TWI842272B - 檢測方法及檢測系統 - Google Patents
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Abstract
一種檢測方法及檢測系統，用於檢測附著於複數報導分子表面之一目標物，其中該複數報導分子於一微流道晶片中流動且被一光源照射，該檢測方法包括下列步驟：個別取得每一該複數報導分子之複數局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像，其中每一個該局域表面電漿共振光譜影像具有一長波長區段亮度(BA)以及一短波長區段亮度(BB)；計算每一個該報導分子之一光譜影像亮度對比因子γ，其中
；以及，定義目標物之一陽性檢出截止值為|γ|
Description
本發明關於一種檢測方法以及檢測系統，特別關於一種藉由比較從局域表面電漿共振(local surface plasmon resonance，以下稱為LSPR)免疫分析法取得之局域表面電漿共振光譜影像之亮度來檢測目標物的檢測方法以及檢測系統。
局域表面電漿共振(LSPR)是一種由電磁照射所觸發之特定表面電漿共振。於電漿奈米粒子(如金或銀的奈米粒子)表面產生自由電子的同步振盪。如圖1所示，P1表示目標物93(如：抗體)並未附著於位在報導分子91(如金或銀奈米粒子)表面之鑲嵌蛋白92(anchor protein)上，P2表示目標物93附著位在報導分子91(如金或銀奈米粒子)表面之鑲嵌蛋白92上。如圖1所示，報導分子91的LSPR光譜影像呈現一位於可見光波段的共振峰值(resonance peak)，並呈現可識別的光散射與吸收現象。此外，峰值共振波長與電漿奈米粒子的折射係數(refractive index)有關。此現象表示，當目標物93(抗體)附著於電漿報導分子91表面時，LSPR峰值會發生偏移(通常是紅移)。藉此，LSPR可做為一免標記尺度來量化目標物93。
藉由前述LSPR光譜的獨特特性，電漿奈米粒子係廣泛用於生物分子偵測，如：偵測抗原及抗體。眾所周知，LSPR免疫分析法可用於檢測多種疾病。
不同的LSPR免疫分析法主要基於兩種常規方法：紫外-可見光吸收光譜檢測(UV-visible absorption spectrum，以下稱為UV-Vis檢測)，以及比色檢測(colorimetric detection)，其係包括肉眼可見檢測與側流分析法(lateral flow assays，以下稱為LFAs)。UV-Vis檢測用吸收光譜來評估目標物，如：根據單分散奈米粒子的LSPR峰值偏移，來評估生物分子結合狀況。然而，因UV-Vis檢測產生的峰值偏移十分微小，其偵測極限(limit of detection，以下稱為LOD)主要受限於LSPR免疫分析法所用之LSPR感測器的低靈敏值(figure of merit，以下稱為FoM)。
此外，肉眼可見檢測以及側流分析法檢測目標物的方法係基於處於液相或試紙上奈米分子聚集產生的劇烈顏色變化來檢測目標物。雖然，肉眼可見檢測及側流分析法簡單、便於使用者操作、且成本低，但此方法需有高濃度的目標物附著於報導分子來呈現顯著的顏色變化。考量到目標物93附著於每一報導分子91的數量，若沒有其他訊號或放大目標物，UV-Vis檢測會導致很差的LOD(ng to μg mL-1)。不僅改善當前LSPR免疫分析法的靈敏度具挑戰性，突破當前LOD邊界也是當前LSPR免疫分析法偵測的主要挑戰。因此，有必要提供一種檢測方法與檢測系統來改善LSPR免疫分析法的靈敏度並提升其LOD。
基於前述問題，本發明提供一種藉由比較從局域表面電漿共振免疫分析法取得之局域表面電漿共振光譜影像之亮度來檢測目標物的檢測方法及檢測系統，藉此提高目標物的檢測靈敏度以及目標物之偵測極限。
為達成上述目的，本發明提供之檢測方法，用於檢測附著於複數報導分子表面之一目標物，其中該複數報導分子於一微流道晶片中流動且被一光源照射，檢測方法包括下列步驟：個別取得每一該複數報導分子之複數局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像，其中每一個該局域表面電漿共振光譜影像皆具有一長波長區段亮度(BA)以及一短波長區段亮度(BB)；計算每一個報導分子之一光譜影像亮度對比因子γ，其中
；以及，定義該目標物之一陽性檢出截止值為|γ|
0.1。
根據本發明之一實施例，當目標物之一分子量大於10kDa，陽性檢出截止值為γ 
0.1。
根據本發明之一實施例，當目標物之該分子量小於500Da，陽性檢出截止值為-γ 
0.1。
根據本發明之一實施例，其中長波長區段及短波長區段由所報導分子之LSPR光譜影像未產生紅移之一峰值區分。
根據本發明之一實施例，其中報導分子之LSPR光譜影像未產生紅移之峰值為X nm，長波長區段定義為(X+10)±10nm；短波長區段定義為(X-10)±10nm。
根據本發明之一實施例，於定義陽性檢出截止值前，檢測方法更包括：定義一關係圖，其中該關係圖呈現每一個光譜影像亮度對比因子
