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WO1993012254A1 - Highly sensitive determination of d-3-hydroxybutyric acid or acetoacetic acid and composition therefor - Google Patents

Highly sensitive determination of d-3-hydroxybutyric acid or acetoacetic acid and composition therefor Download PDF

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Publication number
WO1993012254A1
WO1993012254A1 PCT/JP1991/001706 JP9101706W WO9312254A1 WO 1993012254 A1 WO1993012254 A1 WO 1993012254A1 JP 9101706 W JP9101706 W JP 9101706W WO 9312254 A1 WO9312254 A1 WO 9312254A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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nads
thio
nadps
acetate
acid
Prior art date
Application number
PCT/JP1991/001706
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeru Ueda
Hideo Misaki
Shigeru Ikuta
Mamoru Takahashi
Original Assignee
Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha filed Critical Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha
Priority to PCT/JP1991/001706 priority Critical patent/WO1993012254A1/ja
Priority to DE69129308T priority patent/DE69129308T2/de
Priority to US08/244,450 priority patent/US5633143A/en
Priority to EP92900594A priority patent/EP0632133B1/en
Publication of WO1993012254A1 publication Critical patent/WO1993012254A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/966—Chemistry: molecular biology and microbiology involving an enzyme system with high turnover rate or complement magnified assay, e.g. multi-enzyme systems
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/973—Simultaneous determination of more than one analyte
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/104998—Glucose, ketone, nitrate standard or control

Definitions

  • the present invention relates to a novel high-sensitivity quantification method and a composition for quantification using an enzyme cycling reaction of D-3-hydroxybutyric acid or acetate acetate in clinical biochemical tests, food tests and the like.
  • Conventional technology
  • D-3-Hide ⁇ -xybutyric acid and acetate acetate are measured as individual components of ketones in the clinical laboratory field and are important indicators of metabolic dysfunction.
  • acetone is also contained, but it is easy to evaporate and is unstable, and blood D-3 -hydroxy drank acid and acetate Since it is lower than acetic acid, it is considered clinically sufficient to measure D-3-hydroxybutyric acid and acetate acetate.
  • Conventional measurement methods include, for example, a diazonium method in which acetoacetic acid is chemically reacted with a diazonium salt to measure absorbance as a hydrazo compound or azo compound, and acetoacetic acid and acetone.
  • a chemical method such as a two-mouthed Prussid method, etc., in which a nitric acid reagent is chemically reacted with acetoacetic acid and acetone to form a colored body, and a ketone body is converted to acedone.
  • Gas chromatography which is detected by gas chromatography, and enzymatic methods.
  • the diazoyum method is highly sensitive, but requires deproteinization.
  • D-3_hydroxybutyric acid the D-3-3-hydroxybutyrate dehydrogenase must be used beforehand to measure D-3 The value obtained after converting xylanoic acid into acetic acetic acid (D-3—sum of hydroxybutyric acid and acetic acetic acid) It is obtained by subtracting the value of acetate acetate from the above.
  • the chemical assay is low in specificity, so it is susceptible to the effects of other contaminants, for example, the diazonium method is susceptible to acetic acid at the mouth (CI inica Chimica Acta). : 1 3 4, 3 2 7-3 3 6 (1 9 8 3))).
  • the nitroprusside method like the diazonium method, cannot detect D-3-hid ⁇ -xybutyric acid and has low sensitivity (detection sensitivity 500 to 100 1) (Japanese clinical study). 4 7 volumes, 1989 extra edition, ⁇ . 4 8 4).
  • gas chromatography method is complicated and its operation is not suitable for the field of handling multiple samples such as a clinical test.
  • the enzymatic method uses D-3-hydroxybutyric acid dehydrogenase (EC 1.1.1.10).
  • the enzyme When measuring acetic acid, the enzyme is used.
  • the amount of reduced NAD consumed in the reverse reaction i.e., the reaction between acetate acetate and reduced NAD and D-3-hydroxybutyric acid, is measured, and when D-3-hydroxybutyric acid is measured.
  • the positive reaction of the enzyme reaction that is, the reaction between D-3-hydroxybutyric acid and NAD to form acetate acetate and reduced NAD, is used to measure the amount of increase in reduced NAD over time, respectively.
  • D--3-hydroxybutyric acid and acetate acetate which are important as ketones, can be measured only on one side, and high-sensitivity measurement cannot be performed.
  • Other methods for enzymatically measuring acetate acetate include acetate acetyl-CoA synthetase (EC 6.2.1.16) and 3-ketoacyl-CoA thiolase (EC2.
  • one or more ketone bodies selected from the group consisting of D-3-hydroxybutyric acid and acetate acetate, which are completed based on the above findings.
  • thio NADPs thionicotinamide adodenine dinucleotide phosphates
  • thio NADs thionicotinamide amide adenine dinucleotides
  • a 2 represents a reduced product of
  • B represents a reduced form when Ai is a thio NADP or a thio NAD.
  • Table a-NADP or a reduced NAD, a with but shows the original type Chio NA DP acids or the reduced Chio NAD compound changed when the NADP or NAD, shows a B 2 is oxidized raw product) selected from the group consisting of human Dorokishi ⁇ and ⁇ Seto acetate - which is being made to form a cyclic click-ring reaction, D-3 and feature determining the amount of a 2 or changed by the reaction It provides a sensitive method for the quantification of one or more ketones.
  • the present invention relates to a test solution having one or more ketones selected from the group consisting of D-3-hydroxybutyric acid and acetate acetate.
  • thio NADPs and thio NADs are used as coenzymes, and at least D-3-hydroxybutyric acid is used as a substrate.
  • a 2 represents a reduced product of A, and represents when At is thio NADPs or thio NADs.
  • the reduced NADP or reduced NAD but shows the NA DP acids or former type Chio NA DP class changed when the NA D compounds or the reduced Chio NA D compounds, B 2 of B, oxidized product of are shown, B from B 2, the reaction allowed to form a cyclic click-ring reaction represented by indicating the enzymatic reaction) that generates at by an enzyme capturing a second dehydrogenase to, to the reaction and determining the amount of connexion varying a 2 D-3 - sensitive human Dorokishi acid and one selected from the group consisting ⁇ Se Bok acetate addition if more Ke tons member It provides a quantification method.
  • the present invention relates to a test solution having one or more ketone bodies selected from the group consisting of D-3-hydroxybutyric acid and acetate acetate.
  • One and one selected from the group consisting of NAD Ps and NADs are used as capture enzymes, and at least D-3-H is a reversible reaction that produces acetate acetate using D-3-hydroxybutyrate as a substrate.
  • Deoxybutyrate dehydrogenase is used as capture enzymes, and at least D-3-H is a reversible reaction that produces acetate acetate using D-3-hydroxybutyrate as a substrate.
  • a 1 is a thio NADP or a thio NAD.
  • A indicates NADPs or NADs
  • B 2 indicates oxidized products of the reaction to the a 2 is caused to form a cyclic click-ring reaction represented by an enzyme reaction to produce a, at a third dehydrogenase as a coenzyme a z), it varies with the reaction
  • the present invention provides the following components (1) to (3)
  • One selected from the group consisting of thio NADPs and thio NADs and one selected from the group consisting of NADPs and NADs are used as coenzymes, and at least D-3—hydroxybutyric acid is used as a substrate. Reversible reaction to form set acetic acid D—3—Hydroxybutyrate dehiro Genase,
  • A represents thio NA DPs, thio NA Ds, NADPs or NADs
  • B t represents reduced NA DPs or reduced NAs when is thio NA DPs or thio NADs.
  • D- which represents reduced NADPs or reduced NADs when is NADPs or NADs).
  • D-3 Hydroxydic acid and ⁇ -D It is intended to provide a composition for quantifying one or more ketone bodies selected from the group consisting of set acetic acid.
  • the present invention further comprises the following components 1 to 4
  • One selected from the group consisting of thio NADPs and thio NADs and one selected from the group consisting of NADPs and NADs are used as capture enzymes, and at least D-3-hydroxybutyric acid is used as a substrate.
  • D-3-Hydroxybutyrate dehydrogenase which undergoes a reversible reaction to produce acetate acetate
  • the present invention provides a composition for quantifying one or more ketones selected from the group consisting of:
  • the present invention provides the following components (1) to (3) and (2)
  • D-3 Hydroxybutyric acid
  • the present invention provides a composition for quantifying one or more ketones selected from the group consisting of acetic acid and acetate.
  • NAD P Chio NAD P class
  • Chio N AD acids include, but showing the NAD, as the Chio NAD P class or Chi O NAD, e.g. Chionikochin'a Mi Doadeninjinuku les Phosphatate (ChoNAD P), Cionicotinamide dohipoxy santin dinucleotide, and Chonicotine amido adenine dinucleotide (Cho NAD);
  • NADs include, for example, nicotinamide adenine dinucleotide Fate (NADP), acetylbilidine adenine dinucleotide phosphate (acetyl NADP), acetyl bilidine hypoxanthine nucleotide phosphate, nicotinamide hypoxanthine nucleotide phosphate (Denamino NADP); and nicotinamide adodenidine nucleotide (NAD), and nicotinamide a
  • NAD (P) H when is a NAD (P) H, B, needs to be a NAD (P) H, and when B is a NAD (P) H, A, NAD (P) must be used, and one zeotype enzyme is used in relation to and.
