RU2807188C2

RU2807188C2 - Производные рапамицина

Info

Publication number: RU2807188C2
Application number: RU2020112056A
Authority: RU
Inventors: Симоне Бонацци; Майкл Коннолли; Дэвид Джонатан Гласс; Мануэль МИХАЛИК; Эндрю Уилльям ПАТТЕРСОН; Сильвио Рогго; Теа ШАВЛАКАДЗЕ
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2023-11-10

Abstract

Изобретение относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, где R₁ выбран из группы, состоящей из гидрокси, , , и ; и R₂ выбран из группы, состоящей из, , , где m равняется 0; n равняется 1 или 2; и R₃ представляет собой водород, C_1-6алкил или гидрокси-C_1-6алкил. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для ингибирования активности mTOR на основе указанного соединения. Технический результат – получены новые соединения и фармацевтическая композиция на их основе, которые могут найти применение в медицине для предупреждения или лечения нарушения или заболевания, опосредованных путем mTOR. 9 н. и 24 з.п. ф-лы, 16 ил., 20 пр.

Description

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ УСТАНОВЛЕНИИ ПРИОРИТЕТА

Настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на патент США с серийным № 62/563312, поданной 26 сентября 2017 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

В настоящем изобретении предусмотрены производные 32-дезоксорапамицина, и оно относится к способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В клетках млекопитающих киназа-мишень рапамицина (mTOR) существует в двух различных мультибелковых комплексах, описанных как комплекс mTORC1 и комплекс mTORC2, оба из которых реагируют на доступность питательных веществ и энергии и обеспечивают объединение входящих сигналов от факторов роста и передачу сигнала в случае стресса. mTORC1 обеспечивает объединение сигналов от факторов роста и питательных веществ и контролирует рост и метаболизм клеток. См. Laplante M. et al. Cell. (2012) 149(2):274-93. mTORC1 является ключевым регулятором трансляции белков и аутофагии. Комплекс mTORC1 является чувствительным к аллостерическим ингибиторам mTOR, таким как рапамицин и аналоги рапамицина (так называемые "рапалоги"). Механизм действия рапамицина и ранее полученных рапалогов предусматривает образование внутриклеточного комплекса с FK506-связывающими белками, одного из FKBP12, FKBP51 или FKBP52 (эти три вида FKBP будут упоминаться в данном документе как "FKBP" или "виды FKBP"), с последующим связыванием комплекса FKBP-рапалог с доменом FRB (связывание FK506-рапамицин) mTOR. См. et al. Mol Cell Biol. (2013) 33(7):1357-1367. "Large FK506-Binding Proteins Shape the Pharmacology of Rapamycin". Такое взаимодействие комплекса FKBP-рапалог с mTORC1 приводит к аллостерическому ингибированию комплекса. Рапамицин и рапалоги, такие как RAD001 (эверолимус; Afinitor®), получили клиническую значимость в результате ингибирования активности mTORC1, который ассоциирован с нарушениями, связанными с пролиферацией как клеток доброкачественного новообразования, так и клеток злокачественного новообразования. См. Royce M.E. et al. Breast Cancer (Auckl). (2015) 9:73-79; Pleniceanu O. et al. Kidney Int Rep. (2018) 3(1):155-159.

Рапамицин является известным макролидным антибиотиком, продуцируемым Streptomyces hygoscopius, см. например, McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44:688; Schreiber, S.L.; et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113:7433; патент США № 3929992. Следующее правило нумерации атомов рапамицина и его производных, применяемое в данном документе, показано ниже.

Рапамицин является эффективным иммунодепрессантом, и также было показано, что он обладает противоопухолевой и противогрибковой активностью. Как было показано, он является пригодным при предупреждении или лечении системной красной волчанки, воспаления легких, инсулинозависимого сахарного диабета, нарушений состояния кожи, таких как псориаз, пролиферации гладкомышечных клеток и утолщения интимы после сосудистого повреждения, T-клеточного лейкоза/лимфомы у взрослых, злокачественных карцином, воспалительного заболевания сердца, анемии и повышенного разрастания аксонов. Однако его применимость в качестве фармацевтического средства ограничена его крайне низкой и изменчивой биологической доступностью. Более того, рапамицин трудно составлять, что делает сложным получение устойчивых медицинских композиций.

Для решения данных проблем были (полу)синтезированы многочисленные рапалоги. Водорастворимые пролекарства были получены путем дериватизации рапамицина по C28 и 40 с образованием пролекарств в виде глицината, пропионата и пирролидинобутирата (патент США № 4650803). Другие аналоги рапамицина включают моноацильные и диацильные аналоги (US 4316885), ацетальные аналоги (патент США № 5151413), силиловые простые эфиры (патент США № 5120842), сложные гидроксиэфиры (патент США № 5362718), а также арильные, алкильные, алкенильные и алкинильные аналоги (патенты США № 5665772; 5258389; 6384046; WO 97/35575). Модификации рапамицина включают деметилирование, удаление или замещение одной или нескольких метоксигрупп; удаление, дериватизацию или замещение одного или нескольких гидроксифрагментов; восстановление, удаление или дериватизацию одного или нескольких из кетонных фрагментов; замещение 6-членного пипеколатного кольца 5-членным пролильным кольцом; альтернативное замещение циклогексильного кольца замещенным циклопентильным кольцом. Иллюстративные примеры патентных литературных источников в данной области техники представляют собой патент США № 5527907, WO 96/41865 и WO 99/36553, в которых описано широкое разнообразие рапалогов, нацеленных на устранение иммунодепрессивных побочных эффектов рапамицина. В патенте США № 5985890 раскрыты примеры аналогов 32-дезоксорапамицина, в том числе сам 32-дезоксорапамицин. Описано, что такие соединения, как сообщалось, характеризуются улучшенным фармакологическим профилем по сравнению с рапамицином и лучшей стабильностью.

Рапалоги, описанные в литературных источниках выше, раскрыты как пригодные для лечения таких же нарушений, что и рапамицин. В патенте США № 8906374 и патенте США № 9669032 раскрыто применение при раке. В патенте США № 9358236 раскрыто применение при нейродегенеративных нарушениях.

В животных моделях рапалоги увеличивают продолжительность жизни и задерживают появление возрастных заболеваний. Старение, как и другие биологические процессы, регулируется сигнальными путями, такими как путь TOR (называемый "TOR" в данном случае, чтобы включать системы, предусматривающие дрожжи и C elegans, в которых белок, эквивалентный [mTOR] у млекопитающих, называется просто "TOR"]) и, у млекопитающих, путь mTORC1. Модуляция передачи сигнала TOR и mTORC1 увеличивает продолжительность жизни и задерживает появление возрастных заболеваний у большого ряда организмов, от мух до млекопитающих. Например, ингибирование пути TOR с помощью генетической мутации увеличивало продолжительность жизни у дрожжей, C elegans и дрозофилы, и ингибирование пути mTORC1 увеличивало продолжительность жизни у мышей (Kaeberlein et al., Science (2005) 310:1193-1196; Kapahi et al., Curr Biol (2004) 14:885-890; Selman et al., Science (2009) 326:140-144; Vellai et al., Nature (2003) 426:620). Кроме того, ингибитор mTORC1 рапамицин увеличивал продолжительность жизни у мышей даже при введении на поздних стадиях жизни (Harrison et al., Nature (2009) 460(7253):392-395). Такие данные указывают на возможность того, что лекарственные средства, нацеленные на путь TOR у млекопитающих (mTOR), будут обладать терапевтическими эффектами при старении и возрастных заболеваниях у людей. Например, в WO 2008/022256 описаны способы и составы для местного применения, содержащие ингибитор mTOR, для лечения или предупреждения возрастного заболевания. Отчет о клиническом испытании с применением рапамицина у мужчин преклонного возраста был описан M. Leslie в Science, 2013, 342. J. Mannick et al. описывает в Sci Transl Med. (2014) 6(268): 268ra179, что ингибирование mTOR улучшает иммунную функцию у людей преклонного возраста. Однако исследователи с осторожностью рассматривали применение доступных в настоящее время ингибиторов mTOR в испытаниях относительно старения людей вследствие их побочных эффектов (включающих иммунодепрессию, виды цитопении, стоматит, желудочно-кишечное расстройство и интерстициальный пневмонит).

В исследованиях фокальной кортикальной дисплазии (FCD) и комплекса туберозного склероза (TSC) у животных и человека путь mTOR вовлечен в опосредование клеточных и молекулярных изменений, приводящих к образованию кортикальных патологий и проявлению эпилепсии (Wong et al., Experimental Neurology (2013) 244: 22-26. Фокальная кортикальная дисплазия (FCD) представляет собой патологию кортикального развития, которая является наиболее распространенной причиной рефрактерной эпилепсии среди детей и второй/третьей наиболее распространенной причиной резистентных к медикаментозной терапии эпилептических припадков у взрослых (Kabat J, et al., Pol J. Radiology (2012) 77(2) 35-43). Действие мутаций в комплексе туберозного склероза (TSC), в том числе в комплексе-1 туберозного склероза (TSC1) и в комплексе-2 туберозного склероза (TSC2), проявляется выше по ходу пути mTOR, что приводит к повсеместному развитию доброкачественных опухолей, к задержке в умственном развитии и к высокой частоте возникновения эпилепсии (Manning et al., Identification of the tuberous sclerosis complex-2 tumor suppressor gene product tuberin as a target of the phosphoinositide 3-kinase/akt pathway, Mol. Cell, (2002) 10: 151-162; Inoki et al., Dysregulation of the TSC-mTOR pathway in human Disease, Nat. Genet, (2005), 37:19-24; и Holmes and Stafstrom, Tuberous sclerosis complex and epilepsy: recent developments and future Challenges, Epilepsia, (2007) 48:617-630).

Аномальная активация mTOR препятствует нормальному развитию головного мозга и приводит к эпилепсии. Показано, что лечение с помощью рапамицина, который ингибирует путь mTORC1, уменьшает структурные аномалии и уменьшает интенсивность эпилептических припадков в мышиных моделях TSC и PTEN (Ehninger et al., Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis; Nat. Med., (2008), 843-848; Meikle et al., Response of a neuronal model of tuberous sclerosis to mammalian target of rapamycin, mTOR inhibitors: effects on mTORC1 and Akt signaling lead to improved survival and function; J. Neuroscience., (2008) 28:5422-5432; Zeng et al., Rapamycin prevents epilepsy in a mouse model of tuberous sclerosis complex; Ann. Neurol., (2008) 63:444-453; Ljungberg et al., Rapamycin suppresses seizures and neuronal hypertrophy in a mouse model of cortical dysplasia; (2009) pp. 389-398; и Zhou et al., Pharmacological inhibition of mTORC1 suppresses anatomical, cellular, and behavioral abnormalities in neural-specific Pten knock-out mice, J. Neurosci., (2009), 29:1773-1783). Кроме того, фармакологическое ингибирование пути mTOR либо до неврологического повреждения, либо непосредственно после него может предотвращать патологические изменения в головном мозге животных и развитие спонтанных периодических эпилептических припадков в модели приобретенной эпилепсии (Zeng et al., The mammalian target of rapamycin signaling pathway mediates epileptogenesis in a model of temporal lobe epilepsy; J. Neurosci., (2009) pp. 6964-6972). Следовательно, считается, что рапамицин и рапалоги также имеют потенциальную ценность при таких показаниях.

Митохондриальная миопатия (MM) является наиболее распространенным проявлением приобретенного митохондриального заболевания и демонстрирует многостороннюю реакцию на стресс, специфичную для ткани: (1) транскрипционную реакцию, включающую метаболические цитокины FGF21 и GDF15; (2) ремоделирование одноуглеродного метаболизма; и (3) реакцию несвернутых митохондриальных белков. В Cell Metabolism 26, 419-428, 1 августа 2017 г. Khan et al. описывают, что такие процессы являются частью одной интегрированной митохондриальной реакции на стресс (ISRmt), которая контролируется с помощью mTORC1 в скелетной мышце. Дефект репликации mtDNA активирует mTORC1, который запускает интегрированную митохондриальную реакцию на стресс путем активации ATF4, индуцирования de novo синтеза нуклеотида и серина, 1C-цикла и продуцирования FGF21 и GDF15. Ингибирование mTORC1 с помощью рапамицина снижало экспрессию всех компонентов ISRmt (интегрированной митохондриальной реакции на стресс), улучшало все показатели MM и обращало прогрессирование MM даже на поздней стадии, без индуцирования митохондриального биогенеза. Следовательно, считается, что рапамицин и рапалоги также имеют потенциальную ценность при таких показаниях.

Остается необходимость в обеспечении новых ингибиторов mTOR, которые являются хорошими лекарственными средствами-кандидатами. В частности, предпочтительные соединения должны обладать по меньшей мере способностью ингибировать mTORC1 и легко всасываться из желудочно-кишечного тракта, быть достаточно метаболически устойчивыми и иметь предпочтительные фармакокинетические свойства. Кроме того, идеальное лекарственное средство-кандидат будет способно существовать в физической форме, которая является устойчивой, не гигроскопической и подходящей для составления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Соединения структурной формулы (I) представляют собой ингибиторы mTORC1 и, следовательно, являются потенциально пригодными в лечении широкого разнообразия нарушений, в частности, возрастных нарушений или заболеваний и нарушений, для которых в настоящее время одобрено лечение с применением рапалогов. Полное восстановление кетона по C32 и замещение метоксигруппы по C16 на циклическую N-содержащую алифатическую кольцевую систему, такую как циклический амин, амид или сультам, обеспечивает соединения с вышеуказанными необходимыми преимуществами, которые демонстрируют баланс между надлежащей активностью, стабильностью и биодоступностью.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединения структурной формулы (I):

или их фармацевтически приемлемая соль, где

R₁ выбран из группы, состоящей из гидрокси, и

R₂ выбран из группы, состоящей из

, где

m равняется 0, 1, 2 или 3;

n равняется 1, 2 или 3;

o равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

p равняется 1, 2, 3, 4 или 5;

q равняется 1, 2, 3, 4 или 5, при этом сумма p и q составляет 2, 3, 4, 5 или 6;

r равняется 2, 3 или 4;

s равняется 2, 3 или 4, при этом сумма r и s составляет 4, 5 или 6;

X представляет собой O, S, NR₆ или SO₂;

R₃ представляет собой водород, C_1-6алкил, гидрокси-C_1-6алкил, C_3-8циклоалкил-C_0-6алкил или фенил-C_0-6алкил;

R₄ представляет собой водород;

R₅ представляет собой водород, гидрокси или циано; или R₄ и R₅ вместе образуют =O; и

R₆ представляет собой водород, C_1-6алкил, C_3-8циклоалкил-C_0-6алкил, фенил-C_0-6алкил, C_1-6алкил-CO-, C_3-8циклоалкил-C_0-6алкил-CO-, C_1-6алкил-SO₂- или C_3-8циклоалкил-C_0-6алкил-SO₂-.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения структурной формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая комбинация, содержащая терапевтически эффективное количество соединения структурной формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и одно или несколько терапевтически активных средств.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения нарушения или заболевания, опосредованных путем mTOR, у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения структурной формулы (I), или фармацевтической композиции, или фармацевтической комбинации на его основе. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, где мишень, представляющая собой ткань или орган, ассоциированная с патологией, обусловленной заболеванием или нарушением, характеризуется уровнями FKBP12, достаточными для ингибирования mTORC1, при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения структурной формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, или фармацевтической комбинации на его основе.

В одном варианте осуществления мишень, представляющую собой ткань или орган, ассоциированную с патологией, обусловленной заболеванием или нарушением, подлежащими лечению с помощью соединения структурной формулы (I), характеризующуюся уровнями FKBP12, достаточными для ингибирования mTORC1, определяют эмпирически, например, с применением ингибитора, специфичного в отношении FKBP12, по сравнению с рапамицином или RAD001.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, характеризующегося или ранее определенного как характеризующийся уровнями FKBP12, достаточными для ингибирования mTORC1, при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения структурной формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, или фармацевтической комбинации на его основе.

В одном варианте осуществления субъект характеризуется или ранее определен как характеризующийся уровнями FKBP12 в мишени, представляющей собой ткань, орган или клетки, достаточными для ингибирования mTORC1.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения возрастного заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения структурной формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, или комбинации на его основе,

В одном варианте осуществления заболевание или нарушение выбраны из саркопении, атрофии кожи, видов старческой гемангиомы, видов себорейного кератоза, атрофии головного мозга, также называемой деменцией, атеросклероза, артериосклероза, эмфиземы легких, остеопороза, остеоартрита, высокого кровяного давления, эректильной дисфункции, видов катаракты, макулярной дегенерации, глаукомы, инсульта, цереброваскулярного заболевания (инсультов), хронического заболевания почки, ассоциированного с диабетом заболевания почки, нарушения функции печени, фиброза печени, аутоиммунного гепатита, гиперплазии эндометрия, нарушения обмена веществ, реноваскулярного заболевания, потери слуха, нарушения способности к передвижению (например, немощности), снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), ожирения, потери вкуса, потери обоняния, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения структурной формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, или фармацевтической комбинации на его основе, где нарушение или заболевание выбраны из

- острого или хронического отторжения трансплантата органа или ткани;

- васкулопатий, связанных с трансплантатом;

- пролиферации и миграции гладкомышечных клеток, приводящих к утолщению интимы сосудов, закупорке кровеносных сосудов, обструктивному коронарному атеросклерозу, рестенозу;

- аутоиммунных заболеваний и воспалительных состояний;

- заболеваний, ассоциированных с лечением и предупреждением астмы;

- заболеваний, ассоциированных с множественной лекарственной резистентностью (MDR);

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

- пролиферативных нарушений, в частности рака;

- эпилептических припадков и связанных с эпилептическими припадками нарушений и

- митохондриальной миопатии и митохондриального стресса.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения структурной формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, или фармацевтической комбинации на его основе.

В одном варианте осуществления способ дополнительно предусматривает применение ингибитора PD-1/PDL-1.

В одном варианте осуществления рак выбран из рака почки, почечно-клеточной карциномы, колоректального рака, саркомы матки, рака эндометрия матки, рака эндометрия, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака желудка, фибросаркомы, рака поджелудочной железы, рака печени, меланомы, лейкоза, множественной миеломы, рака носоглотки, рака предстательной железы, рака легкого, глиобластомы, рака мочевого пузыря, мезотелиомы, рака головы, рабдомиосаркомы, саркомы, лимфомы и рака шеи.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой нарушение печени, которое включает процесс фиброза и/или воспаления, например фиброз печени, который возникает на терминальной стадии заболевания печени; цирроз печени; печеночную недостаточность, вызванную токсичностью; неалкогольный стеатогепатит или NASH и алкогольный стеатоз.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой нарушение почки, которое включает процесс фиброза или воспаления в почке, например фиброз почки, который возникает в результате острого повреждения почки, приводящий к хроническому заболеванию почки и диабетической нефропатии.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой дисфункцию сердца, например инфаркт миокарда или гипертрофию сердца. В одном варианте осуществления дисфункция сердца представляет собой систолическую и/или диастолическую дисфункцию. В одном варианте осуществления дисфункция сердца представляет собой гипертензию. В одном варианте осуществления дисфункция сердца приводит к снижению фракции выброса.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой старение иммунной системы, приводящее к раку из-за снижения иммунного надзора.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой рак, в том числе опухоли, которые лечат с помощью иммунотерапии, и опухоли, которые ранее лечили либо рапамицином, либо эверолимусом, либо другим рапалогом. В одном варианте осуществления рак включает опухоли, для которых показано, что путь mTOR активирован, в том числе состояния, в которых происходит мутация в гене Tsc1, или где микроокружение опухоли соответствующим образом обрабатывается рапалогом.

Подробности одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения изложены в данном документе. Другие признаки, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из графических материалов, подробного описания, примеров и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1A представляет собой изображение структуры сокристалла примера 1 с FKBP12. Абсолютная конфигурация по C16 представляет собой (S).

На фигуре 1B показана структура примера 1 при удалении белка FKBP12.

Фигура 2A представляет собой изображение структуры сокристалла примера 2 с FKBP12. Абсолютная конфигурация по C16 представляет собой (R).

На фигуре 2B показана структура примера 2 при удалении белка FKBP12.

Фигура 3 представляет собой линейный график, на котором показан фармакокинетический профиль примера 2 у крыс после введения однократной p.o. дозы, составляющей 3 мг/кг. На оси Y показаны концентрации в крови примера 2 (нМ). На оси X показано время (в часах) забора крови после введения примера 2. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для 3 крыс.

Фигура 4A представляет собой столбчатую диаграмму, демонстрирующую сравнительные концентрации в крови RAD001 (белые столбики) и примера 2 (темные столбики) у крыс, получавших перорально однократную дозу любого из соединений, составляющую 3, 10 и 30 мг/кг. Концентрации соединений измеряли через 3 и 24 часа (ч.) после введения дозы. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для 5-6 крыс в каждой группе. Крысы, у которых содержание соединения было ниже предела количественного определения, были исключены из анализа данных: это относится к группам, обработанным RAD001. Звездочка (*) указывает на значительную разность между соответствующими группами, обработанными RAD001 и примером 2. ** P<0,01, *** P<0,001; ****P<0,0001, критерии Стьюдента. BQL означает ниже предела количественного определения. На оси Y показаны концентрации соединения в крови (нМ). На оси X показано время (3 и 24 часа) после введения пероральной дозы и перорально вводимые дозы (3, 10 и 30 мг/кг).

Фигура 4B представляет собой столбчатую диаграмму, демонстрирующую сравнительные концентрации в головном мозге RAD001 (белые столбики) и примера 2 (темные столбики) у крыс, получавших перорально однократную дозу любого из соединений, составляющую 3, 10 и 30 мг/кг. Концентрации соединений измеряли через 3 и 24 часа (ч.) после введения дозы. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. В каждой группе использовали 5-6 крыс. Крысы, у которых содержание соединения было ниже предела количественного определения, были исключены из анализа данных: это относится к группам, обработанным RAD001. Звездочка (*) указывает на значительную разность между соответствующими группами, обработанными RAD001 и примером 2. ** P<0,01, *** P<0,001; ****P<0,0001, критерии Стьюдента. BQL означает ниже предела количественного определения. На оси Y показаны концентрации соединения в головном мозге (нМ). На оси X показано время (3 и 24 часа) после введения дозы и перорально вводимые дозы (3, 10 и 30 мг/кг).