γ與各光譜影像亮度對比因子γ所對應之報導分子之一計數量(counting number)之關係。
根據本發明之一實施例，其中目標物透過複數免疫製劑附著於該複數報導分子之表面，其中複數免疫製劑的濃度為20%。
根據本發明之一實施例，其中光源為一暗場照明系統(dark-field illurmination system)。
為達成上述目的，本發明另提供一種檢測系統，用於檢測附著於複數報導分子表面之一目標物，其中複數報導分子於一微流道晶片中流動且被一光源照射，檢測系統包括一影像擷取裝置及一處理器。影像擷取裝置用於取得個別取得每一複數報導分子之複數局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像，其中每一個局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像具有一長波長區段亮度(BA)以及一短波長區段亮度(BB)。處理器用於計算每一個報導分子之一光譜影像亮度對比因子γ，其中
，並定義該目標物之一陽性檢出截止值為|γ|
0.1。
根據本發明之一實施例，其中影像擷取裝置為設置於一手持裝置內的相機。
綜上所述，本發明之測方法及檢測系統的主要概念為基於比較於兩選定波長區域內個別金奈米粒子(Au nanoparticles；以下或稱為AuNPs)散射影像的亮度以放大兩選定波長區域間的訊號差異，藉此提高檢測靈敏度與目標物的檢測極限。
91:報導分子
93:目標物
92:鑲嵌蛋白
A、101、101a、101b:長波長區段
B、102、102a、102b:短波長區段
120:微流道晶片
γ:光譜影像亮度對比因子
110:光源
130:物鏡
140:狹縫
150、150a:二向分光鏡
160、160a、171:反射鏡
170、170a:濾光片
10、10a:影像擷取裝置
126:載玻片
124,、124a:壓克力管路接口
123:蓋玻片
121:流入管
125、125a:雙面膠帶
122:流出管
BA:長波長區段亮度
BB:短波長區段亮度
圖1為傳統LSPR免疫分析法取得之散射光譜影像之示意圖。
圖2A為已被鑲嵌蛋白(anchor protein)修飾之報導分子與目標物(抗體)結合前/結合後之示意圖。
圖2B為對應圖2A之報導分子之散射光譜示意圖。
圖2C為對應圖2A之報導分子之散射影像。
圖2D為根據圖2C之散射亮度，不同報導分子之散射影像亮度比較圖。
圖2E為用於本發明之微流道晶片之一實施例與光源照明之一實施例之示意圖。
圖2F及圖2G為追蹤報導分子流經通道1(短波長區段B)及通道2(長波長區段A)之影像。
圖2H為本發明之檢測方法之一實施例之步驟流程圖。
圖2I為本發明之檢測系統之一實施例之硬體架構圖。
圖3A為本發明取得之未修飾之報導分子(金奈米粒子AuNPs，灰點標示)與牛血清蛋白(BSA)100%修飾之報導分子(BSA100%@AuNPs)與抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合前(灰色菱形標示)以及結合後(黑色十字標示)之亮度散點圖。
圖3B為由圖3A萃取出報導分子(AuNP)計數量與光譜影像亮度對比因子
的關係圖。
圖4A為報導分子(AuNP)計數量與100%牛血清蛋白(BSA)修飾之報導分子(BSA100%@AuNPs)與不同濃度之抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合之光譜影像亮度對比因子
的關係圖。
圖4B為報導分子(AuNP)計數量與20%牛血清蛋白(BSA)修飾之報導分子(BSA20%@AuNPs)與不同濃度之抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合之光譜影像亮度對比因子
的關係圖。
圖4C為報導分子(AuNP)計數量與10%牛血清蛋白(BSA)修飾之報導分子(BSA10%@AuNPs)與不同濃度之抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合之光譜影像亮度對比因子
的關係圖。
圖4D為△N/N0訊號對應多種濃度之抗牛血清蛋白(anti-BSA)分別與牛血清蛋白(BSA)100%修飾之報導分子(BSA100%@AuNPs)、牛血清蛋白(BSA)20%修飾之報導分子(BSA20%@AuNPs)、及牛血清蛋白(BSA)10%修飾之報導分子(BSA10%@AuNPs)結合之對比圖。
圖5A為報導分子(AuNP)計數量與棘蛋白(spike protein)20%修飾之報導分子(SP20%@AuNPs)與不同濃度之單株抗體(mAbSP)結合之光譜影像亮度對比因子γ的關係圖。
圖5B為報導分子(AuNP)計數量與棘蛋白(spike protein)20%修飾之報導分子(SP20%@AuNPs)在緩衝液(TE buffer)中與不同濃度之抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合的關係圖。
