KR102011600B1 - 열 및 효소 처리를 통하여 포도 껍질로부터 레스베라트롤을 추출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가열 및 효소 처리를 통하여 포도 껍질로부터 레스베라트롤을 추출하는 방법으로서, 보다 구체적으로는 동결 건조된 포도 껍질을 열처리 후 적절한 효소를 순차적으로 처리하여, 포도 껍질 추출물 내의 피세이드를 레스베라트롤로 분해하여, 결과적으로 포도껍질로부터 레스베라트롤을 높은 효율로 추출하기 위한 추출 방법 및 이를 통해 추출된 레스베라트롤을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 열 및 효소 처리를 통하여 포도 주스 등의 부산물인 포도 껍질로부터 레스베라트롤을 추출하는 방법으로서, 보다 구체적으로는 포도 껍질을 예열한 후, β-글루카나아제 및 폴리갈락투로나아제 등의 효소를 처리하는 과정을 포함하는 레스베라트롤의 추출 방법으로서, 특히 추출물에 포함된 레스베라트롤 전구체인 피세이드의 분해 및 전환을 증가시킨 레스베라트롤의 추출 방법에 대한 것이다.
포도는 세계에서 가장 영양가 높은 과일 작물 중 하나로서, 많은 생리 활성 물질을 포함한다. 이러한 생리 활성 성분 중 하나인 레스베라트롤 (3,5,4'-trihydroxy stilbene)은 환경 인자 자극에 이어 과일 또는 식물 줄기와 뿌리의 피부에 축적되는 식물 phytoalexin으로 항염, 항암 및 항산화 활성 등 다양한 약리학적 이점을 포함한다. (Li, Xia, & Forstermann, 2012; Sahu, Madhyastha, & Rao, 2013).
레스베라트롤의 기능은 수년에 걸쳐 여러 포유류 신호 경로에서 광범위하게 연구되었다. 예를 들어, 레스베라트롤은 DNA 합성과 세포주기를 매개하는 단백질뿐만 아니라 세포 증식과 스트레스 적응을 조절하는 전사 인자를 조절하기 때문에 항암, 노화 방지 및 신경 보호제로서 활용된다. 또한, 레스베라트롤은 항산화 활동을하는 것으로 알려져있다. (2005, Lastra & Villegas, Ren, Fan, Chen, Huang, & Yang, 2011, Signorelli & Ghidoni, 2005).
또한 UVB가 조사 된 HaCaT 각질 형성 세포를 사용하여 확인한 결과, 레스베라트롤은 피부암을 예방하기 위해 세포사멸과 자가소화작용을 결합시킴으로써 피부에 광화학 보호 메커니즘을 제공하기도 한다. (Vitale, Kisslinger, Paladino, Procaccini, Matarese, Pierantoni, et al.)
흥미롭게도, 레스베라트롤과 그 배당체는 포도 껍질에 매우 집중되어 있으며 과육에는 비교적 낮은 농도로 포함되며, 포도 껍질과 종자에서 주로 추출되는 포도 찌꺼기는 풍부한 레스베라트롤과 다른 생체 활성 화합물을 함유하고 있다. 그러나 일반적으로 포도 가공 중 부산물로 처리되어 버려진다. 따라서 포도 껍질 또는 포말(pomace)을 항산화제의 지속 가능한 공급원으로 사용할 수 있도록 최근 관심이 높아지는 실정이다. (Fontana, Antoniolli, & Bottini, 2013)
그러나, 상당한 비율의 레스베라트롤은 소장에서 흡수하기 어려운 유도체인 피세이드(polydatin, 레스베라트롤-3-O-β-D-glucoside)로서 포도껍질에 존재한다. 이와 관련하여, 피세이드는 혈류 (Cottart, Nivet-Antoine, Laguillier-Morizot, & Beaudeux, 2010)에 흡수되기 전에 장내 미생물 효소에 의해 레스베라트롤로 변형되어야 한다는 점이 확인되었다.
레스베라트롤은 주목할 만한 잠재적인 건강상의 이점을 가지며 피세이드보다 생체 이용 가능성이 더 높기 때문에 다양한 정량 추출 기술이나 직접적인 피세이드 당화를 통해 레스베라트롤 수확량을 증가시키기 위한 실현 가능하고 효율적인 방법을 개발하는 것이 중요하다. 60 ℃에서 30 분 동안 교반하면서 에탄올 (80:20, v / v)의 수용액을 사용하여 흰가루병에 감염된 포도 껍질에서 피세이드와 레스베라트롤을 최적으로 정량적으로 추출하였다. (Romero-Perez, Lamuela -Raventos, Andres-Lacueva, & La Torre-Boronat, 2001). 기존에 공지된 방법은 비용이 많이 들고 반응 시간이 길다. 따라서 진 (Jin)과 동료 연구원 (2013)은 고도로 정제된 식용성 아스페르길루스나제 (Aspergillus niger)와 효모를 이용한 간단한 피세이드 생체 변형 기술을 설계하였고, 이러한 방법을 통하여 호장근 뿌리로부터 최적화된 생체 내 변화 조건은 처리되지 않은 뿌리에서 추출한 것보다 11 배 이상의 레스베라트롤을 추출하였다. (Jin, Luo, Wang, Zhao, Gu, Li, et al.)
