PL212661B1 - Sposób izolacji komórki prekursorowej sródblonka - Google Patents
Sposób izolacji komórki prekursorowej sródblonkaInfo
- Publication number
- PL212661B1 PL212661B1 PL373564A PL37356403A PL212661B1 PL 212661 B1 PL212661 B1 PL 212661B1 PL 373564 A PL373564 A PL 373564A PL 37356403 A PL37356403 A PL 37356403A PL 212661 B1 PL212661 B1 PL 212661B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- tie
- endothelial
- precursor cell
- donor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 63
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 134
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 48
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 37
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 22
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 20
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 6
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 6
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 108010022164 acetyl-LDL Proteins 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 5
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 5
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 4
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 description 4
- 102100030301 MHC class I polypeptide-related sequence A Human genes 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 4
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 3
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010008874 Chronic Fatigue Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010048748 Graft loss Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000622123 Homo sapiens E-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010159 IgA glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010021263 IgA nephropathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108010031034 MHC class I-related chain A Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 101000852966 Rattus norvegicus Interleukin-1 receptor-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000012753 TIE-2 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010090091 TIE-2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006749 inflammatory damage Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 231100000355 lymphocytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001391 lymphocytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 208000030247 mild fever Diseases 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 208000029766 myalgic encephalomeyelitis/chronic fatigue syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 230000021368 organ growth Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003867 tiredness Effects 0.000 description 1
- 208000016255 tiredness Diseases 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
- G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji komórki prekursorowej śródbłonka. W celu wykrycia przeciwciał przeciwko komórkom śródbłonka przed transplantacją narządu przeprowadza się bezpośrednią izolację komórek śródbłonka z pełnej krwi dla rutynowej specyficznej dla dawcy próby krzyżowej.
Obecność specyficznych przeciwciał w stosunku do antygenu ludzkich leukocytów (HLA) dawcy reagujących z limfocytami przed i/lub po allograficznym przeszczepie nerki jest związana z odrzuceniem nadostrym, wczesnym odrzuceniem ostrym i słabym przeżyciem przeszczepu. Jednak odrzucenie może występować gdy brak jest możliwych do wykrycia przeciwciał Iimfocytotoksycznych, sugerując, że systemy antygenowe nie-HLA mogą także odgrywać rolę w nadostrym i ostrym odrzuceniu alloprzeszczepów nerki. Opisano przeciwciała reagujące z komórkami śródbłonka i monocytami (także zwane układem antygenowym EM) lub tylko komórkami śródbłonka i doniesiono, że mają szkodliwy wpływ przy przeszczepach kilku narządów.
Niedawno zidentyfikowano główny antygen zgodności tkankowej podobny do łańcucha A klasy I (MICA) wyrażany na komórkach śródbłonka jako jeden z docelowych antygenów odporności humoralnej związanej z nieodwracalnym odrzucaniem alloprzeszczepów nerek. Badania identycznych pod względem HLA aIIoprzeszczepów od żyjących krewnych wykazały, że obecność przeciwciał reagujących z komórkami śródbłonka/monocytami korelowała z odrzuceniem, utratą przeszczepu i słabym funkcjonowaniem alloprzeszczepu. Doniesiono, że ta reaktywność mogła być odpowiedzialna za do 80% nieodwracalnych odrzuceń w tej grupie pacjentów. Jednak rutynowo stosowane próby krzyżowe limfocytów (LXM) nie pozwalają na wykrycie klinicznie istotnych przeciwciał specyficznych dla HLA klasy I, klasy II, reagujących z komórkami śródbłonka/monocytami i reagujących z komórkami śródbłonka. Chociaż obecność krążących komórek śródbłonka w pełnej krwi jest przedmiotem dyskusji od wielu lat, istnienie krążących prekursorów komórek śródbłonka u osób dorosłych było niedawno opisane przez pewnych badaczy. Jednak obecnie nie ma odpowiedniego sposobu przeprowadzenia rutynowej specyficznej dla dawcy próby krzyżowej w celu wykrycia przeciwciał przeciwko komórkom śródbłonka (endothelial cellcrossmatch-ECXM).
Zatem istnieje potrzeba przeprowadzania wydajnej rutynowej specyficznej dla dawcy próby krzyżowej w celu wykrycia przeciwciał przeciwko komórkom śródbłonka, aby pomóc w identyfikacji lepszych kombinacji dawca-biorca, co będzie miało większy wpływ na przeżycie przeszczepu niż obecny sposób próby krzyżowej limfocytów.
Wynalazek dotyczy sposobu izolacji komórki prekursorowej śródbłonka z próbki biologicznej, który obejmuje:
(a) dostarczenie próbki wybranej z grupy składającej się z krwi pełnej, surowicy, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) i leukaferyzatu, zawierającej komórkę prekursorową śródbłonka, lub w której przypuszczalnie jest zawarta taka komórka;
(b) kontaktowanie próbki z odczynnikiem do detekcji, którym jest przeciwciało przeciwko receptorowi powierzchniowemu Tie 2 komórki prekursorowej śródbłonka z wytworzeniem kompleksu przeciwciało-komórka prekursorową śródbłonka; i (c) wydzielenie kompleksu odczynnik do detekcji-komórka prekursorowa śródbłonka z próbki biologicznej i wyizolowanie w ten sposób komórki prekursorowej śródbłonka, przy czym komórka prekursorowa śródbłonka jest CD34 ujemna.
Korzystnie izolowana komórka prekursorowa śródbłonka jest Tie-2 dodatnia.
Korzystnie rozdział przeprowadza się za pomocą cytometrii przepływowej lub pola magnetycznego.
Korzystnie przeciwciało jest przyłączone do stałego nośnika, którym korzystnie jest perełka niemagnetyczna, magnetyczna lub paramagnetyczna.
Korzystnie izolowane komórki prekursorowe stosuje się w próbie krzyżowej dawcy i biorcy obejmującej:
(a) izolowanie komórek prekursorowych śródbłonka z próbki dawcy wybranej z grupy składającej się z krwi pełnej, surowic, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i leukaferyzatu, zawierającej komórkę prekursorową śródbłonka, lub w której przypuszczalnie jest zawarta taka komórka; i (b) skrining próbki biorcy wybranej z grupy składającej się z krwi pełnej, surowic, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i leukaferyzatu na reaktywność z izolowaną komórką prekursorową śródbłonka;
przy czym brak reaktywności próbki biorcy z izolowaną komórką prekursorową śródbłonka wskazuje na zgodność między dawcą i biorcą.
PL 212 661 B1
Odczynnik do detekcji jest przeciwciałem specyficznym wobec receptora powierzchniowego komórki śródbłonka, takiego Tie-2. Przeciwciało jest nienaruszonym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała (np. Fab lub Fv). Odczynnik do detekcji jest przyłączony do stałego nośnika, takiego jak perełka niemagnetyczna, magnetyczna lub paramagnetyczna.
Próbka biologiczna jest pełną krwią, surowicą, homogenatem tkanek, jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej (- PBMC) lub leukaferyzatem.
Komórki prekursorowe śródbłonka izolowane sposobem według wynalazku można wykorzystać do diagnozowania choroby związanej z odpornością lub choroby naczyniowej u osobnika przez dostarczenie pierwszej próbki od osobnika, o której wiadomo, że zawiera, lub podejrzewa się, że zawiera komórkę śródbłonka. Pierwszą próbkę kontaktuje się z drugą próbką. Druga próbka pochodzi od osobnika, o którym wiadomo że zawiera, lub podejrzewa się, że zawiera autoprzeciwciało. Alternatywnie druga próbka zawiera odczynniki (np. przeciwciała), które rozpoznają markery powierzchniowe komórki śródbłonka związane z daną chorobą. Oznacza się tworzenie kompleksu między komórką śródbłonka i drugą próbką. Obecność kompleksu wskazuje na zaburzenie u osobnika.
Ocenę skuteczności leczenia lub prognozę zaburzenia związanego z odpornością lub zaburzenia naczyniowego u osobnika przeprowadza się przez dostarczenie pierwszej próbki od osobnika, o której wiadomo, ż e zawiera, lub podejrzewa się , ż e zawiera, komórk ę ś ródbł onka, kontaktowanie komórki śródbłonka z drugą próbką od osobnika, o której wiadomo, że zawiera, lub podejrzewa się, że zawiera, autoprzeciwciało, pomiar ewentualnego obecnego kompleksu autoprzeciwciało- komórka prekursorowa śródbłonka, aby uzyskać profil osobnika. Profil osobnika porównuje się z profilem referencyjnym, gdzie podobieństwo między profilem osobnika i profilem referencyjnym wskazuje, że terapia jest skuteczna lub, że prognoza jest korzystną prognozą.
Choroby związane z odpornością lub choroby naczyniowe obejmują zapalenie naczyń, miażdżycę tętnic, zaburzenia krwawienia, angiogenezę, zakrzepicę, wadliwe gojenie się ran i transplantację.
