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KR20210099606A - 바이로좀을 포함하는 경구 분산성 백신 - Google Patents

바이로좀을 포함하는 경구 분산성 백신 Download PDF

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Publication number
KR20210099606A
KR20210099606A KR1020217020127A KR20217020127A KR20210099606A KR 20210099606 A KR20210099606 A KR 20210099606A KR 1020217020127 A KR1020217020127 A KR 1020217020127A KR 20217020127 A KR20217020127 A KR 20217020127A KR 20210099606 A KR20210099606 A KR 20210099606A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dosage form
virosome
formulation
freeze
hiv
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020217020127A
Other languages
English (en)
Inventor
익 텡 웡
찰리 스마든
코자스테 쉬르카니
마리오 아마커
실바인 플로이리
안토니우스 요하네스 헨드리쿠스 슈테그만
Original Assignee
카탈렌트 유.케이. 스윈던 지디스 리미티드
마이메틱스 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 카탈렌트 유.케이. 스윈던 지디스 리미티드, 마이메틱스 코포레이션 filed Critical 카탈렌트 유.케이. 스윈던 지디스 리미티드
Priority to KR1020237038419A priority Critical patent/KR20230159621A/ko
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Abstract

본 발명은 경구 백신 투여 형태 및 경구 백신 투여 형태를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 투여 형태는적어도 하나의 백신 표적 분자의 면역원성 양을 보유하는 지질-기반 소포 (예컨대, 바이로좀, 리포좀)를 포함하되 아쥬반트는 포함하거나 포함하지 않는다. 구체적으로, 출원인은 액상 바이로좀 농축물의 조성물, 고체 투여 형태 제형을 위한 베이스 매트릭스의 조성물(바이로좀 농축물은 제외한다), 및 물리적 견고성, 입자 및 항원 무결성 및 안정성을 갖는 동결 건조된 설하 투여 형태를 제조할 수 있는 투여 형태를 위한 제조 조건의 조합을 발견하였다.

Description

바이로좀을 포함하는 경구 분산성 백신
관련 출원에 대한 참조
[0001] 이 출원은 2018년 11월 29일자 미국 가특허출원 No. 62/772,823에 기초한 우선권 주장 출원으로서, 상기 출원의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조 병합된다.
발명의 분야
[0002] 본 발명은 점막 면역화(mucosal immunization)를 유도하는 경구 투여 형태에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바이로좀을 함유하는 동결-건조된 경구 분산성 백신에 관한 것이다. 이 출원으로 이어진 프로젝트는 보조금 계약 No 646122에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 지원 받았다.
발명의 배경
[0003] 백신은 전통적으로 근육내, 피내 또는 피하 주사에 의해 전달된다. 이러한 주사는 강력한 전신 면역 반응을 생성할 수 있는 반면, 점막 면역 반응을 유발하는 효능은 가변적이며, 특히 서브유닛 백신의 경우 그 효능이 약하거나 검출 불가능한 경우가 많다. 주입된 백신을 처리한 배액 림프절로부터, 항원 특이 적 세포독성 T 세포(CTL)와 B 세포에 의해 생성된 항체는 신체의 다른 기관으로 이동할 수 있지만 다양한 점막 조직(예컨대 생식기, 장, 호흡기)으로의 이들의 이동은 부적절한 귀소(homing) 점막 수용체 및 화학주성으로 인해 종종 제한되거나 불가능하다. 그러나, 비경구 면역 경로로도 고려되는 비강내(intranasal) 경로는 일부 상호연결을 공유하는 호흡기, 생식기 및 장에서 우수한 점막 면역 반응을 유발할 수 있어, 이는 백신이 점막 부위에서 전달되는 경우 더 접근하기 쉽다. 따라서 이러한 비경구 백신은 경우에 따라 점막 병원체에 대한 보호를 제공할 수 있다.
[0004] 대부분의 병원체는 점막 조직(경구, 호흡기, 생식기 및 장관)을 통해 체내로 유입되고 이들 중 다수는 점막 조직에서만 복제되기 때문에 점막 예방 접종은 국소 및 원거리 점막 부위에서 선천성(예컨대 NK 세포) 및 후천성(T 및 B 세포) 면역 반응 모두를 유도하여 최전선 방어를 최적으로 유도할 수 있다.
[0005] 상주 점막 방어를 사용하면, 주변으로부터 세포 모집을 지연시키지 않고 즉시 보호할 수 있으며, 이는 병원체 확산 이전의 매우 초기 전파 및 감염 이벤트 및 일부 경우 저장소 확립을 보다 효율적으로 방해할 수 있게 해준다.
[0006] 점막 조직 및 림프절은 90% 이상의 면역 세포를 포함한다. 또한, 점막 항체는 전체 신체 항체 생산의 약 80%를 차지한다. 따라서 점막 항체에 의한 국소 면역 반응은 점막 감염 (예컨대 HIV-1, 헤르페스 바이러스, 로타 바이러스 등) 및 다른 장기(예컨대 HIV-1, B형 간염, 결핵)로의 도달로 이어지는 점막 조직을 통한 유입에 대해 최전선 방어 역할을 할 수 있다. 이와 대조적으로, 혈액 항체는 일단 병원체가 점막 방어를 통과시 백업 방어 역할을 하거나 또는 점막 항체 및 점액 환경과 시너지 효과를 내면서 작용할 수 있다. 혈액 항체는 주로 모기에 물린 후 혈류로 직접 들어가는 병원체(예컨대 말라리아, 치쿤구냐, 뎅기, 지카, 웨스트 나일 바이러스, 황열병 등) 또는 우발적인 피부/점막 손상을 처리하기 위한 효과적인 최전선 방어 역할을 한다. (예를 들어, 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)).
[0007] 점막 백신 전달(협측, 설하, 비강, 구강 또는 질 점막을 통한)은 전신 면역 반응뿐만 아니라 국소 및 원거리 항체 면역 반응을 유도하는 수단으로서 그에 대한 관심이 증가하고 있다. 또한, 고체 투여 형태 (예컨대 협측/설하 정제, 경구 정제 또는 캡슐, 질 삽입물)에 의한 점막 백신 전달은 대량 예방 접종 가능성, 환자 순응도, 사용 용이성, 제품 보관 수명 안정성, 콜드 체인 독립 기능성 등 몇 가지 장점을 제공할 수 있다. 또한, 점막 백신 전달은 주사 바늘 공포증이 있는 환자에게 적합할 수 있으며 환자는 적절한 설명과 함께 백신을 자가 투여할 수 있다. 협측/설하 경로는 약물과 작은 분자를 혈류로 전달하기 위해 수년 동안 사용되어 왔지만 백신의 점막 전달 수단으로서의 적용은 거의 주목을 받지 못하였다.
발명의 간단한 개요
[0008] 지질-기반 소포는 약물, 백신 또는 아쥬반트 전달 시스템 및 이들의 조합으로서 사용될 수 있다. 지질-기반 소포는 기본 구조 (입자)를 형성하는 하나 또는 여러 개의 천연 및/또는 합성 지질 및 추가적인 임의 성분(펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산, 소분자)으로 구성될 수 있다. 지질-기반 소포는 나노 입자(대략 20-200 nm) 내지 서브-마이크로미터(대략 200-800 nm) 내지 마이크로미터(대략 800 nm -10 μm)까지 다양하다.
[0009] 바이로좀 및 리포좀은 지질-기반 소포 시스템에 속한다. 바이로좀은 단일라멜라이고 리포좀은 단일라멜라, 이중라멜라, 또는 다중라멜라일 수 있다. 바이로좀은 지질-기반 바이로좀 입자의 형성을 위한 출발 물질로 사용되는 외피 바이러스 유래 단백질을 포함할 수 있는 일종의 서브유닛 백신이다. 이들 바이로좀은 유전자 물질이 없고, 복제되지 않으며 감염성이 없기 때문에, 안정된 형태로 제형화시킬 수만 있다면 장 및 비경구 면역에 적합하고 안전한다. 바이로좀은 추가 분자, 예컨대 펩타이드, 단백질 및/또는 탄수화물 형태 하에, 동종(동일한 병원체 기원) 또는 이종 표적 분자(출발 바이러스 물질과 다른 병원체에서 유래), 핵산, 아쥬반트, 특정 지질 및/또는 소분자(약물)을 포함할 수 있다. 바이로좀과 유사하게 리포좀 역시도 의약품, 백신 및 아쥬반트의 투여를 위한 비히클로서 사용될 수 있지만, 지질막은 천연 바이러스 단백질을 전혀 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 본원에 사용된 리포좀은 프로테올리포좀 (즉, 단백질을 갖는 리포좀)일 수 있다.
[0010] 안정화는 콜드 체인 방식이 아니어도 백신 보관을 허용하거나, 제품의 생물활성을 손상시킴이 없이, 권장되는 콜드 체인 조건을 벗어난 고온 및 저온 이동을 지원할 수 있도록 하는 것이 이상적이다.
[0011] 출원인은 바이로좀을 함유하는 동결 건조된 경구 분산성 백신 및 바이로좀의 안정성을 보존(물리적으로 입자 구조에 대해 그리고 화학적으로 표적 분자에 대해)할 수 있는 그러한 백신의 제조 과정을 발견하였다. 제품 안정성은 콜드 체인 보관 조건과 관계없이 주변 온도(예컨대 약 25 ℃)에서 보관하는 동안 유지될 수 있으며 우발적인 동결 조건(예컨대 약-4℃ 내지 약-17℃) 뿐만 아니라 온난한 국가에 존재하는 고온(예컨대 35℃ 내지 45℃)에 대한 노출도 지원할 수 있다. 바이러스 백신을 함유하는 본원에 개시된 동결 건조 설하 투여 형태는 점막 면역을 유도할 수 있고 또한 전신 면역 반응도 유도할 수 있다. 구체적으로, 액상 바이로좀 농축물과 그 완충액의 조성, 고체 투여 형태용 액체 베이스 매트릭스의 조성(바이로좀 농축물 제외), 및 동결 건조된 설하 정제 하의 고체 투여 형태를 생성하는 제조 조건의 조합은, 보존된 바이롯좀 및 표적 분자 무결성과 함께, 설하 정제에 적합한 물리적 속성을 갖는 고체 백션 형태를 생성시켜, 다양한 환경 조건에서 보관되는 동안 안정성을 유지할 수 있게 해준다. 적절한 바이로좀 고체 투여 형태를 투여하는 것은 설하 점막 면역에 적합할 수 있다.
[0012] 바이로좀은 출발 정제 바이러스로부터 유래된 바이러스 막 단백질을 함유하는 지질 막을 가지므로 외피보유 바이러스 유사 입자("VLP": enveloped virus like particle) 패밀리에 속한다. VLP로서, 바이로좀은 천연 바이러스 외피의 기능 활성 유무와 함께, 바이러스 입자 구조, 조성, 항원 막 표면 제시를 유사하게 모방할 수 있다. 바이로좀은 일반적으로 가용화제를 사용하여 외피보유 바이러스로부터 가용화된 막 단백질 및 지질을 정제한 다음, 아쥬반트를 사용하거나 사용하지 않고 천연 또는 합성 지질 및 항원을 첨가하고, 혼합물로부터 상기 가용화제를 제거함으로써, 그로부터 단백질이 돌출되어, 지질 이중층이 형성된 재구성된 바이러스 막을 포함할 수 있다. 항원은 천연 단백질뿐만 아니라 재조합 또는 합성 단백질 또는 펩타이드 일 수 있다. 바이로좀은 또한 먼저 형성된 다음, 아쥬반트 및 다른 분자를 함유하도록 그들의 막의 공유 또는 비공유 변형에 의해 변형될 수 있다. 바이로좀의 한 가지 특징적인 속성은 이들이 천연 바이러스 외피의 조성, 표면 구조 및 기능 활성을 밀접하게 모방할 수 있다는 것이다. 일부 사례에서, CD8+ T 세포의 유도가 백신 전략의 일부인 경우, 상기 바이로좀의 특히 중요한 특징은 그의 융합 막 활성과 결합하는 헤마글루티닌(HA) 수용체의 보존이다. 백신 전략이 항원 특이적 항체의 유도에 초점을 맞추는 경우, HA 융합 활성이 절대적으로 필요하지는 않지만 부형제로서 HA의 존재는 여전히 중요한데, 이는 그러한 속성이 부족할 수 있는 작은 항원 및 펩타이드의 경우 특히, T 세포 도움을 제공할 수 있기 때문이다. 비록 본 명세서에서 특정 백신이 언급되었지만, 바이로좀을 전달 플랫폼으로 사용하는 모든 백신이 본 발명의 대상이 될 수 있다. HIV 항원(P1 및 rgp41) 및 TLR 7/8 아쥬반트를 함유하는 인플루엔자 바이로좀은 본원에 개시된 백신을 위한 모델 바이로좀 농축물로 사용될 수 있다. HIV 항원 rgp41을 갖는 인플루엔자 바이로좀은 비강 내 및 근육 내 경로를 통한 다양한 동물 연구와 1상 임상 연구에서 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 연구에서, 바이로좀 제형은 바늘 또는 비강 액체 스프레이로 투여되는 액체 형태였는데, 이러한 형태는 활성 제약 성분("API": Active Pharmaceutical Ingredients)의 화학적 변형으로 인해 4℃에서 제한된 저장 수명 안정성을 나타내기 쉽다. 수성 환경에서 종종 나타나는 이러한 API 화학적 변형을 방지하거나 줄이기 위해 수분 함량이 낮은 고체 백신 형태를 개발하는 것이 유망한 접근 방식으로 확인되었다.
[0013] 출원인은 본원에 개시된 동결 건조된 경구 분산성 백신으로서 고체 백신 형태를 생산하는데 있어서 다양한 문제를 극복할 수 있었다. 구체적으로, 항원 및 아쥬반트를 운반하는 바이로좀을 함유하는 인플루엔자-기반 바이로좀 농축물은 완충염 용액에 현탁액으로 공급될 수 있다. 동결 건조된 백신 투여 형태를 생산하려면 정제 내에서 견고하고 다공성인 구조가 제조 중에 생산되고 후속 보관 중에 유지되어야 한다. 바이로좀 농축물에 완충염이 존재하면 이러한 견고하고 다공성인 구조를 만드는데 어려움이 있을 수 있다. 따라서, 출원인은 동결 건조 공정 동안 붕괴되거나 부분적으로 붕괴되지 않는 견고한 투여 형태의 형성을 가능하게 하는 제조 조건과 함께 부형제의 적절한 양을 발견하였다.
[0014] 이에 더해, 동결, 어닐링 및 동결 건조 공정 역시도 바이로좀 입자의 무결성을 손상시킬 수 있다. 바이로좀에 대한 이러한 손상은 충분한 양의 바이로좀 입자가 동결 건조된 제품에 남아있어서 충분한 양의 바이로좀이 면역 세포에 의해 처리되어, 전신 면역 반응에 의해서도 뒷받침될 수 있는, 점막 면역 반응을 유도하기 위해 설하 점막을 통과할 수 있도록 최소화되어야 한다. 따라서, 출원인은 바이로좀 면역원성(예컨대 클러스터의 존재가 제한된 온전한 바이로좀) 및 우수한 투여 형태 특성(예컨대 구강 붕괴 설하 정제)을 모두 유지하기 위해 부형제 사용 및 동결 건조 공정의 균형을 맞출 수 있었다.
