RU2555534C2 - Method of obtaining preparative quantities of viral particles of phloem-restricted viruses - Google Patents
Method of obtaining preparative quantities of viral particles of phloem-restricted viruses Download PDFInfo
- Publication number
- RU2555534C2 RU2555534C2 RU2013123640/10A RU2013123640A RU2555534C2 RU 2555534 C2 RU2555534 C2 RU 2555534C2 RU 2013123640/10 A RU2013123640/10 A RU 2013123640/10A RU 2013123640 A RU2013123640 A RU 2013123640A RU 2555534 C2 RU2555534 C2 RU 2555534C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- chimeric
- plant
- protein
- plrv
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 13
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 23
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 claims description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 15
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 14
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 13
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 13
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 13
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 13
- 241001147459 Turnip vein-clearing virus Species 0.000 claims description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 claims description 10
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 claims description 3
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 claims description 3
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 abstract description 11
- 241000709769 Potato leafroll virus Species 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000013461 design Methods 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000003817 vacuum liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108090000104 Actin-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000256593 Brachycaudus schwartzi Species 0.000 description 1
- 102100031102 C-C motif chemokine 4 Human genes 0.000 description 1
- 101100054773 Caenorhabditis elegans act-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 101710195101 Flagellar filament outer layer protein Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000984622 Leucodon Species 0.000 description 1
- NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N Meprobamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(N)=O NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150115425 Slc27a2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108091007054 readthrough proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и фундаментальной вирусологии.The invention relates to biotechnology and fundamental virology.
Сущность изобретения заключается в разработке способа получения препаративных количеств химерного вируса, имитирующего икосаэдрический низкокопийный флоэмно-ограниченный вирус (ИНФОВ) растений. Для осуществления способа химерный вирус, имитирующий ИНФОВ растений, получают путем вставки гена белка оболочки ИНФОВ в эффективный вирусный вектор на основе РНК тобамовируса, способного распространяться в растении. При заражении растений полученным химерным вирусом, вирус размножается и накапливается в растении, что позволяет выделить его из тканей растения в препаративных количествах (сотни мг - граммы из 1 кг растительной ткани).The essence of the invention is to develop a method for producing preparative quantities of a chimeric virus that mimics the icosahedral low-copy phloem-restricted virus (INFOV) of plants. To implement the method, a chimeric virus that mimics plant INFOV is obtained by inserting the INFOV envelope protein gene into an effective viral vector based on tobamovirus RNA that can spread in the plant. When plants are infected with the resulting chimeric virus, the virus multiplies and accumulates in the plant, which makes it possible to isolate it from the plant tissues in preparative quantities (hundreds of mg - grams from 1 kg of plant tissue).
Таким образом, объектом изобретения является способ получения препаративных количеств химерного вируса, имитирующего икосаэдрический низкокопийный флоэмно-ограниченный вирус (ИНФОВ) растений, включающий получение химерного вируса путем вставки гена белка оболочки ИНФОВ в эффективный вирусный вектор на основе РНК тобамовируса, способного распространяться и накапливаться в растении, после чего осуществляют системное заражение растений полученным химерным вирусом для размножения и накопления его в тканях растения с последующим выделением химерного вируса из тканей растения в препаративных количествах. Thus, an object of the invention is a method for producing preparative amounts of a chimeric virus that mimics the icosahedral low-copy phloem-restricted plant virus (INFO), comprising producing a chimeric virus by inserting an INFOV coat protein gene into an effective viral vector based on tobamovirus RNA that can spread and accumulate in a plant after which systemic infection of plants with the obtained chimeric virus is carried out for propagation and its accumulation in plant tissues, followed by the preparation of chimeric virus from plant tissues in preparative quantities.
Химерный вирус представляет собой химерную РНК, транскрибированную с ДНК-вектора, состоящую из генома тобамовируса и гена капсидного белка целевого вируса низкокопийного флоэмно-ограниченного вируса растений, причем белок оболочки упаковывает РНК тобамовирусного генома в икосаэдр. Для системного заражения растения химерным вирусным вектором может быть использована техника агроинокуляции.A chimeric virus is a chimeric RNA transcribed from a DNA vector consisting of the tobamovirus genome and the capsid protein gene of the target low-copy phloem-restricted plant virus, the coat protein packaging the tobamovirus genome RNA in the icosahedron. For systemic infection of a plant with a chimeric viral vector, the agroinoculation technique can be used.
Объектом изобретения является также антисыворотка к капсидному белку химерного вируса, имитирующего икосаэдрический низкокопийный флоэмно-ограниченный вирус (ИНФОВ) растений, полученная способом, включающим иммунизацию животных химерными вирусными частицами, полученными вышеуказанным способом.The object of the invention is also an antiserum to the capsid protein of a chimeric virus that mimics the icosahedral low-copy phloem-restricted plant virus (INFOV) obtained by a method comprising immunizing animals with chimeric viral particles obtained by the above method.
В качестве икосаэдрического низкокопийного флоэмно-ограниченного вируса растений может быть использован вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК). В частности, реализация способа показана на примере получения препаративных количеств вирусных частиц (сотни мг - граммы в 1 кг растительной ткани), имитирующих вирионы вируса скручивания листьев картофеля, для получения антисыворотки к ВСЛК. As an icosahedral low-copy phloem-restricted plant virus, a potato leaf curling virus (VLF) can be used. In particular, the implementation of the method is shown by the example of obtaining preparative amounts of viral particles (hundreds of mg - grams per 1 kg of plant tissue) that mimic the virions of the virus of twisting potato leaves to obtain antiserum to VVL.
Таким образом, объектом изобретения является также способ получения препаративных количеств вирусных частиц, имитирующих вирионы вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК), для осуществления которого получают генно-инженерную плазмиду TVCV-PLRV-CP с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. При этом получение химерного вирусного вектора включает следующие этапы: Thus, an object of the invention is also a method for producing preparative amounts of viral particles that mimic the potato leaf curl virus virions (VLCK), for the implementation of which a genetically engineered plasmid TVCV-PLRV-CP with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is obtained. The viral vector includes the following steps:
а) клонирование кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), принадлежащего к тобамовирусам, с транскрипционным промотером с одной стороны и терминатором транскрипции с другой в агробактериальный вектор pCambia1300; a) cloning cDNA of turnip vein enlightenment virus (VLT, TVCV), belonging to tobamoviruses, with a transcriptional promoter on the one hand and a transcription terminator on the other into the agrobacterial vector pCambia1300;
б) вставку гена белка оболочки ВСЛК из плазмиды pBNUP110 вместо гена собственного тобамовирусного гена белка оболочки. b) the insertion of the gene for the protein of the shell of VBLK from plasmid pBNUP110 instead of the gene of its own tobamovirus gene for the protein of the membrane.
Для системного заражения растений осуществляют трансформацию агробактерии штамма GV3101 плазмидой TVCV-PLRV-CP, после чего заражают растения Nicotiana benthamiana вирусной химерной ДНК путем впрыскивания суспензии трансформированных плазмидой TVCV-PLRV-CP агробактерий шприцом со снятой иглой в межклетники листьев растения. Выделение химерного вируса из тканей растения осуществляют путем гомогенизации листьев в блендере в 5 объемах 0.1М цитратного буфера с pH 6.0 с 0.1% 2-меркаптоэтанолом, корректировки pH до 7.0 с помощью 0.5M Na2HPO4, добавления 1% Triton X-100, перемешивания гомогената листьев в этом буфере 30 мин на льду, отделение дебриса центрифугированием при 10.000g с последующим осветлением супернатанта 1/4 V хлороформа и высаживанием химерного вируса на ультрацентрифуге при 40.000g в течение 90 мин через 20% сахарозную подушку. For systemic infection of plants, the agrobacteria of strain GV3101 are transformed with the plasmid TVCV-PLRV-CP, after which the Nicotiana benthamiana plants are infected with viral chimeric DNA by injection of a suspension of the transformed plasmid TVCV-PLRV-CP agrobacteria with a syringe with a needle removed into the intercellular spaces of the plant leaves. Chimeric virus is isolated from plant tissues by homogenizing leaves in a blender in 5 volumes of 0.1 M citrate buffer with pH 6.0 with 0.1% 2-mercaptoethanol, adjusting the pH to 7.0 with 0.5M Na 2 HPO 4 , adding 1% Triton X-100, mixing the leaf homogenate in this buffer for 30 minutes on ice, separating debris by centrifugation at 10,000 g, followed by clarification of the 1/4 V chloroform supernatant and planting the chimeric virus in an ultracentrifuge at 40,000 g for 90 minutes through a 20% sucrose cushion.
Объектом изобретения является также плазмида TVCV-PLRV-CP с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, которая может быть использована для получения препаративных количеств химерного вируса, имитирующего вирус скручивания листьев картофеля.The object of the invention is also the plasmid TVCV-PLRV-CP with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which can be used to obtain preparative quantities of a chimeric virus that mimics the virus of twisting of potato leaves.
Кроме того, объектом изобретения является также препарат химерного вируса, имитирующего икосаэдрический низкокопийный флоэмно-ограниченный вирус растений, полученный вышеуказанным способом. В частности, препарат химерного вируса, в котором в качестве икосаэдрического низкокопийного флоэмно-ограниченного вируса растений используют вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК), может быть получен с использованием плазмиды TVCV-PLRV-CP. In addition, an object of the invention is also a preparation of a chimeric virus that mimics the icosahedral low-copy phloem-restricted plant virus obtained by the above method. In particular, a preparation of a chimeric virus in which a potato leaf curling virus (VLCK) is used as the icosahedral low-copy phloem-restricted plant virus can be obtained using the plasmid TVCV-PLRV-CP.
Объектом изобретения является также способ получения антисыворотки к природным изолятам ВСЛК, включающий иммунизацию животных препаратом, полученным вышеуказанным способом с использованием плазмиды TVCV-PLRV-CP.The object of the invention is also a method for producing antiserum for natural isolates of VLK, including immunization of animals with a preparation obtained by the above method using plasmid TVCV-PLRV-CP.
Объектами изобретения являются также антисыворотка к природным изолятам вируса скручивания листьев картофеля, полученная вышеуказанным способом, и применение такой антисыворотки для диагностики инфицированных природными изолятами ВСЛК растений.Objects of the invention are also an antiserum to natural isolates of the potato leaf twisting virus obtained by the above method, and the use of such antiserum for the diagnosis of plants infected with natural isolates of VSLA.
ВСЛК вызывает снижение урожайности картофеля от 20% до 70% в зависимости от устойчивости сорта картофеля и количества тли. Клубни, собранные от больных растений, более мелкие и имеют сетчатый некроз сосудистой системы (Фиг. 1), то есть теряют товарный вид и плохо хранятся. Вторичная инфекция, которая происходит при выращивании картофеля из зараженных клубней, приводит к еще большим потерям.VSLK causes a decrease in potato yields from 20% to 70%, depending on the stability of the potato variety and the number of aphids. Tubers collected from diseased plants are smaller and have net necrosis of the vascular system (Fig. 1), that is, they lose their presentation and are poorly stored. The secondary infection that occurs when growing potatoes from infected tubers results in even greater losses.
Вирус передается с помощью тлей и является флоэмно-ограниченным, в связи с чем, крайне плохо накапливается в растении, т.к. доля флоэмной ткани составляет десятые доли процента от общего числа клеток, в которых могут накапливаться другие вирусы растений, такие как тобамовирусы. Из-за некротизации флоэмы (проводящих пучков) отмирают черешки листьев и стебель растения, которое быстро из-за этого погибает. Из одного килограмма зараженного материала можно получить всего от 0.4 до 1.3 мг вируса. The virus is transmitted by aphids and is phloem-limited, and therefore, accumulates extremely poorly in the plant, because the proportion of phloem tissue is tenths of a percent of the total number of cells in which other plant viruses, such as tobamoviruses, can accumulate. Due to the necrotization of the phloem (conducting bundles), the petioles of the leaves and the stem of the plant die, which quickly dies because of this. From one kilogram of infected material, only 0.4 to 1.3 mg of the virus can be obtained.
Основная проблема получения препаративных количеств ВСЛК состоит в его эффективной экстракции из жестких проводящих пучков и очистке от примесей совыделяющихся растительных белков. Например, в работе A. Poison «Purification of Potato Leaf Roll Virus» // Preparative Biochemistry, 1993. - V.23, N 1-2. P.267-271, приводятся данные по эффективной очистке ВСЛК, который был выделен из заражённых растений. Эффективность метода заключается в получении препарата вируса со степенью очистки более 20%. При этом общее количество ВСЛК остаётся на уровне 1,3 мг вируса на 1 кг заражённого растительного материала. Такая чистота препарата совершенно недостаточна для иммунизации с целью получения антисыворотки к вирусу для ее последующего использования в диагностике зараженного картофеля.The main problem of obtaining preparative amounts of VBLK is its effective extraction from hard conducting bundles and purification of impurities of co-occurring plant proteins. For example, in A. Poison "Purification of Potato Leaf Roll Virus" // Preparative Biochemistry, 1993. - V.23, N 1-2. P.267-271, provides data on the effective purification of VLCK that has been isolated from infected plants. The effectiveness of the method is to obtain a virus preparation with a degree of purification of more than 20%. At the same time, the total number of AFL remains at the level of 1.3 mg of virus per 1 kg of infected plant material. Such a purity of the drug is completely insufficient for immunization in order to obtain antiserum for the virus for its subsequent use in the diagnosis of infected potatoes.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ BACKGROUND
Для получения больших количеств белка оболочки ВСЛК, годного для иммунизации было предпринято несколько попыток его экспрессии в E. coli. Следует заметить, что в E. coli белок оболочки ВСЛК накапливается плохо, в том числе и из-за содержания большого количества редких для бактерии кодирующих аминокислоты триплетов. Блок из двух и более редких кодонов, идущих подряд в начале последовательности, почти непроходим для прокариотической рибосомы. Ниже приведен анализ редких кодонов в гене белка оболочки ВСЛК, выполненный в программе RACC (http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/).In order to obtain large amounts of VLA coat protein suitable for immunization, several attempts were made to express it in E. coli. It should be noted that in E. coli, the protein of the HFCL envelope accumulates poorly, including due to the content of a large number of triplets, which are rare for bacteria and encoding amino acids. A block of two or more rare codons running in a row at the beginning of the sequence is almost impassable for a prokaryotic ribosome. Below is an analysis of the rare codons in the gene for the envelope protein of VLK performed in the RACC program (http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/).
