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KR101989134B1 - 항―ｉｌ１ｒａｐ 항체 및 그의 인간 치료 용도 - Google Patents

항―ｉｌ１ｒａｐ 항체 및 그의 인간 치료 용도 Download PDF

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KR101989134B1
KR101989134B1 KR1020137021676A KR20137021676A KR101989134B1 KR 101989134 B1 KR101989134 B1 KR 101989134B1 KR 1020137021676 A KR1020137021676 A KR 1020137021676A KR 20137021676 A KR20137021676 A KR 20137021676A KR 101989134 B1 KR101989134 B1 KR 101989134B1
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il1rap
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antibody
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토아스 피오레토스
마르쿠스 예로스
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칸타르기아 아베
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Abstract

세포 사망을 유도하고 및/또는 고형 종양과 연관된 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하기 위해 사용되는, 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(interleukin-1 receptor accessory protein, IL1RAP)에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티를 포함하거나, 그로 구성된 작용제로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 작용제(agent)를 제공한다. 본 발명의 관련된 양태는 고형 종양과 연관된 병리적 세포의 검출에서 사용하기 위한, 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티를 포함하거나, 그로 구성된 작용제로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 작용제를 제공한다. 또한, 본 발명의 작용제를 포함하는 약리적 조성물 및 그를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

항―ＩＬ１ＲＡＰ 항체 및 그의 인간 치료 용도{Anti-IL1RAP Antibodies and their use for treating human}
본 발명은 고형 종양, 예를 들면, 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 및 육종의 치료 및 진단에서 사용하기 위한 작용제(agent)에 관한 것이다.
약물 내성은 고형 종양에서 화학요법의 효과를 제한하는 주요한 인자이다. 그와 같은 종양은 화학요법 전에 본질적으로 내성을 가질 수 있거나, 또는 초기에 화학요법에 대해 감수성을 갖는 종양에 의해 치료 동안 내성이 획득될 수 있다.
또한, 내성의 획득 과정에서, 종양은 광범위한 화학요법에 대해 교차-내성(cross-resistant)을 갖게 될 수 있고, 궁극적으로 전이성 질환을 갖는 환자의 90%보다 높은 비율에서 치료 실패를 초래한다.
또한, 본 발명은 고형 종양의 치료 및 진단에서 사용하기 위한 신규한 작용제 및 방법을 제공하고자 한다.
발명의 요약
본 발명의 제1 양태는 (직접적으로 또는 간접적으로 면역계의 작동(triggering)을 통해)세포 사망을 유도하고 및/또는 고형 종양과 연관된 세포의 성장(즉, 크기) 및/또는 증식(즉, 개수)을 억제하기 위해 사용되는, 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(interleukin-1 receptor accessory protein, IL1RAP)에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티를 포함하거나, 그로 구성된 작용제로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 작용제(agent)를 제공한다. 따라서, 본 발명은 환자에서 고형 종양의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 작용제를 제공한다.
본 발명의 제2 관련된 양태는 고형 종양과 연관된 세포의 검출에서 사용하기 위한, 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티를 포함하거나, 그로 구성된 작용제로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 작용제를 제공한다.
"인터루킨-1 수용체 부속 단백질(Interleukin-1 receptor accessory protein)", "IL1RAP" 및 "IL1-RAP"에 의해, 본 발명자들은 구체적으로 인간 IL1RAP 단백질, 예를 들면, GenBank Accession No. AAB84059, NCBI Reference Sequence: NP_002173.1 및 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q9NPH3-1에 기재된 인간 IL1RAP 단백질을 포함시킨다(또한, Huang et al., 1997, Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 94 (24), 12829-12832 참조). IL1RAP는 또한 과학 학술 문헌에서 IL1R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1RAcP 및 EG3556로 알려져 있다.
"결합 모이어티(binding moiety)"에 의해, 본 발명자들은 IL1RAP에 결합할 수 있는, 모든 종류의 화학적 물질(chemical entity)(예를 들면, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드 모방체(peptidomimetics), 및 소형 화합물)을 포함시킨다. 유리하게, 결합 모이어티는 생리적 조건 하에서 선택적으로(즉, 우선적으로(preferentially)) IL1RAP에 결합할 수 있다. 결합 모이어티는 바람직하게, 세포(예를 들면, 고형 종양 세포)의 표면에 국재화(localize)될 수 있는, 인간 IL1RAP에 대한 특이성을 갖는다.
"고형 종양과 연관된 세포(cell associated with a solid tumour)"에 의해, 본 발명자들은 고형 종양 세포 그 자체를 포함시킨다. 또한, 그와 같은 세포는 개체에서 고형 종양의 발병에 직접적으로 또는 간접적으로 역할을 하는 병리적 줄기 세포(즉, 암 줄기 세포(cancer stem cell), 또는 CSC) 및 전구 세포(progenitor cell)를 포함시킨다. CSC의 예는 Visvader & Lindeman, 2008, Nat Rev Cancer 8:755-768에 개시된다.
본 발명의 제1 양태의 일 구체예에서, 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두부/경부암(head/neck cancer), 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 피부암, 결장암, 폐암, 비뇨기관 암, 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 고형 종양은 전립선암, 흑색종, 자궁경부암, 식도암, 및 두부 및/또는 경부 암(head and/or neck cancer)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 구체예에서, 상기 고형 종양은 흑색종이다.
본 발명의 진단 양태와 관련하여, 작용제는 (그러한 세포에 기능적 영향을 갖지 않으면서) 고형 종양과 연관된 세포의 표면에 존재하는 IL1RAP에 결합할 수 있는 것만으로 충분하다.
본 발명의 치료 및 예방적 양태와 관련하여, 당업자는 고형 종양과 연관된 세포의 표면에 존재하는 IL1RAP로의 작용제의 결합이 IL1RAP의 생물학적 활성의 조절(modulation)(즉, 증가 또는 감소)을 가져올 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 그와 같은 조절 효과는 필수적이지 않다; 예를 들면, 본 발명의 작용제는 단순히 고형 종양과 연관된 세포의 표면에 있는 IL1RAP로의 결합에 의해 치료적 및 예방적 효과를 도출할 수 있으며, 상기 결합은 뒤이어 면역계가 (예를 들면, ADCC에 의해, 및/또는 작용제 내 세포독성/방사성 모이어티의 존재에 의해) 세포 사망을 유도하도록 작동시킬 수 있다.
"IL1RAP의 생물학적 활성(biological activity of IL1RAP)"에 의해, 본 발명자들은 고형 종양과 연관된 세포 상의 IL1RAP를 포함하는, 상호작용 또는 신호전달(signalling) 사건을 포함시킨다. 예를 들면, 일 구체예에서, 상기 작용제는 하나 이상의 보조-수용체(co-receptor)(예를 들면, IL1R1, ST2, C-KIT 및/또는 IL1RL2)의 IL1RAP로의 결합을 차단할 수 있다.
본 발명의 작용제에 의한 그와 같은 IL1RAP의 생물학적 활성의 억제는 전체적이거나 또는 부분적일 수 있다. 예를 들면, 상기 작용제는 그에 노출되지 않았던, 고형 종양과 연관된 세포에서 IL1RAP의 생물학적 활성 대비, IL1RAP의 생물학적 활성을 10% 이상, 바람직하게는, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 100% 억제할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 작용제는 그에 노출되지 않았던, 고형 종양과 연관된 세포 중 IL1RAP의 생물학적 활성 대비, IL1RAP의 생물학적 활성을 50% 또는 그 이상 억제할 수 있다.
또한, 고형 종양과 연관된 세포의 성장 및/또는 증식의 억제는 전체적이거나 또는 부분적일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 상기 작용제는 그에 노출되지 않았던, 고형 종양과 연관된 세포의 성장 및/또는 증식 대비, 고형 종양과 연관된 세포의 성장 및/또는 증식을 10% 이상, 바람직하게는, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 100% 억제할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 작용제는 고형 종양과 연관된 세포를 사멸시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 작용제는 아폽토시스(apoptosis) 또는 자식(autophagy)에 의해 세포를 사망시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 작용제는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)에 의해 아폽토시스를 유도할 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 작용제는 IL1RAP에 대한 특이성을 갖는 결합 모이어티를 구성하는 적합한 화학적 물질을 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다.
테스트 화학적 물질과 IL1RAP 간의 상호작용을 검출하는 방법이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 이온 분무 질량 분광분석법(ion spray mass spectroscopy)/HPLC 방법을 동반한 한외여과 또는 기타 물리적 및 분석적 방법이 이용될 수 있다. 또한, 상호 간에 인접했을 때 형광 표지의 상호작용을 측정하는 것에 의해 두 개의 형광 표지 물질(fluorescent labelled entity)의 결합을 측정할 수 있는 것인 FRET(Fluorescence Energy Resonance Transfer) 방법이 이용될 수 있다.
거대분자, 예를 들면, DNA, RNA, 단백질 및 인지질로의 IL1RAP의 결합을 검출하는 방법은 표면 플라스몬 공명 분석, 예를 들면, Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348에 기재된 방법을 포함한다. 그와 같은 방법은 표지된 폴리펩티드, 예를 들면, 방사성 표지 또는 형광 표지에 의해 표지된 폴리펩티드를 이용할 수 있다.
IL1RAP에 결합할 수 있는 화학적 물질을 확인하는 또 다른 방법은 단백질을 화합물에 노출시키고, 화합물의 상기 단백질로의 결합을 검출 및/또는 측정하는 것인 방법이다. 화합물의 폴리펩티드로의 결합에 대한 결합 상수(binding constant)가 결정될 수 있다. 화합물의 폴리펩티드로의 결합을 검출 및/또는 측정(정량)하는 적절한 방법이 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들면, 고 처리율 작동(high throughput operation)이 가능한 방법, 예를 들면, 칩-기반 방법을 이용하여 수행될 수 있다. VLSIPS™라 불리는 새로운 기술이 수십만 개 이상의 상이한 분자 프로브를 포함하는 매우 작은 칩의 제조를 가능하게 했다. 이러한 생물학적 칩은 어레이로 배열된 프로브를 포함하고, 각 프로브는 특정한 위치에 배치된다. 각 위치가 예를 들면, 10 마이크론의 규모를 갖는 생물학적 칩이 제조되었다. 생물학적 칩은 표적 분자가 칩 상의 프로브와 상호작용하는지 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 선택된 테스트 조건 하에서 어레이를 표적 분자에 노출시킨 후, 스캐닝 장치가 어레이 중의 각 위치를 검사하고, 표적 분자가 그 위치에서 프로브와 상호작용했는지 여부를 결정할 수 있다.
IL1RAP에 대한 결합 친화도를 갖는 화합물을 확인(identify)하는 또 다른 방법은 본 발명의 폴리펩티드가 IL1RAP에 결합하는 단백질을 "포획(capture)"하기 위해 이용될 수 있는 것인 효모 이중 혼성화 시스템(yeast two-hybrid system)이다. 효모 이중-혼성화 시스템은 Fields & Song, Nature 340:245-246 (1989)에 기재된다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 작용제는 폴리펩티드를 포함하거나 또는 그로 구성된다.
예를 들면, 상기 작용제는 IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 IL1RAP에 대한 결합 특이성을 보유하는, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 변이체, 융합체(fusion), 또는 유도체(derivative), 또는 상기 변이체 또는 그의 유도체의 융합체를 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다.
"항체(antibody)"에 의해, 본 발명자들은 실질적으로 온전한(intact) 항체 분자, 및 키메라 항체, 인간화(humanized) 항체, 인간 항체(천연 인간 항체 대비 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 항체), 단쇄 항체(single chain antibody), 이중 특이성(bispecific) 항체, 항체 중쇄(antibody heavy chain), 항체 경쇄(antibody light chain), 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동형 이량체(homodimer) 및 이형 이량체(heterodimer), 및 그의 항원 결합 단편 및 유도체를 포함시킨다.
"항원-결합 단편(antigen-binding fragment)"에 의해, 본 발명자들은 IL1RAP에 결합할 수 있는 항체의 기능성 단편을 의미한다.
바람직하게는, 항원-결합 단편은 Fv　단편(예를 들면, 단쇄 Fv 및 이황화-결합(disulphide-bonded) Fv), Fab-유사 단편(Fab-like fragment)(예를 들면, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인 (예를 들면,　VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 포맷 및 듀얼 포맷(dual format)[즉, dAb-링커-dAb]을 포함한, dAb)로 구성된 군으로부터 선택된다.
전체 항체가 아닌, 항체 단편을 사용하는 것의 장점은 7가지이다. 단편의 보다 작은 크기가 개선된 약리적 특성, 예를 들면, 고형 조직으로의 보다 우수한 침투력(penetration)을 가져올 수 있다. 또한, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편과 같은 항원-결합 단편은 대장균에서 발현되고, 그로부터 분비될 수 있어서, 다량의 그러한 단편의 용이한 제조를 가능하게 한다.
