JPH11279193A

JPH11279193A - アデノシン誘導体

Info

Publication number: JPH11279193A
Application number: JP10096799A
Authority: JP
Inventors: Akira Matsuda; 彰松田; Hiroyasu Nakada; 裕康中田; Yoshiko Saito; 佳子斉藤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 1999-10-12
Also published as: WO1999048903A1

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なアデノシン誘導体を提供する。【解決手段】本発明の化合物はプリン３様受容体物質
（Ｐ３様受容体という）に結合し得るアデノシン誘導体
である。本発明のアデノシン誘導体は、Ｐ３様受容体と
選択的に結合することができるので、Ｐ３様受容体及び
当該作用を有する物質のスクリーニング；プリン受容体
の薬理学的、生化学的、生理学的な作用・機構の研究；
医薬などに利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なアデノシン誘
導体に関する。より詳細には、プリン受容体３様物質と
結合し得るアデノシン誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】アデノシン 5'-三リン酸(Adenosine 5'-
triphospate, ATP)は１９２９年に発見され、生体のエ
ネルギーの源泉になっている物質であリ、その細胞内に
おける生化学的な重要性は過去何年にもわたり認識され
ている。その細胞内の働きに加えて、最近の十年でその
細胞表面に置ける受容体を介した細胞外の作用について
の知見が蓄積されつつある(N.Y. Acad. Sci. 603, 1-1
7, 1990)。ATPはその生理的作用をプリン(purine)受容
体を介して発現する（Receptor &Channel, 3, 283-289,
1995)。その受容体の分類は、主としてP1受容体及びP2
受容体に分かれ、いずれも細胞外のアデニンヌクレオ
チドが結合すると言われている。また、その生体内の結
合性物質（リガンド）としては、P1についてはアデノシ
ン、P2についてはATP及びADPが知られている。そのた
め、P1受容体は通常アデノシン受容体とよばれ、アデノ
シンに選択的に結合し、サブクラスとして、A1, A2, A3
に分類される。A1とA3受容体はGI/G0蛋白と結合してade
nylate cyclase活性の抑制に関与する。一方、A2受容体
はGS蛋白と結合することにより、adenylate cyclase活
性の刺激を行う。さらに、近年では、P2受容体のサブタ
イプが薬理学、電気生理学、分子生物学を基盤として同
定されてきている。即ち、P2受容体はP2X(Ligand Gate
d), P2Y,U, Z(G蛋白結合性）のプリン受容体ファミリー
に分類される（pharmacol. rev.46, 143-156, 1994)。
例えば、神経系で言えば、ATPはプリン受容体の中のP2x
サブタイプに働き、ニューロンや平滑筋細胞を含んだ幅
広い細胞へのイオン運搬の増加作用を示す（Trends. Ph
armacol. Sci. 16, 168-174)。この、P2x受容体につい
ては、過去３年にラットにて６種のp2xのプリン受容体
のサブタイプがクローニングされてきている。