포도 껍질로부터의 레스베라트롤 및 그 배당체에 대한보다 신속하고, 편리하며, 직접적인 추출을 위해, 효소 및 열처리의 조합하는 방법이 연구되었다. 보다 구체적으로, 포도 껍질을 예열하고 이어서 폴리 갈락투로나제 [PG; poly (1,4-α-D-galacturonide) glycan hydrolase]와 β-glucanase (exo-1,3-β-glucanase)를 첨가하여 60 ℃에서 30 분간 80 % 에탄올을 가하여 부드럽게 교반하면서 레스베라트롤 추출을 최적화 하였다. PG는 (1,4) -α-D-galactosiduronic 결합을 가수 분해하여 과일껍질의 세포벽 분해를 일으킨다. (Quesada, Blanco-Portales, Pose, Garcia-Gago, Jimenez-Bermudez, Munoz-Serrano, 등, 2009). β- 글루카나아제는 다당류 (1,3)-β-D-글루칸의 비 환원 말단을 가수분해한다 (Cutfield, Davies, Murshudov, Anderson, Moody, Sullivan, et al., 1999). 따라서 본 연구는 포도 껍질에서 레스베라트롤 추출을 극대화하기 위한 최적의 조건을 수립하기 위해 수행되었다.
본 발명의 목적은 포도껍질로부터 레스베라트롤을 높은 수율로 추출해내는 추출 방법에 대한 것으로서, 포도 부산물을 동결건조한 후, 가열하고 효소를 이용하여 분해하는 과정을 포함하는 레스베라트롤 추출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법에 의해 추출된 레스베라트롤을 포함하는 식품, 음료, 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 (a) 포도 껍질을 동결 건조하는 단계; (b) 상기 동결 건조된 포도 껍질을 가열하는 단계; 및 (c) 상기 가열된 포도 껍질에 추출 용매를 가하여 추출한 추출물을 효소로 처리하여 분해하는 단계를 포함하는 레스베라트롤 추출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 포도껍질을 가열하는 단계는 건조된 포도 껍질 분말에 증류수를 가하여 65℃ 내지 95℃의 온도로 10 내지 60분간 가열하는 것을 포함하는 것이며, 보다 바람직하게는 75℃ 내지 95℃로 10 내지 30분간 가열하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 (c) 단계의 추출 용매는 알코올이며, 보다 바람직하게는 에탄올을 가하여 추출하는 과정을 포함하며, 또한 상기 과정에서 추출된 추출물은 레스베라트롤의 전구체인 피세이드가 높은 함량으로 포함되어 있다.
또한 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 상기 (c) 단계에서 추출된 추출물에 처리되는 효소는 셀룰라아제, 폴리갈락투로나아제, 엑소-1,3-β-글루카나아제, 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제, β-글루카나아제, β-글루코시다아제로 이루어진 군으로부터 1이상 선택된 효소를 사용하며, 보다 바람직하게는 폴리갈락투로나아제 또는 엑소-1,3-β-글루카나아제인 것을 특징으로 하며, 더 바람직하게는 폴리갈락투로나아제 및 엑소-1,3-β-글루카나아제를 동시에 또는 순차적으로 처리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 추출 방법에 따라 추출된 레스베라트롤을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나, 음료, 음료베이스, 건강기능식품, 기능성식품인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 가열 및 효소 처리를 통하여 포도 껍질로부터 레스베라트롤을 추출하는 방법으로서, 보다 구체적으로는 동결 건조된 포도 껍질을 열처리 후 적절한 효소를 순차적으로 처리하여, 포도 껍질 추출물 내의 피세이드를 레스베라트롤로 분해하여, 결과적으로 포도껍질로부터 레스베라트롤을 높은 효율로 추출하기 위한 추출 방법을 제공한다. 본 발명의 추출 방법에 따르면, 기존의 포도 유래 추출물과 비교하여 소화 및 흡수가 용이한 형태인 레스베라트롤을 높은 수율로 추출할 수 있다. 본 발명의 기술로 인하여 경제성 및 효율성이 증대된 레스베라트롤 추출 방법을 제공할 수 있고, 와인에 다량 함유된 레스베라트롤을 주스와 같은 일반 음료에도 고함량으로 포함할 수 있으며, 이를 건강기능식품 또는 기능성 식품 등 다방면으로 활용할 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 순수 피세이드에서 레스베라트롤로 생물전환율을 나타낸 것이다. (A) HPLC 분석에 의한 피세이드의 전환 몰 수율로서, VinoTaste Pro (0.2%, w/v) 및 Viscozyme(2 %, w/v)으로 100mM sodium acetate 완충액 (pH 5.0)에 용해된 피세이드를 별도로 처리하여 β-글루코시다아제 (0.2%, w/v) 또는 셀룰라아제 (2 %, w/v)를 40℃ 조건에서 사용한 결과이다. (B) 반응 시간 별로 VinoTaste Pro를 사용하여 피세이드 전환(to 레스베라트롤)한 결과를 나타내는 크로마토그램. 피세이드는 VinoTaste Pro을 이용하여 60 분 동안 배양 한 후 완전히 레스베라트롤로 전환되었다.