  • D-3-hydroxybutyric acid mouth enzyme used for the quantification uses thioNADs and NADs as coenzymes
  • the above-mentioned thioNADs and NADs are used.
  • D- 3 When hydroxybutyrate dehydrogenase uses both thio-NADs (P) and NAD (P) as coenzymes, the above-mentioned thio-NADs and thio-NADPs and NADs and What is necessary is just to select and use suitably from NADPs.
  • the concentrations of A, and Bi are from 0.02 to 100 mM, especially 0.05 to 20 mM is preferable, and the amount of D-3—hydroxybutyrate dehydrogenase is 5 to: L 000 u / m ⁇ , particularly 20 to 400 u / m ⁇ .
  • the amount can be appropriately determined depending on the type of the subject and the like, and a larger amount can be used.
  • the assay method of the present invention can be applied to two capture enzymes.
  • a combination of NADs or NADPs, or a combination of thio NADPs and NADs or NADPs further adds the D--3—hydroxybutyric acid component to the subject.
  • the cycling reaction can be formed by providing a reaction system for regeneration between and B 2.
  • Dehi drogenase (In the formula, A, represents thio NADPs, thio NADs, NADPs or NADs, A z represents a reduced product of A, and represents a reduced form of thio NADPs or NADPs. NADs or reduced NADs, and when is a NAD or NADs, they represent reduced thio NADPs or reduced NADPs, and B 2 represents an oxidized product of B, and B 2 ⁇ B , Indicates an enzymatic reaction that produces B, using B 2 as a capture enzyme)
  • the second dehydrogenase is supplementarily added for the regeneration of B ⁇ , which makes it possible to reduce the amount of B, used, and in particular, B, It is effective when expensive.
  • the reaction may be carried out using B 2 or a mixture of B 2 and B 2 instead of B 1 and B 2 .
  • B or Roh and but are not particular restrictions on the quantity used of the B 2 generally A, of 1 1 0 mol is preferred arbitrariness.
  • the concentration of A 1 is 0.
  • the concentration of D—3—hydroxybutyrate dehydrogenase is between 5 and 100 uZm £, especially between 20 and 400 tiZm £
  • the second dehydrogenase is preferably It may be prepared so as to be at least 20 times (u / m £ unit) the Km value (mM unit) for B z , for example, 1 to 100 u no m £ is preferable
  • the substrate for the second dehydrogenase is preferably in an excess amount, for example, 0.05 to 20 mM.
  • the second dehydrogenase and its substrate for example when B z is NAD compound or Chio NAD, alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.1) and ethanol, glycerol dehydrogenase (EC 1.1.1.16) (derived from E. C01i) and glycerol 3-Phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.1.8) (derived from rabbit herb muscle) and L-glycerol-l3-Phosphate, lactate dehydrogenase (EC 1.1. 1.
  • D-3-hydroxybutyrate dehydrogenase uses both (thio) NADs and (thio) NADPs as the capture enzymes
  • the two capture enzymes have When a combination of D and NAD or NADP, or a combination of CHINADP and NAD or NADP is selected, D-3 of the component is further added to the subject.
  • a 2 reaction without acting on hydroxybutyric acid By reacting the third dehydrogenase and the substrate of the third dehydrogenase, A! Can be obtained according to the following reaction formula [II]. By providing a reaction system for regeneration between A and A, the cycling reaction can be formed.
  • B is essentially used as a coenzyme.
  • examples include a combination for selecting an enzyme that does not act, a combination for selecting a condition under which the third dehydrogenase does not substantially act on B, based on the quantitative relationship between B, and Az, and the like.
  • a 2 is a reduced product of A t, reduced form when teeth of Chio NA DP acids or NA DP acids Zho NADs or reduced NADs, or when Zeo NADs or NADs, reduced Ziona NADPs or reduced NADPs, B 2 indicates an oxidized product of A 2 ⁇ A , represents an enzymatic reaction that generates as coenzyme a
  • the third dehydrogenase is supplementarily added for the regeneration of A, and this makes it possible to reduce the amount used, especially when is expensive. It is valid.
  • the reaction may be performed using A 2 or a mixture of and A 2 instead of Good. In this case, or the amount of Roh and A 2 is not be particularly limited, in general, preferably not more than 1 Z 1 0 moles of B i.
  • the concentration of is 0.02 ⁇ 1 0 0 1111 ⁇ , especially 0.0 5 ⁇
  • the concentration of D—3—hydroxybutyrate dehydrogenase is preferably 5 to 100 ⁇ m, particularly preferably 20 to 100 ⁇ M, particularly preferably 5 to 500 M.
  • third dehydrogenase is them prepared to be 2 0 times (u / m A units) or more the Km value against the A z (mM Unit) ⁇ well, e.g.
  • the amount of the substrate for the third dehydrogenase is preferably in an excess amount, for example, 0.05 to 20 mM. These amounts can be appropriately determined depending on the seeds of the subject, etc., and larger amounts can be used.
  • glycerol dehydrogenase (EC 1. 1. 1. 1) and acetoaldehyde, glycerol dehydrogenase (EC 1. 1. 1. 6) (derived from E. coli) and dihydroxyaceton, glycerol One 3-phosphate dehydrogenase
  • glyceroaldehyde dehydrogenase dehydrogenase (Derived from porcine myocardium, derived from red heart muscle) and oxalic acetic acid, glyceroaldehyde dehydrogenase dehydrogenase (EC 1.1.1.12 ⁇ ) ( ⁇ Eg skeletal muscle, liver, yeast, E.C 0 1 i) and 1,3—diphospho-D—glyceric acid are NADPs or thioNADPs, glucose-16-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.4)
  • the two coenzymes are appropriately selected in consideration of the relative activities between the various coenzymes of D 3 -hydroxybutyrate dehydrogenase to be used, and then the optimal reaction is performed.
  • the PH conditions may be set so that the enzyme cycling reaction proceeds efficiently.
  • These enzymes may be used alone or in combination of two or more.
  • a test solution for example, serum, plasma, urine, etc.
  • the reaction is carried out at a temperature of about 37, and a few minutes to tens of minutes between two points after a certain time from the start of the reaction, for example, 1 minute after 3 minutes and 4 minutes, or after 3 minutes and 8 minutes the amount of amount or consumed in the generated a 2 in 5 minutes, and may be measured by absorbance change based on the respective absorption wavelengths.
  • a 2 is Chio NADH
  • B case, but of NADH is measured by a reduction or measured by an increase in 4 0 0 nm absorbance production of A 2, or consumption of the 3 4 0 nm absorbance, known
  • the amount of D13—hydroxybutyrate or acetate in the test solution can be determined in real time. You can find it at
  • the total value of D-3-hydroxyacetic acid and acetate acetate that is, the total ketones can be measured in one operation, and such a method is used. Not previously known. this is The individual components of total ketones, D-3-hydroxybutyric acid and acetate acetic acid, are substrates for D-3-hydroxylactate dehydrogenase, and these two components are directly enzymatically synthesized. This is due to the feature of the present invention that it leads to the ringing reaction. Further, when it is desired to measure the values of individual components as well as the total Ke ton body, after pretreatment by the enzyme which acts on only one of the components subject in advance, if Michibike enzyme site click-ring reaction Good.
  • acetate acetate decarboxylase (EC 4.1.1.1.4) converts acetate acetate to acetate and carbonate gas, so that the enzyme cycle according to the present invention continues.
  • acetate acetate decarboxylase (EC 4.1.1.1.4) converts acetate acetate to acetate and carbonate gas, so that the enzyme cycle according to the present invention continues.
  • a ring reaction By performing a ring reaction, only D-3-hydroxybutyric acid can be determined. Further, by subtracting the amount of D-3-hydroxyhydroxy acid from the amount of total ketones, a quantitative value of only acetate acetic acid can be calculated.
  • the quantification method of the present invention leads to the enzyme cycling reaction of D-3-hydroxybutyric acid or acetate acetate itself in a test solution, and the coexisting substance in the test solution is eliminated. Since it is hardly affected, the blank measurement of the test solution can be omitted, and a simple measurement using a late assay can be performed.
  • Fig. 1 is a curve showing the change in absorbance at 400 nm against the amount of D-3-hydroxybutyric acid.
  • Fig. 2 is a curve showing the change in absorbance at 400 nm against the amount of acetate acetate solution. The figure shows a curve showing the absorbance difference at 340 nm for acetate acetate, and the figure shows a curve showing the absorbance difference at 340 nm for D-3-hydroxyacetic acid.
  • Example 3 Using the same reaction solution as in Example 1, the same operation as in Example 1 was performed, except that the D-3-hydroxybutyric acid solution was replaced with an acetate acetic acid solution. The results are shown in Figure 2. As is clear from FIG. 2, as in Example 1, good linearity was obtained.