O ile nie określono inaczej wszystkie techniczne i naukowe terminy tu stosowane mają to samo znaczenie jak powszechnie rozumiane przez specjalistę o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie, do której należy ten wynalazek. Choć sposoby i materiały podobne lub równoważne tu opisanym mogą być stosowane w praktyce lub testowaniu tego wynalazku, odpowiednie sposoby i materiały są opisane poniżej. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne tu wymienione odnośniki są włączone w całości w formie odniesienia. W razie konfliktu, obecny dokładny opis wraz ze szczegółami jest decydujący. Dodatkowo, materiały, sposoby i przykłady są tylko ilustracją i nie są ograniczające.
Inne cechy i zalety wynalazku staną się widoczne z następującego szczegółowego opisu i z zastrzeż e ń .
Krótki opis figur
Na Fig. 1 przedstawiono wykresy kropkowe pokazujące profil rozpraszania do przodu i w bok jak również fluorescencję jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) zabarwionych przeciwciałami monoklonalnymi (Mab) anty-Tie-2+. Komórki Tie-2+ (szare kropki) pojawiły się w bramce limfocytów.
Histogramy pokazują procent komórek Tie-2+ (około 2±3%) w PBMC barwionych negatywnymi przeciwciałami kontrolnymi i Mab na Tie-2.
Fig. 2a-c są fotografiami morfologii komórek Tie-2+ pod mikroskopem świetlnym w różnych punktach czasowych po izolacji z krwi obwodowej. Początkowo komórki te pojawiały się albo jako pojedyncze komórki albo jako klastry okrągłych komórek (a), które po kilku dniach hodowli przekształcały się w komórki przylegające, z rozszerzoną cytoplazmą (ciemne obiekty są perełkami) (b). Po 7-12 dniach w hodowli komórki stopniowo przybrały kształt wrzeciona (c).
Fig. 3a jest serią fotografii przedstawiających komórki Tie- 2+ wybarwione dodatnio wobec markerów połączonych ze śródbłonkiem, acetylowaną lipoproteinę o niskiej gęstości (Ac-LDL), czynnik von Willebranda (vWF), receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-1 (VEGFR-1) i cząsteczkę adhezji naczyniowej komórek (VCAM) (na aktywowanych komórkach Tie-2+). Komórki Tie-2+ także konstytutywnie wyrażały ludzki antygen leukocytów klasy I (HLA klasa I) i marker monocytów/makrofagów CD68.
Na Fig. 3b pokazano, że spoczynkowe komórki Tie-2+ wyrażały małe ilości klinicznie ważnych antygenów MICA (ciemnoszare) i HLA klasy II (jasnoszare), przeciwciała kontrolne (czarne). Fig. 4a jest wykresem kropkowym pokazującym profile rozpraszania do przodu i w bok rozetek komórek Tie-2+ i perełek paramagnetycznych (bramka R1) i samych perełek paramagnetycznych (bramka R2).
Fig. 4b-g są to histogramy pokazujące, że surowice pretransplantacyjne od dwóch pacjentów po przeszczepie nerki z nadostrymi odrzutami silnie reagowały z ich odpowiednimi specyficznymi dla
PL 212 661 B1 dawcy komórkami Tie-2+ (b i e), podczas gdy ich frakcje Tie-2-, które obejmowały limfocyty, nie reagowały (d i g). Histogramy c i f pokazują, że same paciorki paramagnetyczne nie reagują niespecyficznie z surowicami. Szare linie przedstawiają surowice kontrolne lub negatywne, a czarne linie przedstawiają reaktywność z surowicami pacjenta.
Wynalazek jest oparty częściowo na ujawnieniu, że ukierunkowanie na pojedynczą specyficzną populację komórek pozwala na wykrycie klinicznie istotnych przeciwciał specyficznych dla dawcy względem antygenów leukocytów ludzkich (HLA) klasy I, klasy II, śródbłonków-monocytów, lub przeciwciał specyficznych dla komórek prekursorowych śródbłonka przed transplantacją narządów. Rutynowe stosowanie próby krzyżowej dla komórek prekursorowych śródbłonka pomoże w identyfikacji lepszych kombinacji dawca-biorca i w ten sposób będzie miało większy wpływ na przeżycie przeszczepu w porównaniu z tradycyjną próbą krzyżową limfocytów.
Doniesiono o znaczeniu klinicznym przeciwciał dla komórek prekursorowych śródbłonka (EC) w alloprzeszczepach. Jednak brak odpowiedniego sposobu izolacji EC specyficznych dla dawcy przeszkadzał w rutynowym wykrywaniu tych przeciwciał przed transplantacją. Wynalazek dostarcza szybkiego i prostego sposobu bezpośredniej izolacji prekursorów EC z pełnej krwi do rutynowej próby krzyżowej w celu wykrycia przeciwciał anty-EC. Obecność reagujących z komórką śródbłonka przeciwciał uprzednio wykrywano stosując linie komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC), linie keratynocytów lub monocyty jako cele, lub wykrywano metodą immunohistochemiczną. Jednak te sposoby są żmudne, ponieważ hodowla komórek śródbłonka jest uciążliwa i na ogół wymagany jest duży panel dawców linii HUVEC/keratynocytów, aby reprezentować wszystkie znane polimorficzne allele dla skriningu przeciwciał reagujących z komórkami śródbłonka. Ponadto, te sposoby nie pozwalają na wykrywanie przeciwciał przeciw komórkom śródbłonka specyficznym dla dawcy. Tak więc zastosowanie próby krzyżowej komórek śródbłonka jest korzystne w stosunku do stosowania próby krzyżowej limfocytów, ponieważ próba krzyżowa limfocytów nie pozwala na taką detekcję lub izolację przeciwciał reagujących z komórkami śródbłonka specyficznymi dla dawcy.
EC izolowano stosując perełki magnetyczne powleczone przeciwciałami przeciwko receptorowi angiopoetyny Tie-2, który jest wyrażany na prekursorach EC. Geny Tie odgrywają ważną rolę w rozwoju naczyń nerki i w oparciu o doświadczenia z transplantacją wykazano, że te prekursory biorą udział w dojrzewaniu kłębuszków. Przeprowadzono retrospektywną analizę 50 uprzednio dobrze scharakteryzowanych surowic z prób krzyżowych pobranych bezpośrednio przed transplantacją od pacjentów z chorobą nerek w stadium końcowym. Komórki Tie-2+ wyrażały HLA klasy I, klasy II i inne markery komórek śródbłonka. Surowice zawierające tylko przeciwciała specyficzne dla EC lub reagujące z EC i monocytami (EM) reagowały dodatnio z komórkami Tie-2+, ale nie z komórkami Tie-2- od tego samego osobnika. Ponadto, komórki Tie-2+ reagowały z surowicami zawierającymi tylko przeciwciała HLA klasy I lub klasy II. W sumie 3/25 surowic od pacjentów ze stabilnym wynikiem przeszczepu i bez odrzuceń reagowały z komórkami Tie-2+. Ta reakcja antygen-przeciwciało jest istotna dla patogenezy odrzuceń, ponieważ w wielu badaniach te przeciwciała nie były wykrywane w surowicy pacjentów z dobrą funkcją przeszczepu lub u pacjentów niepoddanych transplantacji.
Wynalazek obejmuje sposób izolacji komórki prekursorowej śródbłonka z mieszaniny komórek przez kontaktowanie mieszaniny komórek z odczynnikiem do detekcji w celu wytworzenia kompleksu komórka prekursorowa śródbłonka - odczynnik do detekcji. Kompleks tworzy się przez specyficzną interakcję powinowactwa między odczynnikiem do detekcji a komórką. Kompleks oddziela się od mieszaniny, aby wyizolować komórkę prekursorową, śródbłonka. Kompleks oddziela się od mieszaniny stosując techniki znane w dziedzinie, takie jak np. chromatografia cieczowa (np. HPLC lub FPLC), wysokowydajna chromatografia membranowa (HPMC), cytometria przepływowa lub zastosowanie pola magnetycznego.
Alternatywnie kompleks oddziela się od mieszaniny przez przyłączenie odczynnika do detekcji do stałego nośnika. Może być stosowany etap płukania przez ponowne zawieszenie kompleksu w biologicznie kompatybilnym roztworze. Kompleks może być ponownie zawieszony tzn. płukany tyle razy, ile jest to konieczne. Typowo cząsteczki płucze się trzy razy. Biologicznie kompatybilny roztwór obejmuje bufory biologiczne znane w dziedzinie, takie jak buforowana fosforanem sól fizjologiczna (PBS).
Odczynnikiem do detekcji jest przeciwciało swoiste dla Tie-2. Przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym lub przeciwciałem poliklonalnym. Określenie „przeciwciało''' obejmuje nie tylko nienaruszone przeciwciało, ale także immunologicznie czynny fragment przeciwciała, np. fragment Fab lub (Fab)2; skonstruowaną cząsteczkę Fv o pojedynczym łańcuchu; lub chimerową cząsteczkę np. przeciwciało, które zawiera specyficzność wiązania z jednego przeciwciała, np. pochodzenia mysiego
PL 212 661 B1 i pozostałe części z innego przeciwciała np. pochodzenia ludzkiego. Na przykład, odczynnik do detekcji jest monoklonalnym przeciwciałem wobec Tie-2.