圖5C為藉由本發明取得對應單株抗體(mAbSP)及抗牛血清蛋白(anti-BSA)的讀取訊號△N/N0，虛線為讀取訊號的檢測極限(LOD)。
圖5D為報導分子(AuNP)計數量與棘蛋白(spike protein)20%修飾之報導分子(SP20%@AuNPs)與人工唾液(不含任何添加劑蛋白)中不同濃度的單株抗體(mAbSP)以及含有人類血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)及免疫球蛋白M(IgM)之唾液緩衝液結合之光譜影像亮度對比因子γ的關係圖。
圖5E顯示對應不同濃度單株抗體之△N/N0的統計數據。
圖6A為小分子目標物及大分子目標物分別與報導分子(金奈米粒子)結合之示意圖，其中ds為目標物之結合分子層的厚度，dNP為報導分子(金奈米粒子)的直徑。
圖6B為直徑50nm(dNP)的報導分子(AuNP)與不同ds的歸一化散射截面分布圖。圖中顯示了結合分子層的厚度(ds)。
圖6C顯示在峰值波長和以540nm為中心的光譜圖像亮度對比度γ下，不同直徑的報告器(dNP)的響應比較。
圖6D顯示報導分子(AuNP)10%的直徑變化係數，其直徑變化在±5nm之間。
圖7A顯示陽性檢出截止值位於信心區間(confidence interval；CI)95%的下限(lower limit；LL)處，且陽性檢出截止值隨著農藥濃度增加而逐漸降低的關係圖。
圖7B為95%下限的降低率並使用被氣味結合蛋白-2(odorant-binding-protein-2)修飾之報導分子(金奈米粒子)與多種濃度之農藥的關係圖。本發明對於新尼古丁類農藥(neonicotinoids)具有顯著的靈敏度，且對於其他農藥類別，如毆殺松(acephate)和普芬尼(fipronil)，具有明顯的選擇性。
圖8A為本發明檢測綠茶的盲測結果。
圖8B為綠茶盲測結果的標準方法-ESI-質譜分析結果。
圖8C為本發明檢測紅茶的盲測結果。
圖8D為紅茶盲測結果的標準方法-ESI-質譜分析結果。
為能更瞭解本發明之技術內容，特舉較佳具體實施例說明如下。
請參考圖2A至圖2E。如圖2A及圖2B所示，本發明之檢測方法及檢測系統用於檢測附著於複數報導分子91表面之目標物93，具體來說，本發明之檢測方法及檢測系統用於偵測附著於報導分子91表面之鑲嵌蛋白92的目標物93。根據本發明之一實施例，目標物93可以是抗體、抗原、棘蛋白、農藥、毆殺松、或普芬尼。報導分子91可以是金奈米粒子(AuNP)或銀奈米粒子。
在此需注意的是，如圖2A以及圖2B所示，檢測附著於報導分子91表面之鑲嵌蛋白92的目標物93，主要基於LPSR峰值在光譜中的偏移，而該偏移是由附著於報導分子91表面之目標物93及其伴隨而來之表面折射率增加所引起。然而，LSPR的低靈敏值(figure of merit，FoM)會導致檢測中的波長靈敏度變得非常低。當以LSPR峰值為散射光譜的中心，並選擇相鄰峰值中心的兩波段(長波長區段A及短波長區段B)時，如圖2B所示，隨著LSPR峰值的偏移，長波長區段A及短波長區段B中的區域102、102a、102b以及101、101a、101b也發生變化。由圖2B可看出，長波長區段A(101、101a、101b)增加，而短波長區段B(102、102a、102b)減少。圖2B清楚顯示，長波長區段A與短波長區段B之間的區域變化比LSPR峰值偏移來的明顯許多。此特性表明，使用光譜面積變化在某程度能放大LSPR峰值偏移的讀取結果。在此需注意的是，根據本發明之一實施例，假設報導分子的LSPR光譜影像的峰值在偏移前為X nm，長波長區段A定義為(X+10)±10，短波長區段B定義為(X-10)±10。
如圖2C以及圖2D所示，當光譜為散射影像時，散射光亮度代表了光譜的面積。圖2C及圖2D亦顯示了附著於報導分子91(金奈米粒子)之目標物93於散射影像中的亮度變化及其相應的光譜變化。剛開始時(NP1)，金奈米粒子(報導分子91)的散射LSPR峰值接近兩波長區段的邊界。此時，兩波長區段的散射光譜面積大致相同。當呈現兩選定波長區段(長波長區段A以及短波長區段B)之過濾的散射影像時，該兩區段呈現的亮度相近，長波長區段A的亮度以下標註為長波長區亮度(BA)、短波長區段B的亮度以下標註為短波長區段亮度(BB)。隨目標物93的結合(NP2以及NP3)，LSPR峰值紅移，此時長波長區段A呈現比短波長區段B更亮的散射光，而造成長波長區段A的亮度明顯大於短波長區段B，並且亮度與目標物93的結合數量有關。基於散射影像的亮度變化，可推導出光譜影像亮度對比因子γ，
。
BA(NP(i))及BB(NP(i))為報導分子91(AuNP)在長波長區段A以及短波長區段B個別的散射亮度。γ為光譜影像亮度對比因子、NP(i)之i為報導分子91的計數量(counting number)。當LSPR峰值紅移，長波長區段亮度(BA)增加，短波長區段亮度(BB)降低。因此兩波長區段的亮度對比因子