  • Example 3 Using the same reaction solution as in Example 1, the same operation as in Example 1 was performed, except that the D-3-hydroxybutyric acid solution was replaced with an acetate acetic acid solution. The results are shown in Figure 2. As is clear from FIG. 2, as in Example 1, good linearity was obtained.
  • Example 3 As is clear from FIG. 2, as in Example 1, good linearity was obtained.
  • Triton X—100 (Sigma) 10 u / m £ acetoacetate decarboxylase (Bacillus lipomixa (Bacililuspo1ymyxa) manufactured by Wako Pure Chemical Industries)
  • the reaction solution I was placed in a 0.45 m cuvette and heated at 37'C in advance. Next, serum 20 is added to each of the four normal human sera used in Example 3 and reacted at 37 ° C for 5 minutes to eliminate endogenous' acetacetic acid. After that, 0.5 N of 0.2 N hydrochloric acid was added to inactivate decarboxylase acetate, and then 0.5 ml of reaction solution II was added, followed by enzymatic cycling reaction. The absorbance at 400 nm was read at the second minute and the fifth minute after the addition of the reaction solution, and the difference was determined.

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Description

明 細 書
D - 3 ーヒ ドロキシ酩酸またはァセ ト酢酸の高感度定量法お よび定量用組成物 技術分野
本発明は、 臨床生化学検査、 食品検査等における D— 3 —ヒ ドロ キシ酪酸またはァセ ト酢酸の酵素サイ ク リ ング反応を用いた新規な 高感度定量法および定量用組成物に関する。 従来の技術
D— 3 —ヒ ド σキシ酪酸、 ァセ ト酢酸は、 臨床検査分野において ケ ト ン体の各成分として測定され、 代謝不全の指標として重要であ る。 ケ ト ン体には、 上記 2つの他にアセ ト ンも舍まれるが、 ァセ ト ンは気化しやすく不安定であり、 又、 血中 D— 3 —ヒ ドロキシ酩酸 、 ァセ ト酢酸に比し低値であるため、 臨床上は、 D— 3 —ヒ ドロキ シ酪酸、 ァセ ト酢酸を測定すれば十分とされている。
従来の測定法としては、 例えばァセ ト酢酸をジァゾニゥム塩と化 学的に反応させてヒ ドラゾ化合物またはァゾ化合物として吸光度を 測定するジァゾニゥム法、 およびァセ ト酢酸、 アセ ト ンを測定する ためにァセ ト酢酸、 アセ ト ンにニ ト ロプルシ ッ ド試薬を化学反応せ しめ呈色体となす二 ト 口プルシッ ド法等の化学法、 およびケ ト ン体 をァセ ドンに変換してガスク ロマ トグラフィーで検出するガスク ロ マ トグラフィ一法、 および酵素法等がある。
' ジアゾユウム法は感度が高いが、 除蛋白が必要であり、 D - 3 _ ヒ ドロキシ酪酸を測定するには予め D— 3 — ヒ ドロキ シ酪酸デヒ ド ロゲナーゼにより、 D— 3 -ヒ ド口キシ酩酸をァセ ト酢酸に変換せ しめてから求めた値 （ D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸とァセ ト酢酸の合計） からァセ ト酢酸の値を差し引いて求めることになる。 しかしながら —般に化学的測定法は特異性が低いので、 他の夾雑物の影響を受け やすく例えばジァゾニゥム法においては、 オギザ口酢酸の影響を受 け易いものであった （ C I i n i c a C h i m i c a A c t a : 1 3 4 , 3 2 7 - 3 3 6 ( 1 9 8 3 ) ) 。 また、 ニ トロプルシッ ド 法は、 ジァゾニゥム法と同様に D— 3—ヒ ド σキシ酪酸を検出する ことができず、 感度も低い （検出感度 5 0 0〜 1 0 0 0 Μ) (日 本臨床 4 7巻、 1 9 8 9年増刊号、 Ρ . 4 8 4 ) 。
更にまた、 ガスクロマ トグラフィ一法は、 操作が煩雑で、 臨床検 查等多検体を取り扱う分野には適さない。
又、 酵素法.は、 D— 3—ヒ ドロキシ酪酸デヒ口ゲナ一ゼ （ E C 1. 1. 1. 3 0 ) を用いるものであり、 ァセ ト酢酸を測定する場合に は該酵素の逆反応、 すなわちァセ ト酢酸と還元型 N A Dより D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸と NADとなす反応において消費される還元型 N A Dの滅少量を、 又、 D— 3—ヒ ドロキシ酪酸を測定する場合には 該酵素反応の正反応、 すなわち D— 3—ヒ ドロキシ酪酸と N A Dよ りァセ ト酢酸と還元型 NADとなす反応において増加する還元型 N A Dの増加量をそれぞれ経時的に測定するウィ リ アムソ ン （W i i 1 i a m s o n ) ¾¾ CM e t h o d o f E n z ym a t i c An a l y s i s , A c a d e m i c P r e s s , N e Y o r k, 1 8 3 6 - 1 8 4 3 ( 1 9 7 4 ) 〕 およびその変法がある。 またその他の酵素法として、 D— 3—ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロゲナ ーゼの存在下、 D— 3—ヒ ドロキシ酪酸を測定するため、 D— 3— ヒ ドロキシ酪酸と NADよりァセ ト酢酸と還元型 NADとを生成せ -しめ、 生じた還元型 NADの増加量に比例してテ トラゾリム塩をホ ルマザン色素として試験紙上で検出するべ一パース ト リ ップテス ト (D i a e t e s C a r e , 7 , 4 8 1 ( 1 9 8 4 ) ) もある。 これらの酵素法においては、 ケ ト ン体として重要な D — 3 —ヒ ド 口キシ酪酸およびァセ ト酢酸を片一方しか測定できないばかり力、、 高感度測定もできない。 また、 ァセ ト酢酸を酵素的に測定するその 他の方法として、 ァセ トァセチルー C o Aシンセターゼ （ E C 6 . 2 . 1 . 1 6 ) および 3 —ケ トァシル— C o Aチオラーゼ （ E C 2 . 3 . 1 . 1 6 ) を用いてァセ ト酢酸をァセチル— C o Aに転換 し、 次いでァリノレア ミ ンァセチラーゼ （ E C 2 . 3 . 1 . 5 ) の 作用によりァニリ ンをァセチル化し、 それに伴う 4 0 5 n mの吸光 度の減少から求める測定法も報告されている （ A c t a B i 0 c h i m. B i o p h y s . A c a d . S c i . H u n g . 7 , 1 4 3 ( 1 9 7 2 ) ) が、 工程が複雑であり、 また高感度測定でもない ことから、 普及するに至っていない。 発明が解決しよう とする課題
前述の如く D — 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸の酵素を用 いた測定について種々の方法が試みられているが、 これらはいずれ も高感度測定とは言えないばかりか、 臨床検査値として重要なケ ト ン体の総量についての直接の測定ができないものであった。
ケ トン体の正常値は、 血清または血しょ うでァセ ト酢酸は 4 1 土 1 . 4 (平均士 S E , μ £. / H ) . D — 3 —ヒ ドロキシ酪酸は 3 4 ± 2 . 1、 また総ケ ト ン体として 7 4 ± 2 . 4 と少量であり （ 日本臨床 4 7巻， 1 9 8 9年増刊号， P . 4 8 2 ) 、 高感度の測定 方法が望まれている。 課題を解决するための手段
本発明者らは、 上記の問題点につき鋭意検討した結果、 D — 3 — ヒ ドロキシ酪酸またはァセ ト酢酸の定量において N A Dのアナログ である還元型チォ N A Dと還元型 N A Dの極大吸収波長がそれぞれ 4 0 0 n m付近、 3 4 0 n m付近と異なっていることを利用し、 チ ォ N A D類およびチォ N A D P類からなる群より選ばれた 1つと N A D類および N A D P類からなる群より選ばれた 1つの捕酵素に作 用する D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロゲナーゼを用いることによ り、 吸光度の測定に際し、 他物質の吸収波長の混雑が回避できる酵 素的サイ ク リ ング反応が実施でき、 高感度な測定が可能であること を確認し、 本発明を完成するに至った。
本発明ば、 上記のような知見に基いて完成されたものであって、 D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からなる群より選ばれた 1つまたはそれ以上のケ トン体を舍有する被検液に、
①チォニコチンァ ミ ドアデニンジヌク レオチ ドホスフエー ト類 (以下、 チォ N A D P類という） およびチォニコチンア ミ ドアデニ ンジヌク レオチ ド類 （以下、 チォ N A D類という） からなる群より 選ばれた 1 つと、 ニコチンア ミ ドアデニンジヌク レオチ ドホスフエ ー ト類 （以下、 N A D P類という） およびニコチンアミ ドアデニン ジヌク レオチ ド類 （以下、 N A D類という） からなる群より選ばれ た 1つとを捕酵素とし、 少なく とも D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸を基質 としてァセ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酪 酸デヒ ドロゲナーゼ、