RaCC results: RaCC results:
Жирным шрифтом и прописными буквами выделены редкие кодоны Arg: AGG, AGA, CGA Rare Arg codons are highlighted in bold and in capital letters: AGG, AGA, CGA
Жирным шрифтом и прописными буквами курсивом выделен редкий кодон Leu: CTA The rare Leu codon: CTA is in bold and in capital letters in italics
Прописными буквами выделен редкий кодон Ile: ATA The rare codon Ile: ATA is capitalized
Прописными буквами курсивом выделен редкий кодон Pro: CCC Rare codon Pro: CCC in italics in italics
atg agt acg gtc gtg gtt aaa gga aat gtc aat ggt ggt gca cac caa cca AGA AGG CGA AGA AGG caa tcc ctt cgc AGG cgc gct aac AGA gtt cag cca gtg gtt atg gtc acg gcc cct ggg caa CCC AGG cgc CGA AGA cgc AGA AGA gga ggc aat cgc cgc tca aga aga act gga gtt CCC CGA gga CGA ggc tca agc gag aca ttc gtg ttt aca aag gac aac ctc atg ggc aac tcc caa gga agt ttc acc ttc ggg ccg agt CTA tca gac tgt ccg gca ttc aag gat gga ATA ctc aag gcc tac cat gag tat aag atc aca agc atc tta ctt cag ttc gtc agc gag gcc tct tcc acc tcc tcc ggt tcc atc gct tat gag ttg gac CCC cat tgc aaa gta tca tcc ctc cag tcc tac gtc aac aag ttc caa att acg aag ggc ggc gcc aaa att tat caa gcg cgg atg ATA aac ggg gta gaa tgg cac gat tct tct gag gat cag tgc cgg ATA ctg tgg aag gga aat gga aaa tct tca gat acc gca gga tcc ttc AGA gtc acc att AGG gtg gct ttg caa aac CCC aaaatg agt acg gtc gtg gtt aaa gga aat gtc aat ggt ggt gca cac caa cca AGA AGG CGA AGA AGG caa tcc ctt cgc AGG cgc gct aac AGA gtt cag cca gtg gtt atg gtc acg gcc cct gG cga cg gca cacc CC AGA gga ggc aat cgc cgc tca aga aga act gga gtt CCC CGA gga CGA ggc tca agc gag aca ttc gtg ttt aca aag gac aac ctc atg ggc aac tcc caa gga agt ttc acc ttc ggg ccg agt ct ttc gta ctg gat gga ATA ctc aag gcc tac cat gag tat aag atc aca agc atc tta ctt cag ttc gtc agc gag gcc tct tcc acc tcc tcc ggt tcc atc gct tat gag ttg gac CCC cat tgc aaa gta tca tcc ctc cag tag cc tag cag tag ccc tag cag tac cag tag ccc tag cag tag ttc caa att acg aag ggc ggc gcc aaa att tat caa gcg cgg atg ATA aac ggg gta gaa tgg cac gat tct tct gag gat cag tgc cgg ATA ctg tgg aag gga aat gga aaa tct tca gat acc gca gga gt tga gt tga tg AGG gtg gct ttg caa aac CCC aaa
Однако этот рекомбинантный белок накапливается в клетках E. coli в виде телец включения, которые необходимо растворять в хаотропных агентах для последующей ренатурации белка. Выход растворимого белка после ренатурации составляет несколько процентов с неизвестной конформацией, что ухудшает его иммунологические свойства. Кроме того, если белок оболочки не собрать потом в вирусный капсид, то антитела будут нарабатываться и на ту часть белка, которая у вируса находится внутри капсида (внутренняя поверхность). Такие антитела будут бесполезны в ИФА. Нужно упомянуть, что вирусные икосаэдры обладают большей иммуногенностью, чем отдельные капсомеры и имеют несколько другие антигенные детерминанты по сравнению со свободным белком из-за изменения конформации в процессе сборки в вирион. Можно экспрессировать в E. coli не весь белок оболочки, а только эпитопы, состоящие из нескольких аминокислот, которые расположены на поверхности икосаэдра. However, this recombinant protein accumulates in E. coli cells as inclusion bodies, which must be dissolved in chaotropic agents for subsequent protein renaturation. The yield of soluble protein after renaturation is several percent with an unknown conformation, which impairs its immunological properties. In addition, if the sheath protein is not then assembled into a viral capsid, then antibodies will be produced on that part of the protein that is located inside the capsid of the virus (inner surface). Such antibodies will be useless in ELISA. It should be noted that viral icosahedrons have greater immunogenicity than individual capsomeres and have slightly different antigenic determinants compared to free protein due to changes in conformation during assembly into the virion. It is possible to express in E. coli not the entire membrane protein, but only epitopes consisting of several amino acids that are located on the surface of the icosahedron.
Европейским патентом EP1758925 “RECOMBINANT ICOSAHEDRAL VIRUS LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PSEUDOMONADS” защищено право на использование технологии получения рекомбинантных частиц икосаэдрических вирусов в результате клеточной экспрессии капсидных белков таких вирусов в псевдомонадах в условиях in vivo.European patent EP1758925 “RECOMBINANT ICOSAHEDRAL VIRUS LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PSEUDOMONADS” protects the right to use the technology for producing recombinant particles of icosahedral viruses as a result of cell expression of capsid proteins of such viruses in pseudomonads in vivo.
Всего на тему получения химерных вирусных частиц, в том числе для разработки иммунохимических технологий диагностики ВСЛК, нами обнаружено 9 патентов и 11 печатных работ. На наш взгляд, существующие аналоги разработанного нами способа получения препаративных количеств антигенов флоэмно ограниченных вирусов, не позволяют получать ВСЛК более 1,3 мг вируса на 1 кг заражённого растительного материала.In total, on the subject of obtaining chimeric viral particles, including for the development of immunochemical technologies for the diagnosis of AFL, we discovered 9 patents and 11 publications. In our opinion, the existing analogues of the method we have developed for the preparation of preparative amounts of phloemno-limited virus antigens do not allow the production of VLK more than 1.3 mg of the virus per 1 kg of infected plant material.
Однако массовую диагностику зараженности сельскохозяйственных растений традиционно проводят методами иммунохимической или иммуноферментной молекулярной диагностики, в которых используются антисыворотки или антитела к вирусному антигену. В связи с чем является актуальной разработка способов получения препаративных количеств вирусных частиц, имитирующих вирионы ВСЛК, необходимых для получения антисыворотки к ВСЛК. However, mass diagnosis of infection of agricultural plants is traditionally carried out by immunochemical or enzyme immunoassay methods, which use antisera or antibodies to the viral antigen. In this connection, it is urgent to develop methods for producing preparative amounts of viral particles that mimic the VSLK virions needed to obtain antiserum for VSLK.
Поскольку иммуногенность цельных вирусных икосаэдров самая высокая, была поставлена задача обеспечения сборки вириона ВСЛК в нативных для него условиях, а именно в растениях. Для хорошего накопления продукта с помощью вирусного вектора необходимо, чтобы вектор имел эффективную полимеразу для амплификации генома, транспортный белок, функционирование которого не зависело бы от собственного белка оболочки. Кроме того, ген белка оболочки должен иметь эффективный промотер. Важно, что экспрессируемый белок оболочки должен быть способен инкапсидировать чужую (векторную) РНК, т.е. не зависеть от ориджина («точки» начала) сборки или иметь его в своей нуклеотидной последовательности. Наиболее полно этим условиям соответствует тобамовирусный вектор на основе TVCV. Таким образом, для решения поставленной задачи ген белка оболочки ВСЛК экспрессировали с помощью тобамовирусного вектора. Since the immunogenicity of whole viral icosahedrons is the highest, the task was to ensure the assembly of the VLK virion under native conditions for it, namely in plants. For good product accumulation using a viral vector, the vector must have an effective polymerase for amplification of the genome, a transport protein, the functioning of which would not depend on its own envelope protein. In addition, the coat protein gene must have an effective promoter. It is important that the expressed coat protein must be able to encapsulate foreign (vector) RNA, i.e. not depend on the origin (“point” of the beginning) of the assembly or have it in its nucleotide sequence. Tobamovirus vector based on TVCV most fully corresponds to these conditions. Thus, to solve the problem, the gene for the envelope protein of VLA was expressed using a tobamovirus vector.
СОЗДАНИЕ ХИМЕРНОЙ ПЛАЗМИДЫ CREATION OF A CHIMERIC PLASMID
Для решения поставленной задачи были использованы генно-инженерные подходы. Разработана оригинальная генноинженерная конструкция рекомбинантная ДНК, способная экспрессировать РНК тобамовируса и капсидный белок ВСЛК.To solve this problem, genetic engineering approaches were used. An original recombinant DNA construct capable of expressing tobamovirus RNA and the CBCL capsid protein has been developed.
Элементы конструкции плазмиды TVCV-PLRV-CP Design Elements of the plasmid TVCV-PLRV-CP
/обозначение="RB-right border T-DNA repeat" / notation = "RB-right border T-DNA repeat"
247- Элемент конструкции 272247- Design Element 272
Необходим для переноса ДНК из агробактерии в ядро растительной клетки.It is necessary for the transfer of DNA from agrobacteria to the nucleus of a plant cell.
Элемент конструкции 1313-2313Design Element 1313-2313
/обозначение="STA region from pVS1 plasmid" / designation = "STA region from pVS1 plasmid"
Функция - обеспечивает стабильность плазмиды в клетке Agrobacterium tumefaciens.Function - ensures the stability of the plasmid in the Agrobacterium tumefaciens cell.
Элемент конструкции 2906-3906Design Element 2906-3906
/обозначение="pVS1-REP; replication origin from pVS1" / notation = "pVS1-REP; replication origin from pVS1"
Функция - репликация плазмиды в клетках Agrobacterium tumefaciens.Function - plasmid replication in Agrobacterium tumefaciens cells.
Элемент конструкции 4316-4576Element 4316-4576
/обозначение="bom site from pBR322" (basis of mobilization) / notation = "bom site from pBR322" (basis of mobilization)
Функция - перенос ДНК с помощью коньюгации у E. coli.Function - DNA transfer by conjugation in E. coli.
Элемент конструкции 4716-4996Element 4716-4996
/обозначение="pBR322 origin of replication" / notation = "pBR322 origin of replication"
Функция - репликация плазмиды в клетках E. coli.Function - plasmid replication in E. coli cells.
Элемент конструкции 5287-6081Design Element 5287-6081
/обозначение="Km-aminoglycoside phosphotransferase" - фермент, который обеспечивает устойчивость к антибиотику канамицину, необходимую для селекции целевых клеток E.coli, устойчивых к канамицину. / designation = "Km-aminoglycoside phosphotransferase" is an enzyme that provides antibiotic resistance to kanamycin, necessary for the selection of target kanamycin resistant E. coli cells.
Первичная структура фермента: «MAKMRISPELKKLIEKYRCVKDTEGMSPAKVYKLVGENENLYLKMTDSRYKGTTYDVEREKDMMLWLEGKLPVPKVLHFERHDGWSNLLMSEADGVLCSEEYEDEQSPEKIIELYAECIRLFHSIDISDCPYTNSLDSRLAELDYLLNNDLADVDCENWEEDTPFKDPRELYDFLKTEKPEEELVFSHGDLGDSNIFVKDGKVSGFIDLGRSGRADKWYDIAFCVRSIREDIGEEQYVELFFDLLGIKPDWEKIKYYILLDELF»The primary structure of the enzyme: «MAKMRISPELKKLIEKYRCVKDTEGMSPAKVYKLVGENENLYLKMTDSRYKGTTYDVEREKDMMLWLEGKLPVPKVLHFERHDGWSNLLMSEADGVLCSEEYEDEQSPEKIIELYAECIRLFHSIDISDCPYTNSLDSRLAELDYLLNNDLADVDCENWEEDTPFKDPRELYDFLKTEKPEEELVFSHGDLGDSNIFVKDGKVSGFIDLGRSGRADKWYDIAFCVRSIREDIGEEQYVELFFDLLGIKPDWEKIKYYILLDELF»
Элемент конструкции 6506-6531Design Element 6506-6531
/обозначение="LB-left border repeat" / notation = "LB-left border repeat"
Необходим для переноса ДНК из агробактерии в ядро растительной клетки.It is necessary for the transfer of DNA from agrobacteria to the nucleus of a plant cell.
Элемент конструкции 6598-6783Design Element 6598-6783
/обозначение="CaMV 3'UTR " / designation = "CaMV 3'UTR"
Функция - терминатор транскрипции.Function - transcription terminator.
Элемент конструкции 1-168Design Element 1-168
/обозначение="LacZ alpha fragment" / designation = "LacZ alpha fragment"
Функция - лактозный оперон с сайтами рестрикции.Function - lactose operon with restriction sites.
Элемент конструкции 6812-7598Design Element 6812-7598
/обозначение="AtAct2Prom" / notation = "AtAct2Prom"
Функция - промотор транскрипции для клеточной РНК-полимеразы II гена актина из арабидопсиса (Arabidopsis thaliana).The function is a transcription promoter for cellular RNA polymerase II of the actin gene from Arabidopsis (Arabidopsis thaliana).
Элемент конструкции 7667-12469Design Element 7667-12469
/обозначение="RdRp" Функция-РНК-зависимая РНК-полимераза, функция-размножение РНК вируса. / designation = "RdRp" Function-RNA-dependent RNA polymerase, function-multiplication of the RNA of the virus.