도 2는 열처리(95℃,10분) 및 VinoTaste Pro 효소로 처리된 포도 껍질 추출물의 ABTS + (A) 및 (B) DPPH (B) 라디칼 소거 활성 분석 결과이다. 열처리된 샘플에서 항산화 활성이 더 높은 것을 알 수 있다.
도 3은 트랜스-레스베라트롤과 피세이드에서 추출한 주요 단편에 대한 크로마토그래피 결과이다.
도 2는 열처리(95℃,10분) 및 VinoTaste Pro 효소로 처리된 포도 껍질 추출물의 ABTS + (A) 및 (B) DPPH (B) 라디칼 소거 활성 분석 결과이다. 열처리된 샘플에서 항산화 활성이 더 높은 것을 알 수 있다.
도 3은 트랜스-레스베라트롤과 피세이드에서 추출한 주요 단편에 대한 크로마토그래피 결과이다.
본 발명자들은 포도부산물인 포도 껍질로부터 레스베라트롤을 추출하는 방법으로서, 기존의 포도 음료 또는 포도 추출물에 비하여 체내 흡수가 용이한 레스베라트롤의 함량이 높은 추출물을 제조하기 위한 방법에 대한 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 “추출물”은 포도 껍질을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 특히, 본 발명의 포도 추출물은 레스베라트롤의 함량이 향상된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추출 방법에 따르면, 포도 껍질을 동결 건조하여, 분말화한 후 약간의 증류수를 가하여 가열함으로 인하여 추출이 용이한 형태로 가공한 후에, 추출 용매를 통해 추출된 추출물을 한번 더 효소로 처리하여 추출물 내에 함유된 피세이드를 레스베라트롤로 분해하는 과정을 포함하기 때문에, 체내 흡수 효율이 높고 항산화 등의 활성을 가지는 레스베라트롤의 함량이 매우 높은 추출물을 제조할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 추출 방법에 따른 추출 방법은,
(a) 포도 껍질을 동결 건조하는 단계;
(b) 상기 동결 건조된 포도 껍질을 가열하는 단계; 및
(c) 상기 가열된 포도 껍질에 추출 용매를 가하여 추출한 추출물을 효소로 처리하여 분해하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 포도 껍질은 이에 제한되는 것은 아니나, 와인, 주스 등의 가공식품을 만들고 난 후 생성된 포도 부산물이며, 이 중 특히 포도 껍질을 이용한다. 포도 껍질은 주로 와인 생산 후 발생되는 것으로 전체 원료의 20% 가량 생산되며, 포도 껍질에는 레스베라트롤과 같은 활성 성분이 다량 포함되어 있어, 활용가치가 높다.
또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 레스베라트롤을 추출하기 위한 포도 껍질은 켐벨얼리, 파렐라다, 메카베오, 사렐로, 까리냥, 거봉, 델라웨어, 머스캣, 카베르네 소비뇽, 피노 누아, 시라, 가메, 메를로, 산지오베제, 템프라니요, 리슬링, 소비뇽 블랑, 슈넹 블랑 및 샤르도네 중 1이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 켐벨얼리를 사용하였다. 포도의 품종마다 포도 껍질의 레스베라트롤 함량에 차이가 있을 수 있으나, 본 발명의 방법에 의하여 추출할 경우, 일반적인 착즙, 음료 또는 와인 제조 과정에서 추출되는 양에 비하여 현저히 많은 양의 레스베라트롤이 추출될 수 있다. 특히, 매를로를 사용할 경우, 포도 껍질 1g 당 피세이드가 약 1000㎍ 가량 함유되어 있어(J. Agric . Food Chem . 2001, 49, 210-215), 본 발명의 방법에 따라 추출할 경우, 가장 많은 양의 레스베라트롤을 추출할 수 있다.
본 발명에서는 상기 포도 껍질을 동결 건조하여 사용하며, 열처리를 통해 연화하는 과정을 포함하여 레스베라트롤의 전구체인 피세이드의 추출 수율을 극대화하였다. 상기 열처리는 추출 이전에 과피를 연화하여 효소의 작용을 돕고, 레스베라트롤의 추출 효율을 증가시키기 위한 과정이다. 열처리는 과피의 유효 성분이 파괴되지 않는 범위 내에서 수행되며, 바람직하게는 65℃내지 95℃의 온도로 10 내지 60분간 가열한다. 가열 온도가 낮을수록 가열 시간이 길어지며, 가열온도가 높으면 상대적으로 짧은 시간 동안 가열하여도 가열에 의한 효과를 나타낼 수 있다.
