KR101426407B1

KR101426407B1 - 고생산성, 고면역원성, 및 무병원성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터

Info

Publication number: KR101426407B1
Application number: KR1020110117152A
Authority: KR
Inventors: 권혁준; 김재홍; 김일환
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2011-11-10
Publication date: 2014-08-07
Anticipated expiration: 2031-11-10
Also published as: KR20130051799A

Abstract

저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 약독화용 조성물, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 약독화 재조합 바이러스, 및 상기 재조합 바이러스를 포함하는 백신 조성이 제공된다.　 본 발명의 재조합 발현 벡터는 인플루엔자 예방을 위한 백신주의 계태아 생산성을 높여주고, 포유류에 대한 면역원성이 높으며 계태아와 포유류에 대한 병원성이 없어 생산단계에서의 생물학적 위험성을 원천적으로 차단할 수 있으며 사독백신뿐 아니라 생독백신 개발에도 유용하게 이용될 수 있다는 장점을 갖는다.

Description

고생산성, 고면역원성, 및 무병원성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터{RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PREPARING HIGHLY PRODUCTIVE, HIGHLY IMMUNOGENIC AND AVIRULENT INFLUENZA VIRUS, AND USE THEREOF}

본 발명은 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 약독화용 조성물, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 약독화 재조합 바이러스, 및 상기 재조합 바이러스를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스로서, 상기 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질 (hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제 (neuraminidase, NA), 뉴클레오캡시드 단백질 (nucleoprotein; NP), 매트릭스 단백질 1 및 2 (matrix, M₁, M₂), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2 (polymerase subunit A, B1 & B2; 각각 PA, PB1, PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2 (nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다.

과거 인체 인플루엔자 A 백신은 계태아 증식성이 탁월한 재배열 주를 포르말린으로 불활성화 하여 HA와 NA만을 정제한 단위 백신으로, 항원 생산성 향상을 위해 최신 유행하는 인체 인플루엔자 바이러스와 발육란 증식성이 탁월한 것으로 알려진 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)을 혼합 감염시켜 증식성이 탁월하나, 최근 바이러스의 HA와 NA를 갖는 재배열 주를 선발하여 백신 생산에 사용하였으나(Kilbourne E.D., Future influenza vaccines and the use of genetic recombinants. Bull. World Health Organ 1969. 41:643), 최근 역유전학 기술을 사용하여 계태아 증식성이 탁월하며 특성이 잘 알려진 PR8 바이러스나 A/WSN/33(H1N1) 바이러스나 저온 적응시켜 약독화 시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스 등의 8개 게놈을 바이러스 게놈 전사벡터에 클로닝하고, PA, PB1, PB2, NP 코딩 부분을 발현하는 벡터에 클로닝 하여 12개 플라스미드(특허 제0908757호)를 293T 등의 세포주에 트랜스펙션하여 원하는 바이러스를 작출하거나 벡터의 한 방향으로 바이러스 게놈 전사가 일어나고, 다른 방향으로는 mRNA가 만들어지는 8개의 플라스미드를 트랜스펙션(특허 제0862758호)시켜 재조합 바이러스를 작출하고 있다.

통상 HA와 NA 유전자는 최근 유행하는 바이러스로부터 PCR 법으로 증폭하여 역유전학 벡터에 클로닝하고, PR8의 나머지 유전자 6개와 함께 트랜스펙션하여 백신주를 작출하며 바이러스를 불활화하여 사독백신을 제조하고 있다. PR8은 마우스에 대한 병원성이 잔존하고 있어 역유전학 기법으로 작출한 바이러스는 생독백신으로 사용할 수 없는데 PR8 바이러스의 backbone을 사용하지만 NS1 유전자를 결손시킨 후 NS1 유전자가 없어도 바이러스 증식이 가능한 vero 세포에서 증식시키거나[Virology 1998, 252:324-330; PLoS one 2009,4(6):e5984], 저온에서 적응시켜 병원성을 감소시킨 A/Ann Arbor/6/60(H2N2) 바이러스의 6개 유전자를 사용하거나(Virology 2003, 306:18-24; Journal of Virology 2010, 84:44-51) 저온 적응시킨 A/turkey/OH/313053/04(H3N2) 바이러스의 PB1 유전자에 HA 유전자 유래의 염기서열을 삽입하여 약독화 시킨 후 6개 유전자와 최근 유행하는 바이러스의 HA와 NA 유전자를 함께 트랜스펙션하여 약독화 된 생독백신주를 생산하고 있다(Journal of Virology 2011, 85:456-459).

생독백신은 적은 바이러스를 접종해도 생체에서 증식하며 면역을 형성시킬 수 있지만 상기의 방식으로 제작된 백신주의 생산성이 PR8 대비 현저히 낮은 단점이 있다. 따라서 사독백신의 경우 마우스에 대한 병원성은 잔존하더라도 기존 PR8 바이러스 내부 유전자를 치환하거나 백신 바이러스의 HA 및 NA의 아미노산에 돌연변이를 주어 계태아에서의 증식성을 개선하거나(Vaccine 2010, 28:8008-8014; Vaccine 2011, 29:5153-5162; Vaccine 2011, 29:8032-8041), 계태아 병원성을 줄인 바이러스 제작 기술 개발이 이루어졌다(Archives of Virology 2011, 156:557-563).

인플루엔자 바이러스의 병원성은 다수의 유전자와 관련된 특성으로 HA, NA, PA, PB1, PB2, NP, NS에서 다양한 병원성 관련 아미노산 돌연변이가 보고되어 있다. 특히 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로부터 코딩되는 NS1은 숙주세포의 선천성면역을 억제하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 그 기능은 다양하다. 즉, NS1은 IFN-β 전사를 억제하고, double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR), 2'-5' oligoadenylate synthetase (OAS)/RNase L의 항바이러스 작용을 억제하며 숙주세포의 mRNA 프로세싱과 핵에서 세포질로의 이동을 억제하는 반면 바이러스 mRNA 번역을 증강시키고, 숙주세포의 아포토시스를 억제한다(Journal of General Virology 2008, 89:2359-2376). NS1은 1번 내지 73번 아미노산으로 이루어진 RNA-결합 도메인, 79번 내지 207번 아미노산으로 이루어진 효능 도메인(effector domain), 다양한 숙주세포의 PDZ 도메인과 결합하는 PDZ-ligand (PL) 모티프(227번 내지 230번 아미노산)로 구성된다(Science 2006 311:1576-1580).

한편, KBNP-0028(KCTC 10866BP)은 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스로 계태아에서의 병원성이 없고, 생산성이 높으며 포유류에 대한 병원성과 관련된 돌연변이를 갖지 않아 안전한 백신주로 국내 특허등록(특허 제0708593호) 된 바이러스이나, 실제 마우스에서의 병원성은 확인된 바 없고, 다른 저병원성 조류인플루엔자 바이러스들과 비교적 높은 아미노산 상동성을 보여 병원성과 관련된 아미노산이 밝혀져 있지 않은 상황이다.

이에, 본 발명자들은 발육란에서의 증식성이 PR8 보다 탁월하고, 마우스에서 면역원성이 높으며 계태아와 마우스(포유류)에서 병원성이 전혀 없는 바이러스 제작을 위해, H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스) 기반 벡터시스템에서 PR8 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환하여 재조합 바이러스들을 제작하였고, 이와 같은 재조합 바이러스가 발육란에서의 증식성과 마우스 면역원성이 탁월하고, 계태아와 마우스 병원성이 없어서 안전하고 효과적인 백신으로서 유용함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드의 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스) 약독화에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

또 다른 예는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스) 게놈을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 예는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스)를 제공한다.