Odczynnik do detekcji może być przyłączony do stałego nośnika. Stały nośnik stanowi cząstkę, polimer (np. polistyren, polietylen), naczynie, komora, pasek do zanurzania, perełki, cząstkami, membrany (np. nylon, nitroceluloza lub difluorek poliwinylidenu (PVDF)) lub inne formy znane w dziedzinie.
Stały nośnik może nieść grupy funkcjonalne, takie jak hydroksyl, karboksyl, grupa aldehydowa lub grupy aminowe. Stały nośnik może być naładowany dodatnio, naładowany ujemnie lub hydrofobowy. Funkcjonalizowane powleczone nośniki mogą być przygotowane przez modyfikację nośnika. Na przykład, niepowleczony nośnik traktuje się polimerem niosącym takie grupy funkcjonalne, jak poliuretan razem z poliglikolem w celu dostarczenia grup hydroksylowych lub pochodną celulozy w celu dostarczenia grup hydroksylowych, polimerem lub kopolimerem kwasu akrylowego lub kwasu metakrylowego aby dostarczyć grupy karboksylowe, lub aminoalkilowanym polimerem aby dostarczyć grupy aminowe. W opisie patentów US Nr 4,654,267 opisano wprowadzenie wielu powłok powierzchniowych.
Cząstka jest wykonana ze związków metalu, krzemionki, lateksu, materiałów polimerowych lub jąder z krzemionki, lateksu lub polimeru powleczonych metalem lub związkiem metalu. Korzystnie cząstka jest wykonana ze związku metalu, takiego jak żelazo, gadolin, cynk, ind, złoto, srebro, kobalt, miedź lub magnez. Najbardziej korzystnie cząstka jest magnesowalna lub magnetyczna. Przez magnesowalna lub magnetyczna rozumie się, że cząstka jest zdolna do posiadania nadanego jej momentu magnetycznego, gdy jest umieszczona w polu magnetycznym.
Odczynnik do detekcji jest znakowany wykrywalnym markerem. Na przykład, odczynnik do detekcji może być znakowany radioaktywnymi izotopami (np. 125I i 131I), enzymami (np. peroksydaza, beta-galaktozydaza, fosfataza alkaliczna) lub substancjami fluorescencyjnymi (np. izotiocyjanian fluoresceiny (FITC). Znaczniki oznacza się ilościowo za pomocą konwencjonalnych sposobów dobrze znanych w dziedzinie i oznacza się w ten sposób ilość wytworzonego kompleksu immunologicznego. Mieszanina komórek jest dowolną próbką, o której wiadomo, że zawiera komórki prekursorowe śródbłonka, lub w której przypuszczalnie jest zawarta taka komórka.
Komórka prekursorowa śródbłonka jest dowolną komórką pochodzącą z dowolnej części pnia naczyniowego. Na przykład, komórka prekursorowa śródbłonka pochodzi z dużych i małych żył i naczyń włosowatych i żyły pępowinowej noworodków, naczyń krwionośnych w mózgu lub z unaczynionych guzów litych. Komórka prekursorowa śródbłonka jest komórką prekursorową śródbłonka, która jest Tie-2 dodatnia.
Sposoby specyficznej dla dawcy próby krzyżowej
Próba krzyżowa wykrywa te różnice antygenowe, na które biorca jest już uczulony. Dawcę poddaje się próbie krzyżowej z biorcą. Najpierw kontaktuje się próbkę dawcy z odczynnikiem do detekcji, aby wyizolować komórkę prekursorową śródbłonka. Próbkę biorcy kontaktuje się z izolowaną komórką prekursorową śródbłonka i określa się reaktywność próbki biorcy z izolowaną komórką prekursorową śródbłonka. Przez reaktywność rozumie się, że tworzy się kompleks przez specyficzną interakcję powinowactwa między próbką biorcy i komórką. Brak reaktywności między próbką biorcy i izolowaną komórką prekursorową śródbłonka wskazuje na zgodność między próbką dawcy i biorcy. Przeciwnie, reaktywność próbki biorcy z izolowaną komórką prekursorową śródbłonka wskazuje na brak zgodności między próbką dawcy i biorcy. Zgodność jest mierzona brakiem lub niskim nadostrym odrzucaniem przeszczepu dawcy przez biorcę.
Dawca i biorca są np. dowolnym ssakiem, np. człowiekiem, świnią, krową lub koniem. Dawca i biorca pochodzą z tego samego gatunku. Alternatywnie dawca i biorca pochodzą z różnych gatunków.
Próbką dawcy i biorcy jest, na przykład, pełna krew, surowica, leukaferyzat, szpik kostny, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej lub homogenat tkankowy. Ewentualnie próbki są poddane wstępnemu etapowi oczyszczania przed próbą krzyżową.
Reaktywność jest określana za pomocą sposobów znanych w dziedzinie. Na przykład, reaktywność jest mierzona za pomocą oznaczenia ELISA, cytometrii przepływowej (np. próba krzyżowa za pomocą cytometrii przepływowej), lub zależną od dopełniacza próbą krzyżową, Iimfotoksyczności.
Zaburzenia naczyniowe i immunologiczne
Wynalazek niniejszy umożliwia diagnozowanie, ocenę prognozy i monitorowanie przebiegu zaburzeń naczyniowych i immunologicznych przez stosowanie izolowanych komórek prekursorowych śródbłonka.
W tym celu z próbki testowej od osobnika, o której wiadomo, że próbka zawiera, lub w której przypuszczalnie jest zawarta komórka prekursorowa śródbłonka, izoluje się komórkę prekursorową
PL 212 661 B1 śródbłonka. Zaburzenie immunologiczne diagnozuje się przez skontaktowanie wyizolowanej komórki prekursorowej śródbłonka z próbką od badanego osobnika, która zawiera, lub w której przypuszczalnie jest zawarte autoprzeciwciało i identyfikuje się kompleks autoprzeciwciało-komórka prekursorowa śródbłonka. Obecność kompleksu autoprzeciwciało-komórka prekursorowa śródbłonka wskazuje, że osobnik cierpi na lub ma predyspozycje do choroby immunologicznej.
Przeciwnie nieobecność kompleksu autoprzeciwciało-komórka prekursorowa śródbłonka wskazuje, że osobnik nie cierpi na lub nie ma predyspozycji do choroby immunologicznej.
Zaburzenie naczyniowe diagnozuje się przez skontaktowanie wyizolowanej komórki prekursorowej próbki z próbką od badanego osobnika. Druga próbka pochodzi od osobnika. Alternatywnie próbka od badanego osobnika zawiera przeciwciała w stosunku do markerów powierzchniowych komórki, o których wiadomo, że są związane z danym zaburzeniem naczyniowym. Obecność kompleksu próbka od badanego osobnika - komórka prekursorowa śródbłonka wskazuje, że osobnik cierpi na lub ma predyspozycję do choroby naczyniowej. Przeciwnie, nieobecność takiego kompleksu wskazuje, że osobnik nie cierpi na lub nie ma predyspozycji do choroby naczyniowej.
Wykrywanie kompleksu pozwala na monitorowanie przebiegu leczenia choroby naczyniowej lub immunologicznej lub na określenie prognozy dla osobnika. W tym celu dostarczana jest próbka testowa od osobnika poddawanego leczeniu choroby.
Jeśli jest to pożądane, próbki testowe uzyskuje się od osobnika w różnych punktach czasowych przed, po lub w czasie leczenia. Następnie określa się obecność kompleksu komórki prekursorowej śródbłonka, aby utworzyć profil osobnika.
Profil osobnika porównuje się z profilem referencyjnym o znanym stanie zaburzenia naczyniowego lub zaburzenia immunologicznego. Profil referencyjny nie był poddany leczeniu. Profil referencyjny pochodzi z typu próbki podobnego do próbki testowej. Ewentualnie, profil referencyjny pochodzi z bazy danych informacji molekularnej pochodzącej z próbek, dla których mierzony parametr lub stan jest znany.
Jeśli profil referencyjny nie zawiera kompleksu autoprzeciwciało-komórka prekursorowa śródbłonka, podobieństwo w ilości kompleksów między profilem osobnika i profilem referencyjnym wskazuje, że leczenie jest skuteczne (np. że jeden lub więcej objawów zaburzenia immunologicznego jest złagodzonych lub że ostrość zaburzenia jest zmniejszona), stąd korzystna prognoza dla osobnika. Jednak przesunięcie w ilości kompleksów między profilem osobnika i profilem referencyjnym wskazuje, że leczenie nie jest skuteczne i stąd niekorzystna prognoza dla osobnika.
Gdy profil referencyjny zawiera kompleksy autoprzeciwciało-komórka prekursorowa śródbłonka np. gdy profil referencyjny obejmuje kompleksy pobrane od osobnika w momencie diagnozy ale przed rozpoczęciem terapii, podobieństwo w ekspresji wzorów kompleksów między profilem osobnika i profilem referencyjnym wskazuje, że terapia nie jest skuteczna. Przeciwnie, przesunięcie w ekspresji kompleksów w profilu osobnika i profilu referencyjnym wskazuje, że terapia jest skuteczna.
Przez skuteczne rozumie się leczenie, które prowadzi do zmniejszania dowolnych objawów choroby autoimmunologicznej u uprzednio wymienionego osobnika. Gdy leczenie jest stosowane profilaktycznie, skuteczne oznacza, że leczenie opóźnia lub zapobiega zaburzeniom autoimmunologicznym lub naczyniowym.
