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TW202039573A - 抗轉鐵蛋白受體抗體及其用途 - Google Patents

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TW202039573A
TW202039573A TW108147094A TW108147094A TW202039573A TW 202039573 A TW202039573 A TW 202039573A TW 108147094 A TW108147094 A TW 108147094A TW 108147094 A TW108147094 A TW 108147094A TW 202039573 A TW202039573 A TW 202039573A
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TW
Taiwan
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transferrin receptor
receptor antibody
seq
cases
sequence
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TW108147094A
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碧翠絲 黛安娜 達利曼特
文卡塔 拉瑪那 多帕拉普迪
瑞秋 瓊斯
Original Assignee
美商亞維代堤生物科學公司
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Publication date
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Abstract

在某些實施例中，本發明揭示抗轉鐵蛋白受體抗體、抗轉鐵蛋白受體抗體結合物及包含該等抗轉鐵蛋白受體抗體或結合物之醫藥組合物。在一些實施例中，本發明亦揭示利用本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體來遞送有效負載物之方法及使用本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體進行治療之方法。

Description

抗轉鐵蛋白受體抗體及其用途
本發明係在醫藥劑領域中且特定地關於抗體。本發明提供抗轉鐵蛋白受體抗體以及製備及使用抗轉鐵蛋白受體抗體之方法。
除在診斷中之已知使用之外，已顯示抗體適用作治療劑。舉例而言，免疫療法或用於治療目的之抗體使用已在近些年用於治療癌症及其他病症。轉鐵蛋白受體為用於發展靶向癌症診斷及治療劑之大部分廣泛地靶向之受體中之一者。此II型跨膜醣蛋白負責細胞鐵轉運且發現以低含量處於許多正常細胞類型表面上。需要研發經改良之抗轉鐵蛋白受體抗體以用於醫藥用途。
在某些實施例中，本文揭示抗轉鐵蛋白受體抗體、抗轉鐵蛋白受體抗體結合物及包含該等抗轉鐵蛋白受體抗體或結合物之醫藥組合物。在一些實施例中，本文亦揭示利用本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體來遞送有效負載物之方法及使用本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體進行治療之方法。
在某些實施例中，本文揭示抗轉鐵蛋白受體抗體，其包含可變重鏈(VH)區及可變輕鏈(VL)區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。在一些實施例中，VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X3 選自N或S，X4 選自A或G，X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。在一些實施例中，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 (SEQ ID NO: 92)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。在一些實施例中，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。在一些實施例中，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。在一些實施例中，VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。在一些實施例中，VH區與選自SEQ ID NO: 13-16之序列包含至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，VL區與選自SEQ ID NO: 18-21之序列包含至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含人類化抗體或其結合片段或嵌合抗體或其結合片段。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含多特異性抗體或其結合片段。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含雙特異性抗體或其結合片段。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG-scFv、奈米抗體、BiTE、雙功能抗體、DART、TandAb、sc雙功能抗體、sc雙功能抗體-CH3、三功能抗體、微型抗體(mini-antibody/minibody)、TriBi微型抗體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv-Fc KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2. scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙功能抗體-Fc、雙功能抗體-Fc、串聯scFv-Fc或胞內抗體。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG1構架。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2構架。在一些實施例中，IgG2構架為IgG2b構架。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG4構架。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體進一步包含Fc區中之至少一種突變。在一些實施例中，至少一種突變調節效應功能。在一些實施例中，至少一種突變減弱或消除Fc-γ受體結合。在一些實施例中，至少一種突變係處於殘基位置D265、N297、K322、L328或P329處，其中殘基位置係參照IgG1。在一些實施例中，Fc區包含兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種突變。在一些實施例中，Fc區包含L233及L234處之突變，其中殘基對應於SEQ ID NO: 23之位置233及234。在一些實施例中，Fc區包含D265及N297處之突變。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含選自SEQ ID NO: 23-46之重鏈(HC)序列及選自SEQ ID NO: 47 -50之輕鏈(LC)序列。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體特異性結合至人類轉鐵蛋白受體(TfR)。
在某些實施例中，本文揭示包含本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體及有效負載物之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物。在一些實施例中，有效負載物包含小分子、肽、蛋白質或聚核酸分子。在一些實施例中，有效負載物包含聚核酸分子。在一些實施例中，聚核酸分子包含短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、反義寡核苷酸(ASO)、PMO或mRNA。在一些實施例中，有效負載物包含dsRNA。在一些實施例中，有效負載物包含反義寡核苷酸(ASO)。在一些實施例中，有效負載物包含小分子、肽或蛋白質。在一些實施例中，有效負載物包含微管破壞劑、DNA修飾劑或Akt抑制劑。在一些實施例中，有效負載物包含奧瑞他汀(auristatin)或其衍生物、尾海兔素或其衍生物或類似物、類美登素或吡咯并苯并二氮呯或其衍生物。在一些實施例中，奧瑞他汀或其衍生物為單甲基奧瑞他汀E (MMAE)或單甲基奧瑞他汀F (MMAF)。在一些實施例中，類美登素為DM1或DM4。在一些實施例中，吡咯并苯并二氮呯為吡咯并苯并二氮呯二聚體。在一些實施例中，有效負載物包含免疫調節劑(immunomodulatory agent/immune modulator)。在一些實施例中，免疫調節劑包含細胞介素。在一些實施例中，有效負載物包含蛋白質或肽毒素或其片段。在一些實施例中，有效負載物經由連接子結合至抗轉鐵蛋白受體抗體。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體進一步結合至兩種或更多種有效負載物。在一些實施例中，有效負載物與抗轉鐵蛋白受體抗體之比為約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1或12:1。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白結合物包含A-(X1 -B)n (式(I))，其中A包含抗轉移抗體；B包含有效負載物；X1 由鍵或連接子組成；且n為選自1-12之平均值。在一些實施例中，有效負載物為聚核酸分子。在一些實施例中，聚核酸分子包含隨從股及引導股。在一些實施例中，引導股包含至少一種經修飾之核苷酸間鍵、至少一種反轉無鹼基部分、至少一種經5'-乙烯基膦酸酯修飾之非天然核苷酸或其組合。在一些實施例中，至少一種經5'-乙烯基膦酸酯修飾之非天然核苷酸之位置距離引導股之5'端約1、2、3、4或5個鹼基。在一些實施例中，聚核酸分子進一步包含2'位置處之糖部分修飾。在一些實施例中，2'位置處之修飾係選自經以下修飾之核苷酸：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)。在一些實施例中，隨從股包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個經二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物修飾之非天然核苷酸。在一些實施例中，隨從股之長度比引導股短，由此生成5'突出端、3'突出端、一個末端處之鈍端或其組合。在一些實施例中，隨從股之長度與引導股相等，由此生成聚核酸分子之各末端處之鈍端。在一些實施例中，隨從股結合至A-X1 。在一些實施例中，A-X1 結合至隨從股之5'端。在一些實施例中，A-X1 結合至隨從股之3'端。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白結合物包含：A-X1 -(B-X2 -C)n (式(II))，其中A包含抗轉鐵蛋白受體抗體；B包含聚核酸分子；C由聚合物組成；X1 由鍵或第一連接子組成；X2 由鍵或第二連接子組成；且n為選自1-12之平均值。在一些實施例中，C為聚乙二醇。在一些實施例中，聚核酸分子包含隨從股及引導股。在一些實施例中，隨從股結合至A-X1 及X2 -C。在一些實施例中，A-X1 結合至隨從股之5'端且X2 -C結合至隨從股之3'端。在一些實施例中，X2 -C結合至隨從股之5'端且A-X1 結合至隨從股之3'端。在一些實施例中，X1 及X2 各自獨立地為非聚合連接子。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體結合物進一步包含D。在一些實施例中，D為胞內體裂解部分。
在某些實施例中，本文揭示編碼本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體之核酸聚合物。
在某些實施例中，本文揭示包含編碼本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體之核酸聚合物之載體。
在某些實施例中，本文揭示包含以下之醫藥組合物：本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體或本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物；及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物係調配用於全身投與。在一些實施例中，醫藥組合物係調配用於非經腸投與。
在某些實施例中，本文揭示將有效負載物遞送至個體中之所關注之目標位點之方法，其包含：向個體投與本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或本文所描述之醫藥組合物以將有效負載物遞送至所關注之目標位點。在一些實施例中，所關注之目標位點為包含經過度表現之致病蛋白質之細胞。在一些實施例中，所關注之目標位點為腫瘤位點。在一些實施例中，所關注之目標位點為位於腦中之位點。
在某些實施例中，本文揭示治療有需要之個體之癌症之方法，其包含：向個體投與本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或本文所描述之醫藥組合物以治療個體之癌症。在一些實施例中，癌症為實體癌症。在一些實施例中，癌症為血液惡性病。在一些實施例中，癌症為膀胱癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、乳癌、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、子宮頸癌、卵巢癌、大腸直腸癌、胰臟癌、食道癌、前列腺癌、腎癌、皮膚癌、白血病、甲狀腺癌、肝癌或子宮癌。在一些實施例中，癌症為轉移性癌症。在一些實施例中，癌症為復發性或難治性癌症。
在某些實施例中，本文揭示治療有需要之個體之肌肉萎縮或肌強直性營養不良之方法，其包含：向個體投與本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或本文所描述之醫藥組合物，其中聚核酸分子與萎縮基因之目標序列雜交，且其中聚核酸分子介導針對萎縮基因之RNA干擾，由此治療個體之肌肉萎縮。在一些實施例中，肌肉萎縮為糖尿病相關肌肉萎縮或癌症惡病質相關肌肉萎縮。在一些實施例中，肌肉萎縮與胰島素缺乏症、慢性腎衰竭、充血性心臟衰竭、慢性呼吸道疾病、慢性感染、空腹、去神經、少肌症或1型肌強直性營養不良(DM1)相關。在一些實施例中，肌強直性營養不良為DM1。在一些實施例中，萎縮基因包含IGF1-Akt-FoxO路徑、糖皮質素-GR路徑、PGC1α-FoxO路徑、TNFα-NFқB路徑或肌肉抑制素-ActRIIb-Smad2/3路徑內之經上調基因。在一些實施例中，萎縮基因編碼E3連接酶。在一些實施例中，萎縮基因編碼叉頭框轉錄因子。在一些實施例中，萎縮基因包含萎縮蛋白-1基因(FBXO32 )、MuRF1基因(TRIM63 )、FOXO1 、FOXO3 或MSTN 。在一些實施例中，萎縮基因包含DMPK 。在一些實施例中，個體為人類。
在某些實施例中，本文揭示治療有需要之個體之肌肉營養不良之方法，其包含：向個體投與本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或本文所描述之醫藥組合物，由此治療個體之肌肉營養不良。在一些實施例中，肌肉營養不良為杜興氏肌肉營養不良(Duchenne muscular dystrophy)、貝克爾肌肉營養不良(Becker muscular dystrophy)、面肩臂肌肉營養不良、先天性肌肉營養不良或肌強直性營養不良。在一些實施例中，肌肉營養不良為杜興氏肌肉營養不良。在一些實施例中，個體為人類。
在某些實施例中，本文揭示包含本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體、本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物、本文所描述之核酸聚合物、本文所描述之載體或本文所描述之醫藥組合物的套組。
交叉引用
本申請案主張2018年12月21日申請之美國臨時申請案第62/784,181號之權益，該案以全文引用之方式併入本文中。
轉鐵蛋白受體(TfR)包含膜醣蛋白家族且由基因TFRC 編碼。TfR藉由與鐵-轉鐵蛋白複合物相互作用以促進鐵進入細胞中而涉及於鐵代謝中。存在兩種TfR亞型，亦即轉鐵蛋白受體1 (TfR1或CD71)及轉鐵蛋白受體2 (TfR2)。TfR1無所不在地表現於不同細胞類型中，而TfR2特定地表現於肝細胞中。
在一些情況下，已在各種癌症中注意到異常TfR1表現。實際上，一項研究已顯示TfR1表現量在乳癌細胞中升高(Pizzamiglio等人, 「Expression of iron-related proteins differentiate non-cancerous and cancerous breast tumors」,Int J Mol Sci . 2017;18)。在獨立研究中，亦顯示TFR1在腦癌中過度表現(Rosager等人, 「Transferrin receptor-1 and ferritin heavy and light chains in astrocytic brain tumors: Expression and prognostic value」,PLoS One 12 :e0182954 (2017))。另一研究已注意到鐵吸收在引發腫瘤之細胞中升高(Rychtarcikova等人, 「Tumorinitiating cells of breast and prostate origin show alterations in the expression of genes related to iron metabolism」,Oncotarget .8 :6376-6398 (2017))。
在一些實施例中，本文揭示抗轉鐵蛋白受體抗體、抗轉鐵蛋白受體抗體結合物及包含其之醫藥組合物。在額外實施例中，本文揭示利用抗轉鐵蛋白受體抗體以遞送有效負載物之方法及藉由利用轉鐵蛋白受體之存在以進行靶向遞送來治療疾病或病況之方法。抗轉鐵蛋白受體抗體
在某些實施例中，本文揭示抗轉鐵蛋白受體抗體。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體特異性結合至轉鐵蛋白受體(TfR)。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體特異性結合至人類轉鐵蛋白受體(TfR)。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體特異性結合至轉鐵蛋白受體1 (TfR1) (或CD71)。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體特異性結合至人類轉鐵蛋白受體1 (TfR1) (或人類CD71)。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含可變重鏈(VH)區及可變輕鏈(VL)區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。
在一些實施例中，抗轉移抗體之VH區包含選自表1之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列。 表1.
名稱 HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO:
13E4_VH1 YTFTNYWMH 1 EINPINGRSNYAQKFQG 2 GTRAMHY 3
13E4_VH2* YTFTNYWMH 1 EINPINGRSNYAEKFQG 4 GTRAMHY 3
13E4_VH3 YTFTNYWMH 1 EINPIQGRSNYAEKFQG 5 GTRAMHY 3
*13E4_VH2與抗轉鐵蛋白受體抗體13E4_VH4共用相同HCDR1、HCDR2及HCDR3序列
在一些實施例中，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；包含SEQ ID NO: 2、4或5之HCDR2序列；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。在一些情況下，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。在一些情況下，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。在一些情況下，VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體之VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X3 選自N或S，X4 選自A或G，X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體之VL區包含選自表2之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。 表2.
名稱 LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO:
13E4_VL1* RTSENIYNNLA 6 AATNLAD 7 QHFWGTPLT 8
13E4_VL3 RTSENIYNNLA 6 AATNLAE 9 QHFWGTPLTF 10
13E4_VL4 RTSENIYSNLA 11 AGTNLAD 12 QHFWGTPLTF 10
*13E4_VL1與抗轉鐵蛋白受體抗體13E4_VL2共用相同LCDR1、LCDR2及LCDR3序列
在一些情況下，VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、包含SEQ ID NO: 7、9或12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X3 選自N或S。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X4 選自A或G，且X5 選自D或E。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 7、9或12及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 (SEQ ID NO: 92)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X3 選自N或S，X4 選自A或G，X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、包含SEQ ID NO: 7、9或12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X3 選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X4 選自A或G，且X5 選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 7、9或12及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 (SEQ ID NO: 92)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、包含SEQ ID NO: 7、9或12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X3 選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X4 選自A或G，且X5 選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 7、9或12及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 (SEQ ID NO: 92)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、包含SEQ ID NO: 7、9或12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X3 選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X4 選自A或G，且X5 選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 7、9或12及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 (SEQ ID NO: 92)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、包含SEQ ID NO: 7、9或12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X3 選自N或S。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及包含SEQ ID NO: 8或10之LCDR3序列，其中X4 選自A或G，且X5 選自D或E。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6或11之LCDR1序列、LCDR2序列SEQ ID NO: 7、9或12及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 (SEQ ID NO: 92)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含VH區及VL區，其中VH區之序列與SEQ ID NO: 13-16包含約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，且VL區之序列與SEQ ID NO: 18-21包含約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
在一些實施例中，VH區包含選自SEQ ID NO: 13-16 (表3)之序列，且VL區包含選自SEQ ID NO: 18-21 (表4)之序列。表3及表4中之加下劃線區域指代各別CDR1、CDR2或CDR3序列。表 3
名稱 VH 序列 SEQ ID NO:
13E4_VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 13
13E4_VH2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 14
13E4_VH3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 15
13E4_VH4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSS 16
13E4_VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMH WVKQRPGQGLEWIGEINPINGRSNYGERFKT KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAMHY WGQGTSVTVSS 17
表 4
名稱 VL 序列 SEQ ID NO:
13E4_VL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKSPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIK 18
13E4_VL2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIK 19
13E4_VL3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAE GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIK 20
13E4_VL4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSNLA WYQQKPGKAPKLLIYAGTNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFANYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIK 21
13E4_VL DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRTSENIYNNLA WYQQKQGKSPQLLVYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGNYYCQHFWGTPLT FGAGTKLELK 22
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體包含如表5中所說明之VH區及VL區。 表5
   13E4_VH1 (SEQ ID NO: 13) 13E4_VH2 (SEQ ID NO: 14) 13E4_VH3 (SEQ ID NO: 15) 13E4_VH4 (SEQ ID NO: 16)
13E4_VL1 (SEQ ID NO: 18) SEQ ID NO: 13 + SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 14 + SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 15 + SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 16 + SEQ ID NO: 18
13E4_VL2 (SEQ ID NO: 19) SEQ ID NO: 13 + SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 14 + SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 15 + SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 16 + SEQ ID NO: 19
13E4_VL3 (SEQ ID NO: 20) SEQ ID NO: 13 + SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 14 + SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 15 + SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 16 + SEQ ID NO: 20
13E4_VL4 (SEQ ID NO: 21) SEQ ID NO: 13 + SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 14 + SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 15 + SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 16 + SEQ ID NO: 21
在一些實施例中，上文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體為全長抗體。在其他實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體為其結合片段。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體為人類化抗體或其結合片段、嵌合抗體或其結合片段、單株抗體或其結合片段、多特異性抗體或其結合片段或雙特異性抗體或其結合片段。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體為單價Fab'、二價Fab2 、F(ab)'3 片段、單鏈可變片段(scFv)、雙scFv、(scFv)2 、雙功能抗體、微型抗體、奈米抗體、三功能抗體、四功能抗體、雙硫鍵穩定化Fv蛋白(「dsFv」)、單域抗體(sdAb)、Ig NAR、駱駝抗體或其結合片段或其經化學修飾之衍生物。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體為多特異性抗體。在一些情況下，多特異性抗體包含兩種或更多種目標結合部分，其中兩種或更多種目標結合部分中之各者特異性結合至抗原，且兩種或更多種抗原不同。在一些情況下，多特異性抗體包含特異性結合至三種或更多種不同抗原、四種或更多種不同抗原或五種或更多種不同抗原之目標結合部分。
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體為雙特異性抗體。在一些情況下，雙特異性抗體或結合片段包括杵-臼(Knob-into-Hole) (KiH)、不對稱再工程改造技術-免疫球蛋白(ART-Ig)、三功能單抗四源雜交瘤、雙特異性單株抗體(BiMAb、BsmAb、BsAb、bsMab、BS-Mab或Bi-MAb)、Fc∆Adp、XmAb、Azymetric、基於T細胞受體之抗體之雙特異性接合(BEAT)、雙特異性T細胞接合子(BiTE)、Biclonics、Fab-scFv-Fc、二合一/雙重作用Fab (DAF)、FinomAb、scFv-Fc-(Fab)-融合體、對接與鎖定(Dock-aNd-Lock) (DNL)、Adaptir (先前為SCORPION)、串聯雙功能抗體(TandAb)、雙重親和力再靶向(DART)或奈米抗體。
在一些情況下，雙特異性抗體為三功能抗體或雙特異性微型抗體。在一些情況下，雙特異性抗體為三功能抗體。在一些情況下，三功能抗體為包含用於兩種不同抗原之結合位點之全長單株抗體。
在一些情況下，雙特異性抗體為雙特異性微型抗體。在一些情況下，雙特異性微型抗體包含二價Fab2 、F(ab)'3 片段、雙scFv、(scFv)2 、雙功能抗體、微型抗體、三功能抗體、四功能抗體或雙特異性T細胞接合子(BiTE)。在一些實施例中，雙特異性T細胞接合子為含有兩個單鏈可變片段(scFv)之融合蛋白，其中兩個scFv靶向兩種不同抗原之抗原決定基。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體為三特異性抗體。在一些情況下，三特異性抗體包含F(ab)'3 片段或三功能抗體。在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體為如Dimas等人, 「Development of a trispecific antibody designed to simultaneously and efficiently target three different antigens on tumor cells」,Mol . Pharmaceutics ,12 (9): 3490-3501 (2015)中所描述之三特異性抗體。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含Brinkmann及Kontermann, 「The making of bispecific antibodies」,MABS 9 (2): 182-212 (2017)之圖2中所說明之抗體格式。
在一些實施例中，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG構架、IgA構架、IgE構架或IgM構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG構架(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG1構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2 (例如IgG2a或IgG2b)構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2a構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2b構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG3構架。在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG4構架。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體包含例如CH1域、CH2域、CH3域、鉸鏈區或其組合之構架區中之一或多種突變。在一些情況下，一或多種突變使抗體穩定且/或延長半衰期。在一些情況下，一或多種突變調節Fc受體相互作用，減弱或消除諸如FcyR、抗體依賴型細胞介導之細胞毒性(ADCC)或補體依賴型細胞毒性(CDC)之Fc效應功能。在額外情況下，一或多種突變調節糖基化。
在一些實施例中，一或多種突變位於Fc區中。在一些情況下，Fc區包含殘基位置L234、L235處之突變或其組合。在一些情況下，突變包含L234及L235。在一些情況下，突變包含L234A及L235A。在一些情況下，殘基位置係參照IgG1。
在一些情況下，Fc區包含殘基位置L234、L235、D265、N297、K322、L328或P329處之突變或其組合。在一些情況下，突變包含L234及L235與殘基位置K322、L328或P329處之突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L234、L235及K322處之突變。在一些情況下，Fc區包含L234、L235及L328處之突變。在一些情況下，Fc區包含L234、L235及P329處之突變。在一些情況下，Fc區包含D265及N297處之突變。在一些情況下，殘基位置係參照IgG1。
在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A、D265A、N297G、K322G、L328R或P329G或其組合。在一些情況下，Fc區包含L234A及L235A與K322G、L328R或P329G之組合。在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A及K322G。在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A及L328R。在一些情況下，Fc區包含L234A、L235A及P329G。在一些情況下，Fc區包含D265A及N297G。在一些情況下，殘基位置係參照IgG1。
在一些情況下，Fc區包含殘基位置L235、L236、D265、N297、K322、L328或P329處之突變或該等突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L235及L236處之突變。在一些情況下，Fc區包含L235及L236處之突變與殘基位置K322、L328或P329處之突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L235、L236及K322處之突變。在一些情況下，Fc區包含L235、L236及L328處之突變。在一些情況下，Fc區包含L235、L236及P329處之突變。在一些情況下，Fc區包含D265及N297處之突變。在一些情況下，殘基位置係參照IgG2b。
在一些實施例中，Fc區包含L235A、L236A、D265A、N297G、K322G、L328R或P329G或其組合。在一些情況下，Fc區包含L235A及L236A。在一些情況下，Fc區包含L235A及L236A與K322G、L328R或P329G之組合。在一些情況下，Fc區包含L235A、L236A及K322G。在一些情況下，Fc區包含L235A、L236A及L328R。在一些情況下，Fc區包含L235A、L236A及P329G。在一些情況下，Fc區包含D265A及N297G。在一些情況下，殘基位置係參照IgG2b。
在一些實施例中，Fc區包含殘基位置L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328處之突變，其中殘基對應於SEQ ID NO: 23之位置233、234、264、296、321、327及328。在一些情況下，Fc區包含L233及L234處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233及L234處之突變與殘基位置K321、L327或P328處之突變之組合。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及K321處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及L327處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及K321處之突變。在一些情況下，Fc區包含L233、L234及P328處之突變。在一些情況下，Fc區包含D264及N296處之突變。在一些情況下，涵蓋與IgG1、IgG2、IgG3或IgG4構架中之殘基L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328等效之位置。在一些情況下，亦涵蓋針對對應於IgG1、IgG2或IgG4構架中之SEQ ID NO: 23之殘基L233、L234、D264、N296、K321、L327或P328之殘基的突變。
