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WO1998037187A1 - Genes associes au cancer - Google Patents

Genes associes au cancer Download PDF

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Publication number
WO1998037187A1
WO1998037187A1 PCT/JP1998/000667 JP9800667W WO9837187A1 WO 1998037187 A1 WO1998037187 A1 WO 1998037187A1 JP 9800667 W JP9800667 W JP 9800667W WO 9837187 A1 WO9837187 A1 WO 9837187A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
gene
nucleic acid
sequence
expression level
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/000667
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshie Yoshikawa
Hiroyuki Mukai
Kiyozo Asada
Fumitsugu Hino
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co., Ltd. filed Critical Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority to AU62290/98A priority Critical patent/AU6229098A/en
Priority to EP98904368A priority patent/EP0972830A4/en
Priority to JP53648398A priority patent/JP3681405B2/ja
Publication of WO1998037187A1 publication Critical patent/WO1998037187A1/ja
Priority to US09/377,497 priority patent/US6670119B1/en
Priority to US10/325,881 priority patent/US20030119047A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting cancer cells, which comprises detecting an expression product of a gene whose expression level changes due to canceration.
  • the present invention also relates to a gene whose expression level is changed by canceration and a gene product thereof.
  • Cancer has been the leading cause of death in Japan since 1981, with gastric cancer being the most frequent cancer.
  • it has been known that there is a multi-stage carcinogenesis mechanism until normal cells become cancerous [Phiron E.R. (Fearon, ER) et al., Cell, Vol. Sugimura, T., Science, Science, Vol. 258, pp. 63-607, pp. 195-976 (1990), Sugimura, T. 2)], accumulation of multiple gene abnormalities including DNA repair genes, tumor suppressor genes, and oncogenes is required.
  • gene instability and inactivation of tumor suppressor genes are involved in cancer development, and activation of oncogenes and / or overexpression of growth factors are involved in cancer progression and malignancy.
  • Gene instability includes gene instability associated with abnormalities in the DNA mismatch repair system and chromosomal instability.
  • the chain length of the simple repetitive sequence existing in the genome is different between the cancerous part and the non-cancerous part of the same person (microsatellite instability) [Thibodeau, SN (Thibodeau, SN) et al. Science, Vol. 260, pp. 816-819 (1993)]
  • an example of the latter is translocation between chromosomes. This translocation between chromosomes may cause expression of a protein that is not found in normal cells, or may affect the expression level of a protein that is expressed in normal cells.
  • Examples of the inactivation of the tumor suppressor gene include inactivation of the p53 gene. It is thought that the cause of inactivation is a deletion in the gene or a point mutation occurring in a specific part of the coding region (Nigguchi JM (Nigro, JM) et al., Neyya-(Nature), vol. 342). 705-708 (1989), Malkin D. et al., Science, 250, 1233-1238 (1990)].
  • p53 gene deletion and point mutation are observed in many types of cancers. For example, gastric cancer is observed in more than 60% of early stage cancers [Yokozaki H. ), Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, Vol. 119, pp. 67-70 (1992)], Detection of these mutations is an early It can be used for detection.
  • the P16 / MTS1 gene is known as a gene that is inactivated by homo-deletion, and high-frequency homo-deletion has been observed in gliomas ⁇ cancer, bladder cancer, etc. (Cairns P. (Cairns, P.) et al., Nature genetics, Vol. 1, Vol. 11, pp. 210-212 (1995)].
  • the pl6 protein regulates the cell cycle, and it has been suggested that abnormal P16 expression is involved in canceration of cells (Okamoto A. et al., Proceedings of the National Academy Lab. Sciences of the United States of America (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ⁇ Vol. 91, No. 1045-111049 (1994)].
  • Activation of oncogenes includes, for example, insertion of viruses near oncogenes.
  • Causes include mutations and translocations between chromosomes.
  • a viral insertion mutation has been identified in chicken lymphoma caused by the avian leukosis virus (ALV).
  • ALV DNA is inserted in the vicinity of C-myc, a kind of gene, and normal c-myc is overexpressed by strong viral enhancer and promoter. It was confirmed that different new sequences were expressed.
  • c-myc one of three oncogenes, is placed under strong immunoglobulin transcription signals due to translocation between chromosomes, resulting in increased mRNA expression.
  • overexpression of a growth factor examples include overexpression of C-Met encoding hepatocyte growth factor receptor. This abnormal expression of C-Met is not observed in normal mucous membranes from the early stage of gastric cancer development. The expression of mRNA with a length of 6.0 kb was observed (Kuniyasu.H. Et al. , International Journal of Cancer, Vol. 55, pp. 72-75 (1993)], which is frequently observed and confirms a correlation between gene amplification and cancer malignancy [Kunias H. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 189, pp. 227-232 (1992)].
  • Examples of the correlation between genetic abnormality and malignancy of cancer include the above-mentioned c-Met and amplification and / or overexpression of the C-erbB2 gene, which is an oncogene, in breast cancer, ovarian cancer, gastric cancer, uterus [Wright, C., et al., Cancer Research, Vol. 49, pp. 287-7-2090 (19989); Fari B. (Saffari. B.) et al., Cancer Research, Vol. 55, pp. 5693-56698 (1995)], amplification of the oncogene K-sam gene and Z or its Excessive expression in poorly differentiated adenocarcinoma, a histological type of gastric cancer [Tahara, E. et al., Gastric Cancer, Tokyo (Gastric Cancer, Tokyo), Springer-Verlag (Springer-Verlag) :), published in 1993, pp. 209 to 217].
  • the genes involved in the development and progression of cancer and the information on the abnormalities of the genes are increasing, and performing a genetic diagnosis from biopsy materials can be useful for early diagnosis of cancer and determination of malignancy. is expected.
  • the mechanism of carcinogenesis is multi-stage and the accumulation of multiple mutations is required, the genes involved in canceration are still largely unknown, and further research is needed.
  • gene therapy to suppress the growth of cancer cells by introducing a normal p53 gene into cancer cells has also been performed at the clinical trial stage. Create the possibility of
  • a first object of the present invention is to find a gene that can serve as an indicator of carcinogenesis, in particular, a gene whose expression state changes as the cells become cancerous, and to determine the expression level of the gene in an extracorporeally extracted sample.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting cancerous cells based on measurement and a method for determining the degree of malignancy thereof.
  • a second object of the present invention is to provide a kit for use in the method for detecting cancer cells and / or the method for determining the degree of malignancy of the cells.
  • a third object of the present invention is a method for controlling cancer cell proliferation using a gene that can be an indicator of carcinogenesis or a specific binding substance to the gene expression product.
  • a fourth object of the present invention is to provide a novel peptide related to canceration, and a nucleic acid encoding the peptide.
  • the first invention of the present invention relates to a method for detecting cancer cells in an extracorporeally extracted sample, comprising a base represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing.
  • DNA containing the sequence or any of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing A change in the expression level of a gene selected from genes whose DNA is capable of hybridizing to nucleic acids under stringent conditions, such as a change in mRNA expression level and a change in expression level of protein. It is characterized by investigating by change.
  • the second invention of the present invention relates to a kit for detecting cancer by the detection method of the present invention, and comprises a primer for amplifying mRNA which is an indicator of a change in expression level, or Either a probe that hybridizes to the mRNA or an antibody that recognizes a protein that is an indicator of a change in the expression level is an essential component of the configuration.
  • the third invention of the present invention relates to a method for controlling the growth of cancer cells using a specific conjugate of a gene or a gene expression product, wherein the gene cDNA is any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing.
  • the DNA is a DNA that can hybridize under stringent conditions to a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing, And / or the control of expression product function.
  • a fourth invention of the present invention relates to a peptide which can be used for detecting cancer and a nucleic acid encoding the peptide, which comprises amino acids shown in SEQ ID NOs: 17 to 19 in the sequence listing. It is characterized in that it is a peptide consisting of an amino acid sequence containing all or a part of the sequence and a nucleic acid encoding the peptide.
  • the fifth invention of the present invention relates to an antibody which can be used for detecting a cancer recognizing the peptide of the fourth invention.
  • extracting sample refers to blood, urine, feces, tissue extracted by a surgical technique, and the like.
  • cancer-related gene refers to a gene whose expression state changes as the cells become cancerous. Disclosure of the invention
  • cancer tissue and “control normal tissue” refer to a tissue that constitutes a cancer lesion in a multicellular individual and a spatially identical region to a cancer tissue in the same individual. Means an organization that performs various functions.
  • FIG. 1 is an autoradiogram showing an electrophoresis pattern of the obtained DNA fragment when a cancer-related gene is detected by the DD method.
  • Figure 2 shows changes in the expression level of the cancer-associated gene mRNA detected by the Northern hybridization--since method.After the RNA was electrophoresed, the target mRNA was hybridized with a labeled probe. It is a figure of the obtained autoradiogram.
  • FIG. 3 is a view showing an electrophoresis pattern of the obtained DNA fragment when a change in the expression of a cancer-related gene is detected by the RT-PCR method.
  • the first invention of the present invention provides a method for detecting cancer cells using the expression level of a cancer-related gene as an index.
  • the gene according to the present invention which can be an indicator of canceration, is a gene whose expression state changes as a cell becomes cancerous, in other words, a gene whose expression is significantly induced or suppressed.
  • Such genes can be analyzed, for example, by analyzing the copy number of the gene in the genome and the pattern of chromosomal translocation, and comparing the expression levels of gene products in normal cells and cancerous cells. Detect by identifying something Can be Examples of the gene product include mRNA transcribed from the gene and protein that is a translation product. In the detection of a cancer-related gene according to the present invention, it is efficient to use the mRNA expression level as an index, for which various techniques have been developed for the analysis along with the advance of gene manipulation technology.
  • RNA extracted individually from the cancer tissue and the control normal tissue to be compared was treated with DNAse, respectively, and the crude RNA sample from which the genomic DNA was removed was removed.
  • An oligo (dT) anchor primer and a reverse transcriptase were used.
  • MRNA is converted to cDNA by reverse transcription reaction using (RTase).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR amplification products individually obtained from the tissues to be compared were subjected to polyacrylamide electrophoresis for each amplification product obtained from the same primer pair combination, and the band patterns were compared. Find bands that differ between cancer cells. This band is excised from the gel, and the nucleic acid contained in the band is extracted to obtain a DNA fragment that is considered to be complementary to a partial region of the cancer-related gene mRNA. Can be.
  • the cancer-related gene is determined to be a gene whose expression level decreases due to canceration.
  • the cancer-related gene is determined to be a gene whose expression is amplified by canceration.
  • the expression level of mRNA can be confirmed, for example, by labeling the obtained DNA fragment, using this as a detection probe, and performing Northern hybridization on crude RNA samples extracted from cancer tissues and control normal tissues. It can be carried out by confirming the difference in signal intensity obtained using a densitometer or the like. That is, it can be determined that the higher the signal intensity, the higher the mRNA expression level.
  • the signal intensity can be represented as a volume value [I OD (Integrated optica 1 density)] of a band obtained in a radiogram or the like, and the larger the I 0D value, the more the band is given. It can be determined that the expression level of mRNA is high.
  • the amplified DN obtained by the above-mentioned DD method and whose mRNA is presumed to be expressed from a cancer-related gene is type III.
  • a more sensitive RNase protection assay using RNA prepared from the A fragment as a probe [Krieg, PA], Melton DA (Melton, DA), and Metz's Enzymology (Methods in Enzymology), Vol. 1 55, pp. 397-415 (1987)].
  • This method utilizes an RNase having substrate specificity that exhibits cleavage activity for single-stranded RNA but not for double-stranded RNA.
  • the mRNA to be detected and an excessive amount of the probe are added to the crude RNA sample extracted from the normal tissue and the crude RNA sample derived from the cancer tissue to form a hybrid of the target mRNA and the added probe, and Substrate characteristics RNase having isomerism acts. Confirmation of the mRNA expression level can be performed by measuring the amount of double-stranded RNA remaining after the RNase digestion.
  • the amplified DNA fragment obtained by the above-mentioned DD method and whose mRNA is presumed to be expressed from the cancer-related gene is not necessarily a cDNA complementary to the full length of the cancer-related gene mRNA.
  • a cDNA library of the tissue used for screening is prepared, and the mRNA obtained by the above-mentioned DD method and presumed to be expressed from the cancer-related gene is analyzed.
  • the cancer-associated gene cDNA clone can be isolated by labeling the amplified DNA fragment as a template and performing plaque hybridization using the amplified DNA fragment as a detection probe.
  • the present inventors succeeded in isolating DNA fragments each containing a partial nucleotide sequence of each of the 14 types of cancer-related gene cDNA using the stomach cancer tissue and the control normal tissue by the above method.
  • the genes expressing mRNA corresponding to the cDNA represented by the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in this manner were identified as CA11, CA13, CC24, GG24, AG26, GC31, GC32, and GC33, respectively. , GG 33, CC34, GC35, GC36, CA42, and CC62.
  • Table 1 shows the SEQ ID Nos.
  • the above-mentioned cancer-related genes are largely classified into those whose expression level decreases due to canceration and those whose expression level increases. Can be different.
  • the former is CA1 and AG26, GC35, GC36, CC62, and the latter is CA13, CC24, GG24, GC31, GC32, GC33, GG33, CC34. , CA42.
  • the cancer-related gene serving as an index may be appropriately selected from the above genes, and may be one type or a combination of several types. Further, the cancer-related gene used as an index for detecting cancer cells is not particularly limited to the above-mentioned 14 types of genes. If the expression level of the gene is different due to canceration of the cell, any of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing A gene which is a DNA which can hybridize to the DNA shown in any of the above under stringent conditions may be used as cDNA.
  • the conditions under which the hybridization is possible in this specification are, for example, a nylon membrane on which DNA is immobilized, 6 X SSC (1 x SSC is 8.76 g of sodium chloride, 4.41 g of sodium citrate is added to 1 liter of water).
  • 6 X SSC 1 x SSC is 8.76 g of sodium chloride, 4.41 g of sodium citrate is added to 1 liter of water.
  • 1% SDS 100 ⁇ g / m 1 salmon sperm DNA, 0.1% ⁇ serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% ficoll 6 It means that it can be kept at 5 ° C for 20 hours together with the probe and can be hybridized.
  • the present invention also confirmed the presence of a gene having the above properties.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing exists in the nucleotide sequence of CCDN gene cDNA, but T at nucleotide number 935 in the sequence is replaced with A, and the nucleotide at the 3 'end.
  • the DNA represented by the nucleotide sequence of the GTTAA G sequence with 6 bases deleted was obtained as DNA fragments with different amplification amounts in the DD method using RNA prepared from normal tissue and RNA prepared from cancer tissue. Was done.
  • This amplified DNA fragment can hybridize with the DNA shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing. Therefore, the gene expressing mRNA that gives the DNA fragment obtained by the DD method in the present invention is also included in the cancer-related gene for detecting a cancer cell in the present invention.
  • a cell is a cancer cell
  • the normal range of the expression level of the cancer-related gene as an index of canceration is confirmed, and then the expression level of the cancer-related gene in the extracorporeally extracted sample is measured and compared with the normal range. That is, when the expression of a cancer-related gene as an index is suppressed by canceration, if the expression of the cancer-related gene is not confirmed in an in vitro extracted sample, or if the expression level of the cancer-related gene is lower than a normal range, It is determined that the cancer is positive.
  • the cancer-positive gene is determined to be cancer-positive if the expression level of the cancer-related gene is higher than a normal threshold value.
  • a normal threshold value Either the amount of mRNA or the amount of protein expressed from the gene may be used for comparing the expression level of the cancer-related gene.
  • the normal threshold value in the present specification is represented by the following formula based on the expression levels of cancer-related genes in a plurality of normal tissues obtained by an appropriate detection method.
  • the above-mentioned normal threshold value includes 95% of normal tissues in which cancer-related gene expression levels were measured.
  • Examples of the detection method using mRNA include an RT-PCR method, an RNAse protection assay method, and a Northern hybridization method.
  • RT—PCR (Reverse reset an ancillary—Polymerase cha inreaction) method is a method in which mRNA is converted into type II, cDNA is synthesized by reverse transcriptase reaction, and nucleic acid amplification is performed by PCR [Kawasaki, ES , et al., Amplification of RNA.In PCR Protocol, A Guide to methods AND applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)], but in the present invention, the nucleic acid amplification reaction is not particularly limited.
  • S DA Strand Displacement Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Nucleic Acid Sequense-Based Amplification
  • the reaction conditions are not particularly limited.
  • the amplification region of the cancer-related gene cDNA does not necessarily need to be the full length of the cDNA, and may be a partial region of the cDNA if it does not hinder the confirmation of the amplification product.
  • the primer pair used in the nucleic acid amplification reaction is designed to specifically amplify only the cDNA, but if there is no problem in confirming the amplification product in the region, cDNA other than the detection target can be used. It may be amplified.
  • the term "primer” as used herein refers to the conditions under which the synthesis of a primer extension product by DNA polymerase is started, that is, an appropriate buffer solution.
  • oligonucleotide that can act as a starting point for DNA synthesis, typically containing 10 to 30 nucleotides.
  • a combination of DNAs represented by SEQ ID NOs: 20 and 21 in the sequence listing can be exemplified as the former primer pair.
  • the problem in the confirmation of the amplification product in the present specification is that, for example, when the amplified DNA fragment is subjected to agarose gel electrophoresis and then the gel is stained with ethidium bromide (EtBr), and the nucleic acid amplification reaction is performed.
