JPH02502424A - 抗原特異的ｔセルラインの調製法並びに治療のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗原特異的Ｔセルラインの調製法並びに治療のためのその使用関連出願 この出願は、１９８６年１１月２４日に出願された米国出願番号９３３．７８９ 号の一部継続出願である。

発明の背景 ここに記載の発明は、ナショナル・インスティチニート・オブ・ヘルスの認可番 号１−Ｐｏｌ−ＨＤ１９９３７−０１ＡＩの補助を哺乳動物の免疫応答反応に関 係している物質およびその反応機序は完全に理解されている訳ではないが、免疫 応答を取り扱う技術は、治療上、大きい可能性を持っている。このことは、正常 な免疫応答の抑制に至る様な病態であって、従来の薬物療法による治療では容易 に治癒しない病態の治療に於いて特に明らかである。この様な病態には、ある種 のウィルス感染、および抗癌剤、自己免疫疾患の治療薬、および臓器移植後の拒 絶反応を阻止するために用いられる薬物などの投与によって惹起される免疫抑制 が含まれる。

免疫刺激に応答する能力は、基本的にはリンパ系の細胞にある。

胚の時期に幹細胞が発達し、それがい（つかの異なった道筋に沿って分化する。

例えば、幹細胞はリンパ系幹細胞となり、それが分化して少なくとも２種の別々 のリンパ細胞群を形成する。１つの群は１９２８球と呼ばれ、細胞−仲介性の免 疫におけるエフェクター物質であり、他方（３９７８球）は抗体−コントロール 型の免疫、即ち、体液性免疫の１次エフェクターである。Ｂ細胞が抗体産生を行 うための刺激は、抗原（Ａｇ）がＢ細胞の表面にある免疫グロブリンに付着する ことである。従って、Ｂ細胞の数は、宿主に於ける特異抗体（Ａｂ）の生産量に 太き（影響している。時には、そしてまた抗原によっては、Ｂ細胞の有効な抗体 産生にはＴ細胞の共働作用が必要である。

１９２８球群の中で、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、細菌、ウィルス、真菌および その他の抗原に対する１次免疫認識および宿主の防御反応に関与する抗原−特異 的細胞である。細胞毒性Ｔ細胞（Ｔｃ）は、病原体に感染した標的細胞を死滅さ せることができる抗原−特異的エフェクター細胞である。

ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は抗原特異的であるが、遊離の抗原を認識することはで きない。この認識、およびそれに続＜Ｔｈ細胞の活性化と増殖が起こるためには 、抗原が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス■産物、または“白血球 抗原”と共に、Ｔｈ細胞上のレセプターまたはレセプター複合体に提示されなけ ればならない。即ち、一定の数のＴｈ細胞がオートロガス（自己由来）であるか 、または宿主のＭＨＣによって発現される１またはそれ以上の制限的白血球抗原 （ＬＡ）に対する特異性を共有するものでなければならないという意味で、Ｔｈ 細胞の病原性抗原認識はＭＨＣクラスＤ“制限”である。

同様に、Ｔｃ細胞は、クラスＩ　　ＭＨＣＬＡとの協同作用により抗原を認識す る。

Ｔｈ細胞の場合、この機能は制限された数の“抗原−提示細胞（抗原提供細胞） ”（ＡＰＣ）と呼ばれる特殊な細胞によって行われる。今日では、ヘルパーＴ細 胞（Ｔｈ）が、マクロファージの表面で発現されたクラスＩ［ＭＨＣＬＡと連結 した、処理された可溶性抗原を認識することについては十分に確立されている。

最近、他の細胞型、例えば静止細胞および活性化Ｂ細胞、樹枝細胞、表皮のラン ゲルハンス細胞、およびヒト皮膚フィブロプラスト（ヒト皮膚線維芽細胞）など もＴ細胞に抗原を提示することが知られている。ヒトリンパ芽球様Ｂ細胞（ＬＣ Ｌ）を形質転換したエプスタイン−バーウィルスは、異的Ｔ細胞に提示すること がわかっている。もし、あるＴｈ細胞がＭＨＣ−クラスｎ　　ＬＡ−抗原複合体 の認識を可能ならしめるレセプターまたはレセプター複合体を持っていたら、そ れは活性化され、増殖し、インターロイキン２（Ｉ　Ｌ−２）の様なリンホカイ ンを産生ずる。リンホカインは、抗微生物作用および腫瘍死滅作用を発揮し得る Ｔｃ細胞やマクロファージを含む幾種類かの“キラー細胞”の増殖をうながす。