[0015] 일부 구체예에서, 경구 고체 백신 투여 형태는 적어도 하나의 표적 분자의 면역원성 양을 포함하는 지질-기반 소포; 5-20 중량%의 적어도 하나의 냉동-동결보호제(cryo-lyoprotectant); 25-40 중량%의 매트릭스 형성제; 및 40-55 중량%의 구조 형성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 지질-기반 소포는 바이로좀 또는 프로테리포좀이다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 10-15 중량%의 적어도 하나의 냉동-동결보호제를 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 냉동-동결보호제는 트레할로스를 포함한다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 33-37 중량%의 매트릭스 형성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 매트릭스 형성제는 젤라틴을 포함한다. 일부 구체예에서, 젤라틴은 어류 젤라틴을 포함한다. 일부 구체예에서, 어류 젤라틴은 고 분자량 어류 젤라틴이다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 45-50 중량%의 구조 형성제를 포함한다. 일부 구체예에서, 구조 형성제는 만니톨을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이로좀은 인플루엔자 바이러스 막 또는 다른 외피보유 바이러스로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 표적 분자는 바이로좀에 존재한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 표적 분자는 HIV-1 외피 유래 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, HIV-1 외피 유래 항원은 HIV-1 PI 펩타이드 및/또는 HIV-1 재조합 gp41을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이로좀은 아쥬반트를 포함한다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 적어도 하나의 표적 분자의 구강 흡수를 촉진한다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 180초 이내에 붕해된다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 90초 이내에 붕해된다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 60초 이내에 붕해된다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 30초 이내에 붕해된다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 구강 내에 배치됨으로써 환자에게 투여될 때 유도된다. 일부 구체예에서, 구강 내에 배치된다 함은 혀 위 또는 아래 또는 협측 또는 인두 영역에 배치되는 것을 의미한다.
[0016] 일부 구체예에서, 환자에서 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 투여 형태 중 임의의 것을 면역 반응이 필요한 사람의 구강 내로 배치하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 구강 내에 배치한다 함은 혀 위 또는 아래 또는 협측 또는 인두 영역에 배치하는 것을 의미한다.
[0017] 일부 구체예에서, 경구 고체 백신 투여 형태를 형성하는 방법은 액상 바이로좀 제형을 예비성형된 몰드 내로 투입하는 단계(여기서 바이로좀 제형은 다음을 포함한다: 면역원성 양의 적어도 하나의 표적 분자를 포함하는 지질-기반 소포, 1-5 중량%의 냉동-동결보호제, 4-8 중량%의 매트릭스 형성제 및 5-10 중량%의 구조 형성제); 투입된 바이로좀 제형을-60℃ 내지-90℃의 온도에서 동결시키는 단계; 동결된 바이로좀 제형을-15℃ 미만의 온도에서 3-9 시간 동안 유지함으로써 어닐링하는 단계; 및 어닐링된 바이로좀 제형을 동결-건조하여 투여 형태를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 투입된 바이로좀 제제는 약 1-5 분의 기간 동안-60℃ 내지-90℃의 온도에서 동결된다. 일부 구체예에서, 어닐링된 바이로좀 제형을 동결-건조시키는 것은 어닐링된 바이로좀 제형을-10℃ 내지-20℃의 온도에서 20-28 시간 동안 유지하는 제1 단계 및 어닐링된 바이로좀 제제를-5℃ 내지 약-15℃의 온도에서 14-22 시간 동안 유지하는 제2 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 동결-건조는 600 mbar 미만의 압력에서 일어난다. 일부 구체예에서, 바이로좀 제제는 약 6.5-8의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 동결보호제는 트레할로스를 포함한다. 일부 구체예에서, 매트릭스 형성제는 젤라틴을 포함한다. 일부 구체예에서, 젤라틴은 어류 젤라틴을 포함한다. 일부 구체예에서, 어류 젤라틴은 고 분자량 어류 젤라틴이다. 일부 구체예에서, 구조 형성제는 만니톨을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질-기반 소포는 인플루엔자 바이러스 또는 호흡기 세포융합 바이러스로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 표적 분자는 HIV-1 외피 유래 항원을 포함한다. 일부 구체예에서, HIV-1 외피 유래 항원은 HIV-1 PI 펩타이드 또는 HIV-1 재조합 gp41을 포함한다. 일부 구체예에서, 지질-기반 소포는 아쥬반트를 포함한다.
[0018] 일부 구체예에서, 경구 고체 백신 투여 형태를 형성하는 방법 다음 단계, 즉: 액상 바이로좀 제형을 예비성형된 몰드에 투입하는 단계 [여기서 바이로좀 제형은 다음을 포함한다: (1) 20-50 중량%의 바이로좀 농축물(여기서 바이로좀 농축물은 면역원성 양의 적어도 하나의 표적 분자를 포함하는 바이로좀, 2-10 중량%의 냉동-동결보호제; 및 60-200 mM의 완충 시스템을 포함한다); (2) 4-8 중량%의 매트릭스 형성제 및 (3) 5-10 중량%의 구조 형성제]; 투입된 바이로좀 제형을-60℃ 내지-90℃의 온도에서 동결시키는 단계; 동결된 바이로좀 제형을-15℃ 미만의 온도에서 3-9 시간 동안 유지함으로써 어닐링하는 단계; 어닐링된 바이로좀 제형을 동결-건조하여 투여 형태를 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 완충 시스템은 HEPES-염화나트륨을 포함한다.
[0019] 추가 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 본 명세서의 실시예 및 설명은 본질적으로 예시적이며 이에 한정되지 않는 것으로 간주되어야 한다.
[0020] 본원에서 언급된 특허 문서, 과학 기사 및 데이터베이스를 포함한 모든 간행물은 각 개별 간행물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참조 통합된다. 본 명세서에 기재된 정의가 본 명세서에 참고로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물에 기재된 정의와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서에 기재된 정의는 본 명세서에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
[0021] 첨부된 도면을 참조로 예시적인 구체예를 설명한다. 이들 도면에서:
[0022] 도 1은 본원에 개시된 백신 투여 형태를 제조하기 위한 흐름도 개관을 도시한다.
[0023] 도 2는 본원에 개시된 백신 투여 형태를 제조하기 위한, 매트릭스 제형으로부터 최종 설하 정제까지의 흐름도를 도시한다.
[0024] 도 3A는 완전히 습윤된 정제의 개략도를 사진과 함께 나타낸 것이다.
[0025] 도 3B는 딱딱한 덩어리가 있는 정제의 개략도를 사진과 함께 나타낸 것이다.
[0026] 도 3C는 동결 건조된 정제(껍질)의 표면에 형성되는 붕괴된 제형 매트릭스의 필름이 있는 정제의 개략도를 사진과 함께 나타낸 것이다.
[0027] 도 4는 1개월 및 3개월에 걸쳐 5℃, 25℃, 및 40℃에서 보관된 재조성된 Zydis® 설하 정제로부터의 바이로좀-P1 및 바이로좀-rgp41에 대한 항-P1 및 항-rgp41 특이적 항체 결합을 보여주는 면역 블롯의 사진이다(본원에 개시된 실시예 2의 분석).
[0028] 도 5는 4℃ 및 40℃에서 경시적으로 보관된 액상 바이로좀 농축물 및 바이로좀을 함유하는 동결-건조된 설하 정제의 P1 및 rgp41 항원의 면역원성을 나타낸 도면이다.
발명의 상세한 설명
[0029] 본원에는 지질-기반 소포 (예를 들어, 바이로좀 또는 VLP) 용 의약 조성물 및 이러한 의약 조성물을 제조하는 방법이 개시되어있다. 구체적으로, 본 개시 내용은 VLP의 안정성(즉, 구조적 완전성 및 항원 화학적 안정성)을 보존할 수 있고, 콜드 체인 보관 조건과 무관하게 보관 가능하며 우발적인 동결 조건과 따뜻한 나라에서의 고온 노출을 지원할 수도 있는 동결 건조된 경구 분산성 또는 붕괴 투여 형태에 관한 것이다. 이 투여 형태는 또한 VLP의 물리적 및 화학적 속성을 유지하여 점막 면역을 유도하는 설하 전달에 적합한다.
[0030] 출원인은 완충 시스템 및 냉동-동결보호제를 함유하는 바이로좀 농축물의 고부하 사용을 처리할 수 있는 제제를 갖도록 매트릭스 형성제 및 구조 형성제의 양을 제제화하고 최적화할 수 있었다. 부형제 조정과 함께 투여 형태의 제조 파라미터를 최적화시켰다. 특히, 투여 형태에 견고성을 부여하고 바이로좀 손상을 최소화하는 만니톨 결정화를 최대화하도록 어닐링 시간을 최적화하였다. 이에 더해 동결-건조 조건을 최적화하여 바이로좀 입자의 손상을 최소화하고 동결-건조시 구조적 붕괴를 최소화하였다.
지질 기반 소포 시스템(Lipid Based Vesicle Systems)
[0031] 지질-기반 소포는 약물, 백신 또는 아쥬반트 전달 시스템 및 이들의 조합으로서 사용될 수 있다. 지질-기반 소포 시스템은 소포 막(입자)를 형성하는 하나 또는 여러 개의 천연 및/또는 합성 지질 (예컨대 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 콜레스테롤, 스핑고지질 및 이들의 유도체) 및 추가적인 임의 성분(펩타이드, 단백질, 탄수화물, 소분자)로 구성될 수 있다. 지질-기반 소포는 나노입자 (약 20-200 nm) 내지 서브-이크로 미터(약 200-800 nm) 내지 마이크로미터 (약 800 nm-10 μm) 규모로 다양한다.
[0032] 지질-기반 소포/입자는 단일라멜라, 이중라멜라, 또는 다중라멜라 지질 이중층 소포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지질-기반 소포/입자는 천연 및/또는 합성 지질로부터 선택된 지질을 포함하는 지질 이중층을 포함할 수 있다. 이러한 지질은 최적의 에피토프 노출을 위한 항원 막 고정, 항원 제시 및/또는 폴딩을 개선하기 위해 병원체 막 및 지질 래프트 마이크로도메인을 더 잘 모방하는 데 이용될 수 있다. 지질-기반 소포/입자는 입자의 표면에 노출되거나 입자 내부를 향하거나 무작위 배향을 갖는 막 고정 항원 및/또는 아쥬반트를 보유할 수 있다. 항원 및/또는 아쥬반트는 또한 지질-기반 소포/입자의 내강 내부에 캡슐화될 수도 있다.
[0033] 바이로좀은 무세포 시스템 방식으로 시험관 내에서 조립된, 지질-기반 소포로서, 서브유닛 백신 범주에 속하는 외피보유 VLP를 형성한다. 담체로서의 바이로좀 지질 막은 모든 외피보유 바이러스로부터 유래할 수 있으므로, 결과적으로 출발 바이러스로부터 유래된 천연 바이러스 막 단백질을 적어도 함유한다. 이들 바이로좀은 유전적 바이러스 물질이 없고 복제가 불가능하며 감염성이 없기 때문에 전신 및 점막 면역에 적합하고 안전한다. 또한, 바이로좀은 바이로좀 표면에 고정되거나 및/또는 바이로좀 루멘 내부에 포획될 수 있는, 항원(예컨대 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산), 아쥬반트, 특정 지질 및/또는 소분자(약물)와 같은 추가 분자를 포함할 수 있다.
[0034] 리포좀은 또한 외피보유 바이러스의 천연 바이러스 막으로부터 유래된 단백질을 포함하지 않는, 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포로서 형성될 수 있다. 시험관 내에서 조립된 이러한 지질-기반 입자는 유전 물질이 없으며 전신 및 점막 적용에 적합할 수 있다. 이에 더해 리포좀은 리포좀 표면에 고정되거나 및/또는 리포좀 루멘 내부에 포획될 수 있는, 항원 (펩타이드, 단백질 및/또는 탄수화물, 핵산), 아쥬반트, 특정 지질 및/또는 소분자(약물)와 같은 추가 분자를 포함할 수 있. 일부 구체예에서, 본원에 사용된 리포좀은 프로테오리포좀 (즉, 단백질을 갖는 리포좀)일 수 있다.
[0035] 본원에 기재된 투여 형태에 사용되는 지질은 양이온성 지질, 당지질, 인지질, 글리세로인지질, 갈락토실세라미드, 스핑고지질, 콜레스테롤 및 이의 유도체에 속할 수 있다. 인지질의 예로는 다양한 지방 아실 조성을 갖는 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파타이드산, 카디올리핀, 및 포스파티딜이노시톨을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
[0036] 이에 더해, 지질은 DOTMA (N-[1-(2,3-디올레일락시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, DODAC (N,N-디올레일-N,N,-디메틸암모늄 클로라이드), DDAB (디도데실디메틸암모늄 브로마이드) 및 스테아릴아민 또는 기타 지방족 아민 등으로부터 선택될 수 있다.
바이로좀 제형
바이로좀 농축물
[0037] 도 1은 본원에 개시된 백신 투여 형태를 생산하는 방법 (100)에 대한 흐름도를 예시한다. 단계 101에서, 액상 바이로좀 농축물은 기본 매트릭스 제형의 예비혼합물과 혼합되어 동결-건조에 적합한 액상 바이로좀 제형을 형성할 수 있다. 출원인은 바이로좀 농축물의 조성이 기본 매트릭스 제형의 특정 조성과 조합되고 필요한 입자 특성을 가진 충분한 바이로좀을 보존하도록 최적화된 일련의 제조 조건과 함께 제조될 때 백신의 생물활성이 유지될 수 있음을 발견하였다. 바이로좀 입자의 생물활성은 입자의 형태적 완전성 및 그의 단일라멜라 인지질 막과 관련된 항원 분자의 품질에 따라 달라질 수 있다.
[0038] 일부 구체예에서, 바이로좀 농축물은 액상 바이로좀 농축물일 수 있다. 바이로좀 농축물은 적어도 하나의 바이로좀 집단을 포함한다. 바이로좀 집단은 주어진 약물을 포함하는 바이로좀이거나 백신 항원 및 바이러스 유래 단백질을 포함하는 백신 전달 비히클 역할을 하는 바이로좀일 수 있다 (예컨대 바이로좀이 인플루엔자 바이러스에서 유래된 경우 HA).
[0039] 일부 구체예에서, 바이로좀은 이종 백신 항원 (예컨대 인플루엔자 유래 바이로좀에 고정된 HIV 항원)에 대한 담체로서 작용하는 외피보유 VLP로서 인플루엔자 바이로좀을 생성하기 위한 인플루엔자 바이러스 또는 호흡기 세포 융합 바이러스("RSV")와 같은 다른 외피보유 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, RSV, 센다이 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스(SFV), 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 신드비스와 같은 외피보유 바이러스는 표시된 상동 백신 항원(예컨대 RSV에서 유래된 바이로좀에 대한 천연 RSV 항원)에 대해, 상응하는 RSV-바이로좀, 센다이-바이로좀, SFV-바이로좀, VSV-바이로좀 또는 신드비스-바이로좀을 생성하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 바이러스 기반 바이로좀은 임의의 외피 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 바이러스 기반 바이로좀은 헤르페스바이러스, 폭시바이러스 및 헤파드나바이러스를 비롯한 DNA 바이러스로부터 유래될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 바이러스 기반 바이로좀은 비제한적인 예로서 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, D형 간염, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스, 부냐바이러스 및 필로바이러스를 비롯한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 바이러스 기반 바이로좀은 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다.