Первичная структура фермента: «MAQFQQTIDMQTLQAAAGRNSLVNDLASRRVYDNAVEELNARSRRPKVHFSKAVSTEQTLIATNAYPEFEISFTHTQSAVHSLAGGLRSLELEYLMMQVPFGSLTYDIGGNFSAHLFKGRDYVHCCMPNLDVRDIARHEGHKEAIYSYVNRLKRQQRPVPEYQRAAFNNYAENPHFVHCDKPFQQCELTTAYGTDTYAVALHSIYDIPVEEFGSALLRKNVKTCFAAFHFHENMLLDCDTVTLDEIGATFQKSGDNLSFFFHNESTLNYTHSFSNIIKYVCKTFFPASQRFVYHKEFLVTRVNTWYCKFTRVDTFTLFRGVYHNNVDCEEFYKAMDDAWHYKKTLAMLNAERTIFKDNAALNFWFPKVRDMVIVPLFDASITTGRMSRREIMVNKDFVYTVLNHIKTYQAKALTYANVLSFVESIRSRVIINGVTARSEWDTDKAILGPLAMTFFLITKLGHVQDEIILKKFQKFDRTTNELIWTSLCDALMGVIPSVKETLVRGGFVKVAEQALEIKVPELYCTFADRLVLQYKKAEEFQSCDLSKPLEESEKYYNALSELSVLENLDSFDLEAFKTLCQQKNVDPDMAAKVVVAIMKSELTLPFKKPTEEEISESLKPGEGSCAEHKEVLSLQNDAPFPCVKNLVEGSVPAYGMCPKGGGFDKLDVDIADFHLKSVDAVKKGTMMSAVYTGSIKVQQMKNYIDYLSASLAATVSNLCKVLRDVHGVDPESQEKSGVWDVRRGRWLLKPNAKSHAWGVAEDANHKLVIVLLNWDDGKPVCDETWFRVAVSSDSLIYSDMGKLKTLTSCSPNGEPPEPNAKVILVDGVPGCGKTKEIIEKVNFSEDLILVPGKEASKMIIRRANQAGVIRADKDNVRTVDSFLMHPSRRVFKRLFIDEGLMLHTGCVNFLLLLSQCDVAYVYGDTKQIPFICRVANFPYPAHFAKLVADEKEVRRVTLRCPADVTYFLNKKYDGAVMCTSAVERSVKAEVVRGKGALNPITLPLEGKILTFTQADKFELLEKGYKDVNTVHEVQGETYEKTAIVRLTSTPLEIISSASPHVLVALTRHTTCCKYYTVVLDPMVNVISEMEKLSNFLLDMYRVEAGVQYQLQIDAVFRDSNLFVQTPKSGDWRDMQFYYDALLPGNSTILNEFDAVTMNLRDISLNVKDCRIDFSKSVQLPKEQPIFLKPKIRTAAEMPRTAGLLENLVAMIKRNMNAPDLTGTIDIEDTASLVVEKFWDSYVDKEFSGTNEMTMTRESFSRWLSKQESSTVGQLADFNFVDLPAVDEYKHMIKSQPKQKLDLSIQDEYPALQTIVYHSKKINAIFGPMFSELTRMLLERIDSSKFLFYTRKTPAQIEDFFSDLDSTQAMEILELDISKYDKSQNEFHCAVEYKIWEKLGIDEWLAEVWKQGHRKTTLKDYTAGVKTCLWYQRKSGDVTTFIGNTIIIAACLSSMIPMDKVIKAAFCGDDSLIYIPKGLDLPDIQAGANLMWNFEAKLFRKKYGYFCGRYVIHHDRGAIVYYDPLKLISKLGCKHIRDVVHLEELRESLCDVASNLNNCAYFSQLDEAVAEVHKTAVGGSFAFCSIIKYLSDKRLFRDLFFV»The primary structure of the enzyme: «MAQFQQTIDMQTLQAAAGRNSLVNDLASRRVYDNAVEELNARSRRPKVHFSKAVSTEQTLIATNAYPEFEISFTHTQSAVHSLAGGLRSLELEYLMMQVPFGSLTYDIGGNFSAHLFKGRDYVHCCMPNLDVRDIARHEGHKEAIYSYVNRLKRQQRPVPEYQRAAFNNYAENPHFVHCDKPFQQCELTTAYGTDTYAVALHSIYDIPVEEFGSALLRKNVKTCFAAFHFHENMLLDCDTVTLDEIGATFQKSGDNLSFFFHNESTLNYTHSFSNIIKYVCKTFFPASQRFVYHKEFLVTRVNTWYCKFTRVDTFTLFRGVYHNNVDCEEFYKAMDDAWHYKKTLAMLNAERTIFKDNAALNFWFPKVRDMVIVPLFDASITTGRMSRREIMVNKDFVYTVLNHIKTYQAKALTYANVLSFVESIRSRVIINGVTARSEWDTDKAILGPLAMTFFLITKLGHVQDEIILKKFQKFDRTTNELIWTSLCDALMGVIPSVKETLVRGGFVKVAEQALEIKVPELYCTFADRLVLQYKKAEEFQSCDLSKPLEESEKYYNALSELSVLENLDSFDLEAFKTLCQQKNVDPDMAAKVVVAIMKSELTLPFKKPTEEEISESLKPGEGSCAEHKEVLSLQNDAPFPCVKNLVEGSVPAYGMCPKGGGFDKLDVDIADFHLKSVDAVKKGTMMSAVYTGSIKVQQMKNYIDYLSASLAATVSNLCKVLRDVHGVDPESQEKSGVWDVRRGRWLLKPNAKSHAWGVAEDANHKLVIVLLNWDDGKPVCDETWFRVAVSSDSLIYSDMGKLKTLTSCSPNGEPPEPNAKVILVDGVPGCGKTKEIIEKVNFSEDLILVPGKEASKMIIRRANQAGVIRADKDNVRTVDSFLMHPSRRVFKRLFIDEGLMLHTGCVNFLLLLSQCDVAYVYGDTKQIPFICRVANFPYPAH FAKLVADEKEVRRVTLRCPADVTYFLNKKYDGAVMCTSAVERSVKAEVVRGKGALNPITLPLEGKILTFTQADKFELLEKGYKDVNTVHEVQGETYEKTAIVRLTSTPLEIISSASPHVLVALTRHTTCCKYYTVVLDPMVNVISEMEKLSNFLLDMYRVEAGVQYQLQIDAVFRDSNLFVQTPKSGDWRDMQFYYDALLPGNSTILNEFDAVTMNLRDISLNVKDCRIDFSKSVQLPKEQPIFLKPKIRTAAEMPRTAGLLENLVAMIKRNMNAPDLTGTIDIEDTASLVVEKFWDSYVDKEFSGTNEMTMTRESFSRWLSKQESSTVGQLADFNFVDLPAVDEYKHMIKSQPKQKLDLSIQDEYPALQTIVYHSKKINAIFGPMFSELTRMLLERIDSSKFLFYTRKTPAQIEDFFSDLDSTQAMEILELDISKYDKSQNEFHCAVEYKIWEKLGIDEWLAEVWKQGHRKTTLKDYTAGVKTCLWYQRKSGDVTTFIGNTIIIAACLSSMIPMDKVIKAAFCGDDSLIYIPKGLDLPDIQAGANLMWNFEAKLFRKKYGYFCGRYVIHHDRGAIVYYDPLKLISKLGCKHIRDVVHLEELRESLCDVASNLNNCAYFSQLDEAVAEVHKTAVGGSFAFCSIIKYLSDKRLFRDLFFV »
Элемент конструкции 12475-13227Design Element 12475-13227
/обозначение="MP" прим. 17 аминокислотных остатков удалены на С-конце белка. Транспортный белок, функция - распространение вируса по растению/ designation = "MP" approx. 17 amino acid residues are deleted at the C-terminus of the protein. Transport protein, function - the spread of the virus in the plant
Первичная структура белка:Primary protein structure:
«MSIVSYEPKVSDFLNLSKKEEILPKALTRLKTVSISTKDIISVKESETLCDIDLLINVPLDKYRYVGILGAVFTGEWLVPDFVKGGVTISVIDKRLVNSKECVIGTYRAAAKSKRFQFKLVPNYFVSTVDAKRKPWQVHVRIQDLKIEAGWQPLALEVVSVAMVTNNVVMKGLREKVVAINDPDVEGFEGVVDEFVDSVAAFKAVDNFRKRKKKVEERDVVSKYKYRPEKYAGPDSFNLKEENVLQHYKPE»«MSIVSYEPKVSDFLNLSKKEEILPKALTRLKTVSISTKDIISVKESETLCDIDLLINVPLDKYRYVGILGAVFTGEWLVPDFVKGGVTISVIDKRLVNSKECVIGTYRAAAKSKRFQFKLVPNYFVSTVDAKRKPWQVHVRIQDLKIEAGWQPLALEVVSVAMVTNNVVMKGLREKVVAINDPDVEGFEGVVDEFVDSVAAFKAVDNFRKRKKKVEERDVVSKYKYRPEKYAGPDSFNLKEENVLQHYKPE»
Элемент конструкции 13244-13867Design Element 13244-13867
/обозначение="CP" Капсидный белок вируса ВСЛК, функция-упаковка вирусной РНК в вирион. / designation = "CP" Capsid protein of the AFLV virus, the function is the packaging of viral RNA in a virion.
Первичная структура белка:Primary protein structure:
«MSTVVVKGNLNRGAHQPRRRRRQSLRRRANRVQPVVMVTAPGQPRRRRRRRGGNRRSRRTGVPRGRGSSETFVFTKDNLMGNSQGSFTFGPSLSDCPAFKDGILKAYHEYKITSILLQFVSEASSTSSGSIAYELDPHCKVSSLQSYVNKFQITKGGAKIYQARMINGVEWHDSSEDQCRILWKGNGKSSDTAGSFRVTIRVALQNPK»«MSTVVVKGNLNRGAHQPRRRRRQSLRRRANRVQPVVMVTAPGQPRRRRRRRGGNRRSRRTGVPRGRGSSETFVFTKDNLMGNSQGSFTFGPSLSDCPAFKDGILKAYHEYKITSILLQFVSEASSTSSGSIAYELDPHCKVSSLQSYVNKFQITKGGAKIYQARMINGVEWHDSSEDQCRILWKGNGKSSDTAGSFRVTIRVALQNPK»
Элемент конструкции 13884-14118Design Element 13884-14118
/обозначение="3'NTR" / designation = "3'NTR"
3'-нетранслируемя часть вируса TVCV, необходимая для репликации вирусной РНК вирусной полимеразой.The 3'-untranslated portion of the TVCV virus required for viral RNA replication by viral polymerase.
Элемент конструкции 14141-14410Element 14141-14410
/обозначение="nosT" / notation = "nosT"
Функция - терминатор транскрипции клеточной полимеразы II.Function - terminator of transcription of cell polymerase II.
1 agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa 1 agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa
61 cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc 61 cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc
121 accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc 121 accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc
181 ttggatcaga ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga caggatatat 181 ttggatcaga ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga caggatatat
241 tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt aaaagggcgt 241 tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt aaaagggcgt
301 gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tcccctcggg 301 gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tcccctcggg
361 atcaaagtac tttgatccaa cccctccgct gctatagtgc agtcggcttc tgacgttcag 361 atcaaagtac tttgatccaa cccctccgct gctatagtgc agtcggcttc tgacgttcag
421 tgcagccgtc ttctgaaaac gacatgtcgc acaagtccta agttacgcga caggctgccg 421 tgcagccgtc ttctgaaaac gacatgtcgc acaagtccta agttacgcga caggctgccg
481 ccctgccctt ttcctggcgt tttcttgtcg cgtgttttag tcgcataaag tagaatactt 481 ccctgccctt ttcctggcgt tttcttgtcg cgtgttttag tcgcataaag tagaatactt
541 gcgactagaa ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc ctgctgggct 541 gcgactagaa ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc ctgctgggct
601 atgcccgcgt cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa ctgcacgcgg 601 atgcccgcgt cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa ctgcacgcgg
661 ccggctgcac caagctgttt tccgagaaga tcaccggcac caggcgcgac cgcccggagc 661 ccggctgcac caagctgttt tccgagaaga tcaccggcac caggcgcgac cgcccggagc
721 tggccaggat gcttgaccac ctacgccctg gcgacgttgt gacagtgacc aggctagacc 721 tggccaggat gcttgaccac ctacgccctg gcgacgttgt gacagtgacc aggctagacc
781 gcctggcccg cagcacccgc gacctactgg acattgccga gcgcatccag gaggccggcg 781 gcctggcccg cagcacccgc gacctactgg acattgccga gcgcatccag gaggccggcg
841 cgggcctgcg tagcctggca gagccgtggg ccgacaccac cacgccggcc ggccgcatgg 841 cgggcctgcg tagcctggca gagccgtggg ccgacaccac cacgccggcc ggccgcatgg
901 tgttgaccgt gttcgccggc attgccgagt tcgagcgttc cctaatcatc gaccgcaccc 901 tgttgaccgt gttcgccggc attgccgagt tcgagcgttc cctaatcatc gaccgcaccc
961 ggagcgggcg cgaggccgcc aaggcccgag gcgtgaagtt tggcccccgc cctaccctca 961 ggagcgggcg cgaggccgcc aaggcccgag gcgtgaagtt tggcccccgc cctaccctca
1021 ccccggcaca gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc accgtgaaag 1021 ccccggcaca gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc accgtgaaag
1081 aggcggctgc actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt gagcgcagcg 1081 aggcggctgc actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt gagcgcagcg
1141 aggaagtgac gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac gcattgaccg 1141 aggaagtgac gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac gcattgaccg
1201 aggccgacgc cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca 1201 aggccgacgc cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca
1261 ccaggacggc caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg agatgatcgc 1261 ccaggacggc caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg agatgatcgc
1321 ggccgggtac gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct 1321 ggccgggtac gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct
1381 ggccggtttg tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac 1381 ggccggtttg tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac
1441 cgagcgccgc cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt 1441 cgagcgccgc cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt
1501 cgctgcgtat atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt 1501 cgctgcgtat atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt
1561 atcgctgtac ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc 1561 atcgctgtac ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc
1621 cgcgccctgc aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt 1621 cgcgccctgc aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt
1681 gcccgcgatt gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc 1681 gcccgcgatt gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc
1741 ccgacgattg accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga 1741 ccgacgattg accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga
1801 gcgccccagg cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt 1801 gcgccccagg cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt
1861 ccggtgcagc caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag 1861 ccggtgcagc caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag
1921 cagcgcattg aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc 1921 cagcgcattg aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc
1981 aaaggcacgc gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt 1981 aaaggcacgc gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt
2041 cttgagtccc gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc 2041 cttgagtccc gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc
2101 gttcttgaat cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa 2101 gttcttgaat cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa
2161 attaaatcaa aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca 2161 attaaatcaa aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca
2221 cgctaagtgc cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg 2221 cgctaagtgc cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg
2281 cagacacgcc agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc 2281 cagacacgcc agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc
2341 tgaagatgta cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg 2341 tgaagatgta cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg
2401 cgcagctacc agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa 2401 cgcagctacc agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa
2461 ggaggcggca tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt 2461 ggaggcggca tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt
2521 ggaggaacgg gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc 2521 ggaggaacgg gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc
2581 actggaaccc ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca 2581 actggaaccc ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca
2641 aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca 2641 aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca
2701 gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg 2701 gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg
2761 aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc 2761 aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc
2821 caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga 2821 caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga
2881 tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg 2881 tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg
2941 cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg 2941 cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg
3001 catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc 3001 catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc
3061 catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt 3061 catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt
3121 tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt 3121 tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt
3181 agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa 3181 agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa
3241 gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt 3241 gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt
3301 aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg 3301 aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg
3361 cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat 3361 cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat
3421 cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga 3421 cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga
3481 agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa 3481 agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa
3541 gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa 3541 gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa
3601 ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg 3601 ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg
3661 cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg 3661 cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg
3721 ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc 3721 ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc
3781 gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc 3781 gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc
3841 acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt 3841 acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt
3901 aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac 3901 aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac
3961 agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc 3961 agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc
4021 ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa 4021 ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa
4081 tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg 4081 tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg
4141 caccctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 4141 caccctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg
4201 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 4201 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt
4261 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag 4261 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag
4321 tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg 4321 tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg
4381 gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc 4381 gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc
4441 ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 4441 ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc
4501 aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 4501 aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc
4561 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 4561 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag
4621 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 4621 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc
4681 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 4681 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt
4741 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 4741 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct
4801 ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 4801 ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg
4861 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 4861 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct
4921 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 4921 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat
4981 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 4981 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg
5041 ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 5041 ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa
5101 aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 5101 aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt
5161 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 5161 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc
5221 tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc 5221 tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc
5281 taggtactaa aacaattcat ccagtaaaat ataatatttt attttctccc aatcaggctt 5281 taggtactaa aacaattcat ccagtaaaat ataatatttt attttctccc aatcaggctt
5341 gatccccagt aagtcaaaaa atagctcgac atactgttct tccccgatat cctccctgat 5341 gatccccagt aagtcaaaaa atagctcgac atactgttct tccccgatat cctccctgat
5401 cgaccggacg cagaaggcaa tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc 5401 cgaccggacg cagaaggcaa tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc
5461 aataaagcca cttactttgc catctttcac aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg 5461 aataaagcca cttactttgc catctttcac aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg
5521 ggaaaagaca agttcctctt cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg 5521 ggaaaagaca agttcctctt cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg
5581 atctttaaat ggagtgtctt cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt 5581 atctttaaat ggagtgtctt cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt
5641 cagtaagtaa tccaattcgg ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga 5641 cagtaagtaa tccaattcgg ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga
5701 tatgtcgatg gagtgaaaga gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg 5701 tatgtcgatg gagtgaaaga gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg
5761 gctttgttca tcttcatact cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag 5761 gctttgttca tcttcatact cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag
5821 attgctccag ccatcatgcc gttcaaagtg caggaccttt ggaacaggca gctttccttc 5821 attgctccag ccatcatgcc gttcaaagtg caggaccttt ggaacaggca gctttccttc
5881 cagccatagc atcatgtcct tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt tataccggct 5881 cagccatagc atcatgtcct tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt tataccggct
5941 gtccgtcatt tttaaatata ggttttcatt ttctcccacc agcttatata ccttagcagg 5941 gtccgtcatt tttaaatata ggttttcatt ttctcccacc agcttatata ccttagcagg
6001 agacattcct tccgtatctt ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg 6001 agacattcct tccgtatctt ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg
6061 tgatattctc attttagcca tttattattt ccttcctctt ttctacagta tttaaagata 6061 tgatattctc attttagcca tttattattt ccttcctctt ttctacagta tttaaagata
6121 ccccaagaag ctaattataa caagacgaac tccaattcac tgttccttgc attctaaaac 6121 ccccaagaag ctaattataa caagacgaac tccaattcac tgttccttgc attctaaaac
6181 cttaaatacc agaaaacagc tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta taacatagta 6181 cttaaatacc agaaaacagc tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta taacatagta
6241 tcgacggagc cgattttgaa accgcggtga tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac 6241 tcgacggagc cgattttgaa accgcggtga tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac
6301 aatcaacatg ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg 6301 aatcaacatg ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg
6361 ttcttccgaa tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc 6361 ttcttccgaa tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc
6421 tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc 6421 tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc
6481 ggtcggggag ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc 6481 ggtcggggag ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc
6541 ttagacaact taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa 6541 ttagacaact taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa
6601 ttcgggggat ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat 6601 ttcgggggat ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat
6661 agaagtattt tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc 6661 agaagtattt tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc
6721 gaaaccctat aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga 6721 gaaaccctat aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga
6781 aactcgaaat tcgagctcgg taccacgcgt ttcgacaaaa tttagaacga acttaattat 6781 aactcgaaat tcgagctcgg taccacgcgt ttcgacaaaa tttagaacga acttaattat
6841 gatctcaaat acattgatac atatctcatc tagatctagg ttatcattat gtaagaaagt 6841 gatctcaaat acattgatac atatctcatc tagatctagg ttatcattat gtaagaaagt
6901 tttgacgaat atggcacgac aaaatggcta gactcgatgt aattggtatc tcaactcaac 6901 tttgacgaat atggcacgac aaaatggcta gactcgatgt aattggtatc tcaactcaac
6961 attatactta taccaaacat tagttagaca aaatttaaac aactattttt tatgtatgca 6961 attatactta taccaaacat tagttagaca aaatttaaac aactattttt tatgtatgca
7021 agagtcagca tatgtataat tgattcagaa tcgttttgac gagttcggat gtagtagtag 7021 agagtcagca tatgtataat tgattcagaa tcgttttgac gagttcggat gtagtagtag
7081 ccattattta atgtacatac taatcgtgaa tagtgaatat gatgaaacat tgtatcttat 7081 ccattattta atgtacatac taatcgtgaa tagtgaatat gatgaaacat tgtatcttat
7141 tgtataaata tccataaaca catcatgaaa gacactttct ttcacggtct gaattaatta 7141 tgtataaata tccataaaca catcatgaaa gacactttct ttcacggtct gaattaatta
7201 tgatacaatt ctaatagaaa acgaattaaa ttacgttgaa ttgtatgaaa tctaattgaa 7201 tgatacaatt ctaatagaaa acgaattaaa ttacgttgaa ttgtatgaaa tctaattgaa
7261 caagccaacc acgacgacga ctaacgttgc ctggattgac tcggtttaag ttaaccacta 7261 caagccaacc acgacgacga ctaacgttgc ctggattgac tcggtttaag ttaaccacta
7321 aaaaaacgga gctgtcatgt aacacgcgga tcgagcaggt cacagtcatg aagccatcaa 7321 aaaaaacgga gctgtcatgt aacacgcgga tcgagcaggt cacagtcatg aagccatcaa
7381 agcaaaagaa ctaatccaag ggctgagatg attaattagt ttaaaaatta gttaacacga 7381 agcaaaagaa ctaatccaag ggctgagatg attaattagt ttaaaaatta gttaacacga
7441 gggaaaaggc tgtctgacag ccaggtcacg ttatctttac ctgtggtcga aatgattcgt 7441 gggaaaaggc tgtctgacag ccaggtcacg ttatctttac ctgtggtcga aatgattcgt
7501 gtctgtcgat tttaattatt tttttgaaag gccgaaaata aagttgtaag agataaaccc 7501 gtctgtcgat tttaattatt tttttgaaag gccgaaaata aagttgtaag agataaaccc
7561 gcctatataa attcatatat tttcctctcc gctttgaagt tttagtttta ttgcaacaac 7561 gcctatataa attcatatat tttcctctcc gctttgaagt tttagtttta ttgcaacaac
7621 aacaacaaat tacaataaca acaaacaaaa tacaaacaac aacaacatgg cacaatttca 7621 aacaacaaat tacaataaca acaaacaaaa tacaaacaac aacaacatgg cacaatttca
7681 acaaacaatt gacatgcaaa ctctccaagc cgctgcggga cgcaacagct tggtgaatga 7681 acaaacaatt gacatgcaaa ctctccaagc cgctgcggga cgcaacagct tggtgaatga
7741 tttggcatct cgtcgcgttt acgataatgc agtcgaggag ctgaatgctc gttccagacg 7741 tttggcatct cgtcgcgttt acgataatgc agtcgaggag ctgaatgctc gttccagacg
7801 tcccaaggtt catttctcca aggcagtgtc tacggaacag acactgattg caacaaacgc 7801 tcccaaggtt catttctcca aggcagtgtc tacggaacag acactgattg caacaaacgc
7861 atatccggag ttcgagattt cctttactca tacgcaatcc gctgtgcact ccttggccgg 7861 atatccggag ttcgagattt cctttactca tacgcaatcc gctgtgcact ccttggccgg
7921 aggccttcgg tcacttgagt tggagtatct catgatgcaa gttccgttcg gttctctgac 7921 aggccttcgg tcacttgagt tggagtatct catgatgcaa gttccgttcg gttctctgac
7981 gtacgacatc ggcggtaact tttccgcgca ccttttcaaa gggcgcgatt acgttcactg 7981 gtacgacatc ggcggtaact tttccgcgca ccttttcaaa gggcgcgatt acgttcactg
8041 ctgcatgcct aatctggatg tacgtgacat tgctcgccat gaaggacaca aggaagctat 8041 ctgcatgcct aatctggatg tacgtgacat tgctcgccat gaaggacaca aggaagctat
8101 ttacagttat gtgaatcgtt tgaaaaggca gcagcgtcct gtgcctgaat accagagggc 8101 ttacagttat gtgaatcgtt tgaaaaggca gcagcgtcct gtgcctgaat accagagggc
8161 agctttcaac aactacgctg agaacccgca cttcgtccat tgcgacaaac ctttccaaca 8161 agctttcaac aactacgctg agaacccgca cttcgtccat tgcgacaaac ctttccaaca
8221 gtgtgaattg acgacagcgt atggcactga cacctacgct gtagctctcc atagcattta 8221 gtgtgaattg acgacagcgt atggcactga cacctacgct gtagctctcc atagcattta
8281 tgatatccct gttgaggagt tcggttctgc gctactcagg aagaatgtga aaacttgttt 8281 tgatatccct gttgaggagt tcggttctgc gctactcagg aagaatgtga aaacttgttt
8341 cgcggccttt catttccatg agaatatgct tctagattgt gatacagtca cactcgatga 8341 cgcggccttt catttccatg agaatatgct tctagattgt gatacagtca cactcgatga
8401 gattggagct acttttcaga agtccggtga taatttaagt tttttctttc ataatgagag 8401 gattggagct acttttcaga agtccggtga taatttaagt tttttcttttt ataatgagag
8461 cactctcaat tacacccaca gttttagtaa tataattaag tatgtgtgta aaacgttctt 8461 cactctcaat tacacccaca gttttagtaa tataattaag tatgtgtgta aaacgttctt
8521 tcctgctagt caacggtttg tgtatcataa ggagttttta gttactagag tcaacacttg 8521 tcctgctagt caacggtttg tgtatcataa ggagttttta gttactagag tcaacacttg
8581 gtactgtaag tttacgagag tggatacttt tactcttttc cgtggtgtgt accataataa 8581 gtactgtaag tttacgagag tggatacttt tactcttttc cgtggtgtgt accataataa
8641 tgtggattgc gaagagtttt acaaggctat ggacgatgcg tggcactaca aaaagacgtt 8641 tgtggattgc gaagagtttt acaaggctat ggacgatgcg tggcactaca aaaagacgtt
8701 agcaatgctt aatgccgaga ggaccatctt caaggataac gctgcgttaa acttttggtt 8701 agcaatgctt aatgccgaga ggaccatctt caaggataac gctgcgttaa acttttggtt
8761 cccgaaagtg agagacatgg ttatcgtccc tctctttgac gcttctatca caactggtag 8761 cccgaaagtg agagacatgg ttatcgtccc tctctttgac gcttctatca caactggtag
8821 gatgtctagg agagagatta tggtgaacaa ggatttcgtt tatacggtcc taaatcacat 8821 gatgtctagg agagagatta tggtgaacaa ggatttcgtt tatacggtcc taaatcacat
8881 aaaaacgtat caagctaagg ctttaactta cgcaaatgtt ctgtcctttg tggagtctat 8881 aaaaacgtat caagctaagg ctttaactta cgcaaatgtt ctgtcctttg tggagtctat
8941 taggtctaga gtgataatta acggtgtcac tgccaggtct gaatgggaca cagacaaggc 8941 taggtctaga gtgataatta acggtgtcac tgccaggtct gaatgggaca cagacaaggc
9001 aattctaggt ccattagcaa tgacattttt ccttataaca aagttgggtc atgtgcagga 9001 aattctaggt ccattagcaa tgacattttt ccttataaca aagttgggtc atgtgcagga
9061 tgaaataatc ctgaaaaagt tccagaagtt cgacagaacc accaatgagc tgatttggac 9061 tgaaataatc ctgaaaaagt tccagaagtt cgacagaacc accaatgagc tgatttggac