또한, 항체 및 그의 항원-결합 단편의 변형된 버전, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 적합한 폴리머(하기 참조)의 공유결합에 의한 부착에 의해 변형된 버전도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
항체 및 항체 단편을 생성하는 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 항체는 항체 분자의 인 비보 생성의 유도, 면역글로불린 라이브러리의 스크리닝 (Orlandi. et al, 1989. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) 또는 배양된 세포주에 의한 단일클론 항체의 생성을 이용하는 여러 방법 중 하나를 통해 생성될 수 있다. 이들은 하이브리도마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법, 및 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)-하이브리도마 기법(Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol . Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc . Natl. Acad . Sci . USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol . Cell . Biol . 62:109-120)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
선택된 항원에 대한 적합한 단일클론 항체는 공지된 기법, 예를 들면, "Monoclonal Antibodies : A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications ", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)에 개시된 기법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 항체 단편은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법 (예를 들면, Harlow & Lane, 1988, " Antibodies : A Laboratory Manual " Cold Spring Harbor Laboratory, New York 참조)을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체 단편은 항체의 단백질 분해성(proteolytic) 가수분해 또는 대장균 또는 포유동물 세포(예를 들면, CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 배양물 또는 기타 단백질 발현 시스템) 중 그 단편을 코딩하는 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 처리에 의해 수득될 수 있다.
당업자는 인간의 치료법 또는 진단을 위해, 인간 또는 인간화 항체가 바람직하게 이용된다는 것을 이해할 것이다. 비-인간(예를 들면, 마우스) 항체의 인간화 형태는 바람직하게는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 부분(minimal-portion)을 갖는, 유전적으로 조작된(genetically engineered) 키메라 항체 또는 항체 단편이다. 인간화 항체는 인간 항체(수용자(recipient) 항체)의 상보성 결정 영역(complementary determining region)이 원하는 기능을 갖는, 마우스, 랫트, 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 상보성 결정 영역으로부터의 잔기에 의해 치환된 것인 항체를 포함한다. 일부 경우에, 인간 항체의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체나 또는 도입된(imported) 상보성 결정 영역 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 하나 이상, 및 통상적으로 두 개의 가변 도메인 모두를 포함할 것이고, 상기 가변 도메인에서 상보성 결정 영역의 전체 또는 실질적인 전체는 비-인간 항체의 상보성 결정 영역과 일치하고(correspond), 프레임워크 영역의 전체 또는 실질적인 전체는 관련된 인간 컨센서스 서열(consensus sequence)의 프레임워크 영역과 일치한다. 인간화 항체는 또한 최적으로, 통상적으로 인간 항체로부터 유래된, 항체 불변 영역의 적어도 일부, 예를 들면, Fc 영역을 포함한다 (예를 들면, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596 참조).
비-인간 항체를 인간화하는 방법이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 출처(source)로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 종종 도입된 잔기(imported residue)로 지칭되는, 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 통상적으로 도입된 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 인간 상보성 결정 영역을 상응하는 설치류 상보성 결정 영역으로 치환하는 것에 의해 개시된 바와 같이 (예를 들면, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al ., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l; US 4,816,567 참조) 본질적으로 수행될 수 있다. 따라서, 그와 같은 인간화 항체는 온전한 인간 가변 영역보다 실질적으로 더 작은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 것인 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 일부 상보성 결정 영역 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체 중 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 것인 인간 항체일 수 있다.
인간 항체는 또한 파아지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 포함한, 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 확인될 수 있다 (예를 들면, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol . Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol . Biol . 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol . 147:86-95 참조).
일단 적합한 항체가 수득되면, 이들은 활성에 대해, 예를 들면, ELISA에 의해 테스트될 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 대안적인 구체예에서, 상기 작용제는 비-면역글로불린 결합 모이어티(non-immunoglobulin binding moiety), 예를 들면, Skerra, Curr Opin Biotechnol. 2007 Aug;18(4):295-304에 기재된 모이어티를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
추가적인 대안적 구체예에서, 상기 작용제는 앱타머(aptamer)를 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 작용제는 펩티드 앱타머 또는 핵산 앱타머를 포함하거나 또는 그로 구성될 수 있다 (Hoppe-Seyler & Butz, 2000, J Mol Med . 78 (8): 426-30; Bunka DH & Stockley PG, 2006, Nat Rev Microbiol . 4 (8): 588-96 and Drabovich et al., 2006, Anal Chem . 78 (9): 3171-8).
또 다른 대안적 구체에에서, 상기 작용제는 소형 화학적 물질(small chemical entity)을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 그러한 IL1RAP 결합 특성을 갖는 화학적 물질은 소형 화합물의 상용 라이브러리 (예를 들면, ChemBridge Corporation, San Diego, USA로부터 입수가능한 라이브러리)를 스크리닝하는 것에 의해 확인될 수 있다
결합 모이어티 외에, 본 발명의 작용제는 상기 작용제의 인 비보 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 더 포함할 수 있고, 예를 들면, 상기 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화기(glycosylation group), 지방산, 및 덱스트란이나, 이에 한정되지 않는다. 그와 같은 추가적 모이어티는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 결합 모이어티에 접합(conjugate)되거나 또는 달리 결합될 수 있다.
또한, 본 발명의 작용제는 세포독성 모이어티(cytotoxic moiety)를 더 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
예를 들면, 세포독성 모이어티는 방사성 동위원소, 예를 들면, 아스타틴-211, 비스무트-212, 비스무트-213, 요오드-131, 이트륨-90, 루테튬-177, 사마륨-153 및 팔라듐-109을 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다..
대안적으로, 세포독성 모이어티는 독소(예를 들면, 사포린 또는 칼리키아미신(calicheamicin))를 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다.
또한 대안적으로, 세포독성 모이어티는 화학요법제(예를 들면, 대사길항물질)를 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명의 작용제는 검출가능한 모이어티를 더 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
예를 들면, 상기 검출가능한 모이어티는 방사성 동위원소, 예를 들면, 테크니튬-99m, 인듐-111, 갈륨-67, 갈륨-68, 비소-72, 지르코늄-89, 요오드-12, 또는 탈륨-201을 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다.
대안적으로, 상기 검출가능한 모이어티는 상자성 동위원소(paramagnetic isotope), 예를 들면, 가돌리늄-157, 망간-55, 디스프로슘-162, 크로뮴-52, 또는 철-56을 포함하거나, 또는 그로 구성될 수 있다.
세포독성 모이어티 및 검출가능한 모이어티는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 결합 모이어티에 접합되거나 또는 달리 결합될 수 있다(예를 들면, 기존 면역컨쥬게이트 치료제(immunoconjugate therapy), 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin) [상품명: Mylotarg ®]은 세포독소 칼리키아미신에 결합된 단일클론 항체를 포함한다).
본 발명의 제3 양태는 약학적으로 허용가능한 완충제, 희석제, 아쥬반트, 또는 부형제와 함께, 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태와 관련하여 정의된 작용제의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
EDTA, 시트레이트, EGTA, 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제를 포함한, 추가적인 화합물이 본 발명의 조성물에 또한 포함될 수 있다.
인간 및 동물로의 투여를 위해 충분한 보관 안정성 및 적합성을 갖는 약학적 조성물이 당해 기술 분야에서 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 약학적 조성물은 동결건조, 예를 들면, 냉동 건조(freeze drying), 분무 건조, 분무 냉각을 통해, 또는 초임계 입자 형성(supercritical particle formation)으로부터의 입자 형성의 이용을 통해 동결건조될 수 있다.
"약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"에 의해, 본 발명자들은 본 발명의 작용제의 IL1RAP-결합 활성의 효과를 감소시키지 않는, 무독성 물질을 의미한다. 그와 같은 약학적으로 허용가능한 완충제, 담체 또는 부형제는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) 및 handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000) 참조, 이들 문헌의 개시는 참조에 의해 본 명세서에 포함됨).
용어 "완충제(buffer)"는 pH를 안정화시키는 목적을 갖는 산-염기 혼합물을 포함하는 수용액을 의미하도록 의도된다. 완충제의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 시트르산염, 글리콜산염, 유산염, 붕산염, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트(cacodylate), CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸아세트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제(diluent)"는 약학적 제제(pharmaceutical preparation) 중 작용제를 희석시킬 목적을 갖는 수성 또는 비-수성 용액을 의미하도록 의도된다. 희석제는 염수(saline), 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 또는 오일(예를 들면, 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 또는 참기름) 중 하나 이상일 수 있다.
용어 "아쥬반트(adjuvant)"는 본 발명의 작용제의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제제에 첨가된 화합물을 의미하도록 의도된다. 아쥬반트는 상이한 음이온을 갖는 하나 이상의 아연, 구리, 또는 은 염일 수 있고, 예를 들면, 상이한 아실 조성의 아세테이트, 타르트레이트, 보레이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 카르보네이트, 포스페이트, 히드록시드, 술피트(sulfite), 티오시아네이트, 요오다이드, 브로마이드, 클로라이드, 및 플루오라이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아쥬반트는 또한 양이온성 중합체, 예를 들면, 양이온성 셀룰로오스 에테르, 양이온성 셀룰로오스 에스테르, 탈아세틸화 히알루론산(deacetylated hyaluronic acid), 키토산, 양이온성 덴드리머(cationic dendrimer), 양이온성 합성 중합체, 예를 들면, 폴리(비닐 이미다졸), 및 양이온성 폴리펩티드, 예를 들면, 폴리히스티딘, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 및 이들 아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다.
부형제는 하나 이상의 탄수화물, 중합체, 지질, 및 미네랄일 수 있다. 탄수화물의 예는 락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 및 사이클로덱스트린을 포함하고, 이들은 조성물에 예를 들면, 동결건조를 촉진하기 위해 첨가된다. 중합체의 예는 전분, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 에틸히드록시에틸 셀룰로오스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌옥시드/폴리프로필렌 옥시드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐 알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈이고, 모든 상이한 분자량일 수 있고, 이들은 조성물에, 예를 들면, 점도 조절을 위해, 생물흡착(bioadhesion)을 달성하기 위해, 또는 생화학적 분해 및 단백질 가수분해에 의한 분해(proteolytic degradation)로부터 지질을 보호하기 위해 첨가된다. 지질의 예는 모든 상이한 아실 사슬 길이 및 포화도의 지방산, 인지질, 모노글리세리드, 디글리세리드, 및 트리글리세리드, 세라미드(ceramide), 스핑고리피드(sphingolipid) 및 글리콜리피드(glycolipid), 난 레시틴(egg lecithin), 대두 레시틴, 수소화된(hydrogenated) 난 및 대두 레시틴이고, 이들은 조성물에 중합체의 첨가와 유사한 이유로 첨가된다. 미네랄의 예는 탈크, 산화 마그네슘, 산화 아연, 및 산화 티탄(titanium oxide)이고, 이들은 액체 축적의 감소 또는 유리한 색소 특성과 같은 잇점을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.
본 발명의 작용제는 그의 전달을 위해 적합한 것으로 당해 기술 분야에서 알려진 유형의 약학적 조성물로 제제화될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 리포좀의 제형일 수 있고, 리포좀에서, 작용제는 다른 약학적으로 허용가능한 담체 외에, 지질과 같은 양친매성 작용제와 조합되어, 미셀(miscell), 불용성 단일층(insoluble monolayer), 및 액정(liquid crystal)으로서 응집된 형태로 존재한다. 리포좀 제제를 위한 적절한 지질은 한정 없이, 모노글리세리드, 디글리세리드, 술파티드(sulfatide), 리소레시틴(lysolecithin), 인지질, 사포닌, 담즙산, 등을 포함한다. 적절한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 연장시키기 위해, 극성 헤드그룹(polar headgroup)에서 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 전술된 지질을 포함한다. 그와 같은 리포좀 제제의 제조는 예를 들면, 참조에 의해 그의 개시가 본 명세서에 포함된, 미국특허 제4,235,871호에서 찾을 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생분해성 미소구체(iodegradable microsphere)의 형태일 수 있다. 지방족 폴리에스테르(aliphatic polyester), 예를 들면, 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), PLA와 PGA의 공중합체 (PLGA) 또는 폴리(카르프로락톤) (PCL), 및 폴리안하이드라이드(polyanhydride)가 미소구체의 제조에서 생분해성 중합체로 널리 이용되었다. 그와 같은 미소구체의 제조는 참조에 의해 그의 개시가 본 명세서에 포함된, US　5,851,451 및 EP　0 213　303에서 찾을 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물이 중합체 겔의 제형으로 제공되고, 상기 중합체 겔에서, 전분, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 에틸히드록시에틸 셀룰로오스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌옥시드/폴리프로필렌 옥시드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐 알코올/폴리비닐 아세테이트, 및 폴리비닐비롤리돈이 본 발명의 작용제를 포함하는 용액의 증점(thickening)을 위해 사용된다. 상기 중합체는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
대안적으로, 상기 작용제는 단순히, 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예를 들면, 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 또는 참기름), 타라가간트 검, 및/또는 다양한 완충제에 용해될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 활성제의 작용을 강화하기 위해 이온 및 정의된 pH를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 추가적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균과 같은 통상적인 약제학적 공정에 적용될 수 있고 및/또는 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 완충제, 충진제, 등과 같은 통상적인 아쥬반트를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 가능한 투여 경로는 비경구(정맥내, 피하, 및 근육내) 경로, 국소 경로, 안구(ocular), 비강, 폐, 구강(buccal), 경구, 비경구, 질 및 직장 경로를 포함한다. 또한, 이식물로부터의 투여가 가능하다.