【０００３】このように、プリン受容体は大きくP１受
容体とP２受容体とに大別され、さらに細分化されてい
る。上記のP１受容体、特にアデノシン拮抗剤について
は、近年、抗パーキンソン病の治療薬や腎不全への治療
剤など、多くの試みがなされている。また、P2受容体に
ついては、たとえばP2X受容体とATPの結合はニューロン
に置ける交感神経伝達に深く関与している。また、P2X1
の場合はニューロンと平滑筋間での上記伝達に関与して
いる。したがって、そのリガンドの臨床応用としては神
経系の疾患、頻尿、鎮痛剤等が考慮されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、従来P1
及びP2受容体は医薬などへの応用が検討されているが、
１９９３年に従来のP1及びP2受容体と異なる第三の受容
体が提唱されている。本受容体は、ラットの動脈の交感
神経に局在しており、プリン受容体３様物質(以下、P3
様受容体という)と称され、種々のヌクレオシド、ヌク
レオチドにより活性化することが知られている。その相
対的効力の強さとしては2-chloroadenosine＞beta, gam
ma-methylene-ATP＞ATP＞Adenosineであり、また、別の
報告では、平滑筋弛緩作用の効力ではNECA＞Adenosine
＞ATP=ADP=AMP=inosisnと報告されている（Naunyn-schm
iedberg's arch.pharmacol, 338, 221-227, 1988; J. P
harmacol. 46, 337-341; Gen. Pharmacol. 23, 1067-10
71, 1992)。係るP3様受容体は従来のP1及びP2受容体と
異なるので、P3様受容体へ選択的に親和性を有する化合
物は、プリン受容体の薬理学的、生化学的、生理学的の
研究及び上記臨床応用への可能性が大きいと考えられて
いる。発明者らは従来、前記A1アデノシン受容体の精製
を各種の原料より手がけてきている（J. Biol. Chem. 2
64, 16545-16551, 1989; Eur, J. Biochem. 206, 171-1
77, 1992)。その一連の研究の中で、非選択的アデノシ
ン受容体アゴニストであり、ラットの脳内におけるユニ
ークなリガンドであるNECA(5'-N-ethylcarboxamidoaden
osine)に親和性のある新規な結合性蛋白質を発見し、上
記のP1及びP2と異なる性質を持つこと；リガンドへの結
合性を始めとして、上述のP3様受容体と類似しているこ
とを見い出している(Biochem & Biophysical Research
Com, 219, 469-474, 1996）。本発明者らはその研究を
鋭意継続することにより、上記P3様受容体に選択的に結
合する物質を見出し本発明を完成した。即ち、本発明
は、P3様受容体に結合し得る物質を提供することを目的
とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の要旨は、下記一般式で示されるア
デノシン誘導体である。

【０００６】

【化２】（式中、Ｒ¹及びＲ²は水酸基又は低級アルキニル基を示
す。但し、Ｒ¹及びＲ²の一方が低級アルキニル基のと
き、他方は水酸基であり；またＲ¹及びＲ²の一方が水酸
基のとき、他方は低級アルキニル基である）

【０００７】上記一般式で示される本発明の化合物にお
いて、好適な化合物は下記一般式（４）で示される化合
物である。

【０００８】

【化３】（式中、Ｒ¹及びＲ²は前記と同じ）

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のアデノシン誘導体は上記
の一般式で表され、Ｒ¹及びＲ²で示される低級アルキニ
ル基としては、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブ
チニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などが例示さ
れ、好ましくはエチニル基又は１−ヘキシニル基が例示
される。本発明の化合物は分子内の不斉炭素に基づく光
学異性体が存在するが、係る異性体及びそれらの混合物
は何れも本発明の範囲に包含されるものである。また、
本発明のアデノシン誘導体にはその塩が包含され、係る
塩としては、例えば塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の酸付
加塩が例示される。上記の一般式で示される本発明のア
デノシン誘導体は種々の方法で得ることができるが、例
えば、後記実施例に示されるように、下記の反応工程式
に示される方法にて合成することができる。

【００１０】

【化４】

【００１１】

【発明の効果】本発明のアデノシン誘導体は、後記試験
例に示されるように、P3様受容体と選択的に結合するこ
とができるので、P3様受容体及び当該作用を有する物質
のスクリーニングに利用することができ、ひいてはプリ
ン受容体の薬理学的、生化学的、生理学的な作用・機構
の研究に有用である。また、本発明のアデノシン誘導体
は医薬（例えば、血圧降下剤等）としての応用も期待で
きる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。実施例１(化合物２a,2bの合成)N⁶-ベンゾイル-9-(2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオ
キシ-7-C-トリメチルシリル-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフ
ラノシル)アデニン (2a)及びN⁶-ベンゾイル-9-(2,3-O-
イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-7-C-トリメチルシリ
ル-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン (2b)
［N⁶-Benzoyl-9-(2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-7
-C-trimethylsilyl-b-D-allo-hept-5-ynofuranosyl)ade
nine (2a)及びN⁶-Benzoyl-9-(2,3-O-isopropylidene-6,
7-dideoxy-7-C-trimethylsilyl-a-L-talo-hept-5-ynofu
ranosyl)adenine (2b)］ EtMgBr (3 M THF溶液，5.62 mL)を、トリメチルシリル
アセチレン(trimethylsilyl acetylene)(2.54 mL)を含
むTHF溶液(20 mL)にアルゴン雰囲気下10 ℃で加え、同
温で２時間撹拌した。化合物1 (2.30 g, 5.62 mmol)のT
HF溶液(30 mL)を上記の溶液に-20 ℃で滴下し、同温で
２時間撹拌した。反応液にNH₄Cl水溶液(1M)を加え、酢
酸エチルで抽出し、有機層をNa₂SO₄で乾燥した．有機層
を濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラムにより精製し、
2a (1.24 g)、2b (461 mg)及び2aと2bの混合物(282 mg)
を白色泡状物質として得た。 2aと2bの混合物：EI-MS, m/z 507 (M⁺)¹ H-NMR (CDCl₃) δ ppm, 8.83 and 8.78 (each s, 1H,
H2), 8.27 and 8.20 (each s, 1H, H8), 8.04 and 7.63
(m, total 5H, Ph), 6.05 and 5.97 (each d, 1H, H-
1', J = 4.4, 4.8 Hz), 5.20 and 5.18 (each d, 1H,
H-2'), 4.76 (d, 1H, H4'), 1.68, 1.42, 1.65, and 1.
38 (each s, 3H, Me), 0.22 and 0.12 (s,9H, TMS)