  • EtBr ethidium bromide
  • a large number of amplified DNA fragments having the same number of bases are generated, the separation of each amplified DNA fragment is incomplete, and the amount of the amplified DNA fragment corresponding to the cancer-associated gene mRNA to be detected cannot be confirmed. Re, cases.
  • the amount of amplified DNA can be determined, for example, by subjecting the above nucleic acid amplification reaction solution to agarose gel electrophoresis, and using a labeled probe that specifically hybridizes to the target amplified fragment. It can be confirmed by the position of the band and the signal intensity. Therefore, it can be determined that the higher the signal intensity obtained using a certain amount of the crude RNA sample extracted from the extracorporeally extracted sample, the higher the expression level of the cancer-related gene to be detected.
  • the label of the probe is not particularly limited.
  • a fluorescent substance represented by fluorescein can be used.
  • the signal intensity can be represented by, for example, an autoradiogram obtained by the above method or the IOD of a band on a fluorescent image.
  • the expression level of the cancer-related gene may be determined based on the IOD of the band on the fluorescence image instead of the fluorescence intensity.
  • the purpose can be achieved by applying a quantitative PCR method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-504886).
  • a typical method has primer base sequences used for amplification of the target gene at both ends, adds a known amount of nucleic acid having a different internal sequence or size as an internal standard, amplifies by PCR, and amplifies the final amount of the target product. Is used to estimate the amount of the target gene based on the final amplification of the internal sample.
  • the internal sample is not limited to an externally added sample, and it is possible to use cDNA which is a type II mRNA of a gene equivalently expressed in normal tissues and cancer tissues. good.
  • cDNAs include, for example, actin gene cDNA, which is a component of the cytoskeleton.
  • a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 20 and 21 in the Sequence Listing is used as a primer pair for a nucleic acid amplification reaction.
  • (a) of FIG. 3 As shown in FIG. 3, (a) of the SEQ ID NO: No .: 1. It is possible to amplify only the nucleotide sequence region represented by base numbers 46 to 411.
  • RNA sample extracted from an in vitro extracted sample specifically hybridizes with the cancer-related gene mRNA to be detected or a part thereof. It can be carried out by adding an excess amount of RNA as a probe and measuring the amount of RNA remaining after RNase digestion. That is, it can be determined that the higher the amount of the remaining RNA, the higher the expression level of the cancer-related gene.
  • the probe used in the method is, for example, incubated in a hybridization buffer consisting of 80% formamide, 4 OmM Pipes (pH 6.4), 40 OmM NaCl, and 1 mM EDTA at 45 for 20 hours.
  • the RNA is not particularly limited as long as the RNA is hybridizable and has a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence specific to the cancer-related gene mRNA to be detected.
  • the label of the probe is not particularly limited, and for example, a radioactive substance represented by 32 P and a fluorescent substance represented by fluorescein can be used.
  • RNA sample extracted from the sample tissue is fractionated based on molecular weight, etc., fixed on a nylon filter, etc., and the cancer-related gene to be detected is detected. It can be carried out by contacting an mRNA with an excessive amount of the gene detection probe and measuring the signal intensity obtained from the probe hybridized to the immobilized RNA. That is, it can be determined that the higher the signal intensity, the higher the expression level of the cancer-related gene.
  • the hybridization in the method is, for example, a hybridization consisting of 50% formamide, 0.65 M NaCl, 0.1 M sodium-Pipes, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.1% SDS, 5 mM EDTA. This means that hybridization is possible by keeping the buffer at 42 ° C for 20 hours.
  • the detection probe is composed of a base complementary to the base sequence specific to the mRNA of the cancer-related gene to be detected. Although it is preferable that the nucleic acid has a sequence, it is particularly limited even if it has a nucleotide sequence that can provide a signal at several points in the detection of RNA, as long as the mRNA to be detected can be identified by the signal position. Not done. Labels are also particularly limited Sarezu of the probe, for example, other radioactive materials typified 3 2 P, it is possible to use a fluorescent material represented by Furuoresein.
  • FIG. 2 shows an example in which a change in the expression level of the cancer-related gene mRNA was detected by the Northern hybridization method.
  • the figure is an autoradiogram obtained by separately electrophoresing RNAs obtained from a cancer tissue and a control normal tissue, and then hybridizing the labeled probe for detecting CA11 gene mRNA in the present specification. It is a photograph that reproduces.
  • the change in the expression level of a cancer-related gene is confirmed using a protein as an indicator, it can be confirmed by the biological activity of the protein.
  • an antibody against the protein is used because of its simplicity. Is preferred.
  • the antibody in the present invention is an antibody that specifically binds to a protein encoded by a cancer-related gene. Therefore, it can be determined that the expression level of the cancer-related gene is high if the amount of the antibody bound to a certain amount of the crude protein extracted from the extracorporeal sample is large.
  • Protein as an antigen for obtaining the antibody can be purified from cancer cells expressing the gene, but can also be obtained by using genetic engineering techniques.
  • a nucleic acid encoding the protein can be obtained by a combination of the above-mentioned DD method and screening of a cDNA library prepared from cells expressing the target protein.
  • the target protein can be obtained by incorporating the obtained cDNA into an appropriate expression vector and expressing it in an appropriate host.
  • the present protein may be expressed as a fusion protein.
  • an appropriate peptide chain is added to the N-terminus or C-terminus derived from another protein and expressed, and has an affinity for this peptide chain.
  • the antigen for obtaining the antibody does not necessarily need to use the whole protein, and may be a peptide having an amino acid sequence region specific to the protein that can be recognized by the antibody.
  • the antibody can be obtained as an antiserum by, for example, immunizing an animal with a peptide together with an adjuvant by a conventional method. Further, it can also be obtained as a monoclonal antibody by the method of Galfre et al. [Galfre. G. et al., Neichia, Vol. 266, pp. 550-552 (1977)].
  • cells are treated with a detergent to lyse intracellular proteins, the proteins are separated by SDS-polyacrylamide electrophoresis, transferred to a nitrocellulose membrane, etc., and detected with a specific antibody
  • the antibody bound to the protein can be detected secondarily using, for example, 25 I-labeled protein A, peroxidase-conjugated anti-IgG antibody, or the like.
  • the second invention of the present invention provides a kit for detecting a cancer cell. That is, a kit for detecting cancer cells can be provided by using the method for detecting cancer cells of the first invention of the present invention. Specifically, in a method for detecting a change in the expression level of a cancer-related gene in a cell, a kit for detecting the amount of mRNA or protein expressed by the gene as an index is exemplified.
  • a cDNA is a DNA capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA represented by a base sequence containing any of the base sequences shown in any of the above or a DNA shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing. It is an essential requirement to construct a primer pair having the properties described in the above cancer cell detection method capable of detecting mRNA. I do.
  • the kit of the present invention using RT-PCR as a detection method may incorporate reverse transcriptase, dNTP, and thermostable DNA polymerase in addition to the above primer pair.
  • the type and number of cancer-related genes detected by this kit are not particularly limited. Accordingly, the pair of primers constituting the kit is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type and number of cancer-related genes to be detected.
  • Table 2 shows an example of a pair of primers which make the cancer-related gene cDNA of the present invention type II and specifically amplifies only a partial region thereof.
  • a symbol combining alphabet and a number indicates the primer name in the present invention, and a number in parentheses attached to each symbol indicates a base sequence of each primer.
  • the actin shown in Table 2 is a gene selected as an internal standard for the purpose of quantifying cancer-related gene mRNA in a crude RNA sample extracted from an in vitro extracted sample.
  • the cDNA is any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 A cancer wherein the DNA represented by the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the DNA represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing is a DNA capable of hybridizing under stringent conditions;
  • a probe capable of detecting the mRNA of the relevant gene and having the properties described in the above-mentioned method for detecting cancer is an essential component of the configuration.
  • the probe constituting the kit is not particularly limited as long as it can be appropriately selected depending on the type and number of the cancer-related genes to be detected.
  • a probe for detecting cancer cells by a protein-based detection method using an antibody is used.
  • the DNA represented by the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 16 or the DNA represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 16 in the sequence listing The method according to the above-mentioned method for detecting cancer cells, wherein the method specifically and individually binds to a peptide encoded by a DNA represented by a nucleotide sequence containing a DNA sequence capable of hybridizing under stringent conditions.
  • Antibodies with properties are required for construction.
  • the type and number of cancer-related genes detected by the kit are not particularly limited. Therefore, the antibody constituting the kit may be appropriately selected depending on the type and number of the cancer-related gene to be detected, and is not particularly limited.
  • the kit can be used to diagnose cancer based on the measurement of the expression level of a cancer-related gene. That is, a human for whom the presence of cancer cells has been confirmed by the method for detecting cancer cells using the kit can be determined to be cancer-positive.
  • a third invention of the present invention is a method for controlling the growth of cancer cells using a cancer-related gene or a specific binding substance to the gene expression product.
  • specific binding substance in the present specification include nucleic acids, antibodies, cytotoxic T lymphocytes (CTL) and the like.
  • the bcr-abl chimeric protein which is frequently detected in chronic myeloid leukemia, has high tyrosine kinase activity and plays an important role in the development and proliferation of leukemia.
  • the antisense oligonucleotide for the gene encoding this chimeric protein is vo can suppress the growth of the tumor expressing the gene (Skorski, T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 4504 1994).
  • a cancer-specific peptide of a protein specifically expressed in cancer cells can be a target of a T cell immune response against cancer cells. Immunization provides T cells reactive with the fusion protein (Chen, W. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the technique described in the following report can be used as a method for implementing the method. That is, human T cells specifically react with the ras peptide in which the first amino acid glycine was substituted with another amino acid, and CD4 + T cells having HLA-DR restriction were isolated (Jung, SJ Exp. Med. 173, 273 1991), CTLs from mice immunized with a recombinant vaccinia virus capable of producing a ras protein with a mutation at amino acid 1 can be induced for a peptide consisting of 8 amino acids including the mutation site (Skipper, JJ Exp. Med. 177, 1493 1993).
  • mice immunized with the genetically engineered soluble mutant ras protein suppresses the in vivo growth of cancer cells carrying the same mutation (Fenton, RGJ Natl. Cancer Inst. 85, 1294 1993). From the spleen cells sensitized with the mutant ras peptide, CTLs exhibiting cytotoxic activity against cancer cells expressing the same mutant ras can be obtained (Peace. DJJ Exp. Med. 179, 473 1994).
  • the fourth invention of the present invention provides a novel peptide which can be used for cancer detection and a nucleic acid encoding the peptide.
  • homologous search using a database containing the nucleotide sequence information of the genes was performed to find CA11, CA13, GG33.GC35, Except GC 36, CA 42 It was revealed that this was a gene that had already been isolated and identified. That is, CC24 is a cytochrome c oxidase subunit I gene (Horai, S. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 92, No.
  • AG26 is the p190-B gene [Burbelo, PD, et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 309 9 19 309 626 (19995)]
  • GC31 is a cytochrome c oxidase subunit II gene [Power MD (Power, MD) et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, No. 673 4 (1998)]
  • GC32 is a cytochrome b gene [Anderson, S. et al., Natchiya 1, Vol. 290, pp. 457-465 (pp. 1980). 1)]
  • GC33 is the integrin 6 subunit gene [Tamura, RN ) Et al., Journal of Cell Biology, Vol.
  • GG24 is F 1 — ATP ace ⁇ Subunit gene [Ohta, S. et al., The Journal of Biochemistry. Vol. 99, pp. 135-141 (19986) )]
  • CC62 corresponds to the lactofluorin gene [Rey MW (Rey, MW) et al., Nucleic Acids Research, Vol. 18, pg. 5288 (1990)].
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding 16 S rRNA Horai S. et al., Processings of the National Academy of Sciences of the United States, Vol. 92, pp. 532-536. (1995)] and a clone differing in 7 bases from a partial region. The relationship between these genes and carcinogenesis is not known.
  • nucleic acid having the nucleotide sequence clarified by the present invention is the present invention. It is a novel nucleic acid isolated for the first time by the present inventors.
  • the peptides encoded by the novel nucleic acids according to the present invention which consist of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 13 in the sequence listing, respectively have the sequences shown in the sequence listing from the nucleotide sequences. It is presumed to consist of the amino acid sequences described in Nos. 17, 18, and 19, but is not limited thereto. That is, (1) a peptide containing all or a part of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 17 to 19, and (2) any of SEQ ID NOs: 17 to 19 in the sequence list.
  • It also includes peptides in which one or more amino acids have been added, deleted or substituted in the amino acid sequence described, and whose expression level changes due to cell carcinogenesis. It is for the following reasons. In naturally occurring proteins, deletions, insertions, and additions of amino acids in the amino acid sequence due to polymorphisms and mutations in the gene that encodes them, and modification reactions in vivo and during purification of the produced proteins Mutations such as substitution may occur. However, when such a mutation is present in a portion that is not important with respect to the activity or retention of the structure of the protein, some of them may exhibit physiological and biological activities substantially equivalent to those of the protein having no mutation. Because it is known.
  • the key disclosed by the present invention Deletion, insertion, addition, or substitution of one or several amino acid residues in the amino acid sequence Even if the amino acid sequence is indicated by an amino acid sequence, there is no difference in the expression level due to canceration If so, it is within the scope of the present invention.
  • proteins are known to have peptide regions that are not essential for activity.
  • signal peptides present in extracellularly secreted proteins and prosequences found in protease precursors, etc. Removed upon conversion.
  • Such proteins exist in different forms in the primary structure, but ultimately express the same function.
  • a peptide chain irrelevant to the activity of the protein may be added to the amino or carboxyl terminus of the protein of interest.
  • a fusion protein in which a part of the amino terminal region of a protein highly expressed in the host used is added to the amino terminal of the target protein is produced. May be done.
  • a peptide having an affinity for a specific substance has been added to the amino or carboxyl terminus of the target protein.
  • peptide refers to one in which two or more amino acids are connected by a peptide bond, and includes those described as “protein”.
  • novel nucleic acids according to the present invention include any of SEQ ID NOs: 17 to 19 in the sequence listing. Or a nucleic acid encoding a peptide having an amino acid sequence according to
  • the base sequence is, as shown in Table 1, for example, the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1, 2 and 13 in the sequence listing. That is, the peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing is represented by base numbers 3 to 584 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19 corresponds to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.
  • a peptide that contains all or a part of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 17 to 19 in the sequence listing and can be used for detecting cancer cells (2) a nucleic acid encoding a peptide capable of hybridizing to the novel nucleic acid of the present invention under stringent conditions, the expression of which changes when cancerous cells of the cell, (3) SEQ ID NO: 17 in the sequence listing
  • nucleic acids are also within the scope of the present invention.
  • nucleic acid encoding an amino acid sequence described in the present specification will be explained. It is known that 1 to 6 codons (combinations of three bases) that specify amino acids on a gene exist for each type of amino acid. Accordingly, a large number of nucleic acids encoding a certain amino acid sequence can exist depending on the amino acid sequence. Genes do not exist stably in nature, and mutations in their nucleotide sequences are rare. In some cases, a mutation that occurs in a gene does not change the amino acid sequence encoded therein (called a silent mutation). In this case, it can be said that different nucleic acids encoding the same amino acid sequence have been generated.
  • nucleic acid encoding a specific amino acid sequence is isolated, It is undeniable that a variety of nucleic acids encoding the same amino acid sequence will be produced as the organisms containing it are passaged. Furthermore, it is not difficult to artificially produce various kinds of nucleic acids encoding the same amino acid sequence by using various genetic engineering techniques. For example, in the production of genetically engineered proteins, if the codons used on the original nucleic acid encoding the protein of interest are infrequently used in the host, the expression level of the protein may decrease. May be low. In such cases, high expression of the target protein is achieved by artificially converting codons to those commonly used in the host without changing the encoded amino acid sequence.
  • nucleic acid having a slightly different base sequence but the same encoded amino acid sequence is obtained.
  • the length of nucleotide number 1784 is A
  • the nucleotide number 1985 K is T.
  • cDNA in which R of base number 1784 is G and K of base number 1985 is T, and R of base number 1784 Has been obtained and a nucleic acid in which the base number 1985 K is G is also obtained.
  • nucleotide numbers 1698 to 18050 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing are nucleotide numbers 1698 to 18050 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • All of the peptides encoded by the three nucleic acids have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
  • the cDNAs of the GG33, GC35, and GC36 genes are shown in SEQ ID NOs: 9, 11, and 12, 15, and 16, respectively, in the sequence listing. It has the indicated base sequence.
  • the novel nucleic acid of the present invention can hybridize the nucleic acid represented by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9, 11 and 12, 15, 15 and 16 under stringent conditions. Nucleic acids complementary to the base sequence of mRNA, which is possible and whose expression level changes due to canceration of cells, are also included in the present invention. In fact, a nucleic acid having the above properties has been obtained in the present invention.
  • the CC34 gene cDNA has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • T of base number 935 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing is replaced with A, and 6 bases consisting of the 3 ′ terminal GTTAAG sequence are deleted. ing.
  • the fifth invention of the present invention provides an antibody against a peptide encoded by the novel nucleic acid of the present invention.
  • the antibody can be used for detecting the above-mentioned cancer cells.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • RNA was extracted from stomach cancer tissue and control normal tissue extracted from patients with advanced cancer with poorly differentiated adenocarcinoma using TRIZ01 TM reagent (manufactured by Gibco BRL) to obtain crude RNA samples. . Of the crude RNA sample obtained in this way, 50 £
  • RNA RNA was reacted 1 0 unit of DNa sel (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 37 ° C, 30 minutes in the presence of, to remove genomic DN A Was.