刺激がなくなった後、増加したＴｈ細胞の生き残りは記憶細胞として体内にとど まり、同じ抗原が提示された時には急速に増殖することができる。急性ウィルス 感染からの回復に於けるＴ細胞の重要性は、ある種のウィルス、特Ｊこミクロウ ィルス（インフルエンザ）、ポックスウィルス（奇肢症およびワタシェア症）、 アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス）について、よく解明されてい る。

宿主の安寧にとって免疫系の防御機構が重要であることはよく知られているにも かかられず、これらの物質の治療学的可能性は認識されていない。予備的な研究 で、ローゼンバークらＥＳ　、　Ａ　、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　　ｅｔ　　ａｌ 、、Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｊ、Ｍｅｄ、＋３　１　３．１　４８５＋（ １９８５）コは、あらかじめＩＬ−２と一緒にインキュベートしておいたオート ロガス末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を、さらに追加のＩ　Ｌ−２と共に進行か んの患者に全身投与すると、治療された２５人の患者すべてにがんの退行が認め られたことを報告している。ローゼンバーグらはインキユベートしたＰＢＬを“ リンホカイン−活性化キラー（ＬＡＫ）細胞”と名付け、それらは天然のキラー 細胞や細胞毒性Ｔ細胞とは別個の細胞溶解系に属すると報告した。しかし、この 治療法を用いたその後の研究では、この初期に得られた結果への見込みを確認で きなかった。

この“獲得免疫療法”の試みが長期的にどのような結果に終わったとしても、ロ ーゼンバーグらは、“この方法をヒトがんの治療に適用する場合における最大の 困難は、全身治療に使用する上で充分な数の、抗腫瘍活性を有するオートロガス ヒト細胞を産生ずることができないという点にある”と述べている。このことは 感染症、がん、臓器移植または抗新生物薬等によって免疫が抑制されている患者 において特に問題である。

同様に、ホモジーニアス（均質）なＴｃまたはＴｈ細胞群を単離して維持し、そ れらを抗原特異性およびＭＨＣ制限に関して特性化する試みが多くなされた。こ れらの試みには、通常、血清反応陽性のヒトまたは不ズミ宿主から得た単核細胞 を、細菌またはウィルス製剤と非増殖性のＡＰＣ類、たとえば放射線処理したオ ートロガス単核細胞（ＭＮＣ）との混合物で刺激することが含まれる。ポリクロ ーナル（多クローン性）のＴｈ細胞またＴｃ細胞群を限界希釈法でクローンして ホモジーニアス集団を得、さらに増殖させて様々な方法で特性化する。ローゼン バーグらの記載によると、クローン化ＬＡＫ細胞の場合、Ｔリンパ細胞のクロー ン化における主な障害の１つは、オートロガスまたはアロジェネイック（同種性 （ａｌ　Ｉｏｇｅｎｅｉｃ））なＭＨＣＬＡ−適合ＭＮＣの入手、特に臨床対象 由来のものの入手に制限があるという点である。

この問題を解決するために、オートロガスＭＮＣ以外のＡＰＣ類がＡＰＣとして 用いられてきた。例えば、イセクツら［Ｔ、Ｉ　５ｓｅｋｕｔｚ、　　Ｊ、　Ｔ ｍｍｕｎｏｌ、、　　１λ９，１４４６（１９８２）］は］オートロガスエプス タインーバーウィルスＥＢＶ）−形質転換ＬＣＬセルライン（ライン）が、破傷 風毒素反応性のポリクローナルＴ細胞またはＴ細胞クローンに破傷風毒素関連抗 原を提示し得ることを初めて開示した。

カブラン博士ら［Ｄ、Ｒ，Ｋａｐｌａｎ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ、　　８８＋１９３（１９８４）ＥはＡ型インフルエンザ免疫ドナー（供 給体）から得た末梢血ＭＮＣの増殖による３種のＴｃｔｉｍｌ１ｍクローンの生 産について報告している。それらクローンの１つは照射した、ウィルス感染オー トロガスＭＮＣの存在下または照射した、感染エプスタイン−バーウィルス導入 （形質転換した）アロジェネイックリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）の存在下で増殖 した。

