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KR20120108040A - 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법 - Google Patents

미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법 Download PDF

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KR20120108040A
KR20120108040A KR1020127020413A KR20127020413A KR20120108040A KR 20120108040 A KR20120108040 A KR 20120108040A KR 1020127020413 A KR1020127020413 A KR 1020127020413A KR 20127020413 A KR20127020413 A KR 20127020413A KR 20120108040 A KR20120108040 A KR 20120108040A
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백광산업 주식회사
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Abstract

본 발명은 아스파테이트 유래 아미노산 및 그의 전구체, 특히 L-라이신의 생산에 재조합 미생물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 초기 미생물과 대비하여, 개선된 아스파테이트-유래 아미노산 합성 활성을 갖는 재조합 미생물 및 상기 아미노산, 전구체 및 유도체의 생산, 특히 L-라이신 합성에서의 상기 미생물의 용도에 관한 것이다.

Description

미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법{PRODUCTION PROCESS FOR AMINO ACIDS OF THE ASPARTATE FAMILY USING MICROORGANISMS}
본 발명은 재조합 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산, 특히 L-라이신 및 그의 전구체의 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 초기 미생물과 비교하여 아스파테이트 계열 아미노산의 합성에 참여한 변형 경로를 갖는 재조합형 미생물 및 상기 미생물의 아스파테이트 계열 아미노산, 특히 L-라이신 및 전구체 생산에 있어서의 용도에 관한 것이다.
아미노산 및 그의 유도체는 약학 산업에서 중요한 전구체이며 다양한 음식 및 사료에 보충제로 첨가된다. 글루타메이트, 라이신 및 트레오닌과 같은 몇 아미노산은 그들의 자연 생합성 경로(natural biosynthetic pathways)를 이용하여 생산된다. 자연 아미노산 생합성에서 아미노산 아스파테이트는 라이신, 트레오닌, 이소류신 및 메티오닌과 같은 다른 아미노산의 생산에서 전구체 역할을 한다.
900,000 t/a의 시계 시장에서, 필수 아미노산 L-라이신은 가장 중요한 생명공학 발효산물 중 하나이다(Kohl and Tauch, 2009). 이는 주로 동물 사료에 보충제로 사용된다(Anastassiadis, 2007). 이러한 사료 물질을 라이신이 풍부한 소스로 보충하는 것은 예를 들어 돼지 또는 닭의 최적화된 성장을 야기한다. 지난 수십년 간 흰살 고기 섭취의 계속적인 증가는 라이신의 요구를 증가시켰다.
라이신은 예를 들어 발효 방법으로 생산될 수 있다. 이 목적을 위하여, C.글루타미쿰과 같은 특정 미생물이 특별히 적합하다는 것이 밝혀졌다. 아미노산의 산업적 생산 기술로서의 발효는 글루타메이트를 분비하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 발견으로 알려졌다. 상기 발견의 몇 년 후, 라이신을 분비하는 C.글루타미쿰의 돌연변이체가 최초로 라이신 대규모 생산에 적용되었다(Kinoshita, et al., 1961). 균주 변형 뿐만 아니라 발효 절차의 최적화, 다운스트림 공정을 포함한 고효율 발효를 확립하기 위한 새 기술을 찾는 연구가 계속되고 있다.
종래에는 자외선 또는 화학적 돌연변이유발원 및 차후의 균주 선별을 이용한 무작위 돌연변이 생성의 반복적 접근에 의해 균주를 변형하였다. 오늘날 성공의 핵심은 S-(2-아미노에틸)시스테인과 같은 독성의 라이신 유사체를 사용하여 피드백 내성 균주를 선별하는 것이었다 (Nakayama and Araki, 1973). 이러한 종래의 균주는 전형적으로 라이신 및 트레오닌에 의해 피드백 제어(feedback inhibition)로부터 해제된 아스파토키나아제 유전자에서의 점 돌연변이를 공유하였다(Kalinowski, et al., 1991; Thierbach, et al., 1990). 이러한 종래의 방법으로 유도된 균주를 이용하여 50%까지의 전환률 및 100g L-1의 라이신·Cl 역가와 같은 놀라운 생산 특성이 달성되었다(Leuchtenberger, et al., 2005). 그러나 이는 생산성을 제한하는, 전형적으로 2-3일이 걸리는 오랜 발효 시간과 연결되어 있다. 또한, 균주 발달 동안 축적한 원치 않은 돌연변이로 인한 영양요구성 및 약한 내스트레스성(Ohnishi, et al., 2002)은 종래의 생산균주의 심각한 단점을 더 보여준다. 근년에, 재조합형 DNA 기술 및 분자생물학이 대사공학에 의한 균주공학-합리적인 최적화의 새 시대를 열었다(Ikeda, et al., 2006). 이러한 연구 중 많은 연구가 라이신 생합성 경로의 효소를 직접적으로 변형하는 것에 의한 라이신 생합성 플럭스의 최적화에 초점을 맞추었다. 아스파테이트 키나아제의 피드백 제어에 대한 해제는 오늘날 산업적 생산균주의 가장 중요한 요소로 간주된다. 경로 조절과 관련된 변형 이외에, 생합성 경로의 속도를 결정하는 효소의 세포내 활성이 균주 변형의 키포인트이다. 세포 내의 효소활성을 증가시키는 전략은 더 강한 프로모터(promoter)의 사용에 의한 과발현, 프로모터 시퀀스 또는 유전자의 상류 조절 부위의 돌연변이화 또는 코딩하는 유전자의 복제 개수의 증가를 포함한다. 이와 관련하여 플라스미드 관련 과발현은 보다 높은 효소활성 및 보다 나은 라이신 수율을 달성하기에 적절하지만 (Eggeling, et al., 1998) 산업적 생산에는 거의 적용될 수 없다.
생합성 경로 자체를 제외한 이로운 표적의 인지는 경쟁력 있는 생산균주의 생산을 위한 보조인자 공급 및 전구체 내의 병목 현상을 없애기 위하여 필요하게 되었다. 그러나 이는 시스템 수준의 미생물에 대한 이해를 요구하기 때문에 더 어렵다. 이 점과 관련하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 시퀀스의 이용가능성이 대사공학의 중요한 단계가 되었다 (Haberhauer, et al., 2001; Kalinowski, et al., 2003; Ohnishi, et al., 2002; Pompejus, et al., 2002). 그것은 i)종래의 방식으로 유도된 생산균주와 야생형(wild type)의 비교 시퀀스 분석에 의한 게놈 배양(Ohnishi, et al., 2002), ii)관련된 대사경로(Kromer, et al., 2006; Wittmann and Becker, 2007) 뿐만 아니라 이론적 생산용량을 분석하기 위한 화학량론의 모델링 접근을 포함하는 C.글루타미쿰의 대사 네트워크의 상세한 인 실리코(in silico) 재구성 (Kjeldsen and Nielsen, 2009), iii)게놈 내의 특정 시퀀스 모티브를 이용한 전사 조절 네트워크의 발견(Kohl and Tauch, 2009)의 기초를 제공하였다. 그러나, 상기 모델은 균주 변형을 이해하는 시스템의 주요 특성으로서 인비보 (in vivo) 대사경로의 활성 즉, 흐름체(fluxome)를 예측하기에는 적용가능하지 않다. 인비보 대사 플럭스를 측정하기 위한 인상적인 발전에 의해 언급되었듯이 (Christensen and Nielsen, 2000; Christensen, et al., 2000; Frick and Wittmann, 2005; Van Dien, et al., 2006; Wittmann, 2007; Wittmann and Heinzle, 2002), 플럭스 분석(flux analysis)은 대사공학의 중요 요소이다 (Stephanopoulos, 1999). 생물학적 시스템에 대한 이해를 넘어서, 13C 대사 플럭스 분석은 균주 특성화 및 라이신 생산의 이로운 표적의 식별에 유용한 것으로 밝혀졌다(Kiefer, et al., 2004; Wittmann and Heinzle, 2002). 전체적 수준의 세포 생리학적 통찰을 얻기 위해 활성 유전자 세트(전사체:transcriptome)(Hayashi, et al., 2005) 및 활성 단백질 세트(프로테옴:proteome)(Bendt, et al., 2003)의 측정 및 세포내 대사산물 레벨의 수량화(메타볼롬:metabolome)(Borner, et al., 2007)로부터의 보완적인 결과와 함께 광범위한 데이터 세트가 제공된다. 상기 시스템-위주 접근은 대사공학의 훌륭한 플랫폼을 보여준다(Lee, et al., 2005).
주요 라이신 생산 미생물인 코리네박테리움 글루타미쿰은 1950년대에 일본의 큰 스크리닝 프로그램에서 발견되었다. 균주는 무작위 돌연변이 생성의 반복 공정 및 개선된 생산 특성의 스크리닝을 이용하여 성공적으로 라이신 생산에 최적화되었다. 이는 효율적 생산균주를 야기하였으나, 성장을 손상시키고, 약한 내스트레스성 또는 증가된 영양요구성을 야기하는 돌연변이의 부작용의 축적을 초래하였다. 따라서, 현재 수득된 생산성은 C.글루타미쿰에 대해 이론적으로 예측했던 것보다 훨씬 낮다. 분자생물학 및 시스템-위주의 대사 분석 도구 및 세포의 제어 상태분석 도구의 발전은 균주 변형을 보다 정확하고 표적화된 최적화-시스템 대사공학이 되게 한다. 이는 증가된 생산률, 역가 및 생산성을 내는 독점적인 이로운 변형 세트를 갖는 우수한 고생산균주를 목표로 한다.
이제까지 미생물을 이용하여 L-라이신의 생산을 증가시키기 위한 다양한 노력이 있었다. 예를 들어 메티오닌 또는 라이신의 생합성에 관련된 유전자 발현을 상향조절 및/또는 탈조절하여 메티오닌 또는 라이신의 생산을 증가시키기 위한 노력은 예를 들어 WO 02/10209, WO 2006/008097 및 WO 2005/059093에 나타나 있다.
C.글루타미쿰에서 이전에 발견된 중앙 이화 네트워크(central catabolic network)는 글리콜리시스 경로, 펜토스 포스페이트 경로(pentose phosphate pathway, PPP), 트리카르복실산 회로(tricarboxylic acid cycle) 및 글리옥실산 션트(glyoxylate shunt)를 포함한다.
WO 03/042389는 G6PD 유전자(zwf)가 도입되거나 G6PD 유전자가 변형된 유전자 변형 미생물 및 상기 미생물의 관심 화합물, 예를 들어 아미노산, 특히 바람직하게는 라이신 생산에의 용도에 관한 것이다.
WO 0220542는 특히, 원하는 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사경로가 적어도 부분적으로 제거된 대사경로가 사용된, 예를 들어 강화 gap2 유전자를 이용한, L-아미노산, 특히 L-라이신의 발효 생산 공정에 관한 것이다. 변형 가능한 추가의 유전자의 긴 목록도 개시되었다.
EP 0435132는 재조합형 DNA를 함유하며 아미노산, 특히 L-라이신의 수득에 적합한 코리네박테리움 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 미생물을 개시하고 있다. DNA 시퀀스는 특히 L-라이신 생산 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속 균주로부터, 바람직하게는 감소된 아스파테이트 키나아제 피드백 저해를 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 돌연변이 생성으로 수득된 돌연변이체로부터 유도된다.
EP 1067193은 추가 유전자 dapA(dihydropicolinate synthase: 디하이드로디피콜리네이트 신타아제), lysC(아스파테이트 키나아제), lysE(lysine exporter-carrier: 라이신 익스포터-담체) 및/또는 dapB(dihydropicolinate reductase: 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제) 중 적어도 하나가 증폭된, 바람직하게는 과발현된 증폭 pyc (pyruvate carboxylase:피루베이트 카르복실라제) 유전자를 갖는 L-라이신 생산 코리네형 박테리움(A)을 개시하고 있다.
EP 0854189는 L-라이신 및 L-트레오닌에 의한 피드백 저해가 실질적으로 탈민감화된 아스파테이트 키나아제를 포함하며, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 강화 DNA 시퀀스, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 강화 DNA 시퀀스, 디하이드로디피콜리네이트 신타아제를 코딩하는 증가된 DNA 시퀀스, 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제를 코딩하는 증가된 DNA 시퀀스 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 강화 DNA 시퀀스를 포함하는 코리네형 박테리움을 개시하고 있다.
EP 0857784는 L-라이신 등에 의한 피드백 저해가 없으며 디아미노피멜산 탈카르복실라제 유전자를 함유하며, 코리네형 박테리움의 L-라이신 생산 능력이 개선된 DNA에 관한 것이다.
WO/2007/017526은 강화된 이소시트레이트 리아제 및/또는 말레이트 신타아제 발현을 갖는 미생물을 이용한 라이신, 트레오닌, 이소류신, 메티오닌, 또는 호모세린과 같은 아스파테이트 및 유도된 아미노산의 생산방법을 개시하고 있다.
본 발명의 주 목적은 합리적인 균주 변형에 의한 라이신 생산의 최적화였다. 주형 미생물로서 코리네박테리움 글루타미쿰을 시스템 지향적 접근에 이용하였다. 원료 비용이 산업적 라이신 생산비용의 주 비용이므로, 균주 최적화는 라이신 수율, 역가 및 생산성의 증가를 목표로 하였다. 중심 전략은 C.글루타미쿰의 대사 및 조절 상태를 해제하는 시스템 지향 단계의 최첨단 기술을 목표로 하였고 최적의 생산 성과를 위한 유전자 표적을 찾기 위하여 수득된 지식을 사용한다. C.글루타미쿰에서 라이신 생합성은 탄소 전구체 및 환원력으로서 NADPH의 요구를 통한 중추대사(central metabolism)와 밀접한 연관이 있다. 이 때문에 본 연구는 균주 최적화의 유망한 표적으로서 중추 대사경로의 반응을 포함하였다. 전략은 주로 NADPH 대사, TCA 회로, 라이신 생합성 뿐만 아니라 옥살로아세테이트의 공급의 변형에 초점을 맞추었다. 첫째로, 향상된 라이신 생산을 위한 몇 변형 전략의 가치를 라이신 생산균주에 있어서의 목표 산정에 의해 조사하였다. (i)세포 생리학에 대한 높은 식견을 얻기 위하여 (ii)산업적 적용에 대하여 적용된 전략의 이득을 측정하기 위하여 및 (iii)생산균주의 합리적인 디자인을 위한 가치 있는 정보를 제공하기 위하여 전사체, 대사체 및 흐름체 단계뿐만 아니라, 비교 배양실험을 통하여 독창적인 균주를 자세히 조사하였다.
또한, 본 발명에 따른 생합성 경로, 특히 NADPH 대사의 변형, TCA 회로, 미생물에의 옥살로아세테이트의 공급의 변형은 L-라이신의 생산을 위해서 중요할 뿐만 아니라, 아스파테이트 계열의 다른 아미노산 및 그 전구체의 생산에도 관련이 있다. 따라서, 메티오닌, 트레오닌 또는 이소류신과 같은 아스파테이트 유도 아미노산계의 추가 멤버들도 본 명세서에 제공된 정보를 고려하여 생산될 수 있다.
하기의 발명에 대한 설명에서 더 상세히 설명할 상기 및 다른 목적들은 본 발명의 독립항에서 설명되듯이 본 발명에 의해 달성될 것이다. 종속항은 바람직한 실시예에 관한 것이다.
본 발명은 특히 아미노산 유도 아스파테이트를 고생산하는 미생물, 바람직하게는 야생형의 C. 글루타미쿰 기반의 라이신 고생산 미생물 균주 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 이러한 균주는 본 명세서에 명시된 유익한 변형에 의해 수득되었다. 맞춤형 세포 공장(tailor-made cell factory)은 높은 공간-시간 수율(space-time yield), 높은 최종 라이신 역가, 좋은 생장 거동 뿐만 아니라 높은 탄소 전환률을 갖고, 바람직하게는 또한 부산물 형성이 감소한다. 상기 생산 특징은 공급된 기질의 신속하고 효율적인 전환을 보장하며 따라서 라이신의 비용 효율적인 생산을 보장한다.
또한, 아스파테이트 유도 아미노산, 바람직하게는 L-라이신의 생산은 유전자 변형된 미생물, 바람직하게는 코리네박테리움, 보다 바람직하게는 C. 글루타미쿰을 이용하여 개선된다.
아스파테이트 유도 아미노산의 바람직한 생산방법, 보다 바람직하게는 L-라이신의 생산방법에서, 예를 들어 변형된 라이신 생합성 및 변형된 라이신 전구체의 공급을 갖는 미생물을 사용하였다. 바람직하게는, 상기 미생물은 재조합형 미생물이다. 특히 바람직한 실시예에서, 상기 미생물은 변형되었을 수 있다. 예를 들어, 글루코스 6-인산디하이드로게나제 유전자 및 효소활성이 증가하였을 수 있다. 보다 바람직하게는, 변형된 글루코스 6-인산디하이드로게나제 유전자(zwf)는 변형된 프로모터, 바람직하게는 zwf-유전자의 야생형 프로모터의 이종으로의 치환, 즉 비자연형 프로모터(non-natural promoter), 보다 바람직하게는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sod)의 프로모터를 포함한다. 상기 비자연형 프로모터는 같은 유기체로부터 유도될 수 있지만, 다른 유전자 또는 다른 종으로부터는 유도될 수 없다. 보다 더 바람직하게는, 상기 미생물은 또한 zwf 유전자에서의 점 돌연변이 A243T를 포함한다. 추가의 바람직한 실시예에서, 상기 미생물은 tkt-오페론의 야생형 프로모터가 이종 프로모터에 의해, 바람직하게는 sod-프로모터에 의해 치환되어(replaced) 각각 글루코스 6-인산디하이드로게나제 유전자 및 효소의 증가된 활성을 야기하는, 변형된 tkt-오페론을 포함한다. 또한, 강한 sod-프로모터를 이용하여, zwf-유전자는 그 중에서도 트랜스케톨라제-유전자(tkt), 트랜스알돌라제(tal)를 코딩하는 유전자 및 zwf를 포함하는 tkt-오페론의 과발현에 의해 과발현될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 미생물은 프럭토스 1,6-비스포스파타아제 유전자 및 효소(fbp)의 증가된 활성을 더 갖는다. 상기 목적은 상기 변형 뿐만 아니라 강한 이종 프로모터 예를 들어, sod-프로모터 또는, 바람직하게는, 원래의 프로모터를 치환하는 eftu-프로모터를 포함하는 미생물에 의해서 달성된다.
또한, 상기 미생물은 바람직하게는 원래의 ATG 개시코돈의 GTG 개시코돈으로의 치환을 통한 감쇠된 이소시트레이트 디하이드로게나제 유전자(icd) 및 그에 따른 감소된 효소활성을 더 포함하는 것이 바람직하다.
보다 더 바람직한 실시예에서, 상기 미생물은 증가된 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 유전자 및 효소활성을 더 갖는다. 이는 예를 들어, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제(ddh)를 코딩하는 당해 유전자의 과발현으로 달성될 수 있다. 보다 바람직하게는, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제는 적어도 하나의 ddh-유전자의 추가 카피를 포함하는 미생물에 의해 과발현된다.
또한, 상기 미생물이 상기 변형 뿐만 아니라 바람직하게는 아미노산 교환 T311I를 통한 증가된 유전자 및 효소활성을 갖는 변형된 아스파테이트 키나아제(lysC)를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 실시예는 상술한 변형 뿐만 아니라 (i) 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제(dapB), 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제(lysA)의 과발현, (ii) 아미노산 교환 V59A를 포함하는 돌연변이체의 도입에 의한 호모세린 디하이드로게나제의 변형, (iii) 피루베이트 카르복실라제의 과발현 및 변형, 및 (iv) PEP 카르복시키나아제의 결실 중 적어도 하나의 변형을 포함하는 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법에서 바람직하게 사용되는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰, 바람직하게는 C.글루미타미컴 ATCC13032의 유도체, 보다 바람직하게는 2010년 5월 11일 독일에서의 부다페스트 조약(Budapest Treaty at the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ))에 따라 기탁된, 기탁 번호가 DSM 23586인 미생물이다.
본 발명에 따르면, 상기 독창적 미생물은 아스파테이트 유도 아미노산, 바람직하게는 L-라이신을 생산하는 방법에 사용하기 적합하다. 본 발명의 또 다른 바람직한 측면은 하기의 상세한 설명 및 실시예에서 알 수 있다.
생산방법에 사용된 세포는 원핵생물, 하등 진핵생물, 고립된 식물세포, 이스트균, 고립된 곤충세포 또는 고립된 포유동물세포, 특히 세포배양 시스템 내의 세포일 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "미생물"은 상기 종류의 세포에 사용된다. 본 발명을 수행하는 데 있어 바람직한 종류의 미생물은 코리네박테리움이고 특히 바람직하게는 C.글루타미쿰이다.
도 1: 오픈리딩프레임(ORF)의 시퀀스의 부분적 결실에 의한 유전자 결실의 예를 보여주는 삽입-구축용 PCR 전략. 세 PCR 단계에서 부위-특이성 프라이머(예를 들어 P1, P2, P3 및 P4로 지칭된 것들)를 이용하여 두개의 분리된 DNA 단편을 융합하였다.
도 2: 선별마커 KanR 및 sacB, E.coli를 위한 ORI 및 멀티플 클로닝 사이트를 갖는 통합적 형질전환 벡터 pClik.
도 3: 각각 세 생물학적 복제로부터의 C.글루타미쿰 BS1 (폐쇄 마름모꼴), C.글루타미쿰 BS 87 (폐쇄 원) 및 C.글루타미쿰 BS 205 (개방 원)의 흡광도(OD660, Libra S11)와 세포 건량의 상관관계.
도 4: 단일 탄소원로서 글루코스를 이용한 표준 최소배지에서의 C.글루타미쿰 BS1(lysCT311I)의 배양 동안의 배양 프로필(A) 및 배양 및 생산 특성(B). 바이오매스의 형성과 글루코스의 소비의 선형 상관관계 및 라이신의 형성 및 글루코스의 소비의 선형 상관관계는 각각 대사 정상상태를 나타낸다.
도 5: [1-13C] 글루코스에서 생장한 C.글루타미쿰 BS 13의 동위원소 정상상태(A) 및 [U-13C] 글루코스와 자연적으로 표지된 글루코스(B)의 등몰 혼합물에서 생장한 C.글루타미쿰 BS 13의 동위원소 정상상태의 증명. 아미노산의 라벨 패턴은 배양 동안 다른 세포 건량(CDM) 농도에서 측정되었다. 여기서 예로 보여지는 아미노산은 대사 네크워크의 다른 부분에서 기인하며 알라닌 (폐쇄 사각형), 페닐알라닌 (개방 사각형), 발린 (폐쇄 원), 글리신 (개방 원), 글루타메이트 (폐쇄 삼각형), 트레오닌 (개방 삼각형) 및 세린 (폐쇄 마름모꼴)을 포함한다. M0(라벨되지 않음), M1(단일 라벨됨), M2(이중 라벨됨)는 당해 매스 이소토포머의 상대적 비율을 나타낸다.
도 6: [U-13C] 글루코스와 자연적으로 표지된 글루코스의 동몰 혼합물을 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰의 피루베이트 노드에서의 플럭스 매개변수 수량화를 위한 실험 계획. 다양한 ΦPEPC에 따른 아스파테이트(m/z 418)의 매스 이소토포머 분포(mass isotopomer distribution)의 상대적 변화, 다양한ζPEPC/PEPCK에 따른 발린(m/z 288)의 매스 이소토포머 분포의 상대적 변화, 다양한ζPC/MalE에 따른 알라닌(m/z 260)의 매스 이소토포머 분포의 상대적 변화.
도 7: C.글루타미쿰 BS 1의 99% [1-13C] 글루코스 및 50 % [U-13C] 글루코스 상의 배양 동안의 세포 단백질의 아미노산 및 분비된 트레할로오스의 실험적으로 측정된 매스 이소토포머 분율(mass isotopomer fractions)과 모의의 매스 이소토포머 분율의 상관관계. 상기 데이터는 실험한 GC-MS 데이터 및 최적화된 플럭스 세트에 해당하는 수학 모델의 해법에 의해 예측된 수치를 포함한다.
도 8: 글루코스에서 배양되는 동안 라이신-생산 C.글루타미쿰 BS 1의 피루베이트 노드에서의 탄소 플럭스 분포. 모든 플럭스는 100%로 설정된 비 글루코스 소비속도 qGlc = 4.6 mmol g-1 h-1의 몰 퍼센트로서 주어진다. 오차는 Monte-Carlo 분석으로 수득된 다른 플럭스의 해당하는 90% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 9: 뉴클레오티드 교환의 후보자로서의 제 2 재조합 이벤트로부터의 여섯 개의 돌연변이체 및 C.글루타미쿰 BS87의 조 세포추출물 상태의 이소시트레이트 디하이드로게나제(ICD), 포스포글루코이소머라제(PGI), 피루베이트 디하이드로게나제(PDH) 및 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(G6PDH)의 비활성. 데이터는 복합 배지에서 배양된 세포의 단일 측정을 나타낸다.
도 10: 균주 C.글루타미쿰 ATCC 13032, BS1 (lysC T311I), BS5 (Psod zwf) 및 BS6 (Psod zwf A243T) 에서의 G6P 디하이드로게나제의 인비트로 비활성(A); 억제제로서의 NADPH의 첨가에 따른 야생형 및 A243T 변종의 인비트로 비활성[%](B). 데이터는 탄소원으로서 글루코스를 갖는 최소배지에서 배양된 세포로부터의 세개의 다른 세포추출물의 측정값의 평균값 및 당해 편차를 나타낸다.
도 11: [1-13C] 글루코스에서 배양된 C.글루타미쿰 BS1, C.글루타미쿰 BS5, C.글루타미쿰 BS6 및 C.글루타미쿰 BS7(위에서부터 아래로)의 세포내 플럭스 및 당해 90% 신뢰 구간. 데이터는 글루코스 흡수율로 정상화된 상대값(%)으로 주어졌다(표 15). 참고 균주 C.글루타미쿰 BS1의 상기 플럭스 데이터는 Becker, et al., 2005에서 발췌하였다.
도 12: 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sod)의 프로모터에 의한 tkt-오페론의 과발현에 따른 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(A), 트랜스알돌라제(B) 및 트랜스케놀라제(C)의 비활성.
도 13: 각각 글루코스 또는 프럭토스에서 배양된 C. 글루타미쿰 WT, C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I) 및 C. 글루타미쿰 BS6 (Psod zwf A243T)의 조 세포추출물에서의 말산 효소의 비활성. 3중으로 측정되었고 당해 편차가 주어졌다.
도 14: 글루코스 상 회분배양 동안의 C.글루타미쿰의 다른 라이신 생산균주의 생산 특성. 수율은 각각 전체 배양시간 동안의 바이오매스 또는 라이신 형성과 기질소비 사이의 선형 최적합(linear best fit)의 경사로서 측정되었다. 수율은 세개의 생물학적 복제로부터 측정되었다.
도 15: PPP, 이소시트레이트 디하이드로게나제 및 말산 효소를 NADPH 제공 반응으로 간주하고 바이오매스 형성 및 라이신 분비를 NADPH 소비 반응으로 간주한 인비보 플럭스로부터 계산된 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)의 NADPH 밸런스.
도 16: C. 글루타미쿰 ATCC 13032 (삼각형), C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I) (사각형) 및 C. 글루타미쿰 BS6 (Psod zwf A243T) (원)에서의 NADPH/NADP 비율과 말산 효소 비활성의 상관관계.
도 17: 단일 탄소원으로 글루코스를 사용하여 표준 최소배지에서 배양된 C. 글루타미쿰 BS1(줄무늬 칼럼) 및 C. 글루타미쿰 BS222(회색 칼럼)의 조 세포추출물에서의 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 비활성.
도 18: 다양한 황산 암모늄 농도에서의 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I) 의 비생장률.
도 19: 최소배지에서 다양한 황산 암모늄 농도에서 배양된 C. 글루타미쿰 BS222의 라이신 수율.
도 20: C. 글루타미쿰 BS1 및 C. 글루타미쿰 BS222의 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 황산 암모늄 농도 각각 2 g L-1 및 15 g L-1 에서의 비활성.
도 21: 글루코스에서의 회분배양의 라이신-생산 C. 글루타미쿰 BS1의 정량적 생리학적 특성 (A, B) 및 그의 pyk 결실 유도체 BS13 (C, D)의 정량적 생리학적 특성. 라이신 및 디하이드록시아세톤(DHA)의 생장, 생산량의 글루코스 소비와의 선형 상관관계는 배양 동안 대사 정상상태를 나타낸다.
도 22: 글루코스에서의 생장 동안 라이신-생산 C. 글루타미쿰 BS1의 중추대사에서의 인비보 탄소 플럭스 분포 (위) 및 그의 피루베이트 키나아제 결핍 유도체 C.글루타미쿰 BS13의 중추대사에서의 인비보 탄소 플럭스 분포 (아래). 모든 플럭스는 100%로 설정된 평균 비 글루코스 소비속도의 몰 퍼센트 qGlc = 4.6 mmol g-1 h-1 (BS1) 및 4.5 mmol g-1h-1 (BS13)로서 주어졌다. 대사 가역반응에 대해서는 플럭스 가역성이 괄호 안에 추가적으로 주어지고 순 플럭스의 방향이 화살표로 나타난다.
도 23: 글루코스에서 배양된 라이신-생산 C. 글루타미쿰 BS1의 피루베이트 노드에서의 탄소 순 플럭스 분배 (A) 및 그의 피루베이트키나아제 결핍 유도체 C. 글루타미쿰 BS13의 피루베이트 노드에서의 탄소 순 플럭스 분배(B). 실제 플럭스 값은 당해 화살표의 두께로 나타낸다.
도 24: C. 글루타미쿰 BS1의 NADPH 밸런스 (왼쪽) 및 그의 피루베이트 키나아제 결핍 유도체 C. 글루타미쿰 BS13 의 NADPH 밸런스 (오른쪽).
도 25: 모균주 C. 글루타미쿰 BS87, 감소한 PDH 비활성을 갖는 제 2 재조합 이벤트의 두 돌연변이체 및 균주 구축에 사용된 형질전환 벡터의 시퀀스 배열로부터의 개시코돈 부위의 발췌.
도 26: 글루코스-배양 C. 글루타미쿰 BS87에서의 피루베이트 디하이드로게나제의 비효소활성 (줄무늬 칼럼) 및 그의 aceE att 유도체 C. 글루타미쿰 BS238 에서의 피루베이트 디하이드로게나제의 비효소활성(흰색 칼럼). 회색 칼럼은 일련의 회분에서의 영구 생장의 50 세대 후의 개시코돈 돌연변이체의 비효소활성을 나타낸다. 값은 3중으로 측정되었고 당해 편차는 에러 바에 의해 나타낸다.
도 27: 세개의 생물학적 복제로부터의 최소배지에서 측정된 C. 글루타미쿰 BS87의 라이신 및 바이오매스 수율 (줄무늬 칼럼) 및 C. 글루타미쿰 BS238 의 라이신 및 바이오매스 수율 (회색 칼럼). 당해 편차가 주어졌다. 수율은 생산물 형성 및 기질소비 사이의 선형 최적합의 경사로서 측정되었다.
도 28: C. 글루타미쿰 BS87의 icd 유전자, icd 유전자의 개시코돈 교환을 위한 형질전환 벡터 및 제 2 재조합 이벤트로부터의 4개의 클론의 개시코돈 부위의 배열.
도 29: 단일 탄소원로서 글루코스를 사용하여 최소배지에서 배양한 C. 글루타미쿰 BS87의 조 세포추출물에서의 이소시트레이트 디하이드로게나제의 비활성 (줄무늬 칼럼) 및 C. 글루타미쿰 BS205 (icd att)의 조 세포추출물에서의 이소시트레이트 디하이드로게나제의 비활성 (흰색 칼럼). 회색 칼럼은 일련의 회분에서의 50 세대의 생장 후의 개시코돈 돌연변이체(icd att)의 ICD 비활성을 나타낸다. 데이터는 세 병행의 평균값 및 당해 편차를 나타낸다.
도 30: 글루코스에서의 회분배양 동안의 라이신-생산 C. 글루타미쿰 BS87의 생장 및 생산 특성 (A, B) 및 C. 글루타미쿰 BS205 (icd att )의 생장 및 생산 특성 (C, D). 바이오매스와 글루코스 소비의 선형 상관관계 및 라이신 생산과 글루코스 소비의 선형 상관관계는 각각 배양 동안 대사 정상상태를 나타낸다. 주어진 데이터는 세 생물학적 복제로부터의 값을 나타낸다.
도 31: 글루코스-배양 C.　글루타미쿰 BS87 및 C. 글루타미쿰 BS205 (icd att )의 TCA 회로a 및 피루베이트 카르복실라제b 를 통한 인비보 플럭스. 오차는 Monte-Carlo 분석으로 수득된 90% 신뢰 구간을 나타낸다.
a 시트레이트 신타아제를 통한 도입 플럭스로 주어짐.
b 동화작용의 카르복시화를 통한 럽프트 순 플럭스로 주어짐.
도 32: 경로 공학에 의한 맞춤형 라이신 고생산균주의 구축 및 설계. 변형은 균주 C. 글루타미쿰 BS1 (개방 마름모꼴), C. 글루타미쿰 BS222 (폐쇄 마름모꼴), C. 글루타미쿰 BS87 (폐쇄 사각형), C. 글루타미쿰 205 (개방 사각형), C. 글루타미쿰 BS242 (폐쇄 원) 및 C. 글루타미쿰 244 (개방 원)를 생산하도록 연속적으로 구현된 lysC T311I (1), 2 ×ddh (2), Δpck (3), Psod dapB (4), 2 ×lysA (5), Psod lysC T311I (6), hom V59A (7), pyc P458S (8), Psod pyc P458S (9), icd att (10), Peftu fbp (11) 및 Psod tkt (12)을 포함한다.
도 33: 단일 탄소원로서 글루코스를 이용하여 15 g L-1의 황산 암모늄의 최소배지의 쉐이크 플라스크에서 실험된 야생형 기반 라이신 생산원의 계보의 라이신 수율. 데이터는 세 생물학적 복제의 평균값 및 당해 편차를 나타낸다. 도시된 균주는 C. 글루타미쿰 WT (ATCC 13032), C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I) (1), C. 글루타미쿰 BS222 (ddh) (2), C. 글루타미쿰 BS87 (9), C. 글루타미쿰 BS205 (icd att) (10), C. 글루타미쿰 BS242 (P eftu fbp) (11) 및 C. 글루타미쿰 BS244 (P sod tkt) (12)이다.
도 34: 당밀 기반 복합 배지에서 유가(fed-batch) 발효 동안의 라이신 생산 C. 글루타미쿰 BS244의 배양 프로필. 설탕 농도는 각각 글루코스, 프럭토스 및 슈크로스의 집중 농도로 주어진다.
도 35: 유가 발효 동안의 C. 글루타미쿰 BS244의 이상(two-phase) 라이신 생산 특성. 총 라이신 생산량은 총 당소비에 대하여 그래프로 나타냈다.
C. 글루타미쿰 의 효소 및 유전자
표 1에 본 발명과 관련된 C.글루타미쿰의 효소 및 유전자를 KEGG 데이터베이스에 따른 당해 EC 번호 및 체계적인 유전자 이름과 함께 나타낸다.
펜토스 포스페이트 경로
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 1.1.1.49 zwf NCgl1514
트랜스알돌라제 2.2.1.2 tal NCgl1513
트랜스케톨라제 2.2.1.1 tkt NCgl1512
글리콜리시스/글루코스신생합성
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
프럭토스 1,6-비스포스파타아제 3.1.3.11 fbp NCgl0976
포스포글루코이소머라제 5.3.1.9 pgi NCgl0851
피루베이트 디하이드로게나제 (서브유닛 1) 1.2.4.1 aceE NCgl2167
피루베이트 키나아제 2.7.1.40 pyk NCgl2008
TCA 회로/보충반응
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
이소시트레이트 디하이드로게나제 1.1.1.42 icd NCgl0634
말산 효소 1.1.1.40 malE (mez) NCgl2904
PEP 카르복시키나아제 4.1.1.32 pck NCgl2765
피루베이트 카르복실라제 6.4.1.1 pyc NCgl0659
아미노산 합성
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
아스파토키나아제 2.7.2.4 lysC NCgl0247
디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 1.4.1.16 ddh NCgl2528
디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 1.3.1.26 dapB NCgl1898
호모세린 디하이드로게나제 1.1.1.3 hom NCgl1136
표 1: KEGG 데이터베이스의 효소 코드 및 유전자 명명법에 따른 C. 글루타미쿰의 효소 및 유전자의 체계적 특성.
본 명세서에서 단수형의 "a" 및 "an"의 사용은 별도의 언급이 없는 한 각 복수형 또한 포함한다. 따라서, 용어 "미생물(a microorganism)"은 같은 종류의 미생물을 하나 이상, 즉 두개, 세개, 네 개, 다섯 개 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서의 수치 또는 파라미터의 범위와 함께 쓰인 "약"이라는 표현은 당업자가 어떤 특징의 기술적 효과를 보장한다고 이해할 정확도의 구간을 나타낸다. 상기 표현은 전형적으로 제시된 수치에서 +/- 10%, 바람직하게는 +/- 5%의 편차를 의미한다.
본 발명의 목적에 있어서 용어 "숙주세포"는 예를 들어 폴리펩타이드 또는 정제 화학 제품의 생산을 위한 뉴클레오티드 배열의 발현에 흔히 사용되는 분리 세포를 말한다. 특히 "숙주세포"는 원핵생물, 하등 진핵생물, 식물세포, 이스트균, 곤충세포 또는 포유동물세포배양 시스템에 관한 것이다.
용어 "미생물"은 원핵생물, 하등 진핵생물, 단리된 식물세포, 이스트균, 단리된 곤충세포 또는 단리된 포유동물세포, 특히 세포배양시스템 내의 세포에 관한 것이다. 본 발명을 수행하는 데 적합한 미생물은 S. pombe 또는 S. cerevisiae 및 Pichia pastoris와 같은 이스트를 포함한다. 포유동물세포배양 시스템은 예를 들어 NIH T3 세포, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, Jurkat 세포 및 HeLa 세포를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에서 미생물은 바람직하게는 원핵생물 또는 이스트균이다. 본 명세서에서의 바람직한 미생물은 하기의 발명에 대한 자세한 설명에서 명시될 것이다. 특히 바람직한 미생물은 C. 글루타미쿰 및 그 유도체와 같은 코리네박테리움이다.
용어 "자연형(native)"은 "야생형" 및 "자연적으로 발생하는"과 같은 뜻이다. "야생형" 미생물은 별도의 언급이 없는 한 언급된 미생물의 보통의 자연적으로 발생하는 형태이다. 일반적으로, 야생형 미생물은 재조합형 미생물이 아니다.
"초기의(initial)"는 "개시하는(starting)"과 같은 뜻이다. "초기의" 뉴클레오티드 배열 또는 효소활성은 그의 변형, 예를 들어 돌연변이 또는 억제제의 첨가에 의한 변형의 개시점이다. "초기의" 시퀀스, 효소 또는 미생물은 그 "최종의" 또는 "변형된" 상대가 지니고 있고 특정 문맥에 언급되어 있는 변별적 특징이 부족하다. 본 명세서에서 "초기의"라는 표현은 "자연의" 라는 표현을 포함하고 바람직한 측면에서는 "자연의"와 동의어이다.
야생형 또는 돌연변이(재조합이 아닌 돌연변이체 또는 재조합 돌연변이체) 미생물은 재조합이 아닌 방법 (예를 들어 특정 효소 억제제의 첨가) 또는 재조합의 방법에 의해 더 변형되어 적어도 하나의 물리적 또는 화학적 특성에 있어서 초기의 미생물과 달라지게 할 수 있다.
본 명세서에서 초기의, 변형되지 않은 미생물을 "초기 미생물" 또는 "초기 (미생물) 균주"로 지정한다.
주어진 활성 레벨의 초기 균주와 비교하여 미생물의 선별된 유전자 또는 효소의 활성의 변형(예를 들어 변형된 세포 내의 핵산 또는 단백질의 양, 또는 생산된 생산물의 양, 예를 들어 L-라이신의 양)은 표준의 교과서에 나오는 분자 생물학의 표준 방법을 이용하여 또는 실시예에서 특별히 설명된 방법을 이용하여 비슷한 조건 하에서 두 미생물의 활성을 비교하여 측정된다.
전형적으로 본 발명에 따른 미생물은 유전적 변형을 수반하지 않는 초기 미생물에 유전적 변형을 도입함으로써 수득된다.
미생물 균주의 "유도체"는 그 모균주로부터 예를 들어 전형적인 돌연변이 생성 및 선별 또는 지정 돌연변이 생성에 의해 유도되는 균주이다.
본 발명의 목적에 있어서 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"이라는 용어는 펩타이드, 단백질 등과 같은 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 그의 유사체로 형성될 수 있다. 그러나, DNA로 형성된 핵산 분자가 바람직하다.
본 명세서에서 "재조합형"은 "유전자 변형에 의해 생성된 또는 유전자 변형의 결과인"을 의미한다. 따라서, "재조합형 미생물"은 적어도 하나의 "재조합형 핵산" 또는 "재조합형 단백질"을 포함한다. 재조합형 미생물은 바람직하게는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나 숙주세포의 내생 게놈에 복제된 핵산 시퀀스를 함유하도록 유전자 변형되었다.
"이종(heterologous)"은 유기체의 기원에 관계 없이, 세포 또는 유기체에 있어서 유전자 변형에 의해 상기 세포 또는 유기체에 도입된 핵산 또는 폴리펩타이드/단백질이다. 따라서, "상동(homologous)"이라는 용어가 때로는 유전자 변형 분야에서 사용되지만, 미생물로부터 분리되고 동종의 다른 미생물에 도입된 DNA는 후자에 대해서 이종인 DNA이며, 본 발명의 문맥에서 유전자 변형된 미생물이다. 그러나, "이종"이라는 용어는 바람직하게는 본 발명에서 상동이 아닌 핵산 또는 폴리펩타이드/단백질을 말한다. "이종 단백질/핵산"은 "재조합형 단백질/핵산"과 동의어이다.
용어 "발현하다", "발현하는", "발현된" 및 "발현"은 숙주생물에서의 유전자 산물(예: 경로의 유전자의 생합성 효소)의 발현을 의미한다. 발현은 개시 유기체로 사용되는 미생물의 유전자 변형에 의해 이루어질 수 있다. 몇 실시예에서는, 미생물이 유전자 변형되어(예를 들어 유전자 조작되어), 변형되지 않은 비슷한 미생물에서 또는 개시 미생물에 의해 생산된 유전자 산물에 비하여 증가된 레벨의 유전자 산물을 발현할 수 있다. 유전자 변형은 특정 유전자 발현에 관계된 조절 시퀀스 또는 부위의 변경 또는 변형(예를 들어 강한 프로모터, 유도성 프로모터 또는 다중 프로모터의 첨가에 의해 또는 발현이 구성적 발현이 되도록 조절 시퀀스를 제거하는 것에 의해), 특정 유전자의 유전자 위치의 변형, 리보솜 결합부위 또는 전사종결자와 같은 특정 유전자에 인접한 핵산 서열의 변형, 특정 유전자 카피 개수의 증가, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역에 관련된 단백질(예를 들어 조절 단백질, 억제인자, 증진인자, 전사활성제 등) 변형, 또는 기술분야의 루틴을 이용한 특정 유전자 발현의 비조절(deregulating)의 다른 모든 종래의 방법(안티센스 핵산분자를 사용하여, 예를 들어, 억제인자 단백질의 발현을 막는 것을 포함하지만 그에 제한되지는 않는)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
"보존적 아미노산 치환(conservative amino acid exchange)"은 초기 아미노산 시퀀스에서의 하나 이상의 아미노산이 비슷한 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것, 예를 들어 발린이 알라닌으로 치환되는 것을 의미한다. 초기의 폴리펩타이드 시퀀스와 비교할 때 치환된 아미노산의 비율은 바람직하게는 초기 아미노산 시퀀스의 총 아미노산의 0 내지 30%, 보다 바람직하게는 0 내지 15%, 가장 바람직하게는 0 내지 5%이다.
보존적 아미노산 치환은 바람직하게는 하기의 아미노산기의 일원 중 하나이다:
- 산성 아미노산 (아스파테이트 및 글루타메이트) ;
- 염기성 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘);
- 소수성 아미노산 (류신, 이소류신, 메티오닌, 발린, 알라닌);
- 친수성 아미노산 (세린, 글리신, 알라닌, 트레오닌);
- 지방족 곁사슬을 갖는 아미노산 (글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신);
- 지방족-수산기 곁사슬을 갖는 아미노산 (세린, 트레오닌);
- 아미드 함유 곁사슬을 갖는 아미노산 (아스파라긴, 글루타민);
- 방향족 곁사슬을 갖는 아미노산 (페닐알라닌, 타이로신, 트립토판);
- 황 함유 곁사슬을 갖는 아미노산 (시스테인, 메티오닌).
특히 바람직한 보존적 아미노산 치환은 하기와 같다:
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용어 "단리된(isolated)"은 "원 유기체로부터 분리되거나 정제된"을 의미한다. 보다 상세하게, 다세포 유기체의 분리된 세포는 원 유기체로부터 분리되었거나 정제된 것이다. 이는 생화학적으로 정제되고 재조합형으로 생산된 세포를 포함한다.
본 명세서에서, "아스파테이트 유래 아미노산"은 아미노산 라이신, 메티오닌, 이소류신 및 트레오닌을 가리키며, 바람직하게는 상기 아미노산은 L-형 아미노산이다.
본 명세서에서 아미노산의 "전구체" 또는 "생화학적 전구체"는 본 발명의 미생물의 상기 아미노산의 형성을 야기하는 생화학 경로의 아미노산을 선행하는("업스트림") 화합물, 특히 상기 생화학 경로의 몇 단계 전에 형성된 화합물이다. 본 명세서에서 아미노산 라이신의 "전구체"는 야생형 유기체에서의 아스파테이트의 라이신으로의 인비보 생화학적 전환 동안 형성되는 모든 중간체이다.
"중간체(intermediate)" 또는 "중간 산물(intermediate product)"은 반드시 분석적으로 직접적으로 탐지가능할 필요는 없는 농도에서의 화학적 또는 생화학적 공정 동안 일시적으로 또는 연속적으로 형성된 화합물로 이해한다. 상기 중간체는 이차의 화학적 또는 생화학적 반응에 의해, 특히 하기 상세한 설명에 정의되듯이 차후의 효소 전환에 의해 상기 생화학 공정으로부터 제거될 수 있다. 상기 후속의 효소 전환은 바람직하게는 본 발명에 따른 미생물에서 발생한다. 이 바람직한 측면에 따른 방법에서, 상기 미생물은 내생의 중간체의 상기 방법의 최후 생산물로의 후속적인 전환에서 적어도 하나의 이종 효소 촉매 반응 단계를 포함한다.
"탄소 수율(carbon yield)"은 (발효에 사용된 탄소원, 보통 당의) 소비된 탄소의 양 당 (산물의) 발견된 탄소의 양, 즉 탄소원에 대한 산물의 탄소 비율이다.
본 명세서에서 "변형(modification)" 또는 "변형된(modified)"은 본 발명의 미생물의 게놈이 돌연변이, 결실, 삽입, 치환, 동종 재조합에 의한 핵산 잔기 첨가, 프로모터 시퀀스의 치환, 유전자의 복제 등(각 본보기의 문헌이 뒤에 언급된다)의 방법을 이용하여 변형된 것을 의미한다. 상기 변형의 결과로, 본 발명의 미생물의 핵산 정보는 예를 들어 야생형 미생물 또는 추가의 변형에 사용되는 이미 변형된 미생물과 비교하면 다르다. 변형 기술의 결과는 종래에 알려진 기술, 예를 들어 PCR-기반 방법, Southern Blot, Northern Blot, Western Blot, 제한 효소 소화 및 증폭된 및/또는 소화된 핵산 단편의 가시화, 추가의 변형에 사용되었던 초기의 미생물과 비교한 효소활성의 측정 등을 이용하여 입증될 수 있다.
본 명세서 내에서 변형의 예로, "변형된 글루코스-6-포스페이트-디하이드로게나제"는 상기 유전자(zwf) 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론을 코딩하는 핵산이 변형된 것 즉, 상기 핵산 시퀀스가 상기 효소를 코딩하는 야생형 또는 초기에 발견된 핵산 시퀀스와 다르다는 것을 의미한다. 또한, 상기 변형의 결과로서, 효소활성은 일반적으로 비슷한 조건 하에서 비교할 때 초기의 효소와 다르고 효소의 밀리그램 당 유닛(비활성)으로 표현되거나 효소의 분자 당 분 당 변형된 기질의 분자량으로 표현될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 효소를 코딩하는 핵산은 변형되어 초기 프로모터가 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sod)의 프로모터와 같은 강한 이종 프로모터로 치환된다. 대안적으로, 또는 강한 프로모터의 사용에 더하여, 상기 효소를 코딩하는 핵산 시퀀스는 돌연변이가 될 수 있다. 바람직한 변형은 위치 243의 알라닌 잔기(A)가 트레오닌 잔기(T)로 치환되는 아미노산 시퀀스를 야기하는 돌연변이이다. 추가의 바람직한 실시예에서, tkt-오페론의 프로모터는 상술한 sod-프로모터와 같은 이종 프로모터에 의해 치환된다.
본 명세서에서 "G6PDH 활성"은 ICD의 효소활성, 특히 G6PDH에 의해 가해진 촉매효과를 의미한다. 특히, 이소시트레이트의 알파-케토글루타레이트로의 전환이 "G6PDH 활성"이다. G6PDH 활성은 효소의 밀리그램 당 유닛(비활성)으로 또는 효소의 분자량 당 분 당 변형된 기질의 분자량으로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 변형된 유전자 또는 효소의 활성이 "개선된", "증가된", "감쇠된(attenuated)","감소한","낮아진","줄어든" 또는 "저해된" 등으로 표현되면 이는 상기 유전자가 원래의 변형되지 않은 유전자와 비교하여 높거나 낮은 정도로 (즉, 단위시간 당, 즉 하루 당, 시간 당, 분 당 등에 높은 또는 낮은 양으로) 전사되거나 번역되는 것을 의미한다. 따라서, 상기 변형된 유전자 산물의 효소활성 또한 각각 높거나 낮을 것이다.
본 발명에 따른 미생물에서 변형될 수 있는 유전자 또는 효소의 활성은 zwf-유전자 및 상기 코딩된 효소에 대하여 상술한 것과 일반적으로 비슷한 방법으로 측정될 수 있다. 각 활성의 측정의 특정 방법은 실시예에서 설명한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 변형된 미생물의 생산 및 L-라이신 생산에 있어서의 변형된 미생물의 사용에 관한 것이다. 독창적인 미생물의 핵산의 바람직한 변형에 대해 하기에서 자세히 설명한다.
독창적인 미생물 균주는 C. 글루타미쿰의 대사의 상세한 지식에 기반하여 생산되어 왔다. 이 점과 관련하여, 13C 대사 플럭스 분석은 경로의 인비보 활성에 대한 중요한 정보를 제공하였고, (i)병목현상, 즉 라이신 생합성 뿐만 아니라 주요 NADPH 소스로서 펜토스 포스페이트 경로에서의 병목현상을 극복하기 위한 표적을 예측하였고, (ii)직접적으로 라이신 생합성과 경쟁하는 TCA 회로과 같은 반응을 발견하였다. C. 글루타미쿰에서의 측정가능한 플럭스의 수를 늘리기 위하여, 존재하는 플럭스 측정 모델을 본 발명에서 상당히 확장하였다. 이는 글리콜리시스의 C3 대사산물과 TCA 회로의 C4 대사산물을 연결하는 반응 네트워크에 초점을 맞추었다. 모델링에 있어서, 이는 피루베이트 및 포스포에놀피루베이트의 대사풀의 분리 및 플럭스 평가를 위한 추가의 매스 이소토포머의 부분의 구현을 포함하였다. 실험 준비에 있어서, [1-13C] 글루코스 및 자연적으로 표지된 글루코스와 [U-13C] 글루코스의 등몰 혼합물을 이용한 추적자 실험의 결합적 접근을 적용하였다. 상기 접근법을 이용하여, 보충 카르복시화 또는 탈카르복시화에 포함된 각 반응은 정확하게 해결될 수 있었다. 상기 확장 모델은 후속적으로 라이신 생산 C.　글루타미쿰에 피루베이트 키나아제 결실의 대사 결과를 해명하기 위해 적용되었다. 피루베이트 키나아제로부터 보충 카르복시화로의 플럭스 이동에 의해 라이신 생산량을 증가시키고 이로 인해 라이신 전구체 옥살로아세테이트의 증가된 공급을 야기할 것으로 가정된 상기 변형은 유전적 장애에 대한 C.글루타미쿰의 높은 유연성을 보이는 말산 효소 및 PEP 카르복실라제에 의해 생산된 대사 우회로에 의해 보상된 in vivo이었다.
본 발명에 따른 균주 최적화를 위한 유전자 변형은 예를 들어 유전자 결실, 프로모터 교환 또는 코돈 적응에 의한 과발현을 포함하는 다양한 방법에 의한 라이신 관련 중요 경로의 변형을 포함한다. 수행된 변화의 이점은 대사체 및 흐름체 분석 뿐만 아니라 배양 실험, 효소 검사에 의해 입증될 수 있다.
개시코돈 치환에 있어서, 희귀 개시코돈 GTG의 사용이 흔한 ATG 개시코돈의 제어 하의 유전자 발현과 비교할 때 세포에서 항상 낮아진 비효소활성을 야기한다는 것이 관찰되었다. 따라서 상기 방법은 비효소활성을 변형시키는 데 적용될 수 있고, 오늘날의 유전자 변형에 적용되는 실험 도구를 보완한다. 대안적으로, 상기 희귀 개시코돈 TTG는 보다 흔한 개시코돈을 치환하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 전구체 공급의 개선은 라이신 전구체 옥살로아세테이트를 공급하는 주요 효소인 피루베이트 카르복실라제와 직접적으로 경쟁하는 피루베이트 디하이드로게나제(PDH)의 탈조절에 의해 달성되었다. 야생형 기반 라이신 생산원 C.　글루타미쿰 BS87에서의 PDH의 감쇠는 ATG 개시코돈의 GTG 개시코돈으로의 치환에 의해 달성되었다. 이는 PDH의 비활성을 60% 감소시켰고 라이신 수율을 17% 증가시켰다. 대사 플럭스의 측정은 상기 증진이 피루베이트 디하이드로게나제로부터 피루베이트 카르복실라제로의 효과적 플럭스 전환으로 인하여 보다 효과적인 옥살로아세테이트의 공급을 야기했기 때문이라는 것을 보여주었다.
TCA 회로의 변형은 C. 글루타미쿰에 전구체 공급을 개선하는 효과적인 대안이라는 것이 밝혀졌다. 이소시트레이트 디하이드로게나제(ICD)를 코딩하는 icd 유전자에서의 개시코돈 치환(ATG→GTG)이 ICD 비활성의 70% 감소로 인해 라이신 생산량을 40% 이상 증가시켰다. 본 발명에서 C.　글루타미쿰은 보충 카르복시화로의 플럭스 경로변경에 의해 상기 의도적으로 유도된 병목현상에 대응하였다.
디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 ddh 유전자의 과발현에 의한 라이신 생합성 경로의 직접적인 변형은 구현된 변형의 이점이 적절한 배양 조건에 의해 훨씬 더 증진될 수 있다는 것을 확실히 보여주었다. 이 경우, 상기 증진은 약 2 g L-1 내지 10 g L-1 황산암모늄의 배양배지의 암모늄 농도가 각각 라이신 수율을 약 10% 내지 50% 증진시킬 때 특히 확연하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 배양 조건은 이와 같이 선택된다. 즉, 배양 배지의 암모늄 농도는 바람직하게는 약 10 내지 100 g L-1, 보다 바람직하게는 약 20 내지 100 g L-1, 30 내지 100 g L-1, 40 내지 100 g L-1, 50 내지 100 g L-1, 30 내지 90 g L-1, 30 내지 80 g L-1, 30 내지 70 g L-1, 30 내지 60 g L-1, 30 내지 50 g L-1, 보다 더 바람직하게는 40 내지 90 g L-1, 40 내지 80 g L-1, 40 내지 70 g L-1, 40 내지 60 g L-1, 또는 40 내지 50 g L-1 등으로 선택된다.
라이신 생합성 경로 자체의 대사 공학 및 중심 전구체 옥살로아세테이트의 공급에 대한 성공적인 연구는 라이신 생합성에 보조인자로서 다량이 요구되는 NADHPH의 세포내 공급의 표적화된 최적화에 의해 보완되었다.
C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산을 뒷받침하기 위한 증가된 NADPH 공급은 zwf-유전자에 의해 코딩되는 속도조절효소 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(G6PDH)의 과발현을 이용한 PPP를 통한 플럭스 증가에 의해 달성될 수 있다. 또한, 상기 효소는 중간대사로부터 기인하는 대사산물에 의해 음성적 조절에 대하여 감도성을 줄인 아미노산 교환 A243T의 구현에 의해 개선될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 바람직한 방법에서, 트랜스케톨라제-오페론(tkt)이 예를 들어 zwf-유전자의 발현을 증가시키기 위해 과발현될 수 있다.
더 이상 피드백 저해되지 않은 변형되고 개선된 아스파테이트 키나아제를 갖는 C. 글루타미쿰 lysCT311I의 백그라운드에서, 상기 변형은 PPP 플럭스를 15% 증가시켰고, 이는 라이신 생산량을 40%까지 증가시켰다.
트랜스케톨라제 오페론 내의 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(G6PDH)를 코딩하는 zwf 유전자의 유전자 국부화는 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제와 결합하여 G6PDH의 과발현을 대안적으로 가능하게 하여, PPP의 산화력이 없는 부분을 형성한다. 발현 제어를 위한 sod-프로모터의 사용은 G6PDH, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 증가된 활성을 야기하였고, 이로 인하여 PPP 내의 향후 발생가능한 병목현상을 제거하였다.
PPP 효소의 직접적인 변형 뿐만 아니라, NADPH 공급은 프럭토스 1,6-비스포스파타아제(fbp)의 과발현에 의해 더욱 증가되었다. G6PDH의 과발현 및 변형과 결합하여 상기 변화는 글루코스 상의 라이신 수율을 70% 증가시켰다. 다른 산업적으로 관련있는 당, 프럭토스 및 슈크로스에 있어서도 큰 개선을 가져왔다. 바람직하게는, 하나 이상의 상기 관련 당에 증가된 NADPH 공급을 갖는 균주는 변형된 lysC-유전자, 예를 들어 lysC T311I를 갖는다.
본 발명에 따른 PPP 변형의 추가적인 이점은, 세포내 G6P 레벨이 감소한 결과로 부산물 트레할로오스의 형성이 감소한 것이다. 상세한 대사의 조사는 NADPH 대사에의 새로운 시각을 더 제공할 수 있었다. 이제까지, 주로 PPP 및 ICD는 라이신 생산 C. 글루타미쿰에서 NADPH 소스로 간주되었다. 야생형과 비교하였을 때, C. 글루타미쿰의 라이신 생산균주는 NADPH-의존 말산 효소(MalE)의 증가된 비활성을 보였다. 모(parent) C.글루타미쿰 lysC T311I의 백그라운드에서 코딩하는 말산 효소 유전자의 결실은 NADPH 요구 산물 바이오매스 및 라이신의 형성을 감소시켰다. 감소된 전체 NADPH 소비량은 말산 효소를 통한 15%의 인비보 플럭스와 완벽하게 일치하였으며, 13C 플럭스 분석에 의해 측정되었다. 이는 C.　글루타미쿰이 변화된 생리적 요구를 맞추도록 NADPH 한정 조건 하에서의 말산 효소를 활성화시킨다는 것을 시사한다.
C. 글루타미쿰의 대사에 대한 방대한 지식 및 본 발명의 다른 주요 표적에 근거하여, 우수한 라이신 생산원이 본 발명의 바람직한 실시예에서 창조되었다. 상기 목적을 위하여, 독점적 이로운 변형의 세트가 비생산 야생형 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈으로 통합되었다.
창조된 균주 계보의 생산성의 비교는 본 발명에 따른 오직 다섯 개의 변형의 부분집합이 아스파테이트 유도 아미노산, 특히 라이신의 생산을 증가시키는 데 특히 바람직하다는 것을 보여주었다. 상기 변형은 피드백 저해로부터의 아스파테이트 키나아제(lysC)의 탈조절, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 과발현, icd의 감쇠, 및 프럭토스 1,6-비스포스파타아제 및 트랜스케톨라제 오페론의 과발현에 의한 NADPH 대사의 변형을 포함하였다. 합리적으로 설계된 균주는 30시간 내에 달성된 최종 라이신 HCl 역가 120 g L-1 및 55%까지의 전환률과 같은 현저한 생산 특성을 나타냈다. 상기 생산성과 함께 본 발명 내에서 창조된 라이신 고생산원은 우리가 아는 한 가장 좋은 야생형 기반 생산균주이다. 달성된 최종 라이신 역가 및 탄소 전환률은 40년 이상 동안 최적화되었던, 산업적으로 적용된 생산균주에 의해 달성된 최고 한계에 위치한다. 공간-시간 수율에 있어서, 야생형 기반 생산원은 빠른 생장 및 그에 따른 발효시간 감소로 인해 종래의 균주보다 훨씬 우월하다. 상기 생산 특성 때문에 상기 균주는 산업적 생산에서 매우 적합하다.
특히 바람직한 균주는 12개의 유전자 변형을 포함하였다. 이에 의하여, 라이신 생합성 (아스파테이트 키나아제의 피드백 탈조절 및 과발현, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제의 과발현) 및 전구체 공급 (피루베이트 카르복실라제의 과발현 및 돌연변이화, PEP 카르복시키나아제의 결실 및 호모세린 디하이드로게나제의 돌연변이화)의 변형은 전구체 공급 (이소시트레이트 디하이드로게나제의 감쇠) 및 NADPH 대사 (프럭토스 1,6-비스포스파타아제 및 트랜스케톨라제 오페론의 과발현)의 추가적 주요 표적에 의해 보완되었다.
본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 생산 방법은 발효 방법이다. 그러나, 식물 및 비인간 동물의 인비보 생산을 포함한 화학적 화합물의 다른 생명공학적 생산 방법 또한 고려되었다.
본 발명에 따른 발효 생산 방법은 상기 상술한 변형을 포함하는 적어도 하나의 -바람직하게는 재조합형의-미생물의 배양을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 측면에서, 생산 방법에 사용된 미생물은 재조합형 미생물이다. 식물 및 비인간 동물의 인비보 생산을 포함하는 화학적 화합물의 다른 생명공학적 생산 방법이 고려되는 한에 있어서는, 미생물의 선택은 역시 바람직하게는 재조합형 미생물이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 사용된 미생물에서의 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(zwf) 활성이 변형되었다. 즉, 유전자가 과발현되었다. 본 명세서에서 "과발현" 또는 "증가된 활성"은 동종이고 동일한 유전적 백그라운드를 가진 변형되지 않은 미생물의 초기 활성이 낮다는 것을, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 낮거나 그보다 훨씬 더 낮다는 것을 의미한다. 반대로, 변형된 미생물에서의 유전자 또는 효소의 활성은 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그보다 더 증가하였다. 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제의 활성에 있어서 고려된 것과 비슷한 사항은 본 명세서의 과발현될 수 있는 추가의 유전자 또는 효소, 즉 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 (ddh), 트랜스케톨라제 (tkt), 트랜스알돌라제 (tal), 프럭토스 1,6-비스포스파타아제 (fbp), 아스파테이트 키나아제 (lysC), 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 (dapB), 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제 (lysA), 또는 피루베이트 카르복실라제 (pyc)에도 적용된다.
상기 유전자 또는 효소의 활성을 가능한 한 많이 증가시키는 것이 항상 바람직한 것은 아니다. 어떤 경우에는 상술한 레벨의 불완전한 감소 뿐만 아니라 예를 들어 25%, 40%, 50% 등과 같은 중간 레벨도 충분하고 바람직할 수 있다.
또한, 감소된 효소활성을 갖는 본 발명에 따른 미생물, 예를 들어 동종이고 동일한 유전자적 백그라운드를 갖고 있는 초기 미생물과 비교했을 때 초기의 ICD 활성을 부분적으로 또는 완전히 잃은 본 발명에 따른 미생물이 바람직하다. ICD의 초기 활성의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 4%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%를 잃은 것이 바람직하고, 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 모두를 잃은 것은 보다 바람직하다. 활성의 감소의 정도는 비슷한 조건 하의 초기 미생물에서의 내생의 ICD 활성의 활성 레벨과 비교하여 측정된다.
이소시트레이트 디하이드로게나제의 감소된 활성과 비슷하게, 본 명세서에서 더 낮은 레벨에서 발현된 다른 유전자 또는 효소는 예를 들어 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(pck)이며, 본 발명의 가장 바람직한 실시예는 아닐 지라도, 선택적으로, 피루베이트 디하이드로게나제 또한 변형될 수 있다. 상기 유전자 또는 효소의 활성을 가능한 한 많이 감소시키는 것이 항상 바람직한 것은 아니다. 어떤 경우에는 상술한 것처럼 레벨의 불완전한 감소 뿐만 아니라 25%, 40%, 50%와 같은 중간 레벨의 감소도 충분하고 바람직할 수 있다.
특정 효소활성의 완전한 또는 거의 완전한 (즉, 90% 이상) 손실이 미생물의 특징이 되는 실시예에서, 상기 미생물의 배양 배지, 특히 본 발명에 따른 방법에서 사용된 배지는 효소활성의 억제에 의해 상기 미생물에서 결핍한 하나 이상의 필수 화합물에 의해 보충될 수 있다. 예를 들어, ICD의 활성이 억제되었을 때, 저렴하고, 쉽게 접근가능한 화합물인 글루타메이트가 배지에 보충될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 감소된 활성을 갖는 효소의 추가의 예는 hom-유전자이다. 상기 유전자의 변형은 하기에서 더 자세히 설명한다. 예를 들어 V59A의 점 돌연변이는 활성을 감소시키고 트레오닌 합성으로의 플로우(flow)를 감소시킨다.
본 발명에 필요한 효소활성의 증가 또는 감소는 각각 본 발명에 따른 방법에서 사용된 미생물의 내생의 특성, 예를 들어 자발적 돌연변이에 의한 특성이거나 또는 부분적으로 또는 완전히 효소 활성을, 특히 인비보 효소활성을 증진, 억압 또는 억제하는 종래의 방법에 의한 특성일 수 있다. 효소활성의 증가 또는 감소는 각각 효소 합성 및 효소 반응의 모든 단계에서, 유전적, 전사, 번역 또는 반응 레벨에서 발생할 수 있다.
효소활성의 증가 또는 감소는 각각 바람직하게는 유전자 변형의 결과이다. 숙주세포 내의 하나 이상의 내생 유전자 발현의 양을 증가시키거나 감소시키고 이에 따라 표적 유전자가 각각 증진되거나 억제된 숙주세포의 효소의 양 및/또는 활성을 감소시키기 위하여, 종래에 알려진 모든 방법이 적용될 수 있다.
E. coli 또는 C. 글루타미쿰과 같은 미생물 또는 P. pastoris 및 A. niger와 같은 다른 숙주세포와 같은 미생물 내의 유전자의 발현을 탈조절하기 위하여, 유전자 불활성화(gene-knockout) 접근, 안티센스 기술, RNAi 기술 등과 같은 다수의 기술이 사용가능하다. 각 유전자의 초기 카피를 결실시키거나 및/또는 이를 감소된 활성, 특히 감소된 비활성을 보이는 돌연변이체 버전으로 치환하거나, 약한 프로모터로부터 발현시킬 수 있다. 또는 유전자의 개시코돈 및 유전자의 프로모터를 교체하고, 무작위 또는 표적 돌연변이생성에 의한 돌연변이를 도입하고, 유전자를 방해하거나 불활성화할 수 있다. 또한, mRNA에 불안정 요소를 도입하거나 RNA의 리보솜 결합부위(RBS)의 악화를 야기하는 유전자 변형을 도입할 수도 있다. 마지막으로, 반응 혼합물에 특정 ICD 억제유전자를 첨가할 수 있다.
E. coli 또는 C. 글루타미쿰과 같은 미생물 내의 유전자 또는 P. pastoris 및 A. niger와 같은 다른 숙주세포 내의 유전자 발현을 상향조절(즉, 과발현) 또는 강화하기 위한 다수의 기술이 존재하는데, 예를 들어 보다 강한 프로모터를 사용하거나, 유전자의 증폭 등의 기술을 사용할 수 있다.
한 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 폴리펩타이드를 코딩하는 내생의 뉴클레오티드 시퀀스를 실직적으로 같은 아미노산 시퀀스 및/또는 기능의 폴리펩타이드를 코딩하는 변형된 뉴클레오티드 시퀀스로 치환하면, 코딩된 폴리펩타이드의 감소된 양이 변형된 세포 내에 발현되는 상황을 의미한다.
추가의 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 유전자 발현을 간섭하기 위해 안티센스 기술 또는 RNA 간섭(해당된다면, 예를 들어 진핵 세포배양에서)에 의한 발현의 탈조절을 의미한다. 상기 기술은 mRNA 레벨 및/또는 번역 효율에 영향을 끼칠 수 있다.
추가의 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 "약한" 유전자, 즉 효소활성이 초기 활성보다 낮은 단백질을 코딩하는 유전자의 도입과 결합된 유전자의 결실 또는 파괴, 또는 세포 내의 효소활성을 감소시키는 결과를 낳는 약하게 발현된 부위에서의 유전자의 통합에 의한 유전자의 결실 또는 파괴를 의미한다. 이는 유전자가 덜 잘 전사되는 염색체 위치에서의 유전자를 통합하거나, 또는 더 낮은 비활성을 가지거나 덜 효율적으로 전사된, 덜 효율적으로 번역되거나 세포에서 덜 안정적인 돌연변이체 또는 이종 유전자의 도입을 통해 행해질 수 있다. 상기 돌연변이 유전자의 도입은 복제 플라스미드를 사용하여 또는 게놈으로의 통합에 의해 이루어질 수 있다.
추가의 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 염색체적으로 코딩된 유전자로부터의 전사를 낮춤에 의해, 바람직하게는 초기 프로모터의 돌연변이화 또는 초기 프로모터의 약화된 버전과의 또는 보다 약한 이종 프로모터와의 치환에 의해 mRNA 레벨을 낮춤으로써 활성이 감소한다는 뜻이다.
추가의 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 감소된 효소활성이 리보솜의 번역개시부위에의 감소된 결합을 야기하고 이에 따라 mRNA의 감소된 번역을 야기하는 RBS 돌연변이의 결과라는 것을 뜻한다. 돌연변이는 단순한 뉴클레오티드 변화일 수도 있고 및/또는 개시코돈과 관련하여 RBS의 간격에 영향을 미칠 수도 있다. 상기 돌연변이를 달성하기 위하여, 돌연변이가 된 한 세트의 RBS를 함유하는 돌연변이체 라이브러리가 생성될 수 있다. 예를 들어 보다 낮은 효소활성을 선별함으로써 적합한 RBS가 선별될 수 있다. 그리고, 초기 RBS는 상기 선별된 RBS로 치환될 수 있다.
추가의 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 mRNA의 안정성을 낮춤으로써 예를 들어 이차 구조를 바꿈으로써 mRNA의 레벨을 낮춤으로써 달성된다.
추가의 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 조절인자, 예를 들어 전사 조절인자에 의해 달성된다.
뉴클레오티드 시퀀스에 의해 코딩되는 유전자 또는 효소의 양을 감소시키기 위하여 코리네박테리움 및 특히 바람직하게는 C.글루타미쿰에서 발현될 변형된 뉴클레오티드 시퀀스의 경우, 적어도 한개, 적어도 두개, 적어도 세개, 적어도 네 개, 적어도 다섯 개, 적어도 여섯 개, 적어도 일곱 개, 적어도 여덟 개, 적어도 아홉 개, 적어도 열 개, 바람직하게는 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 4%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 40%,적어도 60%, 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 95%의 변형되지 않은 뉴클레오티드 시퀀스의 코돈이 그리고 가장 바람직하게는 모든 변형되지 않은 뉴클레오티드 시퀀스의 코돈이 변형된 뉴클레오티드 시퀀스에서 각 아미노산에 덜 자주 사용되는 코돈에 의해 치환될 수 있다. 보다 더 바람직한 실시예에서, 상술한 수의치환될 코돈은 흔한, 매우 흔한, 그리고 극도로 흔한 또는 가장 흔한 코돈을 말한다. 또 다른 특히 바람직한 실시예에서, 상기 수의 코돈은 가장 덜 자주 사용되는 코돈에 의해 치환된다. 상기 모든 경우에 참고 코돈 사용빈도는 코리네박테리움의 코돈 사용빈도 및 바람직하게는 C. 글루타미쿰 및 바람직하게는 코리네박테리움의 풍부한 단백질의 코돈 사용빈도 그리고 바람직하게는 C. 글루타미쿰의 코돈 사용빈도에 기반할 것이다. 상세한 설명은 PCT/EP2007/061151에 나와 있다.
상술하였듯이, 본 발명은 라이신 생산방법 뿐만 아니라 미생물 및 라이신 생산에 있어서의 미생물의 사용에 관한 것이다. 본 발명에서 용어 "미생물"은 L-라이신 생산을 위한 뉴클레오티드 시퀀스의 발현에 흔히 사용되는 비인간 유기체, 특히 상술한 미생물, 조류(algae) 및 선류(mosses)를 포함한 식물, 이스트 및 비인간 동물을 말한다. L-라이신 생산에 특히 적합한 미생물 외의 유기체는 식물 및 식물의 부분일 수 있다. 상기 식물은 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 작물 식물, 먹이 식물 또는 사료 작물과 같은 단자엽식물강 또는 쌍자엽식물강일 수 있다. 외떡잎식물의 예는 아베나 속(귀리), 소맥(밀), secale(호밀), hordeum(보리), 오리자(oryza:쌀), 기장, 수크령, 강아지풀, 수수(기장), 제아(zea:옥수수) 등에 속하는 식물이다.
쌍떡잎식물 작물 식물은 그 중에서도 목화, 펄스(pulse)와 같은 콩과(leguminoses) 및 특히 알팔파, 콩, 평지씨, 토마토, 사탕무, 감자, 나무 뿐만 아니라 관상용 식물을 포함한다. 추가 작물 식물은 인도사목 및 디기탈리스와 같은 악용식물 뿐만 아니라, 과일 (특히 사과, 배, 체리, 포도, 감귤류, 파인애플 및 바나나), 기름야자나무, 차나무, 카카오나무 및 커피나무, 담배, 사이잘을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 것은 밀, 보리, 통밀, 귀리, 쌀, 옥수수 및 기장, 사탕무, 평지씨, 콩, 토마토, 감자 및 담배와 같은 곡물이다. 추가의 작물 식물은 US 6,137,030에서 참고할 수 있다.
당업자는 미생물, 식물 및 식물세포, 동물 및 동물세포 등과 같은 다른 유기체 및 세포가 본 명세서에서 사용된 세포의 유전자 및 단백질의 수 및 종류에 있어서 다르다는 것을 잘 알고 있다. 같은 유기체 내에서라도, 다른 균주는 단백질 레벨에서의 약간 이질적인 발현 프로필을 보일 수 있다.
미생물과 다른 유기체가 본 발명 수행시 사용된 경우, 비발효 생산방법이 적용될 수 있다.
본 발명에서, 앞서 정의된 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 미생물은 원핵생물이다. 본 발명을 수행하는 데 있어서 특히 바람직한 미생물은 코리네박테리움 및 브레비박테리움 속, 바람직하게는 특히 코리네박테리움 글루타미쿰에 초점을 맞춘 코리네박테리움, 특히 Escherichia coli에 초점을 맞춘 에쉐리히아 속, 바실러스 속, 특히 Bacillus subtilis, 스트렙토미세스 속 및 아스퍼질러스 속으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시예는 코리네박테리움 속의 박테리아와 같은 코리네형 박테리아로부터 선택되는 미생물의 사용에 관한 것이다. 특히 바람직한 종은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola 및 Corynebacterium effiziens 이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예는 브레비박테리움 및 특히 Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum 및 Brevibacterium divarecatum 종의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, C. acetoglutamicum ATCC15806, C. acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERMBP-1539, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Corynebacterium effiziens DSM 44547, Corynebacterium effiziens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactoformentum ATCC13869, Brevibacterium divarecatum ATCC 14020, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608 뿐만 아니라 그로부터 유도된 균주 예를 들어 종래의 돌연변이생성 및 선택 또는 지정 돌연변이에 의해 유도된 균주로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
C. 글루타미쿰의 다른 바람직한 균주는 ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL B8183, NRRL W8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 및 NRRLB11476으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
약어 KFCC는 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collection)를, ATCC는 미국 균주보존기관(American-Type Strain Culture Collection)을 나타내며 약어 DSM는 독일 미생물균주 보존기관(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)을 나타낸다. 약어 NRRL은 미국 일리노이주의 피오리아의 ARS 균주보존북부지역실험연구소(ARS cultures collection Northern Regional Research Laboratory)를 나타낸다.
이러한 균주는 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 및 특히 그의 유도체이다. 바람직하게는 라이신을 생산한다고 알려진 균주 ATCC 13286, ATCC 13287, ATCC 21086, ATCC 21127, ATCC 21128, ATCC 21129, ATCC 21253, ATCC 21299, ATCC 21300, ATCC 21474, ATCC 21475, ATCC 21488, ATCC 21492, ATCC 21513, ATCC 21514, ATCC 21515, ATCC 21516, ATCC 21517, ATCC 21518, ATCC 21528, ATCC 21543, ATCC 21544, ATCC 21649, ATCC 21650, ATCC 21792, ATCC 21793, ATCC 21798, ATCC 21799, ATCC 21800, ATCC 21801, ATCC 700239, ATCC 21529, ATCC 21527, ATCC 31269 및 ATCC 21526 또한 사용될 수 있다. 특히 바람직한 것은 이미 L-라이신을 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주이다. 따라서, 피드백 내성 아스파토키나아제를 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된 균주 및 그 변이체가 특히 바람직하다. 상기 선호는 피드백 내성 아스파토키나아제를 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 으로부터 변이된 균주를 포함하고 특히 균주 ATCC13032lysC fbr 및 ATCC13286에 관한 것이다.
본 명세서에서, 피드백 내성 아스파토키나아제를 갖는 C. 글루타미쿰 ATCC13032lysC fbr , ATCC13032 또는 ATCC13286 및 그의 변이체가 특히 바람직한 미생물이다. 또한, ATCC13032lysC fbr 또는 ATCC13286이 바람직하다.
ATCC13032 lysC fbr는 ATCC13032로부터 시작하여 생산될 수 있다. 이와 같은 라이신 생산균주를 생산하기 위하여, lysC 야생형 유전자의 대립형질 교환이 C. 글루타미쿰 ATCC13032에서 수행된다. 이를 위하여 뉴클레오티드 교환은 lysC 유전자로 도입되고 그 결과 생성되는 단백질은 트레오닌 대신 위치 311의 이소류신을 운반한다. 상기 균주의 상세한 구축방법이 WO 2005/059093에 개시되어 있다. 상기 lysC 균주의 등록번호는 P26512이다.
뉴클레오티드 시퀀스를 코딩하는 이소시트레이트 디하이드로게나제의 개시코돈으로서 ATG를 대체, 바람직하게는 ATG를 GTG로 대체함으로써 ICD 활성이 감소하는 ATCC13032 lysC fbr 의 유도체가 사용될 수 있다. icd 개시코돈이 바뀐 (균주 ICD ATG→GTG) 실시예에서 설명되는 균주가 본 발명의 문맥에서 특히 바람직하다.
여기서 설명된 미생물의 변형에 사용될 수 있는 기술은, 예를 들어 Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990), Wosnick et al., Gene 60:115 (1987); Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9, John Wiley & Sons, Inc. (1995)를 참고할 수 있다.
앞에서 설명된, 여기서 사용된 클로스트륨 효소(clostridial enzyme)를 코딩하는 유전자의 DNA 분자는 각 아미노산 시퀀스로부터 역-번역된 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 각 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브로 cDNA 또는 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 적절한 라이브러리는 Clostridium subterminale 균주 SB4 (ATCC No. 29748)로부터 게놈 DNA를 수득하고 표준 방법에 따른 라이브러리를 구축함으로써 준비될 수 있다. 예를 들어, Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 2-1 to 2-13 and 5-1 to 5-6 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)를 참고할 수 있다.
대안적으로, 상기 유전자는 상호 프라이밍하는 긴 올리고뉴클레오티드 또는 PCR을 이용한 DNA 분자 합성에 의해 수득될 수 있다. DNA 합성과 관련하여, 예를 들어, Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990), Wosnick et al., Gene 60:115 (1987); Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9, John Wiley & Sons, Inc. (1995)를 참고할 수 있다.
본 명세서에서 언급된 효소는 핵산 시퀀스에 의해 코딩될 수 있고, 핵산 시퀀스는 라이신 생산 가능한 상기 모(parent) 미생물의 코돈 사용빈도에 맞춰진다.
본 발명에 따른 방법은 표적 화합물(L-라이신) 또는 그의 전구체를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 용어 "회수하는"은 배양배지로부터 화합물을 추출, 수확, 분리 또는 정제하는 것을 포함한다. 화합물의 회수는 종래의 수지 (예. 음이온 또는 양이노 교환 수지, 비이온 흡수 수지 등)로 처리, 종래의 흡착제 (예. 활성화된 숯, 규산, 실리카 겔, 셀룰로오스, 알루미나 등)로 처리, pH 변경, 용매 추출(예. 알코올, 에틸 아세테이트, 헥산 등과 같은 종래의 용매로 추출), 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조절, 동결건조 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 종래의 분리 또는 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 화합물은 미생물을 우선 제거함으로써 배양배지로부터 회수될 수 있다. 이어서 잔여 배지는 양이온 교환 수지를 통과시켜 원치 않는 양이온을 제거하고 음이온 교환 수지를 통과시켜 원치 않는 무기 음이온 및 유기산을 제거한다.
당업자는 예를 들어 특정 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 또는 내생의 뉴클레오티드 시퀀스를 변형된 뉴클레오티드 시퀀스로 치환하는 방법에 익숙하다. 이는 예를 들어 전기 천공법, 화학적 형질변환, 콘쥬게이션 또는 다른 적합한 형질변환 방법에 의한 적절한 구축물(복제 개시점이 없는 플라스미드, 복제 개시점이 없는 선형 DNA 단편)의 도입에 의해 달성될 수 있다. 이에 이어 예를 들어 오직 이러한 세포만이 내생의 자연 발생 시퀀스 대신 변형된 뉴클레오티드 시퀀스를 운반한다고 입증되었음을 보장하는 선별마커를 이용한 상동 재조합이 뒤따른다. 다른 방법은 내생의 염색체 위치의 유전자 파괴 및 예를 들어 플라스미드로부터의 변형된 시퀀스의 발현을 포함한다. 다른 방법은 예를 들어 전위(transposition)를 포함한다. 사용될 수 있는 벡터 및 숙주세포에 대한 추가의 정보가 아래에 주어질 것이다.
일반적으로, 당업자는 E. coli 및 C. 글루타미쿰과 같은 미생물에서의 폴리펩타이드의 발현을 구동하기 위한 벡터와 같은 구축물의 설계에 익숙하다. 또한, 당업자는 C. 글루타미쿰 및 E. coli 와 같은 미생물로부터의 아미노산 및 특히 라이신의 상술한 미생물로부터의 수확 및 정제 뿐만 아니라 상술한 미생물과 같은 미생물의 배양 조건에 익숙하다. 상기 측면에 대해 하기에서 상세하게 설명한다.
또한, 당업자는 원래의 변형되지 않은 뉴클레오티드 시퀀스를 동일한 아미노산의 그러나 다른 핵산 시퀀스를 가진 폴리펩타이드를 코딩하는 변형된 뉴클레오티드 시퀀스로 바꾸는 기술에 익숙하다. 이는 중합효소 연쇄반응 기반의 돌연변이생성 기술, 흔히 알려진 복제 절차, 화학적 합성 등에 의해 달성될 수 있다. 재조합 DNA 기술 및 분자 생물학의 표준 기술은 예를 들어 Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel et al. (Eds.) Current protocols in molecular biology (John Wiley & Sons, Inc. 2007). Ausubel et al., Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, Inc. 2002). Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition (John Wiley & Sons, Inc. 1995)등과 같이 다양한 발행물에 설명되어 있다. 특히 C. 글루타미쿰에 대한 방법은 Eggeling and Bott (eds.) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)에 나와 있다. 상기 절차 중 몇가지는 아래의 "실시예"에서 다룬다.
하기에 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물의 유전자 변형이 어떻게 수행될 수 있는지에 대해 자세하게 설명한다.
벡터 및 숙주세포
용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 이송할 수 있는 핵산 분자를 말한다.
벡터의 한 종류는 "플라스미드"인데, 이는 추가의 DNA 단편이 결합될 수 있는 순환 이중 나선 DNA 고리이다. 다른 종류의 벡터는 추가의 DNA 단편이 바이러스성 게놈에 결합될 수 있는 바이러스성 벡터이다.
어떤 벡터는 그들이 도입된 숙주세포에서 자율 복제가 가능하다 (예. 복제의 박테리아의 근원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예. 비에피솜(non-episomal) 포유동물 벡터)는 숙주세포로의 도입 후 숙주세포의 게놈으로 통합되고, 이로 인해 숙주게놈과 함께 복제된다. 또한, 어떤 벡터는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지정할 수 있다. 이러한 벡터는 여기서 "발현 벡터"라고 한다.
일반적으로 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현벡터는 흔히 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예. 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은, 같은 기능을 하는 다른 형태의 발현벡터도 포함한다.
본 발명의 재조합형 미생물 생산에 적합한 재조합형 발현벡터는 상술하였듯이 숙주세포 내의 각 핵산의 발현에 적합한 형태의 이종 핵산을 포함할 수 있고, 이는 상기 재조합형 발현벡터는 발현될 핵산 시퀀스에 작동적으로 연결된 발현에 사용될 숙주세포에 기반하여 선택되는 하나 이상의 조절 시퀀스를 포함한다는 뜻이다.
재조합형 발현벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 시퀀스가 뉴클레오티드 시퀀스의 발현을 가능하게 하도록 (예를 들어 백터가 숙주세포에 도입될 때 인비트로 전사/번역 시스템 또는 숙주세포의) 조절 서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 억제물질 결합 부위, 활성물질 결합 부위, 증폭자 및 다른 발현 제어 요소(예. 종결부위, 아데닐산중합반웅 신호, 또는 mRNA 이차 구조의 다른 요소)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 설명되어 있다. 조절 시퀀스는 많은 타입의 숙주세포에서의 뉴클레오티드 시퀀스의 구성요소적 발현을 지정하는 조절 시퀀스 및 특정 숙주세포 내에서만의 뉴클레오티드 시퀀스의 발현을 지정하는 조절 시퀀스를 포함한다. 바람직한 조절 서열은 예를 들어 cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02, e-Pp- ore PL, SOD, EFTu, EFTs, GroEL, MetZ (마지막 다섯 개는 C. 글루타미쿰으로부터)과 같은 바람직하게는 박테리아에서 사용되는 프로모터들이다. 추가적인 조절 시퀀스는 예를 들어 ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH과 같은 이스트 및 균류로부터의 프로모터, CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33과 같은 식물로부터의 프로모터, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터이다. 인공 프로모터를 사용하는 것도 가능하다. 발현 벡터의 설계는 전환될 숙주세포의 선별, 소정의 단백질 발현 레벨 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것을 당업자가 인식할 것이다. 발현벡터는 숙주세포로 도입될 수 있고 이로 인해 융합 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.
숙주세포 내, 바람직하게는 코리네박테리움, 특히 바람직하게는 C.글루타미쿰 내의 변형된 뉴클레오티드 시퀀스의 발현을 구동시키는 데에 적합한 모든 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어 코리네형 박테리아에서 자기 복제가능한 플라스미드 벡터일 수 있다. 예는 pZ1 (Menkel et al. (1989), Applied and Environmental Microbiology 64:549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al. (1991), Gene 102:93-98), pHS2-1 (Sonnen et al. (1991), Gene 107:69-74)이다. 상기 벡터들은 잠재 플라스미드 pHM1519, pBL1 oder pGA1 기반이다. 다른 적절한 벡터는 pClik5MCS (WO 2005/059093) 기반, 또는 pCG4 (US-A 4,489,160) 또는 pNG2 (Serwold-Davis et al. (1990), FEMS Microbiology Letters 66:119-124) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891) 기반이다. 다른 적절한 벡터의 예는 Handbook of Corynebacterium, Chapter 23 (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)에서 찾을 수 있다.
재조합형 발현벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내의 특정 뉴클레오티드 시퀀스의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 상기 뉴클레오티드 시퀀스는 C. 글루타미쿰 및 E. coli, 곤충세포 (바큘로바이러스 발현벡터를 이용한), 이스트 및 다른 균류세포와 같은 세균 세포 (Romanos, M. A. et al. (1992), Yeast 8:423-488; van den Hondel, C. A. M.J. J. et al. (1991) in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396-428, Academic Press: San Diego; and van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge 참조), 조류 및 다세포 식물세포 (Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.:583-586 참조)에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주세포가 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 더 나와 있다. 대안적으로, 재조합형 발현벡터는 예를 들어 T7 프로모터 조절 시퀀스 및 T7 중합효소를 이용하여 인비트로 전사되거나 번역될 수 있다.
원핵생물에서의 단백질의 발현은 대부분 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 지정하는 구성요소적인 또는 유도성인 프로모터를 함유하는 벡터와 함께 수행된다.
융합 벡터는 그 안에 코딩된 단백질에, 보통 재조합형 단백질의 아미노 말단 뿐만 아니라 C-말단 또는 단백질에 적절한 부위 내의 융합된 단백질에 다수의 아미노산을 첨가한다. 상기 융합 벡터는 전형적으로 1)재조합형 단백질의 발현 증가; 2) 재조합형 단백질의 용해도 증가; 3) 친화도 정제에서의 리간드의 역할을 함으로써 재조합 단백질의 정제를 도움 및; 4) 후의 단백질의 탐지를 위한 "태그(tag)"를 제공의 네 가지 목적을 수행한다. 많은 경우, 융합 발현벡터에서, 단백질가수분해의 절단위치가 융합 잔기와 재조합형 단백질의 연결 지점에서 도입되어 융합 단백질의 정제 후에 융합 잔기로부터 재조합형 단백질의 분리를 가능하게 한다. 상기 효소, 및 그의 동족 인식 시퀀스는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다.
전형적인 융합 발현벨터는 각각 글루타치온 S-전이효소 (GST), 말토오스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 융합하는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) 유전자67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 포함한다.
적절한 유도성 비융합 E. coli 발현벡터의 예는 pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, egtll, pBdCl, 및 pET lld (Studier et al., Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; and Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York, ISBN 0 444 904018)을 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존한다. pET lld 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 공동발현된 바이러스 RNA 중합효소 (T7gnl)에 의해 매개된 T7 gnlO-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 상기 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어 하에서 T7gnl 유전자를 포함하는 레지던트 X 프로파지로부터의 숙주 균주 BL21 (DE3) 또는 HMS174 (DE3)에 의해 공급된다. 다른 다양한 박테리아의 형질전환에, 적절한 벡터가 선별될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 pIJ101, pIJ364, pIJ702 및 pIJ361은 스트렙토미세스를 형질전환하는데에 유용하고, 플라스미드 pUB110, pC194 또는 pBD214는 바실러스 종의 형질전환에 적합하다. 유전자 정보의 코리네박테리움으로의 이송에 사용하는 몇 플라스미드는 pHM1519, pBLl, pSA77 또는 pAJ667 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York ISBN 0 444 904018)을 포함한다.
적합한 C. 글루타미쿰 및 E. coli 셔틀벡터의 예는 예를 들어 pClik5aMCS (WO 2005/059093)이고, 또는 Eikmanns et al. ((1991) Gene 102:93-8)에서 찾을 수 있다.
코리네박테리움 변형에 적합한 벡터의 예는 Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)에서 찾을 수 있다. E. coli- C. 글루타미쿰 셔틀 벡터의 리스트 (표 23.1), E. coli - C. 글루타미쿰 셔틀 발현벡터의 리스트 (표 23.2), DNA의 C. 글루타미쿰 염색체으로의 통합에 사용될 수 있는 벡터의 리스트 (표 23.3), C. 글루타미쿰 염색체으로의 통합에 사용될 수 있는 발현벡터의 리스트 (표 23.4.), 뿐만 아니라 C. 글루타미쿰 염색체으로의 부위-특이적 통합에 사용될 수 있는 벡터의 리스트 (표 23.6)를 볼 수 있다.
또 다른 실시예에서, 발현벡터는 이스트 발현벡터이다. 이스트 S. cerevisiae에서의 발현벡터의 예는 pYepSecl (Baldari, et al., (1987) Embo　J. 6:229-234), 2i, pAG-1, Yep6, Yepl3, pEMBLYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), 및 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)을 포함한다. 사상균류와 같은 다른 균류에 사용하기에 적합한 벡터 및 이의 구축 방법은 van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, and Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (ISBN 0 444 904018)에 명시된 것을 포함한다.
본 발명의 목적을 위하여, 작동적 링크는 프로모터(리보솜 결합부위(RSS))를 포함하는), 코딩 시퀀스, 종결부위 및, 선택적으로, 추가 조절 요소의 순차적 배열로 이해하는데, 코딩 시퀀스를 발현할 때 각 조절요소가 그 결정(determination)에 따라 그 기능을 수행할 수 있게 하는 방식이다.
또 다른 실시예에서, 이종 뉴클레오티드 시퀀스는 단세포 식물세포(예: 조류) 또는 고등식물 (예: 작물식물과 같은 종자식물)의 식물세포에서 발현될 수 있다. 식물 발현벡터의 예는 Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; 및 Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721에 개시된 것을 포함하고, pLGV23, pGHlac+, pBINl9, pAK2004, 및 pDH51 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York ISBN 0 444 904018)를 포함한다.
진핵생물 및 원핵생물 세포에 적합한 다른 발현 시스템은 Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003의 챕터 16 및 17에 나와 있다.
또 다른 실시예에서, 재조합형 발현벡터는 우선적으로 특정세포 타입, 예를 들어 식물세포(예: 조직 특이적 조절 요소가 핵산 발현에 사용된다)에서의 핵산 발현을 지정할 수 있다. 조직 특이적 조절 요소는 본 기술 분야에 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 재조합형 발현 벡터 또는 핵산이 도입된 유기체 또는 숙주세포에 관한 것이다. 그 결과 생성된 세포 또는 유기체는 각각 재조합형 세포 또는 유기체이다. 상기 용어는 특정 대상세포 뿐만 아니라, 자손(progeny)이 재조합형 핵산을 포함할 때의 상기 세포의 자손(progeny) 또는 잠재적인 자손을 가리키는 것으로 이해된다. 어떤 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해서 다음 세대에도 발생할 수 있기 때문에, 사실 상기 자손은 모세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 상기 자손이 발현하거나 재조합형 단백질을 발현할 수 있는 한 여기에 사용된 용어의 범위 내에 포함된다.
벡터 DNA는 종래의 형질전환 또는 트랜스펙션 기술에 의해 진핵생물 또는 원핵생물 세포로 도입될 수 있다. 여기서 사용되는 "형질전환(transformation)" 및 "트랜스펙션(transfection)", "콘쥬게이션(conjugation)" 및 "형질도입(transduction)"은 외래 핵산 (예: 선형 DNA 또는 RNA (예: 선형화된 벡터 또는 벡터 없는 유전자 구축물) 또는 벡터 형태의 핵산 (예: 플라스미드, 파아지, 파스미드, 파아지미드, 트랜스포손 또는 다른 DNA))을 숙주세포에 도입하는, 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공동침전, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션, 자연 반응능, 콘쥬게이션 화학-매개 트랜스퍼, 또는 전기천공법을 포함한 다양한 본 기술분야에서 알려진 기술을 말한다. 숙주세포를 형질전환 또는 트랜스펙트하는 적절한 방법은 Sambrook, et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003), 및 다른 실험 지침서에서 찾을 수 있다.
상기 성분을 식별하고 선별하기 위해, 선별마커(예: 내항생제성)를 코딩하는 유전자를 일반적으로 관심 유전자와 함께 숙주세포로 도입한다. 바람직한 선별마커는 G418, 히그로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 암피실린 및 메토트렉세이트와 같은 약제내성을 부여하는 것들을 포함한다. 선별마커를 코딩하는 핵산은 앞서 설명한 변형된 뉴클레오티드 시퀀스를 코딩하는 벡터와 같은 벡터 상의 숙주세포로 도입되거나 별개의 벡터로 도입될 수 있다. 도입된 핵산을 이용하여 안정적으로 트랜스펙트된 세포는 약(drug) 선별에 의해 식별될 수 있다 (예: 선별마커 유전자를 통합한 세포는 생존할 것이고, 다른 세포는 죽을 것이다).
복제개시점(origin of replication)이 없는 플라스미드 및 두개의 다른 마커 유전자가 사용될 때 (예: pClik int sacB), 게놈으로 삽입된 삽입체의 부분을 갖는, 마커 없는 균주를 생산할 수 있다. 이는 두개의 연이은 상동성 재조합(homologous recombination) 이벤트에 의해 달성될 수 있다 (Becker et al., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71 (12), p. 8587-8596; Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005) 참조). 플라스미드 pClik int sacB의 시퀀스는 WO 2005/059093에서 (SEQ ID NO:24로 표시됨) 볼 수 있다; 거기서, 상기 플라스미드는 pCIS라고 불린다.
또 다른 실시예에서, 도입된 유전자의 조절된 발현을 가능하게 하는 선별된 시스템을 함유하는 재조합형 미생물이 생산될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 시퀀스를 락 오페론의 제어 하에 두는 벡터 상의 뉴클레오티드 시퀀스의 포함은 IPTG의 존재 하에만 유전자 발현을 허용한다. 이러한 조절 시스템은 기술분야에서 잘 알려져 있다.
Escherichia coli 및 코리네박테리움 글루타미쿰 -배지의 생장 및 배양조건
한 실시예에서, 상기 방법은 라이신 생산에 적절한 배지에서 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 배지 또는 숙주세포로부터 라이신을 분리시키는 것을 포함한다.
당업자는 C. 글루타미쿰 및 E. coli와 같은 흔한 미생물의 배양에 익숙하다. 따라서, E. coli 및 C. 글루타미쿰의 배양에 대해 일반적인 설명을 할 것이다. 추가 정보는 E. coli 및 C. 글루타미쿰의 배양에 대한 표준 교과서에서 볼 수 있다.
E. coli 균주들은 통상적으로 각각 MB 및 LB 배지에서 배양된다 (Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175:4096-4103). E. coli용 최소배지는 각각 M9 및 변형된 MCGC (Yoshihama et al. (1985) J.　Bacteriol. 162:591-597)이다. 글루코스는 최종 농도 1%에서 첨가될 수 있다. 항생제는 다음의 양 만큼 (㎍/ml) 첨가될 수 있다: 암피실린, 50; 카나마이신, 25; 날리딕스산, 25. 아미노산, 비타민, 및 다른 보충제는 다음의 양 만큼 첨가될 수 있다: 메티오닌, 9.3 mM; 아르기닌, 9.3 mM; 히스티딘, 9.3 mM; 티아민, 0.05 mM. E. coli 세포는 통상적으로 각각 37℃에서 배양된다.
유전자 변형된 코리네박테리움은 전형적으로 합성 또는 자연 배양배지에서 배양된다. 코리네박테리움용 많은 다른 배양배지는 잘 알려져있고 바로 사용가능하다 (Liebl et al. (1989) Appl.Microbiol. Biotechnol., 32:205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag). 설명은 Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)에서도 볼 수 있다.
상기 배지는 하나 이상의 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 및 미량 원소로 이루어진다. 바람직한 탄소원은 일당류, 이당류와 같은 당(sugars), 또는 다당류이다. 예를 들어, 글루코스, 프럭토스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 락토오스, 말토오스, 슈크로스, 글리세롤, 라피노오스, 녹말 또는 셀룰로오스가 탄소원 역할을 한다.
당밀 또는 다른 당 정제물의 부산물과 같은 착화합물을 통해 배지에 당을 공급할 수도 있다. 다른 탄소원의 혼합물을 공급하는 것이 유리할 수도 있다. 다른 가능한 탄소원은 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 젖산과 같은 알코올 및 유기산이다. 질소원은 보통 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 상기 화합물을 함유하는 물질이다. 질소원의 예는 NH4C1 또는 (NH4)2SO4, NH4OH과 같은 암모니아 가스 또는 암모니아염, 질산염, 요소, 아미노산 또는 옥수수 침지액(corn steep liquor), 대두분, 대두단백질, 이스트 추출물, 고기즙과 같은 복합 질소원을 포함한다.
배지에 포함될 수 있는 무기염 화합물은 마그네슘, 소듐, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리, 철 및 칼슘의 염화염, 인염, 황산염을 포함한다. 킬레이트 화합물은 용액에 금속 이온을 유지하기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 특히 유용한 킬레이트 화합물은 카테콜 또는 프로토카테큐에이트와 같은 디하이드록시페놀, 또는 시트레이트와 같은 유기산을 포함한다. 상기 배지는 비타민과 같은 다른 생장요소, 또는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토텐산 및 피리독신과 같은 생장 촉진제를 함유하는 것이 일반적이다. 생장 요소 및 염은 흔히 이스트 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 복합배지 요소로부터 유래한다. 배지 화합물의 정확한 조성은 직접적인 실험에 따라 다르고 각 경우에 따라 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach"(Eds. P. M. Rhodes, P.F.　Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)에서 볼 수 있다. Standard 1 (Merck) 또는 BHI (뇌심장침출배지: brain heart infusion, DIFCO) 등과 같이 상업적 공급자로부터 배양배지를 선택할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 배지의 예를 하기의 실시예에서 설명한다.
모든 배지 요소는 열 (121℃, 1.5bar에서 20분 동안) 또는 무균여과로 살균화되어야 한다. 상기 요소들은 함께 살균할 수도 있고, 필요하다면 따로 살균할 수 있다.
모든 배지 요소는 배양의 시작에 존재하거나 선별적으로 연속적으로 또는 회분식으로 추가될 수 있다. 배양 조건은 각 실험에서 따로 설명한다.
온도는 사용된 미생물에 따라 다르고 보통 15℃ 내지 45℃이어야 한다. 상기 온도는 일정하게 유지될 수도 있고 실험 중에 변경될 수도 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5일 수 있는데, 바람직하게는 약 7.0이고, 배지에 완충제를 첨가함으로써 유지될 수 있다. 완충제의 예는 인산칼륨 완충제이다. MOPS, HEPES, ACES 등과 같은 합성 완충제는 교대로 또는 동시에 사용될 수 있다. 배양 중 NaOH 또는 NH4OH의 첨가를 통해 일정한 배양 pH를 유지할 수 있다. 이스트 추출물과 같은 복합배지 요소가 사용된다면, 많은 착화합물이 높은 완충력을 가지고 있기 때문에 추가의 완충제의 필요성이 줄어들 수 있다. 발효기가 미생물 배양에 사용된다면, pH 또한 암모니아 가스를 사용함으로써 조절될 수 있다.
배양시간은 보통 몇 시간에서 몇 일이다. 상기 시간은 최대 양의 산물을 배지에 축적가능하게 하기 위해 선택된다. 개시된 배양 실험은 다른 크기의 마이크로타이터 플레이트, 유리 튜브, 유리 플라스크 또는 유리 또는 금속 발효기와 같은 다양한 용기에서 수행될 수 있다. 많은 수의 클론을 스크리닝하기 위하여, 상기 미생물은 배플(baffle)이 있는 혹은 없는 마이크로타이터 플레이트, 유리 튜브 또는 쉐이크 플라스크에서 배양되어야 한다. 바람직하게는 필요한 배양배지의 부피의 10%가 채워진 100 ml 쉐이크 플라스크를 사용한다. 상기 플라스크는 회전진탕기(진폭 25 mm)로 100-300rpm의 속도 범위에서 진동되어야 한다. 증발량 손실은 습한 대기의 유지에 의해 감소될 수 있다; 대안적으로, 증발량에 대한 수학적 교정이 수행되어야 한다. 바람직한 배양조건의 예는 아래의 예에서 설명한다.
유전자 변형된 클론이 실험되면, 변형되지 않은 대조 클론 (예: 모균주) 또는 삽입체 없이 기본 플라스미드를 함유하는 대조 클론도 실험되어야 한다. 배지는 30℃에서 배양된 CM 플레이트 (10g/1의 글루코스, 2,5g/1의 NaCl, 2g/1의 요소, 10g/1의 폴리펩톤, 5g/l의 이스트 추출물, 5g/1의 육즙, 22g/1의 한천, 2M의 NaOH을 첨가하여 pH 6.8로 만듦)와 같이 평면한천배지에서 배양된 세포를 이용하여 0.5-1.5의 OD600가 되도록 접종한다. 상기 배지의 접종은 CM 플레이트로부터의 C. 글루타미쿰 세포의 염수 현탁액의 도입 또는 상기 박테리아의 액체 전배양의 첨가에 의해 달성된다.
아미노산 및 그의 중간체의 수량화
아미노산 및 그의 중간체의 수량화는 당업자에게 알려진 문헌에 의해 수행될 수 있다. 상기 수량화를 하기와 같이 메티오닌의 예를 들어 설명한다. 추가적인 수량화의 예는 실시예에 나와 있다. 본 명세서의 문맥에서는 후자가 바람직하다.
분석은 가드 카트리지 및 시너지 4㎛ 칼럼 (MAX-RP 80Å, 150 * 4.6 mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)을 이용하여 HPLC (Agilent 1100, Agilent, Waldbronn, Germany)에 의해 수행한다. 주입 전에 o-프탈디알데히드(OPA) 및 메르캅토에탄올을 환원제 (2-MCE)로 이용하여 분석물을 유도체화한다. 추가적으로 술프히드릴기를 요오도아세트산으로 차단한다. 분리는 극성 상으로서 40 mM의 NaH2PO4 (용리액 A, NaOH로 pH=7.8으로 맞춤)을, 비극성 상(용리액 B)으로서 메탄올 물 혼합물(100 / 1)을 이용하여 유속 1 ml/min 로 수행한다. 기울기는, 처음 0% B; 39 분 39% B; 70 분 64% B; 100% B 3.5 분; 균형을 위해 2 분 0% B을 적용한다. 상온에서의 유도체화는 하기와 같이 자동화한다. 처음에 0.5㎕의 0.5% 2-MCE을 넣은 바이신(0.5M, pH 8.5)을 0.5㎕의 세포추출물과 혼합한다. 이어서 1.5㎕의 50 mg/ml 요오도아세트산을 넣은 바이신(0.5M, pH 8.5)을 첨가하고, 2.5㎕의 바이신 완충제(0.5M, pH 8.5)를 첨가한다. 유도체화는 1/45/54 v/v/v의 2-MCE/MeOH/바이신 (0.5M, pH 8.5)에 용해된 0.5㎕의 10mg/ml OPA 시약을 첨가함으로써 수행한다. 끝으로 상기 혼합물을 32㎕ H2O에 희석시킨다. 상기 각 피페팅 단계의 사이에 1분의 대기 시간이 있다. 총량 37.5㎕을 칼럼에 주입한다. 오토 샘플러 니들(auto sampler needle)이 샘플 준비 동안 (예: 대기 시간 내에) 및 후에 정기적으로 정제된다면, 상기 분석 결과가 크게 개선될 수 있다. 검출은 형광 검출기 (340 nm 여기, 방출 450 nm, Agilent, Waldbronn, Germany)로 수행한다. 수량화를 위하여 내부표준으로서α-아미노부티르산 (ABA)을 사용한다.
C. 글루타미쿰 의 재조합 프로토콜
하기에 특정 재조합 프로토콜을 이용하여 정밀 화학 생산의 증가된 효율을 갖는 균주 C. 글루타미쿰 균주를 생산하는 방법을 설명한다.
여기서 사용되는 "캠벨 인(Campbell in)"은 전체 순환 이중 나선형 DNA 분자(예를 들어 pClik int sacB 기반 플라스미드)가 하나의 상동성 재조합 이벤트(a cross-in event)에 의해 염색체에 통합되어, 상기 순환 DNA 분자의 선형화된 버전이 상기 순환 DNA 분자의 제 1 DNA 시퀀스와 상동인 염색체의 제 1 DNA 시퀀스로 효과적으로 삽입되게 하는 원 숙주세포의 형질전환주를 의미한다. "캠벨드 인(Campbelled in)"은 "캠벨 인" 형질전환주의 염색체로 통합된 선형화된 DNA 시퀀스를 말한다. "캠벨 인"은 각 카피가 상동성 재조합 교차점의 카피를 포함하고 둘러싸는 제 1 상동형 DNA 시퀀스의 복제를 함유한다. 이름은 상기 재조합을 처음으로 제안한 앨런 캠벨(Alan Campbell) 교수의 이름을 땄다.
여기에서 사용되는 "캠벨 아웃(Campbell out)"은 "캠벨 인" 형질전환주로부터 내려오는 세포를 가리키는데, 상기 세포에서 제 2 상동 재조합 이벤트(a cross out event)가 "캠벨드 인" DNA의 선형화된 삽입 DNA에 함유된 제 2 DNA 시퀀스와, 상기 선형화된 삽입체의 제 2 DNA 시퀀스와 상동인 염색체 오리진의 제 2 DNA 시퀀스 사이에서 발생하여, 상기 통합된 DNA 시퀀스의 부분의 결실(필요없는 것을 버림)을 야기할 뿐만 아니라, 중요하게도, 통합된 캠벨드인 DNA의 부분(단일 염기만큼 작을 수도 있다)이 염색체에 남아 있게 하여, 원 숙주세포와 비교하여, "캠벨 아웃" 세포가 염색체에 하나 이상의 의도적인 변화를 함유 (예를 들어, 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 이종 유전자 또는 DNA 시퀀스의 삽입, 상동 유전자 또는 변형된 상동 유전자의 추가적인 카피(들)의 삽입, 또는 앞에 열거한 예들 중 하나 이상을 포함하는 DNA 시퀀스의 삽입) 하도록 한다.
"캠벨 아웃" 세포 또는 균주는 보통, 항상 그런 것은 아니지만, "캠벨드 인" DNA 시퀀스의 부분(결실되는 것이 바람직한 부분)에 함유된 유전자, 예를 들어 약 5% 내지 10%의 슈크로스의 존재 하에 배양되는 세포에서 발현되면 치명적인 Bacillus subtilis sacB 유전자에 대한 역 선별(counter-selection)에 의해 수득된다. 역 선별을 이용하든 이용하지 않든, 소정의 "캠벨 아웃" 세포는 소정의 세포를 콜로니 형태, 콜로니 색깔, 내항생제성의 존재 여부, 중합효소 연쇄 반응에 의한 주어진 DNA 시퀀스의 존재 여부, 영양요구성의 존재 여부, 효소, 콜로니 핵산 교잡, 항체 스크리닝 등의 존재 여부와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 스크리닝 가능한 표현형을 이용하여 선별하여 수득되거나 식별될 수 있다. 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"은 상술한 방법 또는 공정을 지칭하기 위해 다양한 시제의 동사로도 사용될 수 있다.
"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 야기하는 상동 재조합 이벤트는 상동 DNA 시퀀스 내의 DNA 염기 범위에서 발생할 수 있으며, 상동 시퀀스가 적어도 이 범위의 부분에서는 서로 동일할 것이기 때문에 교배(crossover) 이벤트가 발생한 곳을 정확히 알기는 보통 불가능하다. 다시 말해서, 어떤 시퀀스가 삽입된 DNA로부터 왔는지, 어떤 것이 염색체 DNA로부터 왔는지는 정확히 알 수 없다는 뜻이다. 또한, 제 1 상동 DNA 시퀀스 및 제 2 상동 DNA 시퀀스가 보통 부분적 비상동 관계 부위에서 분리되고, 그것이 "캠벨 아웃"세포의 염색체에 잔여하는 비상동 관계 부위이다.
실현 가능성을 위하여, C. 글루타미쿰에서는, 전형적인 제 1 및 제 2 상동 DNA 시퀀스의 길이가 적어도 약 200 염기쌍이고, 몇 천 염기쌍일 수도 있으나, 보다 짧은 또는 보다 긴 시퀀스를 이용할 수 있도록 하는 절차를 수행할 수 있다. 예를 들어, 제 1 및 제 2 상동 시퀀스의 길이가 500 내지 2000 염기일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 수득하는 것은 제 1 및 제 2 상동 시퀀스를 길이가 거의 같도록, 바람직하게는 200 염기쌍보다 적은 차이가 나도록, 가장 바람직하게는 둘 중 더 짧은 쪽이 더 긴 염기쌍의 길이의 적어도 70%가 되도록 배열함으로써 가능하게 된다. "캠벨 인 및 캠벨 아웃 방법(Campbell in and-Out method)"은 WO 2007/012078 및 Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005), 챕터 23에 나와 있다. 바람직한 C. 글루타미쿰 재조합 프로토콜은 하기의 실시예에서 설명한다.
하기의 실시예에서 본 발명에 대해 더 자세히 설명한다. 실시예는 설명을 위한 것이고, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
하기의 실시예에서 재조합형 DNA 기술 및 분자생물학의 표준 기술의 설명은 예를 들어 Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel et al. (2007), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Protein Science, edition as of 2002, Wiley Interscience와 같은 문헌에도 나와 있다. 별도의 언급이 없는 한, 모든 세포, 시액, 장치 및 키트는 제조회사의 지시에 따라 사용하였다.
재료 및 방법
박테리아 균주
C. 글루타미쿰의 모든 균주는 안정적 유전자 변형에 의해 야생형 ATCC 13032 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 유도되었다. Invitrogen(Karlsruhe, Germany)으로부터 구입한 Escherichia coli DH5a 및 NM522를 각각 벡터 증폭 및 DNA 메틸화에 사용하였다. 모든 균주를 표 2에 나타낸다.
표 2: 본 발명에서 대사 및 유전자 변형에 사용된 박테리아 균주
균주 유전자형
C. 글루타미쿰
ATCC 13032		 야생형
BS1 (lysC T311I) 야생형 + 아미노산 교환 T311I를 야기하는 아스파토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자에서의 뉴클레오티드 교환
BS3 (zwf A243T) BS1 + 아미노산 교환 A243T를 야기하는 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자에서의 뉴클레오티드 교환
BS5 (Psod zwf) BS1 + 자연형 프로모터의, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 sod 프로모터로의 치환에 의한 zwf의 과발현
BS6 (Psod zwf A243T) BS3 + sod-프로모터에 의한 돌연변이 zwf 유전자의 과발현
BS7 (Psod fbp_zwf A243T) BS6 + sod-프로모터에 의한, 프럭토스 1,6-비스포스파타아제를 코딩하는 fbp의 과발현
BS13 (lysC T311I Δpyk) BS1 + 피루베이트 키나아제의 결실 (pyk)
BS44 (lysC T311I ΔmalE) BS1 + 말산효소의 결실 (malE)
BS52 BS6 + 말산효소의 결실 (malE)
BS222 (ddh) BS1 + 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 ddh 유전자의 추가 카피
BS87 BS222 + PEP-카르복시키나아제를 코딩하는 pck의 결실 + 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 dapB의 sod 프로모터에 의한 과발현 + 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제를 코딩하는 lysA(및 argS, 둘 다 같은 유전자군에서 발견됨)의 추가 카피 + sod 프로모터에 의한 lysC 의 과발현 + 호모세린 디하이드로게나제(hom)에서 V59A의 돌연변이화 + 피루베이트 카르복실라제 (pyc)에서의 P458S의 돌연변이화 및 sod 프로모터에 의한 pyc 의 과발현
BS205 (icd att) BS87 + 이소시트레이트 디하이드로게나제를 코딩하는icd 유전자에서의 개시코돈 ATG의 희귀 개시코돈 GTG로의 치환
BS242 (Peftu fbp) BS205 + fbp의 자연형 프로모터의, 연장인자 tu를 코딩하는 eftu 프로모터로의 치환
BS244 (Psod tkt) BS242 + 트랜스알돌라제를 코딩하는tal, zwf, 트랜스케톨라제를 코딩하는 tkt, 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 추정상 서브유닛을 코딩하는 opcA, 6-포스포글루코놀락토나아제를 코딩하는pgl을 포함하는 tkt-오페론의 자연형 프로모터의 sod 프로모터로의 치환
BS238 (aceE att) BS87 + 피루베이트 디하이드로게나제 복합체(PDH)의 하나의 서브유닛을 코딩하는 aceE의 유전자에서의 개시코돈 ATG의 GTG로의 치환
BS240 (pgi att) BS87 + 포스포글루코이소머라아제를 코딩하는 pgi 유전자에서의 개시코돈 ATG의 GTG로의 치환
BS293 (zwf up) BS87 + zwf 유전자에서의 개시코돈 GTG의 ATG로의 치환
E. coli DH5a 형질전환 벡터의 증폭을 위한 열 충격 수용성 세포
NM522 pTC 플라스미드(표 2)를 운반하는 열 충격 수용성 세포. 형질전환 벡터의 DNA 메틸화 및 증폭에 사용됨.
American Type Culture Collection (Manassas, USA)에 의해 야생형 C. 글루타미쿰 ATCC 13032가 수득되었다.
프라이머 및 플라스미드
C. 글루타미쿰의 형질전환은 각각 통합 벡터 pK19 또는 pClik (도 1 및 도 2) (Becker, et al., 2005)를 이용하여 수행하였다. 원 벡터는 크기가 4 kbp이고 E. coli를 위한 복제개시점(ORI), 멀티플 클로닝 사이트 (MCS), 카나마이신 내성 선별마커 (KanR) 및 B. subtilis의 레반수크라제를 코딩하는 sac B 유전자의 오픈 리딩 프레임을 함유한다. KanR 및 sacB 는 두개의 재조합 이벤트에 양성 선별마커(positive selection marker)로 사용된다 (Jager, et al., 1995; Jager, et al., 1992).
C. 글루타미쿰의 유전자 변형을 위한 각 DNA 단편은 PCR로 수득하였고, 이어서 선별된 제한효소의 인식 부위를 통해 기본 벡터 MCS로 삽입하였다. 균주 구축에 사용된 플라스미드 및 프라이머 시퀀스를 각각 표 3 및 4에 나타낸다. 프라미어 디자인 및 복제 전략의 개발은 소프트웨어 Vector NTI 10.0 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)를 이용하였다.
표 3: 본 발명에 사용된 플라스미드
No 플라스미드 설명
1 pTC C. 글루타미쿰의 DNA-메틸트랜스퍼라제용 발현벡터, E. coli를 위한 ORI, 및 선별마커로서 테트라사이클린 내성. 통합 발현 벡터에 C. 글루타미쿰-특이적 DNA-메틸화 패턴을 첨가하기 위하여 E. coli NM522에서 사용.
2 pClik MCS, E. coli를 위한 ORI 및 선별마커로서 KanR 및 sacB를 갖는 C. 글루타미쿰용 통합 형질전환 벡터.
3 pK19 MCS, E. coli를 위한 ORI 및 선별마커로서 KanR 및 sacB를 갖는 C. 글루타미쿰용 통합 형질전환 벡터.
4 pClik_lysC T311I 아스파테이트 키나아제(lysC)로의 돌연변이 T311I의 구현을 위한 통합 형질전환 벡터
5 pK19_2×ddh ddh의 추가 유전자 카피의 구현을 위한 통합 형질전환 벡터
6 pClik_Δpck PEP 카르복시키나아제를 코딩하는 pck 유전자의 결실을 위한 통합 형질전환 벡터
7 pK19_Psod dapB 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 dapB 유전자의 자연형 프로모터의, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 sod 프로모터로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
8 pK19_2×lysA 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제 및 아르기닐-tRNA-신타아제를 코딩하는 lysA 및 argS의 추가 카피 구현을 위한 통합 형질전환 벡터
9 pClik_PsodlysC 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 lysC 유전자의 자연형 프로모터의 sod 프로모터로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
10 pClik_hom V59A 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 hom 유전자으로의 돌연변이 V59A의 구현을 위한 통합 형질전환 벡터
11 pClik_pyc P458S 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 pyc 유전자로의 돌연변이 P458S를 구현하기 위한 통합 형질전환 벡터
12 pClik_Psodpyc pyc 유전자의 자연형 프로모터의 sod 프로모터로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
13 pClik_icd A1G 이소시트레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 icd 유전자의 자연 개시코돈 ATG의 개시코돈 GTG로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
14 pClik_P eftu fbp 프럭토스 1,6-비스포스파타아제를 코딩하는 fbp 유전자의 자연형 프로모터의, 연장 인자 tu를 코딩하는 eftu의 프로모터로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
15 pClik_P sod tkt 트랜스케톨라제 오페론 tkt의 자연형 프로모터의 sod의 프로모터로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
16 pClik_ΔmalE malE 유전자의 결실을 위한 통합 형질전환 벡터
17 pClik_aceE A1G aceE 유전자의 자연 개시코돈 ATG의 개시코돈 GTG로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
18 pClik_pgi A1G pgi 유전자의 자연 개시코돈 ATG의 개시코돈 GTG로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
19 pClik_zwf G1A zwf 유전자의 자연 개시코돈 GTG의 개시코돈 ATG로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
C. 글루타미쿰 BS87의 균주 구축에 사용된 플라스미드를 표 4에 나타낸다.
표 4: C. 글루타미쿰 BS87 의 균주 구축에 사용된 플라스미드
플라스미드 설명
pClik_Δpck PEP 카르복시키나아제를 코딩하는 pck 유전자의 결실을 위한 통합 형질전환 벡터
pK19_Psod dapB 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 dapB 유전자의 자연형 프로모터의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 sod 프로모터로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
pK19_2×lysA 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제를 코딩하는lysA의 추가 카피의 구현을 위한 통합 형질전환 벡터
pClik_Psod lysC 아스파토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자의 자연형 프로모터의 sod 프로모터로의 치환을 위한 통합 형질전환 벡터
pClik_hom V59A 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 hom 유전자로의 돌연변이 V59A의 구현을 위한 통합 형질전환 벡터
pClik_pyc P458S 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 pyc 유전자로의 돌연변이 P458S를 구현하기 위한 통합 형질전환 벡터
pK19_2×ddh ddh의 추가 유전자 카피의 구현을 위한 통합 형질전환 벡터
여기서 언급된 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스는 예를 들어 www.ncbi.nlm.nih.gov와 같은 공공 데이터베이스를 통하여서도 접근가능하다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 완전한 게놈은 배열 순서가 밝혀졌고 GenBank 기탁번호 BA000036.3로 이용가능하다.
화학물질
이스트 추출물, 육즙, 트립톤, 펩톤 및 한천은 Difco Laboratories (Detroit, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 화학물질은 분석용 등급이었고, Sigma, Fluka 또는 Merck에서 구입하였다. 표지된 글루코스는 Campro Scientific (Veenendaal, The Netherlands)에서 구입하였다. 제한효소는 Fermentas (St. Leon-Roth, Germany)에서 구입하였다.
배지 조성
복합 배지
LB 배지
E. coli의 한천 평판배지에서 또는 액체 배양에서의 배양을 LB (Luria-Bertani) 배지에서 수행하였다. 이는 리터 당: 5 g의 이스트 추출물, 10 g의 트립톤 및 5 g의 NaCl를 함유하였다. 18 g L-1 의 한천을 첨가하여 한천 평판배지를 제조하였다. 20분 동안 121℃에서 고압증기 멸균으로 살균하였다. 적절하다면, 카나마이신 및 테트라사이클린을 각각 최종 농도 50　㎍ mL-1또는 12.5 ㎍ mL-1 에 첨가하였다.
SOC 배지
열 충격 형질전환 후에 E. coli DH5a 및 NM522의 재생을 세 용액으로 구성된 강화 SOB 배지(Super Optimized Broth)에서 수행하였다. 용액 1은 총 양 975 mL 중 트립톤 20 g, 이스트 추출물 5 g, NaCl 0.5 g 및 KCl (250 mM) 10 mL을 함유하였고 고압증기 멸균으로 살균하였다. 상온으로 냉각한 뒤, 살균한 MgCl2 (2 M) 5 mL 및 살균한 글루코스 (1 M) 20 mL를 첨가하였다.
CM 배지
코리네박테리움 글루타미쿰의 최초 전배양은 CM 배지에서 생장하였다. 제조를 위하여, 10 g의 펩톤, 5 g의 육즙, 5 g의 이스트 추출물 및 2.5 g의 NaCl을 925 mL의 물에 용해시키고 121℃에서 20분 동안 고압증기 멸균하였다. 그리고, 25 mL의 글루코스 (400 g L-1, 0.2 ㎛의 Ultrafree-MC, Millipore로 여과에 의해 살균함) 및 50 mL의 요소(urea) (40 g L-1, 0.2 ㎛의 Ultrafree-MC, Millipore로 여과에 의해 살균된)를 첨가하였다. 18 g L-1 의 한천을 첨가하여 한전 평판배지를 제조하였다. 선별 목적을 위하여 균주 구축 동안 고압증기 멸균 전에 100g의 슈크로스를 첨가하여 CMSAC 한천 평판배지를 제조하였다. CMKan 한천은 최종 농도 50㎍ mL-1을 갖는 카나마이신을 함유하였다. 고압증기 멸균된 한천을 50-60℃까지 냉각한 후 50 mg mL-1의 모액으로부터 카나마이신을 첨가하였다.
BHI ++ 배지
전기천공법(electroporation)을 위한 세포를 배양하는 데 사용되는 BHI++ 배지는, 37 g의 BHI (뇌심장침출액: Brain-Heart-Infusion)를 850 mL의 물에 용해시켜서 제조하였다. 고압증기 멸균 (20 분, 121℃) 후, 50 mL의 살균된 2　M (NH4)2SO4 및 100　mL의 살균된 40 % 글루코스를 첨가하였다.
BHIS 배지
전기천공법 후 세포 재생을 위하여, BHIS 배지에 C. 글루타미쿰을 선별압력 없이 90분 동안 배양하였다. 1리터의 BHIS는 여과로 살균하고 고압증기 멸균 후 첨가한 250 mL의 2　M 소르비톨 및 37 g의 BHI를 함유하였다.
최소배지
대사 플럭스 분석(metabolic flux analysis)을 포함한 생리학적 연구를 위하여, 최소배지를 사용하였다 (표 5). 이는 사용 전 신선하게 배합된 다른 용액으로 구성되었다.
표 5: C. 글루타미쿰의 배양에 사용되는 합성배지의 조성
표준 배지 변형 배지
용액 A 559 mL 500 mL


