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KR20160101944A - 알파-MSH의 ClpB 단백질 모방을 통한 식욕의 조절에 대한 세균 영향 - Google Patents

알파-MSH의 ClpB 단백질 모방을 통한 식욕의 조절에 대한 세균 영향 Download PDF

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KR20160101944A
KR20160101944A KR1020167017273A KR20167017273A KR20160101944A KR 20160101944 A KR20160101944 A KR 20160101944A KR 1020167017273 A KR1020167017273 A KR 1020167017273A KR 20167017273 A KR20167017273 A KR 20167017273A KR 20160101944 A KR20160101944 A KR 20160101944A
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엠마뉴엘 데
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조나단 브레톤
필리페 찬-치-송
피어레 데첼로테
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Abstract

본 발명은 세균 ClpB 단백질 및 ClpB 발현 세균 및 식사 장애에 대한 이들의 충격에 관계한다. 본 발명은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제뿐만 아니라 ClpB 단백질을 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물 및 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이들의 용도에 더욱 관계한다. 본 발명은 또한, 개체가 식사 장애를 치료하는 방법에 반응할 개연성이 있는 지를 결정하기 위한 진단적 도구 및 식사 장애에 대항하여 면역화의 방법에 관계한다.

Description

알파-MSH의 ClpB 단백질 모방을 통한 식욕의 조절에 대한 세균 영향{BACTERIAL INFLUENCE ON REGULATION OF APPETITE VIA CLPB PROTEIN MIMICRY OF ALPHA-MSH}
본 발명은 세균 ClpB 단백질 및 ClpB 발현 세균 및 식사 장애에 대한 이들의 충격에 관계한다. 본 발명은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제뿐만 아니라 ClpB 단백질을 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물 및 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이들의 용도에 더욱 관계한다. 본 발명은 또한, 개체가 식사 장애를 치료하는 방법에 반응할 개연성이 있는 지를 결정하기 위한 진단적 도구 및 식사 장애에 대항하여 면역화의 방법에 관계한다.
식사 장애는 지난 50여 년 동안 남성과 여성 둘 모두에서 전 세계적으로 증가하였다. 특히 서양에 있는 개체가 이들이 발달할 가장 높은 위험에 처해 있고 서구화의 정도가 이러한 위험을 증가시킨다는 것을 암시하는 증거가 있다. 최근의 진전으로, 과학자들은 식욕의 중심 과정을 훨씬 많이 이해한다. 동기적 과정, 항상성 과정 및 자기-조절 통제 과정 사이에 상호작용은 식사 장애에서 핵심 성분인 식사 행동에 관련되는 것으로 알려져 있다.
최근 과학계는 추가 조절인자, 인간 마이크로바이옴을 발견하였다. 고처리량 DNA 염기서열결정 기술의 진전은 인간 마이크로바이옴을 탐색하는 것을 허용하였고, 따라서 숙주 및 이의 미생물 균총 사이에 분자 관계를 이해하는 것을 향한 중요한 디딤돌을 놓았다. 이러한 "두 번째 유전체", 마이크로바이옴은 4-5 백만 개보다 많은, 비다중 미생물 추정 유전자 및 1 내지 2,000개의 유력한 세균 종의 카탈로그에서 설명되었다. 각 개체는 최소한 160개의 공유된 종류 및 개체의 군을 규정하는 다수의 잘 균형화된 숙주-미생물 분자 관계를 갖는다.
미생물 공동체 및 이들의 인간 숙주 사이에 공생 관계의 필수적인 특질을 이해하는 것은 토착 공동체의 특정 특질로부터, 숙주 표현형, 예를 들면, 건강 상태를 예측하는 것을 허용할 수 있을 것으로 고려된다.
소화관 미생물 균총의 조성은 예로서, 비만 및 당뇨병뿐만 아니라 일부 신경정신병적 장애를 비롯한 숙주 물질대사 표현형과 연관되었는데, 이것은 장내 세균이 뇌 통제된 기능과 행동에 영향을 줄 수 있다는 것을 암시한다.
이러한 문맥에서, 미생물 균총을 숙주 행동에 연계하는 분자 기전을 결정하는 것은 따라서, 숙주 생리학에서 특정한 미생물의 역할을 규정하기 위한 필요한 단계인 것으로 보인다.
신경성 식욕부진 (AN), 폭식증 (BN), 그리고 폭식 장애 (BED)를 비롯한 식사 장애의 기원에서 분자 기전은 현재 알려져 있지 않다. 이전 데이터는 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH)과 반응성인 면역글로불린 (Igs) 또는 자가항체 (auto-Abs)가 급식 및 감정의 조절에 관련된다는 것을 지시하였다; 하지만, 이런 auto-Ab의 기원은 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 단백질체학을 이용하여, 공생 장내 세균 대장균 (E. coli) K12의 ClpB 샤프롱 단백질이 에너지 물질대사 및 감정의 조절에 관련된 신경펩티드인 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH)의 입체형태적 모방체라는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 ClpB-면역화된 생쥐가 식품 섭취, 체중, 불안 및 멜라노코르틴 수용체 4 신호전달에 영향을 주는, α-MSH와 교차반응성인 항-ClpB IgG를 생산한다는 것을 보여준다. 게다가, 이들은 생쥐에서 대장균 (E. coli)의 장기 위내 전달이 식품 섭취를 감소시키고 ClpB- 및 α-MSH-반응성 항체의 형성을 자극하고, 반면 ClpB-결함성 대장균 (E. coli)이 식품 섭취 또는 항체 수준에 영향을 주지 않았다는 것을 보여준다. 최종적으로, 이들은 α-MSH와 교차반응성인 항-ClpB IgG의 혈장 수준이 AN, BN 및 BED를 앓는 환자에서 증가되고, 그리고 식사 장애 환자에서 ED (식사 장애) 척도-2 점수가 항-ClpB IgG 및 IgM과 상관한다는 것을 보여준다.
결과로서, 이들은 여러 공생 및 병원성 미생물 내에 존재하는 세균 ClpB 단백질이 α-MSH와 교차반응성인 auto-Ab의 생산을 책임지고, 식사 장애를 앓는 인간에서 변경된 급식 및 감정과 연관될 수 있다는 것을 보여준다.
이에 더하여, 이들은 식사 장애로 고통받는 환자에서 ClpB 단백질의 증가된 혈장 농도를 보여준다.
이런 이유로, ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 존재는 식사 장애 및 식욕과 감정의 조절장애에 관련될 수 있다.
ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 존재는 식사 장애 및 식욕의 조절장애와 상관하였고, 그 대신에 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 것은 식욕의 조절을 유발할 수 있고, 따라서 식사 장애의 치료법으로서 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물에 관계한다.
본 발명은 개체에서 식욕을 조절하는 비-치료 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한, 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위해, ClpB를 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물에 관계한다.
본 발명은 개체에서 식욕을 조절하는 비-치료 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 ClpB를 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 백신으로서 또는 면역원성 조성물로서 이용을 위한 ClpB 단백질을 포함하는 조성물에 관계한다.
특히, 이용을 위한 상기 조성물은 식사 장애에 대항하여 면역화에서 이용된다.
특히, 이용을 위한 상기 조성물은 식사 장애를 예방하는데 이용된다.
본 발명은 또한, 개체에서 식사 장애를 진단하기 위한 시험관내 방법에 관계하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 상기 개체로부터 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하고;
b) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 상기 계측된 수준을 참조값에 비교하고; 그리고
c) 그것으로부터, 개체가 식사 장애를 겪는 지를 추론함.
본 발명은 식사 장애로 고통받는 개체를, ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 반응할 개연성이 있는 것으로 선별하는 시험관내 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 상기 개체로부터 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하고;
b) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 상기 계측된 수준을 참조값에 비교하고; 그리고
c) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 대해 개체를 선별하고, 여기서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 상기 치료는 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 한 항균제를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하고 및/또는 ClpB를 발현하지 않는 프로바이오틱스 및/또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여함.
본 발명자들이 생쥐에서 대장균 (E. coli)의 위내 전달이 세균에서 ClpB 단백질의 존재로 인해 식품 섭취 및 체중 증가를 감소시킨다는 것을 보여주었기 때문에, 본 발명은 비만의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, ClpB 단백질을 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물에 더욱 관계한다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 단백질체학을 이용하여, 공생 장내 세균 대장균 (E. coli) K12의 ClpB 샤프롱 단백질이 에너지 물질대사 및 감정의 조절에 관련된 신경펩티드인 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH)의 입체형태적 모방체이고, 그리고 ClpB 발현 세균의 존재가 조절장애된 식욕을 유발한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물에 관계한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "ClpB 발현 세균"은 샤프롱 단백질 ClpB를 발현하는 세균을 지칭한다.
열 충격 단백질 F84.1로서 또한 알려져 있는 "단백질 분해 샤프롱", "샤프롱 단백질 ClpB", "ClpB 단백질" 또는 "ClpB"는 헥사머릭 AAA+-ATPase의 Hsp100/ClpB 패밀리의 구성원이다. 이러한 패밀리는 세균, 진균, 그리고 식물 Hsp100 ATPase를 포함하는데, ClpB는 세균 대표이다. 스트레스-유도된 다중-샤프롱 시스템의 일부로서, 이것은 스트레스 조건 하에 세포 생존을 위한 결정적인 과정인 단백질 분해에서 Hsp70 시스템 (DnaK, DnaJ 및 GrpE)과 협력하여, 열-유도된 피해로부터 세포의 회복에 관련된다.
감염 과정 동안, 세균 병원체는 그들을 제거하기 위해 숙주 방어에 의해 산출된 스트레스 조건에 직면하고, 그리고 열 충격 및 다른 스트레스 단백질의 합성을 증가시킴으로써 이러한 숙주 방어에 대응한다. 이러한 배경에서, ClpB는 여러 그람 음성 및 그람 양성 병원성 세균, 예를 들면, 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 야토병균 (Francisella turalensis), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 그리고 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella thyphimurium)의 획득된 열 내성을 위한 및 독력 및 감염성을 위한 필수적인 인자로서 설명되었다.
대장균 (E. coli) K12에서, 열 충격 단백질 F84.1 또는 htpM으로서 또한 알려져 있는 샤프롱 단백질 ClpB는 857개 아미노산의 단백질이다.
전형적으로, 샤프롱 단백질 ClpB는 서열 번호: 1 (NCBI 참조 번호 : NP_417083.1, 2013년 11월 6일자에 가용, 및/또는 UniProtKB/Swiss-Prot 번호: P63284, 2013년 11월 6일자에 가용)을 갖는, 대장균 (E. coli) K12로부터 샤프롱 단백질 ClpB의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성된다. 바람직하게는, 샤프롱 단백질 ClpB의 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성된다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 90 내지 100%, 더욱 바람직하게는 95 내지 100%, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일하다.
따라서, ClpB 발현 세균은 상기 규정된 바와 같은 샤프롱 단백질 ClpB, 또는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일한 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 95 내지 100%, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 폴리펩티드를 발현하는 또는 과다발현하는 세균을 지칭한다.
본 발명의 조회 아미노산 서열과 최소한, 예로서, 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 의해, 주제 폴리펩티드의 아미노산 서열은 이러한 주제 폴리펩티드 서열이 조회 아미노산 서열의 각 100개 아미노산마다 최대 5개 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 점을 제외하고, 조회 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말하면, 조회 아미노산 서열과 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 획득하기 위해, 주제 서열에서 아미노산 잔기의 최대 5% (100개 중에서 5개)가 삽입되거나, 결실되거나, 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 출원의 문맥에서, 동일성의 백분율은 전역 정렬을 이용하여 계산된다 (다시 말하면, 이들 두 서열은 그들의 전체 길이에 걸쳐 비교된다). 2개 또는 그 이상 서열의 동일성을 비교하기 위한 방법은 당분야에서 널리 공지된다. 전체 길이를 고려하여 두 서열의 최적 정렬 (갭 포함)을 찾기 위해 Needleman-Wunsch 전역 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453)을 이용하는 ≪ 바늘 ≫ 프로그램이 예로서 이용될 수 있다. 이러한 바늘 프로그램은 예로서, ebi.ac.uk 월드와이드웹 사이트에서 가용하다. 본 발명에 따른 동일성의 백분율은 바람직하게는, 10.0에 동등한 "Gap 개방" 파라미터, 0.5에 동등한 "Gap 연장" 파라미터, 그리고 Blosum62 매트릭스를 갖는 EMBOSS:: 바늘 (전역) 프로그램을 이용하여 계산된다.
참조 서열과 "최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한" 아미노산 서열로 구성되는 단백질은 참조 서열과 비교하여 돌연변이, 예를 들면, 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 치환의 경우에, 참조 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 단백질은 참조 서열과 다른 종으로부터 유래된 상동성 서열에 상응할 수 있다.
아미노산 치환은 보존성 또는 비보존성일 수 있다. 바람직하게는, 치환은 보존성 치환인데, 여기서 한 아미노산이 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산을 대체한다. 치환은 바람직하게는, 아래 표에서 지시된 바와 같은 보존성 치환에 상응한다.
Figure pct00001
ClpB 발현 세균은 숙련자로부터 널리 공지되어 있고, 그리고 임의의 전통적인 기술에 의해 확인될 수 있다.
한 구체예에서, ClpB 발현 세균은 속 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 야토병균 (Francisella turalensis), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella thyphimurium), 대장균 (Escherichia coli), 장내세균 (Enterobacteriaceae), 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 디센테리아이 (Shigella dysenteriae), 시겔라 보이디이 (Shigella boydii), 시트로박터 요운가에 (Citrobacter youngae), 살모넬라 본고리 (Salmonella bongori) 및 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica)로 구성된 군에서 선택된다.
ClpB 단백질은 2개의 뉴클레오티드 결합 도메인 (ATP1 및 ATP2) 및 2개의 올리고머화 도메인 (NBD1 및 NBD2)을 포함한다. N 말단 도메인은 응집된 단백질을 ClpB 헥사머에 모집하고 및/또는 결합된 단백질을 안정시키는 기질-식별 도메인으로서 기능할 지도 모른다. NBD2 도메인은 올리고머화를 책임지고, 반면 NBD1 도메인은 아마도 ATP-의존성 방식으로 헥사머를 안정시킨다. 이중 코일 도메인의 움직임은 아마도, 기능적 헥사머에서 인접한 ClpB 아단위의 이중 코일 모티프 사이에 결합되는 큰 응집된 단백질을 갈라놓음으로써, 단백질을 응집된 상태로부터 구조하는 ClpB 능력에 필수적이다.
본 발명자들은 공생 장내 세균 대장균 (E. coli) K12의 ClpB 샤프롱 단백질이 에너지 물질대사 및 감정의 조절에 관련된 신경펩티드인 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH)의 입체형태적 모방체라는 것을 확인하였다.
"α-멜라닌세포 자극 호르몬", "알파-MSH", "α-MSH", 알파-멜라노트로핀, 알파-멜라노코르틴, 또는 알파-인터메딘으로서 또한 알려져 있는 "α-MSH"는 트리데카펩티드 구조를 갖는, 멜라노코르틴 패밀리의 자연발생 내인성 펩티드 호르몬이다. α-MSH의 아미노산 서열은 바람직하게는, 아미노산 서열 SYSMEHFRWGKPV (서열 번호: 3) (Gen Pept 서열 ID, PRF: 223274, 2013년 12월 2일자에 가용)을 포함하거나 또는 이것으로 구성된다. 하지만, 아세틸 상태에서 다른 3가지 유형의 알파-멜라닌세포 자극 호르몬이 존재한다: 아세틸 기를 결여하는 데스아세틸 알파 MSH; 서열 번호: 3의 Ser-1의 아미노 기가 아세틸화되는 모노-아세틸 알파 MSH; 및 서열 번호: 3의 Ser-1의 아미노 및 히드록시 기 둘 모두 아세틸화되는 디-아세틸 알파 MSH. 본원에서 이용된 바와 같은 α-MSH는 특히, 모노-아세틸화된 α-MSH를 지칭한다.
이것은 중심적으로뿐만 아니라 주변적으로 작용하는 멜라노코르틴 수용체 유형 4 (MC4R)의 활성화를 통해, 에너지 균형 및 증가하는 에너지 소비의 조절에 결정적으로 관련된다. 인간 및 생쥐 둘 모두에서, 혈장 α-MSH 수준은 체중 변화와 연관된다. 게다가, α-MSH는 불안을 증가시킴으로써 기분 및 감정을 조절한다.
"모방체"는 다른 단백질을 모방하는 단백질을 지칭한다. 이러한 모방은 모방체 단백질이 자신이 모방하는 단백질과 일정한 특징을 공유하기 때문에 가능하다.
"입체형태적 모방체"는 다른 단백질과 최소한 부분적으로 동일한 입체형태를 공유하는 단백질을 지칭한다.
본 발명자들은 ClpB 단백질이 서열 번호: 1로부터 아미노산 542 내지 548 사이에 아미노산 서열 'RWTGIPV' (서열 번호: 2로 참조됨)의, α-MSH와의 불연속적 서열 상동성을 공유한다는 것을 증명하였다. 이론에 한정됨 없이, ClpB의 이러한 입체형태는 ClpB 및 α-MSH 둘 모두에 대해 지향된 항체의 생산을 자극하는 것을 허용한다.
따라서 본원에서 "입체형태적 모방체"는 바람직하게는, ClpB에 대한 항체 생산뿐만 아니라 α-MSH에 대한 자가 항체를 자극하는 능력을 지칭한다.
본원에서, "최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제"는 ClpB 발현 세균의 성장을 저해하고 및/또는 ClpB 발현 세균의 양을 감소시키고 및/또는 ClpB 발현 세균을 파괴하는 항균제 화합물을 지칭한다.
최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제는 바람직하게는, 성장을 저해하고, 양을 감소시키고 및/또는 ClpB 발현 세균을 선별적으로 또는 우선적으로 파괴한다. 상기 항균제는 바람직하게는, 진핵 세포에 부정적으로 영향을 주지 않는다.
ClpB 발현 세포를 특이적으로 표적으로 하는 항생제는 숙련자로부터 널리 공지되어 있고 Martin, I et al. (Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 56: 7177-7189)에서 더욱 설명된다.
최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제는 ClpB에 결합하고 이의 활성을 조정할 수 있다.
특히, 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제는
i) ClpB의 ATPase 활성을 조정하고, 및/또는
ii) ClpB의 유리/및 또는 기질 결합 형태를 저해하고 및/또는
iii) ClpB의 활성화를 저해한다.
한 구체예에서, 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제는 벤질벤젠 골격 위에서 살리실알데히드 유도체, 특히, 5-(2-클로로벤질)-2-히드록시-3-니트로벤즈알데히드 (CAS 번호 292644-32-7, Sigma Aldrich) 또는 (2-{[(3,4-디클로로페닐)아미노]티옥소메틸티오}에톡시)-N-벤즈아미드 (공급업체 번호 ST034398, TimTec)이다.
본 발명의 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 항균제의 전형적인 용량은 예로서, 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 범위에 있을 수 있다; 하지만, 전술한 인자를 특히 고려하여, 이러한 예시적인 범위 미만 또는 초과의 용량이 구상된다. 일일 경구 투약 섭생은 전체 체중의 약 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 특히 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 mg/kg 체중일 수 있다. 환자 진행은 주기적 사정에 의해 모니터링될 수 있고, 그리고 용량이 이에 맞춰 조정될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본원에서 이용된 바와 같이, 이런 용어가 적용되는 장애, 또는 이런 장애 또는 이상의 하나 또는 그 이상의 증상의 진행을 역전시키거나, 경감하거나, 저해하는 것을 의미한다.
"예방하는"은 이런 용어가 적용되는 장애가 발생하는 것을 예방하거나, 또는 장애의 초기 단계에서 취해진 조치를 지칭한다. 예방하는 것은 이런 용어가 적용되는 장애의 추가 발달의 저해를 더욱 지칭한다.