  • RT-PCR was performed using Differentia 1 Display TM Kit (manufactured by Display System) and Enzyme Set—DD (manufactured by Takara Shuzo) according to the procedure described in the kit. Was.
  • nucleic acid amplification was performed by PCR using any one of the 1-mer oligonucleotides in the kit having the nucleotide sequence shown in 55 as an upstream primer, and a total of 54 amplified DNA samples were prepared.
  • the electrophoresis was performed on a 7 IV [urea-denatured 5 polyacrylamide gel, and a finger print consisting of a number of bands was obtained by autoradiography.
  • the autoradiogram obtained from the cancer tissue and the control normal tissue sample were analyzed. There were bands with different signal intensities in the autoradiogram obtained from the base.
  • FIG. 1 shows the results of using D4 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 59 in the sequence listing as the downstream primer, and using U1 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 50 in the sequence listing as the upstream primer.
  • Fig. 1 shows that cancer-related genes 4 is a photograph reproducing an autoradiogram showing an electrophoresis pattern of the obtained DNA fragment when detected by Method D.
  • 1N represents an amplified DNA fragment obtained as a type II crude RNA sample obtained from normal tissue of a poorly differentiated adenocarcinoma-type gastric cancer patient
  • 1T represents the same poorly differentiated adenocarcinoma gastric cancer patient.
  • the lanes show that the amplified DNA fragments obtained from the crude RNA sample obtained from the cancer tissue of Example 1 as type III were respectively electrophoresed on an acrylamide gel.
  • a band with a stronger signal intensity than the autoradiogram obtained from the cancer tissue sample at the position of about 75 Obp in the number of bases indicated by the black circle in Fig. 1 shows the auto-radiogram obtained from the control normal tissue sample.
  • the present inventors have named a gene that expresses an mRNA that produces a band having this difference in intensity as CA11.
  • Table 3 shows the combinations of upstream and downstream primers and amplified DNA for detecting the difference in the expression level of each mRNA by the DD method for each gene detected and named by the present inventors using the DD method.
  • the approximate size of the fragments and the differences in the amount of amplified DNA obtained by RT-PCR based on cancer tissue and control normal tissue samples are shown.
  • a symbol combining alphabets and numbers indicates a primer name, and the number in parentheses attached to each symbol indicates a sequence indicating the base sequence of the primer in the sequence listing. Indicates a number.
  • the Northern Hybridization method was examined. That is, cancer The difference in the expression level of mRNA of the cancer-related gene expressed in the tissue and the control normal tissue was examined as to whether or not each amplified DNA fragment obtained by the method described in 1) can be detected as a probe.
  • the detection probe was prepared as follows. That is, a region containing each amplified DNA fragment shown in Table 3 was cut out from an acrylamide gel on which the amplified DNA fragment obtained by the DD method described in 1) was run, and 100/1 water was added and heat was applied. The DNA fragments contained were individually recovered by extraction. These DNA fragments were individually converted into type III and reamplified by PCR using a combination of upstream and downstream primers used to obtain each DNA fragment shown in Table 3. Further, about 100 ng of each amplified DNA fragment was labeled with 32 P using a random primer-DNA labeling kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to produce 14 kinds of detection probes.
  • a random primer-DNA labeling kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • 8-actin gene mRNA was selected, and a synthetic oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 65 in the sequence listing was similarly labeled with 32 P. Then, it was used as a probe for detecting 8-actin gene mRNA.
  • the above-mentioned detection probes were individually mixed with 100 ⁇ g Zm1 of dicin sperm DNA, and then heat-denatured together with a hybridization buffer (50% formamide, 0. In addition to 65 M NaCl, 0.1 M sodium-Pipes, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.1% SDS, 5 mM EDTA), 15 kinds of probe solutions for detection in Northern hybridization were prepared.
  • the Northern Hybridization was performed as follows. First, crude RNA samples extracted from cancer tissue of gastric cancer patients and control normal tissues prepared by the above-described method were individually electrophoresed on a formalin-modified 1% agarose gel at 20 ag / well, and then subjected to Hybond N + membrane. (Manufactured by Amersham). Next, a blotting membrane and a hybridization buffer containing heat-denatured two-sperm sperm DNA at a final concentration of 100 g / ml were added to Hyprivac (manufactured by Cosmo Bio Inc.) at 42 ° C. , Leave for 2hrs, buffer The solution was discarded to prepare a pre-hybridization-treated membrane.
  • FIG. 2 shows the result of detection of mRNA of CA11 gene.
  • 1 N is a crude RNA sample obtained from a normal tissue of a poorly differentiated adenocarcinoma type gastric cancer patient
  • 1 T is a crude RNA sample obtained from a cancer tissue of the same poorly differentiated adenocarcinoma gastric cancer patient.
  • (A) shows the results using a probe for detecting CA11
  • (b) shows the results using a probe for detecting 8-actin.
  • the signal was obtained with the 3-actin detection probe for both 1N and 1T, indicating that the RNA was extracted without excessive degradation in both samples.
  • the signal intensity was measured for each band of the autoradiogram by densitometry overnight. Specified. Next, I ⁇ D of each band obtained by the autoradiogram is calculated by FMB I 0-100 (manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.) to determine whether it is a cancer-related gene by the following equation. Index value was calculated.
  • each symbol represents the following value.
  • the crude RNA samples obtained from cancer tissues of gastric cancer patients and control normal tissues prepared by the method described in 1) were used as DNase.
  • use 40 ng of each in a reaction system of 100 ⁇ 1 using TaKaRaRNAPCRKitVer. 2.1 according to the procedure described in the instructions attached to the kit. was done. That is, a reverse transcription reaction solution (10 mM Tris-HC and pH 8.3, 5) was used, using 40 ng of the crude RNA sample as type I and an oligo (dT) primer (final concentration 2.5 / M) as the downstream primer.
  • the reverse transcription reaction was performed for 5 minutes at 95 ° C for 5 minutes.
  • Each of the above reverse transcription reaction solutions was used as a primer for CA13, CC24, GG24, AG26, GC33, GG33.
  • Table 4 shows the results of the above-mentioned Northern hybridization method and RT-PCR method, and the change in expression of each gene caused by canceration, which was evident from the results.
  • the gene whose expression is amplified by canceration is indicated by ⁇
  • the gene whose expression is suppressed by canceration is indicated by. That is, in Table 4, it was determined that the index value was greater than 1, the gene was a gene whose gene expression level increased due to canceration, and a gene whose index value was less than 1 was a gene whose gene expression level decreased due to canceration.
  • A indicates an autoradiogram of Northern hybridization
  • B indicates that it was determined from an electrophoresis photograph of the amplification product of RT-PCR.
  • cDNA fragments of these cancer-related genes were cloned.
  • mRNA purification kit Pharmacia
  • phage and host cells XL I were used to make about 40,000 plaques per 10 cm x 14 cm square plate.
  • B 1 ue MRF ' was plated to prepare a cDNA library.
  • the phage particles are transferred to a Hybond N + membrane, and screened by plaque hybridization using the same probe as used in the Northern hybridization described in 2) to obtain the cDNA gene of interest. Containing Un i—ZAP XR clone was found. In vitro exciton from this recombinant Uni—ZAP XR clone
  • the nucleotide sequence obtained in this way was used for the BLAST program (Altschul S.F.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 is shown in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.
  • CC 24 is cytochrome c oxidase subunit I gene
  • AG 26 is p190-B gene
  • GC 31 is cytochrome c oxidase subunit II gene
  • GC 32 is cytochrome b gene
  • GC 3 3 corresponds to the integrin a6 subunit gene
  • GG24 corresponds to the F1-ATP ace ⁇ subunit gene
  • CC62 corresponds to the lactofluorin gene.
  • the nucleotide sequence region shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing of CC34cDNII was different from the partial region of cDNA encoding mitochondrial 16 S rRNA by 7 bases. .
  • Example 1 a cancer tissue different from that in Example 1 was used to examine the relationship between the expression of the gene and cell pain.
  • Example 1 (1) Confirmation of changes in gene expression in cancer tissues of signet-ring cell type gastric cancer patients Different from the cancer patients to which the tissues used in Examples 1 (1) and 2) were provided, the same as in Example 1 (1) from cancer tissues removed from patients with signet-ring cell stomach cancer and control normal tissues Using the crude RNA sample prepared in the above, the Northern hybridization or RT-PCR described in 2) of Example 1 was performed, and each of the 14 cancer-related genes identified in 3) of Example 1 was performed. The expression levels in cancer tissues and normal tissues were compared using the mRNA expression level as an index. As an example, FIG. 3 shows the results of detecting the CA11 gene mRNA by RT-PCR. That is, FIG.
  • FIG. 3 is a photograph showing a fluorescence image of electrophoresis of the obtained DNA fragment when a change in the expression level of a cancer-related gene is detected by the RT-PCR method.
  • the reaction conditions of RT-PCR were set according to the method described in 2) of Example 1, and the number of PCR cycles was set to 25 and 30.
  • FIG. 3 shows the result of detecting the expression of the cancer-related gene CA11, and (b) shows the result of detecting the expression of 3-actin as a positive control.
  • FIG. 3 shows the result of detecting the expression of the cancer-related gene CA11, and (b) shows the result of detecting the expression of 3-actin as a positive control.
  • 2T is an amplified DNA fragment obtained as a type II crude RNA sample extracted from gastric cancer tissue of a signet-ring cell type gastric cancer patient
  • 2N is extracted from a normal gastric tissue of a signet-ring cell type gastric cancer patient.
  • the amplified DNA fragment was an amplified DNA fragment obtained by using the obtained crude RNA sample as type II.
  • 25 and 30 in FIG. 3 indicate the number of nucleic acid amplification cycles in the RT-PCR method.
  • Table 5 shows the results of calculating the IOD of the bands on the fluorescence image shown in FIG. Note that the index values in Table 5 are values calculated by Equation 2 described in 2) of Example 1. Table 5 Number of cycles 25 30
  • Example 3 The same expression level change was observed in 13 cancer-related genes other than CA11 in the same manner as in Example 1, 2), and the 14 types of cancer were clearly identified in Example 1, 3). It was clarified that the change in the expression level of the cancer-related gene was not a change specific to the patient's tissue used in 1) of Example 1).
  • Example 3
  • a cancer detection kit using the RT-PCR method and having the following components was constructed.
  • DNase I DNase I
  • AMV reverse transcriptase RNase inhibitor
  • 10 XRT-PCR buffer 10 OmM Tris-HC1, pH 8.3, 50 OmM
  • KC1 25mM MgC l 2 , each 2.
  • dATP of 5 mM, dGTP, d CTP, a mixture consisting of dTTP, an oligo (dT) primer, Taq DNA polymerase, primer pairs specific to each of the genes shown in Tables 2 and Includes primer pairs for amplification of S-actin gene as a positive control.