1.0 g NaCl 1.0 g NaCl
55 mg CaCl2 55 mg CaCl2
0.2 g MgSO4 *H2O 0.2 g MgSO4 *H2O
용액 B 200 mL 100 mL

5.0 g (NH4)2SO4 15.0 g (NH4)2SO4
pH 7.0
용액 C 100 mL 100 mL

16.0 g K2HPO4 31.6 g K2HPO4
2.0 g KH2PO4 2.5 g KH2PO4
용액 D 100 mL 100 mL

15.0 g 각각 글루코스, 프럭토스 또는 슈크로스 10 g 글루코스
pH 5.0
용액 E 10 mL 10 mL

20 mg FeSO4 * 7 H2O 20 mg FeSO4 * 7 H2O
pH 1.0 - 1.1 pH 1.0 - 1.1
용액 F 20 mL 20 mL
용액 G 10 mL 10 mL
용액 H 1 mL 1 mL
물 159 mL
용액 F 100 mL


2.5 mg 비오틴

5.0 mg 티아민*HCl
5.0 mg 판토텐산 칼슘-염
용액 G 1000 mL






200 mg FeCl3 * 6 H2O








200 mg MnSO4 * H2O
50 mg ZnSO4 * H2O
20 mg CuCl2 * 2 H2O
20 mg Na2B4O7 * 10 H2O
10 mg (NH4)6Mo7O24 * 4 H2O
ad HCl (1 M)을 첨가하여 pH 1.0
용액 H 10 mL