[0040] 일부 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 기반 바이로좀은 백신 아쥬반트 및 담체 시스템으로서 인플루엔자 바이로좀에 기재된 상이한 공정에 따라 형성될 수 있으며(Moser C. et al, Expert review, 779-791 (2013); WO2004110486; WO2004071492; WO2007099446; WO2016039619; EP2058002; 및 WO2016039620), 상기 문헌들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 또한, 이전에 인용된 참고 문헌에 나열된 다양한 특허 및 기타 간행물도 전체적으로 참고로 여기에 포함된다. 따라서이 본 발명은 바이로좀 준비를 위한 특정 프로세스에 국한되지 않다. 따라서 전술한 참고문헌은 단지 바이러좀 제조를 위한 예시에 불과하다. 본 발명은 비제한적인 예로서 항원을 갖는 리포좀을 비롯하여, 나노입자 제제, VLP, 바이로좀과 같은 모든 지질-기반 입자에 적용된다.
[0041] 이 섹션에서는 액상 바이로좀 농축물을 설명하지만, 바이로좀을 리포좀으로 대체하여 액상 리포좀 농축물을 형성할 수도 있다. 따라서 바이로좀 농축액의 성분 (바이로좀 자체 외에)은 리포좀 농축액에 동일하게 적용될 수 있다.
[0042] 바이로좀(예컨대, 인플루엔자 유래 바이로좀)은 그 표면에 바이러스단백질을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질은 헤마글루티닌 ("HA") 및/또는 뉴라미니다제("NA")일 수 있다. 일부 구체예에서, 액상 바이로좀 농축물은 최신 분석 검정에 의해 검출 가능한 농도로 존재하는 바이러스 막 단백질 (예를 들어, HA)을 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스 막 단백질은 이종 백신 항원의 담체로서 인플루엔자 바이로좀을 이용할 경우, 약 10-300 ㎍/mL 또는 약 5-150 ㎍/mL의 액상 바이로좀 농축물이다. CTL 반응을 유도하기 위해 설계된 인플루엔자 바이로좀의 경우, HA 농도는 약 150-800 ㎍/mL 또는 약 75-400 ㎍/mL 범위일 수 있다. 일부 구체예에서 바이러스 막 단백질의 농도는 상기 열거된 예시 농도보다 클 수 있다.
[0043] 바이로좀 농축물은 또한 지질을 포함할 수 있다. 바이로좀 농축물에 사용되는 지질은 양이온성 지질, 당지질, 인지질, 글리세로 인지질, 갈락토실세라미드, 스핑고지질, 콜레스테롤 및 그 유도체에 속할 수 있다. 인지질은 특히 다양한 지방 아실 조성을 갖는 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파타이드산, 카디올리핀, 및 포스파티딜이노시톨을 포함할 수 있다. 또한 지질은 DOTMA (N-[1-(2,3-디올레일락시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, DODAC (N,N-디올레일-N,N,-디메틸암모늄 클로라이드), DDAB (디도데실디메틸암모늄 브로마이드) 및 스테아릴아민 또는 다른 지방족 아민 등으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, the 액상 바이로좀 농축물은 약 0.1-10 mg/mL, 약 0.3-8 mg/mL, 또는 약 0.5-5 mg/mL의 지질을 포함할 수 있다..
[0044] 바이로좀은 아쥬반트와 함께 또는 아쥬반트 없이 표적 분자 (예를 들어, 백신 항원)를 함유할 수 있다. 항원은 가용성이고 바이로좀 루멘 내에 포획되거나 바이로좀 상에 공유 또는 비공유적으로 고정될 수 있으며, 펩타이드, 단백질, 다당류, 박테리아 세포의 전체 또는 부분 단편 또는 추출물, 바이러스 입자, 또는 핵산일 수 있으며, 또는 질병을 유발하는 원생동물 또는 벌레와 같은 기생충 또는 이의 조합으로부터 유래될 수 있거나 또는 식물, 동물 또는 인간 세포 또는 세포주에서 유래할 수 있다. 당업계에 공지된 모든 항원이 바이로좀과 함께 사용하는데 적합하며, 여기에는 상업적으로 입수가능한 것들, 또는 병원체 또는 암세포 제제의 정제에 의해 만들어진 것들 또는 재조합적으로 발현되거나 표준 제조법에 의해 합성적으로 생산된 비-형질전환 세포(천연 단백질)이 포함된다. 바이로좀에 통합시키기에 적합한 항원을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 어떠한 공지 방법이든 본원에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.
[0045] 표적 분자(들)는 액상 바이로좀 농축물의 바이로좀에 포함되고 이어서 본원에 개시된 후속 투여 형태 내에, 그 투여 형태로 제공시 면역원성을 부여하는데 충분한 양으로 포함된다. "면역원성 양"은 원하는 면역 반응을 유발하기에 적절한 양으로 정의된다. 당업자는 여러 인자들 중에서도 특히, 면역화 경로, 투여 형태가 투여될 환자의 나이 및 체중에 기초하여 주어진 질병 또는 감염에 대한 면역원성 양을 쉽게 결정할 수 있다.
[0046] 일부 구체예에서, 액상 바이로좀 농축물은 약 1-2000 ㎍/mL의 표적 분자를 포함할 수 있다. 표적 분자는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산, 소분자 또는 이들의 조합일 수 있다. 표적 분자는 항원 (예컨대 백신 항원), 약물, 진단 분자, 분석 센서 또는 이들의 조합으로 기능할 수 있다. 일부 구체예에서, 액상 바이로좀 농축물은 약 1-1000 ㎍/mL의 하나의 표적 분자 및 약 1-1000 ㎍/mL의 제2 표적 분자를 포함할 수 있다. 고체 투여 형태로 다운스트림 가공 후, 각 정제는 각 표적 분자 약 0.01 내지 250 ㎍을 함유할 수 있다.
[0047] 더욱 바람직한 구체예에서, 액상 바이로좀 농축물은 약 25-500, 약 50-500 ㎍/mL, 약 25-225 ㎍/mL, 약 25-200 ㎍/mL, 약 50-450 ㎍/mL, 약 50-400, 약 100-400 ㎍/mL, 약 100-400 ㎍/mL, 약 100-200 ㎍/mL, 또는 약 200-400 ㎍/mL의 적어도 하나의 표적 분자(예컨대, 항원)를 포하말 수 있다. 일부 구체예에서, 액상 바이로좀 농축물은 약 1-500 ㎍/mL, 약 25-500 ㎍/mL, 약 50-450 ㎍/mL, 약 50-400 ㎍/mL, 약 25-250 ㎍/mL, 약 25-200 ㎍/mL, 약 50-250 ㎍/mL, 약 75-225 ㎍/mL, 또는 약 100-200 ㎍/mL of one 표적 분자 및 약 50-450 ㎍/mL, 약 50-400 ㎍/mL, 약 25-225 ㎍/mL, 약 25-200 ㎍/mL, 약 100-500 ㎍/mL, 약 150-450 ㎍/mL, 약 175-425 ㎍/mL, 또는 약 200-400 ㎍/mL의 제2 표적 분자를 포함할 수 있다.
[0048] 본원에 개시된 투여 형태는 바이로좀 제형에 따라 달라지는, B 세포 (항체) 및/또는 관련 T 세포 서브세트(예컨대, Th1, Th2, Th16, Thf, Tc1, Tc2, Tc3, Treg, 등)의 유도 후, 알레르기 또는 감염, 종양 발생 및 확산, 병원체 전파, 세포 감염, 병원체 부하와 관련된 증상을 예방 또는 감소시키기 위한 치료 또는 예방 백신을 전달하는 데 사용될 수 있다. 이를 위해 표적 분자는 다음의 비제한적인 대표적인 질병 목록에 대한 보호를 제공할 수 있다: 인플루엔자, 결핵, 수막염, 간염, 백일해, 소아마비, 파상풍, 디프테리아, 말라리아, 콜레라, 헤르페스, 장티푸스, HIV/AIDS, 홍역, 라임병, 여행자 설사, A형, B형 및 C형 간염, 중이염, 뎅기열, 광견병, 파라인플루엔자, 풍진, 황열병, 이질, 재향군인병(레지오넬라병), 톡소플라스마 증, q-열, 출혈열, 아르헨티나 출혈열, 충치, 차가스병, 대장균에 의한 요로 감염, 폐렴구균병, 볼거리, 치쿤구냐, 암, 알레르기 및 이들의 조합. 이에 더해, 표적 분자는 다음의 비제한적인 원인 생물체에 의한 질병에 대한 보호를 제공할 수 있다: 비브리오 종, 살모넬라 종, 보르데텔라 종, 헤모필루스 종, 톡소플라스모시스 곤디이, 사이토메갈로바이러스, 클라미디아 종, 연쇄상구균 종, 노워크 바이러스, 대장균, 헬리코박터 파일로리, 로타바이러스, 네이세리아 고노레아, 네이세리아 메닝기디티스, 아데노바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 뉴모시스티스 카리니, 헤르페스 심플렉스, 클로스트리다 종, 호흡기 세포융합 바이러스, 클렙시엘라 종, 시겔라 종, 슈도모나스 에루지노사, 파보 바이러스, 캄필로박터 종, 리케챠 종, 바리셀라 조스터, 예르시니아 종, 로스 리버 바이러스, J.C. 바이러스, 로도코커스 에퀴, 모락셀라 카타 랄리스, 보렐리아 부르크도르페리, 파스퇴렐라 헤모리티카 및 이들의 조합. 추가로 또는 별법으로, 표적 분자는 알레르기(즉, 알레르겐을 함유하는 바이로좀), 암(예컨대 종양 항원, 항체, 항암 약물, 핵산) 및 기타 유형의 상태에 대한 보호 또는 치료를 제공할 수 있다.
[0049] 본 개시 내용의 수의학 적용이 또한 고려된다. 따라서 표적 분자는 다음의 비제한적인 수의학적 질병에 대한 보호를 제공할 수 있다: 콕시듐증, 뉴캐슬병, 유행성 폐렴, 고양이 백혈병, 위축성 비염, 단독(erysipelas), 구제역, 돼지, 폐렴 및 기타 질병 상태 및 기타 반려 동물 및 농장 동물에 영향을 미치는 감염 및 이들의 조합.
[0050] 일부 구체예에서, 바이로좀은 재구성된 막에 존재하는 바이러스 단백질에 추가하여 적어도 하나의 백신 항원을 함유한다. 일부 구체예에서, 백신 항원은 HIV-1 P1 펩타이드 및/또는 HIV-1 재조합 gp41일 수 있다.
[0051] 전술한 바와 같이, 액상 바이로좀 농축물의 바이로좀은 또한 아쥬반트를 함유하거나 이와 혼합될 수 있다. 바이로좀 및 기타 서브유닛 백신은 항체와 T 세포의 생산을 가속화하고 강화하는 동시에 면역학적 기억도 유지할 수 있게 해주는, 면역 반응을 개선하기 위한 아쥬반트를 필요로 할 수 있다. 효과적이기 위해서는 특정 질병으로부터 오래 지속되는 보호를 제공하는 기억 반응의 생성과 관련된 면역 반응을 갖는 것이 바람직한다. 아쥬반트는 또한 항원 용량을 감소시킬 수 있고(용량 절약) 원하는 면역 반응의 폭을 증가시킬 수 있다. 일단 항원에 노출되면 면역 체계는 이를 "기억"할 수 있으며 재노출 중에 면역 반응이 훨씬 빨라진다. 면역 반응을 향상시키는 아쥬반트의 효과는 그와 조합되는 항원과 무관할 수 있는데, 이는 아쥬반트 단독으로 비특이적인 면역 반응을 촉발할 수 있고, 항원 부재시 강력한 세포 활성화가 달성되면 자가면역 부작용을 일으킬 수 있기 때문이다. 그러나 항원과 아쥬반트가 물리적으로 함께 연결되면, 이들 모두는 주사시 모두 동일한 부위로 공동 이동하여 비특이적 염증 반응이 더 낮은 항원 특이적 면역 활성화가 선호된다. 적합한 아쥬반트의 비제한적인 예로는 다음을 들 수 있다: Toll-유사 수용체(TLR) 작용제, 인플라마좀 작용제, 뉴클레오타이드-결합 및 올리고머화 도메인(NOD)-유사 수용체(NLR) 작용제, 보다 구체적으로 비독성 박테리아 단편, 콜레라 독소 (및 이의 해독된 형태 및 분획), 키토산, 대장균의 열에 불안정한 독소 (및 이의 해독된 형태 및 분획), 락타이드/글리콜라이드 호모폴리머±코폴리머(PLA/GA), 폴리무수물, 예를 들어 트리멜리틸이미도-L-티로신, DEAE-덱스트란, 막 단백질 항원과 복합화된 사포닌(면역 자극 복합체-ISCOMS), 박테리아 생성물 예컨대 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 무라밀 디펩타이드(MDP), 리포좀, 코클리에이트, 프로테노이드, 사이토카인(인터루킨, 인터페론), 유전자 조작된 살아있는 미생물 벡터, 비-감염성 백일해 돌연변이 독소, 뉴리미다제/갈락토스 산화효소, 및 돌연변이 균주에서 유래한 약독화된 박테리아 및 바이러스 독소, 및 이들의 조합. 적절한 양의 아쥬반트는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
[0052] 일부 구체예에서, 바이로좀은 아쥬반트 3M-052(3M에 의해 공급되는 TLR7/8 작용제)를 보유할 수 있다. 일부 구체예에서, 액상 바이로좀 농축물은 정제당 약 8-140 ㎍/mL, 약 4-70 ㎍/mL, 약 1-60 ㎍/mL, 및 0.01 내지 16 ㎍ 범위의 3M-052 아쥬반트를 함유할 수 있다.
[0053] 일부 구체예에서, 액상 바이로좀 농축물은 각기 아쥬반트를 포함하거나 포함하지 않고 적어도 하나의 항원을 보유하는, 상이한 바이로좀 집단을 적어도 2개 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 2개의 상이한 바이로좀 집단은 상이한 항원을 가질 수 있지만, 동일한 아쥬반트(예를 들어, 바이로좀-rgp41/3M-052와 혼합된 바이로좀-P1/3M-052)를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 2개의 상이한 바이로좀 집단은 상이한 항원을 가질 수 있지만, 상이한 아쥬반트(예를 들어, 바이로좀-rgp41/아쥬반트 B와 혼합된 바이로좀-P1/아쥬반트 A)를 갖는다.
[0054] 일부 구체예에서, 바이로좀 농축물은 아쥬반트를 포함하거나 포함하지 않고 바이로좀당 적어도 2개의 상이한 항원을 포함할 수 있다 (예를 들어, 아쥬반트를 포함하거나 포함하지 않고 P1 및 rgp41 항원 양자 모두를 보유하는 바이로좀).
[0055] 액상 바이로좀 농축물은 또한 완충 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이로좀은 완충 시스템에 현탁될 수 있다. 완충 시스템은 바이로좀 농축물에서 바이로좀의 물리적 무결성과 화학적 안정성을 유지할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이로좀은 약 6-9, 약 6.5-8, 약 7-8, 약 7.2-7.6, 약 7.3-7.5 또는 약 7.4의 표적 pH를 유지하기 위해 완충 시스템에 현탁된다. 또한 완충 시스템은 약 2-8℃의 보관 온도에서 액체 형태일 때 바이로좀을 안정화할 수 있다.