또 다른 예는 상기 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 (예컨대, PR8 바이러스)를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스(이하, 'PR8 바이러스'로 칭함; NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 백신주로서 널리 사용되는 바이러스로서, 면역원성 및 증식성은 좋으나 병원성이 있어서 안전성이 떨어진다는 문제점이 있지만, 다른 개발된 백신주가 없어서 위험성에도 불구하고 사용되고 있다.

이에, 본 발명자들은 기존 PR8을 기초로 하는 벡터 시스템의 계태아에서의 증식성을 개선시키고, 마우스 등의 포유류에 대한 병원성을 제거하되, 면역원성은 유지시키기 위한 연구를 거듭하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 PR8 바이러스 유래 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드들로부터 선발한 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환하여 발육란 증식성과 마우스 면역원성이 탁월하고, 계태아 및 마우스 병원성이 없는 인플루엔자 백신 제작용 벡터시스템의 조성을 제공한다. 즉, 본 발명은 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스에 있어서 NS 단백질 코딩 유전자가 인플루엔자 바이러스의 고생산성, 무병원성, 및 고면역원성과 관련있음을 제안하는 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 발육란에서의 증식성과 마우스 면역원성이 탁월하고, 계태아와 마우스 병원성이 없는 인플루엔자 바이러스 제작용 역유전학 벡터 시스템의 조성은, PR8 기반의 역유전학 벡터시스템에 한정되는 것은 아니며 마우스와 계태아에 대한 병원성을 갖는 모든 인플루엔자 역유전학 벡터시스템에 적용될 수 있다.　

우선, 본 발명의 일례는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스 약독화용 조성물을 제공한다.

상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스는 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)(KBNP-0028), A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(01310), A/chicken/Korea/SNU8011/2008(H9N2)(SNU8011), A/chicken/Korea/SNU9037/2009(H9N2)(SNU9037), A/dog/Korea/SNU9046/2009(H3N2)(SNU9046), A/wild bird/Korea/SNU50-5/2009(H5N1)(SNU50-5), A/duck/Korea/SNU31D/2009(H7N2)(SNU31D), A/duck/Hong Kong/820/80(H5N3)(HK820) 등일 수 있으며, 보다 구체적으로 KBNP-0028(KCTC 10866BP)일 수 있다.

상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스, 예컨대, KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS 단백질에 있어서, NS1단백질은 다음으로 이루어진 특징 중 하나 이상을 포함하고;

60번 아미노산이 글리신(G),

70번 아미노산이 페닐알라닌(F),

71번 아미노산이 리신(K),

87번 아미노산이 트레오닌(T),

119번 아미노산이 이소루이신(I),

127번 아미노산이 트레오닌(T),

137번 아미노산이 트레오닌(T),

139번 아미노산이 글리신(G)

151번 아미노산이 세린(S),

189번 아미노산이 아스파라긴(N),

220번 아미노산이 글루타민(Q), 및

227번 아미노산이 글리신(G); 및

NS2 단백질은 다음으로 이루어진 특징 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

31번 아미노산이 이소루이신, 및

63번 아미노산이 아르기닌.

H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스가 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로서 상기와 같은 특성을 갖는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질과 NS2 단백질을 코딩하는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 경우 계태아 증식성이 우수하고 병원성이 낮으며 면역원성이 증진된다.　

예컨대, KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 이 유전자로부터 NS1과 NS2의 두 가지 단백질이 생성되는데, 서열번호 1의 유전자 중 27 내지 719까지의 염기서열(마지막 3개는 종료코돈임)로부터 NS1 단백질(서열번호 2)이 코딩되며, 서열번호 1의 27 내지 56까지의 염기서열로부터 코딩되는 단백질과 서열번호 1의 529 내지 864까지의 염기서열(마지막 3개는 종료코돈임)로부터 코딩되는 단백질이 연결된 NS2 단백질(서열번호 3)이 생성된다. 본 명세서에서 NS 단백질은 NS 유전자로부터 서로 다른 splicing에 의하여 생성되는 NS1 단백질과 NS2 단백질을 총칭하는 의미로 사용된다.

보다 구체적으로, 본 발명에서 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스의 NS 유전자와 치환되는 저병원성 조류 인플루엔자의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 NS1 단백질 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 NS2 단백질, 바람직하게는 서열번호 2의 NS1 단백질을 코딩하는 것일 수 있다.

또한, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 한 번의 점돌연변이로는 병원성을 획득하지 못하고 적어도 두 번 이상의 점돌연변이가 발생하여야 원래 병원성을 획득할 수 있도록, 서열번호 2의 227번 아미노산인 글리신의 코돈이 GGT 또는 GGC인 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 NS 유전자로서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 KBNP-0028(KCTC 10866BP)로부터 유래하는 NS1 단백질(서열번호 2) 또는 NS2 단백질 (서열번호 3)의 코딩 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

또한, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질은 PDZ-domain ligand (PL) motif를 갖는 경우, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질코딩 폴리뉴클레오타이드는 NS 단백질(구체적으로, NS1 단백질, 예컨대 서열번호 2)의 아미노산 서열 중 C 말단의 4개의 아미노산 ('GSEV'; PDZ-domain ligand (PL) motif)을 'EPEV' 또는 'RSEV'로 치환하여, 계태아 증식성이 보다 우수한 것일 수 있다 (표 4 참조). 예컨대, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 C 말단의 4개의 아미노산(GSEV)이 'EPEV' 또는 'RSEV'로 치환된 서열번호 4('EPEV'로 치환) 또는 서열번호 5('RSEV'로 치환)의 아미노산 서열을 갖는 NS 단백질의 코딩 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명은 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스의 게놈(NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)에서 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 것을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터는 계태아 증식성이 우수하고 병원성이 낮으며 면역원성이 뛰어난 바이러스 제작을 위한 벡터 시스템으로 유용하다.　

보다 구체적으로, 상기 재조합 발현 벡터는 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 PR8 바이러스(GenBank accession number: NC_002016 내지 NC_002023 유전자 포함)의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적혈구응집 단백질(HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴라미디다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 및 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 및 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있다.

상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로부터 코딩되는 NS1단백질은 다음으로 이루어진 특징 중 하나 이상을 포함하고;

60번 아미노산이 글리신(G),

70번 아미노산이 페닐알라닌(F),

71번 아미노산이 리신(K),

87번 아미노산이 트레오닌(T),

119번 아미노산이 이소루이신(I),

127번 아미노산이 트레오닌(T),

137번 아미노산이 트레오닌(T),

139번 아미노산이 글리신(G)

151번 아미노산이 세린(S),

189번 아미노산이 아스파라긴(N),

220번 아미노산이 글루타민(Q), 및

227번 아미노산이 글리신(G); 및

31번 아미노산이 이소루이신, 및

63번 아미노산이 아르기닌.

상기한 바와 같이, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 KBNP-0028(KCTC 10866BP)로부터 유래하는 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 구체적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 NS1 단백질, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 NS2 단백질의 코딩 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

또한, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 한 번의 점돌연변이로는 병원성을 획득하지 못하고 적어도 두 번 이상의 점돌연변이가 발생하여야 병원성을 획득할 수 있도록, NS1 단백질의 227번 아미노산인 글리신의 코돈이 GGT 또는 GGC인 것일 수 있다.