본원에서, 식사 장애의 치료 또는 예방은 바람직하게는, 치료되는 개체에서 ClpB 발현 세균의 양 또는 농도의 감소를 지칭한다.
본 발명의 문맥에서, "개체"는 인간 또는 비인간 포유동물, 예를 들면, 설치류 (쥐, 생쥐, 토끼), 영장류 (침팬지), 고양이 (고양이), 또는 개 (개)를 표시한다. 바람직하게는, 개체는 인간이다. 본 발명에 따른 개체는 특히 수컷 또는 암컷이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 개체는 13세 이상이다.
바람직하게는, 개체는 암컷이다.
"식사 장애" (ED)는 Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 5판 (DSM-5) 및 이전 판 (DSM-4, 등)으로부터 규준에 의해 규정된 정신질병으로 의미된다. 비정상적인 식사 습관은 불충분한 또는 과도한 식품 섭취 내지 개체의 물리적 및 정신적 건강의 손상을 수반할 수 있다. 신경성 폭식증 (BN), 신경성 식욕부진 (AN) 및 폭식 장애 (BED)는 식사 장애의 가장 흔한 특정한 형태이다. DSM-5 규준에 따라, 신경성 식욕부진을 앓는 것으로 진단되려면 개체는 다음을 전시해야 한다: 유의미하게 낮은 체중을 야기하는 에너지 섭취의 지속 제한 (연령, 성별, 발달 궤적, 그리고 신체적 건강에 대해 최소한으로 예상되는 것의 문맥에서), 체중 증가 또는 살찌는 것에 대한 강렬한 두려움, 또는 체중 증가를 간섭하는 지속 행동 (심지어 유의미하게 낮은 체중임에도 불구하고), 체중 또는 모양이 경험되는 방식에서 교란, 자기 평가에 대한 신체 모양 및 체중의 과도한 영향, 또는 현재 낮은 체중의 심각함의 인식의 지속 결여.
DSM-5 규준에 따라, 신경성 폭식증을 앓는 것으로 진단되려면 개체는 폭식의 재발성 에피소드를 전시해야 한다. 폭식의 에피소드는 다음 중에서 둘 모두에 의해 특징화된다: 유사한 기간 동안 및 유사한 환경 하에 대부분의 사람들이 먹는 것보다 훨씬 많은 식품의 양을 구별된 기간 내에 (가령, 임의의 2-시간 기간 이내에) 식사 및 에피소드 동안 식사에 대한 통제의 결여의 감각 (가령, 식사를 중단하거나 무엇을 또는 얼마나 많이 먹을 지를 통제할 수 없는 느낌), 체중 증가를 예방하기 위한 재발성의 부적절한 보상 행동, 예를 들면, 자기-유도된 구토, 완하제, 이뇨제 또는 다른 약제의 오용, 공복, 또는 과도한 운동. 폭식 및 부적절한 보상 행동 둘 모두 평균적으로, 3 개월 동안 최소한 주 1회 발생한다. 자기 평가는 신체 모양 및 체중에 의해 부당하게 영향을 받는다.
DSM-5 규준에 따라, 폭식 장애를 앓는 것으로 진단되려면 개체는 폭식의 재발성 에피소드를 전시해야 한다. 폭식의 에피소드는 다음 중에서 둘 모두에 의해 특징화된다: 유사한 기간 동안 및 유사한 환경 하에 대부분의 사람들이 먹는 것보다 훨씬 많은 식품의 양을 구별된 기간 내에 (가령, 임의의 2-시간 기간 이내에) 식사, 에피소드 동안 식사에 대한 통제의 결여의 감각 (가령, 식사를 중단하거나 무엇을 또는 얼마나 많이 먹을 지를 통제할 수 없는 느낌). 폭식 에피소드는 다음 중에서 3가지 또는 그 이상과 연관된다:
- 정상보다 훨씬 빠른 식사;
- 불편할 만큼 포만감을 느낄 때까지 식사;
- 신체적으로 배고픔을 느끼지 않을 때, 대량의 식품을 식사
- 많은 식사량에 당혹감으로 혼자 식사
- 그 후에 자신에 대한 혐오감, 우울함 또는 많은 죄책감.
폭식은 평균적으로, 3 개월 동안 최소한 주 1회 발생한다.
식사 장애의 다른 유형은 기타 급식 및 식사 장애 (OSFED)를 포함한다.
DSM-5 규준에 따라, OSFED를 앓는 것으로 진단되려면 개체는 기능의 분야에서 임상적으로 유의미한 곤란 및 장애를 유발하지만, 임의의 다른 급식 및 식사 장애에 대한 전체 규준에 부합하지 못하는 급식 또는 식사 행동을 나타내야 한다. 현성이 다른 장애의 특징에 부합하지 못하는 특정한 이유 (가령, 신경성 폭식증 - 낮은 빈도)를 명시하는 진단이 이후, 할당될지도 모른다. 다음은 OSFED에 대한 추가 실례이다:
- 비정형성 신경성 식욕부진: 유의미한 체중 감소에도 불구하고, 개체의 체중이 정상 범위 안에 있거나 또는 정상 범위를 초과하는 점을 제외하고, 모든 규준이 부합된다;
- 폭식 장애 (낮은 빈도 및/또는 제한된 지속 기간): 더욱 낮은 빈도 및/또는 3 개월 보다 적은 기간을 제외하고, BED에 대한 모든 규준이 부합된다;
- 신경성 폭식증 (낮은 빈도 및/또는 제한된 지속 기간): 폭식 및 부적절한 보상 행동이 더욱 낮은 빈도에서 및/또는 3 개월보다 적은 기간 동안 발생한다는 점을 제외하고, 신경성 폭식증에 대한 모든 규준이 부합된다;
- 통변 장애: 폭식의 부재에서 체중 또는 모양에 영향을 주는 재발성 통변 행동;
- 야식 증후군: 야식의 재발성 에피소드, 수면으로부터 각성 후 식사, 또는 저녁 식사 후 과도한 식품 소비. 이러한 행동은 환경적 영향 또는 사회적 규범에 의해 더 잘 설명되지 않는다. 이러한 행동은 유의미한 곤란/장애를 유발한다. 이러한 행동은 다른 정신적 건강 장애 (가령, BED); 달리 분류되지 않는 급식 및 식사 장애 (UFED)에 의해 더 잘 설명되지 않는다. DSM-5 규준에 따라, 이러한 범주는 행동이 기능의 임상적으로 유의미한 곤란/장애를 유발하지만, 임의의 급식 또는 식사 장애 규준의 전체 규준에 부합하지 못하는 경우에 적용된다. 이러한 범주는 임상의가 더욱 특정한 진단을 내리기에는 정보가 불충분한 현성 (가령, 응급실 환경에서)을 비롯하여, 규준이 부합되지 않는 이유를 명시하지 않기로 선택하는 경우에 임상의에 의해 이용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 식사 장애는 따라서, 전술한 목록의 장애를 지칭할 수 있다.
한 구체예에서, 식사 장애는 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN), 폭식 장애 (BED), 과식, 과식증, 소모병, 예를 들면, 악액질로 구성된 군에서 선택된다.
"식욕"은 배고픔으로서 느껴지는, 식품을 먹고 싶은 욕구인 것으로 의미된다. 식욕은 모든 고등 생명-형태에서 존재하고, 그리고 물질대사 요구를 유지하기 위한 적합한 에너지 섭취를 조절하는데 역할을 한다. 이것은 예로서, 지방 조직 및 간 및 뇌에서 소화관, 에너지 저장 사이에 긴밀한 상호작용에 의해 조절된다. 식욕은 섭취되는 식품의 양을 계측함으로써, 그리고 개체의 먹고 싶은 욕구를 사정함으로써 개체에서 사정된다.
"식욕의 조절장애"는 영구적으로 존재하거나 또는 한 주에 수회 재발하는 증가된 식욕뿐만 아니라 감소된 식욕을 포함하고, 따라서 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증, 악액질, 소모병, 과식, 폭식 장애 및 과식증에 기여하는 비정상적인 식욕을 지칭한다.
한 구체예에서, 개체는 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증, 폭식 장애, 악액질 및 소모병, 더욱 구체적으로, 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증 및 폭식 장애로 구성된 군에서 선택되는 식사 장애를 겪는다.
"식욕부진"은 감소된 식욕을 유발하는 식욕의 감소된 감각에 관계한다. 비과학적 간행물에서 상기 용어가 종종 신경성 식욕부진과 교체 가능하게 이용되긴 하지만, 감소된 식욕에 대한 많은 가능한 원인이 존재하는데, 이들 중에서 일부는 무해할 수 있고, 반면 다른 것들은 심각한 임상적 상태를 지시하거나 또는 유의미한 위험을 제기한다.
"신경성 식욕부진" (AN)은 본 발명의 문맥에서, 정상적인 체중의 최소한 85%의 체중을 유지하는데 실패에 의해 특징화되는 과도한 식품 제한에 의해 특징화되는 식사 장애를 지칭한다. 게다가, 신경성 식욕부진으로 고통받는 개체는 체중 증가에 대한 비합리적 두려움뿐만 아니라 왜곡된 신체 자각을 갖는데, 여기서 개체는 그 반대의 압도적인 증거에도 불구하고, 자신을 체중과다라고 여긴다.
따라서, 신경성 식욕부진으로 고통받는 개체는 바람직하게는, 신체 불만족, 날씬해지려는 욕구, 완벽주의, 무력함, 대인간 불신, 사회적 불안정 및 무쾌감증으로 구성된 군에서 선택되는 심리학적 특성 중에서 최소한 하나를 드러낸다. 바람직하게는, 신경성 식욕부진으로 고통받는 개체는 신체 불만족, 날씬해지려는 욕구 및 완벽주의로 구성된 군에서 선택되는 심리학적 특성 중에서 최소한 하나를 드러낸다. 더욱 바람직하게는, 신경성 식욕부진으로 고통받는 개체는 무력함, 대인간 불신, 사회적 불안정 및 무쾌감증으로 구성된 군에서 선택되는 심리학적 특성 중에서 최소한 하나를 드러낸다.
추가 구체예에서, 신경성 식욕부진으로 고통받는 개체는 17보다 열등한 BMI를 갖는다.
"BMI" 또는 "체질량 지수"는 개체의 신장의 제곱에 의해 나눗셈된 개체의 체질량으로서 규정된다. 의학에서 보편적으로 이용되는 상기 공식은 kg/m2의 척도의 단위를 산출한다.
"폭식증" 또는 "신경성 폭식증"은 폭식 및 통변, 또는 짧은 시간 내에 많은 양의 식품 소비, 그 이후에 전형적으로, 구토, 완하제 또는 이뇨제 복용, 및/또는 과도한 운동에 의해, 소비된 식품을 버리려는 시도 (통변)에 의해 특징화되는 식사 장애이다. 일부 개체는 신경성 폭식증 및 신경성 식욕부진 사이를 왔다 갔다 하는 경향이 있을 수 있다. 폭식증으로 고통받는 개체는 통상적으로 25보다 열등한 정상적인 BMI 범위에 의해 특징화될 수 있다.
"폭식 장애" 또는 "BED"는 유사한 기간 동안 유사한 환경 하에 대부분의 사람들이 먹는 것보다 훨씬 많은 식품의 양을 구별된 기간 내에 (가령, 임의의 2-시간 기간 이내에) 식사로 구성되는 폭식에 의해 특징화되는 식사 장애를 지칭하고, 그리고 통제의 상실의 감정을 동반한다. 폭식은 평균적으로, 6 개월 동안 최소한 주 2회 발생한다. 폭식증과 대조적으로, 폭식은 부적절한 보상 행동의 재발성 이용과 연관되지 않는다. BED로 고통받는 개체는 폭식에 대해 심각하게 걱정한다. 게다가, BED로 고통받는 개체는 소비된 식품의 양으로 인해 신체적으로 불편하고 구역질이 날 때까지 먹고 및/또는 지루하거나 또는 우울할 때 먹고 및/또는 실제로 배고프지 않을 때에도 대량의 식품을 먹고 및/또는 식품에 대한 당혹감의 감정 때문에, 정상적인 식사의 기간 동안 혼자 먹고 및/또는 폭식 후에 혐오감, 우울함, 또는 죄책감을 느낀다. 폭식 장애를 앓는 개체는 충동적으로 행동하고 그들의 식사에 대한 통제의 결여를 느낀다. 게다가, 폭식 장애로 고통받는 개체는 스트레스, 불안, 분노, 슬픔, 지루함 및 걱정에 대처하는데 어려움을 겪는다.
본 발명의 문맥에서, BED로 고통받는 개체는 바람직하게는, 비만하고 30보다 우월한 BMI를 갖는다.
"과식"은 체중 증가를 야기하는, 생물체가 소모하는 (또는 배출을 통해 분출하는) 에너지에 관계하여, 과잉 식품의 소비이다. 과식은 때때로, 폭식 장애 또는 폭식증의 증상일 수 있다. 강박적인 과식자는 그들이 스트레스를 받고, 여러 차례의 우울증을 겪고, 그리고 무기력의 감정이 들 때, 그들 자신을 위로하기 위해 식품에 의존한다.
"다식증"으로서 또한 알려져 있는 "과식증"은 과도한 배고픔 (강박적인) 또는 증가된 식욕을 지칭한다. 한 구체예에서, 과식증은 장애, 예를 들면, 당뇨병, 클레인 레빈 증후군, 유전 질환 프레더 윌리 증후군 및 바데트 비들 증후군에 의해 유발될 수 있다.
"소모병"은 심신쇠약성 질환이 근육 및 지방 조직이 "쇠약"해지도록 유발하는 과정을 지칭한다. 쇠약은 극히 낮은 에너지 섭취 (가령, 기근에 의해 유발됨), 감염으로 인한 영양소 상실, 또는 낮은 섭취 및 높은 상실의 조합에 의해 유발될 수 있다.
"악액질"은 암, AIDS, 만성 폐쇄성 폐 질환, 다발성 경화증, 울혈성 심부전, 결핵, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 수은 중독 (말단통증) 및 호르몬 결핍에 의해 유발될 수 있는 체중의 상실 및/또는 근위축 및/또는 피로, 허약, 그리고 식욕의 유의미한 상실과 연관된 소모 증후군이다. 악액질, 또는 달리 말하면, 쇠약은 여러 질환, 예를 들면, AIDS, 암, 엉덩이뒤 골절, 만성 심부전, 만성 폐 질환, 예를 들면, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COLD) 및/또는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 간경변증, 신부전, 그리고 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염 및 전신 루푸스, 패혈증 및 심각한 감염에서 목격된다. 게다가, 쇠약은 또한, 노화에서 목격된다.
일부 구체예에서, 악액질은 암에 의해 유발된다.
악액질의 가장 중요한 징후는 지방 조직뿐만 아니라 근육 조직 및 심지어 뼈의 체중 감소이다. 이러한 탈지 조직은 "마른 체중"으로서 또한 알려져 있다.
이에 더하여, 식욕의 상실, 허약 (무력), 그리고 헤모글로빈 수준에서 하락 (빈혈)이 있다.
악액질은 많은 상이한 임상적 상태의 말기 단계로서 또는 만성 질환, 예를 들면, 암, 감염, AIDS, 울혈성 심부전, 류마티스성 관절염, 결핵, 엉덩이뒤 골절, 낭포성 섬유증 및 크론병에서 발견된다. 이것은 또한, 질환의 임의의 명백한 증상을 갖지 않는 노인에서 발생할 수 있다.
"증가된 식욕"은 개체가 신체가 필요로 하는 것보다 많은 식품 섭취를 하는 식욕을 지칭한다. 이것은 체중 증가를 유발하거나 또는 유발하지 않을 수도 있다.
"정상적인 식욕"은 따라서, 신체가 필요로 하는 식품의 양에 상응하는 식품 섭취를 갖는 개체를 지칭한다.
"줄어든 식욕" 및/또는 "감소된 식욕"은 개체가 신체가 필요로 하는 것보다 적은 식품 섭취를 하는 식욕을 지칭한다. 이것은 체중 감소를 유발하거나 또는 유발하지 않을 수도 있다.
"식품 섭취"는 예로서, 다이어리 또는 설문지를 이용한 자가-보고, 뷔페 식사로부터 칼로리-섭취의 계측, 섭취에 앞서 식품의 칭량 이용, 또는 식품의 짝짓기된 양의 칭량 및 분석을 비롯한 다수의 기술을 이용하여 계측될 수 있다. 식품 섭취는 식사 기초, 하루 기초, 1 주 기초 또는 1 개월 기초에서 계측될 수 있다.
한 구체예에서, 조성물은 개체에서 체중 증가를 감소시키기 위한 것이다.
조성물은 예로서, 식욕을 감소시키는데 이용될 수 있고, 여기서 증가된 식욕은 폭식 장애 또는 과식에 기인한다.
본 발명의 한 구체예에서, 치료는 식품 섭취에서 최소한 1% 감소, 예를 들면, 2%, 더욱 바람직하게는 3% 또는 5% 또는 7%의 감소, 그리고 훨씬 바람직하게는, 치료의 개시에 앞서 평균 식품 섭취보다 10% 감소를 유발한다.
다른 구체예에서, 치료는 식품 섭취에서 변화와 상관없이 칼로리 섭취에서 감소를 야기하는데, 그 이유는 다양한 식품 항목, 예를 들면, 지방, 탄수화물 및 단백질이 식품 양에 대해 상이한 양의 칼로리를 내포하기 때문에, 섭취된 식품의 양이 섭취된 칼로리 섭취에 직접적으로 관련될 수 없기 때문이다.
본 발명의 한 구체예에서, 치료는 칼로리 섭취에서 최소한 1% 감소, 예를 들면, 2%, 더욱 바람직하게는 3% 또는 5% 또는 7%의 감소, 그리고 훨씬 바람직하게는, 치료의 개시에 앞서 평균 칼로리 섭취보다 칼로리 섭취에서 10% 감소를 유발한다.
한 구체예에서, 조성물은 개체에서 체중 증가를 증가시키기 위한 것이다.
조성물은 예로서, 식욕을 자극하기 위해 이용될 수 있고, 여기서 감소된 식욕은 식욕부진, 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증, 악액질 또는 소모병, 특히 식욕부진, 신경성 식욕부진 또는 신경성 폭식증에 기인한다.
본 발명의 한 구체예에서, 치료는 식품 섭취에서 1% 증가, 예를 들면, 2%, 더욱 바람직하게는 3% 또는 5% 또는 7%의 증가, 그리고 훨씬 바람직하게는, 치료의 개시 이전과 비교하여 평균 식품 섭취보다 10% 증가를 유발한다.
다른 구체예에서, 치료는 식품 섭취에서 변화와 상관없이 칼로리 섭취에서 증가를 야기하는데, 그 이유는 다양한 식품 항목, 예를 들면, 지방, 탄수화물 및 단백질이 식품 양에 대해 상이한 양의 칼로리를 내포하기 때문에, 섭취된 식품의 양이 섭취된 칼로리 섭취에 직접적으로 관련될 수 없기 때문이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 치료는 칼로리 섭취에서 최소한 1% 증가, 예를 들면, 2%, 더욱 바람직하게는 3% 또는 5% 또는 7%의 증가, 그리고 훨씬 바람직하게는, 치료의 개시 이전과 비교하여 칼로리 섭취에서 10% 증가를 유발한다.
일부 구체예에서, 조성물은 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN), 폭식 장애 (BED), 과식, 과식증, 소모병, 예를 들면, 악액질, 그리고 더욱 구체적으로, 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN) 및 폭식 장애 (BED)로 구성된 군에서 선택되는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
개체에서 식사 장애를 치료하거나 또는 이들 장애의 발생의 기회를 감소시키는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하고 및/또는 아래에 설명된 바와 같이 ClpB를 발현하지 않는 프로바이오틱스 및/또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
치료가 필요한 개체는 특히, 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN), 폭식 장애 (BED), 과식증, 소모병, 예를 들면, 악액질, 그리고 더욱 구체적으로, 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN) 및 폭식 장애 (BED)로 구성된 군에서 선택되는, 본원에서 규정된 바와 같은 식사 장애로 고통받는 개체이다.