[0056] 적합한 완충 시스템은 제한없이 HEPES-염화나트륨 (HN) 완충액 HEPES-염화나트륨-EDTA (HNE) 완충액 인산염 완충 시스템 (PBS) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 완충 시스템은 바이로좀 농축물 중 약 5-1000 mM, 약 60-200 mM, 약 100-300 mM, 약 125-275 mM, 약 150-250 mM, 약 175-225 mM 약 180-210 mM, 약 185-200 mM, 약 185-195 mM, 또는 약 190-195 mM일 수 있다. 완충 시스템이 바이로좀 농축물에서 HEPES-염화나트륨인 경우, 염화나트륨은 바이로좀 농축물 중 5-1000 mM, 약 50-150 mM, 약 125-175 mM, 약 130-160 mM, 약 130-150 mM, 약 135-145 mM, 또는 약 140-145 mM일 수 있다. 완충 시스템이 바이로좀 농축물에서 HEPES-염화나트륨인 경우, HEPES는 바이로좀 농축물 중 약 1-200 mM, 약 10-75mM, 약 10-50 mM, 약 25-75 mM, 약 30-70 mM, 약 40-60 mM, 약 45-55 mM, 또는 약 48-52 mM일 수 있다.
[0057] 액상 바이로좀 농축물은 또한 적어도 하나의 냉동-동결보호제를 포함할 수 있다. 바이로좀은 본원에 개시된 투여 형태를 생산하는 동결 및/또는 동결 건조 단계 동안 손상될 수 있다. 이와 같이, 냉동-동결보호제는 동결 및/또는 동결건조 단계 동안 바이로좀 보존을 개선하기 위해 바이로좀 농축물에 포함될 수 있다. 냉동-동결보호제의 예로는 트레할로스와 같은 폴리올, 수크로스와 같은 당, 및 라이신과 같은 아미노산, 이눌린(중쇄 올리고당)과 같은 올리고당 또는 이들의 조합을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 사용된 냉동-동결보호제는 백신 제제에 적합하도록 불활성일 수 있다. 액상 바이로좀 농축물은 약 1-20% w/w, 약 1.5-10% w/w, 약 2-10% w/w, 약 4-10% w/w, 약 2-9% w/w, 약 2-5% w/w, 약 3-8% w/w, 약 3.5-8% w/w, 약 3.5-7% w/w, 약 4-8% w/w, 또는 약 5-7% w/w의 냉동-동결보호제를 포함할 수 있다.
[0058] 바이로좀 농축물은 약 1-75% w/w, 약 10-65% w/w, 약 15-60% w/w, 약 20-55% w/w, 약 20-50% w/w, 또는 약 25-50% w/w의 바이로좀 제형일 수 있다. 일부 구체예에서, 바이로좀 농축물은 약 15-35% w/w, 약 20-30% w/w, 약 23-27% w/w, 또는 약 25% w/w의 바이로좀 제형일 수 있다.
베이스 매트릭스 제형
[0059] 베이스 매트릭스 제형은 최종 투여 형태의 구조를 제공하는 데 도움이된다. 이와 같이, 베이스 매트릭스 제형은 매트릭스 형성제를 포함할 수 있다. 매트릭스 형성제는 취급하는 동안 강도와 탄력성을 부여하는 투여 형태의 네트워크 구조를 제공할 수 있다. 적합한 매트릭스 형성제의 비제한적인 예로는 젤라틴, 전분 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 추가적인 매트릭스 형성제는 EP 2624815 B1에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 젤라틴은 어류 젤라틴, 소 젤라틴, 돼지 젤라틴, 또는 이들의 조합일 수 있다. 각 젤라틴은 다른 겔화 특성을 가질 수 있다. 젤라틴 용액이 젤을 형성하는 정도는 젤라틴의 농도와 젤라틴 용액의 온도에 따라 달라질 수 있다. 소 젤라틴 용액은 18℃ 미만의 온도에서 겔화되는 경향이 있으므로 겔화 젤라틴으로 간주될 수 있다. 이와 대조적으로, 어류 젤라틴은 10℃나 되는 낮은 온도에서 용액에 남아 있을 수 있으므로 비-겔화 젤라틴으로 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 젤라틴은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 가출원 번호 62/640,394에 개시된 공정에 따라 공급된 것이거나 또는 생산된 것과 같은 저-내독소 젤라틴일 수 있다. 일부 구체예에서, 바이로좀 제형 내 매트릭스 형성제의 양은 약 1-15% w/w, 약 2-12, 약 3-10% w/w, 약 4-8% w/w, 약 4-6%, 약 5-7% w/w, 또는 약 6% w/w일 수 있다.
[0060] 바이로좀 제형이 투입되는 온도는 10-18℃ 정도로 낮을 수 있다. 이와 같이, 소 젤라틴만을 단독으로 사용하는 제형은 이러한 저온에서 투입되지 않을 수 있다. 그러나 소 젤라틴과 다른 유형의 젤라틴 (예컨대 어류 젤라틴)의 조합을 사용할 수 있다. 출원인은 어류 젤라틴이 약 30-180 또는 30-60 초의 붕해 시간 및 견고한 매트릭스 구조를 갖는 동결-건조 정제를 제공할 수 있음을 발견하였는데, 이는 구강 점막와의 충분한 접촉 시간에 영향을 주는데 바람직하다. 또한, 어류 젤라틴은 완충 염과 같은 가용성 성분을 높은 부하량, 예컨대 본원에 개시된 양으로 함유하는 제형 조성물에 있어 우수한 물리적 속성을 갖는 동결 건조된 투여 형태를 제공할 수 있다..
[0061] 일부 구체예에서, 어류 젤라틴은 고 분자량 어류 젤라틴, 표준 분자량 어류 젤라틴, 또는 이들의 조합일 수 있다. 고 분자량 어류 젤라틴은 분자량 분포의 50% 이상이 30,000 달톤보다 큰 어류 젤라틴으로 정의된다. 표준 분자량 어류 젤라틴은 분자량 분포의 50% 이상이 30,000 달톤 미만인 어류 젤라틴으로 정의된다.
[0062] 일부 구체예에서, 매트릭스 형성제는 또한 항원에 대한 안정화제 및 점막-접착제로서도 작용할 수 있다. 또한 전분은 면역-자극제 부형제 역할도 할 수 있다.
[0063] 베이스 매트릭스 제형은 또한 구조 형성제를 포함할 수 있다. 적합한 구조 형성제의 비제한적인 예로는 만니톨, 덱스트로스, 락토스, 갈락토스, 사이클로덱스트린 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 구조 형성제는 결정화함에 따라 동결-건조된 제품에 구조적 견고성을 제공하므로 벌크화제로서 동결 건조에 사용할 수 있다. 바이로좀 제형에서 완충 염 및 트레할로스와 같은 가용성 부형제는 그의 결정화를 억제할 수 있다. 결정화를 위해 연장된 어닐링 시간이 일반적으로 사용된다. 그러나 이들 가용성 부형제의 존재는 동결된 제품의 용융을 어닐링 중에 유발할 수도 있다. 따라서 출원인은 구조 형성제, 완충 염 및 냉동-동결보호제의 양과 어닐링 조건 (즉, 온도 및 시간) 사이의 균형을 발견하였다. 일부 구체예에서, 바이로좀 제형 내 구조 형성제의 양은 약 1-20% w/w, 약 3-15% w/w, 약 4.5-10% w/w, 약 4.5-8% w/w, 약 5-10% w/w, 약 6-10% w/w, 약 7-9% w/w, 또는 약 8% w/w일 수 있다. 출원인은 구조 형성제가 4.5% w/w 미만인 값에서는 동결 건조 중에 일부 미세구조 붕괴가 발생하여 동결-건조된 투여 형태의 분산/붕해가 불량할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 구조 형성제의 양이 많을수록 바이로좀에 큰 영향을 미치지 않으면서 미세구조 붕괴를 최소화하거나 제거하는 것으로 밝혀졌다.
[0064] 이에 더해, 베이스 매트릭스 제형은 또한 냉동-동결보호제를 포함할 수 있다. 냉동-동결보호제의 비제한적인 예로는 트레할로스와 같은 폴리올, 수크로스와 같은 당, 및 라이신과 같은 아미노산, 이눌린(중쇄 올리고당)과 같은 올리고당 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 냉동-동결보호제를 사용하여 후속 동결 및 동결 건조 중에 바이로좀이 손상되지 않도록 보호할 수 있다. 그러나, 냉동-동결보호제의 첨가는 동결 건조 동안 투여 형태 매트릭스의 미세구조 붕괴를 유도할 수 있다. 따라서 미세구조 붕괴를 최소화하면서 이와 동시에 면역 반응을 유도하기 위한 바이로좀 품질을 유지하기 위해 충분한 수의 바이로좀을 보존하기 위해 균형을 유지해야 한다. 베이스 매트릭스 제형 중 냉동-동결보호제의 양은 약 0.01-2% w/w, 약 0.1-1.5% w/w, 약 0.2-1% w/w, 또는 약 0.25-0.75% w/w일 수 있다. 따라서, 바이로좀 제형(즉, 액상 바이로좀 농축물 플러스 베이스 매트릭스 제형) 중 냉동-동결보호제의 순량(net amount) (이하 "(순)")은 약 0.5-6% w/w, 약 0.5-5% w/w, 약 0.5-4.5% w/w, 약 1-4.5% w/w, 약 1.5-4.5% w/w, 약 1.5-3% w/w, 약 1.5-2.5, 약 2-3% w/w, 약 2.5% w/w, 또는 약 2%w/w일 수 있다. 출원인은 이러한 수준에서 냉동/동결보호제가 동결 건조 동안 허용할 수 없는 미세구조 붕괴를 초래하지 않고 충분한 냉동-동결보호를 제공할 수 있음을 발견하였다.
[0065] 일부 구체예에서, 베이스 매트릭스 제형은 또한 검과 같은 점막-접착제를 포함할 수 있다. 적합한 검의 비제한적인 예로는 아카시아, 구아, 한천, 잔탄, 젤란, 카라기난, 커들란, 곤약, 로커스트 빈, 웰란, 트라가칸트 검, 아라비아 검, 카라야 검, 가티 검, 펙틴, 덱스트란, 글루코만난, 및 알지네이트, 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
[0066] 베이스 매트릭스 제형은 또한 추가적인 약학적으로 허용되는 제제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 추가적인 약학적으로 허용되는 제제 또는 부형제의 비제한적인 예로는 만니톨, 덱스트로스 및 락토스와 같은 당, 염화나트륨 및 규산 알루미늄과 같은 무기염, 포유동물 기원의 젤라틴, 어류 젤라틴, 변형 전분, 보존제, 항산화제, 계면활성제, 점도 향상제, 투과성 향상제, 착색제, 향미제, pH 조절제, 감미료, 맛 차폐제 및 이들의 조합을 들 수 있다. 적합한 착색제로는 적색, 흑색 및 황색 산화철 및 FD & C 염료 예컨대 FD & C Blue No. 2 및 FD & C Red No. 40, 및 이들의 조합을 들 수 있다. 적합한 향료는 민트, 라즈베리, 감초, 오렌지, 레몬, 자몽, 캐러멜, 바닐라, 체리 및 포도 향 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 적합한 pH 조절제는 시트르산, 타르타르산, 인산, 염산, 말레산, 수산화나트륨 (예를 들어, 3% w/w 수산화나트륨 용액) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 베이스 매트릭스 제형 및/또는 바이로좀 제형은 약 6-9, 약 7-8, 약 7.2-7.6, 약 7.3-7.5 또는 약 7.4의 표적 pH를 유지하기 위항 양으로 pH 조절제를 함유한다. 적합한 감미료는 아스파탐, 아세설팜 K 및 타우마틴, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 당업자는 원하는 경우 이러한 다양한 추가 부형제의 적절한 양을 쉽게 결정할 수 있다.
[0067] 베이스 매트릭스 제형은 또한 용매를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 용매는 물 (예를 들어, 정제수) 일 수 있다. 일부 구체예에서, 베이스 매트릭스 제형 및/또는 바이로좀 제형의 잔량 성분은 용매이다.
[0068] 베이스 매트릭스 제형은 바이로좀 제형의 약 25-99% w/w, 약 35-90% w/w, 약 40-85% w/w, 약 45-80% w/w, 또는 약 50-75% w/w일 수 있다. 일부 구체예에서, the 베이스 매트릭스 제형은 바이로좀 제형의 약 65-85% w/w, 약 70-80% w/w, 약 73-77% w/w, 또는 약 75% w/w일 수 있다.
바이로좀 제형을 포함하는 투여 형태 제조
[0069] 전술한 바와 같이, 액상 바이로좀 농축물은 동결-건조 공정에 적합한 단계 101에서 바이로좀 제제를 형성하기 위해 베이스 매트릭스 제형과 혼합된다. 도 2는 본원에 개시된 백신 투여 형태를 형성하는 과정에 대한보다 상세한 설명을 제공한다. 일부 구체예에서, 베이스 매트릭스 제형은 매트릭스 형성제 및 구조 형성제를 용매에 용해시켜 프리믹스를 형성함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 젤라틴과 만니톨은 도 2의 단계 201에서와 같이 물에 용해될 수 있다. 프리믹스는 약 40-80℃, 약 50-70 ℃, 약 55-65℃, 또는 약 60 ℃로 가열되어 약 45-75분, 약 55-65분, 또는 약 60분 동안 유지될 수 있다. 단계 202에 나타난 바와 같이, 프리믹스는 60℃로 가열되어 1 시간 동안 유지될 수 있다. 이어서 프리믹스는 약 30-50℃, 약 35-45℃, 또는 약 40℃로 냉각되어 체질(sieved)된 다음 약 10-20℃ 또는 약 15℃로 추가 냉각된 후 나머지 공정 동안 이 온도로 유지될 수 있다. 단계 203에 나타낸 바와 같이, 프리믹스는 40℃로 냉각되고 체질될 수 있다. 다음으로, 프리믹스는 단계 204에 도시된 바와 같이 15℃로 냉각될 수 있다.
[0070] 이어서, 냉동-동결보호제를 프리믹스에 첨가할 수 있다. 예컨대, 트레할로스를 단계 205에 도시된 바와 같이 프리믹스에 첨가할 수 있다. 이어서, pH 조절제를 이용하여 pH를 약 6-9, 약 7-8, 약 7.2-7.6, 약 7.3-7.5, 또는 약 7.4로 조정할 수 있다. 예컨대, pH는 단계 206에 도시된 바와 같이 수산화나트륨 용액을 이용하여 7.4로 조정될 수 있다. pH가 조정된 후, 액상 바이로좀 농축물을 첨가할 수 있다. 액상 바이로좀 농축물을 첨가한 후, pH를 재확인하고 (단계 207), 필요한 경우 추가 pH 조절제를 사용하여 약 6.0-8.5, 약 7-8, 약 7.2-7.6, 약 7.3-7.5 또는 약 7.4로 조정할 수 있다. 이 혼합물은 용매 (즉, 바이로좀 제형)를 사용하여 원하는 배치 크기로 만들 수 있다. 예를 들어, 단계 208에 도시된 바와 같이 필요한 양의 물을 혼합물에 첨가할 수 있다.
[0071] 도 1의 단계 102에서, 액상 바이로좀 제형은 예비성형된 몰드에 투입될 수 있다. 본원에 사용된 "투입된(dosed)"라는 표현은 용액 또는 현탁액의 미리 결정된 분취량의 침착(deposition)을 의미한다. 본원에서 사용되는 "예비성형된 몰드"는 그 안에 수용액 또는 현탁액이 침착되어 후속적으로 동결 건조될 수 있는 임의의 적합한 용기 또는 구획을 지칭한다. 본 개시 내용의 특정 구체예에서, 예비성형된 몰드는 하나 이상의 블리스터 포켓이있는 블리스터 팩이다. 바이로좀 제형의 약 150-1000 mg 또는 약 500 mg 습식 충전 투여 중량 (투여 충전 중량이라고도 함)의 미리 결정된 분취량을 예비성형된 몰드 내로 계량할 수 있다. 일부 구체예에서, 바이로좀 제형은 약 10-20℃ 또는 약 15℃에서 투입될 수 있다. 예를 들어, 바이로좀 제형은 단계 209에 나타낸 바와 같이 500mg의 투여 충전 중량으로 15℃에서 투입될 수 있다.