© A t 、
③ B t 、
を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式 A, D— 3 — ヒ ドロキ シ酪 Az
D— 3 — ヒ セ ト酢酸
口キシ酪酸
Figure imgf000007_0001
B z B ,
(式中、 はチォ N A D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または N A D類を示し、 A2 は の還元型生成物を示し、 B , は Ai が チォ NA D P類またはチォ N A D類のときは還元型 N A D P類また は還元型 N A D類を、 A, が N A D P類または N A D類のときは還 元型チォ NA D P類または還元型チォ N A D類を示し、 B 2 は の酸化型生 物を示す） で表されるサイ ク リ ング反応を形成せしめ 、 該反応によって変化する A2 または の量を決定することを特 徴とする D— 3 — ヒ ドロキシ酩酸およびァセ ト酢酸からなる群より 選ばれた 1 つまたはそれ以上のケ ト ン体の高感度定量法を提供する ものである。
また、 本発明は D— 3 — ヒ ドロキ シ酪酸およびァセ ト酢酸からな る群より選ばれた 1つまたはそれ以上のケ ト ン体を舍有する被検液 に、
①チォ N A D P類およびチォ N A D類からなる群より選ばれた 1 つと、 N A D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1 つと を補酵素とし、 少な く とも D— 3 — ヒ ドロキ シ酪酸を基質としてァ セ ト酩酸を生成する可逆反応をなす D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸デヒ ド 口ゲナーゼ、
② 、
③ B , または Zおよび B 2 、
④ D— 3 —ヒ ドロキシ酩酸に作用せず、 B z から B , への反応 を形成する第二のデヒ ドロゲナーゼおよび該第二のデヒ ドロゲナー ゼの基質、 を含有する試薬を作用せしめて、 次の反応式
A D— 3 —ヒ ドロキシ酪 A 2
D— 3—ヒ ァセ ト酢酸
πキシ酪酸
r
Figure imgf000008_0001
第二のデヒ ドロゲナーゼ
(式中、 はチォ NA D P類、 チォ NA D類、 NA D P類または NAD類を示し、 A2 は A, の還元型生成物を示し、 は At が チォ N A D P類またはチォ N A D類のときは還元型 N A D P類また は還元型 NAD類を、 が NA D P類または NA D類のときは還 元型チォ NA D P類または還元型チォ NA D類を示し、 B 2 は B , の酸化型生成物を示し、 B 2 から B , への反応は を捕酵素とし て第二のデヒ ドロゲナーゼにて を生成する酵素反応を示す） で 表されるサイ ク リ ング反応を形成せしめ、 該反応によつて変化する A2 の量を決定することを特徴とする D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およ びァセ 卜酢酸からなる群より選ばれた 1つまたばそれ以上のケ ト ン 体の高感度定量法を提供するものである。
更に本発明は D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からなる 群より選ばれた 1つまたはそれ以上のケ ト ン体を舍有する被検液に、
①チォ NA D P類およびチォ NA D類からなる群より選ばれた
1つと、 NAD P類および NAD類からなる群より選ばれた 1つと を捕酵素とし、 少なく とも D— 3 —ヒドロキシ酪酸を基質としてァ セ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ド ロゲナ一ゼ、
または Zおよび A2 、 ③ B , 、
⑤ D— 3 —ヒ ドロキシ酩酸に作用せず、 A 2 から A , への反応 を形成する第三のデヒ ドロゲナーゼおよび該第三のデヒ ドロゲナ一 ゼの基質、 を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式
第三のデヒ ドロゲナーゼ
z
A, D— 3 —ヒ ドロキシ酷 Az
D— ·3 — ヒ セ ト酢酸
口キシ酪酸
Figure imgf000009_0001
Β ζ Β
(式中、 はチォ N A D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または N A D類を示し、 A2 は A, の還元型生成物を示し、 B , は A1 が チォ NA D P類またはチォ N A D類のときは還元型 NA D P類また は還元型 N A D類を、 A, が N A D P類または N A D類のときは還 元型チォ N A D P類または還元型チォ N A D類を示し、 B 2 は の酸化型生成物を示し、 A2 から への反応は Az を補酵素とし て第三のデヒ ドロゲナーゼにて A , を生成する酵素反応を示す） で 表されるサイ ク リ ング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する B , の量を決定することを特徴とする D _ 3 —ヒ ドロキシ酪酸およ びァセ ト酢酸より選ばれた 1つまたはそれ以上のケ ト ン体の高感度 定量法を提供する ものである。
更にまた本発明は、 次の成分①〜③
①チォ N A D P類およびチォ N A D類からなる群より選ばれた 1つと、 N A D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1 つと を補酵素とし、 少なく とも D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸を基質としてァ セ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D— 3 — ヒ ドロキ シ酪酸デヒ ロ ゲナーゼ、
②八， 、
③ B z 、
(但し、 A, はチォ NA D P類、 チォ NA D類、 N A D P類または NA D類を示し、 B t は がチォ NA D P類またはチォ N A D類 のときは還元型 NA D P類またば還元型 NA D類を、 が NA D P類または NA D類のときは還元型チォ N A D P類または還元型チ ォ NA D類を示す） を舍有することを特徴とする D— 3 —ヒ ドロキ シ酴酸およびァセ ト酢酸からなる群より選ばれた 1つまたはそれ以 上のケ トン体の定量用組成物を提供するものである。
更に本発明.は、 次の成分①〜④
①チォ N A D P類およびチォ N A D類からなる群より選ばれた 1つと、 NA D P類および NAD類からなる群より選ばれた 1つと を捕酵素とし、 少なく とも D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸を基質としてァ セ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ド ロゲナーゼ、
② At 、
@B t または /および B z 、
④ D— 3—ヒ ドロキシ酪酸に作用せず、 B 2 から への反応 を形成する第二のデヒ ドロゲナーゼおよび該第二のデヒ ドロゲナー ゼの基質、
(但し、 ばチォ NA D P類、 チォ NA D類、 N A D P類または NA D類を示し、 B ! は At がチォ NA D P類またはチォ NA D類 のときは還元型 NA D P類または還元型 NA D類を、 At が NAD P類または NA D類のときは還元型チォ N A D P類または還元型チ ォ NA D類を示し、 B 2 は B , の酸化型生成物を示す） を舍有する ことを特徴とする D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からな る群より選ばれた 1 つまたはそれ以上のケ ト ン体の定量用組成物を 提供するものである。
さ らに本発明は、 次の成分①〜③および⑤
①チォ N A D P類およびチォ N A D類のいずれか 1 つと、 N A D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1 つとを補酵素とを 、 少な く とも D— 3 _ヒ ドロキシ酪酸を基質としてァセ ト酢酸を生 成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酩酸デヒ ドロゲナ一ゼ、
② A , またはノおよび A 2 、
③ B , 、
⑤ D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸に作用せず、 A 2 から A , への反応 を形成する第三のデヒ ドロゲナーゼおよび該第三のデヒ ドロゲナ一 ゼの基質、
(但し、 はチォ NA D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または N A D類を示し、 B , は A, がチォ N A D P類またはチォ N A D類 のときは還元型 N A D P類または還元型 N A D類を、 が N A D P類または N A D類のときは還元型チォ N A D P類または還元型チ ォ N A D類を示し、 Az は A, の還元型生成物を示す） を舍有する ことを特徴とする D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からな る群より選ばれた 1 つまたはそれ以上のケ ト ン体の定量用組成物を 提供するのである。
本発明において用いられる、 D— 3 —ヒ ドロキシ酩酸デヒ ドロゲ ナーゼとは少なく とも D— 3 —ヒ ドロキシ酴酸 + N A D ( P ) + —→ァセ ト酢酸 + N A D ( P ) H + H + なる反応を触媒するもので あって、 チォ N A D P類およびチォ N A D類からなる群より選ばれ た 1つと、 N A D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1 つ を補酵素とするものなら特に限定されない。
上記酵素の具体例としては、 P s e u d o m o n a s s p . 由 来の酵素 （東洋紡社製） 、 ロ ドシユー ドモナス スフヱロイデス （