하나의 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 비경구로, 예를 들면, 정맥내로, 측뇌실내로(intracerebroventricularly), 관절내로(intraarticularly), 동맥내로(intraarterially), 복막내로, 경막내로(intrathecally), 심실내로, 흉골내로(intrasternally), 두개내로(intracranially), 근육내로, 또는 피하로 투여되거나, 이들은 주입 기법(infusion technique)에 의해 투여될 수 있다. 이들은 기타 물질, 예를 들면, 용액을 혈액과 등장성이 되게 하기에 충분한 염 또는 글루코오스를 포함할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 편리하게 이용된다. 상기 수용액은 필요한 경우, 적절하게 (바람직하게는 3 내지 9의 pH까지) 완충되어야 한다. 멸균 조건 하에서 적절한 비경구 제제의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약제학적 기법에 의해 용이하게 달성된다.
비경구 투여를 위해 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 세균증식 억제제(bacteriostat), 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 주사 용액; 및 현탁제(suspending agent) 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제제는 단위-투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에, 멸균 액체 담체, 예를 들면, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동-건조(동결건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액(extemporaneous injection solution) 및 현탁액이 전술된 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구, 예를 들면, 정맥내 투여를 위해 특히 적합하다.
대안적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 비강내로, 또는 흡입에 의해 (예를 들면, 적절한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로-메탄, 디클로로테트라플루오로-에탄, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134A3) 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 (HFA 227EA3)과 같은 히드로플루오로알칸, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용한, 가압 용기, 펌프, 스프레이, 또는 네뷸라이저의 형태로) 투여될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 정량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하는 것에 의해 결정될 수 있다. 가압된 용기, 펌프, 스프레이, 또는 네뷸라이저는 예를 들면, 용매로서 에탄올과 추진제의 혼합물을 이용한, 활성 펩티드의 용액 또는 현탁액을 담을 수 있고, 이들은 윤활제, 예를 들면, 소르비탄 트리올리에이트를 추가적으로 포함할 수 있다. 흡입기 또는 취입기(insufflator)에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들면, 젤라틴으로 제조된 캡슐 및 카트리지)는 본 발명의 화합물과, 락토오스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스(powder base)의 분말 믹스를 담도록 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 환자에게 약학적 유효량(pharmaceutically effective dose)으로 투여될 것이다. 본 명세서에서 사용된, "치료적 유효량(therapeutically effective amount)" 또는 "유효량(effective amount)" 또는 "치료적으로 유효한(therapeutically effective)"은 주어진 상태 및 투여 계획(administration regimen)에 대해 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다. 이는 요구되는 첨가제 및 희석제, 즉, 담체 또는 투여 비히클과 함께 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 물질의 소정량(predetermined amount)이다. 또한, 숙주의 활성, 기능, 및 반응에서 임상적으로 유의한 결함을 감소시키고, 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미하도록 의도된다. 대안적으로, 치료적 유효량은 숙주에서 임상적으로 유의한 상태의 개선을 유발하기에 충분한 양이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 화합물의 양은 그의 비활성(specific acitvity)에 따라 변할 수 있다. 적절한 투여량(dosage amount)은 요구되는 희석제와 함께 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 조성물의 소정량을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조를 위한 방법 및 용도에서, 활성 화합물의 치료적 유효량이 제공된다. 치료적 유효량은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 환자 특성, 예를 들면, 연령, 체중, 성별, 상태, 합병증, 기타 질환, 등에 근거하여 통상적인 의료 또는 수의학 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료적 유효량의 투여는 개별적인 단위 투여량 유닛 또는 여러 개의 보다 작은 투여량 유닛의 제형으로 단일 투여에 의해 및 특정한 간격으로 나누어진 투여량(subdivided dose)의 복수 투여에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 투여량은 연장된 기간에 걸쳐 지속적 주입으로 제공될 수 있다.
폴리펩티드는 사용되는 화합물의 효능/독성에 따라, 다양한 농도로 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 제제는 0.1　μM 내지 1　mM, 보다 바람직하게는, 1　μM 내지 500　μM, 500　μM 내지 1　mM, 300　μM 내지 700　μM, 1　μM 내지 100　μM, 100 μM 내지 200　μM, 200　μM 내지 300　μM, 300　μM 내지 400　μM, 400　μM 내지 500　μM 및 가장 바람직하게는 약 500　μM의 농도로 활성제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 고형 종양의 치료에서 사용되는 다른 치료제, 예를 들면, 대사길항물질, 알킬화제, 안트라사이클린 및 기타 세포독성 항생제, 빈카 알칼로이드(vinca alkyloid), 에토포시드(etoposide), 플래티눔 화합물(platinum compound), 탁산(taxane), 토포이소머라아제(topoisomerase) I 억제제, 항증식성 면역억제제(antiproliferative immunosuppressant), 코르티코스테로이드, 성 호르몬, 및 호르몬 길항제, 및 기타 치료 항체(예를 들면, 트라스투주맙) 와 함께 투여될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태와 관련하여 정의된 작용제, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 제5 양태는 세포의 사망을 유도하고, 및/또는 고형 종양과 연관된 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태와 관련하여 정의된 작용제의 용도로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 용도를 제공한다.
본 발명의 관련된 제6 양태는 고형 종양과 연관된 세포를 검출하기 위한 진단제의 제조에서 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태와 관련하여 정의된 작용제의 용도로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 용도를 제공한다. 따라서, 상기 약제는 환자에서 고형 종양의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 관련된 제7 양태는 IL1RAP를 발현하는, 고형 종양과 연관된 세포를 검출하기 위한, 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태와 관련하여 정의된 작용제의 용도를 제공한다.
전술된 본 발명의 용도 양태의 일 구체예에서, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암(brain/CNS), 자궁경부암, 식도암, 위암, 두부/경부암(head/neck cancer), 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 상기 고형 종양은 전립선, 유방, 피부, 결장, 폐, 비뇨기관 및 자궁의 암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 고형 종양은 전립선암, 흑색종, 자궁경부암, 식도암, 및 두부 및/또는 경부 암(head and/or neck cancer)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 양태의 추가적인 구체예에서, 상기 고형 종양은 흑색종이다.
본 발명의 제8 양태는 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태와 관련하여 정의된 작용제 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 약학적 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 세포 사망을 유도하고, 및/또는 고형 종양과 연관된 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. "치료(treatment)"에 의해, 본 발명자들은 환자의 치유적(therapeutic) 및 예방적 치료 모두를 포함한다. 용어 "예방적(prophylactic)"은 환자 또는 개체에서 고형 종양의 가능성(likelihood)을 예방하거나 또는 감소시키는, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 제제의 용도를 포함하도록 사용된다.
본 발명의 제9 양태는 본 발명의 제1 양태 또는 제2 양태와 관련하여 정의된 작용제 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 약학적 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 고형 종양과 연관된 세포를 검출하는 방법으로서, 상기 세포는 IL1RAP를 발현하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 전술된 방법 양태의 일 구체예에서, 상기 고형 종양은 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두부/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 피부암, 결장암, 폐암, 비뇨기관 암, 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 고형 종양은 전립선암, 흑색종, 자궁경부암, 식도암, 및 두부 및/또는 경부 암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 추가적인 구체예에서, 상기 고형 종양은 흑색종이다.
본 발명의 특정 양태를 구현하는, 바람직한, 비-한정적 예가 하기의 도면을 참조하여 설명될 것이다:
도 1. P210 BCR / ABL1 발현은 제대혈 CD34 + 세포에서 IL1RAP 발현을 유도한다.
유동 세포 분석(flow cytometric analysis)은 형질도입(transduction) 3일 후, 제대혈 CD34+ 세포에서 레트로바이러스 P210 BCR / ABL1 발현시 IL1RAP 발현이 유도된다는 것을 확인한다. CD34+GFP+ 세포는 도트 플롯(dot plot) 중 게이트(gate)에 따라 통과되었다(gated). 히스토그램(histogram)은 음성 대조군 염색(백색), MIG 대조군(엷은 회색) 및 MIG-P120 (짙은 회색)에 대해 IL1RAP의 발현을 보여준다. 도트 플롯 중 숫자는 개별적인 게이트/사분면 내 세포의 백분율을 보여준다. 3회 중 대표적인 실험이 표시된다.
도 2. IL1RAP 는 원시(primitive) CML 세포에서 상향조절된다.
5명의 CML 환자 및 2명의 정상 bm 시료로부터의 CD34+ 세포에 대한 FACS 분석. 대표적인 CML 환자 중 CD34+CD38+ 또는 CD34+CD38- 세포에 대한 게이팅(gating)을 보여주는 FACS 도트 플롯 (2a). CD34+CD38+ 세포에서 IL1RAP 발현을 보여주는 히스토그램 (2b). CD34+CD38- 세포에서 IL1RAP 발현을 보여주는 히스토그램 (2c). 백색은 대조군 염색 시료를 나타내고, 회색은 IL1RAP 염색 시료를 나타낸다. CD34+CD38-IL1RAP- 및 CD34+CD38-IL1RAP+ 세포에 대한 분류 게이트(sorting gate)가 히스토그램에 요약된다. 도트 플롯 및 히스토그램 중 숫자는 개별적인 게이트/사분면 내 세포의 백분율을 보여준다.
도 3. IL1RAP 발현은 CD34 + CD38 - 세포 구획( cell compartment) 내에서 Ph + CML 세포를 Ph - CML 세포로부터 구별한다.
5개의 CML 환자 시료로부터의 CML CD34+CD38-IL1RAP- 및 CD34+CD38-IL1RAP+ 세포에 대한 Flow-drop-FISH는 각각 BCR/ABL1- 과 BCR/ABL1+ 세포 간의 거의 완전한 분리를 밝혔다. 흑색 막대는 BCR/ABL1 음성 세포를 나타내고, 백색 막대는 BCR/ABL1 양성 세포를 나타낸다. 각 막대의 상부에 기재된 것은 기록된(scored) 총 핵 중 Ph+ 세포의 갯수이다.
도 4. IL1RAP 발현은 Ph + CML 줄기 세포를 정상 HSC 로부터 구별한다.
CD34+CD38-IL1RAP- 및 CD34+CD38-IL1RAP+ 세포로부터 유래된 LTC-CFC의 갯수 (4a). 흑색 막대는 IL1RAP- 세포를 나타내고, 백색 막대는 IL1RAP+ 세포를 나타낸다. LTC-CFC에 대한 인터페이스 FISH (4b). 흑색 막대는 BCR/ABL1 음성 세포를 나타내고, 백색 막대는 BCR/ABL1 양성 세포를 나타낸다. 각 막대의 상부에 기재된 것은 기록된 총 핵 중 Ph+ 세포의 갯수이다.
도 5. IL1RAP 의 항체 표적화에 의한 CML 세포주의 사멸
필라델피아 염색체를 갖지 않은 KG-1 세포 상에서의 발현 대비, 필라델피아 염색체를 갖는 CML 환자로부터 유래된 KU812 세포 상의 IL1RAP 발현을 보여주는 히스토그램 (A). 백색은 대조군 염색 시료(control stained sample)를 보여주고 회색은 KMT-1 염색 시료를 보여준다. 백혈병 세포주 KG-1은 IL1RAP 발현이 없는 반면, KU812는 IL1RAP를 발현한다 (B). 그 결과, KG-1에서는 낮은 수준의 항체 유도 세포 사망이 관찰되나, KU812 세포에 대해 KMT-1을 이용하여 투여량-의존적 ADCC 효과가 관찰되었다 (B). 비특이적 ADCC 효과에 대한 대조군으로서, 토끼 IgG 항체도 실험에서 이용했다. 그래프는 3회의 독립적인 실험으로부터 항체 유도 세포 사망의 평균 및 표준 편차를 보여준다.
도 6. IL1RAP 의 항체 표적화에 의한 CML 줄기 세포의 사멸
KMT-1을 이용하는 것에 의해, 정상 골수 CD34+CD38- 세포는 IL1RAP에 대해 음성으로 염색되고, CML CD34+CD38+ 및 CD34+CD38- 세포는 IL1RAP를 발현했다. CML-1에 대한 히스토그램은 대표적인 실험으로부터 표시된다 (6a). 백색은 대조군 염색 시료를 보여주고, 회색은 KMT-1 염색 시료를 보여준다. IL1RAP 발현의 수준과 일치하여, 정상 골수 CD34+CD38- 세포를 이용한 경우, 명백한 ADCC 효과는 관찰되지 않았으나, KMT-1은 CML CD34+ 및 CD34+CD38- 세포 모두에서 강한 투여량-의존적 ADCC 효과를 유도했다 (6b). 비특이적 ADCC 효과에 대한 대조군으로서, 토끼 IgG 항체도 실험에서 이용했다. 그래프는 CML-1, CML-3, CML-4, 및 4개의 정상 골수 시료를 이용한 3회의 독립적인 실험으로부터 항체 유도 세포 사망의 평균 및 표준 편차를 보여준다.