Zaburzenie immunologiczne obejmuje zaburzenia z udziałem mechanizmu immunologicznego, takiego jak odkładanie kompleksów immunologicznych, stany zapalne, bezpośredni atak przez krążące przeciwciała (np. zaburzenia autoimmunologiczne). Zaburzenie autoimmunologiczne lub zaburzenie związane z zaburzeniem immunologicznym obejmuje te zaburzenia, które są powodowane przez odpowiedź odpornościową przeciw własnym tkankom organizmu. Zaburzenia autoimmunologiczne powodują zniszczenie jednego lub więcej typów tkanek organizmu, nienormalny wzrost narządu lub zmiany w funkcjonowaniu narządu. Zaburzenie może wpływać tylko na jeden narząd lub typ tkanki lub może wpływać na wiele narządów i tkanek. Narządy i tkanki, na które często działają zaburzenia autoimmunologiczne, obejmują składniki krwi, takie jak krwinki czerwone, naczynia krwionośne, tkanki łączne, gruczoły wewnątrzwydzielnicze, takie jak tarczyca lub trzustka, mięśnie, stawy i skórę. Zaburzenia autoimmunologiczne obejmują, na przykład, autoimmunizacyjną anemię hemolityczną, autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, chorobę Bergera, zespół przewlekłego zmęczenia, chorobę Crohna, zapalenie tarczycy Hashimoto, fibromialgię, ogólnoustrojowy toczeń rumieniowaty, chorobę Gravesa, wrodzoną plamicę płytkową, stwardnienie rozsiane, łuszczycę, gorączkę reumatyczną, reumatoidalne zapalenie stawów.
Zaburzenia naczyniowe obejmują choroby związane z układem naczyniowym. Na przykład, zapalenie naczyń, miażdżycę tętnic, zaburzenia krwawienia, wadliwe gojenie się ran.
PL 212 661 B1
Objawy zaburzenia autoimmunologicznego zależą od konkretnej choroby i narządu lub tkanki, która jest dotknięta. Na przykład, ogólnoustrojowy rumień może powodować niewydolność nerek, zapalenie stawów i wysypkę skórną na twarzy. Autoimmunizacyjna anemia hemolityczna powoduje anemię czyli niską liczbę czerwonych krwinek. Na ogół objawy zaburzeń autoimmunologicznych mogą obejmować: niewielką gorączkę, złe samopoczucie, które jest niewyraźnym odczuciem choroby, zmęczenie, lub łatwe męczenie się.
Zaburzenia autoimmunologiczne są diagnozowane w oparciu o objawy, badanie fizyczne i wyniki testów krwi.
Terapia mająca na celu zmniejszenie objawów może obejmować: niesteroidowe leki przeciwzapalne (non-steroidal anti-inflammatory drugs - NSAID), w tym, aspirynę lub ibuprofen, w celu zmniejszenia gorączki, bólów stawów, i bólów mięśni, kortykosteroidy lub steroidy, które pomagają w zmniejszeniu zapalenia. Te leki są często stosowane krótkoterminowo, aby pomóc osobie przejść przez nagły epizod lub wznowienie. Leki tłumiące układ odpornościowy, takie jak metotreksat, azatiopryna i cyklofosfamid, pomagają w zmniejszeniu zapalenia i uszkodzenia narzą dów. W pewnych przypadkach mogą być potrzebne inne terapie. Na przykład, może być potrzebna chirurgia dla zablokowanych jelit, co może wystąpić w chorobie Crohna. Potrzebna może być transfuzja krwi w ostrych przypadkach autoimmunizacyjnej anemii hemolitycznej. Insulina jest podawana osobnikom z cukrzycą typu 1, aby kontrolować poziomy glukozy we krwi.
Powyższe metody stosuje się korzystnie u ssaków. Ssak może być np. człowiekiem, naczelnym nie będącym człowiekiem, myszą, szczurem, psem, kotem, koniem lub krową.
P r z y k ł a d 1: Przyłączenie Mab anty-Tie-2 do perełek magnetycznych
Mysie monoklonalne przeciwciała anty-ludzki Tie-2 (Mabs) (BD Pharmingen, Oxford, UK) najpierw przyłączono do Pan Mouse Dynabeads z łącznikiem DNA (nr kat.115. 19) (DYNAL, Oslo, Norwegia). W tym celu 10 μg Mab Tie-2 dodano do 500 μl Pan Mouse Dynabeads. Zawiesinę perełekMab poddano mieszaniu w urządzeniu do wytrząsania i obracania przez 24 godziny w 4°C. Nadmiar Mab usunięto i perełki powleczone Tie-2 Mab blokowano 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 0,1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w urządzeniu do wytrząsania i obracania w 4°C przez 10 minut. Etap blokowania powtórzono sześć razy, po czym perełki ponownie zawieszono w oryginalnej objętości (500 μΓ> PBS/0,1% BSA.
P r z y k ł a d 2: Izolacja komórek Tie-2+ z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)
Ze względu na dużą liczbę komórek wymaganych do ustalenia specyficzności komórek Tie-2+, we wstępnych doświadczeniach PBMC izolowano z leukaferyzatu zdrowych dawców krwi za pomocą wirowania w gradiencie z Lymphoprep (Nycomed-Oslo, Norwegia). EC izolowano z PBMC stosując perełki magnetyczne powleczone Mab anty-Tie-2. PBMC najpierw umieszczono w kilku probówkach w każdej po 40 x 106 komórek. Do każdej probówki dodano 15 μl perełek magnetycznych uprzednio powleczonych Tie- i inkubowano w objętości 500 μl podłoża RPMI (GIBCO, Paisley, UK) uzupełnionego 2 mM L-glutaminą i 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą. Komórki+perełki inkubowano w urządzeniu do wytrząsania i obracania w 4°C przez 30 minut. Komórki Tie-2+ rozdzielono po obfitym płukaniu (5-6 razy) z PBS stosując magnes. Komórki Tie-2+ ze wszystkich probówek łączono i liczono rozetki pod mikroskopem świetlnym.
P r z y k ł a d 3: Izolacja komórek Tie-2+ bezpośrednio z krwi obwodowej ml heparynizowanej krwi uzyskano od normalnych zdrowych dawców. Krew płukano jeden raz jak następuje: 10 ml krwi rozcieńczono za pomocą 40 ml PBS/0,1% BSA. Krew odwirowano przy 800 g przez 10 minut. Supernatant odrzucono, a komórki krwi zawieszono w 10 ml PBS zawierającego 0,6% cytrynianu sodu. Do każdej probówki dodano 50 μl perełek magnetycznych powleczonych Mab Tie-2 i inkubowano przez 30 minut w 4°C w urządzeniu do wytrząsania i obracania. Komórki Tie2+ zebrano za pomocą magnesu i płukano raz PBS-Na-cytrynianem. Po 4-5 płukaniach PBS, komórki Tie-2+ zebrano i stężenie komórek doprowadzono do około 3-4 x 106 komórek/ml. Komórki te otoczone przez perełki stosowano albo w oznaczeniu mikrocytotoksyczności albo cytometrii przepływowej.
P r z y k ł a d 4: Immunocytochemia
Mab stosowane do analizy immunocytochemii i FACS podano w Tabeli 1. Z leukaferyzatu normalnych ochotników uzyskano wystarczającą liczbę komórek Tie-2+, aby przeprowadzić różne analizy immunocytochemiczne. Komórki Tie-2+ hodowano na płytkach do hodowli tkankowej powleczonych fibronektyną. Umożliwiono przyłączenie się komórek (24 godz.) przed barwieniem do różnych specyficznych dla EC markerów. Komórki pozostawiano albo bez traktowania albo stymulowano TNF-α i IFN-γ przez 14 godzin. Do immunocytochemii komórki utrwalano stosując 30%
PL 212 661 B1 aceton w metanolu przez 1 minutę. Po dwóch płukaniach PBS, komórki blokowano stosując 1% bydlęcą albuminę surowiczą (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki płukano dwukrotnie PBS i inkubowano z wymienionymi powyżej pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi 1:100 (w PBS) w 4°C przez 2 godziny. Drugorzędowe przeciwciało było antymysim IgG kozy skoniugowanym z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) rozcieńczonym 1:500 (w PBS). Po inkubacji przez 1 godzinę w 4°C, komórki płukano dwa razy i analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym.
P r z y k ł a d 5: Oznaczenie cytometrią przepływową w celu detekcji przeciwciał przeciw komórce śródbłonka
Zbadano łącznie 50 surowic od pacjentów po przeszczepach nerki. W ciągu ostatnich lat (19882001) surowice pretransplantacyjne od pacjentów chorych na nerki starannie scharakteryzowano, stosując różne metody, na obecność przeciwciał specyficznych względem komórki śródbłonka reagujących z śródbłonkiem-monocytami i HLA, które, jak stwierdzono, towarzyszą odrzuceniom. W tych latach zebrano surowic pretransplantacyjnych, scharakteryzowanych jako mające przeciwciała antyEM lub specyficzne dla EC od niealloimmunizowanych pacjentów z odrzutami.
