a 1陽性コロニーの割合を表 1に示す。 RPM I + F C S B I T+ LD L 無処理ゥエル 4. 8% 15. 5% フイブロネクチン固定化ゥエル 14. 1 % 24. 6%
CH- 296固定化ゥエル 1 1. 8% 33. 6 % 共培養法 29. 6% 22. 3 %
上記の結果は、 フイブロネクチンやそのフラグメントである CH— 2 96と、 LD Lを含む B I T- 9500培地、 すなわち、 無血清培地と の組み合わせが、 高効率の遺伝子導入を可能ならしめることを示してい る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法において、 レトロウィルスと標的細胞とを共配置させることにより標的細胞のレト 口ウィルスによる遺伝子導入効率を向上させることができる有効量の機 能性物質の存在下に、 無血清培養培地中でレトロウイルスを標的細胞に 感染させることを特徴とする標的細胞への遺伝子導入方法。
2 . 機能性物質が、 レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位と を同一分子中に有する物質である請求項 1記載の方法。
3 . 機能性物質が、 レトロウイルス結合部位を有する分子と、 標的 細胞結合部位を有する他の分子との混合物である請求項 1記載の方法。
4 . 機能性物質が、 フイブロネクチン、 フイブロネクチンフラグメ ントまたはこれらの混合物である請求項 1記載の方法。
5 . 機能性物質が、 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を 有するポリぺプチドである請求項 4記載の方法。
6 . 機能性物質が、 培養容器に固定化されている請求項 1〜5いず れか 1項記載の方法。
7 . 培養培地が、 低密度リポプロテインを含有する請求項 1〜6い ずれか 1項記載の方法。
8 . 培養培地が、 サイ ト力インを含有する請求項 1〜 7いずれか 1 項記載の方法。
9 . 培養培地が、 I L— 3、 I L— 6および S C Fから選択される サイトカインを含有する請求項 8記載の方法。
1 0 . 標的細胞が、 造血系細胞である請求項 1〜9いずれか 1項記 載の方法。
1 1. 標的細胞が、 CD 34 +細胞である請求項 1 0記載の方法。
1 2. レトロウイルスが、 外来遺伝子を含有する組換えレトロウイ ルスである請求項 1〜 1 1いずれか 1項記載の方法。
1 3. レトロウイルスが、 複製能を欠損した組換えレトロウイルス である請求項 1 2記載の方法。
1 4. 請求項 1〜 1 3いずれか 1項記載の方法で得られる遺伝子導 入細胞。
1 5. 請求項 14記載の方法で得られる遺伝子導入細胞を脊椎動物 に移植することを特徴とする細胞移植方法。
1 6. レトロウィルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用される 培養培地であって、 血清を含有せず、 かつレトロウイルスと標的細胞と を共配置させることにより標的細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入 効率を向上させることができる有効量の機能性物質を含有することを特 徴とする標的細胞の培養培地。
1 7. 機能性物質が、 レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位 とを同一分子中に有する物質である請求項 1 6記載の培養培地。
1 8. 機能性物質が、 レトロウイルス結合部位を有する分子と、 標 的細胞結合部位を有する他の分子との混合物である請求項 1 6記載の培 養培地。
1 9. 機能性物質が、 フイブロネクチン、 フイブロネクチンフラグ メントまたはこれらの混合物である請求項 1 6記載の培養培地。
20. 機能性物質が、 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列 を有するポリペプチドである請求項 1 9記載の培養培地。
2 1. 低密度リポプロテインを含有することを特徴とする請求項 1 6〜 20いずれか 1項記載の培養培地。
22. サイ トカインを含有することを特徴とする請求項 1 6〜2 1 いずれか 1項記載の培養培地。
23. I L— 3、 I L— 6および S C Fから選択されるサイ トカイ ンを含有することを特徴とする請求項 22記載の培養培地。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005019450A1 (ja) * 2003-08-22 2006-10-19 タカラバイオ株式会社 細胞傷害性リンパ球の製造方法
US8765469B2 (en) 2005-08-17 2014-07-01 Takara Bio Inc. Method of producing lymphocytes
US8975070B2 (en) 2002-03-25 2015-03-10 Takara Bio Inc. Process for producing cytotoxic lymphocyte
JP2017506511A (ja) * 2014-02-14 2017-03-09 ナショナル ユニバーシティー オブ アイルランド， ゴールウェイ 無血清培地
JP2023511024A (ja) * 2019-12-30 2023-03-16 サン－ゴバン パフォーマンス プラスティックス コーポレイション 細胞形質導入のための容器及び方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020058636A1 (en) * 1994-09-21 2002-05-16 Geoffrey P. Symonds Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US6627442B1 (en) * 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
EP1414996B1 (en) * 2001-07-10 2010-12-01 Johnson & Johnson Research Pty Limited Methods for genetic modification of hematopoietic progenitor cells and uses of the modified cells
ES2358187T3 (es) * 2001-07-10 2011-05-06 JOHNSON & JOHNSON RESEARCH PTY LIMITED Procedimientos para la modificación genética de las células progenitoras hematopoyéticas y utilizaciones de las células modificadas.
US20030148379A1 (en) * 2002-02-06 2003-08-07 Roitman Daniel B. Methods for making microbar encoders for bioprobes
CN1993460A (zh) * 2004-07-12 2007-07-04 索林集团意大利有限公司 用于培养人细胞的装置和方法
JP5156382B2 (ja) * 2005-09-30 2013-03-06 タカラバイオ株式会社 Ｔ細胞集団の製造方法
JPWO2011024791A1 (ja) * 2009-08-25 2013-01-31 タカラバイオ株式会社 レチノイン酸存在下でのｔ細胞集団の製造方法
EP2589656B8 (en) * 2010-06-30 2016-07-13 Takara Bio Inc. Gene introduction method
US9228206B2 (en) 2010-06-30 2016-01-05 Takara Bio Inc. Method for gene transfer
WO2012048276A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Caridianbct, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
JP6612227B2 (ja) 2013-11-16 2019-11-27 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド バイオリアクターにおける細胞増殖
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
JP6830059B2 (ja) 2014-09-26 2021-02-17 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド スケジュール化された細胞フィーディング
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
CN109415696A (zh) 2016-05-25 2019-03-01 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
CN110612344B (zh) 2017-03-31 2023-09-12 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
GB2619893A (en) 2021-03-23 2023-12-20 Terumo Bct Inc Cell capture and expansion
WO2023205037A1 (en) * 2022-04-17 2023-10-26 Biogen Ma Inc. Methods of delivering nucleotide sequences to cells via simultaneous transduction