도 7. IL1RAP 는 일차( primary ) ALL 및 AML 줄기 세포 상에서 발현된다.
급성 골수성 백혈병 (AML) 세포를 진단시 환자로부터 받았다. 대표적인 AML 환자로부터의 CD34+CD38- 및 CD34+CD38+ 세포에서 IL1RAP의 발현이 제시된다 (7a). AML 세포주 MONO-MAC-6 및 ALL 세포주 REH는 IL1RAP를 발현한다 (7b). 급성 림프성 백혈병(Acute lymphoid leukemia, ALL) 세포를 진단시 환자로부터 받았다. 대표적인 Ph+ ALL 환자로부터의 CD34+CD38- 및 CD34+CD38+ 세포 상의 IL1RAP 발현이 제시된다 (7c). 백색은 대조군 염색 시료를 나타내고 회색은 IL1RAP 염색 시료를 나타낸다.
도 8. IL1RAP 의 항체 표적화에 의한 AML 및 ALL 세포주의 사멸
ADCC 분석에서, KMT-1 투여량 의존적 세포 사망은 MONO-MAC-6 및 REH 세포주 모두에서 유도되었고, 이는 IL1RAP 표적화 항체가 CML보다는 더 넓은 치료 창(therapeutic window)를 가질 수 있다는 것을 시사한다. 비특이적 ADCC 효과에 대한 대조군으로서, 토끼 IgG 항체도 실험에서 이용했다. 그래프는 3회의 독립적인 실험으로부터 항체 유도 세포 사망의 평균 및 표준 편차를 보여준다.
도 9. IL1RAP 의 항체 표적화에 의한 AML 및 ALL 줄기 세포의 사멸
ADCC 분석에서, KMT-1 유도 세포 사망이 일차 AML CD34+CD38- (A) 및 ALL CD34+CD38- (B) 세포 모두에서 관찰되어, IL1RAP 표적화 항체가 또한,세포 표면상에 IL1RAP의 상향 조절을 갖는 AML 및 ALL에서 치료적 효과를 갖는다는 것을 확인했다. 비특이적 ADCC 효과에 대한 대조군으로서, 토끼 IgG 항체도 실험에서 이용했다. 그래프는 특이적 항체 유도 세포 사망(specific antibody induced cell death)을 보여준다.
도 10. IL1RAP 는 MPD 및 MDS 환자로부터의 백혈병 줄기 세포( leukemic stem cell) 상에서 발현된다.
JAK2 돌연변이의 존재 및 부재인 2명의 MPD 환자 (MPD-1 and MPD-2)의 CD34+CD38- 세포에서 IL1RAP 발현을 보여주는 등고선도(contour plot) (A). AML로 진행된 MDS 환자에서 IL1RAP 발현을 보여주는 히스토그램 (B). 백색은 대조군 염색 시료를 보여주고 회색은 항-IL1RAP 항체로 염색된 시료를 보여준다.
도 11. IL1RAP 는 고형 종양으로부터 유래된 암세포의 표면에서 발현된다.
인간 고형 종양으로부터 유래된 상이한 세포주를 항-인간 IL-1 RAcP/IL-1 R3-APC (cat no FAB676A, R&D system) (흑색 선) 및 이소형 대조군(isotype control) (회색 선)으로 염색했다.　유동 세포 분석은 COLO829 (악성 흑색종), HCC1954 (유방관암종(breast ductal carcinoma)), NCI-8228 (폐 선암종), NCI-H716 (결장암), OV-90 (난소 선암종), H716 (결장암), H2228 (폐 선암종), SH-4 (흑색종), SR (림프종) 및　 SW 1783 (성상세포종) 상에서 IL1RAP의 발현을 보여준다.
도 12. IL1RAP 는 고형 종양으로부터 유래된 암 세포의 표면에서 발현된다.
H716 (결장암), H2228 (폐 선암종), HCC1954 (유방관암종), 및 SH-4 (흑색종)에서 IL1RAP 발현을 보여주는, IL1RAP에 대한 항체, mab81.2로 표지된 4종의 상이한 인간 암 세포주로부터의 세포의 유동 세포 측정 분석으로부터의 히스토그램.
도 13. IL1RAP 의 항체 표적화는 인간 NK -세포를 인간 암세포 상에서의 ADCC 로 지시한다.
ADCC 분석에서 항-인간 IL1RAP 항체 mab81.2, 및 인간 NK 세포에 의해 유도된 특이적 세포 사망의 수준을 보여주는 그래프. 이소형 대조군으로서, 비-특이적 인간 IgG1 항체를 실험에 포함시켰다.
도 14. SK - MEL -5 흑색종 세포주의 인 비보 성장에 대한 mAb 81.2의 효과.
mAb 81.2를 주당 2회 10mg/kg 체중으로 복막 내로 투여했다. 대조군 마우스를 동일 부피의 PBS로 처리했다. 각 실험군은 10 마리의 마우스를 포함했다. 결과는 평균 종양 부피 (mm3)로 표시되고; 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
실시예 1
IL1RAP 는 만성 골수성 백혈병( CML ) 줄기 세포에 대한 세포 표면 바이오마커이다 .
요약
만성 골수성 백혈병 (CML)의 영구적인 치료를 달성하는 것을 목적으로 하는, CML에 대한 치료 전략은 CML 줄기 세포의 완전한 근절을 요구할 것이다. 정상 조혈 줄기 세포(HSC)와 자기 증식(self-renew) 능력을 공유하는, CML 줄기 세포는 현재까지 세포 표면 마커를 이용하여 정상 HSC로부터 구별할 수 없었던 백혈병 세포의 작은 집단을 나타낸다. CML 줄기 세포를 표적화하는 하나의 전략은 CML 줄기 세포에 대한 세포 표면 바이오마커를 확인하는 것이고, 상기 마커에 대해 미래의 치료 항체가 제조될 수 있을 것이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 전체적 유전자 발현 분석(global gene expresion analysis)을 이용하여, IL1RAP가 원시(primitive) CML CD34+ 세포에서, 및 이소성 P210 BCR/ABL1 발현의 결과로 보통(commonly) 상향 조절되었다(upregulated)는 것을 확인했다. 본 발명자들은 또한 IL1RAP 발현이 CML 및 정상 HSC를 모두 갖는 희귀한 CD34+CD38- 세포 집단을 두 개의 분획, 즉, IL1RAP 발현의 낮은 수준/부재(absent)를 갖는 분획과 보다 높은 IL1RAP 발현을 갖는 분획으로 분리한다는 것을 보여준다. 프로토콜을 확립하여, 소수의 분류된(sorted) 세포에서 FISA에 의한 BCR/ABL1의 검출을 가능하게 한 후, 본 발명자들은 CML CD34+CD38- 세포 내에서, IL1RAP+ 세포는 BCR/ABL1+이고, 반면에, IL1RAP- 세포는 거의 전적으로 BCR/ABL1-라는 것을 관찰했다. 두 개의 세포 집단에서 장기 배양-개시 세포(long term culture-initiating cell, LTC-IC) 분석을 더 수행하여, 본 발명자들은 후보 CML 줄기 세포와 정상 HSC가 전향적으로(prospectively) 분리될 수 있다는 것을 발견했다. 따라서, 이 연구는 IL1RAP를 CML 줄기 세포를 정상 HSC로부터 구별하는 최초의 세포 표면 마커로 확인하고 CML 및 관련 질환, 예를 들면, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 골수증식성 질환(myeloproliferative disorder, MPD), 및 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome, MDS)에서 치료 및 진단 전략을 위한 새로운 길을 연다.
도입( Introduction )
CML 줄기 세포에 대한 세포 표면 마커를 확인하기 위해, 본 발명자들은 전체적 유전자 발현 분석을 수행하여, 원시 CML 환자 세포에서 및 이소성 P210 BCR/ABL1 발현의 결과로 상향조절된, 인터루킨 1 수용체 부속 단백질 (IL1RAP)를 최고의 후보로 확인하였다. 소수의 분류된 세포에서 BCR / ABL1을 검출하기 위한 분석을 개발한 후, 본 발명자들은 IL1RAP 발현이 원시 백혈병 세포와 정상 세포의 전향적(prospective) 분리를 가능하게 한다는 것을 보여준다. 장기 배양-개시 세포 분석을 이용하여, 본 발명자들은 IL1RAP가 CML 줄기 세포에 대한 세포 표면 바이오마커로, 최초로 정상 HSC로부터 CML 줄기 세포의 전향적 분리를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
재료 및 방법
CML 환자 세포의 수집
제대혈 CD34 + 세포의 단리 및 형질도입( transduction )
현지 윤리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 고지된 동의 후 치료를 개시하기 전에 진단 시 CML 환자로부터의 혈액 시료와 가끔, 골수 시료를 수득했다. 시료를 스웨덴, 룬드 대학 병원, 혈액과 및 덴마크, 코펜하겐, Rigshospitalet로부터 받았다. 제조사의 설명서에 따라, LymphoprepTM (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway)를 이용하여, 단핵세포 (MSC)를 분리하고, 앞서 개시된 바와 같이22, 정기적으로 CD34+ 세포 단리 키트 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 CD34+ 세포를 강화(enrich)시켰고, 이는 95% 이상의 CD34+ 세포의 순도를 가져왔다. 단핵 세포의 부속분획(subfraction)을 항체 염색을 개시하기 전에 액체 질소에서 살아있는 상태로 보관하였다. CD34+ 세포를 2개의 분획으로 나누었다; 하나의 분획은 PBS로 세척하고 Trizol에 재현탁시키고 -80 ℃에서 동결시키고, 나머지 분획은 액체 질소에서 동결시켰다. 기준 시료(reference sample)로서, 룬드 대학 병원에서 고지된 동의 후, 건강한 지원자로부터의 골수 시료를 수득하고, 뒤이어 전술된 바와 같이 CD34-세포 단리를 수행했다.
마이크로어레이 분석
스웨덴, 룬드 대학교의 Swegene DNA Microarray Resource Center로부터의 올리고뉴클레오티드 슬라이드를 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행했다. Pronto Universal Hybridization 키트 (Corning Inc, Corning, NY)를 이용하여 혼성화를 수행했다. 본질적으로 앞서 기술된 바와 같이23, RNA 단리 및 마이크로어레이 분석을 수행했다. 데이터 시각화(visualization)는 소프트웨어 Qlucore Omics Explorer 2.0 (Qlucore, Lund, Sweden)를 이용하여 수행했다.
유동 세포 분석( Flow cytometric analysis )
FACS Canto에서 유동 세포 분석을 수행하고, FACS Aria (both from BD)에서 유동 세포측정 세포 분류(flow cytometric cell sorting)를 수행했다. 세포 염색(cell staining) 전에, 표준 절차에 따라 CD34+ 세포를 해동시키고 2% FCS를 포함하는 PBS (세척 매질)에서 1회 세척했다. 비오틴-표지된 염소 항-인간 IL1RAP 다중클론 항체 (batch 667, R&D Systems, Abingdon, UK)를 얼음 상에서 30분 동안 세포를 염색하기 위해 1:100 희석으로 이용했다. 뒤이어, 세포를 세척하고 PE-접합(PE-conjugated) 스트렙타비딘을 1:200 희석으로 30분 동안 이용했다. 보조-염색(co-staining)을 위해 APC-접합 항-CD34 및 FITC-접합 항-CD38 단일클론 항체를 이용했다(IL1RAP를 제외하고, 사용된 모든 항체는 Beckton-Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA로부터 구입했다). 세포 분류(cell sorting) 전에, PE-접합 스트렙타비딘의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 세포를 2회 세척했다. 이소형 매칭 대조군 항체(isotype matching control antibody)를 음성 대조군으로 이용했다.
세포 분류 및 인터페이스 FISH( Cell sorting and interphase FISH )
유리 슬라이드를 습윤 챔버(moist chamber)에서 유지하면서, 2시간 동안 0.01 % 폴리 L-라이신(Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden)으로 처리하고, 물로 1회 세척하고, 건조될 때까지, 37℃에서 핫 플레이트 상에서 건조시켰다. 뒤이어, 96-웰 조직 배양 플레이트를 주형으로 하여, 소수성 펜(hydrophobic pen) (Daido Sangyo Co., Ltd. Tokyo, Japan)을 이용하여 원을 그렸다. 세포 분류 전에, 그러나, 실온에서 2시간 이상 동안 건조한 후, 방울을 형성하기 위해, 25 ㎕ PBS를 원(ring)에 적용했다. 세포 분류 동안, 30개 내지 3000개의 세포를 2개의 방울로 직접 동시에 분류했다. 세포의 표면으로의 부착을 가능하게 하고, 방울의 건조를 피하기 위해, 슬라이드를 습윤 챔버에서 얼음 상에서 30분 동안 유지하고, 그 후 세포를 메탄올:아세트산 (3:1)에서 10분 동안 고정시켰다. 뒤이어, 슬라이드를 밤새 70℃ 오븐에서 인큐베이션하고, 뒤이어 FISH를 수행했다. BCR / ABL1 (Abbot, Wiesbaden, Germany)에 대한 듀얼 컬러 프로브를 사용했다.