  • the symbol of the combination of alphabet and number indicates the name of the primer, and the number in parentheses accompanying the symbol indicates the sequence number of the base sequence of the primer in the sequence listing. Is shown. Industrial applicability
  • cancer can be easily and quickly detected. Also related to cancer The existence of a novel nucleic acid has become apparent. Equivalent
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA sequence CAGATCTACC GAATCAAAAT C 21 SEQ ID NO: 4 5
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid Number of chains: single strand
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Description

明 細 書 癌関連遺伝子 技術分野
本発明は癌化により発現量が変化する遺伝子の発現産物を検出することを特徴 とする、 癌細胞の検出方法に関する。 また本発明は癌化により発現量が変化する 遺伝子及び該遺伝子産物に関する。 背景技術
癌は 1 9 8 1年以降日本における死因の 1位を占め、 中でも胃癌は最も頻度の 高い癌である。 近年正常細胞が癌になるまでの多段階発癌機構が存在することが 知られてきており 〔フィ一ロン E . R . (Fearon，E. R. )ら、 セル （Cel l) 、 第 6 1巻、 第 7 5 9〜7 6 7頁 （ 1 9 9 0 ) 、 スギムラ T. (Sugimura, T. )、 サイェ ンス（Science) 、 第 2 5 8巻、 第 6 0 3〜6 0 7頁 （ 1 9 9 2 ) 〕 、 D N A修復 遺伝子、 癌抑制遺伝子、 及び癌遺伝子を含む複数の遺伝子異常の蓄積が必要とさ れている。 一般に、 遺伝子の不安定性と癌抑制遺伝子の不活化は癌の発生に、 癌 遺伝子の活性化及び/又は増殖因子の過剰発現は癌の進展、 悪性化に関与する。 遺伝子の不安定性には、 D N Aミスマッチ修復系の異常に関連した遺伝子の不 安定性と染色体レベルの不安定性がある。 前者の例としてゲノム中に存在する単 純繰り返し配列の鎖長が同一人の癌部と非癌部で異なること （マイクロサテライ ト不安定性） 〔シボド一 S . N. (Thibodeau, S. N. ) ら、 サイエンス、 第 2 6 0巻、 第 8 1 6〜8 1 9頁 （ 1 9 9 3 ) 〕 、 後者の例として、 染色体間の転座が 挙げられる。 この染色体間の転座は、 正常細胞では認められないタンパク質を発 現させたり、 正常細胞において発現しているタンパク質であっても、 その発現量 に影響を与える場合がある。 実際、 ヒトの慢性骨髄性白血病において、 染色体間 の転座により、 bcr 遺伝子と c- abl 遺伝子の融合が起こり、 正常細胞では存在し ない bcr-abl 融合遺伝子より転写されたハイプリッド mRNAの発現が確認された。 更に、 bcr-abl融合遺伝子を動物に導入すると白血病を発症することが確認され た 〔ワトソン (Watson, J.D.)ら著、 組み換え DN Aの分子生物学 第 2版；丸善 株式会社、 第 30 9頁 （ 1 9 92) 〕 。
癌抑制遺伝子の不活化としては、 例えば、 p 5 3遺伝子の不活化が挙げられる 。 不活化の原因としては、 遺伝子内の欠失かコード領域の特定の部分に起こる点 突然変異によると考えられている 〔ニグ口 J. M. (Nigro, J.M.)ら、 ネーチヤ ― (Nature) 、 第 342巻、 第 70 5〜 708頁 （ 1 98 9) 、 マルキン D (Ma lkin.D.)ら、 サイエンス、 第 250巻、 第 1 233〜 1 238頁 （ 1 9 9 0) 〕 。 また、 p 5 3遺伝子の欠失及び点突然変異は多くの種類の癌で観察され、 例え ば胃癌では早期癌の 6割以上の症例に認められることから 〔ョコザキ H. (Yoko zaki，H.)ら、 ジャーナル ォブ キャンサー リサーチ アンド クリニカルォ ンコロジー (Journal of Cancer Research and Clinical Oncology) 、 第 1 1 9 巻、 第 67〜70頁 （ 1 9 92 ) 〕 、 これらの変異の検出は、 癌の早期検出に利 用できると考えられる。
一方、 P16/MTS1遺伝子はホモ欠失により不活化する遺伝子として知られており グリオ一マゃ脬癌、 ぼうこう癌などで高頻度のホモ欠失が観察されている 〔ケア ンズ P. (Cairns, P.)ら、 ネーチヤ一 ジエネテイクス （Nature genetics)、 第 1 1巻、 第 2 1 0〜2 1 2頁 （ 1 9 9 5 ) 〕 。 pl6 タンパク質は細胞周期を調節 しており P16発現異常は細胞の癌化に関与することが示唆されている 〔オカモト A. (Okamoto.A.) ら、 プロシーディングズ ォブ ザ ナショナル ァカデミ ― ォブ サイエンシーズ ォブ ザ US A (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)^ 第 9 1巻、 第 1 1 0 4 5〜1 1 04 9頁 （ 1 9 94 ) 〕 。
癌遺伝子の活性化としては、 例えば、 癌遺伝子近傍における、 ウィルスの挿入 突然変異や、 染色体間の転座が原因として挙げられる。 例えば、 トリ白血病ウイ ルス avian leukosis virus (ALV) によって起こる、 ニヮトリのリンパ腫におい て、 ウィルスによる揷入突然変異が確認されている。 この場合、 ALV の DNA が遺 伝子の一種である C- mycの近傍に挿入され、 ウィルスの強いェンハンサ一とプロ モーターにより、 正常な c-mycが過剰発現したり、 正常な遺伝子とは一部異なつ た新しい配列が発現されることが確認された。 また、 ある種のヒト B細胞の腫瘍 では、 染色体間の転座により、 癌遺伝子の一^ 3である c-mycが免疫グロブリンの 強い転写シグナルのもとに置かれ、 その mRNA発現量が増加することが確認さ れている。 この場合、 癌細胞における c-mycタンパク質は、 正常細胞に発現して いる該 c-mycタンパク質と差は認められず、 癌化は、 c-myc mRNA発現量の増 加に起因していると考えられている 〔ワトソン（Watson, J.D.)ら著、 組み換え D N Aの分子生物学 第 2版；丸善株式会社、 第 305〜 30 8頁 （ 1 9 92) 〕 ο
増殖因子の過剰発現としては、 例えば、 肝細胞増殖因子レセプ夕一をコードす る C- Metの過剰発現が挙げられる。 この C-Metの発現異常は、 胃癌の発生初期か ら正常粘膜には認められない 6. 0 k bの長さを有する m R N Aの発現が見られ たり 〔クニヤス H. (Kuniyasu.H.)ら、 インタ一ナショナル ジャーナル ォブ キャンサー （International Journal of Cancer)、 第 5 5巻、 第 72〜 75頁 ( 1 9 93 ) 〕 、 高頻度で見られ、 遺伝子増幅と癌の悪性度に相関性が確認され ている 〔クニヤス H. ら、 バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサ一 チ コミュニケ一ションス (Biochemical and Biophysical Research Communica tions)、 第 1 8 9巻、 第 227〜 232頁 （ 1 9 92) 〕。
遺伝子異常と癌の悪性度に相関が確認されている例として、 上記 c-Met のほか 、 癌遺伝子である C-erbB2遺伝子の増幅及び/又はその過剰発現が、 乳癌、 卵巣 癌、 胃癌、 子宮癌などにおいて 〔ライト C. (Wright, C.)ら、 キャンサー リサ ーチ （Cancer Research), 第 4 9巻、 第 20 8 7〜 20 90頁 （ 1 9 8 9) 、 サ ファリ B . (Saffari. B. ) ら、 キャンサー リサーチ、 第 5 5巻、 第 5 6 9 3〜 5 6 9 8頁 （ 1 9 9 5 ) 〕 、 癌遺伝子 K- sam遺伝子の増幅及び Z又はその過剰発 現が、 胃癌の 1組織型である低分化腺癌において 〔夕ハラ E . (Tahara, E. ) ら 著、 ガストリック キャンサー， 東京 （Gastri c Cancer, Tokyo), スプリンガー 社 （Springer- Verlag：)、 1 9 9 3年発行、 第 2 0 9〜2 1 7頁〕 それぞれ確認さ れている。
このように癌の発生、 進展に関与する遺伝子、 及び該遺伝子異常に関する情報 は増えてきており、 生検材料からの遺伝子診断をすることにより、 癌の早期診断 や悪性度の判定に役立つことが予想される。 しかし、 発癌機構は多段階であり、 複数の変異の蓄積が必要とされることから、 癌化に関連する遺伝子についてはま だまだ未知の部分が多く、 更なる研究が必要である。 また近年、 正常型の p 5 3 遺伝子を癌細胞に導入することにより、 癌細胞の増殖を抑制する遺伝子治療も治 験段階で行われており、 癌抑制遺伝子の解明は診断のみならず遺伝子治療の可能 性を生み出す。
したがって、 本発明の第 1の目的は、 発癌の指標となりうる遺伝子、 特に、 細 胞の癌化に伴レ、発現状態が変化する遺伝子を見出し、 体外摘出試料における該遺 伝子の発現量の測定に基づく癌化した細胞の検出方法、 並びにその悪性度の判定 方法を提供することにある。 本発明の第 2の目的は、 上記癌細胞の検出方法及び /又は該細胞の悪性度の判定方法に使用され.るキッ トを提供することである。 本 発明の第 3の目的は発癌の指標となりうる遺伝子又は該遺伝子発現産物への特異 的結合物を用いた癌細胞増殖の制御方法である。 更に本発明の第 4の目的は癌化 に関連した新規なぺプチド、 及び該ぺプチドをコ一ドする核酸を提供することに める。
本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は体外摘出試料中の癌細胞の検出方 法に関する発明であって、 配列表の配列番号： 1〜1 6のいずれかに示される塩 基配列を含有する D N A又は配列表の配列番号： 1〜1 6のいずれかに示される 核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な D N Aを c D NAとす る遺伝子から選択される遺伝子の発現量の変化を、 例えば m R N Aの発現量の変 化、 夕ンパク質の発現量の変化により調べることを特徴とする。
本発明の第 2の発明は、 本発明の検出方法により癌を検出するためのキッ トに 関する発明であって、 発現量の変化の指標となる m R N Aを増幅するためのブラ イマ一、 又は該 m R NAにハイブリダィズするプローブ、 あるいは発現量の変化 の指標となるタンパク質を認識する抗体のいずれかを構成の必須要件とすること を特徴とする。
本発明の第 3の発明は遺伝子又は遺伝子発現産物の特異的結合物を用いた癌細 胞の増殖制御方法であって、 遺伝子 c D N Aが配列表の配列番号： 1〜1 6のい ずれかに示される塩基配列を含有する D NA又は配列表の配列番号： 1 ~ 1 6の いずれかに示される D NAにストリンジェントな条件下でハイプリダイズ可能な D N Aであることを特徴とし、 該遺伝子の転写制御及び 又は発現産物の機能制 御等からなる。
本発明の第 4の発明は、 癌の検出に利用できるぺプチド及び該ぺプチドをコ一 ドする核酸に関する発明であって、 配列表の配列番号： 1 7〜1 9に示されるァ ミノ酸配列の全部又はその一部を含有するァミノ酸配列からなるぺプチド及び該 ぺプチドをコ一ドする核酸であることを特徴とする。
本発明の第 5の発明は、 上記第 4の発明のぺプチドを認識する癌の検出に利用 できる抗体に関する。
なお、 本明細書において、 「体外摘出試料」 とは、 血液、 尿、 糞便、 外科的手 法により摘出した組織等を指す。 一方、 「癌関連遺伝子」 とは、 細胞の癌化に伴 レ、発現状態が変化する遺伝子を指す。 発明の開示
本発明者らは、 上記目的を達成するために癌患者の癌組織及び対照正常組織に おける、 遺伝子の細胞内発現量を個別に比較することにより、 癌関連遺伝子を見 出し、 該遺伝子の発現量の比較により、 癌細胞の検出が可能であることを見出し た。 また該癌関連遺伝子中に新規遺伝子を見出し、 本発明を完成するに至った。 なお本明細書における 「癌組織」 及び 「対照正常組織」 とは、 多細胞からなる 個体において癌病変部を構成する組織及び同一の個体において癌組織と空間的に 同一の領域を構成し且つ正常な機能を営んでいる組織を意味する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 癌関連遺伝子を D D法にて検出した場合の、 得られた D NA断片の 電気泳動のパターンを示すォ一トラジオグラムの図である。
第 2図は、 癌関連遺伝子 mR N Aの発現量の変化を、 ノーザンハイブリダィゼ —シヨン法により検出した場合の、 R N Aを電気泳動後、 目的 m R N Aに標識プ ローブをハイプリダイズさせることにより得られたォ一トラジオグラムの図であ 。
第 3図は、 癌関連遺伝子の発現変化を、 R T— P C R法により検出した場合の 、 得られた D NA断片の電気泳動のパターンを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を具体的に説明する。
本発明の第 1の発明は、 癌関連遺伝子の発現量を指標とした癌細胞検出方法を 提供する。
本発明にかかわる、 癌化の指標となりうる遺伝子は、 細胞の癌化に伴ってその 発現状態が変化する、 言い換えれば、 その発現が有意に誘導、 あるいは抑制され る遺伝子である。 このような遺伝子は、 例えば、 ゲノム中の遺伝子のコピー数や 染色体の転座のパターンの解析のほか、 正常細胞と癌化した細胞における遺伝子 産物の発現量を比較し、 両細胞間で差異のあるものを特定することにより検出す ることができる。 遺伝子産物としては、 例えば、 遺伝子より転写される mRNA や翻訳産物であるタンパク質が挙げられる。 本発明における癌関連遺伝子の検出 においては、 遺伝子操作技術の進歩に伴い、 その解析に様々な手法が開発されて いる mRNAの発現量を指標とするのが効率的である。 mRNAの発現量を指標 にした遺伝子発現量の変化を確認する手法としてはサブトラクティブハイプリダ ィゼーシヨン法 〔ツイムメルマン C. R. (Ziramermann. C.R.) ら、 セル、 第 2 1巻、 第 709〜 71 5頁 （1 989) 〕 、 リブレゼンテーショナル ディファ レンス アナリシス （Representational Difference Analysis) (RDA)法 〔リシ ツイン N. (Lisitsyn, N.) ら、 サイエンス、 第 259巻、 第 946〜 95 1頁 ( 1 993 ) 〕 、 分子インデックス法 （特開平 8— 322598号） 、 ディファ レンシャルディスプレイ （DD) 法 〔ライアン P. (Liang, P.) 、 及びパーディ 一 A. B. (Pardee, A.B.), サイエンス、 第 257巻、 第 967〜 971頁 （1 992 ) 〕 等があるが、 DD法は操作が簡便であり、 本発明における遺伝子のス クリーニングに適している。 以下、 本発明で利用した DD法を用いた癌関連遺伝 子のスクリーニング方法について、 詳細に説明する。
まず、 比較したい癌組織と対照正常組織より個別に抽出された RNAを各々 D Na s e処理することによりゲノム DN Aを除いた粗 RNA試料と、 オリゴ （dT ) アンカープライマー、 及び逆転写酵素 reverse transcriptase(RTase) を用い た逆転写反応により mRNAを cDN Aに変換する。 その後、 オリゴ （dT) アン カープライマーと種々のランダムプライマーを組合せたポリメラーゼ連鎖反応 （ PCR)により核酸増幅を行う。
次に、 比較すべき組織より個別に得られた PC R増幅産物を、 同一プライマー 対の組合せから得られた増幅産物毎にポリアクリルアミ ド電気泳動を行い、 その バンドパターンを比較し、 正常及び癌細胞間で差異のあるバンドを見出す。 この バンドをゲルより切り出し、 バンド中に含まれる核酸を抽出することにより、 癌 関連遺伝子 mRNAの一部領域に相補的であると思われる DNA断片を得ること ができる。
次に、 上記 DD法で得られた該 DNA断片により、 真に癌関連遺伝子 mRNA の発現量の変化を確認できるか検討する。 癌組織より正常組織の方が m R N Aの 発現量が高いと確認された場合、 該癌関連遺伝子は癌化により発現量が低下する 遺伝子と判断する。 一方、 正常組織より癌組織の方が mRNAの発現量が高いと 確認された場合、 該癌関連遺伝子は癌化により発現が増幅される遺伝子と判断す る。
mRNAの発現量の確認は、 例えば、 得られた該 DNA断片を標識し、 これを 検出用プローブとして癌組織及び対照正常組織より抽出された粗 RNA試料に対 しノーザンハイプリダイゼーションを行い、 得られるシグナル強度の差をデンシ トメーター等を用いて確認することにより実施することができる。 すなわち、 シ グナル強度が強いほど mRNAの発現量が高いと判断できる。 例えば、 ォ一トラ ジォグラム等で得られるバンドの体積値 〔I OD (I n t egr a t e d op t i c a 1 d en s i t y) ) としてシグナル強度を表す事ができ、 該 I 0D 値が大きいほど該バンドを与える mRNAの発現量が高いと判断出来る。
mRNAの発現量が低くノーザンハイプリダイゼーション解析で mRNAの発 現の変化を確認できない場合は、 上記 DD法で得られた、 癌関連遺伝子より発現 したと推定される mRNAを铸型とした増幅 DN A断片より作製した RN Aをプ ローブとして用いた、 より感度の高い RNa s eプロテクションアツセィ 〔クリ —グ P. A. (Krieg, P. A.) 、 及びメルトン D. A. (Melton, D. A. )、 メッツズ イン ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology). 第 1 55巻、 第 397〜 4 1 5頁 （1 987 ) 〕 により確認することも可能である。 本方法は、 一本鎖 R N Aには切断活性を示すが、 二本鎖 R N Aには切断活性を示さない基質特異性を 有する RNa s eを利用する。 すなわち、 検出対象となる mRNAと過剰量のプ ローブを正常組織より抽出した粗 RN A試料及び癌組織由来粗 RN A試料に添加 し、 対象となる mRNAと添加プローブとのハイプリッ ドを形成させ上記基質特 異性を有する RNa s eを作用させる。 mRN Aの発現量の確認は、 上記 RNa s e消化後の残存二本鎖 R N A量を測定することにより実施することができる。 すなわち、 残存二本鎖 RN A量が多いほど mRN Aの発現量が高いと判断できる また、 上記 DD法で得られた、 癌関連遺伝子より発現したと推定される mRN Aを铸型とした増幅 DNA断片の塩基配列を、 PCRダイレクトシ一クェンシン グ 〔エーリツヒ H. A. (Erlich, H.A.) 著、 PCRテクノロジ一 （PCR Techno logy) 、 ストックトン プレス （Stockton Press) 1 989年発行、 第 45〜 6 0頁〕 や、 TAクローニング 〔ミード D. A. (Mead.D.A.)ら、 バイオ/テクノ ロジ一 （Bio/Technology) 、 第 9巻、 第 657〜 663頁 （1 99 1) 〕 と通常 の塩基配列決定法を組合せることにより決定し、 その塩基配列情報を基に設計し た増幅プライマ一を用いた RT— PC R法による増幅産物量の比較により mRN Aの発現量を確認することも可能である。 すなわち、 得られた増幅産物の量が多 いほど、 mRNAの発現量が高いと判断できる。
なお、 上記 DD法で得られた、 癌関連遺伝子より発現したと推定される mRN Aを铸型とした増幅 DNA断片は、 必ずしも、 癌関連遺伝子 mRNA全長に相補 的な cDNAではない。 癌関連遺伝子 c DNAを得るためには、 例えば、 スクリ 一二ングに用いた組織の c D N Aライブラリイを作成し、 上記 D D法で得られた 、 癌関連遺伝子より発現したと推定される mRNAを铸型とした増幅 DNA断片 を標識し、 これを検出用プローブとしてプラークハイプリダイゼーシヨンを行う ことにより癌関連遺伝子 c DN Aクローンを単離することができる。
本発明者らは、 胃癌組織と対照の正常組織を用い、 上記の方法により、 1 4種 の癌関連遺伝子 c D N Aの一部塩基配列をそれぞれ含む D N A断片を単離するこ とに成功した。 こうして得られた DNA断片の塩基配列を含有する塩基配列で示 される cDNAに対応する mRNAを発現する遺伝子を、 それぞれ CA1 1、 C A 1 3、 CC 24、 GG24、 AG26、 GC3 1、 GC32、 GC33、 GG 3 3、 CC 3 4、 GC 3 5、 GC 3 6、 CA4 2、 CC 6 2と命名した。 表 1に 、 1 4種類の癌関連遺伝子各 c DNAの塩基配列において今回塩基配列を決定し た領域の塩基配列を示した配列表の配列番号と、 本発明者らが命名した上記遺伝 子名との対応を示す。
表 1
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上記癌関連遺伝子は、 癌化により発現量が減少するものと増加するものとに大 別することができる。 前者としては CA 1 し AG 2 6、 GC 35、 GC 3 6、 CC 62、 また後者としては C A 1 3、 CC 24、 GG 24、 GC 3 1、 GC 3 2、 GC 33、 GG 33、 CC 34、 CA4 2が挙げられる。
上記のようにして得られた各遺伝子の発現量の比較により、 癌細胞の検出を行 うことができる。 この場合、 指標となる癌関連遺伝子は、 上記遺伝子より適宜選 択すればよく、 1種類であっても、 また、 数種の組合せであってもよい。 また癌 細胞検出の指標とする癌関連遺伝子は、 上記 1 4種の遺伝子に特に限定されず、 細胞の癌化により該遺伝子発現量が異なれば、 配列表の配列番号： 1〜1 6のい ずれかに示される DNAにストリンジヱントな条件下でハイプリダイズ可能な D N Aを c DN Aとする遺伝子であってもよい。
本明細書におけるハイプリダイズ可能な条件とは、 例えば DNAを固定したナ イロン膜を、 6 XSSC ( 1 xSSCは塩化ナトリウム 8. 76 g、 クェン酸ナ トリウム 4. 4 1 g を 1 リッ トルの水に溶かしたもの） 、 1 % SDS、 1 0 0〃 g/m 1サケ精子 DNA、 0. 1 % ゥシ血清アルブミン、 0. 1 % ポリ ビニルピロリ ドン、 0. 1 % フィコールを含む溶液中で 6 5 °Cにて 20時間プ ローブと共に保温してハイプリダイゼ一ション可能であることをいう。
実際、 本発明においても上記性質を有する遺伝子の存在が確認された。 CC 3 4遺伝子 cDN Aの塩基配列中には配列表の配列番号： 1 0に示す塩基配列が存 在するが、 該配列の塩基番号 9 3 5の Tが Aに置換、 及び 3' 末端の GTTAA Gの配列からなる 6塩基が欠失した塩基配列で示される DNAが、 正常組織より 調製した RN Aと癌組織より調製した RN Aを用いた DD法において増幅量の異 なる DNA断片として得られた。 この増幅 DNA断片には配列表の配列番号： 1 0に示す DNAがハイブリダィズ可能である。 従って、 本発明における DD法に おいて得られた該 DN A断片を与える mRN Aを発現する遺伝子も、 本発明にお ける癌細胞を検出するための癌関連遺伝子に包含される。
癌細胞であるか否かの判定は、 まず、 複数の正常組織を用い、 適当な検出方法 により癌化の指標とする癌関連遺伝子の発現量の正常域値を確認し、 次に体外摘 出試料における癌関連遺伝子の発現量を測定し、 正常域値と比較することにより 実施する。 すなわち指標となる癌関連遺伝子が、 癌化により発現が抑制される場 合、 体外摘出試料において、 該癌関連遺伝子の発現が確認されない、 あるいは該 癌関連遺伝子の発現量が正常域値より低ければ、 癌陽性であると判定する。 一方 、 指標とする癌関連遺伝子が、 癌化により発現が増幅される場合、 該癌関連遺伝 子の発現量が正常域値より高ければ、 癌陽性であると判定する。 癌関連遺伝子の 発現量の比較には、 該遺伝子より発現された mRNAの量又はタンパク質の量の いずれを用いてもよい。 なお、 本明細書における正常域値は、 適当な検出方法に より求めた複数の正常組織における癌関連遺伝子の発現量を基に以下の式で表わ される。
式 1
〔正常域値〕
= 〔正常組織における癌関連遺伝子発現量の平均値〕 ±2x 〔標準偏差〕 上記正常域値には計算上、 癌関連遺伝子発現量を測定した正常組織の 95%が 包含されることになる。
mRNAを利用した検出方法としては、 例えば、 RT— PCR法、 RNa s e プロテクションアツセィ法、 あるいはノーザンハイプリダイゼーション法が挙げ られる。
RT— PCR (Reve r s e t r an s c r i b e d— Po l yme r a s e cha i n r e a c t i on) 法とは、 mRNAを铸型とし、 逆転写酵 素反応により cDN Aを合成後、 PCRによる核酸増幅を行う方法 [Kawasaki, E. S. , et al. , Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods AND applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27(1991) ] であるが 、 本発明において、 核酸増幅反応は特に限定されず、 ストランド ディスプレー スメント アンプリフィケ一シヨン （Strand Displacement Amplification ) (S DA) 法 〔ウォー力一 G. T. (Walker, G.T.)ら、 ヌクレイック ァシッズ リサ ーチ （Nucleic Acids Res.；) 、 第 20巻、 第 1 69 1〜 1 696頁 （1 992) 〕 、 ヌクレイック アシッ ド シークェンス一ベースド アンプリフィケーショ ン （Nucleic Acid Sequense-Based Amplification) (NASBA) 法 〔コムプトン J.