的變化會比LSPR峰值偏移的變化明顯許多。BA-BB的差異表示與LSPR峰值偏移相關的類似光譜對比度，這樣可以放大亮度變化。歸一化為(BA+BB)消除來自散射光的強度擾動。由此可看出，如圖2D所示，開始時(NP1)，γ值接近於零，並隨著與目標物(NP2以及NP3)的結合γ值增加。總的來說，光譜影像亮度對比因子γ加重並放大了LSPR
偏移的讀取數據，且為應用金奈米粒子做為報導分子91之LSPR免疫分析法提供了快速的光譜評估。
本發明用之光譜亮度對比方法容易與影像感測元件(CCD)結合，以便快速評估個別金奈米粒子的LSPR偏移，從而提供出色的峰值波長線性度、高波長解析度、快速響應時間及簡單的光學系統。前述能力還便於檢測流動於如圖2E所示之微流道晶片120的報導分子91(金奈米粒子；AuNPs)。此方式具有短時間內簡單地採樣和收集數千筆數據的潛力，並需要快速的數據分析。
再者，如圖1所示，傳統LSPR免疫分析法的訊號為一組金奈米粒子的平均輸出訊號。因此，某些檢測到的陽性訊號(positive signals)會被此平均輸出訊號掩蓋，且該些陽性訊號難以超過可被檢出訊號的最小閾值。本發明之檢測方法和檢測系統利用二元決策的優點來提供更高的訊噪比(S/N)和更低的LOD。然而，對於數位檢測來說，需要檢查大量數據以過濾出低比例的少量陽性訊號。本發明之檢測方法和檢測系統檢測金奈米粒子係利用光譜圖像亮度對比γ和微流控通道實現檢查大量數據以過濾出低比例的少量陽性訊號。
為驗證本發明之檢測方法和檢測系統的檢測能力，在此用本發明之檢測方法和檢測系統做抗體檢測的LOD與其他兩種現有之LSPR免疫檢測方法(UV-Vis檢測和肉眼可見檢測)的LOD進行比較。在LSPR免疫檢測、本發明之檢測方法和檢測系統結合微流道系統，本發明檢測抗牛血清蛋白(anti-BSA)的LOD為1pg mL-1，此結果比UV-Vis檢測和肉眼可見檢測低了4至7個數量級。本發明亦於人工唾液中添加多種人類蛋白
和抗體，以驗證針對SARSCoV-2棘蛋白的抗體在複雜樣本中的敏感度和特異性。結果檢視該LOD為10pg mL-1且具有寬廣的6個數量級的動態範圍。從0pg mL-1的數據明顯證明本發明在複雜樣品中優秀的靈敏度。儘管LOD在複雜樣品中升高，但本發明仍然具有與酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)相同的LOD等級(10pg mL-1)，同時本發明不需標記、易於操作、且具有更快的檢測時間(<15分鐘)。
如圖2E所示，本發明之檢測方法以及檢測系統用於偵測由LSPR免疫檢測方法100取得之LSPR光譜影像，其中LSPR免疫檢測方法100包括光源110、微流道晶片120、物鏡130、狹縫140、短通二向分光鏡(short-pass dichroic mirror)150、150a、反射鏡160、160a、171、濾光片170、170a、及影像擷取裝置10。在本實施例中，光源110是暗場照明系統(dark-field illumination system)，且影像擷取裝置10是科學互補式金屬氧化物半導體攝影機(scientific complementary metal-oxide-semiconductor；sCMOS)。短通二向分光鏡150、150a是530nm短通二向分光鏡，用以將光源110的光束分別傳送至如圖2F及圖2G所示之通道1(短波長區段B)以及通道2(長波長區段A)。光束經530nm短通二向分光鏡150、反射鏡160、濾光片170、反射鏡171至影像擷取裝置10的傳遞路徑表示為圖2B的短波長區段B(102、102a、102b)。光束經530nm短通二向分光鏡150a、反射鏡160a、濾光片170a至影像擷取裝置10的傳遞路徑表為圖2B長波長區段A(101、101a、101b)。
如圖2E所示，首先，微流道晶片120將流動的報導分子91(金奈米粒子)引入由光源110(dark-field illumination system)照明的LSPR免疫檢測方法100中。微流道晶片120包括載玻片126、蓋玻片123、兩壓克力管路接口(acrylic junction)124、124a、3M雙面膠帶125、125a、流入管121及流出管122。首先以氣相沉積對載玻片126、蓋玻片123、壓克力管路接口124、124a、以及3M雙面膠帶125、125a進行表面疏水改性處理，以防止報導分子91(金奈米粒子)的非特異性結合。簡單來說，先將載玻片126、蓋玻片123，壓克力管路接口124、124a、及雙面膠帶125、125a與1毫升(mL)的三氯(1H，1H，2H，2H-perfuorooctyl)矽烷(PTOCTS)一起放入腔室中，然後將腔室真空密封並保持在約0.5個大氣壓下30分鐘。然後將載玻片126、蓋玻片123、壓克力管路接口124、124a和3M雙面膠帶125、125a於120℃烘烤1小時，以促進PTOCTS與玻璃之間的共價結合。隨後將載玻片126、蓋玻片123、壓克力管路接口124、124a及雙面膠帶125、125a密封並組成微流道，並使用兩層厚度為60μm的3M雙面膠帶(如圖2E所示)來定義微流道的結構。