[0072] 도 1의 단계 103에서, 투입된 바이로좀 제형은 예비성형된 몰드에서 냉동될 수 있다. 예비성형된 몰드 내에 투입된 바이로좀 제형은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 동결될 수 있다. 예를 들어, 제형을 극저온 챔버(예컨대 액체 질소 터널)에 통과시킬 수 있다. 동결 중 온도는 약-50 내지-100℃, 약-60 내지-90℃, 약-60 내지-80℃, 약-65 내지-75℃, 또는 약-70℃일 수 있다. 동결 기간은 약 1.5-5분, 약 2-4.5분, 약 2.5-4분, 약 3-4분, 약 3-3.5분, 또는 약 3.25분 범위일 수 있다. 예를 들어, 투입된 바이로좀 제형은 단계 210에 나타낸 바와 같이-70℃에서 3분 15초 동안 동결될 수 있다.
[0073] 도 1의 단계 104에서, 예비성형된 몰드의 냉동 유닛을 수집하여 약-25℃, 약-20℃, 약-15℃, 약-10℃, 약-5℃ 미만의 온도의 냉동고에 넣고 구조 형성제가 결정화되도록 하는 기간 동안 어닐링(즉 동결 유지)할 수 있다. 구조 형성제 결정화는 동결된 유닛에 구조적 강도를 제공하여 동결 건조 중에 동결된 유닛의 붕괴를 방지할 수 있다. 이것은 바이러스의 무결성에 중요할 수 있다. 어닐링 시간은 약 3-9 시간, 약 4-8 시간, 약 5-7 시간 또는 약 6 시간 범위일 수 있다. 예를 들어, 동결된 유닛은 단계 211에 나타난 바와 같이 약 3-9 시간 동안-15℃ 미만에서 어닐링될 수 있다.
[0074] 어닐링 후, 어닐링된 동결 단위는 단계 105에서 동결-건조되어 투여 형태를 형성할 수 있다. 동결-건조 과정에서 물은 동결된 유닛으로부터 승화된다. 일부 실시예에서, 동결된 유닛은 동결-건조기의 선반에 적재될 수 있다. 일부 구체예에서, 동결-건조기는 약-15 내지-35℃, 약-20 내지-30℃, 또는 약-25℃로 예냉될 수 있다. 어닐링된 동결 유닛이 일단 동결-건조기로 들어가면 동결-건조 사이클을 시작할 수 있다. 일부 구체예에서, 동결-건조 사이클이 개시되면 진공이 시작되어 선반 온도가 상승할 수 있다. 동결-건조기는 저압(즉, 진공)에서 작동할 수 있다. 일부 구체예에서, 동결-건조기는 약 1000 mbar, 약 900 mbar, 약 800 mbar, 약 700 mbar, 약 600 mbar, 약 500 mbar, 또는 약 400 mbar 이하의 압력에서 작동할 수 있다.
[0075] 출원인은 투여 형태의 구조적 견고함을 달성할 수 있을 뿐만 아니라 투여 형태 내의 바이로좀의 손상을 최소화할 수 있는 2 단계 동결-건조 사이클 (단계 212)을 발견하였다. 2 단계 동결-건조 사이클은 동결 유닛을 약-5℃ 내지-25℃C, 약-10℃ 내지-20℃C, 약-13℃ 내지-17℃, 또는 약-15℃에서 약 12-36시간, 약 18-30시간, 약 20-28시간, 또는 약 24시간 동안 유지시키는 제1 단계를 포함할 수 있다. 또한, 2 단계 동결-건조 사이클은 제1 단계 이후의 제2 단계를 포함할 수 있다. 제2 단계는 약 0oC 내지-20oC, 약-5 oC 내지 약-15 oC, 약-8 oC 내지 약-12 oC, 또는 약-10 oC에서r 약 6-30시간, 약 12-24시간, 약 14-22시간, 또는 약 18시간 동안 동결 유닛을 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 2 단계 동결 건조 사이클이 끝나면 동결 건조기의 온도를 대략 주변 온도 (즉, 약 20-25℃ 또는 약 23℃)로 올릴 수 있다.
[0076] 일부 구체예에서, 2 단계 동결-건조 공정은 동결-건조기를 약-25℃로 예냉하고, 동결-건조기를-15℃로 2시간 동안 램핑하고, 동결 건조기를 24 시간 동안-15℃에서 유지하고, 동결-건조기를-10℃에서 2 시간 램핑하고,-10℃에서 18 시간 유지하고, 0℃에서 15분간 램핑하고, 23℃에서 15분간 순서대로 램핑하는 것을 포함할 수 있다.
[0077] 동결-건조된 투여 형태는 동결-건조기로부터 제거되고 단계 213에서 결함이 있는지 검사될 수 있다 (후술하는 품질 검사). 이어서 투여 형태를 약 35% RH 미만의 대기 습도에서 보관 캐비넷에 넣은 다음 투여 형태를 그의 예비성형된 몰드에 넣고 밀봉할 수 있다. 밀봉 공정 (단계 214)은 예비성형된 몰드 상에 덮개 호일을 배치하고 동결-건조된 투여 형태의 블리스터를 제공할 수 있다.
[0078] 동결-건조된 투여 형태 내의 물은 동결-건조 동안 승화를 통해 제거될 수 있다. 따라서, 냉동-동결보호제(즉, 동결-건조된 바이로좀 농축물로부터 남아있는 바이로좀, 항원, 아쥬반트 및 완충제 시스템)를 제외한 동결-건조된 투여 형태 내의 나머지 바이로좀 농축물은 투여 형태의 약 1-5 wt.%, 약 2-4 wt.%, 약 2.5-3.5 wt.%, 약 2.6-3.4 wt.%, 약 2.7-3.3 wt.%, 약 2.8-3.2 wt.%, 약 2.9-3.1 wt.%, 또는 약 3-3.1 wt.%일 수 있다.
[0079] 전술 한 바와 같이, 표적 분자(들)은 투여 형태로 제공될 때 면역원성을 부여하기에 충분한 양으로 본원에 개시된 투여 형태에 포함된다. 당업자는 무엇보다도 투여 경로, 투여 형태가 투여될 환자의 연령 및 체중에 기초하여 주어진 질병 또는 감염에 대한 면역원성 양을 쉽게 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, 고체 투여 형태는 0.01-250 ㎍의 각 표적 분자(예를 들어, HIV-1 P1 펩타이드 및/또는 rgp41)를 함유할 수 있다.
[0080] 일부 구체예에서, 동결-건조된 투여 형태의 냉동-동결보호제 중 적어도 하나는 투여 형태의 약 5-20 wt.%, 약 8-18 wt.%, 약 10-15 wt.%, 약 11-15 wt.%, 또는 약 12-15 wt.%일 수 있다. 일부 구체예에서, 동결-건조된 투여 형태의 냉동-동결보호제 중 적어도 하나는 투여 형태의 약 1-5 wt.%, 약 1-4 wt.%, 또는 약 2-4 wt.%일 수 있다.
[0081] 일부 구체예에서, 투여 형태 중의 매트릭스 형성제의 양은 약 20-50 wt.%, 약 25-45 wt.%, 약 25-40 wt.%, 약 30-40 wt.%, 약 33-37 wt.%, 또는 약 35-37 wt.%일 수 있다. 일부 구체예에서, 투여 형태 중의 구조 형성제의 양은 약 27-65 wt.%, 약 27-60 wt.%, 약 40-55 wt.%, 또는 약 45-50 wt.%일 수 있다. 일부 구체예에서, 동결-건조된 제형 중 pH 조절제 (예를 들어, 수산화나트륨)의 잔량은 약 0.01-0.08 wt.%일 수 있다.
[0082] 본 개시 내용의 투여 형태는 용해 투여 형태이고 따라서 더 빠른 붕해 시간이라는 뚜렷한 이점을 갖는다. 투여 경로는 경구, 질 또는 비강일 수 있지만, 바람직하게는 경구 (즉, 설하 및/또는 협측)이다. 일단 구강 내에 배치되어 타액과 접촉하면, 투여 형태는 약 1 내지 약 180초, 약 1 내지 약 120초, 약 1 내지 약 60초 내로, 좋기로는 약 1 내지 약 30초 이내, 더욱 좋기로는 약 1 내지 약 10초 이내 및 가장 좋기로는 약 5초 이내에 붕괴될 수 있다.
제형, 테스트 방법 및 실시예
[0083] 실시예에서는 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 액상 바이로좀 농축물을 사용하였다. 바이로좀에는 인플루엔자 HA뿐만 아니라 추가된 항원과 아쥬반트가 포함되어 있다. 두 개의 바이로좀 제제가 제조되었는데, 이들 각각은 HIV 외피 당단백질로부터 유래된 단일 항원을 함유한다. 액상 바이로좀 농축물은 두 가지 바이로좀 제제의 혼합물이었다. 2개의 HIV-gp41 유래 항원은 마지막 35 개의 C-말단 엑토도메인 잔기를 나타내는 P1 펩타이드 및 클러스터 I과 마지막 21개의 C-말단 엑토도메인 잔기가 없는 절단형(truncated) rgp41이었다. 아쥬반트 3M-052는 이들 두 가지 바이로좀 제제에 존재하거나 부재하였다. pH 7.4에서 142.5mM 염화나트륨 및 50mM HEPES를 함유하는 HEPES-염화나트륨 완충액에 바이로좀을 현탁시켰다. 이에 더해, 트레할로스(냉동-동결보호제)를 액상 바이로좀 농축액의 0-10% w/w 범위에서 테스트하였다. 다음 표 1은 본 발명자들의 일부 실험에 사용된 HIV-1 액상 바이로좀 농축액의 표적 조성을 요약한 것으로, 이 실험 동안 수성 바이로좀 제형의 500mg(투여 충전 중량)의 분취량을 예비성형된 블리스터 포켓에 계량한 다음 동결 및 동결 건조하였다. 투여 충전 중량은 150mg 내지 1000mg 범위일 수 있으며 HIV-1 액상 바이로좀 농축액의 조성은 필요한 표적 용량을 충족하도록 조정할 수 있다. 다음의 목표 범위는 목적 및 추가 사용 (예컨대 동물 연구 또는 인간 연구)에 따라 달라질 수 있다. 따라서 다른 표적 농도는 다른 목적에 유용할 수 있다.
Figure pct00001
[0084] 본 발명자들의 일부 실험에서, 각 정제에 대한 HA 및 HIV-1 항원의 표적 용량은 HA 20㎍, P1 25㎍ 및 rgp41 50㎍이었다. 이러한 용량을 달성하기 위해서는 높은 습식 충전 용량 중량과 함께 액상 바이로좀 농축물의 높은 페이로드가 필요하였다. 표 2는 액상 바이로좀 농축물 로딩 (25-50% w/w 범위)과 습식 충전 투여 중량 (250 ~ 1000mg 범위)의 다양한 조합을 보여준다. 습식 충전 투여 량은 동결-건조 전에 투여량 당 측정된 바이로좀 제제의 분취량이다.
Figure pct00002
[0085] 베이스 매트릭스 제형에 액상 바이로좀 농축물을 25% 로딩으로 첨가할 수 있다. 투여 충전 투여 중량은 500 mg일 수 있다. 표 3은 평가된 HA 및 항원의 함량 범위를 나타낸다.
Figure pct00003
[0086] 수성 조성물에 완충액이 존재하면 빙점을 낮출 수 있고, 따라서 제제 조성물을 동결시키는 것과 동결 상태를 유지하는 것을 어렵게 만든다. 또한, 완충 염이 어닐링 공정 동안 만니톨의 결정화를 저하시킬 수 있기 때문에 동결-건조 중에 정제 매트릭스 구조의 붕괴가 발생할 수도 있다. 만니톨의 결정화는 구조 붕괴를 방지하기 위해 정제 매트릭스에 강도와 구조를 제공하는 데 필요한다. 그러나 만니톨의 결정화는 동결, 어닐링 및 동결 건조 중에 바이로좀 입자를 손상시킬 수 있다. 액상 바이로좀 농축액 (예컨대 25% 로딩)의 낮은 비율 로딩은 이러한 영향을 줄이는데 일조한다. 액상 바이로좀 농축액의 더 낮은 백분율 로딩과 더 큰 투여 충전 중량의 조합도 고려할 수 있다.
[0087] 높은 완충제 함량을 갖는 제형 조성물과 조합된 바이로좀 제형의 높은 습식 충전 투여 중량 역시도 동결-건조 동안 붕괴를 최소화하기 위해 구조를 동결 및 유지하는 것을 더 어렵게 만들 수 있다. 그러나 더 큰 정제 (예컨대 1000mg 투여 충전 중량)는 더 큰 표면적을 커버할 수 있으며 잠재적으로 바이로좀 통과를 개선할 수 있다. 높은 습식 충전 용량이 필요한 경우, 낮은 완충액 함량을 갖는 제형 조성물이 바람직한다.
[0088] 표 4 (제형 1)는 바이로좀 제형의 수성 조성물 및 본원에서 평가된 정제 바이로좀에 대한 상응하는 조성을 요약한 것이다. 다음의 제형 및 정제는 도 2에 도시되고 설명된 단계에 따라 제조되었다. 이에 더해, 동결된 제형을 500 mbar 진공 하에 2 단계 동결-건조 공정 처리하였으며 구체적으로: (a)-25oC 예냉; (b) 2시간 동안-15℃로 램핑; (c)-15℃에서 24시간 유지; (d) 2시간 동안-10℃로 램핑; (e)-10℃에서 10시간 유지; (f) 15분 동안 0℃로 램핑; (g) 15분간 23℃로 램핑 처리하였다. 이어서, 진공을 풀고 동결 건조기의 압력을 대기압으로 회복시켰다
[0089] 각 성분(% w/w)의 농도는 액상 바이로좀 농축물에 존재하는 물, 수산화나트륨 용액 및 동결건조 동안 승화 제조에 사용된 물을 제거하기 전의 양이다. 또한 다음 표에는 각 성분의 가능한 양의 범위가포함되어 있다.
Figure pct00004
[0090] * 전술한 바와 같이, 액상 바이로좀 농축물은 5% w/w 트레할로스와 함께 142.5mM NaCl 및 50mM HEPES의 완충 시스템에 현탁된 바이로좀을 포함하였다. 500mg 투여 충전 중량 (즉, 액상 바이로좀 농축액 125mg) 중의 바이로좀 제형 25% 로딩의 경우, 바이로좀, 항원, 아쥬반트, NaCl 및 HEPES (트레할로스 제외)의 물이 승화된 건조 물질 평가량은 약 2.5-2.6 mg이다.
[0091] ** 이는 바이로좀 제형 및 투여 형태 중의 트레할로스의 순량이다. 따라서, 이 양은 액상 바이로좀 농축물로부터의 트레할로스뿐만 아니라 베이스 매트릭스 제형으로부터 첨가된 트레할로스를 포함한다.