在一些實施例中，Fc區包含L233A、L234A、D264A、N296G、K321G、L327R或P328G，其中殘基對應於SEQ ID NO: 23之位置233、234、264、296、321、327及328。在一些情況下，Fc區包含L233A及L234A。在一些情況下，Fc區包含L233A及L234A與K321G、L327R或P328G之組合。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及K321G。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及L327R。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及K321G。在一些情況下，Fc區包含L233A、L234A及P328G。在一些情況下，Fc區包含D264A及N296G。
在一些實施例中，人類IgG恆定區例如經胺基酸修飾進行修飾以更改抗體依賴型細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴型細胞毒性(CDC)，該胺基酸修飾描述於以下中：Natsume等人, 2008Cancer Res ,68 (10): 3863-72；Idusogie等人, 2001J Immunol ,166 (4): 2571-5；Moore等人, 2010mAbs ,2 (2): 181- 189；Lazar等人, 2006PNAS ,103 (11): 4005-4010, Shields等人, 2001JBC ,276 ( 9): 6591- 6604；Stavenhagen等人, 2007Cancer Res ,67 (18): 8882-8890；Stavenhagen等人, 2008Advan . Enzyme Regul .,48 : 152-164；Alegre等人, 1992J Immunol ,148 : 3461-3468；綜述於Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1): 1-11中。
在一些實施例中，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體為包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)之全長抗體。在一些情況下，重鏈(HC)包含選自表6之序列。在一些情況下，輕鏈(LC)包含選自表7之序列。加下劃線區指代各別CDR。表 6
名稱 HC 序列 SEQ ID NO:
13E4_VH1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 23
13E4_VH1_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 24
13E4_VH1_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 25
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13E4_VH1_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAQKFQG RVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 28
13E4_VH2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 29
13E4_VH2_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 30
13E4_VH2_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 31
13E4_VH2_c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAR PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 32
13E4_VH2_d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 33
13E4_VH2_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWIGEINPINGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 34
13E4_VH3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 35
13E4_VH3_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 36
13E4_VH3_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 37
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13E4_VH3_d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 39
13E4_VH3_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPIQGRSNYAEKFQG RVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMH YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 40
13E4_VH4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 41
13E4_VH4_a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 42
13E4_VH4_b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCG VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 43
13E4_VH4_c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAR PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 44
13E4_VH4_d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALG APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 45
13E4_VH4_e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMH WVRQAPGQGLEWMGEINPINGRSNYAEKFQGR VTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTATYYCARGTRAMHY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVA VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYG STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 46
表 7
名稱 LC 序列 SEQ ID NO:
13E4_VL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKSPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 47
13E4_VL2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLT FGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 48
13E4_VL3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYNNLA WYQQKPGKAPKLLIYAATNLAE GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 49
13E4_VL4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIYSNLA WYQQKPGKAPKLLIYAGTNLAD GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFANYYCQHFWGTPLTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 50
在一些實施例中，與參考抗轉鐵蛋白受體抗體相比，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體具有經改善之血清半衰期。在一些情況下，與參考抗轉鐵蛋白受體抗體相比，經改善之血清半衰期為至少30分鐘、1小時、1.5小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更長時間。產生抗體或其結合片段
在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如抗體及其結合片段)係使用此項技術中已知之適用於合成多肽(例如抗體)之任何方法，詳言之藉由化學合成或藉由重組表現產生，且較佳地藉由重組表現技術產生。
在一些情況下，抗體或其結合片段以重組方式表現，且編碼抗體或其結合片段之核酸由以化學方式合成之寡核苷酸(例如如Kutmeier等人, 1994, BioTechniques 17:242中所描述)裝配，此涉及合成含有編碼抗體之序列部分之重疊寡核苷酸，使彼等寡核苷酸融合且接合，且隨後藉由PCR擴增經接合之寡核苷酸。
可替代地，編碼抗體之核酸分子視情況藉由使用可與序列之3'端及5'端雜交之合成引子進行PCR擴增或藉由使用對特定基因序列具有特異性之寡核苷酸探針進行選殖來由合適源(例如由表現免疫球蛋白之任何組織或細胞生成之抗體cDNA庫或cDNA庫)生成。
在一些情況下，抗體或其結合片段視情況藉由使諸如兔之動物免疫以生成多株抗體或更佳地藉由例如如Kohler及Milstein (1975, Nature 256:495-497)所描述或如Kozbor等人(1983, Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁)所描述生成單株抗體來生成。可替代地，編碼至少抗體之Fab部分之殖株視情況藉由針對結合特定抗原之Fab片段殖株對Fab表現庫(例如如Huse等人, 1989, Science 246:1275-1281中所描述)進行篩檢或藉由對抗體庫(參見例如Clackson等人, 1991, Nature 352:624；Hane等人, 1997Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:4937)進行篩檢來獲得。
在一些實施例中，使用經發展以用於由來自具有適當抗原特異性之小鼠抗體分子之剪接基因連同來自具有適當生物活性之人類抗體分子之基因一起產生「嵌合抗體」的技術(Morrison等人, 1984, Proc . Natl . Acad . Sci . 81:851-855；Neuberger等人, 1984, Nature 312:604-608；Takeda等人, 1985, Nature 314:452-454)。嵌合抗體為其中不同部分來源於不同動物物種，諸如具有來源於鼠單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區(例如人類化抗體)之動物物種的分子。
在一些實施例中，針對單鏈抗體產生所描述之技術(美國專利第4,694,778號；Bird, 1988, Science 242:423-42；Huston等人, 1988, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883；及Ward等人, 1989, Nature 334:544-54)適於產生單鏈抗體。單鏈抗體係藉由以下形成：經由胺基酸橋連接Fv區之重鏈及輕鏈片段，產生單鏈多肽。亦視情況使用用於裝配大腸桿菌(E . coli )中之功能Fv片段之技術(Skerra等人, 1988, Science 242:1038-1041)。
在一些實施例中，藉由習知技術(例如電穿孔、脂質體轉染及磷酸鈣沈澱)將包含抗體之核苷酸序列之表現載體或抗體之核苷酸序列轉移至宿主細胞，且隨後藉由習知技術培養經轉染之細胞以產生抗體。在特定實施例中，藉由組成性、可誘導或組織特異性啟動子調節抗體之表現。
在一些實施例中，利用各種宿主表現載體系統以表現本文所描述之抗體或其結合片段。該等宿主表現系統代表產生抗體之編碼序列且隨後純化之媒劑，且亦代表當經適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時原位表現抗體或其結合片段的細胞。此等宿主表現系統包括但不限於微生物體，諸如經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型的細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌(B . subtilis ))；經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組酵母表現載體轉型的酵母(例如畢赤酵母(Saccharomyces Pichia ))；經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)及煙草嵌紋病毒(TMV))感染或經含有編碼抗體或其結合片段之序列之重組質體表現載體(例如Ti質體)轉型的植物細胞系統；或具有含有來源於哺乳動物細胞基因組之啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如COS、CHO、BH、293、293T、3T3細胞)。
為長期高產率產生重組蛋白，穩定表現為較佳的。在一些情況下，穩定地表現抗體之細胞株視情況經工程改造。宿主細胞可經受適當表現控制元件(例如啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記轉型，而非使用含有病毒複製起點之表現載體轉型。在引入外來DNA之後，使經工程改造之細胞在增濃培養基中生長1-2天，且隨後轉換成選擇性培養基。重組質體中之可選標記賦予選擇抗性，且允許細胞將質體穩定地整合至其染色體中且生長以形成變異區(foci)，之後將該等變異區選殖且擴增至細胞株中。此方法可有利地用於工程改造表現抗體或其結合片段之細胞株。
在一些情況下，使用多個選擇系統，包括但不限於單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人, 1977, Cell 11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Szybalska及Szybalski, 192, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 48:202)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人, 1980, Cell 22:817)基因分別用於tk−細胞、hgprt−細胞或aprt−細胞中。此外，抗代謝物抗性用作選擇以下基因之基礎：dhfr，其賦予抗甲胺喋呤性(Wigler等人, 1980, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:357；O'Hare等人, 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1527)；gpt，其賦予抗黴酚酸性(Mulligan及Berg, 1981, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072)；neo，其賦予抗胺基醣苷G-418性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu及Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol . 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；及Morgan及Anderson, 1993, Ann . Rev . Biochem . 62:191-217；May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215)；及hygro，其賦予抗潮黴素性(Santerre等人, 1984, Gene 30:147)。可使用之重組DNA技術中通常已知之方法描述於Ausubel等人(編, 1993, Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, NY；Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual , Stockton Press, NY；及第12及13章, Dracopoli等人(編), 1994, Current Protocols in Human Genetics , John Wiley & Sons, NY.；Colberre-Garapin等人, 1981, J . Mol . Biol . 150:1)中。
在一些情況下，抗體之表現量係藉由載體擴增來增加(綜述參見Bebbington及Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning , 第3卷. (Academic Press, New York, 1987))。當表現抗體之載體系統中之標記可擴增時，存在於宿主細胞培養物中之抑制劑之含量增加將使標記基因複本之數目增加。由於擴增區與抗體之核苷酸序列相關聯，故抗體之產生亦將增加(Crouse等人, 1983, Mol . Cell Biol . 3:257)。
在一些情況下，使用此項技術中已知之用於純化或分析抗體或抗體結合物之任何方法，例如藉由層析法(例如離子交換、親和力(特別地藉由蛋白A之後針對特定抗原之親和力)及篩分管柱層析法)、離心、差異可溶性或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術進行。例示性層析法包括但不限於強陰離子交換層析法、疏水相互作用層析法、粒徑篩析層析法及快速蛋白質液相層析法。抗轉鐵蛋白受體抗體結合物
在一些實施例中，上文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體進一步結合至有效負載物。在一些情況下，有效負載物包含小分子。在其他情況下，有效負載物包含蛋白質或肽。在額外情況下，有效負載物包含聚核酸分子。
在一些情況下，有效負載物與抗轉鐵蛋白受體抗體之比(藥物與抗體比或DAR比)為約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1或16:1。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體結合物包含 A-(X1 -B)n 式(I) 其中， A包含抗轉鐵蛋白受體抗體； B包含有效負載物； X1 由鍵或連接子組成；且 n為選自1-12之平均值。
在一些情況下，B與A (抗轉鐵蛋白受體抗體)之DAR比為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情況下，B與A之DAR比為約1。在一些情況下，B與A之DAR比為約2。在一些情況下，B與A之DAR比為約3。在一些情況下，B與A之DAR比為約4。在一些情況下，B與A之DAR比為約6。在一些情況下，B與A之DAR比為約8。在一些情況下，B與A之DAR比為約10。在一些情況下，B與A之DAR比為約12。在一些情況下，B與A之DAR比為約16。
在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約1。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約2。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約3。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約4。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約5。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約6。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約7。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約8。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約9。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約10。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約11。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約12。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約13。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約14。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約15。在一些情況下，聚核酸分子(B)與抗轉鐵蛋白受體抗體A之DAR比為約16。
在一些實施例中，B包含小分子、肽或蛋白質。
在一些實施例中，B包含聚核酸分子。在一些情況下，聚核酸分子包含隨從股及引導股。在一些情況下，隨從股結合至A-X1 。在一些情況下，A-X1 結合至隨從股之5'端。在一些情況下，A-X1 結合至隨從股之3'端。
在一些情況下，抗轉鐵蛋白受體抗體結合物包含 A-X1 -(B-X2 -C)n 式(II) 其中， A包含抗轉鐵蛋白受體抗體； B包含有效負載物； C由聚合物組成； X1 由鍵或第一連接子組成； X2 由鍵或第二連接子組成；且 n為選自1-12之平均值。
在一些情況下，C為聚乙二醇。
在一些情況下，B為聚核酸分子。在一些情況下，聚核酸分子包含隨從股及引導股。在一些情況下，隨從股結合至A-X1 及X2 -C。在一些情況下，A-X1 結合至隨從股之5'端且X2 -C結合至隨從股之3'端。在一些情況下，X2 -C結合至隨從股之5'端且A-X1 結合至隨從股之3'端。
在一些情況下，X1 及X2 各自獨立地為非聚合連接子。
在一些情況下，式(II) A-X1 -(B-X2 -C)n 結合物進一步包含D，亦即胞內體裂解部分。結合化學物質
在一些實施例中，藉由化學接合方法使B結合至A。在一些情況下，藉由天然接合使B結合至A。在一些情況下，結合係如以下中所描述：Dawson等人「Synthesis of proteins by native chemical ligation」,Science 1994 ,266 , 776-779；Dawson等人「Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives」,J. Am. Chem. Soc .1997 , 119, 4325-4329；Hackeng等人「Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology. 」,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 , 96, 10068-10073；或Wu等人「Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol」,Angew. Chem. Int. Ed. 2006 ,45 , 4116-4125。在一些情況下，結合係如美國專利第8,936,910號中所描述。在一些實施例中，聚核酸分子經由天然接合化學物質位點特異性地或非特異性地結合至結合部分。
在一些情況下，藉由定點方法利用「無痕跡」偶合技術(Philochem)使B結合至A。在一些情況下，「無痕跡」偶合技術利用結合部分上之N端1,2-胺基硫醇基，隨後使其與含有醛基之聚核酸分子結合。(參見Casi等人, 「Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery」,JACS 134 (13): 5887-5892 (2012))
在一些情況下，藉由定點方法利用併入至結合部分中之非天然胺基酸使B結合至A。在一些情況下，非天然胺基酸包含對乙醯基苯丙胺酸(pAcPhe)。在一些情況下，pAcPhe之酮基選擇性地偶合至烷氧基胺衍生之結合部分以形成肟鍵。(參見Axup等人, 「Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids」,PNAS 109 (40): 16101-16106 (2012))。
在一些情況下，藉由定點方法利用酶催化方法使B結合至A。在一些情況下，定點方法利用SMARTag™技術(Redwood)。在一些情況下，SMARTag™技術包含藉由甲醯基甘胺酸生成酶(FGE)在醛標籤存在下經由氧化方法由半胱胺酸生成甲醯基甘胺酸(FGly)殘基，且後續經由肼基-Pictet-Spengler (HIPS)接合來使FGly結合至烷基肼官能化聚核酸分子。(參見Wu 等人, 「Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag」,PNAS 106 (9): 3000-3005 (2009)；Agarwal等人, 「A Pictet-Spengler ligation for protein chemical modification」,PNAS 110 (1): 46-51 (2013))
在一些情況下，酶催化方法包含微生物轉麩醯胺酸酶(mTG)。在一些情況下，利用微生物轉麩醯胺酸酶催化方法使B結合至A。在一些情況下，mTG催化辨識序列內之麩醯胺酸之醯胺側鏈與官能化聚核酸分子之一級胺之間之共價鍵的形成。在一些情況下，mTG由茂原鏈黴菌(Streptomyces mobarensis )產生。(參見Strop等人, 「Location matters: site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates」,Chemistry and Biology 20 (2) 161-167 (2013))
在一些情況下，藉由如PCT公開案第WO2014/140317號中所描述之方法使B結合至A，該方法利用序列特異性轉肽酶。
在一些情況下，藉由如美國專利公開案第2015/0105539號及第2015/0105540號中所描述之方法使B結合至A。有效負載物 聚核酸分子
在一些實施例中，有效負載物為聚核酸分子。在一些情況下，聚核酸分子涉及於基因療法中，諸如涉及於RNA干擾(RNAi)或基因靜默(例如反義寡核苷酸)療法中。在一些情況下，聚核酸分子調節mRNA之剪接，且由此調節經編碼蛋白質之後續產生。
在一些實施例中，聚核酸分子包含短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)或短髮夾RNA (shRNA)。
在其他實施例中，聚核酸分子包含反義寡核苷酸。
在其他實施例中，聚核酸分子包含PMO。
在額外實施例中，聚核酸分子包含mRNA。
在一些情況下，聚核酸分子與萎縮相關基因(亦稱為萎縮基因)之目標序列雜交。萎縮基因或萎縮相關基因為在萎縮化肌肉中經上調或下調之基因。在一些情況下，經上調之萎縮基因包括編碼泛蛋白接合酶、叉頭框轉錄因子、生長因子、去泛素化酶或涉及於糖皮質素誘發之萎縮中之蛋白質的基因。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與泛蛋白接合酶(例如E3泛蛋白接合酶或粒線體泛蛋白接合酶)之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與叉頭框轉錄因子之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與生長因子之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與去泛素化酶之目標序列雜交。
在一些實施例中，本文所描述之聚核酸分子與FBXO32 、TRIM63 、TRAF6 、FBXO30 、FBXO40 、NEDD4 、TRIM32 、MUL1 、STUB1 、FOXO1 、FOXO3 、MSTN 、USP14 、USP19 、DDIT4 、CTSL2 、TGIF 、MYOG 、HDAC2 、HDAC3 、MT1L 、MT1B 或DMPK 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與FBXO32 、TRIM63 、FOXO1 、FOXO3 或MSTN 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與FBXO32 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與TRIM63 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與TRAF6 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與FBXO30 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與FBXO40 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與NEDD4 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與TRIM32 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與MUL1 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與STUB1 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與FOXO1 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與FOXO3 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與MSTN 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與USP14 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與USP19 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與DDIT4 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與CTSL2 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與TGIF 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與MYOG 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與HDAC2 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與HDAC3 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與MT1L 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與MT1B 之目標序列雜交。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子與DMPK 之目標序列雜交。
在一些情況下，聚核酸分子與以不正確方式剪接之mRNA之目標區域雜交，該以不正確方式剪接之mRNA引起不限於神經肌肉疾病、基因疾病、癌症、遺傳疾病或心血管疾病之疾病或病症。在一些情況下，神經肌肉疾病或病症為杜興氏肌肉營養不良、貝克爾肌肉營養不良、面肩臂肌肉營養不良、先天性肌肉營養不良或肌強直性營養不良。
在一些情況下，聚核酸分子靶向於造成杜興氏肌肉營養不良之DMD 基因中突變之外顯子。於造成杜興氏肌肉營養不良之DMD 基因中突變之例示性外顯子包括但不限於外顯子2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77及78。
在一些情況下，聚核酸分子與致癌基因之目標區域雜交。例示性致癌基因包括但不限於Abl 、 AKT-2 、 ALK 、 AML1 ( 或 RUNX1) 、 AR 、 AXL 、 BCL-2 、 BCL-3 、 BCL-6 、 BRAF 、 c-MYC 、 EGFR 、 ErbB-2 (Her2 、 Neu) 、 Fms 、 FOS 、 GLI1 、 HPRT1 、 IL-3 、 INTS2 、 JUN 、 KIT 、 KS3 、 K-sam 、 LBC (AKAP13) 、 LCK 、 LMO1 、 LMO2 、 LYL1 、 MAS1 、 MDM2 、 MET 、 MLL (KMT2A) 、 MOS 、 MYB 、 MYH11/CBFB 、 NOTCH1 (TAN1) 、 NTRK1 (TRK) 、 OST (SLC51B) 、 PAX5 、 PIM1 、 PRAD-1 、 RAF 、 RAR/PML 、 HRAS 、 KRAS 、 NRAS 、 REL/NRG 、 RET 、 ROS 、 SKI 、 SRC 、 TIAM1 或 TSC2 。在一些情況下，聚核酸分子與KRAS 、EGFR 、AR 、HPRT1 、CNNTB1 (β-連環蛋白)或β-連環蛋白相關基因之目標區域雜交。
在一些實施例中，聚核酸分子包含mRNA。在一些情況下，mRNA編碼細胞毒性蛋白質或肽。例示性細胞毒性蛋白質或肽包括細菌細胞毒素，諸如α-成孔毒素(例如來自大腸桿菌之細胞溶素A)、β-成孔毒素(例如α-溶血素、PVL-潘頓瓦倫丁殺白血球素(panton Valentine leukocidin)、氣單胞菌溶素、梭菌ε-毒素、產氣莢膜芽胞梭菌(clostridium perfringens)腸毒素)、二元毒素(炭疽毒素、水腫毒素、肉毒芽孢梭菌(C. botulinum) C2毒素、螺旋梭菌(C spirofome)毒素、產氣莢膜芽胞梭菌i毒素、困難梭狀芽孢桿菌(C. difficile)細胞致死性毒素(A及B))、普里昂蛋白(prion)、抗癌晶體蛋白(parasporin)、膽固醇依賴型細胞溶素(例如肺炎鏈球菌溶血素)、小成孔毒素(例如短桿菌素A)、藍藻毒素(cyanotoxin) (例如微囊藻毒素(microcystin)、節球藻毒素(nodularin))、血毒素(hemotoxin)、神經毒素(例如肉毒桿菌神經毒素)、細胞毒素、霍亂毒素(cholera toxin)、白喉毒素、假單胞菌外毒素A、破傷風毒素或免疫毒素(艾達黴素(idarubicin)、蓖麻毒素A、CRM9、美洲商陸抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein)、DT)。
在一些情況下，mRNA編碼諸如細胞毒性T細胞或B細胞抗原決定基之細胞毒性肽或免疫系統相關肽以經由用MHC I複合物、補體系統之攻膜複合物蛋白(MAC)、穿孔蛋白、顆粒酶及顆粒溶素呈現該抗原決定基來刺激特定免疫反應。
在一些情況下，mRNA編碼細胞凋亡觸發蛋白質或肽，諸如細胞凋亡蛋白酶活化因子-1 (Apaf-1)、細胞色素-c、凋亡蛋白酶引發蛋白(CASP2、CASP8、CASP9、CASP10)、細胞凋亡誘導因子(AIF)、p53、p73、p63、Bcl-2、Bax、顆粒酶B、聚ADP核糖聚合酶(PARP)及P 21-活化激酶2 (PAK2)。
在一些實施例中，聚核酸分子為核酸誘餌。在一些情況下，核酸誘餌為諸如基於RNA之蛋白結合模擬物之蛋白結合核酸模擬物。例示性核酸誘餌包括轉活化區(TAR)誘餌及Rev反應元件(RRE)誘餌。
在一些情況下，有效負載物為適體。適體為結合至特定目標分子之小寡核苷酸或肽分子。例示性核酸適體包括DNA適體、RNA適體或XNA適體，該等XNA適體為包含一或多種非天然核苷酸之RNA及/或DNA適體。例示性核酸適體包括ARC19499 (Archemix Corp.)、REG1 (Regado Biosciences)及ARC1905 (Ophthotech)。
在一些實施例中，聚核酸分子包含天然或合成或人工核苷酸類似物或鹼基。在一些情況下，聚核酸分子包含DNA、RNA及/或核苷酸類似物之組合。在一些情況下，合成或人工核苷酸類似物或鹼基包含核糖部分、磷酸酯部分、核苷部分中之一或多者或其組合處之修飾。
在一些實施例中，核苷酸類似物或人工核苷酸鹼基包含具有核糖部分之2'羥基處之修飾之核酸。在一些情況下，修飾包括H、OR、R、鹵基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R為烷基部分。例示性烷基部分包括但不限於鹵素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(一級胺、二級胺或三級胺)、醯胺、醚、酯、醇及氧。在一些情況下，烷基部分進一步包含修飾。在一些情況下，修飾包含偶氮基、酮基、醛基、羧基、硝基、亞硝基、腈基、雜環基(例如咪唑基、肼基或羥胺基)、異氰酸酯基或氰酸酯基或含硫基團(例如亞碸基、碸基、硫基或雙硫鍵)。在一些情況下，烷基部分進一步包含雜取代。在一些情況下，雜環基之碳經氮、氧或硫取代。在一些情況下，雜環取代包括但不限於N-嗎啉基、咪唑及N-吡咯啶基。
在一些情況下，2'羥基處之修飾為2'-O-甲基修飾或2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾。在一些情況下，2'-O-甲基修飾將甲基添加至核糖部分之2'羥基，然而2'O-甲氧基乙基修飾將甲氧基乙基添加至核糖部分之2'羥基。下文說明腺苷分子之2'-O-甲基修飾及尿苷之2'O-甲氧基乙基修飾之例示性化學結構。
Figure 02_image001
Figure 02_image003
2'-O-甲基-腺苷              2'-O-甲氧基乙基尿苷
在一些情況下，2'羥基處之修飾為2'-O-胺丙基修飾，其中包含丙基連接子之經延伸之胺基結合胺基與2'氧。在一些情況下，此修飾藉由每個糖引入來自胺基之一個正電荷來中和寡核苷酸分子之磷酸酯衍生之總體負電荷且由此改善歸因於其兩性離子特性之細胞吸收特性。下文說明2'-O-胺丙基核苷胺基磷酸酯之例示性化學結構。
Figure 02_image005
2'-O-胺丙基核苷胺基磷酸酯
在一些情況下，2'羥基處之修飾為經鎖定或橋聯之核糖修飾(例如經鎖定之核酸或LNA)，其中在2'碳處結合之氧分子藉由亞甲基連接至4'碳，因此形成2'-C ,4'-C -氧基-亞甲基連接之雙環核糖核苷酸單體。下文說明LNA化學結構之例示性圖示。左側顯示之圖示突出顯示LNA單體之化學連接性。右側顯示之圖示突出顯示LNA單體之呋喃醣環之經鎖定之3'-內(3 E)構形。
Figure 02_image007
LNA (經鎖定之核酸)
在一些情況下，2'羥基處之修飾包含乙烯核酸(ENA)，諸如將糖構形鎖定成C3 '-內糖波狀構形之2'-4'-乙烯橋聯之核酸。ENA為經橋聯之核酸類別之亦包含LNA之經修飾之核酸的部分。下文說明ENA及經橋聯之核酸之例示性化學結構。
Figure 02_image009
在一些實施例中，2'羥基處之額外修飾包括2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)。
在一些實施例中，核苷酸類似物包含經修飾之鹼基，諸如但不限於5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N, N, -二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2丙基鳥嘌呤、2-胺基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷及在5位置處具有修飾之其他核苷酸、5- (2-胺基)丙基尿苷、5-鹵胞苷、5-鹵尿苷、4-乙醯基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2, 2-二甲基鳥苷、5-甲基胺乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、去氮核苷酸(諸如7-去氮-腺苷、6-偶氮基尿苷、6-偶氮基胞苷、6-偶氮基胸苷)、5-甲基-2-硫代尿苷、其他硫基鹼基(諸如2-硫代尿苷及4-硫代尿苷及2-硫代胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、Q核苷、古嘌苷、萘基及經取代之萘基、任何O-烷基化嘌呤及嘧啶及N-烷基化嘌呤及嘧啶(諸如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮)、苯基及經改質之苯基(諸如胺基苯酚或2,4, 6-三甲氧基苯)、充當G形夾核苷酸之經修飾之胞嘧啶、8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-經取代之尿嘧啶及胸嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基胺基烷基核苷酸及烷基羰基烷基化核苷酸。經修飾之核苷酸亦包括關於糖部分經修飾之彼等核苷酸以及具有糖或其非核糖基之類似物之核苷酸。舉例而言，在一些情況下，糖部分為或基於甘露糖、阿拉伯糖、哌喃葡萄糖、哌喃半乳糖、4'-硫基核糖及其他糖、雜環或碳環。術語核苷酸亦包括在此項技術中稱為通用鹼基之核苷酸。作為舉例，通用鹼基包括但不限於3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素(nebularine)。