(Compton, J.) 、 ネーチヤ一、 第 350巻、 第 9 1〜92頁 （1 991) 〕 等で あってもよく、 その反応条件も特に限定されない。 また、 癌関連遺伝子 cDNA の増幅領域は、 必ずしも cDNA全長である必要はなく、 増幅産物の確認に支障 が無ければ、 該 cDNAの一部領域であってもよい。 核酸増幅反応に使用するプ ライマー対は、 該 c DNAのみを特異的に増幅するように設計するのが好ましい が、 該領域の増幅産物の確認に支障が無ければ、 検出対象以外の cDN Aを増幅 しても構わない。 なお本明細書における 「プライマー」 とは、 DNAポリメラー ゼによるプライマー伸長生成物の合成が開始される条件、 即ち、 適切な緩衝溶液
(緩衝溶液は PH、 イオン強度、 補因子等で決定される） 中に 4種類の異なるヌ クレオチドトリフォスフエ一ト及び DN Aポリメラーゼの存在下、 適切な温度に おいて、 铸型核酸にハイブリダィズした場合に、 DN A合成の開始点として作用 する事が出来るオリゴヌクレオチドを指し、 典型的には 1 0〜 30個のヌクレオ チドを含む。 例えば本明細書における C A 1 1遺伝子の場合、 前者のプライマ一 対として配列表の配列番号： 20及び 21で示される DNAの組み合わせを例示 する事が出来る。 なお、 本明細書における増幅産物の確認における支障とは、 例 えば、 増幅 DNA断片をァガロースゲル電気泳動に供した後、 ゲルをェチジゥム プロマイド （E t B r)染色し確認する場合、 核酸増幅反応により、 同程度の塩 基数を有する増幅 D N A断片が多数生じ、 各増幅 D N A断片の分離が不完全とな り、 検出対象となる癌関連遺伝子 m RNAに対応する増幅 D N A断片の存在量が 確認できなレ、場合が挙げられる。
増幅 DNA量は、 例えば、 上記核酸増幅反応液をァガロースゲル電気泳動に供 した後、 目的増幅断片に特異的にハイブリダィズする標識プローブを用い、 検出 されるバンドの位置とそのシグナル強度により確認できる。 したがって、 体外摘 出試料より抽出した一定量の粗 RN A試料を用いて得られる該シグナル強度が強 いほど、 検出対象とした癌関連遺伝子の発現量が高いと判定できる。 該プローブ の標識は特に限定されず、 例えば、 32Pに代表される放射性物質のほか、 フルォ レセインに代表される蛍光物質を用いることができる。 シグナル強度は、 例えば 上記方法により得られるオートラジオグラム或いは蛍光イメージ上のバンドの I ODにより表す事ができる。
一方、 十分量の増幅産物が得られる場合には、 ァガロースゲル電気泳動を行つ た後、 ゲルを Et Br染色し、 増幅 DNA断片の位置とその蛍光強度により確認 することも可能である。 したがって、 該蛍光強度が高いほど、 検出対象とした癌 関連遺伝子の発現量が高いと判断できる。 また蛍光強度の代わりに蛍光ィメージ 上のバンドの I ODにより癌関連遺伝子の発現量を判断してもよい。
より正確な判定を行うには、 増幅の程度を数値化する必要がある。 例えば、 核 酸増幅反応の段階において、 定量的 PC R法 （特表平 5 - 504886号） の適 用により、 その目的を達成することができる。 代表的な方法は目的遺伝子の増幅 に用いるプライマー塩基配列を両端に有し、 内部配列や大きさが異なる既知量の 核酸を内部標品として添加し P C R反応で増幅し、 目的物の最終増幅量を内部標 品の最終増幅量に照らして目的の遺伝子量を推定するものである。 本発明におい て、 内部標品は、 外部よりの添加標品に限定ざれず、 正常組織及び癌組織におい て同等に発現している遺伝子の mRN Aを铸型とした c DN Aを用いても良い。 このような cDNAとして、 例えば、 細胞骨格の構成成分である ーァクチン遺 伝子 c DN Aを挙げることができる。
例えば、 胃癌組織細胞より抽出した粗 RN A試料を用いた RT— PC R法にお いて、 配列表の配列番号： 20及び 21の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオ チドを核酸増幅反応用のプライマー対とした場合、 第 3図の （a) に示すように 、 本明細書における CA 1 1遺伝子の cDN A塩基配列のうち配列表の配列番号 ： 1において塩基番号 46〜4 1 1で示される塩基配列領域のみを増幅すること が可能である。
RNa s eプロテクションアツセィによる癌関連遺伝子発現量の測定は、 体外 摘出試料より抽出された一定量の粗 R N A試料に、 検出対象となる癌関連遺伝子 mRN A又はその一部と特異的にハイプリダイズする過剰量の RN Aであるプロ ーブを添加し、 更に RNa s e消化した後の残存 RNA量を測定することにより 実施することができる。 すなわち、 該残存 RN A量が多いほど、 癌関連遺伝子の 発現量が高いと判断できる。
なお、 該方法で用いるプローブは、 例えば、 80%ホルムアミ ド、 4 OmM P i p e s (pH 6. 4) 、 40 OmM NaC l、 1 mM EDTAからなる ハイブリダイゼーション緩衝液中 45で、 20時間保温してハイブリダイズ可能 であり、 かつ、 検出対象となる癌関連遺伝子 mRN Aに特異的な塩基配列に相補 的な塩基配列を有している RNAであれば特に限定されない。 また、 該プローブ の標識も特に限定されず、 例えば、 32Pに代表される放射性物質のほか、 フルォ レセインに代表される蛍光物質を用いることができる。
ノーザンハイプリダイゼーション法による癌関連遺伝子発現量の測定は、 試料 組織より抽出された一定量の粗 RN A試料を分子量等による分画後ナイロンフィ ルター等に固定し、 検出対象となる癌関連遺伝子 m RNAと過剰量の該遺伝子検 出用プローブを接触させ、 固定化された RNAにハイプリダイズしたプローブよ り得られるシグナル強度を測定することにより実施することができる。 すなわち 、 該シグナル強度が強いほど、 癌関連遺伝子の発現量が高いと判断できる。 なお、 該方法においてハイブリダィズするとは、 例えば、 50%ホルムアミ ド 、 0. 65M NaC l、 0. 1 Mナトリウム一 P i p e s、 5 xデンハート液 、 0. 1 %SDS, 5mM E DTAからなるハイブリダィゼ一シヨン緩衝液中 42°C、 20時間保温してハイブリダィズ可能であることを指す。 検出用プロ一 ブは、 検出対象となる癌関連遺伝子 m RNAに特異的な塩基配列に相補的な塩基 配列を有する核酸であることが好ましいが、 R NAの検出において数力所にシグ ナルが得られるような塩基配列であっても、 シグナル位置により検出対象 m R N Aを特定することができれば、 特に限定されない。 該プローブの標識も特に限定 されず、 例えば、 3 2 Pに代表される放射性物質のほか、 フルォレセインに代表さ れる蛍光物質を用いることができる。
第 2図に、 癌関連遺伝子 m R NAの発現量の変化を、 ノーザンハイブリダィゼ ーシヨン法により検出した一例を示す。 なお該図は、 癌組織及び対照正常組織よ り得られた R NAを個別に電気泳動後、 本明細書における C A 1 1遺伝子 m R N A検出用標識プローブをハイブリダイズさせることにより得られたォートラジォ グラムを再現した写真である。
また、 癌関連遺伝子の発現量の変化を、 タンパク質を指標に確認する際には、 該タンパク質の生物活性により確認することも可能であるが、 本発明においては 、 その簡便さより、 該タンパク質に対する抗体を用いた検出が好適である。 本発明における抗体とは、 癌関連遺伝子にコードされるタンパク質に特異的に 結合する抗体である。 したがって、 体外摘出試料より抽出した一定量の粗タンパ ク質に対し、 該抗体の結合量が多ければ、 該癌関連遺伝子の発現量が高いと判断 できる。
該抗体を得るための抗原としての夕ンパク質は、 該遺伝子を発現している癌細 胞より精製し得ることもできるが、 遺伝子工学手法を用いることにより得ること もできる。 例えば、 該タンパク質をコードする核酸は、 上記、 D D法及び目的夕 ンパク質を発現している細胞より調製した c D N Aライブラリ一のスクリ一ニン グの組合せにより得ることができる。 目的タンパク質は、 得られた c D N Aを適 当な発現ベクターに組込み、 適当な宿主中で発現させることにより得ることがで きる。 更に、 本タンパク質は、 融合タンパク質として発現させてもよい。 例えば 、 目的夕ンパク質の発現量を増加させるために他の夕ンパク質由来の N末端又は C末端に適当なぺプチド鎖を付加して発現させ、 このべプチド鎖に親和性を持つ 担体を使用することにより目的夕ンパク質の精製を容易にすることができる。 また、 抗体を得るための抗原は、 必ずしも該タンパク質全体を用いなくともよ く、 抗体が認識可能な、 該タンパク質に特異的なアミノ酸配列領域を有するぺプ チドであってもよい。
なお該抗体の取得法は、 例えば、 常法により、 ペプチドをアジュバンドと共に 動物に免疫させることにより、 抗血清として得ることができる。 また、 ガルフレ らの方法 [Galfre.G.ら、 ネーチヤ一、 第 266巻、 第 550〜 552頁 （1 97 7) 〕 により、 モノクローナル抗体として得ることもできる。
抗体を用いたタンパク質の検出方法としては、 例えば、 ウェスタンプロット法 が挙げられる。
本方法は、 細胞を界面活性剤で処理して細胞内タンパク質を溶解後、 該タンパ ク質を、 SDS -ポリアクリルアミ ド電気泳動で分離させた後ニトロセルロース 膜などに転写し特異抗体によって検出する方法である。 タンパク質と結合した抗 体は、 例えば、 25 I—標識プロテイン A、 ペルォキシダーゼ結合抗 I gG抗体な どを用いて二次的に検出することができる。
本発明の第 2の発明は、 癌細胞検出用キットを提供する。 すなわち、 本発明の 第 1の発明である、 癌細胞の検出方法を利用することにより、 癌細胞検出用キッ トを提供することができる。 具体的には、 細胞内における、 癌関連遺伝子の発現 量の変化を検出する方法において、 該遺伝子より発現される mRNAの量あるい はタンパク質の量を指標に検出するキットが例示される。
m R N Aの発現量を指標とし、 上記癌細胞検出方法に記載の核酸増幅法を用レ、 た検出方法により癌細胞を検出するためのキットの場合、 配列表の配列番号： 1 〜1 6のいずれかに示される塩基配列を含有する塩基配列で示される DNA又は 配列表の配列番号： 1〜 1 6のいずれかに示される DNAにストリンジヱン卜な 条件下でハイブリダイズ可能な DNAを cDNAとする mRNAを検出可能な、 上記、 癌細胞の検出方法で述べた性質を有するプライマー対を構成の必須要件と する。 例えば検出方法に R T— P C Rを利用した本発明におけるキットは、 上記 プライマー対の他に、 逆転写酵素、 d N T P、 耐熱性 D NAポリメラ一ゼが組み 込まれていてもよい。 なお本キットにより検出される癌関連遺伝子の種類及びそ の数は特に限定されない。 従って本キッ トを構成するプライマ一対も特に限定さ れなく、 検出対象とする癌関連遺伝子の種類及びその数により適宜選択すればよ い。
本発明の癌関連遺伝子 c D NAを铸型とし、 その一部領域のみを特異的に増幅 させるプライマ一対の一例を、 表 2に示す。 各表のプライマ一対において、 アル ファベットと数字を組合せた記号は、 本発明におけるプライマー名称を、 各記号 に付した括弧内の数字は、 各プライマーの塩基配列を示した、 配列表の配列番号 を示す。 なお、 表 2に示した ーァクチンは、 体外摘出試料より抽出した粗 R N A試料中の癌関連遺伝子 m R N Aの定量を目的とした内部標準として選択した遺 伝子 めな。
表 2 標的遺伝子 プライマ一対 予想増幅 DNAサイズ
CA 1 1 F 1 (20) R 1 (21) 3 6 6 b p
CA 1 3 F 2 (22) R 2 (23) 1 6 8 b p
CC 24 F 3 (24) R 3 (25) 2 5 9 b p
GG 24 F 4 (26) R 4 (27) 3 8 4 b p
AG 2 6 F 5 (28) R 5 (29) 3 8 9 b p
GC 3 1 F 6 (30) R 6 (31) 2 1 3 b p
GC 3 2 F 7 (32) R 7 (33) 2 5 1 b p
GC 3 3 F 8 (34) R 8 (35) 5 6 3 b p
GG 3 3 F 9 (36) R 9 (37) 2 1 8 b p
CC 3 4 F10 (38) RIO (39) 24 1 b p
Liし 。 Fll (40) Rll (41) 1 7 V» n
GC 3 6 F12 (42) R12 (43) 9 5 b p
CA4 2 F13 (44) R13 (45) 24 5 b p
CC 6 2 F14 (46) R14 (47) 1 3 4 b p
β— Ύクチン F15 (48) R15 (49). 2 6 4 b p
—方、 mRNAを指標とし、 RNa s eプロテクションアツセィゃノーザンハ イブリダイゼーシヨン法を用いた検出方法により癌細胞を検出するためのキット の場合、 c DNAが配列番号： 1〜1 6のいずれかに示される塩基配列を含有す る塩基配列で示される DNA又は配列表の配列番号： 1〜1 6のいずれかに示さ れる DNAがストリンジヱントな条件下でハイプリダイズ可能な DNAである癌 関連遺伝子の m R N Aを検出可能な、 上記、 癌の検出方法で述べた性質を有する プローブを構成の必須要件とする。 例えば R N a s eプロテクションアツセィを 利用したキットの場合、 上記プローブの他、 R N a s e、 R N a s e用濃縮反応 液などが組み込まれていてもよい。 本キットにより検出される上記癌関連遺伝子 の種類又は数は特に限定されない。 従って本キットを構成するプローブも検出対 象の癌関連遺伝子の種類及びその数により適宜選択すればよく特に限定されない 一方、 タンパク質を指標とし、 抗体を用いた検出方法により癌細胞を検出する ためのキットの場合、 配列番号： 1〜1 6のいずれかに示される塩基配列を含有 する塩基配列で示される D NA又は配列表の配列番号： 1〜1 6のいずれかに示 される D NAにストリンジェントな条件下でハイプリダイズ可能な D NAの塩基 配列を含有する塩基配列で示される D NAにコードされるぺプチドに対し、 個別 に特異的に結合する、 上記癌細胞検出方法に記載の性質を有する抗体を構成の必 須要件とする。 本キットにより検出される癌関連遺伝子の種類及び数は特に限定 されない。 従って本キットを構成する抗体は、 検出する癌関連遺伝子の種類及び 数により適宜選択すればよく、 特に限定されない。
かかるキットを用いることにより簡単に癌細胞を検出することができる。 従つ て、 該キットを用いて、 癌関連遺伝子の発現量の測定に基づく癌の診断が可能と なる。 即ち該キットを用いた癌細胞の検出方法により癌細胞の存在が確認された ヒトは癌陽性であると判断する事ができる。
本発明の第 3の発明は、 癌関連遺伝子又は該遺伝子発現産物への特異的結合物 を用いた癌細胞の増殖制御方法である。 本明細書における特異的結合物とは、 核 酸、 抗体、 細胞傷害性 Tリンパ球 （C T L ) 等を挙げることが出来る。
例えば、 慢性骨髄性白血病によく検出される bcr- abl キメラ蛋白質は高いチロ シンキナーゼ活性を有し白血病の発生、 増殖に重要な役割を演じている。 本キメ ラ蛋白質をコードする遺伝子に対するアンチセンスォリゴヌクレオチドは in vi voで本遺伝子発現腫瘍の増殖を抑制することができる（Skorski, T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 4504 1994) 。 一方、 従来から癌細胞に特異的に発現される 蛋白質の癌特有なペプチドは、 癌細胞に対する T細胞免疫応答の標的となること が知られており、 この融合蛋白質の融合部近傍のぺプチドで免疫することで本融 合蛋白質に反応性の T細胞が得られる（Chen, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 9， 1468 1992) 。 その実施方法としては例えば以下の報告に述べられている技術 が利用できる。 すなわち、 ヒト T細胞において第 1 2番アミノ酸グリシンを他の アミノ酸に置換した ras ペプチドに特異的に反応し、 HLA-DRの拘束性を有する CD 4 +T細胞が分離され（Jung, S. J. Exp. Med. 173, 273 1991) 、 6 1番アミノ酸 に変異をもつ ras 蛋白質を産生できる組み替えワクシニアウィルスで免疫された マウスから、 その変異部位を含む 8アミノ酸からなるペプチドに対する CTL を誘 導できる（Skipper, J. J. Exp. Med. 177, 1493 1993) 。 さらに、 遺伝子組み替 えで作製した可溶性変異 ras 蛋白質で免疫したマウスでは同一変異を持つた癌細 胞の in vivo での増殖が抑制され（Fenton, R. G. J. Natl. Cancer Inst. 85, 1 294 1993) 、 変異 ras ペプチドで感作した脾臓細胞から、 同一の変異 ras を発現 している癌細胞に細胞障害活性を示す C T Lが得られる（Peace. D. J. J. Exp. Me d. 179, 473 1994) 。