300 mg 디하이드록시벤젠산
500 ㎕ NaOH (6 M)
용액 A-D 및 물을 121℃에서 20분 동안 고압증기 멸균하여 살균하였다. 용액 F-H를 여과(0.2㎛ Ultrafree-MC, Millipore)하여 살균하였다. 암모늄 농도 및 완충용량을 높이고 기질농도를 낮추어 선별된 실험에서 최소배지를 변형하였다.
산업적 생산배지
비타민 및 미량원소로 보충된 당밀 기반 복합배지에서 5 L의 Sartorius fermenter에서의 유가발효를 수행하였다. 회분 배지의 조성을 표 6에 나타낸다. 공급 용액의 제조에는, 200 g의 당밀 및 800 g의 글루코스*H2O를 1.8 L의 물에 용해시키고 121℃에서 20분 동안 고압증기 멸균하여 살균하였다. 이어서, 살균된 200 mL의 (NH4)2SO4 용액 (400 g L-1), 0.8 mL의 용액 E 및 2 ml의 거품억제제(Tego antifoam KS911, Goldschmidt GmbH, Essen, Germany)를 첨가하였다.
회분 배지
용액 A 500 mL
72.44 g 당밀
35.00 mL 옥수수 침지액
0.55 mL FeSO4-시트레이트 용액
5.00 mL Tego 거품억제제 KS911
용액 B 90 mL
36 g (NH4)2SO4
0.27 g MgSO4
225 ㎕ H3PO4 (85 %)
용액 C 10 mL
0.25 g KH2PO4
용액 D 140 mL
70 g 글루코스*H2O
용액 E 7 mL
물 203 mL
표 6: 발효에 사용되는 당밀 기반 배치 배지의 조성.
용액 E는 300 mg L-1 의 비오틴, 500 mg L-1 의 티아민*HCl, 2 g L-1 의 판토텐산 칼슘-염 및 600 mg L-1의 니코틴아미드를 함유하였다. FeSO4-시트레이트 용액은 20 g L-1 의 FeSO4*7 H2O 및 18.14 g L-1 의 시트레이트염으로 구성되었다. 용액 A-D 및 물은 121℃에서 20분 동안 고압증기 멸균하여 살균하였다. 용액 E는 여과(0.2 ㎛ Ultrafree-MC, Millipore)에 의하여 살균하였다.
균주 보존
복합 액체 배양 (E. coli 는 LB 그리고 C. 글루타미쿰은 CB)으로부터의 대수증식하는 세포 1 mL를 1 mL의 살균된 60 % 글리세롤에 혼합하고 -80℃ 에서 저장하였다.
균주 구축
핵산의 단리
C. 글루타미쿰 으로부터 DNA의 분리
정제된 게놈 DNA의 분리를 위하여, 30℃에서 2일 동안 배양된 한천 평판배지의 세포를 살균된 접종 루프를 이용하여 수확하고 500㎕의 살균된 물에 용해시켰다. 두 약수저의 글라스 비드 (0.45 - 0.5 mm) 및 700㎕의 페놀-클로로포름-이소아밀-알코올 혼합물 (Carl-Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)을 첨가한 후 ribolyzer(MM301, Retsch, Haan, Germany)에서 30 Hz에서 1분 동안 세포파괴를 수행하였다. 수상 및 기체상(5분, 13000 rpm, Centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Germany)의 분리 후, 65㎕의 아세트산나트륨 (3 M, pH 5.5) 및 1.3 mL의 에탄올 (100 %)의 첨가 및 원심분리 단계(10 분, 13000 rpm, Centrifuge 5415R)에 의해 수상으로부터의 DNA를 침전시켰다. 이어서, 상등액을 제거하고 게놈 DNA를 100㎕의 살균된 물에 용해시켰다. DNA 농도는 NanoDrop® Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)로 측정하였고 게놈 DNA를 4℃에 저장하였다. 균주 구축 동안 스크리닝 목적을 위한 DNA의 빠른 분리를 위하여, 단일 콜로니를 살균된 이쑤시개로 집어서 500㎕의 살균된 물에 용해시키고 앞서 설명한 대로 세포 파괴를 수행하였다. 세포 잔해를 원심분리로 제거하고 10㎕의 상등액을 PCR 분석에 사용하였다.
E. coli 로부터 플라스미드의 분리
Escherichia coli NM522 및 DH5α로부터의 플라스미드 DNA의 분리를 각각 DNA isolation kits HiSpeed Plasmid Midi Prep Kit (Qiagen, Hilden, Germany) 및 GFX Micro Plasmid Prep Kit (GE Healthcare, Munich, Germany)을 이용하여 수행하였다. GFX Micro Plasmid Prep Kit을 이용한 플라스미드 분리는 지침서에 설명된 대로 LBKan 배지에서 배양된 DH5α의 하룻밤 동안의 배양 3 mL를 이용하여 수행하였다. NM522로부터의 플라스미드의 분리는, 10 mL의 전배양 (LBTet+Kan)을 한천 평판배지로부터의 단일 콜로니로 접종하고 8시간 동안 배양하였다. 전배양으로부터의 세포를 50　mL LBTet+Kan 에서 수행하고 하룻밤 동안 배양한 본 배양을 접종하는데 사용하였다. 세포 수확 및 플라스미드 분리는 HiSpeed Plasmid Midi Prep 매뉴얼에 따라 수행하였다. DNA 농도는 NanoDrop으로 측정하였고 분리된 플라스미드는 두개의 다른 제한효소를 이용한 절단에 의해 조절하였고 -20℃에서 저장하였다. 모든 배양은 회전진탕기(Multitron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland)의 배플드 쉐이크 플라스크에서 37℃, 230 rpm에서 진동 직경 5cm로 수행하였다.
중합효소 연쇄반응
삽입체 생산 및 균주 확인은 mastercycler EP gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 PCR에 의해 수행하였다. 삽입체 생산(insert construction) 및 시퀀싱을 위하여 설계된 PCR 산물에는 교정(proof reading) 기능을 가진 PWO master (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)를 사용하였고, 균주 확인은 Taq 중합효소를 함유하는 PCR master (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행하였다. 벡터 생산을 위한 소정의 DNA 단편의 수득, 유전자 결실의 유도, 점 돌연변이의 도입, 형질전환 벡터를 이용한 지정 결찰(ligation)을 위한 제한효소의 인식부위의 인위적 추가는 종래의 방법에 따라 수행하였다. 각 반응 후, PCR 산물을 GFXTM PCR DNA 및 Gel Band purification kit (GE Healthcare, Munich, Germany)을 이용하여 정제하였다. 증폭은 초기 변성 단계 (95℃에서 5분 동안)에서 시작하여 표준 온도 프로필을 이용하여 수행하였다. 이어서 95℃에서 0.5분의 변성, 0.5분의 어닐링 및 72℃에서 1분 동안의 신장(elongation)을 30회 반복하였다. 72℃에서 5분의 최종 신장 후, 싸이클러를 15℃까지 냉각시켰다. 어닐링 온도는 프라이머에 각각 개별적으로 맞추었고 하기의 식에 따라 GC 함량에 따라 계산하였다:
Figure pct00002
반응은 총량 50㎕에서 전형적인 방법으로 수행하였다. 프라이머를 400 nM의 최종 농도에 첨가하였다. 1㎕의 정제된 게놈 DNA 또는 플라스미드 DNA를 주형으로 첨가하였다. 콜로니 PCR은, 신속한 분리로부터의 주형 DNA를 사용하였고 양을 10㎕로 늘렸다. 음성대조군은 주형 DNA 없이 수행하였다.
겔 전기 영동법(Gel Electrophoresis)
중합효소 연쇄 반응 또는 효소 절단으로부터의 생산물을 1 % 아가로오스 겔에서 전기영동을 이용하여 분리하였다. 전기영동은 100-120 V에서 1-1.5시간 동안 1 ×TAE 완충제(B1A easy cast mini gel 또는 D2 wide gel system, Thermo Scientific, Rochester, USA with Power Pack P25T, Biometra, Gottingen, Germany)에서 수행하였다. 밴드 크기는 1 kb DNA 사다리 (O'GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder ready-to-use, Fermentas, St. Leon-Roth, Germany)로 측정하였다. 겔 로딩 전에, 샘플을 1/10 volume OrangeG 로딩 완충제로 혼합하였다. TAE 완충제 및 OrangeG의 조성을 표 7에 나타낸다.
표 7: 겔 전기 영동에 사용된 겔 로딩 완충제 OrangeG 및 TAE의 조성
Orange G



25 mL 글리세롤 (99.9 %)
75 mg OrangeG
1 mL EDTA (1 M, pH 8.0)
Ad 50 mL H2O
50×TAE-완충제



242.28 g 트리스
100 mL 아세트산 (100 %)
100 mL EDTA (0.5 M, pH 8.0)
Ad 1000 mL H2O
겔은 브롬화 에티듐 염료수조 (0.5㎍ mL-1의 브롬화 에티듐)에서 착색하였다. DNA 검출은 Gel Ix Imager (Intas, Gottingen, Germany)의 자외선 하에서 수행하였다.
효소 절단
형질전환 벡터의 생산을 위하여, 융합 PCR에 의해 수득된 빈 벡터(empty vector) pClik 및 삽입체를 두개의 다른 제한효소를 이용하여 절단하였다. 벡터 절단을 위한 반응은 총량 25㎕에서 수행하였고 각 효소 1㎕, 2.5㎕의 반응 완충제 (10 ×), 5㎕의 플라스미드 DNA 및 15.5㎕의 물을 함유하였다. 절단은 FastDigest 효소(Fermentas, St. Leon-Roth, Germany)를 사용하였을 때 37℃에서 하룻밤 동안 또는 20분 동안 수행하였다. 이어서, 벡터의 재결찰을 피하기 위해, 선형화된 벡터로부터의 포스페이트 잔기를 상온에서 한 시간 동안 알칼리성 포스파타아제 처리(Shrimp alkaline phosphatase (SAP), Fermentas)에 의해 제거하였다. NM522로부터의 플라스미드 분리 후의 절단을 SAP 처리 없이 수행하였다. 삽입체 절단을 융합 PCR로부터의 PCR 산물 25㎕, 각 효소 2㎕, 10×반응 완충제 5㎕ 및 물 16㎕를 이용하여 수행하였다.
DNA 결찰
결찰을 위하여 다른 벡터-삽입체 비율을 가진 두 혼합물을 제조하였다. 반응은 RapidDNA ligation Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)을 이용하여 수행하였고, 0.5㎕ 또는 1㎕의 선형화된 벡터, 2㎕의 삽입체 DNA, 2㎕의 희석 완충제, 10㎕의 결찰 완충제, 1㎕의 T4 연결효소 및 4㎕ 또는 4.5㎕의 물을 함유하였다. 혼합물을 상온에서 30분 동안 배양한 뒤, E. coli DH5α의 열 충격 형질전환에 적용하였다.
형질전환
열 충격 수용성(competent) E. coli (Inoue, et al., 1990)의 제조
한 전배양 및 한 본 배양에서 23℃에서 회전진탕기(Multitron, Infors)의 230rpm에서 세포를 배양하였다. 전배양 (20 mM MgCl2를 함유하는 5 mL LB 배지)을 한천 평판배지로부터의 단일 콜로니로 접종하고 하룻밤 동안 배양하였다. pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522에는 12.5㎍ mL-1 테트라사이클린을 첨가하였다. 2 ml의 하룻밤 동안의 배양을 이용하여 250 mL의 배지를 갖는 2L의 배플드 쉐이크 플라스크에서 수행된 본 배양을 접종하였다. 0.4-0.6의 OD600에서, 세포를 얼음 위에 10분 동안 둔 후, 미리 냉각된 살균된 50 mL의 팔콘 튜브에 옮기고 10분 동안 원심분리하였다 (5000 rpm. 4℃, Centrifuge 5804R, Eppendorf, Hamburg, Germany). 얼음처럼 차가운 TB 완충제 (표 8) 40mL로 세정한 후, 세포를 같은 완충제 20mL 및 1.5mL DMSO에 용해시키고 10분 동안 얼음 위에 두고, 마지막으로 미리 냉각한 1.5 mL 에펜도르프 튜브의 220㎕의 분취액에서 분열시킨 뒤 에탄올-드라이아이스-수조에서 충격냉각하였다. 수용성 세포를 -80℃에서 저장하였다.
표 8: 열 충격 수용성 E. coli의 제조에 사용된 TB 완충제의 조성
TB 완충제
2 mL Pipes-NaOH (0.5 M, pH 6.7)
3 mL CaCl2 (0.5 M)
12.5 mL KCl (2 M)
5.5 mL MnCl2 (1 M)
Ad 100 mL H2O
여과에 의해 살균함 (0.2㎛ Ultrafree-MC, Millipore)
열 충격 형질전환
얼음 위에서 녹인 후, 50㎕의 수용성 E. coli 세포를 3㎕ 의 플라스미드 DNA와 혼합하고 30분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 열충격은 thermo block (Thermomixer comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 45초 동안 45℃에서 수행하한 뒤, 세포를 즉시 얼음에 2분 동안 두었다. 그리고, 900㎕의 SOC 배지를 첨가하고 세포 재생을 thermo mixer에서 500 rpm에서 (Thermomixer comfort, Eppendorf) 선별압력 없이 60분 동안 37℃에서 수행하였다. 선별목적을 위하여, 세포를 LBKan 또는 LBTet+Kan 평판배지에 치상하고 37℃에서 하루동안 배양하였다. 단일 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 분리 및 벡터 절단은 상술한 대로 수행하였다. 소정의 벡터를 함유하는 균주를 -80℃에 저장하였다.
전기-수용성 (electro-competent) C. 글루타미쿰 의 제조
글리세롤 스톡(glycerol stocks)으로부터의 세포를 한천 평판배지에 펼쳐놓고 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 첫 전배양(5 mL BHI++ 배지)을 하룻밤 동안 30℃에서 230 rpm 회전진탕기 (진동 직경 5 cm, Multitron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland)에서 배양한 단일 콜로니로 접종하고 본 배양의 시드(seed)로 사용하였다. 이는 50 mL BHI++ 배지에서 수행하였고 0.3의 OD660 로 접종하였다. 1.2-1.5의 OD660에서 세포를 살균된 미리 냉각된 50 mL 팔콘 튜브에서 수확하고 (7500×g, 3분, 4℃) 얼음처럼 차가운 10 % 글리세롤로 4번 세정하고 세포 습윤 중량(CWW) 그람 당 4 mL의 글리세롤에 용해시켰다. 세포 현탁액을 전기천공 시간 (tE)을 테스트하는 데 사용하였다. 적절하다면(tE < 8 ms) 세포 현탁액을 10 % 글리세롤로 더 희석시킨다.
전기천공법에 의한 형질전환
C. 글루타미쿰의 전기천공법을 200㎕의 세포 현탁액 및 2.5㎍ 및 5㎍의 플라스미드 DNA를 이용하여, BioRad gene pulser XcellTM (Biorad, Hercules, US)를 이용하여 2 mm 전기천공법 크벳에서 각각 2.5 kV, 25㎌ 및 400Ω에서 수행하였다. DNA 없는 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 전자 펄스 후 즉시, 1 mL의 BHIS 배지를 첨가하고 세포 현탁액을 에펜도르프 튜브로 옮기고 선별압력 없이 90분 동안 배양하였다 (30℃, 500 rpm, Thermo mixer comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany). pClik 및 pK19는 C. 글루타미쿰에서 복제할 수 없기 때문에, 벡터의 유전 전달에는 상동 재조합에 의한 플라스미드 DNA의 게놈으로의 삽입이 요구된다. 제 1 재조합 이벤트를 거친 형질전환주의 선별을 이틀 동안 30℃에서 CMKan 한천 평판배지에서 수행하였다. CMKan 으로부터의 단일 콜로니를 제 2 재조합에 사용하였다.
제 2 재조합
C. 글루타미쿰의 마커 없는 변형을 위하여, 전기천공법에 의해 도입된 벡터를 제 2 재조합 이벤트 및 슈크로스의 선별에 의해 제거하였다 (Jager, et al., 1992). 상기 목적을 위하여, 제 1 재조합 이벤트로부터의 단일 콜로니를 하룻밤 동안 5　mL BHI++ 배지(30℃, 230 rpm)에서 배양하고 1:1000-희석액 각각 100㎕ 및 200㎕를 CMSac에 치상하였다. 슈크로스에서의 C. 글루타미쿰의 배양 동안의 sacB 발현의 치명성 때문에, sacB를 포함하는 플라스미드가 제 2 상동 재조합 이벤트에 의해 제거된 재조합형 균주만이 생장할 수 있다. CMSac 에서 배양된 단일 콜로니를 이쑤시개로 집어서 CMSac 및 CMKan 래스터 플레이트에 패치하였다. 카나마이신에 민감하고 슈크로스에 내성이 있는 무작위로 선별된 10 내지 15개의 클론을 원하는 변형에 관하여 더 실험하였다.
스크리닝 및 균주 검증
변형에 따라, 스크리닝 및 균주 검증은 PCR 분석, 효소활성 측정 또는 시퀀싱을 포함하였다. 프로모터 교환 및 유전자 결실은 일반적으로 PCR을 통해 스크리닝하였고 효소 비활성 측정에 의하여 검증하였다. 그러나 개시코돈 치환의 스크리닝은 효소활성 실험으로 수행하였고 변화된 효소 비활성을 갖는 유망한 클론은 시퀀스 분석으로 더 자세히 조사하였다.
균주 특성화
최소배지에서의 회분배양
쉐이크 플라스크에서의 배양은 회전진탕기(진동 직경 5 cm, Multitron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland)에서 30℃에서 230 rpm으로 수행하였다. 제 1 전배양 (500　mL 배플드 플라스크에 50mL 배지)을 이틀 된 한천 평판배지로부터의 단일 콜로니로 접종하였고 8시간 동안 배양하였다. 세포를 원심분리법 (8800×g, 2 분, 4℃)으로 수확하고, 살균된 0.9　% NaCl로 세정하고, 제 2 전배양의 접종원으로 사용하였다. 이는 차후의 본 배양의 탄소원를 함유하는 500 mL의 배플드 플라스크의 50 mL 최소배지에서 수행하였다. 접종원으로서 제 2 전배양으로부터의 세포를 사용하여 3중으로(250 mL 배플드 플라스크에 25　mL 또는 2 L 배플드 플라스크에 200 mL) 본 배양을 수행하였다. 플라스크에 용해된 산소는 O2-의존 발광성 감쇠시간을 갖는 플루오로포어(fluorophore)를 함유하는 고정화 센서 스팟을 통하여 모니터하였다 (Wittmann, et al., 2003). 용해된 산소 레벨은 세포의 충분한 산소 공급이 보장되도록 각 배양 동안 포화도 20% 이상이었다. pH는 전체 배양 동안 7.0±0.2 범위였다. 추적자 실험에서는, 자연적으로 표지된 글루코스를 99　% [1-13C] 글루코스, 99 % [6-13C] 글루코스 또는 자연적으로 표지된 글루코스 및 99　% [U-13C] 글루코스의 등몰량 혼합물로 치환하였다. 최소배지에서의 바이오리액터 발효는 30 ±0.1℃, pH 7.0±0.1 및 800 rpm에서 100 mL의 작업량으로 250 mL 바이오리액터 (Meredos, Bovenden, Germany)에서 수행하였다. 용해된 산소 레벨은 전체 배양 동안 포화도 20% 이상이었다. 공기공급량은 질량유량계(Brooks Instruments, Veenendaal, The Netherlands)에 의해 100 mL min-1 로 유지하였다. 공기공급 및 배기가스의 조성은 사중극 질량분석기(Omnistar, Balzers, Vaduz, Liechtenstein)를 이용하여 2분 간격으로 온라인으로 측정하였다.
유가 발효(Fed-Batch Fermentation)
당밀 기반의 생산배지에서의 유가 발효는 5 L 용기에서 Sartorius 바이오리액터에서 Biostat B plus control unit으로 수행하였다. 공기공급량은 통합 가스 유량계에 의해 2.5 L min-1 로 설정하였다. pH 전극 (Mettler Toledo, Giessen, Germany)을 pH 모니터링에 사용하였다. pH를 6.9로 유지하기 위하여, 25 % NH4OH 를 Biostat control unit의 연동식 펌프 시스템을 이용하여 첨가하였다. 첨가된 양은 중량측정으로 (Lab Balance Cupis, Sartorius, Gottingen, Germany) 측정하였다. 용해된 산소를 pO2 전극(Mettler Toledo, Giessen, Germany)을 사용하여 측정하고 교반기 속도의 변화에 의해 20%의 포화도를 유지하였다. 이것은 프로세스 제어 소프트웨어 BaseLab (BASF SE, Ludwigshafen, Germany)에 의해 제어하였다. pO2 전극의 교정(calibration)은, 배지를 각각 합성의 공기 및 질소를 이용하여 차례차례 공기가 통하게 하였다. 냉각재킷(cooling jacket)을 이용하여 온도를 30℃에 맞추었다. 배기가스 내 CO2 및 O2 를 질량분석계를 이용하여 분석하였다. 모든 절차의 데이터를 온라인으로 모니터하였고 5분 간격으로 프로세스 제어 소프트웨어 BaseLab으로 기록하였다. pO2 신호에 의해 주입을 시작하였다. 10 % min-1보다 높은 속도를 가진 용해된 산소의 변화는 Biostat control unit의 연동식 주입 펌프를 활성화시켰다. 중량측정 방식으로 측정된 추가된 주입량을 통해 프로세스 제어 소프트웨어에 의해 주입량을 제어하였다.
발효는 1 L의 양에서 시작하였다. 이것을 CM 배지에서 회전진탕기(회전 직경 5 cm, Multitron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland)에서 230 rpm, 30℃에서 6시간 동안 배양된 세포로 접종하였다. 600 mL 전배양으로부터의 세포를 원심분리법 (8800×g, 2 분, RT)으로 수확하고, 50 mL의 살균된 NaCl (0.9 %)에 용해시키고 접종에 사용하였다. 흡광도 10으로 회분발효를 시작하였다. 공급 단계는 9시간 후에 시작하였고 총 30시간 동안 발효를 수행하였다.
벡터의 순차적 구축 및 박테리아로의 형질전환에 대한 일반적 개요
변형된 아스파테이트 키나아제 유전자를 운반하는 형질전환 벡터 No 4 (pClik_ lysC T311I )의 구축
표 3 (위 참조)에서 언급된 벡터 No 4 (pClik_lysC T311I)를 프라이머 P1 내지 P4 (SEQ ID Nos: 35 내지 38)를 이용하여 구축하고, 대립형질 치환에 의해 예를 들어 야생형 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 백그라운드에서의 점 돌연변이를 도입한다.
야생형 LysC-폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2)의 위치 311의 트레오닌으로부터 이소류신으로의 아미노산 치환을 야기하는 점 돌연변이를 운반하는 C. 글루타미쿰 균주의 제조를 위하여, 아스파테이트 키나아제 유전자(lysC, SEQ ID NO: 1)를 코딩하는 ORF를 증폭시켰다.
이를 위하여, C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 분리된 게놈 DNA를 야생형 lysC-유전자의 위치 932에서의 핵산 변형을 도입하는 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다.
변형된 lysC / LysC의 아미노산 시퀀스 및 뉴클레오티드 시퀀스를 각각 SEQ ID NO: 3 및 4로 표시한다.
보다 자세하게, 두개의 다른 DNA 단편을 각각 프라이머쌍 P1/P2 (PCR1) 및 P3/P4 (PCR2)을 이용하여 우선 PCR 증폭한다. PCR1 및 PCR2는 각각 P2 및 P3를 통한 lysC 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스에서 위치 932에서 점 돌연변이를 수행하는데 사용한다. 프라이머 P1 및 P4는 예를 들어 XhoI 및 SpeI 과 같은 제한효소의 인식부위를 추가하는데 사용한다.
PCR1에서 위치 932에서의 점 돌연변이를 포함하는 약 946 bp의 lysC 유전자의 시퀀스 및 약 500 bp의 lysC의 업스트림 시퀀스 및 XhoI의 인식부위를 함유하는 1467 bp의 DNA 단편을 수득한다.
PCR2에서 lysC 유전자의 위치 932에서의 뉴클레오티드 교환을 포함하는 lysC 유전자의 일부, 인위적으로 추가된 SpeI의 인식부위와 함께 약 150 bp의 lysC 유전자의 다운스트림 시퀀스를 함유하는 449 bp의 DNA 단편을 수득한다.
다음 단계에서, 각각 PCR1 및 PCR2에서 생산된 정제된 DNA 뿐만 아니라 프라이머 조합 P1 및 P4를 주형으로서 이용하여 상기 두 DNA 단편을 PCR3에서 융합한다. 그 결과 생성된 DNA 단편은 크기가 1916 bp이고, 약 500 bp의 lysC의 업스트림 시퀀스, 위치 932에서의 점 돌연변이를 포함하는 lysC의 완전한 ORF 및 약 150 bp의 lysC의 다운스트림 시퀀스 뿐만 아니라, 인위적으로 추가된 XhoI 및 SpeI의 인식부위를 함유한다.
또 다른 방법에서는, 프라이머 P1 및 P4 및 이미 lysC 유전자 내에 원하는 뉴클레오티드 교환을 함유하고 있는 DNA 주형을 이용하여 원하는 벡터 구축물을 수득한다.
증폭단계에 이어서, PCR-산물을 제한효소 XhoI 및 SpeI를 이용하여 절단하고 벡터 pClik으로 삽입한 뒤 이를 이용하여 E. coli DH5α를 형질전환한다. 형질전환된 E. coli DH5α의 배양에 이어서, 벡터를 분리하여 E. coli NM522를 형질전환하는데 사용한다. 이 균주는 이미 C. 글루타미쿰의 DNA-메틸전이효소의 발현벡터인 pTC 플라스미드 (위의 표 3 참고)를 포함한다. E. coli NM522 내의 두 플라스미드의 공존은 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 야기한다.
정확하게 메틸화된 lysC T311I 유전자를 함유하는 플라스미드 pClik_lysC T311I 를 사용하여 전기천공법으로 야생형 균주 ATCC 13032를 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 시퀀스 분석으로 조사한다. 하기의 균주 1로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체를 차후의 유전자 변형에 사용한다.
디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 ddh -유전자의 두개의 카피를 포함하는 형질전환 벡터 No 5 (pK19_2x ddh )의 구축
P5 내지 P8 (SEQ ID Nos: 39-42)로 명명된 프라이머를 이용하여 벡터 No. 5 (표 3 참조)를 구축하여 상술한 균주 1의 백그라운드에서 ddh의 제 2 유전자 카피를 대립형질 치환에 의해 도입한다.
디아미노피멜레이트 디하이드로게나제(SEQ ID NO: 6)를 코딩하는 야생형 ddh 유전자(SEQ ID NO: 5)를 증폭시키기 위하여, 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 분리된 게놈 DNA를 P5, P6, P7, 및 P8를 이용하여 PCR 증폭한다.
PCR1에서 완전한 ddh 시퀀스뿐만 아니라, 245 bp의 ddh 유전자의 업스트림 시퀀스 및 84 bp의 ddh 유전자의 다운스트림 시퀀스를 P5 및 P6을 이용하여 증폭한다. 그 결과 생성된 PCR 산물은 크기가 1305 bp이고 P5에 의해 도입된 EcoRI의 인식부위를 함유한다.
PCR2에서 ddh의 완전한 시퀀스는 245 bp의 ddh 유전자의 업스트림 및 84 bp의 ddh 유전자의 다운스트림과 함께 프라이머 P7 및 P8을 이용하여 증폭한다. 그 결과 생성된 DNA 단편은 크기가 1305 bp 이고 P8에 의해 첨가된 SalI의 인식부위를 함유한다.
다음 단계에서, 각각 PCR1 및 PCR2에서 수득된 두개의 정제된 DNA 산물을 주형으로 사용하고 PCR3에서 프라이머 조합 P5 및 P8를 이용하여 융합한다.
그 결과 생성된 DNA 단편은 크기가 2530 bp이고, 각각 크기 245 bp의 업스트림 부분 및 크기 84 bp의 다운스트림 부분을 측면에 배치한 두개의 완전한 ddh 유전자 뿐만 아니라 EcoRI 및 SalI(참고. SEQ ID NO: 7)의 인식부위를 함유한다.
증폭단계 후에, 제한효소 EcoRI 및 SalI을 이용하여 PCR-산물을 절단시키고 E. coli DH5α를 형질전환하는데 사용한 벡터 pK19에 삽입하였다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고, 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522을 형질전환하는데 사용하였다.
정확하게 메틸화된 ddh 유전자를 포함하는 플라스미드 pK19_2xddh 를 전기천공법을 이용하여 상술한 균주 1의 형질전환에 사용한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석 및 효소활성 측정으로 조사한다. 하기의 균주 2로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체는 차후의 유전자 변형에 사용한다.
부분적으로 결실된 PEP 카르복시키나아제를 포함하는 형질전환 벡터 No 6 (pClik_Δp ck )의 구축
형질전환 벡터 No 6 (pClik_Δpck; 위의 표 3 참조)의 구축을 위하여, 프라이머 P9-P12 (SEQ ID NO: 43-46)를 사용하여 대립형질의 치환에 의해 상술한 균주 2의 백그라운드에서 말단이 잘린 PEP-카르복시키나아제 (SEQ ID NO: 11)를 코딩하는, 파괴된 형태의 유전자 pck (SEQ ID NO: 10)를 도입하였다.
PEP 카르복시키나아제 (SEQ ID NO: 9)를 코딩하는 야생형 pck 유전자 (SEQ ID NO: 8)로 도입된 부분 결실을 위해, C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 프라이머 P9, P10, P11, 및 P12를 이용하여 PCR 증폭한다.
프라이머 P9 및 P10을 사용하여, PCR1에서 pck 유전자의 뉴클레오티드 111-509를 함유하는 420 bp의 DNA 단편을 증폭한다. P10을 사용하여 21 bp의 프라이머 P11에 상호보완적인 21 bp를 인위적으로 첨가한다. 수득된 시퀀스는 BamHI의 자연 인식부위를 함유한다.
PCR2에서 pck 유전자의 뉴클레오티드 1437-1833을 포함하는 417 bp의 DNA 단편을 프라이머쌍 P11 및 P12를 이용하여 증폭한다. P11을 사용하여 21 bp의 P10에 상호보완적인 21 bp를 인위적으로 첨가한다. 인식부위 BamHI을 인위적으로 첨가하기 위하여 P12를 사용한다.
다음 단계에서, 각각 PCR1 및 PCR2에서 수득된 두개의 정제된 DNA 단편을 프라이머 조합 P9 및 P12를 이용하여 PCR3에서 융합한다. 그 결과 생성된 DNA 단편은 크기가 807 bp이고, pck 유전자의 뉴클레오티드 111-509 및 1437-1833, 프라이머 P11 및 P12에 의해 첨가된 21개의 추가적인 염기쌍 뿐만 아니라 BamHI의 두 인식부위를 함유한다.
증폭단계 후, PCR-산물을 제한효소 BamHI를 이용하여 절단하고, E. coli DH5α를 형질전환하는 데 사용되는 벡터 pClik에 삽입한다. 이어서, 상기 벡터를 형질전환된 E. coli DH5α로부터 분리하고, 상술한 대로 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 야기하는 E. coli NM522의 형질전환에 사용한다. 플라스미드 pClik_Δpck이 포함하는 정확하게 메틸화된 DNA는 전기천공법을 이용하여 상술한 균주 2로 형질전환하였다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석 및 서던 블로팅(Southern Blotting)으로 검사한다. 하기의 균주 3으로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체를 차후의 유전자 변형에 사용한다.
변형된 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 포함하는 형질전환 벡터 No 7 (pK19_P sod dapB )의 구축
디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 (SEQ ID NO: 13)를 코딩하는 dapB 유전자(SEQ ID NO: 12) 및 dapB 유전자의 업스트림 내에서, sod 프로모터에서 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 형질전환 벡터 No 7 (pK19_P sod dapB; cf. 위의 표 3 참조)를 구축하여 상술한 균주 3의 백그라운드에서 프로모터 변형을 대립형질 치환을 통하여 도입한다.
보다 자세하게, dapB 유전자의 프로모터 교환은, C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 각각 sod 프로모터, dapB 유전자, dapB 유전자의 업스트림의 시퀀스 내에서 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 PCR-증폭한다. P13, P14, P15, P16, P17 및 P18로 지정된 적절한 프라이머 시퀀스는 SEQ ID NOs: 47 내지 52에 설명되어 있다.
PCR1에서 sod-프로모터의 시퀀스를 함유하는 약 200 bp의 DNA-단편을 증폭한다. 이는 P13 및 P14에 의해 달성되었는데, 이는 dapB 유전자와 중첩되는 시퀀스가 3'말단에서 인위적으로 추가되게 한다.
PCR2에서 개시코돈 및 유전자의 5'부분을 포함하는 dapB 유전자의 부분을 증폭한다. 이는 개시코돈의 5'말단에서 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스를 인위적으로 추가하는 프라이머 P15 및 P16에 의해 영향을 받는다.
다음 단계에서, 각각 PCR1 및 PCR2에서 수득된 두개의 정제된 DNA 단편을 PCR3에서 sod 및 dapB 특이 프라이머 시퀀스를 이용하여 융합한다.
PCR4에서 dapB 유전자의 업스트림 시퀀스의 부분을 증폭한다. 이는 3'말단에서 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스를 인위적으로 추가하는 프라이머 P17 및 P18을 이용하여 달성된다.
다음 단계에서 각각 PCR3 및 PCR4에서 수득된 정제된 DNA-단편을 프라이머 P17 및 P16을 이용하여 융합한다. 이 프라이머는 최종 DNA-단편을 측면에 두며, 벡터-삽입체-결찰에 적합한 제한효소의 인식부위를 인위적으로 추가한다.
벡터-삽입체-결찰을 위하여, PCR-산물 및 벡터를 선별된 제한효소로 절단하고, 이어서 결찰하고 이를 사용하여 E. coli DH5α를 형질전환한다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522를 형질전환하는데 사용한다.
정확하게 메틸화된 플라스미드 pK19_P sod dapB 를 전기천공법을 이용하여 상술한 균주 3을 형질전환하는데 사용한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석으로 조사한다. 하기의 균주 4로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체는 차후의 유전자 변형에 사용한다.
디아미노피멜레이트 탈카르복실라제의 두개의 카피를 포함하는 형질전환 벡터 No 8 (pK19_2x lysA 및 argS 의)의 구축
형질전환 벡터 No 8 (pK19_2xargSlysA; 위의 표 3 참고)을 lysA 유전자 내 및 그 다운스트림 뿐만 아니라, 아르기닐-tRNA 신타아제를 코딩하는 argS 유전자 내 및 그 업스트림에 특이적으로 결합하는 프라이머의 도움으로 구축하여 대립형질 치환에 의해 균주 4로 도입된 argS 의 시퀀스와 함께 lysA의 두번째 유전자 카피를 수득한다. argSlysA 유전자군은 SEQ ID NO: 15로 표시된다. LysA의 아미노산은 SEQ ID NO: 17로 표시된다.
lysA 및 argS의 두번째 유전자 카피를 하기 위하여, 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 PCR-증폭한다. 이를 위하여, 전체의 클러스트를 커버하는 세개의 별도로 증폭된 DNA-단편으로부터 argSlysA 군의 각 카피가 구축된다. 상기 단편들은 분리된 PCR에서 수득된다. 상기 목적을 위해 사용하는 프라이머 시퀀스는 P19, P20, P21, P22, P23, P24, P25 및 P26 (SEQ ID NOs: 53 내지 60)이다.
PCR1에서, 프라이머 P19 및 P20을 이용하여, argS 유전자의 5'부분을 argS 유전자의 약 500bp의 업스트림과 함께 증폭한다. 5'부분은 argS의 프로모터 시퀀스를 포함한다. 프라이머 P19는 또한 BamHI의 인식부위를 인위적으로 추가하는 데도 사용한다. 프라이머 P20은 EcoRI의 자연적으로 발생하는 인식부위에 위치한다. 수득된 DNA 단편의 크기는 1410 bp이다.
PCR2에서, 프라이머 P21및 P22을 이용하여, argS 유전자의 3'부분을 lysA 유전자의 5'부분과 함께 증폭한다. 프라이머 P21은 EcoRI의 자연적으로 발생하는 인식부위에 위치한다. 프라이머 P22는 SalI의 자연적으로 발생하는 인식 부위에 국한된다. 수득된 DNA 단편의 크기는 약 935 bp이다.
PCR3에서, 프라이머 P23및 P24를 이용하여, lysA 유전자의 3'부분을 약 80bp의 lysA의 다운스트림 시퀀스와 함께 증폭한다. 프라이머 P23은 SalI의 자연적으로 발생하는 인식부위에 위치한다. 프라이머 P24는 XbaI의 인식 부위를 첨가하는 데 사용한다. 수득된 DNA 단편의 크기는 약 1290 bp이다. 이어서, DNA 단편을 EcoRI 및 SalI의 인식부위를 통해 연결시킨다. PCR1, PCR2 및 PCR3으로부터의 연결된 DNA 단편은 argSlysA군의 첫번째 카피를 나타낸다. 다음 단계에서, 두번째 argSlysA 군을 구축한다.
PCR4에서, 프라이머 P25및 P20을 이용하여, argS 유전자의 5'부분을 약 500bp의 argS 유전자의 업스트림과 함께 증폭한다. 이 업스트림 부분은 argS의 프로모터 시퀀스를 포함한다. P25를 사용하여 XbaI의 인식부위를 인위적으로 추가한다. P20은 EcoRI의 자연적으로 발생하는 인식부위에 위치한다. 수득된 DNA 단편의 크기는 약 1374 bp이다.
PCR5에서, 프라이머 P21 및 P22를 이용하여, argS 유전자의 3'부분을 lysA 유전자의 5'부분과 함께 증폭한다. P21은 EcoRI의 자연적으로 발생하는 인식부위에, P22는 SalI의 자연적으로 발생하는 인식부위에 위치한다. 수득된 DNA 단편의 크기는 약 935 bp이다.
PCR6에서, 프라이머 P23 및 P26을 이용하여, lysA 유전자의 3' 부분을 약 70bp의 lysA 의 다운스트림 시퀀스와 함께 증폭한다. P23은 SalI의 자연적으로 발생하는 인식부위에 위치한다. P26을 이용하여 HindIII의 인식부위를 추가한다. 수득된 DNA 단편의 크기는 약 1256 bp이다.
이어서, DNA 단편을 EcoRI 및 SalI의 인식부위를 통하여 연결시킨다. PCR4, PCR5 및 PCR6로부터의 연결된 DNA 단편은 argSlysA군의 두번째 카피를 나타낸다.
argSlysA의 카피 1 및 카피 2 각각을 프라이머 P24 및 P25에 의해 추가된 XbaI의 인식부위를 통하여 연결한다. 연결된 카피(SEQ ID NO: 16)를 각각 프라이머 P19 및 P26를 통해 추가된 BamHI 및 HindIII의 인식부위를 통하여 형질전환 벡터 pK19에 삽입한다. 수득된 벡터를 사용하여 E. coli DH5α를 형질전환한다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522을 형질전환하는데 사용한다. 플라스미드 pK19_2xargSlysA가 포함하는 정확하게 메틸화된 구축물을 이용하여 전기천공법으로 균주 4를 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석으로 조사한다. 하기의 균주 5로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체는 차후의 유전자 변형에 사용한다.
sod -프로모터를 이용한 아스파테이트 키나아제 유전자를 포함하는 형질전환 벡터 No 9 (pClik_P sod LysC )의 구축
sod 프로모터, lysC 유전자 및 lysC 유전자의 업스트림 내에서 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 형질전환 벡터 No 9 (pClik_P sod lysC; 위의 표 3 참조)를 구축하여 균주 5의 백그라운드에서의 프로모터 변형 및 개시코돈 GTG 에서 ATC로의 수반되는 치환을 대립형질 치환에 의해 도입한다. 개시코돈 변형, sod 프로모터 및 치환 T311I을 운반하는 lysC의 DNA 시퀀스는 SEQ ID NO: 3로 표시된다.
lysC 유전자의 프로모터 교환을 위하여, 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 각각 sod 프로모터, lysC 유전자 및 lysC 유전자의 업스트림 내에서 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 PCR-증폭한다. 적절한 프라이머를 P27, P28, P29, P30, P31 및 P32로 지정한다 (SEQ ID NO: 61 내지 66).
PCR1에서, sod-프로모터의 시퀀스를 함유하는 크기 약 200 bp의 DNA-단편을 증폭한다. 이는 프라이머 P27 및 P28을 이용함으로써 달성되는데, 이는 lysC 유전자와 중첩되는 시퀀스가 3'말단에 인위적으로 추가되게 한다. P28은 개시코돈 GTG 에서 ATG로의 교환이 이루어지도록 lysC의 개시코돈의 위치에서 소정의 뉴클레오티드 교환을 운반한다.
PCR2에서 유전자의 개시코돈 및 5'부분을 포함하는 lysC 유전자의 부분을 증폭한다. 이는 프라이머 P29 및 P30을 이용함으로써 달성되는데, 이로 인하여 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 개시코돈에 부착된 5'말단에 인위적으로 추가된다. P29는 개시코돈 치환을 위한 소정의 뉴클레오티드 교환을 추가적으로 함유한다. 다음 단계에서, PCR1 및 PCR2에서 생산된, 수득되고 정제된 두개의 DNA 단편을 PCR3에서 각각 PCR1 및 PCR2에서 이전에 사용된 sod 및 lysC 특이 프라이머 시퀀스의 도움으로 융합한다.
PCR4에서 P31 및 P32의 도움으로 lysC 유전자의 업스트림 시퀀스의 부분을 증폭하는데, 이로 인하여 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 3'말단에서 인위적으로 추가된다.
다음 단계에서 프라이머 P31 및 P30뿐만 아니라 주형으로서 PCR3 및 PCR4로부터의 정제된 DNA를 이용하여 PCR3 및 PCR4으로부터의 DNA-단편을 융합한다.
말단 프라이머(P31 및 P30)를 이용하여 벡터-삽입체-결찰에 적합한 제한효소의 인식부위를 인위적으로 추가한다. 이를 위하여, 선별된 제한효소를 이용하여 PCR-산물 및 벡터를 절단하고 결찰한 뒤 E. coli DH5α를 형질전환하는데 사용한다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고, 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522의 형질전환에 사용한다. pClik_P sod lysC가 포함하는 정확하게 메틸화된 구축물은 전기천공법을 이용하여 균주 5를 형질전환하는데 사용한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석으로 조사한다. 하기의 균주 6으로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체를 차후의 유전자 변형에 사용한다.
돌연변이화된 호모세린 디하이드로게나제를 포함하는 형질전환 벡터 No 10 (pClik_ hom V59A )의 구축
프라이머 P33-P36(SEQ ID NO: 67 내지 70)을 사용하여 형질전환 벡터 No 10 (pClik_hom V59A, 위의 표 3 참조)을 구축하여 대립형질 치환에 의해 균주 6의 백그라운드에서의 hom 유전자(SEQ ID NO: 18)에서의 점 돌연변이를 도입한다.
Hom-폴리펩타이드(SEQ ID NO: 19)의 위치 59에서의 발린으로부터 알라닌으로의 아미노산 치환을 야기하는 점 돌연변이를 운반하는 C. 글루타미쿰 균주의 제조를 위하여, 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 ORF를 증폭한다.
이를 위하여, 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 야생형 hom-유전자의 위치 176에서의 핵산 변형을 야기하는 적절한 프라이머를 이용하여 PCR-증폭한다. 이는 P33, P34, P35 및 P36을 이용하여 달성된다. 변형된 hom/Hom의 뉴클레오티드 시퀀스 및 폴리펩타이드 시퀀스는 각각 SEQ ID NO: 20 및 21로 표시된다.
보다 자세하게는, 두개의 분리된 DNA 단편을 우선 각각 프라이머 P33/P34 (PCR1) 및 P35/P36 (PCR2)을 이용하여 증폭한다.
각각 PCR1 및 PCR2를 이용하여 프라이머 34 및 35의 도움으로 hom 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스에서 위치 176에서의 점 돌연변이를 수행한다.
이 프라이머 조합이 사용되면, 위치 176에서의 점 돌연변이를 포함하는 약 186 bp의 hom 유전자 및 약 500bp의 hom 유전자의 업스트림 시퀀스를 함유하는 686 bp의 DNA 단편이 PCR1에서 수득된다.
PCR2에서, hom 유전자의 위치 176에서의 뉴클레오티드 교환을 포함하는 hom 유전자의 부분을 함유하는 약 1054bp의 DNA 단편이 수득된다.
다음 단계에서, 상기 두 DNA 단편을 각각 프라이머 조합 P33 및 P36 및 PCR1 및 PCR2에서 수득된 두개의 정제된 DNA를 주형으로 사용하여 PCR3에서 융합한다. 그 결과 만들어진 DNA 단편은 크기가 1718 bp이고, 위치 176에서의 점 돌연변이를 포함하는 약 1218bp의 불완전한 hom 유전자 및 약 500bp의 hom의 업스트림 시퀀스를 함유한다.
대안적으로, 프라이머 P33 및 P36 및 hom 유전자내의 소정의 뉴클레오티드 교환을 이미 함유하는 DNA 주형을 이용하여 소정의 구축물을 수득한다. 프라이머 P33-P36을 사용하면 증폭된 DNA 단편은 자연적으로 XmaI 및 NheI의 인식부위를 함유한다.
증폭단계 후, 제한효소 XmaI 및 NheI 를 이용하여 PCR-산물을 절단시키고 그 결과 만들어진 단편을 이전에 XmaI 및 SpeI로 절단된 벡터 pClik에 삽입한다. SpeI 및 NheI는 DNA 절단 동안 상보적인 점착성 말단을 형성한다. 벡터를 이용하여 E. coli DH5α를 형질전환한다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522를 형질전환하는데 사용한다. 플라스미드 pClik_hom V59A 이 포함하는 정확하게 메틸화된 hom V59A 유전자를 이용하여 전기천공법으로 균주 6을 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행하였다. 무작위로 선별된 균주를 시퀀스 분석으로 조사하였다. 하기의 균주 7로 표시된, 양성으로 식별된 재조합체를 사용하여 차후의 유전자 변형을 수행하였다.
돌연변이체 피루베이트 카르복실라제를 포함하는 형질전환 벡터 No 11 (pClik_ pyc P458S ) 의 구축
형질전환 벡터 No 11 (pClik_pyc P458S , 위의 표 3 참조)을 대립형질 치환에 의해 균주 7의 백그라운드에서의 pyc 유전자(SEQ ID NO: 22)의 점 돌연변이의 도입에 적합한 프라이머 P37-P40를 이용하여 구축한다.
Pyc-폴리펩타이드 (SEQ ID NO: 23)의 위치 458에서의 프롤린으로부터 세린으로의 아미노산 치환을 야기하는 점 돌연변이를 운반하는 C. 글루타미쿰 균주의 제조를 위하여, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 ORF를 증폭시켰다.
이를 위하여, 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 분리된 게놈 DNA를 야생형 pyc-유전자의 위치 1372에서의 핵산 변형을 야기하는 적절한 프라이머를 이용하여 PCR증폭한다. 이는 P37, P38, P39, 및 P40 (SEQ ID NOs: 71-74)으로 지정된 프라이머를 이용하여 달성된다. 변형된 pyc/Pyc의 뉴클레오티드 시퀀스 및 폴리펩타이드 시퀀스는 각각 SEQ ID NO: 24 및 25로 표시된다.
보다 자세하게는, 두개의 분리된 DNA 단편을 각각 P37/P38 (PCR1) 및 P39/P40 (PCR2)을 이용하여 우선 생산한다. 이 경우, PCR1 및 PCR2는 각각 P38 및 P39의 도움으로 pyc 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스에서의 위치 1372에서 점 돌연변이를 도입하는 데 사용한다.
PCR1에서 유전자의 위치 1372에서의 점 돌연변이를 포함하는 불완전한 pyc 유전자를 함유하는 745 bp의 DNA 단편이 수득된다.
PCR2에서 pyc 유전자의 위치 1372에서의 뉴클레오티드 교환을 포함하는 pyc 유전자의 부분을 함유하는 744 bp의 DNA 단편이 수득된다.
다음 단계에서, 각각 PCR1 및 PCR2에서 수득된 두개의 DNA 단편을 프라이머 조합 P37 및 P40를 이용하여 PCR3에서 융합한다. 그 결과 생성된 DNA 단편의 크기는 1461 bp이고 유전자의 위치 1372에서의 소정의 점 돌연변이를 포함하는 pyc 유전자의 불완전한 시퀀스를 함유한다.
대안적으로, 프라이머 P37 및 P40 및 pyc 유전자에서의 소정의 뉴클레오티드 교환을 이미 함유한 DNA 주형을 이용하여 소정의 구축물을 수득한다. 증폭된 DNA 단편은 MluI 및 SalI과 같은 제한효소의 적절한 인식부위를 통하여 벡터 pClik으로 삽입될 수 있다.
돌연변이 피루베이트 카르복실라제를 포함하는 벡터를 E. coli DH5α를 형질전환하는데 사용한다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고, 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522를 형질전환하는 데 사용한다. 플라스미드 pClik_pycP 458S 이 포함하는 정확하게 메틸화된 pyc P458S 유전자를 이용하여 전기천공법으로 균주 7을 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 시퀀스 분석으로 조사한다. 균주 8로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체를 이용하여 차후의 유전자 변형을 수행한다.
sod-프로모터를 이용한 피루베이트 카르복실라제를 포함하는 형질전환 벡터 No 12 (pClik_P sod pyc )의 구축
pyc 유전자 및 pyc 유전자의 업스트림 내, sod-프로모터 내에서 특이적으로 결합하는 프라이머의 도움으로 형질전환 벡터 No 12 (pClik_P sod pyc)를 구축하여 대립형질 치환에 의해 균주 8의 백그라운드에서 프로모터 교환을 도입한다. sod-프로모터를 갖는 pyc 시퀀스는 SEQ ID NO: 24로 표시된다. 상기 시퀀스는 상술한 위치 458에서의 아미노산 치환 또한 함유한다.
pyc 유전자의 프로모터 교환을 위하여, 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 각각 pyc 유전자의 업스트림 뿐만 아니라, sod 프로모터의 시퀀스 및 pyc 유전자의 시퀀스 내에서 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다. 적절한 프라이머 시퀀스는 P41, P42, P43, P44, P45 및 P46 (SEQ ID Nos 75-80)으로 지정된 프라이머를 코딩하는 서열에 나타난다.
PCR1에서, sod-프로모터의 시퀀스를 함유하는 약 200 bp의 DNA-단편을 증폭한다. 이는 P41 및 P42을 이용하여 달성되는데, 이로 인하여 pyc 유전자와 중첩되는 시퀀스가 인위적으로 3'말단에서 추가된다.
PCR2에서, 개시코돈 및 유전자의 5'부분을 포함하는 pyc 유전자의 부분을 증폭한다. 이는 P43 및 P44를 이용하여 달성되는데, 이로 인하여 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 개시코돈에 부착된 5'말단에서 인위적으로 추가된다.
다음 단계에서, 수득된 두개의 DNA 단편을 각각 PCR1 및 PCR2에서 사용된 sod 및 pyc 특이 프라이머 시퀀스 및 PCR1 및 PRC2로부터의 정제된 DNA를 이용하여 PCR3에서 융합한다.
PCR4에서 pyc 유전자의 업스트림 시퀀스의 부분을 증폭한다. 이는 프라이머P45 및 P46에 의해 달성될 수 있는데, 이로 인하여 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 인위적으로 3'말단에서 추가된다.
그 후에, 주형으로서 PCR3 및 PCR4로부터의 정제된 DNA 및 프라이머 P45 및 P44를 이용하여 PCR3 및 PCR4로부터 생성된 DNA-단편을 융합한다. 프라이머 P45 및 P44를 사용하여 벡터-삽입체-결찰을 돕는 제한효소의 인식부위를 인위적으로 추가한다. 이를 위하여, PCR-산물 및 벡터를 선별된 제한효소로 절단하고, 이어서 결찰하고, 이를 이용하여 E. coli DH5α를 형질전환한다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고, 이를 이용하여 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522를 형질전환한다. 플라스미드 pClik_P sod pyc 이 포함하는 정확하게 메틸화된 구축물을 사용하여 전기천공법으로 균주 8을 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석으로 조사한다. 하기의 균주 9로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체를 이용하여 차후의 유전자 변형을 한다.
변형된 이소시트레이트 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 형질전환 벡터 No 13 (pClik_ icd A1G )의 구축
형질전환 벡터 No 13 (pClik_icd A1G; 위의 표 3 참조)을 프라이머 P47-P50의 도움으로 구축하여 대립형질 치환에 의해 균주 9의 백그라운드에서 개시코돈 교환을 도입한다.
이소시트레이트 디하이드로게나제 (SEQ ID NO: 27)를 코딩하는 icd 유전자에서 개시코돈 교환 ATG→GTG을 운반하는 C. 글루타미쿰 균주의 제조를 위하여 이소시트레이트 디하이드로게나제(icd, SEQ ID NO: 26)를 코딩하는 ORF를 증폭한다.
이를 위하여, 이전에 분리된 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 icd-유전자의 개시코돈 위치에서 핵산 변형을 도입하는 적절한 프라이머를 이용하여 PCR-증폭시켰다. 프라이머 P47, P48, P49 및 P50을 사용한다 (SEQ ID NO: 81 내지 84). 변형된 icd 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 28로 표시된다.
더 자세하게는, 두개의 분리된 DNA 단편을 각각 PCR-프라이머 P47/P48 (PCR1) 및 P49/P50 (PCR2)을 이용하여 우선 증폭한다. P48 및 P49를 이용하여 icd 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스의 개시코돈 위치에서의점 돌연변이를 수행하는 데 PCR1 및 PCR2를 사용한다. P47을 이용하여 XhoI의 인식부위를 추가하였고 P50을 이용하여 MluI의 인식부위를 추가하였다.
PCR1에서 개시코돈 위치에서의 점 돌연변이를 포함하는 약 18bp의 icd 유전자 및 502 bp의 icd의 업스트림 시퀀스 및 XhoI의 인식부위를 함유한 약 520 bp의 DNA 단편이 수득되었다.
PCR2에서 MluI의 인식부위 및 약 7bp의 icd 유전자의 업스트림 시퀀스 및 icd 유전자의 개시코돈 위치에서의 뉴클레오티드 교환을 포함하는 icd 유전자의 부분을 함유하는 520 bp의 DNA 단편이 수득된다.
다음 단계에서, 주형으로서 각각 프라이머 조합 P47 및 P50 및 PCR1 및 PCR2으로부터의 정제된 DNA를 이용하여 두개의 수득된 DNA 단편을 PCR3에서 융합한다. 그 결과 생성된 DNA 단편의 크기는 1014bp이고, XhoI 및 MluI의 인식부위 뿐만 아니라 약 500 bp의 icd의 업스트림 시퀀스, 개시코돈 치환 및 약 500 bp의 icd 유전자를 함유한다. 증폭단계 후에, 제한효소 XhoI 및 MluI를 이용하여 PCR-산물을 절단시키고, 차후에 E. coli DH5α를 형질전환하는데 사용되는 벡터 pClik에 삽입한다. 배양 단계 후, 벡터를 분리하고, 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E.coli NM522를 형질전환하는데 사용한다.
플라스미드 pClik_icd A1G 가 포함하는, 정확하게 메틸화된 icd A1G 유전자를 사용하여 전기천공법으로 균주 9를 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 효소활성 및 시퀀스 분석으로 조사한다. 하기의 균주 10으로 표시된, 양성으로 밝혀진 재조합체를 사용하여 차후의 유전자 변형을 수행한다.
eftu -프로모터를 이용한 프럭토스 1,6-비스포스파타아제를 포함하는 형질전환 벡터 No 14 (pClik_P eftu fbp )의 구축
형질전환 벡터 No 14 (pClik_P eftu fbp; 위의 표 3 참조)를 eftu 프로모터, fbp 유전자 및 fbp 유전자의 업스트림에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 구축한다. 상기 벡터를 이용하여 대립형질 치환에 의해 상술한 균주 10의 백그라운드에서 프로모터 교환을 도입한다.
프럭토스 1,6-비스포스파타아제(SEQ ID NO: 30)를 코딩하는 야생형 fbp 유전자(fbp 유전자및 자연형 프로모터의 시퀀스를 나타내는 SEQ ID NO: 29)의 프로모터 교환을 위하여, C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 PCR-증폭시켰다. 각각 eftu 프로모터 및 fbp 유전자(eftu-프로모터와 재결합한 fbp 뉴클레오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 31로 나타낸다)의 시퀀스 내에 뿐만 아니라, fbp 유전자의 업스트림에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용한다. 적절한 프라이머 시퀀스가 P51, P52, P53, P54, P55 및 P56으로 지정된 프라이머를 코딩하는 SEQ ID NO: 85 내지 90으로 표시된다.
PCR1에서, P51 및 P52를 이용하여, eftu-프로모터의 시퀀스를 함유하는 약 200bp의 DNA-단편을 증폭한다. PCR2에서 유전자의 5'부분 및 개시코돈을 포함하는 fbp 유전자의 부분을 증폭한다. 이는 P53 및 P54를 이용하여 달성되는데, 이로 인하여 eftu 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 개시코돈에 부착된 5'말단에서 인위적으로 추가된다.
다음 단계에서, 각각 PCR1 및 PCR2에서 수득된 두개의 정제된 DNA 단편을 PCR3에서 각각 PCR1 및 PCR2에서 사용된 eftu 및 fbp 특이 프라이머를 이용하여 융합한다.
PCR4에서 fbp 유전자의 업스트림 시퀀스의 부분을 증폭한다. 이는 프라이머 P55 및 P56를 이용하여 달성되는데, 이로 인하여 eftu 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 인위적으로 3'말단에서 추가된다.
다음 단계에서, 주형으로서 PCR3 및 PCR4로부터의 정제된 DNA 뿐만 아니라 프라이머 P55 및 P54를 이용하여 PCR3 및 PCR4로부터의 DNA 단편을 융합한다. 프라이머 P55 및 P54는 또한 벡터-삽입체-결찰에 사용될 수 있는 MluI 및 SalI와 같은 제한효소의 인위적인 인식부위를 추가하는데 적합하다. 이를 위하여, PCR-산물 및 벡터를 선별된 제한효소로 절단하고, 결찰하여 E. coli DH5α를 형질전환하는데 사용한다. 배양단계 후에, 벡터를 분리하고 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522을 형질전환하는데 사용한다. 플라스미드 pClik_P eftu fbp가 포함하는 정확하게 메틸화된 구축물을 이용하여 전기천공법으로 균주 10을 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석으로 조사한다. 하기의 균주 11로 표시되는, 양성으로 밝혀진 재조합체를 이용하여 차후의 유전자 변형을 수행한다.
tkt -오페론 및 sod -프로모터를 포함하는 형질전환 벡터 No 15 (pClik_P sod tkt )의 구축
균주 11의 백그라운드에서의 프로모터 교환을 야기하는 sod 프로모터, tkt 유전자에서 및 tkt 유전자의 업스트림에서 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 대립형질 치환을 통해 형질전환 벡터 No 15 (pClik_P sod tkt)를 구축한다.
자세하게는, tkt-오페론(SEQ ID NO: 32는 tkt-오페론의 첫번째 유전자인 tkt-유전자 및 tkt-프로모터의 시퀀스를 나타낸다)의 프로모터 교환을 구현하기 위하여, 예를 들어 C. 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 tkt-오페론의 첫번째 유전자이고 tkt 유전자의 업스트림 뿐만 아니라 트랜스케톨라제(SEQ ID NO: 33)를 코딩하는 tkt 유전자 및 sod 프로모터의 시퀀스 내에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다. 적절한 프라이머 시퀀스는 P57, P58, P59, P60, P61 및 P62 (SEQ ID NO: 91 내지 96)로 명명한 프라이머 시퀀스에 나타낸다.
PCR1에서 sod-프로모터의 시퀀스를 함유하는 약 200 bp의 DNA-단편을 증폭한다. 이는 P57 및 P58을 이용하여 달성된다. sod-프로모터 시퀀스 및 tkt-유전자의 재조합은 SEQ ID NO: 34로 표시된다.
PCR2에서 개시코돈 및 유전자의 5'부분을 포함하는 tkt 유전자의 부분을 증폭한다. 이는 P58 및 P59을 이용하여 달성되는데, 이로 인하여 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 개시코돈에 부착된 5'말단에서 인위적으로 추가된다.
다음 단계에서, PCR1 및 PCR2에서 수득된 두개의 DNA 단편을 정제하고 PCR3에서 주형으로 사용하여 두개의 단편을 PCR1 및 PCR2에서 사용된 sod 및 tkt 특이 프라이머 시퀀스로 융합하였다.
PCR4에서 tkt 유전자의 업스트림 시퀀스의 부분을 증폭한다. 이는 P61 및 P62을 이용하여 달성되는데, 이로 인하여 sod 프로모터와 중첩되는 시퀀스가 인위적으로 3'말단에서 추가된다.
다음 단계에서 PCR3 및 PCR4로부터의 DNA-단편을 PCR3 및 PCR4에서 수득된 정제된 DNA를 주형으로서, P61 및 P60를 프라이머로서 이용하여 융합한다. P61 및 P60을 사용하여 MluI 및 SalI과 같은 벡터-구축물-결찰에 적합한 제한효소의 인식부위를 인위적으로 추가한다. 이를 위하여, PCR-산물 및 벡터를 선별된 제한효소로 절단하고, 결찰하여 E. coli DH5α를 형질전환하는데 이용한다. 배양 단계 후에, 벡터를 분리하고, 정확하게 메틸화된 형질전환 벡터의 증폭을 가능하게 하는 pTC 플라스미드를 운반하는 E. coli NM522를 형질전환하는데 사용한다.
플라스미드 pClik_P sod tkt가 포함하는 정확하게 메틸화된 구축물을 이용하여 전기천공법으로 균주 11을 형질전환한다. 제 1 및 제 2 재조합 절차를 상술한 대로 수행한다. 무작위로 선별된 균주를 PCR 분석으로 조사한다. 양성으로 밝혀진 재조합체를 하기에서 균주 12라고 한다.
맞춤형 라이신 고생산원의 구축
본 발명의 바람직한 실시예에서, C. 글루타미쿰을 이용하여 라이신 생산을 합리적으로 최적화하는 다른 전략을 성공적으로 수행하였다.
모 균주 C. 글루타미쿰 BS1 및 C. 글루타미쿰 BS87의 예를 들면, 라이신 생합성의 주경로로부터의 몇가지 표적의 이점, NADPH 대사, 전구체 공급 및 CO2 형성을 조사하였다. 야생형 기반의 고생산원의 구축의 목적을 가지고, 밝혀진 변형을 단일 균주에서 결합하였다.
야생형 C. 글루타미쿰 ATCC 13032에 기반하여 산업적 생산균주에서 나타날 해로운 부작용을 최소화하기 위하여 오직 이로운 변형만을 수행하였다.
균주 구축 및 생산성
고생산원(hyper-producer)의 창출을 위한 첫번째 단계는 라이신 및 트레오닌에 의한 피드백 제어로부터 아스파테이트 키나아제를 해제시키는, 아미노산 교환 T311I를 도입하는 것이었다(Becker, et al., 2005). 이는 상술한 ddh의 과발현에 의해 보완되었다. 상기 두 변형의 단독 수행 및 추가의 배지 최적화는 이미 125mmol의 라이신(mol glucose)-1을 생산한 라이신 생산원을 창출하였다.
라이신 생합성 경로 내의 병목현상을 피하기 위하여, ddh뿐만 아니라 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 (dapB), 아스파테이트 키나아제 (lysC) 및 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제(lysA)를 과발현시켰다. 상기 효소들은 라이신 생합성의 공통 경로의 모든 부분이다. 따라서 라이신 생산에의 효과는 숙시닐라제와 디하이드로게나제 브랜치 사이를 분할하는 플럭스와 무관하다.
추가의 균주 최적화는 몇가지 추가적인 유전자 변형에 의해 수행되었다. 이는 자연 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 교환 V59A를 보이는 돌연변이 변이체로의 치환을 포함하였다. 이 돌연변이는 라이신 생합성과 직접적으로 경쟁하는 트레오닌 경로를 향한 탄소 플럭스를 감소시켜 라이신 생산을 증진시킨다(Ohnishi, et al., 2002). 라이신 형성을 위한 옥살로아세테이트의 충분한 공급을 보장하기 위하여, 추가적인 변형은 전구체 공급에 중점을 두었다. 이것들은 주요 보충 효소 피루베이트 카르복실라제의 과발현 및 변형 (Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001) 및 OAA-소비 반응 PEP 카르복시키나아제의 결실을 시사하였다 (Petersen, et al., 2001). 따라서 그 결과 생성된 균주 C. 글루타미쿰 BS87은 라이신 생합성 내에서의 9개의 변형 및 전구체 공급을 포함하였다 (도 32).
lysC 유전자에서의 조절 점 돌연변이와 ddh 유전자의 두번째 카피만을 보이는 초기 조상균주 C. 글루타미쿰 BS222과 비교해보면, C. 글루타미쿰 BS87에서의 추가의 변형은 라이신 생산의 경미한 증가만을 제공한다는 것이 확실해진다 (도 18). 따라서 오직 대사의 특이 부분에 중점을 둔 변형 전략은 효율적인 생산균주를 생산하기에 적합하지 않다. 그러나, 대사공학에 의한 증가된 라이신 생산을 위한 균주 최적화의 역사는 상기 전략에 의해 분명히 표시된다. 최적화된 라이신 생산원의 개념에서의 주요 반응으로서의 주요 경로 TCA 회로 및 NADPH 대사는 이제까지 거의 등한시되었다. 이 점과 관련하여, 본 발명은 상기 한계점을 극복하여 우수한 생산균주를 구축하기 위하여 이전의 전략을 완벽하게 보완하는 유전자 표적을 개시하였다. 따라서 의도하는 고생산원의 생성을 위한 다음 단계는 TCA 회로에 초점을 맞추었다. 상술하였듯이, C. 글루타미쿰 BS87의 백그라운드의 이소시트레이트 디하이드로게나제 (icd att )의 감쇠는 TCA 회로로부터 보충 카르복시화로의 효율적인 플럭스 전환에 의해 라이신 생산을 크게 증가시켰다. 라이신 생산에 있어서 상기 변형 전략은 CO2-형성에 의한 탄소 손실의 감소 뿐만 아니라 옥살로아세테이트의 증가된 공급에 의해 혜택을 받는다. NADPH 대사의 차후의 변형을 두개의 다른 전략에 의하여 수행하였다. 처음에, NADPH 공급 증진에 큰 영향을 준다고 밝혀진 글루코스신생합성 효소 프럭토스 1,6-비스포스파타아제를 과발현시켰다 (Becker, et al., 2005). 상술한 대로, 이 접근은 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 증폭된 발현으로 잘 보완한다. 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 제한된 용량으로 인한 PPP에서의 추가적인 한계를 처음부터 피하기 위하여, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 과발현과 수반하여, 상술한 대로 sod 프로모터를 통한 완전한 tkt-오페론의 상향조절에 의한 G6PDH의 과발현을 수행하였다. 상기 프로모터 교환에 답하여, G6PDH, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 비활성이 크게 증가하였다. 변형 전략의 개념이 도 32에 도시되어 있다. 상기 변형의 이점은 수득된 계보의 탄소 전환률과 비교해보면 명확해진다 (도 18).
야생형 C. 글루타미쿰 ATCC 13032부터 시작하여, 차후의 이로운 변형의 수행은 야생형 기반 라이신 고생산원을 야기하였다. 본 발명은 모든 관련 경로가 고려된 완벽한 합리적 균주의 첫 보고이다. 주요 조절효소의 피드백 제어를 극복하기 위해 아스파테이트 키나아제 내에서 처음에 도입된 변형이 중요하였다. ddh 과발현으로부터 야기되는 거의 50%의 증진이라는 큰 이점은 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)의 유전자 백그라운드에의 라이신 생합성 경로의 전체 용량이 강하게 라이신 생산을 제한하였다는 것을 분명히 보여주었다. 그러나, 이전의 연구(Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001; Petersen, et al., 2001)에서 이롭다고 설명된 전구체 공급의 변형 뿐만 아니라 라이신 경로의 추가 변형은 여기에서는 보통의 성공에 불과하였다. 이것은 다른 병목현상이 라이신 생산을 손상시키는 C. 글루타미쿰의 중추대사 내에서 일어났다는 것을 명쾌하게 가리킨다. 따라서, 본 발명에서 라이신 생산의 추가 변형에 대한 관심은 중간 대사의 다른 부분으로 옮겨졌다. 이 개념의 성공은 즉시 이소시트레이트 디하이드로게나제 (icd att)의 감쇠에 대한 대응에 의해 반영되었다. icd의 개시코돈에서의 단일 뉴클레오티드 교환의 수행은 라이신 수율을 C. 글루타미쿰 BS87에서 141 mmol mol-1 에서 당해 icd 돌연변이체에서 200 mmol mol-1 까지 증가시켰는데, 이는 40%의 증가를 나타낸다. 이전에 NADPH 제공 PPP로의 효율적인 플럭스 재지정을 야기하는 것으로 나타난 (Becker, et al., 2005) 프럭토스 1,6-비스포스파타아제의 후속의 과발현은 라이신 생산을 18% 더욱 강화하였다 (도 18). 마지막으로 도입된 여기에서 설명한 계보에서의 변형은 tkt-오페론의 프로모터 교환을 포함하였다. 이는 상기 오페론에 의해 코딩되는 효소 G6PDH, TKT 및 TAL의 활성을 크게 증가시켜서, 그 결과 라이신 수율을 13% 증가시켰다. fbp 및 tkt-오페론의 과발현으로부터의 이득은 NADPH의 불충분한 공급이 C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산을 강하게 제한하며, 증가된 PPP 플럭스를 목표로 한 변형 전략은 효율적인 라이신 고생산균주를 생산하는 것을 목표로 하는 것과 함께 매우 중요하다는 것을 분명히 보여준다. 펜토스 포스페이트 경로 유전자의 증폭된 발현의 추가적인 이점은 생장 거동과 관련하여 관찰되었다. 비생장률 0.23 h-1를 보이는 조상 C. 글루타미쿰 BS242 (Peftu fbp)와 비교하여, tkt-돌연변이체는 생장률이 0.32 h-1 였다. C. 글루타미쿰 BS244의 개선된 생장 거동과 결합하여 보다 높은 탄소 전환률(YLys/S = 26 %)은 감소된 발효 시간에 효과적인 라이신 생산을 가능하게 하여 이 균주의 전체적인 생산성을 증가시켰다. 마지막 세개의 변형의 구현으로, 라이신 생산이 거의 90%나 증가하였다. 이것은 오직 세 번의 유전자 변화로부터 야기된 주목할 만하고 놀라운 이득이다. 따라서, 이러한 변형 전략은 예를 들어 라이신 생합성 내의 병목현상 제거와 같은, 이전에 수행된 돌연변이로부터 부분적으로 이익을 얻는다고 가정할 수 있다.
조사된 균주의 생산 특성은 지금까지 최소배지에서 대수증식하는 세포용 쉐이크 플라스크 배양에서 실험하였다. 이러한 조건 하에서 가장 좋은 생산원 C. 글루타미쿰 BS244는, 낮은 기질농도에서의 최소배지 내의 쉐이크 플라스크 배양을 포함하는 실험 구성이 그 생산성을 분명히 제한하지만, 이미 26%의 놀라운 라이신 수율을 보였다. 따라서, 산업적으로 관련된 생산배지 상에서 유가 발효 공정에서 라이신 고생산원의 생산성을 조사하는 것이 적절하였는데, 이는 왜냐하면 이 배양 전략이 산업적 생산에 가장 가깝기 때문이다. 또한, 이 전략은 특히 종래의 방법으로 유도된 생산균주와 비교하여 새로운 고생산원의 잠재력의 보다 현실적인 평가를 가능하게 한다. 가장 좋은 생산원 C. 글루타미쿰 BS244 (Psod tkt)를 당밀 기반의 복합배지에서의 유가 발효를 포함하는 산업적 조건하에서 조사하였다.
산업적 발효 조건 하에서의 생산성
C. 글루타미쿰 BS244의 유가발효의 배양 프로필을 도 19에 나타낸다. 라이신 생산은 초기에 시작하였고 배양 상등액의 라이신 농도는 매우 높은 최종 역가 120 g L-1까지 30시간 내에 연속적으로 증가하였다. 주요 증가는 배치 배지(100 g L-1)에서 공급된 초기의 당이 소비된 후 시작된 공급 단계 동안에 달성되었다. 자동화된 공급의 신호로서, 용해된 산소 (pO2) 기반 신호가 공정 중에 사용되었다. 발효기 내의 O2 포화도는 교반기 속도에 의해 조절되었고 20%로 일정하게 유지되었다. 배지에서의 탄소 제한은 pO2 증가가 10　% min-1를 초과하였을 때 공급 펌프를 활성화한 pO2 의 즉각적이고 빠른 증가를 야기하였다. 당밀 및 클루코스에 기반한 공급용액을 라이신 생산을 위한 충분한 암모늄 공급을 보장하기 위해 황산암모늄으로 추가적으로 강화하였다. 이 전략에 의해 공급 단계에서의 당 농도가 10 g L-1 아래로 유지되었다.
흡광도에 의해 반영된 바이오매스 농도의 시간경로(time course)는 라이신 농도와 확연한 차이를 보였다 (도 34). 배치 단계(batch phase) 중에, 흡광도는 5배 증가한데 반해, 공급 단계에서는 겨우 세 배의 증가가 관찰되었다. 또한, 바이오매스 농도는 배양 단계가 끝날 때까지 증가하지 않았으나, 24시간 후에 최대값에 도달하였다.
균주 C. 글루타미쿰 BS244 의 생산 특성의 정밀 관찰은 발효단계가 더 나뉠 수 있다는 것을 보여주었다. 도 35에서 도시하였듯이, 다른 단계는 달성된 라이신 수율을 기반으로 구별될 수 있다. 여기에서 공급-단계 2(feed-phase 2)라고 명명된 가장 좋은 생산 단계에서, 라이신 고생산원은 55%의 라이신 수율을 보였다. 이 단계의 다른 특성은 거의 침체된 바이오매스 농도이다. 따라서, 소비된 당은 라이신 생합성 경로로 효율적으로 보내진다. 발효 절차가 시작할 때, 라이신 수율은 더 낮았다. 배치 단계 및 공급-단계 1을 포함하는 이 간격은 과도한 바이오매스 형성을 특징으로 하는 주요 생장 단계라고 분명히 설명될 수 있다 (도 34). 흥미롭게도, 이 단계에서 25%의 라이신 수율이 달성되었는데, 이는 대수증식기에서의 쉐이크 플라스크 배양 실험에서 달성된 라이신 수율과 매우 잘 부합한다.
본 발명에서 생산된 라이신 고생산원은 이제까지 설명한 야생형계 생산균주 중 가장 좋은 생산균주이다. 탄소 및 공간-시간 수율 뿐만 아니라 최종 라이신 역가를 고려할 때 상술한 합리적으로 생산된 균주(Ikeda, et al., 2006)보다 확실히 우수하다. 120 g L-1 의 최종 라이신 역가 및 55%의 탄소전환률을 갖는 이 균주는 종래의 방법으로 유도된 균주의 보고된 40-50%의 탄소수율 (Leuchtenberger, et al., 2005) 및 80-120g L-1 의 라이신 역가(Anastassiadis, 2007)의 최대 한계에 위치하는 생산 특성을 보인다. 그러나, 종래의 생산원의 이 생산성은 전형적으로 시간 공간 수율을 크게 손상시키는 100시간까지의 긴 발효시간(Anastassiadis, 2007)과 관련되어 있다. 이는 일반적으로 비특이 돌연변이 생성에 의해 균주 발달 동안 축적되는 많은 해로운 2차적인 돌연변이에 의해 야기되는 약한 생장과 관련 있다. 오직 12개의 독점적 이로운 변형의 세트를 단독 수행하여, 이러한 원치 않는 부작용을 야생형계 생산균주에서 피할 수 있었다. 빠른 생장 및 그로 인해 짧아진 30 시간의 발효 시간은 종래의 생산원에 의한 유가 발효 동안 달성된 2.1 g L-1 h-1 의 공간-시간 수율(Hirao, et al., 1989)보다 훨씬 높은 4 g L-1 h-1 의 시간-공간 수율을 야기한다. 여기서 수득된 생산성은 추가의 유전자 변형 또는 공정 절차의 개선으로 인해 더욱 증가될 수 있다. 이 점과 관련하여, 특히 최적화된 공급 전략은 생산성을 크게 향상시킬 수 있다 (Hirao, et al., 1989; Ikeda, 2003).
본 발명의 야생형계 라이신 고생산원은 균주 최적화의 방법으로서 시스템 대사공학(systems metabolic engineering)의 잠재력을 보여준다. 균주 C. 글루타미쿰 BS244는 산업적 적용에 매우 적합한 완전한 합리적 생산균주의 개념 및 가치의 훌륭한 증거이다.
분석방법
세포농도
샘플링
쉐이크 플라스크로부터의 흡광도 측정을 위하여, 1 mL의 샘플을 피펫을 이용하여 살균조건 하에 두고 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 세포농도의 중량측정을 위하여, 10-15 mL의 샘플을 살균한 원-웨이 리서치 피펫 (Sarstedt, Numbrecht, Germany)으로 취하여 미리 건조된 15 mL의 팔콘 튜브로 옮겼다. 정확한 배양량을 분석용 저울로(CP225D, Sartorius, Gottingen, Germany) 측정하였다. 바이오리액터 배양으로부터의 포샷(foreshots) 및 샘플을 삼방 콕을 통하여 주사기로 집어서 팔콘 튜브로 옮겼다.
수량화
세포농도를 1.5 mL 폴리스티렌 크벳 (Plastibrand, Wertheim, Germany)에서 660nm에서 물을 레퍼런스로 사용하여 광도 측정으로 (Libra S11, Biochrome, Cambridge, UK and Novaspec®II, Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) 측정하였다. 적절하다면, 0.05 내지 0.3의 흡광도를 얻기 위해 세포 현탁액을 분석용 저울 (CP225D, Sartorius, Gottingen, Germany)에서 희석시켰다. 모든 측정은 중복적으로 수행하였다. 흡광도 및 세포 건조량(CDM) 사이의 상관관계를 얻기 위하여, 세포농도를 추가적으로 중량측정(CP225D, Sartorius, Gottingen, Germany)에 의해 측정하였다. 후자를 위하여, 15 mL의 팔콘 튜브를 80℃에서 항량(constant weight)이 될 때까지 건조시키고, 이것을 이용하여 원심분리(10 분, 9800×g, Biofuge stratos, Heraeus, Hanau, Germany)에 의해 15mL의 배양배지로부터 세포를 수확하였다. 세포 물질의 손실을 막기 위해 상등액을 조심스럽게 폐기하였다. 물로 세포를 세번 세정하고 항량이 될 때까지 80℃에서 건조하였다. 세개 균주의 상관관계를 각각 생물학적 3반복으로 측정하였다. 그 결과 수득한 OD660 (Libra S11, Biochrome, Cambridge, UK)와 CDM의 상관관계는 도 3에 도시되어 있다. 해당하는 상관관계 인수는 CDM = 0.255×OD (g/L로 주어짐)로의 직선 회귀로 측정되었다.
아미노산
샘플링
아미노산의 수량화에 사용된 상등액을 원심분리 단계 (에펜도르프 튜브에서 13000×g, 5 분, 4 ℃, 팔콘 튜브에서 8500×g, 5 분, 4 ℃)에서 바이오매스의 분리에 의해 수득하였다. 발효 배지가 원심분리법에 의해 완전히 제거되지 않은 높은 바이오매스 농도를 보였기 때문에, 바이오매스의 완전한 제거를 보장하기 위해 유가 발효로부터의 샘플을 추가적으로 살균 여과하였다 (0.2 ㎛ Minisart filter, Sartorius, Gottingen, Germany).
수량화
최소배지에서의 배양으로부터의 아미노산의 측정을 위하여, 배양 상등액을 내부 표준으로서 α-아미노 부티르산 (237.18　㎛)으로 1:10으로 희석시켰다. 분석은 HPLC (Agilent Series 1100, Agilent Technology, Waldbronn, Germany)에 의해 수행하였다. 프로토콜은 o-프탈디알데히드(OPA)를 이용한 프리칼럼 유도체화(pre-column derivatization) 및 용리액 A (40 mM NaH2PO4, pH 7.8) 및 용리액 B (45 % 메탄올, 45 % 아세토니트릴, 10 % 물)의 기울기를 이용한 40℃에서의 C18 칼럼 (Gemini5u, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)에서의 분리를 포함하였다 (Kromer, et al., 2005). 모든 단백질 생성 아미노산의 분리는 상술한 표준 방법의 시간 프로파일에 의해 수행하였다. 상등액이 소량의 글루타메이트 및 글리신 뿐만 아니라 라이신을 함유할 경우에는 측정시간을 줄이기 위하여 기울기를 변형하였다 (표 9).
표 9: Gemini5u 칼럼 (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)에서의 HPLC에 의한 아미노산의 분리 및 수량화를 위한 용리액 A 및 용리액 B의 기울기 프로파일.
표준 방법 변형된 방법
시간 [분] A [%] B [%] 시간 [분] A [%] B [%]
0.0 100 0 0.0 100 0
41.0 59 41 16.0 64 36
46.0 19 81 17.0 0 100
46.5 0 100 20.0 0 100
49.0 0 100 20.5 100 0
49.5 100 0 22.0 100 0
52.0 100 0
유가 발효로부터의 샘플의 라이신 농도를 RI 검출기를 이용하여 HPLC (Agilent Series 1100, Agilent Technology, Waldbronn, Germany)에 의해 라이신-HCl로서 1:20으로 희석된 상등액에서 측정하였다. 분리는 Ionospher 5C 칼럼 (100 ×3.0 mm; Chrompack, Engstingen, Germany)에서 40℃에서 유량 1.5　mL min-1에서 수행하였다. 이동상은 5 % 메탄올 및 95 % 물에서 1.80 mM 시트레이트, 4.88 mM 에틸렌다이아민 및 20　mM 2,3-디하이드록시숙시네이트로 구성되었다.
당 및 유기산
샘플링
당 및 유기산의 수량화에 사용된 상등액은 상술한 대로 원심분리 단계 및 여과에 의해 수득하였다.
수량화
최소배지에서의 배양으로부터의 상등액을 1:10으로 희석하여, 이를 유기산 뿐만 아니라, 기질 글루코스 및 프럭토스 및 부산물 트레할로오스, 글리세롤, DHA의 HPLC (Kontron Instruments, Neufahrn, Germany)에 의한 측정에 이용하였다. Aminex HPX-87H column (300×7.8mm; Bio-Rad, Hercules, USA)에서 45℃에서 이동상으로 5 mM H2SO4을 이용하여 0.5 mL min-1의 유량에서 분리를 수행하였다. 굴절률 (당, 글리세롤) 및 210 nm에서의 UV 흡수 (유기산, DHA)를 검출에 사용하였다. 슈크로스의 수량화를 위하여, 칼럼 온도를 15℃까지 낮추었다. 용리액 농도를 10 mM의 H2SO4로 증가시켰다. 글루코스는 생화학 분석기 (YSI 2700 Select, Kreienbaum, Langenfeld, Germany)를 이용하여 대안적으로 수량화하였다.
유가 발효로부터의 당 및 유기산의 농도를 희석하지 않은 상등액 샘플에서 HPLC (Agilent Series 1100, Agilent Technology, Waldbronn, Germany)로 측정하였다. 양이온 H 전치칼럼을 갖는 Aminex HPX-87H column (300×7.8 mm; Bio-Rad, Hercules, USA)을 이동상으로서 5 mM의 H2SO4 과 함께 유량 0.5 mL min-1에서 30℃에서 사용하였다. 공급 용액의 당 농도는 1:10 희석으로 측정하였다. 검출을 위하여 굴절률을 이용하였다.
GC-MS에 의한 매스 이소토포머
샘플링
세포를 대수증식기 (13000 rpm, Biofuge fresco, Heraeus, Hanau, Germany)에서 수확하고, 물로 두번 세정하고 -20℃에서 저장하였다. 상등액을 원심분리 단계에서의 세포분리로 수득하고, -20℃에서 따로 저장하였다.
수량화
약 1 mg CDM과 동일한 세포를 50㎕의 HCl (6 M)에 용해시키고 세포 단백질을 24시간 동안 105℃에서 가수분해하였다. 가수분해물을 6 M의 NaOH를 첨가하여 중화시키고 세포 잔해를 여과(Ultrafree-MC centrifugal Filter Devices, Amicon, Bioseparations, Bedford, USA)로 제거하였다. 라벨링 패턴을 이전에 개시된 대로 GC-MS로 측정하였다 (Wittmann, et al., 2002). GC-MS는 HP-5-MS column (5 % 페닐-메틸-실록산-디페닐폴리실록산; 60 m×0.251 mm×0.25㎛, Agilent, Waldbronn, Germany) 및 운반기체로서 헬륨과 함께 HP 6890 가스 크로마토그래프(Hewlett Packard, Paolo Alto, Californien)로 구성되었다. 검출은 quadrupol MS 5973 detector (Agilent)를 이용하여 수행하였다. 샘플 제조는 동결건조 및 유도체화를 포함하였다. 동결건조된 가수분해물을 50㎕의 디메틸포름아미드 (DMF + 0.1 % 피리딘) 및 50㎕의 N-메틸-N-t-부틸-디메틸실릴-트리플루오르아세트아미드(MBDSTFA, Macherey-Nagel, Duren, Germany)에 용해시키고 30분 동안 80℃에서 배양하였다. 적절하다면, 측정 전에 원심분리로 염을 제거하였다. 아미노산 식별은 체류 시간 및 아미노산 표준을 사용한 단편화 패턴을 통해 수행하였다. MBDSTFA으로 유도체화된 아미노산은 매스 프래그먼트 [M-57], [M-85] 및 [M-159]을 포함하는 전형적인 단편화 패턴을 보여주는데, 이로 인하여 [M-57]은 아미노산의 완전한 카본 백본을 함유한다. 아미노산 잔기의 분리는 각 아미노산의 탄소 원자 C1 및 C2을 함유하는 매스 302를 갖는 단편의 형성을 야기한다. 플럭스 측정에 사용된 매스 프래그먼트를 표 10에 나타낸다.
트레할로오스의 매스 이소토포머 분배는 동결건조된 50㎕의 배양 상등액에서 측정하였다. 유도체화는 50㎕의 메톡실아민 (피리딘에 25　mg　mL-1 의 메톡실아민) 및 50㎕의 BSTFA (Macherey-Nagel)를 이용하여 30분 동안 80℃에서 수행하였다 (Kiefer, et al., 2004).
표 10: 플럭스 측정에 TBDMS 유도체로서 단백질 생성 아미노산의 매스 프래그먼트를 이용하였다. 주어진 질량은 오로지 라벨되지 않은 C, O, H, N, S 및 Si의 매스 이소토포머를 포함하는 단편 M0 을 가리킨다.
분석물 M0 [m/z] 단편 탄소 원자
알라닌
 260 M-57 C1-C3
232 M-85 C2, C3
글리신
 246 M-57 C1, C2
218 M-85 C2
발린