在一些實施例中，核苷酸類似物進一步包含N-嗎啉基、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯、1', 5'-無水己糖醇核酸(HNA)或其組合。N-嗎啉基或二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物(PMO)包含合成分子，該等合成分子之結構藉由偏離正常糖及磷酸酯結構而模擬天然核酸結構。在一些情況下，五員核糖環經含有四個碳、一個氮及一個氧之六員N-嗎啉基環取代。在一些情況下，核糖單體係藉由二胺基磷酸酯基而非磷酸酯基連接。在該等情況下，主鏈更改移除使N-嗎啉基中性分子能夠穿過細胞膜而不輔助諸如由帶電寡核苷酸使用之細胞遞送劑之細胞遞送劑的所有正電荷及負電荷。
Figure 02_image011
在一些實施例中，肽核酸(PNA)不含有糖環或磷酸酯鍵，且鹼基經連接且適當地藉由寡甘胺酸樣分子間隔，因此消除主鏈電荷。
Figure 02_image013
在一些實施例中，一或多種修飾視情況發生在核苷酸間鍵處。在一些情況下，經修飾之核苷酸間鍵包括但不限於硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、5'-伸烷基膦酸酯、5'-甲基膦酸酯、3'-伸烷基膦酸酯、三氟化硼、具有3'-5'鍵或2'-5'鍵之硼烷磷酸酯及硒磷酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯、氫膦酸酯鍵、膦酸烷酯、烷基硫代膦酸酯、芳基硫代膦酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯、3'-烷基胺基磷酸酯、胺基烷基胺基磷酸酯、硫羰基胺基磷酸酯、哌嗪磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、酮、碸、磺醯胺、碳酸酯、胺基甲酸酯、亞甲基伸肼基化物、亞甲基二甲基伸肼基化物、甲縮醛、硫代甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基化物、亞甲基甲基亞胺基化物、硫代醯胺、具有核乙醯基之鍵、胺乙基甘胺酸、矽烷基或矽氧烷鍵、具有或不具有例如1至10個碳雜原子之飽和或不飽和及/或經取代及/或含有雜原子之烷基或環烷基鍵、具有N-嗎啉基結構之鍵、醯胺、聚醯胺(其中鹼基直接地或間接地連接至主鏈之氮雜氮)及其組合。硫代磷酸酯反義寡核苷酸(PS ASO)為包含硫代磷酸酯鍵之反義寡核苷酸。下文說明例示性PS ASO。
Figure 02_image015
在一些情況下，修飾為諸如甲基膦酸酯或硫醇膦酸酯修飾之甲基或硫醇修飾。下文說明例示性硫醇膦酸酯核苷酸(左側)及甲基膦酸酯核苷酸(右側)。
Figure 02_image017
在一些情況下，經修飾之核苷酸包括但不限於說明為以下之2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯：
Figure 02_image019
在一些情況下，經修飾之核苷酸包括但不限於說明為以下之己糖醇核酸(或1', 5'-無水己糖醇核酸(HNA))：
Figure 02_image021
在一些實施例中，上文所描述之核苷酸類似物或人工核苷酸鹼基包含具有核糖部分之5'羥基處之修飾之經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸核酸。在一些實施例中，經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸係選自下文所提供之核苷酸，其中X為O或S；且B為雜環鹼基部分。
Figure 02_image023
。
在一些情況下，2'羥基處之修飾為2'-O-胺丙基修飾，其中包含丙基連接子之經延伸之胺基結合胺基與2'氧。在一些情況下，此修飾藉由每個糖引入來自胺基之一個正電荷來中和寡核苷酸分子之磷酸酯衍生之總體負電荷且由此改善歸因於其兩性離子特性之細胞吸收特性。
在一些情況下，經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸在經鎖定或橋聯之核糖修飾(例如經鎖定之核酸或LNA)中之2'羥基處進一步經修飾，其中在2'碳處結合之氧分子藉由亞甲基連接至4'碳，因此形成2'-C,4'-C-氧基-亞甲基連接之雙環核糖核苷酸單體。下文說明經5'-乙烯基膦酸酯修飾之LNA之化學結構之例示性圖示，其中X為O或S；B為雜環鹼基部分；且J為連接至聚核苷酸之相鄰核苷酸之核苷酸間連接基團。
Figure 02_image025
LNA (經鎖定之核酸)
在一些實施例中，2'羥基處之額外修飾包括2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)。
在一些實施例中，核苷酸類似物包含經修飾之鹼基，諸如但不限於5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N, N, -二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2丙基鳥嘌呤、2-胺基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷及在5位置處具有修飾之其他核苷酸、5-(2-胺基)丙基尿苷、5-鹵胞苷、5-鹵尿苷、4-乙醯基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2, 2-二甲基鳥苷、5-甲基胺乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、去氮核苷酸(諸如：7-去氮-腺苷、6-偶氮基尿苷、6-偶氮基胞苷或6-偶氮基胸苷)、5-甲基-2-硫代尿苷、其他硫代鹼基(諸如2-硫代尿苷、4-硫代尿苷及2-硫代胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、Q核苷、古嘌苷(archaeosine)、萘基及經取代之萘基、任何O-及N-烷基化嘌呤與嘧啶(諸如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮或吡啶-2-酮)、苯基及經修飾之苯基(諸如胺基苯酚或2,4, 6-三甲氧基苯)、可作為G形夾(G-clamp)核苷酸之經修飾之胞嘧啶、8-經取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-經取代之尿嘧啶及胸嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基胺基烷基核苷酸，及烷基羰基烷基化核苷酸。經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸亦包括彼等關於糖部分經修飾之核苷酸，及具有糖或其非核糖基之類似物之經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸。舉例而言，在一些情況下，糖部分為或基於甘露糖、阿拉伯糖、哌喃葡萄糖、哌喃半乳糖、4'-硫基核糖及其他糖類、雜環或碳環。術語核苷酸亦包括在此項技術中稱為通用鹼基之核苷酸。例如，通用鹼基包括但不限於3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素(nebularine)。
在一些實施例中，經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸類似物進一步包含N-嗎啉基、肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-亞胺基磷酸酯或1', 5'-脫水己糖醇核酸(HNA)。N-嗎啉基或二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物(PMO)包含合成分子，該等合成分子之結構模擬天然核酸結構，但與正常糖及磷酸酯結構出現偏差。在一些情況下，五員核糖環係經含有四個碳、一個氮及一個氧之六員N-嗎啉基環取代。在一些情況下，核糖單體係藉由二胺基磷酸酯基而非磷酸酯基連接。在該等情況下，主鏈更改移除使N-嗎啉基中性分子能夠穿過細胞膜而不輔助諸如由帶電寡核苷酸使用之細胞遞送劑之細胞遞送劑的所有正電荷及負電荷。下文說明經5'-乙烯基膦酸酯修飾之N-嗎啉基寡核苷酸之非限制性實例，其中X為O或S；且B為雜環鹼基部分。
Figure 02_image027
在一些實施例中，上文所描述之經5'-乙烯基膦酸酯修飾之N-嗎啉基或PMO為包含正電荷或陽離子電荷之PMO。在一些情況下，PMO為PMO加 (Sarepta)。PMO加 係指包含任何數目之(1-哌嗪基)氧亞膦基氧鍵、(1-(4-(ω-胍基-烷醯基))-哌嗪基)氧亞膦基氧鍵之二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物(例如如PCT公開案第WO2008/036127號中所描述之二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物)。在一些情況下，PMO為美國專利第7943762號中所描述之PMO。
在一些實施例中，上文所描述之N-嗎啉基或PMO為PMO-X (Sarepta)。在一些情況下，PMO-X係指包含至少一個鍵或所揭示之末端修飾中之至少一種之二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物，諸如PCT公開案第WO2011/150408號及美國公開案第2012/0065169號中所揭示之二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物。
在一些實施例中，上文所描述之N-嗎啉基或PMO為如美國公開案第2014/0296321號之表5中所描述之PMO。
下文說明經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核酸之化學結構之例示性圖示，其中X為O或S；B為雜環鹼基部分；且J為核苷酸間鍵。
Figure 02_image029
在一些實施例中，肽核酸(PNA)不含有糖環或磷酸酯鍵，且鹼基經連接且適當地藉由寡甘胺酸樣分子間隔，因此消除主鏈電荷。
Figure 02_image013
在一些實施例中，經5'-乙烯基膦酸酯修飾之寡核苷酸之一或多種修飾視情況發生在核苷酸間鍵處。在一些情況下，經修飾之核苷酸間鍵包括但不限於硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；甲基膦酸酯；5'-伸烷基膦酸酯；5'-甲基膦酸酯；3'-伸烷基膦酸酯；三氟化硼；具有3'-5'鍵或2'-5'鍵之硼烷磷酸酯及硒磷酸酯；磷酸三酯；硫羰基烷基磷酸三酯；氫膦酸酯鍵；膦酸烷酯；烷基硫代膦酸酯；芳基硫代膦酸酯；硒代磷酸酯；二硒代磷酸酯；亞膦酸酯；胺基磷酸酯；3'-烷基胺基磷酸酯；胺基烷基胺基磷酸酯；硫羰基胺基磷酸酯；哌嗪磷酸酯；苯胺硫代磷酸酯；苯胺磷酸酯；酮；碸；磺醯胺；碳酸酯；胺基甲酸酯；亞甲基伸肼基化物；亞甲基二甲基伸肼基化物；甲縮醛；硫代甲縮醛；肟；亞甲基亞胺基化物；亞甲基甲基亞胺基化物；硫代醯胺；具有核乙醯基之鍵；胺乙基甘胺酸；矽烷基或矽氧烷鍵；具有或不具有例如1至10個碳雜原子之飽和或不飽和及/或經取代及/或含有雜原子之烷基或環烷基鍵；具有N-嗎啉基結構之鍵；醯胺或聚醯胺(其中鹼基直接地或間接地連接至主鏈之氮雜氮)；及其組合。
在一些情況下，修飾為諸如甲基膦酸酯或硫醇膦酸酯修飾之甲基或硫醇修飾。下文說明例示性硫醇膦酸酯核苷酸(左側)、二硫代磷酸酯(中心)及甲基膦酸酯核苷酸(右側)。
Figure 02_image032
在一些情況下，經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸包括但不限於說明為以下之胺基磷酸酯：
Figure 02_image034
。
在一些情況下，經修飾之核苷酸間鍵為二胺基磷酸酯鍵。下文顯示具有N-嗎啉基系統之二胺基磷酸酯鍵之非限制性實例。
Figure 02_image036
在一些情況下，經修飾之核苷酸間鍵為甲基膦酸酯鍵。下文顯示甲基膦酸酯鍵之非限制性實例。
Figure 02_image038
在一些情況下，經修飾之核苷酸間鍵為醯胺鍵。下文顯示醯胺鍵之非限制性實例。
Figure 02_image040
在一些情況下，經5'-乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸包括但不限於下文所說明之經修飾之核酸。
在一些實施例中，一或多種修飾包含經修飾之磷酸酯主鏈，其中該修飾生成中性或不帶電主鏈。在一些情況下，藉由烷基化修飾磷酸酯主鏈以生成不帶電或中性磷酸酯主鏈。如本文所使用，烷基化包括甲基化、乙基化及丙基化。在一些情況下，如本文在烷基化情形下所使用之烷基係指含有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈飽和烴基。在一些情況下，例示性烷基包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、1, 1 -二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3.3-二甲基丁基及2-乙基丁基。在一些情況下，經修飾之磷酸酯為如美國專利第9481905號中所描述之磷酸酯基。
在一些實施例中，額外經修飾之磷酸酯主鏈包含甲基膦酸酯、乙基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯或甲氧基膦酸酯。在一些情況下，經修飾之磷酸酯為甲基膦酸酯。在一些情況下，經修飾之磷酸酯為乙基膦酸酯。在一些情況下，經修飾之磷酸酯為甲基硫代膦酸酯。在一些情況下，經修飾之磷酸酯為甲氧基膦酸酯。
在一些實施例中，一或多種修飾進一步視情況包括核糖部分、磷酸酯主鏈及核苷修飾或3'端或5'端處之核苷酸類似物修飾。舉例而言，3'端視情況包括3'陽離子基團，或藉由用3'-3'鍵使3'端處之核苷反轉。在另一替代方案中，3'端視情況與例如3' C5-胺基烷基dT之胺基烷基結合。在額外替代方案中，3'端視情況與無鹼基位點結合，例如與無嘌呤核酸或無嘧啶核酸位點結合。在一些情況下，5'端與例如5'-O-烷胺基取代基之胺基烷基結合。在一些情況下，5'端與無鹼基位點結合，例如與無嘌呤核酸或無嘧啶核酸位點結合。
在一些實施例中，聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物中之一或多種。在一些情況下，聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。在一些實施例中，人工核苷酸類似物包括經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合。在一些情況下，聚核酸分子包含選自以下之人工核苷酸類似物中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種：經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合。在一些情況下，聚核酸分子包含經2'-O-甲基修飾之核苷酸中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。在一些情況下，聚核酸分子包含經2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾之核苷酸中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。在一些情況下，聚核酸分子包含硫醇膦酸酯核苷酸中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25種或更多種。
在一些實施例中，聚核酸分子包含複數種二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物或複數種經肽核酸修飾之非天然核苷酸，且視情況包含至少一種反轉無鹼基部分。在一些情況下，聚核酸分子包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個經二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物修飾之非天然核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子包含100%經二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物修飾之非天然核苷酸。
在一些情況下，聚核酸分子包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種或更多種經肽核酸修飾之非天然核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子包含100%經肽核酸修飾之非天然核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含一或多種核苷酸類似物，其中各核苷酸類似物呈立體化學異構形式。在該情況下，聚核酸分子為手性分子。在一些情況下，核苷酸類似物包含主鏈立體化學。在額外情況下，核苷酸類似物包含如美國專利9,982,257、9,695,211或9,605,019中所描述之手性類似物。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約5%至約100%修飾、約10%至約100%修飾、約20%至約100%修飾、約30%至約100%修飾、約40%至約100%修飾、約50%至約100%修飾、約60%至約100%修飾、約70%至約100%修飾、約80%至約100%修飾及約90%至約100%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約90%修飾、約20%至約90%修飾、約30%至約90%修飾、約40%至約90%修飾、約50%至約90%修飾、約60%至約90%修飾、約70%至約90%修飾及約80%至約100%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約80%修飾、約20%至約80%修飾、約30%至約80%修飾、約40%至約80%修飾、約50%至約80%修飾、約60%至約80%修飾及約70%至約80%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約70%修飾、約20%至約70%修飾、約30%至約70%修飾、約40%至約70%修飾、約50%至約70%修飾及約60%至約70%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約60%修飾、約20%至約60%修飾、約30%至約60%修飾、約40%至約60%修飾及約50%至約60%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約50%修飾、約20%至約50%修飾、約30%至約50%修飾及約40%至約50%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約40%修飾、約20%至約40%修飾及約30%至約40%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含以下中之至少一者：約10%至約30%修飾及約20%至約30%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含約10%至約20%修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含約15%至約90%、約20%至約80%、約30%至約70%或約40%至約60%修飾。
在額外情況下，聚核酸分子包含至少約15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22種或更多種修飾。
在一些情況下，聚核酸分子包含至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22種或更多種經修飾之核苷酸。
在一些情況下，約5%至約100%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約5%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約10%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約15%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約20%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約25%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約30%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約35%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約40%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約45%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約50%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約55%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約60%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約65%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約70%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約75%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約80%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約85%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約90%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約95%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約96%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約97%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約98%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約99%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些情況下，約100%聚核酸分子包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，人工核苷酸類似物包括經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)；LNA、ENA、PNA、HNA、N-嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合。
在一些實施例中，聚核酸分子包含約1至約25種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約1種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約2種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約3種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約4種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約5種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約6種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約7種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約8種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約9種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約10種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約11種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約12種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約13種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約14種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約15種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約16種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約17種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約18種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約19種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約20種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約21種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約22種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約23種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約24種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。在一些實施例中，聚核酸分子包含約25種修飾，其中修飾包含本文所描述之人工核苷酸類似物。
在一些實施例中，聚核酸分子係由兩個獨立多核苷酸裝配，其中一個聚核苷酸包含聚核酸分子之有義股且第二個聚核苷酸包含聚核酸分子之反義股。在其他實施例中，有義股經由連接子分子連接至反義股，該連接子分子在一些情況下為聚核苷酸連接子或非核苷酸連接子。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股中之嘧啶核苷酸包含2'-O-甲基嘧啶核苷酸且有義股中之嘌呤核苷酸包含2'-去氧嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股中所存在之嘧啶核苷酸包含2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且其中有義股中所存在之嘌呤核苷酸包含2'-去氧嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中嘧啶核苷酸在存在於該反義股中時為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且嘌呤核苷酸在存在於該反義股中時為2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中嘧啶核苷酸在存在於該反義股中時為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且其中嘌呤核苷酸在存在於該反義股中時包含2'-去氧-嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股包括有義股之5'端、3'端或5'端及3'端兩者處之封端部分。在其他實施例中，封端部分為反轉去氧無鹼基部分。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中反義股包含反義股之3'端處之磷酸酯主鏈修飾。在一些情況下，磷酸酯主鏈修飾為硫代磷酸酯。在一些情況下，隨從股包含比引導股更多之硫代磷酸酯修飾。在其他情況下，引導股包含比隨從股更多之硫代磷酸酯修飾。在額外情況下，隨從股包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個硫代磷酸酯修飾。在額外情況下，引導股包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個硫代磷酸酯修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中反義股包含反義股之3'端處之甘油基修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股包含一或多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或約一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子；且其中反義股包含約1至約10個或更多個，具體言之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子化學修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中有義股包含約1至約25個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或約一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子；且其中反義股包含約1至約25個或更多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經約1至約25個或更多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子化學修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中反義股包含一或多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或約一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子；且其中反義股包含約1至約10個或更多個，具體言之約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經一或多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子化學修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子包含有義股及反義股，其中反義股包含約1至約25個或更多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之有義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子；且其中反義股包含約1至約25個或更多個，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個) 2'-去氧、2'-O-甲基、2'-去氧-2'-氟，及/或一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)經通用鹼基修飾之核苷酸，及視情況選用之反義股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子。在其他實施例中，一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個)有義股及/或反義股之嘧啶核苷酸經2'-去氧、2'-O-甲基及/或2'-去氧-2'-氟核苷酸化學修飾，經或不經約1至約5個(例如約1、2、3、4、5個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵及/或相同股或不同股中所存在之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端分子化學修飾。
在一些實施例中，聚核酸分子為具有以下特性中之一或多者之雙螺旋體聚核酸分子：較大肝細胞穩定性、經減小之總體電荷、經減少之肝細胞吸收或經延伸之藥物動力學。在一些實施例中，雙螺旋體聚核酸分子包含有包含複數種修飾之隨從股(例如有義股)及引導股(例如反義股)。
在一些實施例中，雙螺旋體聚核酸分子包含具有上文所描述之修飾中之一或多者之引導股(例如反義股)及具有複數種二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物或複數種經肽核酸修飾之非天然核苷酸之隨從股(例如有義股)。
在一些實施例中，本文所描述之聚核酸分子為在聚核酸分子之各股中具有約1至約25個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵之經化學修飾之短干擾核酸分子。
在另一實施例中，本文所描述之聚核酸分子包含2'-5'核苷酸間鍵。在一些情況下，2'-5'核苷酸間鍵係處於一或兩個序列股之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處。在額外情況下，2'-5'核苷酸間鍵存在於一或兩個序列股內之各種其他位置處，例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個，包括聚核酸分子之一或兩個股中之嘧啶核苷酸之每一核苷酸間鍵，包含2'-5'核苷酸間鍵；或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個，包括聚核酸分子之一或兩個股中之嘌呤核苷酸之每一核苷酸間鍵，包含2'-5'核苷酸間鍵。
在一些情況下，聚核酸分子為具有自補有義區及反義區之具有雙螺旋體、不對稱雙螺旋體、髮夾或不對稱髮夾二級結構之聚核苷酸，其中反義區包含與獨立目標核酸分子或其部分及具有對應於該目標核酸序列或其部分之核苷酸序列之有義區中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。在其他情況下，聚核酸分子為具有兩個或更多個環結構及包含自補有義區及反義區之主幹之圓形單股聚核苷酸，其中反義區包含與目標核酸分子或其部分及具有對應於該目標核酸序列或其部分之核苷酸序列之有義區中的核苷酸序列互補的核苷酸序列，且其中對圓形聚核苷酸進行活體內或活體外加工以生成能夠調節RNAi的活性聚核酸分子。在額外情況下，聚核酸分子亦包含具有與目標核酸分子或其部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列的單股聚核苷酸(例如在該聚核酸分子不需要在聚核酸分子內存在對應於目標核酸序列或其部分之核苷酸序列的情況下)，其中單股聚核苷酸進一步包含末端磷酸酯基，諸如5'-磷酸酯(參見例如Martinez等人, 2002,Cell ., 110, 563-574及Schwarz等人, 2002,Molecular Cell , 10, 537-568)或5',3'-二磷酸酯。
在一些實施例中，聚核酸分子為介導細胞或經復原活體外系統中之RNAi活性之單股聚核酸分子，其中聚核酸分子包含與目標核酸序列具有互補性之單股聚核苷酸，且其中聚核酸中所存在之一或多個嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸(例如其中所有嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸，或交替地，複數個嘧啶核苷酸為2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸)，且其中聚核酸中所存在之任何嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸(例如其中所有嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸，或交替地，複數個嘌呤核苷酸為2'-去氧嘌呤核苷酸)；及視情況存在於反義序列之3'端、5'端或3'端及5'端兩者處之封端修飾，聚核酸分子在聚核酸分子之3'端處視情況進一步包含約1至約4個(例如約1、2、3或4個)末端2'-去氧核苷酸，其中末端核苷酸進一步包含一或多個(例如1、2、3或4個)硫代磷酸酯核苷酸間鍵，且其中聚核酸分子視情況進一步包含諸如5'-末端磷酸酯基的末端磷酸酯基。
在一些情況下，不對稱雙螺旋體為包含反義區、包含核苷酸或非核苷酸之環部分及包含比反義區少之核苷酸之有義區的線性聚核酸分子，有義區包含核苷酸達至一定程度以至有義區具有與反義區足夠互補之核苷酸與鹼基對且形成具有環之雙螺旋體。舉例而言，不對稱髮夾聚核酸分子包含具有足以介導細胞或活體外系統中之RNAi之長度(例如約19至約22個核苷酸)之反義區及包含約4至約8個核苷酸之環區以及具有與反義區互補之約3至約18個核苷酸之有義區。在一些情況下，不對稱髮夾聚核酸分子亦包含經化學修飾之5'端磷酸酯基。在額外情況下，不對稱髮夾聚核酸分子之環部分包含核苷酸、非核苷酸、連接子分子或結合物分子。
在一些實施例中，不對稱雙螺旋體為具有包含有義區及反義區之兩個獨立股之聚核酸分子，其中有義區包含比反義區少之核苷酸，有義區包含核苷酸達至一定程度以至有義區具有與反義區足夠互補之核苷酸與鹼基對且形成雙螺旋體。舉例而言，不對稱雙螺旋體聚核酸分子包含具有足以介導細胞或活體外系統中之RNAi之長度(例如約19至約22個核苷酸)之反義區及具有與反義區互補之約3至約18個核苷酸之有義區。
在一些情況下，當與天然聚核酸分子相比時，本文所描述之人工核苷酸類似物中之一或多者對核酸酶具有抗性，該等核酸酶諸如核糖核酸酶(諸如RNA酶H)、去氧核糖核酸酶(諸如DNA酶)或核酸外切酶(諸如5'-3'核酸外切酶及3'-5'核酸外切酶)。在一些情況下，包含經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)、LNA、ENA、PNA、HNA、N-嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯或其組合之人工核苷酸類似物對核酸酶具有抗性，該等核酸酶諸如核糖核酸酶(諸如RNA酶H)、去氧核糖核酸酶(諸如DNA酶)或核酸外切酶(諸如5'-3'核酸外切酶及3'-5'核酸外切酶)。在一些情況下，經2'-O-甲基修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-胺丙基修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-去氧修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經T-去氧-2'-氟修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-胺丙基(2'-O-AP)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經LNA修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經ENA修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經HNA修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，N-嗎啉基具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經PNA修飾之聚核酸分子對核酸酶具有抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經甲基膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，經硫醇膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，包含2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯之聚核酸分子具核酸酶抗性(例如RNA酶H、DNA酶、5'-3'核酸外切酶或3'-5'核酸外切酶抗性)。在一些情況下，本文所描述之5'結合物抑制5'-3'核酸外切裂解。在一些情況下，本文所描述之3'結合物抑制3'-5'核酸外切裂解。
在一些實施例中，相對於等效天然聚核酸分子而言，本文所描述之人工核苷酸類似物中之一或多者對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。相對於等效天然聚核酸分子而言，包含經修飾之2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)、LNA、ENA、PNA、HNA、N-嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸或2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯之人工核苷酸類似物中之一或多者對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-甲基修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-胺丙基修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-去氧修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經T-去氧-2'-氟修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-胺丙基(2'-O-AP)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經LNA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經ENA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經PNA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經HNA修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經N-嗎啉基修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經甲基膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，經硫醇膦酸酯核苷酸修飾之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，相對於等效天然聚核酸分子而言，包含2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯之聚核酸分子對其mRNA目標具有經增加之結合親和力。在一些情況下，經增加之親和力係以較低Kd、較高熔化溫度(Tm)或其組合說明。