상기 가열 과정 이후, 추출 용매를 통한 추출 과정을 거친다. 추출에 사용되는 용매는 물, 알코올, 주정(에탄올), 알코올수용액 및 주정(에탄올)수용액 등을 포함하며, 바람직하게는 에탄올 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 80% 에탄올을 사용하여 추출하였으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 추출 방법으로는 상온추출, 가열추출, 냉침추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 초임계 추출인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 추출을 통해 추출되는 성분은 주로 레스베라트롤의 전구체인 피세이드로서, 이는 체내 흡수율이 현저히 낮아 실제 효능을 나타내기 어려운 상태의 물질이다. 일반적으로 포도를 이용한 식품 중, 와인에 레스베라트롤이 0.1 내지 10ppm 가량 포함되는 것으로 알려져 있으나, 알코올이 포함되어 있지 않은 주스, 음료, 등의 일반 식품에는 레스베라트롤이 아닌 피세이트 형태로 포함되어 있는 것이 일반적이다. 따라서, 효소를 통해 상기 피세이드를 레스베라트롤로 분해하는 과정을 포함하여, 일반 식품에도 활용 가능한 레스베라트롤 고함량 추출물을 제조하고자 하는 것이다.
상기 추출된 추출물은 효소를 이용하여 분해하는 과정을 추가로 포함한다. 상기 효소는 이에 제한되는 것은 아니나, 셀룰라아제, 폴리갈락투로나아제, 엑소-1,3-β-글루카나아제, 엔도-1,3(4)-β-글루카나아제, β-글루카나아제, β-글루코시다아제로 이루어진 군으로부터 1이상 선택하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 폴리갈락투로나아제 및 엑소-1,3-β-글루카나아제를 동시 또는 순차적으로 처리하여 추출물을 분해하였다. 상기 엑소-1,3-β-글루카나아제는 상기 폴리갈락투로나아제는 엑소-1,3-β-글루카나아제의 작용을 도와 실제로 피세이드가 레스베라트롤로 전환되는 효율을 더욱 증가시키는 역할을 하는 것임을 본 발명의 실시예를 통하여 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 추출 방법에 따른 레스베라트롤의 추출률은 포도껍질 1g당 60 내지 500 ㎍ 이고, 보다 바람직하게는 150 내지 250 ㎍ 이다. 절대적인 추출량은 사용하는 효소의 종류 및 포도의 품종에 따라 달라질 수 있으나, 어떤 품종을 사용하더라도 효소의 종류는 폴리갈락투로나아제 및 엑소-1,3-β-글루카나아제를 함께 처리하여 분해하는 경우 가장 많은 양의 레스베라트롤이 추출될 수 있다.
본 발명의 상기 추출 방법에 의하여 추출된 추출물은, 공지된 포도 함유 음료, 음료 베이스, 건강기능식품, 기능성 식품에 사용되는 포도 부산물 추출물과 비교하여, 레스베라트롤 함량이 매우 높은 특징을 가진다.
본 발명은 또한 상기와 같은 추출 방법에 의해 추출된 포도 껍질 추출물을 포함하는 식품조성물에 대한 것으로서, 상기 식품은 음료, 음료 베이스, 건강기능식품, 기능성 식품을 포함한다.
상기 음료 또는 음료베이스는 이에 제한되는 것은 아니나, 기능성 음료의 원료로서 사용될 수 있다. 상기 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다. 상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 포도 껍질 추출물을 함유하는 것 외에 다른 성분을 혼합하는 것에 대한 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 추출물을 포함하는 음료 또는 음료베이스는 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것으로, 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 추출 방법에 의해 추출된 레스베라트롤을 유효 성분으로 포함하는 것 이외에, 다른 성분에는 특별한 제한은 없으며, 통상의 음료와 가티 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등, 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g이다. 그밖에 본 발명의 음료 또는 음료 베이스 조성물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다
본 발명의 상기 조성물은 투여를 위하여 상기 기재된 유효성분 이외에 그 제조에 통상적으로 사용되는 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 식품 조성물은 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 한다. “항산화”란, 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함하는 개념이다. 본 발명의 식품 조성물의 경우, 레스베라트롤이 가지는 강력한 항산화능에 따라 상기와 같은 기능을 가지는 기능성 식품일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 주 재료 및 효소 준비
신선한 포도 (Campbell var.)는 경북대 포도마을(한국 영천)에서 공급했다. 각 효소는 다음과 같이 상업적으로 시판되는 것을 구입하여 사용하였다. Rohament(셀룰라아제, 17,200 units/g)는 AB Enzymes GmbH (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. VinoTaste Pro [polygalacturonase (2,500 PG units/g) 및 exo-1,3-β-glucanase (75 units/g)] 및 Viscozyme [엔도-1,3(4) -β-글루카나아제, 100 fungal β-글루카나아제 units/g]은 Novozymes (Bagsvaerd, Denmark)에서 얻었으며, β- 글루코시다제 (5 units/g)는 Sigma Aldrich (미국 미주리 주)에서 구입하였다. 피세이드 (> 95 %)와 레스베라트롤(> 99 %)은 Sigma Aldrich (미주리, 미국)에서 구입하였다. 에탄올, 메탄올 및 인산은 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. Sercrim Safety (Seoul, Korea)에서 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석한 시료의 여과에 사용되는 주사기 필터(Whatman PVDF 필터, 0.45 및 0.2 μm)를 구입하였다. HPLC 분석에 사용 된 아세토니트릴과 메탄올은 HPLC급이며 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 다른 모든 시약은 달리 명시되지 않는 한 분석용 이었으며 추가 정제 단계 없이 사용되었다.