본원에서 규정된 바와 같은 식사 장애의 치료 또는 예방에 의도된 약제의 제조에서 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물의 용도 역시 제공된다.
본 발명자들은 조절장애된 식욕이 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 존재, 그리고 항-α-MSH-반응성 항체, 바람직하게는 항-ClpB IgG 및/또는 IgM 및 항-α-MSH-반응성 IgG 및/또는 IgM의 증가된 혈장 수준과 연관된다는 것을 발견하였다.
한 구체예에서, 개체에서 ClpB 발현 세균의 양 또는 농도를 감소시키는 것은 상기 개체에서 식욕의 정상화를 유발한다.
이론에 한정됨 없이, 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물은 ClpB 발현 세균의 양을 감소시키고, 따라서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준 또는 농도를 감소시키고 및/또는 항-α-MSH-반응성 항체의 수준을 감소시키고, 따라서 정상화된 식욕을 유발한다.
한 구체예에서, 본 발명의 문맥에서 이용된 조성물은 제약학적 조성물이다.
본 발명의 문맥에서 이용된 제약학적 조성물은 바람직하게는, 선별된 투여 방식 또는 루트에 적절하도록 설계되고, 그리고 제약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 및/또는 부형제, 예를 들면, 분산제, 완충액, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장성 작용제, 안정화제, 기타 등등이 적절하면 이용된다. 이런 조성물은 예로서, Remington, The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995에서 개시된 바와 같은 전통적인 기술에 따라서 설계될 수 있다.
제약학적 조성물에 적합한 담체는 본 발명의 항균제와 합동될 때, 분자의 활성을 유지하고 개체의 면역계와 무반응성인 임의의 물질을 포함한다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물은 적합한 제약학적 단위 약형의 형태에서 경구 투여될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 정제, 경성 또는 연성 젤라틴 캡슐, 수성 용액, 현탁액, 그리고 리포솜 및 다른 느린 방출 제제, 예를 들면, 성형된 중합성 겔을 비롯한 많은 형태에서 제조될 수 있다.
투여 방식 및 약형은 제공된 치료 적용에 바람직하고 유효한 치료적 작용제 또는 조성물의 성질에 밀접하게 관련된다. 적합한 약형은 경구, 정맥내, 직장, 설하, 점막, 코, 안과, 피하, 근육내, 경피, 척추, 척수강내, 관절내, 동맥내, 거미막하, 기관지, 그리고 림프성 투여, 그리고 활성 성분의 전신 전달을 위한 다른 약형을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 제약학적 조성물은 제한 없이, 경피 (패치, 겔, 크림, 연고 또는 이온영동을 통해 수동); 정맥내 (일시 주사, 주입); 피하 (주입, 저장소); 경점막 (협측 및 설하, 예를 들면, 입안에서 분해되는 정제, 웨이퍼, 필름, 그리고 비등성 제제; 결막 (점안약); 직장 (좌약, 관장)); 또는 피내 (일시 주사, 주입, 저장소)를 비롯한 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다.
경구 액체 제약학적 조성물은 예로서, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유제, 시럽 또는 엘릭시르의 형태일 수 있거나, 또는 이용 전에 물 또는 다른 적합한 운반제로 구성을 위한 건성 산물로서 제공될 수 있다. 이런 액체 제약학적 조성물은 전통적인 첨가제, 예를 들면, 현탁제, 유화제, 비수성 운반제 (이것은 식용 오일을 포함할 수 있다), 또는 보존제를 내포할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 또한, 비경구 투여 (가령, 주사, 예를 들면, 일시 주사 또는 연속 주입에 의해)를 위해 조제될 수 있고, 그리고 보존제가 첨가된 앰풀, 미리 충전된 주입기, 작은 용적 주입 용기 또는 다중분량 용기에 담긴 단위 약형으로 제공될 수 있다. 제약학적 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성 또는 수성 운반제에서 유제와 같은 형태를 취할 수 있고, 그리고 조제 작용제, 예를 들면, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 내포할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 제약학적 조성물은 이용 전에, 적합한 운반제, 예를 들면, 무균, 발열원 없는 증류수로 구성을 위한, 무균 고체의 무균 단리에 의해 또는 용액으로부터 동결건조에 의해 획득된 분말 형태일 수 있다.
담체가 고체인 직장 투여에 적합한 제약학적 조성물은 가장 바람직하게는, 단위 용량 좌약으로서 제공된다. 적합한 담체는 코코아 버터 및 당분야에서 통상적으로 이용되는 다른 물질을 포함하고, 그리고 좌약은 제약학적 조성물 및 연화된 또는 융해된 담체(들)의 혼합, 그 이후에 냉각 및 주형에서 성형에 의해 편의하게 형성될 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 취입기, 연무기 또는 가압된 팩 또는 에어로졸 스프레이를 전달하는 다른 편의한 수단으로부터 편의하게 전달된다. 가압된 팩은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 포함할 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 복용 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 대안으로, 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위해, 본 발명의 제약학적 조성물은 건조 분말 조성물, 예를 들면, 제약학적 조성물 및 적합한 분말 기제, 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 믹스의 형태를 취할 수 있다. 분말 조성물은 예로서, 분말이 흡입기 또는 취입기의 도움으로 투여될 수 있는 캡슐 또는 카트리지, 또는 젤라틴 또는 블리스터 팩에서 단위 약형으로 제공될 수 있다.
비내 투여를 위해, 본 발명의 제약학적 조성물은 액체 스프레이를 통해, 예를 들면, 플라스틱 병 분무기를 통해 투여될 수 있다. 이들 중에서 Mistometerg (이소프로테레놀 흡입기-Wintrop) 및 Medihaler® (이소프로테레놀 흡입기-Riker)이 전형적이다.
본 발명의 제약학적 조성물은 또한, 부형제, 예를 들면, 풍미제, 착색제, 항균 작용제, 또는 보존제를 내포할 수 있다.
투여 섭생은 예로서, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 일의 기간 동안일 수 있다.
용량 범위는 투여되는 조성물에 의존하고 상기 규정된다.
의학 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 임의의 개체에 대한 용량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여의 시간과 루트, 전반적인 건강, 그리고 동시에 투여되는 다른 약물을 비롯한 많은 인자에 의존한다.
본 발명의 한 양상에서, 본 발명의 치료 또는 예방의 방법은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물을 투여함으로써 안정된 체중을 유지할 수 있게 한다.
체중과다 또는 너무 적은 체중은 또한, 일정한 문화권에서 덜 매력적인 것으로 고려되는 신체적 모습으로서 고려될지도 모른다.
이런 이유로, 한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 식욕을 조절하는 비-치료 방법에 관계하고, 상기 방법은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
전술한 모든 정의는 또한, 상기 비-치료 방법에 적용된다.
한 구체예에서, 효과량 또는 치료 효과량은 개체에 치료적 이익 또는 이익을 부여하는데 필요한 활성제의 최소한 최소 용량이지만, 독성 용량보다 적다. 다른 방식으로 언급하면, 식사 장애를 치료하기 위한 이런 양은 예로서, 식품 섭취의 조절을 유도하거나, 개선하거나, 또는 만약 그렇지 않으면, 식품 섭취의 조절로서 개체의 상태에서 향상을 유발하는 양이다.
한 구체예에서, 상기 비-치료 방법은 미용 방법이다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한, 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위해, ClpB 단백질을 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물에 관계한다.
전술한 모든 정의는 또한, 상기 조성물에 적용된다.
한 구체예에서, 식사 장애는 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN), 폭식 장애 (BED), 과식증, 소모병, 예를 들면, 악액질, 그리고 더욱 구체적으로, 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN) 및 폭식 장애 (BED)로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 개체에서 식욕을 조절하는 비-치료 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 ClpB 단백질을 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함한다.
전술한 모든 정의는 또한, 상기 비-치료 방법에 적용된다.
"프로바이오틱"은 식이에 도입되는 것으로 의도된, 미생물의 효과량을 포함하는 식품 첨가제인 것으로 의미된다. WHO에 따르면, 프로바이오틱스는 적합한 양으로 투여될 때, 숙주 건강에 이익을 부여하는 살아있는 미생물이다 (WHO, 2001).
본 발명의 문맥에서, 식이에 도입되는 세균은 ClpB 단백질을 발현하지 않는 세균이다. 이것은 특히, ClpB 단백질을 정상적으로 발현하지만 상기 단백질의 발현이 결실된 세균이다.
ClpB 발현 세균은 숙련자로부터 널리 공지되어 있고, 그리고 임의의 전통적인 기술에 의해 확인될 수 있다.
한 구체예에서, ClpB 단백질의 발현이 결실되는 ClpB 발현 세균은 인간에서 프로바이오틱 또는 공생 비병원성 세균으로서 알려져 있는 세균, 예를 들면, 비병원성 대장균 (Escherichia coli)으로 구성된 군에서 선택된다.
ClpB 단백질을 발현하지 않는 세균은 숙련자에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 이것은 예로서, DNA 재조합에 의해 행위될 수 있다.
"효과량"은 원하는 효과의 현시, 본 발명의 문맥에서, 식사 장애의 치료 또는 예방을 허용하는 세균의 양인 것으로 의미된다. 특히, 1000 백만 및 10000 백만 UFC.일 -1 사이의 양인 것으로 의미된다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한, 백신으로서 또는 면역원성 조성물로서 이용을 위한 ClpB 단백질을 포함하는 조성물에 관계한다.
"면역원성 조성물"은 본 발명의 문맥에서, 개체에 투여될 때 면역 반응을 유발하거나 또는 면역조정하고 (즉, 면역억제하거나 또는 면역자극하고), 또는 개체에 투여될 때 항체의 생산을 유도하는 ClpB 단백질을 포함하는 조성물인 것으로 의미된다.
"백신"은 면역 반응을 면역조정하기 위해 투여되고, 특히 상기 병원체로 인한 질병으로부터 개체를 보호하거나 또는 치료할 조성물, 예를 들면, 본원에서 설명된 면역원성 조성물인 것으로 의미된다. 본 발명의 백신은 특히, 식사 장애의 발달에 앞서 개체에 투여를 위한 예방적 (예방적) 백신이다.
특히, 상기 조성물은 식사 장애에 대항하여 면역화에서 이용된다.
더욱 구체적으로, 상기 조성물은 식사 장애를 예방하는데 이용된다.
개체에서 면역화 또는 예방접종의 방법 역시 제공되고, 상기 방법은 ClpB 단백질을 포함하는 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함한다.
특히, 상기 방법은 개체에서 식사 장애의 발생의 기회를 감소시키기 위한 것이다.
치료가 필요한 개체는 식사 장애를 앓는 감수성 개체이다.
식사 장애에 대항하여 면역화를 위한 백신 또는 면역원성 조성물의 제조에서 ClpB 단백질을 포함하는 조성물의 용도 역시 제공된다.
특히, 상기 조성물은 식사 장애의 예방을 위한 것이다.
특히, 상기 식사 장애는 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN), 폭식 장애 (BED), 과식, 과식증, 소모병, 예를 들면, 악액질, 특히 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증 및 폭식 장애에서 선택된다.
한 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 또한, 본원에서 개시된 ClpB 단백질의 조합을 포함할 수 있다.
백신 조성물 또는 면역원성 조성물을 획득하는 방법은 당분야에서 널리 공지된다. 일반적으로, 이런 방법은 기술, 예를 들면, 초음파처리, 단백질분해 소화, 열 처리, 동결 해동 처리, 삼투압 충격 처리, 기타 등등을 이용하여, 세균 제조물로부터 단백질을 추출하는 것을 수반한다. 인공 세균 제조물의 실례는 합성 또는 재조합 방법에 의해 부분적으로 또는 완전하게 획득된 단백질 제조물을 포함한다.
ClpB를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 대한 전형적인 용량은 예로서, 약 0.01 nmol/kg 내지 약 1000 nmol/kg의 범위에 있을 수 있다; 하지만, 이러한 예시적인 범위 미만 또는 초과의 용량이 구상된다. 특히, 상기 용량은 전체 체중의 약 0.1 nmol/kg 내지 약 100 nmol/kg, 바람직하게는 전체 체중의 약 0.1 nmol/kg 내지 약 20 nmol/kg, 더욱 구체적으로 0.1 nmol/kg 내지 약 10 nmol/kg, 특히 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nmol/kg이다.
상기 백신 및 면역원성 조성물에 관해서, 주사가능 이용에 적합한 형태는 무균 수용액 또는 분산액, 그리고 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말을 포함한다. 모든 사례에서, 형태는 무균이어야 하고, 그리고 쉬운 주사가능성이 존재하는 정도까지 유체이어야 한다. 이것은 제조와 보관의 조건 하에 안정되고, 그리고 미생물, 예를 들면, 세균과 곰팡이류의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는 예로서, 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액체 폴리에틸렌 글리콜, 기타 등등), 이들의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 내포하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성은 예로서, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 기타 등등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연하는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 이용함으로써 달성될 수 있다.
수성 용액에서 비경구 투여의 경우에, 예로서, 상기 용액은 필요하면 적절하게 완충되어야 하고, 그리고 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성이 되도록 만들어져야 한다. 이들 특정 수성 용액은 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 종양내 및 복막내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 무균 수성 매체는 본 발명에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 가령, 1회 용량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에서 용해되고, 그리고 1000 ml의 피하 주입 유체에 첨가되거나 또는 주입의 제안된 부위에서 주사될 수 있다 (가령, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincot and Williams, 2005를 참조한다). 용량에서 일부 변이가 치료되는 개체의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 게다가, 인간 투여를 위해, 제조물은 FDA Office of Biologics standards에 의해 요구되는 바와 같은 무균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준에 부합해야 한다.
무균 주사가능 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 여과된 살균에 의해, 적절한 용매에 통합함으로써 제조된다.
본원에서 이용된 바와 같이, '담체'는 제한 없이, 용매, 분산 매체, 운반제, 코팅, 희석제, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드, 리포솜 및 비로솜, 예를 들면, Bomsel et al (2011) Immunity 34: 269-280에서 설명된 것들을 포함한다. 제약학적 활성 물질에 대한 이런 매체와 작용제의 이용은 당분야에서 널리 공지된다.
관용구 '제약학적으로-허용되는' 또는 '약리학적으로-허용되는'은 인간에 투여될 때 알레르기성 또는 유사한 부반응을 생산하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 단백질을 활성 성분으로서 내포하는 수성 조성물의 제조는 당분야에서 충분히 이해된다. 전형적으로, 이런 조성물은 주사가능물질 (액체 용액 또는 현탁액으로서)로서 제조된다; 주사에 앞서, 액체에서 용액, 또는 현탁액에 적합한 고체 형태 역시 제조될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 면역원성 또는 백신 조성물은 하나 또는 여러 어쥬번트(들)를 더욱 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "어쥬번트"는 면역원성 조성물의 내용물, 특히 백신에 첨가될 때, 상기 조성물이 투여되는 숙주에서 유도된 면역 반응의 강도를 증가시키는 산물을 표시한다. 어쥬번트는 특히, 상기 조성물의 투여 후 상기 포유동물이 생산할 수 있는 특이적 항체의 양을 증가시키고, 따라서 면역화의 효율을 증가시킬 수 있다.
바람직하게는, 어쥬번트(들)는 인간 숙주에서 부작용을 결여한다.
어쥬번트는 보호 면역 반응을 증가시키는 행동을 하는 임의의 화합물 또는 화합물들을 포함한다. 어쥬번트는 예로서, 유화제; 무라밀 디펩티드; 아브리딘; 수성 어쥬번트, 예를 들면, 수산화알루미늄; 산소-내포 금속 염; 키토산-기초된 어쥬번트, 그리고 당분야에서 공지된 다양한 사포닌, 오일, 그리고 다른 물질 중에서 한 가지, 예를 들면, 암프파이젠, LPS, 세균 세포 벽 추출물, 세균 DNA, CpG 서열, 합성 올리고뉴클레오티드 및 이들의 조합 (Schijns et al (2000) Curr. Opin. Immunol, 12:456), 마이코박테리움 플레이 (Mycobacterium phlei) ( phlei) 세포 벽 추출물 ( CWE) (U.S. 특허 번호 4,744,984), 미코박테리움 플레이 (M. phlei) DNA (M-D A), 그리고 M-DNA-미코박테리움 플레이 (M. phlei) 세포 벽 복합체 (MCC), 열민감 장독소 (LT), 콜레라 독소 (CT), 콜레라 독소 B 아단위 (CTB), 중합화된 리포솜, 돌연변이체 독소, 예를 들면, LTK63 및 LTR72, 마이크로캡슐, 인터류킨 (가령, IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, INFγ), GM-CSF, MDF 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드, LPS, MPL, 포스포파젠, Adju-Phos®, 글루칸, 항원 제제, 리포솜, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/백반 복합체, 프로인드 불완전 어쥬번트, ISCOMs®, LT 경구 어쥬번트, 무라밀 디펩티드, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 트리펩티드, 그리고 포스파티딜에탄올아민을 포함할 수 있다. 유화제로서 역할을 할 수 있는 화합물은 자연 및 합성 유화제뿐만 아니라 음이온성, 양이온성 및 비이온성 화합물을 포함한다. 산소-내포 금속 염은 Al, K, Ca, Mg, Zn, Ba, Na, Li, B, Be, Fe, Si, Co, Cu, Ni, Ag, Au, 그리고 Cr의 염을 포함하는데, 이들은 황산염, 수산화물, 인산염, 질산염, 요오드산염, 브롬산염, 탄산염, 수화물, 아세트산염, 구연산염, 옥살산염, 그리고 주석산염, 그리고 알루미늄 수산화물, 알루미늄 인산염, 알루미늄 황산염, 칼륨 알루미늄 황산염, 인산칼슘, 메이록스 (알루미늄 수산화물 및 마그네슘 수산화물의 혼합물), 베릴륨 수산화물, 아연 수산화물, 아연 탄산염, 아연 염화물, 그리고 바륨 황산염을 비롯한 이들의 혼합된 형태이다. 합성 화합물 사이에서, 음이온성 유화제는 예로서, 라우르산 및 올레산의 칼륨, 나트륨 및 암모늄 염, 지방산의 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄, 그리고 유기 술폰산염, 예를 들면, 나트륨 라우릴 황산염을 포함한다. 합성 양이온성 작용제는 예로서, 세틸트리메틸암모늄 브롬화물을 포함하고, 반면 합성 비이온성 작용제는 글리세릴에스테르 (가령, 글리세릴 모노스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 글리콜 에스테르 및 에테르, 그리고 소르비탄 지방산 에스테르 (가령, 소르비탄 모노팔미테이트) 및 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체 (가령, 폴리옥시에틸렌 소르비탄, 모노팔미테이트)에 의해 구현된다. 자연 유화제는 아카시아, 젤라틴, 레시틴 및 콜레스테롤을 포함한다.
다른 적합한 어쥬번트는 오일 성분, 예를 들면, 단일 오일, 오일의 혼합물, 유중수 유제, 또는 수중유 유제로 형성될 수 있다. 오일은 무기질 오일, 식물성 오일, 또는 동물성 오일일 수 있다. 무기질 오일은 증류 기술을 통해 바셀린으로부터 획득된 액체 탄화수소이고, 그리고 당분야에서 액체 파라핀, 액체 바셀린, 또는 백색 무기질 오일로 또한 지칭된다. 적합한 동물성 오일은 예로서, 대구 간 오일, 핼리벗 오일, 멘헤이든 오일, 오렌지 러피 오일 및 상어 간 오일을 포함하고, 이들 모두 상업적으로 가용하다. 적합한 식물성 오일은 예로서, 카놀라유, 아몬드유, 면실유, 옥수수유, 올리브유, 낙화생유, 홍화유, 호마유, 대두유 등을 포함한다. 프로인드 완전 어쥬번트 (FCA) 및 프로인드 불완전 어쥬번트 (FIA)는 백신 제조물에서 통상적으로 이용되는 2가지 통상적인 어쥬번트이고, 그리고 본 발명에서 이용에 또한 적합하다. FCA 및 FIA 둘 모두 무기질 오일에서 물 유제이다; 하지만, FCA는 또한, 사멸된 미코박테리움 (Mycobacterium) 종을 내포한다. 점막 백신에 대한 특히 바람직한 어쥬번트는 Lee et al (2011) Vaccine 29: 417-425에서 설명된 바와 같이, 갈락토실 세라미드 (GalCer)를 포함한다.