従って、 本発明において細胞の癌化と関連が認められた遺伝子についても同様 のァンチセンスォリゴヌクレオチドを使用する事により細胞増殖を制御出来る可 能性がある。 更に癌化により発現量が増加すると考えられる遺伝子にコ一ドされ る蛋白質に反応性の T細胞が得られれば、 該蛋白質を高発現している細胞の増殖 を抑制することが可能となる。
本発明の第 4の発明は、 癌検出に利用できる新規なぺプチド及び該ぺプチドを コードする核酸を提供する。 本発明者らにより、 明らかにされた癌関連遺伝子に おいて、 遺伝子の塩基配列情報を収録したデータベースを用いたホモロジ一検索 により、 C A 1 1、 C A 1 3、 G G 3 3 . G C 3 5、 G C 3 6、 C A 4 2を除く ものは既に単離、 同定された遺伝子であることが明らかとなった。 すなわち CC 24はチトクローム cォキシダーゼ サブユニッ ト I遺伝子 〔ホーライ S. (Ho rai, S.)ら、 プロシーディングズ ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンシーズ ォブ ザ USA、 第 92巻、 第 5 32〜5 36頁 （ 1 9 95 ) 〕、 AG 2 6は p 1 9 0— B遺伝子 〔バーべ口 P. D. (Burbelo, P. D.) ら 、 ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリー （Journal of Biological Chemistry) 、 第 270巻、 第 30 9 1 9〜 30 92 6頁 （ 1 9 9 5) 〕 、 GC 3 1はチトクローム cォキシダーゼ サブュニッ ト I I遺伝子 〔パワー M. D. (Power, M. D.) ら、 ヌクレイック ァシッズ リサーチ、 第 1 7巻、 第 6 73 4頁 （ 1 9 8 9 ) 〕、 GC 32はチトクローム b遺伝子 〔アンダーソン S. (An derson, S.) ら、 ネーチヤ一、 第 2 9 0巻、 第 45 7〜 4 6 5頁 （ 1 9 8 1 ) 〕 、 GC 33はインテグリン 6 サブユニッ ト遺伝子 〔夕ムラ R. N. (Ta mura, R. N.)ら、 ジャーナル ォブ セル バイオロジー （Journal of Cell Bi ology)、 第 1 1 1巻、 第 1 5 9 3〜1 6 04頁 （ 1 9 9 0 ) 〕、 GG 24は F 1 — ATPエース β サブユニッ ト遺伝子 〔ォ一夕 S. (Ohta, S.) ら、 ザ ジ ヤーナル ォブ バイオケミストリ一 （The Journal of Biochemistry). 第 99 巻、 第 1 3 5〜 1 4 1頁 （ 1 9 8 6) 〕 、 CC 62はラクトフヱリイン遺伝子 〔 レイ M. W. (Rey, M. W.) ら、 ヌクレイック ァシッズ リサーチ、 第 1 8巻 、 第 528 8頁 （ 1 9 9 0) 〕 に相当しており、 一方、 CC 34 cDNAクロー ンは 1 6 S r RNAをコードする c DNAの塩基配列 〔ホーライ S. ら、 プロシ 一ディングズ ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンシーズ ォ ブ ザ US A、 第 92巻、 第 5 32〜5 36頁 （ 1 9 9 5 ) 〕 の一部領域と 7 塩基が異なるクローンであった。 なお、 これらの遺伝子については発癌との関連 は知られていない。
一方、 CA 1 1、 CA 1 3、 GG 33、 GC 35、 GC 3 6、 CA4 2、 の各 遺伝子については、 各遺伝子 c DNAにおいて今回解析した領域その塩基配列、 及びそこにコードされるァミノ酸配列と同一の配列、 あるいはこれらとホモロジ
—のある配列も報告されていない。 すなわち C A 1 1、 C A 1 3、 G G 3 3、 G C 3 5、 G C 3 6、 C A 4 2の各遺伝子 c D N Aの塩基配列において、 本発明に より明らかにした塩基配列を有する核酸は、 本発明者らによって始めて単離され た新規な核酸である。
表 1に示すように、 配列表の配列番号： 1、 2、 及び 1 3に示す塩基配列から なる、 本発明における新規な核酸にコードされるペプチドは、 該塩基配列より、 それぞれ配列表の配列番号： 1 7、 1 8、 及び 1 9に記載のアミノ酸配列からな ると推定されるが、 これらに限定されるものではない。 すなわち、 ①配列表の配 列番号： 1 7〜1 9のいずれかに記載のアミノ酸配列の全部又は一部を含むぺプ チド、 ②配列表の配列番号： 1 7〜1 9のいずれかに記載のアミノ酸配列におい て 1若しくは複数のアミノ酸が付加、 欠失若しくは置換されており、 かつ細胞の 癌化により発現量が変化するペプチドも包含する。 それは、 以下の理由による。 天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多型や変異のほか、 生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによってそのァミノ酸配 列中にアミノ酸の欠失、 挿入、 付加、 置換等の変異が起こりうる。 しかしこのよ うな変異が該タンパク質の活性や構造の保持に関して重要でない部分に存在する 場合には、 変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、 生物学的活性を示 すものがあることが知られているからである。
また、 人為的にタンパク質のァミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合 も同様であり、 この場合には更に多種多様の変異体を作製することが可能である 。 例えば、 ヒトインターロイキン 2 ( I L— 2 ) のアミノ酸配列中のあるシステ ィン残基をセリンに置換したポリぺプチドがィン夕一ロイキン 2活性を保持する ことが知られている 〔ワング A. (Wang, A. )ら、 サイエンス、 第 2 2 4巻、 第 1 4 3 1〜1 4 3 3頁 （ 1 9 8 4 ) 〕 。 したがって、 本発明によって開示されたァ ミノ酸配列に 1若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、 挿入、 付加、 置換が生じた ァミノ酸配列によって示されるものであっても、 癌化による発現量の変化に差異 が見られないものであれば本発明の範囲内に属するものである。
更に、 ある種のタンパク質は、 活性には必須でないペプチド領域を有している ことが知られている。 例えば細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナル ペプチドや、 プロテア一ゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当り、 こ れらの領域のほとんどは翻訳後、 あるいは活性型タンパク質への転換に際して除 去される。 このようなタンパク質は一次構造上は異なった形で存在しているが、 最終的には同等の機能を発現するタンパク質である。
遺伝子工学的に夕ンパク質の生産を行う場合には、 目的の夕ンパク質のァミノ 末端、 あるいはカルボキシル末端に該夕ンパク質の活性とは無関係のぺプチド鎖 が付加されることがある。 例えば、 目的のタンパク質の発現量を上げるために、 使用される宿主中で高発現されているタンパク質のァミノ末端領域の一部を目的 の夕ンパク質のァミノ末端に付加した融合夕ンパク質が作製されることがある。 あるいは発現された夕ンパク質の精製を容易にするために、 特定の物質に親和性 を有するぺプチドを目的のタンパク質のァミノ末端、 あるいはカルボキシル末端 に付加することも行われている。 これらの付加されたべプチドは目的タンパク質 の活性に悪影響を及ぼさなレ、場合には付加されたままであってもよく、 また必要 であれば適当な処理、 例えばプロテア一ゼによる限定分解などによって目的タン ノ、。ク質から除去できるようにすることもできる。
上記したような、 そのタンパク質の機能には必須でないぺプチドを保持した、 あるいは付加されたものであっても、 同等の機能を発現できる限りにおいては本 発明のタンパク質の範囲内に属するものである。 なお、 本明細書において 「ぺプ チド」 とは、 2以上のアミノ酸がペプチド結合によってつながったものを示し、 「タンパク質」 として記載されているものを包含する。
本発明における新規な核酸の一部は、 配列表の配列番号： 1 7〜 1 9のいずれ かに記載のァミノ酸配列を有するぺプチドをコ一ドする核酸からなるものであり
、 その塩基配列は、 表 1に示すように、 例えば、 配列表の配列番号： 1、 2及び 1 3のいずれかに記載の塩基配列が挙げられる。 すなわち、 配列表の配列番号： 1 7に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、 配列表の配列番号： 1に示す塩 基配列の塩基番号 3〜 5 8 4に、 配列表の配列番号： 1 8に記載のァミノ酸配列 を有するペプチドは、 配列表の配列番号： 2に示す塩基配列の塩基番号 1 6 9 8 〜 1 8 5 0に、 配列表の配列番号： 1 9に記載のァミノ酸配列を有するぺプチド は、 配列表の配列番号： 1 3に示す塩基配列の塩基番号 8〜1 9 6にそれぞれコ ―ドされているが、 本発明における新規なぺプチドをコードする核酸はこれらに 限定されない。 すなわち、 ①配列表の配列番号： 1 7〜1 9のいずれかに記載の ァミノ酸配列の全部又は一部を含むぺプチドであって、 癌細胞の検出に利用する ことができるぺプチドをコ一ドする核酸、 ②本発明の新規核酸にストリンジェン トな条件下でハイプリダイズ可能な、 細胞の癌化によってその発現量が変化する ペプチドをコードする核酸、 ③配列表の配列番号： 1 7〜1 9のいずれかに記載 のァミノ酸配列において 1若しくは複数のァミノ酸が付加、 欠失若しくは置換さ れており、 かつ発現量の変化で癌細胞の検出に利用できるぺプチドをコ一ドする 核酸等も本発明の範囲内である。
本明細書に記載の 「アミノ酸配列をコードする核酸」 なる用語について説明す る。 遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン （3つの塩基の組合せ） はアミノ酸の 種類ごとに 1〜6種類ずつが存在することが知られている。 したがって、 あるァ ミノ酸配列をコードする核酸はそのァミノ酸配列にもよるが多数存在することが できる。 遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、 その 塩基配列に変異が起こることはまれではなレ、。 遺伝子上に起こつた変異がそこに コードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合 （サイレント変異と呼ばれる ) もあり、 この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸が生じたとい える。 したがって、 ある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、 それを含有する生物が継代されていくうちに同じァミノ酸配列をコードする多種 類の核酸ができていく可能性は否定できない。 更に同じアミノ酸配列をコードす る多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困 難なことではない。 例えば遺伝子工学的なタンパク質の生産において、 目的の夕 ンパク質をコードする本来の核酸上で使用されているコドンが宿主中では使用頻 度の低いものであった場合には、 タンパク質の発現量が低いことがある。 このよ うな場合にはコードされているァミノ酸配列に変化を与えることなく、 コドンを 宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、 目的タンパク質の高 発現を図ることが行われている （例えば特公平 7— 1 0 2 1 4 6号）。 このよう に特定のァミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作製可能なことはい うまでもなく、 自然界においても生成されうるものである。 したがって、 本明細 書中に開示された塩基配列と同一の核酸ではなくても、 それが本明細書中に開示 されたァミノ酸配列をコードする限り本発明に含有されるものである。
実際、 本発明においても、 塩基配列は若干異なるがコードされるアミノ酸配列 は同一である核酸が得られている。 C A 1 3遺伝子 c D N Aの塩基配列に含有さ れる、 配列表の配列番号： 2に示す塩基配列において、 塩基番号 1 7 8 4の尺が A、 塩基番号 1 9 8 5の Kが Tであるが、 配列表の配列番号： 2に示す塩基配列 において、 塩基番号 1 7 8 4の Rが G、 塩基番号 1 9 8 5の Kが Tである c D N Aや、 塩基番号 1 7 8 4の Rが A、 塩基番号 1 9 8 5の Kが Gである核酸も得ら れている。 しかし、 この 2箇所の塩基配列の違いは、 配列表の配列番号： 2に示 した塩基配列の塩基番号 1 6 9 8〜1 8 5 0にコードされるアミノ酸配列には影 響を与えず、 上記 3種の核酸にコードされるペプチドはいずれも、 配列表の配列 番号： 1 8に示すァミノ酸配列を有する。
更に、 本発明の新規な遺伝子のうち G G 3 3、 G C 3 5、 及び G C 3 6遺伝子 の c D N Aは、 それぞれ配列表の配列番号： 9、 1 1及び 1 2、 1 5、 1 6に記 載の塩基配列を有する。 更に、 本発明の新規な核酸は、 配列表の配列番号： 9、 1 1及び 1 2、 1 5、 1 6のいずれかに記載の塩基配列で示される核酸がストリンジェントな条件下で ハイブリダイズ可能であり、 且つ細胞の癌化によつて発現量が変化する m R N A の塩基配列に相補的な核酸も本発明に含有されるものである。 実際、 本発明にお いても上記性質を有する核酸が得られている。 例えば、 塩基配列は若干異なるが コードされるァミノ酸配列は同一である上記核酸、 また本発明の新規核酸ではな いが、 CC 34遺伝子 cDNAは、 配列表の配列番号： 1 0に示す塩基配列を含 有するが、 配列表の配列番号： 1 0に示す塩基配列の塩基番号 935の Tが Aに 置換され、 3' 末端の GTTAAGの配列からなる 6塩基が欠失した別種の核酸 が得られている。
また、 本発明の第 5の発明は、 本発明における新規な核酸にコードされるぺプ チドに対する抗体を提供する。 該抗体は、 上記記載の癌細胞の検出に利用するこ とができる。 以下、 本発明を実施例をもって更に具体的に説明するが、 本発明はこれらの実 施例によって限定されるものでない。
実施例 1 癌関連遺伝子の解析
1) 癌検出の指標となりうる mRN Aの存在の確認
癌化により発現量の変化する mRNAが存在するか、 以下に示す、 胃の癌化病 変組織部と対照正常組織部の m R N Aの発現を比較する D D法により確認した。 まず、 低分化腺癌の進行癌患者より摘出された胃の癌組織と対照正常組織より それぞれ TR I z 01 TM試薬 （ギブコ BRL社製） を用いて RN Aを抽出し、 粗 RNA試料とした。 こうして得られた粗 RNA試料のうち 5 0 £を最終51111^