동결-건조된 투여 형태의 속성:
[0092] 동결-건조된 투여 형태는 물리적 속성 및 바이로좀 품질(입자 크기 특징 및 항원 함량)에서 안정할 수 있고 콜드 체인 보관 조건과 무관하게 보관될 수 있다. 또한, 동결-건조된 투여 형태는 바이로좀이 보관 또는 운송 중에 영하의 저장 조건에 우발적으로 노출되는 것에도 저항할 수 있다.
투여 형태 물리적 특징:
[0093] 허용 가능한 물리적 특징을 갖는 동결 건조 정제가 제조되었다. 정제의 물리적 속성에는 외관, 분산 특성, 붕해 시간 및 수분 함량이 포함된다.
[0094] 10개의 동결-건조된 정제의 정제 외관을 시험한다. 각 정제를 블리스 터 패키지에서 제거한다. 정제 표면 및 베이스의 표면 결함에 대해 각 정제에 대한 육안 검사를 수행한다. 기준은 동결-건조된 정제가 표면 결함 없이 외관이 좋아야한다는 것이다. 또한, 정제는 파손없이 블리스터 포켓에서 제거 가능하도록 충분히 견고하여야 한다.
[0095] 분산 특성(시험관내 테스트): 최소 5개의 정제를 테스트한다. 먼저, 20℃ ± 0.5℃에서 약 200 mL의 정제수를 포함하는 비커를 준비한다. 그런 다음 각 정제를 블리스터 패키지에서 꺼내고 정제를 물 표면 위에 베이스 다운으로 배치한다. 시간은 각 정제가 완전히 젖거나 분해되는 데 걸리는 시간이다. 유닛이 완전히 젖는 데 걸리는 습윤 시간. 정제의 습윤은 패치에서 발생할 수 있으며, 결국 함께 합쳐져 전체 유닛이 습윤된다. 분산 테스트는 유닛의 중심이 습윤 물질일 때 완료된 것으로 간주된다. 따라서 습윤 시간은 유닛의 중심이 습윤될 경우를 측정하는데 이는 중심부가 유닛의 가장 두꺼운 부분이기 때문이다. 습윤 시간을 5개의 정제 각각에 대해 기록한다. 각 테스트의 최대 시간은 60초이다. 이보다 긴 시간은 간단히 60초 이상으로 기록 가능하다. 분해(dissociation) = 유닛이 분리되는데 걸리는 시간. 이 시간은 유닛이 가장자리부터 떨어져 나가기 시작할 때 취할 수 있다. 분해 시간을 5개의 정제 각각에 대해 기록한다. 각 테스트의 최대 시간은 60초이다. 이보다 긴 시간은 간단히 60초 이상으로 기록 가능하다. 경우에 따라 유닛이 이 제한 시간 내에 완전히 습윤되지 않거나 완전히 분리되지 않을 수 있다. 때때로 유닛의 내부에 단단한 덩어리가 있을 수 있다; 또 다른 경우, 표면에 전혀 습윤되지 않을 수도 있다. 이에 더해, 또한 유닛 전체가 단단한 껍질로 덮일 수도 있다. 그럴 경우 설명에 "단단한 덩어리(hard lumps)" 또는 "껍질 잔존물(skin remains)"을 적절하게 인용하여 기록한다. "단단한 덩어리" 및/또는 "껍질"의 형성은 동결-건조 동안 미세구조 붕괴를 나타내는 것일 수 있다. 도 3A-C는 3가지 가능한 비-분산 상태의 단순화된 모양을 물 속에서 나타날 수 있는 유닛의 측면도 및 정면도와 함께 보여준다. 도 3A-C의 사진은 동일한 범주에 대한 몇 가지 대표적인 유닛을 보여준다. 분산 특성 테스트의 기준은, 5개의 정제가 단단한 덩어리와 껍질 없이 60초 이내에 완전히 습윤되고 및/또는 만질 수 있는(palpable) 덩어리로 분해될 수 있는지 여부이다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 투여 형태는 60초 이내로, 단단한 덩어리 및/또는 껍질의 존재 없이 완전히 습윤되고 및/또는 만져지는 덩어리로 분해될 수 있다.
[0096] 붕해 시간(시험관내 테스트): 이 테스트에는 6개의 정제가 사용된다. 6개의 비커에 정제수를 채우고 37℃ ± 0.5℃로 조절되는 수조에 넣는다. 그런 다음 각 정제를 블리스터 패키지에서 꺼낸다. 6개의 정제 각각에 와이어 클립을 조심스럽게 놓는다. 클립이 손상 없이 정제를 고정하는지 확인한다. 다음으로 약전(Pharmacopeia)에 설명된 대로 테스트를 수행한다. 이러한 테스트의 예는 United State Pharmacopeia (701) Disintegration이다. 최대 분해 시간을 각 정제에 대해 기록한다. 붕해 시간 테스트의 기준은 6개의 정제 각각에 대해 붕해 시간이 60 초를 넘지 않아야 한다는 것이다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 투여 형태는 60초 미만의 붕해 시간을 가질 수 있다.
[0097] 수분 함량: 744 오븐 샘플 프로세서(Metrohm, Herisau, Switzerland)가 구비된 Methron 831 Karl Fischer 전기계량계를 사용하여 정제의 수분 함량을 측정한다. 정제를 정확하게 칭량하여 유리 바이알에 넣는다. 바이알은 수분 침투를 방지하기 위해 즉시 압착 차단(crimp shut)된다. 그런 다음 샘플 바이알을 744 오븐 샘플 프로세서에 넣고 온도를 102℃로 설정한다. 증발된 수분은 Hydranal Coulometric AG Oven 시약을 사용하여 적정하여 방출된 물의 양을 정량화한다. 테스트를 3회 수행하여 평균값을 기록로한다. 수분 함량에 대한 기준은 동결-건조된 투여 형태가 약 8% 미만, 바람직하게는 6% 미만, 더욱 바람직하게는 4% 미만의 수분 함량을 갖는지 여부이다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 투여 형태는 약 8% 미만, 바람직하게는 6% 미만, 더욱 바람직하게는 4% 미만의 수분 함량을 가질 수 있다.
바이로좀 특징:
[0098] 바이로좀을 함유하는 동결-건조된 투여 형태는 출발 액상 바이로좀 집단으로부터의 온전한 바이로좀의 비율, 이의 입자 크기 및 바이로좀의 면역원성 및 면역학적 이점에 필요한 표면 항원 함량 측면에서 충분히 보존될 수 있다. 바이로좀 구조는 투여 형태를 생산하는 데 사용되는 동결 건조 공정에 의해 파괴될 수 있다. 따라서, 재구성된 동결-건조된 정제의 용액으로부터 바이로좀 미립자 특성을 평가한다. 바이로좀은 면역원성이지만 항원/에피토프 노출이 다르며 설하 장벽을 통과하는 다른 능력을 보유하는, 손상되지 않은 개별 입자 및 크기가 다른 클러스터로서 존재할 수 있다. 바이로좀은 (a) 평균 입자 크기 및 (b) 바이로좀 보존 비율 (온전한 바이로좀)의 관점에서 특성화될 수 있다.
[0099] NTA 기술을 이용한 바이로좀 입자 크기 및 입자 농도(mL 당 바이로좀 입자 수) 평가: 나노 입자 추적 분석 (NTA; NanoSight NS300 기기 사용)은 용액 내에 존재하는 30-1000 nm 범위의 상이한 입자 크기를 식별할 수 있는 민감한 방법이다. 샘플 용액 내의 입자를 개별적으로 추적하고 직접 관찰하여 동시에 분석할 수 있다. 나노입자는 이들을 둘러싼 물 분자의 무작위 운동으로 인해 브라운 운동 하에서 움직인다. 작은 입자는 큰 입자보다 빨리 움직인다. 각 입자의 브라운 운동은 비디오를 통해 실시간으로 추적되며 NTA는 브라운 운동을 분석하여 입자 크기를 결정한다. 확산 계수는 각 입자의 움직임을 추적하여 계산할 수 있으며 스토케-아인슈타인 방정식을 적용하여 입자 크기를 계산할 수 있다. 이 입자별 방법론은 입자 크기 분포 및 농도 (즉, 알려진 액체 부피의 입자 수)에 대한 고해상도 결과를 생성한다. 기기 감지를 위한 최적 감지를 위한 목표 값을 다음 표 5에 요약하였다.
Figure pct00005
[0100] 테스트 샘플은 액체 형태여야 한다. 이 작업을 위해 바이러좀 백신은 액체 형태로 제공된다. 본원에 개시된 백신 제제로부터의 테스트 샘플의 경우, 혼합물은 액체 형태로 공급되고, 동결된 유닛은 테스트 전에 액체 형태로 해동되며, 동결-건조된 투여 형태는 물 완충액으로 액체 형태로 재구성된다. 테스트 샘플은 너무 농축되어서는 안된다. 액체 테스트 샘플은 검출을 최적화하기 위해 HN 완충액으로 추가로 희석할 수 있다. 희석 완충액은 고순도 일 수 있으며, 사용 전에 적어도 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과될 수 있다. NTA 분석을 위해 설정된 실험 매개 변수는 다음 표 6에 요약되어 있다.
Figure pct00006
[0101] 샘플은 당업계에 공지된 바와 같이 NTA에 의해 측정되었다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 단편 및 클러스터를 포함하는 바이로좀 입자 범위는 약 50-500 nm 일 수 있다. 일부 구체예에서, 온전한 바이로좀인 바이로좀 입자는 약 70-400 nm 또는 약 70-200 nm (주 피크) 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 바이로좀 입자의 평균 직경은 약 70-200 nm, 약 100-175 nm, 약 125-155 nm일 수 있다. 검출 목적을 위해 샘플에서 바이러좀 집단의 입자 농도는 최소 1010 카운트/mL가 될 수 있다.
[0102] 유세포 분석을 이용한 바이로좀 보존 평가의 비율: 이 평가를 위해 유세포 분석을 이용한다. 먼저, 바이로좀의 지질 이중층에 친유성 염료 Dil (장쇄 디알릴카보시아닌)을 삽입하여 출발 액상 바이로좀 입자를 표지한다(레퍼런스 샘플은 출발 물질의 100%를 나타냄). (Dil을 이용한 표지는 입자 크기에 측정 가능한 영향을 미치지 않는다.) 두 번째로, 동결-건조된 정제를 재구성하고 동결-건조된 정제의 바이로좀을 Dil(테스트 샘플)로 표지한다. 그런 다음 AMNIS 이미징 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석하고 레퍼런스(동결-건조 전 액상 바이로좀)과 테스트 샘플 (동결-건조된 바이로좀) 사이의 이벤트를 비교하여 동결 건조 후 바이로좀 보존 비율을 다음과 같은 측면, 즉: (a) 바이로좀 회수 백분율 및 (b) 바이로좀 클러스터 밴분율 측면에서 추정한다. 일부 구체예에서, 단일 입자로서 바이로좀의 회수 백분율은 출발 물질의 약 20-50%, 약 30-50% 또는 약 40-50% 일 수 있다. 일부 구체예에서, 바이로좀 클러스터(이중, 삼중 또는 더 높은 수의 형태)의 백분율은 약 50% 미만, 약 25%, 약 10% 또는 약 5% 일 수 있다.
바이로좀 헤마글루티닌 (HA), HIV-1 항원 P1, HIV-1 항원 및 아쥬반트의 함량
[0103] 인플루엔자 HA, HIV-1 항원 및 바이로좀의 아쥬반트 함량은 다양한 방법으로 정량할 수 있다. 이는 아래 표 7에 표로 정리되어 있다.
Figure pct00007
[0104] HA, P1 및 rgp41에 대한 면역 블롯 분석 방법: 이 분석에서, 제형 (액상 바이로좀 농축물 또는 바이로좀을 포함하는 재구성된 동결 건조 투여 형태)은 니트로셀룰로스 막에 흡수될 수 있고 가열 공정, 변성 또는 환원제가 없기 때문에 항원은 원래 상태로 유지된다. 이 분석은 특정 항체에 접근할 수 있는 모든 항원을 검출하고 특정 에피토프에 대한 접근을 파괴하거나 차단하는 주요 항원 분해 또는 변성을 나타낸다. 또한 특정 부형제가 그의 항원에 대한 항체 결합을 방지할 수 있는지 여부도 가리킨다. 분석을 위해 동결-건조된 투여 형태(테스트 샘플)를 준비하기 위해, 각 정제를 0.5 mL의 물에 용해시킨다 (즉, 동결-건조된 정제를 동결-건조 전에 바이로좀 제형의 조성으로 다시 재구성한다). 양성 대조군을 준비하기 위해 액상 바이로좀 농축액 샘플을 초순수로 희석한다 (4배 희석). 액상 바이로좀 농축물은 투여 형태 테스트 시험 샘플을 만드는 데 사용된 것과 동일한 배치인 것이 이상적이다. 모든 테스트 샘플과 양성 대조군의 연속 2배 희석액을 준비한다. 합성 P1 및 정제된 HA 및 rgp41과 같은 추가 양성 대조군도 사용할 수 있다. 1.5 μL의 각 샘플과 양성 대조군을 건조 니트로셀룰로오스 막에 스폿한다(좌측에서 우측으로 희석배수를 증가시킴-미희석, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128). 건조 막을 1% (w/v) 카제인으로 차단하고 특정 항체 용액 (HIV-1 P1 항원에 특이적인 인간 모노클로날 항체(mab) 2F5 및 HIV-1 rgp41 항원에 대한 토끼 항-rgp41 혈청)과 함께 인큐베이션한다. 인큐베이션 후 니트로 셀룰로오스 막을 세척한다. 그런 다음 700nm 및 800nm에서 2개의 서로 다른 형광 표지를 동시에 감지할 수 있는 원적외선 형광 스캐너를 사용하여 형광 표지된 2 차 항체(항-인간 또는 항-토끼)와 결합된 특이적인 항체를 탐지한다. 각 샘플 스폿에 대한 미가공 형광 데이터 신호 (최저값으로부터 최고값까지)를 양성 대조군 스폿의 각 희석액(양성 대조군의%)과 비교한다. 샘플 백분율의 산술 평균을 계산한다.
[0105] 3M-052에 대한 UV 분광 분석: 아쥬반트 분자 3M-052는 여러 UV 흡착 피크를 가지고 있다. 이러한 피크 중 일부는 지질 및 단백질의 흡수와 중복된다. 320 nm에서 UV 분광법에 의해 결정을 수행하였다.
[0106] P1 및 rgp41에 대한 HPLC 분석: HIV 항원 P1 및 rgp41을 물 대 아세토니트릴 구배를 사용하여 C18 컬럼에서 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리하였다. 측정은 280nm에서 UV 분광법으로 수행되었으며 피크 면적은 HPLC 시스템 소프트웨어로 정량화하였다.
[0107] ELISA 종점 항체 역가: Maxisorp 96-웰 플레이트 (Nunc-평평한 바닥) 및 Polysorp 플레이트를 PBS pH 7.4에서 제조된 0.1 mL의 rgp41 또는 P1 펩타이드 (2 ㎍/mL)로 각각 4℃에서 16시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 0.05% v/v Tween 20 (PBST)이 포함된 PBS로 3회 세척 한 다음 PBST 중 0.1% BSA에서 면역 혈청 연속 희석액(1/1000 내지 1/64,000) 또는 1/1000으로 희석된 예비-면역 혈청 0.1 mL를 각 웰에 첨가하고 RT에서 2 시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척한 후 PBST 중 0.1% BSA에 1:4000으로 희석된 염소 항-래트 IgG-HRP와 함께 RT에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 0.1 mL의 비색 기질 o-페닐렌디아민(OPD)을 첨가하기에 앞서 플레이트를 다시 세척하고 2M H2SO4로 반응을 중지시킨 다음 492 nm에서 플레이트를 판독하였다.