면역조정성 사이토킨은 또한, 백신 조성물에서 백신 효력을 증강하기 위해, 예로서, 어쥬번트로서 이용될 수 있는데, 이런 사이토킨의 무제한적 실례는 인터페론 알파 (IFN-a), 인터류킨-2 (IL-2), 그리고 과립구 대식세포-집락 자극 인자 (GM--CSF), 또는 이들의 조합을 포함한다.
백신 및 면역원성 조성물은 정맥내 투여, 동맥내, 내시경, 병소내, 경피, 피하, 근육내, 척수강내, 안와내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 흉골내 주사에 의해, 정맥내, 동맥내, 피내, 경피, 근육내, 비내, 피하, 경피, 기관내, 복막내, 흡입 또는 비내 분무에 의해, 기관내 루트에 의해, 기타 등등에 의해 투여될 수 있다. 조성물의 투여는 주입 또는 주사 (가령, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 척수강내, 십이지장내, 복막내 등)에 의해 이루어질 수 있다. 추가적으로, 상기 조성물은 "바늘-없는" 전달 시스템에 의해 투여될 수 있다.
주사는 복수 주사로 분할될 수 있는데, 이런 분할 접종은 바람직하게는 실제적으로 동시에 투여된다. 분할 접종으로서 투여될 때, 면역원의 용량은 바람직하게는, 각 별개의 주사에서 동등하게 조화되지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 만약 어쥬번트가 백신 조성물 내에 존재하면, 어쥬번트의 용량은 바람직하게는, 각 별개의 주사에서 동등하게 조화되지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 분할 접종을 위한 별개의 주사는 바람직하게는, 환자의 신체 상에서 서로에 실제적으로 근위에 투여된다. 일부 바람직한 양상에서, 주사는 신체 상에서 서로 최소한 약 1 cm 떨어져 투여된다. 일부 바람직한 양상에서, 주사는 신체 상에서 서로 최소한 약 2.5 cm 떨어져 투여된다. 고도로 바람직한 양상에서, 주사는 신체 상에서 서로 최소한 약 5 cm 떨어져 투여되고, 일부 양상에서, 주사는 신체 상에서 서로 최소한 약 10 cm 떨어져 투여되고, 일부 양상에서, 주사는 신체 상에서 서로 10 cm보다 많이, 예를 들면, 신체 상에서 서로 최소한 약 12.5. 15, 17.5, 20 cm, 또는 그 이상 떨어져 투여된다.
다양한 대안적 제약학적 전달 시스템이 이용될 수 있다. 이런 시스템의 무제한적 실례는 리포솜 및 유제를 포함한다. 일정한 유기 용매, 예를 들면, 디메틸술폭시드 역시 이용될 수 있다. 추가적으로, 백신 조성물은 단백질을 내포하는 지속된 방출 시스템, 예를 들면, 고체 중합체의 반투성 매트릭스를 이용하여 전달될 수 있다. 가용한 다양한 지속된 방출 물질은 당업자에 의해 널리 공지되어 있다. 지속된 방출 캡슐은 그들의 화학적 성격에 따라, 수일 내지 수주 내지 수개월의 범위에 걸쳐 백신 조성물을 방출한다.
조성물은 이상적으로는, 식사 장애의 증거에 앞서, 또는 식사 장애의 임의의 증상에 앞서 개체에 투여된다.
투여는 비경구 또는 비-비경구 루트를 통해 이루어질 수 있다. 투여 루트는 가령, 정맥내, 동맥내, 피내, 경피, 근육내, 점막 피하, 경피, 기관내, 복막내, 관류 및 세척을 포함한다. 가령, 투여는 점막 루트를 통해, 예를 들면, 코, 경구 (소화계의 점막층을 통해), 질, 협측, 직장, 설하, 눈, 소변기, 폐 또는 귀 (귀를 통해) 루트를 통해 이루어진다.
면역화는 다양한 '단위 용량'을 포함할 수 있다.
단위 용량은 단일 주사로서 투여될 필요가 없고, 설정된 기간에 걸쳐 연속 주입을 포함할 수 있다. 단위 용량은 약 0.01 nmol/kg 내지 약 1000 nmol/kg을 내포할 수 있다. 특히, 상기 용량은 전체 체중의 약 0.1 nmol/kg 내지 약 100 nmol/kg, 바람직하게는 전체 체중의 약 0.1 nmol/kg 내지 약 20 nmol/kg, 더욱 구체적으로 0.1 nmol/kg 내지 약 10 nmol/kg, 특히 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nmol/kg이다.
한 구체예에서, 백신 조성물은 단일 일일량으로 투여될 수 있고, 또는 전체 일일 용량은 예로서, 하루 2회, 3회 또는 4회 분할된 용량으로 투여될 수 있다. 게다가, 백신 조성물은 적합한 비내 운반제의 국소 이용을 통해, 경피 루트를 통해, 당업자에게 널리 공지된 경피 피부 패치의 이들 형태를 이용하여, 이식가능한 펌프에 의해; 또는 투여의 임의의 다른 적합한 수단에 의해 비내 형태로 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태에서 투여될 때, 예로서, 용량 투여는 당연히, 투약 섭생 내내 간헐적이기 보다는 연속적일 것이다.
백신 투여는 프라임 부스트 섭생을 더욱 포함할 수 있다. 이들 방법에서, 하나 또는 그 이상의 기폭 면역화는 하나 또는 그 이상의 추가 접종 면역화에 의해 이어진다. 실제 면역원성 조성물은 각 면역화에 대해 동일하거나 상이할 수 있고, 그리고 면역원성 조성물의 유형, 루트 및 면역원의 조제 역시 변할 수 있다. 한 가지 유용한 프라임 부스트 섭생은 4 주 이격된 2회 기폭 면역화, 그 이후에 최종 기폭 면역화 후 4 및 8 주에 2회 추가 접종 면역화를 제공한다.
동물 (인간 포함)에 대한 면역화 일정 (또는 섭생)은 널리 공지되어 있고, 그리고 특정 개체 및 조성물에 대해 쉽게 결정될 수 있다. 따라서, 조성물은 1회 또는 그 이상 개체에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 조성물의 별개의 투여 사이에 설정된 시간 간격이 있다. 이러한 간격은 모든 개체에 대해 변하긴 하지만, 전형적으로 10 일 내지 수주 범위이고, 그리고 종종 2, 4, 6 또는 8 주이다. 인간의 경우에, 간격은 전형적으로, 2 내지 6 주이다. 본 발명의 특히 유리한 구체예에서, 간격은 더욱 길다, 유리하게는 약 10 주, 12 주, 14 주, 16 주, 18 주, 20 주, 22 주, 24 주, 26 주, 28 주, 30 주, 32 주, 34 주, 36 주, 38 주, 40 주, 42 주, 44 주, 46 주, 48 주, 50 주, 52 주, 54 주, 56 주, 58 주, 60 주, 62 주, 64 주, 66 주, 68 주 또는 70 주이다.
면역화 체제는 전형적으로, 조성물의 1 내지 6회 투여를 갖지만, 적게는 1, 2, 3, 4 또는 5회 투여를 가질 수도 있다. 면역 반응을 유도하는 방법은 또한, 조성물과 함께 어쥬번트의 투여를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 연 1회, 연 2회 또는 다른 긴 간격 (5-10 년) 추가 접종 면역화가 초기 면역화 프로토콜을 보충할 수 있다.
본 발명의 특정한 구체예는 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물을 1회 또는 그 이상 개체에 투여함으로써 개체에서 식사 장애에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하고, 여기서 ClpB 단백질은 개체에서 특정한 면역 반응을 유도하는데 충분한 수준으로 있다. 이런 면역화는 원하는 면역화 체제에 따라서, 최소한 2, 4 또는 6 주 (또는 그 이상)의 시간 간격에서 복수 회 반복될 수 있다.
본 발명자들은 ClpB 단백질 및 항-ClpB 항체, 특히 항-ClpB IgG 및 식사 장애, 특히 신경성 식욕부진 및 신경성 폭식증 사이에 상관을 발견하였다.
결과로서, 본 발명은 또한, 개체에서 식사 장애를 진단하기 위한 시험관내 방법에 관계하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 상기 개체로부터 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하고;
b) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 상기 계측된 수준을 참조값에 비교하고; 그리고
c) 개체가 식사 장애를 겪는 지를 추론함.
본 발명의 문맥에서, 개체는 항-ClpB 항체로 불리는, 세균 단백질 ClpB에 대해 지향된 항체를 생산한다.
본 발명의 문맥에서 개체에 의해 생산된 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA 및/또는 IgE 항체, 특히 IgG 및/또는 IgM 항체일 수 있다.
본 발명의 문맥에서, ClpB 발현 세균 균주의 형태에서 상기 ClpB 단백질의 존재는 ClpB에 대해 지향된 항체 및/또는 α-MSH에 대한 항체의 생산을 증가시킨다.
α-MSH에 대해 지향되는, 개체에 의해 생산된 항체는 또한, 자가항체로 불린다.
용어 "자가항체"는 개체의 자체 단백질에 대해 지향되는 면역계에 의해 생산된 항체를 지칭한다.
바람직하게는, 항-ClpB 항체는 상기 규정된 바와 같이 α-MSH와 교차반응한다.
따라서, 한 구체예에서, 항-ClpB 항체는 또한 항-α-MSH 항체이다.
"항체" 또는 "면역글로불린" (Ig)은 자연 또는 전통적인 항체이고, 여기서 2개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로에 연결되고, 그리고 각 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된다. 2가지 유형의 경쇄, 람다 (l) 및 카파 (k)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요 중쇄 부류 (또는 동위원소)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각 사슬은 상이한 서열 도메인을 내포한다. 경쇄는 2개의 도메인 또는 영역, 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL)을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 가변 도메인 (VH) 및 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3, CH로서 총칭됨)을 포함한다. 가벼운 (VL) 및 무거운 (VH) 사슬 둘 모두의 가변 영역이 항원에 대한 결합 인식 및 특수성을 결정한다. 가벼운 (CL) 및 무거운 (CH) 사슬의 불변 영역 도메인은 중요한 생물학적 성질, 예를 들면, 항체 사슬 연관, 분비, 경태반 이동성, 보체 결합, 그리고 Fc 수용체 (FcR)에 결합을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N 말단 부분이고, 그리고 한 경쇄 및 한 중쇄의 가변 부분으로 구성된다. 항체의 특수성은 항체 결합 부위 및 항원 결정인자 사이에 구조적 상보성에 있다. 항체 결합 부위는 일차적으로, 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDRs)으로부터 잔기로 구성된다. 때때로, 비-초가변 또는 프레임워크 영역 (FR)으로부터 잔기가 전반적인 도메인 구조 및 따라서, 결합 부위에 영향을 준다. 상보성 결정 영역 또는 CDR은 선천적 면역글로불린 결합 부위의 자연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특수성을 함께 규정하는 아미노산 서열을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄와 중쇄는 각각, CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L 및 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H로서 지정된 3개의 CDR을 각각 갖는다. 전통적인 항체 항원 결합 부위는 이런 이유로, 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함한다.
"프레임워크 영역" (FRs)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열, 다시 말하면, 단일 종에서 상이한 면역글로불린 사이에서 상대적으로 보존되는 면역글로불린 경쇄와 중쇄 가변 영역의 부분을 지칭한다. 면역글로불린의 경쇄와 중쇄는 각각, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, 그리고 FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H로서 지정된 4개의 FR을 각각 갖는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "인간 프레임워크 영역"은 자연발생 인간 항체의 프레임워크 영역에 실제적으로 동일한 (약 85%, 또는 그 이상, 특히 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%) 프레임워크 영역이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "진단하기 위한 방법" 또는 "진단하는 방법" 또는 단순히 "진단"은 개체에서 가능한 질환 또는 장애를 결정하거나 또는 확인하기 위한 방법을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 진단의 방법은 식사 장애, 특히 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN), 폭식 장애 (BED), 과식, 과식증, 소모병, 예를 들면, 악액질, 특히 신경성 식욕부진, 신경성 폭식증 및 폭식 장애에서 선택되는 식사 장애를 결정하거나 또는 확인하는 것에 관계한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "생물학적 표본"은 생물학적 기원의 물질을 의미한다. 생물학적 표본의 실례는 혈액, 혈장, 혈청 또는 타액을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 생물학적 표본은 혈액, 혈청 및/또는 혈장 표본, 특히 혈장 표본이다. 본 발명에 따른 생물학적 표본은 숙련자로부터 알려진 표본추출의 임의의 적절한 수단에 의해 개체로부터 획득될 수 있다.
본 발명에 따른 식사 장애를 진단하는 방법은 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 계측된 수준을 참조값에 비교하는 단계 b)를 포함한다.
바람직하게는, 참조값은 본 발명의 방법의 단계 a)의 개체의 생물학적 표본과 동일한 유기 조직 기원으로부터 표본에서 계측된다.
바람직하게는, "참조값"은 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 정상적인 수준에 상응한다.
본원에서 의도된 바와 같이, ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 "정상적인 수준"은 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준이 이들 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체에 대한 표준 컷오프 값 범위 안에 있다는 것을 의미한다. 표준은 생물학적 표본 유형 및 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하는데 이용된 방법에 의존한다. 특히, 정상적인 수준은 건강한 개체군에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 평균 수준이다.
특히, 참조값은 건강한 개체에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준에 상응한다. 따라서, 참조값은 건강한 개체로부터 유래된 참조 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준에 상응할 수 있다.
특히, 참조값은 특히, ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준이 단계 a)에서 계측될 때, 건강한 개체에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준에 상응한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "건강한 개체군"은 식사 장애로 이전에 진단되지 않았던 개체로 구성된 개체군을 의미한다. 바람직하게는, 건강한 개체군의 개체는 또한, 식사 장애의 임의의 증상을 달리 전시하지 않는다. 다시 말하면, 이런 개체는 의학적 전문가에 의해 조사되면, 건강하고 질환의 증상이 없는 것으로 특징화될 것이다.
따라서, "건강한 개체"는 식사 장애로 이전에 진단되지 않았던 개체를 의미한다. 건강한 개체는 또한, 식사 장애의 증상을 달리 전시하지 않는다. 다시 말하면, 이런 건강한 개체는 의학적 전문가에 의해 조사되면, 건강하고 질환의 증상이 없는 것으로 특징화될 것이다.
바람직하게는, 건강한 개체는 전술한 임의의 식사 장애를 전시하지 않는다.
본 발명의 문맥에서, ClpB 단백질 항-ClpB 항체의 수준은 숙련자에게 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 효소 결합 면역흡착 검정에 의해 계측될 수 있다.
특히, ClpB 단백질의 수준은 면역검정 또는 면역블롯에 의해 또는 예로서, 질량 분광분석법 (MS), 모세관 전기영동-질량 분광분석법 (CE-MS), 질량 분광분석법에 연계된 액체 크로마토그래피 (LC-MS, LC-MS/MS)와 같은 분석법에 의해 계측된다.
본 발명에 따라 이용된 바와 같이, 용어 "면역검정"은 경쟁, 직접적인 반응, 또는 샌드위치 유형 검정을 포함한다. 이런 검정은 응집 검사, 효소-표지화된 및 매개된 면역검정, 예를 들면, ELISA, 비오틴/아비딘 유형 검정, 방사면역검정, 면역전기영동, 그리고 면역침전을 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 ELISA에 더욱 직접적으로 관련된다.
질량 분광분석법 (MS), 모세관 전기영동-질량 분광분석법 (CE-MS), 질량 분광분석법에 연계된 액체 크로마토그래피 (LC-MS/MS) 모두 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 적합한 당업자에 의해 매우 잘 알려진 분석법이다.
특정 구체예에서, ClpB DNA의 수준은 예로서, ClpB DNA 검정 하에 아래의 실험적 부분에서 개시된, 또는 아래와 같은 방법을 추종함으로써, 개체의 대변에서 ClpB DNA를 정량함에 의해 계측된다: DNA는 세균 균주의 배양액으로부터 추출되고, 그리고 QIAampR DNA 대변 Mini 키트 (QIAGEN, France)를 이용하여 대변으로부터 정제된다. 세균은 물에서 용해되고, 그리고 11,000 r.p.m.에서 1 분의 원심분리 후, 100 ℃에서 5 분 동안 끓여지고, DNA를 내포하는 상층액은 -20℃에서 보관된다. NCBI 프라이머 설계 도구 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여, 하나의 확인된 α-MSH-유사 에피토프를 내포하는 ClpB 단백질 단편을 코딩하는 180 bp DNA 영역을 증폭하는 다음의 뉴클레오티드 프라이머가 설계된다: 전방: 5'- GCAGCTCGAAGGCAAAACTA -3' (서열 번호: 4) 및 후방: 5'- ACCGCTTCGTTCTGACCAAT -3' (서열 번호: 5) (Invitrogen Custom Primers, Cergy Pontoise, France). PCR은 MicroAmp 튜브 (Eppendorf, Hambourg, Germany)를 갖는 유전자증폭기에서 수행된다. 반응은 25 μL의 Go Taq RGreen 마스터 믹스 2X (Promega, Madison, WI), 1 μl (20 pmol)의 각 프라이머, 21 μl의 이중-증류수 및 1 μl의 세균 DNA를 내포하는 50 μl 용적에서 수행된다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 3 분, 그 이후에 30 초 동안 94℃, 30 초 동안 60℃, 그리고 1.5 분 동안 72℃의 35 주기. PCR 산물은 1% 아가로오스 겔 (Sigma)에서 180 bp의 예상된 크기로 가시화되고, 그리고 특수성이 ClpB 돌연변이 균주를 이용하여 검증된다.
특히, ClpB와 반응하는 항체의 수준은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 계측된다.
전형적으로, ClpB 단백질 (Delphi Genetics)은 전형적으로 4℃에서 72 시간 동안 전형적으로 100 mM NaHCO3 완충액, pH 9.6에서 예로서 100 μl 및 2 μg/ml의 농도를 이용하여, 전형적으로 Maxisorp 평판 (Nunc, Rochester, NY)에서 코팅된다. 평판은 전형적으로 0.05% Tween 200을 포함하는 인산염 완충된 식염수 (PBS), pH 7.4에서 예로서 세척되고 (5 분 x 3), 그리고 이후, 예로서 유리 항체 수준을 결정하기 위해 PBS에서 1:200 희석된, 또는 전체 항체 수준을 결정하기 위해 전형적으로 해리성 3 M NaCl, 1.5 M 글리신 완충액, pH 8.9에서 1:200 희석된 100 μl의 생쥐 또는 쥐 혈장과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 이들 평판은 세척되고 (3x), 그리고 전형적으로 100 μl의 알칼리 인산분해효소 (AP)-접합된 염소 항-쥐 IgG (1:2000), 항-쥐 IgM (1:1000), 항생쥐 IgG (1:2000), 또는 항생쥐 IgM (1:1000) (이들 모두 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA)로부터)와 함께 배양된다. 세척 (3x) 이후에, 전형적으로 100 μl의 p-니트로페닐 인산염 용액 (Sigma)이 알칼리 인산분해효소 기질로서 첨가된다. 실온에서 전형적으로 40 분의 배양 후, 반응은 3N NaOH를 첨가함으로써 중지된다. OD (흡광도)는 전형적으로 마이크로평판 판독기 Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwan)을 이용하여 전형적으로 405 nm에서 결정된다. 혈장 표본의 첨가 없이 평판의 판독으로부터 발생하는 블랭크 OD 값은 표본 OD 값으로부터 감산된다. 각 결정은 전형적으로, 2중으로 행위된다. 중복 값 사이에 변이는 전형적으로, 5%보다 적다.