На фигуре 4C показана концентрация примера 2 в крови у крыс после внутривенного (i.v.) и перорального (p.o.) введения доз. На оси Y показаны концентрации в крови примера 2 (нМ). На оси X показано время (в часах) забора крови после введения примера 2. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для 3 крыс.

На фигуре 4D показана концентрация RAD001 в крови у крыс после внутривенного (i.v.) и перорального (p.o.) введения доз. На оси Y показаны концентрации в крови RAD001 (нМ). На оси X показано время (в часах) забора крови после введения RAD001. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для 3 крыс.

На фигурах 5A - 5D показано, что пример 2 обеспечивает ингибирование пути mTORC1 в печени крыс. Крысам вводили однократную пероральную дозу примера 2 при 3, или 10, или 30 мг/кг и образцы печени собирали через 3 часа (ч.) и 24 ч. после введения доз. Крыс, обработанных средой-носителем (Veh), использовали в качестве контроля. На фигурах (5A) и (5C) показаны изображения результатов иммуноблоттинга фосфорилированных (p-) и общих (t-) S6-белков из образцов печени крыс, обработанных средой-носителем или примером 2 в дозе 3, или 10, или 30 мг/кг и анализируемых через 3 ч. (5A) и 24 ч. (5C) после обработки. Гистограммы на фигурах (5B) и (5D) демонстрируют денситометрическое количественное определение соотношения p-S6 и t-S6 через 3 ч. (5B) и 24 ч. (5D) после обработки. На гистограммах (5B и 5D) средние произвольные значения, которые указывают на соотношения p-S6/t-S6, показаны над каждым столбцом. Оси X представляют собой введенные перорально дозы (3, 10, 30 мг/кг). Оси Y представляют собой произвольные единицы. В каждой экспериментальной группе использовали шесть крыс. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. Данные анализировали с помощью тестов: однофакторного ANOVA с последующим множественным сравнением Даннетта, где средние значения из всех групп сравнивали со значениями для группы, обработанной средой-носителем. ** P < 0,01, **** P < 0,001, ns - не значимое.

На фигурах 6A - 6C показано ингибирование S6K1(Thr389) в клетках 293T дикого типа (6A), клетках с нокдауном FKBP12 (6B) и клетках с нокаутом FKBP12 (6C) после обработки с использованием RAD001 (пунктирная линия) и примера 2 (сплошная линия). Клетки обрабатывали в трех повторностях. Ось Y представляет собой процент ингибирования относительно уровня S6K1(Thr389) в клетках, обработанных средой плюс DMSO. Ось X представляет собой концентрации RAD001 и примера 2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено соединение формулы (I),

или его фармацевтически приемлемая соль, где

R₂ выбран из группы, состоящей из

, где

m равняется 0, 1, 2 или 3;

n равняется 1, 2 или 3;

o равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

p равняется 1, 2, 3, 4 или 5;

r равняется 2, 3 или 4;

X представляет собой O, S, NR₆ или SO₂;

R₄ представляет собой водород;

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрено соединение формулы (I),

R₂ выбран из группы, состоящей из

, где

m равняется 0, 1, 2 или 3;

n равняется 1, 2 или 3;

o равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

p равняется 1, 2, 3, 4 или 5;

r равняется 2, 3 или 4;

X представляет собой O, S, NR₆ или SO₂;

R₃ представляет собой водород, C_1-6алкил, C_3-8циклоалкил-C_0-6алкил или фенил-C_0-6алкил;

R₄ представляет собой водород;

Определения

Если не указано иное, термин "соединения по настоящему изобретению" или "соединение по настоящему изобретению" относится к соединениям формулы (I) и иллюстративным соединениям и к их солям, а также ко всем стереоизомерам (в том числе диастереоизомерам и энантиомерам), ротамерам, таутомерам и меченным изотопом соединениям (включая замещения дейтерием), а также изначально образованным фрагментам.

Применяемое в данном документе обозначение представляет собой часть переменной, связанной с основной молекулой, и включает как (R)-, так и (S)-стереохимию. Например, если R² представляет собой , представляет собой часть R₂, связанную с C16 и включает как (R)-, так и (S)-стереохимию.

Применяемый в данном документе термин "C_1-6алкил" означает углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью, состоящий только из атомов углерода и водорода, не содержащий ненасыщенных связей, содержащий от одного до шести атомов углерода, и который присоединен к остальной части молекулы посредством одинарной связи. Термин "C_1-4алкил" следует истолковывать соответствующим образом. Примеры C_1-6алкила включают без ограничения метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил (изопропил), н-бутил, н-пентил и 1,1-диметилэтил (трет-бутил).

Применяемый в данном документе термин "гидрокси-C_1-6алкил" относится к алкильной группе, замещенной одной или несколькими группами -OH. Примеры гидрокси-C_1-6алкильных групп включают HO-CH₂-, HO-CH₂CH₂- и -CH₂-CH(OH)-.

Применяемый в данном документе термин "C_3-8циклоалкил-C_0-6алкил" относится к устойчивому моноциклическому насыщенному углеводородному радикалу, состоящему исключительно из атомов углерода и водорода, содержащему от трех до восьми атомов углерода, и который присоединен к остальной части молекулы посредством одинарной связи или посредством C_1-6алкильного радикала, определенного выше. Примеры C_3-8циклоалкил-C_0-6алкила включают без ограничения циклопропил, циклопропилметил, циклобутил, циклобутилэтил, циклопентил, циклопентилпропил, циклогексил, циклогептил и циклооктил.

Применяемый в данном документе термин "фенил-C_0-6алкил" относится к фенильному кольцу, присоединенному к остальной части молекулы посредством одинарной связи или посредством C_1-6алкильного радикала, определенного выше. Примеры фенил-C_0-6алкила включают без ограничения фенил и бензил.

Применяемый в данном документе термин "гидрокси" или "гидроксил" относится к -OH.

В данном документе описаны различные (перечисленные) варианты осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что признаки, указанные в каждом варианте осуществления, можно объединять с другими указанными признаками с получением дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Вариант осуществления 1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, описанные выше.

Вариант осуществления 2. Соединение в соответствии с вариантом осуществления 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₁ представляет собой гидрокси.

Вариант осуществления 3. Соединение в соответствии с вариантом осуществления 1 или 2 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ выбран из , в частности , где m, n, X и R₃ определены выше.

Вариант осуществления 4. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ представляет собой , и n равняется 1, 2 или 3. В одном варианте осуществления R₂ представляет собой .

Вариант осуществления 5. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ представляет собой .

Вариант осуществления 6. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ представляет собой .

Вариант осуществления 7. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-4 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ представляет собой . В одном варианте осуществления R₃ представляет собой водород, C_1-6алкил или гидрокси-C_1-6алкил.

Вариант осуществления 8. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-5 формулы (I)-A,

или его фармацевтически приемлемая соль, где R₁ выбран из группы, состоящей из гидрокси, . В одном варианте осуществления R₁ представляет собой гидроксил. В одном варианте осуществления R₂ является таковым, как определено в формуле (I). В одном варианте осуществления положение C16 характеризуется (R)-стереохимией. В одном варианте осуществления положение C16 характеризуется (S)-стереохимией.

Вариант осуществления 9. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-8 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (соединение 1):

Вариант осуществления 10. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-9 или его фармацевтически приемлемая соль, представленное в виде отдельного диастереоизомера по C16. В одном варианте осуществления положение C16 характеризуется (R)-стереохимией. В одном варианте осуществления положение C16 характеризуется (S)-стереохимией.

Вариант осуществления 11. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-9 или его фармацевтически приемлемая соль, представленное в виде диастереоизомерной смеси по C16.

Вариант осуществления 12. Соединение в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10 формулы (I)-B,

или его фармацевтически приемлемая соль, где R₁ и R₂ определены для формулы (I). В одном варианте осуществления R₂ представляет собой

Вариант осуществления 13. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1):

Вариант осуществления 14. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2):

Вариант осуществления 15. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение выбрано из следующих.

Соединение	Структура
Пример 3	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 4	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 5	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 6 Пример 7 диастереомеры по C16	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 8 Пример 9 диастереомеры по C16	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 10 Пример 11 диастереомеры по C16	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 12 Пример 13 Отдельный диастереомер по C16	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 14 Пример 15 диастереомеры по C16	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 16
Пример 17	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 18	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
Пример 19	* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана

Определения конкретных функциональных групп и химических терминов описаны более подробно ниже. Химические элементы идентифицированы в соответствии с Периодической таблицей элементов, CAS-версия, Handbook of Chemistry and Physics, 75-оеизд., внутри обложки, и конкретные функциональные группы обычно определены, как описано в ней. Кроме того, общие принципы органической химии, а также конкретные функциональные фрагменты и реакционная способность, описаны в Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5^th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989 и Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3^rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

В зависимости от выбора исходных материалов и процедур соединения по настоящему изобретению могут находиться в форме одного из возможных стереоизомеров или в виде их смесей в случае стереоцентров, не ограниченных формулой (I), формулой (I)-A и формулой (I)-B, например, в виде чистых оптических изомеров или в виде смесей стереоизомеров, таких как рацематы и смеси диастереоизомеров, в зависимости от числа асимметрических атомов углерода. В настоящем изобретении подразумевается включение всех таких возможных стереоизомеров, в том числе рацемических смесей, смесей диастереоизомеров и оптически чистых форм. Оптически активные (R)- и (S)-стереоизомеры можно получать с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов или выделять с применением традиционных методик. Если соединение содержит двойную связь, заместитель может иметь E- или Z-конфигурацию. Если соединение содержит двузамещенный циклоалкил, циклоалкильный заместитель может иметь цис- или транс-конфигурацию. Также подразумевается включение всех таутомерных форм.

Термин "таутомеры" относится к соединениям, которые являются взаимозаменяемыми формами конкретной структуры соединения и которые различаются по перемещению атомов водорода и электронов. Таким образом, две структуры могут находиться в равновесии благодаря движению π-электронов и атома (обычно H). Например, енолы и кетоны являются таутомерами, поскольку они быстро взаимопревращаются при обработке либо кислотой, либо основанием. Другим примером таутомерии являются аци- и нитроформы фенилнитрометана, которые подобным образом образуются при обработке кислотой или основанием. Таутомерные формы могут иметь отношение к достижению оптимальной химической реакционной способности и биологической активности соединения, представляющего интерес.

Применяемые в данном документе термины "соль" или "соли" означают соль присоединения кислоты или присоединения основания соединения по настоящему изобретению. "Соли" включают, в частности, "фармацевтически приемлемые соли". Термин "фармацевтически приемлемые соли" означает соли, которые сохраняют биологические эффективность и свойства соединений по настоящему изобретению и которые, как правило, не являются биологически или иным образом нежелательными. Во многих случаях соединения по настоящему изобретению способны к образованию кислых и/или основных солей за счет присутствия амино- и/или карбоксильных групп или им подобных групп. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны из уровня техники. Например, Berge et al. подробно описывают фармацевтически приемлемые соли в J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19, включенные в данный документ посредством ссылки.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть образованы с помощью неорганических кислот и органических кислот.

Неорганические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т. п.

Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и т. п.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы неорганическими и органическими основаниями.

Неорганические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, соли аммония и металлов из групп I-XII периодической таблицы элементов. В определенных вариантах осуществления соли получены из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; в частности, подходящие соли включают аммониевые, калиевые, натриевые, кальциевые и магниевые соли.

Органические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, в том числе встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и т. п. Определенные органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглюмин, пиперазин и трометамин.

В другом аспекте в настоящем изобретении представлены соединения в форме соли, представляющей собой ацетат, аскорбат, адипат, аспартат, бензоат, безилат, бромид/гидробромид, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, камфорсульфонат, капринат, хлорид/гидрохлорид, хлортеофиллонат, цитрат, этандисульфонат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, глутамат, глутарат, гликолят, гиппурат, гидройодид/йодид, изетионат, лактат, лактобионат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, соль миндальной кислоты, мезилат, метилсульфат, соль муциновой кислоты, нафтоат, напсилат, никотинат, нитрат, октадеканоат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, полигалактуронат, пропионат, себацинат, стеарат, сукцинат, сульфосалицилат, сульфат, тартрат, тозилат трифенатат, трифторацетат или ксинафоат.

Любая формула, приведенная в данном документе, также подразумевает присутствие немеченых форм, а также меченных изотопом форм соединений. Меченные изотопом соединения имеют структуры, изображенные с помощью формул, приведенных в данном документе, за исключением того, что один или несколько атомов заменены атомом, характеризующимся выбранными атомной массой или массовым числом. Изотопы, которые можно включать в соединения по настоящему изобретению, включают, например, изотопы водорода.

Кроме того, включение определенных изотопов, в частности дейтерия (т. е. ²H или D), может обеспечивать определенные терапевтические преимущества, обусловленные более высокой метаболической устойчивостью, например, увеличенным периодом полувыведения in vivo, или снижением требующейся дозы, или улучшением терапевтического индекса или переносимости. Понятно, что дейтерий в данном контексте рассматривается в качестве заместителя соединения по настоящему изобретению. Концентрацию дейтерия можно определять посредством коэффициента изотопного обогащения. Применяемый в данном документе термин "коэффициент изотопного обогащения" означает соотношение распространенности изотопа и природной распространенности указанного изотопа. Если заместитель в соединении по настоящему изобретению указан как дейтерий, такое соединение характеризуется коэффициентом изотопного обогащения для каждого обозначенного атома дейтерия, составляющим по меньшей мере 3500 (включение 52,5% дейтерия в каждом обозначенном атоме дейтерия), по меньшей мере 4000 (включение 60% дейтерия), по меньшей мере 4500 (включение 67,5% дейтерия), по меньшей мере 5000 (включение 75% дейтерия), по меньшей мере 5500 (включение 82,5% дейтерия), по меньшей мере 6000 (включение 90% дейтерия), по меньшей мере 6333,3 (включение 95% дейтерия), по меньшей мере 6466,7 (включение 97% дейтерия), по меньшей мере 6600 (включение 99% дейтерия) или по меньшей мере 6633,3 (включение 99,5% дейтерия). Следует понимать, что термин "коэффициент изотопного обогащения" может использоваться в отношении любого изотопа таким же образом, как это описано для дейтерия.

Другие примеры изотопов, которые можно включать в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸F ³¹P, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I соответственно. Следовательно, следует понимать, что настоящее изобретение включает соединения, в которые включены один или несколько любых из вышеуказанных изотопов, в том числе, например, радиоактивные изотопы, такие как ³H и ¹⁴C, или соединения, в которых присутствуют нерадиоактивные изотопы, такие как ²H и ¹³C. Такие меченные изотопами соединения применимы в исследованиях метаболизма (с использованием ¹⁴C), исследованиях кинетики реакций (например, с использованием ²H или ³H), методиках обнаружения или визуализации, таких как позитронно-эмиссионная томография (PET) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), включая анализы распределения лекарственного средства или субстрата в тканях, или при лучевой терапии пациентов. В частности, ¹⁸F или меченое соединение может быть особенно востребованными для исследований PET или SPECT. Меченные изотопом соединения по настоящему изобретению, как правило, можно получать с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, или с помощью способов, аналогичных описанным в прилагаемых примерах и способах получения, с использованием подходящего меченного изотопом реагента - вместо немеченного реагента, используемого ранее.

Применяемый в данном документе термин "фармацевтическая композиция" относится к соединению по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем в подходящей для перорального или парентерального введения форме.

Применяемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к веществу, пригодному в получении или применении фармацевтической композиции, и включает, например, подходящие разбавители, растворители, дисперсионные среды, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты, изотонические средства, буферные средства, эмульгаторы, средства, замедляющие абсорбцию, соли, стабилизаторы лекарственных средств, связующие средства, вспомогательные вещества, разрыхляющие средства, смазочные средства, смачивающие средства, подсластители, ароматизирующие средства, красители и их комбинации, которые должны быть известны специалистам в данной области техники (см., например, Remington The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Ed. Pharmaceutical Press, 2013, pp. 1049-1070).

Термин "терапевтически эффективное количество" соединения по настоящему изобретению относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ у субъекта, например, снижение или подавление активности фермента или белка, или уменьшать тяжесть симптомов, облегчать состояние, замедлять или задерживать прогрессирование заболевания, или предупреждать заболевание и т. д. В одном варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении субъекту является эффективным в отношении (1) по меньшей мере частичного облегчения, предупреждения и/или снижения тяжести состояния, или нарушения, или заболевания, (i) опосредованных путем mTOR, или (ii) ассоциированных с активностью mTOR, или (iii) характеризующихся активностью (нормальной или аномальной) mTOR; или (2) уменьшения или подавления активности mTOR; или (3) снижения или подавления экспрессии mTOR. В одном варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку, или ткань, или неклеточный биологический материал, или среду является эффективным в отношении по меньшей мере частичного снижения или подавления активности mTOR или по меньшей мере частичного снижения или подавления экспрессии mTOR.

Применяемый в данном документе термин "субъект" означает приматов (например, людей, мужчин или женщин), собак, кошек, кроликов, морских свинок, свиней, крыс и мышей. В определенных вариантах осуществления субъектом является примат. В других вариантах осуществления субъектом является человек.

Применяемые в данном документе термины "вводить", "осуществление введения" или "введение" относятся к имплантации, абсорбции, приему внутрь, осуществлению инъекции, ингаляции или иному введению соединения по настоящему изобретению или фармацевтической композиции на его основе.

Применяемые в данном документе термины "подавлять", "подавление" или "подавляющий" означают снижение или ослабление данного состояния, симптома, или нарушения, или заболевания или значительное снижение исходной активности в отношении биологической активности или процесса.

Применяемый в данном документе термин "лечить", "осуществление лечения" или "лечение" любого заболевания или нарушения относится к облегчению, задержке наступления, снижению тяжести заболевания или нарушения (т. е. замедлению или остановке развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов) или снижению или уменьшению по меньшей мере одного физического параметра или биомаркера, ассоциированных с заболеванием или нарушением, в том числе таких, которые могут не ощущаться пациентом. В некоторых вариантах осуществления "лечение", "лечить" или "осуществление лечения" требуют, чтобы признаки или симптомы заболевания, нарушения или состояния развивались или наблюдались. В других вариантах осуществления средство лечения может быть введено при отсутствии признаков или симптомов заболевания или состояния. Например, средство лечения может быть введено восприимчивому индивидууму до появления симптомов (например, с учетом истории симптомов и/или с учетом генетических факторов или других факторов восприимчивости). Лечение также может быть продолжено после устранения симптомов, например, для задержки наступления или предупреждения рецидива.

Применяемый в данном документе термин "предупреждать", "осуществление предупреждения" или "предупреждение" любого заболевания или нарушения относится к профилактическому лечению заболевания или нарушения или замедлению начала или прогрессирования заболевания или нарушения.

Применяемый в данном документе термин "возрастное заболевание или нарушение" относится к любому заболеванию или нарушению, частота которых в популяции или тяжесть у индивидуума коррелирует с увеличением возраста. Более конкретно возрастное заболевание или нарушение представляет собой заболевание или нарушение, частота которого по меньшей мере в 1,5 раза выше среди людей старше 65 лет по сравнению с людьми в возрасте 25-35 лет. Примеры возрастных нарушений включают без ограничения саркопению, атрофию кожи, виды старческой гемангиомы, виды себорейного кератоза, атрофию головного мозга, также называемую деменцией, атеросклероз, артериосклероз, эмфизему легких, остеопороз, остеоартрит, высокое кровяное давление, эректильную дисфункцию, виды катаракты, макулярную дегенерацию, глаукому, инсульт, цереброваскулярное заболевание (инсульты), хроническое заболевание почки, ассоциированное с диабетом заболевание почки, нарушение функции печени, фиброз печени, аутоиммунный гепатит, гиперплазию эндометрия, нарушение обмена веществ, реноваскулярное заболевание, потерю слуха, нарушение способности к передвижению (например, немощность), снижение когнитивных способностей, жесткость сухожилия, дисфункцию сердца, такую как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункцию сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старение иммунной системы, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рак, старение иммунной системы, приводящее к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекции, обусловленные снижением иммунной функции, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), ожирение, потерю вкуса, потерю обоняния, артрит и диабет II типа, в том числе осложнения, связанные с диабетом, такие как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

Как используется в данном документе, субъект является "нуждающимся в" лечении, если в результате такого лечения такой субъект получит пользу с биологической, медицинской точки зрения. или улучшится качество его жизни.

Все способы, описанные в данном документе, можно осуществлять в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или нет иного явного противоречия по контексту. Представленное в данном документе применение всех возможных примеров или вводных слов перед примерным объектом (например, "такой как") предназначено исключительно для лучшего освещения настоящего изобретения и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, заявленного в остальной части.

Любой асимметрический атом (например, углерод или подобный) в соединении(соединениях) по настоящему изобретению может находиться в рацемической или энантиомерно обогащенной форме, например, в (R)-, (S)- или (R, S)-конфигурации. В определенных вариантах осуществления каждый асимметрический атом характеризуется по меньшей мере 50% энантиомерным избытком, по меньшей мере 60% энантиомерным избытком, по меньшей мере 70% энантиомерным избытком, по меньшей мере 80% энантиомерным избытком, по меньшей мере 90% энантиомерным избытком, по меньшей мере 95% энантиомерным избытком или по меньшей мере 99% энантиомерным избытком в (R)- или (S)-конфигурации. Заместители при атомах с ненасыщенными двойными связями могут, если это возможно, находиться в цис- (Z)- или транс- (E)-форме.