2. 피세이드의 탈-당화(deglycosylation)를 통한 레스베라트롤 정제
피세이드 표준용액 (100 mg/ML) 을 준비하고, 원액 10㎕를 100mM 아세트산 나트륨 (pH 5.0) 1㎖에 넣고 셀룰라아제 (2 % w/v), 비스코 자임 (2 % w/v), β- 글루코시다제 (0.2 % w/v), VinoTaste (0.2 % w/v)를 40 ℃에서 10분, 20분, 30분, 60분 및 120분 동안 배양 하였다. 반응 혼합물 500㎕에 메탄올 1㎖를 첨가하고 95 ℃에서 3 분간 부드럽게 가열하여 효소 반응을 중단시켰다. 그 후, 용액을 주사기 필터(Whatman PVDF, 0.45 ㎛)에 통과시키고 303nm의 흡광도에서 HPLC로 분석 하였다. 표준 레스베라트롤과 피세이드의 LC mass/mass 스펙트럼을 그림 S1에 나타내었다. 효소를 제외한 모든 시약을 함유한 샘플을 동시에 제조하여 대조군으로 분석 하였다.
그 결과, 피세이드에서 레스베라트롤로의 전환률은 β-글루코시다아제와 VinoTaste Pro을 40 ℃에서 10 분에서 120 분 동안 항온 처리했을 때가 셀룰라아제와 Viscozyme을 처리하였을 경우보다 더 효율적인 것으로 나타났다 (도 1).
기존에는 셀룰라아제가 피세이드를 레스베라트롤로 전환시키는 데 효과적이라고 보고되어 있었으나(p <0.05), 피세이드 탈당화에는 효과가 없었다(Kuo, Chen, Liu, Chen, & Shieh, 2016). 피세이드는 β-1,3-linkage가 있는 레스베라트롤 글리코시드이기 때문에 β-1,3-glucanase 활성을 가지는 효소가 다른 효소보다 효율적으로 작용할 것으로 예상되었다. 이 결과는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)로부터 정제된 피세이드-β-D-glucosidase가 2g/h/U의 기질 전환율을 가지며, 피세이드에서 레스베라트롤로 생체 전환 된다는 이전 보고서의 결과와도 일치한다 (Chen, Li, Gao, & Zhang, 2014). 이 효소 방법 외에도, 미생물 형질 전환 및 산 가수 분해를 포함하여, 피세이드를 레스베라트롤로 변형시키기 위한 몇 가지 방법이 수행되었으나, 분해 수율과 산업 호환성이 낮은 문제점이 있었다.(Wang DG, 2013; Wang, Liu, Guo, Dong, Zhang, & Xiu, 2007)
3. 동결 건조 포도 껍질 샘플 준비
경북대학교 포도마을 Co. (Yeonhcheon, Korea)에서 얻은 포도(2016년 수확 한 Campbell품종)의 과육은 제외하고, 포도 껍질만 준비하였다. 약 500g의 신선한 포도 껍질을 칭량하고 약 250mL 증류수와 혼합하고 혼합기 (HMF602, Hanil, Seoul, Korea)에서 균질화시켰다. 이어서, 혼합물을 동결 건조시키고 분말화하여 후속 분석을 위해 건조된 샘플을 수득 하였다.
4. 레스베라트롤 추출의 온도 및 시간 조건
동결 건조 된 시료의 무게를 0.5g으로 증류수를 약 3mL 가한 후 혼합물을 다양한 온도로(35, 45, 55, 65, 75 및 95 ℃)가열하였다. 레스베라트롤 추출은 이전에 기술된 방법(Romero-Perez, Lamuela-Raventos, Andres-Lacueva, & La Torre-Boronat, 2001)에 따라 수행되었다. 생성된 추출물을 건조시킨 후, 1mL의 80 %(v/v) 에탄올에 용해시키고 주사기 필터(Whatman PVDF 필터, 0.45㎛)를 통해 여과하고, 2000 Plus Series HPLC(Jasco, 일본)에서 MD 2010 Plus Wavelength Detector(Jasco, Tokyo, Japan)를 통해 분석하였다. 시료 분리는 0.8 mL/min의 유속 및 용매 구배 90%A(0-5분), 80%A(5-25분), 90%A(25-30분)에서, Gemini 5μm C18 컬럼(150x2mm) (Phenomenex, California, USA)을 이용하여 각각 수행되었다. 트랜스-레스베라트롤과 피세이드는 광 다이오드 어레이 검출기를 사용하고 250 ~ 400nm의 UV 스펙트럼을 비교 관찰하였다. 트랜스 이성질체와 cis-피세이드의 정량을 위한 trans-레스베라트롤의 표준 곡선은 이전에 공지된 방식으로 분석하였다. (RomeroPerez, LamuelaRaventos, Waterhouse, & delaTorreBoronat, 1996). 모든 분석을 위한 주입량은 10μL으로 하였다.