R h o d o p s e u d o m o n a s s p h e r o i d e s j 由来 の酵素、 ロ ドス ピリ ルム スレブラム ( R h 0 d 0 s p i r i 1 1 u m r u b r u m) 由来の酵素、 シユー ドモナス レモィ ゲネィ （ P s e u d o m o n a s l e m o i g n e i ) 由来の酵素、 動物 (ラ ッ ト肝ミ トコ ン ドリア） 由来の酵素等があげられる （東洋紡社 酵素力タログ 3 5 0 . H B D ;酵素ハン ドブック第 1 1〜 1 2頁、 朝倉書店 1 9 8 2 ; B i o c li e m. J. , 1 0 2 , 4 2 3— 4 3 1 ( 1 9 6 7 ) ； J . B i o l . C ii e m. 2 3 7 , 6 0 3— 6 0 7 ( 1 9 6 2 ) ； M e t h o d s i n E n z y m o 1. 1 4 , 2 2 7 - 2 3 1 ( 1 9 6 9 ) 。 このう ち、 P s e u d o m o n a s s p . 由来の酵素ば特に好ましく、 NAD、 NAD P、 チォ NAD、 チォ NAD Pをいずれも補酵素とするものである。 本酵素の NAD Pに対する特異性ば NADに比して 4. 7 4 % (東洋紡社酵素カタ ログ、 3 5 0 · H B D ) であり、 チォ NADに対する特異性は N A Dに比して約 1 0 %程度、 チォ N A D Pに対する特異性は N A D P に比して約 1 0 %程度であった。 他の起源の酵素については主に N A D類とチォ NAD類を捕酵素とするものが多いが、 適宜の系によ り使用可能である。
又、 および B2 で示される捕酵素はチォ NAD P類、 チォ N AD類、 NAD P類、 NAD類を示すが、 チォ NAD P類またはチ ォ NAD類としては、 例えばチォニコチンア ミ ドアデニンジヌク レ ォチ ドホスフェー ト （チォ NAD P ) 、 チォニコ チンア ミ ドヒポキ サンチンジヌク レオチ ドホスフヱー ト、 およびチォニコチンア ミ ド アデニンジヌク レオチ ド （チォ NAD ) 、 チォニコチンア ミ ドヒポ キサンチンジヌクレオチ ドが挙げられ、 又、 NAD P類または NA D類としては、 例えばニコチンア ミ ドアデニンジヌク レオチ ドホス フェー ト （ N A D P ) 、 ァセチルビ リ ジ ンアデニ ンジヌ ク レオチォ ドホスフェー ト （ァセチル N A D P ) 、 ァセチルビ リ ジ ン ヒ ポキサ ンチ ンジヌ ク レオチ ドホス フユ一 ト、 ニコ チ ンア ミ ド ヒ ポキサ ンチ ンジヌ ク レオチ ドホス フ エ一ト （デァ ミ ノ N A D P ) ； 及びニコ チ ンア ミ ドアデニ ンジヌ ク レオチ ド （ N A D ) 、 ァセチルビ リ ジ ンァ デニ ンジヌ ク レオチ ド （ァセチル N A D ) 、 ァセチルビ リ ジ ン ヒ ポ キサ ンチ ンジヌ ク レオチ ド、 ニコ チ ンア ミ ド ヒポキサ ンチ ンジヌ ク レオチ ド （デァ ミ ノ N A D ) が挙げられる。
本発明の および において例えば がチォ N A D ( P ) 類である場合 B , は N A D ( P ) H類であることが必要であり、 B がチォ NA D ( P ) H類である場合 A, は N A D ( P ) 類であるこ とが必要であり、 および の関係において 1 つのチォ型補酵 素を使用するものである。
又、 定量に用いる D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ド口ゲナ一ゼがチ ォ NA D類と NA D類を補酵素とする場合は、 上述のチォ N A D類 と N A D類より、 また、 用いる D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロゲ ナ一ゼがチォ N A D ( P ) 類および N A D ( P ) 類を共に補酵素と する場合は、 上述のチォ N A D類及びチォ N A D P類と NA D類及 び N A D P類より適宜選択して用いればよい。
A , および の量は、 被検体中の D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸とァ セ ト酢酸の合計量に比較して過剰量であること、 かつ D— 3 — ヒ ド ロキシ酪酸デヒ ドロゲナーゼの A , および B , それぞれに対する K m値に比較して過剰量-であることが必要であり、 特に D— 3 —ヒ ド Ώキシ酩酸とァセ ト酢酸の合計量の 2 0〜 1 0 , 0 0 0倍モルが好 ましい。
本発明の D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸またはァセ ト酢酸定量用組成物 においては、 A , および B i の濃度は 0. 0 2〜 1 0 0 m M、 特に 0. 0 5〜 2 0 mMが好ましく、 D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロ ゲナ一ゼの量ば 5〜 ： L 0 0 0 u /m ί、 特に 2 0〜 4 0 0 u /m ί が好ましいが、 その量は被検体の種類等により適宜决定することが でき、 これ以上の量を用いるこ ·ともできる。
また、 本発明定量法は、 D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロゲナ一 ゼが （チォ） NA D類及び （チォ） N A D P類を共に補酵素とする 場合において、 2つの捕酵素にチォ NA D類と NA D類もしく は N A D P類との組み合わせ、 又はチォ NA D P類と N A D類もしく は NAD P類との組み合わせを選んだときには、 更に被検体に④成分 の D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸に作用せず、 B z → B i の反応を形成す る第二のデヒ ド口ゲナ一ゼ及び該第二のデヒ ドロゲナーゼの基質を 作用せしめることにより、 後記反応式 （ II ) のごと く、 と B 2 の間に の再生のための反応系を付与せしめることにより当該サ イクひ ング反応を形成せしめ得る。 この場合、 第二のデヒ ドロゲナ ーゼに関しては、 この測定系において実質的に At に作用し得ない 条件を設定することが好ましく、 例えば At を本質的に捕酵素とし て利用しない酵素を選択する組み合わせ、 At と B 2 の量的関係に より第二のデヒ口ゲナ一ゼが実質的に に作用しない条件を選択 する組み合わせ等が例示される。 定量の際には反応により生成した A2 の量を測定する。
A： D— 3 —ヒ ドロキシ酪 A2
D— 3—ヒ セ ト酢酸 （ Π ) ロキシ酪酸
Figure imgf000014_0001
のデヒ ドロゲナ一ゼ (式中、 A, はチォ N A D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または N A D類を示し、 Az は A , の還元型生成物を示し、 は が チォ N A D P類または N A D P類のときは還元型チォ N A D類また は還元型 N A D類を、 がチォ N A D類または N A D類のときは 還元型チォ N A D P類または還元型 N A D P類を示し、 B 2 は B , の酸化型生成物を示し、 B 2 → B , は B 2 を捕酵素として B , を生 成する酵素反応を示す）
すなわち、 第二のデヒ ドロゲナ一ゼは B〖 の再生のために補助的 に添加するものであり、 これによつて B , の使用量を少な く するこ とが可能となり、 特に B , が高価な場合は有効である。 又、 B , の 代わりに B 2 あるいは と B 2 の混合物を用いて反応を行っても よい。 この場合、 B , またはノ及び B 2 の使用量は特に限定される ものではないが、 一般的には A, の 1 1 0モル以下が好ま しい。 上記の成分④を用いる D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸 からなる群より選ばれた一つまたはそれ以上のケ ト ン体の定量用組 成物において、 A 1 の濃度は 0. 0 2〜 1 0 0 mM、 特に 0. 0 5 〜 2 0 mMが好ましく、 B 2 またはノ及び B , の濃度は 0. 0 5〜 5 0 0 0 M、 特に 5〜 5 0 0 〃 Mが好ま し く、 D— 3 — ヒ ド ロキ シ酪酸デヒ ドロゲナーゼの濃度は 5〜 1 0 0 0 u Zm £、 特に 2 0 〜 4 0 0 tiZm £が好ま し く、 第二のデヒ ドロゲナーゼは B z に対 する K m値 （ mM単位） の 2 0倍量 （ u /m £単位） 以上になるよ うに調製すればよ く、 例えば 1 〜 1 0 0 uノ m £が好ま し く、 また 第二のデヒ ドロゲナーゼの基質は過剰量、 例えば 0. 0 5〜 2 0 m Mが好ましい。 これらの量は被検体の種類等により適宜決定するこ とができ、 これ以上の量を用いることもできる。
第二のデヒ ドロゲナーゼ及びその基質としては、 例えば B z が N A D類またはチォ N A D類のときは、 アルコールデヒ ドロゲナーゼ (E C 1. 1. 1. 1 ) とエタノ ール、 グリ セロールデヒ ドロゲ ナーゼ （ E C 1. 1. 1. 6 ) ( E.. C 0 1 i由来） とグリセ口 —ル、 グリ セ口一ルー 3 —リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ （ E C 1. 1. 1. 8 ) (ゥサギ筋肉由来） と Lーグリセロール一 3 —リ ン酸、 リ ンゴ酸デヒ ドロゲナ一ゼ （ E C 1. 1. 1. 3 7 ) (ブタ心筋、 ゥシ心筋由来） と Lーリ ンゴ酸、 グリセロアルデヒ ドリ ン酸デヒ ド ロゲナーゼ （ E C 1. 1. 1. 1 2 ) (ゥサギ骨格筋、 肝、 酵母 、 B. C o 1 i由来） と D—グリ セ口アルデヒ ドリ ン酸とリ ン酸、 B 2 が NA D P類またはチォ NA D P類のときば、 グルコース一 6 一リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ （ E C 1. 1. 1. 4 9 ) (酵母由来） とグルコース一 6 —リ ン酸、 イ ソクェン酸デ匕 ドロゲナーゼ （ E C 1. 1. 1. 4 2 ) (酵母、 ブタ心筋由来） とイ ソクェン酸、 グリ ォキシル酸デヒ ドロゲナーゼ （ E C 1. 2. 1. 1 7 ) ( P s e u d o m o n a s o x a 1 a t i c .u s 由来) と C o Aとク リ オ キシル酸、 ホスホダルコ ン酸デヒ ドロゲナ—ゼ （ E C 1. 1. 1. 4 4 ) (ラ ッ ト肝、 ビール酵母、 E C o 1 i由来） と 6 —ホスホー D—ダルコ ン酸、 グリ セ口アルデヒ ドリ ン酸デヒ ドロゲナーゼ （ E C 1. 2. 1. 1 3 ) (植物葉緑体由来） と D—グリセロアルデ ヒ ドー 3—リ ン酸とリ ン酸、 ベンズアルデヒ ドデヒ ドロゲナーゼ （ E C 1. 2. 1. 7 ) ( P s e u d o m o n a s f 1 o r e s c e n s由来） とべンズアルデヒ ド等が挙げられる。