Соответственно, как используется в данном документе, соединение по настоящему изобретению может находиться в форме одного из возможных стереоизомеров, ротамеров, атропоизомеров, таутомеров или их смесей, например, в виде по сути чистых геометрических (цис- или транс-) стереоизомеров, диастереоизомеров, оптических изомеров (антиподов), рацематов или их смесей.

Любые полученные в результате смеси стереоизомеров могут быть разделены на основании физико-химических отличий составляющих на чистые или практически чистые геометрические или оптические изомеры, диастереомеры, рацематы, например, посредством хроматографии и/или фракционной кристаллизации.

Любые полученные в результате рацематы соединений по настоящему изобретению или промежуточных соединений могут быть разделены на оптические антиподы посредством известных способов, например, посредством разделения их диастереомерных солей, полученных с помощью оптически активных кислоты или основания, и выделения оптически активных кислотного или основного соединений. В частности, основный фрагмент, таким образом, может быть использован для разделения соединений по настоящему изобретению на их оптические антиподы, например, путем фракционной кристаллизации соли, образованной с помощью оптически активной кислоты, например, винной кислоты, дибензоилвинной кислоты, диацетилвинной кислоты, ди-O, O'-п-толуоилвинной кислоты, миндальной кислоты, яблочной кислоты или камфор-10-сульфоновой кислоты. Рацемические соединения по настоящему изобретению или рацемические промежуточные соединения также могут быть разделены посредством хиральной хроматографии, например жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) с применением хирального адсорбента.

Способы получения соединений формулы (I)

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ получения соединений формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B. Соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B могут быть получены в соответствии со следующим способом, описанным на схемах 1, 2 и 3.

Схема 1

Соединение формулы (I), в котором R₂ определен для формулы (I), может быть получено путем осуществления реакции C32-дезоксорапамицина (промежуточное соединение 1) с R₂-H, где R₂ определен для формулы (I), в присутствии подходящего реагента для реакции замещения, например п-толуолсульфоновой кислоты, в присутствии подходящего растворителя, например дихлорметана. Подходящие условия являются следующими:

1) R₂-H, п-толуолсульфоновая кислота-H₂O, дихлорметан, комнатная температура;

2) R₂-H, трифторуксусная кислота, -40°C, дихлорметан (см. EP1212331B1);

3) R₂-H, 5 M LiClO₄, Et₂O (0,1 M), комнатная температура (см. TL, 1995, 43, 7823);

4) R₂-H, Cp₂HfCl₂-AgClO₄ (катализатор Сузуки), 4A MS, дихлорметан, комнатная температура (см. TL, 1995, 43, 7823);

5) R₂-H, BF₃-OEt₂ или Zn(OTf)₂, THF, 0°C (см. TL, 1994, 37, 6835);

6) R₂-H, ZnCl₂, дихлорметан, 0°C (см. JOC, 1994, 59, 6512).

C32-дезоксорапамицин, применяемый в качестве исходного материала может быть получен посредством способов, известных из уровня техники, например, как описано в публикации патента США № 005985890 или WO 2007085400.

Схема 2

Соединение формулы (I)-A, где R₁ выбран из и R₂ определен для формулы (I), может быть получено путем осуществления реакции промежуточного соединения 1 с R₁-H или R₁-X с последующей реакцией с R₂-H. В одном варианте осуществления промежуточное соединение 1 вводят в реакцию с R₁-H или R₁-X в условиях алкилирования, фосфинирования или эстерификации с получением промежуточного соединения 1-A. В одном варианте осуществления промежуточное соединение 1-A вводят в реакцию с R₂-H в условиях реакции замещения, например, как представлено в данном документе, с получением соединения формулы (I)-A.

Схема 3

Соединение формулы (I)-C, где R₁ представляет собой ; и R₂ определен для формулы (I), может быть получено путем осуществления реакции промежуточного соединения 1 с R₁-H с последующей реакцией с R₂-H. В одном варианте осуществления промежуточное соединение 1 активируют и вводят в реакцию в нуклеофильных условиях с получением промежуточного соединения 1-A. В одном варианте осуществления промежуточное соединение 1-A вводят в реакцию с R₂-H в условиях реакция замещения, например, как представлено в данном документе, с получением соединения формулы (I)-C.

Реакции могут быть осуществлены в соответствии с традиционными способами, например, как описано в примерах.

Обработку реакционных смесей и очистку получаемых таким образом соединений можно осуществлять в соответствии с известными процедурами.

Соли присоединения кислот можно получать из свободных оснований известным способом и наоборот.

Исходные материалы могут быть известны или получены в соответствии с традиционными процедурами, исходя из известных соединений, например, как описано в примерах.

В другом аспекте в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере два таких фармацевтически приемлемых носителя, которые описаны в данном документе. Фармацевтическая композиция может быть составлена для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение (например, путем инъекции, инфузии, трансдермального или местного введения) и ректальное введение. Местное введение может также относиться к ингаляционному или интраназальному применению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно изготавливать в твердой форме (включая без ограничения капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории) или в жидкой форме (включая без ограничения растворы, суспензии или эмульсии). Таблетки могут быть либо покрыты пленочной оболочкой, либо покрыты кишечнорастворимой оболочкой в соответствии со способами, известными из уровня техники. Как правило, фармацевтические композиции представляют собой таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе с одним или несколькими из:

a) разбавителей, например лактозы, декстрозы, сахарозы, маннита, сорбита, целлюлозы и/или глицина;

b) смазывающих веществ, например, диоксида кремния, талька, стеариновой кислоты, ее магниевой или кальциевой соли и/или полиэтиленгликоля; в случае таблеток также

c) связующих, например алюмосиликата магния, крахмальной пасты, желатина, трагаканта, метилцеллюлозы, натрий-карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидона; при необходимости

d) разрыхлителей, например, видов крахмала, агара, альгиновой кислоты или ее натриевой соли или шипучих смесей; и

e) абсорбентов, красителей, ароматизаторов и подсластителей.

Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль могут также находиться в форме стента, выделяющего лекарственное средство, т. е. стента, покрытого соединением по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью.

Соединения по настоящему изобретению в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли проявляют ценные фармакологические свойства, например модулирующие свойства в отношении пути mTOR, например, показанные с помощью анализов in vitro и in vivo, представленных в следующих разделах, и, следовательно, предназначены для терапии или для применения в качестве химических веществ для исследований, например, в качестве фармакологически активных соединений.

Способы измерения активности ингибиторов mTORC1 широко известны в уровне техники. Как правило, активность определяют с помощью значений IC50, которые оценивают путем определения степени ингибирования фосфорилирования S6, который присутствует в пути передачи сигналов mTORC1. Значения IC50 для ингибиторов mTORC1 сравнивают со значением IC50 для рапамицина в таком же анализе. Ингибитор mTORC1, имеющий значение IC50 в пределах 100-кратного значения IC50 рапамицина в том же анализе, является подходящим для применения в настоящем изобретении, это означает, что все еще может быть необходим менее активный рапалог, чтобы легче достигать только частичного ингибирования активности mTORC1 при определенных условиях, а также для улучшения способности измерять уровень содержания молекулы в кровотоке (поскольку для менее активной молекулы необходимы более высокие концентрации), что было бы полезно для точной настройки соотношения концентрация/эффективность в крови.

Подходящие анализы для измерения активности ингибиторов mTOR описаны, например, в патенте США № 5665772, как измерено по значению IC50 в анализе посредством MLR (реакция смешанной культуры лимфоцитов) и/или в анализе опосредованной IL-6 (интерлейкин-6)-зависимой пролиферации.

Анализ посредством MLR, как правило, проводят следующим образом. Клетки селезенки (0,5×106) от мышей Balb/c (самки, 8-10 недель) инкубируют в течение 5 дней совместно с облученными (2000 рад), обработанными митомицином С клетками селезенки (0,5×106) от мышей CBA (самки, 8-10 недель). Облученные аллогенные клетки индуцируют пролиферативный ответ в клетках селезенки Balb/c, который можно измерить посредством включения меченого предшественника в ДНК. Поскольку клетки-стимуляторы облучают (или обрабатывают митомицином С), они не реагируют на клетки Balb/c с пролиферацией, но сохраняют свою антигенность. Антипролиферативный эффект тестируемых соединений на клетки Balb/c измеряют при различных разведениях и рассчитывают концентрацию, приводящую к 50% ингибированию пролиферации клеток (IC50). Ингибирующую способность тестируемого образца можно сравнить с рапамицином и выразить в виде относительной величины IC50 (т. е. IC50 тестируемого образца/IC50 рапамицина).

Анализ IL-6-опосредованной пролиферации, как правило, осуществляют следующим образом: в анализе используют интерлейкин-6 (IL-6)-зависимую линию клеток гибридомы мыши и его проводят в 96-луночных титрационных микропланшетах. 5000 клеток/лунка культивируют в бессывороточной среде (как описано M. H. Schreier и R. Tees в Immunological Methods, I. Lefkovits and B. Pernis, eds., Academic Press 1981. Vol. II, pp. 263-275), дополненной 1 нг рекомбинантного IL-6/мл. После 66-часовой инкубации в отсутствие или в присутствии тестируемого образца клетки подвергают импульсной обработке с использованием 1 мкКи (3-H)-тимидина/лунка в течение еще 6 часов, собирают и подсчитывают посредством жидкостной сцинтилляции. Включение (3-H)-тимидина в ДНК коррелирует с увеличением числа клеток и, таким образом, является мерой пролиферации клеток. Серийное разведение тестируемого образца позволяет рассчитать концентрацию, приводящую к 50% ингибированию пролиферации клеток (IC50). Ингибирующую способность тестируемого образца можно сравнить с рапамицином и выразить в виде относительной величины IC50 (т. е. IC50 тестируемого образца/IC50 рапамицина).

Активность ингибиторов mTOR также можно определить с применением клеточного анализа, в котором используют клетки MEF TSC1-/-. Клетки MEF TSC1-/- представляют собой фибробласты эмбриона мыши с дефицитом белка туберозного склероза TSC1, который негативно регулирует передачу сигналов mTORC1. Таким образом, дефицит TSC1 индуцирует конститутивную активацию mTORC1, что приводит к фосфорилированию (активации) белков, следующих далее в сигнальных путях mTORC1. Данный клеточный анализ применяют для измерения ингибирования (дефосфорилирования) компонентов S6 и 4EBP1 пути передачи сигнала mTORC1 посредством рапалогов или других ингибиторов mTOR.

Анализ, как правило, проводят следующим образом. Клетки MEF TSC1-/- высеивают в покрытые поли-D-лизином 384-луночные планшеты Greiner с прозрачным дном и инкубируют в течение ночи при 37°C, 5% CO2. На следующий день клетки промывают 8 раз раствором "сильного голода" (1 л DPBS+1 г D(+)-глюкозы+10 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия+20 мл 1 М HEPES) и инкубируют в течение еще 2 часов в том же растворе. Затем клетки обрабатывают соединениями с уменьшающимися значениями концентрации (8 значений при 3,16-кратном разбавлении) и инкубируют в течение 2 часов при 37°C, 5% CO2. Клетки фиксируют с помощью 4% параформальдегида в течение 30 мин. и 5 раз промывают с помощью TBS-EDTA с последующим иммунным окрашиванием меченными флуоресцентной меткой антителами к pS6 и p4EBP1. Ядра делают видимыми с помощью красителя Hoechst. Клетки визуализируют с использованием соответствующих флуоресцентных каналов и активность ингибиторов mTOR определяют с помощью IC₅₀ (нМ) в отношении pS6.

Заболевания и нарушения

Соединения по настоящему изобретению могут быть пригодными в предупреждении или лечении симптома или продромального состояния, выбранных из:

- васкулопатий, связанных с трансплантатом;

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

- эпилептических припадков и связанных с эпилептическими припадками нарушений;

- митохондриальной миопатии и митохондриального стресса;

- поддающихся лечению состояний, которые, как было показано, повышают вероятность возникновения возрастных заболеваний, таких как состояния, при которых происходит повышение уровня цитокинов, вызывающих старение (например, IL6);

- нарушений, которые включают процесс фиброза и/или воспаления, например нарушений печени и почки. Примеры включают фиброз печени, который возникает на терминальной стадии заболевания печени; цирроз печени; печеночную недостаточность, вызванную токсичностью; неалкогольный стеатогепатит или NASH и алкогольный стеатоз. Другой пример представляет собой фиброз почки, который возникает в результате острого повреждения почки, приводящего к хроническому заболеванию почки. Также диабетическая нефропатия может индуцировать фиброз почки и воспаление. Зачастую заболевание почки вызывает сердечную недостаточность в результате повышения кровяного давления; это также может быть связано с фиброзом сердца. Рапалоги обладают доклинической эффективностью в моделях лечения сердечной недостаточности и эффективны в уменьшении фиброза печени у пациентов, перенесших трансплантацию печени (Buss, S.J. et al. Beneficial effects of Mammalian target of rapamycin inhibition on left ventricular remodeling after myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. (2009) 54(25): 2435-46; Buss, S.J. et al. Augmentation of autophagy by mTOR-inhibition in myocardial infarction: When size matters. Autophagy. (2010) 6(2):304-6; Villamil, F.G. et al. Fibrosis progression in maintenance liver transplant patients with hepatitis C recurrence: a randomized study of everolimus vs. calcineurin inhibitors. Liver Int. (2014) 34(10):1513-21).

Лечение острого или хронического отторжения трансплантата органа или ткани включает лечение реципиентов, например, трансплантатов сердца, легких, сердца и легких вместе, печени, почки, поджелудочной железы, кожи или роговицы. Соединения по настоящему изобретению также предназначены для предупреждения реакции "трансплантат против хозяина", например, после трансплантации костного мозга.

Васкулопатии, связанные с трансплантатом, включают атеросклероз.

Аутоиммунные заболевания и воспалительные состояния включают, в частности, воспалительные состояния с этиологией, включающей аутоиммунный компонент, такие как артрит (например, ревматоидный артрит, прогрессирующий хронический артрит и деформирующий артрит) и ревматические заболевания. Конкретные аутоиммунные заболевания, при которых можно использовать соединения формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C, включают аутоиммунные гематологические нарушения (в том числе, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, врожденную апластическую анемию и идиопатическую тромбоцитопению), системную красную волчанку, полихондрию, склеродермию, гранулематоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, миастению гравис, псориаз, синдром Стивенса-Джонсона, идиопатический синдром мальабсорбции, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника (включая, например, язвенный колит и болезнь Крона), эндокринную офтальмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, рассеянный склероз, первичный билиарный цирроз, ювенильный диабет (сахарный диабет I типа), увеит (передний и задний), синдром сухого глаза и весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легких, псориатический артрит, гломерулонефрит (с нефротическим синдромом и без него, например, в том числе идиопатический нефротический синдром или нефропатию минимальных изменений) и ювенильный дерматомиозит.

Лечение при множественной лекарственной резистентности (MDR) включает повышение эффективности других химиотерапевтических средств в лечении и контроле состояний с множественной лекарственной резистентностью, таких как рак с множественной лекарственной резистентностью или СПИД с множественной лекарственной резистентностью. MDR особенно проблематична у пациентов, страдающих раком, и пациентов с ADS, которые не реагируют на традиционную химиотерапию, поскольку Pgp выводит лекарственный препарат из клеток.

Инфекция включает инфекцию, обусловленную патогенами, имеющими Mip-факторы или Mip-подобные факторы.

Возрастные заболевания включают саркопению, атрофию кожи, виды старческой гемангиомы, виды себорейного кератоза, атрофию головного мозга, также называемую деменцией, атеросклероз, артериосклероз, эмфизему легких, остеопороз, остеоартрит, высокое кровяное давление, эректильную дисфункцию, виды катаракты, макулярную дегенерацию, глаукому, инсульт, цереброваскулярное заболевание (инсульты), хроническое заболевание почки, ассоциированное с диабетом заболевание почки, нарушение функции печени, фиброз печени, аутоиммунный гепатит, гиперплазию эндометрия, нарушение обмена веществ, реноваскулярное заболевание, потерю слуха, нарушение способности к передвижению (например, немощность), снижение когнитивных способностей, жесткость сухожилия, дисфункцию сердца, такую как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункцию сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старение иммунной системы, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рак, старение иммунной системы, приводящее к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекции, обусловленные снижением иммунной функции, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), ожирение, потерю вкуса, потерю обоняния, артрит и диабет II типа, в том числе осложнения, связанные с диабетом, такие как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

Нейродегенеративные заболевания включают болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, спиноцеребеллярную атаксию 3 типа, болезнь Альцгеймера, болезнь двигательных нейронов и периферическую нейропатию.

Пролиферативные нарушения включают рак. Такие состояния включают состояния, перечисленные в патенте США № 9669032, в частности рак почки, почечно-клеточную карциному, колоректальный рак, саркому матки, рак эндометрия матки, рак эндометрия, рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак желудка, фибросаркому, рак поджелудочной железы, рак печени, меланому, лейкоз, множественную миелому, рак носоглотки, рак предстательной железы, рак легкого, глиобластому, рак мочевого пузыря, мезотелиому, рак головы, рабдомиосаркому, саркому, лимфому или рак шеи.

Эпилептические припадки и связанные с эпилептическими припадками нарушения включают синдром Веста, фокальную кортикальную дисплазию (FCD), комплекс туберозного склероза (TSC), детскую абсансную эпилепсию, доброкачественную фокальную эпилепсию детства, ювенильную миоклоническую эпилепсию (JME), эпилепсию височной доли, эпилепсию лобной доли, рефрактерную эпилепсию, синдром Леннокса-Гасто, эпилепсию затылочной доли, синдром Протея, синдром гемимегалэнцефалии (HMEG), синдром мегалэнцефалии (MEG), мегалэнцефалию-капиллярную мальформацию (MCAP) и мегалэнцефалию-полимикрогирию-полидактилию-синдром гидроцефалии (MPPH).

Митохондриальная миопатия и митохондриальный стресс представляют собой митохондриальные нарушения, описанные в Chinnery, P.F. (2015); EMBO Mol. Med. 7, 1503-1512; Koopman, W.J. et al., (2016); EMBO Mol. Med. 8, 311-327 и Young, M.J., and Yound and Copeland, W.C. (2016); Curr. Opin. Genet. Dev. 38, 52-62.

Поддающиеся лечению состояния, которые, как было показано, повышают вероятность возникновения возрастных заболеваний, включают старение, например старение иммунной системы. Это диагностируется по (i) увеличению уровня циркулирующих цитокинов, таких как IL-6, но также по (ii) стареющим клеткам, обнаруженным в мышцах, почках, печени, головном мозге, среди нейронов, в печени, поджелудочной железе или сердце; или также по (iii) снижению эффективности репарации ДНК, что может быть продемонстрировано увеличением уровня транскрипции повторяющихся элементов, включая гены, кодируемые транспозоном. В качестве справочной информации см. Baker, D. J. et al, Nature, 2016; 530(7589):184-9. doi: 10.1038/nature16932. Epub 2016 Feb 3.

Способы лечения и варианты применения

В настоящем изобретении предусмотрено применение соединения по настоящему изобретению для применения в терапии. В дополнительном варианте осуществления терапия выбрана для заболевания, или нарушения, или сопутствующего заболевания, лечение которого можно осуществлять посредством модуляции пути mTOR. В одном варианте осуществления заболевание выбрано из вышеупомянутого перечня, в одном варианте осуществления - возрастного заболевания, такого как заболеваемость, связанная с инфекцией дыхательных путей, у пожилых людей.

В настоящем изобретении предусмотрено соединение по настоящему изобретению для применения в терапии. В дополнительном варианте осуществления терапия выбрана для заболевания, лечение которого можно осуществлять посредством модуляции пути mTOR. В одном варианте осуществления заболевание выбрано из вышеупомянутого перечня, в одном варианте осуществления - возрастного заболевания, такого как заболеваемость, связанная с инфекцией дыхательных путей, у пожилых людей.

В настоящем изобретении предусмотрено применение соединения по настоящему изобретению для изготовления лекарственного препарата. В дополнительном варианте осуществления лекарственный препарат предназначен для предупреждения или лечения заболевания, лечение которого можно осуществлять посредством модуляции пути mTOR. В одном варианте осуществления заболевание выбрано из вышеупомянутого перечня, в одном варианте осуществления - возрастного заболевания, такого как заболеваемость, связанная с инфекцией дыхательных путей, у пожилых людей.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR, у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтической комбинации, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, где мишень, представляющая собой ткань или орган, ассоциированная с патологией, обусловленной заболеванием или нарушением, характеризуется уровнями FKBP12, достаточными для ингибирования mTORC1, при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтической комбинации, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, характеризующегося или ранее определенного как характеризующийся уровнями FKBP12, достаточными для ингибирования mTORC1, при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтической комбинации, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления заболевание или нарушение выбраны из саркопении, атрофии кожи, видов старческой гемангиомы, видов себорейного кератоза, атрофии головного мозга, атеросклероза, артериосклероза, эмфиземы легких, остеопороза, остеоартрита, высокого кровяного давления, эректильной дисфункции, видов катаракты, макулярной дегенерации, глаукомы, инсульта, цереброваскулярного заболевания (инсультов), хронического заболевания почки, ассоциированного с диабетом заболевания почки, нарушения функции печени, фиброза печени, аутоиммунного гепатита, гиперплазии эндометрия, нарушения обмена веществ, реноваскулярного заболевания, потери слуха, нарушения способности к передвижению, снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), ожирения, потери вкуса, потери обоняния, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой фиброз печени.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтической комбинации, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, где нарушение или заболевание выбраны из

- васкулопатий, связанных с трансплантатом;

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

В одном варианте осуществления нарушение представляет собой нарушение, которое включает процесс фиброза и/или воспаления.

В одном варианте осуществления нарушение выбрано из нарушений печени и почки.

В одном варианте осуществления нарушение печени выбрано из фиброза печени, который возникает на терминальной стадии заболевания печени; цирроза печени; печеночной недостаточности, вызванной токсичностью; неалкогольного стеатогепатита или NASH и алкогольного стеатоза.

В одном варианте осуществления нарушение почки представляет собой фиброз почки.

В одном варианте осуществления фиброз почки возникает в результате острого повреждения почки.