MgC 12 と 20単位の RN a s e阻害剤 （宝酒造社製） 存在下で 1 0単位の DNa s e l (宝酒造社製） と 37°C、 30分間反応し、 ゲノム DN Aを除去し た。 本 RNAを用い D i f f e r e n t i a 1 D i s p l ay™ K i t (デ ィスプレイシステム社製） 並びに En z yme S e t— DD (宝酒造社製） を 用いキット添付の説明書記載の手順に従い RT— PC Rを行った。
すなわち、 逆転写反応は、 1反応につき、 上記 DNa s e処理した粗 RNA試 料 200 n gと配列表の配列番号： 56〜64に示す塩基配列を有するオリゴヌ クレオチドのいずれか一種をプライマ一として混合後、 70°C、 1 0分間熱処理 、 急冷後、 AMV逆転写酵素と 55°C、 30分反応を行った。 他の下流プライマ 一についても個々に同様の反応を行い、 合計 9種類の一本鎖 c DNAサンプルを 作製した。
続く PCRによる核酸増幅反応は、 上記、 9種類の一本鎖 cDN Aを個別に铸 型とし、 逆転写反応時と同一のオリゴ （dT) プライマーを下流プライマ一、 配 列表の配列番号： 50〜55に示す塩基配列を有するキット中の 1 Ome rのォ リゴヌクレオチドのいずれか一種を上流プライマーとして P CRにて核酸増幅を 行い、 合計 54種類の増幅 DNAサンプルを作製した。
なお、 ？じ尺時の1^8じ 12 濃度は 3mM、 基質として dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTPを各々 1 5 M、 更に標識化合物として [ひ一33 P] — dA TP (アマシャム社製） を 1. 85 kBqZml添加し 94°Cで 30秒、 40 °C で 60秒、 72°Cで 60秒からなる行程を 1サイクルとし 40サイクル反応した 。 反応終了後、 等量の 95%ホルムアミ ドを添加し、 90°C、 2分間熱変性し電 気泳動用サンプルとした。 泳動は 7 IV [尿素変性 5 ポリアクリルアミ ドゲルで行 いオートラジオグラフィ一により多数のバンドよりなるフィンガ一プリントが得 られ、 癌組織を基に得られたオートラジオグラムと対照正常組織部試料を基に得 られたオートラジオグラムでシグナル強度の異なるバンドが存在した。
一例として、 下流プライマーとして配列表の配列番号： 59に示す塩基配列を 有する D4、 上流プライマーとして配列表の配列番号： 50に示す塩基配列を有 する U 1を用いた結果を、 第 1図に示す。 すなわち第 1図は、 癌関連遺伝子を D D法にて検出した場合の、 得られた DNA断片の電気泳動のパターンを示すォー トラジオグラムを再現した写真である。 なお、 第 1図において、 1Nは低分化腺 癌型胃癌患者の正常組織部より得られた粗 RNA試料を铸型として得られた増幅 DNA断片を、 1 Tは同一低分化腺癌型胃癌患者の癌組織部より得られた粗 RN A試料を铸型として得られた増幅 DN A断片を、 それぞれアクリルアミ ドゲル上 で泳動したレーンであることを示す。 第 1図の—で示した塩基数約 75 Obpの 位置に、 癌組織試料を基に得られたオートラジオグラムに比べ、 シグナル強度の 強いバンドが、 対照正常組織試料を基に得られたオートラジオグラムに存在した 。 本発明者らは、 この強度差のあるバンドを生じさせる mRNAを発現する遺伝 子を CA 1 1と命名した。
表 3に、 DD法により本発明者らが検出し、 命名した各遺伝子について、 それ ぞれの mRNAの発現量の違いを DD法により検出するための上流プライマー及 び下流プライマーの組合せ、 増幅 DNA断片のおおよそのサイズ、 癌組織と対照 正常組織試料を基に R T - P C Rで得られた増幅 D N A量の差を示した。 なお、 表 3のプライマ一欄において、 アルファべットと数字を組合せた記号はプライマ —名称を示し、 各記号に付した括弧内の番号は、 配列表において該プライマーの 塩基配列を示した配列番号を示す。
表 3
Figure imgf000032_0001
2) 癌検出の指標となる mRNAの同定
1 ) 記載の DD法を用いて確認された、 表 3に記載の各遺伝子由来増幅 DN A 断片の铸型となった mRN Aの発現量の変化が、 真に癌化に関連しているか検討 した。
まず、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法による検討を行った。 すなわち、 癌 組織及び対照正常組織において発現される癌関連遺伝子の mRN Aの発現量の差 を、 1)記載の方法により得られた各増幅 DNA断片をプローブとして検出でき るか検討した。
検出用プローブは、 以下のように作製した。 すなわち、 1)記載の、 DD法に より得られた増幅 DN A断片を泳動したアクリルアミ ドゲルより、 表 3に示す各 増幅 DN A断片を含む領域を切り出し、 1 00 / 1の水を加え熱抽出により、 含 まれる DNA断片を個別に回収した。 これらの DNA断片を個々に铸型とし、 表 3に示す各 DNA断片を得るために用いた上流、 下流プライマーの組合せによる PCRにて再増幅した。 更に各増幅 DNA断片約 1 00 ngをランダムプライマ — DNAラベリングキット （宝酒造社製） により32 P標識することにより、 14 種類の検出用プローブを作製した。 これとは別に、 各組織より抽出した粗 RNA 試料の陽性コントロールとして、 ；8—ァクチン遺伝子 mRNAを選択し、 配列表 の配列番号： 65に示す塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを同様に32 P 標識し、 8—ァクチン遺伝子 mRNA検出用プローブとした。 次いで、 前記検出 用プローブを、 個別に、 二シン精子 DNAを 1 00〃gZm 1になるように混合 後、 熱変性したものとともに、 ハイブリダィゼーシヨン緩衝液 （50 %ホルムァ ミ ド、 0. 65M NaC l、 0. 1 Mナトリウム一 P i p e s、 5 xデンハー ト液、 0. 1 %SDS、 5mM EDTA) に加え、 ノーザンハイブリダィゼー シヨンにおける検出用プローブ液 1 5種類を調製した。
ノーザンハイブリダィゼ一シヨンは、 以下のように行った。 まず、 前述の方法 により調製した胃癌患者の癌組織及び対照正常組織より抽出した粗 R N A試料を 、 各々個別に 1ゥエルにつきそれぞれ 20 a gずつホルマリン変性 1 %ァガロー スゲルにて電気泳動後、 ハイボンド N+ メンブラン （アマシャム社製） にブロッ ティングした。 次に、 ハイプリバック （コスモ 'バイオ社製） にブロッテイング メンブランと、 熱変性二シン精子 DN Aを最終濃度 1 00 g/mlになるよう に添加したハイブリダィゼ一シヨン緩衝液を加え、 42°C、 2hr放置後、 緩衝 液を捨て、 プレハイブリダィゼ一シヨン処理メンブランを作製した。 上記のメン ブランを 1 5枚作製後、 個別に、 前記 1 5種類のノーザンハイブリダィゼーショ ン用検出プローブ液を加え 42°C、 1 6 h rハイブリダィゼ一シヨンを行った。 次に各ブロッテイングメンブランをハイプリバックより取り出し、 洗浄液 I (2 xSSC、 0. 2%ピロリン酸ナトリウム、 0. 1 %SDS) 中 42°C、 20分 洗浄後、 洗浄液 I I ( 0. 5 X S S C、 0. 2 %ピロリン酸ナトリウム、 0. 1 %SDS) にて 42°C、 20分洗浄した。 なお、 この洗浄液 I Iによる洗浄は、 洗浄液を交換しながら 2回繰り返した。 洗い終えたメンブランをラップに包み高 感度 X線フィルム （コダック社製） に一昼夜露光し、 得られるオートラジオグラ ムにおけるシグナル強度より癌組織と対照正常組織での発現量を比較した。
一例として、 第 2図に CA1 1遺伝子 mRN Aを検出した結果を示す。 第 2図 において、 1 Nは低分化腺瘙型胃癌患者の正常組織より得られた粗 RNA試料、 1 Tは同一低分化腺癌型胃癌患者の癌組織より得られた粗 RNA試料を、 ァガロ —スゲル上で泳動したレーンに相当する領域であることを示す。 （a) は、 CA 1 1検出用プローブ、 （b) は8—ァクチン検出用プローブを用いた結果を示す 。 （b) に示したように 1 N及び 1 T共、 3—ァクチン検出用プローブでシグナ ルが得られていることから、 両試料において RNAが、 過度の分解を受けず抽出 されていることが明らかである。 一方、 （a) において、 —で示した約 1. 1 K b付近に、 レーン 1 Nのみ明瞭なシグナルが存在し、 レーン 1 Tにはシグナルが 存在しないことから、 CA1 1は癌化により発現量の低下する遺伝子であること が判明した。 同様に、 CC 62は約 2. 6Kb付近に、 対照正常胃組織部より得 られたオートラジオグラムにのみバンドが得られた。 一方、 GC 31、 GC 32 、 CC 34に関しては、 それぞれ約 1. 0Kb付近、 1. 6Kb付近、 1. 7K b付近にバンドが認められたが、 いずれも胃癌組織より得られた粗 RNA試料の 方が、 対照正常胃組織より調製した粗 RNA試料より強いシグナルが得られた。 なおシグナル強度はオートラジオグラムの各バンドをデンシトメ一夕一により測 定した。 次に該オートラジオグラムで得られた各バンドの I〇Dを FMB I 0— 1 0 0 (日立ソフトエンジニアリング社製） により計算し、 下式により癌関連遺 伝子であるかを判断するための指標値を計算した。
式 2
〔指標値〕 = (Χχ βΥ) / (Υχ βΧ)
上式において各記号は以下の値を表す。
X ：胃癌組織より得られた表 3記載遺伝子 mRNA由来バンドの I OD Y：対照正常胃組織より得られた表 3記載遺伝子 mRNA由来バンドの I 0 D
βΧ ：胃癌組織より得られた S—ァクチン遺伝子 mRNA由来バンドの I〇 D
βΎ：対照正常胃組織より得られた^ーァクチン遺伝子 mRNA由来バンド の I OD
ノーザンハイブリダィゼ一シヨンでシグナルが得られなかった、 CA 1 3、 C C 24、 GG 24、 AG 2 6、 GC 3 3、 GG 3 3、 GC 3 5、 GC 3 6、 CA 4 2、 の各遺伝子に関しては R T— P C Rにて発現量の比較を行うことにした。 RT— PC Rにおける核酸増幅反応用プライマーの設計のため、 ノーザンハイブ リダイゼ一シヨンにおいてプローブとして用いた DNA断片を、 PCRによるダ ィレクトシークェンシング、 又は TAクローニングにて各 DNA断片をクローン 化した後、 ダイデォキシ法により、 塩基配列を決定した。 得られた塩基配列情報 より設計し、 各遺伝子由来 mRNAを铸型とした RT— PC Rに用いたプライマ 一の塩基配列を、 配列表の配列番号： 22〜2 9、 3 4〜 3 7及び 3 8〜 4 3に 示した。 表 2に、 遺伝子と、 その発現確認に使用したプライマーの対応を示す。
RT - PC Rによる mRNAの発現量の変化の確認は、 1 ) 記載の方法で調製 した胃癌患者の癌組織及び対照正常組織より得られた粗 RNA試料を DN a s e I処理後、 それぞれ 4 0 n gを 1 0 0〃 1の反応系で T a K a R a RNA P CR K i t Ve r . 2. 1を用い、 キット添付の説明書記載の手順に従い R T一 PCRを行った。 すなわち、 铸型として粗 RNA試料 4 0 n g、 下流プライ マーとしてオリゴ （dT) プライマー （終濃度 2. 5 /M) を用い、 逆転写反応 液 （ 1 0mM トリス—HCし pH 8. 3、 5 OmM KC 1、 5 mM Mg C l 2 、 I mM各 dNTP、 1 0 0単位 RN a s eインヒビター、 25単位 AM V逆転写酵素） を調製し、 30 °Cで 1 0分間、 5 5 °Cで 20分間、 9 5でで 5分 間逆転写反応を行った。 上記逆転写反応液各 1 を、 CA 1 3、 CC 24、 GG 24、 AG 26、 GC 33、 GG 33. GC 35、 GC 3 6、 CA4 2、 及 び^ーァクチンの各遺伝子 mRNA検出用のプライマー対 （0. 2 M) を個別 に含む 1 0種類の PC R反応液 （終濃度 1 OmM トリスー HCし pH8. 3 、 5 OmM KC 1、 2. 5 mM MgC l 2 、 1. 25単位 TaKaRa T a q DNAポリメラーゼ） 4 0 1に加え 50 β 1 とした。 PCRにおける 1 サイクルは、 まず 94°C、 2分のインキュベーションの後、 94 °Cで 30秒、 5 5°Cで 6 0秒、 72°Cで 6 0秒からなる行程とした。 増幅 DNA産物量の確認は 、 増幅 DNA産物をァガロースゲル電気泳動したのち、 ゲルをェチジゥムブロマ ィド染色後、 該蛍光イメージ上の各バンドの I〇Dを FMB I〇ー 1 0 0により 計算し、 前記式 2により癌関連遺伝子であるか判断するための指標値を計算した o
上記、 ノーザンハイブリダィゼーシヨン法及び RT— PCR法の結果、 及び該 結果より明らかとなつた各遺伝子の癌化による発現変化のパ夕一ンを表 4に示し た。 なお、 該表の発現変化のパターンの項において、 癌化により発現が増幅され る遺伝子は、 †、 癌化により発現が抑制される遺伝子は、 で示した。 すなわち 表 4において指標値が 1より大きレ、遺伝子は癌化により遺伝子発現量が増加する 遺伝子、 指標値が 1より小さい遺伝子は癌化により遺伝子発現量が低下する遺伝 子であると判断した。 この結果、 CA 1 3、 CC 24、 GG 24、 GC 3 1、 G C 3 2、 GC 3 3、 GG 3 3、 CC 3 4、 C A 4 2遺伝子は癌化により発現量が 増加する遺伝子、 CA 1 1、 AG 2 6. GC 3 5、 GC 3 6、 CC 6 2各遺伝子 は癌化により発現量が低下する遺伝子であることが明らかとなつた。 表 4
Figure imgf000037_0001
(注） 表中、 Aはノーザンハイブリダィゼ一シヨンのオートラジオグラムより Bは RT— PCRの増幅産物の電気泳動写真より決定したことを示す。
3) 癌関連遺伝子 c DN Aの取得 次にこれら該癌関連遺伝子の cDNA断片をクローニングした。 まず、 1)記 載の方法により調製した、 癌組織と正常組織の粗 RN A試料より、 mRNA精製 キッ ト （フアルマシア社製） を用い、 オリゴ （dT) カラムで mRNAを分画し 、 ZAP— cDNA合成キッ ト （ストラタジーン社製） を用い、 キッ ト添付のプ 口トコールに従い 1 0 cmx 14 cmの角プレートに 1枚当り約 40, 000プ ラ一クとなるようファージと宿主菌 XL I—B 1 u e MRF' をプレーティン グし、 cDNAライブラリーを調製した。 次に、 ファージ粒子をハイボンド N + メンブランにトランスファーし、 2)記載のノーザンハイプリダイゼ一ションの 際と同一のプローブを用いプラークハイプリダイゼ一シヨンによりスクリーニン グを行い、 目的の cDNA遺伝子を含む Un i— ZAP XRクローンを見出し た。 この組換え Un i— ZAP XRクローンよりイン ビトロ エキシジョン
(i n v i t r o exc i s i on) 法により pB l u e s c r i p tファ ージミ ドに変換した。 この組換えファージミ ドに組込まれている DNA断片の塩 基配列を蛍光 DNAシークェンサ一 （AB I社製） を用いて決定した。 ファージ ミ ドに組み込まれている DNA断片の塩基配列を基にしたウォーキング （Wa 1 k i ng) により c DNAライブラリ一に含まれる c DNA断片を連結した結果 得られた塩基配列を配列表の配列番号： 1〜1 4に示す。 なお、 GC36遺伝子 に関しては約 2. 6 kb pの c DNAクローンが得られた。 該 cDNAクローン の 5' 末端側及び 3' 末端側から塩基配列を解析したところ、 配列表の配列番号
： 1 5及び配列番号： 1 6に示す塩基配列情報が得られた。
こうして得られた塩基配列を、 BLASTプログラム 〔アルトシュル S. F.