Na ogół sposoby tutaj opisane są oparte na tych 15 surowicach. Uprzednie charakterystyki wykazały, że 10 surowic dało dodatnie reakcje z liniami komórek śródbłonka ludzkiej krwi pępowinowej (HUVEC) i monocytami (Tabela 2, punkty nr 1-10), a 5 surowic tylko z EC (Tabela 2, punkty nr 11-15). Ponieważ żaden z piętnastu pacjentów z przeciwciałami specyficznymi względem EM lub EC nie został alloimmunizowany, nie stwierdzono wykrywalnych alloprzeciwciał HLA w tych surowicach. Dodatkowo, wybrano 10 dobrze scharakteryzowanych surowic od alloimmunizowanych pacjentów, o których było wiadomo, że zawierają tylko alloprzeciwciała HLA klasy I lub tylko klasy II (Tabela 2). Jako kontrolę testowano także 25 surowic od pacjentów bez odrzucenia przeszczepów.
Stosując te surowice stwierdzono, czy izolowane komórki Tie-2+ mogły być odpowiednimi celami dla wykrywania klinicznie istotnych przeciwciał w transplantacji nerki. Pula surowic od pacjentów, którzy wytworzyli alloprzeciwciała w wyniku wielokrotnych transfuzji krwi lub przeszczepów narządów, była stosowana jako kontrola dodatnia. Surowice od zdrowych mężczyzn o grupie krwi AB niepoddanych transfuzji służyły jako kontrole ujemne. Stosowano następujące przeciwciała: skoniugowane z FITC fragmenty F(ab')2 koziej anty-ludzkiej IgG (Fc specyficzne) lub IgM (Immunotech, USA). Do cytometrii przepływowej ECXM stosowano 100000 komórek Tie-2+ sprzężonych z perełkami i procedurę przeprowadzano, jak opisano uprzednio. Komórki analizowano w cytometrze przepływowym Becton Dickinson (FACSorter). Przesunięcie w średniej fluorescencji 10 kanałów w próbie testowej w porównaniu z kontrolą ujemną uważano jako dodatnie, oznaczone jak opisano uprzednio. Ta wartość jest arbitralna i powinna być oznaczona przez każde laboratorium transplantacyjne. Komórki Tie-2+ stosowano także w rutynowo przeprowadzanym oznaczeniu immunomagnetycznym mikrocytotoksyczności, jak opisano gdziekolwiek. Dodatkowo komórki Tie-2+ bezpośrednio po izolacji testowano w cytometrze przepływowym na wszystkie markery powierzchniowe komórek śródbłonka (Tabela 1).
P r z y k ł a d 6: Analiza immunocytochemiczna i FACS markerów komórek śródbłonka na izolowanych komórkach Tie-2+
Tie-2+ EC izolowano z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą selekcji na perełkach magnetycznych. Analiza FACS pokazała, że około 3-4% PBMC było Tie-2+ (Fig. 1). Po 24 godzinach w hodowli większość komórek Tie-2+ przyłączyła się do powleczonych fibronektyną płytek 24-studzienkowych i stała się przylegająca. Na początku komórki te pojawiały się albo jako pojedyncze komórki lub jako klastry okrągłych komórek, które po kilku dniach hodowli przekształcały się w komórki przylegające z rozległą cytoplazmą. Po 4 dniach w hodowli komórki stopniowo wykształcały kształt wrzeciona (Fig. 2a-c). Na Fig. 3 i w Tabeli 1 podsumowano wyniki analizy immunocytochemicznej stosując przeciwciała w stosunku do znanych antygenów komórek śródbłonka. Już przy 0 godzin, analiza FACS wskazywała, że komórki Tie-2+ wyrażały receptor acLDL, vWF, VEGFR-1, i silnie wyrażały antygeny HLA klasy I i HLA klasy II. Istotne jest, że komórki wyrażały klinicznie ważny antygen MICA, choć słabo. Po aktywacji cytokinami, komórki wyrażały zarówno specyficzne dla komórek śródbłonka cząsteczki adhezyjne CD62 E (E-selektyna) i CD 106 (VCAM), jak i miały zwiększoną ekspresję HLA klasy II. Zatem zarówno analiza immunocytochemiczna jak i FACS wykazały, że komórki Tie-2+ wyrażały większość markerów komórek śródbłonka.
PL 212 661 B1
P r z y k ł a d 7: Wykrywanie przeciwciał reagujących wobec komórek śródbłonka
Przeciętnie od pojedynczych dawców można otrzymać około 3-4x104 komórek Tie-2+/106 PBMC.
Ponieważ analizowano tu dużą ilość surowic, komórki Tie-2+ izolowano z leukaferyzatu zdrowych dawców krwi. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2. Wszystkie 10 surowic, o których wiadomo, że mają przeciwciała śródbłonek-monocyt i 5 surowic z przeciwciałami specyficznymi dla komórek śródbłonka, wykazywało zmienne wzory reaktywności z panelem komórek Tie-2+ od sześciu różnych dawców. Jednak frakcje Tie-2-, które obejmowały limfocyty od tych samych dawców, nie reagowały z żadną z surowic. Wzory reaktywności z panelem komórek Tie-2+ zarówno przeciwciał specyficznych dla śródbłonka-monocytów i komórek śródbłonka jak widać w Tabeli 2, wskazują na istnienie polimorfizmu w tych antygenowych systemach lub alternatywnie obecność przeciwciał z różnymi specyficznościami.
Surowice, o których wiadomo, że zawierają tylko reagujące szeroko alloprzeciwciała HLA klasy I, dały również dodatnie wyniki w każdym przypadku z komórkami Tie-2+ od pojedynczych dawców. W niestymulowanych komórkach Tie-2+ obserwowano także reaktywność alloprzeciwciał HLA klasy II (ograniczone specyficzności. 3/25 (12%) surowic od pacjentów kontrolnych bez odrzuceń i ze stabilnymi funkcjami przeszczepów dało pozytywne reakcje z czterema dawcami panelu Tie-2 (Tabela 2). Wyniki uzyskane z zastosowaniem immunomagnetycznego oznaczenia mikrocytotoksyczności zgadzały się z wynikami uzyskanymi z cytometrii przepływowej (Tabela 3).
P r z y k ł a d 8: Specyficzne dla dawcy próby krzyżowe komórek śródbłonka
Specyficzne dla dawcy próby krzyżowe komórek śródbłonka przeprowadzono retrospektywnie w dwóch przypadkach, w których były dostępne zamrożone jednojądrzaste komórki krwi obwodowej. Pierwsze przeszczepy nerek u obu pacjentów utracono w nadostrych odrzutach przy braku możliwych do wykazania przeciwciał specyficznych dla HLA dawcy. Krzyżowe surowice od jednego z tych pacjentów były uprzednio dobrze scharakteryzowane jako mające przeciwciała specyficzne względem komórek śródbłonka z zastosowaniem HUVEC.
W tym przypadku wyizolowano komórki Tie-2+ z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej pierwszego dawcy (ojciec) (punkt nr 11, Tabela 2) i trzymano zamrożone w ciekłym N2. Retrospektywnie przeprowadzono próbę krzyżową z surowicą pacjenta pobraną bezpośrednio przed pierwszym przeszczepem. Wyniki przedstawiono na Fig. 4b-d. Wyniki z drugiego przypadku (punkt nr 12, Tabela 2) są bardzo podobne do punktu nr 11 i są przedstawione na Fig. 4e-g. Jak widać w Tabeli 2, surowice z obu tych punktów dały podobny wzór reaktywności z panelem komórek Tie-2+. Nie obserwowano reaktywności z frakcjami Tie-2-.
T a b e l a 1. Przeciwciała stosowane do barwienia immunocytochemicznego i analizy za pomocą cytometrii przepływowej komórek Tie-2+ izolowanych z pełnej krwi
| Przeciwciała | Firma | Immunocytochemia | FACS |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| CD1a | Becton Dickinson (BD) USA | - | - |
| CD3 | BD | - | - |
| CD14 | BD | (+)/+ | (+)/+ |
| CD19 | BD | - | - |
| CD31 | BD | - | - |
| CD34 | BD | - | - |
| CD56+16 | BD | - | - |
| CD68 | BD | ++ | ++ |
| CD83 | BD | - | - |
| CD62E(anty-E-selektyna) | Biogenesis-UK (Wielka Brytania) | +* | +* |
| CD106(anty-VCAM) | Biogenesis-UK | ++* | ++* |
| CD54 (anty-ICAM) | R&D Systems-UK | +* | +* |
| VWF | Serotec-UK | ++ | ++ |
PL 212 661 B1 cd tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Ac-LDL | Molecular Probes, Inc-USA | +++ | +++ |
| VEGF-R1 (Fit-1) | R&D Systems | +++ | +++ |
| MHC klasa I | Serotec-UK | +++ | +++ |
| MHC klasa II | Serotec-UK | + | + |
| MICA | Dr. Thomas Spies | (+)/+ | (+)/+ |
| Anty-fibroblast | Serotec-UK | - | - |
| Anty-a-aktyna | Boehringer Mannheim-Niemcy | - | - |
(+), słabe lub zmienne barwienie; +, umiarkowane barwienie; ++, silne barwienie; +++, bardzo silne barwienie; vWF, czynnik von Willebranda; Ac-LDL, acetylowana lipoproteina o niskiej gęstości; MICA, (Major histocompatibility complex class I-related chain A) łańcuch A związany z głównymi antygenami zgodności tkankowej klasy I.