실시예 1: 저온 동결 건조 사이클과 함께 높은 만니톨 수준 ( 8% w/w)을 사용하여 바이로좀 무결성을 손상시키지 않고 동결 건조 동안 미세구조 붕괴를 감소시킨다.
[0108] 만니톨은 구조적 견고성을 증가시키기 위해 투여 형태에 사용된다. 높은 수준의 완충액 존재 및 바이로좀 입자를 보호하기 위한 트레할로스의 첨가로 인해, 4.5% w/w의 일반적인 수준으로 만니톨을 사용하면 동결 건조 동안 충분한 구조적 지지를 제공할 수 없었다. 따라서 미세 구조 붕괴가 발생하였다.
[0109] 그러나, 출원인은 더 높은 수준의 만니톨 및 저온 동결 건조 사이클의 조합을 사용함으로써 구조적으로 더 견고한 동결-건조된 정제가 얻어질 수 있음을 발견하였다. 이 실시예는 4.5% w/w 만니톨을 함유하는 제형과 8% w/w 만니톨을 함유하는 제형을 비교하는 데이터를 보여준다. 두 제형 모두에서, HN 완충액 pH 7.4 (50 mM HEPES, 142.5 mM NaCl) 중 HA 70-80 ㎍/ml, P1 40-50 ㎍/ml, rgp41 70-80 ㎍/ml (A/Brisbane/59/2007 (H1N1)을 함유하는, Mymetics사가 공급한 액상 바이로좀 농축물 MYM-201 lot 160125-1의 25% w/w 로딩을 바이로좀 제형에서 이용하였다. 어류 젤라틴과 순 트레할로스 수준은 바이로좀 제형에 대해 각각 6% w/w 및 2% w로 유지시켰다. 도 2에 도시된 바와 같이, 제형들을 알루미늄 트레이의 블리스터 포켓에 15℃에서 500mg 용량 충전 분취량으로 투입하였다. 투입된 수성 백신 믹스가 들어있는 트레이는 알루미늄 트레이를 3분 15초의 기간 동안-70℃로 설정된 냉동실을 통해 통과시킴으로써 냉동시켰다. 냉동된 제품이 들어있는 알루미늄 트레이를 수집하여 <-15℃의 냉동고에 넣고 동결건조에 앞서 6 시간 동안 동결을 유지하면서 6시간 동안 어닐링한다.-15℃에서 24 시간 및 이어서-10℃에서 18시간으로 이루어진 2 단계 FD 사이클을 이용하였다. 동결-건조된 정제를 봉지(sachets)에 밀봉하고 주변 조건에서 보관하였다.
[0110] 동결건조된 정제의 물리적 특성(외관 및 분산 시간)은 전술한 테스트에 따라 평가하였다. 또한, 동결건조된 정제의 바이로좀 입자 크기를 전술한 테스트에 따라 특징지었다. 결과를 하기 표 8에 요약하였다.
Figure pct00008
[0111] 모든 정제는 외관이 양호하였다. 4.5% w/w 만니톨 제형은 미세구조 붕괴로 인해 정제에서 보이는 단단한 덩어리 및/또는 껍질의 불량한 분산 거동을 나타낸다. 제형을 8% w/w로 증가시키면 만니톨의 결정화가 촉진되어 동결-건조된 정제의 구조가 개선되었다. 8% w/w 만니톨을 함유한 제형은 분산 거동이 우수하고 매끄러우면서 만져볼 수 있는 질감을 제공하였다. 저온 동결 건조 사이클과 조합시, 동결-건조된 정제의 바이로좀 입자는 영향을 받지 않았다. 동결-건조된 정제의 바이로좀 입자 크기는 제형들 간에 전반적으로 서로 필적하였다.
실시예 2: ICH 조건 하에서 3개월 동안 보관된 동결-건조된 백신 투여 형태 (제형 1)의 안정성 데이터.
[0112] 액상 바이로좀 농축물은 일반적으로 2-8℃에서 안정하지만, 액상 HIV 바이러스 백신은 항원에 중요한 화학적 변형이 일어나기 때문에 수 개월의 제한된 저장 수명을 갖지만 응집은 없다. 수분 함량이 낮은 고체 백신을 사용하면, 이러한 변형이 경시적으로 둔화 및 최소화되어 보관 수명이 1년 넘게 연장될 것으로 기대된다. 동결-건조된 정제 제형 1 형태의 바이로좀 백신의 안정성이 이 실시예에 설명되어 있다. 약 100 μg/ml HIV-1 P1, 230 μg/ml HIV-1 rgp41, 130 μg/ml HA (A/Brisbane/59/2007 (H1N1))로 구성된 Mymetics에서 공급하는 액상 바이로좀 농축액 배치 MYM V202 lot 170130-1, HN 완충액 pH 7.4 (50mM HEPES, 142.5mM NaCl) 중 65μg/ml 아쥬반트 3M-052와 7% w/w 트레할로스가 동결 건조된 백신 정제 (배치 Z33787A101)의 제조를 위해 공급되었다. 동결건조된 백신 정제 (뱃치 Z33787A101)의 제조를 위해, 7% w/w 트레할로스와 함께 HN 완충액 pH 7.4 (50 mM HEPES, 142.5mM NaCl) 중 대략 100 ㎍/ml HIV-1 P1, 230 ㎍/ml HIV-1 rgp41, 130 ㎍/ml HA (A/Brisbane/59/2007 (H1N1), 65 ㎍/ml 아쥬반트 3M-052을 포함하는, Mymetics에서 공급된 액상 바이로좀 농축물 뱃치 MYM V202 lot 170130-1을 공급하였다.
[0113] 백신 정제를 제조하기 위해, 액상 바이로좀 제형 혼합물을 먼저 제조하였다. 이것은 25% w/w의 액상 바이로좀 농축물 뱃치 MYM V202 lot 170130-1, 6% w/w 어류 젤라틴, 4.5% w/w 만니톨, 2% w/w (순) 트레할로스, 수산화나트륨 용액(pH 4로 만드는 양), 정제수 (100% w/w로 만드는 양)을 함유하였다.
[0114] 액상 바이로좀 제형 혼합물을 15℃에서 알루미늄 트레이의 블리스터 포켓에 500mg 용량 충전 분취량으로 투입하였다. 투입된 수성 백신 믹스가 들어있는 트레이를 3분 15초 동안-70℃로 설정된 냉동 챔버를 통과시켜 동결시켰다. 냉동 제품이 들어있는 알루미늄 트레이를 수집하여 <-15℃의 냉동고에 넣었다.-15℃에서 24시간, 이어서-10℃에서 18시간을 이용하는 2 단계 FD 사이클이 사용되었다.
[0115] 동결-건조된 정제의 블리스터를 봉지에 밀봉하고 5℃, 25℃/60% 상대 습도 및 40℃/75% 상대 습도에서 3개월 동안 보관하였다. 초기 테스트 및 3개월 테스트 결과를 아래 표 9에 요약하였다.
Figure pct00009
[0116] 안정성 데이터는 정제 외관이 양호하고 뱃치 간에 일관성이 있음을 보여준다. 3개월의 보관 기간 동안 상이한 안정성 조건들 간에 수분 함량은 5-6% w/w로 거의 차이가 없었다. 이 제형은 4.5% w/w 만니톨을 함유하고 있기 때문에, 붕괴 시간의 가변성에서 나타난 바와 같이 동결 건조 동안 약간의 미세구조 붕괴가 있다. 바이로좀 입자 크기 측면에서, DLS 및 NTA 데이터는 다양한 안정성 조건에서 보관된 정제들 간의 바이로좀 입자 크기에서 눈에 띄는 차이를 보이지 않았다. 출발 액상 바이로좀 농축물은 < 200 nm인 입자가 < 50%이다. 이러한 결과는 재구성된 유닛에서 < 200nm의 바이로좀이 본질적으로 유사한 크기로 보존된다는 것을 보여준다.
[0117] 반-정량적(semi-quantitative) 면역블롯 분석을 사용하여 항원 HIV-1 항원 P1 및 rgp41을 3개월에 걸친 분해에 대해 모니터링하였다. 모든 샘플은 2배 사전 희석되었다. P1에 특이적인 인간 mAb 2F5 및 토끼 항-rgp41 혈청을 이 목적을 위해 사용하였다. 백신 배치 생산에 사용된 액상 바이로좀 농축 배치 MYM-V202 로트 170130-1을 8배 희석하여 양성 대조군으로 사용하였다. 도 4는 면역블롯 분석 사진을 도시한다. 샘플 Z33787A101의 경우, 5℃에서 보관된 정제는 초기(t = 0) 샘플과 비교하여 1개월 및 3개월 보관 후 rgp41 항원 신호가 전혀 감소되지 않거나 또는 최소한의 감소만을 나타냈다. 이와 유사하게, rgp41 항원의 경우 25℃에서 저장된 유닛의 신호 강도에는 최소한의 차이만 있었고 P1 항원의 경우 약간 감소하였다. 40℃ 유닛의 경우 차이는 더 두드러졌지만 여전히 10-20%의 분석 정확도 내에 있을 수 있다.
[0118] rgp41 및 P1의 형광 데이터에 대한 정량적 평가는 각각 표 10 및 11에 제시되어있다. 각 표의 상단 부분은 표시된 안정성 샘플에 대한 각 스폿(최저 희석에서 최고 희석까지)에 대한 미가공 형광 데이터 신호를 나타낸다. 각 표의 하단 부분은 양성 대조군 스폿의 각 희석액과 비교한 각 샘플 스폿의 값을 보여준다(양성 대조군의%). 하단 라인은 모든 샘플 백분율의 산술 평균을 보여준다. 측정치의 명백한 아웃라이너는 평균 계산에서 제외되었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
[0119] Z33787A101용 백신 정제의 경우, 5℃에서 보관된 정제는 초기(t=0) 샘플과 비교하여 1개월 및 3개월 보관 후 rgp41 및 P1 항원 신호가 전혀 감소되지 않거나 또는 최소한의 감소만을 나타냈다. 이와 유사하게, rgp41 항원의 경우 25℃에서 저장된 유닛의 신호 강도에는 최소한의 차이만 있었고 P1 항원의 경우 약간 감소하였다. 40℃ 유닛에서의 차이는 항원 P1과 rpg41 모두에 있어서 더 두드러졌지만, 여전히 분석 정확도 내일 수 있는데 이는 특히 연속 희석 샘플 내에서 변이가 다시 나타났기 때문이다.
[0120] 3M-052의 측정은 3개월 이상의 서로 다른 온도에서 보관된 모든 백신 정제에 대해 320 nm에서 UV 분광법에 의해 수행되었다. 아래 표 12에 측정 값을 나타내었다.
Figure pct00012
[0121] 이들 샘플들 사이에 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았으므로, 3M-052 농도는 이 분석의 정확도 내에서 모든 샘플에서 안정적으로 유지되는 것으로 간주되었다. 전반적으로, HA, P1, rpg41 및 3M-052는 아래 표 13에 나타난 바와 같이 시간이 지남에 따라 약간의 변화와 함께 다양한 보관 조건에서 보관된 동결-건조된 정제에서 안정적이었다.
Figure pct00013
실시예 3: ICH 조건하에 보관된 동결-건조된 백신 투여 형태(제형 2)의 안정성 데이터
[0122] 이 실시예에서는 제형 2에 대한 동결-건조된 정제 형태의 바이로좀 백신의 안정성에 대해 설명한다. 7% w/w 트레할로스와 함께 HN 완충액 pH 7.4 (50 mM HEPES, 142.5mM NaCl) 중 대략 121 ㎍/ml HIV-1 P1, 67 ㎍/ml HIV-1 rgp41, 41 ㎍/ml HA (A/Brisbane/59/2007 (H1N1), 39 ㎍/ml 아쥬반트 3M-052을 포함하는, Mymetics에 의해 공급된 액상 바이로좀 농축물 뱃치 MYM V202 lot 17MYM002/F17255를 동결건조된 백신 정제 (뱃치 MYM-212 lot 1690747)를 제조하는데 사용하였다.
[0123] 백신 정제를 제조하기 위해, 액상 바이로좀 제형 믹스를 먼저 제조하였다. 이것은 25% w/w의 액상 바이로좀 농축물 뱃치 MYM V202 lot 17MYM002/F17255, 6% w/w 어류 젤라틴, 8% w/w 만니톨, 2% w/w (net) 트레할로스, 수산화나트륨 용액(pH 7.4로 만드는 양), 및 정제수(100% w/w로 만드는 양)을 함유하였다.
[0124] 액상 바이로좀 제형 혼합물을 15℃에서 알루미늄 트레이의 블리스터 포켓에 500mg 용량 충전 분취량으로 투입하였다. 투입된 수성 백신 믹스를 함유하는 트레이를 3분 15초 동안-70℃로 설정된 냉동 챔버에 통과시켜 동결시켰다. 냉동 제품이 들어있는 알루미늄 트레이를 수집하여 <-15℃의 냉동고에 넣었다.-15℃에서 24 시간 및 이어서-10℃에서 18시간의 2 단계 FD 사이클이 사용되었다.
[0125] 동결-건조된 정제의 블리스터를 봉지에 밀봉하고 5℃, 25℃/60% 상대 습도 및 40℃/75% 상대 습도에서 3개월 동안 보관하였다. 초기 테스트 및 6개월 테스트 결과를 아래 표 14에 요약하였다.
Figure pct00014
[0126] 안정성 데이터는 정제 외관이 양호하고 배치간에 일관성이 있음을 보여준다. 수분 함량은 3.6-4.0% w/w였으며 6 개월 보관 기간 동안 서로 다른 안정성 조건간에 거의 차이가 없었다. 이 제형은 8% w/w 만니톨을 함유하고 있기 때문에, 더 짧고 일관된 붕해 시간에 나타난 바와 같이 동결 건조 동안 미세 구조 붕괴가 적다.
[0127] 항원 함량 (HIV-1 항원 P1 및 rgp41)의 안정성을 HPLC 분석을 사용하여 3개월에 걸쳐 분해에 대해 모니터링하였다. 액상 백신 MYM V202 (출발 물질)의 경우 2-8℃(냉장 보관 조건)에서 1개월 및 3개월 보관시 P1 함량이 각각 4% 및 7% 감소한 것으로 나타났다. rgp41의 경우 냉장 보관 조건에서 1개월과 3개월에 각각 16%, 25% 감소하였다. 액상 바이로좀을 25℃ 및 40℃에서 보관하였을 때 P1과 rgp41은 1개월 3개월 후에 더 이상 검출되지 않았다.
[0128] 동결건조된 정제의 보관시 항원 함량 결과는 항원 P1 및 항원 rgp41에 대해 각각 표 15 및 표 16에 제시되어있다. 동결건조된 정제 형태에서 P1 항원은 2-8℃(콜드 체인 조건)에서 3개월 후 함량 감소가 관찰되지 않고 매우 안정적으로 유지되었으며 또한 콜드 체인 조건 외에서 1개월 및 3개월 동안 보관하는 동안 영향을 받지 않았다. rgp41 항원의 경우 2-8℃, 25℃ 및 40℃에서 1개월 후 각각 약 5%, 10% 및 20% 감소가 관찰되었다. 3개월 보관시, 감소는 각각 약 13%, 15% 및 19%였다. HPLC 방법의 정확도를 고려할 때 15% 미만의 감소된 농도 차이는 유의하지 않다. 더욱이 관찰된 점진적인 항원 손실 또는 감소는 화학적 변형과 관련이 있으며 구조적 절단, 아미노산 손실 또는 응집으로 인한 진행된 분해 때문이 아니다. 한편, 주어진 에피토프의 화학적 변형(들)은 잠재적으로 그의 인식을 변경하여, 그 영역에 결합하는 항체를 감소 또는 증가시킬 수 있는 반면 다른 영역은 계속 동일하게 잘 인식된다.