또한, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 상기와 같은 NS 단백질의 아미노산 서열 중 C 말단의 4개의 아미노산 (PL motif)을 'EPEV' 또는 'RSEV'로 치환하여, 계태아 증식성이 보다 우수한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 C 말단의 4개의 아미노산이 'EPEV' 또는 'RSEV'로 치환된 서열번호 2 또는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 NS 단백질의 코딩 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

예컨대, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 도 3의 개열지도를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 예는, 상기 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스의 게놈 중 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 변이 균주, 구체적으로 PR8 바이러스의 게놈 중 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 PR8 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 PR8 바이러스는 PR8 게놈에서 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 i) KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS1 단백질(서열번호 2)의 코딩 폴리뉴클레오타이드, NS2 단백질(서열번호 3)의 코딩 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열번호 1의 NS 유전자로 치환된, 보다 구체적으로 NS1 단백질(서열번호 2)의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 균주 (rPR8-KBNP-0028(NS)), ii) KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS1 단백질(서열번호 2)에서 C 말단의 4개의 아미노산이 'EPEV'로 치환된 단백질(서열번호 4)의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 균주 (rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)), 또는 iii) KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS1 단백질(서열번호 2)에서 C 말단의 4개의 아미노산이 'RSEV'로 치환된 단백질(서열번호 5)의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 균주(rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV))일 수 있다.

상기 재조합 바이러스는 발육란(계태아) 증식성이 우수하고, 닭과 오리와 같은 조류뿐 아니라 마우스 등의 포유류에서 면역력이 우수하면서도 병원성이 낮거나 없어서 안전하고 효과 좋은 인플루엔자 바이러스 백신 제작에 매우 유용하며, 특히 우수한 안전성으로 인하여 사독백신뿐 아니라 생독백신으로 사용 가능하다.

이에, 본 발명의 또 다른 예는 상기 발육란(계태아) 고생산성, 포유류 고면역원성, 및 조류와 포유류 무병원성의 재조합 바이러스를 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신을 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 특히, PR8 바이러스(NC_002016 내지 NC_002023) 게놈에서 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 i) KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS1 단백질(서열번호 2)의 코딩 폴리뉴클레오타이드, NS2 단백질(서열번호 3)의 코딩 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열번호 1의 NS 유전자로 치환된, 보다 구체적으로 NS1 단백질(서열번호 2)의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 균주 (rPR8-KBNP-0028(NS)), ii) KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS1 단백질(서열번호 2)에서 C 말단의 4개의 아미노산이 'EPEV'로 치환된 단백질(서열번호 4)의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 균주 (rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)), 또는 iii) KBNP-0028(KCTC 10866BP)의 NS1 단백질(서열번호 2)에서 C 말단의 4개의 아미노산이 'RSEV'로 치환된 단백질(서열번호 5)의 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환된 균주(rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

상기 백신은 면역원성이 우수할 뿐 아니라 마우스를 비롯한 포유류와 조류에 대하여 병원성이 낮거나 없어서 사독백신뿐 아니라 생독백신으로도 사용 가능하다.

상기 백신은 닭과 오리 등의 조류뿐 아니라 인간, 돼지, 개, 마우스 등을 포함하는 포유류에도 적용 가능하다.　

또한, 본 발명은 상기 발육란(계태아) 고생산성, 포유류 고면역원성, 및 조류와 포유류 무병원성의 재조합 바이러스에 대한 항혈청을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 및 진단용 키트를 제공한다. 상기 재조합 바이러스는 특히 rPR8-KBNP-0028(NS) 균주, rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV) 균주, 및 rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV) 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 항혈청은 조류 또는 포유류로부터 얻어진 것일 수 있으며, 진단 대상 환자는 조류 또는 포유류일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 KBNP-0028(KCTC 10866BP, 특허등록 제0708593호), 01310(특허등록 제0708593호), SNU8011, SNU9037, A/dog/Korea/SNU9046/2009(H3N2)(이하 SNU9046), SNU50-5, A/duck/Korea/SNU31D/2009(H7N2)(이하 SNU31D), A/duck/Hong Kong/820/80(H5N3)(이하 HK820)를 10 내지 11일령 specific pathogen free(SPF) 계태아의 요막강에 접종하여 배양한 후 요막액을 수확하여 RNA를 추출한 후 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 RT-PCR로 증폭한 후 아가로스겔에 전기영동 하여 증폭산물을 잘라내어 정제하였고, 염기서열을 결정하여 외국의 주요 인플루엔자 바이러스들과 NS1 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과 KBNP-0028은 A/duck/Hong Kong/820/80(H5N3)(이하 HK820)과 92.1%, 01310과 91.7%의 비교적 높은 상동성을 보였으나 비교한 나머지 바이러스들과는 91.3% 내지 66.5%의 상동성을 보였고 (표 1), KBNP-0028의 NS2는 HK820과 WSN33과 97.5%, 01310과 96.6%의 높은 상동성을 보였으나 나머지 바이러스들과는 80.1% 내지 95.8%의 상동성을 보였다(표 2). 또한 KBNP-0028의 NS1은 다른 모든 저병원성 조류인플루엔자 바이러스들과 달리 60번 아미노산으로 알라닌(A), 이소루이신(I), 글루탐산(E), 발린(V) 대신 글리신(G), 70번 아미노산으로 글루탐산(E)과 리신(K) 대신 페닐알라닌(F), 71번 아미노산으로 글루탐산(E), 세린(S), 글리신(G) 대신 리신(K), 87번 아미노산으로 세린(S)이나 프로린(P) 대신 트레오닌(T), 119번 아미노산으로 메티오닌(M) 대신 이소루이신(I), 127번 아미노산으로 아스파라긴이(N)나 아르기닌(R) 대신 트레오닌(T), 137번 아미노산으로 이소루이신(I)이나 루이신(L) 대신 트레오닌(T), 139번 아미노산으로 아스파탐산(D)이나 글루탐산(E)이나 아스파라긴(N) 대신 글리신(G), 151번 아미노산으로 트레오닌(T) 대신 세린(S), 189번 아미노산으로 아스파탐산(D) 대신 아스파라긴(N), 220번 아미노산으로 아르기닌(R) 대신 글루타민(Q), 227번 아미노산으로 아르기닌(R)이나 글루탐산(E) 대신 글리신(G)을 가지고 있어 차이를 보였고, NS2는 31번 아미노산으로 메티오닌 대신 이소루이신, 63번 아미노산으로 글루탐산 대신 아르기닌을 가지고 있어 차이를 보였다(표 3).