가열과 효소 처리가 레스베라트롤 추출에서 중요한 결정 인자이기 때문에 포도 껍질을 다양한 온도와 시간에 가열하여 레스베라트롤 추출을 위한 최적 조건을 확립 하였다. 효소 처리가 없는 경우, 레스베라트롤 추출은 65 ℃ 이상의 열처리에 의해 10 분에서 60 분 동안 유의적으로 증가 하였다 (표 2). 75 ℃에서 60 분간 및 95 ℃에서 10 분간 포도 껍질의 열처리 전처리는 80 % (v/v) 에탄올 (표 1)을 사용시 최대 추출 수율을 나타냈다.
열처리 없이 제조 한 포도 껍질 추출물 중 피세이드와 레스베라트롤의 농도는 건조된 껍질에서 각각 19.15 g과 20.96 g/g이었다. 대조적으로, 95 ℃에서 10 분 동안의 예열 처리는 추출물에서의 피세이드와 레스베라트롤의 수준을 각각 2.1 배와 5.4 배 증가시켰다.
| Temperature(°C) | Time(min) |
Concentration
(㎍/gdriedskin) |
|
| 피세이드 | 레스베라트롤 | ||
| Control | 0 | 19.15 ± 0.65 | 20.96 ± 4.19 |
| 35 | 10 | 32.55 ± 2.14 | 73.44 ± 2.67 |
| 30 | 26.59 ± 1.66 | 72.20 ± 2.88 | |
| 60 | 22.40 ± 1.52 | 62.11 ± 1.59 | |
| 45 | 10 | 23.61 ± 2.04 | 74.09 ± 0.82 |
| 30 | 20.66 ± 1.53 | 69.85 ± 1.27 | |
| 60 | 20.44 ± 3.72 | 49.42 ± 1.27 | |
| 55 | 10 | 16.01 ± 0.67 | 77.70 ± 1.26 |
| 30 | 20.56 ± 1.77 | 67.14 ± 0.99 | |
| 60 | 27.61 ± 2.14 | 60.02 ± 5.08 | |
| 65 | 10 | 28.92 ± 1.17 | 95.74 ± 9.16 |
| 30 | 29.34 ± 1.84 | 97.40 ± 6.76 | |
| 60 | 41.35 ± 1.36 | 118.48 ± 3.08 | |
| 75 | 10 | 30.35 ± 1.46 | 97.76 ± 1.56 |
| 30 | 40.17 ± 2.53 | 111.14 ± 0.95 | |
| 60 | 57.08 ± 5.73 | 112.21 ± 1.19 | |
| 95 | 10 | 41.16 ± 3.25 | 113.74 ± 1.77 |
| 30 | 25.51 ± 7.59 | 101.47 ± 2.38 | |
| 60 | 53.07 ± 2.75 | 90.96 ± 0.74 | |
결과적으로, 포도 껍질에 열 처리 시, 레스베라트롤 추출을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.
5. 포도 껍질의 효소 및 가온 처리
동결 건조 된 포도 껍질 (0.5g)을 칭량하고 95 ℃에서 3 분간 증류수로 10 분간 예열한 다음 3mL 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)과 혼합하고 VinoTaste 프로(β-글루카나제, 5 단위) 및 β-글루코시다제(5 단위)를 각각 처리하였다. 0.1 N HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH 5.0으로 조정하고 반응 혼합물을 열 쉐이커에서 50 ℃에서 1시간 동안 항온 배양 하였다. 그 후, Romero-Perez 등이 보고한 최적 추출 조건에 따라 레스베라트롤을 추출하였다. 60℃에서 30 분 동안 예열하였고, 추출 용매로 에탄올과 물 (80:20)을 이용 하였다. 생성된 추출물을 증발 건조시키고, 1mL 80%(v/v)에탄올에 용해시킨 다음, HPLC 분석을 위해 Whatman PVDF 필터 (0.45 또는 0.2㎛)가 장착 된 주사기 필터를 통해 여과 하였다.