9121 aagtctctgc gatgccctga tgggggttat tccctcggtc aaggagacgc ttgtgcgcgg 9121 aagtctctgc gatgccctga tgggggttat tccctcggtc aaggagacgc ttgtgcgcgg
9181 tggttttgtg aaagtagcag aacaagcctt agagataaag gttcccgagc tatactgtac 9181 tggttttgtg aaagtagcag aacaagcctt agagataaag gttcccgagc tatactgtac
9241 ctttgccgac agattggtac tacagtacaa gaaggcggag gagttccaat cgtgtgatct 9241 ctttgccgac agattggtac tacagtacaa gaaggcggag gagttccaat cgtgtgatct
9301 ttccaaacct ctagaagagt cagagaagta ctacaacgca ttatccgagc tatcagtgct 9301 ttccaaacct ctagaagagt cagagaagta ctacaacgca ttatccgagc tatcagtgct
9361 tgagaatctc gactcttttg acttagaggc gtttaagact ttatgtcagc agaagaatgt 9361 tgagaatctc gactcttttg acttagaggc gtttaagact ttatgtcagc agaagaatgt
9421 ggacccggat atggcagcaa aggtggtcgt agcaatcatg aagtcagaat tgacgttgcc 9421 ggacccggat atggcagcaa aggtggtcgt agcaatcatg aagtcagaat tgacgttgcc
9481 tttcaagaaa cctacagaag aggaaatctc ggagtcgcta aaaccaggag aggggtcgtg 9481 tttcaagaaa cctacagaag aggaaatctc ggagtcgcta aaaccaggag aggggtcgtg
9541 tgcagagcat aaggaagtgt tgagcttaca aaatgatgct ccgttcccgt gtgtgaaaaa 9541 tgcagagcat aaggaagtgt tgagcttaca aaatgatgct ccgttcccgt gtgtgaaaaa
9601 tctagttgaa ggttccgtgc cggcgtatgg aatgtgtcct aagggtggtg gtttcgacaa 9601 tctagttgaa ggttccgtgc cggcgtatgg aatgtgtcct aagggtggtg gtttcgacaa
9661 attggatgtg gacattgctg atttccatct caagagtgta gatgcagtta aaaagggaac 9661 attggatgtg gacattgctg atttccatct caagagtgta gatgcagtta aaaagggaac
9721 tatgatgtct gcggtgtaca cagggtctat caaagttcaa caaatgaaga actacataga 9721 tatgatgtct gcggtgtaca cagggtctat caaagttcaa caaatgaaga actacataga
9781 ttacttaagt gcgtcgctgg cagctacagt ctcaaacctc tgcaaggtgc ttagagatgt 9781 ttacttaagt gcgtcgctgg cagctacagt ctcaaacctc tgcaaggtgc ttagagatgt
9841 tcacggcgtt gacccagagt cacaggagaa atctggagtg tgggatgtta ggagaggacg 9841 tcacggcgtt gacccagagt cacaggagaa atctggagtg tgggatgtta ggagaggacg
9901 ttggttactt aaacctaatg cgaaaagtca cgcgtggggt gtggcagaag acgccaacca 9901 ttggttactt aaacctaatg cgaaaagtca cgcgtggggt gtggcagaag acgccaacca
9961 caagttggtt attgtgttac tcaactggga tgacggaaag ccggtttgtg atgagacatg 9961 caagttggtt attgtgttac tcaactggga tgacggaaag ccggtttgtg atgagacatg
10021 gttcagggtg gcggtgtcaa gcgattcctt gatatattcg gatatgggaa aacttaagac10021 gttcagggtg gcggtgtcaa gcgattcctt gatatattcg gatatgggaa aacttaagac
10081 gctcacgtct tgcagtccaa atggtgagcc accggagcct aacgccaaag taattttggt10081 gctcacgtct tgcagtccaa atggtgagcc accggagcct aacgccaaag taattttggt
10141 cgatggtgtt cccggttgtg gaaaaacgaa ggagattatc gaaaaggtaa acttctctga10141 cgatggtgtt cccggttgtg gaaaaacgaa ggagattatc gaaaaggtaa acttctctga
10201 agacttgatt ttagtccctg ggaaggaagc ttctaagatg atcatccgga gggccaacca10201 agacttgatt ttagtccctg ggaaggaagc tctctaagatg atcatccgga gggccaacca
10261 agctggtgtg ataagagcgg ataaggacaa tgttagaacg gtggattcct tcttgatgca10261 agctggtgtg ataagagcgg ataaggacaa tgttagaacg gtggattcct tcttgatgca
10321 tccttctaga agggtgttta agaggttgtt tatcgatgaa ggactaatgc tgcatacagg10321 tccttctaga agggtgttta agaggttgtt tatcgatgaa ggactaatgc tgcatacagg
10381 ttgtgtaaat ttcctactgc tgctatctca atgtgacgtc gcatatgtgt atggggacac10381 ttgtgtaaat ttcctactgc tgctatctca atgtgacgtc gcatatgtgt atggggacac
10441 aaagcaaatt ccgttcattt gcagagtcgc gaactttccg tatccagcgc attttgcaaa10441 aaagcaaatt ccgttcattt gcagagtcgc gaactttccg tatccagcgc attttgcaaa
10501 actcgtcgct gatgagaagg aggttagaag agttacgctc aggtgcccgg ctgatgttac10501 actcgtcgct gatgagaagg aggttagaag agttacgctc aggtgcccgg ctgatgttac
10561 gtatttcctt aacaagaagt atgacggggc ggtgatgtgt accagcgcgg tagagagatc10561 gtatttcctt aacaagaagt atgacggggc ggtgatgtgt accagcgcgg tagagagatc
10621 cgtgaaggca gaagtggtga gaggaaaggg tgcattgaac ccaataacct taccgttgga10621 cgtgaaggca gaagtggtga gaggaaaggg tgcattgaac ccaataacct taccgttgga
10681 gggtaaaatt ttgaccttca cacaagctga caagttcgag ttactggaga agggttacaa10681 gggtaaaatt ttgaccttca cacaagctga caagttcgag ttactggaga agggttacaa
10741 ggatgtgaac actgtgcacg aggtgcaagg ggagacgtac gagaagactg ctattgtgcg10741 ggatgtgaac actgtgcacg aggtgcaagg ggagacgtac gagaagactg ctattgtgcg
10801 cttgacatca actccgttag agatcatatc gagtgcgtca cctcatgttt tggtggcgct10801 cttgacatca actccgttag agatcatatc gagtgcgtca cctcatgttt tggtggcgct
10861 gacaagacac acaacgtgtt gtaaatatta caccgttgtg ttggacccga tggtgaatgt10861 gacaagacac acaacgtgtt gtaaatatta caccgttgtg ttggacccga tggtgaatgt
10921 gatttcagaa atggagaagt tgtccaattt ccttcttgac atgtatagag ttgaagcggg10921 gatttcagaa atggagaagt tgtccaattt ccttcttgac atgtatagag ttgaagcggg
10981 ggtccaatag caattacaga tcgatgcagt attcagggac agcaacttgt ttgttcagac10981 ggtccaatag caattacaga tcgatgcagt attcagggac agcaacttgt ttgttcagac
11041 gcccaagtca ggagattggc gagatatgca attttactat gacgctcttc ttcccggaaa11041 gcccaagtca ggagattggc gagatatgca attttactat gacgctcttc ttcccggaaa
11101 cagtactatt ctcaatgaat ttgatgctgt tacgatgaat ttgagggata tttccttaaa11101 cagtactatt ctcaatgaat ttgatgctgt tacgatgaat ttgagggata tttccttaaa
11161 cgtcaaagat tgcagaatcg acttctccaa atccgtgcaa cttcctaaag aacaacctat11161 cgtcaaagat tgcagaatcg acttctccaa atccgtgcaa cttcctaaag aacaacctat
11221 tttcctcaag cctaaaataa gaactgcggc agaaatgccg agaactgcag gtttgctgga11221 tttcctcaag cctaaaataa gaactgcggc agaaatgccg agaactgcag gtttgctgga
11281 aaatttggtt gcaatgatca aaagaaacat gaatgcgccg gatttgacag ggacaattga11281 aaatttggtt gcaatgatca aaagaaacat gaatgcgccg gatttgacag ggacaattga
11341 cattgaggat actgcatctc tggtggttga aaagttttgg gattcgtatg ttgacaagga11341 cattgaggat actgcatctc tggtggttga aaagttttgg gattcgtatg ttgacaagga
11401 atttagtgga acgaacgaaa tgaccatgac aagggaaagt ttttctagat ggctttcgaa11401 atttagtgga acgaacgaaa tgaccatgac aagggaaagt ttttctagat ggctttcgaa
11461 acaagagtca tctacagttg gtcagttagc ggactttaac tttgtggatt tgccggcagt11461 acaagagtca tctacagttg gtcagttagc ggactttaac tttgtggatt tgccggcagt
11521 agatgagtac aagcatatga tcaagagtca accaaagcaa aagttagact tgagtattca11521 agatgagtac aagcatatga tcaagagtca accaaagcaa aagttagact tgagtattca
11581 agacgaatat cctgcattgc agacgatagt ctaccattcg aaaaagatca atgcgatttt11581 agacgaatat cctgcattgc agacgatagt ctaccattcg aaaaagatca atgcgatttt
11641 cggtccaatg ttttcagaac ttacgaggat gttactcgaa aggattgact cttcgaagtt11641 cggtccaatg ttttcagaac ttacgaggat gttactcgaa aggattgact cttcgaagtt
11701 tctgttctac accagaaaga cacctgcaca aatagaggac ttcttttctg acctagactc11701 tctgttctac accagaaaga cacctgcaca aatagaggac ttcttttctg acctagactc
11761 aacccaggcg atggaaattc tggaactcga catttcgaag tacgataagt cacaaaacga11761 aacccaggcg atggaaattc tggaactcga catttcgaag tacgataagt cacaaaacga
11821 gttccattgt gctgtagagt acaagatctg ggaaaagtta ggaattgatg agtggctagc11821 gttccattgt gctgtagagt acaagatctg ggaaaagtta ggaattgatg agtggctagc
11881 tgaggtatgg aaacaaggac acagaaaaac gaccttgaaa gattatacgg ccggagtcaa11881 tgaggtatgg aaacaaggac acagaaaaac gaccttgaaa gattatacgg ccggagtcaa
11941 aacatgtctt tggtatcaaa ggaaaagtgg tgatgtgaca acctttattg gtaataccat11941 aacatgtctt tggtatcaaa ggaaaagtgg tgatgtgaca acctttattg gtaataccat
12001 catcattgca gcctgtttga gctcaatgat ccccatggac aaagtgataa aggcagcttt12001 catcattgca gcctgtttga gctcaatgat ccccatggac aaagtgataa aggcagcttt
12061 ttgtggagac gatagcctga tttacattcc taaaggttta gacttgcctg atattcaggc12061 ttgtggagac gatagcctga tttacattcc taaaggttta gacttgcctg atattcaggc
12121 gggcgcgaac ctcatgtgga acttcgaggc caaactcttc aggaagaagt atggttactt12121 gggcgcgaac ctcatgtgga acttcgaggc caaactcttc aggaagaagt atggttactt
12181 ctgtggtcgt tatgttattc accatgatag aggagccatt gtgtattacg atccgcttaa12181 ctgtggtcgt tatgttattc accatgatag aggagccatt gtgtattacg atccgcttaa
12241 actaatatct aagttaggtt gtaaacatat tagagatgtt gttcacttag aagagttacg12241 actaatatct aagttaggtt gtaaacatat tagagatgtt gttcacttag aagagttacg
12301 cgagtctttg tgtgatgtag ctagtaactt aaataattgt gcgtattttt cacagttaga12301 cgagtctttg tgtgatgtag ctagtaactt aaataattgt gcgtattttt cacagttaga
12361 tgaggccgtt gccgaggttc ataagaccgc ggtaggcggt tcgtttgctt tttgtagtat12361 tgaggccgtt gccgaggttc ataagaccgc ggtaggcggt tcgtttgctt tttgtagtat
12421 aattaagtat ttgtcagata agagattgtt tagagatttg ttctttgttt gataatgtcg12421 aattaagtat ttgtcagata agagattgtt tagagatttg ttctttgttt gataatgtcg
12481 atagtctcgt acgaacctaa ggtgagtgat ttcctcaatc tttcgaagaa ggaagagatc12481 atagtctcgt acgaacctaa ggtgagtgat ttcctcaatc tttcgaagaa ggaagagatc
12541 ttgccgaagg ctctaacgag gttaaaaacc gtgtctatta gtactaaaga tattatatct12541 ttgccgaagg ctctaacgag gttaaaaacc gtgtctatta gtactaaaga tattatatct
12601 gtcaaggagt cggagacttt gtgtgatata gatttgttaa tcaatgtgcc attagataag12601 gtcaaggagt cggagacttt gtgtgatata gatttgttaa tcaatgtgcc attagataag
12661 tatagatatg tgggtatcct aggagctgtt tttaccggag agtggctagt gccagacttc12661 tatagatatg tgggtatcct aggagctgtt tttaccggag agtggctagt gccagacttc
12721 gttaaaggtg gagtgacgat aagtgtgata gataagcgtc tggtgaactc aaaggagtgc12721 gttaaaggtg gagtgacgat aagtgtgata gataagcgtc tggtgaactc aaaggagtgc
12781 gtgattggta cgtacagagc cgcagccaag agtaagaggt tccagttcaa attggttcca12781 gtgattggta cgtacagagc cgcagccaag agtaagaggt tccagttcaa attggttcca
12841 aattactttg tgtccaccgt ggacgcaaag aggaagccgt ggcaggttca tgttcgtata12841 aattactttg tgtccaccgt ggacgcaaag aggaagccgt ggcaggttca tgttcgtata
12901 caagacttga agattgaggc gggttggcag ccgttagctc tggaagtagt ttcagttgct12901 caagacttga agattgaggc gggttggcag ccgttagctc tggaagtagt ttcagttgct
12961 atggtcacca ataacgttgt catgaagggt ttgagggaaa aggtcgtcgc aataaatgat12961 atggtcacca ataacgttgt catgaagggt ttgagggaaa aggtcgtcgc aataaatgat
13021 ccggacgtcg aaggtttcga aggtgtggtt gacgaattcg tcgattcggt tgcagcattt13021 ccggacgtcg aaggtttcga aggtgtggtt gacgaattcg tcgattcggt tgcagcattt
13081 aaagcggttg acaactttaa aagaaggaaa aagaaggttg aagaaaaggg tgtagtaagt13081 aaagcggttg acaactttaa aagaaggaaa aagaaggttg aagaaaaggg tgtagtaagt
13141 aagtataagt acagaccgga gaagtacgcc ggtcctgatt cgtttaattt gaaagaagaa13141 aagtataagt acagaccgga gaagtacgcc ggtcctgatt cgtttaattt gaaagaagaa
13201 aacgtcttac aacattacaa acccgaataa tcgataactc gagatgagta cggtcgtggt13201 aacgtcttac aacattacaa acccgaataa tcgataactc gagatgagta cggtcgtggt
13261 taaaggaaat ctcaatcgtg gtgcacacca accaagaagg cgaagaaggc aatcccttcg13261 taaaggaaat ctcaatcgtg gtgcacacca accaagaagg cgaagaaggc aatcccttcg
13321 caggcgcgct aacagagttc agccagtggt tatggtcacg gcccctgggc aacccaggcg13321 caggcgcgct aacagagttc agccagtggt tatggtcacg gcccctgggc aacccaggcg
13381 ccgaagacgc agaagaggag gcaatcgccg ctcaagaaga actggagttc cccgaggacg13381 ccgaagacgc agaagaggag gcaatcgccg ctcaagaaga actggagttc cccgaggacg
13441 aggctcaagc gagacattcg tgtttacaaa ggacaacctc atgggcaact cccaaggaag13441 aggctcaagc gagacattcg tgtttacaaa ggacaacctc atgggcaact cccaaggaag
13501 tttcaccttc gggccgagtc tatcagactg tccggcattc aaggatggaa tactcaaggc13501 tttcaccttc gggccgagtc tatcagactg tccggcattc aaggatggaa tactcaaggc
13561 ctaccatgag tataagatca caagcatctt acttcagttc gtcagcgagg cctcttccac13561 ctaccatgag tataagatca caagcatctt acttcagttc gtcagcgagg cctcttccac
13621 ctcctccggt tccatcgctt atgagttgga cccccattgc aaagtatcat ccctccagtc13621 ctcctccggt tccatcgctt atgagttgga cccccattgc aaagtatcat ccctccagtc
13681 ctacgtcaac aagttccaaa ttacgaaggg cggcgccaaa atttatcaag cgcggatgat13681 ctacgtcaac aagttccaaa ttacgaaggg cggcgccaaa atttatcaag cgcggatgat
13741 aaacggggta gaatggcacg attcttctga ggatcagtgc cggatactgt ggaagggaaa13741 aaacggggta gaatggcacg attcttctga ggatcagtgc cggatactgt ggaagggaaa
13801 tggaaaatct tcagataccg caggatcctt cagagtcacc attagggtgg ctttgcaaaa13801 tggaaaatct tcagataccg caggatcctt cagagtcacc attagggtgg ctttgcaaaa
13861 ccccaaatag agcggcccct agagcgtggt gcgcacgata gcgcatagtg tttttctctc13861 ccccaaatag agcggcccct agagcgtggt gcgcacgata gcgcatagtg tttttctctc
13921 cacttgaatc gaagagatag acttacggtg taaatccgta ggggtggcgt aaaccaaatt13921 cacttgaatc gaagagatag acttacggtg taaatccgta ggggtggcgt aaaccaaatt
13981 acgcaatgtt ttgggttcca tttaaatcga aaccccttat ttcctggatc acctgttaac13981 acgcaatgtt ttgggttcca tttaaatcga aaccccttat ttcctggatc acctgttaac
14041 gcacgtttga cgtgtattac agtgggaata agtaaaagtg agaggttcga atcctcccta14041 gcacgtttga cgtgtattac agtgggaata agtaaaagtg agaggttcga atcctcccta
14101 accccgggta ggggcccagc ggccgcttgg atcctctaga gtcaagcaga tcgttcaaac14101 accccgggta ggggcccagc ggccgcttgg atcctctaga gtcaagcaga tcgttcaaac
14161 atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata14161 atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata
14221 taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt14221 taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt
14281 atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac14281 atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac
14341 aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat14341 aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat
14401 cgaccagctt14401 cgaccagctt
Описание плазмиды TVCV-PLRV-CPDescription of the plasmid TVCV-PLRV-CP
Для экспрессии белка оболочки ВСЛК выбрали вирусный вектор на основе вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), который принадлежит к тобамовирусам, и способен накапливаться в количестве до 7 грамм на 1 кг зараженного материала. С этой целью из имеющихся в лаборатории кДНК TVCV и ВСЛК с помощью методов генной инженерии была создан агробактериальный вирусный вектор TVCV-PLRV-CP. For expression of the VLA coat protein, a viral vector was selected based on the turnip vein enlightenment virus (HPVT, TVCV), which belongs to tobamoviruses, and is able to accumulate up to 7 grams per 1 kg of infected material. For this purpose, the TVCV-PLRV-CP agrobacterial viral vector was created from the TVCV and VBLK cDNAs using genetic engineering methods.