본 발명에서 확인된 KBNP-0028 NS의 차별화되는 아미노산의 계태아 생산성, 마우스 고면역원성, 계태아와 마우스 무병원성과의 관련성을 알아보기 위해 PR8 바이러스 기반의 역유전학 벡터시스템의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 대신 KBNP-0028, 01310, SNU8011, SNU9037, SNU50-5 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 치환하여 재조합 바이러스인 rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS), rPR8-SNU8011(NS), rPR8-SNU9037(NS), rPR8-SNU50-5(NS)를 제작하였고, KBNP-0028 NS1의 PL motif를 PR8의 PL motif인 RSEV로 치환한 바이러스 [rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)], 01310의 PL motif인 ESEV로 치환한 바이러스 [rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)], KBNP-0028의 PL motif인 GSEV로 치환한　 PR8 바이러스[rPR8(NS-GSEV)], KBNP-0028의 PL motif로 치환한　 01310 바이러스[rPR8-01310(NS-GSEV)]를 역유전학 기술로 제작하였다. 제작한 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID₅₀/ml)를 측정한 결과 rPR8은 10^8.8, rPR8-KBNP-0028(NS)는 10^8.7, rPR8-01310(NS)는 10^8.2, rPR8-SNU8011(NS)은 10^8.1, rPR8-H5N3(NS)는 10^8.3, rPR8-50-5(NS)는 10^8.5, rPR8(NS-GSEV)는 10^8.9, rPR8-01310(NS-GSEV)는 10^8.7EID₅₀/ml을 보여 rPR8 대비 유사하거나 조금 높거나 낮은 역가를 보였으나 rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)는 10^9.1, rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)는 10^9.5EID₅₀/ml을 보여 rPR8 대비 높은 계태아 증식성을 보였다 (표 4).　　

본 발명의 재조합 바이러스들의 마우스 병원성을 알아보기 위해 각 바이러스에 대해 4-5주령의 BALB/c 마우스 암컷 5수씩을 졸레틸로 마취한 후 비강으로 10⁶EID₅₀/마우스 접종하여 매일 체중과 폐사를 관찰한 결과 rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV), rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)는 무접종 대조군 대비 체중의 변화가 관찰되지 않고, 폐사도 일어나지 않아 마우스에 대한 병원성이 전혀 없었으나 rPR을 포함한 나머지 재조합 바이러스들은 폐사와 함께 뚜렷한 체중의 감소를 보여 마우스에 대한 병원성을 보이는 것을 알 수 있다 (도 1). 또한 본 발명의 재조합 바이러스들의 마우스에 대한 면역원성을 알아보기 위해 재조합 바이러스들을 접종한 마우스들을 2주간 사육한 후 채혈하여 혈청을 수확하였고, 혈구응집억제항체 역가(log2) 측정한 결과 rPR8은 평균 8.0,　rPR8-KBNP-0028(NS)는 6.4, rPR8-01310(NS)은 8.3, rPR8-SNU50-5(NS)는 8.0, 음성대조군은 0을 보여 모두 높은 면역원성을 보였으나 rPR8-KBNP-0028(NS)의 경우 마우스에 대한 병원성이 전혀 없으면서 높은 항체수준을 보여 효과적인 백신개발에 활용할 수 있을 것으로 평가되었다(표 5).

본 발명의 재조합 바이러스들의 계태아에 대한 병원성을 알아보기 위해 10-11일령의 SPF 발육란에 요막강 경로로 10^-1 내지 10^-8 희석한 rPR8, rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS),　rPR8-SNU8011(NS), rPR8-SNU50-5(NS) 바이러스를 각 희석배수에 대해 3개의 발육란을 접종하고, 3일간 폐사유무와 병변유무를 확인한 결과 rPR8과 rPR8-KBNP-0028(NS)에서는 출혈이나 충혈과 같은 병변과 폐사는 관찰되지 않아 계태아에 대한 병원성이 없었으나 rPR8-01310(NS),　rPR8-SNU8011(NS), rPR8-SNU50-5(NS)에서는 병변과 함께 폐사가 관찰되어 계태아에 대한 병원성이 있었다(도 2).

본 발명은 기존의 PR8 바이러스를 이용한 백신 제조에 있어서 병원성이 나타나는 문제점을 해결하고자, 병원성이 없거나 매우 낮으면서 면역원성이 우수한 재조합 PR8 바이러스를 제공하며, 본 발명에서 제공되는 재조합 PR8 바이러스는 발육란(계태아) 고생산성, 포유류 고면역원성, 및 조류와 포유류 무병원성이어서 사독백신뿐 아니라 생독백신으로서도 유용하다.

도 1a는 PR8 벡터시스템에서 A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)(특허 제0708593호; 이후 KBNP-0028), A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(특허 제0790801; 이후 01310), A/chicken/Korea/SNU8011/2008(H9N2)(이후 SNU8011),　A/chicken/Korea/SNU9037/2009(H9N2) (이후 SNU9037),　A/wild bird/Korea/SNU50-5/2009(H5N1)(이후 SNU50-5)의 NS유전자로 PR8 NS를 치환하여 제작한 재조합 바이러스인 rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS), rPR8-SNU8011(NS), rPR8-SNU9037(NS), rPR8-SNU50-5(NS) 바이러스의 BALB/c 마우스에 대한 병원성을 모 바이러스인 rPR8과 비교한 결과이다.
도 1b는 PR8 벡터시스템에서 KBNP-0028의 NS를 갖는 바이러스[rPR8-KBNP-0028(NS)]와 KBNP-0028의 NS1의 PL motif를 PR8의 PL motif로 치환한 바이러스 [rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)], 01310의 PL motif(ESEV)로 치환한 바이러스 [rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)], KBNP-0028의 PL motif(GSEV)로 치환한　PR8 바이러스[rPR8(NS-GSEV)], KBNP-0028의 PL motif로 치환한 01310 바이러스[rPR8-01310(NS-GSEV)]의 BALB/c 마우스에 대한 병원성을 모 바이러스인 rPR8과 비교한 결과이다.
도 2는 PR8 벡터 시스템에서 rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-01310(NS), rPR8-SNU8011(NS), rPR8-SNU9037(NS), 및 rPR8-SNU50-5(NS) 바이러스의 계태아에 대한 병원성을 모 바이러스인 rPR8과 비교한 결과이다.
도 3은 PR8 바이러스의 형질전환을 위한 발현 벡터의 개열지도를 예시한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 재조합 PR8 바이러스 작출

1-1: PR8 바이러스의 준비

본 발명에서 재조합 바이러스의 모바이러스로 사용된 PR8 바이러스는 다음과 같은 방법으로 준비하였다.

구체적으로, PR8(A/Puerto Rico/8/34(H1N1)) 바이러스 전체 cDNA에 대응하는pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, pHW197-M, 및 pHW198-NS 역유전학용 플라스미드(Vaccine 2002, 20:3165-3170)를 St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공받았다. 상기 8개 플라스미드를 갖는 바이러스 제작을 위하여, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X10⁶개/2ml의 양으로 부유하여 각 웰에 첨가한 후, 3-4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후, Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.

상기 준비된 8개 플라스미드를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각의 양이 300ng씩이 되도록 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 PLUS reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다. 기다리는 동안 lipofectamine 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다.

얻어진 반응 생성물을 상기 293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO₂, 37℃에서 20시간 배양한 후, 웰당 트립신10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발생란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발생란을37℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집이 되는 경우 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스로부터 RNA를 추출하여 염기서열을 결정하여 PR8 바이러스(NC_002016 내지 NC_002023 포함)가 제대로 제작되었는지 확인한 후 -70℃에서 보관하였다. 이와 같이 제작된 균주를 아래 실험의 PR8 바이러스 균주로 사용하였다.