在一些實施例中，本文所描述之聚核酸分子為手性純(或立體純)聚核酸分子或包含單一對映異構體之聚核酸分子。在一些情況下，聚核酸分子包含L-核苷酸。在一些情況下，聚核酸分子包含D-核苷酸。在某種情況下，聚核酸分子組合物包含少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%或更少其鏡對映異構體。在一些情況下，聚核酸分子組合物包含少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%或更少外消旋混合物。在一些情況下，聚核酸分子為以下中所描述之聚核酸分子：美國專利公開案第2014/194610號及第2015/211006號；及PCT公開案第WO2015107425號。
在一些實施例中，本文所描述之聚核酸分子經進一步修飾以包括適體結合部分。在一些情況下，適體結合部分為DNA適體結合部分。在一些情況下，適體結合部分為阿法默(Alphamer) (Centauri Therapeutics)，其包含辨識特定細胞表面目標之適體部分及呈現特定抗原決定基以連接至循環抗體之部分。在某種情況下，本文所描述之聚核酸分子經進一步修飾以包括如以下中所描述之適體結合部分：美國專利第8,604,184號、第8,591,910號及第7,850,975號。
在額外實施例中，本文所描述之聚核酸分子經修飾以提高其穩定性。在一些實施例中，聚核酸分子為RNA (例如siRNA)。在一些情況下，藉由上文所描述之修飾中之一或多者對聚核酸分子進行修飾以提高其穩定性。在一些情況下，聚核酸分子在2'羥基位置處經修飾，此係諸如藉由2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-胺丙基、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾或藉由經鎖定或橋聯之核糖構形(例如LNA或ENA)進行。在一些情況下，聚核酸分子經2'-O-甲基及/或2'-O-甲氧基乙基核糖修飾。在一些情況下，聚核酸分子亦包括N-嗎啉基、PNA、HNA、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及/或2'-氟N3-P5'-胺基磷酸酯以提高其穩定性。在一些情況下，聚核酸分子為手性純(或立體純)聚核酸分子。在一些情況下，手性純(或立體純)聚核酸分子經修飾以提高其穩定性。用以提高穩定性以進行遞送之針對RNA之合適修飾為熟習此項技術者顯而易知。
在一些情況下，通用鹼基係指用其間幾乎無區別之天然DNA/RNA鹼基中之各者形成鹼基對之核苷酸鹼基類似物。通用鹼基之非限制性實例包括如此項技術中已知之C-苯基、C-萘基及其他芳族衍生物、肌苷、唑甲醯胺及諸如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚及6-硝基吲哚之硝基唑衍生物(參見例如Loakes, 2001,Nucleic Acids Research , 29, 2437-2447)。小分子、蛋白質及肽
在一些實施例中，有效負載物為小分子。在一些情況下，小分子為細胞毒性有效負載物。例示性細胞毒性有效負載物包括但不限於微管破壞劑、DNA修飾劑或Akt抑制劑。
在一些實施例中，有效負載物包含微管破壞劑。例示性微管破壞劑包括但不限於2-甲氧基雌二醇、奧瑞他汀、查耳酮(chalcone)、秋水仙鹼、考布他汀(combretastatin)、念珠藻素、迪科他汀(dictyostatin)、迪斯德莫來(discodermolide)、多拉他汀(dolastain)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、埃坡黴素(epothilone)、軟海綿素(halichondrin)、絡厘麥萊蒂(laulimalide)、美登素、類諾斯卡品(noscapinoid)、太平洋紫杉醇、派羅苷(peloruside)、擬莖點黴毒素(phomopsin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、根瘤菌素、海綿抑制素、紫杉烷、妥布賴森(tubulysin)、長春花生物鹼、長春瑞濱(vinorelbine)或其衍生物或類似物。
在一些實施例中，妥布賴森為諸如美國專利第8580820號及第8980833號以及美國公開案第20130217638號、第20130224228號及第201400363454號中所描述之妥布賴森類似物或衍生物。
在一些實施例中，美登素為類美登素。在一些實施例中，類美登素為DM1、DM4或安絲菌素(ansamitocin)。在一些實施例中，類美登素為DM1。在一些實施例中，類美登素為DM4。在一些實施例中，類美登素為安絲菌素。在一些實施例中，類美登素為諸如美國專利第5208020號、第5416064號、第7276497號及第6716821號或美國公開案第2013029900號及第US20130323268號中所描述之類美登素衍生物或類似物。
在一些實施例中，有效負載物為尾海兔素或其衍生物或類似物。在一些實施例中，尾海兔素為尾海兔素10或尾海兔素15或其衍生物或類似物。在一些實施例中，尾海兔素10類似物為奧瑞他汀、索波度素(soblidotin)、森泊他汀(symplostatin) 1或森泊他汀3。在一些實施例中，尾海兔素15類似物為西馬多丁(cemadotin)或他西多丁(tasidotin)。
在一些實施例中，尾海兔素10類似物為奧瑞他汀或奧瑞他汀衍生物。在一些實施例中，奧瑞他汀或奧瑞他汀衍生物為奧瑞他汀E (AE)、奧瑞他汀F (AF)、奧瑞他汀E5-苯甲醯基戊酸酯(AEVB)、單甲基奧瑞他汀E (MMAE)、單甲基奧瑞他汀F (MMAF)或單甲基奧瑞他汀D (MMAD)、奧瑞他汀PE或奧瑞他汀PYE。在一些實施例中，奧瑞他汀衍生物為單甲基奧瑞他汀E (MMAE)。在一些實施例中，奧瑞他汀衍生物為單甲基奧瑞他汀F (MMAF)。在一些實施例中，奧瑞他汀為諸如美國專利第6884869號、第7659241號、第7498298號、第7964566號、第7750116號、第8288352號、第8703714號及第8871720號中所描述之奧瑞他汀衍生物或類似物。
在一些實施例中，有效負載物包含DNA修飾劑。在一些實施例中，DNA修飾劑包含DNA裂解劑、DNA嵌入劑、DNA轉錄抑制劑或DNA交聯劑。在一些情況下，DNA裂解劑包含博萊黴素(bleomycine) A2、卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物或類似物。在一些情況下，DNA嵌入劑包含小紅莓、表阿黴素(epirubicin)、PNU-159682、倍癌黴素(duocarmycin)、吡咯并苯并二氮呯、寡黴素C、道諾黴素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)、拓朴替康(topotecan)或其衍生物或類似物。在一些情況下，DNA轉錄抑制劑包含放線菌素D。在一些情況下，DNA交聯劑包含絲裂黴素C。
在一些實施例中，DNA修飾劑包含安吖啶、蒽環黴素、喜樹鹼、小紅莓、倍癌黴素、烯二炔、依託泊苷(etoposide)、吲哚啉并苯并二氮呯、紡錘菌素、替尼泊苷(teniposide)或其衍生物或類似物。
在一些實施例中，蒽環黴素為小紅莓、道諾黴素、表阿黴素、艾達黴素、絲裂黴素-C、放線菌素D、光神黴素、奈莫柔比星(nemorubicin)、匹蒽醌、薩巴比星(sabarubicin)或戊柔比星。
在一些實施例中，喜樹鹼類似物為拓朴替康、伊立替康(irinotecan)、司拉替康(silatecan)、蔻西替康(cositecan)、依昔替康(exatecan)、勒托替康(lurtotecan)、吉馬替康(gimatecan)、貝洛替康(belotecan)、盧比替康(rubitecan)或SN-38。
在一些實施例中，倍癌黴素為倍癌黴素A、倍癌黴素B1、倍癌黴素B2、倍癌黴素C1、倍癌黴素C2、倍癌黴素D、倍癌黴素SA或CC-1065。在一些實施例中，烯二炔為卡奇黴素、埃斯培拉黴素(esperamicin)或達內黴素(dynemicin) A。
在一些實施例中，吡咯并苯并二氮呯為安麯黴素(anthramycin)、赤黴素、芝加黴素(chicamycin)、DC-81、混胺茴黴素、新茴黴素A、新茴黴素B、坡咯黴素(porothramycin)、普咯黴素(prothracarcin)、西巴黴素(sibanomicin) (DC-102)、西伯利亞黴素(sibiromycin)或富山黴素(tomaymycin)。在一些實施例中，吡咯并苯并二氮呯為諸如美國專利第8404678號及第8163736號中所描述之富山黴素衍生物。在一些實施例中，吡咯并苯并二氮呯係諸如美國專利第8426402號、第8802667號、第8809320號、第6562806號、第6608192號、第7704924號、第7067511號、第US7612062號、第7244724號、第7528126號、第7049311號、第8633185號、第8501934號及第8697688號以及美國公開案第US20140294868號中所描述。
在一些實施例中，吡咯并苯并二氮呯為吡咯并苯并二氮呯二聚體。在一些實施例中，PBD二聚體為對稱二聚體。對稱PBD二聚體之實例包括但不限於SJG-136 (SG-2000)、ZC-423 (SG2285)、SJG-720、SJG-738、ZC-207 (SG2202)及DSB-120 (表2)。在一些實施例中，PBD二聚體為不對稱二聚體。不對稱PBD二聚體之實例包括但不限於諸如美國專利第8697688號及第9242013號以及美國公開案第20140286970號中所描述之SJG-136衍生物。
在一些實施例中，有效負載物包含Akt抑制劑。在一些情況下，Akt抑制劑包含伊巴替布(ipatasertib) (GDC-0068)或其衍生物。
在一些實施例中，有效負載物包含聚合酶抑制劑，其包括但不限於諸如a-瓢菌素之聚合酶II抑制劑及聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑。例示性PARP抑制劑包括但不限於依尼帕瑞(Iniparib) (BSI 201)、拉唑帕尼(Talazoparib) (BMN-673)、奧拉帕尼(Olaparib) (AZD-2281)、奧拉帕尼、蘆卡帕尼(Rucaparib) (AG014699、PF-01367338)、維利帕尼(Veliparib) (ABT-888)、CEP 9722、MK 4827、BGB-290或3-胺基苯甲醯胺。
在一些實施例中，有效負載物為顯影劑。在一些情況下，有效負載物包含例如使用x射線視覺化之標籤之「不透射線」標籤。不透射線材料已為熟習此項技術者熟知。例示性不透射線材料包括碘化鹽、溴化鹽或鋇鹽。額外不透射線材料包括但不限於有機鉍衍生物(參見例如美國專利5,939,045)、不透射線聚胺基甲酸酯(參見例如美國專利5,346,981)、有機鉍複合物(參見例如美國專利5,256,334)、不透射線鋇聚合物複合物(參見例如美國專利4,866,132)及其類似物。
在一些情況下，有效負載物包含例如用於免疫結合物中之可偵測標籤，該可偵測標籤包括可藉由光譜法、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段偵測之任何組合物。適用於免疫結合物中之標籤包括磁珠(例如DYNABEADS™)、螢光染料(例如螢光異硫氰酸鹽、德克薩斯紅(texas red)、若丹明(rhodamine)、綠色螢光蛋白及其類似物)、放射性標籤(例如3 H、125 I、35 S、14 C或32 P)、酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及常用於ELISA中之其他酶)及諸如膠態金或著色玻璃或塑膠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠粒、奈米粒子、量子點之比色標籤及其類似物。
在一些實施例中，合適放射性標籤包括但不限於99 Tc、203 Pb、67 Ga、68 Ga、72 As、111 In、113m In、97 Ru、62 Cu、64 Cu、52 Fe、52m Mn、51 Cr、186 Re、188 Re、77 As、90 Y、67 Cu、169 Er、121 Sn、127 Te、142 Pr、143 Pr、198 Au、199 Au、161 Tb、109 Pd、165 Dy、149 Pm、151 Pm、153 Sm、157 Gd、159 Gd、166 Ho、172 Tm、169 Yb、175 Yb、177 Lu、105 Rh及111 Ag。
在一些情況下，有效負載物包含增強電離輻射(例如可能由60 Co或x射線源產生)對細胞之細胞毒性作用之放射增敏劑。許多放射增敏劑為已知的且包括但不限於苯并卟啉衍生化合物(參見例如美國專利5,945,439)、1,2,4-苯并三嗪氧化物(參見例如美國專利5,849,738)、含特定二胺化合物(參見例如美國專利5,700,825)、BCNT (參見例如美國專利5,872,107)、放射增敏性硝基苯甲酸醯胺衍生物(參見例如美國專利4,474,814 )、各種雜環衍生物(參見例如美國專利5,064,849)、鉑錯合物(參見例如美國專利4,921,963)及其類似物。
在一些情況下，有效負載物包含α發射體，亦即發射α粒子之放射性同位素。最近，已顯示α-發射體有效地治療癌症(參見例如McDevitt等人(2001) Science 294: 1537-1540；Ballangrud等人(2001) Cancer Res. 61 : 2008-2014；Borchardt等人(2003) Cancer Res. 63: 5084-50)。合適α發射體包括但不限於213 Bi、211 At及其類似物。
在一些情況下，有效負載物包含免疫調節劑。有用免疫調節劑包括阻斷對腫瘤之激素作用之抗激素及遏制細胞介素產生、下調自身抗原表現或遮蓋MHC抗原之免疫抑制劑。代表性抗激素包括抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、拉洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑之芳香酶、4-羥基他莫昔芬、特洛西芬(thoxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、那普斯酮(onapnstone)及托瑞米芬(toremifene)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及抗腎上腺劑。說明性免疫抑制劑包括但不限於經2-胺基-6-芳基-5取代之嘧啶、硫唑嘌呤、環磷醯胺、溴隱定、達那唑、二胺苯碸、戊二醛、用於MHC抗原及MHC片段之抗遺傳型抗體、環孢素A、類固醇(諸如糖皮質類固醇)、鏈球菌激酶或雷帕黴素(rapamycin)。
在一些實施例中，有效負載物包含蛋白質或肽毒素或其片段。例示性酶活性毒素及其片段包括但不限於白喉毒素A片段、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A (來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、a-帚麴菌素(a-sacrin)、特定A油桐(leurites fordii)蛋白、特定康乃馨蛋白、洋商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAP、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Morodica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹素、米托潔林(mitogillin)、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。
在一些情況下，有效負載物為免疫調節劑。例示性免疫調節劑包括但不限於更昔洛韋(gancyclovier)、依那西普(etanercept)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、伏環孢素(voclosporin)、環孢靈(cyclosporine)、雷帕黴素、環磷醯胺、硫唑嘌呤、黴酚酸酯(mycophenolgate mofetil)、甲胺喋呤(methotrextrate)、糖皮質素及其類似物、黃嘌呤、幹細胞生長因子、淋巴毒素(lymphotoxin)、造血因子、腫瘤壞死因子(TNF) (例如TNFα)、介白素(例如介白素-1 (IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18及IL-21)、群落刺激因子(例如顆粒球群落刺激因子(G-CSF)及顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF))、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ)、命名為「S1因子」之幹細胞生長因子、紅血球生成素及血小板生成素或其組合。
在一些情況下，有效負載物包含細胞介素。在一些實施例中，細胞介素包含IL-2、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素(例如IFNα、IFNβ)或TNFα。聚合物
在一些實施例中，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物進一步包含聚合物(聚合物部分C)。在一些情況下，聚合物為由分支鏈或非分支鏈單體之長鏈及/或二維或三維單體之交聯網狀結構組成之天然或合成聚合物。在一些情況下，聚合物包括多醣、木質素、橡膠或聚環氧烴(例如聚乙二醇)。在一些情況下，至少一種聚合物包括但不限於α-二羥基聚乙二醇、ω-二羥基聚乙二醇、基於生物可降解內酯之聚合物(例如聚丙烯酸、聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸) (PGA)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚烯烴、聚醯胺、聚氰基丙烯酸酯、聚醯亞胺、聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylenterephthalat) (PET、PETG)、聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate) (PETE)、聚伸丁二醇(PTG)或聚胺基甲酸酯)以及其混合物。如本文所使用，混合物係指相同化合物內之不同聚合物之使用且參考嵌段共聚物。在一些情況下，嵌段共聚物為其中聚合物之至少一個部分由另一聚合物之單體建構之聚合物。在一些情況下，聚合物包含聚環氧烴。在一些情況下，聚合物包含PEG。在一些情況下，聚合物包含聚乙烯醯亞胺(PEI)或羥乙基澱粉(HES)。
在一些情況下，C為PEG部分。在一些情況下，PEG部分係在聚核酸分子之5'端處結合，而結合部分係在聚核酸分子之3'端處結合。在一些情況下，PEG部分係在聚核酸分子之3'端處結合，而結合部分係在聚核酸分子之5'端處結合。在一些情況下，PEG部分結合至聚核酸分子之內部位點。在一些情況下，PEG部分、結合部分或其組合結合至聚核酸分子之內部位點。在一些情況下，結合為直接結合。在一些情況下，結合係經由天然接合進行。
在一些實施例中，聚環氧烴(例如PEG)為多分散或單分散化合物。在一些情況下，多分散材料包含不同分子量之材料之分散分佈，其特徵在於平均重量(重量平均)尺寸及分散度。在一些情況下，單分散PEG包含一個尺寸之分子。在一些實施例中，C為聚分散或單分散聚環氧烴(例如PEG)且所指示之分子量代表例如PEG之聚環氧烴分子之分子量的平均值。
在一些實施例中，聚環氧烴(例如PEG)之分子量為約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000 Da。
在一些實施例中，C為聚環氧烴(例如PEG)且具有約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、 4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000 Da之分子量。在一些實施例中，C為PEG且具有約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、 4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000 Da之分子量。在一些情況下，C之分子量為約200 Da。在一些情況下，C之分子量為約300 Da。在一些情況下，C之分子量為約400 Da。在一些情況下，C之分子量為約500 Da。在一些情況下，C之分子量為約600 Da。在一些情況下，C之分子量為約700 Da。在一些情況下，C之分子量為約800 Da。在一些情況下，C之分子量為約900 Da。在一些情況下，C之分子量為約1000 Da。在一些情況下，C之分子量為約1100 Da。在一些情況下，C之分子量為約1200 Da。在一些情況下，C之分子量為約1300 Da。在一些情況下，C之分子量為約1400 Da。在一些情況下，C之分子量為約1450 Da。在一些情況下，C之分子量為約1500 Da。在一些情況下，C之分子量為約1600 Da。在一些情況下，C之分子量為約1700 Da。在一些情況下，C之分子量為約1800 Da。在一些情況下，C之分子量為約1900 Da。在一些情況下，C之分子量為約2000 Da。在一些情況下，C之分子量為約2100 Da。在一些情況下，C之分子量為約2200 Da。在一些情況下，C之分子量為約2300 Da。在一些情況下，C之分子量為約2400 Da。在一些情況下，C之分子量為約2500 Da。在一些情況下，C之分子量為約2600 Da。在一些情況下，C之分子量為約2700 Da。在一些情況下，C之分子量為約2800 Da。在一些情況下，C之分子量為約2900 Da。在一些情況下，C之分子量為約3000 Da。在一些情況下，C之分子量為約3250 Da。在一些情況下，C之分子量為約3350 Da。在一些情況下，C之分子量為約3500 Da。在一些情況下，C之分子量為約3750 Da。在一些情況下，C之分子量為約4000 Da。在一些情況下，C之分子量為約4250 Da。在一些情況下，C之分子量為約4500 Da。在一些情況下，C之分子量為約4600 Da。在一些情況下，C之分子量為約4750 Da。在一些情況下，C之分子量為約5000 Da。在一些情況下，C之分子量為約5500 Da。在一些情況下，C之分子量為約6000 Da。在一些情況下，C之分子量為約6500 Da。在一些情況下，C之分子量為約7000 Da。在一些情況下，C之分子量為約7500 Da。在一些情況下，C之分子量為約8000 Da。在一些情況下，C之分子量為約10,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約12,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約20,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約35,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約40,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約50,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約60,000 Da。在一些情況下，C之分子量為約100,000 Da。
在一些實施例中，聚環氧烴(例如PEG)為離散PEG，其中離散PEG為包含超過一個重複環氧乙烷單元之聚合物PEG。在一些情況下，離散PEG (dPEG)包含2至60個、2至50個或2至48個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、42、48、50個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約2個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約3個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約4個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約5個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約6個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約7個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約8個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約9個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約10個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約11個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約12個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約13個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約14個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約15個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約16個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約17個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約18個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約19個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約20個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約22個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約24個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約26個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約28個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約30個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約35個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約40個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約42個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約48個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，dPEG包含約50個或更多個重複環氧乙烷單元。在一些情況下，以逐步方式由純(例如約95%、98%、99%或99.5%)起始材料使dPEG合成為單分子量化合物。在一些情況下，dPEG具有特定分子量，而非平均分子量。在一些情況下，本文所描述之dPEG為來自Quanta Biodesign, LMD之dPEG。
在一些實施例中，聚合物部分C包含基於陽離子黏液酸之聚合物(cMAP)。在一些情況下，cMAP包含至少一個重複亞單元之一或多個亞單元，且亞單元結構表示為式(III)：
Figure 02_image042
式III 其中m在每次出現時獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，較佳4-6或5；且n在每次出現時獨立地為1、2、3、4或5。在一些實施例中，m及n為例如約10。
在一些情況下，cMAP進一步結合至PEG部分，生成cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情況下，PEG部分之範圍為約500 Da至約50,000 Da。在一些情況下，PEG部分之範圍為約500 Da至約1000 Da、大於1000 Da至約5000 Da、大於5000 Da至約10,000 Da、大於10,000至約25,000 Da、大於25,000 Da至約50,000 Da或此等範圍中之兩者或更多者之任何組合。
在一些情況下，C為cMAP-PEG共聚物、mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物或cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。在一些情況下，C為cMAP-PEG共聚物。在其他情況下，C為mPEG-cMAP-PEGm三嵌段聚合物。在額外情況下，C為cMAP-PEG-cMAP三嵌段聚合物。胞內體裂解部分
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體結合物進一步包含額外結合部分。在一些情況下，額外結合部分為胞內體裂解部分。在一些情況下，胞內體裂解部分為細胞隔室釋放組分，諸如能夠自諸如胞內體、溶酶體、內質網(ER)、高基氏體(Golgi apparatus)、微管、過氧化體或具有細胞之其他泡狀體之此項技術中已知之細胞隔室中之任一者釋放的化合物。在一些情況下，胞內體裂解部分包含胞內體裂解多肽、胞內體裂解聚合物、胞內體裂解脂質或胞內體裂解小分子。在一些情況下，胞內體裂解部分包含胞內體裂解多肽。在其他情況下，胞內體裂解部分包含胞內體裂解聚合物。胞內體裂解多肽
在一些實施例中，抗轉鐵蛋白受體抗體結合物進一步與胞內體裂解多肽結合。在一些實施例中，式(I) A-(X1 -B)n 或式(II) A-X1 -(B-X2 -C)n 結合物進一步與胞內體裂解多肽結合。在一些情況下，胞內體裂解多肽為pH依賴型膜活性肽。在一些情況下，胞內體裂解多肽為兩性多肽。在額外情況下，胞內體裂解多肽為肽模擬物。在一些情況下，胞內體裂解多肽包含INF、蜂毒肽、黏液素(meucin)或其各別衍生物。在一些情況下，胞內體裂解多肽包含INF或其衍生物。在其他情況下，胞內體裂解多肽包含蜂毒肽或其衍生物。在額外情況下，胞內體裂解多肽包含黏液素或其衍生物。
在一些情況下，INF7為24殘基多肽，彼等序列包含CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA (SEQ ID NO: 51)或GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (SEQ ID NO: 52)。在一些情況下，INF7或其衍生物包含以下之序列：GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG (SEQ ID NO: 53)、GLFEAIEGFIENGWEGMIDG WYG-(PEG)6-NH2 (SEQ ID NO: 54)或GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K(GalNAc)2 (SEQ ID NO: 55)。
在一些情況下，蜂毒肽為26殘基多肽，彼等序列包含CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ (SEQ ID NO: 56)或GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 57)。在一些情況下，蜂毒肽包含如美國專利第8,501,930號中所描述之多肽序列。
在一些情況下，黏液素為來源於蒙古正鉗蠍(scorpion Mesobuthus eupeus)之毒腺之抗微生物肽(AMP)。在一些情況下，黏液素由以下組成：黏液素-13，彼等序列包含IFGAIAGLLKNIF-NH2 (SEQ ID NO: 58)；及黏液素-18，彼等序列包含FFGHLFKLATKIIPSLFQ (SEQ ID NO: 59)。
在一些情況下，胞內體裂解多肽包含其中其序列與INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或黏液素或其衍生物具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%序列一致性的多肽。在一些情況下，胞內體裂解部分包含INF7或其衍生物、蜂毒肽或其衍生物或黏液素或其衍生物。
在一些情況下，胞內體裂解部分包含如表8中所說明之序列。 表8
名稱 起源 胺基酸序列 SEQ ID NO: 類型
Pep-1 來自猴病毒40大抗原及HIV逆轉錄酶之NLS KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 60 一級兩性
pVEC  VE-鈣黏蛋白 LLIILRRRRIRKQAHAHSK 61 一級兩性
VT5 合成肽 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD 62 β片兩性
C105Y 1-抗胰蛋白酶 CSIPPEVKFNKPFVYLI 63 -
運輸蛋白 甘丙胺素及黃蜂毒素 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL 64 一級兩性
TP10 甘丙胺素及黃蜂毒素 AGYLLGKINLKALAALAKKIL 65 一級兩性
MPG    來自HIV gp41之融合序列及SV40 T抗原之NLS之疏水域 GALFLGFLGAAGSTMGA 66 β片兩性
gH625  I型HSV之醣蛋白gH HGLASTLTRWAHYNALIRAF 67 二級兩性α-螺旋形
CADY PPTG1肽 GLWRALWRLLRSLWRLLWRA 68 二級兩性α-螺旋形
GALA 合成肽 WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA 69 二級兩性α-螺旋形
INF 流行性感冒HA2融合肽 GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC 70 二級兩性α-螺旋形/ pH依賴型膜活性肽
HA2E5-TAT 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2亞單元 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG 71 二級兩性α-螺旋形/ pH依賴型膜活性肽
HA2- 穿透蛋白 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2亞單元 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGRQIKIWFQNRRMKW KK-amide 72  pH依賴型膜活性肽
HA-K4 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2亞單元 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG-SSKKKK 73 pH依賴型膜活性肽
HA2E4 流行性感冒病毒X31菌株融合肽之流行性感冒HA2亞單元 GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC 74 pH依賴型膜活性肽
H5WYG  HA2類似物 GLFHAIAHFIHGGWH GLIHGWYG 75 pH依賴型膜活性肽
GALA-INF3- (PEG)6-NH  INF3融合肽 GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAA- (PEG)6-NH2 76 pH依賴型膜活性肽
CM18-TAT11 殺菌肽-A-蜂毒肽2 - 12 (CM18 )融合肽 KWKLFKKIGAVLKVLTTG-YGRKKRRQRRR 77 pH依賴型膜活性肽
在一些情況下，胞內體裂解部分包含經由拮抗諸如Bcl-2及/或Bcl-xL 之抑制因子目標來誘導細胞凋亡之Bak BH3多肽。在一些情況下，胞內體裂解部分包含以下中所描述之Bak BH3多肽：Albarran等人, 「Efficient intracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsive carrier」,Reactive & Functional Polymers 71 : 261-265 (2011)。
在一些情況下，胞內體裂解部分包含如PCT公開案第WO2013/166155號或第WO2015/069587號中所描述之多肽(例如滲透細胞之多肽)。胞內體裂解聚合物
在一些實施例中，式(I) A-(X1 -B)n 或式(II) A-X1 -(B-X2 -C)n 結合物進一步與胞內體裂解聚合物結合。如本文所使用，胞內體裂解聚合物包含線性、分支網狀、星形、梳狀或梯形類型之聚合物。在一些情況下，胞內體裂解聚合物為包含兩種或更多種不同類型之單體之均聚物或共聚物。在一些情況下，胞內體裂解聚合物為聚陽離子聚合物。在其他情況下，胞內體裂解聚合物為聚陰離子聚合物。
在一些情況下，聚陽離子聚合物包含具有正電荷、中性電荷或負電荷之單體單元，其中淨電荷為正電荷。在其他情況下，聚陽離子聚合物包含含有兩個或更多個正電荷之非聚合分子。例示性陽離子聚合物包括但不限於聚(L-離胺酸) (PLL)、聚(L-精胺酸) (PLA)、聚乙亞胺(PEI)、聚[α-(4-胺丁基)-L-乙醇酸] (PAGA)、甲基丙烯酸2-(二甲胺基)乙酯(DMAEMA)或甲基丙烯酸N,N-二乙胺基乙酯(DEAEMA)。
在一些情況下，聚陰離子聚合物包含具有正電荷、中性電荷或負電荷之單體單元，其中淨電荷為負電荷。在其他情況下，聚陰離子聚合物包含含有兩個或更多個負電荷之非聚合分子。例示性陰離子聚合物包括聚(烷基丙烯酸酯) (例如聚(丙基丙烯酸) (PPAA))或聚(N-異丙基丙烯醯胺) (NIPAM)。額外實例包括PP75，亦即以下中所描述之L-苯丙胺酸-聚(L-離胺酸間苯二甲醯胺)聚合物：Khormaee等人, 「Edosomolytic anionic polymer for the cytoplasmic delivery of siRNAs in localized in vivo applications」,Advanced Functional Materials 23 : 565-574 (2013)。
在一些實施例中，本文所描述之胞內體裂解聚合物為pH反應性胞內體裂解聚合物。pH反應性聚合物包含視環境之pH而增加尺寸(膨脹)或塌縮之聚合物。聚丙烯酸及幾丁聚醣為pH反應性聚合物之實例。
在一些情況下，本文所描述之胞內體裂解部分為膜破裂性聚合物。在一些情況下，膜破裂性聚合物包含陽離子聚合物、中性或疏水性聚合物或陰離子聚合物。在一些情況下，膜破裂性聚合物為親水性聚合物。
在一些情況下，本文所描述之胞內體裂解部分為pH反應性膜破裂性聚合物。例示性pH反應性膜破裂性聚合物包括聚(烷基丙烯酸)、聚(N-異丙基丙烯醯胺) (NIPAM)共聚物、丁二醯基化聚(縮水甘油)及聚(β-蘋果酸)聚合物。
在一些情況下，聚(烷基丙烯酸)包括聚(丙基丙烯酸) (聚PAA)、聚(甲基丙烯酸) (PMAA)、聚(乙基丙烯酸) (PEAA)及聚(丙基丙烯酸) (PPAA)。在一些情況下，聚(烷基丙烯酸)包括Jones等人,Biochemistry Journal 372 : 65-75 (2003)中所描述之聚(烷基丙烯酸)。
在一些實施例中，pH反應性膜破裂性聚合物包含聚(丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸)。(參見Bulmus等人,Journal of Controlled Release 93 : 105-120 (2003)；及Yessine等人,Biochimica et Biophysica Acta 1613 : 28-38 (2003))
在一些實施例中，pH反應性膜破裂性聚合物包含聚(苯乙烯-交替-順丁烯二酸酐)。(參見Henry等人,Biomacromolecules 7 : 2407-2414 (2006))
在一些實施例中，pH反應性膜破裂性聚合物包含吡啶基二硫化物丙烯酸酯(PDSA)聚合物，諸如聚(MAA-共-PDSA)、聚(EAA-共-PDSA)、聚(PAA-共-PDSA)、聚(MAA-共-BA-共-PDSA)、聚(EAA-共-BA-共-PDSA)或聚(PAA-共-BA-共-PDSA)聚合物。(參見El-Sayed等人, 「Rational design of composition and activity correlations for pH-responsive and glutathione-reactive polymer therapeutics」,Journal of Controlled Release 104 : 417-427 (2005)；或Flanary等人, 「Antigen delivery with poly(propylacrylic acid) conjugation enhanced MHC-1 presentation and T-cell activation」,Bioconjugate Chem .20 : 241-248 (2009))
在一些實施例中，pH反應性膜破裂性聚合物包含有包含以下之基底結構之裂解聚合物：
Figure 02_image044
.