장기 배양-개시 세포( Long term culture - initiating cell , LTC - IC )
M210B4 기질 세포(stroma cell)를 이전에 개시된 바와 같이24 ,25, 10% FCS로 보충한 RPMI-1640 배지를 배양했다. 세포 분류의 2일 전에, 기질 세포를 10-6 M 히드로코르티손 (Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden)을 포함하는 200 ㎕ Myelocult 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)에 mL 당 50,000개의 세포 밀도로 96-웰 플레이트의 웰에 접종했다. 세포 분류 24시간 전에, 기질 세포에 1000 Rad를 조사했다. 세포 분류 동안, 두 세트로(in duplicate), 100 내지 500개의 세포를 기질-사전코팅(precoated) 웰 내로 직접 분류시키고, 100 ㎕ 배지를 3시간 뒤에 교환했다. 주당 1회, 100 ㎕ 배양 배지의 교환을 반복했다. 5 내지 6주 배양 후, 세포를 세척하고 24-웰 플레이트 중 메틸셀룰로오스 배지(MethoCult H44435; Stem Cell Technologies)에 플레이팅했다. 2주 후에, 콜로니의 갯수를 측정했다. 개별 웰로부터의 콜로니를 모으고, 세척하고, 슬라이드 상의 PBS 방울에 적용하고, 뒤이어 전술된 바와 같이, FISH 분석을 수행했다.
제대혈 CD34 + 세포 중 P210 BCR / ABL1 발현
현지 유리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 고지된 동의를 얻은 후에, 정상 분만으로부터 제대혈 시료를 수집했다. 이전에 개시된 바와 같이22, CD34+ 세포를 강화하여, 95% 이상의 CD34+ 세포의 순도를 수득했다. 본 연구에서, RD114 슈도타입(pseudotyped) MSCV-IRES-GFP (MIG) 및 MIG-P210 바이러스 벡터를 이용했다23. 이전에 개시된 바와 같이23, 트롬보포이에틴 (TPO; 50 ng/mL), 줄기 세포 인자 (SCF; 100 ng/mL), 및 Flt-3-리간드 (FL; 100 ng/mL)가 보충된 SFMM 배지 (Stem Cell Technology, Vancouver, Canada)에서 CD34+ 세포를 배양하고 형질도입시켰다.
결과 및 검토
전체적 유전자 발현 분석( global gene expression analysis )은 CML CD34 + 세포 상에서 IL1RAP 가 상향조절되는 것으로 확인한다
Ph+ CML 줄기 세포(C Eaves14에 의해 검토됨)에 대한 세포 표면 바이오마커를 확인하기 위한 목적으로 많은 노력을 연구에 기울였다. 백혈병 세포 및 정상 세포가 FISH에 의한 백혈병 특이적 BCR / ABL1 융합 유전자의 검출 후에 CML에서 후향적으로(retrospectively) 다소 용이하게 확인될 수 있어서, CML을 전향적으로 백혈병 세포와 정상 세포를 분리하기 위한 시도를 평가하기 위한 이상적 질환이 되게 한다. 그러나, 현재까지, CML 줄기 세포의 정상 HSC로부터의 전향적 분리를 가능하게 하는 세포 표면 마커는 확인된 바 없었다. 전체적 유전자 발현 분석은 조혈 줄기 세포와 전구 세포(progenitor cell)를 구별하는 SLAM 수용체와 같은 새로운 HSC 마커를 찾기 위한 강력한 전략인 것으로 입증되었다15. CML 줄기 세포에 대한 후보 세포 표면 바이오마커를 코딩하는 상향조절된 유전자를 찾기 위해, 11개의 CML 환자 시료 및 5개의 정상 골수(bm) 시료로부터 CD34+ 세포의 전사 프로파일을 비교했다. CML에서 확인된 상향조절된 유전자는 모든 공지된 CD 분자를 포함하도록 수동으로 정리된(manually curated), GO(Gene Ontology) 카테고리 "원형질막 결합(Integral to plasma membrance)"에 일치(match)되었다(세부사항은 재료 및 방법 참조). 통틀어, CML CD34+ 세포 중 13개의 상향조절된 유전자가 원형질막 결합 유전자 카테고리에 일치되었다 (데이터는 나타내지 않음). 상향조절된 유전자를 P210 BCR / ABL1 발현에 보다 직접적으로 더 연결시키기 위해, 본 발명자들은 동시에 제대혈 CD34+ 세포에서 P210 BCR / ABL1 발현의 결과로서 상향조절된 유전자의 목록을 생성했다. 이 분석은 동일한 GO 카테고리 유전자 목록에 일치하는 23개의 상향조절된 유전자를 가져왔다(데이터는 표시되지 않음). 흥미롭게도, 단 하나의 유전자, 인터루킨 1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)만이 CD34+ CML 세포, 및 P210 BCR / ABL1 발현의 결과로 제대혈 CD34+ 세포, 모두에서 강한 상향조절을 보였다. IL1RAP가 두 유전자 목록 모두에 존재한다는 발견은 원시 CML 세포에서의 상향조절이 P210 BCR / ABL1 발현과 밀접하게 연결(couple)된다는 것을 시사하고, IL1RAP는 원시 CML 세포 상의 신규한 백혈병-연관 항원(leukemia-associated antigen)이라는 것을 나타낸다.
IL1RAP 는 CML 환자로부터의 CD34 + CD38 - 세포에서 상향조절되고, 이소성( ectopic ) P210 BCR / ABL1 발현의 결과로 유도된다.
IL1RAP는 Toll-유사 수용체 수퍼패밀리(Toll-like receptor superfamily)의 일원이고 인터루킨 1 수용체 타입 1 (IL-1R1)에 대한 잘 알려진 보조-수용체이다16. IL1RAP는 따라서 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 IL-1의 효과를 매개하는데 결정적이나, 또한 IL-33의 수용체인 ST2로의 결합을 통해 T-세포 및 비만 세포를 활성화시키는 사이토카인인 IL-33의 신호를 매개하는데에도 관여하고, ST2는 뒤이어 IL1RAP와 이량체를 형성한다17. IL-1R1 활성화는 이전에 인터페론 감수성 CML 세포18의 콜로니 성장을 자극하는 것으로 확인되었으나, 본 발명자들이 알기로는, IL1RAP가 CML에 직접 연결되지는 않았다.
P210 BCR / ABL1이 CML의 특징으로 CML 세포에 존재하므로, 이상적으로, CML 중 신뢰할 수 있는 세포 표면 바이오마커는 P210 BCR / ABL1의 존재 및 발현과 직접적으로 연결되어야 한다. 마이크로어레이 데이터와 일치하여, IL1RAP 발현은 실제로 레트로바이러스 P210 BCR / ABL1 발현 후, CB CD34+ 세포의 표면 상에서 실제로 상향조절되었다 (도 1). 이는 P210 BCR / ABL1이 직접적으로, 또는 간접적인 효과를 통해 IL1RAP 발현을 조절한다는 것을 시사하여, CML 바이오마커로서의 후보 위치(candidature)를 강화한다.
본 발명자들은 그 후, 대다수의 보다 성숙한 CD34+ 세포를 나타내는, CML CD34+CD38+ 세포 상에서 세포 표면 IL1RAP 발현을 조사했다. 이 세포 집단에서, 상응하는 정상 bm 세포에서의 발현 대비, IL1RAP의 상향조절이 관찰되었다(도 2a, 2b). 정상 CD34+CD38+ 세포는 CML 세포에서의 발현과 부분적으로 중첩되는 보다 낮은 IL1RAP 발현을 보였다. 본 발명자들은 HSC를 포함하는, 정상 세포의 CD34+CD38- 세포 구획(compartment)으로 관심을 기울였다. 이전의 연구와 일치하여, 이 집단은 IL1RAP 발현의 낮은 수준/부재를 보였다 (도 2c)19. 현저하게, Ph+ CML 줄기 세포 및 정상 HSC를 모두 갖는 CML 환자로부터의 CD34+CD38- 세포는 2개의 집단으로 분리되었다: 한 집단은 IL1RAP 발현의 낮은 수준/부재를 보이고, 다른 집단은 보다 높은 IL1RAP 발현을 보였다 (도 2c). 5명의 CML 환자의 말초 혈액 (PB)에서, IL1RAP 양성 세포 분획은 CD34+CD38- 세포의 75% 내지 95%를 구성했다 (n = 5). 이러한 발견에 근거하여, 본 발명자들은 IL1RAP 발현이 CML의 CD34+CD38- 세포 구획 내에서 정상 세포와 백혈병 세포를 구별할 수 있다고 추측했다. 모든 CML 줄기 세포와 정상 HSC는 전적으로 CD34+CD38- 세포 내에서 발견되고, 정상 세포와 백혈병 세포 간의 그러한 분리는 정상 HSC로부터 CML 줄기 세포의 전향적 분리를 가능하게 할 것이다.
Flow - drop - FISH 는 IL1RAP 발현이 CML CD34 + CD38 - 세포 내에서 정상 세포와 백혈병 세포를 분리한다는 것을 보여준다.
IL1RAP 발현이 CML CD34+CD38- 세포 구획 내에서 정상 (Ph-) 세포와 백혈병 (Ph+) 세포를 구별하는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 소수의 분류된 세포 상에서 형광 인 시투 혼성화(fluorescent in situ hybridization, FISH)를 수행하기 위한 새로운 프로토콜을 수립했다 (재료 및 방법 참조). 이 프로토콜의 제1 단계는 부분적으로 세포를 슬라이드 상의 방울로 분류하고, 뒤이어 단일 세포 면역-염색을 수행하는 방법에 근거한다20. 하기에서 Flow-drop-FISH로 지칭되는, 슬라이드 상의 방울로의 직접적인 세포의 분류 및 뒤이은 FISH를 포함하는 이 새로운 프로토콜을 적용하는 것에 의해, 본 발명자들은 30개의 세포를 방울 내로 분류하고, 그로부터 15개의 핵을 성공적으로 FISH에 의해 평가했다 (CML-5, 도 3). 흥미롭게도, 본 발명자들은 Flow-drop-FISH에 의해 CML CD34+CD38-IL1RAP+ 세포가 BCR / ABL1 + 이고, CML CD34+CD38-IL1RAP- 세포는 거의 전적으로 Ph-라는 것을 확인했다(n = 5, 도 3). 이 데이터는 IL1RAP 발현이 CML CD34+CD38- 세포 구획 내에서 백혈병 세포와 정상 세포를 분리한다는 것을 보여주어, CML 줄기 세포 및 정상 HSC가 전향적으로 분리될 수 있다는 것을 나타낸다.
CML 줄기 세포는 CD34 + CD38 - IL1RAP + 이고, 반면에 정상 HSC 는 CD34 + CD38 - IL1RAP -/low 이다.
만성기(chronic phase) CML 줄기 세포에 대한 연구는 현재까지 줄기 세포 구획이 장기 분석 후에 백혈병 세포가 우세한 것인 희귀한 CML 환자로의 접근에 대해 전달(relay)했다14. CML 줄기 세포는 일반적으로 면역-결핍 마우스에서 열등한 생착(engraftment)을 보이므로, 장기 배양 개시 세포(LTC-IC)-분석이 후보 CML 줄기 세포의 검출을 위한 대리 분석(surrogate assay)으로 널리 이용된다. CML CD34+CD38-IL1RAP+ 및 CD34+CD38-IL1RAP-/ low가 독특하게 각각 후보 CML 줄기 세포 및 정상 HSC를 포함하는지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 LTC-IC 분석에서 두 개의 세포 집단을 테스트했다. 정상 대조군으로부터의 골수 CD34+ 세포의 경우, 장기 배양-콜로니 형성 세포(long term culture-colony forming cell, LTC-CFC)는 CD34+CD38-IL1RAP+ 세포 대비, CD34+CD38-IL1RAP- 세포 중에서 > 100배 더 높은 빈도로 확인되어(도 4a, n= 2), 정상 CD34+CD38-IL1RAP-가 계층적으로(hierarchically) CD34+CD38-IL1RAP+ 세포 위에 있다는 것을 나타낸다. CML에서, 본 발명자들은 CD34+CD38-IL1RAP+ 세포 대비, CD34+CD38-IL1RAP- 세포 내에서 LTC-CFC의 평균 3.6배 더 높은 빈도를 관찰했고 (n= 5, Fig 4a), 이는 원시 세포에 대해 CML CD34+CD38-IL1RAP- 세포가 더 강화(enrich)되었다는 것을 시사한다. 중요하게, CML 환자 시료 및 정상 대조군으로부터의 CD34+CD38-IL1RAP+ 세포에서보다 CD34+CD38-IL1RAP- 세포에서 더 많은 갯수의 LTC-IC가 관찰되었으나, CMT LTC-콜로니에 대한 FISH는 두 그룹에서 Ph- 세포와 Ph+ 세포 간의 거의 완전한 구별을 밝혔다 (도 4b). CD34+CD38-IL1RAP- 세포로부터 유래된 CML LTC-콜로니는 거의 전적으로 Ph-이고, 반면에, CD34+CD38-IL1RAP+는 거의 전적으로 Ph+였다. 이 데이터는 IL1RAP가 정상 HSC로부터 CML 줄기 세포를 분리하기 위해 이용될 수 있는 신규한 세포 표면 바이오마커이다.