1-2: 바이러스 증식

각 시료(PR8(실시예 1-1), KBNP-0028(A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2), KCTC 10866BP, 특허등록 제0708593호), 01310(A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2), 특허등록 제0790801호), SNU8011, SNU9037, SNU9046, SNU50-5, SNU31D (이상, 서울대학교 조류질병학실)와　A/duck/Hong HK820(일본 훗가이도대학교 수의과대학 Kida 교수님))를 SPF 발육란 (Sunrise Co., NY) 3개의 요막강 (allantoic cavity)에 각각 접종(총 27개 종란 사용)하고, 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 요막액 (allantoic fluid)을 수확하여 하기의 평판혈구응집검사를 수행하였다.　 상기 요막액 20㎕와 상기 각각의 시료를 접종한SPF 발육란 (Sunrise Co., NY)을 부화시킨 닭에서 추출한 0.1%(w/v) 닭 적혈구 20㎕를 유리 평판에 점적 후 혼합하여 평판혈구응집검사를 실시하여 양성인 시료는 -70℃에 보관하며 실험에 사용하였다.　

1-3: 역전사효소 - 중합효소연쇄반응 , 유전자 클로닝 , 염기서열 결정 및 분석

산-구아니디늄-페놀 (acid-guanidinium-phenol) 방법 (Chomzinski and Sacci, 1985)을 사용하여, PR8, KBNP-0028, 01310, SNU8011, SNU9037, SNU9046, SNU50-5, SNU31D, 및 A/duck/Hong HK820 바이러스의 게놈 RNA를 요막액으로부터 추출하였다.　

이를 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.　 RNA분리를 위하여, 상기 1-2에서 얻어진 발육란 배양 요막강액 100㎕에 easyBlue (iNtRON Co. Ltd., 서울, 대한민국) 1 ml를 첨가하고, 제조사에서 제공한 방법에 따라 RNA를 분리하여, DEPC (diethyl-pyrocarbonate; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA)로 처리한 멸균 3차 증류수 10㎕에 용해시켜 RNA 용액을 만들었다.　 얻어진 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여, 1st strand buffer (iNtRON Co.) 4㎕, 0.1M DTT (iNtRON Co.) 1㎕, 2.5mM dNTP (iNtRON Co.) 1㎕, random hexamer (50ng/㎕) 1㎕ 및 상기 RNA 용액 10㎕를 혼합하고, 70℃에서 15분간 가온한 후, 얼음에서 급냉시켰다.　 그리고 나서, 실온에서 10분간 정치한 후, 역전사효소 (iNtRON Co.) 1㎕를 첨가하고, 42℃에서 1시간 반응시킨 후, 95℃에서 5분간 역전사효소를 불활화 하였다.

그리고 나서, 10X PCR 버퍼(iNtRON Co.) 1㎕, 2.5mM dNTP (iNtRON Co.) 0.2㎕, 프라이머 (Bm-NS-1; Bm-NS-890R 프라이머; Hoffmann 등, Archives Virol, 2001) (5pmol/㎕) 각각 0.2㎕, Taq 폴리머레이즈 (iNtRON Co.; 1U/㎕) 0.2㎕, 멸균증류수 7.2㎕ 및 상기에서 얻어진 cDNA 1㎕를 혼합하고, Thermocycler 9600 (Perkin-Elmer Co, Foster City, CA, USA)을 이용하여 94℃에서 4분간 변성시킨 후, 94℃에서 20초, 52℃에서 15초, 72℃에서 2분간의 반응을 35회 실시한 후, 72℃에서 7분간 반응시켜 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.　 얻어진 증폭산물을 1.0중량% 아가로오스 젤에서 전기영동하여 에티디움브로마이드로 염색하여 관찰하였다.　

PR8, KBNP-0028, 01310, SNU8011, SNU9037, SNU9046, SNU50-5, SNU31D와　HK820 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드 염기서열을 DNA 자동분석장치(ABI Prism 3700, Applied Biosystems Co. CA)와 다이 종결 키트 (dye terminator kit, Perkin Elmer, Foster, CA)를 사용하여 결정하였다. Bioedit 프로그램을 사용하여 염기서열을 NS1와 NS2 아미노산 서열로 번역한 후 GenBank 상에 등록되어 있는 A/WSN/33(H1N1)(M12597; 이하 WSN33), A/California/04/09(H1N1)(FJ969514; 이하 Cal04), A/chicken/Korea/IS/06(H5N1)(EU233679; 이하 IS06), A/Hong Kong/213/03(H5N1)(AY576369; 이하 HK213), A/Hong Kong/485/97(H5N1)(AF084287; 이하 HK485), A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)(AF144307; 이하 GD1), A/Vietnam/1203/04(H5N1)(AY651553; 이하 VN1203), A/Hong Kong/1073/99(H9N2)(AJ278649; 이하 HK1073)과 다중배열 하여, 아미노산 상동성을 각각 표1과 표 2에 정리하였다. 표 1 및 표 2에 기재된 rPR8은 상기 실시예 1-1에서 제작된 재조합 바이러스를 의미하는 것으로, 야생형 PR8과 동일한 유전자 조성을 가지며, 'PR8'과 혼용 가능하다.

KBNP-0028은 HK820과 92.1%, 01310과 91.7%의 비교적 높은 상동성을 보였으나 비교한 나머지 바이러스들과는 66.5% 내지 91.3%의 상동성을 보였다(표 1 참조).

또한, KBNP-0028의 NS2는 HK820과 WSN33과 97.5%, 01310과 96.6%의 높은 상동성을 보였으나 나머지 바이러스들과는 80.1% 내지 95.8%의 상동성을 보였다(표 2 참조).

또한　 KBNP-0028의 NS1은 다른 모든 저병원성 조류인플루엔자 바이러스들과 달리 60번 아미노산으로 알라닌(A), 이소루이신(I), 글루탐산(E), 발린(V) 대신 글리신(G), 70번 아미노산으로 글루탐산(E)과 리신(K) 대신 페닐알라닌(F), 71번 아미노산으로 글루탐산(E), 세린(S), 글리신(G) 대신 리신(K), 87번 아미노산으로 세린(S)이나 프로린(P) 대신 트레오닌(T), 119번 아미노산으로 메티오닌(M) 대신 이소루이신(I), 127번 아미노산으로 아스파라긴이(N)나 아르기닌(R) 대신 트레오닌(T), 137번 아미노산으로 이소루이신(I)이나 루이신(L) 대신 트레오닌(T), 139번 아미노산으로 아스파탐산(D)이나 글루탐산(E)이나 아스파라긴(N) 대신 글리신(G), 151번 아미노산으로 트레오닌(T) 대신 세린(S), 189번 아미노산으로 아스파탐산(D) 대신 아스파라긴(N), 220번 아미노산으로 아르기닌(R) 대신 글루타민(Q), 227번 아미노산으로 아르기닌(R)이나 글루탐산(E) 대신 글리신(G)을 가지고 있어 차이를 보였고, NS2는 31번 아미노산으로 메티오닌 대신 이소루이신, 63번 아미노산으로 글루탐산 대신 아르기닌을 가지고 있어 차이를 보였다(표 3). 이러한 아미노산 차이는 비교한 바이러스들에서만 관찰되는 것이 아니라 KBNP-0028의 NS1 및 NS2 아미노산 서열로 BLAST 검색하여도 표 2에 제시한 아미노산 차이가 대부분 관찰되어 KBNP-0028의 아미노산 서열은 매우 독특하였다.

KBNP-0028 NS1과 NS2 특이 아미노산 서열

	KBNP-0028	Location of Amino acid	Other influenza viruses
NS1	G	60	A/I/V/E
	F	70	E/K
	K	71	E/S/G
	T	87	S/P
	I	119	M
	T	127	N/R
	T	137	I/L
	G	139	D/E/N
	S	151	T
	N	189	D/G
	Q	220	R
	G	227	R/E
NS2	I	23	M
	R	65	E

1-3. 재조합 바이러스 제작

재조합 인플루엔자 바이러스 작출을 위해 호프만 박사의 역유전학 벡터시스템(특허 제0862758호)을 사용하였다.