更にまた、 本発明定量法は D— 3—ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロゲナ ーゼが （チォ） NA D類及び （チォ） N A D P類を共に捕酵素とす る場合において、 2つの捕酵素にチォ NA D類と NA D類もしく は NAD P類との組み合わせ、 又はチォ NA D P類と NA D類もしく は NAD P類との組み合わせを選んだときには、 更に被検体に⑤成 分の D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸に作用せず、 A2 の反応を形成 する第三のデヒ ドロゲナーゼ及び該第三のデヒ ドロゲナーゼの基質 を作用せしめることにより、 後記反応式 〔 II〕 のごと く、 A！ と A の間に の再生の為の反応系を付与せしめることにより 当該サイ ク リ ング反応を形成し得る。 の場合、 第三のデヒ ドロゲナーゼに 関しては、 この測定系において実質的に B , に作用し得ない条件を 設定することが好ま しく、 例えば B , を本質的に補酵素と して利用 しない酵素を選択する組み合わせ、 B , と Az の量的関係により第 三のデヒ ドロゲナーゼが実質的に B , に作用しない条件を選択する 組み合わせ等が例示される。 定量の際には の消費量を測定する < 第三のデヒ ドロゲナーゼ
A, D— 3 —ヒ ドロキシ酪 A2
D— 3 — ヒ ド ト酢酸
ロキシ酢酸
Figure imgf000017_0001
B 2 B , 〔 ID〕
(式中、 はチォ N A D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または NA D類を示し、 A2 は At の還元型生成物を示し、 は が チォ NA D P類または NA D P類のときは還元型チォ N A D類また は還元型 NA D類を、 がチォ N A D類または N A D類のときは 還元型チォ N A D P類または還元型 N A D P類を示し、 B 2 は の酸化型生成物を示し、 A2 →A, は A2 を補酵素として を生 成する酵素反応を示す）
すなわち、 第三のデヒ ドロゲナ一ゼは A , の再生の為に補助的に 添加するものであり、 これによつて の使用量を少な く すること が可能となり、 特に が高価な場合には有効である。 又、 の 代わりに A2 あるいは と A2 の混合物を用いて反応を行っても よい。 この場合、 またはノ及び A2 の使用量は特に限定される ものでばないが、 一般的には B i の 1 Z 1 0モル以下が好ましい。
この成分⑤を用いる D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酔酸か らなる群より選ばれた一つまたはそれ以上のケ ト ン体の定量用組成 物において、 の濃度は 0. 0 2〜 1 0 0 1111^、 特に 0. 0 5〜
2 0 mMが好ましく、 Az またはノ及び の濃度は 0. 0 5〜 5
0 0 0 〃 M、 特に 5〜 5 0 0 Mが好ましく、 D— 3 —ヒ ドロキシ 酪酸デヒ ドロゲナ一ゼの濃度は 5〜 1 0 0 0 uノ m £、 特に 2 0〜
4 0 0 /m £が好ましく、 第三のデヒ ドロゲナーゼは Az に対す る Km値 （mM単位） の 2 0倍量 （ u /m A単位） 以上になるよう に調製すれ^よく、 例えば 1〜 1 0 0 u/m ίが好ましく、 また第 三のデヒ ドロ ゲナ一ゼの基質は過剰量、 例えば 0. 0 5〜 2 0 m Mが好ましい。 これらの量は被検体の種穎等により適宜決定するこ とができ、 これ以上の量を用いることもできる。
第三のデヒ ドロゲナーゼ及びその基質としてば、 例えば At が N A D類またはチォ N A D類のときは、 アルコールデヒ ドロゲナ一ゼ
( E C 1. 1. 1. 1 ) とァセ トアルデヒ ド、 グリ セロールデ匕 ド口ゲナ一ゼ （ E C 1. 1. 1. 6 ) (E. C o l i 由来） とジ ヒ ドロキシァセ ト ン、 グリ セロール一 3—リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ
( E C 1. 1. 1. 8 ) (ゥサギ筋肉由来） とジヒ ドロキシァセ ト ンリ ン酸、 リ ンゴ酸デヒ ドロゲーゼ （ E C 1. 1. 1. 3 7 )
(ブタ心筋由来、 ゥ シ心筋由来） とォキザ口酢酸、 グリ セロアルデ ヒ ドリ ン酸デヒ ドロゲナーゼ （ E C 1. 1. 1. 1 2·) (ゥサギ 骨格筋、 肝、 酵母、 E. C 0 1 i 由来） と 1 , 3 —ジホスホー D— グリセリ ン酸、 が NA D P類またはチォ NAD P類のときは、 グルコース一 6—リ ン酸デヒ ドロゲナ一ゼ （ E C 1. 1. 1. 4
9 ) (酵母由来） とダルコノ ラク ト ン一 6 —リ ン酸、 グリ セ口アル デヒ ドリ ン酸デヒ ドロゲナ一ゼ （ E C 1. 2. 1 . 1 3 ) (植物 葉緑体由来） と 1 , 3 —ジホスホー D グリ セ リ ン酸等が挙げられ る。
反応液組成については、 使用する D 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ド ロゲナーゼの各種補酵素間の相対活性等を考慮して 2種の補酵素を 適宜選択し、 その後正反応ノ逆反応の至適 P H条件を酵素サイ ク リ ング反応が効率よ く進行するように設定すればよい。 これら使用す る酵素は単独でも、 あるいは適宜 2種以上を組み合わせて用いても よい。 ·
かく して、 調製された本発明の D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸またはァ セ ト酢酸定量用組成物によつて被検体中の D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸 またはァセ ト酢酸を測定するには、 前記の成分①〜③、 ①〜④、 あ るいは①〜③及び⑤を舍有する組成物に被検液、 例えば血清、 血漿 、 尿等の 0. 0 0 1〜 1 111 £を加ぇ、 約 3 7 ての温度にて反応させ 、 反応開始一定時間後の 2点間の数分ないし数十分間、 例えば 3分 後と 4分後の 1分間、 または 3分後と 8分後の 5分間における生成 された A2 の量または消費された の量を、 それぞれの吸収波長 に基く吸光度の変化によって測定すればよい。 例えば A2 がチォ N A D H、 B , が N A D Hの場合、 A2 の生成を 4 0 0 n mの吸光度 の増加により測定するか、 あるいは の消費を 3 4 0 n mの吸光 度の減少により測定し、 既知濃度の D— 3 —ヒ ドロキシ酷酸または ァセ ト酢酸を用いて測定したときの値と比較すれば、 被検液中の D 一 3 —ヒ ドロキシ酪酸またはァセ ト酢酸量をリ アルタイ ムで求める こ とができる。
特に被検体が血清あるいは血漿の場合には D— 3 —ヒ ドロキシ酴 酸とァセ ト酢酸の合計値、 すなわち、 ひとつの操作で総ケ ト ン体が 測定できるわけで、 このような方法は従来知られていない。 これは 総ケ ト ン体の個々の成分、 D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢 酸が D— 3—ヒ ドロキシ酵酸デヒ ドロゲナーゼの基質であるという ことと、 これら 2成分を直接酵素サイ ク リ ング反応に導いていると いう本発明の特徴による。 更に、 総ケ トン体だけでなく個々の成分 の値を測定したい場合には、 被検体をあらかじめどちらかの成分の みに作用する酵素によって前処理したのち、 酵素サイ ク リ ング反応 に導けばよい。 例えば、 ァセ ト酢酸デカルボキシラーゼ （ E C 4 . 1 . 1 . 4 ) により前処理を行えばァセ ト酢酸ばアセ ト ンと炭酸ガ スに転換されるので、 引続き本発 明による酵素サイ ク リ ング反応 を実施することにより D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸のみを定量すること もできる。 また、 総ケ トン体の量から前記 D— 3 —ヒ ドロキシ酷酸 の量を差し引く ことにより、 ァセ ト酢酸のみの定量値を算出するこ ともできる。
また、 本発明の定量法は、 被検液中の D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸ま たはァセ ト酢酸そのものを酵素サィ ク リ ング反応に導く ものであり 、 被検液中の共存物質の影響を受けにく いため、 被検液のブランク 測定を省略することができ、 レイ トア ツセィによる簡便な測定を成 し得る。
尚、 本発明においては A 2 または の測定に当たり、 吸光度測 定の代わりに他の公知の測定法を使用して定量を行う こともできる。 図面の簡単な説明
第 1図は D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸量に対する 4 0 0 n mにおける 吸光度変化量を示す曲線、 第 2図はァセ ト酢酸溶液量に対する 4 0 0 n mにおける吸光度変化量を示す曲線、 第 3図はァセ ト酢酸に対 する 3 4 0 n mにおける吸光度差を示す曲線、 第 4図は D— 3 —ヒ ドロキシ酴酸に対する 3 4 0 n mにおける吸光度差を示す曲線であ る。
次いで、 本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、 本発明は れによって何ら限定されるものではない。