[0129] T0에서, P1 및 rgp41 항원은 유사한 SDS-PAGE 이동 프로파일을 나타내고 일단 설하 정제에서 특이적인 모노클로날 항체에 의해 여전히 인식되었으며, P1 및 rgp41에 대한 혈청 항체는 여전히 주요 에피토프를 산생하는 다양한 P1 및 gp41 펩타이드에 반응하였다. 이러한 분석은 전체적으로 P1 및 rgp41이 제조 공정 동안 그들의 항원성과 면역원성의 대부분을 보존하였음을 시사한다 (데이터 미표시).
Figure pct00015
Figure pct00016
실시예 4: 영하의 온도(sub-zero) 보관 조건에서 보관된 동결건조된 정제의 안정성
[0130] 실시예 4의 데이터는 영하의 조건 하에서 보관될 때 바이로좀 백신 정제 및 바이로좀 입자의 물리적 특성의 안정성을 보여준다. Mymetics에 의해 공급된 25% w/w 로딩의 액상 바이로좀 농축물 MYM-201 lot 160125-1 (HN 완충액 pH 7.4 (50mM HEPES, 142.5mM NaCl) 중에 HA 70-80 ㎍/ml, P1 40-50 ㎍/ml, rgp41 70-80 ㎍/ml (A/Brisbane/59/2007 (H1N1) 함유), 6% w/w 어류 젤라틴, 8% w/w 만니톨, 및 2% w/w (net) 트레할로스을 함유하는 액상 바이로좀 제형 믹스를 500mg 용량 충전 중량으로 투입하고 동결 건조하였다. 15℃에서 이들 제형에 500mg 투여 충전 중량 분취량을 투입하여 알루미늄 트레이의 블리스터 포켓에 투입하였다. 투입된 수성 백신 믹스를 함유하는 트레이를-70℃로 설정된 냉동실을 통해 3분 15초의 기간 동안 알루미늄 트레이를 통과시켜 동결시켰다. 냉동된 제품이 들어있는 알루미늄 트레이를 수집하여 <-15℃의 냉동고에 넣고 동결건조 전 냉동 상태를 유지하면서 6시간 동안 어닐링한다.-15℃에서 24 시간, 이어서-10℃에서 18 시간의 2 단계 FD 사이클이 사용되었다. 동결-건조된 정제의 블리스터들을 봉지에 밀봉하고 1주일 동안-15℃의 냉동고에 보관하였다. 상응하는 정제의 블리스터 세트를 봉지에 밀봉하고 동일한 기간 동안 주변 조건에 두었다. 이들 정제를 전술한 테스트에 방법에서 설명된 바와 같이 외관, 분산 특성 (습윤 시간 및 분해 시간) 및 바이로좀 입자 크기 분포에 대해 평가하였다.
[0131] 모든 유닛은 양 조건 모두에서 보관 후 외관이 양호한 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 영하에서의 보관이 정제 분산 특성(습윤 및 분해 시간) (표 17) 및 바이로좀 입자 크기 분포(표 18)에 거의 영향을 미치지 않음을 보여주었다.
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 5: 재구성된 동결-건조된 정제로부터의 바이로좀 입자의 유세포 분석 평가.
[0132] 공정 개발로부터 동결-건조된 정제 샘플에서 보존된 바이로좀 비율의 추정이 아래에 요약되어있다. 표 19에 제공된 값은 바이로좀 게이트에 해당하는 초점 영역의 이벤트 측정을 사용하여 AMNIS 유세포 분석 데이터로부터 유래하였다.
Figure pct00019
[0133] 이 데이터는 출발 바이로좀의 24-40%가 동결-건조된 정제에서 보존되며, 이들 바이로좀의 10-25%는 대부분 이중 및 삼중의 클러스터 형태라는 것을 보여준다.
실시예 6: 액상 바이로좀 제형 및 바이로좀을 함유하는 재구성된 동결건조된 설하 정제로부터의 P1 및 rgp41 항원의 면역원성 평가.
[0134] 액상 바이로좀 농축물 (액상 백신 MYM-V202) 및 실시예 3에 대한 바이로좀을 함유하는 동결-건조된 설하 정제를 면역원성 평가를 위해 3개월에 걸쳐 4℃ 및 40℃에서 보관하였다. 1 개월 보관 후, 면역원성 평가를 위해 보관 캐비닛에서 40℃에서 보관된 액상 백신 및 설하 정제 샘플을 제거하였다. 3개월 보관 후, 면역원성 평가를 위해 4℃ 및 40℃에서 보관된 액상 백신 및 설하 정제 샘플을 제거하였다.
[0135] 면역원성 평가를 위해 Wistar 래트(그룹당 n = 10), 각 성별 50% 씩을 사용하였다. 래트를 제0일, 제28일 및 제56일에 면역화시켰다. 액상 백신은 0.1 mL에 3.9 ㎍의 P1, 2.2 ㎍의 rgp41 및 1.3 ㎍의 3M-052 TLR7/8 (아쥬반트)를 함유하였으며 이를 피하 주사에 사용하였다. 설하 정제의 경우, 적절한 양의 설 하 정제를 멸균수에 녹여 0.1 mL 중 약 3 ㎍의 P1, 1.7 ㎍의 rgp41 및 1 ㎍의 3M-052 TLR7/8 (아쥬반트)를 얻고 이를 피하 주사로 투여한다. 각 동물 혈청 및 혈청 풀에 대한 종점 항체 역가를 결정하기 위해 면역전 혈청을 제0일에 수집하고 면역 혈청을 제65일에 수집하였다.
[0136] 도 5는 상이한 온도에서 보관된 액상 백신 및 설하 정제로부터의 P1 및 rgp41의 면역원성을 보여준다. P1 및 rgp41 항원 양자 모두를 함유하는 액상 면역증강(adjuvanted) 백신 제gud MYM-V202는 온도에 민감하였으며, 열 안정성이 개선된 설하 정제 백신 형태의 면역원성과 비교하기 위한 레퍼런스 물질로 사용되었다. (흑색선)은 4℃에서 3개월 동안 보관된 백신을 보여준다; (흑색 점선)은 40℃에서 1개월 동안 보관된 백신을 보여준다; (회색선)은 40℃에서 3개월 동안 보관된 백신을 나타낸다. 이들 데이터는 동결-건조된 정제에 대한 항원의 면역원성이 유지됨을 나타낸다. 각 패널에는, 종점 항체 역가도 표시되어 있다. 종점 역가는 면역 전 백그라운드보다 > 2배의 OD 값을 생성하는 마지막 혈청 희석에 해당한다.
추가 정의
[0137] 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 용어는 본 발명의 청구 대상이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어를 본원에서 정의하였으나, 이러한 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되어서는 아니된다.
[0138] 본원에서 어떤 값 또는 파라미터와 관련하여 "약"이라 함은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 변형을 포함(및 설명)하는 것이다. 예를 들어, "약 X"라는 설명에는 "X"에 대한 설명이 포함된다. 이에 더해, 일련의 값 또는 파라미터 다음에 나오는 "미만", "초과, "최대", "적어도", "이하", "이상" 등의 표현을 포함하는 문구는 그 그 문구가 일련의 값 또는 파라미터 내의 각각의 값 또는 파라미터에도 적용되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 용액의 농도가 적어도 약 10 mM, 약 15 mM 또는 약 20 mM이라 함은 용액의 농도가 적어도 약 10 mM, 적어도 약 15mM 또는 적어도 약 15mM임을 의미한다.
[0139] 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "및/또는"은 하나 이상의 연관된 열거된 항목의 임의의 및 모든 가능한 조합을 지칭하고 포함하는 것으로도 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 용어 "포함하다(includes)", "포함하는(including)", "포함하다(comprises)," 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 특징, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분 및/또는 유닛의 존재를 명시하는 것이지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분, 유닛 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하는 것은 아니다.
[0140] 본 출원은 텍스트 및 도면에서 여러 수치 범위를 개시한다. 개시된 수치 범위는 본질적으로 개시된 수치 범위 내의 모든 범위 또는 값을 지원하며, 명세서 내에 정확한 범위 한계가 말 그대로 언급되지 않는다 하더라도 종점들을 포함할 수 있는데, 이는 본 개시 내용은 개시된 수치 범위 전체에 대해 실시될 수 있기 때문이다
[0141] 전술한 설명은 당업자가 본 발명 내용을 만들고 사용할 수 있도록 제시된 것으로, 특정 응용 및 그 요구 사항의 맥락에서 제공된다. 바람직한 구체예에 대한 다양한 변형은 당업자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리는 본 개시 내용의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 다른 구체예 및 적용에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 개시 내용은 제시된 구체예에 제한되도록 의도되지 않고, 본 명세서에 개시된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 범위에 따른다.

Claims (40)

  1. 적어도 하나의 표적 분자의 면역원성 양을 포함하는 지질-기반 소포;
    5-20 wt.%의 적어도 하나의 냉동-동결보호제;
    25-40 wt.%의 매트릭스 형성제; 및
    40-55 wt.%의 구조 형성제
    를 포함하는 경구 고체 백신 투여 형태.
  2. 제1항에 있어서, 지질-기반 소포는 바이로좀 또는 프로테오리포좀인 투여 형태.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투여 형태는 10-15 wt.%의 적어도 하나의 냉동-동결보호제를 포함하는 투여 형태.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 냉동-동결보호제는 트레할로스를 포함하는 투여 형태.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투여 형태는 33-37 wt.%의 매트릭스 형성제를 포함하는 투여 형태.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 매트릭스 형성제는 젤라틴을 포함하는 투여 형태.
  7. 제6항에 있어서, 젤라틴은 어류 젤라틴을 포함하는 투여 형태.
  8. 제7항에 있어서, 어류 젤라틴은 고 분자량 어류 젤라틴인 투여 형태.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투여 형태는 45-50 wt.%의 구조 형성제를 포함하는 투여 형태.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구조 형성제는 만니톨을 포함하는 투여 형태.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바이로좀은 인플루엔자 바이러스 막 또는 다른 외피보유 바이러스로부터 유래된 것인 투여 형태.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자는 바이로좀에 존재하는 투여 형태.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자는 HIV-1 외피 유래된 항원을 포함하는 투여 형태.
  14. 제13항에 있어서, HIV-1 외피 유래된 항원은 HIV-1 PI 펩타이드 및/또는 HIV-1 재조합 gp41을 포함하는 투여 형태.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바이로좀은 아쥬반트를 포함하는 투여 형태.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투여 형태는 적어도 하나의 표적 분자의 구강 흡수를 촉진하는 투여 형태.
  17. 제16항에 있어서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 180초 이내에 붕괴되는 투여 형태.
  18. 제16항에 있어서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 90초 이내에 붕괴되는 투여 형태.
  19. 제16항에 있어서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 60초 이내에 붕괴되는 투여 형태.
  20. 제16항에 있어서, 투여 형태는 구강 내에 배치된 후 30초 이내에 붕괴되는 투여 형태.
  21. 제16항에 있어서, 구강 내에 배치됨으로써 환자에게 투여된 때 면역 반응이 유도되는 투여 형태.
  22. 제21항에 있어서, 구강 내에 배치되는 것은 혀 위 또는 혀 아래 또는 협측 또는 인두 영역에 배치되는 것인 투여 형태.
  23. 면역 반응을 필요로 하는 사람의 구강 내로 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 기재된 투여 형태를 배치하는 것을 포함하는, 환자에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 구강 내에 배치하는 것은 혀 위 또는 혀 아래 또는 협측 또는 인두 영역에 배치하는 것인 방법.
  25. 경구 고체 백신 투여 형태를 형성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    액상 바이로좀 제형을 예비성형된 몰드에 투입하는 단계로서, 여기서 바이로좀 제형은
    적어도 하나의 표적 분자의 면역원성 양을 포함하는 지질-기반 소포;
    1-5 wt.%의 냉동-동결보호제;
    4-8 wt.% 의 매트릭스 형성제; 및
    5-10 wt.%의 구조 형성제를 포함하는 것인 단계;
    투여된 바이로좀 제형을-60℃ 내지-90℃의 온도에서 동결시키는 단계;
    동결된 바이로좀 제형을-15℃ 미만의 온도에서 3-9시간 유지시킴으로써 어닐링하는 단계; 및
    어닐링된 바이로좀 제형을 동결-건조시켜 투여 형태를 형성하는 단계
    를 포함하는 것인, 경구 고체 백신 투여 형태를 형성하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 투입된 바이로좀 제형은-60℃ 내지-90℃의 온도에서 약 1-5분의 기간 동안 동결되는 방법.
  27. 제25항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 어닐링된 바이로좀 제형을 동결-건조하는 것은, 어닐링된 바이로좀 제형을-10℃ 내지-20℃의 온도에서 20-28시간 동안 유지하는 제1 단계 및 어닐링된 바이로좀 제형을-5℃ 내지-15℃의 온도에서 14-22시간 동안 유지하는 제2 단계를 포함하는 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 동결-건조는 600 mbar 미만의 압력에서 일어나는 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바이로좀 제형의 pH는 약 6.5-8인 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 냉동-동결보호제는 트레할로스를 포함하는 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 매트릭스 형성제는 젤라틴을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 젤라틴은 어류 젤라틴을 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 어류 젤라틴은 고 분자량 어류 젤라틴인 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구조 형성제는 만니톨을 포함하는 방법.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질-기반 소포는 인플루엔자 바이러스 또는 호흡기 세포융합 바이러스로부터 유래하는 방법.
  36. 제25항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 표적 분자는 HIV-1 외피 유래된 항원을 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, HIV-1 외피 유래된 항원은 HIV-1 PI 펩타이드 및/또는 HIV-1 재조합 gp41을 포함하는 방법.
  38. 제25항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 지질-기반 소포는 아쥬반트를 포함하는 방법.
  39. 경구 고체 백신 투여 형태를 형성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    액상 바이로좀 제형을 예비성형된 몰드에 투입하는 단계로서, 여기서 상기 바이로좀 제형은
    20-50 wt.%의 바이로좀 농축물 (여기서 바이로좀 농축물은 적어도 하나의 표적 분자의 면역원성 양을 포함하는 바이로좀; 2-10 wt.%의 냉동-동결보호제; 및 60-200 mM의 완충 시스템을 포함한다);
    4-8 wt.%의 매트릭스 형성제; 및
    5-10 wt.%의 구조 형성제를 포함하는 것인 단계;
    투입된 바이로좀 제형을-60℃ 내지-80℃의 온도에서 동결시키는 단계;
    동결된 바이로좀 제형을-15oC씨 미만의 온도에서 3-9시간 동안 유지시킴으로써 어닐링하는 단계; 및
    어닐링된 바이로좀 제형을 동결-건조시켜 투여 형태를 형성하는 단계
    를 포함하는 것인, 경구 고체 백신 투여 형태를 형성하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 완충 시스템은 HEPES-염화나트륨을 포함하는 방법.
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