* wyrażany na komórkach Tie-2+ tylko po aktywacji TNF-alfa i IFN-gamma przez 12-14 godzin.
T a b e l a 2. Badanie za pomocą cytometrii przepływowej reaktywności przeciwciał anty-śródbłonek-monocyt, specyficznych wobec śródbłonka i specyficznych wobec antygenów HLA klasy I lub klasy II z panelem komórek Tie-2+
| Punkt nr | Dawca 1 Tie-2+/Tie-2' | Dawca 2 Tie-2+/Tie-2' | Dawca 3 Tie-2+/Tie-2' | Dawca 4 Tie-2+/Tie-2' | Dawca 5 Tie-2+/Tie-2- | Dawca 6 Tie-2+/Tie-2- |
| Surowice zawierające przeciwciała reagujące z EM | ||||||
| 1 | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- |
| 2 | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- |
| 3 | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- |
| 4 | +/- | -/- | -/- | +/- | -/- | +/- |
| 5 | -/- | -/- | +/- | +/- | +/- | -/- |
| 6 | -/- | +/- | +/- | +/- | +/- | -/- |
| 7 | -/- | +/- | +/- | +/- | +/- | -/- |
| 8 | -/- | -/- | -/- | +/- | -/- | +/- |
| 9 | +/- | +/- | -/- | -/- | +/- | -/- |
| 10 | +/- | +/- | -/- | -/- | +/- | -/- |
| Surowice zawierające tylko przeciwciała reagujące z EC | ||||||
| 11 | +/- | +/- | -/- | +/- | -/- | -/- |
| 12 | +/- | +/- | -/- | +/- | -/- | -/- |
| 13 | -/- | -/- | +/- | -/- | +/- | +/- |
| 14 | -/- | -/- | +/- | -/- | +/- | +/- |
| 15 | -/- | -/- | +/- | -/- | +/- | +/- |
| Surowice zawierające tylko przeciwciała reagujące szeroko z HLA klasy I (n = 5) | ||||||
| 16 | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ | +/+ |
| Surowice zawierające tylko przeciwciała reagujące z HLA klasy II (n = 5) | ||||||
| 17 | +/+ | -/- | -/- | +/+ | -/- | +/+ |
| Kontrolne surowice od pacjentów ze stabilną funkcją przeszczepu (n = 25) | ||||||
| 18 | -/-* | -/- | -/-* | -/- | -/- | -/-* |
*3/25 (12%) surowic reagowało z częścią komórek Tie-2 w panelu
PL 212 661 B1
T a b e l a 3. Reaktywność przeciwciał anty-śródbłonek-monocyt, specyficznych wobec śródbłonka i specyficznych wobec antygenów HLA klasy I lub klasy II w oznaczeniu mikrocytotoksyczności
| Punkt nr | Dawca 1 Tie-2+/Tie-2 | Dawca 2 Tie-2+/Tie-2 | Dawca 3 Tie-2+/Tie-2 | Dawca 4 Tie-2+/Tie-2 | Dawca 5 Tie-2+/Tie-2 | Dawca 6 Tie-2+/Tie-2 |
| Surowice zawierające przeciwciała reagujące z EM | ||||||
| 1 | ++/- | +++/- | ++/- | ++/- | ++/- | +++/- |
| 2 | ++/- | +/- | +++/- | ++/- | +++/- | ++/- |
| 3 | +++/- | ++/- | ++/- | ++/- | ++/- | ++/- |
| 4 | +++/- | -/- | -/- | +++/- | -/- | +++/- |
| 5 | -/- | ++/- | ++/- | ++/- | ++/- | -/- |
| 6 | -/- | ++/- | ++/- | ++/- | ++/- | -/- |
| 7 | -/- | ++/- | ++/- | ++/- | ++/- | -/- |
| 8 | -/- | -/- | -/- | ++/- | -/- | ++/- |
| 9 | +++/- | ++/- | -/- | -/- | ++/- | -/- |
| 10 | ++/- | ++/- | -/- | -/- | ++/- | -/- |
| Surowice zawierające tylko przeciwciała reagujące z EC | ||||||
| 11 | +++/- | ++/- | -/- | +++/- | -/- | -/- |
| 12 | ++/- | +++/- | -/- | ++/- | -/- | -/- |
| 13 | -/- | -/- | ++/- | -/- | ++/- | ++/- |
| 14 | -/- | -/- | ++/- | -/- | ++/- | ++/- |
| 15 | -/- | -/- | ++/- | -/- | ++/- | ++/- |
| Surowice zawierające tylko przeciwciała reagujące szeroko z HLA klasy I (n = 5) | ||||||
| 16 | +++/+++ | +++/+++ | ++++/++++ | +++/+++ | +++/+++ | +++/+++ |
| Surowice zawierające tylko przeciwciała reagujące z HLA klasy II (n = 5) | ||||||
| 17 | ++/++ | -/- | -/- | ++/++ | -/- | ++/++ |
| Kontrolne surowice od pacjentów ze stabilną funkcją przeszczepu (n = 25) | ||||||
| 18 | -/-* | -/- | -/-* | -/- | -/- | -/- |
-2/25 (8%) surowic reagowało z częścią komórek Tie-2 w panelu
-, ujemne; +, 10-25%; ++, 26-50%; +++, 51-75%; +++, 76-100% martwych komórek.
PL 212 661 B1
Literatura
Kissmeyer-Nielsen F, Olsen S, Posborg-Petersen V, Fjeldborg O. Hyperacute rejection of kidney allografts, associated with pre-existing humoral antibodies against donor cells. Lancet 1966; 2: 662.
Ting A. Positive crossmatches--when is it safe to transplant? Transplant Int. 1989; 2: 2.
Sumitran-Karuppan S. The clinical importance of choosing the right assay for detection of HLAspecific donor-reactive antibodies. Transplantation 1999; 68: 502.
Chapman JR, Taylor CJ, Ting A, Morris PJ. Immunoglobulin klasy and specificity of antibodies causing positive T cell crossmatches. Relationship to renal transplant outcome. Transplantation 1989; 42: 608.
Brasile L, Rodman E, Shield CFd, Clarke J, Cerilli J. The association of antivascular endothelial cell antibody with hyperacute rejection: a case report. Surgery 1986; 99: 637.
Sumitran-Karuppan S, Tyden G, Reinholt F, Berg U, Moller E. Hyperacute rejections of two Conseoutive renal allografts and early Ioss of the third transplant caused by non-HLA antibodies specific for endothelial cells. Transplant Immunol. 1997; 5:321.
Cerilli J, Brasile L. Endothelial cell alloantigens. Transplant. Proc. 1980; 12 (3 Supply): 37.
Stastny P. Endothelial-monocyte antigens. Transplant. Proc. 1980; 12 (3 Suppl 1): 32.
Pierce JC, Waller M, Phibbs M. A mixed antiglobulin test with kidney cells in suspension for IgG antibody in human allograft recipients. Transplantation 1975; 19: 343.
Wilson CB. Individual and strain differences in renal basement membrane antigens. Transplant.
Proc. 1980; 12 (3 Suppl 1): 69.
Paul LC, Carpenter CB. Antibodies against renal endothelial alloantigens. Transplant. Proc.
1980; 12 (3 Suppl 1): 43.
Mohanakumar T, Waldrep JC, Phibbs M, Mendez-Picon G, Kaplan AM, Lee HM. Serological characterization of antibodies eluted from chronically rejected human renal allografts. Transplantation
1981; 32: 61.
Hosenpud JD, Everett JP, Morris TE, Mauck KA, Shipley GD,
Wagner CR. Cardiac aliograft vasculopathy. Association with cell-mediated but not humoral alloimmunity to donor-specific vascular endothelium. Cireulation 1995; 92: 205.
Perrey C, Brenchley PE, Johnson RW, Martin S. An association between antibodies specific for endothelial cells and renal transplant failure. Transplant Immunol. 1998; 6: 101.
Kalil J, Guilherme L, Neumann J, i wsp. Humoral rejection in two HLA identical Iiving related donor kidney transplants. Transplant. Proc 1989; 21 (1 Pt1): 711.
Sumitran-Holgersson S, Wilczeck H, Holgersson J i Soderstrm K: Identification of the nonclassical HLA molecules, MICA, as targets for humoral immunity associated with irreversible rejections of kidney allografts. Przyjęte. Transplantation.
Cerilli J, Bay W, Brasile L: The significance of the monocyte crossmatch in recipients of livingrelated HLA identical kidney graft. Hum Immunol. 1983; 7: 45.
Ianhez L, Saldanha LB, Paula FJ i WSP.: Humoral rejection with negative crossmatches. Transplant Proc. 1989; 21: 720.
Asahara T, Murohara T, Sullivan A. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964.
Peichev M, Naiyer AJ, Pereira D i wsp. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood 2000; 95: 952.
Vartdal F, Gaudernack G, Funderud S, Brattie A, Lea T, Ugerstad S i Thorsby E : HLA class I and II typing using cells positively selected from blood by immunomagnetic isolation-a fast and reliable technique. Tissue Antigens 1986; 28: 301.