実施例 1
ぐ反応液 >
1 0 0 m M T r i s - H C £ ( p H 8. 5 )
0. 1 m M 還元型 N A D (オ リ エ ンタル酵母社製）
4 m M チォ N A D (シグマ社製）
4 5 u m £ D— 3 —ヒ ドロキ シ酩酸デヒ ドロゲナ一ゼ （ 東洋紡社製、 シユウ ドモナス エスピー由来） ぐ操作 >
上記試薬 1 m £をキュべッ トにとり、 予め 3 7 てにて加温した。 0、 1 0、 2 0、 3 0、 4 0、 5 0 Mの D— 3 — ヒ ドロキ シ酪酸 溶液をそれぞれ 2 0 £添加し、 3 7 'Cにて反応を開始させた。 反 応開始後 2分目と 5分百の 4 0 0 n mにおける吸光度を読み取りそ の差を求めた。 その結果は第 1図に示した。 第 1図から明らかなよ うに、 D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸量に対する吸光度変化量は良好な直 線を示した。 実施例 2
実施例 1 と同様の反応液を用い、 D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸溶液を ァセ ト酢酸溶液に代えて、 実施例 1 と同様の操作を行った。 その結 果は第 2図に示した。 第 2図から明らかなように、 実施例 1 と同様 、 良好な直線性を得た。 実施例 3
ぐ反応液 > 1 0 0 mM T r i s - H C £ ( P H 8. 5 )
0. 1 mM 還元型 NA D (オリ エンタル酵母社製）
5 mM チォ N A D (シグマ社製）
6 0 u / H D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロゲナーゼ
(東洋紡社製、 シユー ドモナス エスビー由来） 0. 2 % ト リ ト ン X— 1 0 0 (シグマ社製）
ぐ操作 >
上記反応液 1 in £をキュベッ トにとり、 あらかじめ 3 7てにて加 熱した。 次いで正常人血清 4種類につき、 各々反応液中に 2 0 £ を添加し、 3 7てにて反応を開始させた。 反応開始後の 2分目と 5 分目に 4 0 0. n mにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 別に 、 標準液として — 3 —ヒ ドロキシ酪酸溶液を、 また試薬 ブラ ンクとしてサンプルの代わりに蒸留水を加えたものそれぞれに ついて同様の測定を行った。 血清中の D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸とァ セ ト酢酸の合計量を標準液の値より換算して下記第 1表に示す結果 を得た。
第 1表 ケ ト ン体の総量 ( D一 3 —ヒ ドロキシ酪酸 +ァセ ト 酢酸） U 血清 1 7 8， 3
血清 2 4 8， 7
血清 3 5 3. 4
血清 4 6 2. 9 実施例 4
ぐ反応液 I >
1 0 m M リ ン酸緩衝液 （ P H 6. 0 )
0. 2 % ト リ ト ン X— 1 0 0 ( シグマ社製） 1 0 u /m £ ァセ ト酢酸デカルボキ シ ラーゼ （バチルスポ リ ミ クサ ( B a c i l l u s p o 1 y m y x a ) 和光純薬社製）
<反応液 Π >
2 0 0 m M T r i s - H C £ ( p H 9. 0 )
0. 2 m M 還元型 N A D (オ リ エ ンタル酵母社製） 1 0 m M チォ N A D ( シグマ社製）
1 2 0 u / m £ D— 3 — ヒ ドロキ シ酪酸デヒ ド ロゲナーゼ （ 東洋紡社製、 シュ ドモナス エス ピー由来）
<操作 >
上記反応液 I を 0. 4 5 m キュべッ 卜にとり、 あらかじめ 3 7 'Cにて加温した。 次いで実施例 3に用いた正常人血清 4種類それぞ れについて、 血清 2 0 を添加し、 3 7 °C 5分間反応させ、 内在 性の'ァセ ト酢酸を消去する。 その後、 0. 2 Nの塩酸を 0. 0 5 m £加えてァセ ト酢酸デカルボキシラ一ゼを失活させたのち、 反応液 IIを 0. 5 m £加え、 酵素サイ ク リ ング反応を 3 7てにて実施した, 反応液 Π添加後の 2分目と 5分目の 4 0 0 n mにおける吸光度を読 み取りその差を求めた。 別に、 標準液として 5 0 ^ M D— 3 — ヒ ド 口キシ酩酸溶液を、 また試薬ブランク としてサ ンプルの代わりに蒸 留水を加えたものそれぞれについて同様の測定を行い、 それぞれの 血清につき D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸濃度を算出した。 実施例 3の結 果と併せてァセ ト酢酸濃度についても計算し、 下記第 2表に示す結 果を得た。 第 2 ¾
Figure imgf000024_0001
実施例 5
ぐ反応液 >
4 0 mM N a 2 C 03 - N a H C 03 緩衝液 （ p H 1 0.
0 )
2 0 mM NA D P (オ リ エ ンタル酵母社製）
5 0 n M チォ NA D (シグマ社製）
0. 4 M エタノール
3 0 u Zni Aアルコールデヒ ドロゲナーゼ （オ リ エ ンタル酵母 社製）
3 5 0 n /m D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ ドロゲナーゼ （東洋 紡社製、 シユー ドモナス エスピー由来）
<操作 >
上記 l m £をキュベッ トにとり、 0、 2 0、 4 0、 6 0、 8 0、 1 0 0 Mのァセ ト酢酸溶液をそれぞれ 5 0 £添加し、 3 7 'Cに て反応を開始させた。 反応開始後 3分目と 8分目の 3 4 0 n mにお ける吸光度を読み取りその差を求めた。 濃度 0 の値を試薬ブランク とし、 2 0〜 1 0 0 〃 Mのそれぞれのァセ ト酢酸の値からこの値を 引き、 その結果を第 3図に示した。 実施例 6
ぐ反応液 >
5 0 m T r i s - H C £緩衝液 （ P H 8. 0 )
0 2 5 m M 還元型 N A D P (オ リ エ ンタル酵母社製）
5 0 jj M チォ N A D ( シグマ社製）
5 m M ジヒ ドロキ シアセ ト ン リ ン酸
1 0 u /m £ グリ セ 口一ルー 3 — リ ン酸デヒ ド ロゲナ一ゼ
(ベーリ ンガ一社製 ； ゥサギ筋肉由来）
3 5 0 u / m £ D— 3 — ヒ ドロ キ シ酪酸デヒ ロゲナ一ゼ （東 洋紡社製、 シユー ドモナス エス ピー由来） ぐ操作 >
上記試薬 l m £をキュベッ トにとり、 0、 5 0、 1 0 0、 1 5 0. 2 0 0、 2 5 0 Mの D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸溶液をそれぞれ 5 0 U ϋ添加し、 3 7 'Cにて反応を開始させた。 反応開始後 3分目と 8 分目の 3 4 0 n mにおける吸光度を読み取りその差を求めた。 実施 例 5 と同様試薬ブランク との差を求め、 その結果を第 4図に示した < 発明の効果
以上のように、 本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵素を用い るため測定誤差が生じず、 また、 酵素サイ ク リ ング反応を組み合わ せることによつて感度を増大させることができるため、 少量の検体 で迅速かつ正確に被検体中の D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸またはァセ ト 酢酸を定量することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からなる群より選 ばれた 1つまたはそれ以上のケ ト ン体を舍有する被検液に、
①チォニコチンァ ミ ドアデニンジヌク レオチ ドホスフエ一 ト類 (以下、 チォ NA D P類という） およびチォニコチンアミ ドアデニ ンジヌク レオチ ド類 （以下、 チォ NAD類という ） からなる群より 選ばれた 1つと、 ニコチンア ミ ドアデニンジヌク レオチ ドホスフエ ート類 （以下、 N A D P類という） およびニコチンア ミ ドアデニン ジヌク レオチド類 （以下、 N A D類という） からなる群より選ばれ た 1つとを裨酵素とし、 少なく とも D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸を基質 としてァセ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酪 酸デヒ ドロゲナ一ゼ、
©At 、
③ B , 、
を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式
A！ D— 3 —ヒ ドロキシ酪 A2
D— 3 —ヒ セ ト酢酸
ロキシ酪酸
Figure imgf000026_0001
Β 2 Β！
(式中、 At はチォ NAD P類、 チォ NAD穎、 NA D P類または NA D類を示し、 A2 は Α: の還元型生成物を示し、 B , は At が チォ N A D P類またはチォ NA D類 のときは還元型 N A D P類ま たは還元型 NA D類を、 が NA D P類または NA D類のときは 還元型チォ NAD P類または還元型チォ NAD類を示し、 B 2 ば の酸化型生成物を示す） で表されるサイ ク 1/ ング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する Az または B , の量を決定することを特徴 とする D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からなる群より選 ばれた 1つまたはそれ以上のケ ト ン体の高感度定量法。
2. D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からなる群より選 ばれた 1つまたはそれ以上のケ ト ン体を舍有する被験液に、
①チォ N A D P類およびチォ N A D類からなる群より選ばれた 1つと、 N A D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1 つと を捕酵素とし、 少な く とも D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸を基質としてァ セ ト酩酸を生成する可逆反応をなす D— 3 — ヒ ドロキシ酪酸デヒ ド ロゲナーゼ、 .