Вначале инфекционная копия тобамовируса TVCV50 (NCBI Reference Sequence: NC_001873.1), содержащая репортерный ген GFP вместо гена белка оболочки тобамовируса, поставленная под контроль промотера гена актина 2 из Arabidopsis thaliana (GenBank accession no. BRU03387), (Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 6852-6857), была переклонирована из бинарного вектора BV1 в другой бинарный вектор pCambia 1300 и названа TVCV. Initially, an infectious copy of the tobamovirus TVCV 50 (NCBI Reference Sequence: NC_001873.1) containing the GFP reporter gene instead of the tobamovirus envelope protein gene, placed under the control of the promoter of the
Схема химерного вирусного вектора TVCV-PLRV-CP, где: Scheme of the chimeric viral vector TVCV-PLRV-CP, where:
35S Pr - транскрипционный промотер. 35S Pr - transcriptional promoter.
35Т - терминатор транскрипции.35T - transcription terminator.
Act2 Pr - транскрипционный промотер. Act2 Pr is a transcriptional promoter.
NosT - терминатор транскрипции.NosT - transcription terminator.
P0 - ген антисайленсингового белка, модулятора патогенности ВСЛК.P0 is the gene of antisilencing protein, a modulator of pathogenicity of AFL.
P1 - ген протеазы ВСЛК.P1 is the VHLC protease gene.
P2 - ген полимеразы ВСЛК.P2 is the gene for polymerase VSLK.
P3 - ген мажорного капсидного белка ВСЛК.P3 - gene of the major capsid protein of VSLK.
P4 - ген транспортного белка ВСЛК.P4 is the gene for the transport protein of VLK.
P5 - ген минорного капсидного белка ВСЛК, ассоциированного с капсидом, который образуется при супрессии амбер-стоп кодона P3.P5 is the gene for the minor capsid protein of VLK associated with the capsid, which is formed upon suppression of the amber-stop codon P3.
P6 и P7 - гены белков ВСЛК с неизвестными функциями.P6 and P7 are the genes for VLK proteins with unknown functions.
Полимераза - полимераза TVCV.Polymerase - TVCV polymerase.
Тр. белок - ген транспортного белка TVCV, содержащий субгеномный промотер для P3.Tr. Protein — The TVCV transport protein gene containing the subgenomic promoter for P3.
Бел. оболочки - ген белка оболочки TVCV.Bel. membranes - TVCV membrane protein.
T-like - шпилечная структура на конце генома TVCV.T-like is the hairpin structure at the end of the TVCV genome.
В этой плазмиде произвели замену гена GFP на ген белка оболочки ВСЛК. Для этого фрагмент длиной 627 нуклеотидов (3572-4199), содержащий ген белка оболочки PLRV р3, был амплифицирован с имеющейся матрицы pBNUP110, содержащей инфекционную копию канадского изолята PLRV (GenBank: D13954.1), с помощью праймеров: In this plasmid, the GFP gene was replaced with the VSLK coat protein gene. For this, a fragment of 627 nucleotides in length (3572-4199) containing the PLRV p3 coat protein gene was amplified from the existing pBNUP110 template containing an infectious copy of the Canadian PLRV isolate (GenBank: D13954.1) using the primers:
5' TTCTCGAG3572ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAACGTCAACGG-3' PLRV-CPΔ4-p5 'TTCTCGAG 3572 ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAACGTCAACGG-3' PLRV-CPΔ4-p
5'-TTGGTACC4199CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCA-3' PLRV-CP-m5'-TTGGTACC 4199 CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCA-3 'PLRV-CP-m
Дополнительно был инактивирован транспортный ген PLRV p4, который находится полностью внутри гена белка оболочки p3, и экспрессируется с той же субгеномной РНК, но находится в другой рамке трансляции. Для этого в праймер PLRV-CPΔ4-p были внесены замены T на C (подчеркнуты), которые элиминировали два стартовых ATG кодона в p4, но не изменяли аминокислотный состав p3 (Asp aat→aac). Полученный PCR фрагмент был разрезан по сайтам XhoI-Acc65I и заклонирован в плазмиду TVCV по сайтам рестрикции XhoI-BsrGI. Полученную конструкцию назвали TVCV-PLRV-CP.Additionally, the PLRV p4 transport gene was inactivated, which is located completely inside the p3 envelope protein gene and is expressed with the same subgenomic RNA, but is in a different translation frame. For this, substitutions of T for C were introduced into the primer PLRV-CPΔ4-p (underlined), which eliminated the two starting ATG codons in p4, but did not change the amino acid composition of p3 (Asp aat → aac). The resulting PCR fragment was cut at the XhoI-Acc65I sites and cloned into the TVCV plasmid at the XhoI-BsrGI restriction sites. The resulting construct was called TVCV-PLRV-CP.
Такой рекомбинантной плазмидой была трансформирована агробактерия A. tumefaciens штамма GV3101, способная эффективно встраивать кДНК химерного вируса в хромосому растительной клетки. Agrobacterium A. tumefaciens strain GV3101, capable of efficiently integrating chimeric virus cDNA into the chromosome of a plant cell, was transformed with such a recombinant plasmid.
Таким образом, получился химерный вирусный вектор, с геном белка оболочки ВСЛК, вместо собственного тобамовирусного капсидного белка. Thus, we obtained a chimeric viral vector, with the gene for the envelope protein of VLA, instead of its own tobamovirus capsid protein.
АГРОИНОКУЛЯЦИЯ РАСТЕНИЙ N. benthamianaAGROINOCULATION OF PLANTS N. benthamiana
Плазмидой TVCV-PLRV-CP трансформировали агробактерии штамма GV3101, наращивали бактерии в среде 2YT, содержащей антибиотики (Rif 50, Gent 25 и Km 100 мкг/мл) при температуре 28°С в течение ночи. Клетки высаживали и ресуспендировали в буфере для инфильтрации (10 mM MgCl2+10mM MES pH 6.5) до плотности 0.2 о.е. при OD600. Суспензию агробактерии впрыскивали шприцом в межклетники листьев растения Nicotiana benthamiana в присутствии агробактерии с антисайленсинговыми генами p19 (TBSW) P1-HcPro (PVA) или без них. Agrobacteria of strain GV3101 were transformed with plasmid TVCV-PLRV-CP, bacteria were grown in 2YT medium containing antibiotics (
Вектор оказался способен системно заражать N. benthamiana и показывать высокий титр белка оболочки ВСЛК в верхних листьях растения (фиг. 2). На фотографии можно увидеть, что в молодых листьях развиваются симптомы накопления вирусной химеры. The vector was able to systemically infect N. benthamiana and show a high titer of the protein of the coat of VCLK in the upper leaves of the plant (Fig. 2). In the photo you can see that the symptoms of the accumulation of a viral chimera develop in young leaves.
Репликация генома химерного вируса происходила с помощью тобамовирусной полимеразы, и химерный вирус распространялся по тканям растения, не ограничиваясь флоэмой. Накопление белка оболочки ВСЛК в зараженном растении оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях (Фиг. 3). В зараженных листьях первого, второго и третьего ярусов, начиная с верхушки, делали высечки одинаковой площади, растирали зеленый материал в 3 объемах 10 mM Tris-HCl pH 7.5, и далее проводили анализ электрофорезом в ПААГ по Лэмли (U. K. Laemmli “Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4” Nature 227, 680 - 685).The replication of the genome of the chimeric virus occurred using tobamovirus polymerase, and the chimeric virus spread throughout the tissues of the plant, not limited to the phloem. The accumulation of VLA coat protein in an infected plant was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under denaturing conditions (Fig. 3). In the infected leaves of the first, second and third tiers, starting from the apex, the same area was cut, green material was ground in 3 volumes of 10 mM Tris-HCl pH 7.5, and then an analysis was performed by electrophoresis in PAGE by Laemli (UK Laemmli “Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 ”Nature 227, 680 - 685).
Количество белка оболочки ВСЛК оценивали относительно с известным количеством БСА (бычий сывороточный альбумин). Оказалось, что количество белка оболочки ВСЛК в листьях первого яруса соответствует концентрации 3 грамма на 1 килограмм зеленой массы, во втором ярусе концентрация вируса падает примерно в пять раз, в третий ярус вирус практически не доходит из-за некротизации черешка листочка. Таким образом, концентрация химерного вируса в двух верхних ярусах на три порядка превосходит концентрацию настоящего ВСЛК с накоплением 0.4-1мг/кг.The amount of VLA coat protein was evaluated relative to a known amount of BSA (bovine serum albumin). It turned out that the amount of the protein of the HVAC membrane in the leaves of the first tier corresponds to a concentration of 3 grams per 1 kilogram of green mass, in the second tier the virus concentration drops by about five times, the virus practically does not reach the third tier due to necrotization of the leaf petiole. Thus, the concentration of the chimeric virus in the upper two tiers is three orders of magnitude higher than the concentration of the true VLK with an accumulation of 0.4-1 mg / kg.
ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА ВИРУСА И ЕГО ХАРАКТЕРИСТИКАOBTAINING A VIRUS DRUG AND ITS CHARACTERISTIC
С 50 лабораторных растений N. Benthamiana удалось собрать 25 грамм зараженных листьев и выделить более 20 мг химерного вируса по следующей методике. From 50 laboratory plants, N. Benthamiana managed to collect 25 grams of infected leaves and isolate more than 20 mg of the chimeric virus using the following procedure.
Листья гомогенизировали в коммерческом блендере в 5 объемах 0.1 М цитратного буфера с pH 6.0 с 0.1% 2-меркаптоэтанолом, корректировали pH до 7.0 с помощью 0.5M Na2HPO4, добавляли 1% Triton X-100. Гомогенат листьев перемешивали в этом буфере 30 мин на льду. Дебрис откручивали при 10.000g, а супернатант осветляли 1/4 V хлороформа. Далее химерный вирус высаживали на ультрацентрифуге при 40.000g в течение 90 мин через 20% сахарозную подушку. Осадок растворяли в 1 ml 10 mM Tris-HCl pH 7.5. The leaves were homogenized in a commercial blender in 5 volumes of 0.1 M citrate buffer at pH 6.0 with 0.1% 2-mercaptoethanol, the pH was adjusted to 7.0 with 0.5M Na 2 HPO 4 , and 1% Triton X-100 was added. The leaf homogenate was mixed in this buffer for 30 minutes on ice. The debris was unscrewed at 10,000 g, and the supernatant was clarified with 1/4 V of chloroform. Next, the chimeric virus was planted in an ultracentrifuge at 40.000g for 90 minutes through a 20% sucrose cushion. The precipitate was dissolved in 1
Вирусный препарат был разведен в 50 раз и контрастирован 2% уранилацетатом. Размер икосаэдра химерного вируса равен ~25 нм (Фиг. 4). На правой микрофотографии видно некоторое количество сильноконтрастированных вирионов, возможно, они не содержат РНК.The viral preparation was diluted 50 times and contrasted with 2% uranyl acetate. The size of the icosahedron of the chimeric virus is ~ 25 nm (Fig. 4). The right micrograph shows a certain number of highly contrasted virions, possibly they do not contain RNA.