PL 212 661 B1
Sumitran-Karuppan S, Lindholm A, Moller E: Fewer acute rejection episodes and improved outcome in kidney transplanted patients with changed selection of criteria based on cross-matching/ Transplantation 1992; 53: 666.
Sumitran-Karuppan S, Moller E: Specific inhibition of HLA class I and II antibodies by soluble antigens-A method for the identification of antibody specificity in sera from alloimmunized individuals. Transplantation 1994; 58: 713.
Sumitran-Karuppan S, Moller E. The use of magnetic beads coated with soluble HLA class I or class II proteins in antibody screening and for specificity determinations of donorreactive antibodies. Transplantation 1996; 61: 1539.
Moraes JR, Moraes ME, Luo Y, Stastny P: Alloantibodies against donor epidermis and early kidney transplant rejection. Transplantation 1991; 51: 370.
Schnurch H, Risau W. Expression of Tie-2, a member of a novel family of receptor tyrosme kinases, in endothelial cell lineage. Development 1993; 119: 957.
Woolf AS, Yuan HT. Angiopoietin growth factors and Tie receptor tyrosine kinases in renal vascular development. Pediatr Neplirol. 2001; 16: 177.
Claims (6)
1. Sposób izolacji komórki prekursorowej śródbłonka z próbki biologicznej, znamienny tym, że obejmuje:
(a) dostarczenie próbki wybranej z grupy składającej się z krwi pełnej, surowicy, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) i leukaferyzatu, zawierającej komórkę prekursorową śródbłonka, lub w której przypuszczalnie jest zawarta taka komórka;
(b) kontaktowanie próbki z odczynnikiem do detekcji zawierającym przeciwciało przeciwko receptorowi powierzchniowemu Tie-2 komórki prekursorowej śródbłonka z wytworzeniem kompleksu przeciwciało-komórka prekursorowa śródbłonka; i (c) oddzielenie kompleksu odczynnik do detekcji-komórka prekursorowa śródbłonka od próbki biologicznej i wyizolowanie w ten sposób komórki prekursorowej śródbłonka, przy czym komórka prekursorowa śródbłonka jest CD34 ujemna.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izolowana komórka prekursorowa śródbłonka jest Tie-2 dodatnia.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozdział kompleksu odczynnik do detekcjikomórka prekursorowa śródbłonka od próbki biologicznej, przeprowadza się za pomocą cytometrii przepływowej lub pola magnetycznego.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało jest przyłączone do stałego nośnika.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stałym nośnikiem jest perełka niemagnetyczna, magnetyczna lub paramagnetyczna.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że izolowane komórki prekursorowe stosuje się w próbie krzyż owej dawcy i biorcy obejmują cej:
(a) izolowanie komórek prekursorowych śródbłonka z próbki dawcy wybranej z grupy składającej się z krwi pełnej, surowic, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i leukaferyzatu, zawierającej komórkę prekursorowa śródbłonka, lub w której przypuszczalnie jest zawarta taka komórka;
(b) skrining próbki biorcy wybranej z grupy składającej się z krwi pełnej, surowic, komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i leukaferyzatu na reaktywność z izolowaną komórką prekursorową śródbłonka;
przy czym brak reaktywności próbki biorcy z izolowaną prekursorową komórką śródbłonka wskazuje na zgodność między dawcą i biorcą.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38103302P | 2002-05-16 | 2002-05-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL373564A1 PL373564A1 (pl) | 2005-09-05 |
| PL212661B1 true PL212661B1 (pl) | 2012-11-30 |
Family
ID=29550055
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL397820A PL397820A1 (pl) | 2002-05-16 | 2003-05-16 | Sposób diagnozowania choroby oraz sposób określenia skuteczności leczenia lub oceny prognozy choroby związanej z odpornością lub naczyniowej u osobnika |
| PL373564A PL212661B1 (pl) | 2002-05-16 | 2003-05-16 | Sposób izolacji komórki prekursorowej sródblonka |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL397820A PL397820A1 (pl) | 2002-05-16 | 2003-05-16 | Sposób diagnozowania choroby oraz sposób określenia skuteczności leczenia lub oceny prognozy choroby związanej z odpornością lub naczyniowej u osobnika |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8173372B2 (pl) |
| EP (1) | EP1458853B1 (pl) |
| AT (1) | ATE449838T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003241107B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0311182A2 (pl) |
| CA (1) | CA2486119C (pl) |
| CY (1) | CY1109815T1 (pl) |
| DE (1) | DE60330223D1 (pl) |
| DK (1) | DK1458853T3 (pl) |
| ES (1) | ES2337244T3 (pl) |
| IL (2) | IL165250A0 (pl) |
| NO (1) | NO20040174L (pl) |
| NZ (1) | NZ537220A (pl) |
| PL (2) | PL397820A1 (pl) |
| PT (1) | PT1458853E (pl) |
| SI (1) | SI1458853T1 (pl) |
| WO (1) | WO2003098212A2 (pl) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8986944B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-24 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples |
| US8980568B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample |
| PL397820A1 (pl) * | 2002-05-16 | 2012-07-16 | Absorber Ab | Sposób diagnozowania choroby oraz sposób określenia skuteczności leczenia lub oceny prognozy choroby związanej z odpornością lub naczyniowej u osobnika |
| WO2008008515A2 (en) | 2006-07-14 | 2008-01-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting rare cells from a biological sample |
| EP2051076A1 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-22 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Interaction of probe molecules and cells as a diagnostic marker |
| US11597770B2 (en) | 2020-01-24 | 2023-03-07 | Pfizer Inc. | Anti-E-selectin antibodies, compositions and methods of use |
Family Cites Families (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4352883A (en) | 1979-03-28 | 1982-10-05 | Damon Corporation | Encapsulation of biological material |
| US4353888A (en) | 1980-12-23 | 1982-10-12 | Sefton Michael V | Encapsulation of live animal cells |
| NO155316C (no) | 1982-04-23 | 1987-03-11 | Sintef | Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler. |
| US5130144B1 (en) | 1984-02-06 | 1995-08-15 | Univ Johns Hopkins | Human stem cells and monoclonal antibodies |
| US4714680B1 (en) * | 1984-02-06 | 1995-06-27 | Univ Johns Hopkins | Human stem cells |
| US4965204A (en) | 1984-02-06 | 1990-10-23 | The Johns Hopkins University | Human stem cells and monoclonal antibodies |
| US5026365A (en) | 1987-04-29 | 1991-06-25 | The University Of Massachusetts | Method and apparatus for therapeutically treating immunological disorders and disease states |
| ES2035317T5 (es) | 1987-11-09 | 1998-03-16 | Becton Dickinson Co | Metodo para analizar celulas hematopoyeticas en una muestra. |
| US5283187A (en) | 1987-11-17 | 1994-02-01 | Brown University Research Foundation | Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion |
| US5158881A (en) | 1987-11-17 | 1992-10-27 | Brown University Research Foundation | Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments |
| US5071741A (en) | 1988-04-18 | 1991-12-10 | Cryolife, Inc. | Cryoprotective agent and its use in cryopreservation of cellular matter |
| DE3829752A1 (de) | 1988-09-01 | 1990-03-22 | Akzo Gmbh | Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration |
| DE3829766A1 (de) | 1988-09-01 | 1990-03-22 | Akzo Gmbh | Verfahren zur herstellung von membranen |
| US5084350A (en) | 1990-02-16 | 1992-01-28 | The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) | Method for encapsulating biologically active material including cells |
| US5061620A (en) | 1990-03-30 | 1991-10-29 | Systemix, Inc. | Human hematopoietic stem cell |
| US5283058A (en) | 1990-08-30 | 1994-02-01 | The General Hospital Corporation | Methods for inhibiting rejection of transplanted tissue |
| SG47470A1 (en) | 1991-04-25 | 1998-04-17 | Univ Brown Res Found | Implantable biocompatible immunoisolatory vehicle for delivery of a selected therapeutic products |
| US5257984A (en) | 1991-10-02 | 1993-11-02 | Norfolk Scientific, Inc. | Blood collector |
| US5955291A (en) * | 1992-01-09 | 1999-09-21 | Alitalo; Kari | Antibodies recognizing tie receptor tyrosine kinase and uses thereof |
| WO1993014191A1 (en) | 1992-01-21 | 1993-07-22 | Cryopharm Corporation | Method of freezing cells and cell-like materials |
| US5518890A (en) | 1992-11-20 | 1996-05-21 | Mccormick & Company, Inc. | Method and apparatus for the quantitation and separation of contaminants from particulate materials |
| AU7568094A (en) | 1993-08-12 | 1995-03-14 | Cytotherapeutics, Inc. | Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules |
| US5518878A (en) | 1993-09-15 | 1996-05-21 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of cultured skin or cornea equivalents with agitation |
| US5482841A (en) | 1994-05-24 | 1996-01-09 | Sangstat Medical Corporation | Evaluation of transplant acceptance |
| US5968753A (en) * | 1994-06-14 | 1999-10-19 | Nexell Therapeutics, Inc. | Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release |
| US5840502A (en) * | 1994-08-31 | 1998-11-24 | Activated Cell Therapy, Inc. | Methods for enriching specific cell-types by density gradient centrifugation |
| US5580714A (en) | 1995-03-08 | 1996-12-03 | Celox Laboratories, Inc. | Cryopreservation solution |
| US5629145A (en) | 1995-03-24 | 1997-05-13 | Organ, Inc. | Cryopreservation of cell suspensions |
| KR0176513B1 (ko) * | 1995-04-13 | 1999-04-15 | 김광호 | 자기 기록/재생장치 |
| US5942385A (en) * | 1996-03-21 | 1999-08-24 | Sugen, Inc. | Method for molecular diagnosis of tumor angiogenesis and metastasis |
| US5843633A (en) * | 1996-04-26 | 1998-12-01 | Amcell Corporation | Characterization of a human hematopoietic progenitor cell antigen |
| WO1998014058A1 (en) | 1996-10-03 | 1998-04-09 | The Regents Of The University Of California | Cryopreservation of human adult and fetal pancreatic cells and human platelets |
| US6103536A (en) | 1997-05-02 | 2000-08-15 | Silver Lake Research Corporation | Internally referenced competitive assays |
| EP0893493A3 (de) * | 1997-07-21 | 2002-12-04 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen |
| US20030100107A1 (en) | 1998-05-29 | 2003-05-29 | Thomas Jefferson University | Compositions and methods for generating differentiated human cells |
| US6376653B1 (en) | 1998-09-28 | 2002-04-23 | Smithkline Beecham Plc | Tie2 antagonist antibodies |
| US6197294B1 (en) | 1998-10-26 | 2001-03-06 | Neurotech S.A. | Cell surface molecule-induced macrophage activation |
| US6309643B1 (en) | 1999-04-30 | 2001-10-30 | The Regents Of The University Of California | IBD-associated microbial antigens and methods of using same |
| GB0015923D0 (en) * | 2000-06-30 | 2000-08-23 | Astrazeneca Ab | Methods |
| US6984308B2 (en) * | 2001-03-06 | 2006-01-10 | Cincinnati Children's Hospital Research Foundation | Electrochemical analysis of coenzyme Q10 and reduced coenzyme Q10 |
| JP2005526482A (ja) | 2001-08-10 | 2005-09-08 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | Ｖｅｇｆｒ−１を発現する幹細胞の単離および動員 |
| US20030148952A1 (en) * | 2001-10-18 | 2003-08-07 | Crombleholme Timothy M. | Methods and materials for the recruitment of endothelial cells |
| PL397820A1 (pl) * | 2002-05-16 | 2012-07-16 | Absorber Ab | Sposób diagnozowania choroby oraz sposób określenia skuteczności leczenia lub oceny prognozy choroby związanej z odpornością lub naczyniowej u osobnika |
| JP2008509678A (ja) * | 2004-08-13 | 2008-04-03 | メドトロニック・インコーポレーテッド | 内皮前駆細胞サブセットの単離とそれらの使用方法 |
-
2003
- 2003-05-16 PL PL397820A patent/PL397820A1/pl not_active Application Discontinuation
- 2003-05-16 NZ NZ537220A patent/NZ537220A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-05-16 PT PT03730427T patent/PT1458853E/pt unknown
- 2003-05-16 EP EP03730427A patent/EP1458853B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-16 IL IL16525003A patent/IL165250A0/xx active IP Right Grant
- 2003-05-16 AU AU2003241107A patent/AU2003241107B2/en not_active Ceased
- 2003-05-16 ES ES03730427T patent/ES2337244T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-16 AT AT03730427T patent/ATE449838T1/de active
- 2003-05-16 PL PL373564A patent/PL212661B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2003-05-16 DE DE60330223T patent/DE60330223D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-16 DK DK03730427.6T patent/DK1458853T3/da active
- 2003-05-16 US US10/439,666 patent/US8173372B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-16 WO PCT/IB2003/002502 patent/WO2003098212A2/en not_active Application Discontinuation
- 2003-05-16 CA CA2486119A patent/CA2486119C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-05-16 BR BRPI0311182A patent/BRPI0311182A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-05-16 SI SI200331742T patent/SI1458853T1/sl unknown
-
2004
- 2004-01-15 NO NO20040174A patent/NO20040174L/no not_active Application Discontinuation
- 2004-11-16 IL IL165250A patent/IL165250A/en unknown
-
2005
- 2005-05-16 US US11/130,306 patent/US20050244404A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-12-02 US US12/326,547 patent/US8034635B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-02-12 CY CY20101100147T patent/CY1109815T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60330223D1 (pl) | 2010-01-07 |
| WO2003098212A2 (en) | 2003-11-27 |
| NZ537220A (en) | 2008-06-30 |
| EP1458853A2 (en) | 2004-09-22 |
| SI1458853T1 (sl) | 2010-04-30 |
| US20050244404A1 (en) | 2005-11-03 |
| NO20040174L (no) | 2004-03-08 |
| AU2003241107B2 (en) | 2009-09-03 |
| AU2003241107A1 (en) | 2003-12-02 |
| DK1458853T3 (da) | 2010-04-06 |
| ATE449838T1 (de) | 2009-12-15 |
| US20030228638A1 (en) | 2003-12-11 |
| WO2003098212A3 (en) | 2004-07-01 |
| PL373564A1 (pl) | 2005-09-05 |
| US20090142780A1 (en) | 2009-06-04 |
| ES2337244T3 (es) | 2010-04-22 |
| CA2486119A1 (en) | 2003-11-27 |
| IL165250A0 (en) | 2005-12-18 |
| WO2003098212B1 (en) | 2004-07-29 |
| US8034635B2 (en) | 2011-10-11 |
| EP1458853B1 (en) | 2009-11-25 |
| PT1458853E (pt) | 2010-02-23 |
| CY1109815T1 (el) | 2014-09-10 |
| BRPI0311182A2 (pt) | 2016-06-21 |
| CA2486119C (en) | 2011-01-04 |
| IL165250A (en) | 2011-03-31 |
| PL397820A1 (pl) | 2012-07-16 |
| US8173372B2 (en) | 2012-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Strom et al. | Cellular components of allograft rejection: identity, specificity, and cytotoxic function of cells infiltrating acutely rejecting allografts | |
| Caforio et al. | Inappropriate major histocompatibility complex expression on cardiac tissue in dilated cardiomyopathy. Relevance for autoimmunity? | |
| Bishop et al. | Immunopathology of renal allograft rejection analyzed with monoclonal antibodies to mononuclear cell markers | |
| EP1078263B1 (en) | Method of direct selection of antigen-specific t cells | |
| EP2726879B1 (en) | Requlatory t cells and methods of identifying and isolating them using cd6 -expression or the combination of cd4, cd25 and cd127 | |
| Andrioli et al. | Study of platelet adhesion in patients with uncomplicated hypertension | |
| Perry et al. | Two novel assays of alloantibody-secreting cells demonstrating resistance to desensitization with IVIG and rATG | |
| US8034635B2 (en) | Methods of donor specific crossmatching | |
| RU2627445C2 (ru) | Способы идентификации, выделения, истощения и обогащения популяций tr1 клеток, популяции tr1 клеток, фармацевтические композиции, способ мониторинга эффекта терапии | |
| Vermehren et al. | Isolation of precursor endothelial cells from peripheral blood for donor-specific crossmatching before organ transplantation | |
| Puga Yung et al. | Release of pig leukocytes and reduced human NK cell recruitment during ex vivo perfusion of HLA‐E/human CD 46 double‐transgenic pig limbs with human blood | |
| JP3550410B2 (ja) | 好塩基球に結合するモノクローナル抗体、好塩基球の分離方法、好塩基球からのケミカルメディエーターの遊離方法、及び好塩基球由来ケミカルメディエーター遊離試験法 | |
| Karuppan et al. | Relevance of a positive crossmatch in liver transplantation | |
| US20070202085A1 (en) | Systems and methods for monitoring immune responses and predicting outcomes in transplant recipients | |
| Pruvot et al. | Characterization, quantification, and localization of passenger T lymphocytes and NK cells in human liver before transplantation | |
| Alheim et al. | A flow cytometric crossmatch test for simultaneous detection of antibodies against donor lymphocytes and endothelial precursor cells | |
| WO2014203214A1 (en) | Markers for long-term kidney graft dysfunction | |
| Moghaddami et al. | Recruitment of dendritic cells and macrophages during T cell-mediated synovial inflammation | |
| US20020160429A1 (en) | Method for binding basophils and mast cells | |
| US20130177925A1 (en) | Detection of antigen-specific peripheral blood mononuclear cells and methods for diagnosing immune disorders | |
| Joshi et al. | Applications of Flow Cytometry in Transplant Medicine | |
| Otto et al. | Immunological Methods in Small Animal Research | |
| Shanahan | Department of Microbiology | |
| Shanahan | Histocompatibility and Immunogenetics Division | |
| Schmidt-Lucke et al. | Articles in PresS. Am J Physiol Heart Circ Physiol (January 19, 2007). doi: 10.1152/ajpheart. 01197.2006 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| VDSO | Invalidation of derivated patent or utility model |
Ref document number: 397820 Country of ref document: PL Kind code of ref document: A1 |