전형적으로, 유사한 프로토콜이 전형적으로 상응하는 항인간 IgG 또는 IgM AP-접합된 항체를 이용하여 전형적으로 1:400 희석된 인간 혈장에서 항-ClpB IgG 및 IgM 항체를 계측하는데 이용된다.
바람직하게는, 특히 항-ClpB 항체의 수준이 효소 결합 면역흡착 검정을 이용하여 계측될 때, 항-ClpB 항체의 참조값은 특히, 혈장에서 항-ClpB IgG에 대한 OD에서 계측되고, 그리고 상기 OD 값은 0 및 3 사이, 더욱 바람직하게는 2.0 및 3.0 사이 및/또는 0.0 및 1.0 사이이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서, ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 계측된 수준이 본 발명에 따른 참조값보다 높거나 (증가된) 또는 낮은 (감소된) 지가 결정된다.
본 발명자들은 대조에서, 항-ClpB IgG가 여러 심리학적 특성의 정상 범위와 음성으로 상관하는 반면, AN 환자에서, 항-ClpB IgG가 핵심 정신병리학적 특성, 예를 들면, 신체 불만족 및 날씬해지려는 욕구와 양성으로 상관한다는 것을 더욱 발견하였다.
본 발명의 방법은 따라서, 식사 장애를 특징짓는 심리학적 특성이 평가되는 단계 b2)를 더욱 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 참조값보다 증가된 값의 항-ClpB IgG 항체는 식사 장애 특히, AN의 존재를 지시한다.
한 구체예에서, 식사 장애의 존재를 지시하는 정신병리학적 특성은 신체 불만족 및 날씬해지려는 욕구이다.
특정 구체예에서, 참조값보다 증가된 값의 항-ClpB IgG 및/또는 단계 b2)에서 식사 장애와 연관된 물리적 특성의 검출은 식사 장애, 특히, AN의 존재를 지시한다.
식사 장애와 연결된 "심리학적 특성"을 평가하는 방법은 당업자에게 알려져 있다.
한 가지 실례에서, 식사 장애와 연결된 심리학적 특성은 식사 장애 척도-2를 이용하여 검정될 수 있다.
"식사 장애 척도 (EDI)"는 식사 장애, (a) 제한 및 폭식/통변 유형 둘 모두의 신경성 식욕부진; (b) 신경성 폭식증; 및 (c) 폭식 장애 (BED)를 비롯하여 달리 특정되지 않는 식사 장애의 존재를 사정하는데 이용된 자가-보고 설문지이다. 본래 설문지는 8개의 하위척도로 나눠진 64개 문항으로 구성되었다. EDI-2는 1991의 재검토된 이형을 지칭한다.
한 구체예에서, 본 발명의 진단의 방법의 단계 c)는 개체가 식사 장애를 겪는 지를 추론하는 것을 지칭하는데, 여기서 참조값보다 증가된 값의 항-ClpB 항체는 바람직하게는, 식사 장애의 존재를 지시한다.
다른 구체예에서, 단계 b2)에서 검출될 때 식사 장애와 연관된 물리적 특성의 검출은 식사 장애의 존재를 지시한다.
상기 방법은 따라서, 단계 a)에서 결정된 항-ClpB IgG의 전체 수준과 비교하여, 상기 표본에서 α-MSH와 교차반응하는 항-ClpB IgG의 수준의 비율을 결정하는 추가 단계 프리-c)를 포함한다.
α-MSH와 교차반응하는 항-ClpB IgG의 수준의 비율은 예로서, ClpB 단백질 (Delphi Genetics)로 코팅된 전형적으로 96-웰 Maxisorp 평판 (Nunc)에 표본을 첨가하기 전에, 예로서 4℃에서 하룻밤 동안 전형적으로 10-6 M α-MSH 펩티드 (Bachem)와 함께, PBS에서 1:400 희석된 인간의 혈장 표본을 전배양함으로써 결정될 수 있다. ClpB와 반응성인 IgG 항체는 상응하는 항인간 AP-접합된 항체 (Jackson)를 이용하여, 전형적으로 ELISA에 의해 검출된다. α -MSH와 교차반응성인 ClpB IgG의 백분율은 100% 동등한, 각 개별 혈장 표본에서 흡수 없이 검출된 항-ClpB IgG의 수준에 비하여 계산될 수 있다.
특정 구체예에서, 참조값보다 증가된 비율의, 항-ClpB 항체의 전체 수준과 비교하여 α-MSH와 교차반응하는 항-ClpB IgG의 수준은 식사 장애의 존재를 지시한다.
본 발명은 치료가 필요한 개체에서 식사 장애의 발생의 기회를 치료하거나 또는 감소시키는 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 한 항균제를 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하고 및/또는 ClpB를 발현하지 않는 프로바이오틱스 및/또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 개체는
a) 상기 개체로부터 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하고;
b) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 상기 계측된 수준을 참조값에 비교하고; 그리고
c) 개체가 식사 장애를 겪는 지를 추론함에 의해 식사 장애로 고통받는 것으로서 진단되었다.
전술한 모든 정의는 또한, 상기 방법에 적용된다.
본 발명은 식사 장애로 고통받는 개체를, ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 반응할 개연성이 있는 것으로 선별하는 시험관내 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 상기 개체로부터 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하고;
b) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 상기 계측된 수준을 참조값에 비교하고; 그리고
c) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 대해 개체를 선별하고, 여기서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 상기 치료는 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 한 항균제를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하고 및/또는 ClpB를 발현하지 않는 프로바이오틱스 및/또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여함.
한 구체예에서, 참조값보다 증가된 값의 ClpB 단백질 및/또는 ClpB 항체를 갖는 개체는 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 반응할 개연성이 있는 것으로서 선별된다.
한 구체예에서, 상기 방법은 따라서, 단계 b2)를 더욱 포함할 수 있는데, 여기서 식사 장애를 특징짓는 심리학적 특성이 상기 규정된 바와 같이 평가된다.
본 발명의 진단의 방법의 단계 c)는 단백질 ClpB 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 대해 개체를 선별하는 것을 지칭하고, 여기서 참조값보다 증가된 값의 ClpB 단백질 및/또는 ClpB 항체를 갖는 개체는 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 반응할 개연성이 있는 것으로서 선별된다.
특정 구체예에서, 참조값보다 증가된 값의 ClpB 단백질 및/또는 ClpB 항체를 갖는 및/또는 단계 b2)에서 검출될 때 식사 장애와 연관된 물리적 특성을 갖는 개체는 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 반응할 개연성이 있는 것으로서 선별된다.
한 구체예에서, 식사 장애의 존재를 지시하는 정신병리학적 특성은 신체 불만족 및 날씬해지려는 욕구이다.
게다가, 본 발명자들이 생쥐에서 대장균 (E. coli)의 만성 위내 전달이 식품 섭취를 감소시킨다는 것을 보여주었기 때문에, 본 발명은 비만의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 ClpB 단백질을 과다발현하는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물에 더욱 관계한다.
본원에서 "비만"은 개체가 바람직하게는 30보다 우월한 BMI를 갖는 의학적 상태를 지칭한다.
"과다발현하는"은 증가된 양으로 유전자의 발현으로 인한 단백질의 인공 발현, 본원에서 ClpB 단백질을 인코딩하는 유전자의 증가된 발현인 것으로 의미된다.
ClpB 단백질을 과다발현하는 세균은 숙련자에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 이것은 예로서, ClpB DNA를 발현하는 벡터로 세균 형질전환에 의해 행위될 수 있다.
한 구체예에서, ClpB 과다발현 세균은 인간에서 프로바이오틱 또는 공생 비병원성 세균으로서 알려져 있는 세균, 예를 들면, 비병원성 대장균 (Escherichia coli)으로부터 선별된다.
"효과량"은 원하는 효과의 현시를 허용하는 세균의 양인 것으로 의미된다. 특히, 1000 백만 및 10000 백만 UFC.일-1 사이의 양인 것으로 의미된다.
본 출원 전반에서, 용어 "포함하는"은 모든 구체적으로 언급된 특질뿐만 아니라 임의선택적, 추가, 특정되지 않은 특질을 포괄하는 것으로서 해석된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포함하는"의 이용은 또한, 구체적으로 언급된 특질 이외에 어떤 특질도 존재하지 않는 (다시 말하면, "구성되는") 구체예를 개시하다.
본 발명은 이제, 하기 도면 및 실시예에 관하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.
서열
서열 번호: 1은 NCBI 참조 번호 NP_417083.1 하에 참조되고 Uni-Prot 엔트리 P63284 하에 참조된 대장균 (E. coli) K12로부터 샤프롱 단백질 ClpB의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호: 2는 서열 번호: 1의 대장균 (E. coli) K12로부터 샤프롱 단백질 ClpB의 아미노산 서열의 아미노산 542 내지 548을 보여준다.
서열 번호: 3은 Gen Pept 서열 ID, PRF: 223274 하에 참조된 호모 사피엔스 (Homo sapiens)로부터 α-MSH의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호: 4는 뉴클레오티드 프라이머 ClpB의 핵산 서열을 보여준다.
서열 번호: 5는 뉴클레오티드 프라이머 ClpB의 핵산 서열을 보여준다.
도면
도면 1: 대장균 (E. coli) K12 단백질 및 α-MSH 사이에 분자 모방의 프로테오믹 확인.
(a) 대장균 (E. coli) 세포질 단백질의 2D GE. (b, c) α-MSH로 전흡착된 (c) 또는 전흡착되지 않은 (b) Rb 항-α-MSH IgG로 검출된 대장균 (E. coli) 단백질의 면역블롯. 적색의 원은 단백질 확인에 이용되었던 α-MSH IgG에 의해 특이적으로 인식된 스팟을 둘러싼다. 청색의 원은 비특이적 스팟을 지시한다. 스팟 1-4에서 확인된 단백질은 ClpB의 동종형이다. (d) Stretcher 프로그램을 이용한 α-MSH 및 ClpB 아미노산 서열 정렬. (e) 항-α-MSH IgG로 드러난 재조합 ClpB의 웨스턴 블롯. 레인 1 및 2, 각각 20 및 10 μg의 ClpB.
도면 2. 생쥐에서 ClpB 면역화.
ClpB-면역화된 생쥐 (ClpB+Adj)는 어쥬번트 (Adj), PBS 또는 대조 (Ctr)를 제공받는 생쥐와 비교되었다. (a) 연구의 32 일 동안 체중 변화. 식품 섭취 및 급식 패턴은 BioDAQ 케이지에서 최종 2 주 동안 연구되었다. 연구의 최종 10 일 동안 평균 일일 식품 섭취 (b), 식사 크기 (c) 및 식사 횟수 (d). (e) α-MSH (100 μg kg- 1 체중, i.p.) 또는 PBS의 주사 후 24 시간 동안 식품 섭취. (f) 10-6M α-MSH로 흡착 전후에 ClpB-반응성 IgG의 혈장 수준. (g) 해리 평형 상수 (KD 값)로서 도시된 항-ClpB IgG의 친화성. (h) α-MSH-반응성 전체 IgG의 혈장 수준. (i) 항-α-MSH IgG의 친화성 (KD). (j) 단독으로, 또는 ClpB-면역화된 생쥐로부터 또는 Adj-주사된 생쥐로부터 모아진 IgG (0.5 mg ml-1)와 함께, α-MSH에 의한 자극 후 MC4R을 과다발현하는 인간 배아 신장-293 세포에서 cAMP 검정. (k) cAMP 검정은 항-α-MSH IgG로부터 고갈된 IgG로 수행되었다. (a) α-MSH 주사 (100 μg kg-1 체중, i.p.) 전에 2-원 반복된 계측 분산 분석 (ANOVA), Po0.0001, 본페로니 사후 검증 *a 최소한, Po0.05 ClpB 군 대 Ctr; *b 최소한, Po0.05 Adj 군 대 Ctr.; *c, Po0.05, 스튜던트 t 검증 ClpB 군 대 PBS; 및 *d, Po0.05, 스튜던트 t 검증 ClpB 군 대 Ctr. (b) ANOVA P=0.0002, Tukey 사후 검증 ***Po0.001, **Po0.01, #Po0.05, 스튜던트 t 검증. (c) ANOVA P=0.007, Tukey 사후 검증 **Po0.01. (e) 스튜던트 t 검증, *Po0.05. (f, g) ANOVA Po0.0001, Tukey 사후 검증 ***Po0.001 ClpB +Adj 대 다른 군, 짝비교 t 검증 ##Po0.01, ###Po0.001. (h) ANOVA P =0.0002, Tukey 사후 검증 ***Po0.001, *Po0.05; (i) 크러스칼 왈리스 검증 P =0.003, 던 사후 검증 **Po0.01, (평균 ±s.e.m., n=8). (j) ANOVA P= 0.005, Tukey 사후 검증 *Po0.05; ANOVA P =0.04, 스튜던트 t 검증 #Po0.05, aClpB 대 α-MSH, bClpB 대 Adj. (평균 ± s.e.m.; j, n =6, k, n=3).
도면 3: 생쥐에서 대장균 (E. coli) 보충.
생쥐에서 체중 (a), 식품 섭취 (b), 식사 크기 (c) 및 식사 횟수 (d)에 대한 대장균 (E. coli) K12 야생형 (WT), ClpBdeficient (△ClpB) 대장균 (E. coli) K12 또는 LB 배지로 위내 일일 위관영양 (1-21 일자)의 효과. (e) 세균 ClpB DNA의 180-염기쌍 단편의 PCR 검출, 첫 번째 레인, 분자량 마커, 두 번째 레인 대장균 (E. coli) K12 WT의 시험관내 배양액으로부터 DNA, 세 번째 레인 대장균 (E. coli) K12 △ClpB의 시험관내 배양액으로부터 DNA, 그리고 나머지 레인 21 일자에 수집된 생쥐 대변으로부터 DNA. 10-6M α-MSH로 흡착 전후에 항-ClpB IgM (f) 및 IgG (g)의 효소 결합 면역흡착 검정에서 흡광도에서 혈장 수준.
항-α-MSH IgM (h) 및 IgG (i)의 혈장 수준. (j) 항-α-MSH IgG의 친화성 (평형 상수). (a) 2-원 반복된 계측 분산 분석 (ANOVA), P =0.3, 2 일자 본페로니 사후 검증, **Po0.01 대조 (Ctr) 대 대장균 (E. coli) WT. (b) 1-2 일자 ANOVA, P =0.0006, Tukey 사후 검증 ***Po0.001, *Po0.05, 대장균 (E. coli) WT 대 aCtr 및 bLB. (c) 세 번째 주 크러스칼 왈리스 (K-W) 검증 P=0.0001, 던 사후 검증, ***Po0.001, **Po0.01, 대장균 (E. coli) WT 대 aCtr, bLB 및 C△ClpB. (d) 1-2 일자 ANOVA, P =0.006, Tukey 사후 검증 **Po0.01, *Po0.05, 세 번째 주 K-W 시험 Po0.0001, 던 사후 검증, ***Po0.001, **Po0.01, 대장균 (E. coli) WT 대 aCtr, bLB 및 C△ClpB. (f) 흡착 전 K-W 시험 P =0.02, 던 사후 검증 *Po0.05, 흡착 후 ANOVA, Po0.0001, Tukey 사후 검증 **Po0.01, 대장균 (E. coli) WT 대 다른 군. (g) 흡착 전 ANOVA, P=0.01, Tukey 사후 검증 *Po0.05, 대장균 (E. coli) WT 대 다른 군, 짝비교 t 검증 ##Po0.01. (h) 스튜던트 t 검증, 대장균 (E. coli) WT 대 다른 군 *Po0.05. (j) K-W 시험 P =0.02, 던 사후 검증 *Po0.05, 만-휘트니 검증, #Po0.05. (평균 ± s.e.m., n=8).
도면 4. ED 환자에서 항-ClpB 항체.
건강한 여성 (대조, Ctr)에서 및 AN, BN 및 BED를 앓는 환자에서 항-ClpB IgG (a) 및 IgM (b)의 혈장 수준. 10-6M α-MSH로 흡착 전후에 ClpB IgG (c) 및 IgM (d)의 혈장 수준. α-MSH 교차반응성 항-ClpB IgG (e) 및 IgM (f)의 백분율. (b) 스튜던트 t 검증 *Po0.05. (c, d) 짝비교 t 검증, ***Po0.001, **Po0.01. (e) 크러스칼 왈리스 검증 Po0.0001, 던 사후 검증, **Po0.01, 만-휘트니 검증 #Po0.05. (f) 분산 분석 P =0.02, Tukey 사후 검증 *Po0.05. (평균 ±s.e.m., Ctr, n =65, AN, n=27 BN, n =32 및 BED, n=14).
도면 5. 식사 장애를 앓는 환자 및 건강한 대조 (Ctr)에서 세균 ClpB 단백질의 혈장 농도.
AN, 신경성 식욕부진, BN, 신경성 폭식증, BED, 폭식 장애. *p<0.05 평균 ClpB 농도 대 Ctr의 스튜던트 t 검증. 대조의 평균+2 표준 편차 (SD)보다 높은 ClpB 농도를 갖는 환자의 백분율 (%).
실시예
다음 실시예는 공생 장내 세균 대장균 (E. coli) K12의 ClpB 샤프롱 단백질이 에너지 물질대사 및 감정의 조절에 관련된 신경펩티드인 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH)의 입체형태적 모방체라는 것을 증명한다. 이들은 또한, ClpB 발현 장내 세균, 그리고 α-MSH와 교차반응성인 ClpB 단백질 및 항-ClpB 항체의 생산을 통한 동기부여된 행동 및 감정의 조절 사이에 분자 연결을 드러낸다. 이들은 증가된 ClpB 단백질 및 ClpB 항체 생산, 그리고 비정상적인 급식 행동 및 감정의 확립에서 ClpB-발현 미생물의 관여를 더욱 뒷받침한다.
실시예 1
재료와 방법
대장균 (E. coli) K12 배양액 및 단백질 추출
본 연구에서 이용된 세균 균주는 Rouen University, France의 UMR 6270 CNRS 실험실에 의해 제공된 대장균 (E. coli) K12이었다. 대장균 (E. coli) K12는 37 ℃에서 24 시간 동안 250 ml Luria Bertani (LB) 액체배지 (MP Biomedicals, Illkirch, France)에서 성장되었다. 단백질 추출은 Marti et al. (PLoS ONE 2011, e26030)에 의해 설명된 바와 같이 수행되었다. 간단히 말하면, 세균은 4 ℃에서 30 분 동안 4000 g에서 원심분리에 의해 수확되었고, 그리고 결과의 펠렛은 추출 완충액 (300mM NaCl 및 20mM Tris-HCl, pH 8)에서 재현탁되었다. 현탁액은 초음파처리 (3 x 3 분, 21%의 진폭에서 펄스 온 1 초, 오프 1 초)에 의해 교란되고 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 g에서 원심분리되었다. 상층액은 회수되고, 그리고 단백질을 세포질 (상층액) 및 외피 (펠렛) 분획물로 더욱 분리하기 위해 4 ℃에서 45 분 동안 60,000 g에서 초원심분리되었다. 단백질 농도는 2-D Quant 키트 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 계측되었다.