請參考圖2E至圖2H。如圖2E及圖2H所示，本發明之檢測方法包括步驟S1至步驟S3。
步驟S1：個別取得每一複數報導分子之複數局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像，其中每一個局域表面電漿共振光譜影像具有一長波長區段(BA)亮度以及一短波長區段(BB)亮度。
如圖2E所示，LSPR免疫檢測方法100中之微流道晶片120被光源110照射，可快速紀錄流動於微流道晶片120中每一個報導分子
91(金奈米粒子)的LSPR訊息。本實施例之光源110以奧林巴斯直立式顯微鏡(Olympus upright microscope)為基礎。本實施例使用60×(NA=0.7)的空氣式物鏡及一帶有20瓦鹵素燈光源的暗場聚光器(Cyto Viva)。在下面實驗中，報導分子91(金奈米粒子)被引入上述之微流道晶片120，且由暗場照明激發報導分子91(金奈米粒子)的光散射。散射光通過530-nm短通二向分光鏡(short-pass dichroic mirror)，其中截止處(cutoff)位於未修飾之報導分子91(AuNPs)的LSPR散射的峰值處，並分成兩個有色帶的通道，如圖2F以及圖2G所示，兩個有色帶的通道分別為綠色通道分和黃色通道分。每一通道中的光隨後通過兩個帶通濾光片(bandpass filter)，藉此進一步提取出金奈米粒子之LSPR的重要波段。本發明使用的兩個濾光片為不重疊、而波長區段相鄰的濾光片，本發明所用之傳遞的波長區段為540±10nm(濾光片A；濾光片170a)以及520±10nm(濾光片B；濾光片170)。利用二向分光鏡及兩個波長區段的濾光片將報導分子91(金奈米粒子)的LSPR光譜轉換為強度訊息。該些訊息可快速地被影像擷取裝置10(如sCMOS)紀錄為影像。圖2F及圖2G顯示未修飾之金奈米粒子在分開平行的通道2(長波長區段A)及通道1(短波長區段B)的實際散射影像，影像中的亮點表示單個金奈米粒子。為收集數據，如圖2F及圖2G所示，金奈米粒子先在通道2(長波長區段A)被追蹤，並在通道1(短波長區段B、綠色圓圈)中共定位。同時一併紀錄金奈米粒子於平行通道中的強度(intensity)，用於以下分析。
步驟S2：計算每一個報導分子之一光譜影像亮度對比因子γ，其中
。
根據本發明之一實施例，圖3A顯示，未修飾之金奈米粒子及牛血清蛋白(BSA)100%修飾之報導分子(牛血清蛋白(BSA100%@AuNPs)與抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合前(灰色菱形標示)以及結合後(黑色十字標示)之亮度散點圖。每一數據集包含15000個數據。檢測時間小於15分鐘，且BA與BB間為線性分布。在此有3個組成因素：BA、BB及數據點在圖中的位置。雖然，經牛血清蛋白(BSA)修飾且與抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合後，數據點在圖中的位置略為傾向於較弱的BB值及更強的BA值，但從這些座標評估數據集仍然過於複雜。但是，通過將該些原始數據應用於光譜圖像亮度對比因子
，可將數據集(dataset)轉換為線性不相關的變數，即如圖3B所示之計數量(N)及
。利用定義新的直角坐標系統，金奈米粒子的LSPR偏移在數位數據集中取得最佳化的描述。選定的兩波長區段間的亮度差(BA-BB)表示與LSPR峰值偏移相關的類似光譜對比度。歸一化(BA+BB)可有效消除光散射引起的強度波動。這些計數顯示了顯著的LSPR偏移統計分佈，並幫助我們更直接地研究數據集趨勢的變化。
步驟S3：定義目標物之陽性檢出截止值為|γ|
0.1。
圖3B顯示γ值與金奈米粒子(AuNP)計數量的關係，兩者之間呈高斯分布。研究發現，隨生物分子表面附著物(未修飾、牛血清蛋白修飾、及抗-牛血清蛋白結合)的增加，多數的數據點(data point)的γ值增加，此分佈朝更高的γ值移動。此結果與LSPR免疫測定的原理一致，即如圖2B所示，蛋白質結合誘導共振光譜中LSPR的紅移。然，傳統LSPR分析和本發明所用之數位LSPR分析之間仍然存在細微差異。在傳統的LSPR分析中，讀取的是LSPR峰值的平均偏移。對於本發明之檢測方法
及檢測系統而言，讀取的是陽性檢測的頻率，這意味著更多的生物分子結合誘導更多的金奈米粒子(AuNPs)越過陽性檢出截止值(LSPR閾值)。因此，陽性檢出截止值(LSPR閾值集)在本發明所用之數位分析中起著至關重要的作用。在本實施例中在BSA100%的95%信賴區間(CI)上限處設置截止值(cutoff)@AuNPs做為二元閾值來定義本發明之陽性檢出截止值。根據上限的95%信賴區間，當不考慮目標物(負對照，N.C.)時，97.5%的數據集會低於截止值(陽性檢出截止值)，顯示為陰性檢測結果。剩下的2.5%則被視為背景(N0)。讀取數據(readout)將是附著目標物後的相對陽性檢測計數(△N/N0)增量，如圖3B插圖所示。