 288 M-57 C1-C5
260 M-85 C2-C5
218 M-159 C2-C5
트레오닌
 404 M-57 C1-C4
376 M-85 C2-C4
아스파테이트

 418 M-57 C1-C4
390 M-85 C2-C4
316 M-159 C2-C4
글루타메이트
 432 M-57 C1-C5
330 M-85 C2-C5
세린

 390 M-57 C1-C3
362 M-85 C2, C3
288 M-159 C2, C3
페닐알라닌

 336 M-57 C1-C9
234 M-159 C2-C9
302 M-잔기 C1, C2
티로신
 446 M-57 C1-C9
302 M-잔기 C1, C2
아르기닌 442 M-57 C1-C6
NMR에 의한 포지셔널 이소토포머(positional isotopomers)
샘플링
세포를 2회의 전배양 및 1회의 본배양에서 상술한 대로 배양하였다. 자연적으로 표지된 글루코스를 [6-13C] 글루코스로 치환하였다. 상등액을 원심분리 (13000 rpm, Biofuge fresco, Heraeus, Hanau, Germany)로 수득하고 질소 플럭스 하에 건조하였다.
수량화
이치환성 양자(labile protons)를 3 mL의 99.9 % D2O (Eurisotop, Saint-Aubain Cedex, France)에서 2회 동결건조하여 듀테륨으로 교환하고 최종 샘플을 600㎕의 100 mM DCl (Eurisotop)에 현탁시켰다. 5 mm z-gradient BBI 프로브를 구비한 Avance 500 MHz 분광계 (Bruker, Wissembourg, Cedex, France)에서 모든 1D 및 2D NMR 스펙트럼을 수득하였다. TOPSPIN®1.3 software를 이용하여 데이터를 수득하고 처리하였다. 온도는 298 K였다. 1D 양자 스펙트럼을 정량적 조건(quantitative conditions)을 이용하여 기록하였다. 풀 시그널 리커버리(full signal recovery)를 갖기 위해, 스캔 사이의 완화 지연은 30초이었고 펄스 앵글은 30°이었다. 스위프 폭은 5000 Hz였고 수득시간은 1.6초였다. 총 16 스캔이 축적되었다. 선별적인 여기(excitations)는 형성된 펄스를 이용하여 수행하였다. 여기 범위는 보다 큰 다중선 폭(multiple width) 때문에 100 Hz인 γ 양자를 제외하고는 60 Hz이었다. 1D 13C-decoupled DANTE-Z 시퀀스는 여덟 개의 연속적인 on-resonance Inversion BURP (I-BURP) 펄스 스캔과 잇따른 8개의 연속적인 off-resonance I-BURP 펄스 (Geen and Freeman, 1991) 스캔으로 구성되었다. 이 주기가 4회 반복되었다. 선별적 여기 후 0.7 G mm-1 의 퍼지 구배(purge gradient)를 적용하였다. 1D 13C-decoupled DPFGSE 시퀀스는 두개의 REfocusing BURP (RE-BURP) 펄스로 구성되었다. 구배 동력은 각각 0.7 및 0.3 G mm-1으로 설정하였다. 선별적 펄스 동안의 13C nuclei의 디커플링은 GARP4 시퀀스를 이용하여 3.8 kHz의 동력에서 수행하였다. 13C-decoupled DANTE-Z 펄스 모듈을 이전에 공지된 ZQFTOCSY 시퀀스 (Massou, et al., 2007)에 삽입하여 13C-decoupled DANTE-Z, Zero-Quantum Filtered TOCSY (DANTE-Z ZQF-TOCSY) 시퀀스를 생성하였다. 13C-decoupled DANTE-Z 펄스를 위와 같은 파라미터를 이용하여 적용하였다. 20 ms 동안 10 kHz의 필드 폭으로 적용된 DIPSI-2믹싱 시퀀스를 이용하여 TOCSY 트랜스퍼를 수행하였다. 믹싱 기간의 끝에, 평면 자화(in-plane magnetization)를 square 2.6 G mm-1 퍼지 구배로 압축하였다. 10%의 평활도를 갖는 180°CHIRP 단열 펄스, 20 kHz 스위프 폭, 및 330 Hz의 최대한의 RF 동력에서 30 ms의 지속기간으로 구성된 Zero-Quantum Filter (Thrippleton and Keeler, 2003)를 수득 전에 적용하였다. 단열 펄스(adiabatic pulse) 동안 square 0.2 G mm-1 구배 펄스를 적용하였다. 모든 NMR 측정은 기관 Ingenierie des systemes biologiques et des procedes (INSA, Toulouse, France)에서 수행하였다.
세포내 대사산물
샘플링
메탄올 급랭을 위하여 12 mL의 세포 현탁액(OD660 = 5)을 플라스틱 주사기에 흡수시키고, 미리 냉각된, 60 % 메탄올 (-58℃, 10 mM HEPES, pH 7) 24mL로 채워진 팔콘 튜브에 바로 주입시킨 뒤 즉시 격렬하게 혼합하고 5분 동안 원심분리(10000×g, -19℃, Biofuge Stratos, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany)하였다. 샘플링은 알칼리 뿐만 아니라 산의 추출을 위해 4중으로 병행 수행하였다.
전체 배양 급랭(culture quenching)은 대수증식기의 세포를 갖는 10mL의 배양을 액체질소에 배양된 유리병으로 옮김으로써 수행하였다. 동시에, 상등액(Bolten, et al., 2007)에서 발생하는 대사산물을 설명하기 위하여 여과 (0.2㎛ 기공 크기, Sartorius, Gottingen, Germany)로 세포 분리하여 상등액 샘플을 채취하였다. 뉴클레오티드 샘플링을 위하여 메탄올 급랭을 수행하였고, 전체 배양의 급랭으로부터의 샘플을 각각 글루코스 6-포스페이트 및 프럭토스 6-포스페이트의 측정에 사용하였다.
추출
900㎕의 HClO4 (pH　1)을 세포 펠릿에 첨가하고, 수조에서 55℃에서 7분 동안 배양하고, 즉시 얼음 위에 놓아 대사산물의 불안정성을 제거하여, 메탄올 담금질로부터의 산화된 뉴클레오티드를 추출하였다. 과염소산 샘플을 10000×g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 분리하였다. 상등액의 중화는 pH가 7.0이 될 때까지 5 M K2CO3를 조심스럽게 첨가하여 달성하였다. 그 결과로 생성된 침전물(KClO4)을 원심분리(5 분 동안 13000×g에서)로 제거하였다. 감소된 뉴클레오티드의 알칼리 추출은 900㎕의 에탄올 KOH 용액 (200 mL 1M K2HPO4 + 50 mL EtOH + 20 mL 5 M KOH, pH 12.4)을 세포 펠릿에 첨가하고 수조에서 55℃에서 2분 동안 배양하고, 이어서 얼음물에서 배양하고 세포 잔해를 제거하기 위하여 마지막으로 원심분리(5분 동안 10000×g, 4　℃에서)를 하여 수행하였다. 최종 pH 1.2에 10M의 HCl을 첨가하여 전체 배양의 급랭으로부터의 대사산물을 추출하였다. 이어서, 세포를 해동하고, 수조에서 50℃에서 8분 동안 추출하고 10 M의 KOH를 이용하여 중화하고, 원심분리(15 분, 10000×g, 4 ℃)로 세포 잔해를 제거하였다.
수량화
540　nm의 96-웰 플레이트 (iEMS Reader MF, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 효소적 사이클링 검사(Bernofsky and Swan, 1973)에 의해 포스포릴화된 뉴클레오티드 NADP 및 NADPH을 수량화하였다. 측정을 위하여 50 mM의 트리스-HCl (pH 7.8), 250 mM의 글루코스 6-포스페이트, 0.5 mM의 티아졸릴 블루, 2　mM의 페나진 에토설페이트 및 100 mU mL-1 의 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제를 함유하는 110개의 반응을 위한 마스터 믹스를 준비하였다. 25㎕ 샘플 또는 표준 용액(각각 NADP 또는 NADPH)을 웰 플레이트에 제공하고, 반응은 175㎕의 마스터 믹스를 첨가함으로써 시작하였다. 흡광도의 변화를 10분 동안 관찰하였다. 뉴클레오티드 표준품을 갖는 캘리브레이션 커브를 이용하여 수량화를 수행하였다.
글루코스 6-포스페이트 (G6P) 및 프럭토스 6-포스페이트(F6P)를 다단계 반응 (Bergmeyer and Hohorst, 1970)에서 효소적으로 측정하였다. 측정을 위하여, 200 mM의 트리스-HCl (pH 7.6), 0.2 mM의 NADP, 5 mM의 MgCl2 및 500㎕의 샘플을 함유하는 총량 1mL의 반응 믹스를 5분 동안 배양하고, 340 nm에서의 염기 흡광도(basic absorbance)를 측정하였다 (EO). 그리고 5㎕의 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(34 U mL-1)를 첨가하고 5분 후 E1을 측정하였다. 10㎕의 PGI (35 U mL)를 첨가하여 F6P의 전환을 시작하였고 340nm에서의 최종 흡광도를 5분 뒤 측정하였다(E2). G6P와 F6P의 혼합물을 함유하는 표준 용액으로 양성 대조군을 수행하였고, 음성 대조군은 물로 수행하였다. NADPH의 흡광계수 ε340 = 6.22 L　mmol-1　cm-1 및 샘플의 희석인자(dilution factor: DF) 를 고려하여, G6P 및 F6P의 농도는 하기의 식에 의해 계산될 수 있다:
Figure pct00003
효소활성
샘플링
대수증식기에서, 세포를 원심분리(5 분, 9800×g, Biofuge stratos, Heraeus, Hanau, Germany)로 수확하고, 파괴 완충제로 한 번 세정하고 마지막으로 0.25 g CWW/mL에 현탁시켰다. 파괴는 얼음물 수조에서 20 미크론에서 5회의 15 초 펄스로 초음파처리 (MSE soniprep 150, Sanyo Europe, Munich, Germany)로, 또는 기계적으로 수행하였다. 이를 위하여, 세포 현탁액을 글라스 비드를 함유하는 2　mL 에펜도르프 튜브에 750㎕의 양을 분취하였다. ribolyser (MM301, Retsch, Haan, Germany)에서 30　Hz (2×5분; 사이에 5분 휴식)에서 파괴를 수행하였다. ribolyser 파괴를 위하여 10분 동안 13000 rpm(Biofuge stratos, Heraeus, Hanau, Germany)에서의 원심분리에 의해 또는 초음파처리에 의한 파괴를 위하여 8500 rpm(Biofuge fresco, Heraeus, Hanau, Germany)에서의 2×30 분 동안 원심분리에 의해 조 세포추출물을 수득하였다. BioRad (Quick Start Bradford Dye, BioRad, Hercules, USA)의 시약 용액 및 BSA 단백질 표준을 이용하여 Bradford (Bradford, 1976) 방법으로 단백질 함량을 측정하였다.
수량화
모든 측정은 흡광도의 변화를 온라인으로 모니터하여 분광측광기 (Specord 40, Analytik Jena, Jena, Germany or Helios alpha, Thermo Scientific, Waltham, USA)에서 총량 1mL에서 3중으로 수행하였다. 음성 대조군은 각각 기질 또는 세포추출물 없이 수행하였다. 활성은 30℃에서 1 U = 1　μmol min-1를 갖는 비효소활성 [U mg-1]으로서 주어졌고 흡광도 [A　min-1]의 변화 및 NAD(P)H의 비흡광계수 e340 = 6.22 L mmol-1 cm-1 로부터 계산하였다. 일반적 절차로서, 기질 및 세포추출물이 없는 마스터 믹스를 반응 완충제, MgCl2, 보조인자 (NADP, NAD, NADH, ADP, TPP, CoA) 및 커플링 효소 (LDH, G6PDH, PGI, 리보오스 5-포스페이트 이소머라제 (RPI), 리불로스 5-포스페이트 에피머라제 (RPE), TPI/GDH)의 모액으로부터 제조하고 10분 동안 30℃에서 배양하였다. 기질용액 및 세포추출물을 1.5 mL의 폴리스티렌 크벳 (Plastibrand, Wertheim, Germany)에 제공하였다. 마스터 믹스를 즉시 첨가하여 반응을 시작하였다.
글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 (G6PDH) (Moritz, et al., 2000)
세포 파괴를 100 mM의 트리스/HCl (pH 7.5), 10 mM의 MgCl2 및 0.75 mM의 DTT를 함유하는 완충제에서 수행하였다. DTT를 100 mM의 모액으로서 갓 제조하고 파괴 전에 세포 현탁액에 첨가하였다. 효소의 불안정성 때문에, 세포 파괴 후에 즉시 활성을 측정하였다. G6P 디하이드로게나제 활성의 수량화를 위한 반응 믹스는 100 mM의 트리스/HCl (pH 7.8), 200 mM의 KCl, 1 mM의 NADP, 10　mM의 MgCl2, 5　mM의 G6P 및 50 ㎕의 세포추출물을 함유하였다. Michaelis-Menten 친화상수를 각각 기질, G6P 또는 NADP의 농도를 달리 하여 측정하였다. 이펙터의 활성에의 영향을 측정하기 위하여, 반응 믹스를 다양한 농도의 ATP, PEP, FBP 또는 NADPH로 추가적으로 보충하였다.
피루베이트 키나아제 (PYK) (Netzer, et al., 2004)
피루베이트 키나아제 활성의 측정을 위하여, 10 mM MgCl2 을 함유하는 100 mM의 트리스/HCl (pH 7.5)에서 세포를 파괴시켰다. 커플링 효소로서 젖산디하이드로게나제 (LDH)를 이용하고 A340의 온라인 모니터링을 이용하여 활성을 측정하였다. 검사를 100　mM의 트리스/HCl, 15　mM의 MgCl2, 1　mM의 ADP, 0.25　mM의 NADH, 5.5　U의 LDH, 10 mM의 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 10㎕의 조 세포추출물을 이용하여 pH 7.0에서 수행하였다. 기질 (1　M PEP)의 모액을 사용 전에 pH 7.0으로 맞추었다.
말산 효소 (MalE) (Gourdon, et al., 2000)
말산효소 활성의 측정을 위한 파괴 완충제는 100 mM의 트리스/HCl (pH 7.8) 및 200 mM의 KCl을 함유하였다. MalE 활성을 2 mM의 MgCl2, 1 mM의 NADP, 40 mM 의 말레이트 및 50㎕의 세포추출물을 추가적으로 함유하는 같은 완충제에서 측정하였다. 모액으로서 농도 1 mol L-1 및 pH 7.8인 말레이트를 제조하였다.
이소시트레이트 디하이드로게나제 (ICD)
세포 파괴 및 활성 측정을 10 mM의 MgCl2을 함유하는 100 mM 트리스/HCl (pH 7.8)에서 수행하였다. 효소활성 측정을 위한 반응 믹스는 추가적으로 1 mM의 이소시트레이트, 0.5 mM의 NADP 및 25㎕의 조 세포추출물을 함유하였다.
피루베이트 디하이드로게나제 (PDH)
100 mM의 트리스/HCl (pH 7.4), 10 mM의 MgCl2 및 3 mM의 시스테인 (Blombach, et al., 2007)에서 파괴를 수행하였다. 피루베이트 디하이드로게나제 활성의 수량화를 위한 반응 믹스는 50　mM의 트리스/HCl, 0.01 mM의 CaCl2, 0.3 mM의 TPP, 0.12 mM의 CoA, 2 mM의 NAD, 3 mM의 시스테인, 5　mM의 피루베이트 및 50㎕의 세포추출물을 함유하였고 pH 7.4에서 수행하였다 (Guest and Creaghan, 1974).
포스포글루코이소머라제 (PGI) (Dominguez, et al., 1998)
PGI의 측정을 위하여, 10　mM의 MgCl2를 함유하는 100 mM의 트리스/HCl (pH 7.8)에서 세포를 파괴시켰다. 커플링 효소로서 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 (G6PDH)및 340 nm에서 NADPH 형성의 온라인 모니터링을 통하여 활성을 수량화하였다. 검사는 pH 7.8에서 100 mM의 트리스/HCl, 10 mM의 MgCl2, 0.5 mM의 NADP, 1.25 U의 G6PDH, 4 mM의 프럭토스 6-포스페이트 및 10㎕의 조 세포추출물을 이용하여 수행하였다.
디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 (DDH) (Cremer, et al., 1988)
DDH 활성 측정을 위한 파괴 완충제는 100 mM의 트리스/HCl 및 10　mM의 MgCl2 을 함유하였고 pH를 7.8로 맞추었다. DDH 활성을 메조-디아미노피멜레이트 산화 및 수반되는 NADPH 형성 방향으로 측정하였다. 이 방향을 뒷받침하기 위하여 알칼리 pH 10.5에서 반응을 수행하였다. 200 mM의 글리신/NaOH (pH 10.5), 10 mM의 MgCl2, 2 mM의 NADP, 4 mM의 메조-디아미노피멜레이트 및 50㎕의 세포추출물을 이용하여 반응을 수행하였다.
프럭토스 1,6-비스포스파타아제 (FBPase)
FBPase의 인비트로 활성의 측정은 약간의 수정을 한 Sugimoto와 Shiio의 프로토콜 (Sugimoto and Shiio, 1989)에 기초하였다. 반응 믹스는 100　mM의 트리스/HCl, 10 mM의 MgCl2, 0.5 mM의 NADP, 1 mM의 프럭토스 1,6 비스포스페이트, 2 U의 포스포글루코이소머라제, 1 U의 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 및 50㎕의 세포추출물을 함유하였다. 세포 파괴는 pH 7.8에서 100 mM의 트리스/HCl에서 수행하였다.
트랜스케톨라제 (TKT)
조 세포추출물을 100 mM의 트리스/HCl에서 pH 7.8에서 제조하였다. TKT 활성의 측정은 몇 커플링 효소의 적용을 요구하였다. RPI 및 RPE이 커플링 효소의 역할을 하여 검사에 공급된 리보오스 5-포스페이트(R5P)로부터의 기질 리불로스 5-포스페이트 및 자일로오스 5-포스페이트를 제공하였다. 340 nm에서의 온라인 모니터링은 트리오스포스페이트 이소머라제 및 글리세로포스페이트 디하이드로게나제 (TPI/GDH)에 의한 TKT 반응의 산물로서의 글리세르알데히드 3-포스페이트의 추가적 전환에 의해 가능했다. 상술한 절차와 반대로, 두개의 별개의 마스터믹스를 제조하였다. 믹스 A는 총량 650㎕에 완충제, TPI, RPI, RPE 및 NADH를, 믹스 B는 총량 300㎕에 완충제, TPP, MgCl2 및 세포추출물을 함유하였다. 두가지 모두 10분 동안 30℃에서 미리 가열하였다. 크벳에 리보오스 5-포스페이트를 제공하였고 믹스 B 및 믹스 A의 첨가에 의해 반응이 시작되었다. 최종 반응 믹스는 50 mM의 트리스/HCl (pH 7.8), 0.5 mM의 NADH, 1 U의 RPI, 0.5 U의 RPE, 1 U의 TPI/GDH, 10 mM의 MgCl2, 0.2 mM의 TPP, 20 mM의 R5P 및 50㎕의 조 세포추출물을 함유하였다.
트랜스알돌라제 (TAL)
트리스/HCl 완충제 (100 mM, pH 7.8)에서 세포파괴를 수행하였다. 트랜스알돌라제의 측정을 위한 반응은 추가적으로 1 mM의 프럭토스 6-포스페이트, 0.5 mM의 NADH, 4 mM의 에리트로오스 4-포스페이트, 6 U의 TPI/GDH 및 50㎕의 조 세포추출물을 함유하는 50 mM의 트리스/HCl 완충제 (pH 7.8)에서 수행하였다. TPI/GDH는 커플링 효소로서의 역할을 하여 340 nm에서 온라인 모니터링을 가능하게 하였다.
대사 플럭스 분석
시스템 와이드의 [13C] 대사 플럭스 분석
글루코스에서 배양된 C. 글루타미쿰에 의한 생장 및 라이신 생산을 위한 대사 네트워크는 모든 중추 대사경로, 즉 글리콜리시스, PPP, 트리카르복실산 회로, 및 보충 카르복시화 및 탈카르복시화를 포함하였다. 또한, 중간 전구체로부터 바이오매스까지의 동화 경로 뿐만 아니라 라이신 및 다른 부산물의 생합성 경로를 수행하였다. 글리신 합성을 위하여, 두개의 가능한 경로 즉, 세린을 통한 경로 및 트레오닌 알돌라제를 통한 경로(Simic, et al., 2002)를 고려하였다. 이전의 결과에 근거하여, 글리옥실산 경로는 비활성일 것으로 가정하였다 (Wittmann and Heinzle, 2002). C. 글루타미쿰에서 피루베이트 카르복실라제, PEP 카르복실라제, 말산 효소 및 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제는 C3 및 C4의 대사산물의 상호 변환(inter conversion)을 통하여 글리콜리시스와 TCA 회로를 연결한다 (Wittmann and Becker, 2007). 기본 모델에서, 카르복시화 및 탈카르복시화는 각각 럼프트 플럭스(lumped flux)로 간주하였다. 그러나, 확장 접근에서는, 모든 단일 효소를 개별 반응으로 간주하였다. 상기 목적을 위하여, PEP 및 피루베이트를 개별대사 푸울로 나누었다. 다른 전구체의 동화작용의 수요에 대한 계산은 세포의 디아미노피멜레이트 함량에 기초한 세포벽 합성에 대한 특이 동화작용 수요를 고려한 C. 글루타미쿰의 바이오매스 조성의 데이터에 기초하였다 (Wittmann and de Graaf, 2005). 단백질생성 아미노산 및 트레할로오스의 라벨링하는 데이터 및 세개의 병행 배양으로부터의 화학량론적 데이터의 평균값을 대사 플럭스의 계산을 위하여 결합하였다. 실험적 (Mi,exp) 및 모의 (Mi,calc) 매스 이소토포머 분율 사이의 편차가 가장 적었던 플럭스의 세트를 가장 좋은 세포내 플럭스 분포 평가치로 간주하였다. 네트워크는 최소제곱법이 가능하도록 과측정하였다 (over-determined). 최소제곱법의 가중치의 합을 오차 기준으로 사용하였다 (Wittmann and Heinzle, 2002). 수득된 플럭스의 통계학적 분석을 Monte Carlo 접근으로 수행하였다 (Wittmann and Heinzle, 2002). 수득된 데이터로부터, 단일 파라미터의 90 % 신뢰 한계를 계산하였다. 모든 대사적 시뮬레이션을 Matlab 7.0 또는 Matlab 9.0 (Mathworks Inc.)을 이용한 개인 컴퓨터로 수행하였다 (Wittmann and Heinzle, 2001a; Wittmann and Heinzle, 2001b; Wittmann and Heinzle, 2002). 플럭스 분배비(flux partitioning ratio(Φ)) 및 플럭스 가역성(flux reversibility (ζ))은 각각 두개의 브랜치 중 하나로의 상대적 플럭스 및 포워드 방향에서의 순 플럭스에 대한 백워드 또는 교환 플럭스의 비율로 정의되었다 (Wittmann and Heinzle, 2002). 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(PEPC), 피루베이트 카르복실라제(PC), 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 (PEPCK), 및 말산 효소 (MAE)에 의해 촉진된 반응을 갖는 피루베이트 노드에 있어서, 정의는 다음과 같다:
Figure pct00004
또한, 라이신 생합성 경로의 분배비를 라이신으로부터의 탄소 원자 Cβ 및 Cσ 의 비 13C 강화 및 [6-13C] 글루코스에서 배양된 C. 글루타미쿰의 배양 상등액으로부터의 아세테이트로부터의 Cβ로부터 하기의 식과 같이 측정하였다:
Figure pct00005
화학량론 기반의 플럭스 측정
상대적 시트레이트 신타아제 플럭스 (υCIS) 및 상대적 피루베이트 디하이드로게나제 플럭스(υPDH)의 라이신 수율 (YLys/S) 및 바이오매스 수율(YX/S)과의 밀접한 상관관계가 화학량론적 데이터에 기초한 플럭스 측정에 탄탄한 기본을 제공하였다.
필수의 화학량론적 상관관계는 18개의 독립적 플럭스 평가치의 풍부한 데이터 세트의 포물면 접합(paraboloid fitting)으로 달성되었고 υCIS 및 υPDH 의 계산을 하기와 같이 가능하게 하였다:
Figure pct00006
비슷하게, 보충반응을 통한 순 플럭스(υPYC)는 화학량론적 특징과 밀접한 상관관계가 있다 (Wittmann and Heinzle, 2002). 여기에서 관찰되었듯이, TCA 회로로부터의 부산물 형성의 결핍이 동화작용 및 라이신 합성을 위한 TCA 회로로부터의 탄소의 철회를 통한 υPYC의 계산을 가능하게 하였다:
Figure pct00007
옥살로아세테이트(υ OAA, Anabolism) 및 α- 케토글루타레이트(υ AKG, Anabolism) 동화작용의 수요를 바이오매스 수율 및 표 A.4에 주어진 C. 글루타미쿰 의 세포의 조성으로부터 측정하였다(Wittmann and de Graaf, 2005). 이러한 플럭스 파라미터의 평균값 및 신뢰 구간을 Monte-Carlo 접근을 이용하여 바이오매스, 라이신 수율 및 동화작용 플럭스의 100개의 다양한 값으로부터 계산하였다. 플럭스 값을 소프트웨어 오리진 (Microcal Origin 6.0)을 이용하여 t-테스트에 의해 통계적으로 측정하였다.
산화환원 반응(Redox) 밸런싱
보조인자 대사에 관한 보다 깊이 있는 통찰을 위하여 완전한 산화환원 반응 밸런스(식 12)를 플럭스 데이터 및 C. 글루타미쿰의 대사 네트워크에 기반하여 설정하였다. 계산을 위하여, 산화성 인산화(oxidative phosphorylation) 동안의 모든 가능한 산화환원 반응을 고려하였다 (Yang, et al., 2006a).
Figure pct00008
여기서 v O2 는 산소 소비 플럭스를 가리키고 v XADH 및 v NADPH 는 각각 NADH, FADH 및 NADPH의 순생산량을 가리킨다. 모든 관련 반응을 계산에 넣어 C. 글루타미쿰의 대사 네트워크의 플럭스로부터 동화작용의 NADPH 소비 Y NADPH/X = 16.4 mmol g-1 (Wittmann and de Graaf, 2005) 및 동화작용의 NADH 생산 Y NADH/X = 3.2 mmol g-1 (Yang, et al., 2006a)를 이용하여 v XADH 및 v NADPH 를 계산할 수 있다:
Figure pct00009
G6P 디하이드로게나제 (v 2), 6-포스포글루콘산 디하이드로게나제(v 3) 및 이소시트레이트 디하이드로게나제(v 24)를 주요 NADPH 공급 효소로 간주한다 (Wittmann and de Graaf, 2005). 산소 소비 플럭스를 실험적으로 측정된 호흡률(respiratory quotient: RQ) 및 이산화탄소 생산 플럭스(v CO2)를 통하여 계산하였다:
v O2 = v CO2 ×Q (15)
v CO2 의 계산을 위하여 중앙 탄소 대사 및 동화작용으로부터의 모든 CO2 생산 및 소비 반응을 고려하였다:
Figure pct00010
상기 식 (16)은 보충 순 플럭스를 나타내고 C. 글루타미쿰의 동화작용 CO2 생산량은 Y CO2 / X = 1025μmol g-1 이다(Yang, et al., 2006a).
Figure pct00011
라이신 생산 C. 글루타미쿰 의 대사 플럭스 분석
인비보 플럭스의 분해(resolution)는 조사된 유기체의 유전자적 또는 환경적 장애에 대한 대사 반응에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이것은 생세포의 복잡성이 유전자 변형의 임팩트에 대한 정확한 예측을 지연시키기 때문에, 특히 합리적 균주 최적화를 위하여 중요하다.
전제 조건
본 발명에서 대사 플럭스 분석은 GC-MS에 의한 가수분해된 세포 단백질로부터 수득된 라벨링 정보를 이용한 고정된 플럭스 분석으로서 수행되었다. 이 접근은 상수 배치 파라미터, 즉 pH 및 pO2 가 필수적인 조사된 배양의 대사 및 동위원소의 정상상태를 요구한다. 도 4A에 도시되어 있듯이 균주 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)에 있어서, 선별된 배양 조건은 적용된 배플드 쉐이크 플라스크에 흡광도 10까지의 충분한 산소 공급 뿐만 아니라, C. 글루타미쿰의 대수증식 및 pH의 유지를 뒷받침하였다(Novaspec III). 대사 정상상태의 존재는 또한 조사된 균주의 끊임없는 생장 및 생산 거동으로부터 보장된다 (도 4B).
상이한 배양시점에서 샘플링한 두개의 병행 추적자 연구로부터의 다른 단백질생성 아미노산의 예를 들었듯이, 대사산물의 13C 라벨 패턴은 일정하게 유지되었다 (도 5). 이것은 수득된 플럭스 분포가 전체 배양기간을 대표할 수 있는 것으로 간주될 수 있도록 하는 배양 동안의 동위원소 정상상태를 가리킨다.
대사 플럭스의 계산은 실험적으로 측정된 매스 이소토포머 분율 및 시뮬레이션한 매스 이소토포머 분율의 편차를 최소화하는데 기초하였다. 상기 접근은 세개의 병행 배양으로부터의 생장 및 산물 형성의 화학량론적 데이터 및 바이오매스 전구체의 동화작용 수요를 고려하여 각 단계에서의 대사 밸런싱을 포함하였다 (Wittmann and de Graaf, 2005).
C. 글루타미쿰 lysC T311I 의 대사 플럭스
C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)의 대사경로 활성을 추적자 기질로서 [1-13C] 글루코스를 이용하여 라벨 실험으로부터 측정하였다. 플럭스 모델은 C. 글루타미쿰 의 모든 관련 대사경로, 즉 라이신 생합성 경로 뿐만 아니라 펜토스 포스페이트 경로, 글리콜리시스, TCA 회로, 보충 카르복시화 및 탈카르복시화를 포함하였다. 이전의 결과에 근거하여, 글리옥실산 션트(glyoxylic acid shunt)를 글루코스에서의 배양 동안 비활성으로 가정하였다 (Wittmann and Heinzle, 2002). 각각 피루베이트 및 PEP 및 옥살로아세테이트 및 말레이트를 럼프트 풀로 간주하였다. 따라서, 인터커넥팅 반응 즉, 피루베이트 카르복실라제, PEP 카르복실라제, 말산 효소 및 PEP 카르복시키나아제를 각각 카르복시화 및 탈카르복시화를 통한 럼프트 플럭스로서 측정하였다. 수득된 적합성과 관련하여, 실험적으로 측정된 매스 이소토포머 분율 및 계산된 매스 이소토포머 분율 사이의 뛰어난 일치가 달성되었다 (표 11).
표 11: 99 % [1-13C] 글루코스에서 배양된 라이신 생산 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)의 분비된 트레할로오스 및 세포 단백질로부터의 아미노산의 상대적 매스 이소토포머 분율. 데이터는 실험적 GC-MS 데이터 (Exp) 및 플럭스의 최적화된 세트에 해당하는 수학적 모델의 해결에 의해 예측된 값 (Calc)을 포함한다.
Figure pct00012
그 결과 형성된 플럭스 맵을 보면 중추경로 활성, 특히 펜토스 포스페이트 경로를 통한 플럭스 및 당분해 플럭스가 높은 정확성을 가지고 측정되었다는 것을 확실히 알 수 있다.
야생형과 비교할 때 (Kim, et al., 2006; Kromer, et al., 2008), C. 글루타미쿰의 라이신 및 트레오닌에 의한 피드백 제어로부터 아스파테이트 키나아제의 해제가 큰 플럭스 변화를 야기하였다. 가장 확실한 차이는 물론 탈조절된 라이신 생산의 직접적인 결과인 8% 증가한 라이신 플럭스이다. 보충 카르복시화를 통한 순 플럭스는 크게 증가하여 라이신 생산에 필요한 충분한 옥살로아세테이트를 공급하였다. 또한, 탈조절 돌연변이체는 펜토스 포스페이트 경로 및 TCA 회로를 통한 변화된 플럭스를 보였다. C. 글루타미쿰 BS1에서의 바이오매스 형성 감소 때문에, 동화작용 수요를 맞추기 위하여 중간대사로부터 보다 적은 양의 탄소를 회수한다. 플럭스 측정을 위해 여기서 적용된 접근법은 상대적으로 적은 노력으로 이러한 전반적인 플럭스 변화를 해결하는데 완전히 적합하다. 따라서, 29개의 매스 이소토포머 분율로부터의 라벨 정보를 포함하는 플럭스 모델 뿐만 아니라, 실험 구성은 유전자적 변화 또는 환경적 조건의 효과를 조사하는 루틴 13C MFA에 효과적으로 적용될 수 있었다.
확장된 플럭스 분석
그러나, 몇 경우에, 플럭스 측정을 위하여 적용된 상기 접근이 충분하지 않았다. 피루베이트 카르복실라제, PEP 카르복실라제, 말산 효소 및 PEP 카르복시키나아제를 포함하는 피루베이트 노드 주위의 완전한 대사 네트워크의 해결은 훨씬 더 정교하다. C. 글루타미쿰의 라이신 생산에 관하여 이러한 반응은 상당한 중요성을 갖고 있다. 따라서 PEP 카르복시키나아제 (PEPCK) 뿐만 아니라 PEP 카르복실라제 (PEPC), 피루베이트 카르복실라제 (PC) 및 말산효소 (MalE)를 통한 모든 플럭스를 해결하기 위해 플럭스 모델을 확장시켰다.
네트워크 디자인 및 실험 준비
모델 적응을 위한 첫번째 단계는 PEP 및 피루베이트를 별개의 풀로, PC, PEPC, PEPCK 및 말산 효소를 별개의 효소 반응으로 간주하여 대사 네트워크를 확장하는 것이었다. 이 시나리오에서, [1-13C] 글루코스를 이용한 단독 추적자 연구로부터의 라벨 데이터를 이용하는 상술한 접근을 확장하였는데, 이는 이것이 상기 모든 플럭스를 완전히 해결할 수는 없고, 오직 럼프트 카르복시화 및 탈카르복시화 플럭스만 해결할 수 있기 때문이다 (Kim, et al., 2006). 중추 대사경로에 관하여, [1-13C] 글루코스는 대사의 윗부분, 특히 산화적 PP 경로, 글리콜리시스, 그리고 만약 존재한다면, Entner-Doudoroff 경로를 해결하는데 중요하고, [U-13C] 글루코스와 라벨하지 않은 글루코스의 혼합물의 사용은 특히 PEP의 플럭스 다운스트림, 특히 피루베이트 노드에서 해결하는데 유용하다 (Fischer, et al., 2004; Wittmann and Heinzle, 2001b). 이 때문에, 실험 전략은 플럭스 계산을 위한 다른 추적자 기질로부터의 대사산물의 GC-MS 라벨 분석으로부터 이용가능한 정보를 결합하기 위하여 (i) [1-13C] 글루코스 및 (ii) [U-13C] 글루코스 및 자연적으로 표지된 글루코스의 혼합물을 이용한 두개의 병행 추적자 연구에 기반하였다. 플럭스 계산을 위한 보다 자세한 정보를 분석물의 탄소 골격의 오직 특정 부분을 함유하는 단편 이온의 추가 분석을 통한 GC-MS를 이용하여 수득할 수 있다고 알려져 있기 때문에, 원핵생물 (Klapa, et al., 2003) 및 진핵생물(Frick and Wittmann, 2005)의 복합 대사 네트워크의 플럭스 분석에 유용하다고 이전에 증명된, 단백질생성 아미노산으로부터의 많은 단편 이온을 추가적으로 고려하였다. 전체적으로, 여기에서 각 균주에 197개의 다른 매스 이소토포머 분율을 고려하였고, 오직 단일 추적자 실험 및 더 적은 측정된 단편을 이용한 원래의 단순화된 접근은 29개의 매스 이소토포머 분율을 고려하였다. 확장된 접근은 추가적으로 고려된 라벨 정보가 추가적으로 도입된, 피루베이트 노드 주변의 자유 플럭스를 측정하기 위해 사용될 수 있는지 여부를 판단하기 위하여 컴퓨터 기반 모의실험 연구로 실험하였다. 상기 목적을 위하여, 이용가능한 매스 이소토포머 분율 및 관심 플럭스 파라미터의 민감성을 이전에 개시된 방법(Wittmann and Heinzle, 2001b)으로 부분 유도체로부터 유도하였다. 많은 새롭게 고려된 단편 이온의 라벨 패턴은 피루베이트 노드 주위의 자유 플럭스의 변이에 의해 영향을 받았고 따라서 이러한 관심 플럭스 파라미터를 측정하기 위한 민감한 정보를 함유한다. 이것은 추적자 기질로서의 [U-13C] 글루코스 및 라벨하지 않은 글루코스 및 분석된 대사산물의 라벨 패턴에 강한 영향을 미치는 자유 플럭스 파라미터 ΦPEPC (PEPC 및 PC 사이를 분할하는 플럭스), ζPEPC/PEPCK (PEPC 및 PEPCK에 의한 플럭스의 교환) 및 ζC/MalE (PC 및 말산효소에 의한 플럭스의 교환)의 변이(도 6)를 이용한 연구의 예가 된다.
PEPC (ΦPEPC = 100 %)의 단일 기여에서의 라벨 패턴 및 피루베이트 노드(ζPEPC/PEPCK = ζPC/MalE = 10)에서의 매우 가역 가능한 플럭스를 기준점으로 하고 100%로 설정한다. 합성 라벨 데이터 세트를 이용하여, 자유 플럭스를 위한 고유의 해법을 네트워크의 모든 자유 플럭스의 관측성 및 인식가능성 및 개발된 확장 접근의 적합성을 나타내는 임의추출한 다양한 시작값을 이용한 다수의 파라미터 평가으로 수득하였다. 생물학적 시스템의 적용 가능성을 균주 C. 글루타미쿰 BS　1 (lysC T311I) 및 C. 글루타미쿰 BS　13 (lysC T311I Dpyk)를 이용하여 입증하였다.
추적자 연구 및 파라미터 평가
상술한 동위 원소의 정상 상태 뿐만 아니라 끊임없는 생장 및 생산 특성은 단백질 세포로부터의 단백질생성 아미노산의 13C 강화로부터 플럭스 측정을 가능하게 하였다. 대사 플럭스 분포를 실험적으로 측정된 매스 이소토포머 분율과 계산된 매스 이소토포머 분율 사이의 편차를 최소화하여 수득하였다. 확실히, C. 글루타미쿰 BS 1의 라벨 패턴의 매칭이 도 7에 도시된 것처럼 우수한 적합이 달성되었다.
여기서 적용된 대사 네트워크 모델은 말레이트 및 옥살로아세테이트를 단일 풀, 즉 두개의 풀 사이의 완전히 평형시킨 라벨 교환으로 간주한다. 라벨 데이터의 우수한 적합성은 말레이트 및 옥살로아세테이트 사이의 가역가능한 상호 변환의 존재를 뒷받침한다. 세포질 관련 (MDH) 및 박막 결합성 말레이트 디하이드로게나제(MQO)의 협동 작용에 의한 말레이트 및 옥살로아세테이트 사이의 가역가능한 상호 변환을 설명하는 C. 글루타미쿰에 대한 인비트로 연구(Molenaar, et al., 2000) 로부터 추가의 증거를 얻을 수 있다. 실험적 라벨 패턴과 모의 라벨 패턴 사이의 편차가 가장 적은 세포내 플럭스의 세트를 세포내 플럭스 분포의 가장 좋은 추정치로 간주하였다. 도 8은 피루베이트 노드 주위의 복합 네트워크 및 C. 글루타미쿰 BS 1을 위해 측정된 인비보 플럭스를 자세하게 보여준다.
확장 모델을 이용하여, PEPC, PC, PEPCK 및 말산 효소를 통한 인비보 플럭스를 매우 자세히 측정하였는데, 통계적 평가로 수득된 좁은 신뢰 구간이 이를 반영한다. PC는 C. 글루타미쿰 BS 1의 주요 보충 효소인 반면, PEPC는 보충 카르복시화에 미약한 기여를 한다. 이것은 C. 글루타미쿰의 라이신 생산이 피루베이트 카르복실라제의 발현 레벨에 크게 의존(Peters-Wendisch, et al., 2001)하는 반면, PEP 카르복실라제 활성은 라이신 생산에 불필요하다(Peters-Wendisch, et al., 1993)는 이전의 연구결과에 매우 잘 들어맞는다. 또한, 확장 접근은 말산 효소를 통한 중요한 플럭스를 나타냈다. 이것은 말산 효소가 이제까지는 프럭토스-배양 C. 글루타미쿰을 위해서만 가정된 생리학적 역할인(Dominguez, et al., 1998; Kiefer, et al., 2004) 글루코스에서의 배양 동안 NADPH 소스로서의 역할을 한다는 것의 첫번째 힌트를 제공하였다. 확장 모델에 의해 측정된, 카르복시화 및 탈카르복시화를 통한 순 플럭스는 각각 단순 모델에 의해 수득된 럼프트 플럭스와 매우 잘 일치한다. 따라서, 이 복합 네트워크의 완전한 해결을 위해 필요한 추가의 노력은 연관된 플럭스 중 하나의 정확한 측정을 요구하는 몇가지 경우에서만 가치가 있다.
대사공학의 도구로서의 코돈 적응(codon adaptation)
근년에, 대사공학 및 유전자 공학은 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 라이신 생산에 있어서 우수한 균주를 생산하기 위한 유력한 접근으로 나타나고 있다. 상기 접근은 상술한 중추 대사경로 활성을 해제하는 방법론과 같은 균주 특성화의 정교한 툴박스를 요구한다. 그러나, 균주 최적화를 위한 의도된 변형은 또한 유전자 도구에 의해 달성되어야 한다. 이 점과 관련하여, 세포내의 효소활성의 표적 조절(modulation)은 선별된 대사경로에 의해 탄소 전환을 늘리거나 줄이기 위해 중요하다. 상기 목적을 위하여 적용된 유전자 변화는 전형적으로 강하다. 즉, 유전자 결실 또는 플라스미드 기반 유전자 과발현을 통한 많은 증폭을 통한 완전한 경로 차단을 야기한다. 많은 경우에, 이러한 극심한 변화는 불리한 부작용을 야기한다. 예를 들어, 중추 당분해작용 효소 포스포글루코이소머라제의 결실은 심한 C. 글루타미쿰의 생장 결핍을 야기하였다 (Marx, et al., 2003). C. 글루타미쿰의 피루베이트 디하이드로게나제 결실 돌연변이체는 당 기반의 생산배지에서 자랄 수 없고 광범위한 부산물 형성을 보인다 (Blombach, et al., 2007). 본 발명에서, 요즘에 대사공학에 사용되는 상술한 툴박스는 C. 글루타미쿰의 비효소활성의 변경을 위해 개시코돈 교환을 사용하는 보다 온화한 접근에 의해 보완되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 에서의 개시코돈의 사용
C. 글루타미쿰에서 번역 개시 부위를 개시코돈 ATG, GTG 또는 TTG 중 하나로 표시한다. 정확한 개시코돈 분포의 측정을 위하여, 모든 전체의 게놈 시퀀스를 NCBI 데이터베이스로부터 FASTA-file 형태로 다운로드하였고, 개시코돈 위치에서 초기 뉴클레오티드로서의 A, G 및 T의 정확한 수를 엑셀(MS Office, 2003)을 이용하여 검색하였다. A, G 및 T의 정확한 수는 각각 2215, 627 및 215이었고, 이는 72%, 21% 및 7%의 상대도수에 해당한다. 상기 개시코돈의 빈도는 C. 글루타미쿰의 중추대사에서의 빈도인 81% ATC, 15% GTG 및 4% TTG와 약간 다르다.
중추 대사경로의 유전자로부터, ATG를 GTG로 치환하기 위한 세개의 유전자 및 자연 GTG를 ATG로 치환하기 위한 한개의 유전자를 선별하였다. 선별된 효소 PGI, PDH, ICD 및 G6PDH를 주요 분기점에 위치시킨다. 이러한 노드, 예를 들어 펜토스 포스페이트 경로 (PPP), 보충 카르복시화 및 TCA 회로에서의 플럭스 재지정은 목표로 한 라이신의 과생산에 전체적으로 매우 중요하다 (Wittmann and Becker, 2007; Wittmann and Heinzle, 2002).
개시코돈 교환에 의한 효소활성의 조절
C. 글루타미쿰 BS87의 유전적 백그라운드에서 개시코돈 교환을 수행하였다. 두개의 상동 재조합 이벤트를 통하여, 야생형 대립 유전자를 돌연변이 대립 유전자로 치환하였다. 근본적인 복제 프로토콜에 근거하여, 두번째 재조합 이벤트로부터 형성된 클론은 모균주 또는 개시코돈 돌연변이체를 다시 반영할 수 있다. 개시코돈에서의 점 돌연변이를 운반하는 재조합 균주의 스크리닝을 각각 ICD, PGI, PDH 또는 G6PDH의 비효소활성의 측정을 통하여 수행하였다. 도 9에 도시되어 있듯이, 몇 개의 클론은 모 균주 BS87과 비교할 때 표적 효소의 변화된 활성을 보였다.
상기 클론은 시퀀스 분석에 의해 더 자세하게 조사하였다. 선별된 클론 및 모균주의 시퀀스는 개시코돈 뉴클레오티드를 제외한 100% 일치를 보였다. 여기서, 변화된 인비트로 활성을 보이는 모든 균주는 또한 개시코돈에서의 뉴클레오티드 교환을 보였다. 시퀀싱에 의한 뉴클레오티드 교환의 확인 후, 단독 탄소원로서 글루코스를 이용하여 최소배지에서 비활성을 측정하였다 (표 12).
표 12: 이소시트레이트 디하이드로게나제 (ICD), 포스포글루코이소머라제 (PGI), 피루베이트 디하이드로게나제 (PDH) 및 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 (G6PDH)의 C. 글루타미쿰에서의 개시코돈의 역할로서의 비활성. 수치는 세개의 생물학적 복제로부터의 평균값을 당해 편차와 함께 나타낸다.
ICD
[mU mg-1]		 PGI
[mU mg-1]		 PDH
[mU mg-1]		 G6PDH
[mU mg-1]
ATG 변이체 1292 ±60 1073 ±70 30 ±3 170 ±15
GTG 변이체 342 ±32 618 ±30 13 ±1 120 ±10
효소활성에의 현저한 효과가 icd 유전자에서 발견되었다. 당해 돌연변이체에서, ICD 비활성이 70% 감소하였다. aceE 및 pgi의 번역 개시위치의 교환은 피루베이트 디하이드로게나제 및 포스포글루코이소머라제의 비활성을 각각 56% 및 47% 감소하게 하였다. G6PDH의 경우에, 비활성은 GTG 대신 ATG 개시코돈의 사용으로 20% 증가하였다. ICD 활성의 번역 하향조절(translational down-regulation)을 위한 추가 전략은 글리신을 위한 희귀 코돈 GGG의 수행 및 이소류신을 위한 AUA의 수행을 포함하였다. 효과를 극대화하기 위하여 세개의 인접한 글리신의 자연 코돈을 희귀 GGG 변이체로 치환하였다. 이것들은 위치 570-572에 국소화되었다. 이소류신의 경우, 위치 78 및 79에서 두번의 코돈 치환을 수행하였다. icd 유전자를 코딩하는데 있어서 성공적으로 수행되었지만, 시퀀싱으로 입증되었듯이, 비효소활성에 영향이 없었다. 이것은 변형균류에서의 코돈 최적화에 있어서 최소의 역할을 하는 것으로 밝혀진 뉴클레오티드 교환 수행의 국소화와 연관될 수 있다 (Vervoort, et al., 2000).
유전자 발현의 조절의 방법으로서의 코돈 교환은 새로운 접근은 아니다. 그러나, 이 전략은 이제까지 이종 유전자 발현을 포함하는 과정에서 주로 코돈-최적화에 중점을 두었다. 여기에서는, 코돈의 숙주 균주에서의 상대적 외관에의 적응 (Jo, et al., 2007; Wiedemann and Boles, 2008) 또는, 최근 적용된 tRNA 보완 (Lee, et al., 2009)이 개선된 발현을 야기하였다. 이러한 시간이 걸리고 돌아가는 방법과 비교하여, 본 발명에서 수행되는 개시코돈 교환은 단일 코돈에 집중하기 때문에 확실히 보다 간단하고 쉽다. 코돈 악화 즉, 글리신을 위한 GGG 수행 및 이소류신을 위한 AUA의 수행의 결과는 개시코돈 적응이 성공하기 위한 우수한 방법이라는 것을 보여준다. 대사공학과 관련하여, 원치않는 경로의 탈조절은 사소한 것이 아니므로, 특히 번역 개시를 악화시킴으로써 유전자 발현을 줄일 수 있다는 점이 흥미롭다. 이제까지, 탄소 플럭스는 많은 경우 심각한 생장 결핍 또는 원치 않는 영양요구성을 야기하는 유전자 결실에 의해 완전히 차단되었다 (Blombach, et al., 2007; Marx, et al., 2003). 최근에, 안티센스 RNA의 플라스미드 관련 발현은 글루타메이트 생산 C. 글루타미쿰에서의 2-옥소글루타레이트 디하이드로게나제 복합체 (ODHC)의 활성을 줄이는데 성공적으로 적용되었다(Kim, et al., 2009). 그러나, 이 접근은 영구적 선별압(selective pressure)을 요구하였고, 따라서 산업적 생산공정에 적합하지 않다 (Kim, et al., 2009). 개시코돈 교환은 이러한 방해요인 없이 선별된 효소의 표적 감쇠의 기회를 제공한다. C. 글루타미쿰에서의 개시코돈 ATG의 높은 빈도(72 %)때문에 이 방법은 대사공학의 전반적인 도구로서 대단한 잠재력을 갖는다. C. 글루타미쿰의 라이신 생산 최적화를 위한 이 전략의 두개의 성공적인 예를 하기에서 더 자세히 설명한다.
지난 두 장(chapter)은 균주 특성화 및 유전자 조작에 있어서의 기본으로서 주요 방법에 대한 것이었고, 하기의 내용은 이제 C. 글루타미쿰에 의한 개선된 라이신 생산을 위한 다른 변형 전략에 대해 다룬다. C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산의 주경로 즉, NADPH 대사, 라이신 생합성, 전구체 공급 및 TCA 회로는 개선된 라이신 생산을 위하여 성공적으로 조작되었다.
NADPH 대사의 변형
보조인자 NADPH를 위한 라이신의 생합성 경로의 높은 필요성 때문에, C. 글루타미쿰에서의 NADPH 대사는 합리적 변형을 위한 주요 목표 중의 하나이다. 그것은 이전에 주요 NADPH 소스로 밝혀진 (Wittmann and Heinzle, 2002) 펜토스 포스페이트 경로를 통한 플럭스를 강화하는 데 유망한 것으로 보였다. 이것은 처음에 프럭토스 1,6-비스포스파타아제를 코딩하는 유전자 fbp의 과발현에 의해 보완된, 속도 제한 효소 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 과발현 및 변형에 의해 접근되었다. 대안적 접근으로서, 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 상향조절(up-regulation)은 무엇보다도 코딩하는 유전자 zwf, tal 및 tkt를 포함하는 tkt-오페론의 프로모터 교환에 의한 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제의 과발현으로 달성되었다. 또한, 이제까지 잘 이해되지 못했던 라이신 생산 C. 글루타미쿰의 NADPH 공급을 위한 말산효소의 역할을 조사하였다.
글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 과발현 및 변형
과발현은 zwf 유전자의 자연형 프로모터 유전자의, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 sod 유전자의 강한 프로모터에 의한 게놈 치환을 통해 달성되었다. 또한, A243T 점 돌연변이를 G6PDH에 도입하였다. 이 돌연변이는 이전에 야생형 및 전통 방법으로 유도된 생산균주 사이의 비교 시퀀싱을 통해 발견되었고, 이 돌연변이의 정확한 대사 결과가 이제까지 더 자세히 설명된 적이 없음에도 불구하고, 라이신 생산의 증가를 초래한다는 것을 보여주었다 (Zelder, et al., 2005). 이어서, 이런 표적이 이전에는 PPP를 향한 플럭스 전환에 의해 라이신 생산을 뒷받침한다고 밝혀진 (Becker, et al., 2005) 프럭토스 1,6-비스포스파타아제 유전자의 과발현에 의해 보완될 수 있는지에 대해 실험하였다. 모든 균주를 세포 성장 및 라이신 생산에 대하여 특성화하였다. 상기 연구는 A243T 돌연변이의 도입의 결과를 조사하기 위한 야생형 및 돌연변이체 G6P 디하이드로게나제의 특성화에 의해 보완되었다. 추가적으로, 유전자 변형의 대사적 결과를 해결하고 전체 세포거동을 이해하기 위하여, 중추 탄소대사를 통한 대사 플럭스 및 세포내 대사산물 레벨을 분석하였다.
인 비트로 활성
G6P 디하이드로게나제의 인비트로 비활성은 코딩하는 zwf 유전자의 과발현에 의해 확실히 영향을 받는다 (도 10A). 야생형 및 균주 BS1 (lysC T311I)은 비슷한 활성을 보이지만, zwf 유전자의 자연형 프로모터의, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 sod 의 프로모터로의 치환은 효소활성의 4배 증가를 가져왔다. 이는 sod 프로모터의 사용이 세포내의 G6P 디하이드로게나제의 양을 늘린다는 것을 가리킨다. 점 돌연변이 A243T는 BS5 (Psod zwf) 및 BS6 (Psod zwf A243T)에 대해 관찰되는 비슷한 수치에서 알 수 있듯이, G6P 디하이드로게나제의 비활성에 크게 영향을 미치지 않았다.
야생형 및 A243T-변이체의 동력학적 특성
zwf 유전자에서의 점 돌연변이의 결과를 이해하기 위하여, 두개의 효소 변이체를 동력학적 거동에 관하여 비교하였다. 돌연변이가 된 효소는 다른 측면에서 우월한 특성을 나타내었다. 이것은 그것의 기질 중 하나인 NADP에 대한 높은 친화도를 포함하였다 (표 15). 또한, 중추대사의 대사산물에 의한 억제에 대한 강한 저항성이 관찰되었다. 5　mM ATP 또는 PEP의 첨가 후 훨씬 더 높은 활성이 돌연변이체 효소에 대해서 유지되었지만, FBP 추가에 대해서는 약간 약한 영향이 나타났다. 1 내지 2mM 사이의 생리학적 농도의 세 가지 대사산물을 모두 결합하여 첨가하는 것에 의해 A243T 점 돌연변이가 대사 레벨의 G6P 디하이드로게나제의 조절제어를 약화시킨다는 것이 밝혀졌다. 기질 G6P에 대한 두 효소의 친화도(표 13) 및 NADPH에 의한 억제(도 10B)에 있어서는 큰 변화가 관찰되지 않았다.
표 13: C. 글루타미쿰으로부터의 G6P 디하이드로게나제의 야생형 및 A243T 변이체의 동력학적 특성화: G6P (KM,G6P) 및 NADP (KM,NADP) 의 Michaelis-Menten 친화도 상수 및 등몰량으로 첨가된 ATP, 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 프럭토스 1,6-비스포스페이트(FBP)의 합동작용을 통한 효소활성 제어. 데이터는 탄소원로서 글루코스를 갖는 최소배지에서 배양된 세포로부터의 세포추출물을 이용한 세개의 다른 측정으로부터의 평균값을 나타낸다.
효소
변이체		 KM,G6P
[㎛]		 KM,NADP
[㎛]		 대사산물에 의한 억제 (잔여 활성 [%])a
5 mM
ATP		 5 mM
PEP		 5 mM
FBP		 1 mM ATP, PEP, FBPb 2 mM ATP,
PEP, FBPb 		3 mM ATP, PEP, FBPb
야생형 500±31 100±7 68.8±0.1 62.6±0.1 84.4±0.2 84.8±0.1 79.4±0.1 71.3±0.2
A243T
돌연변이체		 481±31 75±4 86.0±0.2 72.5±0.1 87.0±0.1 89.9±0.1 88.8±0.1 85.8±0.2
a 첨가 없이, 활성과 관련된 상대치로 주어짐(100 %)
b [ATP] = [FBP] = [PEP]
zwf 유전자 내의 A243T 돌연변이의 이득은 코딩된 G6P 디하이드로게나제의 개선된 동력학적 거동 때문이고 증가된 비활성으로 인한 것이 아니다. 돌연변이체 효소의 매우 약한 억제는 실험된 C. 글루타미쿰에서의 대사산물 PEP, FBP 및 ATP에서 발견된 생리학적 범위내인, 농도 1mM에서 이미 관찰되었다 (Moritz, et al., 2002). 따라서, 돌연변이체 효소 변이체는 보다 높은 인비보 활성을 나타내는 것으로 보인다. 또한 실제 NADP 레벨이 100㎛의 범위 내이기 때문에 NADP에 대한 보다높은 친화도는 이 영향에 영향을 끼칠 수 있다 (Moritz, et al., 2002).
산물 형성 및 대사 플럭스
다른 돌연변이체를 생장 및 생산 특성에 대하여 비교하였다 (표 14 및 15). 이를 위하여, 균주를 각각 탄소원인 글루코스, 프럭토스 또는 슈크로스 중 하나를 함유하는 표준 최소배지에서 배양하였다. 피드백 내성 모균주 C. 글루타미쿰 BS1 을 위하여, 라이신 수율은 프럭토스 배양 세포에서의 74 c-mmol c-mol-1과 글루코스 배양 세포에서의 85 c-mmol c-mol-1 사이였다(Becker, et al., 2005).
표 14: 글루코스, 프럭토스 및 슈크로스에서의 라이신 생산 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I), C.　글루타미쿰 BS5 (Psod zwf), C.　글루타미쿰 BS6 (Psod zwf A243T) 및 C. 글루타미쿰 BS7 (Psod fbp_zwf A243T)의 생장 및 생산 특성. 주어진 데이터는 라이신 수율 (YLys/S) 및 바이오매스 수율 (YX/S)이고 세개의 병행 배양실험으로부터의 평균값을 나타낸다.