Несмотря на то, что химерная РНК больше РНК ВСЛК на 1000 нуклеотидов, и на отсутствие минорного капсидного белка (55К - read-through protein), вирионы выглядят похожими на вирионы ВСЛК. Чистоту вирусного препарата оценивали с помощью электофореза в ПААГ в денатурирующих условиях по Лемли.Despite the fact that chimeric RNA is more than 1000 nucleotides in VLNA RNA, and in the absence of a minor capsid protein (55K - read-through protein), virions look similar to VLCs. The purity of the viral preparation was evaluated by electrophoresis in SDS page under denaturing conditions according to Lemley.
На 12% ПААГ нанесены 5, 10 и 15 мкл вирусного препарата. Электрофоретический анализ очищенного химерного вируса TMV-PLRV-CP в денатурирующем 12% полиакриамидном геле показал (Фиг. 5), что молекулярная масса капсидного белка равна предполагаемой 23 kDa. Видно, что в препарате присутствует незначительная примесь высокомолекулярных клеточных белков. Выделенный препарат химерного ВСЛК был охарактеризован спетрофотометрически. On 12% PAAG, 5, 10, and 15 μl of the viral preparation were applied. An electrophoretic analysis of the purified chimeric TMV-PLRV-CP virus in a denaturing 12% polyacryamide gel showed (Fig. 5) that the molecular weight of the capsid protein was equal to the estimated 23 kDa. It is seen that the preparation contains an insignificant admixture of high molecular weight cellular proteins. The isolated preparation of the chimeric VBLK was characterized spectrophotometrically.
Поскольку концентрированные суспензии вирусов сильно рассеивают УФ-свет и вирус ВСЛК склонен к агрегации (Фиг. 6, левый), обработку спектра проводили по методу, описанному в («Определение спектров истинного поглощения фага СД и ВТМ. Поправка на светорассеяние вирусной суспензии». Практикум по общей вирусологии (под ред. И.Г.Атабекова), Изд-во МГУ, 1981). В результате обработки спектра, устраняющей эффект рассеяния, удается определить поглощение в УФ-свете вирусного препарата. Далее определяли его соответствия чистому препарату ВСЛК по спектральным данным согласно Таканами и Кубо (Y. Takanami, S. Kubo “Enzyme-assisted Purification of two Phloem-limited Plant Viruses: Tobacco N e c r o t i c Dwarf and Potato LeafrollSince concentrated virus suspensions strongly scatter UV light and AFL virus is prone to aggregation (Fig. 6, left), the spectrum was processed according to the method described in ("Determination of true absorption spectra of phage C D and TMV. Correction for light scattering of the virus suspension." Workshop on General Virology (edited by I.G. Atabekov), Moscow State University Publishing House, 1981). As a result of processing the spectrum, eliminating the effect of scattering, it is possible to determine the absorption in the UV light of the viral preparation. Then, its correspondence to the pure VSLA preparation was determined by spectral data according to Takanami and Kubo (Y. Takanami, S. Kubo “Enzyme-assisted Purification of two Phloem-limited Plant Viruses: Tobacco N ecrotic Dwarf and Potato Leafroll
J. gen. Virol. (I979), 44, I53-I59), а именно A260/A280 = 1.78; A260/A240=1.43, а затем концентрацию вируса по формуле A260 (0.1%;1 cm)=8.6, т.е. раствор вируса с концентрацией 1 мг/мл в 1 см кювете имеет оптическое поглощение при 260 нм, равное 8,6 о.е. J. gen. Virol. (I979), 44, I53-I59), namely A 260 / A 280 = 1.78; A 260 / A 240 = 1.43, and then the concentration of the virus according to the formula A 260 (0.1%; 1 cm) = 8.6, i.e. a virus solution with a concentration of 1 mg / ml in a 1 cm cuvette has an optical absorption at 260 nm of 8.6 p.u.
Полученный препарат химерного ВСЛК имел отношение A260/A280 = 1,37 и A260/A240=0,99 (Фиг. 6, правый), что было близко спектральным характеристикам изолята природного вируса. Проведенные расчеты показали хорошее совпадение результатов определения выхода химерного вируса методами ИФА, электрофореза в ПААГ и УФ-спектрофотометрии. The resulting preparation of the chimeric VBLK had a ratio of A 260 / A 280 = 1.37 and A 260 / A 240 = 0.99 (Fig. 6, right), which was close to the spectral characteristics of the isolate of the natural virus. The calculations showed good agreement between the results of determining the yield of the chimeric virus by ELISA, electrophoresis in SDS page and UV spectrophotometry.
Для определения насколько химерные вирусных частицы иммунологически похожи на вирионы природного изолята ВСЛК использовали метод т.н. «иммунотреппинга», в котором на электронномикроскопические сеточки с коллодиевой пленкой-подложкой, закрепленной напылением атомов графита, помещали 30 мкл-каплю коммерческих иммуноглобулинов G (0.2 мг/мг, «Агдия», США) к ВСЛК. Сетки выдерживали для сорбции антител 10 мин, отмывали 2 раза PBS и помещали в суспензию инфицированного клеточного экстракта с предполагаемой по данным электрофореза концентрацией ВСЛК (0.05-10 нг/мл) в PBS на ночь при комнатной температуре. Сетки отмывали 4 раза PBS и 2 раза водой. Для контрастирования использовали 2% раствор уранил ацетата в воде (Фиг. 7).To determine how chimeric viral particles are immunologically similar to the virions of the natural isolate of VLK, the so-called “Immunotrapping”, in which 30 μl-drop of commercial immunoglobulins G (0.2 mg / mg, Agdia, United States) were added to VLC on electron microscopy nets with a collodion film substrate fixed by sputtering of graphite atoms. The nets were kept for adsorption of antibodies for 10 min, washed 2 times with PBS and placed in a suspension of infected cell extract with the expected concentration of VLKL (0.05-10 ng / ml) in PBS overnight at room temperature according to electrophoresis. The nets were washed 4 times with PBS and 2 times with water. For contrasting, a 2% solution of uranyl acetate in water was used (Fig. 7).
Электронномикроскопическое исследование разбавленного в 100 раз препарата выделенного вируса с помощью ТЭМ (фиг. 8) подтвердило данные иммунной электронной микроскопии экстрактов зараженного растения (Фиг. 7) о форме (икосаэдр) и размерах (25-27 нм) вирусной частицы.Electron microscopic examination of a 100-fold diluted preparation of the isolated virus using TEM (Fig. 8) confirmed the data of immune electron microscopy of the infected plant extracts (Fig. 7) on the shape (icosahedron) and size (25-27 nm) of the virus particle.
Таким образом, за счет создания химерного ВСЛК технология получения препаративных количеств целевых антигенов флоэмно-ограниченного вируса ВСЛК стала многократно проще и эффективней: нет зависимости от природного переносчика ВСЛК - персиковой тли; выделение химерных вирусных частиц из всего листа растения проще, чем выделение природного ВСЛК, который нужно экстрагировать из жестких проводящих пучков сосудов листовой ткани растения. Количественный эффект технологии состоит в том, что 20 мг вирусной химеры можно получить всего лишь из 25 грамм, а не 1-1,3 мг из 1 килограмма зараженных листьев картофеля, как в случае природного изолята вируса. Полученные таким способом препаративные количества химерного вируса химически более чистые, а их выделение является менее трудоемким.Thus, by creating a chimeric VSLA, the technology for producing preparative amounts of the target antigens of the phloem-restricted virus LSVF has become much simpler and more efficient: there is no dependence on the natural carrier of VSLK - peach aphids; the isolation of chimeric viral particles from the entire leaf of a plant is simpler than the isolation of natural VBLK, which must be extracted from hard conducting bundles of blood vessels of the leaf tissue of the plant. The quantitative effect of the technology is that 20 mg of the viral chimera can be obtained from only 25 grams, and not 1-1.3 mg from 1 kilogram of infected potato leaves, as in the case of a natural virus isolate. The preparative amounts of the chimeric virus obtained in this way are chemically purer, and their isolation is less labor intensive.
Важно отметить, что накопившийся в растении капсидный белок ВСЛК упаковывает РНК вируса ВПЖТ в икосаэдрический вирион (Фиг. 4, 7, 8). По своим спектрофотометрическим (Фиг. 6) и электронномикроскопическим характеристикам химерный вирус подобен ВСЛК, поэтому стереометрия его антигенных детерминант должна быть близка таковой природного изолята вируса, поскольку она определяется общим механизмом сборки вирусных частиц. Именно сборка химерного капсида, подобного капсиду природного изолята, является необходимым условием для использования химерной частицы в качестве антигена для иммунизации лабораторных животных.It is important to note that the VSLK capsid protein accumulated in the plant packs the RNA of the HPLV virus into the icosahedral virion (Figs. 4, 7, 8). According to its spectrophotometric (Fig. 6) and electron microscopic characteristics, the chimeric virus is similar to HFCS, therefore, the stereometry of its antigenic determinants should be close to that of the natural isolate of the virus, since it is determined by the general mechanism of assembly of viral particles. It is the assembly of a chimeric capsid, similar to that of a natural isolate, that is a prerequisite for using a chimeric particle as an antigen for immunization of laboratory animals.
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ К ХИМЕРНОМУ ВИРУСУGETTING ANTI-SERIES TO A CHIMERIC VIRUS
Выделенным препаратом химерного ВСЛК иммунизовали кроликов для получения антисывороток, которые использовали для диагностического анализа растений, инфицированных ВСЛК. Двух кроликов (1 и 2) иммунизовали трижды препаратами ВСЛК с полным (1 раз) и неполным (1 раз) адъювантом Фрейнда, вводя под кожу по 300-500 мкг препарата ВСЛК. Rabbits were immunized with the isolated chimeric VSLA preparation to obtain antisera, which were used for the diagnostic analysis of plants infected with VSLD. Two rabbits (1 and 2) were immunized three times with AFLA preparations with complete (1 time) and incomplete (1 time) Freund's adjuvant, introducing 300-500 μg of VSLK preparation under the skin.
Было важно установить степень перекрестного и прямого узнавания вирусных препаратов (природного изолята и химерного ВСЛК) антисыворотками, коммерческой к природном изоляту ВСЛК и полученной нами к химерному вирусу. Анализ полученных на химерный ВСЛК антисывороток проводили методом дот-блот иммуноферментного анализа с флуоресцентным субстратом и твердофазным непрямым иммуноферментным анализом.It was important to establish the degree of cross and direct recognition of viral preparations (natural isolate and chimeric VLCK) by antisera, commercial to the natural isolate of VCRK and obtained by us to the chimeric virus. The analysis of antisera obtained for the chimeric VBLK was carried out by dot-blot enzyme-linked immunosorbent assay with a fluorescent substrate and solid-phase indirect enzyme-linked immunosorbent assay.
Для дот-блот анализа (Фиг. 9) на нитратцеллюлозную мембрану Protran ВА-85 (Schleicher&Shull) наносили следующие препараты (по 1 мкл):For dot blot analysis (Fig. 9), the following preparations (1 μl each) were applied to Protran BA-85 nitrate cellulose membrane (Schleicher & Shull):
1. Химерный ВСЛК препарат №1 (2-3 мг/мл), разведенный PBS 1:1 и еще 3 последовательных 5-кратных разведения.1. Chimeric VLK drug No. 1 (2-3 mg / ml) diluted with PBS 1: 1 and 3 consecutive 5-fold dilutions.
2. Химерный ВСЛК препарат №1 после гель-фильтрации на носителе HW-60 (Toyo Pearl) без разведения и еще 3 последовательных 5-кратных разведения.2. Chimeric VBLK preparation No. 1 after gel filtration on a HW-60 carrier (Toyo Pearl) without dilution and another 3 consecutive 5-fold dilutions.
3. Природный изолят ВСЛК 0.08 мг/мл, разведенный PBS 1:1 и еще 2 последовательных 5-кратных разведения.3. Natural isolate of VLK 0.08 mg / ml, diluted with PBS 1: 1 and another 2 consecutive 5-fold dilutions.
4. Экстракт N. benthamiana, полученный из 10 мг листовой ткани, растертой в 100 мкл PBS и отцентрифугированной 8000 об/мин, 5 мин. Экстракт разведен сначала в 2 раза и последовательно в 10 раз.4. N. benthamiana extract obtained from 10 mg of leaf tissue, triturated in 100 μl of PBS and centrifuged at 8000 rpm, 5 min. The extract is diluted first 2 times and sequentially 10 times.
Далее мембраны помещали в 5% блокирующий раствор раствор («Амершам») в TBS, рН 9.1 с 0.1% ТВ.-20 на 1 час при комнатной температуре на качалке.Then the membranes were placed in a 5% blocking solution (Amersham) in TBS, pH 9.1 with 0.1% TW-20 for 1 hour at room temperature on a rocking chair.
Затем мембраны отмывали последовательно в TBS с 0.1% Tween-20, 2 раза быстро, 1 раз 15 мин и 2 раза по 5 мин. Готовили разведения антисывороток 1:25, 1:125 , 1:625 буфером TBS, рН 9.1 и инкубировали мембраны с каждым разведением 1час при комнатной температуре, а затем отмывали последовательно в TBS с 0.1% Tween-20, 2 раза быстро (1 раз 15мин и 2 раза по 5 мин буфером).Then the membranes were washed sequentially in TBS with 0.1% Tween-20, 2 times quickly, 1
Далее мембраны помещали в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, разбавленных в 5000 раз буфером TBS - 0,5% БСА, на 1час при комнатной температуре, отмывали последовательно в TBS с 0.1% Tween-20, 2 раза быстро (1 раз 15 мин и 2 раза по 5 мин). Then the membranes were placed in a solution of secondary antibodies conjugated with horseradish peroxidase, diluted 5,000 times with TBS buffer - 0.5% BSA, for 1 hour at room temperature, washed sequentially in TBS with 0.1% Tween-20, 2 times quickly (1
Для детекции вируса использовали хемилюминесцентный субстрат по протоколу ECL («Амершам»).For the detection of the virus, a chemiluminescent substrate was used according to the ECL protocol (Amersham).