在一些情況下，本文所描述之胞內體裂解部分進一步結合至額外結合物，例如聚合物(例如PEG)或經修飾之聚合物(例如經膽固醇修飾之聚合物)。
在一些情況下，額外結合物包含清潔劑(例如Triton X-100)。在一些情況下，本文所描述之胞內體裂解部分包含與清潔劑(例如Triton X-100)結合之聚合物(例如聚(醯胺基胺))。在一些情況下，本文所描述之胞內體裂解部分包含聚(醯胺基胺)-Triton X-100結合物(Duncan等人, 「A polymer-Triton X-100 conjugate capable of pH-dependent red blood cell lysis: a model system illustrating the possibility of drug delivery within acidic intracellular compartments」,Journal of Drug Targeting 2 : 341-347 (1994))。胞內體裂解脂質
在一些實施例中，胞內體裂解部分為脂質(例如促融脂質)。在一些實施例中，式(I) A-(X1 -B)n 或式(II) A-X1 -(B-X2 -C)n 結合物進一步與胞內體裂解脂質(例如促融脂質)結合。例示性促融脂質包括1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)、N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)甲胺(DLin-k-DMA)及N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)乙胺(XTC)。
在一些情況下，胞內體裂解部分為PCT公開案第WO09/126,933號中所描述之脂質(例如促融脂質)。胞內體裂解小分子
在一些實施例中，胞內體裂解部分為小分子。在一些實施例中，式(I) A-(X1 -B)n 或式(II) A-X1 -(B-X2 -C)n 分子進一步與胞內體裂解小分子結合。適用作胞內體裂解部分之例示性小分子包括但不限於奎寧(quinine)、氯奎(chloroquine)、羥基氯奎、胺酚喹(amodiaquin) (卡諾喹(carnoquine))、阿莫吡喹(amopyroquine)、伯胺喹(primaquine)、甲氟喹(mefloquine)、硫酸氯喹(nivaquine)、鹵甲丙二苯卓(halofantrine)、醌亞胺或其組合。在一些情況下，喹啉胞內體裂解部分包括但不限於7-氯-4-(4-二乙胺基-1-甲基丁基-胺基)喹啉(氯奎)；7-氯-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁基-胺基)喹啉(羥基氯奎)；7-氟-4-(4-二乙胺基-1-甲基丁基-胺基)喹啉；4-(4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(4-二乙基-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氯-4-(4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉(去甲基氯奎)；7-氟-4-(4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉)；4-(4-二乙基-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-胺基-1-丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-二乙胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氟-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羥基-乙基)-胺基-1-甲基丁胺基-)喹啉；7-羥基-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；磷酸羥基氯奎；7-氯-4-(4-乙基-(2-羥乙基-1)-胺基-1-丁胺基)喹啉(去甲基羥基氯奎)；7-氟-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-丁胺基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；7-羥基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羥乙基)-胺基-1-甲基丁胺基)喹啉；8-[(4-胺基戊基)胺基-6-甲氧基二鹽酸鹽喹啉；1-乙醯基-1,2,3,4-四氫喹啉；8-[(4-胺基戊基)胺基]-6-甲氧基喹啉二鹽酸鹽；1-丁醯基-1,2,3,4-四氫喹啉；3-氯-4-(4-羥基-α,α'-雙(2-甲基-1-吡咯啶基)-2,5-茬胺基喹啉, 4-[(4-二乙基-胺基)-1-甲基丁基-胺基]-6-甲氧基喹啉；3-氟-4-(4-羥基-α,α'-雙(2-甲基-1-吡咯啶基)-2,5-茬胺基喹啉, 4-[(4-二乙胺基)-1-甲基丁基-胺基]-6-甲氧基喹啉；4-(4-羥基-α,α'-雙(2-甲基-1-吡咯啶基)-2,5-茬胺基喹啉；4-[(4-二乙胺基)-1-甲基丁基-胺基]-6-甲氧基喹啉；3,4-二氫-1-(2H)-喹啉甲醛；1,1'-五亞甲基二喹啉鎓二碘化物；硫酸8-喹啉醇及其胺基、醛、羧酸、羥基、鹵素、酮、硫氫基及乙烯基衍生物或類似物。在一些情況下，胞內體裂解部分為Naisbitt等人(1997, J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893)及美國專利第5,736,557號中所描述之小分子。
在一些實施例中，胞內體裂解部分為尼日利亞菌素(nigericin)或其結合物，例如葉酸酯-尼日利亞菌素酯結合物、葉酸酯-尼日利亞菌素醯胺結合物或葉酸酯-尼日利亞菌素胺基甲酸酯結合物。在一些情況下，胞內體裂解部分為Rangasamy等人, 「New mechanism for release of endosomal contents: osmotic lysis via nigericin-mediated K+/H+ exchange」,Bioconjugate Chem .29 :1047-1059 (2018)中所描述之尼日利亞菌素。連接子
在一些實施例中，本文所描述之連接子為可裂解連接子或不可裂解連接子。在一些情況下，連接子為可裂解連接子。在其他情況下，連接子為不可裂解連接子。
在一些情況下，連接子為非聚合連接子。非聚合連接子係指不含有藉由聚合方法生成之單體之重複單元之連接子。例示性非聚合連接子包括但不限於C1 -C6 烷基(例如C5 、C4 、C3 、C2 或C1 烷基)、同型雙官能交聯子、異型雙官能交聯子、肽連接子、無痕連接子、自我分解型連接子、基於順丁烯二醯亞胺之連接子或其組合。在一些情況下，非聚合連接子包含C1 -C6 烷基(例如C5 、C4 、C3 、C2 或C1 烷基)、同型雙官能交聯子、異型雙官能交聯子、肽連接子、無痕連接子、自我分解型連接子、基於順丁烯二醯亞胺之連接子或其組合。在額外情況下，非聚合連接子不包含超過兩個相同類型之連接子，例如超過兩個同型雙官能交聯子或超過兩個肽連接子。在另外情況下，非聚合連接子視情況包含一或多個反應性官能基。
在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋上文所描述之聚合物。在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋聚合物部分C所涵蓋之聚合物。在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋聚環氧烴(例如PEG)。在一些情況下，非聚合連接子不涵蓋PEG。
在一些情況下，連接子包含同型雙官能連接子。例示性同型雙官能連接子包括但不限於羅曼特氏試劑(Lomant's reagent)二硫代雙(丁二醯亞胺基丙酸酯) DSP、3'3'-二硫代雙(丙酸磺基丁二醯亞胺酯) (DTSSP)、辛二酸二丁二醯亞胺酯(DSS)、雙(磺基丁二醯亞胺基)辛二酸酯(BS)、酒石酸二丁二醯亞胺酯(DST)、酒石酸二磺基丁二醯亞胺酯(磺基DST)、乙二醇雙(丁二醯亞胺基丁二酸酯) (EGS)、戊二酸二丁二醯亞胺酯(DSG)、碳酸N,N'-二丁二醯亞胺酯(DSC)、己二亞胺酸二甲酯(DMA)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫代雙丙亞胺酸酯(DTBP)、1,4-二-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺基)丁烷(DPDPB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、含有芳基鹵化物之化合物(DFDNB) (諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基碸(DFDNPS)、雙-[β-(4-疊氮基柳基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二縮水甘油醚、己二酸二醯肼、碳醯肼、鄰甲苯胺、3,3'-二甲基聯苯胺、聯苯胺、α,α'-對二胺基聯苯、二碘-對二甲苯磺酸、N,N'-伸乙基-雙(碘乙醯胺)或N,N'-六亞甲基-雙(碘乙醯胺)。
在一些實施例中，連接子包含異型雙官能連接子。例示性異型雙官能連接子包括但不限於：胺反應性及氫硫基交聯子，諸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(sPDP)、長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(LC-sPDP)、水溶性長鏈3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(磺基-LC-sPDP)、丁二醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基丁二醯亞胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯醯胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MB)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基丁二醯亞胺酯(磺基-MB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(sIAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-sIAB)、丁二醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基丁二醯亞胺基-4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)琥珀醯亞胺酯(GMB)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯(磺基-GMB)、6-((碘乙醯基)胺基)己酸丁二醯亞胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙醯基)胺基)己醯基)胺基]己酸丁二醯亞胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(sIAC)、6-((((4-碘乙醯基)胺基)甲基)環己烷-1-羰基)胺基)己酸丁二醯亞胺酯(sIACX)、碘乙酸對硝苯酯(NPIA)；羰基反應性及硫氫基反應性交聯子，諸如4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸醯肼(MPBH)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-醯肼-8 (M2 C2 H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙醯基醯肼(PDPH)；胺反應性及光反應性交聯子，諸如N-羥基丁二醯亞胺基-4-疊氮柳酸(NH-AsA)、N-羥基磺基丁二醯亞胺基-4-疊氮柳酸(磺基-NH-AsA)、磺基丁二醯亞胺基-(4-疊氮基柳基醯胺基)己酸酯(磺基-NH-LC-AsA)、磺基丁二醯亞胺基-2-(ρ-疊氮基柳基醯胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羥基丁二醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羥基磺基丁二醯亞胺基-4-疊氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-丁二醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(sANPAH)、磺基丁二醯亞胺基-6-(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯氧基丁二醯亞胺(ANB-NO)、磺基丁二醯亞胺基-2-(間疊氮基-鄰硝基苯甲醯胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-丁二醯亞胺基-4(4-疊氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-疊氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基丁二醯亞胺酯(磺基-sADP)、4-(ρ-疊氮苯基)丁酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙醯胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基丁二醯亞胺酯(sAED)、7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸ρ-硝苯酯(ρNPDP)、ρ-硝苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)；硫氫基反應性及光反應性交聯子，諸如1-(ρ-疊氮基柳基醯胺基)-4-(碘乙醯胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(ρ-疊氮基柳基醯胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙醯胺(APDP)、二苯基酮-4-碘乙醯胺、二苯基酮-4-順丁烯二醯亞胺；羰基反應性及光反應性交聯子，諸如ρ-疊氮基苯甲醯基醯肼(ABH)；羧酸酯反應性及光反應性交聯子，諸如4-(ρ-疊氮基柳基醯胺基)丁胺(AsBA)；及精胺酸反應性及光反應性交聯子，諸如ρ-疊氮苯基乙二醛(APG)。
在一些情況下，連接子包含反應性官能基。在一些情況下，反應性官能基包含對結合部分上所存在之親電子基團具反應性之親核基團。例示性親電子基團包括羰基-諸如醛、酮、羧酸、酯、醯胺、烯酮、鹵化醯基或酸酐。在一些實施例中，反應性官能基為醛。例示性親核基團包括醯肼、肟、胺基、肼、縮胺基硫脲、肼羧酸酯及芳基醯肼。
在一些實施例中，連接子包含順丁烯二醯亞胺基。在一些情況下，順丁烯二醯亞胺基亦稱為順丁烯二醯亞胺間隔子。在一些情況下，順丁烯二醯亞胺基進一步涵蓋己酸，形成順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在一些情況下，連接子包含順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在一些情況下，連接子為順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在其他情況下，順丁烯二醯亞胺基包含順丁烯二醯亞胺基甲基，諸如上文所描述之丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)或磺基丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)。
在一些實施例中，順丁烯二醯亞胺基為自我穩定型順丁烯二醯亞胺。在一些情況下，自我穩定型順丁烯二醯亞胺利用二胺基丙酸(DPR)以併有鄰近順丁烯二醯亞胺之鹼性胺基來提供硫代丁二醯亞胺環水解之分子內催化，由此使順丁烯二醯亞胺避免經由逆邁克爾(retro-Michael)反應進行消除反應。在一些情況下，自我穩定型順丁烯二醯亞胺為Lyon等人, 「Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates」,Nat . Biotechnol .32 (10):1059-1062 (2014)中所描述之順丁烯二醯亞胺基。在一些情況下，連接子包含自我穩定型順丁烯二醯亞胺。在一些情況下，連接子為自我穩定型順丁烯二醯亞胺。
在一些實施例中，連接子包含肽部分。在一些情況下，肽部分包含超過至少2、3、4、5或6個胺基酸殘基。在一些情況下，肽部分包含至多2、3、4、5、6、7、或8個胺基酸殘基。在一些情況下，肽部分包含約2、約3、約4、約5或約6個胺基酸殘基。在一些情況下，肽部分為可裂解肽部分(例如以酶方式或以化學方式)。在一些情況下，肽部分為不可裂解肽部分。在一些情況下，肽部分包含Val-Cit (纈胺酸-瓜胺酸)、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 78)、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 79)或Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 80)。在一些情況下，連接子包含諸如以下之肽部分：Val-Cit (纈胺酸-瓜胺酸)、Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 78)、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 79)或Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 80)。在一些情況下，連接子包含Val-Cit。在一些情況下，連接子為Val-Cit。
在一些實施例中，連接子包含苯甲酸基團或其衍生物。在一些情況下，苯甲酸基團或其衍生物包含對胺基苯甲酸(PABA)。在一些情況下，苯甲酸基團或其衍生物包含γ-胺基丁酸(GABA)。
在一些實施例中，連接子包含呈任何組合形式之順丁烯二醯亞胺基、肽部分及/或苯甲酸基團中之一或多者。在一些實施例中，連接子包含順丁烯二醯亞胺基、肽部分及/或苯甲酸基團之組合。在一些情況下，順丁烯二醯亞胺基為順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)。在一些情況下，肽基團為val-cit。在一些情況下，苯甲酸基團為PABA。在一些情況下，連接子包含mc-val-cit基團。在一些情況下，連接子包含val-cit-PABA基團。在額外情況下，連接子包含mc-val-cit-PABA基團。
在一些實施例中，連接子為自我分解型連接子或自我消除型連接子。在一些情況下，連接子為自我分解型連接子。在其他情況下，連接子為自我消除型連接子(例如環化自我消除型連接子)。在一些情況下，連接子包含美國專利第9,089,614號或PCT公開案第WO2015038426號中所描述之連接子。
在一些實施例中，連接子為樹突狀類型連接子。在一些情況下，樹突狀類型連接子包含分支化多官能連接子部分。在一些情況下，樹突狀類型連接子用於增加聚核苷酸B與結合部分A之莫耳比。在一些情況下，樹突狀類型連接子包含PAMAM樹突狀聚合物。
在一些實施例中，連接子為無痕連接子或其中在裂解之後不留下與結合部分A、聚核苷酸B、聚合物C或胞內體裂解部分D之連接子部分(例如原子或連接子基團)的連接子。例示性無痕連接子包括但不限於鍺連接子、矽連接子、硫連接子、硒連接子、氮連接子、磷連接子、硼連接子、鉻連接子或苯基醯肼連接子。在一些情況下，連接子為如Hejesen等人, 「A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry」,Org Biomol Chem 11 (15): 2493-2497 (2013)中所描述之無痕芳基-三氮烯連接子。在一些情況下，連接子為Blaney等人, 「Traceless solid-phase organic synthesis」,Chem . Rev .102 : 2607-2024 (2002)中所描述之無痕連接子。在一些情況下，連接子為如美國專利第6,821,783號中所描述之無痕連接子。
在一些情況下，連接子為以下中所描述之連接子：美國專利第6,884,869號；第7,498,298號；第8,288,352號；第8,609,105號；或第8,697,688；美國專利公開案第2014/0127239號；第2013/028919號；第2014/286970號；第2013/0309256號；第2015/037360號；或第2014/0294851號；或PCT公開案第WO2015057699號；第WO2014080251號；第WO2014197854號；第WO2014145090號；或第WO2014177042號。
在一些實施例中，X1 及X2 各自獨立地為鍵或非聚合連接子。在一些情況下，X1 及X2 各自獨立地為鍵。在一些情況下，X1 及X2 各自獨立地為非聚合連接子。
在一些情況下，X1 為鍵或非聚合連接子。在一些情況下，X1 為鍵。在一些情況下，X1 為非聚合連接子。在一些情況下，連接子為C1 -C6 烷基。在一些情況下，X1 為C1 -C6 烷基，諸如C5 、C4 、C3 、C2 或C1 烷基。在一些情況下，C1 -C6 烷基為未經取代之C1 -C6 烷基。如在連接子之情形下且詳言之在X1 之情形下所使用，烷基意謂含有至多六個碳原子之飽和直鏈或分支鏈烴基。在一些情況下，X1 包括上文所描述之同型雙官能連接子或異型雙官能連接子。在一些情況下，X1 包括異型雙官能連接子。在一些情況下，X1 包括sMCC。在其他情況下，X1 包括視情況結合至C1 -C6 烷基之異型雙官能連接子。在其他情況下，X1 包括視情況結合至C1 -C6 烷基之sMCC。在額外情況下，X1 不包括上文所描述之同型雙官能連接子或異型雙官能連接子。
在一些情況下，X2 為鍵或連接子。在一些情況下，X2 為鍵。在其他情況下，X2 為連接子。在額外情況下，X2 為非聚合連接子。在一些實施例中，X2 為C1 -C6 烷基。在一些情況下，X2 為上文所描述之同型雙官能連接子或異型雙官能連接子。在一些情況下，X2 為上文所描述之同型雙官能連接子。在一些情況下，X2 為上文所描述之異型雙官能連接子。在一些情況下，X2 包含諸如上文所描述之順丁烯二醯亞胺基己醯基(mc)或自我穩定型順丁烯二醯亞胺基之順丁烯二醯亞胺基。在一些情況下，X2 包含諸如Val-Cit之肽部分。在一些情況下，X2 包含諸如PABA之苯甲酸基團。在額外情況下，X2 包含順丁烯二醯亞胺基、肽部分及/或苯甲酸基團之組合。在額外情況下，X2 包含mc基團。在額外情況下，X2 包含mc-val-cit基團。在額外情況下，X2 包含val-cit-PABA基團。在額外情況下，X2 包含mc-val-cit-PABA基團。使用方法
在一些實施例中，本文描述使用本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體將有效負載物遞送至所關注之目標位點之方法。在一些情況下，所關注之目標位點為過度表現與疾病或病況相關之致病蛋白質之細胞。在一些情況下，所關注之目標位點為包含經不正確地加工之mRNA之細胞，該經不正確地加工之mRNA編碼非功能性蛋白質或表現減少之導致疾病或病況之蛋白質。在一些情況下，所關注之目標位點為腫瘤位點。在額外情況下，所關注之目標位點為位於腦中之位點。
在一些實施例中，本文描述治療以經過度表現之蛋白質表徵之疾病或病症之方法。在一些情況下，疾病或病症為肌肉萎縮。在一些情況下，疾病或病症為肌強直性營養不良。
在一個實施例中，肌肉萎縮係指肌肉強度大量損失。肌肉強度大量損失意謂相對於對照個體中之同一肌肉組織而言個體中之患病、受傷或未使用肌肉組織之強度降低。在一實施例中，肌肉強度大量損失為相對於對照個體中之同一肌肉組織而言至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多之強度降低。在另一實施例中，肌肉強度大量損失意謂相對於非使用期之前同一個體中之同一肌肉組織之肌肉強度而言未使用肌肉組織中之強度降低。在一實施例中，肌肉強度大量損失為相對於非使用期之前同一個體中之同一肌肉組織之肌肉強度而言至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多之降低。
在另一實施例中，肌肉萎縮係指肌肉質量大量損失。肌肉質量大量損失意謂相對於對照個體中之同一肌肉組織而言個體中之患病、受傷或未使用肌肉組織中之肌肉體積減小。在一實施例中，肌肉體積大量損失為相對於對照個體中之同一肌肉組織而言至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多。在另一實施例中，肌肉質量大量損失意謂相對於非使用期之前同一個體中之同一肌肉組織之肌肉體積而言未使用肌肉組織中之肌肉體積減小。在一實施例中，肌肉組織大量損失為相對於非使用期之前同一個體中之同一肌肉組織之肌肉體積而言至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多。視情況藉由評估肌肉之截面面積量測肌肉體積，該評估係諸如藉由磁共振成像(例如藉由肌肉體積/截面面積(CSA) MRI方法)進行。
在一些實施例中，肌肉萎縮包含以下或與以下相關：惡病質、去神經、肌病變、運動神經元疾病、糖尿病、慢性阻塞性肺病、肝病、充血性心臟衰竭、慢性腎衰竭、慢性感染、敗血症、空腹、少肌症、糖皮質素相關肌肉萎縮或廢用性相關肌肉萎縮。
惡病質為由潛在疾病導致之肌肉後天性加速損失。在一些情況下，惡病質係指營養學上無法逆轉且一般與諸如癌症、COPD、AIDS、心臟衰竭及其類似疾病之潛在疾病相關之身體質量損失。當在患有末期癌症之患者中見到惡病質時，該惡病質稱為「癌症惡病質」。癌症惡病質影響大部分患有晚期癌症之患者且與治療耐藥性降低、療法反應減弱、生活品質降低及存活持續時間縮短相關。在一些情況下，癌症惡病質定義為特徵在於骨胳肌肉質量持續損失且脂肪質量損失或不損失之多因素症候群，該脂肪質量損失無法藉由習知營養支持完全逆轉且導致進行性功能減損。在一些情況下，骨胳肌肉損失似乎為癌症惡病質中之最明顯事件。另外，癌症惡病質之分類表明，診斷準則不僅考慮體重損失為惡病質過程之信號事件，且亦考慮諸如低BMI或低肌肉發達位準之患者初始儲備亦應考慮在內。
去神經為對周邊運動神經元之損傷，該等周邊運動神經元在器官與中樞神經系統之間具有部分或完全神經纖維中斷，導致神經傳導及運動神經元啟動中斷，之後防止骨骼肌肉縮小。由於總體運動神經元單元之損失，故此神經功能損失為局部化或全身性的。所得之骨骼肌肉不可收縮性導致肌肉萎縮。在一些情況下，去神經與以下相關或歸因於以下：退化性、代謝性或發炎性神經病變(例如格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、周邊神經病變或對環境毒素或藥物之暴露)。在額外情況下，去神經與例如外科手術之物理損傷相關。
肌病變為描述肌肉疾病之總括術語。在一些情況下，肌病變包括肌強直；先天性肌病變，諸如線樣肌病變、多軸空/微軸空肌病變(multi/minicore myopathy)及肌微管性(中央核)肌病變；粒線體肌病變；家族性週期性麻痹；發炎性肌病變；代謝性肌病變，例如由肝糖或脂質貯積病導致；皮肌炎；多發性肌炎；包涵體肌炎；骨化性肌炎；橫紋肌溶解症；及肌球蛋白尿。在一些情況下，肌病變係由諸如杜興氏肌肉營養不良、貝克爾肌肉營養不良、肌強直性肌肉營養不良、面肩臂肌肉營養不良、埃-德二氏(Emery-Dreifuss)肌肉營養不良、外眼肌咽肌肌肉營養不良、肩胛與肱骨肌肉營養不良、肢帶肌肉營養不良、福山(Fukuyama)肌肉營養不良、先天性肌肉營養不良或遺傳性遠程肌病變之肌肉營養不良症候群導致。在一些情況下，肌病變係由肌強直性營養不良(例如1型肌強直性營養不良或DM1)導致。在一些情況下，肌病變係由DM1導致。
運動神經元疾病(MND)涵蓋影響運動神經元，亦即控制身體之隨意肌之細胞之神經病症。例示性運動神經元疾病包括但不限於成人運動神經元疾病、嬰兒脊髓性肌肉萎縮、肌肉萎縮性側索硬化、青少年脊髓性肌肉萎縮、具有多灶性導體阻斷之自身免疫性運動神經病變、歸因於中風或脊髓損傷之麻痹或歸因於外傷之骨骼固定。
糖尿病(diabete/diabetes mellitus (DM))包含1型糖尿病、2型糖尿病、3型糖尿病、4型糖尿病、雙重糖尿病、潛伏性自身免疫性糖尿病(LAD)、妊娠糖尿病、新生兒糖尿病(NDM)、年輕起病成人型糖尿病(MODY)、沃夫然症候群(Wolfram syndrome)、阿爾斯特倫症候群(Alström syndrome)、前期糖尿病或尿崩症。亦稱為非胰島素依賴型糖尿病之2型糖尿病為占所有糖尿病病例95%之最常見類型之糖尿病。在一些情況下，2型糖尿病係由因素組合導致，該等因素包括歸因於胰臟β細胞功能障礙之胰島素抗性，該胰臟β細胞功能障礙之後導致高血糖含量。在一些情況下，經增加之升糖素含量刺激肝以產生異常量之不合需要之葡萄糖，該異常量之不合需要之葡萄糖促成高血糖含量。亦稱為胰島素依賴型糖尿病之1型糖尿病占所有糖尿病病例約5%至10%。1型糖尿病為自身免疫性疾病，其中T細胞攻擊且破壞胰臟中之產生胰島素之β細胞。在一些實施例中，1型糖尿病係由基因及環境因素導致。4型糖尿病為影響約20%之65歲及超過65歲之糖尿病患者之類型的糖尿病。在一些實施例中，4型糖尿病之特徵在於年齡相關之胰島素抗性。3型糖尿病用作用於導致腦中之胰島素抗性之阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)之術語。
慢性阻塞性肺病(COPD)為特徵在於長期呼吸難題及不良氣流之類型之阻塞性肺病。慢性支氣管炎及肺氣腫為兩種不同類型之COPD。
肝病(Liver disease/hepatic disease)包含纖維化、硬化、肝炎、酒精性肝病、肝脂肪變性、遺傳性疾病或原發性肝癌。
充血性心臟衰竭為其中心臟不能向身體組織泵送足夠血液及氧氣之病況。
慢性腎衰竭或慢性腎病為特徵在於腎功能隨時間推移之逐步損失的病況。
在一些實施例中，諸如AIDS之慢性感染進一步導致肌肉萎縮。
敗血症為針對導致組織損傷、器官衰竭及/或死亡之感染之免疫反應。
空腹為願意戒斷或減少一些或所有食品、飲品或兩者達一定時間段。
少肌症為在常規老化過程中肌肉萎縮之連續過程，其特徵在於肌肉質量及肌肉強度跨數月及數年之逐步損失。常規老化過程在本文中意謂未受促進骨骼肌肉神經退化之病症及疾病之存在影響或加速的老化過程。
在一些情況下，用糖皮質素進行之治療進一步導致肌肉萎縮。例示性糖皮質素包括但不限於皮質醇、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、普賴蘇(prednisone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)及普賴蘇穠(prednisolone)。
當肢體經固定(例如因肢體或關節斷裂或諸如髖或膝置換手術之矯形外科手術所致)時，廢用性相關肌肉萎縮產生。如本文所使用之「固定」或「經固定」係指部分或完全限制肢體、肌肉、骨骼、肌腱、關節或任何其他身體部位之移動達一段經延長時間(例如達2天、3天、4天、5天、6天、一週、兩週或更長時間)。在一些情況下，固定期包括不受限制之移動之短時段或情況以便洗浴、置換外部器件或調整外部器件。肢體固定視情況藉由以下進行：任何多種外部器件，其包括但不限於支架、吊索、鑄件、繃帶及夾板(其中任一者視情況由包括但不限於布、紗布、玻璃纖維、塑膠、石膏或金屬之硬或軟材料構成)；以及任何多種內部器件，其包括以手術方式植入之夾板、平板、支架及其類似器件。在肢體固定之情形下，移動限制涉及單個關節或多個關節(例如單一關節，諸如肩關節或髖關節；混合關節，諸如橈腕關節；及複合關節，諸如膝關節，包括但不限於以下中之一或多者：手關節、肩關節、肘關節、腕關節、輔助關節、胸鎖關節、椎骨關節、顳下頜關節、薦髂關節、髖關節、膝關節及腳關節)、單個肌腱或韌帶或多個肌腱或韌帶(例如包括但不限於以下中之一或多者：前十字韌帶、後十字韌帶、肩回旋肌肌腱、肘及膝之內側側副韌帶、手屈肌肌腱、踝側韌帶及鄂夾或顳下頜關節之肌腱及韌帶)、單個骨骼或多個骨骼(例如包括但不限於以下中之一或多者：頭骨、下頜骨、鎖骨、肋、橈骨、尺骨、肱骨(humorous)、骨盆、骶骨、股骨、膝蓋骨、趾骨、腕骨、掌骨、跗骨、蹠骨、腓骨、脛骨、肩胛骨及脊椎)、單個肌肉或多個肌肉(例如包括但不限於以下中之一或多者：背闊肌(latissimus dorsi)、斜方肌、三角肌、胸、二頭肌、三頭肌、外斜肌(external oblique)、腹部、臀大肌、大腿後肌、四頭肌、腓腸肌及隔膜)；單個肢體或多個肢體、臂及腿中之一或多者；或總體骨胳肌肉系統或其部分(例如在全身鑄件或人字形鑄件之情況下)。
肌強直性營養不良為包含兩種主要類型之多元系統神經肌肉疾病：1型肌強直性營養不良(DM1)及2型肌強直性營養不良(DM2)。DM1係由基因DM蛋白激酶(DMPK )中之顯性遺傳性「CTG」重複擴增導致，當該基因DMPK 轉錄至mRNA中時，形成以高親和力結合至肌盲蛋白樣(MBNL)蛋白質家族之髮夾。MBNL蛋白涉及於轉錄後剪接及多腺苷酸化位點調節中，且MBNL蛋白功能損失導致核變異區下游積聚及錯剪接事件增多且後續導致肌強直及其他臨床症狀。
在一些實施例中，本文描述治療以經不正確地剪接之mRNA表徵之疾病或病症之方法。在一些實施例中，本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體將聚核酸分子遞送至經不正確地剪接之mRNA轉錄物之位點以誘導外顯子跳躍或外顯子包括。
在一些情況下，由經不恰當地剪接或部分剪接之mRNA造成之疾病或病症包括但不限於神經肌肉疾病、基因疾病、癌症、遺傳疾病或心血管疾病。