본 연구에서, 본 발명자들은 전체적 유전자 발현 분석을 통해, 신규한 세포 표면 항원, IL1RAP를 확인했고, IL1RAP는 복수 분석에서 검사(challenging) 후, Ph+ CML 줄기 세포에 대한 신규한 세포 표면 바이오마커이기 위한 기준을 충족시켰다. 이 발견에 근거하여, CML에서 미래 지향적 치료법(future directed therapy)이 IL1RAP에 대한 치료 항체를 사용하는 것에 의해, 정상 HSC를 보존하면서, CML 줄기 세포를 표적하도록 설계될 수 있다. 또한, 항-CD34, 항-CD38 및 항-IL1RAP 항체를 포함하는 항체 칵테일은 진단 목적 및 상이한 치료를 받고 있는 CML 환자의 후속 연구를 위해 이용될 수 있다. 중요하게, 정상 및 CML 줄기 세포의 전향적 분리는 이 두 세포 집단의 미래 기전 연구(mechanistic study)를 가능하게 할 것이다. 또한, 본 발명자들은 또한 Flow-drop-FISH가 점점 더 작고 더 순수한 세포 집단으로 정제되었던 세포 종류인 백혈병 줄기 세포(leukemic stem cell)와 같은 소수의 분류된 세포에서 유전적 이상을 규명하는 데 유용한 방법으로 이용될 수 있다는 것을 보여준다2 1. 미래 연구를 위해, 이 방법은 예를 들면, 다양한 작은 백혈병 줄기 세포 및 전구 세포 집단에서 유전적 이상의 검출을 가능하게 하고, 이 발견은 백혈병 발병(leukemogenesis)을 이해하기 위한 핵심 지식인 다양한 이상이 획득되는 순서에 대한 새로운 이해를 제공할 것으로 보인다. 또한, Flow-drop-FISH는 치료 동안 백혈병 줄기 세포에 대한 치료 효과를 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 중요하게, 본 발명자들은 Flow-drop-FISH를 이용하여, IL1RAP가 정상 HSC로부터 CML 줄기 세포를 구별하는 최초의 세포 표면 마커라는 것을 확인했고, 이 발견은 줄기 세포 및/또는 전구 세포에서의 IL1RAP의 상향조절과 연관된 CML 및 기타 종양성 혈액 질환(neoplastic hematologic disorder)에 대한 새로운 치료 기회를 연다.
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실시예 2
백혈병 줄기 세포 및 전구 세포 상의 IL1RAP 의 항체-표적화가 항체-의존성 세포-매개 세포독성 ( ADCC )를 유발한다.
요약
영구적 치료를 달성하는 것을 목표로 하는 백혈병에 대한 치료 전략은 백혈병 줄기 세포의 완전한 제거를 요구할 것이다. 백혈병 세포(leukemic cell)의 작은 집단을 나타내는, 백혈병 줄기 세포는 지금까지 세포 표면 마커를 이용하여 정상 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 구별될 수 없었다. 백혈병 줄기 세포를 표적화하는 새로운 개념은 백혈구 줄기 세포에 대한 세포 표면 바이오마커를 확인하는 것이고, 이 바이오마커에 대해 미래 치료 항체가 제조될 수 있을 것이다 (실시예 1 참조).
본 연구에서, 본 발명자들은 항-IL1RAP 항체를 생성하고, 만성 골수성 백혈병 (CML) 줄기 세포, 급성 골수성 백혈병 (AML) 줄기 세포, 및 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL) 줄기 세포를 표적화하는 항-IL1RAP가 항체-의존성-세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도하기 위해 이용될 수 있다는 개념의 증거(proof of concept)를 제공하고, 반면에 정상 HSC에 대해서는 세포독성 효과가 관찰되지 않았다. 또한, 본 발명자들은 IL1RAP 양성 세포주 KU812 (CML), MONO-MAC-6 (급성 골수성 백혈병; AML) 및 REH (급성 림프모세포종 세포주; ALL)에서 투여량-의존적 IL1RAP 표적화 ADCC를 입증한다. 본 발명자들은 또한 MDS 및 MPD 줄기 세포가 IL1RAP 발현을 증가시켰다는 것을 보여주고, 이는 미래의 치료적 항-IL1RAP 표적화 항체가 또한 이들 질환에서도 효과적일 것이라는 것을 나타낸다.
따라서, 이 연구는 CML, AML, ALL, MDS, 및 MPD에서 백혈병 줄기 세포 상의 IL1RAP의 항체 표적화에 의한 새로운 치료 기회를 연다.
재료 및 방법
KMT -1의 생성; 다중 클론 토끼 항-인간 IL1RAP 항체
토끼를 IL1RAP의 세포외 도메인으로 면역화시켰다. 토끼로부터의 혈청을 증가된 반감기를 위해 면역화 단백질(immunizing protein)에 존재하는 면역글루불린 도메인으로의 항체 결합이 면역글로불린 적재 컬럼(immunoglobulin loaded column)으로의 결합을 통해 제거되었다는 것을 제외하고는, 표준 절차에 따라 정제했다. ELISA에서, 정제된 항체는 IL1RAP의 세포외 도메인에 결합하고 인간 면역글로불린 도메인에 결합하는 항체는 없는 것으로 확인했다. 유동 세포측정법에서 이용된 경우, PE접합 염소 항-토끼 IgG 항체를 이차 시약(secondary reagent)으로 사용했다.
ADCC 분석
이전에 개시된 프로토콜1에 근거하여 ADCC 분석을 수행했다. 요약하면, 표적 세포를 제조사의 설명서에 따라 PKH26 (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri)으로 표지화하고, 세포를 직접 96-웰 플레이트의 웰에 직접 넣거나, 또는 CD34+CD38- 세포의 분류(sorting) 후 웰에 접종했다. KU812 및 KG-1 세포주 및 일차(primary) CD34+ 세포를 웰 당 10,000 개의 세포로 접종하고, 일차 CD34+CD38- 세포를 웰 당 2,000 내지 3,000개의 세포로 접종했다. 뒤이어, 항체를 상이한 농도로 웰에 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션하고, 그 후, 100,000개의 NK-효능자(NK-effector) 세포를 각 웰에 첨가했다. 제조사의 설명서에 따라 NK-세포 음성 세포 분리 키트(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여, 고지된 동의 후, 건강한 지원자로부터 추출했다. 비-면역화(non-immunized) 토끼로부터 정제된 토끼 IgG 항체를 실험에서 대조군 항체로 이용했다 (R&D Systems Abingdon, UK). 세포 사망의 검출에 대한 7-AAD 양성 세포를 FACS CANTO 유동 세포 측정기(flow cytometer) (BD)를 이용하여 측정했다. 항체 유도 세포 사망의 평균 및 표준 편차를 하기 식에 따라 계산했다:
3회 이상의 독립 실험에 근거한, (정의된 항체 농도에서의 7-AAD+ 세포의 비율 - 항체가 없는 경우의 7-AAD+ 세포의 비율) / (0.01 x 항체가 없는 경우의 7-AAD- 세포의 비율) (도 9; 실험 1 제외).
11명의 AML 환자 및 2명의 Ph+ ALL 환자로부터의 시료는 룬드 대학 병원으로부터 받았고, CML 세포의 분석을 위한 것과 동일한 세팅을 이용하여 CD34+CD38+ 및 CD34+CD38- 세포 집단에서 IL1RAP의 발현을 분석했다. AML 세포주 MONO-MAC-6 및 ALL 세포주 REH도 KG-1 및 KU812 세포주에서와 동일한 설정(setup)을 이용하여 ADCC 테스트에서 테스트했다.
결과
CML 줄기 세포 및 전구 세포 상의 IL1RAP 의 항체- 표적화는 NK -세포를 ADCC 로 지시하나, CML 세포주 상의 IL1RAP 의 항체- 표적화는 그렇지 않다.
항체-의존적-세포-매개 세포독성 (ADCC)은 선천적인 면역계의 보존된 메카니즘이고, 이를 통해, CD20에 대한 리툭시맙(Rituximab)과 같은, 여러 치료 항체가 적어도 부분적으로 그들의 치료 효과를 발휘하는 것으로 사료된다2. ADCC가 IL1RAP를 표적으로 이용하여 달성될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 염소 항체와 대조적으로, 토끼 항체의 Fc 도메인은 인간 면역계에 의해 인지될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 하기에서 KMT-1로 지칭되는, 다중클론 토끼 항-인간 IL1RAP 항체를 생성했다.
예상되는 바와 같이, 낮은 수준의 ADCC가 높은 KMT-1 농도에서도, IL1RAP 음성/저발현(IL1RAP negative/low) 백혈병 세포주 KG-1에서 관찰했다(도 5a, 5b). 대조적으로, IL1RAP를 발현하는 CML 세포주 KU812에서, KMT-1의 존재 하에, NK(natural killer)-세포 매개 ADCC를 관찰하였고(도 5a, 5b), 이는 KMT-1이 IL1RAP+ 표적 세포로 세포독성 면역 세포를 동원하는 것에 의해 ADCC를 유도할 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
CML 환자 및 정상 대조군으로부터의 일차 세포(primary cell)에서, KMT-1은 약간 더 약하나, 이전에 사용된 다중클론 염소 항-인간 IL1RAP 항체와 유사한 염색 패턴을 보였다(실시예 1, 도 6a). CML-1, CML-3 및 CML-4로부터의 미성숙 세포 (CML-2 및 CML-5로부터의 세포는 더 이상 남아있지 않음)를 건강한 대조군 시료로부터의 세포와 동시에 ADCC 분석에서 테스트하였다. CML CD34+ 세포에서, KMT-1의 결합은 정상 CD34+ 대조군 세포에서보다 더 높은 수준으로 ADCC를 초래했고, 이는 IL1RAP의 발현 수준과 상관관계를 가지며, 특히, 더 낮은 항체 농도에서 상관관계를 가졌다 (도 6b). 보다 현저하게, 줄기 세포 강화된 CD34+CD38- 세포(stem cell enriched CD34+CD38- cell)에서, KMT-1은 정상 CD34+CD38- 세포의 ADCC를 유도하기 않았으나, 반면에, 명백한 투여량 의존적 ADCC 효과가 CML CD34+CD38- 세포에서 관찰되었고(도 6b), 이는 다시 이 세포 종류에서 IL1RAP의 발현 패턴에 대한 강한 상관관계를 보여준다.
AML 및 ALL 세포 상의 IL1RAP 를 표적화하는 항체는 NK -세포를 ADCC 로 지시한다.
11개의 테스트된 시료 중 9개에서 AML CD34+CD38- 세포에서 IL1RAP 발현을 관찰했다 (도 7a). CD34+CD38+ 세포 집단에서, 유사한 IL1RAP 발현 패턴을 관찰했다 (도 7a). 또한, IL1RAP는 AML 세포주 MONO-MAC-6 및 ALL 세포주 REH에서 발현되었다 (도 7b). IL1RAP 발현은 또한 2개의 테스트된 시료 중 2개에서 Ph+ ALL CD34+CD38- 세포에서 관찰되었다 (도 7c). IL1RAP를 표적으로 이용하여, MONOMAC-6 및 REH 세포주도 ADCC 분석에서 테스트했다. 이 두 세포주 모두에서, 투여량 의존적 IL1RAP 표적화 ADCC 효과를 관찰했고 (도 8), 이는 치료적 항-IL1RAP 표적화 항체가 CML보다 더 광범위한 응용을 갖는다는 것을 보여준다.
본 발명자들은 또한 일차 AML 및 ALL CD34+CD38- 세포에 대해 ADCC 실험을 수행했고, 또한 이 질환들에서 증가된 세포 사망이 KMT-1을 이용하여 달성될 수 있다는 원리의 증거(proof of principle)를 보여주었다 (도 9).
또한, AML로 진행되는 1명의 MDS 환자 및 2명의 MPD 환자(이들 중 1명은 JAK2 돌연변이+였음)로부터의 CD34+CD38- 세포를 IL1RAP 표적화 항체로 염색했다. 정상 골수 CD34+CD38- 세포 대비 증가된 IL1RAP 발현을 관찰했다(도 10, 도 2c).