В одном варианте осуществления нарушение почки представляет собой хроническое нарушение почки.

В одном варианте осуществления нарушение почки представляет собой диабетическую нефропатию.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения возрастного нарушения или заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтической комбинации, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, где нарушение или заболевание выбраны из саркопении, атрофии кожи, видов старческой гемангиомы, видов себорейного кератоза, атрофии головного мозга, атеросклероза, артериосклероза, эмфиземы легких, остеопороза, остеоартрита, высокого кровяного давления, эректильной дисфункции, видов катаракты, макулярной дегенерации, глаукомы, инсульта, цереброваскулярного заболевания (инсультов), хронического заболевания почки, ассоциированного с диабетом заболевания почки, нарушения функции печени, фиброза печени, аутоиммунного гепатита, гиперплазии эндометрия, нарушения обмена веществ, реноваскулярного заболевания, потери слуха, нарушения способности к передвижению, снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), ожирения, потери вкуса, потери обоняния, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения рака у субъекта, при этом способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтической комбинации, содержащей соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическая комбинация, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в качестве лекарственного препарата.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическая комбинация, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в предупреждении или лечении нарушения или заболевания, опосредованных путем mTOR.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическая комбинация, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в предупреждении или лечении нарушения или заболевания, выбранных из

- васкулопатий, связанных с трансплантатом;

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

- митохондриальной миопатии и митохондриального стресса и

- поддающихся лечению состояний, которые, как было показано, повышают вероятность возникновения возрастных заболеваний, таких как состояния, в которых происходит повышение уровня цитокинов, вызывающих старение.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическая комбинация, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в предупреждении или лечении нарушения или заболевания, которые включают процесс фиброза и/или воспаления.

В одном варианте осуществления нарушение почки представляет собой фиброз почки, который возникает в результате острого повреждения почки.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическая комбинация, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в предупреждении или лечении возрастного нарушения или заболевания, выбранных из саркопении, атрофии кожи, видов старческой гемангиомы, видов себорейного кератоза, атрофии головного мозга, также называемой деменцией, атеросклероза, артериосклероза, эмфиземы легких, остеопороза, остеоартрита, высокого кровяного давления, эректильной дисфункции, видов катаракты, макулярной дегенерации, глаукомы, инсульта, цереброваскулярного заболевания (инсультов), хронического заболевания почки, ассоциированного с диабетом заболевания почки, нарушения функции печени, фиброза печени, аутоиммунного гепатита, гиперплазии эндометрия, нарушения обмена веществ, реноваскулярного заболевания, потери слуха, нарушения способности к передвижению (например, немощности), снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), ожирения, потери вкуса, потери обоняния, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическая комбинация, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в предупреждении или лечении рака.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрены соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемая соль, фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтическая комбинация, содержащая соединение формулы (I), формулы (I)-A, формулы (I)-B и формулы (I)-C или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в лечении рака почки, почечно-клеточной карциномы, колоректального рака, саркомы матки, рака эндометрия матки, рака эндометрия, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака желудка, фибросаркомы, рака поджелудочной железы, рака печени, меланомы, лейкоза, множественной миеломы, рака носоглотки, рака предстательной железы, рака легкого, глиобластомы, рака мочевого пузыря, мезотелиомы, рака головы, рабдомиосаркомы, саркомы, лимфомы или рака шеи.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрено соединение

или его фармацевтически приемлемая соль, для применения в лечении возрастного заболевания, такого как заболеваемость, связанная с инфекцией дыхательных путей, у пожилых людей. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления нарушение или заболевание выбраны из

- васкулопатий, связанных с трансплантатом;

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

- поддающихся лечению состояний, которые, как показано, повышают вероятность возникновения возрастных заболеваний, таких как состояния, при которых происходит повышение уровня цитокинов, вызывающих старение (например, IL6).

В одном варианте осуществления нарушение или заболевание представляют собой возрастное нарушение или заболевание, выбранное из саркопении, атрофии кожи, видов старческой гемангиомы, видов себорейного кератоза, атрофии головного мозга, также называемой деменцией, атеросклероза, артериосклероза, эмфиземы легких, остеопороза, остеоартрита, высокого кровяного давления, эректильной дисфункции, видов катаракты, макулярной дегенерации, глаукомы, инсульта, цереброваскулярного заболевания (инсультов), хронического заболевания почки, ассоциированного с диабетом заболевания почки, нарушения функции печени, фиброза печени, аутоиммунного гепатита, гиперплазии эндометрия, нарушения обмена веществ, реноваскулярного заболевания, потери слуха, нарушения способности к передвижению (например, немощности), снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), ожирения, потери вкуса, потери обоняния, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

В одном варианте осуществления нарушение или заболевание включают процесс фиброза и/или воспаления, например, нарушения печени и почки. В одном варианте осуществления нарушение представляет собой нарушение почки. В одном варианте осуществления нарушение представляет собой нарушение печени. Примеры включают фиброз печени, который возникает на терминальной стадии заболевания печени; цирроз печени; печеночную недостаточность, вызванную токсичностью; неалкогольный стеатогепатит или NASH и алкогольный стеатоз. Другой пример представляет собой фиброз почки, который возникает в результате острого повреждения почки, приводящего к хроническому заболеванию почки. Также диабетическая нефропатия может индуцировать фиброз почки и воспаление. Зачастую заболевание почки вызывает сердечную недостаточность в результате повышения кровяного давления; это также может быть связано с фиброзом сердца. Рапалоги обладают доклинической эффективностью в моделях лечения сердечной недостаточности и эффективны в уменьшении фиброза печени у пациентов, перенесших трансплантацию печени.

Терапевтически эффективная доза соединения, фармацевтической композиции или их комбинаций зависит от вида субъекта, веса тела, возраста и индивидуального состояния, нарушения или заболевания, лечение которых осуществляют, или их тяжести. Квалифицированный лечащий врач, клиницист или ветеринар может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для предупреждения, лечения или подавления прогрессирования нарушения или заболевания.

Вышеупомянутые параметры дозировки являются очевидными в тестах in vitro и in vivo с применением преимущественно млекопитающих, например мышей, крыс, собак, нечеловекообразных обезьян или выделенных органов, тканей и их препаратов. Соединения по настоящему изобретению можно применять in vitro в виде растворов, например водных растворов, и in vivo либо энтерально, либо парентерально, преимущественно внутривенно, например, в виде суспензии или водного раствора. Доза in vitro может находиться в диапазоне молярной концентрации от приблизительно 10^-3 моль/л до 10^-9 моль/л. Терапевтически эффективное количество in vivo в зависимости от пути введения может находиться в диапазоне приблизительно 0,1-500 мг/кг или приблизительно 0,1-500 мг на субъекта.

Соединение по настоящему изобретению можно вводить либо одновременно с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, либо до, либо после их введения. Соединение по настоящему изобретению можно вводить отдельно с помощью того же или отличающегося пути введения или совместно в составе одной и той же фармацевтической композиции, что и другие средства. Терапевтическое средство представляет собой, например, химическое соединение, пептид, антитело, фрагмент антитела или нуклеиновую кислоту, которые являются терапевтически активными или повышают терапевтическую активность при введении пациенту в комбинации с соединением по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении представлен продукт, содержащий соединение по настоящему изобретению и по меньшей мере одно другое терапевтическое средство в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. В одном варианте осуществления терапия представляет собой лечение заболевания или состояния посредством частичного или полного ингибирования mTOR. Продукты, представленные в виде комбинированного препарата, включают композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению и другое(другие) терапевтическое(терапевтические) средство(средства) вместе в той же фармацевтической композиции, или соединение по настоящему изобретению и другое(другие) терапевтическое(терапевтические) средство(средства) в отдельной форме, например, в форме набора.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению и другое(другие) терапевтическое(терапевтические) средство(средства). Необязательно фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, описанный выше.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен набор, содержащий две или более отдельных фармацевтических композиций, по меньшей мере одна из которых содержит соединение по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления набор содержит средства для раздельного содержания указанных композиций, такие как контейнер, разделенная бутылка или разделенный пакет из фольги. Примером такого набора является блистерная упаковка, как правило, применяемая для упаковки таблеток, капсул и т. п.

Набор по настоящему изобретению можно применять для введения различных лекарственных форм, например, для перорального и парентерального применения, для введения отдельных композиций с различными интервалами между введениями доз или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. В целях содействия соблюдению режима лечения набор по настоящему изобретению, как правило, содержит инструкции по введению.

В видах комбинированной терапии по настоящему изобретению соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство могут быть изготовлены и/или составлены одним и тем же или разными производителями. Более того, соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство могут быть объединены в комбинированной терапии: (i) до того, как комбинированный продукт попадает к врачам (например, в случае набора, содержащего соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство); (ii) самими врачами (или под наблюдением врача) незадолго до введения; (iii) в самих пациентах, например во время последовательного введения соединения по настоящему изобретению и другого терапевтического средства.

Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения по настоящему изобретению для предупреждения или лечения заболевания или состояния посредством частичного или полного ингибирования mTOR, где лекарственный препарат получают для введения с другим терапевтическим средством. В настоящем изобретении также предусмотрено применение другого терапевтического средства для предупреждения или лечения заболевания или состояния, опосредованного ингибированием mTOR, где лекарственный препарат вводят с соединением по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении также предусмотрено соединение формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемая соль для применения в способе предупреждения или лечения заболевания или состояния, опосредованного ингибированием mTOR, где соединение по настоящему изобретению получают для введения с другим терапевтическим средством. В настоящем изобретении также предусмотрено другое терапевтическое средство для применения в способе предупреждения или лечения заболевания или состояния, опосредованного ингибированием mTOR, где другое терапевтическое средство получают для введения с соединением формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой солью. В настоящем изобретении также предусмотрено соединение формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемая соль для применения в способе предупреждения или лечения заболевания или состояния, опосредованного ингибированием mTOR, где соединение вводят с другим терапевтическим средством. В настоящем изобретении также предусмотрено другое терапевтическое средство для применения в способе предупреждения или лечения заболевания или состояния, опосредованного ингибированием mTOR, где другое терапевтическое средство вводят с соединением формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой солью.

В настоящем изобретении также предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения заболевания или состояния, опосредованного mTOR, где пациент ранее (например, в течение 24 часов) подвергался лечению с помощью другого терапевтического средства. В настоящем изобретении также предусмотрено применение другого терапевтического средства для предупреждения или лечения заболевания или состояния, опосредованного mTOR, где пациент ранее (например, в течение 24 часов) подвергался лечению с помощью соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения нарушения или заболевания, опосредованных путем mTOR.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения нарушения или заболевания, выбранных из

- васкулопатий, связанных с трансплантатом;

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения нарушения или заболевания, которые включают процесс фиброза или воспаления.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения возрастного нарушения или заболевания, выбранных из саркопении, атрофии кожи, видов старческой гемангиомы, видов себорейного кератоза, атрофии головного мозга, также называемой деменцией, атеросклероза, артериосклероза, эмфиземы легких, остеопороза, остеоартрита, высокого кровяного давления, эректильной дисфункции, видов катаракты, макулярной дегенерации, глаукомы, инсульта, цереброваскулярного заболевания (инсультов), хронического заболевания почки, ассоциированного с диабетом заболевания почки, нарушения функции печени, фиброза печени, аутоиммунного гепатита, гиперплазии эндометрия, нарушения обмена веществ, реноваскулярного заболевания, потери слуха, нарушения способности к передвижению, снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), ожирения, потери вкуса, потери обоняния, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения рака.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для лечения рака почки, почечно-клеточной карциномы, колоректального рака, саркомы матки, рака эндометрия матки, рака эндометрия, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака желудка, фибросаркомы, рака поджелудочной железы, рака печени, меланомы, лейкоза, множественной миеломы, рака носоглотки, рака предстательной железы, рака легкого, глиобластомы, рака мочевого пузыря, мезотелиомы, рака головы, рабдомиосаркомы, саркомы, лимфомы или рака шеи.

Конкретные отдельные комбинации, которые могут обеспечивать определенные преимущества лечения, включают комбинацию соединения

или его фармацевтически приемлемой соли и ингибитора каталитической активности mTOR, в частности ингибитора, указанного выше. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен продукт, содержащий соединение

или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор каталитической активности mTOR, в частности ингибитор, указанный выше, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая соединение

или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор каталитической активности mTOR, в частности ингибитор, указанный выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления другое терапевтическое средство выбрано из средства, истощающего СD4-лимфоциты, такого как антитело к CD4 или его антигенсвязывающий фрагмент, такое как гуманизированное антитело к CD4, например занолимумаб. Такое терапевтическое средство можно применять, в частности, для лечения пролиферативного нарушения, в частности рака. См. также патент США № 8906374 и патент США № 9427463 в отношении такой комбинированной терапии.

или его фармацевтически приемлемой соли и средства, истощающего СD4-лимфоциты, в частности средства, указанного выше. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

или его фармацевтически приемлемую соль и средство, истощающее СD4-лимфоциты, в частности средство, указанное выше, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

или его фармацевтически приемлемую соль, средство, истощающее СD4-лимфоциты, в частности средство, указанное выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления другое терапевтическое средство выбрано из средства, которое модулирует активность иммуноингибирующих белков, таких как PD-1/PDL-1, например, антитело к PD-1 или антитело PDL-1. Антитела к PD-1, которые пригодны в качестве такого терапевтического средства, раскрыты в патенте США № 9683048. Такое терапевтическое средство можно применять в лечении рака, в частности для иммунотерапии рака.

или его фармацевтически приемлемой соли и средства, которое модулирует активность иммуноингибирующих белков, таких как PD-1, в частности средства, указанного выше. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

или его фармацевтически приемлемую соль и средство, которое модулирует активность иммуноингибирующих белков, таких как PD-1, в частности средства, указанного выше, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая

или его фармацевтически приемлемую соль, средство, которое модулирует активность иммуноингибирующих белков, таких как PD-1, в частности средство, указанное выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 1) или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления соединение представляет собой (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин (пример 2) или его фармацевтически приемлемую соль.

ПРИМЕРЫ

В настоящем изобретении изложены следующие примеры. Примеры синтеза и биологические примеры, описанные в данной заявке, представлены для иллюстрации соединений, фармацевтических композиций и способов, предусмотренных в данном документе, и их не следует рассматривать каким-либо образом как ограничивающие их объем.

Соединения, предусмотренные в данном документе, можно получать из легко доступных исходных материалов с использованием модификаций конкретных протоколов синтеза, изложенных ниже, как будет общеизвестно специалистам в данной области техники. Будет понятно, что если указаны типичные или предпочтительные условия способа (т. е. значения температуры реакции, значения времени, мольные соотношения реагентов, растворители, значения давления и т. д.), также можно использовать другие условия способа, если не указано иное. Оптимальные условия реакции могут изменяться в зависимости от конкретных применяемых реагентов или растворителей, но такие условия могут быть определены специалистами в данной области техники посредством обычных процедур оптимизации.

Кроме того, специалистам в данной области техники будет понятно, что применение традиционных защитных групп может быть необходимо для предотвращения прохождения нежелательных реакций с определенными функциональными группами. Выбор подходящей защитной группы для конкретной функциональной группы, а также подходящие условия для защиты и удаления защитной группы являются общеизвестными из уровня техники. Например, многочисленные защитные группы, и их введение и удаление, описаны в Greene et al., Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991, и литературных источниках, цитируемых в приведенном документе.

Рапамицин и его производные, например, соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B, существуют в виде зависимого от раствора и pH-зависимого равновесия шестичленной и семичленной полукетальных форм, показанных ниже как E и F (схемы 4 и 5). См. The Journal of Antibiotics (Tokyo) (1991) 44(6):688-90 и Tetrahedron Letters (1992) 33(33):4139-4142. Рапамицин и его производные также существуют в виде смеси цис- и транс-амидов, показанных ниже как E, H, J и K (схемы 4 и 5). [См. Mierke, D. F., Schmieder, P., Karuso, P. and Kessler, H. (1991), Conformational Analysis of the cis and trans-Isomers of FK506 by NMR and Molecular Dynamics. Helvetica Chimica Acta, 74: 1027-1047.] Данные определения характеристик с помощью ЯМР, показанные в примерах, соответствуют только главной равновесной форме, наблюдаемой при указанных условиях в дейтерированном растворителе.

Схема 4

где

R₁ выбран из группы, состоящей из гидрокси,

R₂ выбран из группы, состоящей из

, где

m равняется 0, 1, 2 или 3;

n равняется 1, 2 или 3;

o равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

p равняется 1, 2, 3, 4 или 5;

r равняется 2, 3 или 4;

X представляет собой O, S, NR₆ или SO₂;

R₄ представляет собой водород, и R₅ представляет собой водород, гидрокси или циано, или R₄ и R₅ вместе образуют =O; и

В одном варианте осуществления R₁ представляет собой гидрокси.

В одном варианте осуществления R₂ представляет собой

, и n равняется 1, 2 или 3. В одном варианте осуществления R₂ представляет собой .

Схема 5

где

R₁ представляет собой , и

R₂ выбран из группы, состоящей из

, где

m равняется 0, 1, 2 или 3;

n равняется 1, 2 или 3;

o равняется 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

p равняется 1, 2, 3, 4 или 5;

r равняется 2, 3 или 4;

X представляет собой O, S, NR₆ или SO₂;

В одном варианте осуществления соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B существуют в виде зависимого от растворителя и pH-зависимого равновесия шестичленной и семичленной полукетальных форм, показанных ниже как E-1 и F-1 (схема 6). В одном варианте осуществления соединения формулы (I), формулы (I)-A и формулы (I)-B существуют в виде смеси цис- и транс-амидов E-1 и H-1.

Схема 6

Получение соединений

Соединения по настоящему изобретению можно получать, как описано в следующих примерах.

Сокращения

4-EP 4-этилпиридин

AcOH уксусная кислота

ACN ацетонитрил

водн. водный

C градусы Цельсия

d дублет

dd дублет дублетов

DCM дихлорметан

DIPEA N, N-диизопропилэтиламин

DMSO диметилсульфоксид

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

ESIMS масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением

EtOAc этилацетат

EtOH этанол

FA муравьиная кислота

г грамм

ч. час(часы)

HPLC высокоэффективная жидкостная хроматография

HRMS масс-спектрометрия высокого разрешения

iPrOH 2-пропанол или изопропанол

л литр

LC жидкостная хроматография

LCMS жидкостная хроматография и масс-спектрометрия

MeOH метанол

MS масс-спектрометрия

М моль/л

m мультиплет

мин. минуты

мл миллилитр(миллилитры)

мкМ мкмоль/л

масса/заряд соотношение массы и заряда

N₂ газообразный азот

нМ нмоль/л

ЯМР ядерный магнитный резонанс

¹H ЯМР: спектрометрия на основе протонного ядерного магнитного резонанса

PEI полиэтиленимин

PPU пропилпиридилмочевина

pTsOH п-толуолсульфоновая кислота

преп. препаративный

rac рацемический

об./мин. обороты в минуту

к. т. комнатная температура

s синглет

насыщ. насыщенный

SFC сверхкритическая флюидная хроматография

t триплет

TCEP трис(2-карбоксиэтил)фосфин

TFA трифторуксусная кислота

THF тетрагидрофуран

TLC тонкослойная хроматография

об. объем

Способы, применяемые для очистки соединений из примеров

Очистку промежуточных соединений и конечных продуктов осуществляли с помощью или хроматографии с нормальной фазой или обращенной фазой.

Хроматографию с нормальной фазой проводили с применением предварительно заполненных картриджей SiO₂ (например, колонки RediSep® Rf от Teledyne Isco, Inc.) с градиентами элюирования подходящих систем растворителей (например, гексаны и этилацетат; DCM и MeOH; или если не указано иное).

SFC проводили с применением способов, описанных ниже.

Способ 1: колонка Princeton PPU 5 мкм (100A) (30 × 250 мм); CO₂/MeOH

Способ 2: колонка Princeton 4-EP 5 мкм (60A) (30 × 250 мм); CO₂/MeOH

Способ 3: колонка Reprospher PEI 5 мкм (100A) (30 × 250 мм); CO₂/MeOH

Градиенты выбирали на основе аналитического разделения.

Препаративную HPLC с обращенной фазой проводили с применением способов, описанных ниже.

Способ 1: колонка (Agilent) Phenomenex Luna C18; 5 мкм (30 × 250 мм); 0,1% муравьиной кислоты и 5% воды в ацетонитриле; 0,1% муравьиной кислоты и 5% ацетонитрила в воде. Градиенты выбирали на основе аналитического разделения.

Способ 2: колонка (EZprep) YMC Actus Triart C18; 5 мкм (20 × 150 мм); ацетонитрил/вода. Градиенты выбирали на основе аналитического разделения.

Хиральную препаративную HPLC проводили с применением способов, описанных ниже.

Способ 1: колонка Chiralpak IC; 5 мкм (20 ×250 мм); н-гептан/DCM/EtOH

Способ 2: колонка Chiralpak ID; 5 мкм (20 × 250 мм); н-гептан/DCM/iPrOH

Способ LC/MS

Колонка: Acquity UPLC BEH C18, 130 ангстрем, 1,7 мкм, 2,1 мм × 50 мм

температура: 50°C

Введение: 1 мкл

Растворитель A: вода+5 мМ гидроксида аммония

Растворитель B: ацетонитрил+5 мМ гидроксида аммония

Градиент:

Время (мин.)	Расход	A%	B%	Кривая
Исходное значение	1,000	98,0	2,0	Исходное значение
4,40	1,0	2,0	98,0	6
5,15	1,0	2,0	98,0	6
5,19	1,0	98,0	2,0	6

Оборудование для ¹ H ЯМР:

Bruker UltraShield™ Advance III HD, работающий при 400 МГц, с зондом для крио-DCI. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения MestReNova 11.0.