在一些情況下，基因疾病或病症包括體染色體顯性病症、體染色體隱性病症、X性聯顯性病症、X性聯隱性病症、Y性聯病症、粒線體疾病或多因素或多基因病症。
在一些情況下，諸如高膽固醇血症之心血管疾病係由經不恰當地剪接或部分剪接之mRNA造成。在高膽固醇血症中，已顯示低密度脂蛋白受體(LDLR)之外顯子12中之單核苷酸多形現象促進外顯子跳躍。
在一些情況下，經不恰當地剪接或部分剪接之mRNA造成癌症。舉例而言，經不恰當地剪接或部分剪接之mRNA影響包括但不限於增殖、運動及藥物反應之涉及於癌症中之細胞過程。在一些情況下，該癌症為實體癌症或血液癌。在一些情況下，癌症為膀胱癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、乳癌、非霍奇金淋巴瘤、子宮頸癌、卵巢癌、大腸直腸癌、胰臟癌、食道癌、前列腺癌、腎癌、皮膚癌、白血病、甲狀腺癌、肝癌或子宮癌。
在一些情況下，經不恰當地剪接或部分剪接之mRNA造成神經肌肉疾病或病症。例示性神經肌肉疾病包括諸如杜興氏肌肉營養不良、貝克爾肌肉營養不良、面肩臂肌肉營養不良、先天性肌肉營養不良或肌強直性營養不良之肌肉營養不良。在一些情況下，肌肉營養不良為基因肌肉營養不良。在一些情況下，肌肉營養不良係由自發性突變導致。已顯示貝克爾肌肉營養不良及杜興氏肌肉營養不良涉及編碼肌肉萎縮蛋白之DMD 基因中之突變。已顯示面肩臂肌肉營養不良涉及雙重同源盒4 (DUX4 )基因中之突變。
在一些情況下，經不恰當地剪接或部分剪接之mRNA造成杜興氏肌肉營養不良。杜興氏肌肉營養不良造成嚴重肌無力且係由破壞功能肌肉萎縮蛋白產生之DMD 基因中之突變導致。在一些情況下，杜興氏肌肉營養不良係由DMD 基因中外顯子中之突變造成。在一些情況下，杜興氏肌肉營養不良係由DMD 基因中外顯子1、2、3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78及79中之至少一者中之突變造成。在一些情況下，杜興氏肌肉營養不良係由DMD 基因中外顯子3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62及63中之至少一者中之突變造成。在一些情況下，杜興氏肌肉營養不良係由DMD 基因中外顯子8、23、35、43、44、45、50、51、52、53及55中之至少一者中之突變造成。在一些情況下，多個外顯子經突變。舉例而言，外顯子48-50之突變常見於杜興氏肌肉營養不良患者中。在一些情況下，杜興氏肌肉營養不良係由外顯子51之突變造成。在一些情況下，杜興氏肌肉營養不良係由外顯子23之突變造成。在一些情況下，突變涉及一或多個外顯子之刪除。在一些情況下，突變涉及一或多個外顯子之複製。在一些情況下，突變涉及外顯子中之點突變。舉例而言，已顯示一些患者具有DMD 基因之外顯子51中之無義點突變。醫藥調配物
在一些實施例中，本文所描述之醫藥調配物係藉由多個投與途徑投與至個體，該等投與途徑包括但不限於非經腸(例如靜脈內、皮下、肌內)、經口、鼻內、頰內、經直腸或經皮投與途徑。在一些情況下，本文所描述之醫藥組合物係調配用於非經腸(例如靜脈內、皮下、肌內、動脈內、腹膜內、鞘內、腦內、腦室內或顱內)投與。在其他情況下，本文所描述之醫藥組合物係調配用於經口投與。在再其他情況下，本文所描述之醫藥組合物係調配用於鼻內投與。
在一些實施例中，醫藥調配物包括但不限於水性液體分散液、自我乳化型分散液、固溶體、脂質分散液、氣霧劑、固體劑型、散劑、立即釋放調配物、受控釋放調配物、速熔調配物、錠劑、膠囊、丸劑、延時釋放調配物、緩釋調配物、脈衝釋放調配物、多微粒調配物(例如奈米粒子調配物)及混合型立即且受控釋放調配物。
在一些情況下，醫藥調配物包括多微粒調配物。在一些情況下，醫藥調配物包括奈米粒子調配物。在一些情況下，奈米粒子包含cMAP、環糊精或脂質。在一些情況下，奈米粒子包含固體脂質奈米粒子、聚合物奈米粒子、自我乳化型奈米粒子、脂質體、微乳液或膠束溶液。額外例示性奈米粒子包括但不限於順磁奈米粒子、超順磁奈米粒子、金屬奈米粒子、富勒烯樣材料(fullerene-like material)、無機奈米管、樹突狀聚合物(諸如具有經共價連接之金屬螯合物)、奈米纖維、奈米角、奈米洋蔥(nano-onion)、奈米棒、奈米繩及量子點。在一些情況下，奈米粒子為金屬奈米粒子，例如鈧、鈦、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、釔、鋯、鈮、鉬、釕、銠、鈀、銀、鎘、鉿、鉭、鎢、錸、鋨、銥、鉑、金、釓、鋁、鎵、銦、錫、鉈、鉛、鉍、鎂、鈣、鍶、鋇、鋰、鈉、鉀、硼、矽、磷、鍺、砷、銻奈米粒子及其組合、合金或氧化物。
在一些情況下，奈米粒子包括核或核及殼，如同核殼奈米粒子。
在一些情況下，奈米粒子進一步塗佈有用於連接功能元件(例如用本文所描述之聚核酸分子或結合部分中之一或多者)之分子。在一些情況下，塗料包含硫酸軟骨素、硫酸聚葡萄糖、羧甲基聚葡萄糖、海藻酸、果膠、鹿角菜膠、褐藻糖膠、膠洋硫菜、金屬化四聯吡咯環、刺梧桐樹膠、結蘭膠、三仙膠、玻尿酸、葡萄糖胺、半乳胺糖、幾丁質(或幾丁聚醣)、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、溶菌酶、細胞色素C、核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、α-胰凝乳蛋白酶、聚離胺酸、聚精胺酸、組織蛋白、魚精蛋白、卵白蛋白或糊精或環糊精。在一些情況下，奈米粒子包含經石墨烯塗佈之奈米粒子。
在一些情況下，奈米粒子之至少一個尺寸為小於約500 nm、400 nm、300 nm、200 nm或100 nm。
在一些情況下，奈米粒子調配物包含順磁奈米粒子、超順磁奈米粒子、金屬奈米粒子、富勒烯樣材料、無機奈米管、樹突狀聚合物(諸如具有經共價連接之金屬螯合物)、奈米纖維、奈米角、奈米洋蔥、奈米棒、奈米繩或量子點。在一些情況下，本文所描述之聚核酸分子或結合部分直接地或間接地結合至奈米粒子。在一些情況下，至少1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多個本文所描述之聚核酸分子或結合部分直接地或間接地結合至奈米粒子。
在一些實施例中，醫藥調配物包含例如重組載體之遞送載體以將聚核酸分子遞送至細胞中。在一些情況下，重組載體為DNA質體。在其他情況下，重組載體為病毒載體。例示性病毒載體包括來源於腺相關病毒、反轉錄病毒、腺病毒或α病毒之載體。在一些情況下，能夠表現聚核酸分子之重組載體提供於目標細胞中之穩定表現。在額外情況下，使用提供聚核酸分子之短暫表現之病毒載體。
在一些實施例中，醫藥調配物包括基於與本文所揭示之組合物之相容性及所需劑型之釋放概況特性選擇之載劑或載劑材料。例示性載劑材料包括例如黏合劑、懸浮劑、崩解劑、填充劑、界面活性劑、增溶劑、穩定劑、潤滑劑、潤濕劑、稀釋劑及其類似載劑材料。醫藥學上相容之載劑材料包括但不限於阿拉伯膠、明膠、膠態二氧化矽、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、麥芽糊精、丙三醇、矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、膽固醇、膽固醇酯、酪蛋白鈉、大豆卵磷脂、牛膽酸、磷脂醯膽鹼、氯化鈉、磷酸三鈣、磷酸氫二鉀、纖維素及纖維素結合物、硬脂醯基乳酸糖鈉、鹿角菜膠、單酸甘油酯、二酸甘油脂、預膠凝化澱粉及其類似物。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第十九版(Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)；Hoover, John E.,Remington ' s Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975；Liberman, H.A.及Lachman, L., 編,Pharmaceutical Dosage Forms , Marcel Decker, New York, N.Y., 1980；及Pharmaceutical Dosage Fo rmsand Drug Delivery Systems, 第七版(Lippincott Williams & Wilkins1999)。
在一些情況下，醫藥調配物進一步包括pH調節劑或緩衝劑，該等pH調節劑或緩衝劑包括酸，諸如乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸及鹽酸；鹼，諸如氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉及參羥基甲胺基甲烷；及緩衝劑，諸如檸檬酸鹽/右旋糖、碳酸氫鈉及氯化銨。包括呈將組合物之pH維持在可接受範圍內所需之量之該等酸、鹼及緩衝劑。
在一些情況下，醫藥調配物包括呈使組合物之重量莫耳滲透濃度達可接受範圍所需之量之一或多種鹽。該等鹽包括具有鈉、鉀或銨陽離子及氯、檸檬酸根、抗壞血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子之鹽；合適鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及硫酸銨。治療方案
在一些實施例中，投與本文所描述之醫藥組合物以用於治療性應用。在一些實施例中，每天一次、每天兩次、每天三次或更多次投與醫藥組合物。每日、每天、每隔一天、一週五天、一週一次、每隔一週、每月兩週、每月三週、每月一次、每月兩次、每月三次或更多次投與醫藥組合物。投與醫藥組合物達至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、18個月、2年、3年或更長時間。
在一些實施例中，同時、依序或以間隔時間段投與一或多種醫藥組合物。在一些實施例中，同時投與一或多種醫藥組合物。在一些情況下，依序投與一或多種醫藥組合物。在額外情況下，以間隔時間段投與一或多種醫藥組合物(例如在第一天首先投與第一醫藥組合物，接著在投與至少第二醫藥組合物之前間隔至少1、2、3、4、5天或更長時間)。
在一些實施例中，共投與兩種或更多種不同醫藥組合物。在一些情況下，同時共投與兩種或更多種不同醫藥組合物。在一些情況下，依序共投與兩種或更多種不同醫藥組合物，且投與之間無時間間隙。在其他情況下，依序共投與兩種或更多種不同醫藥組合物，且投與之間之間隙為約0.5小時、1小時、2小時、3小時、12小時、1天、2天或更長時間。
在患者狀態改善之情況下，在醫生判斷後組合物投與連續地進行；可替代地，所投與之組合物之劑量暫時減少或暫時中止達特定時間長度(亦即「藥物假期」)。在一些情況下，藥物假期之長度在2天與1年之間變化，包括僅例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。藥物假期期間之劑量減少為10%-100%，包括僅例如10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
一旦患者病況發生改善，則在必要時投與維持劑量。隨後，可依據症狀將投與劑量或頻率或兩者降低至經改善之疾病、病症或病況得以保持的位準。
在一些實施例中，與此類量相對應之給定藥劑之量視諸如以下之因素而變化：特定化合物、疾病之嚴重程度、需要治療之個體或宿主之屬性(例如重量)，然而通常以此項技術中已知之方式根據圍繞該病例之特定情形來確定，該等特定情形包括例如所投與之特定藥劑、投與途徑及所治療之個體或宿主。在一些情況下，所需劑量宜以單次劑量或以同時(或在短時間段內)或以適當間隔(例如每天兩次、三次、四次或更多次亞劑量)投與之分次劑量呈現。
前述範圍僅為建議範圍，此係因為關於個別治療方案之變數之數目大，且與此等推薦值有相當大之偏移並非不常見。該等劑量視許多變數而更改，該等變數不限於所用化合物之活性、待治療之疾病或病況、投與模式、個別個體之要求、所治療之疾病或病況之嚴重程度及醫師判斷。
在一些實施例中，該等治療方案之毒性及治療功效係在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來確定，該等標準醫藥程序包括但不限於測定LD50 (50%群體之致死劑量)及ED50 (50%群體之治療有效劑量)。毒性與治療效果之間之劑量比為治療指數且其表示為LD50與ED50之間之比率。展現高治療指數之化合物為較佳的。使用自細胞培養物分析及動物研究獲得之資料調配用於人類中之劑量範圍。該等化合物之劑量較佳處於包括在毒性最低情況下之ED50之循環濃度的範圍內。劑量視所採用劑型及所用投與途徑而在此範圍內變化。套組 / 製品
在某些實施例中，本文揭示與本文所描述之組合物及方法中之一或多者一起使用之套組及製品。該等套組包括載架、包或經分隔以容納一或多個容器(諸如小瓶、管及其類似容器，容器中之各者包含待用於本文所描述之方法中之獨立元件中的一者)之容器。合適容器包括例如瓶、小瓶、注射器及試管。在一個實施例中，容器由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。
本文所提供之製品含有封裝材料。醫藥封裝材料之實例包括但不限於泡殼包、瓶、管、袋、容器、瓶及適用於所選調配物及預期投與及治療模式之任何封裝材料。
舉例而言，容器包括本文所描述之抗轉鐵蛋白受體抗體及視情況選用之一或多種目標核酸分子。該等套組視情況包括與其在本文所描述之方法中使用有關之識別描述或標籤或說明書。
套組通常包括列出含量之標籤及/或使用說明書及藥品說明書與使用說明書。通常亦包括一組說明書。
在一個實施例中，標籤處於容器上或與容器系連。在一個實施例中，當形成標籤之字母、數字或其他特徵附著、模製或蝕刻至容器本身中時，標籤處於容器上；當標籤存在於容器或亦固持容器之載架內時，標籤與容器系連，例如呈藥品說明書形式。在一個實施例中，標籤用於指示待用於特定治療性應用之含量。標籤亦指示諸如本文所描述之方法中之內容物使用說明。
在某些實施例中，醫藥組合物係在含有一或多個含有本文所提供之化合物之單位劑型的包或分配器件中呈現。包例如含有金屬或塑膠箔(諸如泡殼包)。在一個實施例中，包或分配器件附有投與說明書。在一個實施例中，包或分配器亦附有與容器系連之通知書，該通知書所呈形式由管制醫藥之製造、使用或銷售之政府機構規定，該通知反映機構批准藥物形式用於人類或獸醫學投與。該通知書例如為經美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration)批准用於處方藥物之標籤，或經批准之藥品說明書。在一個實施例中，亦製備含有於相容醫藥載劑中調配之本文所提供之化合物之組合物，置放於適當容器中，且進行標記以用於指定病況治療。特定術語
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有熟習所主張之主題所屬技術者通常所理解之含義相同之含義。應理解，前述一般描述及以下詳細描述僅具例示性及解釋性且不限制所主張之任何主題。在本申請案中，除非另外明確陳述，否則單數之使用包括複數。必須注意，除非上下文另外清楚地指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該/該等」包括複數個提及物。在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。此外，術語「包括(including)」以及諸如「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(included)」之其他形式之使用不具限制性。
如本文所使用，範圍及量可表示為「約」特定值或範圍。約亦包括準確量。因此，「約5 µL」意謂「約5 µL」以及「5 µL」。一般而言，術語「約」包括預期在實驗誤差內之量。
本文所使用之部分標題僅出於組織目的且不應解釋為限制所描述之主題。
「抗體」及「免疫球蛋白」(Ig)為具有相同結構特徵之醣蛋白。該等術語同義地使用。在一些情況下，免疫球蛋白之抗原特異性為已知的。
術語「抗體」在最廣泛意義上使用且完全覆蓋經裝配之抗體、可結合抗原(例如Fab、F(ab')2 、Fv、單鏈抗體、雙功能抗體、抗體嵌合體、雜交抗體、雙特異性抗體、人類化抗體及其類似物)之抗體片段及包含前述物質之重組肽。
如本文所使用之術語「單株抗體」及「mAb」係指自實質上均質之抗體群獲得之抗體，亦即包含該群之個別抗體除可少量存在之可能性天然存在之突變之外其他相同。
「天然抗體」及「天然免疫球蛋白」通常為約150,000道爾頓之由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈構成之雜四聚體醣蛋白。各輕鏈藉由一個共價二硫鍵與重鏈連接，而在不同免疫球蛋白同型之重鏈中，二硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。各重鏈在一個末端處具有可變域(VH )，接著為多個恆定域。各輕鏈在一個末端處具有可變域(VL )且在其另一末端處具有恆定域；輕鏈恆定域與重鏈第一恆定域比對，且輕鏈可變域與重鏈可變域比對。咸信特定胺基酸殘基形成輕鏈可變域與重鏈可變域之間之介面。
術語「可變」係指可變域之某些部分在抗體中之序列方面廣泛不同之事實。可變區賦予抗原結合特異性。然而，可變性並非均勻分佈於整個抗體可變域中。其集中於三個片段中，該等片段稱為均處於輕鏈可變域及重鏈可變域中之互補決定區(CDR)或高變區。可變域之更高度保守部分稱為構架(FR)區。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含由三個CDR連接之四個FR區，該等FR區大體上採用β摺疊片組態，該等CDR形成連接β摺疊片結構之環且在一些情況下形成β摺疊片結構之一部分。各鏈中之CDR極為貼近FR區結合在一起，且與來自其他鏈之CDR一起促成抗體之抗原結合位點之形成(參見Kabat等人(1991) NIH公開案編號91-3242, 第I卷, 第647-669頁)。恆定域不直接地涉及於抗體與抗原之結合中，但展現諸如Fc受體(FcR)結合、抗體於抗體依賴型細胞毒性中之參與、補體依賴型細胞毒性引發及肥大細胞去顆粒之各種效應功能。
術語「高變區」在本文中使用時係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(亦即輕鏈可變域中之殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)以及重鏈可變域中之31-35 (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)；Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 國立衛生研究院公共衛生處(Public Health Service, National Institute of Health), Bethesda, Md.)及/或來自「高變環」之彼等殘基(亦即輕鏈可變域中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)及91-96 (L3)以及重鏈可變域中之(H1)、53-55 (H2)及96-101 (13)；Clothia及Lesk, (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917)。「構架」或「FR」殘基為除如本文所相信之高變區殘基以外之彼等可變域殘基。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(Zapata等人(1995) Protein Eng. 10:1057-1062)；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。抗體之木瓜酶消化產生稱為「Fab」片段之兩個相同抗原結合片段，各片段具有單個抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其容易結晶之能力。胃蛋白酶治療產生具有兩個抗原組合位點且仍能夠使抗原交聯之F(ab')2片段。
「Fv」為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密非共價締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域之二聚體組成。在此組態中，各可變域之三個CDR相互作用以界定VH -VL 二聚體表面上之抗原結合位點。六個CDR共同地賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單個可變域(或僅包含三個對抗原具有特異性之CDR之Fv之一半)能夠辨識且結合抗原，但親和力比總體結合位點低。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1 )。Fab片段與Fab'片段之不同之處在於在重鏈CH1 域之羧基端處添加數個殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab'-SH為本文中之Fab'標識，其中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基。Fab'片段係藉由還原F(ab')2片段重鏈二硫橋鍵產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為兩種明顯不同類型(稱為κ及λ)中之一種。
免疫球蛋白可視其重鏈恆定域之胺基酸序列而歸為不同類別。存在五種主要類別之人類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及IgY，且此等人類免疫球蛋白中之若干可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之子單元結構及三維組態為眾所周知的。不同同型具有不同效應功能。舉例而言，人類IgG1及IgG3同型具有ADCC (抗體依賴型細胞介導之細胞毒性)活性。
在一些情況下，抗體之CDR係根據以下確定：(i) Kabat編號系統(Kabat等人(197 ) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391及Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest 第五版, 美國衛生與人群服務部(U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開案編號91-3242)；或(ii) Chothia編號流程，其在本文中稱為「Chothia CDR」(參見例如Chothia及Lesk, 1987,J . Mol . Biol .,196 :901-917；Al-Lazikani等人, 1997,J . Mol . Biol .,273 :927-948；Chothia等人, 1992,J . Mol . Biol .,227 :799-817；Tramontano A等人, 1990,J . Mol . Biol .215 (1): 175-82；及美國專利第7,709,226號)；或(iii) ImMunoGeneTics (IMGT)編號系統，例如如以下中所描述：Lefranc, M.-P., 1999,The Immunologist ,7 : 132-136及Lefranc, M.-P.等人, 1999,Nucleic Acids Res . ,27 :209-212 (「IMGT CDR」)；或(iv) MacCallum等人, 1996,J . Mol . Biol .,262 :732-745。亦參見例如Martin, A., Antibody Engineering中之「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」,Kontermann及Diibel, 編, 第31章, 第422-439頁, Springer- Verlag, Berlin (2001)。
就Kabat編號系統而言，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於以下處：胺基酸位置31至35 (其視情況可包括一或兩個額外胺基酸)，接著為35 (在Kabat編號流程中作為35 A及35B提及) (CDRl)、胺基酸位置50至65 (CDR2)及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於以下處：胺基酸位置24至34 (CDRl)、胺基酸位置50至56 (CDR2)及胺基酸位置89至97 (CDR3)。如熟習此項技術者所熟知，使用Kabat編號系統，抗體可變域之實際線性胺基酸序列可由於FR及/或CDR之縮短或延長而含有較少或額外胺基酸，且因而，胺基酸之Kabat編號並非必需與其線性胺基酸編號相同。
就Chotia編號系統而言，抗體重鏈分子內之CDR通常存在於以下處：胺基酸位置26至31 (其視情況可包括一或兩個額外胺基酸)，接著為31 (在Chotia編號流程中作為31A及31 B提及) (CDR1)、胺基酸位置52至56 (CDR2)及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Chotia編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR通常存在於以下處：胺基酸位置24至34 (CDR1)、胺基酸位置50至56 (CDR2)及胺基酸位置89至97 (CDR3)。如熟習此項技術者所熟知，使用Chotia編號系統，抗體可變域之實際線性胺基酸序列可由於FR及/或CDR之縮短或延長而含有較少或額外胺基酸，且因而，胺基酸之Chotia編號並非必需與其線性胺基酸編號相同。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之剩餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
術語「人類化抗體」係指其中構架或CDR已經修飾以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性之免疫球蛋白之CDR的抗體。
如本文所使用之術語「個體(individual(s)/subject(s))」及「患者」意謂任何哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為人類。在一些實施例中，哺乳動物為非人類。該等術語中無一者需要或限於特徵在於以下之情形：健康照護工作者(例如醫生、註冊護士、護士從業者、醫師助理、勤雜工或臨終關懷工作者)之(例如持續或間歇性)監督。實例
此等實例僅出於說明之目的提供且不限制本文所提供之申請專利範圍之範疇。實例 1 ：人類化抗 TfR 抗體產生及表徵
將編碼例示性抗TfR抗體之核酸穩定地轉染至CHOK1SV GSKO細胞中以產生3個穩定池/種產物。自轉染後第8天開始監測穩定池之細胞生長及蛋白A力價。一旦培養物達到在70%活力下0.6 × 10e6 個細胞/毫升之臨限值，則使穩定池傳代。當細胞之活力超過97%時，使用所測試之池當中之最高生產池來以0.2 × 10e6 個細胞/毫升接種600毫升進料批式過度生長培養物(FOG)/種產物。在第4天及第8天進料FOG培養物且在第11天藉由離心及無菌過濾進行採集。藉由在AKTA純化器(以10 mL/min運行)上使用串聯3 × 5 ml MabSelectSuRE管柱進行蛋白A純化來純化無菌細胞培養上清液。將管柱用50 mM磷酸鈉、250 mM氯化鈉(pH 7.0)平衡，用50 mM磷酸鈉及1 M氯化鈉(pH 7.0)洗滌，且用10 mM甲酸鈉(pH 3.5)溶離。藉由用2× PBS進行1:2稀釋來中和經溶離之溶離份，隨後使用經稀釋之NaOH將pH調節至7.4。
藉由SE-HPLC及SDS-PAGE分析抗體。藉由SE-HPLC使用Zorbax GF-2509.4 mm ID × 25 cm管柱(Agilent)分析重複樣品。注入1 mg/ml樣品之80 µl等分試樣，且在50 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、500 mM L-精胺酸(pH 6.0)中以1 ml/min運行15分鐘。所有變異體均顯示與可溶性聚集物一致之＜16.89%小峰值及~7.66 min滯留時間。使用Empower第3版軟體分析可溶性聚集物含量。
表9說明所測試之抗TfR抗體之構築體設計及HPLC分析。
抗體名稱 HC 名稱 LC 名稱 滯留時間 (Min) % 單體
13E4-變異體2i 13E_VH2_a 13E4_VL1 8.315 95.44
13E4-變異體2ii 13E_VH2_b 13E4_VL1 8.326 95.86
13E4-變異體2iii 13E_VH2_c 13E4_VL1 8.324 95.85
13E4-變異體9i 13E_VH1_a 13E4_VL3 8.337 94.40
13E4-變異體9ii 13E_VH1_b 13E4_VL3 8.347 94.62
13E4-變異體9iii 13E_VH1_c 13E4_VL3 8.324 96.28
13E4-變異體15i 13E_VH3_a 13E4_VL4 8.311 83.11
13E4-變異體15ii 13E_VH3_b 13E4_VL4 8.316 87.39
13E4-變異體15iii 13E_VH3_c 13E4_VL4 8.311 88.50
對九個例示性人類化抗TfR抗體及親本嵌合抗體之結合動力學進行表徵。在BioRad ProteOn XPR36光學生物感測器上使用用於mAb採集之塗佈有蛋白A之GLM感測器晶片運行研究。運行緩衝液包括10 mm HEPES、150 mM NaCl (pH 7.4)及0.05% tween-20與0.2 mg/ml BSA。在25℃下收集資料。基於所提供之儲備液濃度，將所有mAb稀釋至運行緩衝液中達到2 μg/ml。隨後，在蛋白A表面上採集各物質達40秒。
將hTfR (100 μg)溶解於300 μL水中，得到4.3 μM儲備液濃度。將hTfR稀釋至43 nM作為最高濃度且在3倍稀釋系列中進行測試。以200 μl/min注入hTfR達2分鐘，接著為一小時解離期。
藉由減除內點參考表面之資料來處理反應資料，且二次提及緩衝液注入。
表10說明在25℃下測定之結合常數。
   k a (M-1 s-1 ) k d (s-1 ) K D (pM)
13E4_WT第1 1.0608(2)*e6 3.7(2)e-7 0.35(1)
13E4_WT第2 9.03(1)e5 1.50(2)e-6 1.66(1)
13E4_WT第3 8.402(9)e5 1.18(2)e-6 1.40(1)
平均值(n =3) 9[1]**e5 1.0[6]e-6 1.1[7]
           
13E4_變異體2-i 9.132(1)e5 3.9(2)e-7 0.43(1)
13E4_變異體2-ii 8.801(1)e5 4.3(2)e-7 0.49(1)
13E4_變異體2-iii 8.623(1)e5 8.2(2)e-7 0.95(1)
13E4_變異體9-i 8.427(2)e5 1.02(2)e-6 1.21(2)
13E4_變異體9-ii 7.843(2)e5 1.81(3)e-6 2.31(1)
13E4_變異體9-iii 7.913(8)e5 4.17(2)e-6 5.27(1)
13E4_變異體15-i 7.205(7)e5 6.13(2)e-6 8.51(1)
13E4_變異體15-ii 6.966(8)e5 9.14(3)e-6 13.1(1)
13E4_變異體15-iii 6.947(9)e5 6.94(3)e-6 9.99(1)
*括號中之數字代表基於資料集擬合之最後一次報導之數位中之標準誤差。 **括號中之數字代表基於複製資料集之實驗標準差。舉例而言，9[1]e5代表(9 ± 1)e5。實例 2
使用 hIgG2 TfR1 嵌合抗體 siRNA ( SSB ) 結合物進行之活體內基因下調
將針對hTfR1之小鼠IgG2抗體之CDR次選殖至人類IgG2背景中，且參見實例4之序列，轉染至CHO-K1SP細胞中。選擇穩定細胞池，在37℃及5% CO2下使用Wave生物反應器(GE Healthcare)在於細胞袋(GE Healthcare)中之Dynamis培養基(GIBCO)中擴增且接種。每兩天進料一次8%最終培養物體積(25公升)，在第4天陳述，進行總共14天培育。採集培養物上清液，進行深度過濾，且使用Monofinity A樹脂(GenScript)以30 ml/min之流動速率進行純化。將經溶離之蛋白質之緩衝液更換為PBS，且藉由在還原及非還原條件下之SDS-PAGE且藉由SEC-HPLC分析經純化之蛋白質的分子量及純度。最終蛋白質純度＞98%。
使用雙順丁烯二醯亞胺 ( BisMal ) 連接子將 TfR1 - IgG2 mAb 嵌合體結合至 SSB siRNA
對於用於此實驗中之結合物，使用SSB siRNA雙螺旋體。21聚體SSB引導股/反義股之序列為(5'至3') UUACAUUAAAGUCUGUUGUUU (SEQ ID NO: 81)。在固相上使用標準胺基磷酸酯化學物質完全裝配單股且使用HPLC進行純化。使用RNAi領域中充分描述之鹼基、糖及磷酸酯修飾以使雙螺旋體效力最佳化且降低免疫原性。參見圖1，siRNA隨從股含有於5'端上之C6-NH2 結合柄。siRNA雙螺旋體設計為具有19個具互補性鹼基及一個3'二核苷酸突出端之鈍端雙螺旋體。參見圖2，結合柄經由末端鹼基上之磷酸二酯連接至siRNA隨從股。
步驟 1 ：用 TCEP 減少抗體
用25 mM硼酸酯緩衝液(pH 8)及1 mM DTPA對抗體進行緩衝液更換且達到10 mg/ml濃度。向此溶液中添加4當量於相同硼酸酯緩衝液中之TCEP且在37℃下培育2小時。在室溫(RT)下將所得反應混合物與BisMal-siRNA (1.25當量)於pH 6.0 10 mM乙酸酯緩衝液中之溶液組合且保持在4℃下隔夜。藉由分析性SAX管柱層析法進行之反應混合物分析顯示抗體siRNA結合物以及未反應之抗體及siRNA。用10 EQ N-乙基順丁烯二醯亞胺(於DMSO中，在10 mg/mL下)處理反應混合物以覆蓋任何剩餘游離半胱胺酸殘基。
步驟 2 ：純化
藉由AKTA純FPLC使用陰離子交換層析(SAX)法-1純化粗反應混合物。分離含有DAR1抗體-siRNA結合物之溶離份，濃縮且用pH 7.4之PBS進行緩衝液更換。
陰離子交換層析法 ( SAX )- 1 .