2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기이동
2차원 (2D) 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (PAGE)을 위해, 400 μg의 대장균 (E. coli) K12 단백질 추출물이 등전위 초점 완충액 (7M 요소, 2M 티오요소 및 0.5% 양성체, pH 4-7, 20mM DTT, 2mM TBP, 2% CHAPS 및 0.005% 브로모페놀 블루)에 첨가되고 약하게 진탕하면서 실온에서 60 분 동안 가용화되었다. 첫 번째-차원 겔 분리가 ReadyStrip IPG 스트립 (18 cm, pH 4-7 NL, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)을 이용하여 수행되었다. 등전위 초점 완충액으로 스트립의 24 시간 수동 재수화 후, 단백질 표본은 캐소드로부터 1.5 cm에 배치된 적하 컵을 통해 스트립에 첨가되었다. 등전위 초점은 4 단계 (31,500 Vh): 1 시간 동안 500 V, 1000 V 구배, 10,000 V 구배 및 2 시간 동안 10,000 V에서 Ettan IPGphor 3 시스템 (GE Healthcare, Orsay, France)으로 수행되었다. 각각, 2% DTT 및 2.5% 요오드아세트아미드로 2회 평형화 단계 후, 두 번째 차원, 다시 말하면, SDS-PAGE, (10% 폴리아크릴아미드 겔, 20 cm x 18- cm x 1 mm)가 겔마다 12 mA로 Ettan Daltsix 수직 전기이동 시스템 (GE Healthcare)에서 수행되었다. SDS-PAGE 후, 2D 겔은 실온에서 2% (vol:vol) 오르토인산에서 및 50% (vol:vol) 메탄올에서 2 시간 동안 고정되었다. 겔은 이후, 물로 헹굼되고, 그리고 단백질 스팟은 CBB G-250 (Bio-Rad) 염색 (34% (vol: vol) 메탄올, 17% (wt:vol) 황산암모늄, 2% (vol:vol) 오르토인산 및 0.66 g CBB G-250 리터당)에 의해 가시화되었다.
면역블롯팅
2D-PAGE 이후에, 대장균 (E. coli) 세포질 단백질은 건성 전달 방법 (Trans Blot Cell, Bio-Rad, USA) 및 2 시간 동안 막 크기의 0.8 mA.cm-2의 정전류를 통해 Hybond-ECL PVDF 막 (GE Healthcare) 위에 이전되었다. 전달 후, 막은 인산염 완충된 식염수 (PBS; 10 mmol.l-1 Tris, pH 8, 그리고 150mM.l-1 NaCl) + 0.05% (vol:vol) Tween 20에서 5% (wt:vol) 우유 (Regilait, France)로 차단되었다. 세척 후, 막은 다중클론 토끼 항-α-MSH IgG (1:1000, Peninsula Laboratories, San Carlos, CA, USA)와 함께 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양되고, 그 이후에 세척 및 다중클론 돼지 항-토끼 양고추냉이 과산화효소-접합된 Ig (1:3000; Dako, Trappes, France)와 함께 배양이 뒤를 이었다. 면역블롯은 ECL 검출 시스템 (GE Healthcare)에 의해 드러났고, 그리고 그레이 스케일 마커 (Kodak)를 이용함으로써 미리 보정된 ImageScanner II (GE Healthcare)로 스캔되고 Labscan 6.00 소프트웨어 (GE Healthcare)로 디지털화되었다. 동일한 절차가 4 ℃에서 하룻밤 동안 10-6M의 α-MSH 펩티드 (Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)로 토끼 항-α-MSH IgG의 흡착 후 수행되었다.
단백질 확인
관심되는 단백질 스팟은 Ettan Spot Picker (GE Healthcare)를 이용하여 CBB G-250-염색된 2D 겔로부터 절제되었고, 그리고 단백질의 자동화된 인-겔 소화가 Ettan Digester (GE Healthcare)에서 수행되었다. 단백질 추출물은 이후, 10 μl의 5% (vol:vol) 아세토니트릴/0.1% (vol:vol) 포름산에서 재현탁되고, 그리고 이후, 나노스프레이 공급원 및 HPLC-칩 큐브 인터페이스 (Agilent Technologies, Courtaboeuf, France)로 장비된 6340 이온 트랩 질량분광계에 연계된 nano-LC1200 시스템으로 분석되었다. 간단히 말하면, 펩티드는 농축되고, 40-nl RPC18 트랩 칼럼에서 탈염되고, 그리고 Zorbax (30-nm 구멍 크기, 5-μm 입자 크기) C18 칼럼 (43mm 길이 x 75 μm 내부 직경; Agilent Technologies)에서 분리되었다. 400 nl.min-1의 유속에서 9-분 선형 구배 (0.1% 포름산에서 3-80% 아세토니트릴)가 이용되었고, 그리고 용리액은 이온 트랩 질량분광계로 분석되었다. 단백질 확인을 위해, MS/MS 피크 목록이 도출되고, 그리고 MASCOT Daemon 버전 2.2.2 (Matrix Science) 검색 엔진을 이용함으로써 단백질 데이터베이스와 비교되었다. 이들 검색은 다음의 특정한 파라미터로 수행되었다: 효소 특수성, 트립신; 1회 빗나간 개열 허용됨; 고정된 변형 없음; 가변적 변형, 메티오닌 산화, 시스테인 카르바미도메틸화, 세린, 티로신 및 트레오닌 인산화; 단일동위원소; 펩티드 전하, 2+ 및 3+; 전구체 이온에 대한 질량 내성, 1.5 Da; 단편화에 대한 질량 내성, 0.6 Da; 기기로서 ESI-TRAP; 분류학, 대장균 (E. coli); National Center for Biotechnology Information (NCBI) 데이터베이스 (NCBInr 20120531 (18280215 서열, 6265275233 잔기); Bethesda, MD, USA). 단백질 적중은 이들이 다음의 규준 중에서 한 가지를 충족하면, 자동적으로 검증되었다: 각각 454의 MASCOT 점수 (Po0.01)를 갖는 최소한 2개의 최상위 펩티드 (굵은 및 적색), 또는 각각 447의 MASCOT 점수 (Po0.05)를 갖는 최소한 2개의 최상위 펩티드로 확인. 가성-양성 비율을 평가하기 위해, 모든 초기 데이터베이스 검색은 MASCOT의 '미끼' 옵션을 이용하여 수행되었다. 결과는 가성-양성 비율이 1%를 초과하지 않으면, 유관한 것으로 고려되었다.
OFFGEL로부터 단백질 확인
24개 분획물 내로 고해상 대장균 (E. coli) K12 단백질 분리는 OFFGEL pH3-10 키트 (Agilent Technologies)를 이용하여 3100 OFFGEL 분별장치 위에 행위되었다. 단백질 표본 (400 μg) 제조 및 OFFGEL 시스템의 모든 부분의 어셈블리는 Agilent 빠른 시작 안내서에서 설명된 절차에 따라 행위되었다. OFFGEL 분별은 30 시간 후 64 KVh가 도달될 때까지 최대 한정된 전류 파라미터 (8000 V, 50 μA 및 200 mW)로 표준 프로그램 OG24PRO를 이용하여 수행되었다. 실험의 종결점에서, 모든 분획물은 0.8-ml 깊이 웰 (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France) 내로 이전되고 -20 ℃에서 보관되었다. OFFGEL의 중심 부분으로부터 회수된 9개 단백질-내포 분획물은 토끼 항-α-MSH IgG (Peninsula Laboratories)를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 연구되었고, 그 이후에 앞서 설명된 바와 같은 단백질 확인이 뒤를 이었다.
생쥐에서 면역화 및 행동
모든 실험적 프로토콜은 US 국립보건원 지침 및 EU 지침에 따라 수행되었고, 그리고 동물 실험은 기관 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 2-개월령 수컷 C57Bl6 생쥐 (Janvier Laboratories, L'Arbresle, France)는 12 시간 명암 주기, 07:00 시에 점등을 갖는 동물 시설에 1 주 동안 순화되었고, 그리고 각각, 표준 생쥐-유지 케이지 (n = 8)에서 유지되었다. 생쥐는 표준 펠렛화된 설치류 사료 (RM1 사료, SDS, UK)로 무제한으로 사양되고, 음료수가 항상 가용하고, 그리고 온건한 움켜짐 및 체중 계측에 의해 매일 조종되었다. 순화 동안, 생쥐는 케이지마다 생쥐에 대한 유사한 평균 체중을 획득하기 위해 4개 케이지 사이에 분산되었다. 1 주의 순화 후, 각 케이지로부터 생쥐는 4가지 연구 군 중에서 한 가지에 배정되었고 다음의 치료를 제공받았고: (i) 군 1, ClpB 면역화 (n = 8): ClpB 단백질 (Delphi Genetics, Gosselies, Belgium) 생쥐마다 PBS와 완전한 프로인드 어쥬번트 (Sigma, St Louis, MO, USA)의 1:1 (vol:vol)의 200 μl에서 50 μg, 복막내 (i.p.); (ii) 군 2, 어쥬번트 주사 대조 (n = 8): 200 μl의 PBS에서 완전한 프로인드 어쥬번트 (1:1 (vol:vol), i.p.); (iii) 군 3, PBS 주사 대조 (n = 8): 200 μl의 PBS (i.p.); 및 (iv) 군 4, 무손상 대조 (n = 8): 어떤 주사도 제공받지 않음, 그리고 이후 모든 생쥐는 그들의 유지 케이지로 복귀되었다. 15 일 후, 생쥐는 추가 접종 면역화 및 다음의 치료가 제공되었다: (i) 군 1 (n = 8), ClpB 단백질 (Delphi Genetics) 생쥐마다 PBS와 불완전 프로인드 어쥬번트 (Sigma)의 1:1 (vol:vol)의 200 μl에서 50 μg, i.p.; (ii) 군 2 (n = 8): 200 μl의 PBS에서 불완전 프로인드 어쥬번트 (1:1 (vol:vol), i.p.); (iii) 군 3, (n = 8): 200 μl의 PBS (i.p.); 및 iv) 군 4, (n = 8): 어떤 주사도 제공받지 않음. 추가 접종 다음 날, 생쥐는 자동 급식 모니터로 각각 장비된 BioDAQ 생쥐 케이지 (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA) 내로 개별적으로 배치되었다. 사료 (Serlab, Montataire France) 및 음료수는 무제한으로 가용하고 체중이 매일 계측되었다. BioDAQ 케이지에 3 일의 순화 후, 생쥐는 다음의 치료를 제공받았다: 군 1, 2 및 3 (각 n = 8), 다시 말하면, ClpB로 면역화되고, 각각 어쥬번트 및 PBS로 주사된 생쥐 모두 10:00 시에 100 μl의 PBS (i.p.)에서 α-MSH 펩티드 (Bachem AG), 100 μg.kg-1 체중의 급성 주사를 제공받았다. 대조 생쥐 (n = 8)는 PBS 단독 (i.p.)을 제공받았다. 급식 데이터는 연속적으로 모니터링되고 BioDAQ 데이터 뷰어 2.3.07 (Research Diets)을 이용하여 분석되었다. 식사 패턴 분석을 위해, 식사간 간격은 300 초에서 세팅되었다.
급식 연구 후, 생쥐는 사료 및 물이 무제한으로 가용한 개별 생쥐-유지 케이지에 배치되었고, 그리고 2 연속일 동안 수행된 O-미로 (Med Associate, Inc., St Albans, VT, USA) 시험에서 운동 활동 및 불안에 대해 분석되었다. O-미로 시험 후 2 시간에, 생쥐는 길로틴에서 머리제거에 의해 사멸되었고, 그리고 체간 혈액이 EDTA-내포 튜브 내로 수집되었다. 혈장은 4 ℃에서 10 분 동안 3500 r.p.m. (1.4 g)에서 원심분리에 의해 분리되고 검정 전에 -80 ℃에서 보관되었다.
운동 활동 및 불안 시험
BioDAQ 케이지에서 급식 연구 후, 생쥐는 Versamax 동물 활동 모니터 (AccuScan Instruments, Inc., Columbus, OH, USA)를 이용하여 운동 활동에 대해 분석되었다. 운동 활동 시험 다음 날, 모든 생쥐는 상승된 O-미로에서 그들의 불안에 대해 시험되었다. 상승된-O-미로는 설치류에서 불안 시험을 위해 약리학적으로 검증된 더욱 통상적으로 이용되는 상승된 플러스 미로의 변형이다. O-미로의 이점은 전통적인 플러스 미로의 애매모호한 중심 사각형을 결여한다는 것이다. O-미로는 바닥 위로 80 cm 상승된 환상 적외선 플랫폼 (외부 직경 120 cm)으로 구성되었고, 회색 플라스틱으로 만들어진 2개의 열린 분절 및 2개의 닫힌 분절을 특징으로 한다. 닫힌 분절은 미로의 표면 위로 20 cm 확장하는 벽에 의해 에워싸이고 검은색 적외선 플렉시유리 뚜껑으로 덮였다. 각 시험은 생쥐를 2개의 닫힌 분절 중에서 하나에 배치함으로써 시작되었다. 시험은 5 분간 지속되었고, 그리고 O-미로 위에 배치된 비디오 카메라 및 EthoVision 비디오 추적 소프트웨어 (Noldus IT, Wageningen, The Netherlands)를 이용하여 기록되었다. 열린 분절 및 닫힌 분절에서 소모된 거리 및 시간의 치수가 분석되었다. 각 생쥐 시험 사이에, O-미로는 30% 에탄올로 청소되었다.
ClpB 및 α-MSH 자가항체 검정
ClpB, α-MSH 및 부신 피질자극 호르몬과 반응하는 자가-Ab의 혈장 수준은 공개된 프로토콜 (Fetissov SO., Methods Biol Mol 2011)에 따라 효소 결합 면역흡착 검정을 이용하여 계측되었다. 간단히 말하면, ClpB 단백질 (Delphi Genetics), α-MSH 또는 부신 피질자극 호르몬 펩티드 (Bachem AG)는 4 ℃에서 72 시간 동안 100mM NaHCO3 완충액, pH 9.6에서 100 μl 및 2 μg.ml-1의 농도를 이용하여 96-웰 Maxisorp 평판 (Nunc, Rochester, NY, USA) 위에 코팅되었다. 평판은 0.05% Tween 200을 포함하는 PBS, pH 7.4에서 세척되고 (3회 동안 5 분), 그리고 이후, 유리 자가-Ab 수준을 결정하기 위해 PBS에서 1:200 희석된 또는 전체 자가-Ab 수준을 결정하기 위해 해리성 3M NaCl 및 1.5M 글리신 완충액, pH 8.9에서 1:200 희석된 100 μl의 생쥐 혈장과 함께 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 이들 평판은 세척되고 (3회) 100 μl의 알칼리 인산분해효소 (AP)-접합된 염소 항생쥐 IgG (1:2000) 또는 항생쥐 IgM (1:1000) (이들 모두 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA)로부터 획득됨)와 함께 배양되었다. 세척 (3회) 이후에, 100 μl의 p-니트로페닐 인산염 용액 (Sigma)이 AP 기질로서 첨가되었다. 실온에서 40 분의 배양 후, 반응은 3N NaOH를 첨가함으로써 중지되었다. 흡광도는 마이크로평판 판독기 Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwan)을 이용하여 405 nm에서 결정되었다. 혈장 표본의 첨가 없이 평판의 판독으로부터 발생하는 블랭크 흡광도 값은 표본 흡광도 값으로부터 감산되었다. 각 결정은 2중으로 행위되었다. 중복 값 사이에 변이는 5%보다 열등하였다. 유사한 프로토콜이 상응하는 항인간 IgG 또는 IgM AP-접합된 항체 (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)를 이용하여 인간 혈장 (1:400)에서 항-ClpB IgG 및 IgM을 계측하는데 이용되었다.
α-MSH로 ClpB 항체의 흡수
PBS에서 1:200 희석된 생쥐의 혈장 표본, 또는 PBS에서 1:400 희석된 인간의 혈장 표본은 ClpB 단백질 (Delphi Genetics)로 코팅된 96-웰 Maxisorp 평판 (Nunc)에 이들 표본을 첨가하기 전에, 4 ℃에서 하룻밤 동안 10-6M α-MSH 펩티드 (Bachem AG)와 함께 전배양되었다. ClpB와 반응성인 IgG 및 IgM 항체는 앞서 설명된 바와 같이, 상응하는 항생쥐 또는 항인간 AP-접합된 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)를 이용한 효소 결합 면역흡착 검정에 의해 검출되었다. α -MSH와 교차반응성인 ClpB 항체의 백분율은 100% 동등한, 각 개별 혈장 표본에서 흡수 없이 검출된 항-ClpB 항체의 수준에 비하여 계산되었다.
혈장으로부터 IgG 정제
IgG 정제 및 친화성 검정은 공개된 프로토콜 (Legrand et al., Protoc Exch 2014, doi:10.1038/protex2014.004)에 따라 수행되었다. 혈장 글로불린의 추출은 혈장 산성화 및 C18 SEP 칼럼 (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA)에서 분리에 의해 행위되었고, 이후 500 μl의 생쥐 혈장이 500 μl의 완충액 A (물에서 1% 트리플루오로아세트산)와 혼합되었다. 칼럼은 700 r.p.m.에서 3 분 원심분리에 의해 1 ml의 완충액 B (1% 트리플루오로아세트산에서 60% 아세토니트릴)에서 활성화되고 3 ml의 완충액 A로 3회 헹굼되었다. 희석된 혈장 (완충액 A에서 1:1)은 칼럼에 첨가되었고, 그리고 유출액 (1 ml)은 IgG의 추가 정제를 위해 저장되었다 (-20 ℃에서 동결되었다). 전체 IgG는 Melon Gel 키트 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 생쥐 혈장 표본의 유출액으로부터 정제되었다. 키트의 정제 완충액에서 1:4 희석된 혈장 유출액은 칼럼 내에 가라앉은 세척된 멜론 겔에 첨가되었다. 칼럼은 6000 r.p.m.에서 1 분 회전되었고, 그리고 IgG 내포 유출액은 저장되고 동결건조 전에 -20 ℃에서 동결되었다. 동결건조된 IgG는 HBS-EP 완충액 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)에서 재구성되었다. 환상 아데노신 일인산염 (cAMP) 실험을 위해, ClpB 및 어쥬번트 대조군의 8마리 생쥐로부터 정제된 IgG는 각각, 2개의 부분으로 분할되는 2개의 풀 내로 합동되었다. 한 부분은 cAMP 검정에서 직접적으로 이용되었고, 그리고 다른 부분은 활성화된 UltraLink 비드 (Pierce, Rockford, IL, USA) 위에 코팅된 α-MSH (Bachem AG)에 대한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 더욱 정제되었다. α-MSH IgG고갈된 IgG 유출액은 저장되고, 동결건조되고, PBS에서 희석되었다.
친화성 동역학 검정
ClpB 및 α-MSH에 대한 생쥐 IgG의 친화성 동역학은 BIAcore 1000 기기 (GE Healthcare)에서 표면 플라스몬 공명 현상에 근거된 생물특정 상호작용 분석에 의해 결정되었다. α-MSH (Bachem AG) 또는 ClpB 단백질 (Delphi Genetics)은 10mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 (GE Healthcare)에서 0.5 mg.ml-1로 희석되었고, 그리고 아민 연계 키트 (GE Healthcare)를 이용함으로써 센서 칩 CM5 (GE Healthcare)에 공유적으로 연계되었다. 모든 계측은 동일한 α-MSH 또는 ClpB-코팅된 칩에서 수행되었다. 친화성 활동적 분석을 위해, 멀티사이클 방법이 840 nmol의 복제물 및 블랭크 표본 (HBS-EP 완충액 단독)을 비롯하여, 각 IgG 표본의 5가지 연속 희석액: 3360, 1680, 840, 420 및 210 (nmol)으로 실행되었다. 각 주기는 2 분의 피분석물 주사 및 25 ℃에서 흐름 속도 30 μl.min-1에서 5 분의 해리를 포함하였다.
각 표본의 주사 사이에, 결합 표면은 10mM NaOH로 재건되고, 센서그램의 동일한 기준선 수준을 유발하였다. 친화성 활동적 데이터는 BiaEvaluation 4.1.1 프로그램 (GE Healthcare)을 이용하여 분석되었다. 활동적 데이터를 적합시키기 위해, 랭뮤어의 1:1 모형이 이용되었고, 그리고 표본 값이 블랭크 값을 감산함으로써 교정되었다.