② 、
®Β , またはノおよび B z 、
④ D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸に作用せず、 B z から B , への反応 を形成する第二のデヒ ドロゲナ一ゼおよび該第二のデヒ ドロゲナー ゼの基質、 を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式
A , D— 3 —ヒ ドロキシ酪 Az
、酸デヒ ドロゲナーゼ
D— 3 — ヒ ド < 、 ァセ ト酢酸
口キシ酩酸
Figure imgf000027_0001
第二のデヒ ドロゲナーゼ
(式中、 はチォ N A D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または N A D類を示し、 A2 は の還元型生成物を示し、 は が チォ N A D P類またはチォ N A D類のときは還元型 N A D P類また は還元型 NA D類を、 、 が NA D P類または N A D類のときは還 靳た な用紙 元型チォ NAD P類またば還元型チォ NAD類を示し、 B 2 は B t の酸化型生成物を示し、 B z から への反応は B 2 を補酵素とし て第二のデヒ ドロゲナ一ゼにて B , を生成する酵素反応を示す） で 表されるサイ ク リ ング反応を形成せしめ、 該反応によつて変化する Az の量を決定することを特徴とする D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およ びァセ ト酔酸からなる群より選ばれた 1つまたはそれ以上のケ トン 体の高感度定量法。
3. D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からなる群より選 ばれた 1つまたばそれ以上のケ ト ン体を舍有する被験液に、
①チォ NA D P類およびチォ NA D類からなる群より選ばれた 1つと、 NA D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1つと を捕酵素とし、 少なく とも D— 3—ヒ ドロキシ酪酸を基質としてァ セ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酷酸デヒ ド 口ゲナ一ゼ、
®At または Zおよび A2 、
③ B t 、
⑤ D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸に作用せず、 A 2 から への反応 を形成する第三のデヒ ドロゲナーゼおよび該第三のデヒ ドロゲナー ゼの基質、 を舍有する試薬を作用せしめて、 次の反応式
第三のデヒ ドロゲナーゼ
A I D— 3 —ヒ ドロキシ酪 A2
D— 3 —ヒ セ 卜酢酸
αキシ酪酸
Figure imgf000028_0001
B z B (式中、 はチォ N A D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または N A D類を示し、 A2 は の還元型生成物を示し、 B , は A! が チォ NA D P類またはチォ N A D類のときは還元型 N A D P類また は還元型 N A D類を、 が Ν· A D P類または N A D類のときは還 元型チォ N A D P類または還元型チォ N A D類を示し、 B 2 は B ! の酸化型生成物を示し、 Az から への反応は A2 を補酵素とし て第三のデヒ ドロゲナーゼにて を生成する酵素反応を示す） で 表されるサイ ク リ ング反応を形成せしめ、 該反応によって変化する B , の量を決定することを特徴とする D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およ びァセ ト酢酸より選ばれた 1 つまたはそれ以上のケ ト ン体の高感度 定量法。
4. チォ N A D P類が、 チォニコチンア ミ ドアデニンジヌク レオ チ ドホスフェー ト （チォ N A D P ) またはチォニコチンア ミ ドヒポ キサンチンジヌク レオチ ドホスフヱ一トである請求の範囲 1 から 3 のいずれかの請求の範囲に記載の高感度定量法。
5. チォ NA D類がチォニコチンア ミ ドアデニンジヌク レオチ ド (チォ NA D ) またはチォニコチンア ミ ドヒポキサンチンジヌ ク レ ォチドである請求の範囲 1 から 3のいずれかの請求の範囲に記載の 高感度定量法。
6. N A D P類が、 ニコチンア ミ ドアデニンジヌク レオチ ドホス フェー ト （ NA D P ) 、 ァセチルビリ ジンアデニンジヌク レオチ ド ホスフェー ト （ァセチル N A D P ) 、 ァセチルビリ ジンアデニンヒ ポキサンチンジヌク レオチ ドホスフエ一 トおよびニコチンア ミ ドヒ ポキサンチンジヌク レオチ ドホスフェー ト （デァ ミノ N A D P ) か らなる群より選ばれた捕酵素である請求の範囲 1から 3 のいずれか の請求の範囲に記載の高感度定量法。
7. N A D類が、 ニコ チンアミ ドアデニンジヌ ク レオチ ド （ N A D ) 、 ァセチルビリ ジ ンアデニンジヌク レオチ ド （ァセチル N A D ) 、 ァセチルビリ ジンアデニンヒポキサンチンジヌク レオチ ドおよび ニコ チンア ミ ドヒポキサンチ ンジヌク レオチ ド （デァ ミ ノ NAD ) からなる群より選ばれた捕酵素である請求の範囲 1から 3のいずれ かの請求の範囲に記載の高感度定量法。
8. 次の成.分①〜③
①チォ NA D P類およびチォ NA D類からなる群より選ばれた 1つと、 NA D P類および NAD類からなる群より選ばれた 1つと を捕酵素とし、 少なく とも D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸を基質としてァ セ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸デヒ口 ゲナ一ゼ、
、
③ B , 、
(但し、 A, はチォ NA D P類、 チォ NAD類、 N A D P類または NAD類を示し、 は At がチォ NAD P類またはチォ NAD類 のときは還元型 NA D P類または還元型 NAD類を、 が NA D P類または NA D類のときは還元型チォ NA D P類または還元型チ ォ NA D類を示す） を舍有することを特徴とする D— 3 — ヒ ドロキ シ酪酸およびァセ ト酢酸からなる群より選ばれた 1つまたはそれ以 上のケ トン体の定量用組成物。
9. 次の成分①〜④
①チォ N A D P類およびチォ N A D類からなる群より選ばれた 1 つと、 N A D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1 つと を補酵素とし、 少な く とも D— 3 —ヒ ドロキシ酩酸を基質としてァ セ ト酢酸を生成する可逆反応をなす D _ 3 —ヒ ドロキシ酩酸デヒ ド 口ゲナ一ゼ、
② A卜、
③ B , またはノおよび B 2 、
④ D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸に作用せず、 B z から B！ への反応 を形成する第二のデヒ ドロゲナーゼおよび該第二のデヒ ドロゲナ一 ゼの基質、 .
(但し、 Α はチォ N A D P類、 チォ N A D類、 N A D P類または NA D類を示し、 B , は , がチォ N A D P類またはチォ N A D類 のときは還元型 N A D P類または還元型 N A D類を、 が N A D P類または NA D類のときは還元型チォ N A D P類または還元型チ ォ N A D類を示し、 B 2 は B , の酸化型生成物を示す） を含有する ことを特徴とする D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸およびァセ ト酢酸からな る群より選ばれた 1つまたはそれ以上のケ ト ン体の定量用組成物。
1 0. 次の成分①〜③および⑤
①チォ N A D P類およびチォ N A D類のいずれか 1 つと、 N A D P類および N A D類からなる群より選ばれた 1 つとを補酵素とし 、 少な く とも D— 3 —ヒ ドロキシ酪酸を基質としてァセ ト酢酸を生 成する可逆反応をなす D— 3 —ヒ ドロキシ酴酸デヒ ドロゲナーゼ、
② A , または および A z 、
③ B 、
⑤： D— 3 —ヒ ドロキシ酩酸に作用せず、 A 2 から A , への反応 O 93/12254
3 0
を形成する第三のデヒ ドロゲナ—ゼおよび該第三のデヒ ドロゲナ— ゼの基質、
(但し、 A はチォ NAD P類、 チォ NAD類、 NAD P類または NAD類を示し、 B t ば がチォ NAD P類またはチォ NAD類 のときば還元型 NAD P類または還元型 NAD類を、 Ai が NAD P趙または NAD類のときは還元型チォ N A D P類または還元型チ ォ NAD類を示し、 は A1 の還元型生成物を示す） を舍有する ことを特徴とする D— 3—ヒ ドロキシ酩酸およびァセ ト酢酸からな る群よ 選ばれた 1つまたばそれ以上のケ トン体の定量用組成物。
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