【００１３】実施例２（化合物３a、bの合成） 9-(2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-b-D-ア
ロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン (3a)［9-(2,3-O
-Isopropylidene-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept-5-ynofur
anosyl)adenine (3a)］化合物2a (1.24 g)をメタノ−ル性アンモニア(0 ℃で飽
和，40 mL)に溶解し、室温で26時間撹拌した。析出した
結晶をろ過し化合物3aを1.95 g(80%)を得た。 mp 257-258.5 ℃ (MeOHから再結晶) EI-MS, m/z 331 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.15
(s, 1H, H8), 7.36 (br s,2H, 6-NH₂), 6.29 (d, 1H,
5'-OH, J = 4.9 Hz), 6.16 (d, 1H, H1', J = 3.3Hz),
5.30 (dd, 1H, H2', J = 3.3, 6.0 Hz), 5.07 (dd, 1H,
H3', J = 1.7, 6.0 Hz), 4.41 (ddd, 1H, H5', J = 2.
2, 4.9 Hz), 4.18 (dd, 1H, H4', J = 2.2,1.7 Hz), 3.
38 (dd, 1H, -C≡CH, J = 2.0 Hz) 元素分析 C₁₅H₁₇N₅O₄として: 計算値：C, 54.38; H, 5.17; N, 21.14 実測値：C, 54.33; H, 5.10; N, 21.07

【００１４】 9-(2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデ
オキシ-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン
(3b)［9-(2,3-O-Isopropylidene-6,7-dideoxy-a-L-talo
-hept-5-ynofuranosyl)adenine (3b)］化合物2b (458 mg)をメタノ−ル性アンモニア(0 ℃で飽
和，40 mL)に溶解し、室温で26時間撹拌した。反応液を
減圧下濃縮すると白色結晶が析出し、結晶をろ過し化合
物3bを260 mg (87%)を得た。 mp 232-234 ℃ (MeOHから再結晶) EI-MS, m/z 331 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.33 (s, 1H, H2), 8.15
(s, 1H, H8), 7.36 (br s,2H, 6-NH₂), 6.17 (d, 1H, H
1', J = 2.8 Hz), 6.06 (d, 1H, 5'-OH, J = 6.6Hz),
5.29 (dd, 1H, H2', J = 2.8, 6.0 Hz), 5.01 (dd, 1H,
H3', J = 3.3, 6.0 Hz), 4.42 (ddd, 1H, H5', J = 2.
2, 6.1, 6.6 Hz), 4.16 (dd, 1H, H4', J =3.3, 6.1 H
z), 3.39 (dd, 1H, -C≡CH, J = 2.0 Hz). 元素分析 C₁₅H₁₇N₅O₄・0.25 H₂Oとして: 計算値：C, 53.65; H, 5.18; N, 20.85 実測値：C, 53.73; H, 5.10; N, 20.85.