Получение промежуточных соединений 1-7

Промежуточное соединение 1: C32-дезоксорапамицин

Промежуточное соединение 1 получали в соответствии с процедурами, известными в литературе, в том числе раскрытыми в публикации патента США № 005985890 и WO 2007/085400 A1, каждый из которых включен посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте.

Промежуточное соединение 2: RAD001 (эверолимус; Afinitor®)

Промежуточное соединение 2

Промежуточное соединение 2 получали в соответствии с процедурами, известными в литературе, в том числе раскрытыми в WO 2012103959, который включен в данный документ посредством ссылки в данном документе во всей своей полноте.

Промежуточное соединение 3:

Промежуточное соединение 3 получали посредством двух стадий из промежуточного соединения A, как показано ниже.

Стадия 1. Синтез промежуточного соединения A

Растворяли 2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этанол (0,471 г, 2,67 ммоль) в безводном толуоле (0,95 мл) в реакционном сосуде. Сосуд закрывали и затем вакуумировали с помощью азота. Добавляли N, N-диизопропилэтиламин (DIPEA) (0,490 мл, 2,81 ммоль) с помощью шприца. Смесь охлаждали до 0°C на ледяной бане. Добавляли по каплям трифлатный ангидрид (Tf₂O) (0,438 мл, 2,59 ммоль) при0°C в течение периода, составляющего приблизительно две минуты. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут.

Сосуд снимали с охлаждающей бани. Добавляли DIPEA (0,490 мл, 2,81 ммоль) с помощью шприца. Сосуд открывали и быстро добавляли одной порцией промежуточное соединение 1 (0,600 г, 0,667 ммоль). Сосуд снова быстро закрывали и смесь вакуумировали с помощью азота. Добавляли толуол (0,5 мл).

Реакционную смесь перемешивали при 40°C в атмосфере азота в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли насыщенным водным раствором NaHCO₃. Гашенную смесь пять раз экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄, фильтровали в вакууме через целит и концентрировали с получением воскообразного белого твердого неочищенного продукта.

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 35% ацетона в гептане, колонка с 40 г диоксида кремния, TLC в 35% ацетона в гептане, визуализировали под УФ) с получением необходимого промежуточного соединения A (0,245 г, 0,231 ммоль, выход 34,7%) в виде стекловидного вещества, которое непосредственно применяли "как есть" на следующей стадии.

Промежуточное соединение A: ESIMS [M+NH4] 1076,1, ESIMS [M-H] 1056,0.

Стадия 2. Синтез промежуточного соединения 3

Растворяли промежуточное соединение A (0,135 г, 0,128 ммоль) в безводном THF (1,2 мл) в стеклянном реакционном сосуде. Сосуд закрывали и смесь дважды вакуумировали с помощью азота. Смесь охлаждали до 0°C на ледяной бане. Добавляли по каплям HF-пиридин (0,12 мл, 1,332 ммоль) с помощью шприца в течение периода, составляющего 30 секунд. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 60 минут.

Реакционную смесь добавляли по каплям в насыщенный водный раствор NaHCO₃. Гашенную смесь пять раз экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄, фильтровали в вакууме через целит и концентрировали с получением белого твердого неочищенного продукта.

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 50% ацетона в гептане, колонка с 40 г диоксида кремния, TLC в 50% ацетона в гептане, визуализировали под УФ) с получением промежуточного соединения 3 (0,087 г, 0,092 ммоль, выход 72,2%) в виде белого твердого вещества.

Промежуточное соединение 3: ESIMS [M+NH4] 962,0, ESIMS [M-H] 943,0.

¹H ЯМР (400 МГц, Хлороформ-d) δ 6,46-6,25 (m, 2H), 6,19-6,09 (m, 1H), 5,91 (m, 1H), 5,55 (m, 1H), 5,34-5,26 (m, 1H), 5,26-5,15 (m, 1H), 4,88-4,64 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 3,94-3,82 (m, 1H), 3,79 (m, 1H), 3,73-3,63 (m, 3H), 3,63-3,47 (m, 4H), 3,45 (m, 4H), 3,33 (m, 3H), 3,28-3,15 (m, 2H), 3,13 (s, 3H), 3,08 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,32 (m, 3H), 2,14 (m, 2H), 2,07-1,94 (m, 2H), 1,94-1,72 (m, 5H), 1,72-1,56 (m, 8H), 1,56-1,40 (m, 3H), 1,39-1,21 (m, 7H), 1,21-1,09 (m, 1H), 1,08-0,99 (m, 8H), 0,98-0,83 (m, 9H), 0,73 (q, J=12,0 Гц, 1H).

Промежуточное соединение 4:

Объединяли промежуточное соединение 1 (0,233 г, 0,259 ммоль) с 2,6-ди-трет-бутил-4-метилпиридином (0,425 г, 2,071 ммоль) в безводном дихлорметане (2,6 мл). Реакционную смесь один раз вакуумировали с помощью азота. Реакционную смесь охлаждали до 0°C на ледяной бане. Добавляли одной порцией твердый диметилфосфиновый хлорид (0,146 г, 1,294 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 80 минут.

Реакционную смесь разбавляли насыщенным водным раствором NaHCO3 и несколько раз экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄, декантировали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде бесцветной смолы (0,768 г).

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 80% ацетона в гептане, колонка с 24 г диоксида кремния, TLC в 80% EtOAc в гептане, визуализировали под УФ). Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали с получением промежуточного соединения 4 (0,087 г, 0,089 ммоль, выход 34,4%) в виде белого твердого вещества.

Промежуточное соединение 4: ESIMS [M+NH4] 993,7, ESIMS [M-H] 974,7.

HRMS: Рассчитано: 999,5812 (как аддукт с натрием). Обнаружено: 999,5807.

¹H ЯМР (600 МГц, Хлороформ-d) δ 6,47-6,26 (m, 2H), 6,22-6,08 (m, 1H), 6,02-5,83 (m, 1H), 5,54 (m, 1H), 5,35-5,26 (m, 1H), 5,21 (m, 1H), 4,85-4,76 (m, 1H), 4,12 (m, 2H), 3,93-3,81 (m, 1H), 3,67 (t, J=7,7 Гц, 1H), 3,62 (d, J=6,7 Гц, 1H), 3,60-3,53 (m, 1H), 3,53-3,44 (m, 1H), 3,42-3,36 (m, 3H), 3,32 (m, 3H), 3,28-3,18 (m, 1H), 3,13 (m, 3H), 3,05 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 2,42-2,21 (m, 3H), 2,16-2,08 (m, 3H), 1,99 (m, 1H), 1,95-1,83 (m, 1H), 1,83-1,72 (m, 4H), 1,71-1,57 (m, 9H), 1,57-1,43 (m, 12H), 1,39 (m, 1H), 1,34-1,20 (m, 4H), 1,20-1,10 (m, 1H), 1,05 (m, 4H), 1,00 (d, J=6,5 Гц, 3H), 0,95 (dd, J=6,6, 2,1 Гц, 3H), 0,92 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0,91-0,84 (m, 4H), 0,77 (q, J=12,1 Гц, 1H).

Промежуточное соединение 5:

Растворяли промежуточное соединение 1 (4,372 г, 4,86 ммоль) в безводном дихлорметане (20 мл). Добавляли безводный толуол (20 мл). Реакционную смесь выпаривали до сухого состояния на роторном испарителе. Данный процесс азеотропного высушивания повторяли еще два раза.

Высушенный исходный материал объединяли с 2,6-лутидином (1,388 мл, 11,91 ммоль) в безводном дихлорметане (58 мл). Колбу закрывали и смесь два раза вакуумировали с помощью азота. Смесь охлаждали до -30°C на бане с ацетонитрилом/сухим льдом.

Добавляли по каплям трифлатный ангидрид (1,209 мл, 7,16 ммоль) с помощью шприца в течение периода, составляющего четыре минуты. Реакционную смесь перемешивали при -30°C в течение 30 минут. Реакционную смесь переносили в ледяную баню с температурой 0°C и перемешивали в течение 20 минут при 0°C.

Реакционную смесь помещали на роторный испаритель и концентрировали без нагревания. Добавляли изопропилацетат (22 мл). Добавляли одной порцией тетразол (1,170 г, 16,71 ммоль). Колбу быстро закрывали и два раза вакуумировали с помощью азота. Добавляли N, N-диизопропилэтиламин (4,18 мл, 23,94 ммоль) с помощью шприца в течение периода, составляющего одну минуту. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре.

Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе. Концентрат очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с нормальной фазой на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 40% ацетона в гептане, колонка с 80 г диоксида кремния, TLC 40% ацетона в гептане, визуализировали под УФ).

Фракции, соответствующие второму пику элюирования (определенного с помощью поглощения УФ-излучения при 279 нм), объединяли и концентрировали с получением промежуточного соединения 5 (2,194 г, 2,304 ммоль, выход 47,4%) в виде белого твердого вещества.

Промежуточное соединение 5: ESIMS [M+NH4] 969,8, ESIMS [M-H] 950,8.

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ 9,33 (d, J=6,4 Гц, 1H), 6,58-6,41 (m, 2H), 6,35-6,14 (m, 2H), 6,09-5,98 (m, 1H), 5,55-5,43 (m, 1H), 5,19 (m, 1H), 5,05 (m, 1H), 5,00-4,93 (m, 1H), 4,87-4,79 (m, 1H), 4,67-4,56 (m, 1H), 3,98-3,87 (m, 1H), 3,87 (d, J=6,9 Гц, 1H), 3,61 (m, 2H), 3,55 (dd, J=11,8, 1,9 Гц, 1H), 3,49-3,38 (m, 1H), 3,31-3,17 (m, 4H), 3,10 (m, 4H), 3,04 (s, 3H), 2,88-2,75 (m, 1H), 2,29-2,09 (m, 3H), 2,07-1,86 (m, 3H), 1,88-1,60 (m, 9H), 1,59-1,44 (m, 7H), 1,43-1,01 (m, 11H), 0,96 (t, J=7,1 Гц, 5H), 0,95-0,77 (m, 7H), 0,72 (m, 4H).

Промежуточное соединение 6:

Объединяли 2-этоксиэтанол (0,538 мл, 5,55 ммоль) в безводном толуоле (2,0 мл) и безводном диоксане (0,22 мл). Добавляли N, N-диизопропилэтиламин (1,067 мл, 6,11 ммоль) с помощью шприца. Реакционную смесь два раза вакуумировали с помощью азота. Смесь охлаждали до 0°C на ледяной бане.

Добавляли по каплям трифлатный ангидрид (0,901 мл, 5,33 ммоль) с помощью шприца в течение периода, составляющего две минуты. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут. Охлаждающую баню удаляли и обеспечивали достижение равновесия реакционной смесью при комнатной температуре в течение 15 минут.

Добавляли по каплям N, N-диизопропилэтиламин (1,067 мл, 6,11 ммоль) с помощью шприца в течение периода, составляющего 30 секунд. Добавляли одной порцией промежуточное соединение 1 (1,00 г, 1,111 ммоль). Реакционную смесь быстро закрывали и вакуумировали с помощью азота. Добавляли безводный толуол (2,0 мл) и безводный диоксан (0,22 мл) с помощью шприца. Смесь перемешивали при 55°C в течение 24 часов.

Реакционную смесь разбавляли солевым раствором и несколько раз экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄, декантировали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде бесцветной смолы (4,25 г).

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 50% ацетона в гептане, колонка с 80 г диоксида кремния, TLC в 40% ацетона в гептане, визуализировали под УФ). Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали с получением промежуточного соединения 6 (0,443 г, 0,456 ммоль, выход 41,0%) в виде бесцветного стекловидного вещества.

Промежуточное соединение 6: ESIMS [M-H] 970,9.

HRMS: рассчитано - 989,6678 (как аддукт с аммонием); обнаружено - 989,6655

Рассчитано - 994,6232 (как аддукт с натрием); обнаружено - 994,6215.

Промежуточное соединение 7:

Промежуточное соединение 7 получали посредством двух стадий из промежуточного соединения B, как показано ниже.

Стадия 1. Синтез промежуточного соединения B

Объединяли 2,2,5-триметил-1,3-диоксан-5-карбоновую кислоту (0,400 г, 2,296 ммоль) и триэтиламин (0,320 мл, 2,296 ммоль) и растворяли в безводном THF (7,6 мл). Реакционную смесь охлаждали до 0°C. Добавляли 2,4,6-трихлорбензоилхлорид (0,359 мл, 2,296 ммоль) с помощью шприца. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение десяти минут. Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часа. Осаждалось белое твердое вещество.

Реакционную смесь фильтровали через шприцевой фильтр. Фильтр прополаскивали с помощью THF (2 мл). Фильтраты объединяли и концентрировали на роторном испарителе с получением бесцветной смолы.

В концентрат добавляли толуол (7,6 мл). Добавляли одной порцией промежуточное соединение 1 (1,447 г, 1,607 ммоль) с последующим добавлением 4-диметиламинопиридина (0,281 г, 2,296 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи.

Смесь разбавляли водой и четыре раза экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄, декантировали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде желтой смолы (2,15 г).

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 40% ацетона в гептане, колонка с 40 г диоксида кремния, TLC в 40% ацетона в гептане, визуализировали под УФ). Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали с получением промежуточного соединения B (0,438 г, 0,415 ммоль, выход 18,1%) в виде белой пены.

Промежуточное соединение B: ESIMS [M+NH4] 1074,0, ESIMS [M-H] 1055,1.

Стадия 2. Синтез промежуточного соединения 7

Растворяли промежуточное соединение B (0,431 г, 0,408 ммоль) в THF (4 мл). Добавляли HCl (1 М, экв.) (2,0 мл, 2,00 ммоль) с помощью шприца. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 36 часов.

Реакционную смесь разбавляли водой и четыре раза экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄, декантировали и концентрировали с получением бледно-желтой смолы. Смолу растворяли в дихлорметане и разбавляли гептаном. Смесь концентрировали и высушивали в глубоком вакууме с получением промежуточного соединения 7 (0,407 г, 0,400 ммоль, выход 98%) в виде белого твердого вещества.

Промежуточное соединение 7: ESIMS [M+NH4] 1034,0, ESIMS [M-H] 1015,0.

HRMS: рассчитано - 1033,6576 (как аддукт с аммонием); обнаружено - 1033,6588

Рассчитано - 1038,6130 (как аддукта с натрием); обнаружено - 1038,6138.

Пример 1: ( S )-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин

Пример 2: ( R )-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин

В перемешиваемый раствор промежуточного соединения 1 (2,0 г, 2,222 ммоль) и изотиазолидин-1,1-диоксида (4,04 г, 33,3 ммоль, 15 эквивалентов) в безводном дихлорметане (5,6 мл) добавляли одной порцией п-толуолсульфоновую кислоту⋅H₂O (0,042 г, 0,222 ммоль, 0,1 эквивалента). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в атмосфере азота в течение 34 минут. Всю реакционную смесь непосредственно хроматографировали на диоксиде кремния (градиент элюирования от 100% гептана до 40% ацетона в гептане) с получением продукта, представляющего собой смесь обоих диастереомеров в соотношении приблизительно 3:1, определенном с помощью поглощения УФ-излучения при 279 нм в анализе LC/MS.

Диастереомерную смесь разделяли с помощью хроматографии с нормальной фазой на диоксиде кремния (градиент элюирования от 100% дихлорметана до 40% ацетонитрила в дихлорметане).

В качестве первого элюированного диастереомера (Rf ~0,23 на диоксиде кремния в TLC, которую проводили с 30% ацетонитрила в дихлорметане) получали (S)-диастереомер примера 1 в виде белого твердого вещества.

Пример 1: ESIMS [M+NH4] 1006,7, ESIMS [M-H] 987,8.

¹H ЯМР (600 МГц, Хлороформ-d) δ 6,43 (dd, J=14,9, 10,4 Гц, 1H), 6,35 (dd, J=14,9, 10,7 Гц, 1H), 6,16 (dd, J=15,1, 10,2 Гц, 1H), 6,06-6,01 (m, 1H), 5,67 (dd, J=15,2, 8,6 Гц, 1H), 5,35 (dd, J=6,4, 1,8 Гц, 1H), 5,26 (d, J=9,6 Гц, 1H), 4,83 (td, J=6,6, 4,7 Гц, 1H), 4,12 (d, J=7,4 Гц, 1H), 3,88 (dd, J=11,1, 5,1 Гц, 1H), 3,84-3,77 (m, 1H), 3,63-3,60 (m, 2H), 3,51 (d, J=7,5 Гц, 1H), 3,46 (s, 3H), 3,45-3,42 (m, 3H), 3,35 (s, 3H), 3,29-3,14 (m, 3H), 3,06-2,96 (m, 2H), 2,93 (ddd, J=10,4, 6,4, 1,5 Гц, 1H), 2,44 (tt, J=8,6, 6,2 Гц, 1H), 2,37-2,23 (m, 4H), 2,22-2,14 (m, 2H), 2,03 (dt, J=12,3, 3,8 Гц, 1H), 1,96 (pd, J=6,4, 5,7, 3,5 Гц, 2H), 1,92-1,82 (m, 3H), 1,80-1,76 (m, 2H), 1,75 (d, J=1,2 Гц, 4H), 1,72 (d, J=3,1 Гц, 1H), 1,68 (d, J=1,3 Гц, 3H), 1,65-1,53 (m, 4H), 1,48-1,17 (m, 9H), 1,07 (d, J=6,5 Гц, 1H), 1,06 (s, 3H), 1,04 (d, J=7,3 Гц, 3H), 1,01 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0,99 (dd, J=6,7, 2,3 Гц, 3H), 0,95 (d, J=6,8 Гц, 3H), 0,74 (q, J=11,9 Гц, 1H).

В качестве второго элюированного диастереомера (Rf ~0,16 на диоксиде кремния в TLC, которую проводили с 30% ацетонитрила в дихлорметане) получали (R)-диастереомер примера 2 в виде белого твердого вещества.

Пример 2: ESIMS [M+NH4] 1006,9, ESIMS [M-H] 988,1.

¹H ЯМР (Хлороформ-d) δ 6,48 (dd, J=14,7, 10,9 Гц, 1H), 6,24 (dd, J=14,6, 10,6 Гц, 1H), 6,16 (dd, J=14,9, 10,6 Гц, 1H), 6,01 (d, J=11,0 Гц, 1H), 5,38 (dd, J=14,9, 9,8 Гц, 1H), 5,23 (dd, J=6,2, 2,0 Гц, 1H), 5,12 (d, J=9,9 Гц, 1H), 4,73 (dd, J=12,1, 2,9 Гц, 1H), 4,65 (dt, J=8,3, 3,9 Гц, 1H), 4,14 (d, J=6,7 Гц, 1H), 3,97 (m, 1H), 3,74 (d, J=6,7 Гц, 1H), 3,62 (qd, J=13,9, 12,7, 5,5 Гц, 2H), 3,42 (s, 3H), 3,39 (m, 1H), 3,31 (s, 3H), 3,24 (ddd, J=12,2, 7,5, 4,6 Гц, 1H), 3,10 (td, J=8,2, 3,8 Гц, 1H), 3,08 (s, 1H), 3,02-2,97 (m, 1H), 2,97-2,92 (m, 1H), 2,83-2,71 (m, 1H), 2,42 (ddt, J=13,1, 9,5, 6,4 Гц, 1H), 2,34 (d, J=4,3 Гц, 1H), 2,31 (s, 1H), 2,28-2,23 (m, 1H), 2,22-2,19 (m, 1H), 2,19 (s, 2H), 2,12-2,08 (m, 2H), 2,03-1,99 (m, 1H), 1,90 (s, 3H), 1,88 (s, 1H), 1,79 (s, 1H), 1,77 (s, 1H), 1,76 (s, 1H), 1,72-1,68 (m, 1H), 1,48 (s, 1H), 1,46 (s, 1H), 1,40 (d, J=3,0 Гц, 1H), 1,38 (s, 1H), 1,66 (d, J=3,0 Гц, 2H), 1,64 (d, J=2,9 Гц, 1H), 1,62 (s, 2H), 1,62 (s, 2H), 1,58-1,53 (m, 1H), 1,37 (s, 1H), 1,36 (d, J=2,3 Гц, 1H), 1,33 (d, J=2,9 Гц, 1H), 1,30 (dd, J=6,7, 1,8 Гц, 1H), 1,28 (s, 2H), 1,28 (s, 2H), 1,24 (s, 1H), 1,09 (s, 1H), 1,07 (d, J=6,6 Гц, 3H), 1,05 (d, J=6,6 Гц, 3H), 1,01 (d, J=3,2 Гц, 1H), 0,95 (d, J=6,8 Гц, 3H), 0,92 (s, 1H), 0,92-0,90 (m, 3H), 0,88 (d, J=6,8 Гц, 2H), 0,66 (q, J=12,0 Гц, 1H)

Абсолютные конфигурации заместителей C16 в примере 1 и примере 2 определяли с помощью рентгеноструктурной кристаллографии при совместной кристаллизации с FKBP12. [См. Stuart L. Schrieber and Jon Clardy, et al., Atomic Structure of the Rapamycin Humano Immunophilin FKBP-12 Complex, J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7433-7434.] Кристаллические структуры изображены на фигурах 1A и 1B и фигурах 2A и 2B.

Чистый белок FKBP12(1-108) концентрировали до 9 мг/мл в 50 мМ Tris с pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ TCEP. Комплекс для совместной кристаллизации получали путем смешивания белка с 3 мМ соединения (из 50 мМ исходного раствора, полученного в 90% dDMSO, 10% D2O). Комплекс инкубировали в течение двух часов при 4°C, затем центрифугировали при 10000 об./мин. в течение 2 минут для удаления какого-либо возможного осадка перед кристаллизацией. Сокристаллы получали при 20°C и путем диффузии паров в сидячей капле с применением скрининга методом микропереноса кристаллов [Allan D'Arcy et al., An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization, Acta Cryst., (2007) D63, 550-554.] Капли состояли из 200 нл раствора белка, 160 нл резервуарного раствора и 40 нл исходной затравки. Кристаллы появлялись за несколько дней в условии A1 коммерчески доступного набора для скрининга "сульфат аммония" Qiagen. Резервуарный раствор состоял из 2,2 М сульфата аммония. Кристаллы защищали от действия низкой температуры в резервуарном растворе, дополненном 20% этиленгликоля, и подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте. Данные собирали в комплексе Swiss Light Source (SLS, Филлиген, Швейцария) на экспериментальной станции источника синхротронного излучения X10SA.