管柱：Tosoh Bioscience，TSKGel SuperQ-5PW，21.5 mm ID × 15 cm，13 µm
溶劑A：20 mM TRIS緩衝液，pH 8.0；溶劑B：20 mM TRIS，1.5 M NaCl，pH 8.0；流動速率：6.0 ml/min
梯度： a)      %A  %B    管柱    體積 b)     100    0        1 c)      81     19       0.5 d)     50     50       13 e)      40     60       0.5 f)      0       100     0.5 g)     100    0        2
強陰離子交換層析 ( SAX ) 法 - 2
管柱：Thermo Scientific，ProPacTM SAX-10，Bio LCTM ，4 × 250 mm
溶劑A：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇；溶劑B：80% 10 mM TRIS pH 8，20%乙醇，1.5 M NaCl；流動速率：0.75 ml/min
梯度： a)         時間  %A    %B b)        .0       90    10 c)         3.00    90    10 d)        11.00  40    60 e)         14.00  40    60 f)         15.00  20    80 g)        16.00  90    10 h)        20.00  90    10
藉由分析性HPLC使用SAX法-2評估結合物之純度(表11)。
結合物 SAX 滯留時間 (min) 純度 % ( 以峰面積計 )
TfR-SSB DAR 1 9.41 99
用於此實例中之結合物之分析性資料表：以分鐘為單位之HPLC滯留時間(RT)及以層析峰面積計之純度%。
hTfR1 - IgG2 mAb siRNA DAR1 結合物之活體外活性
使用ELISA分析評估hTfR1-IgG2 mAb siRNA結合物結合人類及cynoTfR1之能力。半充分高結合96孔盤(Costar編號3690)塗佈有1 ng/µL於PBS (Gibco 14190)中之重組人類轉鐵蛋白受體蛋白(Sino Biological 11020-H07H)或重組食蟹獼猴轉鐵蛋白受體蛋白(Sino Biological 90253-C07H)且在4℃下培育隔夜。用100 µL Tris緩衝鹽水+ Tween (20× TBST，Cell Signaling 9997S)洗滌盤四次。將100 µL Superblock (ThermoFisher PI-37535)添加至各孔中且在室溫下培育1小時。在添加樣品之前重複洗滌步驟。每個孔添加50 µL濃度為至多10 nM之樣品。將盤在室溫下再培育一小時且重複洗滌步驟。將二級抗體(對Fcγ片段具有特異性之過氧化酶親和純化山羊抗人類IgG，Jackson Immunoresearch，109-035-098)在Superblock中進行1:5000稀釋且每個孔添加50 µL。將盤在室溫下培育1小時且再洗滌一次。藉由添加50 µL 1-Step™超TMB-ELISA (ThermoFisher，34028)，培育5分鐘來量測結合，且在添加25 µL終止溶液2N硫酸(R&D Systems DY994)之情況下終止反應。量測450 nm處之吸光度，其中減除570 nm參考波長。使用利用希爾斜率(Hill Slope)之GraphPad Prism特異性結合測定結合常數。
未經結合及經結合之hTfR1.IgG2 mAb抗體以類似親和力結合重組人類及食蟹獼猴TfR1 (圖3A-圖3B)。
在HEL92.1.7及人類骨胳肌肉細胞中監測TfR1.IgG2 mAb-SSB結合物下調SSB表現之能力。在含有10%胎牛血清(Nucleus Biologics FBS1824)之RPMI 1640中培養HEL92.1.7細胞(ATCC® TIB-180™)。將細胞稀釋至100,000個/mL且向盤之各孔中添加100 µL。稀釋抗體結合物以獲得100 nM最高濃度。將作為陰性對照之20 µL結合物或PBS添加至96孔盤之孔中，將經治療之細胞置放在37℃及5% CO2 下達72小時。
將永生化人類骨胳肌肉細胞(巴黎肌學研究所(Institute of Myology, Paris))塗鋪於24孔膠原蛋白盤(Thermo Fisher A1142802)上之500 µl骨胳肌肉細胞生長培養基(PromoCell C-23260)中，且在37℃下在5% CO2 中培育直至肌母細胞變得匯合為止。此時，藉由在500 µl分化培養基(補充有10 μg/ml胰島素及50 µg/ml健他黴素之DMEM (Gibco 10566-016))中培育4天來誘導肌管分化。更新培養基且添加50 µl於PBS中稀釋之TfR1.IgG2 mAb-SSB結合物。將經治療之細胞培育72小時。對於任一細胞類型之採集及分析，自孔移除培養基且添加150 µl Trizol (Ambion 15596018)。在分析之前，將盤在-80℃下冷凍隔夜或更長時間。遵循製造商說明書使用Direct-zol 96 RNA套組分離RNA且以光譜方式定量。根據製造商說明書使用高容量cDNA套組(Thermo Fisher編號4368813)對RNA (100-200 ng)進行逆轉錄。使用TaqMan qPCR，使用經適當地設計之引子及探針對mRNA含量進行定量。使用PPIB (管家基因)作為內部RNA內參考物。使用ΔΔCt方法計算mRNA %，其中經PBS治療之細胞設定成100%表現。在此等實驗中，TfR1.IgG2 mAb-SSB結合物下調SSB至多60%，然而在經TfR1.IgG2 mAb-MSTN結合物(陰性對照)治療之細胞中SSB受到最大限度地25%下調(圖4A-圖4B)。
食蟹獼猴中之 hTfR1 - IgG2 mAb SSB siRNA 結合物之活性及安全性
在食蟹獼猴中評估hIgG2 TfR1.mAb-siSSB結合物之PK、PD及安全性特點。動物為雄性，2-3歲且體重介於2-3 kg之間。給藥動物30 mg/kg或60 mg/kg (mAb濃度)該結合物，或藉由30分鐘(+/- 3分鐘)靜脈內(IV)輸注給藥PBS。在如表12中所概述之不同時間分別自受約束、有意識動物之周邊靜脈或已服鎮靜劑之動物之腓腸肌及四頭肌收集血液試樣及肌肉生檢。
表12：經hTfR1.IgG2 mAb siRNA結合物治療之食蟹獼猴之取樣時程。
時間點 (研究週數) 血液學 血清化學反應 PK 肌肉生檢 c
馴化 (第2週) 1× 1× - 1× (腓腸肌)
馴化 (第1週) 1× 1× - 1× (腓腸肌)
給藥 第1天 1× 1× 3× (5'，4h) -
第2天 1× 1× 1× -
第3天       1× -
第4天 1× 1× 1× -
第8天 1× 1× 1× -
第15天 1× 1× 1× -
第22天 1× 1× 1× 1× (腓腸肌)
第29天 1× 1× 1× 2× (腓腸肌、四頭肌)
使用莖環qPCR分析測定hIgG2 TfR1.mAb-siSSB結合物之血漿濃度。簡言之，將血漿樣品直接稀釋於TE緩衝液+ 0.1% v/v Triton X-100中。藉由將siRNA刺突至來自未經治療之動物之血漿中且隨後用TE緩衝液+ 0.1% v/v Triton X-100進行連續稀釋來生成標準曲線。使用TaqMan微小RNA反轉錄套組(Applied Biosystems)及25 nM序列特異性莖環RT引子對siRNA之反義股進行逆轉錄。利用來自RT步驟之cDNA以使用TaqMan快速高級主混合物(Applied Biosystems)及1.5 μM正向引子、0.75 μM反向引子及0.2 μM探針進行即時PCR。SSB siRNA反義股及用於量測其之所有引子及探針之序列示於表13中。使用QuantStudio 7 Flex即時PCR系統(Life Technologies)中之標準循環條件執行定量PCR反應。使用自標準曲線導出之線性等式將Ct值轉換成血漿或組織濃度。表 13 . 用於莖環 qPCR 分析中之所有 siRNA 反義股、引子及探針之序列
目標 名稱 序列 (5 ' – 3 ' ) SEQ ID NO:
SSB 反義(引導) UUACAUUAAAGUCUGUUGUUU 81
SSB RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACAAC 82
SSB 正向 GGCGGCTTACATTAAAGTCTGT 83
SSB 反向 AGTGCAGGGTCCGAG 84
SSB 探針 (6FAM)-TGGATACGACAAACAA-(NFQ-MGB) 85
結合物之清除率及半衰期示於表14中。此等結合物之PK特性與於小鼠中測試之小鼠抗轉鐵蛋白mAb結合物類似。 表14：hTfR1.IgG2 mAb-SSB結合物在食蟹獼猴中藉由30 min輸注以30 mg/kg及60 mg/kg投與(n=3)後之PK參數估計值。
      AUC0-29d 劑量 CL CL α t1/2 β t1/2
AOC 劑量 (mg/kg) (mg/mL)*min mg/kg mL/min/kg μL/min/kg h h
hTfR1.IgG2 mAb-SSB (DAR1) 3 82.89 3 0.036 36 12.9 230
hTfR1.IgG2 mAb-SSB (DAR1) 6 155.2 6 0.039 39 13.8 269
為評估肌肉中之siRNA濃度及結合物活性，根據表12中所示之時程獲得肌肉生檢(腓腸肌及四頭肌)。藉由6 mm衝頭採取肌肉生檢，稱重且在液氮中急凍。在1 ml冷TRIZOl (供應商)中使經冷凍之組織樣品均質化。為確定mRNA減弱，遵循製造商說明書使用Direct-zol 96 RNA套組自組織提取總RNA且以光譜方式定量。根據製造商說明書使用高容量cDNA套組(Thermo Fisher編號4368813)對RNA (100-200 ng)進行逆轉錄。使用TaqMan qPCR，使用經適當地設計之引子及探針對SSB mRNA含量進行定量。使用PPIB (管家基因)作為內部RNA內參考物。使用ΔΔCt方法計算mRNA %，其中治療前同一動物中之SSB mRNA含量或經PBS治療之動物中之SSB含量設定成100%表現。
使用莖環qPCR分析確定組織siRNA濃度之定量。簡言之，在500 uL Trizol中使用基於組織研磨機II盤之均質機(Qiagen)使15-50 mg組織塊均質化且隨後在TE緩衝液+ 0.1% v/v Triton X-100中稀釋。藉由將siRNA刺突至來自未經治療之動物之經均質化組織中且隨後用TE緩衝液+ 0.1% v/v Triton X-100進行連續稀釋來生成標準曲線。使用TaqMan微小RNA反轉錄套組(Applied Biosystems)及25 nM序列特異性莖環RT引子對siRNA之反義股進行逆轉錄。利用來自RT步驟之cDNA以使用TaqMan快速高級主混合物(Applied Biosystems)及1.5 μM正向引子、0.75 μM反向引子及0.2 μM探針進行即時PCR。SSB siRNA反義股及用於量測其之所有引子及探針之序列示於表13中。使用QuantStudio 7 Flex即時PCR系統(Life Technologies)中之標準循環條件執行定量PCR反應。使用自標準曲線導出之線性等式將Ct值轉換成血漿或組織濃度。
用該結合物進行之食蟹獼猴治療引起至多62%之腓腸肌中之SSB mRNA下調及至多75%之四頭肌中之SSB mRNA下調(圖5A及圖5B)。此等組織中之siRNA濃度為劑量依賴型的，且對於30 mg/kg及60 mg/kg劑量而言，分別介於0.6-1.9 nM之間及2.0-6.5 nM之間。當在給藥後21或28天進行探測時，組織中之結合物活性及siRNA濃度為類似的。此等結果證實，所選TfR1抗體可有效地將siRNA遞送至靈長類動物肌肉組織中，且靶向轉鐵蛋白受體之AOC之活性在物種之間轉譯。
為監測靈長類動物中之所選抗hTfR1抗體之安全性，根據表x中所示之時程分析血液學及臨床化學。在網狀紅血球之劑量依賴型但暫時性耗乏(圖6)除外之情況下，在給藥後至多28天未觀測到對任何血液學或臨床化學參數之治療相關影響。所觀測到之網狀紅血球暫時下調已描述為TfR1抗體之副作用。已顯示具有完整效應功能或補體結合能力之鼠TfR1抗體嚴重耗乏表現TfR之網狀紅血球(Daniels-Wells等人, 「Transferrin receptor 1: a target for antibody-mediated cancer therapy」,Immunotherapy 8 (9): 991-994 (2016))。因為靈長類動物中之表現高含量TfR1之網狀紅血球分數低，故與嚙齒動物相比，網狀紅血球耗乏僅為暫時且不太明顯的。重要地，其他人員之研究已顯示，此活性可藉由移除抗體之ADCC/CDC活性之突變而得到成功遏制(WO 2014/189973 A2)。實例 3
人類 / 食蟹獼猴交叉反應性抗 TfR1 抗體之生成、表徵及人類化
使用此項技術中充分描述之現代電腦模擬抗體人類化及去免疫化程式，設計在實例1中之NHP研究中測試之嵌合抗轉鐵蛋白1 mAb的16種變異體，參見表XYZ之變異體序列。作為設計之一部分，進行藉由高風險轉譯後修飾(PTM)識別進行之可製造性評估，且在可行之情況下，執行作為人類化活動之一部分之經由胺基酸取代進行之其移除。亦進行免疫原性風險評估以識別且在可行之情況下移除高風險抗原決定基。亦進行向變異體之Fc域中之突變引入以移除效應功能(ADCC及CDC)。隨後，在哺乳動物細胞培養物中使用此項技術中充分描述之技術表現16種變異體，且使用基於蛋白A樹脂之親和性層析法進行純化。隨後，對mAb變異體進行完全表徵且如下文所描述製造siRNA結合物。
人類及食蟹獼猴 TfR1 ELISA 分析
此等分析之目標為驗證16種變異人類抗TfR1抗體結合至人類TfR1及食蟹獼猴TfR1兩者。人類或食蟹獼猴轉鐵蛋白受體ELISA分析方案描述於下文中：
半充分高結合96孔盤(Costar編號3690)塗佈有1 ng/µL於PBS (Gibco 14190)中之重組人類轉鐵蛋白受體蛋白(Sino Biological 11020-H07H)或重組食蟹獼猴轉鐵蛋白受體蛋白(Sino Biological 90253-C07H)且在4℃下培育隔夜。用100 µL Tris緩衝鹽水+ Tween (20× TBST，Cell Signaling 9997S)洗滌盤四次。將100 µL Superblock (ThermoFisher PI-37535)添加至各孔中且在室溫下培育1小時。在添加樣品之前重複洗滌步驟。每個孔添加50 µL濃度為至多10 nM之樣品。將盤在室溫下再培育一小時且重複洗滌步驟。將二級抗體(對Fcγ片段具有特異性之過氧化酶親和純化山羊抗人類IgG，Jackson Immunoresearch，109-035-098)在Superblock中進行1:5000稀釋且每個孔添加50 µL。將盤在室溫下培育1小時且再洗滌一次。藉由添加50 µL 1-Step™超TMB-ELISA (ThermoFisher，34028)，培育5分鐘來量測結合，且在添加25 µL終止溶液2N硫酸(R&D Systems DY994)之情況下終止反應。量測450 nm處之吸光度，其中減除570 nm參考波長。使用利用希爾斜率之GraphPad Prism特異性結合測定結合常數。
圖7及圖8分別說明與食蟹獼猴CD71及人類CD71之結合結果。
Tf - TfR 阻斷 ELISA 分析
此分析之目標為驗證在存在全轉鐵蛋白之情況下TfR抗體結合至TfR。
遵循製造商說明書使用50倍莫耳過量之EZ-Link No weigh NHS-生物素(Thermo Scientific A39256)對抗體進行生物素標記。在4℃下使半充分高結合盤(Costar編號3690)塗佈有500 ng/mL於PBS中之經純化人類全轉鐵蛋白(R&D Systems 2914-HT)隔夜。為進行比較，用hTfR直接塗佈盤。用100 µL Tris緩衝鹽水+ Tween (20× TBST，Cell Signaling 9997S)洗滌盤四次。將100 µL Superblock (ThermoFisher PI-37535)添加至各孔中且在室溫下培育1小時。在將hTfR (於25 µl中200 ng/mL)添加至轉鐵蛋白盤或將Superblock添加至hTfR盤且培育30分鐘之前，重複洗滌步驟。將經生物素標記抗體稀釋至20 nM以獲得高濃度，且添加至盤中且進行3倍連續稀釋。將25 µl/孔添加至盤中已存在之25 µl。將盤培育1小時，且重複洗滌步驟。在進行藥品說明書上之推薦稀釋之後，添加抗生蛋白鏈菌素-HRP (R&D Systems DY998)，且進行最終洗滌步驟。藉由添加50 µL 1-Step™超TMB-ELISA (ThermoFisher，34028)，培育5分鐘來量測結合，且在添加25 µL終止溶液2N硫酸(R&D Systems DY994)之情況下終止反應。量測450 nm處之吸光度，其中減除570 nm參考波長。使用利用希爾斜率之GraphPad Prism特異性結合測定結合常數。在存在與不存在轉鐵蛋白之情況下之抗體結合常數變化視為與市售抗體相關，已知該市售抗體具有與轉鐵蛋白重疊之抗原決定基(AF2474，R&D Systems)。參見圖9A-圖9B。
HFE - TfR 結合 ELISA 分析
此分析之目標為驗證當TfR結合至HFE時TfR抗體維持結合。
遵循與在存在轉鐵蛋白之情況下之TfR結合相同之方法運行此分析，其中轉鐵蛋白經輔因子HFE (遺傳性血色素沉著症蛋白質，mybiosource.com，MBS953891)置換。參見圖10A-圖10B。
FcγRIIIA (CD16a) ELISA
此分析之目標為藉由量測與FcγRIIIA (CD16a)基因型V158之結合來確定抗體之ADCC活性的潛在性。使半充分高結合96孔盤(Costar編號3690)塗佈有2 ng/µL於PBS (Gibco 14190)中之重組CD16a蛋白質(Sino Biological 10389-H27H1)且在4℃下培育隔夜。用100 µL Tris緩衝鹽水+ Tween (20× TBST，Cell Signaling 9997S)洗滌盤四次。將100 µL Superblock (ThermoFisher PI-37535)添加至各孔中且在室溫下培育1小時。在添加樣品之前重複洗滌步驟。每個孔添加50 µL濃度為至多1 µM之樣品。將盤在室溫下再培育一小時且重複洗滌步驟。將二級抗體(對Fcγ片段具有特異性之過氧化酶親和純化山羊抗人類IgG，Jackson Immunoresearch，109-035-098)在Superblock中進行1:5000稀釋且每個孔添加50 µL。將盤在室溫下培育1小時且再洗滌一次。藉由添加50 µL 1-Step™超TMB-ELISA (ThermoFisher，34028)，培育5分鐘來量測結合，且在添加25 µL終止溶液2N硫酸(R&D Systems DY994)之情況下終止反應。量測450 nm處之吸光度，其中減除570 nm參考波長。使用利用希爾斜率之GraphPad Prism特異性結合測定結合常數。參見圖11。
HEL92 . 1 . 7 細胞中之活體外效力分析
此分析之目標為證實TfR mAb結合物能夠進行siRNA遞送及基因特異性下調。mAb變異體結合至活性siRNA (SSB)或加擾對照(Scr)。在含有10%胎牛血清(Nucleus Biologics FBS1824)之RPMI 1640 (Gibco A10491)中培養HEL92.1.7細胞株(ATCC® TIB-180™)。稀釋抗體-siRNA結合物以獲得100 nM最大劑量。將20 µl結合物添加至96孔盤之孔中。將20 µl PBS添加至一些孔中作為額外陰性對照。將細胞稀釋至100,000個/mL且向盤之各孔中添加100 µl。將細胞置放在37℃及5% CO2 下達72小時。自孔移除培養基且添加150 µl Trizol (Ambion 15596018)。在分析之前，將盤在-80℃下冷凍隔夜或更長時間。遵循製造商說明書使用Direct-zol 96 RNA分離套組(Zymo Research R2056)分離RNA。根據製造商說明書使用高容量cDNA套組(Applied biosystems 4368814)對RNA進行逆轉錄，且用Taqman快速高級主混合物(Applied Biosystems 4444558)及SSB與PPIB Taqman探針集(ThermoFisher Hs04187362_g1及Hs00168719_m1)進行qPCR。使用ΔΔCt方法計算mRNA %，其中經PBS治療之細胞設定成100%表現。
如實例2中所描述製造且表徵含有活性siRNA (SSB)或非活性或加擾siRNA (Scr)之DAR1結合物。對於此等結合物，含有Cy5螢光標籤之SSB siRNA結合於核糖2'羥基上之隨從股之位置11上。在固相合成期間引入此物質，且不抑制引導股之活性但允許進行吸收分析。藉由分析性HPLC使用陰離子交換層析法-2評估結合物之純度，且層析滯留時間及純度描述於下表15中。 表15
結合物 SAX 滯留時間 (min) 純度 % ( 以峰面積計 )
hIgG1 TfRVar2i-SSB DAR 1 9.106 98.2
hIgG1 TfR-Var2i-Scr DAR 1 8.905 98.0
hIgG1 TfR-Var2ii-SSB DAR 1 9.059 98.3
hIgG1 TfR-Var2ii-Scr DAR 1 8.863 98.4
hIgG1 TfR-Var2iii-SSB DAR 1 9.069 98.2
hIgG1 TfR-Var2iii-Scr DAR 1 8.871 98.5
hIgG1 TfR-Var9i-SSB DAR 1 9.066 98.4
hIgG1 TfR-Var9i-Scr DAR 1 8.867 98.5
hIgG1 TfR-Var9ii-SSB DAR 1 9.048 98.6
hIgG1 TfR-Var9ii-Scr DAR 1 8.855 98.8
hIgG1 TfR-Var9iii-SSB DAR 1 9.069 98.6
hIgG1 TfR-Var9iii-Scr DAR 1 8.862 99.0
hIgG1 TfR-Var15i-SSB DAR 1 9.097 98.8
hIgG1 TfR-Var15i-Scr DAR 1 8.892 98.6
hIgG1 TfR-Var15ii-SSB DAR 1 9.082 98.2
hIgG1 TfR-Var15ii-Scr DAR 1 8.882 98.8
hIgG1 TfR-Var15iii-SSB DAR 1 9.078 98.3
hIgG1 TfR-Var15iii-Scr DAR 1 8.877 98.6
hIgG1 TfR-WT-SSB DAR 1 9.045 98.6
hIgG1 TfR-WT-Scr DAR 1 8.847 98.9
用於此實例中之結合物之分析性資料表：以分鐘為單位之HPLC滯留時間(RT)及以層析峰面積計之純度%。
由 PBMC 中之 TfR1 抗體及抗體 siRNA 結合物 ( ASC ) 介導之抗體依賴型細胞毒性 ( ADCC )
小鼠及非人類靈長類動物(NHP)中之研究已證實具有效應功能及/或補體結合能力之結合鼠/食蟹獼猴TfR之抗體選擇性地耗乏表現TfR之網狀紅血球。為確定變異體是否具有效應功能，使用來自健康人類供體之周邊血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞來進行ADCC分析。
材料 ：
來自BUYPBMC.COM之PBMC，批號2010113378，具有強ADCC活性。
目標細胞：HEL-92.1.7 (ATCC，編號TIB-180)；HEL (編號JCRB0062)
細胞毒性LDH套組，Pierce (ThermoFisher)，編號88953
含有10%加熱不活化FBS (在56℃下30分鐘)及2% L-麩醯胺酸之具有血清之組織培養基(完全培養基) RPMI 1640 (Life Technologies)
hIgG1 mAb變異體
程序 ：
在輕輕攪動之情況下在37℃水浴中解凍PBMC細胞。一旦解凍，則經30秒向小瓶逐滴添加1 mL溫培養基以使細胞調節至環境變化。將細胞緩慢地添加至含有9 mL溫培養基之15-mL或50-mL錐形管。沖洗具有1 mL含細胞培養基之原始小瓶以回收可黏著至側面之細胞；將沖洗培養基添加至錐形管。藉由離心集結350 × g細胞達8-12分鐘。丟棄上清液。藉由輕敲(避免過量剪切力)使細胞集結粒再懸浮。藉由將10 mL溫培養基添加至錐形管來再次沖洗細胞。藉由離心集結350 × g細胞達8-12分鐘。捨棄來自第二次洗滌之上清液。藉由輕敲(避免過量剪切力)使細胞集結粒再懸浮。視需要使細胞再懸浮於10 mL溫培養基中。在37℃下在T75中培育隔夜以使細胞適應。
用冷分析培養基2×採集且洗滌目標細胞HEL-92；確保高活力。在冰上在96孔圓底盤中之冷50 µl (8 × 105 )分析培養基(具有1% BSA及100個單位/毫升青黴素及鏈黴素之RPMI-1640)中以4 × 104 個/孔接種目標細胞。將測試抗體及對照抗體/ASC (10 µl)之稀釋液(6×，以10 µg/ml開始)添加至含有如同下表中之目標細胞之盤中，接著在冰上培育30分鐘以允許調理作用。將10 µl培養基添加至對照孔中以維持體積。
對照 ：
-背景低級對照：目標細胞自發性LDH釋放對照校正自目標細胞之自發性釋放(低級對照)。添加相同數目之用於實驗孔中之目標細胞。用培養基將最終體積調節至100 µL/孔。
-陽性高級對照：計算需要目標細胞最大LDH釋放對照以測定LDH之100%釋放。添加相同數目之用於實驗孔中之目標細胞。最終體積必須為100 µL/孔(步驟5添加10 µL 10×裂解緩衝液)。
-在含有目標細胞及效應細胞之孔中量測抗體非依賴型細胞毒性(AICC)，且不添加抗體。
以下兩個對照係用於監測分析條件，並非為ADCC計算所需。
-效應細胞自發性LDH釋放對照校正自效應細胞之LDH自發性釋放。添加各種數目之用於實驗孔中之效應細胞。用培養基將最終體積調節至100 µL/孔。
-需要培養基背景對照來校正由可存在於含血清培養基中之LDH活性產生之貢獻。將100 µL培養基添加至一式三份孔集合(無細胞)中。
在於冰上培育30 min之後，將於50 µl溫分析培養基(具有1% BSA及100個單位/毫升青黴素及鏈黴素之RPMI-1640)中之8 × 105 個PBMC效應細胞添加至各孔中，得到20:1效應細胞:目標細胞比，將盤在37℃下再培育4小時。
在採集上清液之前四十五分鐘，將10 µL裂解緩衝液(10×)添加至目標細胞最大LDH釋放對照(陽性對照)及體積校正對照中。將10 µL PBS添加至具有細胞之背景低級對照、樣品及其他對照中。在培育(350 g，10 min)之後對盤進行離心。將50 μl上清液轉移至96孔澄清平底盤中，且將50 µL反應混合物添加至各樣品孔中且藉由輕敲進行混合。將盤在室溫下避光培育30分鐘。將50 µL終止溶液添加至各樣品孔中且藉由輕敲進行混合。量測490 nm及680 nm處之吸光度。為測定LDH活性，由490 nm吸光度值減除680 nm吸光度值(來自儀器之背景信號)。
特異性 ADCC 活性 如下計算：
ADCC % = 100 × ((A490 (樣品)-A490 (AICC))/(A490 (高級對照)-A490 (低級對照))
結果說明於圖14中。
由兔血清 中之 TfR1 抗體及抗體 siRNA 結合物 ( ASC ) 介導之抗體依賴型細胞毒性 ( ADCC )
材料 ：
經凍乾之兔補體。用冰冷蒸餾水進行復原。輕輕地攪動以確保所有經凍乾之材料溶解。在復原一小時內使用。將經復原之材料始終保持在冰上。若等分試樣在½稀釋時不具有完全活性，則捨棄該等等分試樣。
目標細胞：HEL-92.1.7 (ATCC，編號TIB-180)
Viobility 405/452可固定染料
含有10%加熱不活化FBS (在56℃下30分鐘)及2% L-麩醯胺酸之具有血清之組織培養基(完全培養基) RPMI 1640 (Life Technologies)
hIgG1變異體
程序 ：
採集HEL92.1.7目標細胞且用冷分析培養基洗滌兩次。在96孔圓底盤中之冷25 µl分析培養基(具有1% BSA及100個單位/毫升青黴素及鏈黴素之RPMI-1640)中以5 × 104 個/孔接種細胞。將測試抗體及對照抗體(25 µl)之稀釋液(5×，以100 µg/ml開始，最終為50 μg/ml)添加至含有25 µl目標細胞之盤中，接著在冰上培育30分鐘以允許調理作用。
對照 ：
-背景低級對照：目標細胞自發性LDH釋放對照校正自目標細胞之自發性釋放(低級對照)。添加相同數目之用於實驗孔中之目標細胞。用培養基將最終體積調節至100 µL/孔。
-在含有目標及CDC之孔中量測抗體非依賴型細胞毒性(AICC)，且不添加抗體。
在30 min培育之後，除培養基及低級對照(具有50 µL培養基)以外，將50 µL補體添加至各孔中，且將盤在37℃下再培育60 min。在培育(350 g，10 min)結束時，對盤進行離心。添加經稀釋之Viobility 405/452染料(於100 µL染色緩衝液中之0.5 µL染料)。使盤在室溫下避光15分鐘。洗滌且固定細胞。進行流動分析以量測死亡細胞。
特異性 CDC 活性如下計算：
CDC % =樣品中之死亡細胞% -對照中之死亡細胞%
結果說明於圖15中。
人類抗 TfR1 IgG1 siRNA 結合物 ( ASC ) 活體外吸收至人類骨骼肌管中
為監測肌肉細胞中之ASC吸收，將初級人類骨骼肌母細胞(Thermo Fisher Scientific A11440)塗鋪於補充有10% FBS (Nucleus Biologics FBS1824)及1× ITS (Thermo Fisher Scientific 41400045)之1 mL DMEM (ATCC 30-2002)中的24孔膠原蛋白盤(Thermo Fisher A1142802)上。在37℃下在5% CO2中培育細胞直至肌母細胞變得匯合為止。此時，藉由在補充有2%馬血清(ATCC 30-2040)及1× ITS (Thermo Fisher Scientific 41400045)之1000 µl (1 mL) DMEM (ATCC 30-2002)中培育2天來誘導肌管分化。將培養基置換為500 μl分化培養基，且添加於PBS中稀釋之50 µl TfR1.IgG2 mAb-SSB(Cy5)結合物以達到1 nM及10 nM之最終濃度。將細胞在37℃下在5% CO2中培育24小時，隨後用500 μl PBS洗滌3×，且在150 μl T-PER裂解緩衝液(Thermo Fisher Scientific 78510)中使用冷凍-解凍循環進行裂解。用75 µl無核酸酶水稀釋75 μl經裂解細胞，且使用TECAN盤讀取器進行螢光測定(Ex 635 nM-Em 675 nM)。結果呈現為輸入物相關細胞中之螢光(圖16)。
由人類骨骼肌管中之人類抗 TfR1 IgG1 siRNA 結合物 ( ASC ) 介導之活體外基因下調
為監測TfR1.mAb-SSB結合物下調SSB mRNA含量之能力，將初級人類骨骼肌母細胞(Thermo Fisher Scientific A11440)塗鋪於補充有10% FBS (Nucleus Biologics FBS1824)及1× ITS (Thermo Fisher Scientific 41400045)之1 mL DMEM (ATCC 30-2002)中的24孔膠原蛋白盤(Thermo Fisher A1142802)上。在37℃下在5% CO2中培育細胞直至肌母細胞變得匯合為止。此時，藉由在補充有2%馬血清(ATCC 30-2040)及1× ITS (Thermo Fisher Scientific 41400045)之1000 µl (1 mL) DMEM (ATCC 30-2002)中培育2天來誘導肌管分化。更新培養基且添加100 µl於PBS中稀釋之TfR1.IgG2 mAb-SSB結合物。將經治療之細胞培育72小時。為進行採集，自孔移除培養基且添加150 µl Trizol (Ambion 15596018)。在分析之前，將盤在-80℃下冷凍隔夜或更長時間。遵循製造商說明書使用Direct-zol 96 RNA套組分離RNA且以光譜方式定量。根據製造商說明書使用高容量cDNA套組(Thermo Fisher編號4368813)對RNA (100-200 ng)進行逆轉錄。使用TaqMan qPCR，使用經適當地設計之引子及探針對mRNA含量進行定量。使用PPIB (管家基因)作為內部RNA內參考物。使用ΔΔCt方法計算mRNA %，其中經PBS治療之細胞設定成100%表現。所有所測試之SSB siRNA結合物以類似效力將SSB下調50% (圖17)。實例 4
hTfR1 重鏈： 461aa