시험관내 cAMP 검정
인간 MC4R을 발현하는 인간 배아 신장-293 세포의 안정된 세포주는 렌티바이러스 형질도입 기술을 이용하여 산출되고 Amsbio (Oxon, UK)로부터 구입되었다. 형질감염된 세포에서 MC4R mRNA의 높은 발현은 Amsbio 및 우리의 실험실에서 역전사 PCR에 의해 검증되었다. 각 실험 전에 세포에서 도입유전자의 존재는 녹색 형광 단백질의 형광 현미경에서 가시화에 의해 실증되었는데, 상기 유전자는 MC4R 렌티벡터로, 하지만 상이한 프로모터 하에 세포에 삽입되었다. α-MSH 펩티드 (Bachem AG)는 각각, 0.6, 3, 4.5, 6, 15, 30, 45, 60 및 120 pmol의 α-MSH 용량에 상응하는 2, 1, 750, 500, 250, 100, 75, 50 및 10 nM의 최종 농도로 유도 완충액: PBS, 500 μM IBMX, 100 μM RO 20-1724 (Sigma), 20mM MgCl2에서 희석되고, 그리고 또한, 하나의 블랭크 표본을 포함하였다. 해동한 후, 세포는 8-10 일 동안 37℃, 5% CO2에서 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 250 ml 조직 배양 플라스크 (BD-Falcon, Beckton-Dickinson, Bedford, MA, USA)에서, (2mM L-글루타민, 10% 소 태아 혈청, 0.1mM 비필수 아미노산 및 1% 페니실린-스트렙타비딘)으로 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 4.5 g.l-1 글루코오스 (Eurobio, Courtaboeuf, France)에서 배양되었다. 실험 당일에, 배양된 MC4R 인간 배아 신장-293 세포는 0.25% 트립신-EDTA (Sigma-Aldrich)로 처리되었고, 그리고 세포 펠렛은 비처리된 생물발광 백색 96-마이크로웰 평판 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서 웰마다 5000 세포 (10 μl)를 획득하기 위해 PBS에서 재현탁되었다. cAMP 생산은 제조업체의 사용설명서에 따라 생물발광 검정 cAMP-Glo Max 검정 키트 (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 계측되었다. 간단히 말하면, 이들 세포는 α-MSH 펩티드 단독, 또는 ClpB-면역화된 또는 어쥬번트 대조군으로부터 생쥐 IgG 풀과 함께 α-MSH의 상이한 농도에서 실온에서 15 분 동안 배양되었고, 그리고 이들은 α-MSH 직전에 세포에 첨가되었다. cAMP 표준 (키트에 의해 제공됨)의 연속 희석액은 동일한 마이크로평판에서 검정되었다. cAMP 검출 용액이 각 웰에 첨가되었고, 이후 이들 세포는 교반에 의해 균질화되고 1000 r.p.m.에서 2 분 동안 원심분리되고, 그리고 이후, 23℃에서 20 분 동안 배양되었다. Kinase-Glo 시약 기질이 각 웰에 첨가되었고, 그리고 23℃에서 10 분 배양 후, 발광이 생물발광 기기 (Safas Spectrometer, Monaco)로 판독되었다. 각 희석액에 대한 3가지 시험이 별개의 웰에서 수행되었고 2 분리 일자에서 반복되어, 선천적 IgG가 이용될 때 cAMP 활성화 곡선의 각 포인트에 대한 n = 6을 유발하였다. 항-α-MSH IgG 분획물로부터 선천적 IgG의 고갈 후, 동일한 실험이 앞서 설명된 바와 같이, 각 α-MSH 농도 및 IgG로 수행되었다.
생쥐에서 대장균 (E. coli) 위관영양
1-개월령 수컷 C57Bl6 생쥐 (Janvier Laboratories)는 앞서 설명된 바와 같이, 동물 시설에 1 주 동안 순화되고 유지되었다. 생쥐는 아래와 같이, 4가지 군 (각각에서 n = 8)으로 분포되었다: (i) 108 대장균 (E. coli) K12 세균으로 위관영양; (ii) ClpB에 대해 결함성인 108 대장균 (E. coli) K12 세균으로 위관영양; (iii) LB 배지 단독으로 위관영양; 및 (iv) 어떤 처리도 제공받지 않은 대조. ClpB 돌연변이 균주는 Bernd Bukau's Laboratory (ZMBH, Heidelberg University, Heidelberg, Germany)에서 산출되었고, 그리고 상응하는 야생형 (WT) 대장균 (E. coli) 세균과 함께 Dr Axel Mogk에 의해 우호적으로 제공되었다. 생쥐는 BioDAQ 케이지 (Research Diets) 내로 개별적으로 배치되었고, 그리고 세균을 포함하거나 또는 포함하지 않는 0.5 ml의 LB 배지로 21 일 동안 어둠 단계의 개시 전에 매일 위내 위관영양되었다. 위관영양의 최종일 동안, 생쥐 대변이 수집되고 동결되었다. 위관영양 후, 생쥐는 머리제거에 의해 사멸되었고 체간 혈액이 EDTA-내포 튜브 내로 수집되었다. 혈장은 4 ℃에서 10 분 동안 3500 r.p.m. (1.4 g)에서 원심분리에 의해 분리되고 검정 전에 -80 ℃에서 보관되었다. 항-ClpB 및 항-α-MSH IgG 및 IgM의 혈장 수준은 앞서 설명된 바와 같이 검정되었다.
ClpB DNA 검정
DNA는 WT 및 ClpB 돌연변이 균주의 배양액으로부터 추출되었고, 그리고 또한, QIAampR DNA 대변 Mini 키트 (Qiagen, France)를 이용하여 생쥐 대변으로부터 정제되었다. 세균은 물에서 용해되고, 그리고 11,000 r.p.m.에서 1 분의 원심분리 후, 100 ℃에서 5 분 동안 끓여지고, DNA를 내포하는 상층액은 -20℃에서 보관되었다. NCBI 프라이머 설계 도구 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여, 우리는 하나의 확인된 α-MSH-유사 에피토프 (도면 1e)를 내포하는 ClpB 단백질 단편을 코딩하는 180-염기쌍 DNA 영역을 증폭하는 다음의 뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다, 전방: 5'- GCAGCTCGAAGGCAAAACTA -3' (서열 번호: 4) 및 후방: 5'- ACCGCTTCGTTCTGACCAAT -3' (서열 번호: 5) (Invitrogen Custom Primers, Cergy Pontoise, France). PCR은 MicroAmp 튜브 (Eppendorf, Hambourg, Germany)를 갖는 유전자증폭기에서 수행되었다. 반응은 25 μL의 Go Taq Green 마스터 믹스 2x (Promega), 1 μl (20 pmol)의 각 프라이머, 21 μl의 이중-증류수 및 1 μl의 세균 DNA를 내포하는 50 μl 용적에서 수행되었다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 3 분, 그 이후에 30 초 동안 94℃, 30 초 동안 60℃, 그리고 1.5 분 동안 72℃의 35 주기. PCR 산물은 1% 아가로오스 겔 (Sigma)에서 180개 염기쌍의 예상된 크기로 가시화되고, 그리고 특수성이 ClpB 돌연변이 균주를 이용하여 검증되었다.
세균 ClpB 단백질의 혈장 농도.
세균 ClpB의 혈장 농도는 다음의 프로토콜에 따라 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 계측되었다. Delphi Genetics (Gosselies, Belgium)에 의해 맞춤 산출된 토끼 다중클론 항-ClpB IgG는 4℃에서 24 시간 동안 100 mM NaHCO3 완충액, pH 9.6에서 100 μl 및 2 μg/ml의 농도를 이용하여 96-웰 Maxisorp 평판 (Nunc, Rochester, NY) 위에 코팅되었다. 평판은 0.05% Tween 200을 포함하는 인산염 완충된 식염수 (PBS), pH 7.4에서 세척되었다 (5 분 x 3). 표준으로서, Delphi Genetics에 의해 맞춤 산출된 재조합 ClpB 단백질은 표본 완충액 (PBS, 아지드화나트륨 0.02%, pH 7.4)에서 5, 10, 25, 50, 70, 100 및 150 pM으로 계열 희석되고 웰에 2중으로 첨가되었다. 식사 장애를 앓는 환자 및 건강한 대조로부터 혈장 표본 (표본 완충액에서 1:25)은 나머지 웰에 2중으로 첨가되었고, 그리고 ClpB 표준 및 혈장 표본은 실온에서 (RT) 2 시간 동안 배양되었다. 평판은 0.05% Tween 200을 포함하는 PBS, pH 7.4에서 세척되었다 (5 분 x 3). Delphi Genetics에 의해 맞춤 산출되고 α-MSH와 교차반응성을 갖지 않는 것으로 미리 선별검사된 생쥐 단일클론 항-ClpB IgG (표본 완충액에서 1:500)가 웰에 첨가되고 실온에서 90 분 동안 배양되었다. 평판은 0.05% Tween 200을 포함하는 PBS, pH 7.4에서 세척되었다 (5 분 x 3). Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA)로부터 알칼리 인산분해효소와 접합된 염소 항생쥐 IgG (표본 완충액에서 1:2000)가 웰에 첨가되고 실온에서 90 분 동안 배양되었다. 평판은 0.05% Tween 200을 포함하는 PBS, pH 7.4에서 세척되었고 (5 분 x 3), 그리고 이후 100 μl의 p-니트로페닐 인산염 용액 (Sigma, St. Louis, MO)이 알칼리 인산분해효소 기질로서 첨가되었다. 실온에서 40 분의 배양 후, 반응은 3N NaOH를 첨가함으로써 중지되었다. 흡광도 (OD)는 마이크로평판 판독기 Metertech 960 (Metertech Inc., Taipei, Taiwan)을 이용하여 405 nm에서 결정되었다. 혈장 표본 또는 ClpB 단백질 표준 희석액의 첨가 없이 평판의 판독으로부터 발생하는 블랭크 OD 값은 표본 OD 값으로부터 감산되었다. ClpB의 혈장 농도는 ClpB 표준 곡선의 OD에 근거하여 계산되었고 혈장 희석을 위해 조정되었다.
통계학적 분석
데이터가 분석되었고, 그리고 그래프가 GraphPad Prism 5.02 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 플롯팅되었다. 정상화는 콜모고르프 스머노프 검증에 의해 평가되었다. 군 차이는 정상화 결과에 따라, 각각 Tukey 또는 던 사후 검증과 함께 분산 분석 또는 비파라미터 크러스칼 왈리스 검증에 의해 분석되었다. 체중 변화는 2-원 반복된 계측 분산 분석 및 본페로니 사후 검증으로 분석되었다. 개별 군은 정상화 결과에 따라 스튜던트 t 검증 또는 만-휘트니 검증을 이용하여 비교되었다. α-MSH로 ClpB 항체의 흡수의 효과는 짝비교 t 검증을 이용하여 분석되었다. 피어슨 또는 스피어만 상관 계수는 변수의 정상화에 따라 계산되었다. cAMP 생산은 비선형 회귀 적합 (로그(α-MSH) 대 정상화된 cAMP 반응)을 이용하여 분석되었는데, 상기 방정식은 Y = 100/(1+10(로그EC50-X) x 사면)이었다. 데이터는 평균 ± s.e.m.으로서 도시되고, 그리고 모든 시험에 대해, Po0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다.
결과
세균 α-MSH 모방체의 프로테오믹 확인
α-MSH에 분자 모방을 갖는 세균 단백질을 확인하기 위해, 프로테오믹 기술에 근거된 연구 전략이 개발되었다. 전체 단백질은 대장균 (E. coli) K12 배양액으로부터 추출되었고, 세포질 분획물은 2D 겔 전기이동 (도면 1a)에 의해 분해되고 폴리비닐리덴 이플루오르화물 막으로 이전되었다. 세균 단백질에서 복수 α-MSH-유사 에피토프의 검출의 확률을 증가시키기 위해, 막은 다중클론 항-α-MSH IgG로 드러났다. 13개의 면역양성 단백질 스팟이 발견되었고 (도면 1b), 이들 중에서 스팟 1-8은 10-6M α-MSH로 항체의 전흡착 후 사라졌는데 (도면 1c), 이것은 특정한 α-MSH-모방 에피토프를 확증한다. 질량 분광분석법을 이용하여, 가장 강한 α-MSH-유사 염색을 전시하는 단백질 스팟 1,2,3 및 4는 ClpB, 857-a.a. 단백질, 857개 아미노산 단백질 분해 샤프롱 또는 ClpB, MW 95526 (분자량: 95526 Da, 수탁 번호: NP_417083.1, 서열 번호: 1)으로 명명된 열 충격 단백질의 동종형으로서 확인되었다. 덜 강렬하게 염색된 α-MSH-유사 스팟 5-8 (각각, 880, 877, 874 및 800의 가장 높은 MASCOT 점수를 가짐)은 548-a.a. 단백질 샤페로닌 GroEL, (분자량: 57293 Da; 수탁 번호: YP_001732912.1)의 동종형이었다. OFFGEL 분별장치, 그 이후에 1차원 겔 전기이동 및 α-MSH로 전흡착되거나 또는 전흡착되지 않은 항-α-MSH IgG로 웨스턴 블롯을 이용하는, 대장균 (E. coli) 단백질 분리의 대안 전략 역시 이용되었다 (데이터 제시되지 않음). 하나의 띠가 항-α-MSH IgG에 의해 특이적으로 인식되었고 ClpB 단백질 (1065의 가장 높은 MASCOT 점수를 가짐)을 내포하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과에 근거하여, ClpB가 α-MSH와 분자 모방의 추가 검증을 위한 표적 단백질로서 선별되었다. α-MSH 및 세균 ClpB 사이에 아미노산 서열 상동성을 분석하기 위해, 양쪽 서열은 Needleman-Wunsch 알고리즘 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)을 이용한 Emboss Stretcher 프로그램에서 정렬되었다. 이들 정렬은 α-MSH와 불연속적 5 a.a. 서열 상동성을 전시하는 ClpB 단백질의 부위를 드러냈다 (도면 1d). 이러한 추정 α-MSH-유사 에피토프는 ClpB 단백질 구조의 나선간 루프에서 위치되었는데, 이것은 상기 에피토프가 단백질 표면 상에서 노출되고, 자가-Ab 결합에 접근가능하다는 것을 지시한다. 항-α-MSH IgG로 드러난 재조합 ClpB 단백질의 웨스턴 블롯은 96-kDa 띠 (도면 1e)를 보여주었는데, 이것은 ClpB 단백질이 α-MSH-유사 에피토프(들)를 내포한다는 것을 확증한다. 이들 결과는 분자 모방 개념에 따라, 최소한 5개의 연속성 아미노산 서열 상동성의 존재가 세균 단백질이 신경펩티드와 교차반응하는 IgG에 의해 인식되기 위한 필수적인 조건이 아니라는 것을 보여준다.
ClpB로 생쥐의 면역화
대장균 (E. coli) ClpB가 α-MSH와 교차반응성인 자가-Ab를 유도하고 급식 및 불안에 영향을 줄 수 있는 지를 조사하기 위해, 생쥐는 재조합 세균 ClpB 단백질로 면역화되었다. 어쥬번트와 함께 ClpB 또는 어쥬번트 단독을 제공받은 생쥐는 주사 후 수일 동안 더욱 낮은 체중을 전시하였다 (도면 2a). 하지만, 4 주 후, ClpB-면역화된 생쥐는 대조와 대비하여 더욱 높은 체중 (+5%)을 가졌다 (도면 2a). 실험의 마지막 10 일 동안 계측될 때, 평균 일일 식품 섭취는 또한, 다른 군과 비교하여 ClpB-면역화된 생쥐에서 더욱 높았다 (+13%) (도면 2b). 식사 횟수가 변하지 않았기 때문에 (도면 2d), 식품 섭취에서 증가는 증가된 식사 크기 때문이었는데 (도면 2c), 이것은 ClpB 면역화가 배고픔 기전보다는 포만을 간섭하였다는 것을 지시한다. 이것은 포만을 유도하는 α-MSH의 공지된 역할과 일치한다. α-MSH 식욕억제 효과에 대한 ClpB 면역화의 관련성을 더욱 검증하기 위해, 생쥐는 α-MSH의 i.p. 주사를 제공받았다. 이후의 24 시간 식품 섭취 및 체중은 ClpB-면역화된 생쥐에서 영향을 받지 않았는데 (도면 2e), 이것은 이들이 비면역화된 생쥐에서 존재하는 투여된 α-MSH의 식욕억제 효과에 민감하지 않았다는 것을 지시한다. 급식 실험 후, 생쥐에서 운동 활동 및 불안 관련된 행동이 오픈 필드 및 O-미로 시험에서 연구되었다. 전체 운동 활동 및 열린 구역 대 경계 구역에서 소모된 시간은 연구 군 사이에 유의미하게 다르지 않았다 (데이터 제시되지 않음). 하지만, O-미로의 닫힌 팔에서, ClpB-면역화된 생쥐는 대조와 비교하여 더욱 짧은 거리를 이동하였고 (데이터 제시되지 않음), 그리고 모든 다른 군과 비교하여 더욱 적은 시간을 소모하였다 (데이터 제시되지 않음), 이것은 감소된 불안을 지시한다. 면역화의 효율을 확증하기 위해, 항-ClpB IgG의 혈장 수준이 검정되고 그들의 친화성이 계측되었다. ClpB 면역화된 생쥐에서, 더욱 낮은 친화성 (도면 2g)과 함께 항-ClpB IgG 수준에서 강한 증가 (도면 2f)가 밝혀졌는데, 이것은 최근의 IgG 유도와 일치한다. α-MSH-반응성 IgG의 증가된 혈장 수준 역시 ClpB-면역화된 생쥐에서 발견되었다 (도면 2h); 이들 IgG는 대조와 비교하여, α-MSH에 대한 더욱 낮은 친화성에 의해 유사하게 특징화되었다 (도면 2i). α-MSH로 생쥐 혈장의 흡착은 항-ClpB IgG의 혈장 수준을 유의미하게 감소시켰는데, 이것은 항-ClpB IgG의 전체가 아닌 일부분이 α-MSH와 교차반응성이었다는 것을 확증한다 (도면 2f). α-MSH IgM 자가-Ab의 혈장 수준은 군 간에 유의미하게 다르지 않았다 (데이터 제시되지 않음). ClpB 면역화가 부신 피질자극 호르몬과 교차반응하는 자가-Ab를 유도할 수 있는 지에 상관없이, α-MSH 서열을 내포하는 39-a.a. 펩티드가 또한 분석되었다. 혈장 부신 피질자극 호르몬-반응성 IgG에서 어떤 유의미한 차이도 발견되지 않았는데 (데이터 제시되지 않음), 이것은 ClpB 및 α-MSH 사이에 입체형태적 모방의 선택성을 보여준다.
MC4R 신호전달에 대한 생쥐 IgG 효과
MC4R 신호전달에 대한 ClpB 면역화-유도된 α-MSH 교차반응성 IgG의 충격을 결정하기 위해, MC4R-발현 세포에서 α-MSH-유도된 cAMP 생산에 대한 그들의 효과가 연구되었다. cAMP 농도는 2가지 가장 높은 α-MSH 농도에서 8-10%의 감소로, α-MSH 단독 또는 어쥬번트 주사된 생쥐로부터 IgG와 함께 전배양된 α-MSH와 비교하여, α-MSH가 ClpB-면역화된 생쥐로부터 IgG와 함께 전배양될 때 더욱 낮은 것으로 밝혀졌다 (도면 2j). 모아진 IgG로부터 α-MSH-반응성 IgG의 고갈 후, ClpB 면역화된 생쥐로부터 나머지 IgG는 α-MSH-유도된 cAMP 방출에 대한 어떤 효과도 보여주지 않았는데 (도면 2k), 이것은 ClpB-면역화된 생쥐에서 항-α-MSH 교차반응성 IgG가 α-MSH에 대한 응답으로 cAMP 생산을 낮추는 것을 책임졌다는 것을 지시한다. MC4R 활성화 및 신호전달에서 감소는 따라서, ClpB-면역화된 생쥐에서 관찰된 증가된 식품 섭취 및 감소된 불안을 설명할 수 있다.