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995026200A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Indiana University Foundation Enhanced virus-mediated dna transfer
WO1997018318A1 (en) * 1995-11-13 1997-05-22 Takara Shuzo Co., Ltd. Method for gene introduction into target cells by retrovirus

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946788A (en) * 1985-06-11 1990-08-07 Ciba-Geigy Corporation Purified immunoglobulin-related factor, novel monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, processes and applications
US5498537A (en) * 1994-03-09 1996-03-12 Cellco, Inc. Serum-free production of packaged viral vector
US6033907A (en) * 1995-09-29 2000-03-07 Indiana University Foundation Enhanced virus-mediated DNA transfer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995026200A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Indiana University Foundation Enhanced virus-mediated dna transfer
WO1997018318A1 (en) * 1995-11-13 1997-05-22 Takara Shuzo Co., Ltd. Method for gene introduction into target cells by retrovirus

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP0999279A4 *
SEKHAR M., ET AL.: "RETROVIRAL TGRANSDUCTION OF CD34-ENRICHED HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS UNDER SERUM-FREE CONDITIONS.", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, INC. PUBLISHERS, US, vol. 07., 1 January 1996 (1996-01-01), US, pages 33 - 38., XP002913105, ISSN: 1043-0342 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8975070B2 (en) 2002-03-25 2015-03-10 Takara Bio Inc. Process for producing cytotoxic lymphocyte
JPWO2005019450A1 (ja) * 2003-08-22 2006-10-19 タカラバイオ株式会社 細胞傷害性リンパ球の製造方法
JP4870432B2 (ja) * 2003-08-22 2012-02-08 タカラバイオ株式会社 細胞傷害性リンパ球の製造方法
US8927273B2 (en) 2003-08-22 2015-01-06 Takara Bio Inc. Process for producing cytotoxic lymphocytes
US8765469B2 (en) 2005-08-17 2014-07-01 Takara Bio Inc. Method of producing lymphocytes
JP2017506511A (ja) * 2014-02-14 2017-03-09 ナショナル ユニバーシティー オブ アイルランド， ゴールウェイ 無血清培地
US10472605B2 (en) 2014-02-14 2019-11-12 National University Of Ireland, Galway Serum-free medium
JP2023511024A (ja) * 2019-12-30 2023-03-16 サン－ゴバン パフォーマンス プラスティックス コーポレイション 細胞形質導入のための容器及び方法

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