(Altschul, S.F.)、 ジャーナル ォブ モレキュラー バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 、 第 2 1 5巻、 第 403〜 4 1 0頁 （1 990) 〕 を用 い、 ジーンバンク （Gen ebank) に収められた既知遺伝子 c DNAの塩基 配列とホモロジ一サーチを行った。 その結果 C A 1 1、 CA1 3、 GG33、 G C 35、 GC36、 CA42、 の各遺伝子 c DNAについては相当する配列が報 告されておらず、 これらの遺伝子は新規遺伝子と判断された。 更に、 CA 1 1、 CA 1 3、 CA4 2、 各遺伝子 cDNAに含有される塩基配列より、 遺伝子産物 の読み取り枠 （オープンリーディングフレイム） を検索したところ、 CA 1 1 c DNAは、 配列表の配列番号： 1 7に示すアミノ酸配列を、 CA 1 3 cDNAは 、 配列表の配列番号： 1 8に示すァミノ酸配列を、 CA42 cDNAは、 配列表 の配列番号： 1 9に示すアミノ酸配列を、 それぞれコードしていると予想された 。 一方、 CC 24はチトクローム cォキシダ一ゼ サブユニット I遺伝子、 AG 26は p 1 9 0— B遺伝子、 GC 3 1はチトクローム cォキシダ一ゼ サブュニ ット I I遺伝子、 GC 32はチトクローム b遺伝子、 GC 3 3はインテグリ ン a 6 サブユニット遺伝子、 GG 24は F 1—ATPエース β サブュニッ ト遺伝子、 C C 62はラクトフヱリイン遺伝子に相当していた。 一方、 C C 34 c DN Αの配列表の配列番号： 1 0に示す塩基配列領域は、 ミ トコンドリア 1 6 S r RNAをコ一ドする c DNAの一部領域と 7塩基の違いが認められた。
ところで、 本実施例における CC 34由来増幅 DNA断片をプローブとして使 用した cDNAライブラリイからのスクリーニングでは、 配列表の配列番号： 1 0に示す塩基配列を有する c DN Aクローンのほかに、 更に別種の陽性 c DN A クローンが得られた。 該 cDNAの塩基配列は、 配列表の配列番号： 1 0に示す 塩基配列における塩基番号 935の Tが Aに置換し、 更に 3' 末端の GTTAA G配列からなる 6塩基が欠失した塩基配列を有しており、 全塩基配列 1 54 6塩 基中 1 54 0塩基がミ トコンドリア 1 6 S r RNAをコ一ドする c DNAの一部 領域と同一配列を有することが明らかとなつた。 実施例 2 癌組織における遺伝子発現の変化の確認
実施例 1で確認された癌関連遺伝子について、 実施例 1 とは異なる癌組織を用 レ、該遺伝子発現と細胞痛化との関連を調べた。
1 ) 印環細胞型胃癌患者の癌組織における遺伝子発現の変化の確認 実施例 1の 1 ) 及び 2) で用いた組織の提供を受けた癌患者とは異なる、 印環細 胞型胃癌患者より摘出された癌組織と対照正常組織より実施例 1の 1 ) と同様に 調製した粗 RNA試料を用い、 実施例 1の 2) 記載のノーザンハイブリダィゼー シヨン又は RT— PCRを行い、 実施例 1の 3) で明らかとなった 1 4種の癌関 連遺伝子それぞれにっき癌組織と正常組織における発現量を、 mRNAの発現量 を指標に比較した。 一例として、 第 3図に RT— PCR法による CA 1 1遺伝子 mRNAの検出結果を示す。 すなわち第 3図は、 癌関連遺伝子の発現量の変化を 、 RT— PC R法により検出した場合の、 得られた DNA断片の電気泳動の蛍光 イメージを示す写真である。 RT— PC Rの反応条件は、 実施例 1の 2) 記載の 方法に従い、 PCRのサイクル数は 25、 及び 3 0の 2通りを設定した。 第 3図 において、 （a) は癌関連遺伝子 CA 1 1の発現を、 （b) は陽性コントロール として 3—ァクチンの発現を検出した結果を示す。 第 3図において、 2Tは印環 細胞型胃癌患者の胃癌組織より抽出した粗 RN A試料を铸型として得られた増幅 DNA断片を、 2 Nは印環細胞型胃癌患者の正常胃組織より抽出した粗 RN A試 料を铸型として得られた増幅 DNA断片であることを示す。 また、 第 3図におけ る 25及び 30は、 RT— PC R法における核酸増幅サイクル数を示す。 表 5に 第 3図に示した蛍光イメージ上のバンドの I ODを計算した結果を示す。 なお表 5における指標値は実施例 1の 2 ) に記した式 2により計算した値である。 表 5 サイ クル数 25 30
試 料 名 称 2 T 2N 2 T 2N
CA 1 1 3 65 3 1 1 1 8 6 34 5 6 1 742 8—ァクチン 7 1 0 5 6 2 25 1 1 5 204 25 指 標 値 0. 0 0 93 0. 08 3 表 5において蛍光イメージ上得られた ーァクチン由来のバンドの I OD値は P C Rサイクル数 25及び 30において 2 T及び 2 Nともほぼ同等の値が得られ ている事から、 全ての試料において RNAが抽出されていることが明らかとなつ た。 しかし指標値は PCRサイクル、 25及び 30とも 1より小さいことから、 CA1 1は印環細胞型胃癌患者においても、 癌化により発現量が低下する遺伝子 であることが明らかとなった。 なお、 CA1 1以外の 1 3種の癌関連遺伝子につ いても、 実施例 1の 2) と同様の発現量の変化が認められ、 実施例 1の 3) で明 らかとなつた 1 4種の癌関連遺伝子の発現量の変化が実施例 1の 1 ) に用いた患 者組織固有の変化でないことが明らかとなつた。 実施例 3
癌の検出キット構築
以下に示す構成成分を有する、 RT— PC R法を利用した癌の検出キッ トを構 築した。
すなわち、 DNa s e I、 AMV逆転写酵素、 RNa s eインヒビ夕一、 1 0 XRT—PCR緩衝液 （ 1 0 OmM トリスー HC 1、 pH 8. 3、 50 OmM
KC 1) 、 25mM MgC l 2 、 各々 2. 5mMの dATP、 dGTP、 d CTP、 dTTPから成る混合物、 オリゴ （dT) プライマー、 Taq DNA ポリメラーゼ、 表 2に示す各々の遺伝子に特異的なプライマー対及び陽性コント ロールとしてのS—ァクチン遺伝子の増幅のためのプライマー対を含む。 なお、 表 2のプライマ一対欄において、 アルファベットと数字の組合せの記号はブラィ マー名称を示し、 該記号に付随する （ ） 内の数字は、 配列表における該プライ マーの塩基配列を示した配列番号を示す。 産業上の利用可能性
本発明により癌を簡便かつ迅速に検出することが可能となる。 また、 癌に関連 する新規な核酸の存在が明らかとなつた。 均等物
当業者であれば、 単なる日常的な実験手法によって、 本明細書に記載された発 明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、 あるいは確認することができる であろう。 そのような均等物は、 下記クレームに記載されるような本発明の範疇 に含まれるものである。
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33vfwsuvo33333 vvj VV33V1
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CGTGCACGGA AAATACAGCG TTTCTTGTCT CAGCCATTCC AGGTTGCTGA GGTCTTCACA 1500 GGTCATATGG GGAAGCTGGT ACCCCTGAAG GAGACCATCA AAGGATTCCA GCAGATTTTG 1560 GCAGGTGAAT ATGACCATCT CCCAGAACAG GCCTTCTATA TGGTGGGACC CATTGAAGAA 1620 GCTGTGGCAA AAGCTGATAA GCTGGCTGAA GAGCATTCAT CGTGAGGGGT CTTTGTCCTC 1680 TGTACTTGTC TCTCTCCTTG CCCCTAACCC AAAAAGCTTC ATTTTTCTAT ATAGGCTGCA 1740 CAAGAGCCTT GATTGAAGAT ATATTCTTTC TGAACAGTAT TTAAGGTTTC CAATAAAATC 1800 GGAATTC 1807 配列番号： 5
配列の長さ ： 4 9 9 2
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
配列
CCGCGGTGAG CCGCGAGGAA GAGAGGCGAG CGAGAGTGGA GGAGGAGGCG GCGGCTGCGG 60 GACGGTCCCC AGGAATGTCG CTGCCCCCCC CCCCCCTGCC GTTGAGGAGG AGACGGAGGA 120 GACCGACGTT GTTAGGGAAG ATGATCCCTA TGATCTGCCG CTGTTTCTGC ACAGAAATGA 180 GGGAAATACA AAGAACCAAA TACAGTTCTA AATTTGGGAT CTGTATTTTG AGATGATTTT 240 ATTTTCAGAA TGAGAAGCAT ATCTGGTTAC CTTTATGAAT GTAGAGACAT GAGAAGAGAG 300 TTATGATGGC AAAAAACAAA GAGCCTCGTC CCCCATCCTA TACCATCAGT ATAGTTGGAC 360 TCTCTGGGAC TGAAAAAGAC AAAGGTAACT GTGGAGTTGG AAAGTCTTGT TTGTGCAATA 420 GATTTGTACG CTCAAAAGCA GATGAATATT ATCCAGAGCA TACTTCTGTG CTTAGCACCA 480 TTGACTTTGG AGGACGAGTA GTAAACAATG ATCACTTTTT GTACTGGGGT GACATAATAC 540 AAAATAGTGA AGATGGAGTA GAATGCAAAA TTCATGTCAT TGAACAAACA GAGTTCATTG 600 ATGACCAGAC TTTCTTGCCT CATCGGAGTA CGAATTTGCA ACCATATATA AAACGTGCAG 660 00 05
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配列の長さ ： 5 8 0
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
配列
CCATCCAATG AGGCCACCTC TTTCTAAACT CAGACTCTTC ATTTAGGGAG GTGAGTTCCA 60 TTAAGGAACT TGAGATTTTC AGATAAATGG AAAATACTAG ATAAAGAGGT ATCTCATAGA 120 TAGCAAAGGT AAACTCTCAT ACAATCATTG AGCTAGGACA TTAATGGTTC AGTGGTTCCC 180 AATTCTAGAT ATACATTAAA ATAAATTGAA AAGCCTTTTA AAAATACATG ATTACTGGAC 240
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CCACAGTATGCCGT AAGGCACCGCCG GAATTT TAACGGCCGC CCTGCATA
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ACAGAATATA CATTCTTCTT ATCTGCACAT GGAACACATT CCAAGATCAA TCACATGCTA 1920
GGTAAGAAAG CAAGTCTCAA TAAATTAAAA AAAATTGAAA TCATACGAAC CTTAATATCA 1980
GACCACAATG TAATTAAAAA TAAATCAATA TCAAGAAGAT CTCATACATA AATACATGAA 2040
AATTAAACAA CTTACTCCTG AATAACTCTT GTGTGAACAT CAAAATTCAG GAAGAAATAA 2100
AAAATTATTT GAAATT 2116 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 1 7 3
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
配列
GCGATCCACA AATGGGAGGT GACGGTCCAT CAGGGAAGCT GGGTTCGCGG CTCCACGGCT 60 GGGGGCTGCC GCAATTTCCT GGATACCTTT TGGACCAATC CACAAATAAA ATTGTCTCTG 120 ACTGAGAAAG ATGAGGGGCA GGAGGAGTGT AGTTTCCTTG TAGCCCTGAT GCA 173 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 6 5 5
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA to mRNA
配列
CTGATCCATG GGCCAGCAGC ATCAATATTA CCTGGGAGCT TACAGAAATG CAGAATTTCA 60 o o o o o au ovi QilvvlvvvvvvVIU33 O O O O O O C O UD
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170 175 180
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185 190 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 5 1
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列
Met Val Asp Asp Lys Arg Lys Ser Ala Leu Trp Lys Glu Arg Thr 1 5 10 15
Val Ser Thr Arg Val Lys Ser Met Asn Ala Ser l ie Glu Arg Thr
20 25 30
Arg Gly Asn l ie Pro Ser Thr Gly Leu His Thr Cys He Tyr l ie
35 40 45
Leu Glu Asn Thr Ala Met
50 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 6 3
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド 配列
Met Gly Gin Gin His Gin Tyr Tyr Leu Gly Ala Tyr Arg Asn Ala
1 5 10 15
Glu Phe Gin Ala His Cys Arg Ser Thr Glu Ser Lys Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Lys l ie Ser Gin Thr l ie Ser Thr Gly Leu Hi s Pro Phe Tyr
35 40 45
Pro Ser Leu Ala He Arg Asp Val Arg Ser Glu Gly Phe Lys Arg
50 55 60
Ser Pro Glu 配列番号： 2 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
TCTTTGCTGG ACTTCTTGGA 20 配列番号： 2 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CTTTGTTTGG GTTGACTGAG 20 配列番号： 2 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CACCCTCATT ACATCATCAG 20 配列番号： 2 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
ATTCCTTGTG TCTTCTGGTA 20 配列番号： 2 4
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CAGTCCTACT TCTCCTATCT C 21 配列番号： 2 5.
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
ATCATAGCTC AGACCATACC T 21 配列番号： 2 6
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GATCCTGCAG GACTACAAAT C 21 配列番号： 2 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GCCTATATAG AAAAATGAAG 20 配列番号： 2 8
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CACCTAGTGA CCGTTCCAGA T 21 配列番号： 2 9
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTCATCTCCT TGGGTGTTAT T 21 配列番号： 3 0
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CTCAGACGCT CAGGAAATAG A 21 配列番号： 3 1
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
AATGGGGGAA GTATGTAGGA G 21 配列番号： 3 2
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTACGGATCA TTTCTCTACT C 21 配列番号： 3 3
配列の長さ ： 2 1 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
AGGGCAAGAT GAAGTGAAAG G 21 配列番号： 3 4
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TCCGGAAAGA AGAGCGAGAG A 21 配列番号： 3 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TGAAACACAA CTACCCCAAT G 21 配列番号： 3 6 配列の長さ ： 2. 0 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
ATAGCAAAGG TAAACTCTCA 20 配列番号： 3 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TCAATCAGTA GTTCCCAGTA 20 配列番号： 3 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTAACAGCCC AATATCTACA 20 配列番号： 3 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GAACAAGTGA TTATGCTACC 20 配列番号： 4 0
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
AGAATAAGCA ACTTGGAAAA 20 配列番号： 4 1
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TGAATCTGAT GACTATGTGC 20 配列番号： 4 2
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TCCTGGATAC CTTTTGGACC 20 配列番号： 4 3
配列の長さ ： 1 9
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CATCAGGGCT ACAAGGAAA 19 配列番号： 4 4
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列 CAGATCTACC GAATCAAAAT C 21 配列番号： 4 5
配列の長さ ： 2 1
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
ACCAGAATTA GGAATAAGGA T 21 配列番号： 4 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GACTCCATGG CAAAACAACA 20 配列番号： 4 7
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TCTTCTTCGG TTTTACTTCC 20 配列番号： 4 8
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
AGGCACCAGG GCGTGATGGT 20 配列番号： 4 9
配列の長さ ： 2 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GGTCTCAAAC ATGATCTGGG 20 配列番号： 5 0
配列の長さ ： 1 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CTTGATTGCC 10 配列番号： 5 1
配列の長さ ： 1 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
AGGTGACCGT 10 配列番号： 5 2
配列の長さ ： 1 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GTTGCGATCC 10 配列番号： 5 3
配列の長さ ： 1 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CTGATCCATG 10 配列番号： 5 4
配列の長さ ： 1 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CTGCTTGATG 10 配列番号： 5 5
配列の長さ ： 1 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GATCTGACTG 10 配列番号： 5 6
配列の長さ ： 1 3
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TAA 13 配列番号： 5 7
配列の長さ ： 1 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TAC 13 配列番号： 5 8
配列の長さ ： 1 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TAG 13 配列番号： 5 9
配列の長さ ： 1 3 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TCA 13 配列番号： 6 0
配列の長さ ： 1 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TCC 13 配列番号： 6 1
配列の長さ ： 1 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TCG 13 配列番号： 6 2 配列の長さ ： 1 3 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TGA 13 配列番号： 6 3
配列の長さ ： 1 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TGC 13 配列番号： 6 4
配列の長さ ： 1 3
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
TTTTTTTTTT TGG 13 配列番号： 6 5
配列の長さ ： 2 6 4
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
AGGCACCAGG GCGTGATGGT GGGCATGGGT CAGAAGGATT CCTATGTGGG CGACGAGGCC 60 CAGAGCAAGA GAGGCATCCT CACCCTGAAG TACCCCATCG AGCACGGCAT CGTCACCAAC 120 TGGGACGACA TGGAGAAAAT CTGGCACCAC ACCTTCTACA ATGAGCTGCG TGTGGCTCCC 180
GAGGAGCACC CCGTGCTGCT GACCGAGGCC CCCCTGAACC CCAAGGCCAA CCGCGAGAAG 240
ATGACCCAGA TCATGTTTGA GACC 264

Claims

請求の範囲
1. 体外摘出試料における癌細胞を検出する方法において、 配列表の配列番号 ： 1〜1 6のいずれかに示される塩基配列を含有する DNA又は配列表の配列番 号： 1〜1 6のいずれかに示される塩基配列からなる核酸にストリンジェントな 条件でハイブリダィズ可能な DNAを cDNAとする遺伝子から選択される少な くとも 1つの癌関連遺伝子の発現量の変化を調べることを特徴とする癌細胞の検 出方法。
2. 癌関連遺伝子の発現量の変化を、 該遺伝子 mRNAの発現量の変化により 調べることを特徴とする請求項 1に記載の検出方法。
3. mRNAの発現量の変化を、 該 mRNA又はその一部を核酸増幅法を利用 して検出することを特徴とする請求項 2に記載の検出方法。
4. 核酸増幅法がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項 3に記 載の検出方法。
5. mRNAの発現量の変化をノーザンハイプリダイゼ一シヨン法によって検 出することを特徴とする請求項 2に記載の検出方法。
6. mRNAの発現量の変化を RN a s eプロテクションアツセィ法によって 検出することを特徴とする請求項 2に記載の検出方法。
7. 癌関連遺伝子の発現量の変化を、 該遺伝子にコードされるタンパク質の発 現量の変化により調べることを特徴とする請求項 1に記載の検出方法。
8. 夕ンパク質の発現の変化を、 該夕ンパク質を認識する抗体を利用し検出す ることを特徴とする請求項 7に記載の検出方法。
9. 請求項 3記載の方法により癌を検出するためのキットであって、 発現量の 変化を調べようとする mRNA又は該 mRNAの一部を増幅するためのプライマ —を含むことを特徴とするキット。
1 0. 請求項 5又は 6記載の方法により癌細胞を検出するためのキットであつ て、 発現量の変化を調べようとする mRNAにハイプリダイズするプローブを含 むことを特徴とするキット。
1 1. 請求項 8記載の方法により癌細胞を検出するためのキットであって、 発 現量の変化を調べようとするタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする ャッ 卜 o
1 2. 遺伝子又は該遺伝子発現産物への特異的結合物を用いた癌細胞の増殖制 御方法において、 遺伝子 cDN Aが配列表の配列番号： 1〜1 6のいずれかに示 される塩基配列を含有する、 又はこれらの塩基配列からなる核酸にストリンジェ ントな条件でハイプリダイズ可能な DNAであって発現量の変化で癌細胞の検出 に利用できる DN Aから選択される少なくとも 1つの DN Aであることを特徴と する癌細胞の増殖制御方法。
1 3. 配列表の配列番号： 1 7〜1 9に示されるアミノ酸配列の全部又はその 一部を含有するァミノ酸配列で示されることを特徴とする癌細胞の検出に利用で きるぺプチド。
1 4. 配列表の配列番号： 1 7〜1 9に示されるアミノ酸配列において、 1又 は 2以上のアミノ酸残基の欠失、 置換又は付加の少なくとも一つを生じさせたァ ミノ酸配列を含有するァミノ酸配列で示されることを特徴とする発現量の変化で 癌細胞の検出に利用できるぺプチド。
1 5. 請求項 1 3又は請求項 1 4記載のペプチドをコードする核酸。
1 6. 配列表の配列番号： 1， 2， 9、 1 1、 1 2、 1 3, 1 5, 1 6のいず れかに示される塩基配列を含有する塩基配列で示されることを特徴とする請求項 1 5記載の核酸。
1 7. 請求項 1 5または請求項 1 6記載の核酸にストリンジェントな条件下で ハイプリダイズする、 発現量の変化で癌細胞の検出に利用できる核酸。
1 8. 請求項 1 3あるいは請求項 1 4記載のペプチドを認識する癌細胞の検出 に利用できる抗体。
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