구체적으로, 실시예 1-2에서 증폭한 KBNP-0028, 01310, SNU8011, SNU50-5, 및 HK820의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 TOPO-TA cloning 벡터(Invitrogen Co. USA)에 클로닝하여 M13F/M13R 프라이머(M13F, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(서열번호 6); M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'(서열번호 7))로 염기서열을 결정하고, BsmBI(NEB Inc, USA) 20U/2㎕, NEBuffer(NEB Inc., USA) 2㎕, pHW2000 플라스미드(한국특허등록 제0862758호, 국립수의과학검역원으로부터 St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사, 호프만 박사의 동의를 얻어 입수) 10㎍/3㎕, 멸균 3차증류수 13㎕를 혼합하여 50℃에서 1.5시간 배양한 후 아가로스겔에 전기영동하여 해당 DNA를 Gel extraction kit(QIAGEN Co.)로 정제하였다.

또한 상기 pHW2000 플라스미드에 대하여 상기와 동일한 방법으로 BsmBI을 처리하여 아가로스겔에 전기영동하여 정제한 pHW2000 벡터 6㎕와 NS 2㎕에 T4 DNA 라이게이즈 (1,000,000 U/㎕; NEB Inc, USA) 1㎕, 10X 반응 버퍼(NEB Inc, USA) 1㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 정치한 후, 대장균(Escherichia coli, OneShot

top10 competent cell, Invitrogen Co. USA)에 transformation 한 후 염기서열을 분석하여 유전자의 염기서열의 돌연변이가 없는 정확한 클론을 선발하여 플라스미드를 추출하였다.

PR8과 01310 NS의 PL 모티프로 GSEV 갖도록 그리고, KBNP-0028의 NS의 PL 모티프로 EPEV또는 RSEV를 갖도록 프라이머(PR8-GSEV-F: GAACAATTGGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAG (서열번호 8); PR8-GSEV-R: CTTATTTCTTCAAACTTCTGACCCAATTGTTC(서열번호 9); 01310-GSEV-F: GAACAATTGGGTCAGAAGTTTGAAGAAATAAG(서열번호 10); 01310-GSEV-R: CTTAT TTCTTCAAACTTCTGACCCAATTGTTC(서열번호 11); 0028-RSEV-F: TGGCGAGAACAATTAGGTCAGAAGTTTGAAGA(서열번호 12); 0028-RSEV-R: TCTTCAAACTTCTGACCTAATTGTTCTCGCCA(서열번호 13); 0028-EPEV-F: TGGCGAGAACAATTGAGCCAGAAGTTTGAAGA(서열번호 14); 0028-EPEV-R: TCTTCAAACTTCTGGCTCAATTGTTCTCGCCA(서열번호 15))를 제작하고, 상기 NS 유전자를 pHW2000에 클로닝하여 선발한 정확한 클론으로부터 추출한 플라스미드를 사용하여 site-directed mutagenesis를 수행하였다.

상기 실시예 1-1에서 St. Jude Children's Research Hospital의 웹스터 박사로부터 제공 받은 pHW191-PB2, pHW192-PB1, pHW193-PA, pHW194-HA, pHW195-NP, pHW196-NA, 및 pHW197-M 역유전학용 플라스미드(Vaccine 2002, 20:3165-3170; pHW2000 (등록특허 제10-0862758호 참조) 에 PR8 바이러스의 NS 제외 7개 유전자를 삽입한 플라스미드)와 각 바이러스의 상기 NS 플라스미드와 site-directed mutagenesis를 수행한 NS 플라스미드를 갖는 재조합 바이러스를 제작하기 위해, 293T 세포(생명자원센터, KCTC)를 6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 MEM (GIBCO BRL) 배지에 2X10⁶개/2ml의 양으로 부유하여 각 웰에 첨가한 후, 3-4시간 부착시켰다. 배지를 제거한 후, Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2ml를 첨가하였다.

상기 준비된 8개 플라스미드(PR8 바이러스의 NS 유전자를 제외한 7개 유전자 대응 7개 플라스미드 + 동종(PR8) 또는 이종 바이러스(KBNP-0028, 01310, SNU8011, SNUH5N3, SNU50-5, HK820)의 NS 유전자 또는 PL 모티프 치환된 NS 유전자 대응 1개 플라스미드)를 모두 하나의 1.5ml tube에 각각의 양이 300ng씩이 되도록 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하고, 또 다른 1.5ml tube에 PLUS reagent(Invitrogen Co. USA) 6㎕와 Opti-MEM 배지 69㎕를 첨가하여 혼합한 후 플라스미드가 들어있는 1.5ml tube에 첨가하여 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시켰다.

기다리는 동안 lipofectamine 4㎕(Invitrogen Co)와 Opti-MEM 96㎕를 혼합하여 15분간 반응한 후 100㎕를 취하여 플라스미드가 있는 tube에 첨가한 후 15분간 추가 반응시켰다.

얻어진 반응 생성물을 상기 293T 세포가 들어있는 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 6-웰 배양용기를 5% CO₂, 37℃에서 20시간 배양한 후, 웰당 트립신10㎍(2.5㎍/4㎕)을 첨가한 후, 24시간 후 상층액을 수확하여 10 내지 11일령 SPF 발생란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 상기 수확된 원액 200ul를 접종하였다. 상기 접종된 발생란을37℃에서 3일간 배양한 후 요막액을 수확하여 혈구응집이 되는 경우 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스로부터 RNA를 추출하여 NS 유전자의 염기서열을 결정하여 바이러스가 제대로 제작되었는지 확인한 후 -70℃에서 보관하며 실험에 사용하였다.

본 실시예 결과, rPR8-KBNP-0028(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 KBNP-0028의 NS 유전자(서열번호 1)로 치환), rPR8-01310(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 01310의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-SNU8011(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNU8011의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-SNUH5N3(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNUH5N3의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-SNU50-5(NS)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 SNU50-5의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-HK820(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 HK820의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8(NS-GSEV)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드의 PL 모티프가 GSEV 로 치환), rPR8-01310(NS-GSEV)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 PL 모티프가 GSEV로 치환된 01310의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)(PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 PL 모티프가 RSEV로 치환된 KBNP-0028의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환), 및 rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV) (PR8바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 PL 모티프가 EPEV로 치환된 KBNP-0028의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드로 치환)를 제작하였으며, 이중에서 rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV: 서열번호 4)를 대전에 소재하는 생명자원센터에 2011년 11월3일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC 12045BP를 부여받았다.

1-4. 바이러스 역가 측정

상기에서 제작한 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식역가(50% embryo infection dose, EID₅₀/ml)를 측정하기 위하여, 각각의 재조합 바이러스들을 인산완충용액으로 10^-1 내지 10^-9까지 10진 희석하여 각 희석 배수 별로 10-11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강 경로로 100㎕씩 접종하였다. 그 후 3일간 배양한 후, 요막액을 수확하여 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하여 Reed-Muench 계산식에 따라 바이러스 역가(EID₅₀/ml)를 측정하였다.

그 결과 얻어진 바이러스 역가(EID₅₀/ml(log10))를 아래의 표 4에 나타내었다.