【００１５】実施例３（化合物４a,bの合成） 9-(6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフラノ
シル)アデニン (4a)［9-(6,7-Dideoxy-b-D-allo-hept-5
-ynofuranosyl)adenine (4a)］化合物3a (623 mg)を90%トリフルオロ酢酸(20 mL)に溶
解し、室温で１０分間撹拌した。反応液を減圧下留去
し、エタノ−ルで数回共沸した。残渣をシリカゲルカラ
ムで精製し、エタノ−ルから結晶化し化合物4aを431 mg
(79%)得た。 mp 242-243 ℃ EI-MS, m/z 291 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.29 (s, 1H, H2), 8.13
(s, 1H, H8), 7.40 (br s,2H, 6-NH₂), 6.58 (d, 1H,
5'-OH, J = 3.3 Hz), 5.90 (d, 1H, H1', J = 7.7Hz),
5.45 (d, 1H, 2'-OH, J = 7.1 Hz), 5.33 (d, 1H, 3'-O
H, J = 3.9 Hz), 4.65 (ddd, 1H, H2', J = 7.1, 7.7 H
z), 4.48 (m, 1H, H5', J = 2.2, 3.3, 3.9Hz), 4.21
(dd, 1H, H3', J = 3.9 Hz), 3.98 (dd, 1H, H4', J =
3.9 Hz), 3.40 (dd, 1H, -C≡CH, J = 2.2 Hz) 元素分析 C₁₂H₁₃N₅O₄・0.25 H₂Oとして: 計算値：C, 48.73; H, 4.60; N, 23.68 実測値：C, 48.94; H, 4.60; N, 23.38.

【００１６】 9-(6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-ヘプト-5
-イノフラノシル)アデニン (4b)［9-(6,7-Dideoxy-a-L-
talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine (4b)］化合物3b (251 mg)を90%トリフルオロ酢酸(8 mL)に溶解
し、室温で１０分間撹拌した。反応液を減圧下留去し、
エタノ−ルで数回共沸した。残渣をシリカゲルカラムで
精製し、エタノ−ルから結晶化し化合物4bを213 mg (97
%)得た。 mp 214-215.5 ℃ EI-MS, m/z 291 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.33 (s, 1H, H2), 8.16
(s, 1H, H8), 7.45 (br s,2H, 6-NH₂), 5.92 (d, 1H, H
1', J = 7.2 Hz), 5.48 (d, 1H, 2'-OH, J = 2.2Hz),
5.31 (d, 1H, 3'-OH, J = 3.3 Hz), 4.63 (ddd, 1H, H
2', J = 7.1, 2.2 Hz), 4.49 (dd, 1H, H5', J = 2.2,
3.8 Hz), 4.13 (dd, 1H, H3', J = 1.7, 3.3Hz), 3.96
(dd, 1H, H4', J = 1.7, 3.9 Hz), 3.32 (dd, 1H, -C≡
CH, J = 2.2Hz) 元素分析 C₁₂H₁₃N₅O₄として: 計算値：C, 49.48; H, 4.50; N, 24.04 実測値：C, 49.30; H, 4.60; N, 23.88.

【００１７】実施例４（化合物3c, dの合成） N⁶-ベンゾイル-9-(7-C-ブチル-2,3-O-イソプロピリ
デン-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフラノシ
ル)アデニン (2c), N⁶-ベンゾイル-9-(7-C-ブチル-2,3-
O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-ヘプト-
5-イノフラノシル)アデニン (2d)及び9-(7-C-ブチル-2,
3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプ
ト-5-イノフラノシル)アデニン (3c) 及び9-(7-C-ブチ
ル-2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-
ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン (3d)［N⁶-Benzoyl-
9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-b-D-
allo-hept-5-ynofuranosyl)adenine (2c), N⁶-Benzoyl-
9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-a-L-
talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine (2d)及び9-(7-C-bu
tyl-2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept
-5-ynofuranosyl)adenine(3c), 及び9-(7-C-butyl-2,3-
O-isopropylidene-6,7-dideoxy-a-L-talo-hept-5-ynofu
ranosyl)adenine (3d)］ EtMgBr (3 M THF溶液，17.7 mL)を、n-ヘキシン(n-hexy
ne) (6.1 mL)を含むTHF溶液(20 mL)にアルゴン雰囲気下
10 ℃で加え、同温で３時間撹拌した。化合物１ (2.17
g, 5.31 mmol)のTHF溶液(50 mL)を上記の溶液に-20 ℃
で滴下し、20℃で４時間撹拌した。反応液にNH₄Cl水溶
液(1 M)を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層をNa₂SO₄
で乾燥した。有機層を濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカ
ラムにより精製し、2cと2dの混合物を白色泡状物質とし
て632 mg及び3cと3dの混合物を白色泡状物質として819
mg得た。 2cと2dの混合物：EI-MS, m/z 491 (M⁺)¹ H-NMR (CDCl₃) δ ppm, 8.83 and 8.78 (each s, 1H,
H2), 8.22 and 8.17 (each s, 1H, H8), 8.05 and 7.53
(each m, total 5H, Ph), 6.04 and 5.97 (eachd, 1H,
H-1', J = 4.4, 4.8 Hz), 5.20 (m, 2H, H2', H3'),
4.73 (dd, 1H, 5'-OH), 1.68, 1.42, 1.65, and 1.38
(each s, 3H, Me), 1.25 (m, total 14H,CH₂CH₂, 0.90
(m, total 3H, Me)