如前所述，本發明之檢測方法及檢測系統的讀取數據為免疫製劑(金奈米粒子)之陽性檢測數量(positive-detection number)。為了提高檢測靈敏度，需要盡可能增加有限目標物內的金奈米粒子(AuNPs)陽性檢測數量。因此，在本發明之檢測方法所示之數字分析中，位於報導分子(AuNPs)上的探針蛋白(probe protein)修飾具有至關重要的作用。一般來說，當探針蛋白比例升高時，每個報導分子(AuNP)可提供更多結合位點給目標物。然而，在高探針蛋白比例的情況下，有限的目標物可能分配不均，一些報導分子(AuNPs)可能捕捉到更多目標物，而其他的報導分子(AuNPs)可能捕捉到較少的目標物或沒有捕捉到目標物。在本發明所述的檢測方法中，必須有足夠的目標物結合在報導分子(AuNPs)上才能讓檢測讀數跨越陽性檢出截止值。不均勻分布會降低陽性檢測計數。另一方面，非常低的探針蛋白比例會導致報導分子(AuNPs)上結合位點不足，即使這些結合位點已完全被目標物佔據，也難以檢測。在報導分子(AuNPs)上的探針蛋白
比例存在一個權衡，需要平衡以最大化本發明所述的檢測方法的計數和靈敏度。
實驗中採用PEG-(NH2)2調節金奈米粒子上探針蛋白(probe protein)比率。PEG-(NH2)2是一種柔軟的線性聚合物，可用與探針蛋白類似的方式通過強物理吸附固定在報導分子(AuNPs)上。同時，添加PEG-(NH2)2可增強報導分子(AuNPs)在複雜基質中的穩定性。報導分子(AuNPs)分別以牛血清蛋白(BSA)和PEG-(NH2)2不同的質量比例(1：0、1：4和1：9wt%)進行修飾，分別標記為BSA100%@AuNPs、BSA20%@AuNPs和BSA10%@AuNPs。牛血清蛋白(BSA)和PEG-(NH2)2不修飾的報導分子(AuNPs)與不同濃度的抗牛血清蛋白(anti-BSA)溶液相互作用，以比較抗牛血清蛋白(anti-BSA)結合的靈敏度和動態範圍。如圖4A至圖4C所示，在不同濃度下進行反應前後的相應γ分佈。結果顯示，報導分子(AuNPs)表面修飾會對γ分佈產生影響。增加PEG-(NH2)2的比例導致截止值下降(負對照的上限95% CI)。這歸因於PEG-(NH2)2的添加減少了報導分子(AuNPs)表面上等效分子量和折射率，這與UV-Vis峰值的偏移結果一致。這個結果證明了本發明所示的檢測方法能可靠地檢測報導分子(AuNPs)表面吸附不同分子時的LSPR偏移。
本發明之檢測靈敏度評估是透過檢測不同濃度的抗牛血清蛋白(anti-BSA)，範圍從0pg mL-1到1μg mL-1來進行。從圖4D顯示的結果來看，使用BSA100%@AuNPs在檢測低於100ng mL-1的抗牛血清蛋白(anti-BSA)時，並未呈現明顯的訊號區分能力。這是因為有限的目標物分配地不平均，進而降低了正確陽性檢測的計數。當抗牛血清蛋白
(anti-BSA)分子濃度足夠(>100ng mL-1)時，大多數報導分子(AuNPs)可以結合足夠的目標物，以便跨越截止值(陽性檢出閾值)，並導致訊號的跳升。對於BSA10%@AuNPs而言，儘管隨著低濃度抗牛血清蛋白(anti-BSA)的增加，訊號有所增加，但較高濃度會產生報導分子(AuNPs)結合飽和的情況。此飽和限制了檢測的動態範圍。相較而言，BSA20%@AuNPs的靈敏度和動態範圍表現出色，其檢測範圍從分子濃為1pg/mL到1μg/mL的抗牛血清蛋白(anti-BSA)，涵蓋超過六個數量級，且不會出現飽和現象。然而，需要注意的是，在重複實驗中，PEG-(NH2)2的使用量增加會導致數據偏差擴大，這表明了報導分子(AuNPs)上鑲嵌蛋白(anchor protein)的分佈是不均勻的。BSA20%@AuNPs和BSA10%@AuNPs的檢定結果顯示，在沒有目標物時(N.C.，0pg mL-1)和1pg mL-1之間存在統計學上的顯著差異。綜合考慮靈敏度、動態範圍和標準差等因素，本發明選擇使用BSA20%@AuNPs作為免疫製劑進行抗牛血清蛋白(anti-BSA)的檢測。
在優化後，本發明的檢測方法和系統與傳統的LSPR免疫分析方法進行比較，本發明的檢測方法和檢測系統係與傳統的LSPR免疫分析方法的UV-Vis吸收光譜法和肉眼觀察法進行比較。值得注意的是，在有限目標物的情況下，使用更高數量的免疫製劑會導致每個試劑所載的目標物減少，進而降低檢測極限。因此，為了優化這三種方法的檢測極限，測試了每種方法的最小可檢測報導分子(AuNP)濃度，以最大化目標物與免疫製劑的比率。肉眼觀察法的最小可檢測濃度為5×109NP/mL，UV-Vis吸收光譜法和本發明的最小可檢測濃度為5×108NP/mL。