재조합 바이러스의 계태아 증식성 비교

Recombinant viruses	EID₅₀/ml(log10)
rPR8	8.8±0.3
rPR8-SNU50-5(NS)	8.5
rPR8-HK820(NS)	8.3
rPR8-01310(NS)	8.2±0.1
rPR8-KBNP-0028(NS)	8.7±0.0
rPR8-SNU8011(NS)	8.1±0.6
rPR8-NS-GSEV	8.9
rPR8-01310(NS-GSEV)	8.7
rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)	9.5
rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)	9.1

바이러스 역가(EID₅₀/ml(log10))를 살펴보면, PR8의 경우 10^8.8, rPR8-KBNP-0028(NS)의 경우 10^8.7, rPR8-01310(NS)의 경우 10^8.2, rPR8-SNU8011(NS)의 경우 10^8.1, rPR8-SNUH5N3(NS)의 경우 10^8.3, rPR8-SNU50-5(NS)의 경우 10^8.5, rPR8(NS-GSEV)의 경우 10^8.9, rPR8-01310(NS-GSEV)의 경우 10^8.7EID₅₀/ml을 보여서, 이종 바이러스의 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드가 포함된 재조합 바이러스들은 rPR8 대비 유사하거나 조금 높거나 낮은 역가를 보이는 것으로 나타났다. 그러나, rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)의 경우 10^9.1, rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV)의 경우에는 10^9.5EID₅₀/ml을 보여, rPR8 대비 높은 계태아 증식성을 보였다.

실시예 2: 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 유래 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 갖는 재조합 PR8 바이러스 병원성 및 면역원성 측정

2-1. BALB /c 마우스에 대한 병원성 측정

상기 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 각각 10진 희석하여 졸레틸(Virbac S.A., France) 15mg/kg로 마취한 BALB/C 마우스(6주령 암컷, 주식회사 코아텍) 5수에 비강으로 각각 10⁶EID₅₀를 접종하였다. 그 후, 매일 폐사 유무를 조사하였고, 체중을 측정하여 체중 변화를 도 1a 및 1b에 나타내었다. 그 결과 폐사율은 rPR8 100%, rPR8-01310(NS) 40%, rPR8-9037(NS) 100%, rPR8-SNU50-5(NS) 60% 이고, 이들 재조합 균주에서는 체중의 뚜렷한 감소가 관찰되었으나, rPR8-KBNP-0028(NS)와 대조군(바이러스 대신 인산완충용액 접종)에서는 폐사율이 0% 였고, 체중의 감소가 관찰되지 않아 병원성이 전혀 없는 것으로 나타났다(도 1a 참조). 또한 PL 모티프를 변화시킨 재조합 바이러스의 병원성을 조사한 결과, 폐사율은 rPR8, 100%, rPR8(NS-GSEV) 100%, rPR8-01310(NS-GSEV) 0% 였으며 대조군 대비 뚜렷한 체중의 감소가 관찰되었으나, rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV), rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)에서는 폐사가 일어나지 않았고, 대조군 대비 체중의 감소가 거의 일어나지 않아 병원성이 없었다(도 1b 참조).

2-2. BALB /c 마우스에 대한 면역원성 측정

상기 재조합 바이러스를 1X10⁵ 또는 1X10⁶비강접종한 BALB/C 마우스(6주령 암컷, 주식회사 코아텍)를 2주간 관찰한 후 채혈하여 혈청을 수확하였다. 상기 수확된 혈청 25㎕에 receptor destroying enzyme(RDEII; DENKA SEIKEN Co. Ltd. Japan)을 75㎕에 첨가하고, 37℃에서 종야 배양한 후, 56℃에서 30분 처리한 후 혈구응집억제법으로 항체를 측정하였다.

보다 구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각각의 웰에 인산완충용액 50 ㎕ 씩을 분주하고, 첫번째 웰에 PR8 바이러스 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 다시 50 ㎕를 채취하여 다음 웰에 첨가하여 섞어주는 과정을 반복하며 마지막 웰에서는 50 ㎕를 채취하여 제거하는 방법으로 연쇄 희석(serial dilution)을 실시하여, 상기 바이러스 각각에 대한 희석액을 만들었다. 상기와 같이 바이러스가 2배 단위로 희석된 각 웰에 SPF 종란(Sunrise Co., NY)을 부화시켜 얻은 SPF 닭으로부터 채취한 0.5%(v/v) 닭 적혈구 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후, 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 완벽한 혈구응집이 일어난 웰의 희석배수(2ⁿ, n=희석배수)를 혈구응집 역가로 하였다.

상기에서 설정한 역가에 기초하여 혈구응집억제법으로 감염시킨 BALB/c 마우스 혈청내 항체의 혈구응집억제 능력을 검사하였다. 즉, 4-혈구응집단위의 PR8 바이러스 25 ㎕와 마우스 혈청 25 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분 간 반응시킨 후 상기 0.5%(w/v) 닭 적혈구 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 30분경과 후 혈구응집이 완전히 억제된 웰의 혈청 희석배수를 혈구응집억제 역가로 하였다.

동일 바이러스를 감염시켜 얻은 혈청 역가의 평균값과 표준편차를 하기의 표 5에 나타내었다. 다른 바이러스에 대하여도 동일한 방법으로 혈청 역가의 평균값과 표준편자를 구하여 표 5에 함께 나타내었다.

재조합 바이러스들의 BALB/c 마우스에 대한 면역원성

Recombinant viruses	No. of serum	Mean HI titer	SD
rPR8-KBNP-0028(NS) 10⁶	5	104	54
rPR8-01310(NS) 10⁶	3	187	122
rPR8-SNU50-5(NS) 10⁶	2	160	0.0
PR8 10⁵	3	240	92
rPR8(NS-GSEV) 10⁶	0	Not tested	Not tested
rPR8-01310(NS-GSEV) 10⁶	5	288	72
rPR8-9037(NS) 10⁶	3	533	185
rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV) 10⁶	5	320	196
rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV) 10⁶	5	176	88
(-)　 control	4	0.0	0.0

(대조군: 인산완충용액을 접종한 마우스의 혈청)

표 5에서 보여지는 바와 같이, 모든 바이러스에서 항체가 검출되었다. 특히 병원성이 전혀 없었던 rPR8-KBNP-0028(NS), rPR8-KBNP-0028(NS-EPEV), rPR8-KBNP-0028(NS-RSEV)에서도 비교적 높은 항체가 검출되어 면역원성이 있음을 확인하여 사독백신뿐 아니라, 생독백신 개발에 유용할 것으로 판단되었다.

2-3. 계태아 병원성 측정

상기 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 각각 10진 희석하여 10^- ¹내지 10^- ⁸희석하여 200㎕의 양으로 10 내지 11일령 SPF 종란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하여 3일 간 37℃에 배양하며 폐사한 종란과 3일까지 생존한 종란을 4℃에서 12 내지 24시간 보관한 후 계태아에서의 폐사와 출혈이나 충혈 등의 병변을 관찰하여 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보여지는 바와 같이, rPR8-SNU50-5(NS), rPR8-01310(NS), 및 rPR8-SNU8011(NS)에서는 계태아의 폐사와 병변이 관찰되어 계태아에 대한 병원성을 갖는다는 것을 알 수 있는 반면, rPR8-KBNP-0028(NS)는 계태아의 병변을 관찰할 수 없어 병원성이 없었다 (도 2).