Данные обрабатывали с помощью XDS (Kabsch, W. (2010), XDS. Acta Cryst. D, 66: 125-132). Структуры определяли путем молекулярного замещения (Collaborative Computational Project, Number 4 (1994). Acta Cryst. D50, 760-763) с использованием предыдущих рентгеновских структур FKBP12 в качестве модели поиска. Использовали программы REFMAC (Murshudov GN, Lebedev AA, et al., REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2011; 67 (Pt 4): 355-367) и COOT (Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, Cowtan K. Features and development of Coot, Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2010; 66 (Pt 4): 486-501) для уточнения структуры и (пере)построения модели.

В следующих примерах абсолютная стереохимическая конфигурация заместителя C16 не была определена с помощью рентгенографии при совместной кристаллизации и не является известной. В некоторых примерах выделяли только главный диастереомер продукта реакции и описывали его характеристики. В других примерах выделяли каждый диастереомер и описывали его характеристики без присваивания абсолютной стереохимии.

Пример 3: C16-(4-оксоазетидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин

Пример 3

* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана

В раствор промежуточного соединения 1 (130 мг, 0,144 ммоль, 1,0 экв.) и азетидин-2-она (205 мг, 2,89 ммоль, 20 экв.) в ацетонитриле (3 мл) добавляли моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (82 мг, 0,433 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. и затем разбавляли с помощью H₂O и экстрагировали этилацетатом. Органический экстракт выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной HPLC-хроматографии (способ 1) с последующей очисткой с помощью SFC (способ 1) с получением примера 3 (2,5 мг, выход 1,7%) в виде белого твердого вещества.

Пример 3: ESIMS [M-H] 938,0.

Точная масса: 938,59

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ 6,45 (dd, J=14,0, 11,0 Гц, 1H), 6,28-6,11 (m, 2H), 5,98 (d, J=10,9 Гц, 1H), 5,95-5,85 (m, 1H), 5,50 (dd, J=14,2, 9,5 Гц, 1H), 5,06 (d, J=4,7 Гц, 1H), 5,02-4,97 (m, 1H), 4,94 (d, J=9,8 Гц, 1H), 4,63-4,53 (m, 2H), 4,34-4,22 (m, 1H), 3,99-3,92 (m, 1H), 3,84-3,74 (m, 1H), 3,61-3,53 (m, 1H), 3,49 (d, J=7,3 Гц, 1H), 3,46-3,39 (m, 1H), 3,37-3,25 (m, 3H), 3,22-3,12 (m, 4H), 3,10-3,04 (m, 1H), 3,04-2,95 (m, 1H), 2,92-2,65 (m, 4H), 2,27-2,11 (m, 2H), 2,10-1,99 (m, 2H), 1,96-1,87 (m, 1H), 1,84-1,70 (m, 5H), 1,69-1,37 (m, 15H), 1,37-1,05 (m, 8H), 1,03-0,93 (m, 4H), 0,90 (d, J=6,4 Гц, 3H), 0,88-0,83 (m, 5H), 0,79 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,75 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,59 (q, J=11,8 Гц, 1H).

Пример 4: C16-(3-метилимидазолидин-2-он-1-ил)-C32-дезоксорапамицин

Пример 4

В раствор промежуточного соединения 1 (100 мг, 0,111 ммоль, 1,0 экв.) и 1-метилимидазолидин-2-она (167 мг, 1,66 ммоль, 15 экв.) в DCM (2 мл) добавляли моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (63 мг, 0,333 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Смесь разбавляли с помощью H₂O и экстрагировали с помощью DCM. Органический экстракт выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной HPLC-хроматографии (способ 1) с получением примера 4 (9,0 мг, выход 8%) в виде белого твердого вещества.

Пример 4: ESIMS [M-H] 966,5.

Точная масса: 967,61

¹H ЯМР (600 МГц, DMSO-d ₆) δ 0,59 (q, J=11,9 Гц, 1H), 0,74 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,79 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,80-0,90 (m, 8H), 0,92-1,00 (m, 4H), 1,04-1,10 (m, 1H), 1,12-1,34 (m, 7H), 1,34-1,67 (m, 14H), 1,69 (s, 3H), 1,71-1,78 (m, 2H), 1,88-1,94 (m, 1H), 1,96-2,08 (m, 3H), 2,10-2,25 (m, 2H), 2,60-2,69 (m, 4H), 2,80-2,94 (m, 2H), 3,07-3,20 (m, 5H), 3,21-3,26 (m, 2H), 3,33 (s, 3H), 3,41-3,48 (m, 1H), 3,56-3,66 (m, 3H), 3,99 (dd, J=6,5, 3,5 Гц, 1H), 4,53-4,63 (m, 3H), 4,95-5,00 (m, 2H), 5,07 (d, J=4,8 Гц, 1H), 5,35 (s, 1H), 5,45 (dd, J=14,9, 9,8 Гц, 1H), 5,98 (d, J=11,0 Гц, 1H), 6,15 (dd, J=14,8, 10,7 Гц, 1H), 6,23 (dd, J=14,6, 10,7 Гц, 1H), 6,44 (dd, J=14,6, 11,0 Гц, 1H).

Пример 5: C16-(2-гидроксиэтил)-2-оксоимидазолидин-1-ил)-C32-дезоксорапамицин

Пример 5

В раствор промежуточного соединения 1 (100 мг, 0,111 ммоль, 1,0 экв.) и 1-(2-гидроксиэтил)имидазолидин-2-она (289 мг, 1,66 ммоль, 15 экв.) в DCM (2 мл) добавляли моногидрат 4-метилбензолсульфоновой кислоты (119 мг, 0,626 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли с помощью H₂O и экстрагировали с помощью DCM. Органический экстракт выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной HPLC-хроматографии (способ 1) с последующей хиральной препаративной HPLC (способ 2) с получением примера 5 (13,7 мг, выход 12%) в виде белого твердого вещества.

Пример 5: ESIMS [M+H] 998,5.

Точная масса: 997,62

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ 6,45 (dd, J=14,3, 11,0 Гц, 1H), 6,23 (dd, J=14,3, 10,6 Гц, 1H), 6,14 (dd, J=14,6, 10,6 Гц, 1H), 5,98 (d, J=10,9 Гц, 1H), 5,44 (dd, J=14,5, 9,8 Гц, 1H), 5,28 (s, 1H), 5,07 (d, J=4,7 Гц, 1H), 5,02-4,96 (m, 2H), 4,67 (t, J=5,3 Гц, 1H), 4,64-4,53 (m, 3H), 4,03-3,96 (m, 1H), 3,71-3,57 (m, 3H), 3,52-3,42 (m, 2H), 3,42-3,29 (m, 6H), 3,22-3,07 (m, 7H), 2,95-2,79 (m, 2H), 2,71-2,56 (m, 1H), 2,27-1,87 (m, 6H), 1,80-1,36 (m, 20H), 1,36-1,12 (m, 6H), 1,11-1,02 (m, 1H), 1,00-0,91 (m, 4H), 0,91-0,76 (m, 11H), 0,74 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,59 (q, J=11,9 Гц, 1H).

Пример 6: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин

(диастереомер 1)

Пример 7: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин

(диастереомер 2)

Пример 6 и пример 7

Диастереомер 1. В раствор промежуточного соединения 1 (150 мг, 0,167 ммоль, 1,0 экв.) и 1,2-тиазетидин-1,1-диоксида (89 мг, 0,833 ммоль, 5 экв.) в DCM (3 мл) добавляли хлорид цинка(II) (1 М раствор в диэтиловом эфире, 0,5 мл, 0,500 ммоль, 3 экв.) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь разбавляли с помощью H₂O и экстрагировали этилацетатом. Органический экстракт выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт, представляющий собой диастереомерную смесь, разделяли с помощью флэш-хроматографии (диоксид кремния; MeCN/DCM от 0:100 до 100:0).

В результате конечной очистки первого элюированного диастереомера с помощью препаративной HPLC (способ 2) получали пример 6 (18 мг, выход 10,7%) в виде белого твердого вещества.

Пример 6: ESIMS [M+NH₄] 992,6, [M+FA-H] 1019,6.

Точная масса: 974,55

¹H ЯМР (400 МГц, Хлороформ-d) δ 6,39 (dd, J=14,8, 9,8 Гц, 1H), 6,34 (dd, J=14,8, 10,3 Гц, 1H), 6,18-6,10 (m, 1H), 6,02 (d, J=10,3, 1,5 Гц, 1H), 5,66 (dd, J=15,1, 8,6 Гц, 1H), 5,38 (s, 1H), 5,32 (dd, J=6,4, 1,8 Гц, 1H), 5,23 (d, J=9,6 Гц, 1H), 4,87-4,76 (m, 1H), 4,12-4,06 (m, 1H), 3,99 (ddd, J=12,0, 8,2, 6,2 Гц, 1H), 3,92-3,86 (m, 1H), 3,84 (dd, J=10,7, 4,4 Гц, 1H), 3,81-3,74 (m, 1H), 3,63-3,59 (m, 2H), 3,59 (d, J=3,6 Гц, 1H), 3,46 (d, J=7,6 Гц, 1H), 3,43 (s, 3H), 3,40-3,37 (m, 1H), 3,32 (s, 3H), 3,04 (ddd, J=8,2, 5,8, 3,8 Гц, 1H), 3,00-2,94 (m, 1H), 2,94-2,89 (m, 1H), 2,88-2,84 (m, 1H), 2,64 (d, J=6,7 Гц, 1H), 2,47-2,38 (m, 1H), 2,36-2,27 (m, 2H), 2,21-2,12 (m, 1H), 2,03-1,97 (m, 1H), 1,95-1,77 (m, 7H), 1,76-1,67 (m, 5H), 1,65 (s, 3H), 1,60-1,50 (m, 6H), 1,47-1,39 (m, 2H), 1,38-1,27 (m, 4H), 1,25-1,10 (m, 3H), 1,08-1,04 (m, 1H), 1,03-1,01 (m, 3H), 1,00 (d, J=1,4 Гц, 3H), 0,99-0,97 (m, 3H), 0,97 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0,93 (d, J=6,8 Гц, 3H), 0,75-0,66 (m, 1H).

В результате конечной очистки второго элюированного диастереомера с применением SFC-хроматографии (способ 2) получали пример 7 (15,8 мг, выход 9,2%) в виде белого твердого вещества.

Пример 7: ESIMS [M+NH₄] 992,7, [M+FA-H] 1019,6.

Точная масса: 974,55

¹H ЯМР (400 МГц, Хлороформ-d) δ 6,46 (dd, J=14,2, 10,9 Гц, 1H), 6,22 (dd, J=14,2, 10,6 Гц, 1H), 6,14 (dd, J=14,5, 10,6 Гц, 1H), 6,00 (d, J=10,9 Гц, 1H), 5,38 (dd, J=14,5, 9,6 Гц, 1H), 5,27-5,19 (m, 1H), 5,12-5,05 (m, 1H), 4,66-4,59 (m, 1H), 4,59-4,53 (m, 1H), 4,25 (d, J=1,8 Гц, 1H), 4,17-4,06 (m, 3H), 4,02 (ddd, J=11,8, 8,0, 3,5 Гц, 1H), 3,66 (d, J=7,0 Гц, 1H), 3,60-3,52 (m, 2H), 3,43-3,34 (m, 4H), 3,28 (s, 3H), 3,17-3,07 (m, 1H), 3,03-2,95 (m, 1H), 2,95-2,89 (m, 1H), 2,84-2,73 (m, 1H), 2,65-2,62 (m, 1H), 2,35-2,26 (m, 1H), 2,27-2,21 (m, 1H), 2,21-2,12 (m, 3H), 2,12-2,05 (m, 1H), 2,02-1,98 (m, 1H), 1,97-1,95 (m, 3H), 1,91-1,83 (m, 1H), 1,82-1,70 (m, 3H), 1,70-1,51 (m, 10H), 1,50-1,17 (m, 10H), 1,11-1,06 (m, 1H), 1,06-1,02 (m, 6H), 1,01-0,96 (m, 1H), 0,93 (d, J=6,8 Гц, 4H), 0,89 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0,86 (d, J=6,8 Гц, 3H), 0,64 (q, J=11,9 Гц, 1H).

Пример 8: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-(2-гидроксиэтокси)рапамицин (диастереомер 1)

Пример 9: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-(2-гидроксиэтокси)рапамицин (диастереомер 2)

Пример 8 и пример 9

В раствор промежуточного соединения 3 (50 мг, 0,053 ммоль, 1,0 экв.) и 1,2-тиазетидин-1,1-диоксида (56,7 мг, 0,530 ммоль, 10 экв.) в DCM (1 мл) добавляли хлорид цинка(II) (1 М раствор в диэтиловом эфире, 0,265 мл, 0,265 ммоль, 5 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа. Реакционную смесь разбавляли с помощью H₂O и экстрагировали этилацетатом. Органический экстракт выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт, представляющий собой диастереомерную смесь, разделяли с помощью флэш-хроматографии (диоксид кремния; MeCN/DCM от 0:100 до 100:0).

В результате конечной очистки первого элюированного диастереомера с применением препаративной HPLC (способ 2) получали пример 8 (3,1 мг, выход 5,5%) в виде белого твердого вещества.

Пример 8: ESIMS [M+NH₄] 1037,0, [M+FA-H] 1064,1.

Точная масса: 1018,58

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ: 6,53-6,44 (m, 1H), 6,41 (dd, J=11,0, 5,6 Гц, 1H), 6,29-6,14 (m, 2H), 6,07 (dd, J=11,0, 1,5 Гц, 1H), 5,54 (dd, J=14,6, 9,1 Гц, 1H), 5,06 (d, J=8,9 Гц, 1H), 4,99-4,93 (m, 1H), 4,92-4,83 (m, 1H), 4,70-4,60 (m, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 4,13-4,02 (m, 3H), 3,92-3,86 (m, 1H), 3,69-3,64 (m, 1H), 3,59-3,54 (m, 1H), 3,52-3,42 (m, 5H), 3,33 (s, 3H), 3,30-3,27 (m, 1H), 3,13 (s, 3H), 3,10-3,02 (m, 2H), 3,02-2,94 (m, 2H), 2,90-2,80 (m, 1H), 2,30-2,21 (m, 1H), 2,21-2,10 (m, 1H), 2,10-2,00 (m, 2H), 2,00-1,87 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,81-1,62 (m, 6H), 1,58-1,54 (m, 1H), 1,53-1,47 (m, 5H), 1,47-1,35 (m, 5H), 1,36-1,23 (m, 2H), 1,23-1,09 (m, 4H), 1,06-1,01 (m, 1H), 1,01-0,95 (m, 6H), 0,90-0,87 (m, 1H), 0,87-0,83 (m, 3H), 0,81 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,76-0,70 (m, 4H), 0,68-0,60 (m, 1H).

В результате конечной очистки второго элюированного диастереомера с применением препаративной HPLC (способ 2) получали пример 9 (2,8 мг, выход 4,9%) в виде белого твердого вещества.

Пример 9: ESIMS [M+NH4] 1037,2, [M+FA-H] 1064,3.

Точная масса: 1018,58

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ: 6,48-6,40 (m, 1H), 6,27-6,19 (m, 1H), 6,19-6,13 (m, 1H), 6,10-6,05 (m, 1H), 5,52 (dd, J=14,2, 9,3 Гц, 1H), 5,13-5,00 (m, 2H), 4,96 (d, J=9,4 Гц, 1H), 4,67-4,57 (m, 1H), 4,48-4,40 (m, 1H), 4,17-4,10 (m, 2H), 4,10-4,02 (m, 2H), 3,98-3,90 (m, 1H), 3,56-3,49 (m, 2H), 3,50-3,43 (m, 4H), 3,37 (d, J=11,2 Гц, 1H), 3,33 (s, 3H), 3,23-3,15 (m, 1H), 3,15-3,10 (m, 4H), 3,07-2,95 (m, 2H), 2,75-2,64 (m, 1H), 2,27-2,14 (m, 2H), 2,11-2,00 (m, 2H), 2,00-1,89 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,76-1,65 (m, 2H), 1,65-1,56 (m, 3H), 1,56-1,49 (m, 7H), 1,48-1,36 (m, 3H), 1,34-1,23 (m, 3H), 1,23-1,04 (m, 5H), 1,01-0,94 (m, 4H), 0,90 (d, J=6,4 Гц, 3H), 0,88-0,83 (m, 5H), 0,80 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,75 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,62 (q, J=11,8 Гц, 1H).

Пример 10: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-диметилфосфинилрапамицин (диастереомер 1)

Пример 11: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-диметилфосфинилрапамицин (диастереомер 2)

Пример 10 и пример 11

В раствор промежуточного соединения 4 (100 мг, 0,102 ммоль, 1,0 экв.) и 1,2-тиазетидин-1,1-диоксида (54,9 мг, 0,512 ммоль, 5 экв.) в DCM (5 мл) добавляли хлорид цинка(II) (1 М раствор в диэтиловом эфире, 0,512 мл, 0,512 ммоль, 5 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Реакционную смесь разбавляли с помощью H₂O и экстрагировали этилацетатом. Органический экстракт выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт, представляющий собой диастереомерную смесь, разделяли с помощью SFC-хроматографии (способ 3).

В результате конечной очистки первого элюированного диастереомера с применением препаративной HPLC (способ 2) получали пример 10 (20,7 мг, выход 18,8%) в виде белого твердого вещества.

Пример 10: ESIMS [M+H] 1051,9, [M+FA-H] 1096,0.

Точная масса: 1050,56

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ 6,49-6,39 (m, 2H), 6,30-6,14 (m, 2H), 6,11-6,01 (m, 1H), 5,60-5,50 (m, 1H), 5,06-5,00 (m, 1H), 4,98-4,93 (m, 1H), 4,87 (d, J=9,7 Гц, 1H), 4,67-4,58 (m, 1H), 4,17-4,01 (m, 3H), 4,01-3,92 (m, 1H), 3,92-3,85 (m, 1H), 3,73-3,64 (m, 1H), 3,60-3,52 (m, 1H), 3,50-3,42 (m, 1H), 3,35-3,26 (m, 4H), 3,15-3,12 (m, 3H), 3,11-3,01 (m, 2H), 3,01-2,95 (m, 1H), 2,88-2,79 (m, 1H), 2,29-2,20 (m, 1H), 2,20-2,12 (m, 1H), 2,10-1,99 (m, 2H), 1,99-1,87 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,80-1,71 (m, 1H), 1,71-1,62 (m, 4H), 1,58-1,54 (m, 1H), 1,52-1,48 (m, 5H), 1,47-1,31 (m, 13H), 1,28-1,11 (m, 4H), 1,07-1,02 (m, 1H), 1,01-0,95 (m, 8H), 0,87-0,84 (m, 3H), 0,82 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,79-0,76 (m, 1H), 0,74 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,72-0,66 (m, 1H).

В результате конечной очистки второго элюированного диастереомера с применением препаративной HPLC (способ 2) получали пример 11 (13,4 мг, выход 12,2%) в виде белого твердого вещества.

Пример 11: ESIMS [M+H] 1051,8, [M+FA-H] 1095,8.

Точная масса: 1050,56

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ) 6,51-6,39 (m, 1H), 6,28-6,13 (m, 2H), 6,08 (d, J=11,1 Гц, 1H), 6,04-5,88 (m, 1H), 5,57-5,46 (m, 1H), 5,05 (s, 1H), 5,03 (d, J=5,7 Гц, 1H), 4,96 (d, J=9,9 Гц, 1H), 4,67-4,56 (m, 1H), 4,18-4,11 (m, 2H), 4,09-4,02 (m, 2H), 3,99-3,89 (m, 2H), 3,60-3,49 (m, 2H), 3,37 (d, J=13,3 Гц, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,18 (dt, J=7,7, 5,1 Гц, 1H), 3,15-3,11 (m, 4H), 3,07-3,00 (m, 1H), 2,73-2,63 (m, 1H), 2,28-2,13 (m, 2H), 2,13-2,05 (m, 2H), 2,05-1,97 (m, 2H), 1,97-1,88 (m, 1H), 1,83 (s, 3H), 1,80-1,69 (m, 1H), 1,68-1,58 (m, 4H), 1,58-1,48 (m, 7H), 1,48-1,43 (m, 1H), 1,42-1,34 (m, 10H), 1,34-1,28 (m, 1H), 1,28-1,22 (m, 2H), 1,22-1,13 (m, 2H), 1,13-1,03 (m, 1H), 1,03-0,94 (m, 5H), 0,94-0,88 (m, 4H), 0,86 (d, J=6,5 Гц, 3H), 0,81 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,75 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0,66 (q, J=12,0 Гц, 1H).

Пример 12: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-( S )-(1H-тетразол-1-ил)рапамицин (диастереомер 1)

Пример 13: C16-(1,1-диоксидо-1,2-тиазетидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-( S )-(1H-тетразол-1-ил)рапамицин (диастереомер 2)

Пример 12 и пример 13

В раствор промежуточного соединения 5 (118 мг, 0,124 ммоль, 1,0 экв.) и 1,2-тиазетидин 1,1-диоксида (66,4 мг, 0,620 ммоль, 5 экв.) в DCM (6 мл) добавляли хлорид цинка(II) (1 М раствор в диэтиловом эфире, 0,620 мл, 0,620 ммоль, 5 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение трех часов. Реакционную смесь разбавляли с помощью H₂O и экстрагировали этилацетатом. Органический экстракт выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт, представляющий собой диастереомерную смесь, разделяли с помощью SFC-хроматографии (способ 3).

В результате конечной очистки первого элюированного диастереомера с применением препаративной HPLC (способ 2) получали пример 12 (14,8 мг, выход 11,3%) в виде белого твердого вещества.