【００１８】 9-(7-C-ブチル-2,3-O-イソプロピリデ
ン-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフラノシ
ル)アデニン (3c), 及び9-(7-C-ブチル-2,3-O-イソプロ
ピリデン-6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラ
ノシル)アデニン (3d)［9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropyl
idene-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept-5-ynofuranosyl)ade
nine (3c), 及び9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropylidene-
6,7-dideoxy-a-L-talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine
(3d)］化合物2cと2dの混合物 (800 mg)をメタノ−ル性アンモ
ニア(0 ℃で飽和，30 mL)に溶解し、室温で20時間撹拌
した。溶媒を留去した後，残渣をシリカゲルカラムによ
り精製し、3cと3dの混合物を白色泡状物質として527 mg
(84%)得た。 EI-MS, m/z 388 (M+H⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.14
(s, 1H, H8), 7.36 (br s,2H, 6-NH₂), 6.13 (d, 2H,
5'-OH, H1', J = 3.3 Hz), 5.27 (dd, 1H, H2', J= 3.
3, 6.0 Hz), 5.04 (dd, 1H, H3', J = 1.6, 6.0 Hz),
4.38 (dd, 1H, H4',J = 1.6 Hz), 4.16 (ddd, 1H, H
5'), 2.16 (m, total 2H, CH2), 1.48 and 1.33 (each
s, 3H, Me), 1.33 (m, total 14H, CH₂CH₂, 0.84 (m, t
otal 3H, Me) 元素分析 C₁₉H₂₅N₅O₄として: 計算値：C, 58.90; H, 6.50; N, 18.08 実測値：C, 58.77; H, 6.41; N, 17.93

【００１９】実施例５（化合物４c、dの合成）9-(7-C-ブチル-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イ
ノフラノシル)アデニン (4c)及び9-(7-C-ブチル-6,7-ジ
デオキシ-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン
(4d)［9-(7-C-butyl-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept-5-yn
ofuranosyl)adenine (4c)及び9-(7-C-butyl-6,7-dideox
y-a-L-talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine(4d)］化合物3cと3dの混合物 (1.86 g)を90%トリフルオロ酢酸
(20 mL)に溶解し、室温で４０分間撹拌した。反応液を
減圧下留去し、エタノ−ルで数回共沸した。残渣をシリ
カゲルカラムで精製し、部分精製された4c (765 mg)及
び 4d (205 mg)並びにその混合物(208 mg)得た。化合物
4c及び4dはさらに逆層C-18 HPLCにより精製した。化合物4c mp 124-126 ℃ EI-MS, m/z 348 (M+H⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.15
(s, 1H, H8), 7.55 (br s,2H, 6-NH₂), 5.90 (d, 1H, H
1', J = 7.3 Hz), 5.35 (m, 2H, 2', 3'-OH), 4.63 (d
dd, 1H, H2', J = 7.3, 5.5 Hz), 4.44 (dd, 1H, H5',
J = 1.5, 3.7 Hz),4.21 (d, 1H, H3', J = 5.1 Hz), 3.
95 (dd, 1H, H4', J = 1.5, 3.3 Hz) 元素分析 C₁₆H₂₁N₅O₄・5/4 H₂Oとして: 計算値：C, 51.95; H, 6.40; N, 18.83 実測値：C, 51.98; H, 6.10; N, 18.63