검토
본 연구에서, 본 발명자들은 IL1RAP를 정상 HSC로부터 후보 CML 줄기 세포를 구별하는 최초의 세포 표면 바이오마커로 확인하고, 이 지식을 CML 줄기 세포의 항체-의존적 세포 사멸을 유도하기 위해 이용했다. 또한, 본 발명자들은 IL1RAP가 AML 줄기 세포, ALL 줄기 세포, MPD 줄기 세포, 및 MDS 줄기 세포에서 상향조절된다는 것으로 확인하고, AML 및 ALL 줄기 세포가 모두 IL1RAP-표적화 항체를 이용하여 사멸시킬 수 있고, 반면에, 정상 세포는 영향받지 않는다는 것을 확인했다. CML, ALL 및 AML 줄기 세포가 IL1RAP 표적화 항체에 의해 사멸될 수 있다는 발견 에 근거하여, MPD 및 MDS 줄기 세포도 ADCC 분석에서 사멸될 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 발견은 백혈병 줄기 세포의 직접적인 표적화에 의한 백혈병 환자의 치료에 대한 새로운 컨셉트를 여는 것이고, 이 컨셉트는 현재 사용되고 있는, CML 줄기 세포의 하류에 있는 표적 세포를 우선적으로 표적화하는, 티로신 키나아제 억제제와 구별된다3 ,4.
CML 줄기 세포가 글리벡과 같은 약물에 내성을 갖는 이유는 부분적으로 명확하지 않으나, 기여할 수 있는 인자는 이 세포들 중 정지(quiescence) 및 BCR / ABL1 발현의 상대적으로 높은 수준, 및 특이적 막 수송체 단백질(membrane transporter protein)의 조합 발현(combinatorial expression)과 같은 특징이다3 ,5,6. CML 줄기 세포의 이러한 특징을 고려할 때, 궁극적으로 CML 줄기 세포를 제거하기 위한 새로운 치료 접근 방법을 발견하는 것이 매우 요구된다. 항체 작용 방식이 CML 줄기 세포가 키나아제 억제제 치료에 무반응이게 하는 공지된 내성 메카니즘(resistant mechanism)과 독립적이므로, 직접적으로 CML 줄기 세포를 표적화하는 항체-기반 요법이 그러한 전략에서 이용될 것이다. 그와 같은 개발을 위한 주요한 제한은 정상의 건강한 (Ph-) 줄기 세포로부터 CML Ph+를 구별하는 세포 표면 수용체의 완전한 부재였다. 본 발명자들은 전체적 유전자 발현 분석으로부터 그와 같은 표적으로 IL1RAP를 확인하고, 중요하게 그의 발현을 BCR / ABL1 발현에 연결시켰다(전술된 실시예 1 참조).
중요하게, IL1RAP를 표적화하는 항체의 생성에 의해, 본 발명자들은 최초로, 정상 HSC를 보존하면서, 후보 CML 줄기 세포가 표적화될 수 있다는 개념의 증거를 제공한다. 중요하게, ADCC에서 항체의 작용 모드가 면역 세포를 세포 사멸(cell killing)을 표적화하도록 지시하는 경우, 치료 메카니즘은 현재의 치료를 이용하는 CML에서 키나아제 억제제 내성을 유발하는 공지된 메카니즘과 독립적이다. 따라서, CML 줄기 세포의 항체 표적화는 단독으로 또는 현재의 치료 계획(current regimen)과 조합되어, CML 줄기 세포를 근절할 수 있는 능력을 가져서, 궁극적으로, CML 환자에 대한 영구적 치료를 가져올 것이다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 또한, IL1RAP 표적화 항체가 불량한 예후(poor prognosis)를 갖는 성인 중 급성 백혈병의 가장 흔한 타입인 AML의 AML 줄기 세포; 및 아동 백혈병의 가장 흔한 종류인 ALL의 ALL 줄기 세포;의 ADCC를 유발할 수 있다는 것을 관찰했다. 공통적으로, CML, AML, ALL, MDS, 및 MPD 중 CD34+CD38- 면역-표현형을 갖는 백혈병 줄기 세포에서의 IL1RAP 발현의 발견 및 IL1RAP 의존적 방식의 세포 사멸을 보여주는 ADCC 실험은 항-IL1RAP 치료 항체에 의해 이러한 질환이 치료될 수 있다는 것을 보여준다.
본 연구에서 제시된 ADCC 실험에서, 다중클론 항-인간 IL1RAP 항체(본질적으로, 여러 상이한 모노클론 항체의 혼합물임)를 이용했다. 그러나, ADCC 능력을 갖는, IL1RAP를 표적화하는 개별적인 단일클론 항체도 발견될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
참고 문헌
1. Wilkinson RW , Lee - MacAry AE , Davies D, Snary D, Ross EL . Antibodydependent cell - mediated cytotoxicity : a flow cytometry - based assay using fluorophores . J Immunol Methods . 2001;258:183-191.
2. Morris JC , Waldmann TA . Antibody - based therapy of leukaemia . Expert Rev Mol Med . 2009;11: e29 .
3. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ , et al . Dasatinib ( BMS -354825) targets an earlier progenitor population than imatinib in primary CML but does not eliminate the quiescent fraction . Blood . 2006;107:4532-4539.
4. Jorgensen HG , Allan EK , Jordanides NE , Mountford JC , Holyoake TL . Nilotinib exerts equipotent antiproliferative effects to imatinib and does not induce apoptosis in CD34 + CML cells . Blood . 2007;109:4016-4019.
5. Graham SM , Jorgensen HG , Allan E, et al . Primitive , quiescent , Philadelphiapositive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro . Blood . 2002;99:319-325.
6. Jiang X, Zhao Y, Smith C, et al . Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR - ABL targeted therapies. Leukemia . 2007;21:926-935.
실시예 3 - 고형 종양 상에서의 유전자 발현
재료 및 방법
Oncomine 검색 엔진(www.oncomine.org)을 이용하여, 본 발명자들은 상이한 종양 종류로부터 수립된 다양한 세포주를 포함하는 모든 데이터 세트를 확인했다. 확인된 가장 큰 데이터 세트는 데이터 세트 "Wooster Cell Line2"였다. 이 데이터 세트는 20개의 상이한 종양 종류를 대표하는, 308개의 암 세포주를 포함한다. 사용된 쿼리(query) 용어는 리포터 설정 "205277_at"인 "IL1RAP"였다.
결과
전체로, 본 발명자들은 IL1RAP의 상향조절된 발현에 대한 기준을 충족하는 세포주에 의해 대표되는 17개의 상이한 고형 종양 종류를 확인했다 (표 1 참조). 상향조절된 IL1RAP를 보이는 각 종양 종류 내의 세포주의 비율은 4% (대장암) 내지 67% (흑색종, 전립선암) 범위였다. 종양 종류 중, 본 발명자들은 유방, 결장, 폐, 전립선 및 방광으로부터의 악성 종양을 포함한, 인간에서의 가장 흔한 암 종류(cancer entity) 중 일부를 확인했다. 또한, 열등한 임상적 결과(poor clinical outcome)와 연관된 일부 종양 종류, 예를 들면, 흑색종 및 뇌종양은 IL1RAP의 고도로 상향조절된 발현을 보였다.
　
결론
본 발명자들은 여러 상이한 종양(tumour entitiy)이 IL1RAP의 상향조절된 유전자 발현 수준을 보인다는 결론을 얻는다.
이 데이터는 IL1RAP에 대한 항체에 의한 치료가 여러 상이한 인간 종양 종류에서 새로운 치료 방안을 제공할 것이라는 것을 나타낸다.
표 1
상이한 종양 종류를 대표하는 308개의 암 세포주에서 IL1RAP의 상향 조절*　
　종양 종류 　 IL1RAP 의 상향 조절을 보이는 종양의 갯수 ** 　
방 광암 3/9 (33%)
뇌 및 CNS 암 7/16 (44%)
유방암 4/19 (21%)
자궁경부암 4/7 (57%)
대장암 1/23 (4%)
식도암 3/4 (75%)
위암 1/5 (20%)
두부/경부암 3/6 (50%)
신장암 1/8 (12%)
간암 3/9 (33%)
폐암 14/73 (19%)
림프종 2/38 (5%)
흑색종 8/12 (67%)
난소암 2/5 (40%)
췌장암 3/9 (33%)
전립선암 2/3 (67%)
육종 5/13 (38%)
* 308개의 암 세포주에 대한 Wooster 데이터 세트는 Oncomine (www.oncomine.org)을 사용하여 검색하였다. 사용된 쿼리 용어는 "IL1RAP"였고, 리포터 세팅은 "205227_at"이었다. 사용된 플랫폼은 Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays (Affymetrix Inc.)였다.
** 필라델피아(Philadelphia)-양성 세포주 KU812에서와 동일하거나 또는 더 높은 IL1RAP의 발현 수준을 보이는 종양 세포주만 "상향조절(upregulated)"로 평가하였다. KU812는 이전에 본 발명자들에 의해 세포 표면에서 IL1RAP의 상향조절된 단백질 발현을 갖는 것으로 확인되었다 (Jaras, et al., 2010, PNAS 107(14): 16280-5).
　
실시예 4 - 유동 세포 분석에 의한 인간 세포주 상의 IL1RAP 발현의 분석
재료 및 방법
시약
Figure 112013074399088-pct00001
BD Biosciences의 Fc-수용체 차단제
Figure 112013074399088-pct00002
항-인간 CD16 (cat no 555404)
Figure 112013074399088-pct00003
항-인간 CD32 (cat no 555447)
Figure 112013074399088-pct00004
BD Biosciences의 APC-마우스 IgG1 κ 이소형 대조군 (cat no 555751)
Figure 112013074399088-pct00005
R&D system의 항-인간 IL-1 RAcP/IL-1 R3-APC (cat no FAB676A).
세포주
세포주 설명 ATCC / DSMZ 카탈로그 No .
KG-1 인간 급성 골수성 백혈병(음성 대조군으로 이용됨) ACC 14
KU-812 골수성 급성 전환기(myeloid blast crisis)의 인간 만성 골수성 백혈병(양성 대조군으로 이용됨) ACC 378
NCI-H2228 폐 선암종 CRL-5935
NCI-H716 결장암 CCL-251
HCC1954 유방관암종(Breast Ductal Carcinoma) CRL-2338
SR 림프종 CRL-2262
OV-90 난소 선암종 CRL-11732
COLO 829 악성 흑색종 CRL-1974
SH-4 흑색종 CRL-7724
SW 1783 성상세포종 HTB-13
상기 세포주를 공급자가 권장하는 배지에서 표준 조건 하에 배양했다.
FACS 분석
세포 (350 000)를 2 ml FACS 완충액(0.5% BSA로 보충된, 칼슘 및 마그네슘을 포함하지 않는 PBS)에 재현탁시키고, 300 x g에서 4분 동안 원심분리했다. 상층액을 버리고, 세포를 실온에서 5분 동안 30 ㎕의 부피 중 3 ㎍/ml의 농도로 항-CD16/CD32 mAb와 인큐베이션시키는 것에 의해 Fc-수용체를 블록킹시켰다. 그 후, 55 ㎕ FACS 완충액 및 인간 IL1RAP에 대한 5 ㎕ APC-표지 단일클론 항체 또는 4 ㎕ APC-표지된 이소형 항체를 세포에 첨가하고, +4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 3 ml FACS 완충액으로 세척하고, 300 x g에서 4분 동안 원심분리했다. 세포를 최종적으로 200 ㎕ FACS 완충액에 재현탁시키고, FACS CantoII flow cytometer (BD Biosciences)에서 표준 셋팅에 따라 유동 세포 분석을 수행했다.
결과
테스트된 고형 종양 세포주의 IL1RAP 발현 수준이 하기의 표 3 및 도 11에 의해 표시된다.
표 3
상이한 인간 세포주 상에서의 IL1RAP의 발현.
값은 평균 형광 강도를 나타냄.
세포주 블랭크( Blank ) 이소형( Isotype ) 항- IL1RAP
KG-1 46 52 113
KU-812 62 69 451
NCI-H2228 80 96 587
NCI-H716 60 96 2043
HCC1954 112 119 410
SR 51 54 2257
OV-90 78 89 1921
COLO 829 77 82 3732
SH-4 40 51 5189
SW 1783 119 153 341
결론
고형 종양 세포주 NCI-H2228, NCI-H716, HCC1954, SR, OV-90, COLO 829, SH-4 및 SW 1783에서 IL1RAP의 발현을 관찰했다. 이 세포주에서의 발현은 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 KU-812 상에서의 발현과 유사하거나 그보다 더 높았다.
실시예 5 - 고형 종양 세포 상의 IL1RAP 의 항체- 표적화는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 ( ADCC )를 유발한다.
재료 및 방법
키메라 단일클론 항체 81.2 hIgG1 의 개발 및 제조.
인간 IL1RAP의 세포외 부분에 특이적인 단일클론 항체를 분비하는 마우스 하이브리도마 세포주를 표준 절차에 의해 생성했다. 요약하면, BALB/c 마우스를 IL1RAP의 세포외 부분(extracellular part)과 인간 IgG1의 Fc-부분(Pro100-Lys330)으로 구성된 융합 단백질로 면역화시켰다. 지라 세포(splenocyte)를 마우스 흑색종 세포주 Sp2/0와 융합시키고 IL1RAP의 세포외 부분에 대한 항체를 생성하는 클론을 면역화(immunization)를 위해 사용된 융합 단백질에 의해 스크리닝하고, 인간 IgG1에 의해 카운터-스크리닝(counter-screen)했다.