생쥐에서 대장균 (E. coli)의 위내 전달
대장균 (E. coli)이 ClpB 단백질에 대항하여 면역원성 반응을 유도하여, α-MSH와 교차반응성인 항-ClpB 자가-Ab의 생산을 유발할 수 있는 지를 시험하기 위해, 대장균 (E. coli) K12의 WT 및 △ClpB 균주가 3 주 동안 위내 위관영양에 의해 생쥐에 매일 제공되었다. 다른 군의 생쥐는 세균 배양 배지 단독으로 위관영양되었고, 그리고 대조군은 어떤 처리도 제공받지 않았다. 위관영양의 첫 며칠은 WT 대장균 (E. coli)을 제공받는 생쥐에서 체중 및 식품 섭취의 감소를 동반하였고, 이것은 이후, 대조 수준으로 점진적으로 복귀하였다 (도면 3a 및 b). 다시 한 번, 위관영양의 마지막 주 동안, 급식 패턴이 대장균 (E. coli) WT를 제공받는 생쥐에서 영향을 받았는데, 식사 크기에서 감소, 하지만 식사 횟수에서 증가가 관찰되었다 (도면 3c 및 d). 두드러지게는, △ClpB 대장균 (E. coli)을 제공받는 생쥐는 임의의 시점에서 체중 증가, 식품 섭취 또는 급식 패턴에서 대조와 유의미하게 상이하지 않았다. 이들 데이터는 식품 섭취의 숙주 급성 감소에서 뿐만 아니라 대장균 (E. coli) 감염 이후에 급식 패턴의 만성 조절에서 세균 ClpB의 특정한 관여를 뒷받침한다. 예상된 바와 같이, ClpB DNA는 비록 이의 낮은 수준이 일부 대조 생쥐에서 검출되긴 했지만, 대장균 (E. coli) WT를 제공받는 생쥐의 대변에서 더욱 풍부하였다 (도면 3e). 3 주의 위관영양 후, 항-ClpB IgM 및 IgG 둘 모두의 혈장 수준이 대조 및 △ClpB 대장균 (E. coli) 군과 비교하여, 대장균 (E. coli) WT를 제공받은 생쥐에서 상승되었다 (도면 3f 및 g). α-MSH로 혈장의 흡착은 대장균 (E. coli) WT-위관영양된 생쥐에서 항-ClpB IgG 수준을 감소시켰는데 (도면 3g), 이것은 α-MSH와 교차반응성인 항-ClpB IgG의 존재를 지시한다. 흥미롭게도, 항-ClpB 자가-Ab의 IgM 부류의 혈장 수준은 α-MSH로 흡착 후 증가되었는데, 이것은 α-MSH가 대장균 (E. coli) WT-위관영양된 생쥐에서 증가된 ClpB와 교차반응성인 α-MSH IgM 면역복합체의 해리를 유발했다는 것을 암시한다 (도면 3f). 항-α-MSH IgM의 혈장 수준 역시 모든 다른 군과 비교하여 대장균 (E. coli) WT 전달에 의해 증가되었고 (도면 3h), 반면 항-α-MSH 반응성 IgG는 유의성에 도달하지 못하고 단지 약간 증가되었다 (도면 3i). 그럼에도 불구하고, α-MSH IgG의 친화성 활동적 분석은 연관 또는 해리 비율의 유의미한 변화 없이 (데이터 제시되지 않음), 대장균 (E. coli)-위관영양된 생쥐에서 해리 평형 상수의 더욱 낮은 값을 드러냈다 (도면 3j). α-MSH 반응성 자가-Ab의 IgM 부류의 증가된 수준을 비롯한 이들 변화는 신규한 항원에 대한 ClpB를 향한 면역 반응을 반영할지도 모른다. 실제로, 대장균 (E. coli) WT를 제공받지 않은 생쥐의 대변에서 ClpB DNA의 낮은 또는 검출할 수 없는 수준은 ClpB-발현 미생물이 연구된 생쥐에서 주요 소화관 공생 세균이 아니었다는 것을 지시한다. 따라서, 증가된 식사 크기 및 체중 증가와 연관된 낮은 친화성 항-α-MSH IgG의 증가된 수준을 보여주었던 ClpB-면역화된 생쥐와 대조적으로, 대장균 (E. coli)-위관영양된 생쥐는 감소된 식사 크기 및 체중과 연관된 증가된 친화성으로 항-α-MSH-반응성 IgM 및 IgG 둘 모두의 증가된 생산을 보여주었다.
ED 환자에서 항-ClpB 항체.
α-MSH 교차반응성 자가-Ab의 생산을 자극하는 대장균 (E. coli) ClpB 단백질이 능력이 검증되었기 때문에, ED에 대한 세균 ClpB의 관련성이 그 다음, AN, BN 또는 BED를 앓는 환자에서 항-ClpB 항체를 연구함으로써 결정되었다. 항-ClpB IgG 및 IgM 둘 모두 ED 환자뿐만 아니라 건강한 개체의 혈장에서, 그들의 평균 수준의 유의미한 차이 없이, 쉽게 검출가능한 것으로 밝혀졌다 (도면 4a 및 b). 하지만, 모든 연구 군에서 높은 가변성이 있었는데, 이것은 ClpB-유사 항원을 조우함에 있어서 상이한 개별 전력을 지시한다. 인간 항-ClpB 항체가 α-MSH와 유사하게 교차반응성이었는 지를 실증하기 위해, 혈장 표본이 10-6M α-MSH로 흡착되어, 모든 연구 군에서 항-ClpB IgG 및 IgM 검출가능한 수준의 유의미한 감소가 야기되었다 (도면 4c 및 d). 게다가, α-MSH 교차반응성 항-ClpB IgG의 상대적 수준이 건강한 대조와 대비하여 ED 환자의 3가지 군 모두, 특히 BN 및 BED에서 증가되었다 (도면 4e). α-MSH 교차반응성 항-ClpB IgM의 상승된 수준이 BN과 비교하여 AN에서 발견되었다 (도면 4f). ED에 대한 항-ClpB IgG 및 IgM의 관련성을 더욱 결정하기 위해, 이들의 혈장 수준이 EDI-2에 의해 계측된 ED 환자 및 대조에서 행동 특성과 상관할 수 있는 지가 연구되었다. 대조에서, ClpB IgG는 소수의 심리학적 특성의 정상 범위와 역으로 상관하지만, AN 환자에서 ClpB IgG 수준은 핵심 정신병리학적 특성, 예를 들면, 신체 불만족 및 날씬해지려는 욕구와 양성으로 상관하는 것으로 밝혀졌다. 게다가, AN 및 BED 환자에서, EDI-2 하위척도 점수는 반대의 방식 (AN에서 음성, 하지만 BED에서 양성)으로 ClpB IgM와 상관하였다 (표 1). 하지만, BED 환자에서, ClpB IgM은 연령과 음성으로 상관하였는데, 이것은 가장 높은 항-ClpB IgM 수준이 상기 질환의 급성 형태와 연관되었다는 것을 암시한다. 두드러지게는, 각각 ClpB IgG 또는 IgM 및 날씬해지려는 욕구 또는 대인간 불신 사이에 AN 환자에서 발견된 상관은 이전 연구에서 AN 환자의 상이한 군에서 발견된 동일한 심리학적 특성 및 α-MSH-반응성 IgG 또는 IgM 사이에 상관과 매우 유사하였다.
식사 장애 척도-2에 의해 검정된, 식사 장애 환자 및 대조 (Contr.)에서 항-ClpB IgG 및 IgM의 혈장 수준 및 심리학적 특성 사이에 유의미한 상관. 완벽주의에 대한 피어슨 r * p<0.05를 제외하고, 모든 스피어만 r * p<0.05, ** p<0.01. (n=65 Contr., n=27 AN, 그리고 n=14 BED).
ClpB IgG (대조) 성장 공포
r= -0.31 *
충동 조절
r= -0.26 *
사회적 불안정
r= -0.26 *
ClpB IgG (AN) 신체 불만족
r= 0.4 *
날씬해지려는 욕구
r= 0.35 *
완벽주의
r= 0.38 *
ClpB IgM (AN) 무력함
r= -0.42 *
대인간 불신
r= -0.58 **
사회적 불안정 무쾌감증
r= -0.52 ** r= -0.35 *
ClpB IgM (BED) 폭식증
r= 0.53 *
완벽주의
r= 0.6 *
연령
r= -0.74 **
세균 ClpB 단백질의 혈장 농도.
ClpB 단백질은 모든 연구 개체의 혈장 표본에서 10 pM 내지 180 pM 범위에서 검출되는데, 건강한 대조에서 평균 수준은 약 30 pM이다. ClpB의 평균 혈장 수준은 AN, BN 및 BED를 비롯한 식사 장애를 앓는 환자의 모든 군에서 유의미하게 상승되었다 (도면 5 참조). 2 표준 편차와 동등한 또는 이를 초과하는 농도의 진단적으로-유관한 변화의 공통 규준을 적용함으로써, 21.7%의 AN 환자, 32%의 BN 환자 및 25%의 BED 환자가 증가된 수준의 혈장 ClpB를 보여주었다.
결론
이들 결과는 ClpB 발현 장내 세균, 그리고 α-MSH와 교차반응성인 ClpB 단백질 및 항-ClpB 항체의 생산을 통한 동기부여된 행동 및 감정의 조절 사이에 분자 연결을 드러낸다. 이것은 소화관 미생물 균총의 특정한 변경이 ED 환자에서 관찰된 바와 같이, 행동 및 감정 비정상을 야기할 수 있다는 것을 보여준다. ED 환자에서 α-MSH와 교차반응성인 ClpB 단백질 및 항-ClpB IgG의 증가된 수준 및 항-ClpB 항체와 환자의 정신병리학적 특성의 상관의 조사 결과는 증가된 ClpB 항체 생산, 그리고 비정상적인 급식 행동 및 감정의 확립에서 ClpB-발현 미생물의 관여를 뒷받침한다.
결론적으로, 이들 결과는 ClpB를, ED 환자에서 정신병리학적 특성과 연관된 α-MSH와 교차반응성인 자가-Ab의 기원을 책임지는 단백질로서 확인하고, 따라서 ClpB-발현 미생물을 ED의 진단 및 치료를 위한 신규한 특정한 표적으로서 확인한다.
SEQUENCE LISTING <110> INSERM TRANSFERT <120> Bacterial influence on regulation of appetite via ClpB protein mimicry of alpha-MSH <130> BET14L3181 <150> EP13306673.8 <151> 2013-12-05 <150> EP14306552.2 <151> 2014-10-02 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 857 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Arg Leu Asp Arg Leu Thr Asn Lys Phe Gln Leu Ala Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Gln Ser Leu Ala Leu Gly His Asp Asn Gln Phe Ile Glu Pro Leu 20 25 30 His Leu Met Ser Ala Leu Leu Asn Gln Glu Gly Gly Ser Val Ser Pro 35 40 45 Leu Leu Thr Ser Ala Gly Ile Asn Ala Gly Gln Leu Arg Thr Asp Ile 50 55 60 Asn Gln Ala Leu Asn Arg Leu Pro Gln Val Glu Gly Thr Gly Gly Asp 65 70 75 80 Val Gln Pro Ser Gln Asp Leu Val Arg Val Leu Asn Leu Cys Asp Lys 85 90 95 Leu Ala Gln Lys Arg Gly Asp Asn Phe Ile Ser Ser Glu Leu Phe Val 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Glu Ser Arg Gly Thr Leu Ala Asp Ile Leu Lys Ala 115 120 125 Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Ile Thr Gln Ala Ile Glu Gln Met Arg 130 135 140 Gly Gly Glu Ser Val Asn Asp Gln Gly Ala Glu Asp Gln Arg Gln Ala 145 150 155 160 Leu Lys Lys Tyr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Arg Ala Glu Gln Gly Lys 165 170 175 Leu Asp Pro Val Ile Gly Arg Asp Glu Glu Ile Arg Arg Thr Ile Gln 180 185 190 Val Leu Gln Arg Arg Thr Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro 195 200 205 Gly Val Gly Lys Thr Ala Ile Val Glu Gly Leu Ala Gln Arg Ile Ile 210 215 220 Asn Gly Glu Val Pro Glu Gly Leu Lys Gly Arg Arg Val Leu Ala Leu 225 230 235 240 Asp Met Gly Ala Leu Val Ala Gly Ala Lys Tyr Arg Gly Glu Phe Glu 245 250 255 Glu Arg Leu Lys Gly Val Leu Asn Asp Leu Ala Lys Gln Glu Gly Asn 260 265 270 Val Ile Leu Phe Ile Asp Glu Leu His Thr Met Val Gly Ala Gly Lys 275 280 285 Ala Asp Gly Ala Met Asp Ala Gly Asn Met Leu Lys Pro Ala Leu Ala 290 295 300 Arg Gly Glu Leu His Cys Val Gly Ala Thr Thr Leu Asp Glu Tyr Arg 305 310 315 320 Gln Tyr Ile Glu Lys Asp Ala Ala Leu Glu Arg Arg Phe Gln Lys Val 325 330 335 Phe Val Ala Glu Pro Ser Val Glu Asp Thr Ile Ala Ile Leu Arg Gly 340 345 350 Leu Lys Glu Arg Tyr Glu Leu His His His Val Gln Ile Thr Asp Pro 355 360 365 Ala Ile Val Ala Ala Ala Thr Leu Ser His Arg Tyr Ile Ala Asp Arg 370 375 380 Gln Leu Pro Asp Lys Ala Ile Asp Leu Ile Asp Glu Ala Ala Ser Ser 385 390 395 400 Ile Arg Met Gln Ile Asp Ser Lys Pro Glu Glu Leu Asp Arg Leu Asp 405 410 415 Arg Arg Ile Ile Gln Leu Lys Leu Glu Gln Gln Ala Leu Met Lys Glu 420 425 430 Ser Asp Glu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Asp Met Leu Asn Glu Glu Leu 435 440 445 Ser Asp Lys Glu Arg Gln Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Glu Trp Lys Ala 450 455 460 Glu Lys Ala Ser Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ile Lys Ala Glu Leu Glu 465 470 475 480 Gln Ala Lys Ile Ala Ile Glu Gln Ala Arg Arg Val Gly Asp Leu Ala 485 490 495 Arg Met Ser Glu Leu Gln Tyr Gly Lys Ile Pro Glu Leu Glu Lys Gln 500 505 510 Leu Glu Ala Ala Thr Gln Leu Glu Gly Lys Thr Met Arg Leu Leu Arg 515 520 525 Asn Lys Val Thr Asp Ala Glu Ile Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr 530 535 540 Gly Ile Pro Val Ser Arg Met Met Glu Ser Glu Arg Glu Lys Leu Leu 545 550 555 560 Arg Met Glu Gln Glu Leu His His Arg Val Ile Gly Gln Asn Glu Ala 565 570 575 Val Asp Ala Val Ser Asn Ala Ile Arg Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala 580 585 590 Asp Pro Asn Arg Pro Ile Gly Ser Phe Leu Phe Leu Gly Pro Thr Gly 595 600 605 Val Gly Lys Thr Glu Leu Cys Lys Ala Leu Ala Asn Phe Met Phe Asp 610 615 620 Ser Asp Glu Ala Met Val Arg Ile Asp Met Ser Glu Phe Met Glu Lys 625 630 635 640 His Ser Val Ser Arg Leu Val Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr 645 650 655 Glu Glu Gly Gly Tyr Leu Thr Glu Ala Val Arg Arg Arg Pro Tyr Ser 660 665 670 Val Ile Leu Leu Asp Glu Val Glu Lys Ala His Pro Asp Val Phe Asn 675 680 685 Ile Leu Leu Gln Val Leu Asp Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly 690 695 700 Arg Thr Val Asp Phe Arg Asn Thr Val Val Ile Met Thr Ser Asn Leu 705 710 715 720 Gly Ser Asp Leu Ile Gln Glu Arg Phe Gly Glu Leu Asp Tyr Ala His 725 730 735 Met Lys Glu Leu Val Leu Gly Val Val Ser His Asn Phe Arg Pro Glu 740 745 750 Phe Ile Asn Arg Ile Asp Glu Val Val Val Phe His Pro Leu Gly Glu 755 760 765 Gln His Ile Ala Ser Ile Ala Gln Ile Gln Leu Lys Arg Leu Tyr Lys 770 775 780 Arg Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Glu Ile His Ile Ser Asp Glu Ala Leu 785 790 795 800 Lys Leu Leu Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Val Tyr Gly Ala Arg Pro 805 810 815 Leu Lys Arg Ala Ile Gln Gln Gln Ile Glu Asn Pro Leu Ala Gln Gln 820 825 830 Ile Leu Ser Gly Glu Leu Val Pro Gly Lys Val Ile Arg Leu Glu Val 835 840 845 Asn Glu Asp Arg Ile Val Ala Val Gln 850 855 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val 1 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 10 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcagctcgaa ggcaaaacta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 accgcttcgt tctgaccaat 20

Claims (13)

  1. 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 최소한 하나의 ClpB 단백질 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물.
  2. 개체에서 식욕을 조절하는 비-치료 방법에 있어서, 상기 방법은 최소한 하나의 ClpB 단백질 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 개체에서 식사 장애를 치료하거나 또는 이들 장애의 발생의 기회를 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 최소한 하나의 항균제를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 식사 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위해, ClpB 단백질을 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물.
  5. 개체에서 식욕을 조절하는 비-치료 방법에 있어서, 상기 방법은 ClpB 단백질을 발현하지 않는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 백신으로서 또는 면역원성 조성물로서 이용을 위한 ClpB 단백질을 포함하는 조성물.
  7. 식사 장애에 대항하여 면역화를 위해 청구항 5에 따라 이용되는 조성물.
  8. 식사 장애를 예방하기 위해 청구항 5 또는 6에 따라 이용되는 조성물.
  9. 개체에서 식사 장애를 진단하기 위한 시험관내 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법:
    a) 상기 개체로부터 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하고;
    b) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 상기 계측된 수준을 참조값에 비교하고; 그리고
    c) 개체가 식사 장애를 겪는 지를 추론함.
  10. 식사 장애로 고통받는 개체를, ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 반응할 개연성이 있는 것으로 선별하는 시험관내 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법:
    a) 상기 개체로부터 생물학적 표본에서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 계측하고;
    b) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 상기 계측된 수준을 참조값에 비교하고; 그리고
    c) ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 치료에 대해 개체를 선별하고, 여기서 ClpB 단백질 및/또는 항-ClpB 항체의 수준을 감소시키는 상기 치료는 최소한 하나의 ClpB 발현 세균에 대해 지향된 한 항균제를 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여하고 및/또는 ClpB를 발현하지 않는 프로바이오틱스 및/또는 이들의 조합을 포함하는 조성물의 효과량을 상기 개체에 투여함.
  11. 청구항 9 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 ClpB 단백질의 수준은 상기 개체의 대변에서 ClpB DNA를 정량함으로써 계측되는 것을 특징으로 하는 시험관내 방법.
  12. 식사 장애가 신경성 식욕부진 (AN), 신경성 폭식증 (BN), 폭식 장애 (BED), 과식, 과식증, 소모병, 예를 들면, 악액질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 청구항 1, 4 또는 6 내지 8 중 어느 한 항에 따라 이용되는 조성물, 청구항 2 또는 5에 따른 비-치료 방법 또는 청구항 9 내지 10 중 어느 한 항에 따른 시험관내 방법.
  13. 비만의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 ClpB 단백질을 과다발현하는 프로바이오틱스를 포함하는 조성물.
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