【００２０】化合物4d mp 113-116 ℃ EI-MS, m/z 348 (M+H⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.14
(s, 1H, H8), 7.38 (br s,2H, 6-NH₂), 5.90 (d, 1H, H
1', J = 7.0 Hz), 5.43 (br s, 1H, 2'-OH), 5.25(br
s, 1H, 3'-OH), 4.64 (d, 1H, H2', J = 7.0 Hz), 4.45
(br s, 1H, H5'),4.13 (br s, 1H, H3'), 3.91 (dd, 1
H, H4') 元素分析 C₁₆H₂₁N₅O₄として: 計算値：C, 55.32; H, 6.09; N, 20.16 実測値：C, 55.03; H, 6.39; N, 19.87

【００２１】試験例１Ｐ３様受容体の精製 J.Biol. Chem., 264, 16545-16551 (1989)に記されてい
る方法と同様の方法でラット脳の膜画分を調製し、０℃
にて１０倍量の0.4% CHAPSを含む５０ｍＭトリス酢酸緩
衝液(pH7.2)と混合することにより、膜タンパク質を可
溶化した。40,000ｘｇにて１時間遠心分離した後、上清
を集め、0.1M 塩化ナトリウム及び0.1% CHAPSを含む50m
M トリス酢酸緩衝液(pH7.2)であらかじめ平衡化したヒ
ドロキシアパタイトカラムに添加した。0.1M 塩化ナト
リウム及び0.1% CHAPSを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液
(pH7.2)でカラムを洗浄した後、0.1Mから0.5Mのリン酸
カリウム濃度勾配により吸着したタンパク質を溶出し
た。Ｐ３様受容体活性の測定はトリチウムラベルされた
ＮＥＣＡを用い、Biochem. Biophys. Res. Commun.,21
9, 469-474(1996)に記されている方法によって測定し
た。Ｐ３様受容体を含む画分を集め、限外濾過器を用い
て2.3倍に濃縮して以下の実験に用いた。最終的に得ら
れた精製標品は約2.7pmol/mg蛋白質のＰ３様受容体活性
を有する。

【００２２】試験例２本発明化合物による結合阻害実験本発明の化合物のプリン受容体結合阻害実験を以下の方
法にて行った。Ｐ３様受容体のＮＥＣＡ結合活性に対する化合物の
阻害効果はBiochem. Biophys. Res. Commun., 219, 469
-474 (1996)に記されている方法に準じて調べた。0.1%
CHAPS、4mM塩化マグネシウム、種々の濃度(1nM-100μM)
の試験化合物（一般式（４ａ）で示される本発明の化合
物、以下同様）及び32nMのトリチウムラベルされたＮＥ
ＣＡを含む50mM トリス酢酸緩衝液(pH7.2)中に精製した
Ｐ３様受容体0.12pmolを加え、０℃で１５時間インキュ
ベートした。反応液を0.3%ポリエチレンイミンで前処理
したフィルター(Whatman GF/B)で濾過することにより反
応を終了した。このフィルターを50mM トリス酢酸緩衝
液(pH7.2)で３回洗浄した後、バイアルに移し、５ｍｌ
のアクアゾル(Aquasol)を加えて液体シンチレーション
カウンターでトリチウムのカウントを測定した。Ｋｉ値
は、コンピュータープログラムのGraph Pad Prismを用
いて計算した。試験化合物のＰ３様受容体のＮＥＣＡ結
合活性に対するＫｉは１９ｎＭと求められた。

【００２３】Ａ１及びＡ２ａアデノシン受容体のリ
ガンド結合活性測定には、J. Biol. Chem., 264, 16545
-16551(1989)に記されている方法で調製したラット脳の
膜画分を用いた。Ａ１アデノシン受容体の活性測定には
0.18mg、Ａ２ａアデノシン受容体の活性測定には0.55mg
の膜画分を用いた。Ａ１アデノシン受容体のリガンドに
は2.0nMのトリチウムラベルされたＤＰＣＰＸ(8-[4-
[[[2-aminoethyl)amino]carbonyl]methyl]phenyl]-1,3-
diprocyclopentyltheophylline)、Ａ２ａアデノシン受
容体には5.9nMのトリチウムラベルされたＣＧＳ２１６
８０を用い、上記と同様の方法で結合活性を測定した。
試験化合物は0.1μM以下の濃度でＡ１アデノシン受容体
のＤＰＣＰＸ結合活性を阻害せず(Ｋｉ； 12μM)、Ａ２
ａアデノシン受容体のＣＧＳ２１６８０結合活性は100
μMでも約40％しか阻害しなかった。