위와 같이 포도 껍질을 예열 한 후, 에탄올을 용매로 하여 추출 한 후, 상기 추출물을 효소 처리를 한 결과, 비가열 대조군에 비해 레스베라트롤과 그 배당체의 추출이 크게 증가하였다.(표 2) 특히, 포도 껍질의 예열 후에 VinoTaste Pro를 사용하면 추출물의 추출물 중 피세이드 농도가 감소하면서 추출된 레스베라트롤 농도가 매우 증가하였다. 이것은 VinoTaste Pro가 레스베라트롤 글리코사이드의 아글리콘으로의 생물 전환에 매우 효과적임을 시사하는 것이다. 즉, 가열 후 VinoTaste Pro 처리로 얻은 포도 피부 추출물에서는 트랜스 및 시스 형태의 피세이드가 검출되지 않았지만 가열 후 β-글루코시다제를 처리한 샘플에서는 일정 수준의 피세이드가 검출되었다. 이러한 결과는 피세이드의 레스베라트롤로의 전환 효율이 Vino Taste Pro 및 β-glucosidase 사이에서 유의한 차이가 없었고, 그렇기 때문에 polygalacturonase가 VinoTaste Pro의 exo-β-1,3-glucanase의 효소 효율을 높이고 가열된 포도껍질 시료로부터의 레스베라트롤 추출을 증가시켰다는 점을 알 수 있다. (도 1).
포도 껍질을 가열하지 않으면 β-글루코시다아제와 VinoTaste Pro는 둘 다 피세이드와 레스베라트롤을 추출하는데 효과적이지 않아 열처리에 의해 유발된 포도 껍질의 구조 변화가 레스베라트롤과 피세이드의 추출을 용이하게 하는데 필수적임을 시사한다. 즉, 열처리를 통하여 피세이드를 레스베라트롤로 효소로 전환시키는 효과를 향상시킴을 확인하였다.
6. 추출물로부터
피세이드
및
레스베라트롤
정량
포도 피부 추출물 중 트랜스-레스베라트롤 및 피세이드의 동정은 triple quadrupole mass spectrometer(LC-MS / MS 8040, Shimadzu, Kyoto, USA)에 연결된 전기 분무 이온화 (ESI) 소스가 장착된 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 수행하였다. UPLC 시스템은 0.2mL/min의 유속으로 유지되고 10-50% 범위의 A용매 구배(0-3 분) 및 10% A (3.1-7 분)에서 작동하는 Kinetex C18 컬럼(100 mm x 2.6μm)(Phenomenex, California, USA)을 이용한다. (용매 A : 아세토니트릴 중 0.1 %포름산, 용매B : 물 중 0.1% 포름산) Standard 및 샘플의 주입량은 5μL이다. MS/MS 시스템의 모세관을 250 ℃로 설정하고, 질소 건조 가스를 8L/min의 유속으로 유지시켰다. 가열되지 않은 포도 껍질 샘플을 대조군으로 하였다. 결과는 말린 포도껍질 1 그램 당 μg 으로 표시하였다.(표 2)
| Samples | 피세이드** | 레스베라트롤** | |
| Unheated | Control | 15.40 ± 6.90 | 16.89 ± 1.55 |
| β-Glucosidase | 16.47 ± 11.50 | 11.45 ± 7.17 | |
| VinoTaste Pro | 26.81 ± 10.18 | 13.13 ± 8.74 | |
| Heated | Control | 56.27 ± 12.34 | 72.35 ± 12.80 |
| β-Glucosidase | 16.88 ± 8.21 | 139.05 ± 28.79 | |
| VinoTaste Pro | nd* | 205.27 ± 31.73 |
*nd: not detected
**Data represent mean ± standard deviation (S.D.) of three independent measurements.
7. 포도껍질 추출물의 항산화 활성 분석
포도 껍질 샘플을 80%(v/v) 에탄올로 추출한 후 95℃에서 10 분간 예열한 샘플 및 예열하지 않은 샘플에 각각 VinoTaste Pro 효소 처리를 시행하였다. 다른 조건 하에서 준비된 포도 껍질 추출물을 공지된 방법으로(Thaipong, Boonprakob, Crosby, Cisneros-Zevallos, & Byrne, 2006) ABTS+- 및 DPPH 라디칼 소거 활성에 대해 분석 하였다.
포도 껍질 추출물의 총 페놀, 플라보노이드 및 안토시아닌의 농도는 공지된 방법으로 계산하였다. (Ariffin, Chew, Bupinder, Karim, & Huda, 2011; Lee, Durst, & Wrolstad, 2005; Singleton, Orthofer, & Lamuela- Raventos, 1999).
증류수에서 열처리 후, 80%(v/v) 에탄올 용액에서 추출한 포도 껍질 추출물의 라디칼 소거능을 측정하였다 (도 2). 효소 처리 없이 포도 껍질을 95℃에서 10 분간 열처리하면 용량 의존적으로 ABTS+ 및 DPPH 라디칼 소거능이 향상되었다. 그러나, 35, 45, 55, 65 및 75 ℃에서의 열처리는 라디칼 소거 활성을 향상 시키는데 비 효율적이었다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과와 일치하여 총 페놀, 안토시아닌 및 플라보노이드의 농도는 처리 온도에 비례하여 증가하지 않았지만 35-75℃에서 가열하여 제조한 포도 껍질 추출물은 총 페놀, 플라보노이드, 및 안토시아닌(anthocyanins)을 가열하지 않은 것보다 더 많이 추출하였다.