균주
탄소원		 YLys/S,
[c-mmol c-mol-1]		 YX/S, [g c-mol-1]
C. 글루타미쿰 BS1a

글루코스 84.7±2.9 13.0±0.3
프럭토스 73.6±1.2 8.2±0.1
슈크로스 78.8±3.5 10.9±0.4
C. 글루타미쿰 BS5

 글루코스 112.6±2.1 10.4±0.8
프럭토스 88.4±0.1 7.8±0.5
슈크로스 101.6±0.2 10.4±0.3
C. 글루타미쿰 BS6

 글루코스 117.1±2.7 11.1±1.0
프럭토스 97.3±0.3 7.6±0.6
슈크로스 112.0±3.0 10.7±0.3
C. 글루타미쿰 BS7

 글루코스 130.0±5.5 9.9±0.6
프럭토스 111.9±7.1 8.4±0.2
슈크로스 133.5±6.3 8.4±0.3
a Becker et al. (2005)에서 데이터 발췌함.
sod 프로모터를 통한 zwf 유전자의 과발현은 현저하게 라이신 생산을 증가시켰다. 당해 균주 C. 글루타미쿰 BS5에서의 라이신 생산에의 긍정적 영향이 이 모든 실험된 탄소원에서 관찰되었고, 이로 인해 글루코스에서 배양된 세포에 있어서는 30% 이상이라는 가장 큰 증가를 야기하였다 (표 16). zwf 유전자가 A243T 아미노산 교환에 의해 추가적으로 변형된 C. 글루타미쿰 BS6은 훨씬 더 높은 라이신 생산을 보였다. 이것은 탄소원로서 프럭토스 및 슈크로스에서 가장 확연하였다. fbp 유전자의 추가 과발현에 의해 라이신 생산은 모든 탄소원에서 더욱 강화되었다. 도입된 변형의 중요한 영향은 세개의 돌연변이를 모두 운반하는 C. 글루타미쿰 BS7와 균주 C.　글루타미쿰 BS1의 라이신 수율을 비교하면 확실해진다. 변형의 결합된 도입은 글루코스 및 프럭토스에서의 라이신 수율을 약 50% 증가시키고, 슈크로스에서의 라이신 수율은 약 70%증가시키는 등 전체적인 라이신 수율을 증가시켰다. 라이신 수율의 증가와 함께, 글루코스 및 슈크로스에서의 바이오매스 수율은 성공적으로 줄었고, 프럭토스에서의 바이오매스 수율은 거의 똑같이 유지되었다 (표 14). 비속도(specific rates)와 관련하여, 글루코스 흡수는 유전자 변형에 의해 거의 영향을 받지 않은 채로 유지되어 (표 15) 돌연변이체 사이에 관찰된 변화는 탄소 플럭스의 재분포를 나타낸다. 그것에 답하여 비생장률(specific growth rate)은 라이신 생산의 증가와 함께 감소하였다.
표 15: 글루코스에서 배양된 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I), C.　글루타미쿰 BS5 (Psod zwf), C.　글루타미쿰 BS6 (Psod zwf A243T) 및 C. 글루타미쿰 BS7 (Psod fbp_zwf A243T)의 생장(μ), 글루코스 흡수 (qGlc) 및 라이신 생산 (qLys) 및 호흡률의 비속도.
균주 μ
[h-1]		 qGlc
[mmol g-1h-1]		 qLys
[mmol g-1h-1]		 RQ
[mol mol-1]
C. 글루타미쿰 BS1a 0.38±0.00 4.9±0.1 0.42±0.01 n.d.b
C. 글루타미쿰 BS5 0.32±0.01 5.2±0.2 0.59±0.01 1.16±0.04
C. 글루타미쿰 BS6 0.33±0.02 5.0±0.3 0.59±0.01 1.15±0.06
C. 글루타미쿰 BS7 0.29±0.01 4.9±0.2 0.64±0.03 1.19±0.08
a Becker et al. (2005)에서 발췌한 데이터
b n.d. = 측정되지 않음
어떻게 유전자 변형이 PPP 및 C. 글루타미쿰의 다른 대사경로를 통한 인비보 플럭스에 영향을 미쳤는지 자세히 조사하기 위하여 13C 대사 플럭스 분석을 다른 균주에 수행하였다. 상기 목적을 위하여 [1-13C] 글루코스에서 추적자 연구를 수행하였다. 글루코스에서 배양된 다른 돌연변이체에서의 중추 대사반응의 수득된 주요 플럭스를 도 11에 요약하였는데, 각 플럭스 파라미터에 주어진 편차는 90% 신뢰 구간을 나타낸다. 모의 및 측정된 라벨 패턴 사이의 우수한 적합이 수득되었다. 자유 플럭스 파라미터에 있어서 시작값을 통계학적으로 달리하여 파라미터 측정을 20배 반복한 것은 각 균주에 있어서 동일한 결과를 낳았는데, 이는 전체 최소치의 식별을 보장하였다.
균주 BS5 및 BS6은 모균주와 비교하였을 때 매우 강화된 PPP 플럭스를 보인 반면, 당분해 플럭스는 많이 감소하였다. 따라서 zwf 유전자의 과발현은 G6P 노드에서의 확실한 플럭스 전환을 야기하였다. 프럭토스 1,6-비스포스파타아제의 추가적 과발현은 PPP로의 플럭스의 추가적 증가를 야기하였다. PPP 뿐만 아니라, 다른 중요한 C. 글루타미쿰에서의 NADPH 공급 경로인 TCA 회로을 통한 플럭스가 크게 강화되었다. 다른 zwf 돌연변이체에서의 TCA 회로 및 NADPH 공급 경로 PPP의 일반적으로 높은 활성이 동화작용 및 라이신 생산에 필요한 실제 수요보다 훨씬 더 높은 NADPH 공급을 야기하여서 모든 zwf 돌연변이체에서 NADPH의 큰 초과를 야기하였다. PPP 변형된 돌연변이체의 보조인자 대사의 정밀 심사를 확장된 산화환원반응 밸런스에 의해 수행하였다. 이것은 탄소대사의 이화작용 및 동화작용 경로에 형성되는 환원 당량 (NADH, FADH 및 NADPH)의 산화를 야기하는 산화적 인산화 동안의 모든 가능한 반응을 고려하였다. 모든 돌연변이체는 NADH/FADH 및 NADPH의 큰 초과를 보였다. 전체 산소소비는 형성된 모든 환원 당량의 산화를 완전히 설명할 정도로 충분하지는 않았다. 즉, 산화환원 밸런스는 예상하듯이 폐쇄되지 않았다. 이것은 보조인자의 산화를 야기할 추가적 대사 반응의 확실한 표시이다 (하기에 더 자세히 다룬다). 흥미롭게도, 최적화된 균주에서의 라이신을 위한 전구체로서의 옥살로아세테이트의 더 높은 수요는 보충 카르복시화를 통하여 증가된 플럭스에 의해 반영되지 않았다 (도 11). 이것은 아마도 감소된 바이오매스 수율 때문에 감소한 동화작용의 옥살로아세테이트 수요와 관련이 있을 것이다 (표 14).
글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 과발현 및 변형의 전략을 통해, C. 글루타미쿰 의 라이신 생산은 산업적으로 관련 있는 탄소원인 글루코스 및 슈크로스를 포함한 다른 탄소원에서 크게 개선되었다. 그러나, 효소의 인비트로 활성의 네배 증가는 오직 당해 인비보 활성의 1.4 배 증가 즉, G6P 디하이드로게나제 인비보 (Moritz, et al., 2000)의 강한 대사조절을 보이는 플럭스에 의해 반영되었다. 수득된 글루코스의 계보학의 다른 균주의 라이신 생산을 비교하면, sod 프로모터에 의한 과발현이 생산의 가장 큰 증가를 야기하였고 점 돌연변이 A243T의 추가 도입은 많은 증진을 가져오지 않았기 때문에 (표 14), 한번 봤을 때에는 sod 프로모터에 의한 과발현이 가장 유익하다고 생각할 수 있다. 그러나, 도입된 돌연변이의 순서를 교환하면 완전히 다른 그림이 나온다. 자연형 프로모터와 함께 오직 돌연변이가 된 효소만을 함유하는, 추가적으로 구축된 균주 BS3은 120 c-mmol c-mol-1의 높은 라이신 수율을 보였는데, 이는 zwf 유전자가 sod 프로모터에 의해 추가적으로 과발현되었을 때 추가적으로 증진되지 않았다. 이는 유전자 섭동에 대한 대사 반응이 도입된 변형에 의존적일 뿐만 아니라, 숙주 균주의 유전적 백그라운드에도 더 의존적인 것을 확실하게 보여준다.
부산물 형성
라이신 생산의 증진에 뿐만 아니라, 대사 조작은 또한 글루코스에서 배양되었을 때 C. 글루타미쿰의 주 부산물인 트레할로오스의 형성에도 영향을 끼쳤다. 트레할로오스 배설은 이 화합물이 당해 흡수 시스템의 결핍에 기인하여 세포에 의해 흡수될 수 없기 때문에, 라이신 생산에 불필요하다. C. 글루타미쿰의 다른 zwf 돌연변이체는 PPP 플럭스의 대사 변형의 긍정적 부작용인 감소된 트레할로오스 형성을 보였다. 표 17에 나타나듯이, zwf 유전자 과발현은 모균주 BS1에 비하여 균주 BS5에서 53% 감소된 트레할로오스 형성을 보였다. 균주 BS6에서 트레할로오스 생산은 67%나 감소하였다. C. 글루타미쿰에서, 트레할로오스는 기질로 G6P를 사용하는 세개의 다른 경로를 통하여 형성될 수 있다 (Tzvetkov, et al., 2003). 세포내 대사산물 분석은 균주 BS5 및 BS6 내의 감소된 트레할로오스 플럭스는 G6P의 감소된 유용성과 연관있다는 것을 보여주었다 (표 16).