【００２４】Ａ３アデノシン受容体のリガンド結合
活性測定にはＲＢＬ−２Ｈ３細胞から調製した膜画分0.
27mgを用いた。0.1% CHAPS、4mM 塩化マグネシウム、２
Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼ及び種々の濃度(10nM-
100μM)の試験化合物を含む50mM トリス酢酸緩衝液(pH
7.2)に100nM ＤＰＣＰＸと100μM ＡｐｐＮＨｐ(adenyl
ylimidodiphosphate)を加えた反応液（Ａ）と、10nM Ｉ
Ｂ−ＭＥＣＡ(N⁶-(3-iodobenzyl)-5'-N-methylcarbamol
yladenosine)、100nM ＤＰＣＰＸ及び100μM ＡｐｐＮ
Ｈｐを加えた反応液（Ｂ）それぞれに０．１５ｎＭの
¹²⁵IラベルされたＡＢ−ＭＥＣＡ(N⁶-(4-amimo-3-iodob
enzyl)adenosine-5'-N-methyluronamide)を加えて２５
℃で２時間インキュベートした。それ以外の条件は上記
の方法に準じた。Ａ３アデノシン受容体に由来するＡＢ
−ＭＥＣＡ結合量は反応液Ａと反応液Ｂそれぞれから得
られた結合活性の差から計算した。試験化合物はいずれ
の濃度でも、Ａ３アデノシン受容体のＡＢ−ＭＥＣＡ結
合活性を全く阻害しなかった。

【００２５】Ａ２ｂアデノシン受容体の活性測定に
は、ＶＡ−１３細胞を用い、試験化合物を加えた時の細
胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を調べた。２４ウェルプレート
中で100,000細胞／ウェルの濃度で２日間培養し、細胞
を118mM 塩化ナトリウム、4.7mM塩化カリウム、1.2mM
塩化マグネシウム、1.5mM 塩化カルシウム、1.2mM リン
酸二水素カリウム、0.5mM ＥＤＴＡ及び10mM グルコー
スを含む20mM HEPES緩衝液(pH7.4)で洗浄した。つぎに
0.1mM Ｒｏ−２０−１７２４と２ユニット／ｍｌアデノ
シンデアミナーゼを含む同緩衝液を加えて３７℃で１０
分間プレインキュベートした後、種々の濃度(0-100μM)
の試験化合物を含む同緩衝液を加えて３７℃で１０分間
インキュベートした。緩衝液を除去し、0.1M 塩酸を添
加して反応を停止させた。１Ｍ水酸化ナトリウムで中和
させた後、氷冷した65%(v/v)エタノールで２回抽出し、
乾固させてからエンザイムイムノアッセイによりｃＡＭ
Ｐを定量した。試験化合物はいずれの濃度でもＡ２ｂア
デノシン受容体によるｃＡＭＰ濃度の上昇を誘起しなか
った。また、Ａ２ｂアデノシン受容体アゴニスト（ＮＥ
ＣＡ）によるｃＡＭＰ濃度上昇を阻害しなかった。以上の結果から、本発明の化合物はＰ３様受容体と
特異的に結合し得る物質であることが明らかとなった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者斉藤佳子東京都府中市武蔵台３−13−４プラムハウス203

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式で示されるアデノシン誘導
体。【化１】（式中、Ｒ¹及びＲ²は水酸基又は低級アルキニル基を示
す。但し、Ｒ¹及びＲ²の一方が低級アルキニル基のと
き、他方は水酸基であり；またＲ¹及びＲ²の一方が水酸
基のとき、他方は低級アルキニル基である）
【請求項２】請求項１記載の化合物を用いるプリン
受容体３様物質のスクリーニング方法。