Пример 12: ESIMS [M+NH4] 1050,0, [M+FA-H] 1072,1.

Точная масса: 1026,57

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆) δ 9,32 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 6,45-6,37 (m, 1H), 6,31-6,14 (m, 2H), 6,10-6,04 (m, 1H), 5,60-5,49 (m, 1H), 5,23-5,12 (m, 1H), 5,07-5,01 (m, 1H), 4,99-4,93 (m, 1H), 4,87 (d, J=9,7 Гц, 1H), 4,69-4,59 (m, 1H), 4,15-4,02 (m, 3H), 3,94-3,84 (m, 1H), 3,72-3,54 (m, 3H), 3,51-3,42 (m, 1H), 3,27 (s, 4H), 3,11 (s, 3H), 3,07 (dd, J=7,3, 5,1 Гц, 1H), 3,01-2,91 (m, 1H), 2,85 (td, J=10,6, 9,5, 4,7 Гц, 1H), 2,28-2,13 (m, 3H), 2,10-2,00 (m, 2H), 1,98-1,88 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,80-1,75 (m, 1H), 1,73-1,67 (m, 4H), 1,59-1,53 (m, 4H), 1,53-1,45 (m, 6H), 1,45-1,34 (m, 3H), 1,33-1,20 (m, 3H), 1,20-1,07 (m, 3H), 1,05-1,01 (m, 1H), 1,00-0,94 (m, 6H), 0,88-0,82 (m, 6H), 0,80-0,75 (m, 1H), 0,73 (d, J=6,7 Гц, 3H).

В результате конечной очистки второго элюированного диастереомера с применением препаративной HPLC (способ 2) получали пример 13 (12,3 мг, выход 9,4%) в виде белого твердого вещества.

Пример 13: ESIMS [M+H] 1027,7, [M-H] 1025,6, [M+FA-H] 1071,6.

Точная масса: 1026,57

¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d ₆ δ 9,30 (s, 1H), 6,52-6,38 (m, 1H), 6,28-6,14 (m, 2H), 6,08 (d, J=11,1 Гц, 1H), 5,58-5,42 (m, 1H), 5,21-5,14 (m, 1H), 5,10-5,00 (m, 2H), 5,00-4,92 (m, 1H), 4,69-4,57 (m, 1H), 4,16-4,10 (m, 3H), 4,08-4,01 (m, 1H), 3,97-3,91 (m, 1H), 3,61 (dt, J=10,6, 4,1 Гц, 1H), 3,57-3,51 (m, 1H), 3,51-3,46 (m, 1H), 3,46-3,36 (m, 1H), 3,27 (s, 3H), 3,19-3,15 (m, 1H), 3,12 (s, 3H), 3,11-3,08 (m, 1H), 2,80-2,68 (m, 1H), 2,25-2,15 (m, 3H), 2,10-2,01 (m, 2H), 2,01-1,89 (m, 2H), 1,83 (s, 3H), 1,79-1,65 (m, 4H), 1,64-1,58 (m, 2H), 1,57-1,54 (m, 2H), 1,54-1,47 (m, 7H), 1,46-1,35 (m, 3H), 1,32-1,18 (m, 5H), 1,14-1,04 (m, 3H), 0,98 (d, J=6,6 Гц, 3H), 0,91-0,85 (m, 7H), 0,83 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,72 (d, J=6,6 Гц, 3H).

Пример 14: C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-диметилфосфинилрапамицин (диастереомер 1)

Пример 15: C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-диметилфосфинилрапамицин (диастереомер 2)

Пример 14 и пример 15

Растворяли промежуточное соединение 4 (0,146 г, 0,150 ммоль) и изотиазолидин-1,1-диоксид (0,181 г, 1,496 ммоль) в безводном ацетонитриле (1,5 мл). Добавляли одной порцией моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (2,84 мг, 0,015 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов.

Добавляли насыщенный водный раствор NaHCO₃. Смесь несколько раз экстрагировали этилацетатом. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO, декантировали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде бесцветной смолы.

Неочищенный продукт растворяли в MeOH (2,5 мл) и очищали за одно введение с помощью препаративной хроматографии с обращенной фазой (от 40 до 90% ацетонитрила в воде плюс 0,1% TFA в качестве модификатора на колонке C18 ISCO 100 г).

Фракции, соответствующие первому пику элюирования, объединяли и уменьшали до приблизительно 1/3 объема на роторном испарителе. Повышали основность оставшегося раствора с помощью насыщенного водного раствора NaHCO₄ и его несколько раз экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na₂SO₄, декантировали и концентрировали с получением примера 14 (0,055 г, 0,044 ммоль, выход 29,3%) в виде белого твердого вещества.

Пример 14: ESIMS [M+NH4] 1082,8, [M-H] 1063,7.

HRMS: рассчитано для C55H89N2O14PSNa как аддукта с натрием - 1087,5670. Обнаружено - 1087,5725.

¹H ЯМР (400 МГц, Хлороформ-d) δ 6,45 (dd, J=14,4, 10,9 Гц, 1H), 6,22 (dd, J=14,5, 10,6 Гц, 1H), 6,13 (dd, J=14,6, 10,5 Гц, 1H), 5,98 (d, J=10,8 Гц, 1H), 5,35 (dd, J=14,7, 9,8 Гц, 1H), 5,23-5,17 (m, 1H), 5,10 (d, J=9,8 Гц, 1H), 4,67 (m, 2H), 4,47 (d, J=1,8 Гц, 1H), 4,18-4,04 (m, 2H), 4,03-3,91 (m, 1H), 3,72 (d, J=6,5 Гц, 1H), 3,68-3,48 (m, 2H), 3,38 (m, 4H), 3,28 (s, 3H), 3,26-3,12 (m, 2H), 3,12-2,91 (m, 4H), 2,74 (m, 1H), 2,48-2,26 (m, 3H), 2,26-2,12 (m, 3H), 2,12-2,04 (m, 2H), 1,87 (s, 3H), 1,85-1,72 (m, 4H), 1,72-1,54 (m, 12H), 1,54-1,43 (m, 6H), 1,43-1,33 (m, 3H), 1,33-1,21 (m, 2H), 1,21-1,09 (m, 2H), 1,03 (m, 7H), 1,00-0,78 (m, 9H), 0,72 (q, J=11,9 Гц, 1H).

Фракции, соответствующие второму пику элюирования, объединяли и уменьшали до приблизительно 1/3 объема на роторном испарителе. Повышали основность оставшегося раствора с помощью насыщенного водного раствора NaHCO3. Смесь несколько раз экстрагировали этилацетатом. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na2SO4, декантировали и концентрировали с получением примера 15 (0,010 г, 7,51 мкмоль, выход 5,02%) в виде белого твердого вещества.

Пример 15: ESIMS [M+NH4] 1082,8, [M-H] 1063,8.

¹H ЯМР (400 МГц, Хлороформ-d) δ 6,36 (dd, J=19,2, 10,3 Гц, 1H), 6,13 (m, 1H), 6,04-5,84 (m, 1H), 5,65 (m, 1H), 5,32 (m, 1H), 6,21 (m,1H), 5,11 (m, 1H), 4,81 (dd, J=13,7, 7,5 Гц, 1H), 4,21-4,03 (m, 1H), 3,83 (dd, J=15,2, 5,1 Гц, 2H), 3,74 (d, J=13,2 Гц, 1H), 3,59 (dq, J=10,9, 6,8, 5,6 Гц, 2H), 3,52 (d, J=7,1 Гц, 1H), 3,46-3,33 (m, 7H), 3,30 (m, 3H), 3,18 (m, 3H), 3,10-2,82 (m, 3H), 2,39 (t, J=4,1 Гц, 1H), 2,28 (m, 3H), 2,14 (m, 3H), 1,90-1,77 (m, 4H), 1,74 (m, 4H), 1,66 (d, J=10,4 Гц, 3H), 1,61-1,41 (m, 12H), 1,34-1,19 (m, 5H), 1,18-1,11 (m, 1H), 1,11-0,79 (m, 19H), 0,78-0,68 (m, 1H).

Пример 16: (R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-(2-гидроксиэтокси)рапамицин

Пример 16

Известно, что абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 соответствует (R) на основании того, что в качестве исходного материала применяли пример 2.

Пример 16 получали посредством двухстадийной процедуры из 2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этанола и примера 2.

Стадия 1. Получение промежуточного соединения C

Растворяли 2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этанол (0,142 г, 0,803 ммоль) в безводном толуоле (0,4 мл). Добавляли N, N-диизопропилэтиламин (0,147 мл, 0,843 ммоль) с помощью шприца. Смесь вакуумировали с помощью азота, затем охлаждали до 0°C на ледяной бане. Добавляли трифлатный ангидрид (0,132 мл, 0,779 ммоль) с помощью шприца в течение периода, составляющего 60 секунд. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут.

Добавляли N, N-диизопропилэтиламин (0,147 мл, 0,843 ммоль), толуол (0,5 мл) и пример 2 (0,198 г, 0,200 ммоль). Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при 40°C и затем в течение одного часа при 55°C.

Реакционную смесь разбавляли насыщенным водным раствором NaHCO3 и четыре раза экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na2SO4, фильтровали в вакууме через целит и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде бесцветного масла.

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 40% ацетона в гептане, колонка с 12 г диоксида кремния, TLC в 30% ацетона в гептане, визуализировали с помощью УФ) с получением промежуточного соединения C (0,077 г, 0,067 ммоль, выход 33,5%) в виде белого твердого вещества.

Промежуточное соединение C: ESIMS [M+NH4] 1164,7, [M-H] 1147,0.

Стадия 2. Получение примера 16

Объединяли промежуточное соединение C (0,077 г, 0,067 ммоль) с пиридином (5,43 мкл, 0,067 ммоль) в безводном THF (0,7 мл). Смесь два раза вакуумировали с помощью азота и затем охлаждали до 0°C на ледяной бане. Добавляли по каплям HF-пиридин (0,086 мл, 0,671 ммоль) с помощью шприца в течение периода 15 секунд. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 70 минут.

Реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором NaHCO3 и несколько раз экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na2SO4, фильтровали в вакууме через целит и концентрировали с получением белого твердого неочищенного продукта.

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 40% ацетона в гептане, колонка с 12 г диоксида кремния, TLC в 40% EtOAc в гептане, визуализировали с помощью УФ) с получением примера 16 (0,049 г, 0,046 ммоль, выход 69,0%) в виде белого твердого вещества.

Пример 16: ESIMS [M+NH4] 1050,9, [M-H] 1031,9.

¹H ЯМР (600 МГц, Хлороформ-d) δ 6,45 (dd, J=14,6, 10,9 Гц, 1H), 6,22 (dd, J=14,7, 10,6 Гц, 1H), 6,13 (dd, J=14,9, 10,6 Гц, 1H), 5,98 (d, J=10,9 Гц, 1H), 5,35 (dd, J=14,9, 9,8 Гц, 1H), 5,20 (d, J=5,9 Гц, 1H), 5,09 (d, J=9,9 Гц, 1H), 4,71 (d, J=12,3 Гц, 1H), 4,62 (m, 1H), 4,46 (s, 1H), 4,11 (d, J=6,8 Гц, 1H), 3,96 (t, J=11,3 Гц, 1H), 3,78 (m, 1H), 3,70 (m, 3H), 3,63-3,55 (m, 3H), 3,43 (s, 3H), 3,28 (s, 3H), 3,24-3,15 (m, 2H), 3,12-3,04 (m, 2H), 3,07-2,98 (m, 1H), 2,97 (q, J=7,9 Гц, 1H), 2,75 (m, 1H),2,44-2,33 (m, 1H), 2,30 (M, 2H), 2,23 (m, 1H), 2,16 (m, 2H), 2,09 (d, J=13,1 Гц, 1H), 2,01 (m, 1H), 1,88 (s, 3H), 1,84 (d, J=13,1 Гц, 1H), 1,78-1,70 (m, 3H), 1,70-1,62 (m, 4H), 1,52 (dd, J=11,8, 7,7 Гц, 1 H), 1,50-1,41 (m, 2 H), 1,43-1,32 (m, 1H), 1,34-1,27 (m, 1H), 1,30-1,17 (m, 8H), 1,04 (dd, J=9,5, 6,6 Гц, 7H), 1,02-0,85 (m, 10H), 0,85 (d, J=6,8 Гц, 3H), 0,69 (q, J=12,0 Гц, 1H).

Пример 17: C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-( S )-(1H-тетразол-1-ил)рапамицин

Пример 17

Объединяли промежуточное соединение 5 (0,109 г, 0,114 ммоль) с изотиазолидин-1,1-диоксидом (0,139 г, 1,145 ммоль) в безводном ацетонитриле (1,1 мл). Добавляли моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (0,0022 г, 0,011 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов.

Реакционную смесь разбавляли насыщенным водным раствором NaHCO3. Смесь несколько раз экстрагировали с помощью EtOAc. Органические экстракты объединяли, высушивали над Na2SO, декантировали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде желтой смолы.

Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 40% ацетона в гептане, колонка с 24 г диоксида кремния, TLC в 40% ацетоне в гептане, визуализировали с помощью УФ) с получением примера 17 (0,053 г, 0,046 ммоль, выход 40,0%) в виде белого твердого вещества.

Пример 17: ESIMS [M+H] 1041,8, [M-H] 1039,8.

HRMS: рассчитано для C54H84N6O12SNa - 1063,5765. Обнаружено - 1063,5759.

¹H ЯМР (600 МГц, Хлороформ-d) δ 8,86 (s, 1H), 6,39 (dd, J=14,7, 11,0 Гц, 1H), 6,22 (dd, J=14,7, 10,7 Гц, 1H), 6,11 (dd, J=15,0, 10,5 Гц, 1H), 5,99 (d, J=10,9 Гц, 1H), 5,34 (dd, J=14,9, 9,8 Гц, 1H), 5,18 (d, J=5,7 Гц, 1H), 5,10 (d, J=9,8 Гц, 1H), 4,87 (m, 1H), 4,67 (m, 1H), 4,63 (d, J=12,2 Гц, 1H), 4,50 (s, 1H), 4,13 (d, J=6,1 Гц, 1H), 3,97 (t, J=11,4 Гц, 1H), 3,78 (d, J=6,2 Гц, 1H), 3,69-3,62 (m, 1H), 3,55 (dt, J=11,2, 4,0 Гц, 1H), 3,50-3,39 (m, 1H), 3,39 (s, 3H), 3,38-3,30 (m, 1H), 3,27 (s, 3H), 3,25-3,13 (m, 1H), 3,07 (td, J=8,4, 3,8 Гц, 1H), 3,01 (m, 1H), 2,96 (q, J=7,9 Гц, 1H), 2,70-2,63 (m, 2H), 2,39 (m, 1H), 2,35-2,21 (m, 3H), 2,18 (d, J=13,7 Гц, 1H), 2,16-2,09 (m, 1H), 1,95-1,81 (m, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,75 (m, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,60 (m, 6H), 1,58-1,50 (m, 1H), 1,53-1,34 (m, 2H), 1,32 (m, 1H), 1,29 (m, 1H), 1,25 (m, 6H), 1,12 (m, 1H), 1,05 (d, J=6,6 Гц, 3H), 1,05-0,78 (m, 12H).

Пример 18: C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-(2-этоксиэтокси)рапамицин

Пример 18

Объединяли промежуточное соединение 6 (0,090 г, 0,093 ммоль) с изотиазолидин-1,1-диоксидом (0,112 г, 0,926 ммоль) в безводном дихлорметане (0,93 мл). Добавляли одной порцией моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (1,761 мг, 9,26 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 100 минут.

Всю реакционную смесь очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 40% ацетона в гептане, колонка с 24 г диоксида кремния, TLC в 40% ацетоне в гептане, визуализировали с помощью УФ) с получением смеси примера 18 и остаточного непрореагировавшего изотиазолидин-1,1-диоксида.

Перемешанный материал снова очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (градиент элюирования от 0 до 50% ацетонитрила в дихлорметане, колонка с 24 г, TLC в 30% ацетонитрила в дихлорметане, визуализировали с помощью УФ) с получением примера 18 (0,021 г, 0,019 ммоль, выход 20,4%) в виде белого твердого вещества.

Пример 18: ESIMS [M+NH4] 1078,9, [M-H] 1059,9.

HRMS: рассчитано для C57H92N2O14SNa, аддукта с натрием - 1083,6167. Обнаружено - 1083,6151.

¹H ЯМР (600 МГц, Хлороформ-d) δ 6,45 (dd, J=14,5, 11,0 Гц, 1H), 6,21 (dd, J=14,6, 10,7 Гц, 1H), 6,14 (dd, J=14,8, 10,8 Гц, 1H), 5,98 (d, J=10,9 Гц, 1H), 5,35 (dd, J=14,8, 9,8 Гц, 1H), 5,20 (d, J=5,8 Гц, 1H), 5,09 (d, J=9,8 Гц, 1H), 4,72 (d, J=12,1 Гц, 1H), 4,61 (m, 1H), 4,46 (s, 1H), 4,10 (d, J=6,9 Гц, 1H), 3,96 (t, J=11,4 Гц, 1H), **3,73 (t, J=5,5 Гц, 2H), 3,68 (d, J=6,9 Гц, 1H), 3,59 (m, 4H), 3,53 (m, 2H), 3,46 (s, 3H), 3,28 (s, 3H), 3,21 (m, 1H), 3,13 (m, 1H), 3,07 (m, 2H), 3,05-2,99 (m, 1H), 2,97 (q, J=8,0 Гц, 1H), 2,78 (dq, J=14,4, 7,1 Гц, 1H), 2,44-2,33 (m, 1H), 2,31 (m, 2H), 2,27-2,19 (m, 1H), 2,19-2,12 (m, 2H), 2,07-1,94 (m, 2H), 1,88 (s, 3H), 1,83 (d, J=12,9 Гц, 1H), 1,74 (m, 3H), 1,66 (m, 7H), 1,56-1,44 (m, 1H), 1,43 (m, 2H), 1,41-1,15 (m, 12H), 1,04 (m, 7H), 0,91 (m, 8H), 0,84 (d, J=6,7 Гц, 3H), 0,70 (q, J=12,0 Гц, 1H).

Пример 19: C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксо-C40-((3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропаноил)окси)рапамицин

Пример 19

Объединяли промежуточное соединение 7 (0,088 г, 0,087 ммоль) с изотиазолидин-1,1-диоксидом (0,105 г, 0,866 ммоль) в безводном дихлорметане (0,87 мл). Добавляли моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (1,647 мг, 8,66 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут.

Всю реакционную смесь очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии с нормальной фазой (градиент элюирования от 0 до 60% ацетонитрила в дихлорметане, колонка с 12 г диоксида кремния, TLC в 30% ацетонитрила в дихлорметане) с получением примера 19 (0,020 г, 0,017 ммоль, выход 19,9%) в виде белого твердого вещества.

Пример 19: ESIMS [M+NH4] 1123,0, [M-H] 1104,0.

HRMS: Рассчитано для аддукта с аммонием, C58H92N2O16SNH4-1122,6511; обнаружено - 1122,652.

¹H ЯМР (600 МГц, Хлороформ-d) δ 6,45 (dd, J=14,7, 10,9 Гц, 1H), 6,22 (dd, J=14,7, 10,7 Гц, 1H), 6,13 (dd, J=14,9, 10,6 Гц, 1H), 5,99 (d, J=10,9 Гц, 1H), 5,35 (dd, J=14,9, 9,8 Гц, 1H), 5,21 (d, J=5,8 Гц, 1H), 5,10 (d, J=9,9 Гц, 1H), 4,73 (ddd, J=11,0, 9,2, 4,7 Гц, 1H), 4,69 (d, J=12,4 Гц, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,49 (s, 1H), 4,13 (d, J=6,5 Гц, 1H), 3,97 (t, J=11,3 Гц, 1H), 3,84 (dd, J=18,5, 11,4 Гц, 2H), 3,78-3,69 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,56 (td, J=13,5, 3,0 Гц, 1H), 3,43-3,31 (m, 4H), 3,28 (m, 3H), 3,26-3,17 (m, 2H), 3,12-2,92 (m, 3H), 2,76-2,68 (m, 1H), 2,45-2,34 (m, 1H), 2,31-2,21 (m, 3H), 2,20-2,10 (m, 3H), 2,06 (m, 1H), 1,87 (m, 4H), 1,75 (m, 3H), 1,71-1,59 (m, 3H), 1,60 (s, 3H), 1,60-1,50 (m, 1H), 1,48-1,39 (m, 1H), 1,42-1,31 (m, 2H), 1,33-1,20 (m, 8H), 1,11 (s, 3H), 1,11-1,05 (m, 2H), 1,03 (dd, J=18,2, 6,6 Гц, 6H), 0,99-0,82 (m, 10H), 0,79 (q, J=12,0 Гц, 1H).

Пример 20: биологические анализы и данные

Активность соединения в соответствии с настоящим изобретением оценивали с помощью следующих способов in vitro и in vivo.

Определение фармакологических характеристик

Материалы и способы

Клеточный анализ для определения активности рапалогов. Активность рапалогов определяли с применением анализа на основе клеток MEF TSC1-/-. Клетки MEF TSC1-/- представляют собой фибробласты эмбрионов мышей с дефицитом белка туберозного склероза - TSC1, который негативно регулирует передачу сигнала mTORC1, и, таким образом, демонстрируют конститутивную активацию mTORC1, что приводит к фосфорилированию (активации) последующих молекул. Данный клеточный анализ применяют для измерения ингибирования (дефосфорилирования) S6 и 4EBP1 рапалогами или другими ингибиторами mTOR.