請參考圖5A至圖5E。在本實施例中，我們證明瞭本發明在抗牛血清蛋白(anti-BSA)檢測中的可靠性、快速回應(≦15分鐘)、高靈敏度(LOD~1pg mL-1)和大動態範圍(>六個數量級)。在此，我們進一步證明瞭本發明針對SARS-CoV-2棘蛋白(spike protein)的抗體檢測方面的能力，結果如圖5A至圖5E所示。根據棘蛋白修飾之50-nm金奈米粒子(SP20%@AuNPs)的上限95%信賴區間，截止值(cutoff，也可稱為陽性檢出截止值)為0.255。如圖5A所示，使用SP20%@AuNPs作為免疫製劑，隨著單株抗體(mAbSP)濃度的增加，可以觀察到金奈米粒子(AuNP)計數量與γ分佈朝較大γ值方向移位的情況(圖5A)。這導致金奈米粒子(AuNP)計數數量不斷增加，並超過設定的截止值。相反地，當濃度低於100ng/mL時，用作特異性測試的抗牛血清蛋白(anti-BSA)檢測並未顯示任何明顯移位。相反地，用於特異性測試的抗牛血清蛋白(anti-BSA)檢測在濃度低於100ng/mL時，未顯示任何明顯移位。儘管如圖5C所示，在濃度為1μg/mL處存在一個跳升，但在10pg/mL以上的濃度，單株抗體(mAbSP)的信號仍然可區分。然而，這結果也暗示靈敏度可能會因LSPR免疫分析的基質影響而波動。為了釐清基質影響，我們進一步使用含或不含人類抗體的人造唾液來演示在複雜樣品中的檢測。
提供含有人類血清蛋白和多種抗體的人工唾液來模擬人類唾液做為複雜樣本。然後對模擬人工唾液(唾液緩衝液；S.B.)中不斷增加的單株抗體(mAbSP)濃度進行了檢測。如圖5D所示，空白(blank)是沒有添加任何蛋白質的人工唾液。做為複雜樣本，根據N.C.的95%信賴區間設置的截止值(cutoff，也可稱為陽性檢出截止值)比純樣本(TE緩衝液，圖5A、
圖5B)更大。此外，圖5C中空白和N.C.之間的△N/N0的差異大約為1μg/mL的抗牛血清蛋白(anti-BSA)。這個結果是由複雜樣本中的基質影響所造成的。基質影響會影響本發明的檢測極限，不同添加劑(蛋白質)和基礎基質的近似△N/N0表明影響有限。從圖5D和圖5E可以看出，儘管截止值提高了，但隨著單株抗體(mAbSP)濃度的增加，報導分子(AuNP)的數量仍會明顯地超過設置的截止值。對於N.C.(0pg mL-1)的明顯計數差異證明了本發明獨特的檢測能力，可以在唾液中檢測出針對SARS-CoV-2棘蛋白的抗體。本發明顯示其檢測極限為10pg mL-1，至少有六個數量級的動態範圍。此結果歸因於抗體的特異性和基質影響導致抗牛血清蛋白(anti-BSA)和單株抗體(mAbSP)檢測的檢測極限不同。儘管檢測極限在複雜樣品中有所提高，但本發明與ELISA一樣，檢測極限達到了10pg mL-1，且本發明不需標記、便於操作、且數據讀取時間更短。在此需注意的是，如圖3B、圖4A、圖4B、圖4C、圖5A、圖5B、圖5D所示，大分子如抗牛血清蛋白(anti-BSA)、棘蛋白等，其截止值(陽性檢出截止值)為γ
0.1。
請參考圖6A至圖6D。如圖6A所示，小分子和大分子結合在金奈米粒子(AuNPs)上，其中ds表示結合分子層的厚度，dNP表示AuNPs的直徑。在此需注意的是，小分子是指分子量小於500Da，大分子是指分子量大於10kDa。圖6B顯示了直徑為50nm(dNP)的報導分子(AuNP)與不同ds的歸一化散射截面。圖例表示結合分子層(ds)的厚度。圖6C顯示了使用峰值波長和以540nm為中心的光譜圖像對比因子γ進行的dNP的反應比較。對於dNP小於0.5nm的小分子，光譜圖像對比因子γ表現出更好的線性特徵，表示光譜圖像對比因子γ在小分子、農藥檢測中表現更佳。圖
6D顯示由於直徑變異係數為10%，報導分子(AuNP)直徑變異為±5nm。理論上，當ds=0時，γ的截止值是相對於報導分子(AuNP)直徑為正值，即較小的γ代表較小的報導分子(AuNP)。此外，根據計算，較小的報導分子(AuNP)將隨著ds的增加呈現出強烈的γ增加速率。這種現象在小分子檢測中起著關鍵作用。這表示，在使用本發明的檢測方法和檢測系統時，將截止值(陽性檢出截止值)設置在下限(lower limit；LL，γ分佈圖的左側)會有強烈的計數變化率和更好的農藥檢測靈敏度。
如圖7A及圖7B所示，本發明之檢測方法及檢測系統用於益達胺(imidacloprid)檢測，其設於95%信賴區間的下限LL處的截止值隨著農藥濃度的增加而逐漸降低。圖7B顯示基於95%LL降低率和使用氣味結合蛋白-2修飾之金奈米粒子，本發明對於新尼古丁類農藥(neonieotinoids)有顯著的靈敏度，且對其他類別的農藥(pesticides)，如歐殺松(acephate)和芬普尼(fipronil)具有明顯的選擇性。在此需注意的是，如圖7A及圖7B顯示之結果，對於小分子如：益達胺以及其相似物，其截止值(陽性檢出截止值)為-γ 
0.1。
請參考圖8A及圖8B。本發明於綠茶的盲測結果如圖8A所示，此結果顯示本發明之截止值(陽性檢出截止值)設置為不含農藥的空白樣品標準偏差的三倍。如圖8B表格所列，圖8A中的盲測結果與ESI-質譜法的標準方法結果一致。這種一致性表明，使用氣味結合蛋白-2和本發明所示之檢測技術，可以在新尼古丁類農藥(neonicotinoids)以及其他農藥類別之間體現顯著選擇性。這個結果驗證了本發明所示之檢測方法在多種農藥的檢測能力。