Как видно (ряд 1), антисыворотка к химерному ВСЛК при развелении в 625 раз узнает антиген, разведенный в 250 раз, а дополнительная очистка антигена гель-фильтрацией (ряд 2) приводит к ослаблению чувствительности его определения либо за счет разведения и потерь при очистке, либо от освобождения от интерферирующей примеси. Следует отметить, что изолят природного типа определяется ИФА с полученной нами антисывороткой (ряд 3), но с меньшей чувствительностью. И наконец, антисыворотка четко различает незараженное растение (ряд 4а, б) и зараженный природным изолятом ВСЛК картофель.As can be seen (row 1), when diluted 625 times, the antiserum to the chimeric VBLK recognizes the antigen diluted 250 times, and additional purification of the antigen by gel filtration (row 2) leads to a weakening of its detection sensitivity either due to dilution and loss during purification, or from exemption from interfering impurities. It should be noted that the natural type isolate is determined by ELISA with the antiserum we obtained (row 3), but with less sensitivity. And finally, the antiserum clearly distinguishes between an uninfected plant (row 4a, b) and potato infected with the natural isolate of VLK.
Таким образом, полученная к химерному ВСЛК антисыворотка определяет зараженный природным изолятом ВСЛК картофель.Thus, the antiserum obtained for the chimeric VSLK determines potatoes infected with the natural isolate of VSLK.
При сравнении (см. Фиг. 9) антисыворотка №2 проявляет те же свойства, что и №1, но обладает меньшей чувствительностью (ряд 4в, г) и специфичностью - дает больший фон для незараженного растения (ряд 4а, б), что может объясняться большим загрязнением антигена клеточными компонентами. When comparing (see Fig. 9), antiserum No. 2 exhibits the same properties as No. 1, but has less sensitivity (row 4c, d) and specificity - it gives a larger background for an uninfected plant (row 4a, b), which can due to the large contamination of the antigen by cellular components.
В предварительных экспериментах твердофазным непрямым иммуноферментным анализом полученной антисыворотки к химерному ВСЛК было установлено, что чувствительность детекции химерного вируса, выделенного из зараженной N. bentomiana, составляет 2 нг/мл, в то время чувствительность определения природного изолята ВСЛК, выделенного из картофеля равна 5 нг/мл (Фиг. 10). In preliminary experiments, a solid-phase indirect enzyme-linked immunosorbent assay of the obtained antiserum to chimeric VLCK found that the sensitivity of detection of the chimeric virus isolated from infected N. bentomiana is 2 ng / ml, while the sensitivity of the determination of the natural isolate of VCRK isolated from potato is 5 ng / ml (Fig. 10).
Таким, образом, по результатам твердофазного непрямого ИФА можно заключить, что достоверные отличия иммунологической реакции антисыворотки к химерному ВСЛК сохраняются после разведения ее в 8-10 тысяч раз. Thus, according to the results of the solid-phase indirect ELISA, it can be concluded that significant differences in the immunological reaction of the antiserum to the chimeric VLA persist after it is diluted 8-10 thousand times.
Наблюдаемый неспецифический фон при разведениях антисыворотки мы объясняем примесью антител на хозяйские антигены. Эту проблему обычно снимают истощением антисыворотки соком растения-хозяина. Несмотря на то, что мы этого не делали, результаты ИФА однозначно говорят о высоком титре (достоверный сигнал целевых антител в антисыворотке виден при 8000-кратном разведении). The observed nonspecific background in antiserum dilutions is explained by an admixture of antibodies to host antigens. This problem is usually removed by depletion of antiserum by the juice of the host plant. Despite the fact that we did not, the results of ELISA clearly indicate a high titer (a reliable signal of the target antibodies in the antiserum is visible at 8000-fold dilution).
Краткое описание рисунковBrief Description of Drawings
Фиг.1. Картофель, зараженный ВСЛК.Figure 1. Potato infected with AFL.
Фиг. 2. Фото N. benthamiana через 14 дней после инокуляции агробактерией, несущей плазмиду TVCV-PLRV-CP: А - зона инокуляции агробактерией, Б - некроз проводящей ткани черешка, I - лист первого яруса, II - лист второго яруса, III - лист третьего яруса, I-III - симптомы, вызванные накоплением вируса.FIG. 2. Photo of N. benthamiana 14 days after inoculation with an agrobacterium bearing the plasmid TVCV-PLRV-CP: A — inoculation zone with agrobacterium, B — necrosis of the conductive tissue of the petiole, I — leaf of the first tier, II — leaf of the second tier, III — leaf of the third tier, I-III - symptoms caused by the accumulation of the virus.
Фиг. 3. Накопление белка оболочки ВСЛК в зависимости от яруса листьев по окраске кумасси в ПААГ. Стрелочкой обозначена зона, соответствующая подвижности белка оболочки ВСЛК.FIG. 3. The accumulation of protein shell VLK depending on the tier of the leaves on the coloring of Coomassie in PAG. The arrow indicates the zone corresponding to the mobility of the protein of the envelope of VLK.
Фиг. 4. Электронная микрофотография вирусного препарата (А - Увеличение 600.000 раз, В - увеличение 60.000 раз).FIG. 4. Electronic micrograph of the viral preparation (A - 600,000 times magnification, B - 60,000 times magnification).
Фиг. 5. Оценка чистоты полученного препарата химерного ВСЛК электрофорезом в 12% ПААГ.FIG. 5. Assessment of the purity of the obtained chimeric VBLK preparation by electrophoresis in 12% SDS page.
Фиг. 6. УФ-спектрофотометрия препарата химерного ВСЛК. Кривая 1- видимый спектр вирусного препарата. Кривая 2 - кстраполяция раасеяния света вирусными частицами на область их поглощения света. Кривая 3 - истинный УФ-спектр поглощения препаратом вируса с вычетом светорассеивания. FIG. 6. UV spectrophotometry of the drug chimeric VSLK. Curve 1 - visible spectrum of the viral preparation. Curve 2 - extrapolation of the scattering of light by viral particles to the region of their absorption of light.
Фиг. 7. Иммунная электронная микроскопия (trapping mode) неочищенного препарата -экстракт листьев N. benthamiana , зараженных химерным вирусом, с помощью антител к ВСЛК.FIG. 7. Immunological electron microscopy (trapping mode) of a crude preparation — an extract of leaves of N. benthamiana infected with a chimeric virus using anti-VHC antibodies.
Фиг. 8. Просвечивающая электронная микроскопия очищенного препарата химерного вируса ВСЛК, нанесенного на формваровую подложку. Контрастирование 2% уранилацетатом.FIG. 8. Transmission electron microscopy of a purified preparation of the chimeric virus VLK deposited on a formwar substrate. Contrast with 2% uranyl acetate.
Фиг. 9. Дот-блот иммуноанализ специфичности антисыворотки (см. фиг. 10) к химерному вирусу скручивания листьев картофеля. * - при нанесении на мембрану 1000 и более нанограмм происходит отслоение части окрашенного вещества.FIG. 9. Dot blot immunoassay of antiserum specificity (see FIG. 10) for the chimeric potato leaf curling virus. * - when 1000 or more nanograms are applied to the membrane, a part of the colored substance is peeled off.
На мембраны наносили:On the membrane was applied:
1 ряд - химерный ВСЛК, 2 ряд - тот же вирус, после дополнительной очистки гель-фильтрацией, 3 ряд - изолят природного ВСЛК, 4а,б -отрицательный контроль - экстракт N. benthamiana, 4 в, г - сок картофеля, зараженного природным изолятом ВСЛК. 1 row - chimeric VBLK, 2 row - the same virus, after additional purification by gel filtration, 3 row - isolate of natural VBLK, 4a, b - negative control - extract of N. benthamiana, 4 c, d - juice of potato infected with a natural isolate FLC.
Количество ВСЛК (нг): 1а* - 1000, 1б - 200, 1в - 40, 1г - 8, 2а - 100, 2б - 20, 2в - 8, 2г - 1.6, 3а - 40, 3б - 8, 3в - 1.6, 3г - 0.3.Number of VLK (ng): 1a * - 1000, 1b - 200, 1v - 40, 1g - 8, 2a - 100, 2b - 20, 2v - 8, 2g - 1.6, 3a - 40, 3b - 8, 3v - 1.6 3g - 0.3.
Фиг. 10. Чуствительность определения очищенных препаратов химерного (кривая - ряд 1) и природного изолята (кривая - ряд 2) ВСЛК в непрямом ИФА с использованием антисыворотки к химерному вирусу. Оптическая плотность в отрицательных контролях в среднем составляла 0.08 о.е. в картофеле и 0.03 в N. bentomiana.FIG. 10. The sensitivity of the determination of purified chimeric preparations (curve - row 1) and natural isolate (curve - row 2) of VLK in indirect ELISA using antiserum to the chimeric virus. The optical density in the negative controls averaged 0.08 p.u. in potatoes and 0.03 in N. bentomiana.
Claims (10)
а) клонирование кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), принадлежащего к тобамовирусам, с транскрипционным промотером с одной стороны и терминатором транскрипции с другой в агробактериальный вектор pCambia1300;
б) вставку гена белка оболочки ВСЛК из плазмиды pBNUP110 вместо гена собственного тобамовирусного гена белка оболочки;
при этом получают генно-инженерную плазмиду TVCV-PLRV-CP с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.1. A method for producing preparative amounts of a chimeric virus that mimics the icosahedral low-copy phloem-restricted plant virus (INFOV), comprising producing a chimeric virus by inserting the INFOV coat protein gene into an effective viral vector based on tobamovirus RNA that can spread and accumulate in all plant tissues after which carry out systemic infection of plants with the obtained chimeric virus for propagation and accumulation in plant tissues, followed by isolation of the chimeric virus from tissues plants in preparative quantities, while the chimeric virus is a chimeric RNA transcribed from a DNA vector, consisting of the tobamovirus genome and the coat protein gene of the target virus of the low-copy phloem-restricted plant virus, which is used as the potato leaf curling virus (VLCK), moreover, the VLA coat protein packs the tobamovirus genome RNA into the icosahedron, and where the preparation of the chimeric viral vector involves the following steps:
a) cloning cDNA of turnip vein enlightenment virus (VLT, TVCV), belonging to tobamoviruses, with a transcriptional promoter on the one hand and a transcription terminator on the other into the agrobacterial vector pCambia1300;
b) the insertion of the gene for the protein of the shell of VBLK from plasmid pBNUP110 instead of the gene of its own tobamovirus gene for the protein of the membrane;
this gives the genetically engineered plasmid TVCV-PLRV-CP with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123640/10A RU2555534C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | Method of obtaining preparative quantities of viral particles of phloem-restricted viruses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123640/10A RU2555534C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | Method of obtaining preparative quantities of viral particles of phloem-restricted viruses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013123640A RU2013123640A (en) | 2014-11-27 |
| RU2555534C2 true RU2555534C2 (en) | 2015-07-10 |
Family
ID=53381242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013123640/10A RU2555534C2 (en) | 2013-05-23 | 2013-05-23 | Method of obtaining preparative quantities of viral particles of phloem-restricted viruses |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2555534C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807751C1 (en) * | 2022-12-27 | 2023-11-21 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Method of obtaining recombinant vesicular stomatitis virus |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0686196A1 (en) * | 1993-02-26 | 1995-12-13 | Gene Shears Pty Limited | Plant virus resistance conferring polyribozyme and resistant plants producing same |
| EP1758925A2 (en) * | 2003-12-01 | 2007-03-07 | Dow Gloval Technologies Inc. | Recombinant icosahedral virus like particle production in pseudomonads |
-
2013
- 2013-05-23 RU RU2013123640/10A patent/RU2555534C2/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0686196A1 (en) * | 1993-02-26 | 1995-12-13 | Gene Shears Pty Limited | Plant virus resistance conferring polyribozyme and resistant plants producing same |
| EP1758925A2 (en) * | 2003-12-01 | 2007-03-07 | Dow Gloval Technologies Inc. | Recombinant icosahedral virus like particle production in pseudomonads |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2807751C1 (en) * | 2022-12-27 | 2023-11-21 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Method of obtaining recombinant vesicular stomatitis virus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013123640A (en) | 2014-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108546712B (en) | Method for realizing homologous recombination of target gene in plant by using CRISPR/L bcPf1 system | |
| CN110551752B (en) | xCas9n-epBE base editing system and application thereof in genome base replacement | |
| CN108203714B (en) | Cotton gene editing method | |
| CN111893097A (en) | Coronavirus pseudovirus packaging system and one-step packaging method | |
| KR100785946B1 (en) | Plant transformation vector | |
| CN107119063B (en) | A kind of method for improving cordycepin content in Cordyceps militaris | |
| CN110656114B (en) | A kind of gene related to tobacco pigment synthesis and its application | |
| CN112126658A (en) | Plant overexpressed luciferase reporter gene recombinant vector and construction method and application | |
| CN110760538B (en) | Method for creating fusarium wilt-resistant watermelon seed material | |
| CN109321576A (en) | A kind of creation method of glandless low gossypol cotton germplasm | |
| CN109232726B (en) | Application of protein OsVPE2 in regulating plant vacuolar inorganic phosphorus export ability | |
| AU2014338940B2 (en) | Novel fiber-preferential promoter in cotton | |
| RU2555534C2 (en) | Method of obtaining preparative quantities of viral particles of phloem-restricted viruses | |
| TW201210471A (en) | Method for enhancing thermotolerance of plant and applicatibility of transgenic plant | |
| CN115058439A (en) | Yunjin Rhododendron SAMT gene overexpression vector and construction method and application thereof | |
| CN109485707B (en) | Application of protein OsVPE1 in regulation and control of inorganic phosphorus output capacity of plant vacuole | |
| CN113490741B (en) | Inhibition of target gene expression by genome editing of natural miRNAs | |
| CN115466319B (en) | Sorghum SbMS1 protein and its encoding gene and its application | |
| CN111394385A (en) | Method for rapidly identifying bidirectional promoter of rice | |
| CN114958881A (en) | Soybean gene GmPP2C89, overexpression vector and application | |
| CN117043331A (en) | Inducible chimera | |
| CN109337925B (en) | Method for improving artemisinin content in artemisia annua by using AaADS-transferred gene taking artemisia annua suspension cell line as receptor | |
| CN113281521B (en) | Gateway binary plasmid vector for rapidly identifying plant stress particle associated protein, and construction method and application thereof | |
| CN113122516B (en) | Plant EPSPS mutant and application thereof in plants | |
| CN108841862A (en) | A kind of construction method of plant expression plasmid carrier containing HA protein fusion label and its carrier |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
| TK4A | Correction to the publication in the bulletin (patent) |
Free format text: AMENDMENT TO CHAPTER -FG4A- IN JOURNAL: 19-2015 FOR TAG: (54) |