Клетки MEF TSC1-/- высеивали в покрытые поли-D-лизином 384-луночные планшеты Greiner с прозрачным дном и инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO₂. На следующий день клетки промывали 8 раз раствором "сильного голода" (1 л DPBS+1 г D(+)-глюкозы+10 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия+20 мл 1 М HEPES) и инкубировали в течение еще 2 часов в том же растворе. Затем клетки обрабатывали соединениями с уменьшающимися значениями концентрации (8 значений при 3,16-кратном разбавлении) и инкубировали в течение 2 часов при 37°C, 5% CO₂. Клетки фиксировали с помощью 4% параформальдегида в течение 30 мин. и 5 раз промывали с помощью TBS-EDTA с последующим иммунным окрашиванием меченными флуоресцентной меткой антителами к pS6 (Ser240/244) (Cell Signaling №9468) и p4EBP1 (Thr 37/46) (Cell Signaling №5123). Ядра делали видимыми с помощью красителя Hoechst (ThermoFisher Scientific №H3570). Клетки визуализировали (InCell 600) с использованием соответствующих флуоресцентных каналов и активность ингибиторов mTOR определяли с помощью IC₅₀ (нМ) pS6.

Содержание животных, обработка соединениями и сбор тканей. Все процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Института биомедицинских исследований Novartis, Кембридж, Массачусетс, США. Приобретали взрослых самцов крыс линии Sprague Dawley (SD) в Envigo (Индианаполис, США) или Charles River (США). После транспортировки крыс удерживали в отдельных помещениях со стерильными условиями с контролируемыми температурой и освещением (22°C, цикл 12 часов света/12 часов темноты: свет включают в 06:00 ч./свет выключают в 18:00 ч.) и с доступом к пище и воде ad libitum. Крыс акклиматизировали в течение по меньшей мере 3 дней перед проведением экспериментов.

Пример 2 и RAD001 составляли для перорального введения (per os, p.o.) дозы. Холостые составы (без примера 2 или RAD001) выполняли функцию контролей со средой-носителем. Крысы получали однократную дозу примера 2, RAD001 или соответствующей среды-носителя p.o. В заранее заданные моменты времени после обработки крыс анестезировали с помощью 3,5% изофлурана и подвергали эвтаназии. Различные органы собирали и замораживали в жидком азоте. Кровь собирали через хвостовую вену или путем сердечной пункции (последний отбор) и замораживали для дальнейших фармакокинетических анализов. Все ткани хранили при -80°C до проведения анализа.

Определение значений концентрации примера 2 и RAD001 в крови и тканях. Значения концентрации определяли с применением HPLC/масс-спектрометрии.

Экстракция белков и иммуноблоттинг. Для экстракции белков быстро замороженные ткани лизировали в буфере для лизиса MSD (MSD, Роквилл, Мэриленд), дополняли ингибитором протеаз cOmplete без EDTA и таблетками ингибитора фосфатазы PhosSTOP (Roche, Манхейм, Германия) и центрифугировали при 13000 g в течение 20 мин. при 4°C. Полученную надосадочную жидкость применяли для иммуноблоттинга. Белок количественно определяли посредством анализа белков BCA (Thermo Scientific, Массачусетс). Образцы разделяли на 4-20% предварительно полимеризованных миди-гелях для электрофореза белков Criterion™ TGX™ (Bio-Rad, Калифорния) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Bio-Rad, Калифорния) с применением системы Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Калифорния). Иммуноблоттинг проводили с применением антител к p-S6 и t-S6 от Cell Signaling Technologies (все 1:1000 в TBS-T с 5% BSA). Приставки "p" и "t" означают "фосфорилированную" и "общую" формы, соответственно. Конъюгированные с HRP вторичные антитела к IgG кролика (№ 7074) были получены от Cell Signaling Technologies, Массачусетс. Сигнал хемилюминесценции генерировали с применением улучшенного хемилюминесцентного субстрата SuperSignal™ West Femto (№ 34095, Thermo Scientific, Массачусетс) или улучшенного хемилюминесцентного субстрата Western Lightning® Plus-ECL (NEL103001EA, Perkin Elmer, Массачусетс) и регистрировали с применением системы визуализации ChemiDoc MP (Bio-Rad). Полученные цифровые изображения конвертировали в формат TIFF и подвергали количественному анализу с применением программного обеспечения ImageJ.

Создание клеток с нокдауном FKPB12. Вектор CRISPR/CAS9, содержащий последовательность gRNA, нацеленную на C-конец FKBP12 (GCTTCTAAAACTGGAATGAC), трансфицировали в клетки 293T. Отбор проводили с применением пуромицина в течение 48 часов и клетки высеивали для образования колоний. Клоны с нокдауном FKBP12 подвергали скринингу путем иммуноблоттинга с применением антитела к FKBP12 (Thermo Scientific, Pierce № PA1-026A). Отбирали клоны со значительно сниженным уровнем FKBP12 (с примерно 80% снижением относительно уровней в необработанных клетках 293T).

Создание клеток с нокаутом FKPB12. Применяли систему CRISPR/Cas9 для доставки рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих последовательность направляющей РНК (gRNA), нацеленную на FKBP12 (GCCACTACTCACCGTCTCCT), в клетки 293T с применением набора Amaxa® 4D-Nucleofector™ X (Lonza, V4XC-2032). Клеточные клоны подвергали скринингу путем иммуноблоттинга с применением антитела к FKBP12 (Novus, NB300-508) и отбирали отдельные клоны, демонстрирующие полный нокаут FKBP12 (без измеримого количества FKBP12).

Обработка клеток 293T дикого типа (WT) с нокдауном FKBP12 и с нокаутом FKBP12 с помощью RAD001 и примера 2. Клетки 293T WT с нокдауном FKBP12 и с нокаутом по FKBP12 высеивали при плотности 30000 клеток на лунку в покрытые поли-D-лизином 96-луночные планшеты (Corning, № 354461) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ThermoFisher, № 11995-065), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (ThermoFisher, № 16140-071). Клетки инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 48 часов, до достижения ими ~80% конфлюэнтности. Клетки обрабатывали с помощью RAD001 и примера 2 с использованием диапазона доз из 12-значений от 1000 нМ до 0,0033 нМ в течение 2 часов при 37°C в двух повторностях. Среду, дополненную холостым диметилсульфоксидом (DMSO), применяли в качестве контроля для обоих соединений. Количества фосфорилированного S6K1 (Thr389) определяли с помощью набора для сэндвич-ELISA (Cell signaling, № 7063C) в соответствии с инструкциями производителя.

SPR-анализ для определения аффинности связывания с FK506-связывающими белками (FKBP).

Меченные по N-концу с помощью avi-his6 FKBP, слитые с FKBP12, FKBP51 и FKBP52, экспрессировали в E. coli и очищали с помощью стандартной хроматографии. Каждый белок последовательно иммобилизировали на чипе со стрептавидином в оборудовании для SPR Biacore 8K (GE Healthcare). В режиме одноциклового определения кинетики титры соединения пропускали при 45 мкл/мин. по каждой поверхности с применением 2-минутной фазы ассоциации и 30-минутной фазы диссоциации в буфере, содержащем 50 мМ Tris с pH 7,5/150 мМ NaCl/0,01% Tween 20/1 мМ DTT/2% DMSO. Данные подгоняли с применением результатов одноциклового определения кинетики низкомолекулярных соединений (LMW). Приведены равновесные константы диссоциации (K_D).

Могут достигаться различные показатели фармакологии рапалогов в различных типах клеток или тканей в зависимости от 1) относительной распространенности гомологов FKBP в таких клетках/тканях и 2) специфичности связывания с такими различными гомологами FKBP (Mol. Cell Biol. (2013) 33:1357-1367).

Результаты

Активность in vitro ингибиторов mTOR определяли с помощью pS6 IC₅₀ (нМ) в клетках MEF TSC1-/-.

Соединение	IC50 (нМ)
Рапамицин	0,050
RAD001	0,050
Промежуточное соединение 1	0,092
Промежуточное соединение 3	0,0591
Промежуточное соединение 4	0,066
Промежуточное соединение 5	0,106
Пример 1	2,4
Пример 2	0,274
Пример 3	1,45
Пример 4	>500
Пример 5	153
Пример 6	0,170
Пример 7	0,300
Пример 8	0,328
Пример 9	1,45
Пример 10	0,557
Пример 11	3,33
Пример 12	0,374
Пример 13	0,656
Пример 14	7,77
Пример 15	3,2
Пример 16	0,645
Пример 17	1,1
Пример 18	1,55

Значения IC50 рассчитывают как средние из нескольких анализов.

Равновесные константы диссоциации (K_D) для FKBP12, FKBP51 и FKBP52.

Соединение	FKBP- связывающий белок	Средняя K_D (нМ)
RAD001	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	500 811 1765
Пример 1	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	0,35 153 174
Пример 2	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	16 >10000 >10000
Пример 6	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	0,32 39 53
Пример 7	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	1,2 287 236
Пример 10	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	1,6 95 176
Пример 14	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	16 -- 542
Пример 16	FKBP12: FKBP51: FKBP52:	35 4064 4073

Фармакокинетический профиль примера 2 у крыс. Крыс в возрасте 4 месяца обрабатывали с помощью однократной p.o. дозы примера 2 при 3 мг/кг и кровь собирали через 0,25, 0,5, 1, 2, 4 и 7 ч. после введения дозы. В данном эксперименте пример 2 составляли в 15% полиэтиленгликоля (PEG) 300, 7,5% Solutol HS 15, 7,5% Cremophore EL в воде MilliQ. Значения концентрации примера 2 измеряли с помощью HPLC-MS (фигура 3).

Сравнительные значения концентрации примера 2 и RAD001 в крови и головном мозге у крыс.

Крыс в возрасте 4 месяца обрабатывали p.o. с помощью примера 2 (составленном в 15% PEG 300, 7,5% Solutol HS 15, 7,5% Cremophore EL в воде MilliQ) при 3, 10 и 30 мг/кг. В другом эксперименте крыс в возрасте 8 недель обрабатывали p.o. с помощью RAD001 (составленном в виде микроэмульсии при 2% (вес/вес) и разбавляли до конечной концентрации в воде MilliQ) при 3, 10 и 30 мг/кг. Ткани крови и головного мозга собирали через 3 часа (ч.) и 24 ч. после обработки с определением значений концентрации соединений. При введении в одинаковых дозах (3, 10 и 30 мг/кг), значения концентрации в крови и головном мозге для примера 2 были выше по сравнению с таковыми для RAD001 (фигуры 4A и 4B).

Для сравнения биодоступности примера 2 относительно RAD001 у крыс соединения составляли в виде составов растворов: пример 1 составляли в 15% PEG300, 7,5% Solutol HS 15, 7,5% Cremophore EL в PBS и RAD001 составляли в 10% PEG300, 10% Solutol HS 15, 10% Cremophore EL в PBS. Соединения вводили крысам в возрасте 7-9 недель (N=3 на группу) p.o. при 3 мг/кг и внутривенно (i. v.). при 1 мг/кг (фигуры 4C и 4D). Для примера 2 и RAD001 соответственно биологическая доступность составляла 18% и 19%, конечный период полувыведения после i.v.: 9,9 ч. и 9,5 ч., клиренс: 9 мл/мин./кг и 32 мл/мин./кг, и Vdss (объем распределения в равновесном состоянии): 4,4 л/кг и 18,8 л/кг.

Пример 2 ингибирует путь mTORC1 в печени крысы. Способность примера 2 ингибировать путь mTORC1 in vivo определяли у крыс в возрасте 4 месяца (фигуры 5A - 5D). Однократная доза примера 2 при 3, 10 и 30 мг/кг обеспечивала значительное дефосфорилирование (инактивацию) S6 в печени крыс (по сравнению с контролем со средой-носителем) через три часа после введения дозы (фигуры 5A и 5B). S6 оставался инактивированным через 24 ч. после введения дозы при 10 (p=0,06 для динамики изменения) и 30 мг/кг (фигуры 5C и 5D).

FKBP12 является необходимым для ингибирующего эффекта примера 2, но не RAD001. Количества фосфорилированного S6K1 (Thr389) измеряли в клетках 293T WT с нокдауном FKBP12 и с нокаутом FKBP12, обработанных с помощью RAD001 или примера 2. S6K1 является последующей мишенью mTORC1, и фосфорилирование его рапалог-чувствительного участка Thr389 используют в качестве эффективного показателя активности mTORC1. Lee, C. H., Inoki, K. and Guan, K. L. (2007). mTOR pathway as a target in tissue hypertrophy. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 443-467. В клетках 293T WT как RAD001, так и пример 2 были эффективными в ингибировании S6K1(Thr389) на ~80% (фигура 6A). В клетках с нокдауном FKBP12 пример 2 не обеспечил ингибирование фосфорилирования S6K1 (Thr389) до такого же уровня, как RAD001: максимальное ингибирование S6K1 (Thr389) с помощью RAD001 составляло ~70%, тогда как ингибирование, достигнутое с помощью примера 2, составляло ~40% (фигура 6B). В клетках с нокаутом FKBP12 пример 2 не обеспечил ингибирование фосфорилирования S6K1 (Thr389), тогда как все еще было достигнуто >60% ингибирование с помощью RAD001 (фигура 6C). Данные результаты указывают на то, что фармакологические эффекты примера 2 ограничены FKBP12. Такая специфичность примера 2 в отношении FKBP12 может способствовать нацеливанию на клетки и ткани с относительно высокими уровнями экспрессии FKBP12, и при этом устранять (или сводить к минимуму) побочные эффекты в тканях, где уровень экспрессии FKBP12 низкий.

Эквиваленты и объем правовой защиты

В формуле изобретения формы единственного числа могут также включать множественное число, если иное не указано или другим образом не очевидно из контекста. Формула изобретения или разделы описания, в которых включены "или" между одним или несколькими членами группы, считаются выполненными, если один, более чем один или все члены группы присутствуют в данном продукте или способе, используются в них или другим образом имеют отношение к ним, если иное не указано или другим образом не очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых ровно один член группы присутствует в данном продукте или способе, используется в них или другим образом имеет отношение к ним. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых более чем один или все члены группы присутствуют в данном продукте или способе, используются в них или другим образом имеют отношение к ним.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и сочетания, в которых одно или несколько ограничений, элементов, пунктов и описательных терминов из одного или нескольких перечисленных пунктов формулы изобретения представлены в другом пункте формулы изобретения. Например, любой пункт формулы изобретения, который является зависимым от другого пункта формулы изобретения, может быть модифицирован, чтобы включать одно или несколько ограничений, обнаруженных в любом другом пункте формулы изобретения, который является зависимым от того же независимого пункта формулы изобретения. Если элементы представлены в виде списков, например, в формате группы Маркуша, каждая подгруппа элементов также является раскрытой, и любой(любые) элемент(элементы) может(могут) быть удален(удалены) из группы. Следует понимать, что в целом, если указано, что настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения содержат конкретные элементы и/или признаки, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения или аспекты настоящего изобретения состоят или по сути состоят из таких элементов и/или признаков. Также следует отметить, что предполагается, что термины "включающий" и "содержащий" являются открытыми и допускают включение дополнительных элементов или стадий. Если приведены диапазоны, конечные точки включены в них. Кроме того, если иное не указано или другим образом не очевидно из контекста и понимания специалиста в данной области техники, значения, выраженные в виде диапазонов, могут принимать любое конкретное значение или поддиапазон в пределах указанных диапазонов в различных вариантах осуществления настоящего изобретения, до десятой доли единицы нижнего предела диапазона, если в контексте явно не предусматривается иное.

Данная заявка ссылается на различные выданные патенты, опубликованные заявки на патент, статьи из журналов и другие публикации, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Если присутствует расхождение между каким-либо из включенных литературных источников и данным описанием, описание будет иметь преимущество. Кроме того, любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который входит в предшествующий уровень техники, может быть явно исключен из любых одного или нескольких пунктов формулы изобретения. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными специалисту в данной области техники, они могут быть исключены, даже если исключение явно не изложено в данном документе. Любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения может быть исключен из любого пункта формулы изобретения по любой причине, независимо от того, относится ли она к существованию предшествующего уровня техники.

Специалисты в данной области техники определят или смогут установить, используя только стандартные эксперименты, многочисленные эквиваленты конкретных вариантов осуществления, описанных в данном документе. Предполагается, что объем вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в данном документе, не ограничен описанием выше, а вместо этого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что можно выполнять различные изменения и модификации данного описания без отступления от сущности или объема настоящего изобретения, определенных в следующей формуле изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NOVARTIS AG

<120> НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ РАПАМИЦИНА

<130> PAT057873-WO-PCT

<140> PCT/IB2018/057422

<141> 2018-09-25

<150> 62/563,312

<151> 2017-09-26

<160> 3

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

Синтетический олигонуклеотид"

<400> 1

gcttctaaaa ctggaatgac

20

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

Синтетический олигонуклеотид"

<400> 2

gccactactc accgtctcct

20

<210> 3

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

Синтетическая 6xHis метка"

<400> 3

His His His His His His

1. 5

<---

Claims

1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль

(I),

где R₁ выбран из группы, состоящей из гидрокси,

, , , и ; и

R₂ выбран из группы, состоящей из

, , ,

где m равняется 0;

n равняется 1 или 2; и

R₃ представляет собой водород, C_1-6алкил или гидрокси-C_1-6алкил.

2. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где

R₃ представляет собой водород или C_1-6алкил.

3. Соединение по п. 1 или 2 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₁ представляет собой гидрокси.

4. Соединение по любому из пп. 1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ представляет собой

и n равняется 1 или 2.

5. Соединение по любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемая соль, где R₂ представляет собой

6. Соединение, выбранное из:

Структура
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана .
* Абсолютная стереохимическая конфигурация по C16 не задана

или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой

C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин.

8. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой

(S)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин.

9. Соединение по любому из пп. 1-5 или его фармацевтически приемлемая соль, где указанное соединение представляет собой

(R)-C16-(1,1-диоксидоизотиазолидин-2-ил)-C32-дезоксорапамицин.

10. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль для применения в качестве лекарственного препарата для ингибирования активности mTOR.

11. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль для применения в предупреждении или лечении нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR.

12. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, для применения в предупреждении или лечении нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR, выбранного из

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

13. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, для применения в предупреждении или лечении нарушения или заболевания, которое включает процесс фиброза или воспаления.

14. Соединение для применения по п. 13, где нарушение выбрано из нарушений печени и почки.

15. Соединение для применения по п. 14, где нарушение печени выбрано из фиброза печени, который возникает на терминальной стадии заболевания печени; цирроза печени; печеночной недостаточности, вызванной токсичностью; неалкогольного стеатогепатита или NASH и алкогольного стеатоза.

16. Соединение для применения по п. 14, где нарушение почки представляет собой фиброз почки, который возникает в результате острого повреждения почки.

17. Соединение для применения по п. 14, где нарушение почки представляет собой хроническое нарушение почки.

18. Соединение для применения по п. 14, где нарушение почки представляет собой диабетическую нефропатию.

19. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, для применения в предупреждении или лечении возрастного нарушения или заболевания, опосредованных путем mTOR, выбранных из саркопении, остеопороза, остеоартрита, снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, ожирения, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

20. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль для применения в предупреждении или лечении рака, опосредованного путем mTOR.

21. Соединение по п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, для применения в лечении рака почки, почечно-клеточной карциномы, колоректального рака, саркомы матки, рака эндометрия матки, рака эндометрия, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака желудка, фибросаркомы, рака поджелудочной железы, рака печени, меланомы, лейкоза, множественной миеломы, рака носоглотки, рака предстательной железы, рака легкого, глиобластомы, рака мочевого пузыря, мезотелиомы, рака головы, рабдомиосаркомы, саркомы, лимфомы или рака шеи.

22. Фармацевтическая композиция для ингибирования активности mTOR, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп. 1-9 или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

23. Применение соединения по любому из пп. 1-9 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по п. 22 для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR.

24. Применение соединения по любому из пп. 1-9 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по п. 22 для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR, выбранного из:

- васкулопатий, связанных с трансплантатом;

- инфекций, вызванных грибами;

- воспаления;

- инфекции;

- возрастных заболеваний;

- нейродегенеративных заболеваний;

25. Применение соединения по любому из пп. 1-9 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по п. 22 для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR, которое включают процесс фиброза или воспаления.

26. Применение по п. 25, где нарушение выбрано из нарушений печени и почки.

27. Применение по п. 26, где нарушение печени выбрано из фиброза печени, который возникает на терминальной стадии заболевания печени; цирроза печени; печеночной недостаточности, вызванной токсичностью; неалкогольного стеатогепатита или NASH и алкогольного стеатоза.

28. Применение по п. 26, где нарушение почки представляет собой фиброз почки, который возникает в результате острого повреждения почки.

29. Применение по п. 26, где нарушение почки представляет собой хроническое нарушение почки.

30. Применение по п. 26, где нарушение почки представляет собой диабетическую нефропатию.

31. Применение соединения по любому из пп. 1-9 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по п. 22 для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения возрастного нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR, выбранного из саркопении, остеопороза, остеоартрита, снижения когнитивных способностей, жесткости сухожилия, дисфункции сердца, такой как гипертрофия сердца, и/или систолическая и/или диастолическая дисфункция, и/или гипертензия, дисфункции сердца, которая приводит к снижению фракции выброса, старения иммунной системы, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, рака, старения иммунной системы, приводящего к раку из-за снижения иммунного надзора, инфекций, обусловленных снижением иммунной функции, ожирения, артрита и диабета II типа, в том числе осложнений, связанных с диабетом, таких как почечная недостаточность, слепота и нейропатия.

32. Применение соединения по любому из пп. 1-9 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по п. 22 для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для предупреждения или лечения рака, опосредованного путем mTOR.

33. Применение соединения по любому из пп. 1-9 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по п. 22 для изготовления лекарственного препарата, предназначенного для лечения нарушения или заболевания, опосредованного путем mTOR, выбранного из рака почки, почечно-клеточной карциномы, колоректального рака, саркомы матки, рака эндометрия матки, рака эндометрия, рака молочной железы, рака яичника, рака шейки матки, рака желудка, фибросаркомы, рака поджелудочной железы, рака печени, меланомы, лейкоза, множественной миеломы, рака носоглотки, рака предстательной железы, рака легкого, глиобластомы, рака мочевого пузыря, мезотелиомы, рака головы, рабдомиосаркомы, саркомы, лимфомы или рака шеи.