C. 글루타미쿰 		트레할로오스
수율
[c-mmol c-mol-1]		 G6P세포내 [μmol g-1] F6P세포내
[μmol g-1]
BS1 17.6±2.2a 23.5±0.3 2.6±0.6
BS5 8.1±0.8 12.7±0.3 2.8±0.4
BS6 5.8±0.5 12.6±0.7 1.8±0.2
BS7 12.6±0.3 36.0±2.2 4.5±1.7
a Becker et al. (2005)에서 발췌.
표 16: 글루코스에서 라이신 생산 C. 글루타미쿰 BS1, C. 글루타미쿰 BS5, C. 글루타미쿰 BS6, 및 C.　글루타미쿰 BS7을 배양하는 동안 트레할로오스 형성 및G6P 및 F6P의 세포내 레벨. 트레할로오스 수율은 세개의 병행 배양으로부터 측정하였다. 세포내 G6P 및 F6P 레벨은 각각 두개로 분석한 두개의 독립적인 세포추출물에서 측정하였다.
높은 G6PDH 활성에 의한 G6P의 PPP로의 가속된 전환은 이 전구체의 유용성을 감소시켜 트레할로오스의 형성을 감소시킨다. fbp 유전자의 수반하는 과발현은 zwf 조작의 효과를 약화시켜서 트레할로오스 형성의 감소가 확실해졌는데, 트리플-돌연변이 균주는 약간 감소가 줄어들었다 (28%). 이는 상기 조작이 G6P 풀을 통해 PPP로 탄소를 "밀고", G6P 디하이드로게나제의 변형은 G6P 풀로부터 이 경로로 탄소를 "당긴다"는 사실에 기인하여야 한다. 따라서 이 돌연변이체 내의 G6P 풀은 실질적으로 더 높았다. 그에 따라 F6P 풀 또한 BS7 균주에서 훨씬 더 높았다 (표 16).
산화환원 밸런싱 및 NADPH 대사
대사 플럭스 분석에 의해 알 수 있듯이, 유전자 조작은 세포의 NADPH 대사의 극심한 변화를 가져왔다. PPP 및 TCA 회로를 통한 증가된 플럭스는 NADPH 공급의 커다란 증가를 야기하였다. 상기 플럭스 변화와 관련된 증가된 라이신 수율은 케모스타트 배양(chemostat cultures)에 대한 가정은 다르지만, NADPH 공급이 C. 글루타미쿰의 회분배양에서의 라이신 생산에 제한된 역할을 한다는 것을 보여준다 (Sahm, et al., 2000). 모균주 BS1이 약간의 명백한 NADPH 결핍을 나타내는 반면 (Kim, et al., 2006), PPP 변형 균주에의 NADPH 공급은 그의 수요보다 훨씬 더 높았다 (표 17). 그 결과 형성되는 명백한 NADPH의 이러한 균주에서의 초과는 수행된 변화가 라이신 생산에 완전히 활용될 수 없었지만, 추가의 최적화를 위해 잠재력을 남겨둔다는 것을 가리킨다. 이 잠재력의 정도는 라이신 경로에 모든 초과 NADPH를 보낼 수 있다면 가장 좋은 돌연변이체 C. 글루타미쿰 BS7의 생산량이 두 배가 될 수 있다는 사실에 의해 설명된다. 이 가능성은 카르복시화의 방향에서 활동하는 말산 효소에 의한 NADPH의 부분적 산화에 의해 어느 정도 낮아질 수 있다. zwf 돌연변이체의 소비되지 않거나 잘못 보내진 NADPH는 PPP 플럭스 조작에 따라 발생하는 대사 네트워크의 다른 부분의 한계를 나타낸다. 특히 C. 글루타미쿰의 보충 플럭스의 증가는 증가된 라이신 생산을 야기하는 것으로 나타나기 때문에, 이러한 한계는 옥살로아세테이트 공급과 관련 있을 수 있다 (Koffas, et al., 2003; Peters-Wendisch, et al., 2001). 사실 보충 순 플럭스(anaplerotic net flux)는 여기서 조사된 균주에서 거의 일정하게 남아 있었기 때문에, 동화 옥살로아세테이트 수요의 감소만이 이 전구체의 라이신 경로로의 보다 높은 유입을 가능하게 하였다.
PPP 돌연변이체에서의 높은 명백한 NADPH 과잉은 NADPH를 소비하는 추가 반응을 나타낸다. 가능한 후보로는 호흡 체인에서의 과산화물을 생성하는 NAD(P)H 산화효소(Matsushita, et al., 2001) 또는 카르복시화 방향에서의 말산 효소 작용을 포함한다 (de Graaf, 2000; Petersen, et al., 2000). 이러한 반응 중 하나의 역할을 뒷받침하는 명백한 실험적 증거는 지금까지 수득되지 않았다. 그러나 탈카르복시화 방향에서 작용하는 말산 효소가 외견 상의 NADPH 결핍과 함께 균주에서 추가적 NADPH 소스로서 작용할 수 있다고 가정되었다 (Dominguez, et al., 1998). PPP 변형 돌연변이체의 보조인자 대사에 대해 더 자세히 알기 위하여, 산화적 인산화 동안 가능한 모든 산화환원반응을 고려한 완전한 밸런스를 설정하였다 (표 17).
균주 C.　글루타미쿰
BS5		 C.　글루타미쿰
BS6 		C.　글루타미쿰
BS7
CO 2 생산
글루코스 6-P 디하이드로게나제 62.1 60.9 66.1
피루베이트 디하이드로게나제 87.4 82.4 88.3
보충 카르복시화 -30.5 -32.4 -31.3
이소시트레이트 디하이드로게나제 67.7 61.2 69.9
2-옥소글루타레이트 디하이드로게나제 59.7 52.8 62.6
라이신 분비 11.3 11.7 13.0
동화작용 6.2 7.6 6.0
총계 263.9 244.2 274.6
O 2 소비
총계 227.5 212.3 230.8
NADH 생산
글리세르알데히드 3-P 디하이드로게나제 159.2 158.6 160.1
피루베이트 디하이드로게나제 87.4 82.4 88.3
2-옥소글루타레이트 디하이드로게나제 59.7 52.8 62.6
푸마라아제 59.7 52.8 62.6
말산 디하이드로게나제 59.7 52.8 62.6
동화작용 20.0 25.0 19.0
총계 445.7 424.4 455.2
NADPH 생산
글루코스 6-P 디하이드로게나제 62.1 60.9 66.1
6-P 글루콘산 디하이드로게나제 62.1 60.9 66.1
이소시트레이트 디하이드로게나제 67.7 61.2 69.9
라이신 분비 -45.0 -46.8 -52.1
동화작용 -102.6 -109.2 -95.3
총계 44.3 27.0 54.8
산화환원 밸런스
총계 -17.5 -13.3 -24.2
[H] 산화 플럭스
총계 35.0 26.8 48.4
표 17: 측정된 플럭스로부터 계산된 PPP 변형된 C. 글루타미쿰 BS5, C.　글루타미쿰 BS6, 및 C.　글루타미쿰 BS7의 PPP의 산화환원 밸런스 (도 11), 동화작용 CO2 및 NADH 생산, 동화작용 NADPH 수요 및 호흡률 (표 15).
어떤 균주에서도 보조인자 밸런스는 폐쇄되어 있지 않았다. 이것은 이제까지 [H] 산화의 지정되지 않은 플럭스의 추가적 존재는 밸런스가 폐쇄되기를 요구한다는 것을 나타낸다. 세 균주 모두에서 이 [H] 산화 플럭스는 명백한 NADPH 과잉과 거의 비슷하게 높았다. 호흡체인의 부분으로서의 NAD(P)H 산화효소의 활성은 산소를 소비할 것이고, 따라서 폐쇄된 산화환원 밸런스를 야기할 것이기 때문에, 호흡체인의 NAD(P)H 산화효소의 NADPH 산화에의 큰 기여는 제외될 수 있다. 이 고려사항은 말산 효소에도 적용된다. 카르복시화 방향으로 작용하는 말산 효소의 활성에 의한 NADPH 산화는 옥살로아세테이트로 전환되는 말레이트의 형성을 야기하고 따라서 NADH를 형성한다. 호흡연쇄 내의 완전한 NADH 산화는 결과적으로 산소 소비와 연관된다. 그러나 야생형 및 다른 라이신 생산원에서의 말산 효소의 비활성의 조사는 라이신 생산 C. 글루타미쿰에서의 말산 효소의 생리학적 중요성의 상승에 대한 첫번째 힌트를 주었다 (도 13). 따라서 그것의 생리학적 역할을 더 자세히 관찰하였다.
tkt -오페론의 과발현
C. 글루타미쿰에서 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자는 G6PDH의 추정상 서브유닛을 코딩하는 유전자 opcA, 트랜스알돌라제를 코딩하는 tal, 트랜스케톨라제를 코딩하는 tkt, 및 6-포스포글루코놀락토나아제를 코딩하는 pgl와 함께 tkt-오페론에 위치하고 있다. 상술한 접근의 대안으로, G6PDH의 과발현은 완전한 오페론의 증폭된 발현에 의해 달성될 수 있고, 따라서 펜토스 포스페이트 경로의 확대된 효소 세트를 상향조절할 수 있다.
글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제는 PPP의 속도 제어 효소로 간주되지만 (Moritz, et al., 2000), 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 제한된 용량 때문에 zwf의 과발현에 대응하여 PPP의 비산화 부분에 다른 병목현상이 발생한다는 것이 제외될 수는 없다. 이 점과 관련하여, tkt의 과발현은 비산화 경로에 의한 탄소전환을 효과적으로 증가시키는 것으로 나타났다 (Ikeda and Katsumata, 1999). 따라서 PPP의 산화 및 비산화 부분의 효소의 결합된 과발현은 PPP를 통한 효과적인 플럭스 증가를 보장하고, 따라서 라이신 생산을 위한 증가된 NADPH 공급을 보장한다.
균주 구축 및 비효소활성
tkt-오페론의 야생형 프로모터의, 강한 sod-프로모터로의 대립형질 치환에 의해 과발현이 달성되었다. 프로모터 치환은 PCR 분석에 의해 입증되었다. 이를 위하여, 프로모터 내에서 결합하는 부위 특이 프라이머가 tkt-오페론 내에서 결합하는 프라이머와 결합되었다. 이 접근은 게놈내의 프로모터 교환을 보이는 돌연변이체로부터의 PCR 산물을 생산하였을 뿐이다. 관심 효소에 수행된 프로모터 교환의 효과를 조사하기 위하여, 비활성(specific activity)을 측정하였다. sod-프로모터에 의한 tkt-오페론의 전사 상향조절에 대응하여, 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 비활성이 크게 증가하였다 (도 12).
tkt-오페론의 유전자의 기본 발현 레벨은 공통 프로모터에 의해 확실히 제어되는데, 상기 공통 프로모터의 보다 강한 sod-프로모터로의 교환은 기저 발현 레벨을 증가시키고, 따라서 코딩된 효소의 비활성을 증가시킨다. 이는 복수 유전자 변형 대신 단일 프로모터 교환만을 요구하므로 zwf, tkt 및 tal의 수반하는 과발현을 확실히 단순화한다. 펜토스 포스페이트 경로를 통한 제한되지 않은 탄소 플럭스를 달성하기 위하여, 전체 tkt-오페론의 과발현이 가장 유망하고 효과적인 전략이다.
NADPH 대사에서의 말산 효소의 기능적 역할
상술한 균주의 대사 플럭스 분석은 조사된 균주 중 어느 것도 NADPH-소비 반응으로서 바이오매스 및 라이신 형성 및 NADPH 제공 반응으로서 PPP 및 ICD를 오직 고려하는 닫힌 NADPH 밸런스를 달성하지 못하였다는 것을 보여주었다. NADPH 공급은 균주 최적화 관련 주요 이슈 중 하나이기 때문에, 확실히 NADPH 결핍을 보인 균주 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)가 어떻게 그것의 NADPH 수요를 완전히 만족시킬 수 있는지를 보는 것은 특히 흥미롭다. 잠재적 후보는 이제까지 역할이 잘 이해되지 않은 말산 효소이다. 따라서, 말산 효소의 NADPH 대사에의 역할을 더 자세하게 조사하였다. 이를 위하여, 코딩하는 유전자 malE를 C. 글루타미쿰 BS1 및 PPP-변형 균주 C. 글루타미쿰 BS6의 백그라운드에서 결실시켜 생장 및 생산 특징에 대한 효과를 연구하였다.
균주 구축 및 확인
야생형 malE 유전자의, 400 bp의 malE 시퀀스가 결핍된 단축된 DNA 단편으로의 대립형질 치환에 의해 말산 효소의 결실을 달성하였다. PCR 분석 및 비말산효소활성의 측정에 의해 확인을 수행하였다. 결실 돌연변이주에서의 MalE 활성은 검출 한계 아래였다 (< 0.01 U mg-1).
말산효소 활성
말산효소의 비활성은 유전자 백그라운드 및 영양 상태에 강하게 의존한다. 야생형과 비교하여, 라이신 생산 C.　글루타미쿰 BS1은 크게 증가한 말산효소 활성을 보였다 (도 13). C.　글루타미쿰 BS1에서 생장조건이 말산효소 활성에 미치는 영향을 추가적으로 조사하였다. 여기서, MalE 활성은 글루코스에서 배양된 세포와 비교하여 프럭토스 배양세포에서 증가하였다 (도 13).
이전의 연구에서, malE의 발현 레벨은 영양상태에 크게 의존한다 (Dominguez, et al., 1998; Hayashi, et al., 2002; Polen, et al., 2007)고 알려져 있다. 간접적으로 효소 용량에, 그리고 발현 레벨에 영향을 미치는, 여기서 관찰된 다른 인비트로 활성은 유전적 섭동(genetic perturbation) 때문에 말산효소의 증가된 발현을 시사한다.
malE 결실에 대한 생리적 반응
말산 효소의 생리적 역할을 조사하기 위하여, 모균주 C.　글루타미쿰 BS1 및 그의 ΔmalE 유도체를 표준 최소배지에서의 생장 및 라이신 생산을 고려하여 비교하였다. 도 14에서 나타나듯이, 라이신 및 바이오매스 수율은 결실돌연변이주에서 감소하였다. 그러나, 생장은 malE 결실에 약간의 영향만 미쳤다. PPP를 통한 증가된 NADPH 공급과 함께 NADPH-변형 균주 C. 글루타미쿰 BS6에서는, 그림이 달랐다. 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 과발현 및 변형 때문에, 이 균주에의 NADPH 공급은 생장 및 생산 특성 변화를 야기한 C.　글루타미쿰 BS1와 비교하여 크게 증가하였다. 이 균주의 말산효소 결실은 라이신 및 바이오매스 형성에 어떤 영향도 주지 않았다 (도 14).
C.　글루타미쿰의 NADPH-대사에의 결과를 더 조사하기 위하여, 바이오매스 형성 및 라이신 생산에 대한 균주의 전체 NADPH 수요를 16.4 mmol NADPH (g 세포 건량)-1 및 4 mol NADPH (mol 라이신)-1의 동화작용 수요를 고려하여 계산하였다. malE 결실 균주 C. 글루타미쿰 BS44 및 그것의 모(parent) C.　글루타미쿰 BS1의 각 NADPH 수요의 비율은 0.93이었고, 이는 이 보조인자의 소비가 결실 균주에서 줄었다는 것을 나타낸다. NADPH-변형 균주 C. 글루타미쿰 BS6 및 당해 malE 결실 균주의 바이오매스 및 라이신 형성은 동일하였다. 따라서, 양 균주 모두 산물 합성에의 NADPH 필요량에 있어서 다르지 않았고, 따라서 그들의 각 NADPH 소비의 비율은 1.00이었다. 확장된 플럭스 모델을 이용한 수득된 데이터 세트 및 13C 대사 플럭스의 분석은 말산 효소가 라이신 생산 C.　글루타미쿰 BS1에의 NADPH 공급에 기여한다는 것을 확실히 보여준다. 야생형과 비교하여, MalE 활성은 증가된 NADPH 수요에 관하여 라이신 생산원에서 증가하였고 malE 의 결실은 NADPH 소비 산물인 라이신 및 바이오매스의 감소된 형성을 야기하였다. 100%로 설정된 글루코스 비흡수율에 정상화된 상대적 플럭스[%]로서의 NADPH 필요량을 발현함에 의해, C. 글루타미쿰 BS1의 전체 NADPH 소비 플럭스는 malE-결핍 유도체의 전체 NADPH 소비보다 13% 높았다. 이 차이는 확장된 플럭스 모델에서 측정된 C.　글루타미쿰 BS1에서의 말산 효소를 통한 15 %의 인비보 플럭스에(도 20), 결실 균주에서의 말산 효소를 통한 제로 플럭스에 매우 잘 부합한다. 말산 효소를 통한 이 인비보 플럭스가 닫힌 NADPH 밸런스를 달성하기 위해 라이신 생산 C. 글루타미쿰 BS1에 필요하다는 것이 NADPH 밸런스 (도 15)로부터 자명해진다.
그러나, C. 글루타미쿰의 야생형에 있어서, 글루코스에서의 생장 동안, PPP 및 TCA 회로만이 세포생장을 위한 충분한 NADPH를 공급한다는 것이 최근 입증되었고(Kromer, et al., 2008), 이는 야생형 백그라운드에서 말산 효소의 결실이 이 탄소원에서의 생장 특성에 영향을 미치지 않는다는 것을 설명한다 (Gourdon, et al., 2000). C. 글루타미쿰은 증가된 NADPH 수요를 맞추기 위하여 라이신 생산조건 하에서 말산 효소를 확실히 활성화하는데, 이는 증가된 MalE 비활성 뿐만 아니라 증가된 발현 레벨에도 반영된다. malE 발현의 조절을 위한 근본적인 조절 전략은 이제까지 명확해지지 않았다. 여기서, 몇 연구는 몇 조절유전자에 의해 발현 조절을 나타냈다. 예를 들어, malE 가 ramB-레귤론에 속한다(Gerstmeir, et al., 2004)는 증거가 있으며, 영양 상태에의 의존성이 설명되었고 (Dominguez, et al., 1998; Hayashi, et al., 2002; Polen, et al., 2007), 전체 질소조절 amtR에의 연결이 최근 발견되었다 (Buchinger, et al., 2009). 그러나, 세포내 신호는 여전히 불확실하다. C. 글루타미쿰의 NADPH 대사에의 말산 효소의 확실한 관련 때문에, 세포의 산화환원반응 상태를 유발인자로 생각할 수 있다. 따라서, NADPH/NADP 비는 세포의 산화환원반응 상태의 가능한 신호 체계로서 측정되었다.
발현제어 신호로서의 세포내 NADPH/NADP 비
세포내 NADPH/NADP 비의 측정은 조사된 균주 간에 큰 차이를 보여주었다. C.　글루타미쿰 BS1에서 NADPH/NADP 비는 0.82±0.10이었다. 이 유전자 백그라운드에서의 말산효소 활성의 결핍은 아무 영향을 주지 않았는데, 이는 C. 글루타미쿰 BS44에서 비슷한 값인 0.76±0.10에 의해 반영된다. 그러나, PPP 변형에 의한 NADPH의 증가된 공급은 확실히 NADPH/NADP 비에 영향을 미쳤다. C. 글루타미쿰 BS6에서의 측정 값 (1.45±0.40)은 그것의 모 C.　글루타미쿰 BS1과 비교하여 훨씬 높았다. C. 글루타미쿰 BS52은 NADPH/NADP 비 1.76±0.20을 보였고, 이와 같이 그것의 모균주 C. 글루타미쿰 BS6와 다르지 않았다. 도 16에서 볼 수 있듯이, MalE 활성은 분명히 NADPH/NADP 비와 상관관계가 있다. 가장 높은 비 2.35를 보이는 C. 글루타미쿰 ATCC 13032(Kromer, et al., 2008)는 가장 낮은 MalE 활성을 보였다.
NADPH/NADP 비의 감소, 즉 NADPH 한계의 세포내 신호로서의 NADPH/NADP 비의 감소는 malE 발현을 유발하고, 이는 조사된 라이신 생산원에서의 증가된 비활성에서 반영된다. 이전의 연구는 E. coli에서, 세포에서의 NADPH의 유용성에 의해 반영된 산화환원반응의 상태는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 발현의 조절 신호로서 인식된다는 것을 밝혔다(Gardner and Fridovich, 1993). PPP 변형 균주에의 증가된 NADPH 공급 때문에, 말산효소에 의한 NADPH의 추가적 공급은 불필요한데, 이는 이 균주에서의 MalE의 낮은 활성을 설명한다. 이 가정은 이 균주에서 malE 결실에 대한 대응에 의해 확실해진다. 라이신 생산 및 바이오매스 형성은 말산효소 활성의 결핍에 의해 영향을 받지 않았는데, 이는 PPP에 의한 NADPH 공급이 이 균주의 완전한 NADPH 수요를 맞추는 데 충분하다는 것을 보여준다.
수득된 데이터는 C. 글루타미쿰이 확실히 MalE-활성의 조절에 의해 다른 세포의 필요조건에 확실히 적응한다는 것을 확실히 보여준다. 예를 들어 프럭토스에서의 생장 또는 라이신 생산과 같은 제한된 NADPH의 조건 하에서, malE 발현은 증가하고 C. 글루타미쿰에서의 중요한 추가 NADPH 소스를 나타낸다. 이와 관련하여, MalE는 변화하는 세포 필요조건에 대처하는 대사 유연성 및 강건성을 뒷받침한다. 그러나, 말산 효소가 PPP 조작 균주에서 NADPH 과다 형성과 함께 산화환원 밸런싱에 기여하는지, 또는 어떻게 기여하는지는 확실하지 않다. 이와 관련하여 확실한 것은 malE가 명백한 NADPH 초과의 산화에 책임이 있다면, 가정할 수 있듯이, 말산 효소의 결실은 NADPH를 요구하는 산물인 라이신 및 바이오매스의 증가된 생산을 야기하지 않는다는 것이다. 그러나, malE-결핍 균주가 PPP 및 TCA 회로를 통한 플럭스를 포함하는 대사 플럭스의 전체적 재배열에 의해 대응하였고, 이로 인하여 전체 NADPH 공급을 감소시켰다는 것이 제외될 수는 없다. 본 발명은 확장적 접근을 이용한 대사 플럭스 분석, 완전한 산화환원 및 NADPH 밸런스의 측정을 포함하는 추가적인 조사를 요구할 것이다.
라이신 생합성의 변형
균주 최적화에 있어서, 라이신 생합성 경로를 형성하는 효소가 대사공학에서의 주요 타겟이다. 그러나, 라이신 형성의 다른 루트는 분리된 경로가 높은 유연성을 부여하기 때문에 균주 디자인을 방해한다. 본 발명에서, 초점은 C. 글루타미쿰에서의 라이신 경로의 디하이드로게나제 브랜치를 수집하는 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제에 있다. ddh 유전자를 코딩하는 두번째 카피의 구현에 의해, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제는 피드백 탈조절된 균주 C. 글루타미쿰 BS1의 백그라운드에서 과발현되었다.
ddh 과발현의 비효소활성에의 임팩트
ddh 유전자의 두번째 카피의 구현은 모균주 BS1에 비하여 C. 글루타미쿰 BS222의 조 세포추출물에서의 DDH의 활성을 크게 증가시켰다. 도 17에서 나타나듯이, ddh-돌연변이체는 440　mU　mg-1의 비활성을 보였고, BS1은 210 mU mg-1의 비활성을 보였다. 효소활성에의 영향은 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 추가적인 유전자 카피를 반영한다.
ddh 과발현의 생장 및 생산에의 영향
두배로 증가한 DDH의 활성이 라이신 생산 및 생장 거동에 미친 영향을 알기 위해, 글루코스에서의 표준 최소배지에서의 배양 실험을 수행하였다. 두개의 균주 모두 전체 배양기간 동안에 균형잡힌 생장 및 대사 안정성을 보였다. 균주 C. 글루타미쿰 BS222에서의 증가된 DDH 활성은 라이신 수율의 23% 증가를 가져왔다 (표 18).
YLys/S
[mmol mol-1]		 YX/S
[g mol-1]		 μ
[h-1]
C. 글루타미쿰 BS1 81.3±4.8 90.1±1.1 0.38±0.00
C. 글루타미쿰 BS222 100.8±4.8 82.0±1.0 0.31±0.00
표 18: 단일 탄소원로서 글루코스를 이용한 표준 최소 배지에서의 C. 글루타미쿰 BS1 및 C. 글루타미쿰 BS222의 생장 및 생산 특성. 글루코스 소비 및 산물 형성 사이의 선형 최적합의 기울기로서 수율을 측정하였다.
추가의 유전자 카피는 생장 뿐만 아니라, 바이오매스 형성에 영향을 미쳤다 (표 19). 두가지 모두 모균주와 비교하여 C. 글루타미쿰 BS222에서 약간 감소하였다. 이는 0.38 h-1의 비속도로 성장하였고, ddh 돌연변이체에서 μ는 0.31 h-1로 감소하였다.
라이신 생합성 경로의 숙시닐라제 브랜치와 다르게, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제는 직접적으로 암모늄을 사용한다. (NH4)+ 에 대한 DDH의 낮은 친화도 (Wehrmann, et al., 1998) 때문에, 배지에서의 농도가 DDH의 인비보 활성에 영향을 미치기 쉽고, 따라서 ddh 과발현이 라이신 생산에 영향을 미치기 쉽다. 추가의 쉐이크 플라스크 배양에서도 이런 이유로 생장하는 동안 상이한 황산암모늄 농도에서 두개의 균주를 비교하였다.
황산암모늄 농도 증가에 의한 생장 촉진
다른 황산암모늄 농도에서의 균주 C. 글루타미쿰 BS1의 배양은 농도와 비생장속도와의 분명한 상관관계를 보여주었다. 도 18에 나와 있듯이, 비생장속도는 황산암모늄의 증가된 유용성과 함께 증가하였다.
가장 낮은 농도 2 g L-1 에서, C. 글루타미쿰 BS1은 0.32　h-1의 비생장속도를 보였고 15 g L-1의 농도에서 최대 생장률 0.43 h-1 에 도달하였다. 생장 거동과 반대로, C. 글루타미쿰 BS1의 라이신 및 바이오매스 형성은 배지의 다양한 황산암모늄 농도에 영향을 받지 않았다 (표 19).
황산암모늄
[g L-1]		 YLys/S
[mmol mol-1]		 YX/S
[g mol-1]
2 80.8±1.8 88.9±1.1
5 81.3±4.8 90.8±1.3
10 79.8±4.8 88.5±1.1
15 82.1±4.2 91.2±0.8
표 19: 최소배지에서 배양된 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)의 다양한 황산암모늄 농도에서의 라이신 수율 및 바이오매스 수율.
증가된 암모늄 유용성에 의한 라이신 생산의 향상
ddh 변형 균주 C. 글루타미쿰 BS222의 그림은 완전히 달랐다. 여기서, 라이신 생산은 배지에서의 황산암모늄 농도에 극도로 의존하였다. 도 19에 나타나듯이, BS222의 라이신 수율은 황산암모늄의 이용가능성 증가와 함께 연속적으로 증가하였다. 황산암모늄의 농도 2 g L-1 에서 균주는 89.4 mmol mol-1의 라이신 수율을 보였다. 이것은 10 g L-1 황산암모늄 농도에서 125.2 mmol mol-1까지 증가하였다. 황산암모늄으로의 추가 보충은 추가적인 생산 향상을 가져오지 않았는데, 이는 농도 10 g L-1 가 변형된 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 포화에 충분하다는 것을 시사하고, 이는 암모늄에 대한 DDH의 km값인 34 mM과 일치한다 (Wehrmann, et al., 1998).
C. 글루타미쿰 BS1과 반대로, ddh 돌연변이체의 비생장속도는 배지의 황산암모늄의 농도에 영향받지 않았다. 균주는 평균 0.30 h-1±0.01의 속도로 생장하였다. 생장 속도가 0.26 h-1로 약간 감소한 황산암모늄 농도 2 g L-1 에서의 배양이 유일한 예외였다. 이는 모균주 BS1의 가장 나쁜 생장을 야기한 농도이기도 했다. 상기 낮은 암모늄 양은 최적의 생장을 뒷받침하지 않고 바이오매스 형성을 제한한다 (Silberbach, et al., 2005b). 이는 2.75 g L-1 미만의 농도에서는 암모늄 동화에 참여한 몇 유전자가 암모늄 조절을 보장하기 위하여 상향조절된다는 연구결과와 일치한다. 그러나, 바이오매스 형성은 황산암모늄 농도 10 g L-1 이상에서 감소하였는데 (표 20), 이는 아마도 크게 증가하는 라이신 수율과 관련이 있다.
황산암모늄
[g L-1]		 μ
[h-1]		 YX/S
[g mol-1]
2 0.27±0.00 81.4±1.6
5 0.31±0.01 82.0±1.0
10 0.29±0.01 77.8±1.2
15 0.30±0.01 72.0±1.3
표 20: 최소배지에서 배양된 C. 글루타미쿰 BS222의 다양한 황산암모늄 농도에서의 비생장속도 및 바이오매스 수율.
두가지 라이신 생합성 경로와 함께 C.글루타미쿰을 다양한 황산암모늄 농도에 적응하도록 잘 준비한다. NH4 +에 대한 낮은 친화도를 갖는 디하이드로게나제 경로는 높은 농도에서 활성이 되는 반면, 숙시닐라제 경로는 또한 암모늄 이용가능성이 적을 때 생장을 보장한다. 이는 또한 다양한 황산암모늄 농도에서의 생장 동안의 이 두개의 경로 사이의 플럭스 분할에도 반영된다 (Eikmanns, et al., 1993; Sonntag, et al., 1993). 전체적 질소 조절유전자 amtR에 의한 숙시닐라제 브랜치의 제 1 효소를 코딩하는 dapD의 탈조절은 이 에너지 소비 경로가 암모늄 공급이 높을 때 오직 경미한 중요성을 갖는다는 것을 보장한다 (Buchinger, et al., 2009; Silberbach, et al., 2005b). 이는 C. 글루타미쿰 BS1에서의 변화 없는 라이신 수율을 설명한다. 숙시닐라제 및 디하이드로게나제 브랜치를 포함하는 그것의 라이신 경로는 일정 용량을 가지고, 여기서 황산암모늄의 변화는 이 두 브랜치 사이의 플럭스 변화만을 야기한다. NMR 분석에 의한 플럭스 분배비의 측정은 5 g L-1의 황산암모늄 농도에서 디하이드로게나제 브랜치가 라이신에 대한 전체 플럭스의 약 40%에 기여한다는 것을 보여주었다. 이 황산암모늄 농도에서, DDH는 NH4 +에 대한 낮은 친화도 때문에 DDH가 최대일 때 작용하지 않고, 따라서 이 브랜치를 통한 탄소 플럭스를 제한한다. NH4 + 이용가능성을 증가시키는 것은 DDH 활성을 증가시키고 따라서 그것의 전체 라이신 플럭스에의 기여를 증가시키지만 (Sonntag, et al., 1993), 숙시닐라제 브랜치를 형성하는 효소의 발현을 감소시켜서 (Buchinger, et al., 2009) 전체 라이신 플럭스가 증가되지 않게 한다. 그러나, C. 글루타미쿰 BS222에서, 라이신 경로의 전체 용량은 ddh의 과발현에 의해 증가된다. NH4 +에 대한 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 낮은 친화도 때문에, 이 용량은 보다 높은 농도에서만 완전히 이용될 수 있다. C. 글루타미쿰 BS1과 다르게, C. 글루타미쿰 BS222는 라이신 경로의 상기 증가된 용량을 라이신 생산에 사용하고, 가속 생장에 대응하지 않는다. 높은 암모늄 농도에서의 C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산에 있어서의 ddh의 중요성은 이전에 수행된 결실 실험에 의해 더 강조된다(Schrumpf, et al., 1991). 여기서 결실은 심하게 감소된 라이신 생산성을 야기하였다.
그러나, 충분한 암모늄 공급이 보장되었지만 ddh의 플라스미드 관련 과발현은 라이신 생산에 있어서 이롭지 않았다 (Cremer, et al., 1991). 여기서, 두개의 가능한 설명에 주목해야 한다: 암모늄 이용가능성에의 의존도 뿐만 아니라, 라이신 생합성 경로의 플럭스 분배비는 또한 중요한 시간 의존도를 보였다 (Sonntag, et al., 1993). 높은 황산암모늄 농도에서, 디하이드로게나제 경로는 배양의 처음 열두 시간 내에 전체 라이신 플럭스에 70% 이상 기여하는데, 이는 본 연구에서 조사된 배양 단계와 일치한다. 그러나, 이전의 연구에서 연구된 이후의 배양 단계에서, 디하이드로게나제 경로의 기여는 12%로 현격히 감소한다 (Sonntag, et al., 1993). 또한, 과발현은 유전자적으로 정의되지 않은 생산원에서 수행되었다. 이것은 화학적 돌연변이 생성에 의해 수득되었고, 피드백 조절되지 않은 아스파테이트 키나아제에 관하여 선별되었다 (Menkel, et al., 1989). 따라서, ddh 과발현의 긍정적인 효과를 피하는 추가적인 돌연변이의 축적은 제외될 수 없다. 이러한 연구결과로부터, 변형 전략의 이점은 중요 변수로서 실험 조건 뿐만 아니라, 변형된 균주의 유전자 백그라운드를 고려하여 조심스럽게 증명되어야 한다는 것이 확실해진다.
디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 비활성은 배양 배지의 황산암모늄의 농도에 영향받지 않았다. 각각 2 g L-1 또는 15 g L-1 에서 배양되었을 때 두 균주 모두 동일한 비활성을 보였다 (도 20). 이것은 라이신 생산성에 관해 관찰된 차이는 배지에의 NH4 + 공여에 의해 뒷받침되는 DDH의 인비보 활성과 상관관계가 있고, 변화된 NH4 + 농도에 대한 반응으로서의 ddh의 발현 레벨 변화의 결과가 아니라는 것을 확실히 보여준다.
어느 정도까지, 높은 암모늄 농도에서 달성된 증진은 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 lysA의 발현 레벨에 의해서도 영향받을 수 있다. 낮은 암모늄 이용가능성에서, lysA 발현은 amtR에 의해 억제되어, 라이신 형성 대신 생장을 지지한다. 그러나, 이 억압은 증가하는 황산암모늄 농도에서 폐지되고, 이로 인하여 lysA (Silberbach, et al., 2005b) 발현을 증가시키고 따라서 ddh-변형 균주에서의 라이신 생산을 지지할 수 있는 보다 높은 효소 용량을 야기한다.
전구체 공급의 변형
NADPH의 과잉 공급 때문에, 상술된 PPP 변형 균주는 라이신 생산에서의 중요한 잔여 잠재력을 가졌다. 여기서, 라이신 합성은 아마도 변하지 않는 보충 순 플럭스에서 반영되는 옥살로아세테이트의 불충분한 공급에 의해 제한된다 (도 24). 이와 관련한 균주 증진은 피루베이트 카르복실라제 또는 PEP 카르복실라제의 과발현을 통한 OAA 공급의 증가에 의해 달성되었다 (Peters-Wendisch, et al., 2001; Sano, et al., 1987). 본 연구에서 적용된 전략은 OAA의 직접적인 탄소 전구체로서의 피루베이트 및 포스포에닐피루베이트를 두고 경쟁하는 대사경로를 통한 탄소 전환 감소에 의한 OAA 공급 증가를 위한 새로운 표적에 초점을 맞추었다.
피루베이트 키나아제 결실에 대한 대사반응
피루베이트 키나아제는 중간 대사의 플럭스 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. 그것은 포스포에닐피루베이트의 피루베이트로의 불가역성 전환을 촉진시키고 ATP 및 AMP의 알로스테릭 조절(allosteric control) 하에 있다 (Jetten, et al., 1994b). 피루베이트 키나아제 결핍 균주에서 두 라이신 전구체 옥살로아세테이트 및 피루베이트의 필요한 등몰비는 포스포트랜스퍼라제 시스템(PTS) 및 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(PEPC)의 합주 작용(concerted action)을 통하여 달성될 수 있고, 이로 인하여 감소된 양의 탄소가 TCA 회로로의 줄어든 플럭스에 기인하여 CO2로 손실될 수 있기 때문에, 라이신 생산 C. 글루타미쿰에서 피루베이트 키나아제의 결실은 균주 개량의 유망한 전략으로 보인다. 이전의 연구에서, 라이신 생산 C. 글루타미쿰에서의 피루베이트 키나아제의 결실은 확실한 그림을 내지 못했기 때문에, 정확한 대사 결과가 완전히 이해되지 않았다 (Gubler, et al., 1994; Ozaki and Shiio, 1969; Shiio, et al., 1990). 여기서, 피루베이트 키나아제 결실에 대한 C. 글루타미쿰의 대사반응을 상술한 확장 모델을 이용하여 인비보 플럭스의 레벨을 자세히 조사하였다. 피루베이트 키나아제 결핍 균주 C. 글루타미쿰 BS13를 라이신 생산원 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)의 백그라운드에서의 코딩하는 pyk 유전자의 결실에 의해 구축하였다.
피루베이트 키나아제 활성
pyk 결실 돌연변이체 C. 글루타미쿰 BS13은 인 비트로 피루베이트 키나아제 활성(< 0.6 mU mg-1)의 완전한 부재를 보인 반면, 모균주 C. 글루타미쿰 BS1은 이 효소에 대한 강한 비활성 1099　mU mg-1을 보였다. PYK 활성의 결핍은 C. 글루타미쿰 BS13에서의 활성과 같은 잔여 피루베이트 키나아제가 없다는 것을 보여주었다. 결실 균주에서, PEP의 피루베이트로의 직접적 전환은 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의한 글루코스 흡수로 제한되었다.
결실의 생장 및 생산 특성에의 영향
피루베이트 키나아제 결실의 양적 생리학적 효과를 조사하기 위하여, 라이신 생산 C. 글루타미쿰 BS1 및 그 피루베이트 키나아제 결핍 유도체 C. 글루타미쿰BS13을 배치 배지에서 배양하였다 (도 21 A-D).
두 균주 모두 상대적으로 비슷한 비생장률, 비글루코스흡수율 또는 바이오매스 수율을 보였다. 그러나, 라이신 생산의 수율 및 비속도는 C. 글루타미쿰 BS13에서 약간 더 낮았다 (표 21). 또한, 피루베이트 키나아제 활성의 결핍은 오버플로우 대사산물 디하이드록시아세톤(DHA) 및 글리세롤의 형성을 유도하였다. 트레할로오스 형성은 약간 감소하였다.
펜토스 포스페이트 경로
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 1.1.1.49 zwf NCgl1514
트랜스알돌라제 2.2.1.2 tal NCgl1513
트랜스케톨라제 2.2.1.1 tkt NCgl1512
글리콜리시스/글루코스신생합성
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
프럭토스 1,6-비스포스파타아제 3.1.3.11 fbp NCgl0976
포스포글루코이소머라제 5.3.1.9 pgi NCgl0851
피루베이트 디하이드로게나제 (서브유닛 1) 1.2.4.1 aceE NCgl2167
피루베이트 키나아제 2.7.1.40 pyk NCgl2008
TCA 회로/보충반응
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
이소시트레이트 디하이드로게나제 1.1.1.42 icd NCgl0634
말산 효소 1.1.1.40 malE (mez) NCgl2904
PEP 카르복시키나아제 4.1.1.32 pck NCgl2765
피루베이트 카르복실라제 6.4.1.1 pyc NCgl0659
아미노산 합성
효소 EC 번호 유전자 자리 태그
아스파토키나아제 2.7.2.4 lysC NCgl0247
디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 1.4.1.16 ddh NCgl2528
디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 1.3.1.26 dapB NCgl1898
호모세린 디하이드로게나제 1.1.1.3 hom NCgl1136
표 21: 라이신 생산 C.글루타미쿰 BS1 및 BS13의 글루코스에서의 회분배양 동안의 생장 및 생산 특성. 주어진 데이터는 바이오매스 수율(YX/S), 라이신 수율(YLys/S), 글리세롤 수율(YGly/S), 디하이드록시아세톤 수율(YDHA/S), 트레할로오스 수율(YTre/S) 뿐만 아니라, 비생장률(μ), 비글루코스흡수율(qGlc) 및 비라이신생산률(qLys)이다. 모든 수치는 세개의 병행배양 실험으로부터의 평균값을 나타낸다. 수율은 도 21에서 나타나듯이 세개의 생물학적 복제로부터의 산물 형성과 기질소비를 플로팅 할 때의 선형 최적합(linear best fit)의 기울기로 측정되었다.
비생장률 및 바이오매스 수율, 라이신 및 부산물을 포함하는 주요 동력학적 및 화학량론적 파라미터는 배양 내내 일정하게 유지하였다 (도 21 A - D). 이는 두 균주 모두 대사 플럭스의 용해를 위한 상술한 확장 플럭스 모델의 사용을 허용하는 대사 정상상태에 있었다는 것을 확실히 보여준다.
피루베이트 키나아제 결실에 대응한 대사 플럭스
피루베이트 키나아제 결실에 대한 라이신 생산 C. 글루타미쿰의 반응을 대사 탄소 플럭스의 레벨에서 조사하였다. 어떻게 C. 글루타미쿰 BS13이 중앙 당분해 유전자의 손실을 보상하는지, 모균주의 생장 및 생산특성을 거의 유지하는지를 자세히 관찰하는 것이 흥미로웠다.
여기서, PEP의 대사산물 풀 및 피루베이트의 분리, 및 카르복시화 및 탈카르복시화에 참여한 모든 플럭스의 해결(resolution)이 중요했기 때문에, 99 % [1-13C] 글루코스 및 50 % [U-13C] 글루코스를 이용한 추적자 실험으로부터의 라벨 정보 및 확대된 대사 네트워크를 이용한 대사 플럭스 분석을 수행하였다. 유전자 변형에 대한 직접적 반응으로서, PEP로부터 피루베이트로의 전체 전환 플럭스는 138%에서 100%로 현격히 감소하였는데, 이는 글루코스 흡수에의 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의한 PEP의 피루베이트로의 독점적 전환을 반영한다. 도 22의 대사 플럭스 분포는 피루베이트 키나아제의 결실이 또한 피루베이트 노드 주위의 플럭스가 PEP에서 피루베이트로의 제한된 직접 전환을 우회하게 하는 국지적 경로변경을 야기하였다는 것을 보여준다. 펜토스 포스페이트 경로 및 TCA 회로의 반응은 오히려 약했다. 자세히, 상기 두 균주는 PC 및 PEPC의 TCA 회로의 보충대사 공급에의 상대적 기여에서 많이 달랐다. C. 글루타미쿰 BS1에서 PC가 주요 보충 효소인데 반해, 이 목적으로 PEPC를 이용한 결실 돌연변이주에서는 완전히 비활성이었다. 탈카르복시화 효소 PEPCK 및 말산 효소를 통한 플럭스는 두 균주 간에 약간의 차이를 보였다. 전체적으로 보아, 피루베이트 키나아제 결실은 피루베이트로부터의 보충 순 플럭스의 PEP 카르복시화로의 강한 이동을 야기하였고, PEPC, 말산디하이드로게나제 및 말산 효소를 포함하는 피루베이트에 대한 옥살로아세테이트 및 말레이트를 통한 PEP로부터의 대사 우회를 야기하였다 (도 23). 이 우회는 피루베이트가 충분히 공급되게 하였고 따라서 피루베이트 디하이드로게나제 및 TCA 회로를 통한 높은 플럭스가 유지되었다. 전체 C. 글루타미쿰 BS13은 보충 효소의 유연적 사용을 포함하는 국부 플럭스 재배열에 의해 유전자 결실을 보상할 수 있었다. 좁은 신뢰구간은 모든 탄소 플럭스가 매우 높은 정확성을 가지고 측정되었다는 것을 강조한다 (도 22). 따라서 여기서 언급된 플럭스 차이는 피루베이트 키나아제의 결실과 분명히 관계가 있다. 두 균주의 비글루코스흡수율이 거의 동일했기 때문에 (표 22) 상대적 플럭스에 대한 모든 결론은 절대적 플럭스값에 있어서도 적용된다. 두 균주에 있어서, 실험으로 측정된 매스 이소토포머 및 모의의 매스 이소토포머 사이의 우수한 적합성이 달성되었다.
대사 우회로의 부분으로서의 옥살로아세테이트의 말레이트로의 전환은 순 TCA 회로 플럭스의 반대 방향이며, 오히려 말레이트로부터 옥살로아세테이트를 형성하고, 이 두 대사산물의 가역적 상호변환을 요구한다. 상술하였듯이, 여기서 적용된 확장된 플럭스 모델은 단일 풀로서 말레이트 및 옥살로아세테이트를 고려하고, 라벨 데이터의 훌륭한 적합성은 말레이트 및 옥살로아세테이트 사이의 가역적 상호변환의 존재를 뒷받침한다. 이 우회로의 활성화는 피루베이트 키나아제 활성 손실을 보상하고 TCA 회로 뿐만 아니라, PPP, 당분해 또는 동화작용을 포함하는 다른 중추경로를 통한 탄소 플럭스를 유지하는 필수요소이다. 같은 대사 우회로는 또한 글루코스에서의 배양 동안의 피루베이트 키나아제 결핍 E. coli에서 활성화되고 (Al Zaid Siddiquee, et al., 2004; Emmerling, et al., 2002) PEPC 및 PC를 소유하는 미생물의 일반적 전략을 확실히 보여준다. 반대로, PEPC 결핍 B. subtilis 는 피루베이트 키나아제가 없으면 글루코스에서 생장할 수 없다 (Diesterhaft and Freese, 1973; Fry, et al., 2000).
C. 글루타미쿰 BS1 및 pyk 결실 돌연변이주는 모두 C. 글루타미쿰 대사의 유연성에 있어서의 말산 효소의 중요한 역할을 보여주는 말산 효소를 통한 중요한 플럭스를 보인다. 결실 돌연변이주에서, 말산 효소는 생성된 대사 우회로의 부분이고 따라서 유전적 섭동에 대한 대사의 강건성에 기여한다. 두 균주에서의 말산효소의 플럭스, 즉 인비보 활성은 말산효소가 C. 글루타미쿰에서의 보조인자 대사의 유연성에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주고, 상술하였듯이 이 효소의 라이신 생산균주 C. 글루타미쿰에서의 NADPH 소스로서의 중요성을 보여준다. NADPH 밸런스(도 24)에 의해 알 수 있듯이, 말산 효소는 두 균주에서 세포의 NADPH 수요를 맞추기 위해 필요하고 이 보조인자의 공급에 크게 기여한다. 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 및 6-포스포글루콘산 디하이드로게나제(PPP), 이소시트레이트 디하이드로게나제 (ICD) 및 말산 효소(MalE)는 16.4 mmol NADPH (g 세포 건조중량)-1의 화학량론적 수요를 갖는 NADPH 공급 반응 및 동화작용으로서 (Wittmann and de Graaf, 2005) 및 NADPH 소비 반응으로서 4 mol NADPH (mol lysine)-1 의 화학량론적 수요를 갖는 라이신 생산으로 간주되었다. 이는 말산 효소의 생리적 역할에 대한 본 연구의 결론을 상당히 뒷받침한다.
피루베이트 키나아제 결실 균주에서 PPP를 통한 뿐만 아니라 말산 효소를 통한 보다 낮은 플럭스는 TCA 회로을 통한 강화된 NADPH 공급을 야기하는 이소시트레이트 디하이드로게나제를 통한 플럭스 증가와 연관있을 수 있다. 전체 공급을 균형잡는 NADPH 공급 경로의 공동 조절은 라이신 생산 C. 글루타미쿰에서 이전에 관찰되었다 (Wittmann and Heinzle, 2002).
C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산에 대한 피루베이트 키나아제의 결실의 정확한 영향은 배양 조건 뿐만 아니라 생산균주에 따라 확실히 달라진다. 그러나, 피루베이트 키나아제의 결실 후, 라이신 생산은 B. 플라붐의 다른 균주에서 강화되었고 (Ozaki and Shiio, 1969; Shiio, et al., 1990), C. 락토페르멘툼에서는 생산이 감소하였는데(Gubler, et al., 1994), 어느 정도까지는 본 연구에서도 그렇다. NADPH의 전체 공급이 크게 변하지 않았기 때문에, 가능한 설명은 라이신 전구체 옥살로아세테이트의 제한된 이용가능성일 수 있다. 여기서 연구된 C. 글루타미쿰 BS1 및 C. 글루타미쿰 BS13의 생리적 특성 및 세포내 탄소 플럭스는 가능한 설명을 가리킨다. 이와 관련하여, 특히 피루베이트 키나아제의 결실과 관련된 디하이드록시아세톤 및 글리세롤의 축적이 흥미로워 보인다. 이 오버플로우 대사산물은 보다 낮은 당분해 체인에 유입되는 플럭스가 예를 들어 프럭토스에서 배양하는 동안 글리세르알데히드 3-포스페이트의 다운스트림 반응의 용량을 초과할 때 C. 글루타미쿰에 의해 형성된다 (Dominguez, et al., 1998; Kiefer, et al., 2004). 이 조건 하에서, 병목현상은 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나제에 기인하며, 이 효소능을 감소시키는 부정적인 NAD/NADH 비에 의해 야기된다. 그러나, 관찰된 C. 글루타미쿰 BS1 및 pyk 결실 돌연변이주의 대사 플럭스는 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소능을 감소시킬 수 있는 피루베이트 키나아제 결실 균주에서 NAD/NADH의 비율의 큰 변화를 시사하지 않는다. 이 효소를 통한 인비보 플럭스가 여기서 연구된 두 균주에서 동일하였으므로, 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나제의, 관찰된 한계에의 기여는 가능성이 없어 보인다. 다른 후보는 보다 유망하다. 볼 수 있듯이, 보충 플럭스는 결실 돌연변이주에서의 PEPC로 완전히 이동한다. 모균주에 비하여, 이 효소를 통한 전체 플럭스는 약 2.5배 증가하였는데 이는 이 조건 하에서 이 효소가 작용할 수 있는 최대능을 나타낼 수 있다. 이 점에 있어서, 이전에 피루베이트 키나아제 결실 후 강화된 라이신 생산을 보이는 균주 C. 글루타미쿰은 아스파테이트에 의한 알로스테릭 제어에 민감하지 않은 PEPC의 피드백 내성 변수를 추가적으로 함유한 반면 (Shiio, et al., 1987), 피루베이트 키나아제 및 PEPC가 결핍된 이중 돌연변이체는 심각하게 손상된 글루코스 사용을 보였다 (Park, et al., 1997). 말산 효소의 제한된 능력은 관찰된 한계에 관련된다는 것이 가능해 보인다. 피루베이트 키나아제 결핍의 야생형 C. 글루타미쿰에서의 말산 효소활성은 아세테이트 또는 시트레이트에서의 생장을 가능하게 하기에 충분하지 않지만, 생장은 이 효소의 과발현에 의해 회복될 수 있다 (Netzer, et al., 2004).
피루베이트 디하이드로게나제의 감쇠
C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산에 있어서 피루베이트 디하이드로게나제는 라이신 전구체 옥살로아세테이트의 주요 소스로서의 보충 효소 피루베이트 카르복실라제와 직접적으로 경쟁한다 (Peters-Wendisch, et al., 2001). 이 중추 당분해 유전자 중 하나의 서브유닛을 코딩하는 aceE 의 결실은 C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산을 향상시키는 것으로 나타났다. 그러나, 이 결실은 TCA 회로를 향한 탄소 플럭스를 완전히 막았고, 심각한 생장 결핍을 야기하였고, 전형적 당계 생산배지에서 돌연변이체가 생장할 수 없게 하였다. 또한, 피루베이트 디하이드로게나제 활성의 결핍은 광범위한 부산물 형성을 유도하였다 (Blombach, et al., 2007). 본 연구에서, PDH를 통한 탄소 플럭스 및 TCA 회로 전구체 아세틸-CoA의 공급을 감소시키고, 따라서 유해한 부작용 없이 라이신 생산을 증가시키 위하여, PDH의 발현은 개시코돈 교환에 의해 탈조절되었다.
균주 구축 및 확인
aceE 유전자에서의 개시코돈 교환은 상동재조합을 이용하여 돌연변이체를 통한 야생형 대립유전자의 치환에 의해 달성되었다. 변형은 C. 글루타미쿰 BS87의 유전자 백그라운드에서 수행하였다. 이 균주는 피루베이트 카르복실라제의 과발현 및 변형 및 PEP 카르복시키나아제의 결실에 의한 변형된 전구체 공급 뿐만 아니라, 라이신 생합성 경로내의 몇가지 변형을 이미 포함하였다 (표 1). 제 2 재조합으로부터의 클론을 상술하였듯이 비PDH 활성에 관하여 스크리닝하였다 (도 21). 약 1000 bp의 폭을 포함하는 aceE의 개시코돈 부위의 시퀀싱에 의한 돌연변이체의 추가적인 분석은 개시코돈 뉴클레오티드만 제외하고는 야생형에 100% 시퀀스 일치를 보였다. 감소한 PDH 활성을 갖는 두 돌연변이체는 개시코돈 내에서의 뉴클레오티드 교환을 운반하였다 (도 25). 균주 구축 과정 동안에 돌연변이가 발생하지 않았기 때문에, 돌연변이체의 감소된 비PDH활성은 시행된 점 돌연변이의 결과라고 할 수 있다. C. 글루타미쿰 BS238라고 표시될 클론 2로 추가 실험을 수행하였다.
개시코돈 교환의 비효소활성에의 영향
재조합 균주 BS238 및 모균주 BS87의 비PDH 활성은 단일 탄소원로서 글루코스를 이용하여 최소배지에서 측정하였다. 도 26에서 도시하고 있듯이, 흔한 ATG 대신 희귀 개시코돈 GTG의 사용이 피루베이트 디하이드로게나제의 현저한 비활성 감소를 야기하였다. 모균주 C.　글루타미쿰 BS87이 약 30　mU mg-1의 비PDH 활성을 보인 반면, C.　글루타미쿰 BS238에서는 겨우 13 mU mg-1였다.
산업적 공정에서 개시코돈 교환에 의한 PDH 감쇠의 성공적 적용을 위하여, 시행된 점 돌연변이의 안정성은 중요한 요소이다. 이는 회분배양에서 기하급수적으로 생장하는 세포의 차후의 전이를 포함하는 오랜 기간의 배양 실험에서 확인되었다. 돌연변이체 C. 글루타미쿰 BS238에서의 비 PDH 활성은 이 절차에 의해 영향을 받지 않았다. 50 세대 후, 돌연변이체 균주는 낮아진 피루베이트 디하이드로게나제의 비활성을 여전히 보였는데 (도 26), 이는 변형이 안정적으로 게놈으로 시행되었고, 복귀돌연변이가 되지 않았다는 것을 보여준다.
생장 및 생산 특성에의 영향
PDH 활성의 탈조절은 C.　글루타미쿰 BS238에서 BS87에서 142 mmol mol-1로부터 165 mmol mol-1로의 라이신 수율의 증가를 야기하였는데, 이는 17%의 증가에 해당한다. 바이오매스 형성은 변형된 효소활성에 의해 거의 영향을 받지 않았다 (도 27).
그러나, C. 글루타미쿰 BS238의 비생장률 (μ= 0.25 h-1)은 C. 글루타미쿰 BS87 (μ= 0.33 h-1)에 비해 약간 감소하였다. 재조합 균주는 부산물 형성에 있어서 영양요구성 뿐만 아니라 상당한 차이를 보이지 않았고, 오직 적은 양의 트레할로오스만이 생산되었다 (< 10 mmol mol-1). 비생장률 뿐만 아니라 라이신 및 바이오매스의 수율은 전체 배양 내내 일정하였고, 이는 균주가 대사 정상상태에 있었다는 것을 보여준다. 따라서, 두 균주 사이의 관찰된 변화는 변화된 개시코돈 시퀀스에 기인하고 따라서 피루베이트 디하이드로게나제의 감소한 비활성에 기인한다.
피루베이트 디하이드로게나제의 탈조절에 대한 플럭스의 반응
피루베이트 디하이드로게나제의 감소한 비활성에 따른 균주 C. 글루타미쿰 BS238의 변화된 생리는 피루베이트 노드 주위의 변화된 플럭스를 시사한다. 변경된 효소활성의 이 대사경로에의 영향을 더 자세히 연구하기 위하여, 피루베이트 카르복실라제를 통한 PDH 플럭스 및 순 플럭스를 C.　글루타미쿰 BS238 및 그 모균주에서 측정하였다. 여기서, C. 글루타미쿰을 이용한 18개의 독립적인 13C 라벨 실험에서 수득된 라이신 수율, 바이오매스 수율 및 PDH 플럭스 사이의 화학량론적 상관관계는 계산의 기본의 역할을 하였다 (도 13). 이는 변형된 효소 피루베이트 디하이드로게나제를 통한 작지만 중요한 플럭스 감소를 보였다 (표 23). 피루베이트 카르복실라제를 통한 순 플럭스의 증가와 함께 (표 22), 이는 PDH로부터 보충 반응으로의 플럭스 변화를 야기한다. 관찰된 플럭스 차이의 유의도는 PDH 플럭스 및 PYC 플럭스를 고려하는 t-테스트에 의해 확인되었다 (표 22).
C. 글루타미쿰 BS87 C. 글루타미쿰 BS238 t-값
νPDH [%] 77.2±1.0 76.0±1.2 8.0
νPYC [%] 35.1±0.5 36.6±0.5 -21.8
표 22: 피루베이트 디하이드로게나제를 통한 인비보 플럭스(νPDH) 및 글루코스 배양 C.　글루타미쿰 BS87 (모균주) 및 C. 글루타미쿰 BS238 (aceE att )의 동화 카르복시화를 통한 럼프트 순 플럭스(lumped net flux;νPYC). 편차는 Monte-Carlo 분석에 의해 수득된 90% 신뢰구간을 나타낸다.
향상된 라이신 생산에 목적을 둔 합리적 대사 변형 접근의 주요 목적은 원치 않는 해로운 부작용을 야기하지 않고, 순수하게 유익한 돌연변이의 식별 및 도입이다 (Ohnishi, et al., 2002). 이는 방해받는 생장 거등 또는 손상된 스트레스 내성 없는 우수한 세포 공장을 약속한다 (Park and Lee, 2008). 그러나, 우리는 적용된 유전자 변화가 전형적으로 강하기 때문에, 의도된 유익한 변화 뿐만 아니라, 이러한 잘 정의된 표적 변형 중 많은 변형은 여전히 이롭지 않은 부작용을 낳는다는 것을 깨닫는다. 유효한 예는 최근 설명된 증가된 부산물 형성을 도입하는 라이신 생산 C. 글루타미쿰에서의 피루베이트 디하이드로게나제의 결실 및 산업적으로 적합한 당 기반 생산배지에서 생장할 수 없다는 것이다 (Blombach, et al., 2007). 이는 긍정적 효과 및 부정적 효과를 균형잡히게 할 수 있는 보다 점진적인 경로 변형에 대한 수요를 다시 불러일으킨다. 이전의 연구를 넘어서, 피루베이트 디하이드로게나제의 60 % 감쇠는 라이신 생산을 증진시키지만, 여전히 산업적으로 적합한 당에서의 잘 균형된 생장을 가능하게 한다. 또한, 결실 돌연변이주에서 발견된 피루베이트 노드에서의 과도한 부산물 형성은 (Blombach, et al., 2007) 완전히 방지될 수 있다. 피루베이트 노드 주위의 대사 플럭스의 측정은 감소된 활성의 이점이 확실히 피루베이트 디하이드로게나제로부터 보충 카르복시화로의 플럭스 변화 때문일 수 있다는 것을 보여주었다. 변형된 균주는 pyc 유전자에서의 주요 돌연변이체 P458S 뿐만 아니라, 증폭된 피루베이트 카르복실라제 발현을 포함하는 변형 전구체의 공급을 이미 보인다. 두 돌연변이 모두 증가된 보충 카르복시화 플럭스를 통하여 라이신 생산의 증가를 가져온다는 것이 밝혀졌다 (Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001). 이 변형 및 그에 따른 피루베이트 카르복실라제의 증가된 능력은 효율적인 플럭스 전환을 야기하고 따라서 라이신 생산을 증진시킬 수 있다. 60 % 감소한 피루베이트 디하이드로게나제 활성은 오직 하나의 뉴클레오티드의 교환에 의해, 즉 전사 개시코돈의 변형에 의해 달성되었다. 이 방법은 유전자 섭동에 민감하고 생장 및 생존력을 유지하기 위해 필요한 효소 및 경로에 접근하도록 해준다.
TCA 회로의 변형
NADPH 대사, 전구체 공급 및 라이신 생합성 뿐만 아니라, TCA 회로는 C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산의 변형의 유망한 대사경로인데, 이는 라이신 플럭스 및 TCA 회로 플럭스 사이의 상관관계에 반영된다 (도 12) (Wittmann and Becker, 2007; Wittmann and Heinzle, 2002). 그러나, TCA 회로가 유전자 결실에 의한 완전한 블록을 막는 세포 생장에 중요하기 때문에 이 경로에 의한 감소된 탄소전환을 목표로 하는 유전자 변형은 사소하지 않다. 본 연구에서, 이소시트레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 icd의 발현은 합리적으로 감쇠되었다. 다른 미생물과 반대로, C. 글루타미쿰에서의 ICD 발현 레벨은 생장기 또는 생장 조건과 무관하다 (Eikmanns, 2005). 약 1 U mg-1 (Eikmanns, et al., 1995)의 비활성과 함께, ICD는 가장 높게 발현된 TCA 회로 효소이고 따라서 탈조절의 유망한 후보이다. 이는 코딩하는 유전자 icd의 개시코돈 교환에 의해 달성되었다. 변형은 라이신 생산원 C. 글루타미쿰 BS87의 백그라운드로 구현되었다. 이어서, 효소활성, 생산 특성 및 TCA 회로 플럭스에의 영향을 조사하였다.
균주 구축 및 확인
두개의 상동재조합 이벤트에서, ATG 개시코돈을 함유하는 이소시트레이트 디하이드로게나제의 야생형 대립유전자를 돌연변이체 GTG-개시-코돈-대립유전자로 치환하였다. 두개의 재조합 이벤트로부터의 성장하는 클론의 비효소활성의 측정을 통하여 상술한 대로 스크리닝을 수행하였다 (도 21). 이어서 수행된 현격히 감소한 비 ICD 활성을 갖는 클론의 시퀀스 분석은 이 클론이 GTG 개시코돈의 운반체라는 것을 확실히 확인하였다 (도 28).
상동재조합 이벤트에 관련된 완전한 시퀀스의 해결(resolution)은 균주 구축 과정에서 어떤 돌연변이도 발생하지 않았다는 것을 보장하였다. 여기서 시퀀스 배열은 개시코돈의 뉴클레오티드 교환을 제외하고는 1000 bp의 완전한 스팬에서 선별된 돌연변이체 및 모균주 BS87 사이의 100% 일치를 보였다. 효소활성의 관찰된 감소는 희귀 개시코돈 GTG의 사용의 직접적 결과였다.
개시코돈 교환의 효소활성에의 영향
시퀀싱에 의한 균주 확인에 이어서, 모균주 C. 글루타미쿰 BS87 및 개시코돈 돌연변이체 C. 글루타미쿰 BS205의 비 ICD 활성을 발효 배지에서의 배양 동안 비교하였다. 도 29에서 도시하고 있듯이, 흔한 ATG 대신 희귀 개시코돈 GTG의 사용은 이소시트레이트 디하이드로게나제의 비활성을 현격하게 감소시켰다. 모균주 C. 글루타미쿰 BS87이 약 1.3　U mg-1의 비 ICD 활성을 보인 반면, C. 글루타미쿰 BS205에서는 겨우 0.3 U mg-1이었다.
균주 C. 글루타미쿰 BS205에서의 감소된 ICD 활성은 개시코돈 교환의 결과라고 할 수 있고 따라서 유전자 발현의 전사 감쇠를 반영한다. icd의 야생형 대립유전자와 비교하여, GTG 돌연변이체에서의 개시코돈 인식은 손상되어 리보솜에 결합하는 mRNA를 수반하는 전사개시 과정의 방해를 야기한다 (O'Donnell and Janssen, 2001; Vellanoweth and Rabinowitz, 1992). 이는 mRNA 안정성 뿐만 아니라 번역의 빈도를 크게 감소시키는데, 이 두가지 모두는 기능적으로 활성인 이소시트레이트 디하이드로게나제 단백질의 완성을 감소시키고, 따라서 효소활성을 감소시켰다. 순차적 배치에서의 장기간 배양에 의해 확인되었듯이, 산업적 적용에 있어서 중요한 필수요소인 변형 및 그것의 효소활성에의 영향은 안정적이었다 (도 29).
생장 및 생산 특성에의 영향
변화된 효소활성의 생산 특성에 대한 영향을 연구하기 위하여, 변형된 최소배지에서의 배양 동안 다른 균주의 생장, 라이신 생산 및 바이오매스 형성을 비교하기 위한 배양 실험을 수행하였다. ICD의 탈조절에 의해, 글루코스에서의 배양 동안의 라이신 수율은 BS87에서 141 mmol mol-1 에서 C. 글루타미쿰 BS205에서 200 mmol mol-1 로 증가하였는데, 이는 42%의 증가에 해당한다. 바이오매스 형성은 거의 영향받지 않았다 (표 23). 그러나, 비생장률은 돌연변이체 균주에서 감소하였다. 모균주 BS87는 0.32 h-1의 생장률로 생장하였고, BS205는 0.28　h-1의 비생장률을 보였다.
YLys/S
[mmol mol-1]		 YX/S
[g mol-1]
C. 글루타미쿰 BS87 141.3±3.5 72.6±2.0
C. 글루타미쿰 BS205 200.4±4.4 68.4±2.5
표 23: 글루코스에서의 배양 중 라이신 생산 C. 글루타미쿰 BS87 및 C. 글루타미쿰 BS205 (icd att )의 생산 특성. 주어진 데이터는 바이오매스 수율(YX/S) 및 라이신 수율(YLys/S)이다. 기질소비에 대한 생산물 형성을 그래프로 나타낼 때 선형 최적합의 기울기로서의 세개의 생물학적 복제로부터 수율을 측정하였다 (도 30).
충분한 산소 공급이 산소 결핍에 의해 유도된 부산물의 형성을 방지하였다 (Inui, et al., 2004). 아주 적은 양의 트레할로오스 (< 10　mmol　mol-1)가 양 균주에서 생산되었다. 비생장률 뿐만 아니라 라이신 및 바이오매스의 수율 또한 전체 배양 기간 내내 일정하였는데 이는 균주들이 대사 정상상태에 있었다는 것을 보여준다 (도 30). 따라서 두 균주 사이에 관찰된 차이는 변화된 개시코돈 시퀀스에 확실히 기인하고, 따라서 이소시트레이트 디하이드로게나제 비활성을 감소시켰다.
icd 의 탈조절에 대한 대사 플럭스 반응
효소활성의 측정 및 비교 배양 실험의 데이터는 ATG 대신 희귀 개시코돈 GTG의 사용이 균주의 세포생리학을 크게 변화시켰다는 것을 확실히 보여주었다. 대사경로에의 변형된 효소활성의 영향을 더 자세히 알기 위해, TCA 회로를 통한 플럭스 및 피루베이트 카르복실라제를 통한 순 플럭스를 C. 글루타미쿰 BS87 및 C. 글루타미쿰 BS205에서 측정하였다. 이를 위하여, 라이신 수율, 바이오매스 수율 및 TCA 회로 플럭스 사이의 화학량론적 상관관계를 정립하였다 (도 12). 시트레이트 신타아제를 통한 진입 플럭스(entry flux)는 피루베이트 카르복실라제를 통한 순 플럭스의 증가와 함께 icd 돌연변이체에서 감소하였다 (도 31). 수행된 t-테스트는 각각 TCA 회로 플럭스(t = -10.1)를 고려하는 균주 및 PYC 플럭스(t = 43.6)를 고려하는 균주 사이의 큰 차이를 확실히 보였다. 요컨대, 이 플럭스 변화는 TCA 회로로부터 보충 반응으로의 플럭스 전환을 야기하였다.
PDH 감쇠에 대하여 이미 가정하였듯이, 보충 카르복시화를 향한 플럭스 이동은 변형된 피루베이트 카르복실라제에 의해 뒷받침될 가능성이 높다. 여기서 달성된 40% 라이신 수율 증진은 aceE 유전자에서의 개시코돈 교환에서 기인하는 증가보다 훨씬 더 높다. 이는 전체 효소활성의 감소를 반영할 수 있으며, icd 유전자에서의 감소가 70%로 가장 확연하다. 감소된 효소활성이 라이신 생산에 주는 이점에도 불구하고, 변형은 관련 경로에 의해 생산 또는 탄소전환을 크게 손상시키지 않고, 따라서 부산물 형성에서 나타난다. 개시코돈 돌연변이체에서의 300 mU mg-1라는 높은 잔여 ICD 활성은 추가적인 탈조절에 의한 연속적 최적화에 대한 여지를 남겨둔다. TCA 회로 내에서의 유도된 병목현상의 결과로서 부산물 형성이 없는 것은 C. 글루타미쿰 BS205의 피루베이트 노드 주위의 대사 네트워크가 훨씬 더 엄격한 감쇠를 충족시킬 능력이 있다는 것을 시사한다. 하나의 가능한 전략은 가장 희귀한 개시코돈 변이체 TTG의 구현일 수 있다. 본 연구를 넘어서, TCA 회로에 의한 CO2 형성을 통한 높은 탄소 손실은 소정의 산물의 탄소 수율에 있어서 일반적으로 바람직하지 않기 때문에 TCA 회로의 표적 탈조절은 다른 다양한 산물에 대하여도 유망해 보인다. 이 점과 관련하여 확실한 산물은 아스파테이트 계열의 다른 아미노산 또는 탈카르복시화에 의한 라이신으로부터 직접적으로 형성된 디아미노펜탄의 생산이다. 상술한 피루베이트 디하이드로게나제의 감쇠에도 똑같이 적용된다.
맞춤형 라이신 고생산원의 구축
이전의 챕터에서는, C. 글루타미쿰에 의한 라이신 생산을 합리적으로 최적화하기 위한 다른 전략들이 성공적으로 적용되었다. 모균주 C. 글루타미쿰 BS1 및 C. 글루타미쿰 BS87의 예를 들면, NADPH 대사, 전구체 공급 및 CO2 형성, 및 라이신 생합성의 주요 경로로부터의 몇가지 표적의 이점에 대해 연구하였다. 산업적 생산에 적절한 균주로서의 야생형 기반 고생산원을 생산하는 목표를 가지고, 확인된 변형이 이제 단일 균주에서 결합되었다. 이 작업은 산업적 생산균주에 나타나는 해로운 부작용을 최소화하고 오직 이로운 변형만을 수행하기 위하여 야생형 C. 글루타미쿰 ATCC 13032에 기반하였다.
균주 구축 및 생산능
고생산원의 생산을 위한 제 1단계는 아미노산 교환 T311I를 도입하여 라이신 및 트레오닌에 의한 피드백 제어로부터 아스파테이트 키나아제를 방출하는 것이었다 (Becker, et al., 2005). 이는 상술한 ddh의 과발현으로 보완되었다. 이 두가지 변형 및 추가적인 배지 최적화만의 수행으로 125 mmol lysine (mol glucose)-1를 이미 생산한 라이신 생산원을 만들어 내었다. 라이신 생합성 경로 내의 추가 병목현상을 회피하기 위하여, ddh 뿐만 아니라 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 (dapB), 아스파테이트 키나아제 (lysC) 및 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제(lysA)를 과발현시켰다. 이 효소들은 모두 라이신 생합성을 위한 공통 루트의 모든 부분이다. 따라서 라이신 생산에의 영향은 숙시닐라제와 디하이드로게나제 브랜치 사이를 분할하는 플럭스와는 무관해야 한다. 근년에 이미 가치있다고 증명된 몇가지 유전자 변형의 수행에 의해 추가적인 균주 최적화를 수행하였다. 이는 자연 호모세린 디하이드로게나제의 아미노산 교환 V59A를 보이는 돌연변이 변이체로의 치환을 포함하였다. 이 돌연변이는 직접적으로 라이신 생합성과 경쟁하는 트레오닌 경로로의 탄소 플럭스를 줄여서 라이신 생산을 증진시킨다 (Ohnishi, et al., 2002). 라이신 형성을 위한 옥살로아세테이트의 충분한 공급을 보장하기 위하여, 추가 변형은 전구체 공급에 집중하였다. 이는 주요 보충 효소 피루베이트 카르복실라제의 과발현 및 변형(Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001) 및 OAA 소비 반응 PEP 카르복시키나아제의 결실(Petersen, et al., 2001)을 시사하였다. 그 결과 생성된 균주 C. 글루타미쿰 BS87은 라이신 생합성 및 전구체 공급 내에서 9개의 변형을 포함하였다 (도 32).
lysC 유전자및 ddh 유전자의 제 2카피에서의 조절 기능의 점돌연변이 만을 나타내는 조상 균주 C. 글루타미쿰 BS222와 비교하면, C. 글루타미쿰 BS87에서의 추가적인 변형은 라이신 생산에 오직 경미한 증진만을 가져온다는 것이 확실해진다 (도 18). 따라서 대사의 특정 부분에만 초점을 맞춘 변형 전략은 효율적인 생산균주를 생산하는 데에 적합하지 않다. 그러나, 대사 변형에 의한 증진된 라이신 생산을 위한 균주 최적화의 역사는 이 전략에 의해 확실히 특징지어진다. 최적화된 라이신 생산원의 개념에서 주요 반응으로서의 주요 경로 TCA 회로 및 NADPH 대사는 지금까지 거의 무시되었다. 이 점에서, 본 발명은 이러한 한계를 극복하고 이전의 전략을 완벽하게 보완하여 우월한 생산균주를 구축하는 유전자 목표를 드러냈다. 따라서 의도된 고생산원 생산을 위한 다음 단계는 TCA 회로에 초점을 맞추었다. 상술하였듯이, C. 글루타미쿰 BS87의 백그라운드에서의 이소시트레이트 디하이드로게나제 (icd att )의 감쇠는 TCA 회로로부터 보충 카르복시화로의 효율적 플럭스 전환에 의해 라이신 생산을 크게 증진시켰다. 라이신 생산에 관하여 이 변형 전략은 CO2 형성을 통한 탄소손실의 감소 뿐만 아니라, 옥살로아세테이트의 공급 증가에 의해 이익을 받는다. NADPH 대사의 차후의 변형은 두가지 다른 전략에 의해 수행되었다. 처음에, 이전에 증진된 NADPH 공급에 크게 기여하는 것으로 나타났던 (Becker, et al., 2005) 글루코오스신생합성 효소 프럭토스 1,6-비스포스파타아제를 과발현시켰다. 상술하였듯이, 이 접근은 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제의 증폭된 발현을 잘 보완한다. 처음부터 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 제한된 용량에 의해 PPP에서의 추가 제한을 피하기 위하여, 상술하였듯이 sod 프로모터를 통한 완전한 tkt-오페론의 상향조절에 의한 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 과발현을 수반하여, G6PDH의 과발현을 실현하였다. 프로모터 교환에 응하여, G6PDH, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제의 비활성은 크게 증가하였다. 변형 전략의 개념은 도 32에 도시되어 있다. 상기 변형의 이점은 수득된 계보의 탄소전환율의 비교로부터 확실해진다 (도 18).
야생형 C. 글루타미쿰 ATCC 13032로 시작하여, 차후의 유익한 변형의 수행은 야생형 기반 라이신 고생산원을 야기하였다. 본 발명은 모든 관련 경로가 고려된 이러한 완전히 합리적인 균주의 첫번째 보고이다. 이 주요 조절효소의 피드백 저해를 극복하기 위하여, 아스파테이트 키나아제 내에 최초로 도입된 변형이 매우 중요하였다. ddh 과발현의 결과, 거의 50%의 증진이라는 큰 이득은 C. 글루타미쿰 BS1 (lysC T311I)의 유전자 백그라운드에서 라이신 생합성 경로의 전체 성능이 라이신 생산을 크게 제한하였다는 것을 확실히 보여주었다. 그러나, 이전의 연구에서 이로운 것으로 나타났던 라이신 경로의 추가 변형 뿐만 아니라, 전구체 공급의 변형은 (Ohnishi, et al., 2002; Peters-Wendisch, et al., 2001; Petersen, et al., 2001) 여기서는 겨우 중간 정도의 성공이었다. 이는 라이신 생산을 손상시키는 C. 글루타미쿰의 중추대사 내에서 다른 병목현상이 일어났다는 것을 분명하게 나타낸다. 따라서, 본 연구에서 라이신 생산의 추가 변형에 대한 관심은 중간 대사의 다른 부분으로 옮겨갔다. 이 개념은 성공은 이소시트레이트 디하이드로게나제 (icd att)의 감쇠에 대한 반응에 의해 즉시 반영되었다. icd의 개시코돈에서의 단일 뉴클레오티드 교환의 구현은 라이신 수율을 C. 글루타미쿰 BS87에서 141 mmol mol-1 에서 상응 icd 돌연변이체에서 200 mmol mol-1 까지 증가시켰는데, 이는 40%의 증가이다. 이전의 연구에서 NADPH 공급 PPP로의 효율적 플럭스 전환을 야기하는 것으로 보여진 (Becker, et al., 2005) 프럭토스 1,6-비스포스파타아제의 차후의 과발현은 라이신 생산을 18% 더 증진시켰다 (도 18). 여기서 설명된 계보에서 마지막으로 도입된 변형은 tkt-오페론의 프로모터 교환을 포함하였다. 이는 이 오페론에 의해 코딩된 효소 G6PDH, TKT 및 TAL의 활성을 크게 증가시켰고 이는 결과적으로 라이신 수율을 13% 증가시켰다. fbp 및 tkt-오페론의 과발현의 이득은 NADPH의 불충분한 공급은 C. 글루타미쿰에서의 라이신 생산을 크게 제한하며, 증가된 PPP 플럭스에 목표를 둔 변형 전략이 효율적 라이신 고생산균주를 생산하는 목표와 함께 중요하다는 것을 확실하게 보여준다. 펜토스 포스페이트 경로 유전자의 증폭된 발현의 추가적 이점은 생장 거동 관련하여 관찰되었다. 비생장률 0.23 h-1를 보이는 그것의 조상 C. 글루타미쿰 BS242 (Peftu fbp)와 비교하면 tkt-돌연변이체는 0.32 h-1의 속도로 생장하였다. C. 글루타미쿰 BS244의 증진된 생장 거동과 결합하여 보다 높은 탄소 전환률(YLys/S = 26 %)은 짧은 발효 시간에 효율적 라이신 생산을 가능하게 하므로 이 균주의 전체 생산능력을 증가시켰다. 마지막 세 변형의 구현에 의해, 전체 라이신 생산이 거의 90% 증가하였다. 이는 오직 세 유전적 변화로부터 야기되는 주목할 만한 놀라운 이득이다. 따라서 이 변형 전략들이 이전에 수행된 돌연변이, 예를 들어 라이신 생합성 내의 병목현상의 제거로부터 부분적으로 이득을 받는다는 것이 가정될 수 있다.
조사된 균주의 생산 특성은 이제까지 최소배지에서 기하급수적으로 생장하는 세포를 위한 쉐이크 플라스크 배양에서 테스트되었다. 낮은 기질농도에서의 최소배지에서의 쉐이크 플라스크 배양을 포함하는 실험 설정이 생산성을 분명히 제한하였음에도 불구하고, 이 조건들 하에서 가장 좋은 생산원 C. 글루타미쿰 BS244 는 이미 26%의 주목할 만한 라이신 수율을 보였다. 산업적으로 적절한 생산배지에서의 유가 발효 과정에서 라이신 고생산원의 생산성을 조사하는 방법이 산업적 생산에 가장 가깝기 때문에 이 방법이 적절하였다. 게다가, 그것은 특히 종래의 방법으로 유도된 생산균주와 비교하여 새로운 고생산원의 잠재력이 보다 현실적인 평가를 가능하게 한다. 가장 좋은 생산원 C. 글루타미쿰 BS244 (Psod tkt)를 당밀 기반 복합배지에서의 유가 발효를 포함하는 산업적 조건 하에서 조사하였다.
산업적 발효 조건 하에서의 생산성
C. 글루타미쿰 BS244의 유가 발효의 배양 프로필이 도 19에 도시되어 있다. 라이신 생산을 일찍 시작하였고 배지 상등액에서의 라이신 농도는 30시간 내에 놀라울 정도로 높은 최종 역가인 120g L-1까지 연속적으로 증가하였다. 주요 증가는 배치 배지 (100g L-1)에 공급된 초기 당이 소비된 후 시작된 공급 단계에서 주로 이루어졌다. 자동 공급의 신호로서, 용해된 산소(pO2) 기반 신호를 공정 내내 사용하였다. 발효기에서의 산소 포화도는 교반기 속도를 통해 제어되었고, 20%로 일정하게 유지되었다. 배지에서의 탄소 제한은 pO2 증가가 10% min-1을 초과하였을 때 공급 펌프를 활성화한 pO2의 즉각적이고 빠른 증가를 야기하였다. 당밀 및 글루코스 기반의 공급 용액은 라이신 생산을 위한 충분한 암모늄 공급을 보장하기 위하여 황산암모늄으로 추가적으로 강화하였다. 이 전략으로 공급 단계에서의 당 농도는 10g L-1 아래로 유지되었다.
흡광도에 의해 반영된 바이오매스 농도의 생육 곡선은 라이신 농도와 분명히 달랐다 (도 34). 배치 단계 중에, 흡광도는 5배 증가하였는데, 공급 단계에는 겨우 세 배의 증가가 관찰되었다. 뿐만 아니라, 바이오매스 농도는 배양 기간 끝까지 증가하지 않았는데, 24시간 후에 최대치에 도달하였다.
균주 C. 글루타미쿰 BS244의 생산 특성에 대한 보다 정밀한 관찰은 발효 공정이 더 나뉠 수 있다는 것을 보여주었다. 도 35에서 도시하고 있듯이, 다른 단계는 달성된 라이신 수율을 기초로 구별될 수 있다. 여기에서 공급 단계 2로 지정된 가장 좋은 생산 단계에서, 라이신 고생산원은 라이신 수율 55%를 보였다. 이 단계의 추가적 특성은 거의 침체되는 바이오매스 농도이다. 따라서 소비된 당은 라이신 생합성 경로로 효율적으로 보내진다. 발효 단계의 처음에, 라이신 수율은 더 낮았다. 배치 단계 및 공급 단계 1을 포함하는 이 간격은 광범위한 바이오매스 형성으로 특징지어지는 주요 생장 단계라고 설명될 수 있다 (도 34). 흥미롭게도, 이 단계에서 대수증식기에서의 쉐이크 플라스크 배양 실험에서 달성된 라이신 수율과 매우 잘 부합되는 25%의 라이신 수율이 달성되었다.
이 연구에서 생산된 라이신 고생산원은 이제까지 개시된 가장 좋은 야생형 기반 생산균주이다. 탄소 및 공간-시간 수율 뿐만 아니라 최종 라이신 역가를 고려할 때 이전에 개시된 합리적으로 생산된 균주(Ikeda, et al., 2006)보다 확실히 우월하다. 최종 라이신 역가 120 g L-1 및 55%까지의 탄소 전환률과 함께 이 균주는 보고된 탄소 수율 40-50% (Leuchtenberger, et al., 2005) 및 라이신 역가 80-120 g L-1 (Anastassiadis, 2007)인 종래의 방법으로 유도된 균주의 최대치에 위치하는 생산 특성을 보인다. 그러나 종래의 생산원의 이 생산성은 시간-공간 수율을 크게 손상시키는 100시간까지의 긴 발효 시간(Anastassiadis, 2007)과 전형적으로 관련이 있다. 이는 일반적으로 비특이 돌연변이생성 때문에 균주 개발 동안 축적된 많은 해로운 이차적 돌연변이에 의해 야기된 약한 생장과 관련이 있다. 오직 12개의 이로운 변형의 독점적 세트의 단일 수행에 의해, 이러한 원치않는 부작용은 야생형 기반 생산균주에서 방지될 수 있다. 빠른 생장 및 그에 따른 30 시간이라는 줄어든 발효 시간은 종래의 생산원에 의한 유가 발효 동안 달성된 2.1 g L-1h-1의 시간 공간 수율(Hirao, et al., 1989) 보다 훨씬 높은 4 g L-1 h-1 의 높은 시간-공간 수율을 야기한다.
본 발명의 야생형 기반 라이신 고생산원은 균주 최적화의 방법으로서 시스템 대사 변형의 잠재력을 보여준다. 균주 C. 글루타미쿰 BS244는 산업적 적용에 매우 적합한 완전한 합리적 생산균주의 개념 및 가치의 우수한 증거이다.
<용어 정의>
약어
2-OXO: 2-옥소글루타레이트
AA: 아미노산
Ac-CoA: 아세틸-코엔자임 A
Ace: 아세테이트
aceE: 하나의 피루베이트 디하이드로게나제 복합체 서브유닛을 코딩하는 유전자
ADP: 아데노신 디포스페이트
amtR: 전체적 질소 레귤레이터를 코딩하는 유전자
amyA: α-아밀라아제를 코딩하는 유전자
ara: 아라비노스 이용을 위한 유전자군
asd: 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자
argS: 아르기닐-tRNA-신타아제를 코딩하는 유전자
ATCC: American type culture collection
ATP: 아데노신 트리포스페이트
BamHI: Bacillus amyloli로부터의 제한효소
bp: 염기쌍
BSA: 소혈청 알부민
BSTFA: N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오르-아세트아미드
CDM: 세포 건량
CIT: 시트레이트
CoA: 코엔자임 A
CWW: 세포 습윤 중량
dapA: 디하이드로디피콜리네이트 신타아제를 코딩하는 유전자
dapB: 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자
dapC: 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제를 코딩하는 유전자
dapD: 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제를 코딩하는 유전자
dapE: 숙시닐-디아미노피멜레이트 디숙시닐라제를 코딩하는 유전자
dapF: 디아미노피멜레이트 에피머라제를 코딩하는 유전자
ddh: 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자
DDH: 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제
DHA: 디하이드록시아세톤
DHAP: 디하이드록시아세톤 포스페이트
DMSO: 디메틸술폭시드
DNase: 디옥시리보뉴클레아제
DTT: 디티오트레이톨
E4P: 에리트로오스 4-포스페이트
eftu: 연장인자 tu를 코딩하는 유전자
F1P: 프럭토스 1-포스페이트
F6P: 프럭토스 6-포스페이트
FBP: 프럭토스 1,6-비스포스페이트
fbp: 프럭토스 1,6-비스포스파타아제를 코딩하는 유전자
FBPase: 프럭토스 1,6-비스포스파타아제
fbr: 피드백 내성
Fru: 프럭토스
G6P: 글루코스 6-포스페이트
G6PDH: 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제
GAP: 글리세르알데히드 3-포스페이트
GC-MS: 기체 크로마토그래피/ 질량 분석법
GDH: 글리세로포스페이트 디하이드로게나제
Glu: 글루코스
gltA: 시트레이트 신타아제를 코딩하는 유전자
Gly:글리세롤
GRAS: 일반적으로 안전하다고 여겨지는
hom: 호모세린 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
icd: 이소시트레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자 ICD: 이소시트레이트 디하이드로게나제
Kan: 카나마이신
Lac: 젖산
LDH: 젖산 디하이드로게나제
Lys: 라이신
lysA: 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제를 코딩하는 유전자 lysC: 아스파테이트 키나아제(aspartokinase)를 코딩하는 유전자
lysE: 라이신 퍼미아제를 코딩하는 유전자
malE: 말산효소를 코딩하는 유전자
MalE: 말산 효소
MBDSTFA : N-메틸-N-테르트-부틸디메틸실릴-트리플루오르-아세트아미드
MCS: 멀티플 클로닝 사이트
MDV: 매스 분포 벡터
MDH: 세포질 말산 디하이드로게나제
MFA: 대사 플럭스 분석
MQO: 막결합성 말산 디하이드로게나제
NAD/NADH: 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 산화/환원
NADP/NADPH: 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 산화/환원
OAA: 옥살로아세테이트
OD: 흡광도
ODHC: 2-옥소글루타레이트 디하이드로게나제 복합체
OPA: 오쏘-프탈디알데히드
opcA: G6PDH의 추정 서브유닛을 코딩하는 유전자
ORF: 오픈 리딩 프레임
ORI: 복제개시점
PC: 피루베이트 카르복실라제
pyc: 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자
pck: PEP 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자 PCR: 중합효소 연쇄 반응
PDH: 피루베이트 디하이드로게나제 복합체
PEP: 포스포에놀피루베이트
PEPC:포스포에놀피루베이트 카르복실라제
PEPCK: 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제
pgi: 포스포글루코이소머라제를 코딩하는 유전자
PGI: 포스포글루코이소머라제
PPP: 펜토스 포스페이트 경로
PTS: 포스포트랜스퍼라제 시스템
Pwo: Pyrococcus woesei로부터의 DNA 폴리머라제
pyk: 피루베이트 키나아제를 코딩하는 유전자 Pyr: 피루베이트
R5P: 리보오스 5-포스페이트
RNase: 리보뉴클레아제
RPE: 리불로스 5-포스페이트 에피머라제
RPI: 리보오스 5-포스페이트 이소머라제
RQ: 호흡률
S7P: 세도헵툴로오스 7-포스페이트
sacB: Bacillus subtilis의 레반수크라제를 코딩하는 유전자
SAP: 쉬림프 알칼리 포스파타아제 (Shrimp alkaline phosphatase)
sod: 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 코딩하는 유전자
Suc: 슈크로스
SUC: 숙시네이트
tal: 트랜스알돌라제를 코딩하는 유전자
TAL: 트랜스알돌라제
Taq: Thermus aquaticus로부터의 DNA 폴리머라제
TCA cycle: 트리카르복실산 회로
Tet: 테트라사이클린
tkt: 트랜스알돌라제/트랜스알돌라제 오페론을 코딩하는 유전자
TKT: 트랜스케톨라제
TPI: 트리오세포스페이트 이소머라제
TPP: 티아민 피로포스페이트
SLS: 최소제곱의 합
Tre: 트레할로오스
rpm: 분 당 회전
XhoI: Xanthomonas holcicola로부터의 제한효소
xyl: 자일로스 사용을 위한 유전자군
기호
C : 능력 [F]
c : 농도 [mol L-1] 또는 [gL-1]
m: 질량 [g]
μ: 비생장률 [h-1]
n: 물질의 양 [mol]
qs: 비흡수율 [mmol g-1 h-1]
qp: 비생산률 [mmol g-1 h-1]
R: 내성 [Ω]
T : 온도 [℃]
t : 시간 [h]
U : 유닛 [μmol min-1]
ν: 플럭스 [%]
λ: 파장 [nm]
YP/S : 산물 수율 [mol mol-1]
YX/S : 바이오매스 수율 [g mol-1]
<참고자료>
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<110> Paik Kwang Industrial Co., Ltd. <120> PRODUCTION PROCESS FOR AMINO ACIDS OF THE ASPARTATE FAMILY USING MICROORGANISMS <130> 10K1032KR <160> 96 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1466 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (201)..(1463) <223> lysC, DNA sequence encoding C. glutamicum aspartate kinase with natural promoter <400> 1 gtcacttttg tctcaaatat taaatcgaat atcaatatat ggtctgttta ttggaacgcg 60 tcccagtggc tgagacgcat ccgctaaagc cccaggaacc ctgtgcagaa agaaaacact 120 cctctggcta ggtagacaca gtttataaag gtagagttga gcgggtaact gtcagcacgt 180 agatcgaaag gtgcacaaag gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc 233 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser 1 5 10 tcg ctt gag agt gcg gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt 281 Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val 15 20 25 gcc acc aag aag gct gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg 329 Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met 30 35 40 gga gac acc acg gat gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc 377 Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro 45 50 55 gtt ccg cca gct cgt gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt 425 Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg 60 65 70 75 att tct aac gct ctc gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa 473 Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu 80 85 90 gcc caa tct ttc acg ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc 521 Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg 95 100 105 cac gga aac gca cgc att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa 569 His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu 110 115 120 gca ctc gat gag ggc aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt 617 Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val 125 130 135 aat aaa gaa acc cgc gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac 665 Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp 140 145 150 155 acc act gca gtt gcg 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365 370 375 acc tct gag att cgt att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat 1385 Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp 380 385 390 395 gct gct gca cgt gca ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac 1433 Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp 400 405 410 gaa gcc gtc gtt tat gca ggc acc gga cgc taa 1466 Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 415 420 <210> 2 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(421) <223> LysC, amino acid sequence of C. glutamicum aspartate kinase <400> 2 Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 3 <211> 1458 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (193)..(1455) <223> lysCT311I, DNA sequence encoding C. glutamicum aspartate kinase with T311I-substitution, sod-promoter and start codon exchange GTG -> ATG <400> 3 tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60 ttcgttgcaa tataaacaaa aaggcctctc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120 gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180 gattttttac cc atg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc 225 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser 1 5 10 tcg ctt gag agt gcg gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt 273 Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val 15 20 25 gcc acc aag aag gct gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg 321 Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met 30 35 40 gga gac acc acg gat gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc 369 Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro 45 50 55 gtt ccg cca gct cgt gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt 417 Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg 60 65 70 75 att tct aac gct ctc gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa 465 Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu 80 85 90 gcc caa tct ttc acg ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc 513 Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg 95 100 105 cac gga aac gca cgc att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa 561 His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu 110 115 120 gca ctc gat gag ggc aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt 609 Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val 125 130 135 aat aaa gaa acc cgc gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac 657 Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp 140 145 150 155 acc act gca gtt gcg ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag 705 Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu 160 165 170 att tac tcg gac gtt gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt 753 Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val 175 180 185 cct aat gca cag aag ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa 801 Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu 190 195 200 ctt gct gct gtt ggc tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac 849 Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr 205 210 215 gct cgt gca ttc aat gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat 897 Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn 220 225 230 235 gat ccc ggc act ttg att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa 945 Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu 240 245 250 gaa gca gtc ctt acc ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta 993 Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val 255 260 265 acc gtt ctg ggt att tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc 1041 Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe 270 275 280 cgt gcg ttg gct gat gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac 1089 Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn 285 290 295 gtc tct tct gta gaa gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct 1137 Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro 300 305 310 315 cgt tcc gac ggc cgc cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt 1185 Arg Ser Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val 320 325 330 cag ggc aac tgg acc aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc 1233 Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val 335 340 345 tcc ctc gtg ggt gct ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag 1281 Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu 350 355 360 ttc atg gaa gct ctg cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc 1329 Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser 365 370 375 acc tct gag att cgt att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat 1377 Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp 380 385 390 395 gct gct gca cgt gca ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac 1425 Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp 400 405 410 gaa gcc gtc gtt tat gca ggc acc gga cgc taa 1458 Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 415 420 <210> 4 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(421) <223> LysCT311I amino acid sequence of C. glutamicum aspartate kinase with T311I-substitution <400> 4 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 5 <211> 1193 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (231)..(1190) <223> ddh, DNA sequence encoding C. glutamicum diaminopimelate dehydrogenase with natural promoter <400> 5 aacggcaacg gatcaaaagt cctgttggtg aagctgcgcc ccacagatcc tgactgctgg 60 gagccatgaa aatagatcag cgcatccgtg gtggaaccaa aaggctcaac aatacgaaac 120 gttcgctttc ggtcctgatg aaagagatgt ccctgaatca tcatctaagt atgcatctcg 180 gtaagctcga ccaggacagt gccaccacaa ttttggagga ttacaagaac atg acc aac 239 Met Thr Asn 1 atc cgc gta gct atc gtg ggc tac gga aac ctg gga cgc agc gtc gaa 287 Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg Ser Val Glu 5 10 15 aag ctt att gcc aag cag ccc gac atg gac ctt gta gga atc ttc tcg 335 Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly Ile Phe Ser 20 25 30 35 cgc cgg gcc acc ctc gac aca aag acg cca gtc ttt gat gtc gcc gac 383 Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp Val Ala Asp 40 45 50 gtg gac aag cac gcc gac gac gtg gac gtg ctg ttc ctg tgc atg ggc 431 Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu Cys Met Gly 55 60 65 tcc gcc acc gac atc cct gag cag gca cca aag ttc gcg cag ttc gcc 479 Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala Gln Phe Ala 70 75 80 tgc acc gta gac acc tac gac aac cac cgc gac atc cca cgc cac cgc 527 Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro Arg His Arg 85 90 95 cag gtc atg aac gaa gcc gcc acc gca gcc ggc aac gtt gca ctg gtc 575 Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val Ala Leu Val 100 105 110 115 tct acc ggc tgg gat cca gga atg ttc tcc atc aac cgc gtc tac gca 623 Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg Val Tyr Ala 120 125 130 gcg gca gtc tta gcc gag cac cag cag cac acc ttc tgg ggc cca ggt 671 Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp Gly Pro Gly 135 140 145 ttg tca cag ggc cac tcc gat gct ttg cga cgc atc cct ggc gtt caa 719 Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro Gly Val Gln 150 155 160 aag gca gtc cag tac acc ctc cca tcc gaa gac gcc ctg gaa aag gcc 767 Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu Glu Lys Ala 165 170 175 cgc cgc ggc gaa gcc ggc gac ctt acc gga aag caa acc cac aag cgc 815 Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr His Lys Arg 180 185 190 195 caa tgc ttc gtg gtt gcc gac gcg gcc gat cac gag cgc atc gaa aac 863 Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg Ile Glu Asn 200 205 210 gac atc cgc acc atg cct gat tac ttc gtt ggc tac gaa gtc gaa gtc 911 Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu Val Glu Val 215 220 225 aac ttc atc gac gaa gca acc ttc gac tcc gag cac acc ggc atg cca 959 Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr Gly Met Pro 230 235 240 cac ggt ggc cac gtg att acc acc ggc gac acc ggt ggc ttc aac cac 1007 His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly Phe Asn His 245 250 255 acc gtg gaa tac atc ctc aag ctg gac cga aac cca gat ttc acc gct 1055 Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp Phe Thr Ala 260 265 270 275 tcc tca cag atc gct ttc ggt cgc gca gct cac cgc atg aag cag cag 1103 Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met Lys Gln Gln 280 285 290 ggc caa agc gga gct ttc acc gtc ctc gaa gtt gct cca tac ctg ctc 1151 Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro Tyr Leu Leu 295 300 305 tcc cca gag aac ttg gac gat ctg atc gca cgc gac gtc taa 1193 Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 310 315 320 <210> 6 <211> 320 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(320) <223> Ddh, amino acid sequence of C. glutamicum diaminopimelate dehydrogenase <400> 6 Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg 1 5 10 15 Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly 20 25 30 Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp 35 40 45 Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu 50 55 60 Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala 65 70 75 80 Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro 85 90 95 Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val 100 105 110 Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg 115 120 125 Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp 130 135 140 Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro 145 150 155 160 Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu 165 170 175 Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr 180 185 190 His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg 195 200 205 Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu 210 215 220 Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr 225 230 235 240 Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly 245 250 255 Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp 260 265 270 Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met 275 280 285 Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro 290 295 300 Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 305 310 315 320 <210> 7 <211> 2554 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (231)..(1190) <223> ddh DNA, two copies encoding C. glutamicum diaminopimelate dehydrogenase including flanking regions <400> 7 aacggcaacg gatcaaaagt cctgttggtg aagctgcgcc ccacagatcc tgactgctgg 60 gagccatgaa aatagatcag cgcatccgtg gtggaaccaa aaggctcaac aatacgaaac 120 gttcgctttc ggtcctgatg aaagagatgt ccctgaatca tcatctaagt atgcatctcg 180 gtaagctcga ccaggacagt gccaccacaa ttttggagga ttacaagaac atg acc aac 239 Met Thr Asn 1 atc cgc gta gct atc gtg ggc tac gga aac ctg gga cgc agc gtc gaa 287 Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg Ser Val Glu 5 10 15 aag ctt att gcc aag cag ccc gac atg gac ctt gta gga atc ttc tcg 335 Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly Ile Phe Ser 20 25 30 35 cgc cgg gcc acc ctc gac aca aag acg cca gtc ttt gat gtc gcc gac 383 Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp Val Ala Asp 40 45 50 gtg gac aag cac gcc gac gac gtg gac gtg ctg ttc ctg tgc atg ggc 431 Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu Cys Met Gly 55 60 65 tcc gcc acc gac atc cct gag cag gca cca aag ttc gcg cag ttc gcc 479 Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala Gln Phe Ala 70 75 80 tgc acc gta gac acc tac gac aac cac cgc gac atc cca cgc cac cgc 527 Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro Arg His Arg 85 90 95 cag gtc atg aac gaa gcc gcc acc gca gcc ggc aac gtt gca ctg gtc 575 Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val Ala Leu Val 100 105 110 115 tct acc ggc tgg gat cca gga atg ttc tcc atc aac cgc gtc tac gca 623 Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg Val Tyr Ala 120 125 130 gcg gca gtc tta gcc gag cac cag cag cac acc ttc tgg ggc cca ggt 671 Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp Gly Pro Gly 135 140 145 ttg tca cag ggc cac tcc gat gct ttg cga cgc atc cct ggc gtt caa 719 Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro Gly Val Gln 150 155 160 aag gca gtc cag tac acc ctc cca tcc gaa gac gcc ctg gaa aag gcc 767 Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu Glu Lys Ala 165 170 175 cgc cgc ggc gaa gcc ggc gac ctt acc gga aag caa acc cac aag cgc 815 Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr His Lys Arg 180 185 190 195 caa tgc ttc gtg gtt gcc gac gcg gcc gat cac gag cgc atc gaa aac 863 Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg Ile Glu Asn 200 205 210 gac atc cgc acc atg cct gat tac ttc gtt ggc tac gaa gtc gaa gtc 911 Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu Val Glu Val 215 220 225 aac ttc atc gac gaa gca acc ttc gac tcc gag cac acc ggc atg cca 959 Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr Gly Met Pro 230 235 240 cac ggt ggc cac gtg att acc acc ggc gac acc ggt ggc ttc aac cac 1007 His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly Phe Asn His 245 250 255 acc gtg gaa tac atc ctc aag ctg gac cga aac cca gat ttc acc gct 1055 Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp Phe Thr Ala 260 265 270 275 tcc tca cag atc gct ttc ggt cgc gca gct cac cgc atg aag cag cag 1103 Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met Lys Gln Gln 280 285 290 ggc caa agc gga gct ttc acc gtc ctc gaa gtt gct cca tac ctg ctc 1151 Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro Tyr Leu Leu 295 300 305 tcc cca gag aac ttg gac gat ctg atc gca cgc gac gtc taatttagct 1200 Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val 310 315 320 cgaggggcaa ggaaacagtg tggtttcctt gcctctttta gccttttcag agggtgtctt 1260 cgctggacca agaggaaaac ggcaacggat caaaagtcct gttggtgaag ctgcgcccca 1320 cagatcctga ctgctgggag ccatgaaaat agatcagcgc atccgtggtg gaaccaaaag 1380 gctcaacaat acgaaacgtt cgctttcggt cctgatgaaa gagatgtccc tgaatcatca 1440 tctaagtatg catctcggta agctcgacca ggacagtgcc accacaattt tggaggatta 1500 caagaacatg accaacatcc gcgtagctat cgtgggctac ggaaacctgg gacgcagcgt 1560 cgaaaagctt attgccaagc agcccgacat ggaccttgta ggaatcttct cgcgccgggc 1620 caccctcgac acaaagacgc cagtctttga tgtcgccgac gtggacaagc acgccgacga 1680 cgtggacgtg ctgttcctgt gcatgggctc cgccaccgac atccctgagc aggcaccaaa 1740 gttcgcgcag ttcgcctgca ccgtagacac ctacgacaac caccgcgaca tcccacgcca 1800 ccgccaggtc atgaacgaag ccgccaccgc agccggcaac gttgcactgg tctctaccgg 1860 ctgggatcca ggaatgttct ccatcaaccg cgtctacgca gcggcagtct tagccgagca 1920 ccagcagcac accttctggg gcccaggttt gtcacagggc cactccgatg ctttgcgacg 1980 catccctggc gttcaaaagg cagtccagta caccctccca tccgaagacg ccctggaaaa 2040 ggcccgccgc ggcgaagccg gcgaccttac cggaaagcaa acccacaagc gccaatgctt 2100 cgtggttgcc gacgcggccg atcacgagcg catcgaaaac gacatccgca ccatgcctga 2160 ttacttcgtt ggctacgaag tcgaagtcaa cttcatcgac gaagcaacct tcgactccga 2220 gcacaccggc atgccacacg gtggccacgt gattaccacc ggcgacaccg gtggcttcaa 2280 ccacaccgtg gaatacatcc tcaagctgga ccgaaaccca gatttcaccg cttcctcaca 2340 gatcgctttc ggtcgcgcag ctcaccgcat gaagcagcag ggccaaagcg gagctttcac 2400 cgtcctcgaa gttgctccat acctgctctc cccagagaac ttggacgatc tgatcgcacg 2460 cgacgtctaa tttagctcga ggggcaagga aacagtgtgg tttccttgcc tcttttagcc 2520 ttttcagagg gtgtcttcgc tggaccaaga ggaa 2554 <210> 8 <211> 1833 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1830) <223> pck, DNA sequence encoding wildtype C. glutamicum PEP-carboxykinase <400> 8 atg act act gct gca atc agg ggc ctt cag ggc gag gcg ccg acc aag 48 Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 1 5 10 15 aat aag gaa ctg ctg aac tgg atc gca gac gcc gtc gag ctc ttc cag 96 Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 20 25 30 cct gag gct gtt gtg ttc gtt gat gga tcc cag gct gag tgg gat cgc 144 Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 35 40 45 atg gcg gag gat ctt gtt gaa gcc ggt acc ctc atc aag ctc aac gag 192 Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu 50 55 60 gaa aag cgt ccg aac agc tac cta gct cgt tcc aac cca tct gac gtt 240 Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 65 70 75 80 gcg cgc gtt gag tcc cgc acc ttc atc tgc tcc gag aag gaa gaa gat 288 Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 85 90 95 gct ggc cca acc aac aac tgg gct cca cca cag gca atg aag gac gaa 336 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 100 105 110 atg tcc aag cat tac gct ggt tcc atg aag ggg cgc acc atg tac gtc 384 Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val 115 120 125 gtg cct ttc tgc atg ggt cca atc agc gat ccg gac cct aag ctt ggt 432 Val Pro Phe Cys Met Gly Pro Ile Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly 130 135 140 gtg cag ctc act gac tcc gag tac gtt gtc atg tcc atg cgc atc atg 480 Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg Ile Met 145 150 155 160 acc cgc atg ggt att gaa gcg ctg gac aag atc ggc gcg aac ggc agc 528 Thr Arg Met Gly Ile Glu Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ala Asn Gly Ser 165 170 175 ttc gtc agg tgc ctc cac tcc gtt ggt gct cct ttg gag cca ggc cag 576 Phe Val Arg Cys Leu His Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln 180 185 190 gaa gac gtt gca tgg cct tgc aac gac acc aag tac atc acc cag ttc 624 Glu Asp Val Ala Trp Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr Ile Thr Gln Phe 195 200 205 cca gag acc aag gaa att tgg tcc tac ggt tcc ggc tac ggc gga aac 672 Pro Glu Thr Lys Glu Ile Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn 210 215 220 gca atc ctg gca aag aag tgc tac gca ctg cgt atc gca tct gtc atg 720 Ala Ile Leu Ala Lys Lys Cys Tyr Ala Leu Arg Ile Ala Ser Val Met 225 230 235 240 gct cgc gaa gaa gga tgg atg gct gag cac atg ctc atc ctg aag ctg 768 Ala Arg Glu Glu Gly Trp Met Ala Glu His Met Leu Ile Leu Lys Leu 245 250 255 atc aac cca gag ggc aag gcg tac cac atc gca gca gca ttc cca tct 816 Ile Asn Pro Glu Gly Lys Ala Tyr His Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ser 260 265 270 gct tgt ggc aag acc aac ctc gcc atg atc act cca acc atc cca ggc 864 Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ile Thr Pro Thr Ile Pro Gly 275 280 285 tgg acc gct cag gtt gtt ggc gac gac atc gct tgg ctg aag ctg cgc 912 Trp Thr Ala Gln Val Val Gly Asp Asp Ile Ala Trp Leu Lys Leu Arg 290 295 300 gag gac ggc ctc tac gca gtt aac cca gaa aat ggt ttc ttc ggt gtt 960 Glu Asp Gly Leu Tyr Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val 305 310 315 320 gct cca ggc acc aac tac gca tcc aac cca atc gcg atg aag acc atg 1008 Ala Pro Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Asn Pro Ile Ala Met Lys Thr Met 325 330 335 gaa cca ggc aac acc ctg ttc acc aac gtg gca ctc acc gac gac ggc 1056 Glu Pro Gly Asn Thr Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly 340 345 350 gac atc tgg tgg gaa ggc atg gac ggc gac gcc cca gct cac ctc att 1104 Asp Ile Trp Trp Glu Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala His Leu Ile 355 360 365 gac tgg atg ggc aac gac tgg acc cca gag tcc gac gaa aac gct gct 1152 Asp Trp Met Gly Asn Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala 370 375 380 cac cct aac tcc cgt tac tgc gta gca atc gac cag tcc cca gca gca 1200 His Pro Asn Ser Arg Tyr Cys Val Ala Ile Asp Gln Ser Pro Ala Ala 385 390 395 400 gca cct gag ttc aac gac tgg gaa ggc gtc aag atc gac gca atc ctc 1248 Ala Pro Glu Phe Asn Asp Trp Glu Gly Val Lys Ile Asp Ala Ile Leu 405 410 415 ttc ggt gga cgt cgc gca gac acc gtc cca ctg gtt acc cag acc tac 1296 Phe Gly Gly Arg Arg Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr 420 425 430 gac tgg gag cac ggc acc atg gtt ggt gca ctg ctc gca tcc ggt cag 1344 Asp Trp Glu His Gly Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln 435 440 445 acc gca gct tcc gca gaa gca aag gtc ggc aca ctc cgc cac gac cca 1392 Thr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro 450 455 460 atg gca atg ctc cca ttc att ggc tac aac gct ggt gaa tac ctg cag 1440 Met Ala Met Leu Pro Phe Ile Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln 465 470 475 480 aac tgg att gac atg ggt aac aag ggt ggc gac aag atg cca tcc atc 1488 Asn Trp Ile Asp Met Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser Ile 485 490 495 ttc ctg gtc aac tgg ttc cgc cgt ggc gaa gat gga cgc ttc ctg tgg 1536 Phe Leu Val Asn Trp Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp 500 505 510 cct ggc ttc ggc gac aac tct cgc gtt ctg aag tgg gtc atc gac cgc 1584 Pro Gly Phe Gly Asp Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val Ile Asp Arg 515 520 525 atc gaa ggc cac gtt ggc gca gac gag acc gtt gtt gga cac acc gct 1632 Ile Glu Gly His Val Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala 530 535 540 aag gcc gaa gac ctc gac ctc gac ggc ctc gac acc cca att gag gat 1680 Lys Ala Glu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro Ile Glu Asp 545 550 555 560 gtc aag gaa gca ctg acc gct cct gca gag cag tgg gca aac gac gtt 1728 Val Lys Glu Ala Leu Thr Ala Pro Ala Glu Gln Trp Ala Asn Asp Val 565 570 575 gaa gac aac gcc gag tac ctc act ttc ctc gga cca cgt gtt cct gca 1776 Glu Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala 580 585 590 gag gtt cac agc cag ttc gat gct ctg aag gcc cgc att tca gca gct 1824 Glu Val His Ser Gln Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ala 595 600 605 cac gct taa 1833 His Ala 610 <210> 9 <211> 610 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(610) <223> Pck, amino acid sequence of C. glutamicum PEP-carboxykinase <400> 9 Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 1 5 10 15 Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 20 25 30 Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 35 40 45 Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 65 70 75 80 Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 100 105 110 Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val 115 120 125 Val Pro Phe Cys Met Gly Pro Ile Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly 130 135 140 Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg Ile Met 145 150 155 160 Thr Arg Met Gly Ile Glu Ala Leu Asp Lys Ile Gly Ala Asn Gly Ser 165 170 175 Phe Val Arg Cys Leu His Ser Val Gly Ala Pro Leu Glu Pro Gly Gln 180 185 190 Glu Asp Val Ala Trp Pro Cys Asn Asp Thr Lys Tyr Ile Thr Gln Phe 195 200 205 Pro Glu Thr Lys Glu Ile Trp Ser Tyr Gly Ser Gly Tyr Gly Gly Asn 210 215 220 Ala Ile Leu Ala Lys Lys Cys Tyr Ala Leu Arg Ile Ala Ser Val Met 225 230 235 240 Ala Arg Glu Glu Gly Trp Met Ala Glu His Met Leu Ile Leu Lys Leu 245 250 255 Ile Asn Pro Glu Gly Lys Ala Tyr His Ile Ala Ala Ala Phe Pro Ser 260 265 270 Ala Cys Gly Lys Thr Asn Leu Ala Met Ile Thr Pro Thr Ile Pro Gly 275 280 285 Trp Thr Ala Gln Val Val Gly Asp Asp Ile Ala Trp Leu Lys Leu Arg 290 295 300 Glu Asp Gly Leu Tyr Ala Val Asn Pro Glu Asn Gly Phe Phe Gly Val 305 310 315 320 Ala Pro Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Asn Pro Ile Ala Met Lys Thr Met 325 330 335 Glu Pro Gly Asn Thr Leu Phe Thr Asn Val Ala Leu Thr Asp Asp Gly 340 345 350 Asp Ile Trp Trp Glu Gly Met Asp Gly Asp Ala Pro Ala His Leu Ile 355 360 365 Asp Trp Met Gly Asn Asp Trp Thr Pro Glu Ser Asp Glu Asn Ala Ala 370 375 380 His Pro Asn Ser Arg Tyr Cys Val Ala Ile Asp Gln Ser Pro Ala Ala 385 390 395 400 Ala Pro Glu Phe Asn Asp Trp Glu Gly Val Lys Ile Asp Ala Ile Leu 405 410 415 Phe Gly Gly Arg Arg Ala Asp Thr Val Pro Leu Val Thr Gln Thr Tyr 420 425 430 Asp Trp Glu His Gly Thr Met Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Gly Gln 435 440 445 Thr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Lys Val Gly Thr Leu Arg His Asp Pro 450 455 460 Met Ala Met Leu Pro Phe Ile Gly Tyr Asn Ala Gly Glu Tyr Leu Gln 465 470 475 480 Asn Trp Ile Asp Met Gly Asn Lys Gly Gly Asp Lys Met Pro Ser Ile 485 490 495 Phe Leu Val Asn Trp Phe Arg Arg Gly Glu Asp Gly Arg Phe Leu Trp 500 505 510 Pro Gly Phe Gly Asp Asn Ser Arg Val Leu Lys Trp Val Ile Asp Arg 515 520 525 Ile Glu Gly His Val Gly Ala Asp Glu Thr Val Val Gly His Thr Ala 530 535 540 Lys Ala Glu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asp Thr Pro Ile Glu Asp 545 550 555 560 Val Lys Glu Ala Leu Thr Ala Pro Ala Glu Gln Trp Ala Asn Asp Val 565 570 575 Glu Asp Asn Ala Glu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Pro Arg Val Pro Ala 580 585 590 Glu Val His Ser Gln Phe Asp Ala Leu Lys Ala Arg Ile Ser Ala Ala 595 600 605 His Ala 610 <210> 10 <211> 927 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(927) <223> pck, DNA sequence encoding C. glutamicum PEP-carboxykinase with deletion of 927 bp, nucleotides 510 to 1436 of wildtype PEP-carboxykinase and artificially introduced nucleotides at positions 510 to 531 <400> 10 atgactactg ctgcaatcag gggccttcag ggcgaggcgc cgaccaagaa taaggaactg 60 ctgaactgga tcgcagacgc cgtcgagctc ttccagcctg aggctgttgt gttcgttgat 120 ggatcccagg ctgagtggga tcgcatggcg gaggatcttg ttgaagccgg taccctcatc 180 aagctcaacg aggaaaagcg tccgaacagc tacctagctc gttccaaccc atctgacgtt 240 gcgcgcgttg agtcccgcac cttcatctgc tccgagaagg aagaagatgc tggcccaacc 300 aacaactggg ctccaccaca ggcaatgaag gacgaaatgt ccaagcatta cgctggttcc 360 atgaaggggc gcaccatgta cgtcgtgcct ttctgcatgg gtccaatcag cgatccggac 420 cctaagcttg gtgtgcagct cactgactcc gagtacgttg tcatgtccat gcgcatcatg 480 acccgcatgg gtattgaagc gctggacaat gtttaagttt agtggatggg gcagaactgg 540 attgacatgg gtaacaaggg tggcgacaag atgccatcca tcttcctggt caactggttc 600 cgccgtggcg aagatggacg cttcctgtgg cctggcttcg gcgacaactc tcgcgttctg 660 aagtgggtca tcgaccgcat cgaaggccac gttggcgcag acgagaccgt tgttggacac 720 accgctaagg ccgaagacct cgacctcgac ggcctcgaca ccccaattga ggatgtcaag 780 gaagcactga ccgctcctgc agagcagtgg gcaaacgacg ttgaagacaa cgccgagtac 840 ctcactttcc tcggaccacg tgttcctgca gaggttcaca gccagttcga tgctctgaag 900 gcccgcattt cagcagctca cgcttaa 927 <210> 11 <211> 171 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(171) <223> Pck, amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 10 <400> 11 Met Thr Thr Ala Ala Ile Arg Gly Leu Gln Gly Glu Ala Pro Thr Lys 1 5 10 15 Asn Lys Glu Leu Leu Asn Trp Ile Ala Asp Ala Val Glu Leu Phe Gln 20 25 30 Pro Glu Ala Val Val Phe Val Asp Gly Ser Gln Ala Glu Trp Asp Arg 35 40 45 Met Ala Glu Asp Leu Val Glu Ala Gly Thr Leu Ile Lys Leu Asn Glu 50 55 60 Glu Lys Arg Pro Asn Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Asn Pro Ser Asp Val 65 70 75 80 Ala Arg Val Glu Ser Arg Thr Phe Ile Cys Ser Glu Lys Glu Glu Asp 85 90 95 Ala Gly Pro Thr Asn Asn Trp Ala Pro Pro Gln Ala Met Lys Asp Glu 100 105 110 Met Ser Lys His Tyr Ala Gly Ser Met Lys Gly Arg Thr Met Tyr Val 115 120 125 Val Pro Phe Cys Met Gly Pro Ile Ser Asp Pro Asp Pro Lys Leu Gly 130 135 140 Val Gln Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Val Val Met Ser Met Arg Ile Met 145 150 155 160 Thr Arg Met Gly Ile Glu Ala Leu Asp Asn Val 165 170 <210> 12 <211> 947 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (201)..(944) <223> dapB, DNA sequence encoding wildtype C. glutamicum dihydrodipicolinate reductase with natural promoter <400> 12 aagggcaact taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa 60 cggaacaaac tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga 120 tatcagcacc ttctgaacgg gtacgtctag actggtgggc gtttgaaaaa ctcttcgccc 180 cacgaaaatg aaggagcata atg gga atc aag gtt ggc gtt ctc gga gcc aaa 233 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys 1 5 10 ggc cgt gtt ggt caa act att gtg gca gca gtc aat gag tcc gac gat 281 Gly Arg Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp 15 20 25 ctg gag ctt gtt gca gag atc ggc gtc gac gat gat ttg agc ctt ctg 329 Leu Glu Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu 30 35 40 gta gac aac ggc gct gaa gtt gtc gtt gac ttc acc act cct aac gct 377 Val Asp Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala 45 50 55 gtg atg ggc aac ctg gag ttc tgc atc aac aac ggc att tct gcg gtt 425 Val Met Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val 60 65 70 75 gtt gga acc acg ggc ttc gat gat gct cgt ttg gag cag gtt cgc gac 473 Val Gly Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp 80 85 90 tgg ctt gaa gga aaa gac aat gtc ggt gtt ctg atc gca cct aac ttt 521 Trp Leu Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe 95 100 105 gct atc tct gcg gtg ttg acc atg gtc ttt tcc aag cag gct gcc cgc 569 Ala Ile Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg 110 115 120 ttc ttc gaa tca gct gaa gtt att gag ctg cac cac ccc aac aag ctg 617 Phe Phe Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu 125 130 135 gat gca cct tca ggc acc gcg atc cac act gct cag ggc att gct gcg 665 Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala 140 145 150 155 gca cgc aaa gaa gca ggc atg gac gca cag cca gat gcg acc gag cag 713 Ala Arg Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln 160 165 170 gca ctt gag ggt tcc cgt ggc gca agc gta gat gga atc ccg gtt cat 761 Ala Leu Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His 175 180 185 gca gtc cgc atg tcc ggc atg gtt gct cac gag caa gtt atc ttt ggc 809 Ala Val Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly 190 195 200 acc cag ggt cag acc ttg acc atc aag cag gac tcc tat gat cgc aac 857 Thr Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn 205 210 215 tca ttt gca cca ggt gtc ttg gtg ggt gtg cgc aac att gca cag cac 905 Ser Phe Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His 220 225 230 235 cca ggc cta gtc gta gga ctt gag cat tac cta ggc ctg taa 947 Pro Gly Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 240 245 <210> 13 <211> 248 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(248) <223> DapB, amino acid sequence of C. glutamicum dihydrodipicolinate reductase dapB, DNA sequence encoding C. glutamicum dihydrodipicolinate reductase <400> 13 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala 20 25 30 Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala 35 40 45 Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu 50 55 60 Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly 65 70 75 80 Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys 85 90 95 Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val 100 105 110 Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly 130 135 140 Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala 145 150 155 160 Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser 165 170 175 Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser 180 185 190 Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly 210 215 220 Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val 225 230 235 240 Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 245 <210> 14 <211> 939 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (193)..(936) <223> dapB-DNA sequence with sod-promoter instead natural promoter of C. glutamicum <400> 14 tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60 ttcgttgcaa tataaacaaa aaggcctctc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120 gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180 gattttttac cc atg gga atc aag gtt ggc gtt ctc gga gcc aaa 225 Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys 1 5 10 ggc cgt gtt ggt caa act att gtg gca gca gtc aat gag tcc gac gat 273 Gly Arg Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp 15 20 25 ctg gag ctt gtt gca gag atc ggc gtc gac gat gat ttg agc ctt ctg 321 Leu Glu Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu 30 35 40 gta gac aac ggc gct gaa gtt gtc gtt gac ttc acc act cct aac gct 369 Val Asp Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala 45 50 55 gtg atg ggc aac ctg gag ttc tgc atc aac aac ggc att tct gcg gtt 417 Val Met Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val 60 65 70 75 gtt gga acc acg ggc ttc gat gat gct cgt ttg gag cag gtt cgc gac 465 Val Gly Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp 80 85 90 tgg ctt gaa gga aaa gac aat gtc ggt gtt ctg atc gca cct aac ttt 513 Trp Leu Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe 95 100 105 gct atc tct gcg gtg ttg acc atg gtc ttt tcc aag cag gct gcc cgc 561 Ala Ile Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg 110 115 120 ttc ttc gaa tca gct gaa gtt att gag ctg cac cac ccc aac aag ctg 609 Phe Phe Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu 125 130 135 gat gca cct tca ggc acc gcg atc cac act gct cag ggc att gct gcg 657 Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala 140 145 150 155 gca cgc aaa gaa gca ggc atg gac gca cag cca gat gcg acc gag cag 705 Ala Arg Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln 160 165 170 gca ctt gag ggt tcc cgt ggc gca agc gta gat gga atc ccg gtt cat 753 Ala Leu Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His 175 180 185 gca gtc cgc atg tcc ggc atg gtt gct cac gag caa gtt atc ttt ggc 801 Ala Val Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly 190 195 200 acc cag ggt cag acc ttg acc atc aag cag gac tcc tat gat cgc aac 849 Thr Gln Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn 205 210 215 tca ttt gca cca ggt gtc ttg gtg ggt gtg cgc aac att gca cag cac 897 Ser Phe Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His 220 225 230 235 cca ggc cta gtc gta gga ctt gag cat tac cta ggc ctg taa 939 Pro Gly Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu 240 245 <210> 15 <211> 3506 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (514)..(2163) <223> Gene cluster encoding wildtype argS (arginyl-tRNA-synthetase) and lysA (diaminopimelate decarboxylase) including natural promoter sequence <220> <221> CDS <222> (2169)..(3503) <223> Gene cluster encoding wildtype argS (arginyl-tRNA-synthetase) and lysA (diaminopimelate decarboxylase) including natural promoter sequence <400> 15 ggctgcactg caacgaggtc gtagttttgg tacatggctt ctggccagtt catggattgg 60 ctgccgaaga agctataggc atcgccacca gggccaccgg agttaccgaa gatggtgccg 120 tgcttttcgc cttgggcagg gaccttgaca aagcccacgc tgatatcgcc aagtgaggga 180 tcagaatagt gcatgggcac gtcgatgctg ccacattgag cggaggcaat atctacctga 240 ggtgggcatt cttcccagcg gatgttttct tgcgctgctg cagtgggcat tgataccaaa 300 aaggggctaa gcgcagtcga ggcggcaaga actgctacta ccctttttat tgtcgaacgg 360 ggcattacgg ctccaaggac gtttgttttc tgggtcagtt accccaaaaa gcatatacag 420 agaccaatga tttttcatta aaaaggcagg gatttgttat aagtatgggt cgtattctgt 480 gcgacgggtg tacctcggct agaatttctc ccc atg aca cca gct gat 528 Met Thr Pro Ala Asp 1 5 ctc gca aca ttg att aaa gag acc gcg gta gag gtt ttg acc tcc cgc 576 Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val Leu Thr Ser Arg 10 15 20 gag ctc gat act tct gtt ctt ccg gag cag gta gtt gtg gag cgt ccg 624 Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val Val Glu Arg Pro 25 30 35 cgt aac cca gag cac ggc gat tac gcc acc aac att gca ttg cag gtg 672 Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile Ala Leu Gln Val 40 45 50 gct aaa aag gtc ggt cag aac cct cgg gat ttg gct acc tgg ctg gca 720 Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala Thr Trp Leu Ala 55 60 65 gag gca ttg gct gca gat gac gcc att gat tct gct gaa att gct ggc 768 Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala Glu Ile Ala Gly 70 75 80 85 cca ggc ttt ttg aac att cgc ctt gct gca gca gca cag ggt gaa att 816 Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala Gln Gly Glu Ile 90 95 100 gtg gcc aag att ctg gca cag ggc gag act ttc gga aac tcc gat cac 864 Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly Asn Ser Asp His 105 110 115 ctt tcc cac ttg gac gtg aac ctc gag ttc gtt tct gca aac cca acc 912 Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser Ala Asn Pro Thr 120 125 130 gga cct att cac ctt ggc gga acc cgc tgg gct gcc gtg ggt gac tct 960 Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala Val Gly Asp Ser 135 140 145 ttg ggt cgt gtg ctg gag gct tcc ggc gcg aaa gtg acc cgc gaa tac 1008 Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val Thr Arg Glu Tyr 150 155 160 165 tac ttc aac gat cac ggt cgc cag atc gat cgt ttc gct ttg tcc ctt 1056 Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe Ala Leu Ser Leu 170 175 180 ctt gca gcg gcg aag ggc gag cca acg cca gaa gac ggt tat ggc ggc 1104 Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp Gly Tyr Gly Gly 185 190 195 gaa tac att aag gaa att gcg gag gca atc gtc gaa aag cat cct gaa 1152 Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu Lys His Pro Glu 200 205 210 gcg ttg gct ttg gag cct gcc gca acc cag gag ctt ttc cgc gct gaa 1200 Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu Phe Arg Ala Glu 215 220 225 ggc gtg gag atg atg ttc gag cac atc aaa tct tcc ctg cat gag ttc 1248 Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser Leu His Glu Phe 230 235 240 245 ggc acc gat ttc gat gtc tac tac cac gag aac tcc ctg ttc gag tcc 1296 Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser Leu Phe Glu Ser 250 255 260 ggt gcg gtg gac aag gcc gtg cag gtg ctg aag gac aac ggc aac ctg 1344 Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp Asn Gly Asn Leu 265 270 275 tac gaa aac gag ggc gct tgg tgg ctg cgt tcc acc gaa ttc ggc gat 1392 Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr Glu Phe Gly Asp 280 285 290 gac aaa gac cgc gtg gtg atc aag tct gac ggc gac gca gcc tac atc 1440 Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp Ala Ala Tyr Ile 295 300 305 gct ggc gat atc gcg tac gtg gct gat aag ttc tcc cgc gga cac aac 1488 Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser Arg Gly His Asn 310 315 320 325 cta aac atc tac atg ttg ggt gct gac cac cat ggt tac atc gcg cgc 1536 Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly Tyr Ile Ala Arg 330 335 340 ctg aag gca gcg gcg gcg gca ctt ggc tac aag cca gaa ggc gtt gaa 1584 Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro Glu Gly Val Glu 345 350 355 gtc ctg att ggc cag atg gtg aac ctg ctt cgc gac ggc aag gca gtg 1632 Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp Gly Lys Ala Val 360 365 370 cgt atg tcc aag cgt gca ggc acc gtg gtc acc cta gat gac ctc gtt 1680 Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu Asp Asp Leu Val 375 380 385 gaa gca atc ggc atc gat gcg gcg cgt tac tcc ctg atc cgt tcc tcc 1728 Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu Ile Arg Ser Ser 390 395 400 405 gtg gat tct tcc ctg gat atc gat ctc ggc ctg tgg gaa tcc cag tcc 1776 Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp Glu Ser Gln Ser 410 415 420 tcc gac aac cct gtg tac tac gtg cag tac gga cac gct cgt ctg tgc 1824 Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His Ala Arg Leu Cys 425 430 435 tcc atc gcg cgc aag gca gag acc ttg ggt gtc acc gag gaa ggc gca 1872 Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr Glu Glu Gly Ala 440 445 450 gac cta tct cta ctg acc cac gac cgc gaa ggc gat ctc atc cgc aca 1920 Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp Leu Ile Arg Thr 455 460 465 ctc gga gag ttc cca gca gtg gtg aag gct gcc gct gac cta cgt gaa 1968 Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala Asp Leu Arg Glu 470 475 480 485 cca cac cgc att gcc cgc tat gct gag gaa tta gct gga act ttc cac 2016 Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala Gly Thr Phe His 490 495 500 cgc ttc tac gat tcc tgc cac atc ctt cca aag gtt gat gag gat acg 2064 Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val Asp Glu Asp Thr 505 510 515 gca cca atc cac aca gca cgt ctg gca ctt gca gca gca acc cgc cag 2112 Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala Ala Thr Arg Gln 520 525 530 acc ctc gct aac gcc ctg cac ctg gtt ggc gtt tcc gca ccg gag aag 2160 Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser Ala Pro Glu Lys 535 540 545 atg taaca atg gct aca gtt gaa aat ttc aat gaa ctt ccc 2201 Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro 550 1 5 10 gca cac gta tgg cca cgc aat gcc gtg cgc caa gaa gac ggc gtt gtc 2249 Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val 15 20 25 acc gtc gct ggt gtg cct ctg cct gac ctc gct gaa gaa tac gga acc 2297 Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr 30 35 40 cca ctg ttc gta gtc gac gag gac gat ttc cgt tcc cgc tgt cgc gac 2345 Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp 45 50 55 atg gct acc gca ttc ggt gga cca ggc aat gtg cac tac gca tct aaa 2393 Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys 60 65 70 75 gcg ttc ctg acc aag acc att gca cgt tgg gtt gat gaa gag ggg ctg 2441 Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu 80 85 90 gca ctg gac att gca tcc atc aac gaa ctg ggc att gcc ctg gcc gct 2489 Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala 95 100 105 ggt ttc ccc gcc agc cgt atc acc gcg cac ggc aac aac aaa ggc gta 2537 Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val 110 115 120 gag ttc ctg cgc gcg ttg gtt caa aac ggt gtg gga cac gtg gtg ctg 2585 Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu 125 130 135 gac tcc gca cag gaa cta gaa ctg ttg gat tac gtt gcc gct ggt gaa 2633 Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu 140 145 150 155 ggc aag att cag gac gtg ttg atc cgc gta aag cca ggc atc gaa gca 2681 Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala 160 165 170 cac acc cac gag ttc atc gcc act agc cac gaa gac cag aag ttc gga 2729 His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly 175 180 185 ttc tcc ctg gca tcc ggt tcc gca ttc gaa gca gca aaa gcc gcc aac 2777 Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn 190 195 200 aac gca gaa aac ctg aac ctg gtt ggc ctg cac tgc cac gtt ggt tcc 2825 Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser 205 210 215 cag gtg ttc gac gcc gaa ggc ttc aag ctg gca gca gaa cgc gtg ttg 2873 Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu 220 225 230 235 ggc ctg tac tca cag atc cac agc gaa ctg ggc gtt gcc ctt cct gaa 2921 Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu 240 245 250 ctg gat ctc ggt ggc gga tac ggc att gcc tat acc gca gct gaa gaa 2969 Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu 255 260 265 cca ctc aac gtc gca gaa gtt gcc tcc gac ctg ctc acc gca gtc gga 3017 Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly 270 275 280 aaa atg gca gcg gaa cta ggc atc gac gca cca acc gtg ctt gtt gag 3065 Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu 285 290 295 ccc ggc cgc gct atc gca ggc ccc tcc acc gtg acc atc tac gaa gtc 3113 Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val 300 305 310 315 ggc acc acc aaa gac gtc cac gta gac gac gac aaa acc cgc cgt tac 3161 Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr 320 325 330 atc gcc gtg gac gga ggc atg tcc gac aac atc cgc cca gca ctc tac 3209 Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr 335 340 345 ggc tcc gaa tac gac gcc cgc gta gta tcc cgc ttc gcc gaa gga gac 3257 Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp 350 355 360 cca gta agc acc cgc atc gtg ggc tcc cac tgc gaa tcc ggc gat atc 3305 Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile 365 370 375 ctg atc aac gat gaa atc tac cca tct gac atc acc agc ggc gac ttc 3353 Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe 380 385 390 395 ctt gca ctc gca gcc acc ggc gca tac tgc tac gcc atg agc tcc cgc 3401 Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg 400 405 410 tac aac gcc ttc aca cgg ccc gcc gtc gtg tcc gtc cgc gct ggc agc 3449 Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser 415 420 425 tcc cgc ctc atg ctg cgc cgc gaa acg ctc gac gac atc ctc tca cta 3497 Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu 430 435 440 gag gca taa 3506 Glu Ala 445 <210> 16 <211> 7091 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7091) <223> Two recombinantly joined copies of DNA sequences of argS and lysA including flanking regions <400> 16 gaggctgcac tgcaacgagg tcgtagtttt ggtacatggc ttctggccag ttcatggatt 60 ggctgccgaa gaagctatag gcatcgccac cagggccacc ggagttaccg aagatggtgc 120 cgtgcttttc gccttgggca gggaccttga caaagcccac gctgatatcg ccaagtgagg 180 gatcagaata gtgcatgggc acgtcgatgc tgccacattg agcggaggca atatctacct 240 gaggtgggca ttcttcccag cggatgtttt cttgcgctgc tgcagtgggc attgatacca 300 aaaaggggct aagcgcagtc gaggcggcaa gaactgctac tacccttttt attgtcgaac 360 ggggcattac ggctccaagg acgtttgttt tctgggtcag ttaccccaaa aagcatatac 420 agagaccaat gatttttcat taaaaaggca gggatttgtt ataagtatgg gtcgtattct 480 gtgcgacggg tgtacctcgg ctagaatttc tccccatgac accagctgat ctcgcaacat 540 tgattaaaga gaccgcggta gaggttttga cctcccgcga gctcgatact tctgttcttc 600 cggagcaggt agttgtggag cgtccgcgta acccagagca cggcgattac gccaccaaca 660 ttgcattgca ggtggctaaa aaggtcggtc agaaccctcg ggatttggct acctggctgg 720 cagaggcatt ggctgcagat gacgccattg attctgctga aattgctggc ccaggctttt 780 tgaacattcg ccttgctgca gcagcacagg gtgaaattgt ggccaagatt ctggcacagg 840 gcgagacttt cggaaactcc gatcaccttt cccacttgga cgtgaacctc gagttcgttt 900 ctgcaaaccc aaccggacct attcaccttg gcggaacccg ctgggctgcc gtgggtgact 960 ctttgggtcg tgtgctggag gcttccggcg cgaaagtgac ccgcgaatac tacttcaacg 1020 atcacggtcg ccagatcgat cgtttcgctt tgtcccttct tgcagcggcg aagggcgagc 1080 caacgccaga agacggttat ggcggcgaat acattaagga aattgcggag gcaatcgtcg 1140 aaaagcatcc tgaagcgttg gctttggagc ctgccgcaac ccaggagctt ttccgcgctg 1200 aaggcgtgga gatgatgttc gagcacatca aatcttccct gcatgagttc ggcaccgatt 1260 tcgatgtcta ctaccacgag aactccctgt tcgagtccgg tgcggtggac aaggccgtgc 1320 aggtgctgaa ggacaacggc aacctgtacg aaaacgaggg cgcttggtgg ctgcgttcca 1380 ccgaattcgg cgatgacaaa gaccgcgtgg tgatcaagtc tgacggcgac gcagcctaca 1440 tcgctggcga tatcgcgtac gtggctgata agttctcccg cggacacaac ctaaacatct 1500 acatgttggg tgctgaccac catggttaca tcgcgcgcct gaaggcagcg gcggcggcac 1560 ttggctacaa gccagaaggc gttgaagtcc tgattggcca gatggtgaac ctgcttcgcg 1620 acggcaaggc agtgcgtatg tccaagcgtg caggcaccgt ggtcacccta gatgacctcg 1680 ttgaagcaat cggcatcgat gcggcgcgtt actccctgat ccgttcctcc gtggattctt 1740 ccctggatat cgatctcggc ctgtgggaat cccagtcctc cgacaaccct gtgtactacg 1800 tgcagtacgg acacgctcgt ctgtgctcca tcgcgcgcaa ggcagagacc ttgggtgtca 1860 ccgaggaagg cgcagaccta tctctactga cccacgaccg cgaaggcgat ctcatccgca 1920 cactcggaga gttcccagca gtggtgaagg ctgccgctga cctacgtgaa ccacaccgca 1980 ttgcccgcta tgctgaggaa ttagctggaa ctttccaccg cttctacgat tcctgccaca 2040 tccttccaaa ggttgatgag gatacggcac caatccacac agcacgtctg gcacttgcag 2100 cagcaacccg ccagaccctc gctaacgccc tgcacctggt tggcgtttcc gcaccggaga 2160 agatgtaaca atggctacag ttgaaaattt caatgaactt cccgcacacg tatggccacg 2220 caatgccgtg cgccaagaag acggcgttgt caccgtcgct ggtgtgcctc tgcctgacct 2280 cgctgaagaa tacggaaccc cactgttcgt agtcgacgag gacgatttcc gttcccgctg 2340 tcgcgacatg gctaccgcat tcggtggacc aggcaatgtg cactacgcat ctaaagcgtt 2400 cctgaccaag accattgcac gttgggttga tgaagagggg ctggcactgg acattgcatc 2460 catcaacgaa ctgggcattg ccctggccgc tggtttcccc gccagccgta tcaccgcgca 2520 cggcaacaac aaaggcgtag agttcctgcg cgcgttggtt caaaacggtg tgggacacgt 2580 ggtgctggac tccgcacagg aactagaact gttggattac gttgccgctg gtgaaggcaa 2640 gattcaggac gtgttgatcc gcgtaaagcc aggcatcgaa gcacacaccc acgagttcat 2700 cgccactagc cacgaagacc agaagttcgg attctccctg gcatccggtt ccgcattcga 2760 agcagcaaaa gccgccaaca acgcagaaaa cctgaacctg gttggcctgc actgccacgt 2820 tggttcccag gtgttcgacg ccgaaggctt caagctggca gcagaacgcg tgttgggcct 2880 gtactcacag atccacagcg aactgggcgt tgcccttcct gaactggatc tcggtggcgg 2940 atacggcatt gcctataccg cagctgaaga accactcaac gtcgcagaag ttgcctccga 3000 cctgctcacc gcagtcggaa aaatggcagc ggaactaggc atcgacgcac caaccgtgct 3060 tgttgagccc ggccgcgcta tcgcaggccc ctccaccgtg accatctacg aagtcggcac 3120 caccaaagac gtccacgtag acgacgacaa aacccgccgt tacatcgccg tggacggagg 3180 catgtccgac aacatccgcc cagcactcta cggctccgaa tacgacgccc gcgtagtatc 3240 ccgcttcgcc gaaggagacc cagtaagcac ccgcatcgtg ggctcccact gcgaatccgg 3300 cgatatcctg atcaacgatg aaatctaccc atctgacatc accagcggcg acttccttgc 3360 actcgcagcc accggcgcat actgctacgc catgagctcc cgctacaacg ccttcacacg 3420 gcccgccgtc gtgtccgtcc gcgctggcag ctcccgcctc atgctgcgcc gcgaaacgct 3480 cgacgacatc ctctcactag aggcataacg cttttcgacg cctgaccccg cccttcacct 3540 tcgccgtgga gggcggtttt gggtttctgg gtttctttct agagaggctg cactgcaacg 3600 aggtcgtagt tttggtacat ggcttctggc cagttcatgg attggctgcc gaagaagcta 3660 taggcatcgc caccagggcc accggagtta ccgaagatgg tgccgtgctt ttcgccttgg 3720 gcagggacct tgacaaagcc cacgctgata tcgccaagtg agggatcaga atagtgcatg 3780 ggcacgtcga tgctgccaca ttgagcggag gcaatatcta cctgaggtgg gcattcttcc 3840 cagcggatgt tttcttgcgc tgctgcagtg ggcattgata ccaaaaaggg gctaagcgca 3900 gtcgaggcgg caagaactgc tactaccctt tttattgtcg aacggggcat tacggctcca 3960 aggacgtttg ttttctgggt cagttacccc aaaaagcata tacagagacc aatgattttt 4020 cattaaaaag gcagggattt gttataagta tgggtcgtat tctgtgcgac gggtgtacct 4080 cggctagaat ttctccccat gacaccagct gatctcgcaa cattgattaa agagaccgcg 4140 gtagaggttt tgacctcccg cgagctcgat acttctgttc ttccggagca ggtagttgtg 4200 gagcgtccgc gtaacccaga gcacggcgat tacgccacca acattgcatt gcaggtggct 4260 aaaaaggtcg gtcagaaccc tcgggatttg gctacctggc tggcagaggc attggctgca 4320 gatgacgcca ttgattctgc tgaaattgct ggcccaggct ttttgaacat tcgccttgct 4380 gcagcagcac agggtgaaat tgtggccaag attctggcac agggcgagac tttcggaaac 4440 tccgatcacc tttcccactt ggacgtgaac ctcgagttcg tttctgcaaa cccaaccgga 4500 cctattcacc ttggcggaac ccgctgggct gccgtgggtg actctttggg tcgtgtgctg 4560 gaggcttccg gcgcgaaagt gacccgcgaa tactacttca acgatcacgg tcgccagatc 4620 gatcgtttcg ctttgtccct tcttgcagcg gcgaagggcg agccaacgcc agaagacggt 4680 tatggcggcg aatacattaa ggaaattgcg gaggcaatcg tcgaaaagca tcctgaagcg 4740 ttggctttgg agcctgccgc aacccaggag cttttccgcg ctgaaggcgt ggagatgatg 4800 ttcgagcaca tcaaatcttc cctgcatgag ttcggcaccg atttcgatgt ctactaccac 4860 gagaactccc tgttcgagtc cggtgcggtg gacaaggccg tgcaggtgct gaaggacaac 4920 ggcaacctgt acgaaaacga gggcgcttgg tggctgcgtt ccaccgaatt cggcgatgac 4980 aaagaccgcg tggtgatcaa gtctgacggc gacgcagcct acatcgctgg cgatatcgcg 5040 tacgtggctg ataagttctc ccgcggacac aacctaaaca tctacatgtt gggtgctgac 5100 caccatggtt acatcgcgcg cctgaaggca gcggcggcgg cacttggcta caagccagaa 5160 ggcgttgaag tcctgattgg ccagatggtg aacctgcttc gcgacggcaa ggcagtgcgt 5220 atgtccaagc gtgcaggcac cgtggtcacc ctagatgacc tcgttgaagc aatcggcatc 5280 gatgcggcgc gttactccct gatccgttcc tccgtggatt cttccctgga tatcgatctc 5340 ggcctgtggg aatcccagtc ctccgacaac cctgtgtact acgtgcagta cggacacgct 5400 cgtctgtgct ccatcgcgcg caaggcagag accttgggtg tcaccgagga aggcgcagac 5460 ctatctctac tgacccacga ccgcgaaggc gatctcatcc gcacactcgg agagttccca 5520 gcagtggtga aggctgccgc tgacctacgt gaaccacacc gcattgcccg ctatgctgag 5580 gaattagctg gaactttcca ccgcttctac gattcctgcc acatccttcc aaaggttgat 5640 gaggatacgg caccaatcca cacagcacgt ctggcacttg cagcagcaac ccgccagacc 5700 ctcgctaacg ccctgcacct ggttggcgtt tccgcaccgg agaagatgta acaatggcta 5760 cagttgaaaa tttcaatgaa cttcccgcac acgtatggcc acgcaatgcc gtgcgccaag 5820 aagacggcgt tgtcaccgtc gctggtgtgc ctctgcctga cctcgctgaa gaatacggaa 5880 ccccactgtt cgtagtcgac gaggacgatt tccgttcccg ctgtcgcgac atggctaccg 5940 cattcggtgg accaggcaat gtgcactacg catctaaagc gttcctgacc aagaccattg 6000 cacgttgggt tgatgaagag gggctggcac tggacattgc atccatcaac gaactgggca 6060 ttgccctggc cgctggtttc cccgccagcc gtatcaccgc gcacggcaac aacaaaggcg 6120 tagagttcct gcgcgcgttg gttcaaaacg gtgtgggaca cgtggtgctg gactccgcac 6180 aggaactaga actgttggat tacgttgccg ctggtgaagg caagattcag gacgtgttga 6240 tccgcgtaaa gccaggcatc gaagcacaca cccacgagtt catcgccact agccacgaag 6300 accagaagtt cggattctcc ctggcatccg gttccgcatt cgaagcagca aaagccgcca 6360 acaacgcaga aaacctgaac ctggttggcc tgcactgcca cgttggttcc caggtgttcg 6420 acgccgaagg cttcaagctg gcagcagaac gcgtgttggg cctgtactca cagatccaca 6480 gcgaactggg cgttgccctt cctgaactgg atctcggtgg cggatacggc attgcctata 6540 ccgcagctga agaaccactc aacgtcgcag aagttgcctc cgacctgctc accgcagtcg 6600 gaaaaatggc agcggaacta ggcatcgacg caccaaccgt gcttgttgag cccggccgcg 6660 ctatcgcagg cccctccacc gtgaccatct acgaagtcgg caccaccaaa gacgtccacg 6720 tagacgacga caaaacccgc cgttacatcg ccgtggacgg aggcatgtcc gacaacatcc 6780 gcccagcact ctacggctcc gaatacgacg cccgcgtagt atcccgcttc gccgaaggag 6840 acccagtaag cacccgcatc gtgggctccc actgcgaatc cggcgatatc ctgatcaacg 6900 atgaaatcta cccatctgac atcaccagcg gcgacttcct tgcactcgca gccaccggcg 6960 catactgcta cgccatgagc tcccgctaca acgccttcac acggcccgcc gtcgtgtccg 7020 tccgcgctgg cagctcccgc ctcatgctgc gccgcgaaac gctcgacgac atcctctcac 7080 tagaggcata a 7091 <210> 17 <211> 445 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(445) <223> LysA, amino acid sequence of C. glutamicum diaminopimelate decarboxylase <400> 17 Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro 1 5 10 15 Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val 20 25 30 Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val 35 40 45 Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe 50 55 60 Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80 Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala 85 90 95 Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala 115 120 125 Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu 130 135 140 Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp 145 150 155 160 Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe 165 170 175 Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu 195 200 205 Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala 210 215 220 Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln 225 230 235 240 Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly 245 250 255 Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala 260 265 270 Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu 275 280 285 Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile 290 295 300 Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320 Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly 325 330 335 Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp 340 345 350 Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg 355 360 365 Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu 370 375 380 Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala 385 390 395 400 Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr 405 410 415 Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu 420 425 430 Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala 435 440 445 <210> 18 <211> 1338 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1335) <223> hom, DNA sequence encoding wildtype C. glutamicum homoserine dehydrogenase <400> 18 atg acc tca gca tct gcc cca agc ttt aac ccc ggc aag ggt ccc ggc 48 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 tca gca gtc gga att gcc ctt tta gga ttc gga aca gtc ggc act gag 96 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 gtg atg cgt ctg atg acc gag tac ggt gat gaa ctt gcg cac cgc att 144 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 ggt ggc cca ctg gag gtt cgt ggc att gct gtt tct gat atc tca aag 192 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 cca cgt gaa ggc gtt gca cct gag ctg ctc act gag gac gct ttt gca 240 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 ctc atc gag cgc gag gat gtt gac atc gtc gtt gag gtt atc ggc ggc 288 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 att gag tac cca cgt gag gta gtt ctc gca gct ctg aag gcc ggc aag 336 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 tct gtt gtt acc gcc aat aag gct ctt gtt gca gct cac tct gct gag 384 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 ctt gct gat gca gcg gaa gcc gca aac gtt gac ctg tac ttc gag gct 432 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 gct gtt gca ggc gca att cca gtg gtt ggc cca ctg cgt cgc tcc ctg 480 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 gct ggc gat cag atc cag tct gtg atg ggc atc gtt aac ggc acc acc 528 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 aac ttc atc ttg gac gcc atg gat tcc acc ggc gct gac tat gca gat 576 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 tct ttg gct gag gca act cgt ttg ggt tac gcc gaa gct gat cca act 624 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 gca gac gtc gaa ggc cat gac gcc gca tcc aag gct gca att ttg gca 672 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 tcc atc gct ttc cac acc cgt gtt acc gcg gat gat gtg tac tgc gaa 720 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 ggt atc agc aac atc agc gct gcc gac att gag gca gca cag cag gca 768 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 ggc cac acc atc aag ttg ttg gcc atc tgt gag aag ttc acc aac aag 816 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 gaa gga aag tcg gct att tct gct cgc gtg cac ccg act cta tta cct 864 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 gtg tcc cac cca ctg gcg tcg gta aac aag tcc ttt aat gca atc ttt 912 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 gtt gaa gca gaa gca gct ggt cgc ctg atg ttc tac gga aac ggt gca 960 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 ggt ggc gcg cca acc gcg tct gct gtg ctt ggc gac gtc gtt ggt gcc 1008 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 gca cga aac aag gtg cac ggt ggc cgt gct cca ggt gag tcc acc tac 1056 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 gct aac ctg ccg atc gct gat ttc ggt gag acc acc act cgt tac cac 1104 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 ctc gac atg gat gtg gaa gat cgc gtg ggg gtt ttg gct gaa ttg gct 1152 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 agc ctg ttc tct gag caa gga atc tcc ctg cgt aca atc cga cag gaa 1200 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 gag cgc gat gat gat gca cgt ctg atc gtg gtc acc cac tct gcg ctg 1248 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 gaa tct gat ctt tcc cgc acc gtt gaa ctg ctg aag gct aag cct gtt 1296 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 gtt aag gca atc aac agt gtg atc cgc ctc gaa agg gac taa 1338 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 19 <211> 445 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(445) <223> Hom, amino acid sequence of C. glutamicum homoserine dehydrogenase <400> 19 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 20 <211> 1338 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1335) <223> homV59A, DNA sequence sequence encoding C. glutamicum homoserine dehydrogenase with V59A substitution <400> 20 atg acc tca gca tct gcc cca agc ttt aac ccc ggc aag ggt ccc ggc 48 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 tca gca gtc gga att gcc ctt tta gga ttc gga aca gtc ggc act gag 96 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 gtg atg cgt ctg atg acc gag tac ggt gat gaa ctt gcg cac cgc att 144 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 ggt ggc cca ctg gag gtt cgt ggc att gct gct tct gat atc tca aag 192 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Ala Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 cca cgt gaa ggc gtt gca cct gag ctg ctc act gag gac gct ttt gca 240 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 ctc atc gag cgc gag gat gtt gac atc gtc gtt gag gtt atc ggc ggc 288 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 att gag tac cca cgt gag gta gtt ctc gca gct ctg aag gcc ggc aag 336 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 tct gtt gtt acc gcc aat aag gct ctt gtt gca gct cac tct gct gag 384 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 ctt gct gat gca gcg gaa gcc gca aac gtt gac ctg tac ttc gag gct 432 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 gct gtt gca ggc gca att cca gtg gtt ggc cca ctg cgt cgc tcc ctg 480 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 gct ggc gat cag atc cag tct gtg atg ggc atc gtt aac ggc acc acc 528 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 aac ttc atc ttg gac gcc atg gat tcc acc ggc gct gac tat gca gat 576 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 tct ttg gct gag gca act cgt ttg ggt tac gcc gaa gct gat cca act 624 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 gca gac gtc gaa ggc cat gac gcc gca tcc aag gct gca att ttg gca 672 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 tcc atc gct ttc cac acc cgt gtt acc gcg gat gat gtg tac tgc gaa 720 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 ggt atc agc aac atc agc gct gcc gac att gag gca gca cag cag gca 768 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 ggc cac acc atc aag ttg ttg gcc atc tgt gag aag ttc acc aac aag 816 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 gaa gga aag tcg gct att tct gct cgc gtg cac ccg act cta tta cct 864 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 gtg tcc cac cca ctg gcg tcg gta aac aag tcc ttt aat gca atc ttt 912 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 gtt gaa gca gaa gca gct ggt cgc ctg atg ttc tac gga aac ggt gca 960 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 ggt ggc gcg cca acc gcg tct gct gtg ctt ggc gac gtc gtt ggt gcc 1008 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 gca cga aac aag gtg cac ggt ggc cgt gct cca ggt gag tcc acc tac 1056 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 gct aac ctg ccg atc gct gat ttc ggt gag acc acc act cgt tac cac 1104 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 ctc gac atg gat gtg gaa gat cgc gtg ggg gtt ttg gct gaa ttg gct 1152 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 agc ctg ttc tct gag caa gga atc tcc ctg cgt aca atc cga cag gaa 1200 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 gag cgc gat gat gat gca cgt ctg atc gtg gtc acc cac tct gcg ctg 1248 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 gaa tct gat ctt tcc cgc acc gtt gaa ctg ctg aag gct aag cct gtt 1296 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 gtt aag gca atc aac agt gtg atc cgc ctc gaa agg gac taa 1338 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 21 <211> 445 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(445) <223> HomV59A, amino acid of C. glutamicum homoserine dehydrogenase with V59A substitution <400> 21 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Ala Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 22 <211> 3623 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (201)..