如圖8C及圖8D所示，本發明於紅茶的盲測結果如圖8C所示，此結果顯示截止值(陽性檢出截止值)設置為不含農藥的空白樣品標準偏差的三倍。如圖8D表格所列，圖8D中的盲測結果與ESI-質譜法的標準方法結果一致，。這種一致性表明，使用氣味結合蛋白-2和本發明所示之檢測技術，可以在新尼古丁類農藥(neonicotinoids)以及其他農藥類別之間體現顯著選擇性。這個結果驗證了本發明所示之檢測方法在多種農藥的檢測能力
請參考圖2I，本發明之檢測系統1包括影像擷取裝置10a以及處理器20，處理器20電性連接影像擷取裝置10a。影像擷取裝置10a用於個別取得每一個複數報導分子的複數局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像，其中每一個LSPR光譜影像皆具有一長波長區段亮度(BA)以及短波長區段亮度(BB)。處理器20計算每一個報導分子的光譜影像亮度對比因子γ，
，且處理器定義目標物之陽性檢出截止值為|γ|
0.1。根據本發明之一實施例，影像擷取裝置10a為設置於手持裝置內的相機，比如：智慧型手機內建的相機。
應注意的是，上述諸多實施例僅係為了便於說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
步驟S1至步驟S3
Claims (17)
- 一種檢測方法，用於檢測附著於複數報導分子表面之一目標物，其中該複數報導分子於一微流道晶片中流動且被一光源照射，該檢測方法包括：個別取得每一該複數報導分子之複數局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像，其中每一個該局域表面電漿共振光譜影像具有一長波長區段亮度(BA)以及一短波長區段亮度(BB)；計算每一個該報導分子之一光譜影像亮度對比因子γ，其中；以及定義該目標物之一陽性閾值為|γ|0.1。
- 如請求項1所述之該檢測方法，其中當該目標物之一分子量大於10kDa，該陽性閾值為γ0.1。
- 如請求項1所述之該檢測方法，其中當該目標物之該分子量小於500Da，該陽性閾值為-γ0.1。
- 如請求項1所述之該檢測方法，其中該長波長區段及該短波長區段由該報導分子之該LSPR光譜影像未產生紅移之一峰值所區分。
- 如請求項4所述之該檢測方法，其中該報導分子之該LSPR光譜影像未產生紅移之該峰值為X nm，該長波長區段定義為(X+10)±10；該短波長區段定義為(X-10)±10。
- 如請求項1所述之該檢測方法，其中於定義該陽性閾值前，該檢測方法更包括：定義一關係圖，其中該關係圖呈現每一個該光譜影像亮度對比因子 γ與各該光譜影像亮度對比因子γ所對應之該報導分子之一計數量(counting number)之關係。
- 如請求項1所述之該檢測方法，其中該目標物透過複數免疫製劑附著於該複數報導分子之該表面，其中該複數免疫製劑的濃度為20%。
- 如請求項7所述之該檢測方法，其中該光源為一暗場照明系統(dark-field illumination system)。
- 一種檢測系統，用於檢測附著於複數報導分子表面之一目標物，其中該複數報導分子於一微流道晶片中流動且被一光源照射，該檢測系統包括：一影像擷取裝置，用於取得個別取得每一該複數報導分子之複數局域表面電漿共振(LSPR)光譜影像，其中每一個該局域表面電漿共振光譜影像具有一長波長區段亮度(BA)以及一短波長區段亮度(BB)；以及一處理器，用於計算每一個該報導分子之一光譜影像亮度對比因子γ，其中，並定義該目標物之一陽性閾值為|γ|0.1。
- 如請求項9所述之該檢測系統，其中當該目標物之一分子量大於10kDa，該陽性閾值為γ0.1。
- 如請求項9所述之該檢測系統，其中當該目標物之該分子量小於500Da，該陽性閾值為-γ0.1。
- 如請求項9所述之該檢測系統，其中該長波長區段及該短波長區段由該報導分子之該LSPR光譜影像未產生紅移之一峰值所區分。
- 如請求項12所述之該檢測系統，其中該報導分子之該LSPR光譜影像未產生紅移之該峰值為X nm，該長波長區段定義為(X+10)±10；該短波長區段定義為(X-10)±10。
- 如請求項9所述之該檢測系統，其中於定義該陽性閾值前，該檢測系統更包括：定義一關係圖，其中該關係圖呈現每一個該光譜影像亮度對比因子γ與各該光譜影像亮度對比因子γ所對應之該報導分子之一計數量(counting number)之關係。
- 如請求項9所述之該檢測系統，其中該目標物透過複數免疫製劑附著於該複數報導分子之該表面，其中該複數免疫製劑的濃度為20%。
- 如請求項15所述之該檢測系統，其中該光源為一暗場照明系統(dark-field illumination system)。
- 如請求項9所述之該檢測系統，其中該影像擷取裝置為設置於一手持裝置內的相機。
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