하이브리도마 세포주 클론 81.2에 의해 생성된 항체는 IgG1/kappa 타입이었고, IL1RAP-양성 세포 및 재조합 단백질 인간 IL1RAP (21-367)에 대한 높은 특이성을 갖는 것으로 확인되었다. 이 세포주로부터, 총 RNA를 단리하고, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, VH 및 VK를 나타내는 cDNA를 PCR에 의해 증폭하고, 클로닝하고 서열결정했다.
인간 카파(kappa) 유전자의 불변 부분과 동일한 프레임 내에(in frame) 있는 마우스 VK를 코딩하는 유전적 요소를 합성하고 플라스미드 포유동물 발현 벡터(plasmid mammalian expression vector)로 클로닝시켰다.
마우스 VH를 코딩하는 PCR 단편을 인간 IgG1의 불변 부분과 합치고, 플라스미드 포유동물 발현 벡터로 클로닝시켰다.
HEK 293 세포를 두 플라스미드에 의해 동시-형질도입(co-transfect)시키고, 세포를 100 ng/ml 키푸넨신(kifunensine)으로 보충된 무혈청 배지에서 배양하였다. 키메라 항체 81.2 hIgG1을 단백질 G 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 정제하였다.
유동 세포 분석
4개의 상이한 인간 고형 암 세포주 H2228 (선암; 비소세포폐암), H716 (대장 선암), HCC1954 (관상 유방암(ductal breast carcinoma)), 및 SH-4 (흑색종)로부터의 세포를 수집하고 항-인간 IL1RAP 항체(Cantargia AB, Lund, Sweden)인 mab81.2로 염색했다. 검출을 위해, 세포를 이차 항-인간 IgG PE-접합 항체 (Thermo-Fisher, Waltham, MA)로 염색하고, 세포를 FACS CANTO 유동 세포 분석기 (BD　Immunocyteometry Systems, Mountain View, CA)를 이용하여 분석했다.
ADCC 분석
ADCC 분석은 앞서 기술된 프로토콜(전술된 실시예 2 참조)에 기초했다. 요약하면, 표적 세포를 제조사의 설명서에 따라 PKH26 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)으로 염색하고, 96-웰 플레이트에 웰당 10,000개의 세포 밀도로 접종했다. 뒤이어, 항체를 상이한 농도로 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션시키고, 그 후, 100,000개의 NK-효능자 세포를 각 웰에 첨가했다. NK-세포를 고지된 동의 후에 건강한 자원자로부터 제조사의 설명서에 따라 NK-세포 음성 세포 단리 키트(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 추출했다. 비-특이적 인간 IgG1 항체를 실험에서 대조군으로 사용했다 (Eureka Therapeutics, Emeryville, CA).
FACS CANTO 유동 세포 분석기(flow cytometer) (BD)를 이용하여 7-AAD 양성 세포의 검출에 의해 세포 사망의 정도를 평가했다. 항체 유도 세포 사망의 수준을 하기 식에 따라 계산했다: 정의된 항체 농도에서 7-AAD+ 세포의 비율 - 항체 없는 경우의 7-AAD+ 세포의 비율.
결과
인간 IL1RAP 에 대한 항체는 유동 세포측정기에서 인간 비-백혈병 암세포를 표지하고, NK -세포를 ADCC 로 지시하여 인간 암세포의 사멸을 가져온다.
본 발명자들은 인간 IL1RAP에 대한 다중클론 항체, KMT1이 NK-세포를 ADCC로 지시하고, IL1RAP-고발현 CML 세포주 KU812의 세포 사망을 유도하나, IL1RAP-저발현 KG1 세포의 세포 사망은 유도하지 않는다는 것을 보여주었다(전술된 실시예 2 참조).
본 연구의 결과는 백혈병 세포 및 고형 인간 암으로부터의 세포가 IL1RAP에 의해 매개되는 ADCC에 민감하다는 것을 보여준다. 4개의 상이한 고형 인간 암 종류를 대표하는, 4개의 상이한 인간 암세포주를 연구했고, 모두 세포 표면에서 IL1RAP의 발현을 보였다 (도 12).
테스트된 4개의 세포주 모두는 또한 투여량-의존적으로 보이는 방식으로, 인간 IL1RAP에 대한 항체, mab81.2에 의해 매개되는 ADCC에 민감한 것으로 확인되었다 (도 13).
결론
본 연구는 IL1RAP가 폐암, 결장암, 유방암, 및 악성 흑색종을 포함한 여러 인간 암 종류의 세포 표면 상에서 발현된다는 것을 확인한다.
IL1RAP에 대한 항체를 이용하여, 테스트된 모든 4종의 고형 종양 세포주의 세포는 ADCC-분석에서 특이적 NK-매개 사멸에 의해 표적화되는 것으로 입증되었다.
실시예 6 - 인간 흑색종 SK - MEL -5 이종이식 마우스 모델에서 단일클론 항체 81.2의 인 비보 효능
재료 및 방법
IgG1 및 IgG2a 이소형의 마우스 단일클론 항체 81.2의 개발 및 생성.
인간 IL1RAP의 세포외 부분에 특이적인 단일클론 항체를 분비하는 마우스 하이브리도마 세포주를 표준 절차에 의해 생성했다. 요약하면, BALB/c 마우스를 IL1RAP의 세포외 부분(extracellular part)과 인간 IgG1의 Fc-부분(Pro100-Lys330)으로 구성된 융합 단백질로 면역화시켰다. 지라 세포를 마우스 흑색종 세포주 Sp2/0와 융합시키고 IL1RAP의 세포외 부분에 대한 항체를 생성하는 클론을 면역화를 위해 사용된 융합 단백질에 의해 스크리닝하고, 인간 IgG1에 의해 카운터-스크리닝했다.
하이브리도마 세포주 클론 81.2에 의해 생성된 항체는 IgG1/kappa 타입이었고, IL1RAP-양성 세포 및 재조합 단백질 인간 IL1RAP (21-367)에 대한 높은 특이성을 갖는 것으로 확인되었다. 이 세포주로부터, 총 RNA를 단리하고, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, VH 및 VK를 나타내는 cDNA를 PCR에 의해 증폭하고, 클로닝하고 서열결정했다.
인간 카파(kappa) 유전자의 불변 부분과 동일한 프레임 내에(in frame) 있는 마우스 VK를 코딩하는 유전적 요소를 합성하고 플라스미드 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝시켰다.
마우스 VH를 코딩하는 PCR 단편을 마우스 IgG2a의 불변 부분과 합치고, 플라스미드 포유동물 발현 벡터로 클로닝시켰다.
HEK 293 세포를 두 플라스미드에 의해 동시-형질도입시키고, 세포를 무혈청 배지에서 배양하였다. IgG2a 이소형의 마우스 항체 81.2를 단백질 G 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 정제하였다.
유동 세포 분석
인간 악성 흑색종 세포주, SK-MEL-5의 IL1RAP 발현을 확인하고, 발현을 인간 CML 세포주 KU812와 비교하기 위해, 두 세포주를 표준 절차에 따라 배양하고, 지수 성장기(logarithmic growth phase)에서 유지시켰다. 세포 수집 (cell harvet) 시, 3.5-5.0 x 105 세포/mL를 1-50 ㎍/mL의 마우스 IgG1 81.2 단일클론 항체로 표지하였다. IgG1 이소형 대조군 항체를 대조군으로 이용하였다. 염색은 Accuri C6 Flow Cytometer를 이용하여 분석했다.
약물 및 치료
그룹
 n
 약물/테스트 작용제
작용제 mg/kg 경로 일정(schedule)
대조군 10 비히클 (PBS) - ip biwk x 6
치료군 (treated) 10 mAb 81.2 10 ip biwk x 6
인간 IL1RAP 특이적 mAb 81.2 또는 비히클의 인 비보 투여
8주 내지 12주령의 암컷 CD.17 SCID 마우스에 동물당 50% Matrigel 중 1 x 107 SK-MEL-5 종양 세포를 피하로 옆구리에 주사했다. 흑색종 세포 주사 후 약 1주 경과시 종양이 108-128mm3의 크기에 도달했을 때 치료를 개시했다. 20 마리의 동물에서 종양 크기의 쌍 매칭(paired match)을 수행하여, 두 개의 치료군에 각각 10마리의 마우스를 배정했다.
마우스 IgG2a 단일클론 항체, 81.2를 10 mg/kg의 투여량으로 PBS 중 10 mg/kg의 부피(volume)로 준비했다. 대조군 동물에 동일한 부피의 PBS를 투여했다. 치료제는 복막내 경로를 통해 투여했다. 캘리퍼 측정에 의한 종양 부피 및 총 중량을 주당 2회 모니터링했다.
연구의 종말점(endpoint)은 종양 성장 지연(tumour growth delay)이다.
결과
유동 세포 분석
Figure 112013074399088-pct00006
대표적인 mAb 81.2의 인 비보 활성
투여의 개시 후 33일차 연구의 분석은 22일차 (p<0.05), 26일차 및 29일 차 (p<0.001) 및 33일차 (p<0.0001)에 대조군 대비 치료군에서 종양 성장의 통계적으로 유의성 있는 지연을 보였다. (도 14 참조).
결론
IL1RAP의 발현은 흑색종 종양 세포주 SK-MEL-5에 대한 유동 세포측정법에 의해 확인되었고, 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 KU-812 상의 발현보다 더 높은 발현을 보였다.
인 비보 데이터는 10 mg/kg의 투여량으로 주당 2회 투여된, 인간 IL1RAP 특이적 단일클론 항체, 81.2가 IL1RAP 발현 인간 흑색종 세포주, SK-MEL-5의 종양 세포 성장에서 저해를 유발했다는 것을 나타낸다.

Claims (64)

  1. 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(interleukin-1 receptor accessory protein, IL1RAP)에 대한 특이성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 그로 구성되는, 환자에서 고형 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 고형 종양은 IL1RAP를 발현하는 세포를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  2. 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 특이성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 그로 구성되는, 환자에서 고형 종양을 진단하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 고형 종양은 IL1RAP를 발현하는 세포를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두부/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 및 육종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 피부암, 결장암, 폐암, 비뇨기관 암, 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 고형 종양은 전립선암, 흑색종, 자궁경부암, 식도암, 두부 암(head cancer) 및 경부 암(neck cancer)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 고형 종양은 흑색종인 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 IL1RAP에 대한 특이성을 갖는 것인 약학적 조성물.
  8. 청구항 1 또는 2에 있어서, IL1RAP는 세포의 표면에 국재화(localize)되는 것인 약학적 조성물.
  9. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 보조-수용체(co-receptor)의 IL1RAP로의 결합을 차단할 수 있는 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 하나 이상의 보조-수용체는 IL1R1, ST2, C-KIT 및 IL1RL2로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 고형 종양과 연관된 세포를 사멸시킬 수 있는 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 고형 종양과 연관된 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 것인 약학적 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 세포의 사멸은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의해 유도되는 것인 약학적 조성물.
  14. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 약학적 조성물은 온전한(intact) 항체를 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것인 약학적 조성물.
  15. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항체의 항원-결합 단편을 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것인 약학적 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fv 단편 및 Fab-유사 단편(Fab-like fragment)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 단쇄 Fv, 이황화-결합 Fv 및 도메인 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab)2 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  19. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체는 재조합 항체인 것인 약학적 조성물.
  20. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것인 약학적 조성물.
  21. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체는 다중클론 항체인 것인 약학적 조성물.
  22. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 유래(human)이거나, 또는 인간화된 것인 약학적 조성물.
  23. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 인 비보 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 인 비보 반감기를 증가시키기 위한 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화기(glycosylation group), 지방산, 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 페길화된 것인 약학적 조성물.
  26. 청구항 1 또는 2에 있어서, 세포독성 모이어티(cytotoxic moiety)를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 세포독성 모이어티는 방사성 동위원소를 포함하거나 또는 그로 구성되는 것인 약학적 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 아스타틴-211, 비스무트-212, 비스무트-213, 요오드-131, 이트륨-90, 루테튬-177, 사마륨-153 및 팔라듐-109로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  29. 청구항 26에 있어서, 상기 세포독성 모이어티는 독소를 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것인 약학적 조성물.
  30. 청구항 26에 있어서, 상기 세포독성 모이어티는 화학요법제를 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것인 약학적 조성물.
  31. 청구항 1 또는 2에 있어서, 검출가능한 모이어티를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 방사성 동위원소를 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것인 약학적 조성물.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 테크니튬-99m; 인듐-111; 갈륨-67; 갈륨-68; 비소-72; 지르코늄-89; 요오드-12; 탈륨-201로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  34. 청구항 31에 있어서, 상기 검출가능한 모이어티는 상자성 동위원소(paramagnetic isotope)를 포함하거나, 또는 그로 구성되는 것인 약학적 조성물.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 상자성 동위원소는 가돌리늄-157; 망간-55, 디스프로슘-162, 크로뮴-52; 철-56으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  36. 청구항 1 또는 2에 있어서, 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 부형제를 더 포함하는 약학적 조성물.
  37. 청구항 36에 있어서, 비경구 전달을 위해 개조된 것인 약학적 조성물.
  38. 청구항 36에 있어서, 정맥내 전달을 위해 개조된 것인 약학적 조성물.

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