(3620) <223> pyc, DNA sequence encoding wildtype C. glutamicum pyruvate carboxylase with natural promoter <400> 22 actggggcgg ggttagatcc tggggggttt atttcattca ctttggcttg aagtcgtgca 60 ggtcagggga gtgttgcccg aaaacattga gaggaaaaca aaaaccgatg tttgattggg 120 ggaatcgggg gttacgatac taggacgcag tgactgctat cacccttggc ggtctcttgt 180 tgaaaggaat aattactcta gtg tcg act cac aca tct tca acg ctt cca gca 233 Val Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala 1 5 10 ttc aaa aag atc ttg gta gca aac cgc ggc gaa atc gcg gtc cgt gct 281 Phe Lys Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala 15 20 25 ttc cgt gca gca ctc gaa acc ggt gca gcc acg gta gct att tac ccc 329 Phe Arg Ala Ala Leu Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro 30 35 40 cgt gaa gat cgg gga tca ttc cac cgc tct ttt gct tct gaa gct gtc 377 Arg Glu Asp Arg Gly Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val 45 50 55 cgc att ggt acc gaa ggc tca cca gtc aag gcg tac ctg gac atc gat 425 Arg Ile Gly Thr Glu Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp 60 65 70 75 gaa att atc ggt gca gct aaa aaa gtt aaa gca gat gcc att tac ccg 473 Glu Ile Ile Gly Ala Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro 80 85 90 gga tac ggc ttc ctg tct gaa aat gcc cag ctt gcc cgc gag tgt gcg 521 Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala 95 100 105 gaa aac ggc att act ttt att ggc cca acc cca gag gtt ctt gat ctc 569 Glu Asn Gly Ile Thr Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu 110 115 120 acc ggt gat aag tct cgc gcg gta acc gcc gcg aag aag gct ggt ctg 617 Thr Gly Asp Lys Ser Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu 125 130 135 cca gtt ttg gcg gaa tcc acc ccg agc aaa aac atc gat gag atc gtt 665 Pro Val Leu Ala Glu Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val 140 145 150 155 aaa agc gct gaa ggc cag act tac ccc atc ttt gtg aag gca gtt gcc 713 Lys Ser Ala Glu Gly Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala 160 165 170 ggt ggt ggc gga cgc ggt atg cgt ttt gtt gct tca cct gat gag ctt 761 Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu 175 180 185 cgc aaa tta gca aca gaa gca tct cgt gaa gct gaa gcg gct ttc ggc 809 Arg Lys Leu Ala Thr Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly 190 195 200 gat ggc gcg gta tat gtc gaa cgt gct gtg att aac cct cag cat att 857 Asp Gly Ala Val Tyr Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile 205 210 215 gaa gtg cag atc ctt ggc gat cac act gga gaa gtt gta cac ctt tat 905 Glu Val Gln Ile Leu Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr 220 225 230 235 gaa cgt gac tgc tca ctg cag cgt cgt cac caa aaa gtt gtc gaa att 953 Glu Arg Asp Cys Ser Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile 240 245 250 gcg cca gca cag cat ttg gat cca gaa ctg cgt gat cgc att tgt gcg 1001 Ala Pro Ala Gln His Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala 255 260 265 gat gca gta aag ttc tgc cgc tcc att ggt tac cag ggc gcg gga acc 1049 Asp Ala Val Lys Phe Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr 270 275 280 gtg gaa ttc ttg gtc gat gaa aag ggc aac cac gtc ttc atc gaa atg 1097 Val Glu Phe Leu Val Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met 285 290 295 aac cca cgt atc cag gtt gag cac acc gtg act gaa gaa gtc acc gag 1145 Asn Pro Arg Ile Gln Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu 300 305 310 315 gtg gac ctg gtg aag gcg cag atg cgc ttg gct gct ggt gca acc ttg 1193 Val Asp Leu Val Lys Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu 320 325 330 aag gaa ttg ggt ctg acc caa gat aag atc aag acc cac ggt gca gca 1241 Lys Glu Leu Gly Leu Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala 335 340 345 ctg cag tgc cgc atc acc acg gaa gat cca aac aac ggc ttc cgc cca 1289 Leu Gln Cys Arg Ile Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro 350 355 360 gat acc gga act atc acc gcg tac cgc tca cca ggc gga gct ggc gtt 1337 Asp Thr Gly Thr Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val 365 370 375 cgt ctt gac ggt gca gct cag ctc ggt ggc gaa atc acc gca cac ttt 1385 Arg Leu Asp Gly Ala Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe 380 385 390 395 gac tcc atg ctg gtg aaa atg acc tgc cgt ggt tcc gac ttt gaa act 1433 Asp Ser Met Leu Val Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr 400 405 410 gct gtt gct cgt gca cag cgc gcg ttg gct gag ttc acc gtg tct ggt 1481 Ala Val Ala Arg Ala Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly 415 420 425 gtt gca acc aac att ggt ttc ttg cgt gcg ttg ctg cgg gaa gag gac 1529 Val Ala Thr Asn Ile Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp 430 435 440 ttc act tcc aag cgc atc gcc acc gga ttc att gcc gat cac ccg cac 1577 Phe Thr Ser Lys Arg Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His 445 450 455 ctc ctt cag gct cca cct gct gat gat gag cag gga cgc atc ctg gat 1625 Leu Leu Gln Ala Pro Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp 460 465 470 475 tac ttg gca gat gtc acc gtg aac aag cct cat ggt gtg cgt cca aag 1673 Tyr Leu Ala Asp Val Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys 480 485 490 gat gtt gca gct cct atc gat aag ctg cct aac atc aag gat ctg cca 1721 Asp Val Ala Ala Pro Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro 495 500 505 ctg cca cgc ggt tcc cgt gac cgc ctg aag cag ctt ggc cca gcc gcg 1769 Leu Pro Arg Gly Ser Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala 510 515 520 ttt gct cgt gat ctc cgt gag cag gac gca ctg gca gtt act gat acc 1817 Phe Ala Arg Asp Leu Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr 525 530 535 acc ttc cgc gat gca cac cag tct ttg ctt gcg acc cga gtc cgc tca 1865 Thr Phe Arg Asp Ala His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser 540 545 550 555 ttc gca ctg aag cct gcg gca gag gcc gtc gca aag ctg act cct gag 1913 Phe Ala Leu Lys Pro Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu 560 565 570 ctt ttg tcc gtg gag gcc tgg ggc ggc gcg acc tac gat gtg gcg atg 1961 Leu Leu Ser Val Glu Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met 575 580 585 cgt ttc ctc ttt gag gat ccg tgg gac agg ctc gac gag ctg cgc gag 2009 Arg Phe Leu Phe Glu Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu 590 595 600 gcg atg ccg aat gta aac att cag atg ctg ctt cgc ggc cgc aac acc 2057 Ala Met Pro Asn Val Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr 605 610 615 gtg gga tac acc ccg tac cca gac tcc gtc tgc cgc gcg ttt gtt aag 2105 Val Gly Tyr Thr Pro Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys 620 625 630 635 gaa gct gcc agc tcc ggc gtg gac atc ttc cgc atc ttc gac gcg ctt 2153 Glu Ala Ala Ser Ser Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu 640 645 650 aac gac gtc tcc cag atg cgt cca gca atc gac gca gtc ctg gag acc 2201 Asn Asp Val Ser Gln Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr 655 660 665 aac acc gcg gta gcc gag gtg gct atg gct tat tct ggt gat ctc tct 2249 Asn Thr Ala Val Ala Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser 670 675 680 gat cca aat gaa aag ctc tac acc ctg gat tac tac cta aag atg gca 2297 Asp Pro Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala 685 690 695 gag gag atc gtc aag tct ggc gct cac atc ttg gcc att aag gat atg 2345 Glu Glu Ile Val Lys Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met 700 705 710 715 gct ggt ctg ctt cgc cca gct gcg gta acc aag ctg gtc acc gca ctg 2393 Ala Gly Leu Leu Arg Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu 720 725 730 cgc cgt gaa ttc gat ctg cca gtg cac gtg cac acc cac gac act gcg 2441 Arg Arg Glu Phe Asp Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala 735 740 745 ggt ggc cag ctg gca acc tac ttt gct gca gct caa gct ggt gca gat 2489 Gly Gly Gln Leu Ala Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp 750 755 760 gct gtt gac ggt gct tcc gca cca ctg tct ggc acc acc tcc cag cca 2537 Ala Val Asp Gly Ala Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro 765 770 775 tcc ctg tct gcc att gtt gct gca ttc gcg cac acc cgt cgc gat acc 2585 Ser Leu Ser Ala Ile Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr 780 785 790 795 ggt ttg agc ctc gag gct gtt tct gac ctc gag ccg tac tgg gaa gca 2633 Gly Leu Ser Leu Glu Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala 800 805 810 gtg cgc gga ctg tac ctg cca ttt gag tct gga acc cca ggc cca acc 2681 Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr 815 820 825 ggt cgc gtc tac cgc cac gaa atc cca ggc gga cag ttg tcc aac ctg 2729 Gly Arg Val Tyr Arg His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu 830 835 840 cgt gca cag gcc acc gca ctg ggc ctt gcg gat cgt ttc gaa ctc atc 2777 Arg Ala Gln Ala Thr Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile 845 850 855 gaa gac aac tac gca gcc gtt aat gag atg ctg gga cgc cca acc aag 2825 Glu Asp Asn Tyr Ala Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys 860 865 870 875 gtc acc cca tcc tcc aag gtt gtt ggc gac ctc gca ctc cac ctc gtt 2873 Val Thr Pro Ser Ser Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val 880 885 890 ggt gcg ggt gtg gat cca gca gac ttt gct gcc gat cca caa aag tac 2921 Gly Ala Gly Val Asp Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr 895 900 905 gac atc cca gac tct gtc atc gcg ttc ctg cgc ggc gag ctt ggt aac 2969 Asp Ile Pro Asp Ser Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn 910 915 920 cct cca ggt ggc tgg cca gag cca ctg cgc acc cgc gca ctg gaa ggc 3017 Pro Pro Gly Gly Trp Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly 925 930 935 cgc tcc gaa ggc aag gca cct ctg acg gaa gtt cct gag gaa gag cag 3065 Arg Ser Glu Gly Lys Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln 940 945 950 955 gcg cac ctc gac gct gat gat tcc aag gaa cgt cgc aat agc ctc aac 3113 Ala His Leu Asp Ala Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn 960 965 970 cgc ctg ctg ttc ccg aag cca acc gaa gag ttc ctc gag cac cgt cgc 3161 Arg Leu Leu Phe Pro Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg 975 980 985 cgc ttc ggc aac acc tct gcg ctg gat gat cgt gaa ttc ttc tac ggc 3209 Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly 990 995 1000 ctg gtc gaa ggc cgc gag act ttg atc cgc ctg cca gat gtg cgc acc 3257 Leu Val Glu Gly Arg Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr 1005 1010 1015 cca ctg ctt gtt cgc ctg gat gcg atc tct gag cca gac gat aag ggt 3305 Pro Leu Leu Val Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly 1020 1025 1030 1035 atg cgc aat gtt gtg gcc aac gtc aac ggc cag atc cgc cca atg cgt 3353 Met Arg Asn Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg 1040 1045 1050 gtg cgt gac cgc tcc gtt gag tct gtc acc gca acc gca gaa aag gca 3401 Val Arg Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala 1055 1060 1065 gat tcc tcc aac aag ggc cat gtt gct gca cca ttc gct ggt gtt gtc 3449 Asp Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val 1070 1075 1080 acc gtg act gtt gct gaa ggt gat gag gtc aag gct gga gat gca gtc 3497 Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val 1085 1090 1095 gca atc atc gag gct atg aag atg gaa gca aca atc act gct tct gtt 3545 Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val 1100 1105 1110 1115 gac ggc aaa atc gat cgc gtt gtg gtt cct gct gca acg aag gtg gaa 3593 Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu 1120 1125 1130 ggt ggc gac ttg atc gtc gtc gtt tcc taa 3623 Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser 1135 1140 <210> 23 <211> 1140 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1140) <223> Pyc, amino acid sequence of C. glutamicum pyruvate carboxylase <400> 23 Val Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly 35 40 45 Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr 100 105 110 Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125 Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu 130 135 140 Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg 165 170 175 Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu 210 215 220 Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser 225 230 235 240 Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His 245 250 255 Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe 260 265 270 Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln 290 295 300 Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys 305 310 315 320 Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu 325 330 335 Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile 340 345 350 Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile 355 360 365 Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala 370 375 380 Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400 Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile 420 425 430 Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg 435 440 445 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro 450 455 460 Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val 465 470 475 480 Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro 485 490 495 Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser 500 505 510 Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu 515 520 525 Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala 530 535 540 His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu 565 570 575 Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu 580 585 590 Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val 595 600 605 Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro 610 615 620 Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser 625 630 635 640 Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln 645 650 655 Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala 660 665 670 Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys 675 680 685 Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys 690 695 700 Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg 705 710 715 720 Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp 725 730 735 Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala 740 745 750 Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala 755 760 765 Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile 770 775 780 Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu 785 790 795 800 Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr 805 810 815 Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg 820 825 830 His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr 835 840 845 Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala 850 855 860 Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser 865 870 875 880 Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp 885 890 895 Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser 900 905 910 Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp 915 920 925 Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys 930 935 940 Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala 945 950 955 960 Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro 965 970 975 Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr 980 985 990 Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg 995 1000 1005 Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg 1010 1015 1020 Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val 1025 1030 1035 1040 Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser 1045 1050 1055 Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys 1060 1065 1070 Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala 1075 1080 1085 Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala 1090 1095 1100 Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp 1105 1110 1115 1120 Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile 1125 1130 1135 Val Val Val Ser 1140 <210> 24 <211> 3615 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (193)..(3612) <223> pycP458S, DNA sequence encoding C. glutamicum pyruvate carboxylase with P458S substitution and sod-promoter <400> 24 tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60 ttcgttgcaa tataaacaaa aaggcctctc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120 gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180 gattttttac cc gtg tcg act cac aca tct tca acg ctt cca gca 225 Val Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala 1 5 10 ttc aaa aag atc ttg gta gca aac cgc ggc gaa atc gcg gtc cgt gct 273 Phe Lys Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala 15 20 25 ttc cgt gca gca ctc gaa acc ggt gca gcc acg gta gct att tac ccc 321 Phe Arg Ala Ala Leu Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro 30 35 40 cgt gaa gat cgg gga tca ttc cac cgc tct ttt gct tct gaa gct gtc 369 Arg Glu Asp Arg Gly Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val 45 50 55 cgc att ggt acc gaa ggc tca cca gtc aag gcg tac ctg gac atc gat 417 Arg Ile Gly Thr Glu Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp 60 65 70 75 gaa att atc ggt gca gct aaa aaa gtt aaa gca gat gcc att tac ccg 465 Glu Ile Ile Gly Ala Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro 80 85 90 gga tac ggc ttc ctg tct gaa aat gcc cag ctt gcc cgc gag tgt gcg 513 Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala 95 100 105 gaa aac ggc att act ttt att ggc cca acc cca gag gtt ctt gat ctc 561 Glu Asn Gly Ile Thr Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu 110 115 120 acc ggt gat aag tct cgc gcg gta acc gcc gcg aag aag gct ggt ctg 609 Thr Gly Asp Lys Ser Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu 125 130 135 cca gtt ttg gcg gaa tcc acc ccg agc aaa aac atc gat gag atc gtt 657 Pro Val Leu Ala Glu Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val 140 145 150 155 aaa agc gct gaa ggc cag act tac ccc atc ttt gtg aag gca gtt gcc 705 Lys Ser Ala Glu Gly Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala 160 165 170 ggt ggt ggc gga cgc ggt atg cgt ttt gtt gct tca cct gat gag ctt 753 Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu 175 180 185 cgc aaa tta gca aca gaa gca tct cgt gaa gct gaa gcg gct ttc ggc 801 Arg Lys Leu Ala Thr Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly 190 195 200 gat ggc gcg gta tat gtc gaa cgt gct gtg att aac cct cag cat att 849 Asp Gly Ala Val Tyr Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile 205 210 215 gaa gtg cag atc ctt ggc gat cac act gga gaa gtt gta cac ctt tat 897 Glu Val Gln Ile Leu Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr 220 225 230 235 gaa cgt gac tgc tca ctg cag cgt cgt cac caa aaa gtt gtc gaa att 945 Glu Arg Asp Cys Ser Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile 240 245 250 gcg cca gca cag cat ttg gat cca gaa ctg cgt gat cgc att tgt gcg 993 Ala Pro Ala Gln His Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala 255 260 265 gat gca gta aag ttc tgc cgc tcc att ggt tac cag ggc gcg gga acc 1041 Asp Ala Val Lys Phe Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr 270 275 280 gtg gaa ttc ttg gtc gat gaa aag ggc aac cac gtc ttc atc gaa atg 1089 Val Glu Phe Leu Val Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met 285 290 295 aac cca cgt atc cag gtt gag cac acc gtg act gaa gaa gtc acc gag 1137 Asn Pro Arg Ile Gln Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu 300 305 310 315 gtg gac ctg gtg aag gcg cag atg cgc ttg gct gct ggt gca acc ttg 1185 Val Asp Leu Val Lys Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu 320 325 330 aag gaa ttg ggt ctg acc caa gat aag atc aag acc cac ggt gca gca 1233 Lys Glu Leu Gly Leu Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala 335 340 345 ctg cag tgc cgc atc acc acg gaa gat cca aac aac ggc ttc cgc cca 1281 Leu Gln Cys Arg Ile Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro 350 355 360 gat acc gga act atc acc gcg tac cgc tca cca ggc gga gct ggc gtt 1329 Asp Thr Gly Thr Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val 365 370 375 cgt ctt gac ggt gca gct cag ctc ggt ggc gaa atc acc gca cac ttt 1377 Arg Leu Asp Gly Ala Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe 380 385 390 395 gac tcc atg ctg gtg aaa atg acc tgc cgt ggt tcc gac ttt gaa act 1425 Asp Ser Met Leu Val Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr 400 405 410 gct gtt gct cgt gca cag cgc gcg ttg gct gag ttc acc gtg tct ggt 1473 Ala Val Ala Arg Ala Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly 415 420 425 gtt gca acc aac att ggt ttc ttg cgt gcg ttg ctg cgg gaa gag gac 1521 Val Ala Thr Asn Ile Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp 430 435 440 ttc act tcc aag cgc atc gcc acc gga ttc att gcc gat cac tcg cac 1569 Phe Thr Ser Lys Arg Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Ser His 445 450 455 ctc ctt cag gct cca cct gct gat gat gag cag gga cgc atc ctg gat 1617 Leu Leu Gln Ala Pro Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp 460 465 470 475 tac ttg gca gat gtc acc gtg aac aag cct cat ggt gtg cgt cca aag 1665 Tyr Leu Ala Asp Val Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys 480 485 490 gat gtt gca gct cct atc gat aag ctg cct aac atc aag gat ctg cca 1713 Asp Val Ala Ala Pro Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro 495 500 505 ctg cca cgc ggt tcc cgt gac cgc ctg aag cag ctt ggc cca gcc gcg 1761 Leu Pro Arg Gly Ser Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala 510 515 520 ttt gct cgt gat ctc cgt gag cag gac gca ctg gca gtt act gat acc 1809 Phe Ala Arg Asp Leu Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr 525 530 535 acc ttc cgc gat gca cac cag tct ttg ctt gcg acc cga gtc cgc tca 1857 Thr Phe Arg Asp Ala His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser 540 545 550 555 ttc gca ctg aag cct gcg gca gag gcc gtc gca aag ctg act cct gag 1905 Phe Ala Leu Lys Pro Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu 560 565 570 ctt ttg tcc gtg gag gcc tgg ggc ggc gcg acc tac gat gtg gcg atg 1953 Leu Leu Ser Val Glu Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met 575 580 585 cgt ttc ctc ttt gag gat ccg tgg gac agg ctc gac gag ctg cgc gag 2001 Arg Phe Leu Phe Glu Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu 590 595 600 gcg atg ccg aat gta aac att cag atg ctg ctt cgc ggc cgc aac acc 2049 Ala Met Pro Asn Val Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr 605 610 615 gtg gga tac acc ccg tac cca gac tcc gtc tgc cgc gcg ttt gtt aag 2097 Val Gly Tyr Thr Pro Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys 620 625 630 635 gaa gct gcc agc tcc ggc gtg gac atc ttc cgc atc ttc gac gcg ctt 2145 Glu Ala Ala Ser Ser Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu 640 645 650 aac gac gtc tcc cag atg cgt cca gca atc gac gca gtc ctg gag acc 2193 Asn Asp Val Ser Gln Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr 655 660 665 aac acc gcg gta gcc gag gtg gct atg gct tat tct ggt gat ctc tct 2241 Asn Thr Ala Val Ala Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser 670 675 680 gat cca aat gaa aag ctc tac acc ctg gat tac tac cta aag atg gca 2289 Asp Pro Asn Glu Lys Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala 685 690 695 gag gag atc gtc aag tct ggc gct cac atc ttg gcc att aag gat atg 2337 Glu Glu Ile Val Lys Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met 700 705 710 715 gct ggt ctg ctt cgc cca gct gcg gta acc aag ctg gtc acc gca ctg 2385 Ala Gly Leu Leu Arg Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu 720 725 730 cgc cgt gaa ttc gat ctg cca gtg cac gtg cac acc cac gac act gcg 2433 Arg Arg Glu Phe Asp Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala 735 740 745 ggt ggc cag ctg gca acc tac ttt gct gca gct caa gct ggt gca gat 2481 Gly Gly Gln Leu Ala Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp 750 755 760 gct gtt gac ggt gct tcc gca cca ctg tct ggc acc acc tcc cag cca 2529 Ala Val Asp Gly Ala Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro 765 770 775 tcc ctg tct gcc att gtt gct gca ttc gcg cac acc cgt cgc gat acc 2577 Ser Leu Ser Ala Ile Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr 780 785 790 795 ggt ttg agc ctc gag gct gtt tct gac ctc gag ccg tac tgg gaa gca 2625 Gly Leu Ser Leu Glu Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala 800 805 810 gtg cgc gga ctg tac ctg cca ttt gag tct gga acc cca ggc cca acc 2673 Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr 815 820 825 ggt cgc gtc tac cgc cac gaa atc cca ggc gga cag ttg tcc aac ctg 2721 Gly Arg Val Tyr Arg His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu 830 835 840 cgt gca cag gcc acc gca ctg ggc ctt gcg gat cgt ttc gaa ctc atc 2769 Arg Ala Gln Ala Thr Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile 845 850 855 gaa gac aac tac gca gcc gtt aat gag atg ctg gga cgc cca acc aag 2817 Glu Asp Asn Tyr Ala Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys 860 865 870 875 gtc acc cca tcc tcc aag gtt gtt ggc gac ctc gca ctc cac ctc gtt 2865 Val Thr Pro Ser Ser Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val 880 885 890 ggt gcg ggt gtg gat cca gca gac ttt gct gcc gat cca caa aag tac 2913 Gly Ala Gly Val Asp Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr 895 900 905 gac atc cca gac tct gtc atc gcg ttc ctg cgc ggc gag ctt ggt aac 2961 Asp Ile Pro Asp Ser Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn 910 915 920 cct cca ggt ggc tgg cca gag cca ctg cgc acc cgc gca ctg gaa ggc 3009 Pro Pro Gly Gly Trp Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly 925 930 935 cgc tcc gaa ggc aag gca cct ctg acg gaa gtt cct gag gaa gag cag 3057 Arg Ser Glu Gly Lys Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln 940 945 950 955 gcg cac ctc gac gct gat gat tcc aag gaa cgt cgc aat agc ctc aac 3105 Ala His Leu Asp Ala Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn 960 965 970 cgc ctg ctg ttc ccg aag cca acc gaa gag ttc ctc gag cac cgt cgc 3153 Arg Leu Leu Phe Pro Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg 975 980 985 cgc ttc ggc aac acc tct gcg ctg gat gat cgt gaa ttc ttc tac ggc 3201 Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly 990 995 1000 ctg gtc gaa ggc cgc gag act ttg atc cgc ctg cca gat gtg cgc acc 3249 Leu Val Glu Gly Arg Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr 1005 1010 1015 cca ctg ctt gtt cgc ctg gat gcg atc tct gag cca gac gat aag ggt 3297 Pro Leu Leu Val Arg Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly 1020 1025 1030 1035 atg cgc aat gtt gtg gcc aac gtc aac ggc cag atc cgc cca atg cgt 3345 Met Arg Asn Val Val Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg 1040 1045 1050 gtg cgt gac cgc tcc gtt gag tct gtc acc gca acc gca gaa aag gca 3393 Val Arg Asp Arg Ser Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala 1055 1060 1065 gat tcc tcc aac aag ggc cat gtt gct gca cca ttc gct ggt gtt gtc 3441 Asp Ser Ser Asn Lys Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val 1070 1075 1080 acc gtg act gtt gct gaa ggt gat gag gtc aag gct gga gat gca gtc 3489 Thr Val Thr Val Ala Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val 1085 1090 1095 gca atc atc gag gct atg aag atg gaa gca aca atc act gct tct gtt 3537 Ala Ile Ile Glu Ala Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val 1100 1105 1110 1115 gac ggc aaa atc gat cgc gtt gtg gtt cct gct gca acg aag gtg gaa 3585 Asp Gly Lys Ile Asp Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu 1120 1125 1130 ggt ggc gac ttg atc gtc gtc gtt tcc taa 3615 Gly Gly Asp Leu Ile Val Val Val Ser 1135 1140 <210> 25 <211> 1140 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1140) <223> PycP458S amino acid sequence of C. glutamicum pyruvate carboxylase with P458S substitution <400> 25 Val Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly 35 40 45 Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr 100 105 110 Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125 Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu 130 135 140 Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg 165 170 175 Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu 210 215 220 Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser 225 230 235 240 Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His 245 250 255 Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe 260 265 270 Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln 290 295 300 Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys 305 310 315 320 Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu 325 330 335 Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile 340 345 350 Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile 355 360 365 Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala 370 375 380 Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400 Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile 420 425 430 Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg 435 440 445 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Ser His Leu Leu Gln Ala Pro 450 455 460 Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val 465 470 475 480 Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro 485 490 495 Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser 500 505 510 Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu 515 520 525 Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala 530 535 540 His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu 565 570 575 Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu 580 585 590 Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val 595 600 605 Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro 610 615 620 Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser 625 630 635 640 Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln 645 650 655 Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala 660 665 670 Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys 675 680 685 Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys 690 695 700 Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg 705 710 715 720 Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp 725 730 735 Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala 740 745 750 Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala 755 760 765 Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile 770 775 780 Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu 785 790 795 800 Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr 805 810 815 Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg 820 825 830 His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr 835 840 845 Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala 850 855 860 Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser 865 870 875 880 Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp 885 890 895 Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser 900 905 910 Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp 915 920 925 Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys 930 935 940 Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala 945 950 955 960 Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro 965 970 975 Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr 980 985 990 Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg 995 1000 1005 Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg 1010 1015 1020 Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val 1025 1030 1035 1040 Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser 1045 1050 1055 Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys 1060 1065 1070 Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala 1075 1080 1085 Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala 1090 1095 1100 Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp 1105 1110 1115 1120 Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile 1125 1130 1135 Val Val Val Ser 1140 <210> 26 <211> 2367 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (151)..(2364) <223> icd, DNA sequence encoding wildtype C. glutamicum isocitrate dehydrogenase including 150 bp of upstream sequence <400> 26 aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg tttccatgcg 60 gggctgaaac tgccaccata ggcgccagca attagtagaa cactgtattc taggtagctg 120 aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc atg gct aag atc atc tgg acc cgc 174 Met Ala Lys Ile Ile Trp Thr Arg 1 5 acc gac gaa gca ccg ctg ctc gcg acc tac tcg ctg aag ccg gtc gtc 222 Thr Asp Glu Ala Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Ser Leu Lys Pro Val Val 10 15 20 gag gca ttt gct gct acc gcg ggc att gag gtc gag acc cgg gac att 270 Glu Ala Phe Ala Ala Thr Ala Gly Ile Glu Val Glu Thr Arg Asp Ile 25 30 35 40 tca ctc gct gga cgc atc ctc gcc cag ttc cca gag cgc ctc acc gaa 318 Ser Leu Ala Gly Arg Ile Leu Ala Gln Phe Pro Glu Arg Leu Thr Glu 45 50 55 gat cag aag gta ggc aac gca ctc gca gaa ctc ggc gag ctt gct aag 366 Asp Gln Lys Val Gly Asn Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Leu Ala Lys 60 65 70 act cct gaa gca aac atc att aag ctt cca aac atc tcc gct tct gtt 414 Thr Pro Glu Ala Asn Ile Ile Lys Leu Pro Asn Ile Ser Ala Ser Val 75 80 85 cca cag ctc aag gct gct att aag gaa ctg cag gac cag ggc tac gac 462 Pro Gln Leu Lys Ala Ala Ile Lys Glu Leu Gln Asp Gln Gly Tyr Asp 90 95 100 atc cca gaa ctg cct gat aac gcc acc acc gac gag gaa aaa gac atc 510 Ile Pro Glu Leu Pro Asp Asn Ala Thr Thr Asp Glu Glu Lys Asp Ile 105 110 115 120 ctc gca cgc tac aac gct gtt aag ggt tcc gct gtg aac cca gtg ctg 558 Leu Ala Arg Tyr Asn Ala Val Lys Gly Ser Ala Val Asn Pro Val Leu 125 130 135 cgt gaa ggc aac tct gac cgc cgc gca cca atc gct gtc aag aac ttt 606 Arg Glu Gly Asn Ser Asp Arg Arg Ala Pro Ile Ala Val Lys Asn Phe 140 145 150 gtt aag aag ttc cca cac cgc atg ggc gag tgg tct gca gat tcc aag 654 Val Lys Lys Phe Pro His Arg Met Gly Glu Trp Ser Ala Asp Ser Lys 155 160 165 acc aac gtt gca acc atg gat gca aac gac ttc cgc cac aac gag aag 702 Thr Asn Val Ala Thr Met Asp Ala Asn Asp Phe Arg His Asn Glu Lys 170 175 180 tcc atc atc ctc gac gct gct gat gaa gtt cag atc aag cac atc gca 750 Ser Ile Ile Leu Asp Ala Ala Asp Glu Val Gln Ile Lys His Ile Ala 185 190 195 200 gct gac ggc acc gag acc atc ctc aag gac agc ctc aag ctt ctt gaa 798 Ala Asp Gly Thr Glu Thr Ile Leu Lys Asp Ser Leu Lys Leu Leu Glu 205 210 215 ggc gaa gtt cta gac gga acc gtt ctg tcc gca aag gca ctg gac gca 846 Gly Glu Val Leu Asp Gly Thr Val Leu Ser Ala Lys Ala Leu Asp Ala 220 225 230 ttc ctt ctc gag cag gtc gct cgc gca aag gca gaa ggt atc ctc ttc 894 Phe Leu Leu Glu Gln Val Ala Arg Ala Lys Ala Glu Gly Ile Leu Phe 235 240 245 tcc gca cac ctg aag gcc acc atg atg aag gtc tcc gac cca atc atc 942 Ser Ala His Leu Lys Ala Thr Met Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Ile 250 255 260 ttc ggc cac gtt gtg cgc gct tac ttc gca gac gtt ttc gca cag tac 990 Phe Gly His Val Val Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Val Phe Ala Gln Tyr 265 270 275 280 ggt gag cag ctg ctc gca gct ggc ctc aac ggc gaa aac ggc ctc gct 1038 Gly Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly Leu Asn Gly Glu Asn Gly Leu Ala 285 290 295 gca atc ctc tcc ggc ttg gag tcc ctg gac aac ggc gaa gaa atc aag 1086 Ala Ile Leu Ser Gly Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gly Glu Glu Ile Lys 300 305 310 gct gca ttc gag aag ggc ttg gaa gac ggc cca gac ctg gcc atg gtt 1134 Ala Ala Phe Glu Lys Gly Leu Glu Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val 315 320 325 aac tcc gct cgc ggc atc acc aac ctg cat gtc cct tcc gat gtc atc 1182 Asn Ser Ala Arg Gly Ile Thr Asn Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile 330 335 340 gtg gac gct tcc atg cca gca atg att cgt acc tcc ggc cac atg tgg 1230 Val Asp Ala Ser Met Pro Ala Met Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp 345 350 355 360 aac aaa gac gac cag gag cag gac acc ctg gca atc atc cca gac tcc 1278 Asn Lys Asp Asp Gln Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser 365 370 375 tcc tac gct ggc gtc tac cag acc gtt atc gaa gac tgc cgc aag aac 1326 Ser Tyr Ala Gly Val Tyr Gln Thr Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn 380 385 390 ggc gca ttc gat cca acc acc atg ggt acc gtc cct aac gtt ggt ctg 1374 Gly Ala Phe Asp Pro Thr Thr Met Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu 395 400 405 atg gct cag aag gct gaa gag tac ggc tcc cat gac aag acc ttc cgc 1422 Met Ala Gln Lys Ala Glu Glu Tyr Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg 410 415 420 atc gaa gca gac ggt gtg gtt cag gtt gtt tcc tcc aac ggc gac gtt 1470 Ile Glu Ala Asp Gly Val Val Gln Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val 425 430 435 440 ctc atc gag cac gac gtt gag gca aat gac atc tgg cgt gca tgc cag 1518 Leu Ile Glu His Asp Val Glu Ala Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln 445 450 455 gtc aag gat gcc cca atc cag gat tgg gta aag ctt gct gtc acc cgc 1566 Val Lys Asp Ala Pro Ile Gln Asp Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg 460 465 470 tcc cgt ctc tcc gga atg cct gca gtg ttc tgg ttg gat cca gag cgc 1614 Ser Arg Leu Ser Gly Met Pro Ala Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg 475 480 485 gca cac gac cgc aac ctg gct tcc ctc gtt gag aag tac ctg gct gac 1662 Ala His Asp Arg Asn Leu Ala Ser Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp 490 495 500 cac gac acc gag ggc ctg gac atc cag atc ctc tcc cct gtt gag gca 1710 His Asp Thr Glu Gly Leu Asp Ile Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala 505 510 515 520 acc cag ctc tcc atc gac cgc atc cgc cgt ggc gag gac acc atc tct 1758 Thr Gln Leu Ser Ile Asp Arg Ile Arg Arg Gly Glu Asp Thr Ile Ser 525 530 535 gtc acc ggt aac gtt ctg cgt gac tac aac acc gac ctc ttc cca atc 1806 Val Thr Gly Asn Val Leu Arg Asp Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Pro Ile 540 545 550 ctg gag ctg ggc acc tct gca aag atg ctg tct gtc gtt cct ttg atg 1854 Leu Glu Leu Gly Thr Ser Ala Lys Met Leu Ser Val Val Pro Leu Met 555 560 565 gct ggc ggc gga ctg ttc gag acc ggt gct ggt gga tct gct cct aag 1902 Ala Gly Gly Gly Leu Phe Glu Thr Gly Ala Gly Gly Ser Ala Pro Lys 570 575 580 cac gtc cag cag gtt cag gaa gaa aac cac ctg cgt tgg gat tcc ctc 1950 His Val Gln Gln Val Gln Glu Glu Asn His Leu Arg Trp Asp Ser Leu 585 590 595 600 ggt gag ttc ctc gca ctg gct gag tcc ttc cgc cac gag ctc aac aac 1998 Gly Glu Phe Leu Ala Leu Ala Glu Ser Phe Arg His Glu Leu Asn Asn 605 610 615 aac ggc aac acc aag gcc ggc gtt ctg gct gac gct ctg gac aag gca 2046 Asn Gly Asn Thr Lys Ala Gly Val Leu Ala Asp Ala Leu Asp Lys Ala 620 625 630 act gag aag ctg ctg aac gaa gag aag tcc cca tcc cgc aag gtt ggc 2094 Thr Glu Lys Leu Leu Asn Glu Glu Lys Ser Pro Ser Arg Lys Val Gly 635 640 645 gag atc gac aac cgt ggc tcc cac ttc tgg ctg acc aag ttc tgg gct 2142 Glu Ile Asp Asn Arg Gly Ser His Phe Trp Leu Thr Lys Phe Trp Ala 650 655 660 gac gag ctc gct gct cag acc gag gac gca gat ctg gct gct acc ttc 2190 Asp Glu Leu Ala Ala Gln Thr Glu Asp Ala Asp Leu Ala Ala Thr Phe 665 670 675 680 gca cca gtc gca gaa gca ctg aac aca ggc gct gca gac atc gat gct 2238 Ala Pro Val Ala Glu Ala Leu Asn Thr Gly Ala Ala Asp Ile Asp Ala 685 690 695 gca ctg ctc gca gtt cag ggt gga gca act gac ctt ggt ggc tac tac 2286 Ala Leu Leu Ala Val Gln Gly Gly Ala Thr Asp Leu Gly Gly Tyr Tyr 700 705 710 tcc cct aac gag gag aag ctc acc aac atc atg cgc cca gtc gca cag 2334 Ser Pro Asn Glu Glu Lys Leu Thr Asn Ile Met Arg Pro Val Ala Gln 715 720 725 ttc aac gag atc gtt gac gca ctg aag aag taa 2367 Phe Asn Glu Ile Val Asp Ala Leu Lys Lys 730 735 <210> 27 <211> 738 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(738) <223> Icd, amino acid sequence of C. glutamicum isocitrate dehydrogenase <400> 27 Met Ala Lys Ile Ile Trp Thr Arg Thr Asp Glu Ala Pro Leu Leu Ala 1 5 10 15 Thr Tyr Ser Leu Lys Pro Val Val Glu Ala Phe Ala Ala Thr Ala Gly 20 25 30 Ile Glu Val Glu Thr Arg Asp Ile Ser Leu Ala Gly Arg Ile Leu Ala 35 40 45 Gln Phe Pro Glu Arg Leu Thr Glu Asp Gln Lys Val Gly Asn Ala Leu 50 55 60 Ala Glu Leu Gly Glu Leu Ala Lys Thr Pro Glu Ala Asn Ile Ile Lys 65 70 75 80 Leu Pro Asn Ile Ser Ala Ser Val Pro Gln Leu Lys Ala Ala Ile Lys 85 90 95 Glu Leu Gln Asp Gln Gly Tyr Asp Ile Pro Glu Leu Pro Asp Asn Ala 100 105 110 Thr Thr Asp Glu Glu Lys Asp Ile Leu Ala Arg Tyr Asn Ala Val Lys 115 120 125 Gly Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Arg Glu Gly Asn Ser Asp Arg Arg 130 135 140 Ala Pro Ile Ala Val Lys Asn Phe Val Lys Lys Phe Pro His Arg Met 145 150 155 160 Gly Glu Trp Ser Ala Asp Ser Lys Thr Asn Val Ala Thr Met Asp Ala 165 170 175 Asn Asp Phe Arg His Asn Glu Lys Ser Ile Ile Leu Asp Ala Ala Asp 180 185 190 Glu Val Gln Ile Lys His Ile Ala Ala Asp Gly Thr Glu Thr Ile Leu 195 200 205 Lys Asp Ser Leu Lys Leu Leu Glu Gly Glu Val Leu Asp Gly Thr Val 210 215 220 Leu Ser Ala Lys Ala Leu Asp Ala Phe Leu Leu Glu Gln Val Ala Arg 225 230 235 240 Ala Lys Ala Glu Gly Ile Leu Phe Ser Ala His Leu Lys Ala Thr Met 245 250 255 Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Ile Phe Gly His Val Val Arg Ala Tyr 260 265 270 Phe Ala Asp Val Phe Ala Gln Tyr Gly Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly 275 280 285 Leu Asn Gly Glu Asn Gly Leu Ala Ala Ile Leu Ser Gly Leu Glu Ser 290 295 300 Leu Asp Asn Gly Glu Glu Ile Lys Ala Ala Phe Glu Lys Gly Leu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val Asn Ser Ala Arg Gly Ile Thr Asn 325 330 335 Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile Val Asp Ala Ser Met Pro Ala Met 340 345 350 Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp Asn Lys Asp Asp Gln Glu Gln Asp 355 360 365 Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser Ser Tyr Ala Gly Val Tyr Gln Thr 370 375 380 Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn Gly Ala Phe Asp Pro Thr Thr Met 385 390 395 400 Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu Met Ala Gln Lys Ala Glu Glu Tyr 405 410 415 Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg Ile Glu Ala Asp Gly Val Val Gln 420 425 430 Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val Leu Ile Glu His Asp Val Glu Ala 435 440 445 Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln Val Lys Asp Ala Pro Ile Gln Asp 450 455 460 Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg Ser Arg Leu Ser Gly Met Pro Ala 465 470 475 480 Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg Ala His Asp Arg Asn Leu Ala Ser 485 490 495 Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp His Asp Thr Glu Gly Leu Asp Ile 500 505 510 Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala Thr Gln Leu Ser Ile Asp Arg Ile 515 520 525 Arg Arg Gly Glu Asp Thr Ile Ser Val Thr Gly Asn Val Leu Arg Asp 530 535 540 Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Pro Ile Leu Glu Leu Gly Thr Ser Ala Lys 545 550 555 560 Met Leu Ser Val Val Pro Leu Met Ala Gly Gly Gly Leu Phe Glu Thr 565 570 575 Gly Ala Gly Gly Ser Ala Pro Lys His Val Gln Gln Val Gln Glu Glu 580 585 590 Asn His Leu Arg Trp Asp Ser Leu Gly Glu Phe Leu Ala Leu Ala Glu 595 600 605 Ser Phe Arg His Glu Leu Asn Asn Asn Gly Asn Thr Lys Ala Gly Val 610 615 620 Leu Ala Asp Ala Leu Asp Lys Ala Thr Glu Lys Leu Leu Asn Glu Glu 625 630 635 640 Lys Ser Pro Ser Arg Lys Val Gly Glu Ile Asp Asn Arg Gly Ser His 645 650 655 Phe Trp Leu Thr Lys Phe Trp Ala Asp Glu Leu Ala Ala Gln Thr Glu 660 665 670 Asp Ala Asp Leu Ala Ala Thr Phe Ala Pro Val Ala Glu Ala Leu Asn 675 680 685 Thr Gly Ala Ala Asp Ile Asp Ala Ala Leu Leu Ala Val Gln Gly Gly 690 695 700 Ala Thr Asp Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser Pro Asn Glu Glu Lys Leu Thr 705 710 715 720 Asn Ile Met Arg Pro Val Ala Gln Phe Asn Glu Ile Val Asp Ala Leu 725 730 735 Lys Lys <210> 28 <211> 2367 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (151)..(2364) <223> icdA1G, DNA sequence encoding C. glutamicum isocitrate dehydrogenase with substitution ATG -> GTG including 150 bp of upstream sequence <400> 28 aggcctcgac cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg tttccatgcg 60 gggctgaaac tgccaccata ggcgccagca attagtagaa cactgtattc taggtagctg 120 aacaaaagag cccatcaacc aaggagactc gtg gct aag atc atc tgg acc cgc 174 Val Ala Lys Ile Ile Trp Thr Arg 1 5 acc gac gaa gca ccg ctg ctc gcg acc tac tcg ctg aag ccg gtc gtc 222 Thr Asp Glu Ala Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Ser Leu Lys Pro Val Val 10 15 20 gag gca ttt gct gct acc gcg ggc att gag gtc gag acc cgg gac att 270 Glu Ala Phe Ala Ala Thr Ala Gly Ile Glu Val Glu Thr Arg Asp Ile 25 30 35 40 tca ctc gct gga cgc atc ctc gcc cag ttc cca gag cgc ctc acc gaa 318 Ser Leu Ala Gly Arg Ile Leu Ala Gln Phe Pro Glu Arg Leu Thr Glu 45 50 55 gat cag aag gta ggc aac gca ctc gca gaa ctc ggc gag ctt gct aag 366 Asp Gln Lys Val Gly Asn Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Leu Ala Lys 60 65 70 act cct gaa gca aac atc att aag ctt cca aac atc tcc gct tct gtt 414 Thr Pro Glu Ala Asn Ile Ile Lys Leu Pro Asn Ile Ser Ala Ser Val 75 80 85 cca cag ctc aag gct gct att aag gaa ctg cag gac cag ggc tac gac 462 Pro Gln Leu Lys Ala Ala Ile Lys Glu Leu Gln Asp Gln Gly Tyr Asp 90 95 100 atc cca gaa ctg cct gat aac gcc acc acc gac gag gaa aaa gac atc 510 Ile Pro Glu Leu Pro Asp Asn Ala Thr Thr Asp Glu Glu Lys Asp Ile 105 110 115 120 ctc gca cgc tac aac gct gtt aag ggt tcc gct gtg aac cca gtg ctg 558 Leu Ala Arg Tyr Asn Ala Val Lys Gly Ser Ala Val Asn Pro Val Leu 125 130 135 cgt gaa ggc aac tct gac cgc cgc gca cca atc gct gtc aag aac ttt 606 Arg Glu Gly Asn Ser Asp Arg Arg Ala Pro Ile Ala Val Lys Asn Phe 140 145 150 gtt aag aag ttc cca cac cgc atg ggc gag tgg tct gca gat tcc aag 654 Val Lys Lys Phe Pro His Arg Met Gly Glu Trp Ser Ala Asp Ser Lys 155 160 165 acc aac gtt gca acc atg gat gca aac gac ttc cgc cac aac gag aag 702 Thr Asn Val Ala Thr Met Asp Ala Asn Asp Phe Arg His Asn Glu Lys 170 175 180 tcc atc atc ctc gac gct gct gat gaa gtt cag atc aag cac atc gca 750 Ser Ile Ile Leu Asp Ala Ala Asp Glu Val Gln Ile Lys His Ile Ala 185 190 195 200 gct gac ggc acc gag acc atc ctc aag gac agc ctc aag ctt ctt gaa 798 Ala Asp Gly Thr Glu Thr Ile Leu Lys Asp Ser Leu Lys Leu Leu Glu 205 210 215 ggc gaa gtt cta gac gga acc gtt ctg tcc gca aag gca ctg gac gca 846 Gly Glu Val Leu Asp Gly Thr Val Leu Ser Ala Lys Ala Leu Asp Ala 220 225 230 ttc ctt ctc gag cag gtc gct cgc gca aag gca gaa ggt atc ctc ttc 894 Phe Leu Leu Glu Gln Val Ala Arg Ala Lys Ala Glu Gly Ile Leu Phe 235 240 245 tcc gca cac ctg aag gcc acc atg atg aag gtc tcc gac cca atc atc 942 Ser Ala His Leu Lys Ala Thr Met Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Ile 250 255 260 ttc ggc cac gtt gtg cgc gct tac ttc gca gac gtt ttc gca cag tac 990 Phe Gly His Val Val Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Val Phe Ala Gln Tyr 265 270 275 280 ggt gag cag ctg ctc gca gct ggc ctc aac ggc gaa aac ggc ctc gct 1038 Gly Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly Leu Asn Gly Glu Asn Gly Leu Ala 285 290 295 gca atc ctc tcc ggc ttg gag tcc ctg gac aac ggc gaa gaa atc aag 1086 Ala Ile Leu Ser Gly Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gly Glu Glu Ile Lys 300 305 310 gct gca ttc gag aag ggc ttg gaa gac ggc cca gac ctg gcc atg gtt 1134 Ala Ala Phe Glu Lys Gly Leu Glu Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val 315 320 325 aac tcc gct cgc ggc atc acc aac ctg cat gtc cct tcc gat gtc atc 1182 Asn Ser Ala Arg Gly Ile Thr Asn Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile 330 335 340 gtg gac gct tcc atg cca gca atg att cgt acc tcc ggc cac atg tgg 1230 Val Asp Ala Ser Met Pro Ala Met Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp 345 350 355 360 aac aaa gac gac cag gag cag gac acc ctg gca atc atc cca gac tcc 1278 Asn Lys Asp Asp Gln Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser 365 370 375 tcc tac gct ggc gtc tac cag acc gtt atc gaa gac tgc cgc aag aac 1326 Ser Tyr Ala Gly Val Tyr Gln Thr Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn 380 385 390 ggc gca ttc gat cca acc acc atg ggt acc gtc cct aac gtt ggt ctg 1374 Gly Ala Phe Asp Pro Thr Thr Met Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu 395 400 405 atg gct cag aag gct gaa gag tac ggc tcc cat gac aag acc ttc cgc 1422 Met Ala Gln Lys Ala Glu Glu Tyr Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg 410 415 420 atc gaa gca gac ggt gtg gtt cag gtt gtt tcc tcc aac ggc gac gtt 1470 Ile Glu Ala Asp Gly Val Val Gln Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val 425 430 435 440 ctc atc gag cac gac gtt gag gca aat gac atc tgg cgt gca tgc cag 1518 Leu Ile Glu His Asp Val Glu Ala Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln 445 450 455 gtc aag gat gcc cca atc cag gat tgg gta aag ctt gct gtc acc cgc 1566 Val Lys Asp Ala Pro Ile Gln Asp Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg 460 465 470 tcc cgt ctc tcc gga atg cct gca gtg ttc tgg ttg gat cca gag cgc 1614 Ser Arg Leu Ser Gly Met Pro Ala Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg 475 480 485 gca cac gac cgc aac ctg gct tcc ctc gtt gag aag tac ctg gct gac 1662 Ala His Asp Arg Asn Leu Ala Ser Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp 490 495 500 cac gac acc gag ggc ctg gac atc cag atc ctc tcc cct gtt gag gca 1710 His Asp Thr Glu Gly Leu Asp Ile Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala 505 510 515 520 acc cag ctc tcc atc gac cgc atc cgc cgt ggc gag gac acc atc tct 1758 Thr Gln Leu Ser Ile Asp Arg Ile Arg Arg Gly Glu Asp Thr Ile Ser 525 530 535 gtc acc ggt aac gtt ctg cgt gac tac aac acc gac ctc ttc cca atc 1806 Val Thr Gly Asn Val Leu Arg Asp Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Pro Ile 540 545 550 ctg gag ctg ggc acc tct gca aag atg ctg tct gtc gtt cct ttg atg 1854 Leu Glu Leu Gly Thr Ser Ala Lys Met Leu Ser Val Val Pro Leu Met 555 560 565 gct ggc ggc gga ctg ttc gag acc ggt gct ggt gga tct gct cct aag 1902 Ala Gly Gly Gly Leu Phe Glu Thr Gly Ala Gly Gly Ser Ala Pro Lys 570 575 580 cac gtc cag cag gtt cag gaa gaa aac cac ctg cgt tgg gat tcc ctc 1950 His Val Gln Gln Val Gln Glu Glu Asn His Leu Arg Trp Asp Ser Leu 585 590 595 600 ggt gag ttc ctc gca ctg gct gag tcc ttc cgc cac gag ctc aac aac 1998 Gly Glu Phe Leu Ala Leu Ala Glu Ser Phe Arg His Glu Leu Asn Asn 605 610 615 aac ggc aac acc aag gcc ggc gtt ctg gct gac gct ctg gac aag gca 2046 Asn Gly Asn Thr Lys Ala Gly Val Leu Ala Asp Ala Leu Asp Lys Ala 620 625 630 act gag aag ctg ctg aac gaa gag aag tcc cca tcc cgc aag gtt ggc 2094 Thr Glu Lys Leu Leu Asn Glu Glu Lys Ser Pro Ser Arg Lys Val Gly 635 640 645 gag atc gac aac cgt ggc tcc cac ttc tgg ctg acc aag ttc tgg gct 2142 Glu Ile Asp Asn Arg Gly Ser His Phe Trp Leu Thr Lys Phe Trp Ala 650 655 660 gac gag ctc gct gct cag acc gag gac gca gat ctg gct gct acc ttc 2190 Asp Glu Leu Ala Ala Gln Thr Glu Asp Ala Asp Leu Ala Ala Thr Phe 665 670 675 680 gca cca gtc gca gaa gca ctg aac aca ggc gct gca gac atc gat gct 2238 Ala Pro Val Ala Glu Ala Leu Asn Thr Gly Ala Ala Asp Ile Asp Ala 685 690 695 gca ctg ctc gca gtt cag ggt gga gca act gac ctt ggt ggc tac tac 2286 Ala Leu Leu Ala Val Gln Gly Gly Ala Thr Asp Leu Gly Gly Tyr Tyr 700 705 710 tcc cct aac gag gag aag ctc acc aac atc atg cgc cca gtc gca cag 2334 Ser Pro Asn Glu Glu Lys Leu Thr Asn Ile Met Arg Pro Val Ala Gln 715 720 725 ttc aac gag atc gtt gac gca ctg aag aag taa 2367 Phe Asn Glu Ile Val Asp Ala Leu Lys Lys 730 735 <210> 29 <211> 1208 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (201)..(1205) <223> fbp, DNA sequence encoding wildtype C. glutamicum fructose 1,6-bisphosphatase with natural promoter <400> 29 tcagccaccc gcctagtatg tcacgagttt ggtacgaaac ccccttttgg gtgtccagaa 60 tccaaaattc cgggcacaaa agtgcaacaa tagatgacgt gcgggttgat acagcccaag 120 cgccgataca tttataatgc gcctagatac gtgcaaccca cgtaaccagg tcagatcaag 180 tgccccagga ggcccttcag atg aac cta aag aac ccc gaa acg cca gac cgt 233 Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg 1 5 10 aac ctt gct atg gag ctg gtg cga gtt acg gaa gca gct gca ctg gct 281 Asn Leu Ala Met Glu Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala 15 20 25 tct gga cgt tgg gtt gga cgt ggc atg aag aat gaa ggc gac ggt gcc 329 Ser Gly Arg Trp Val Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala 30 35 40 gct gtt gac gcc atg cgc cag ctc atc aac tca gtg acc atg aag ggc 377 Ala Val Asp Ala Met Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly 45 50 55 gtc gtt gtt atc ggc gag ggc gaa aaa gac gaa gct cca atg ctg tac 425 Val Val Val Ile Gly Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr 60 65 70 75 aac ggc gaa gag gtc gga acc ggc ttt gga cct gag gtt gat atc gca 473 Asn Gly Glu Glu Val Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala 80 85 90 gtt gac cca gtt gac ggc acc acc ctg atg gct gag ggt cgc ccc aac 521 Val Asp Pro Val Asp Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn 95 100 105 gca att tcc att ctc gca gct gca gag cgt ggc acc atg tac gat cca 569 Ala Ile Ser Ile Leu Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro 110 115 120 tcc tcc gtc ttc tac atg aag aag atc gcc gtg gga cct gag gcc gca 617 Ser Ser Val Phe Tyr Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala 125 130 135 ggc aag atc gac atc gaa gct cca gtt gcc cac aac atc aac gcg gtg 665 Gly Lys Ile Asp Ile Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val 140 145 150 155 gca aag tcc aag gga atc aac cct tcc gac gtc acc gtt gtc gtg ctt 713 Ala Lys Ser Lys Gly Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu 160 165 170 gac cgt cct cgc cac atc gaa ctg atc gca gac att cgt cgt gca ggc 761 Asp Arg Pro Arg His Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly 175 180 185 gca aag gtt cgt ctc atc tcc gac ggc gac gtt gca ggt gca gtt gca 809 Ala Lys Val Arg Leu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala 190 195 200 gca gct cag gat tcc aac tcc gtg gac atc atg atg ggc acc ggc gga 857 Ala Ala Gln Asp Ser Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly 205 210 215 acc cca gaa ggc atc atc act gcg tgc gcc atg aag tgc atg ggt ggc 905 Thr Pro Glu Gly Ile Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly 220 225 230 235 gaa atc cag ggc atc ctg gcc cca atg aac gat ttc gag cgc cag aag 953 Glu Ile Gln Gly Ile Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys 240 245 250 gca cac gac gct ggt ctg gtt ctt gat cag gtt ctg cac acc aac gat 1001 Ala His Asp Ala Gly Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp 255 260 265 ctg gtg agc tcc gac aac tgc tac ttc gtg gca acc ggt gtg acc aac 1049 Leu Val Ser Ser Asp Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn 270 275 280 ggt gac atg ctc cgt ggc gtt tcc tac cgc gca aac ggc gca acc acc 1097 Gly Asp Met Leu Arg Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr 285 290 295 cgt tcc ctg gtt atg cgc gca aag tca ggc acc atc cgc cac atc gag 1145 Arg Ser Leu Val Met Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu 300 305 310 315 tct gtc cac cag ctg tcc aag ctg cag gaa tac tcc gtg gtt gac tac 1193 Ser Val His Gln Leu Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr 320 325 330 acc acc gcg acc taa 1208 Thr Thr Ala Thr 335 <210> 30 <211> 335 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(335) <223> Fbp, amino acid sequence of C. glutamicum fructose 1,6-bisphosphatase <400> 30 Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu 1 5 10 15 Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val 20 25 30 Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met 35 40 45 Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly 50 55 60 Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val 65 70 75 80 Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp 85 90 95 Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu 100 105 110 Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr 115 120 125 Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile 130 135 140 Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly 145 150 155 160 Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His 165 170 175 Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu 180 185 190 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser 195 200 205 Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile 210 215 220 Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile 225 230 235 240 Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly 245 250 255 Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp 260 265 270 Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg 275 280 285 Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met 290 295 300 Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu 305 310 315 320 Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr 325 330 335 <210> 31 <211> 1208 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (201)..(1205) <223> fbp, DNA sequence with eftu (elongation factor Tu)-promoter <400> 31 tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 60 ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 120 aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 180 gaagtccagg aggacataca atg aac cta aag aac ccc gaa acg cca gac cgt 233 Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg 1 5 10 aac ctt gct atg gag ctg gtg cga gtt acg gaa gca gct gca ctg gct 281 Asn Leu Ala Met Glu Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala 15 20 25 tct gga cgt tgg gtt gga cgt ggc atg aag aat gaa ggc gac ggt gcc 329 Ser Gly Arg Trp Val Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala 30 35 40 gct gtt gac gcc atg cgc cag ctc atc aac tca gtg acc atg aag ggc 377 Ala Val Asp Ala Met Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly 45 50 55 gtc gtt gtt atc ggc gag ggc gaa aaa gac gaa gct cca atg ctg tac 425 Val Val Val Ile Gly Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr 60 65 70 75 aac ggc gaa gag gtc gga acc ggc ttt gga cct gag gtt gat atc gca 473 Asn Gly Glu Glu Val Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala 80 85 90 gtt gac cca gtt gac ggc acc acc ctg atg gct gag ggt cgc ccc aac 521 Val Asp Pro Val Asp Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn 95 100 105 gca att tcc att ctc gca gct gca gag cgt ggc acc atg tac gat cca 569 Ala Ile Ser Ile Leu Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro 110 115 120 tcc tcc gtc ttc tac atg aag aag atc gcc gtg gga cct gag gcc gca 617 Ser Ser Val Phe Tyr Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala 125 130 135 ggc aag atc gac atc gaa gct cca gtt gcc cac aac atc aac gcg gtg 665 Gly Lys Ile Asp Ile Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val 140 145 150 155 gca aag tcc aag gga atc aac cct tcc gac gtc acc gtt gtc gtg ctt 713 Ala Lys Ser Lys Gly Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu 160 165 170 gac cgt cct cgc cac atc gaa ctg atc gca gac att cgt cgt gca ggc 761 Asp Arg Pro Arg His Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly 175 180 185 gca aag gtt cgt ctc atc tcc gac ggc gac gtt gca ggt gca gtt gca 809 Ala Lys Val Arg Leu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala 190 195 200 gca gct cag gat tcc aac tcc gtg gac atc atg atg ggc acc ggc gga 857 Ala Ala Gln Asp Ser Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly 205 210 215 acc cca gaa ggc atc atc act gcg tgc gcc atg aag tgc atg ggt ggc 905 Thr Pro Glu Gly Ile Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly 220 225 230 235 gaa atc cag ggc atc ctg gcc cca atg aac gat ttc gag cgc cag aag 953 Glu Ile Gln Gly Ile Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys 240 245 250 gca cac gac gct ggt ctg gtt ctt gat cag gtt ctg cac acc aac gat 1001 Ala His Asp Ala Gly Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp 255 260 265 ctg gtg agc tcc gac aac tgc tac ttc gtg gca acc ggt gtg acc aac 1049 Leu Val Ser Ser Asp Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn 270 275 280 ggt gac atg ctc cgt ggc gtt tcc tac cgc gca aac ggc gca acc acc 1097 Gly Asp Met Leu Arg Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr 285 290 295 cgt tcc ctg gtt atg cgc gca aag tca ggc acc atc cgc cac atc gag 1145 Arg Ser Leu Val Met Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu 300 305 310 315 tct gtc cac cag ctg tcc aag ctg cag gaa tac tcc gtg gtt gac tac 1193 Ser Val His Gln Leu Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr 320 325 330 acc acc gcg acc taa 1208 Thr Thr Ala Thr 335 <210> 32 <211> 2303 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (201)..(2300) <223> tkt-operon, DNA sequence encoding wildtype C. glutamicum transketolase operon <400> 32 cacatttgaa ccacagttgg ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg 60 acgggtcaga ttaagcaaag actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca 120 attaacctaa gtcgtagatc tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc 180 ccggtttaac ccaggaagga ttg acc acc ttg acg ctg tca cct gaa ctt cag 233 Leu Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln 1 5 10 gcg ctc act gta cgc aat tac ccc tct gat tgg tcc gat gtg gac acc 281 Ala Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr 15 20 25 aag gct gta gac act gtt cgt gtc ctc gct gca gac gct gta gaa aac 329 Lys Ala Val Asp Thr Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn 30 35 40 tgt ggc tcc ggc cac cca ggc acc gca atg agc ctg gct ccc ctt gca 377 Cys Gly Ser Gly His Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala 45 50 55 tac acc ttg tac cag cgg gtt atg aac gta gat cca cag gac acc aac 425 Tyr Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn 60 65 70 75 tgg gca ggc cgt gac cgc ttc gtt ctt tct tgt ggc cac tcc tct ttg 473 Trp Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu 80 85 90 acc cag tac atc cag ctt tac ttg ggt gga ttc ggc ctt gag atg gat 521 Thr Gln Tyr Ile Gln Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp 95 100 105 gac ctg aag gct ctg cgc acc tgg gat tcc ttg acc cca gga cac cct 569 Asp Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro 110 115 120 gag tac cgc cac acc aag ggc gtt gag atc acc act ggc cct ctt ggc 617 Glu Tyr Arg His Thr Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly 125 130 135 cag ggt ctt gca tct gca gtt ggt atg gcc atg gct gct cgt cgt gag 665 Gln Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu 140 145 150 155 cgt ggc cta ttc gac cca acc gct gct gag ggc gaa tcc cca ttc gac 713 Arg Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp 160 165 170 cac cac atc tac gtc att gct tct gat ggt gac ctg cag gaa ggt gtc 761 His His Ile Tyr Val Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val 175 180 185 acc tct gag gca tcc tcc atc gct ggc acc cag cag ctg ggc aac ctc 809 Thr Ser Glu Ala Ser Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu 190 195 200 atc gtg ttc tgg gat gac aac cgc atc tcc atc gaa gac aac act gag 857 Ile Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu 205 210 215 atc gct ttc aac gag gac gtt gtt gct cgt tac aag gct tac ggc tgg 905 Ile Ala Phe Asn Glu Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp 220 225 230 235 cag acc att gag gtt gag gct ggc gag gac gtt gca gca atc gaa gct 953 Gln Thr Ile Glu Val Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala 240 245 250 gca gtg gct gag gct aag aag gac acc aag cga cct acc ttc atc cgc 1001 Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg 255 260 265 gtt cgc acc atc atc ggc ttc cca gct cca act atg atg aac acc ggt 1049 Val Arg Thr Ile Ile Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly 270 275 280 gct gtg cac ggt gct gct ctt ggc gca gct gag gtt gca gca acc aag 1097 Ala Val His Gly Ala Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys 285 290 295 act gag ctt gga ttc gat cct gag gct cac ttc gcg atc gac gat gag 1145 Thr Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu 300 305 310 315 gtt atc gct cac acc cgc tcc ctc gca gag cgc gct gca cag aag aag 1193 Val Ile Ala His Thr Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys 320 325 330 gct gca tgg cag gtc aag ttc gat gag tgg gca gct gcc aac cct gag 1241 Ala Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu 335 340 345 aac aag gct ctg ttc gat cgc ctg aac tcc cgt gag ctt cca gcg ggc 1289 Asn Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly 350 355 360 tac gct gac gag ctc cca aca tgg gat gca gat gag aag ggc gtc gca 1337 Tyr Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala 365 370 375 act cgt aag gct tcc gag gct gca ctt cag gca ctg ggc aag acc ctt 1385 Thr Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu 380 385 390 395 cct gag ctg tgg ggc ggt tcc gct gac ctc gca ggt tcc aac aac acc 1433 Pro Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr 400 405 410 gtg atc aag ggc tcc cct tcc ttc ggc cct gag tcc atc tcc acc gag 1481 Val Ile Lys Gly Ser Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu 415 420 425 acc tgg tct gct gag cct tac ggc cgt aac ctg cac ttc ggt atc cgt 1529 Thr Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg 430 435 440 gag cac gct atg gga tcc atc ctc aac ggc att tcc ctc cac ggt ggc 1577 Glu His Ala Met Gly Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly 445 450 455 acc cgc cca tac ggc gga acc ttc ctc atc ttc tcc gac tac atg cgt 1625 Thr Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg 460 465 470 475 cct gca gtt cgt ctt gca gct ctc atg gag acc gac gct tac tac gtc 1673 Pro Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val 480 485 490 tgg acc cac gac tcc atc ggt ctg ggc gaa gat ggc cca acc cac cag 1721 Trp Thr His Asp Ser Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln 495 500 505 cct gtt gaa acc ttg gct gca ctg cgc gcc atc cca ggt ctg tcc gtc 1769 Pro Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val 510 515 520 ctg cgt cct gca gat gcg aac gag acc gcc cag gct tgg gct gca gca 1817 Leu Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala 525 530 535 ctt gag tac aag gaa ggc cct aag ggt ctt gca ctg acc cgc cag aac 1865 Leu Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn 540 545 550 555 gtt cct gtt ctg gaa ggc acc aag gag aag gct gct gaa ggc gtt cgc 1913 Val Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg 560 565 570 cgc ggt ggc tac gtc ctg gtt gag ggt tcc aag gaa acc cca gat gtg 1961 Arg Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val 575 580 585 atc ctc atg ggc tcc ggc tcc gag gtt cag ctt gca gtt aac gct gcg 2009 Ile Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala 590 595 600 aag gct ctg gaa gct gag ggc gtt gca gct cgc gtt gtt tcc gtt cct 2057 Lys Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro 605 610 615 tgc atg gat tgg ttc cag gag cag gac gca gag tac atc gag tcc gtt 2105 Cys Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val 620 625 630 635 ctg cct gca gct gtg acc gct cgt gtg tct gtt gaa gct ggc atc gca 2153 Leu Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala 640 645 650 atg cct tgg tac cgc ttc ttg ggc acc cag ggc cgt gct gtc tcc ctt 2201 Met Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu 655 660 665 gag cac ttc ggt gct tct gcg gat tac cag acc ctg ttt gag aag ttc 2249 Glu His Phe Gly Ala Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe 670 675 680 ggc atc acc acc gat gca gtc gtg gca gcg gcc aag gac tcc att aac 2297 Gly Ile Thr Thr Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn 685 690 695 ggt taa 2303 Gly 700 <210> 33 <211> 700 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(700) <223> Tkt, amino acid sequence of C. glutamicum transketolase <400> 33 Leu Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg 1 5 10 15 Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr 20 25 30 Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His 35 40 45 Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln 50 55 60 Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp 65 70 75 80 Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr Ile Gln 85 90 95 Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu 100 105 110 Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr 115 120 125 Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser 130 135 140 Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp 145 150 155 160 Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His Ile Tyr Val 165 170 175 Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser 180 185 190 Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile Val Phe Trp Asp 195 200 205 Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile Ala Phe Asn Glu 210 215 220 Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr Ile Glu Val 225 230 235 240 Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala 245 250 255 Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val Arg Thr Ile Ile 260 265 270 Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala 275 280 285 Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe 290 295 300 Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val Ile Ala His Thr 305 310 315 320 Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val 325 330 335 Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe 340 345 350 Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu 355 360 365 Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser 370 375 380 Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly 385 390 395 400 Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val Ile Lys Gly Ser 405 410 415 Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu 420 425 430 Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu His Ala Met Gly 435 440 445 Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly 450 455 460 Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu 465 470 475 480 Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser 485 490 495 Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu 500 505 510 Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp 515 520 525 Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu 530 535 540 Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu 545 550 555 560 Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val 565 570 575 Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile Leu Met Gly Ser 580 585 590 Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala 595 600 605 Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Met Asp Trp Phe 610 615 620 Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu Pro Ala Ala Val 625 630 635 640 Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met Pro Trp Tyr Arg 645 650 655 Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu His Phe Gly Ala 660 665 670 Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Thr Asp 675 680 685 Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Gly 690 695 700 <210> 34 <211> 2295 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (193)..(2292) <223> tkt-operon with sod-promoter <400> 34 tagctgccaa ttattccggg cttgtgaccc gctacccgat aaataggtcg gctgaaaaat 60 ttcgttgcaa tataaacaaa aaggcctctc attgggaggt gtcgcaccaa gtacttttgc 120 gaagcgccat ctgacggatt ttcaaaagat gtatatgctc ggtgcggaaa cctacgaaag 180 gattttttac cc ttg acc acc ttg acg ctg tca cct gaa ctt cag 225 Leu Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln 1 5 10 gcg ctc act gta cgc aat tac ccc tct gat tgg tcc gat gtg gac acc 273 Ala Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr 15 20 25 aag gct gta gac act gtt cgt gtc ctc gct gca gac gct gta gaa aac 321 Lys Ala Val Asp Thr Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn 30 35 40 tgt ggc tcc ggc cac cca ggc acc gca atg agc ctg gct ccc ctt gca 369 Cys Gly Ser Gly His Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala 45 50 55 tac acc ttg tac cag cgg gtt atg aac gta gat cca cag gac acc aac 417 Tyr Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn 60 65 70 75 tgg gca ggc cgt gac cgc ttc gtt ctt tct tgt ggc cac tcc tct ttg 465 Trp Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu 80 85 90 acc cag tac atc cag ctt tac ttg ggt gga ttc ggc ctt gag atg gat 513 Thr Gln Tyr Ile Gln Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp 95 100 105 gac ctg aag gct ctg cgc acc tgg gat tcc ttg acc cca gga cac cct 561 Asp Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro 110 115 120 gag tac cgc cac acc aag ggc gtt gag atc acc act ggc cct ctt ggc 609 Glu Tyr Arg His Thr Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly 125 130 135 cag ggt ctt gca tct gca gtt ggt atg gcc atg gct gct cgt cgt gag 657 Gln Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu 140 145 150 155 cgt ggc cta ttc gac cca acc gct gct gag ggc gaa tcc cca ttc gac 705 Arg Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp 160 165 170 cac cac atc tac gtc att gct tct gat ggt gac ctg cag gaa ggt gtc 753 His His Ile Tyr Val Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val 175 180 185 acc tct gag gca tcc tcc atc gct ggc acc cag cag ctg ggc aac ctc 801 Thr Ser Glu Ala Ser Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu 190 195 200 atc gtg ttc tgg gat gac aac cgc atc tcc atc gaa gac aac act gag 849 Ile Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu 205 210 215 atc gct ttc aac gag gac gtt gtt gct cgt tac aag gct tac ggc tgg 897 Ile Ala Phe Asn Glu Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp 220 225 230 235 cag acc att gag gtt gag gct ggc gag gac gtt gca gca atc gaa gct 945 Gln Thr Ile Glu Val Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala 240 245 250 gca gtg gct gag gct aag aag gac acc aag cga cct acc ttc atc cgc 993 Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg 255 260 265 gtt cgc acc atc atc ggc ttc cca gct cca act atg atg aac acc ggt 1041 Val Arg Thr Ile Ile Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly 270 275 280 gct gtg cac ggt gct gct ctt ggc gca gct gag gtt gca gca acc aag 1089 Ala Val His Gly Ala Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys 285 290 295 act gag ctt gga ttc gat cct gag gct cac ttc gcg atc gac gat gag 1137 Thr Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu 300 305 310 315 gtt atc gct cac acc cgc tcc ctc gca gag cgc gct gca cag aag aag 1185 Val Ile Ala His Thr Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys 320 325 330 gct gca tgg cag gtc aag ttc gat gag tgg gca gct gcc aac cct gag 1233 Ala Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu 335 340 345 aac aag gct ctg ttc gat cgc ctg aac tcc cgt gag ctt cca gcg ggc 1281 Asn Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly 350 355 360 tac gct gac gag ctc cca aca tgg gat gca gat gag aag ggc gtc gca 1329 Tyr Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala 365 370 375 act cgt aag gct tcc gag gct gca ctt cag gca ctg ggc aag acc ctt 1377 Thr Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu 380 385 390 395 cct gag ctg tgg ggc ggt tcc gct gac ctc gca ggt tcc aac aac acc 1425 Pro Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr 400 405 410 gtg atc aag ggc tcc cct tcc ttc ggc cct gag tcc atc tcc acc gag 1473 Val Ile Lys Gly Ser Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu 415 420 425 acc tgg tct gct gag cct tac ggc cgt aac ctg cac ttc ggt atc cgt 1521 Thr Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg 430 435 440 gag cac gct atg gga tcc atc ctc aac ggc att tcc ctc cac ggt ggc 1569 Glu His Ala Met Gly Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly 445 450 455 acc cgc cca tac ggc gga acc ttc ctc atc ttc tcc gac tac atg cgt 1617 Thr Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg 460 465 470 475 cct gca gtt cgt ctt gca gct ctc atg gag acc gac gct tac tac gtc 1665 Pro Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val 480 485 490 tgg acc cac gac tcc atc ggt ctg ggc gaa gat ggc cca acc cac cag 1713 Trp Thr His Asp Ser Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln 495 500 505 cct gtt gaa acc ttg gct gca ctg cgc gcc atc cca ggt ctg tcc gtc 1761 Pro Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val 510 515 520 ctg cgt cct gca gat gcg aac gag acc gcc cag gct tgg gct gca gca 1809 Leu Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala 525 530 535 ctt gag tac aag gaa ggc cct aag ggt ctt gca ctg acc cgc cag aac 1857 Leu Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn 540 545 550 555 gtt cct gtt ctg gaa ggc acc aag gag aag gct gct gaa ggc gtt cgc 1905 Val Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg 560 565 570 cgc ggt ggc tac gtc ctg gtt gag ggt tcc aag gaa acc cca gat gtg 1953 Arg Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val 575 580 585 atc ctc atg ggc tcc ggc tcc gag gtt cag ctt gca gtt aac gct gcg 2001 Ile Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala 590 595 600 aag gct ctg gaa gct gag ggc gtt gca gct cgc gtt gtt tcc gtt cct 2049 Lys Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro 605 610 615 tgc atg gat tgg ttc cag gag cag gac gca gag tac atc gag tcc gtt 2097 Cys Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val 620 625 630 635 ctg cct gca gct gtg acc gct cgt gtg tct gtt gaa gct ggc atc gca 2145 Leu Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala 640 645 650 atg cct tgg tac cgc ttc ttg ggc acc cag ggc cgt gct gtc tcc ctt 2193 Met Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu 655 660 665 gag cac ttc ggt gct tct gcg gat tac cag acc ctg ttt gag aag ttc 2241 Glu His Phe Gly Ala Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe 670 675 680 ggc atc acc acc gat gca gtc gtg gca gcg gcc aag gac tcc att aac 2289 Gly Ile Thr Thr Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn 685 690 695 ggt taa 2295 Gly 700 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P1) <400> 35 ccgctcgagc cattgaatcg tgctgagag 29 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P2) <400> 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Primer (P18) <400> 52 cccggaataa ttggcagcta tatgctcctt catttt 36 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P19) <400> 53 attatttgga tccgaggctg cactgcaacg aggt 34 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P20) <400> 54 catcgccgaa ttcggtggtg gaa 23 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P21) <400> 55 tccaccgaat tcggcgatga 20 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P22) <400> 56 cggaaatcgt cctcgtcgac tac 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P23) <400> 57 cactgttcgt agtcgacgag gac 23 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P24) <400> 58 attattttct agagaaaccc aaaaccgccc tcc 33 <210> 59 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P25) <400> 59 attattttct agagaggctg cactgcaacg aggt 34 <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P26) <400> 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cgacacgggt aaaaaatcct ttc 33 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P43) <400> 77 gaaaggattt tttacccgtg tcgactcaca cat 33 <210> 78 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P44) <400> 78 gagtacacgc gtcaaagatg gggtaagtct gg 32 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P45) <400> 79 gagtacctcg aggctgtggc agtgaccaac cg 32 <210> 80 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P46) <400> 80 ggaataattg gcagctatag agtaattatt cctttcaaca agagacc 47 <210> 81 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P47) <400> 81 gagtacctcg agcgaagacc tcgcagattc cg 32 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P48) <400> 82 gagactcgtg gctaagatca tctg 24 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P49) <400> 83 cagatgatct tagccacgag tctc 24 <210> 84 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P50) <400> 84 catgagacgc gtggaatctg cagaccactc gc 32 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P51) <400> 85 tggccgttac cctgcgaatg 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P52) <400> 86 tgtatgtcct cctggacttc 20 <210> 87 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P53) <400> 87 gaagtccagg aggacataca atgaacctaa agaaccccga 40 <210> 88 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P54) <400> 88 atctacgtcg acccaggatg ccctggattt c 31 <210> 89 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P55) <400> 89 tatcaacgcg ttcttcatcg gtagcagcac c 31 <210> 90 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P56) <400> 90 cattcgcagg gtaacggcca ctgaagggcc tcctggg 37 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P57) <400> 91 tagctgccaa ttattccggg 20 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P58) <400> 92 gggtaaaaaa tcctttcgta g 21 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P59) <400> 93 tacgaaagga ttttttaccc ttgaccacct tgacgctgtc 40 <210> 94 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P60) <400> 94 atctacgtcg acccatcaga agcaatgacg tag 33 <210> 95 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P61) <400> 95 atcaacgcgt cggcaaatta gtcgaatgaa g 31 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer (P62) <400> 96 cccggaataa ttggcagcta tccttcctgg gttaaac 37