계태아를 이용한 백신 생산시 중간에 죽는 계태아는 백신 생산에 사용할 수 없으므로 계태아에 대한 무병원성은 백신 고생산성과 함께 백신주의 조류에 대한 낮은 병원성을 의미하므로 KBNP-0028 NS 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드는 계태아 생산성과 안전성이 높은 다양한 백신주 제작에 유용하게 사용될 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC12045BP

20111103

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PREPARING HIGHLY PRODUCTIVE, HIGHLY IMMUNOGENIC AND AVIRULENT INFLUENZA VIRUS, AND USE THEREOF <130> DPP20115412KR <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 890 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS gene of KBNP-0028 <400> 1 agcaaaagca gggtgacaaa aacataatgg attctaacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60 actgctttct ctggcatgtc cgcaaacgat ttgcagacca agaactgggt gatgccccat 120 tccttgaccg gcttcgccga gatcagaagt ccctaagagg aagaggcagc actcttggtc 180 tggacattga aacagctacc cgtgggggaa agcagatagt ggagcggatt cttttcaaag 240 aatccgatga ggcacttaaa atgactgttg cttcagtacc ggctacacgc tatctaactg 300 atatgactct tgaagaaatg tcaagggact ggttcatgct catgcccaag cagaaagtgg 360 caggttccct ttgcatcaaa atagaccagg caataatgga taaaaccatc acattgaaag 420 caaacttcag tgtgactttt ggtcggctgg aaaccctaat actacttaga gctttctcag 480 aggaaggagc aattgtggga gaaatctcac cgttaccctc tcttccagga catactgatg 540 aggatgtcaa aaatgcaatt ggggtcctca tcggaggact tgaatggaat aataacacag 600 ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagtgatgag aatgggagac 660 ctccactccc tccaaagcag aaacagaaaa tggcgagaac aattgggtca gaagtttgaa 720 gaaataaggt ggctgatcga agaggtgcga catagattaa agattacgga gaacagcttt 780 gaacaaataa catttatgca agccttacaa ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840 actttctcgt ttcagcttat ttgataataa aaaacaccct tgtttctact 890 <210> 2 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NS1 protein of KBNP-0028 <400> 2 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Gly Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Phe Lys Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Val Ala Ser Val Pro Ala Thr Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala 100 105 110 Gly Ser Leu Cys Ile Lys Ile Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Thr Ile 115 120 125 Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Thr Phe Gly Arg Leu Glu Thr Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe Ser Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile 145 150 155 160 Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn 165 170 175 Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asn Asn Thr Val 180 185 190 Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asp Glu 195 200 205 Asn Gly Arg Pro Pro Leu Pro Pro Lys Gln Lys Gln Lys Met Ala Arg 210 215 220 Thr Ile Gly Ser Glu Val 225 230 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NS2 protein of KBNP-0028 <400> 3 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Asp Ile Leu Met Arg Met 1 5 10 15 Ser Lys Met Gln Leu Gly Ser Ser Ser Glu Asp Leu Asn Gly Ile Ile 20 25 30 Thr Gln Phe Glu Ser Leu Lys Leu Tyr Arg Asp Ser Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Val Met Arg Met Gly Asp Leu His Ser Leu Gln Ser Arg Asn Arg Lys 50 55 60 Trp Arg Glu Gln Leu Gly Gln Lys Phe Glu Glu Ile Arg Trp Leu Ile 65 70 75 80 Glu Glu Val Arg His Arg Leu Lys Ile Thr Glu Asn Ser Phe Glu Gln 85 90 95 Ile Thr Phe Met Gln Ala Leu Gln Leu Leu Leu Glu Val Glu Gln Glu 100 105 110 Ile Arg Thr Phe Ser Phe Gln Leu Ile 115 120 <210> 4 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 'EPEV' variant of NS1 protein of KBNP-0028, wherein PL motif is substituted with 'EPEV'. <400> 4 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Gly Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Phe Lys Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Val Ala Ser Val Pro Ala Thr Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala 100 105 110 Gly Ser Leu Cys Ile Lys Ile Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Thr Ile 115 120 125 Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Thr Phe Gly Arg Leu Glu Thr Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe Ser Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile 145 150 155 160 Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn 165 170 175 Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asn Asn Thr Val 180 185 190 Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asp Glu 195 200 205 Asn Gly Arg Pro Pro Leu Pro Pro Lys Gln Lys Gln Lys Met Ala Arg 210 215 220 Thr Ile Glu Pro Glu Val 225 230 <210> 5 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 'RSEV' variant of NS1 protein of KBNP-0028, wherein PL motif is substituted with 'RSEV' <400> 5 Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 1 5 10 15 His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe 20 25 30 Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser 35 40 45 Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Gly Gly Lys Gln Ile 50 55 60 Val Glu Arg Ile Leu Phe Lys Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr 65 70 75 80 Val Ala Ser Val Pro Ala Thr Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu 85 90 95 Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala 100 105 110 Gly Ser Leu Cys Ile Lys Ile Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Thr Ile 115 120 125 Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Thr Phe Gly Arg Leu Glu Thr Leu 130 135 140 Ile Leu Leu Arg Ala Phe Ser Glu Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile 145 150 155 160 Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn 165 170 175 Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asn Asn Thr Val 180 185 190 Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asp Glu 195 200 205 Asn Gly Arg Pro Pro Leu Pro Pro Lys Gln Lys Gln Lys Met Ala Arg 210 215 220 Thr Ile Arg Ser Glu Val 225 230 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M13F <400> 6 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer M13R <400> 7 caggaaacag ctatgac 17 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> priemr PR8-GSEV-F <400> 8 gaacaattgg gtcagaagtt tgaagaaata ag 32 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> priemr PR8-GSEV-R <400> 9 cttatttctt caaacttctg acccaattgt tc 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 01310-GSEV-F <400> 10 gaacaattgg gtcagaagtt tgaagaaata ag 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> priemr 01310-GSEV-R <400> 11 cttatttctt caaacttctg acccaattgt tc 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0028-RSEV-F <400> 12 tggcgagaac aattaggtca gaagtttgaa ga 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0028-RSEV-R <400> 13 tcttcaaact tctgacctaa ttgttctcgc ca 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0028-EPEV-F <400> 14 tggcgagaac aattgagcca gaagtttgaa ga 32 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0028-EPEV-R <400> 15 tcttcaaact tctggctcaa ttgttctcgc ca 32

Claims

저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 KBNP-0028(A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)의 NS(nonstructural protein) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하며,
상기 NS 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열의 C 말단의 4개의 아미노산이 'EPEV'로 치환된 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것인,
H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 약독화용 조성물.
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H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 중합효소 B1(PB1) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 B2(PB2) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 중합효소 A(PA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 적혈구응집 단백질(HA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레오캡시드(NP) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 뉴라미디다제(NA) 코딩 폴리뉴클레오타이드, 및 매트릭스 단백질(M) 코딩 폴리뉴클레오타이드와, 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스 KBNP-0028(A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)의 NS(nonstructural protein) 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하며,
상기 NS(nonstructural protein) 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열의 C 말단의 4개의 아미노산이 'EPEV'로 치환된 것인, 재조합 발현 벡터.
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H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)가 제10항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 인플루엔자 바이러스.
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H1N1 계통 조류 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)가 제10항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자 바이러스 백신.
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제23항에 있어서, 사독백신 또는 생독백신인, 백신.
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기탁번호 KCTC 12045BP의 재조합 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스.