그러나 95 ℃에서 10 분 동안 가열하여 제조 한 포도 피부 추출물은 75℃ 이하에서 가열한 시료보다 유의하게 높은 항산화 수준을 보였다. 이와 같이 추가 공정 전에 95℃에서 포도 껍질 샘플을 열처리하여 레스베라트롤 및 기타 산화 방지제의 추출을 실질적으로 향상시키는 결과를 나타내었다.
| Temperature(°C) | Total Anthocyanins | Total Phenolics | Total Flavonoids |
| Control | 125.35 ± 3.48*,a | 48.97 ± 1.37a | 167.50 ± 7.89a |
| 35 | 213.10 ± 11.13c | 77.23 ± 0.89b,c | 297.30 ± 8.62c |
| 45 | 175.37 ± 3.77b | 82.14±0.58c | 279.35 ± 5.21c |
| 55 | 240.20 ± 7.67d | 80.93 ± 1.01c | 413.46 ± 15.33e |
| 65 | 144.81 ± 4.89a | 72.54±2.13b | 219.74 ± 8.56b |
| 75 | 189.87 ± 8.81b | 78.25 ± 1.79c | 334.82 ± 18.68d |
| 95 | 390.62 ± 9.56e | 92.71 ± 2.58d | 630.03 ± 10.20 |
8. 통계적 분석
수집 된 데이터는 SPSS Statistics 22 소프트웨어 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 편도 분산 분석 (ANOVA)으로 분석되었다. 평균값 사이의 통계적 유의성은 Duncan의 다중 범위 검정에 의해 p<0.05에서 결정되었다. 값 사이의 통계적 차이는 다른 알파벳 문자를 사용하여 표시하였다.
<결론>
본 연구는 포도 껍질에 존재하는 피세이드와 자연적으로 발생하는 레스베라트롤로부터 전환 된 레스베라트롤 모두를 추출하는 효율적인 방법을 보고한다. 열처리와 포도 피부 추출물의 효소 처리는 레스베라트롤의 총 생산량을 크게 향상시켰다. 보다 구체적으로, 95℃에서 10 분간 열처리 후, exo-β-1,3-glucanase와 Polygalacturonase 효소를 사용하여 포도 껍질을 80%(v/v) 에탄올을 용매로 추출할 경우, 레스베라트롤 추출 수율이 매우 향상되었다. 따라서, 전술한 포도 껍질 추출 방법은 식품의 레스베라트롤 강화를 위한 저가의 산업적 대안을 제공 할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (10)
- (a) 포도 껍질을 동결 건조하는 단계;
(b) 상기 동결 건조된 포도 껍질을 95℃ 온도에서 10분간 가열하는 단계; 및
(c) 상기 가열된 포도 껍질에 추출 용매를 가하여 추출한 추출물을 폴리갈락투로나아제 및 엑소-1,3-β-글루카나아제로 처리하여 분해하는 단계를 포함하는 레스베라트롤 추출 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 동결 건조된 포도 껍질을 분말화하여 증류수를 가한 뒤, 가열하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤 추출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 물, 알코올, 주정 중 선택된 추출용매로 레스베라트롤의 전구체인 피세이드를 추출하는 과정을 포함하는 것인 레스베라트롤 추출 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 추출 방법에 따라 추출된 추출물은 건조된 포도 껍질 1g 당 50 내지 500㎍의 레스베라트롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤 추출 방법.
- 제1항, 제3항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 기재된 추출 방법에 따라 추출된 레스베라트롤 추출물을 포함하는, 항산화용 식품 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 식품 조성물은 음료, 음료 베이스, 건강기능식품 및 기능성식품 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항산화용 식품 조성물. - 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2018/008678 WO2019088408A1 (ko) | 2017-10-31 | 2018-07-31 | 열 및 효소 처리를 통하여 포도 껍질로부터 레스베라트롤을 추출하는 방법 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170144028 | 2017-10-31 | ||
| KR20170144028 | 2017-10-31 |
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| KR20190049384A KR20190049384A (ko) | 2019-05-09 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020180047141A KR102011600B1 (ko) | 2017-10-31 | 2018-04-24 | 열 및 효소 처리를 통하여 포도 껍질로부터 레스베라트롤을 추출하는 방법 |
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| KR (1) | KR102011600B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017171751A (ja) | 2016-03-23 | 2017-09-28 | 一般社団法人長野県農協地域開発機構 | 天然色素抽出液の製造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0164359B1 (ko) | 1995-09-06 | 1999-02-18 | 김광호 | 싸이클시간을 감소시키기 위한 반도체 메모리 장치 |
| FR2790645B1 (fr) * | 1999-03-12 | 2001-06-08 | Arkopharma Laboratoires | Complement alimentaire et procede de traitement cosmetique a base d' un extrait de raisin riche en polyphenols |
| KR20130016750A (ko) * | 2011-08-09 | 2013-02-19 | 이영주 | 포도송이가지의 레스베라트롤 추출 및 정제 |
-
2018
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Catalysts, 2016. 02. 24, 제6권, 아티클 번호 32, 제1-10면* |
| Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 제49권, 제210-215면* |
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|---|---|
| KR20190049384A (ko) | 2019-05-09 |
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