Claims (15)

  1. 초기 미생물과 비교하여, 적어도 (a) 증가된 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 활성, (b) 증가된 프럭토스 1,6-비스포스파타아제 활성, (c) 감쇠된 이소시트레이트 디하이드로게나제 활성, (d) 증가된 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 활성, 및 (e) 증가된 아스파테이트 키나아제 활성의 특성을 포함하는 미생물을 이용하여 아스파테이트 유래 아미노산, 바람직하게는 라이신을 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    (a) 증가된 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제 활성은 (i) zwf-유전자의 과발현, 바람직하게는 이종 프로모터를 통한 zwf-유전자의 자연형 프로모터(natural promoter)의 치환에 기초한 zwf-유전자의 과발현 및/또는 (ii) 아미노산 잔기 교환 A243T, 또는 (iii) 이종 프로모터를 통한 tkt-오페론의 자연형 프로모터의 치환에 의한 것이고,
    (b) 증가된 프럭토스 1,6-비스포스파타아제의 활성은 fbp-유전자의 과발현, 바람직하게는 이종 프로모터를 통한 자연형 프로모터의 치환에 기초한 fbp-유전자의 과발현에 의한 것이고,
    (c) 감쇠된 이소시트레이트 디하이드로게나제 활성은 다른 개시코돈을 통한 icd-유전자의 자연형 개시코돈의 치환에 기초하며,
    (d) 증가된 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 활성은 ddh-유전자의 과발현, 바람직하게는 유전자-증식을 통한 ddh-유전자의 과발현에 기초하고,
    (e) 증가된 아스파테이트 키나아제 활성은 lysC-유전자의 과발현, 바람직하게는 아미노산 교환 T311I를 야기하는 lysC-유전자의 변형을 통한 lysC-유전자의 과발현에 기초하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 특징 (a) 및/또는 (b)의 이종 프로모터는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sod)의 프로모터 또는 연장인자 tu (eftu)의 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은
    (f) 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제의 과발현,
    (g) 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제의 과발현,
    (h) 피루베이트 카르복실라제의 과발현 및 돌연변이,
    (i) PEP 카르복시키나아제의 결실, 및
    (j) 호모세린 디하이드로게나제의 돌연변이
    중 적어도 하나의 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 DSM 23586으로 DSMZ에 기탁되었거나, 그의 변이체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 변형된 코리네박테리움, 바람직하게는 변형된 C.글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파테이트 유래 아미노산, 바람직하게는 라이신을 수확하고 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. (a) 증가된 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 활성,
    (b) 증가된 프럭토스 1,6-비스포스파타아제 활성,
    (c) 감쇠된 이소시트레이트 디하이드로게나제 활성,
    (d) 증가된 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 활성, 및
    (e) 증가된 아스파테이트 키나아제 활성의 특징을 갖는 재조합 미생물.
  10. 제 9항에 있어서,
    (a) 증가된 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제 활성은 (i) zwf-유전자의 과발현, 바람직하게는 이종 프로모터를 통한 zwf-유전자의 자연형 프로모터의 치환에 기초한 zwf-유전자의 과발현 및/또는 (ii) 아미노산 잔기 교환 A243T, 또는 (iii) 이종 프로모터를 통한 tkt-오페론의 자연형 프로모터의 치환에 의한 것이고,
    (b) 증가된 프럭토스 1,6-비스포스파타아제의 활성은 fbp-유전자의 과발현, 바람직하게는 이종 프로모터를 통한 자연형 프로모터의 치환에 기초한 fbp-유전자의 과발현에 의한 것이고,
    (c) 감쇠된 이소시트레이트 디하이드로게나제 활성은 다른 개시코돈을 통한 icd-유전자의 자연 개시코돈의 치환에 기초하며,
    (d) 증가된 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 활성은 ddh-유전자의 과발현, 바람직하게는 유전자-증식을 통한 ddh-유전자의 과발현에 기초하고,
    (e) 증가된 아스파테이트 키나아제 활성은 lysC-유전자의 과발현, 바람직하게는 아미노산 교환 T311I를 야기하는 lysC-유전자의 변형을 통한 lysC-유전자의 과발현에 기초하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 이종 프로모터는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (sod) 또는 연장인자 tu(eftu)의 프로모터로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  12. 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (f) 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제의 과발현,
    (g) 디아미노피멜레이트 탈카르복실라제의 과발현,
    (h) 피루베이트 카르복실라제의 과발현 및 돌연변이,
    (i) PEP 카르복시키나아제의 결실, 및
    (j) 호모세린 디하이드로게나제의 돌연변이
    중 적어도 하나의 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  13. 제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 변형된 코리네박테리움, 바람직하게는 변형된 C.글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 미생물.
  14. 제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, DSM 23586으로 DSMZ에 기탁되었거나, 그의 변이체인 것을 특징으로 하는 미생물.
  15. 제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 미생물의, 아스파테이트 유래 아미노산, 바람직하게는 L-라이신 생산에의 용도.
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