NruI -Kozak序列--人工信號肽 -hTfR1 mAb HC 可變區 -人類 IgG2 恆定區 ( P01859 )-- 終止密碼子 - PmlI
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(SEQ ID NO: 86)
hTfR1 輕鏈： 233aa
AscI - Kozak 序列 -- 人工信號肽 - hTfR1 mAb LC 可變區 -人類 Ig κ 恆定區 ( P01834 )-- 終止密碼子 - FseI
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(SEQ ID NO: 87)實例 5 ： 食蟹獼猴研究中之例示性抗 TfR 抗體之 SSB siRNA 減弱
測試用例示性抗TfR抗體進行之食蟹獼猴治療以測定腓腸肌中之SSB mRNA下調百分比。測試30 mg/kg、10 mg/kg及3 mg/kg之劑量。在給藥後21天及/或28天探測抗體結合物之活性。亦經由血液學及臨床化學分析監測靈長類動物之安全性。實例 6 ： hIgG1 TfR - Var2ii 與 hIgG1 TfR - Var9ii 之 SSB 結合物不影響食蟹獼猴中之絕對網狀紅血球含量
hIgG1 TfR-Var2ii及hIgG1 TfR-Var9ii為靶向hTfR1之人類化IgG1抗體，該等抗體含有IgG1重鏈中鉸鏈區中之突變，設計成移除效應功能(LALA+L328R)。在於食蟹獼猴中給藥之後，與嵌合hIgG2 TfR1抗體相反，hIgG1 TfR-Var2ii與hIgG1 TfR-Var9ii之SSB結合物不降低網狀紅血球含量。此結果與其他人員之研究一致，該等研究證實靶向TfR1之抗體進行之未成熟網狀紅血球耗乏可藉由移除抗體之ADCC/CDC活性之突變而得到成功遏制(WO 2014/189973 A2)。
方法：
在第一天藉由30分鐘(+/- 3分鐘)靜脈內(IV)輸注對食蟹獼猴(雄性；2-3歲；BW 2-3 kg)進行給藥。如圖18中所指示，在給藥後不同時間點自受約束、有意識動物之周邊靜脈收集血液試樣。實例 7 ： hIgG1 TfR - Var2ii Ab 與 hIgG1 TfR - Var9ii Ab 之 SSB 結合物下調食蟹獼猴肌肉中之 SSB RNA 含量
在給藥後21天，與給藥前SSB mRNA含量相比，1 mg/kg或6 mg/kg單次劑量(siRNA)之hIgG1 TfR-Var2ii或hIgG1 TfR-Var9ii SSB結合物將腓腸肌及四頭肌中之SSB mRNA含量下調至多72% (圖19)。人類化抗體之活性與親本嵌合IgG2 TfR1抗體之活性類似。以60 mg/kg (此等於6 mg/kg AOC劑量)給藥之未經結合之TfR-Var2ii Ab不顯示顯著SSB下調。
方法：
在第一天藉由30分鐘(+/- 3分鐘)靜脈內(IV)輸注對食蟹獼猴(雄性；2-3歲；BW 2-3 kg)進行給藥。在給藥後-10天及+21天，藉由6 mm衝頭自已服鎮靜劑之動物採取肌肉生檢(腓腸肌及四頭肌)，稱重且在液氮中進行急凍。在1 ml冷TRIzol (Thermo Fisher編號15596026)中使經冷凍之組織樣品均質化。為確定mRNA減弱，遵循製造商說明書使用Direct-zol 96 RNA套組自組織提取總RNA且以光譜方式定量。根據製造商說明書使用高容量cDNA套組(Thermo Fisher編號4368813)對RNA (100-200 ng)進行逆轉錄。使用TaqMan qPCR，使用經適當地設計之引子及探針對SSB mRNA含量進行定量。使用PPIB (管家基因)作為內部RNA內參考物。使用ΔΔCt方法計算mRNA %，其中治療前同一動物中之SSB mRNA含量或經PBS治療之動物中之SSB含量設定成100%表現。實例 8 ： AOC 介導之 SSB 減弱而非 siRNA 遞送具有肌肉特異性
在6 mg/kg單次劑量之hIgG1 TfR-Var2ii-SSB後21天，大部分組織展現介於10-100 nM之間之SSB siRNA濃度。siRNA含量在肝及腎上腺中最高(≥1000 nM)；在腦中最低(2 nM)。骨骼肌肉中之siRNA濃度為3-20 nM。不管相對低之siRNA暴露如何，僅骨骼肌肉及心展現＞50%之SSB mRNA含量減少。此結果證實靶向TfR1之抗體進行之寡核苷酸有效負載物遞送具有肌肉特異性且由細胞特異性移行途徑代替siRNA暴露來驅動。
方法：
在第一天藉由30分鐘(+/- 3分鐘)靜脈內(IV)輸注對食蟹獼猴(雄性；2-3歲；BW 2-3 kg)進行給藥。在給藥後第21天，藉由6 mm衝頭自已服鎮靜劑之動物採取肌肉生檢。在死後30 min內收集所有其他組織樣品。對組織樣品進行加工，且如上文所描述測定SSB mRNA含量(圖20B)。使用如方法部分中所描述之莖環qPCR分析測定組織SSB siRNA濃度(圖20A)。使用TaqMan微小RNA反轉錄套組，使用序列特異性莖環RT引子對siRNA之反義股進行逆轉錄。隨後，利用來自RT步驟之cDNA以進行即時PCR，且使用自標準曲線導出之線性等式將Ct值轉換成血漿或組織濃度。
儘管已在本文中顯示且描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易知，該等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不脫離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文所描述之本發明之實施例之各種替代方案可用於實踐本發明。預期以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且由此涵蓋在此等申請專利範圍及其等效者之範疇內的方法及結構。
本發明之各種態樣在所附申請專利範圍中特定地闡述。將參考闡述其中利用本發明原理之說明性實施例及下文附圖之以下詳細描述來獲得對本發明之特點及優點的較佳理解： 專利申請檔案含有至少一個彩製圖。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利申請公開案之複本。
圖1說明例示性SSB隨從股之結構。
圖2說明具有19個具互補性鹼基及一個3'二核苷酸突出端之例示性鈍端雙螺旋體之結構。使純化單股雙螺旋化以得到雙股siRNA。
圖3A說明TfR1.IgG2 mAb及TfR1.IgG2 mAb-SSB與重組人類TfR1之活體外結合。
圖3B說明TfR1.IgG2 mAb及TfR1.IgG2 mAb-SSB與重組食蟹獼猴TfR1之活體外結合。
圖4A說明經hTfR1.IgG2 mAb SSB或hTfR1.IgG2 mAb MSTN (陰性對照)結合物治療之Hel92.1.7細胞中siRNA遞送中之SSB mRNA含量。
圖4B說明經hTfR1.IgG2 mAb SSB或hTfR1.IgG2 mAb MSTN (陰性對照)結合物治療之永生化人類骨胳肌肉細胞中siRNA遞送中之SSB mRNA含量。
圖5A說明在投與30及60 mg/kg (n=3)之hTfR1.IgG2 mAb-SSB結合物後食蟹獼猴腓腸肌中之SSB mRNA及SSB siRNA含量。
圖5B說明在投與30及60 mg/kg (n=3)之hTfR1.IgG2 mAb-SSB結合物後食蟹獼猴四頭肌中之SSB mRNA及SSB siRNA含量。
圖6說明在給藥30及60 mg/kg之hTfR1.IgG2 mAb-SSB結合物之前及之後食蟹獼猴中之相對網狀紅血球含量。
圖7說明例示性抗TfR抗體與食蟹獼猴CD71之結合常數。
圖8說明例示性抗TfR抗體與人類CD71之結合常數。
圖9A說明在競爭性環境下例示性抗TfR抗體與TfR之結合。
圖9B顯示圖9A之所測試之抗TfR抗體之結合常數。
圖10A顯示例示性抗TfR抗體與TfR之結合得到維持。
圖10B顯示圖10A之所測試之抗TfR抗體之結合常數。
圖11顯示例示性抗TfR抗體之ADCC活性。
圖12顯示抗TfR抗體不結合至TfR2。
圖13A顯示HEL92細胞中之SSB mRNA減弱%。
圖13B顯示圖13A之所測試之抗TfR抗體之EC50。
圖14說明例示性抗TfR抗體之ADCC活性。
圖15說明例示性抗TfR抗體之CDC活性。
圖16顯示初級人類骨胳肌肉細胞(肌管)中之TfR1.mAb結合物之吸收。
圖17顯示經TfR1.hIgG2 mAb或TfR1.hIgG1 mAb變異體之SSB或零亂siRNA結合物治療之初級人類骨胳肌肉細胞中之SSB mRNA含量。
圖18顯示給藥靶向TfR1之AOC (在第1天單次劑量)之前/之後食蟹獼猴中之絕對網狀紅血球含量。
圖19顯示單次劑量之TfR1 mAb SSB結合物(n=3)之後21天食蟹獼猴肌肉中之SSB mRNA含量。
圖20A顯示單次6 mg/kg劑量之Av01Ab-SSB結合物(n=2)之後21天食蟹獼猴組織中之SSB siRNA含量。
圖20B顯示單次6 mg/kg劑量之Av01Ab-SSB結合物(n=2)之後21天食蟹獼猴組織中之SSB mRNA含量。
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Claims (106)

  1. 一種抗轉鐵蛋白受體抗體，其包含可變重鏈(VH)區及可變輕鏈(VL)區，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列；HCDR2序列EINPIX1 GRSNYAX2 KFQG (SEQ ID NO: 88)，其中X1 選自N或Q且X2 選自Q或E；及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。
  2. 如請求項1之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。
  3. 如請求項1之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。
  4. 如請求項1之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VL區包含LCDR1序列RTSENIYX3 NLA (SEQ ID NO: 89)、LCDR2序列AX4 TNLAX5 (SEQ ID NO: 90)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X3 選自N或S，X4 選自A或G，X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、LCDR2序列AATNLAX5 (SEQ ID NO: 92)及LCDR3序列QHFWGTPLTX6 (SEQ ID NO: 91)，其中X5 選自D或E，且X6 存在或不存在且若存在，則為F。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
  8. 如請求項1至5中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
  9. 如請求項1至5中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 2之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且該VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
  11. 如請求項1至9中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且該VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 7之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 8之LCDR3序列。
  12. 如請求項1至9中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 5之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且該VL區包含有包含SEQ ID NO: 6之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 9之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
  13. 如請求項1至9中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區包含有包含SEQ ID NO: 1之HCDR1序列、包含SEQ ID NO: 4之HCDR2序列及包含SEQ ID NO: 3之HCDR3序列；且該VL區包含有包含SEQ ID NO: 11之LCDR1序列、包含SEQ ID NO: 12之LCDR2序列及包含SEQ ID NO: 10之LCDR3序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VH區與選自SEQ ID NO: 13-16之序列包含至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該VL區與選自SEQ ID NO: 18-21之序列包含至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含人類化抗體或其結合片段或嵌合抗體或其結合片段。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含多特異性抗體或其結合片段。
  18. 如請求項1至17中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含雙特異性抗體或其結合片段。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG-scFv、奈米抗體、BiTE、雙功能抗體、DART、TandAb、sc雙功能抗體(scDiabody)、sc雙功能抗體-CH3、三功能抗體、微型抗體(mini-antibody/minibody)、TriBi微型抗體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv-Fc KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-scFv2. scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙功能抗體-Fc、雙功能抗體-Fc、串聯scFv-Fc或胞內抗體。
  20. 如請求項1至19中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG1構架。
  21. 如請求項1至19中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG2構架。
  22. 如請求項21之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該IgG2構架為IgG2b構架。
  23. 如請求項1至19中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含IgG4構架。
  24. 如請求項1至23中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體進一步包含Fc區中之至少一種突變。
  25. 如請求項24之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該至少一種突變調節效應功能。
  26. 如請求項24或25之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該至少一種突變減弱或消除Fc-γ受體結合性。
  27. 如請求項24至26中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該至少一種突變係處於殘基位置D265、N297、K322、L328或P329處，其中該殘基位置係參照IgG1。
  28. 如請求項24至27中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該Fc區包含兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種突變。
  29. 如請求項24至28中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該Fc區包含L233及L234處之突變，其中該等殘基對應於SEQ ID NO: 23之位置233及234。
  30. 如請求項24至28中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該Fc區包含D265及N297處之突變。
  31. 如請求項1至30中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體包含選自SEQ ID NO: 23-46之重鏈(HC)序列及選自SEQ ID NO: 47-50之輕鏈(LC)序列。
  32. 如請求項1至31中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體特異性結合至人類轉鐵蛋白受體(TfR)。
  33. 一種抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其包含如請求項1至32之抗轉鐵蛋白受體抗體及有效負載物。
  34. 如請求項33之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含小分子、肽、蛋白質或聚核酸分子。
  35. 如請求項33之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含聚核酸分子。
  36. 如請求項35之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該聚核酸分子包含短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、反義寡核苷酸(ASO)、PMO或mRNA。
  37. 如請求項34至36中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含dsRNA。
  38. 如請求項34至36中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含反義寡核苷酸(ASO)。
  39. 如請求項33之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含小分子、肽或蛋白質。
  40. 如請求項39之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含微管破壞劑、DNA修飾劑或Akt抑制劑。
  41. 如請求項39之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含奧瑞他汀(auristatin)或其衍生物、尾海兔素(dolastatin)或其衍生物或類似物、類美登素(maytansinoid)或吡咯并苯并二氮呯或其衍生物。
  42. 如請求項41之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該奧瑞他汀或其衍生物為單甲基奧瑞他汀E (MMAE)或單甲基奧瑞他汀F (MMAF)。
  43. 如請求項41之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該類美登素為DM1或DM4。
  44. 如請求項41之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中吡咯并苯并二氮呯為吡咯并苯并二氮呯二聚體。
  45. 如請求項39之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含免疫調節劑(immunomodulatory agent/immune modulator)。
  46. 如請求項45之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該免疫調節劑包含細胞介素。
  47. 如請求項39之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物包含蛋白質或肽毒素或其片段。
  48. 如請求項33至47中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物經由連接子結合至該抗轉鐵蛋白受體抗體。
  49. 如請求項33至48中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該抗轉鐵蛋白受體抗體進一步結合至兩種或更多種有效負載物。
  50. 如請求項33至49中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該等有效負載物與該抗轉鐵蛋白受體抗體之比例為約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1或12:1。
  51. 如請求項33至50中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中抗轉鐵蛋白結合物包含 A-(X1 -B)n 式(I) 其中， A包含抗轉移抗體； B包含有效負載物； X1 由鍵或連接子組成；及 n為選自1-12之平均值。
  52. 如請求項51之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該有效負載物為聚核酸分子。
  53. 如請求項52之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該聚核酸分子包含隨從股及引導股。
  54. 如請求項53之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該引導股包含至少一個經修飾之核苷酸間鍵、至少一個反轉無鹼基部分、至少一個經5'-乙烯基膦酸酯修飾之非天然核苷酸或其組合。
  55. 如請求項54之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該至少一個經5'-乙烯基膦酸酯修飾之非天然核苷酸之位置距離該引導股之5'端約1、2、3、4或5個鹼基。
  56. 如請求項51至55中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該聚核酸分子進一步包含2'位置處之糖部分修飾。
  57. 如請求項56之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該2'位置處之修飾係選自經以下修飾之核苷酸：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-去氧、T-去氧-2'-氟、2'-O-胺丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基胺乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基胺丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)。
  58. 如請求項53之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該隨從股包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個經二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物修飾之非天然核苷酸。
  59. 如請求項52至58中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該隨從股之長度比該引導股短，由此生成5'突出端、3'突出端、一個末端處之鈍端或其組合。
  60. 如請求項52至58中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該隨從股之長度與該引導股相等，因此在該聚核酸分子之各末端處形成鈍端。
  61. 如請求項52至60中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該隨從股結合至A-X1 。
  62. 如請求項61之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中A-X1 結合至該隨從股之5'端。
  63. 如請求項61之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中A-X1 結合至該隨從股之3'端。
  64. 如請求項33至50中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該抗轉鐵蛋白結合物包含： A-X1 -(B-X2 -C)n 式(II) 其中， A包含該抗轉鐵蛋白受體抗體； B包含該聚核酸分子； C由聚合物組成； X1 由鍵或第一連接子組成； X2 由鍵或第二連接子組成；及 n為選自1-12之平均值。
  65. 如請求項64之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中C為聚乙二醇。
  66. 如請求項64之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該聚核酸分子包含隨從股及引導股。
  67. 如請求項66之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中該隨從股結合至A-X1 及X2 -C。
  68. 如請求項67之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中A-X1 結合至該隨從股之5'端且X2 -C結合至該隨從股之3'端。
  69. 如請求項67之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中X2 -C結合至該隨從股之5'端且A-X1 結合至該隨從股之3'端。
  70. 如請求項51至69中任一項之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中X1 及X2 各自獨立地為非聚合連接子。
  71. 如請求項64之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其進一步包含D。
  72. 如請求項71之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物，其中D為胞內體裂解部分。
  73. 一種核酸聚合物，其編碼如請求項1至32之抗轉鐵蛋白受體抗體。
  74. 一種載體，其包含如請求項73之核酸聚合物。
  75. 一種醫藥組合物，其包含： 如請求項1至32之抗轉鐵蛋白受體抗體或如請求項33至72之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物；及 醫藥學上可接受之賦形劑。
  76. 如請求項75之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係調配用於全身投藥。
  77. 如請求項75或76之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係調配用於非經腸投藥。
  78. 一種將有效負載物遞送至個體中之所關注之目標位點之方法，其包含： 向該個體投與如請求項33至72之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或如請求項75至77之醫藥組合物，以將該有效負載物遞送至該所關注之目標位點。
  79. 如請求項78之方法，其中該所關注之目標位點為包含過度表現之致病蛋白質之細胞。
  80. 如請求項78之方法，其中該所關注之目標位點為腫瘤位點。
  81. 如請求項78之方法，其中該所關注之目標位點為位於腦中之位點。
  82. 一種治療有需要之個體之癌症之方法，其包含： 向該個體投與如請求項33至72之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或如請求項75至77之醫藥組合物，以治療該個體之癌症。
  83. 如請求項82之方法，其中該癌症為實體癌症。
  84. 如請求項82之方法，其中該癌症為血液惡性病。
  85. 如請求項82至84中任一項之方法，其中該癌症為膀胱癌、肺癌、腦癌、黑色素瘤、乳癌、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、子宮頸癌、卵巢癌、大腸直腸癌、胰臟癌、食道癌、前列腺癌、腎癌、皮膚癌、白血病、甲狀腺癌、肝癌或子宮癌。
  86. 如請求項82至85中任一項之方法，其中該癌症為轉移性癌症。
  87. 如請求項82至85中任一項之方法，其中該癌症為復發性或難治性癌症。
  88. 一種治療有需要之個體之肌肉萎縮或肌強直性營養不良之方法，其包含： 向該個體投與如請求項33至72之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或如請求項75至77之醫藥組合物，其中該聚核酸分子與萎縮基因(atrogene)之目標序列雜交，且其中該聚核酸分子介導針對該萎縮基因之RNA干擾，由此治療該個體之肌肉萎縮。
  89. 如請求項88之方法，其中該肌肉萎縮為糖尿病相關肌肉萎縮或癌症惡病質相關肌肉萎縮。
  90. 如請求項88之方法，其中該肌肉萎縮與胰島素缺乏症、慢性腎衰竭、充血性心臟衰竭、慢性呼吸道疾病、慢性感染、空腹、去神經性、少肌症或1型肌強直性營養不良(DM1)相關。
  91. 如請求項88之方法，其中該肌強直性營養不良為DM1。
  92. 如請求項88之方法，其中在投與抗轉鐵蛋白受體抗體之後，該個體中之網狀紅血球含量沒有減少。
  93. 如請求項88之方法，其中抗轉鐵蛋白受體抗體結合物之投藥可下調該個體中之SSB siRNA或SSB mRNA含量。
  94. 如請求項93之方法，其中SSB siRNA或SSB mRNA之下調係在肌肉中進行。
  95. 如請求項94之方法，其中該肌肉為骨胳肌肉。
  96. 如請求項94之方法，其中該肌肉為心臟肌肉。
  97. 如請求項88之方法，其中該萎縮基因包含IGF1-Akt-FoxO路徑、糖皮質素-GR路徑、PGC1α-FoxO路徑、TNFα-NFқB路徑或肌肉抑制素(myostatin)-ActRIIb-Smad2/3路徑內之上調基因。
  98. 如請求項88之方法，其中該萎縮基因編碼E3連接酶。
  99. 如請求項88之方法，其中該萎縮基因編碼叉頭框(Forkhead box)轉錄因子。
  100. 如請求項88之方法，其中該萎縮基因包含萎縮蛋白-1基因(FBXO32 )、MuRF1基因(TRIM63 )、FOXO1 、FOXO3 或MSTN 。
  101. 如請求項88之方法，其中該萎縮基因包含DMPK 。
  102. 一種治療有需要之個體之肌肉營養不良之方法，其包含： 向該個體投與如請求項33至72之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物或如請求項75至77之醫藥組合物，由此治療該個體之肌肉營養不良。
  103. 如請求項102之方法，其中該肌肉營養不良為杜興氏肌肉營養不良(Duchenne muscular dystrophy)、貝克爾肌肉營養不良(Becker muscular dystrophy)、面肩臂肌肉營養不良、先天性肌肉營養不良、或肌強直性營養不良。
  104. 如請求項102之方法，其中該肌肉營養不良為杜興氏肌肉營養不良。
  105. 如前述請求項中任一項之方法，其中該個體為人類。
  106. 一種套組，其包含如請求項1至32之抗轉鐵蛋白受體抗體、如請求項33至72之抗轉鐵蛋白受體抗體結合物、如請求項73之核酸聚合物、如請求項74之載體、或如請求項75至77之醫藥組合物。
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