エルフェリンクらｌ：Ｂ、Ｇ、Ｅｌｆｅｒｉｎｋ、　　５ｃａｎｄ　Ｊ、　Ｉｔ ｒｍｕｎｏｌ、、　　２２．５８５（１９８５）］はオートロガスな、および同 種性のエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）−形質転換ＬＣＬセルラインがＭ 。

化Ｔセルラインに提供し得ることを示した。その後、彼等は、Ｍ。

レプレ抗原のみを認識し得るＴ細胞クローンの単離についても報告した。このク ローン化ではＡＰＣ類としてオートロガスＥＢＶ−４５質転換ＬＣＬを用いてい る。ＥＢＶ−形質転換ＬＣＬ使用の利点は、それが連続的かつ非制限的にＡＰＣ の供給源になり得る点にある［ハーネンら（Ｊ、Ｂ、Ａ、Ｇ、Ｈａａｎｅｎ、　 　５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、＋　　２：ｌ　　１０１（１９８６））コ 。

ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）は大きい、種−特異的ヘルペスウィルス （ＤＮＡ　１．　５ｘ　１０”Ｄａ）であって、このグループの他のものと共通 の潜在性および再活性化に関する性質を有する。ＨＣＭＶの基本的な潜在部位お よびその再活性化に関連した分子的事象は不確実である。ＨｃＭｖｇ染および再 活性化は無症状であるかもしれないが、免疫抑制患者の場合にはかなりの罹病率 および死亡率を伴う。例えば、ＣＭＶは骨髄移植患者での日和見感染の最大の病 因である。このような人々の８０％以上が現在の治療法によってもＨＣＭＶ肺炎 により死亡している。

モノクローナル抗体療法は予防治療として役立つかもしれないが重篤なＨＣＭＶ 感染症にかかった免疫抑制患者の生存はＨＣＭ　Ｖ特異的−細胞毒性Ｔ細胞の存 在にかかっていることが示唆された。キナンら［Ｑｕｉｎｎａｎ、　　Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｄ、、　　３０ユ、　　７（１９ｇ２ルは、これらの 患者でのＨＣＭＶ特異的−細胞毒性Ｔ細胞応答には臨床上の回復とウィルス排出 の停止が伴うが、細胞毒性応答のない活性な感染患者は一様に死亡することを示 唆した。

ゲルッら［ＲｌＣ，Ｇｅｈｒｚ、Ｌａｎｃｅｔ、２，８４４（１９７７）コは先 天性のＨＣＭＶ感染幼児は、ヘルパーＴ細胞の増殖における抗原−特異的欠損を 有し、ＨＣＭＶ特異抗体の存在先；もかかわらず数箇月から数年間続く反復性（ レプリケーティング）のウィルス感染症を伴うことを報告した。ＨＣＭＶ−特異 的リンパ球増殖性応答を獲得するとウィルス排出が減少するようである。このよ うに、ＨＣＭＶ　−特異的ヘルパーＴ細胞は、免疫受容性の宿主での該ウィルス に対する免疫欠損に対し、重要な役割を果たすと思われる。

再活性化ＨＣＭＶ感染症患者ではＨＣＭ　Ｖ抗原に対する抗体は防御的でなく、 またはそれは適当なＴ細胞応答と連結してのみ有用である。末梢血中リンパ細胞 （Ｐ　Ｂ　Ｌ）も、たとえそれが充分な量得られたとしても、治療剤としては有 用でないようである。特定の抗原と反応性のヘルパーＴ細胞または細胞毒性Ｔ細 胞の数は極めて少なく、従って、治療目的に十分な数を得るためには抗原−特異 的Ｔ細胞のインビトロにおける選択的な拡張（増加）が必要である。

しかも、同種性ＰＢＬを治療的に投与するとＴ細胞の“外来”白血球抗原認識を 活性化し、混合白血球培養反応を引き起こす可能性がある。この混合白血球培養 反応は望ましくない非特異的免疫応答の活性化、または所望の抗原−特異的免疫 応答を阻害し得るサプレッサー細胞の誘導をもたらし得る。

オートロガスまたは同種性抗原−特異的Ｔセルラインは混合白血球培養反応に関 連する付随的な副作用なしに所望の治療活性を発現すると思われる。ポリシービ ッツ［Ｌ、　Ｋ、Ｂｏｒｙｓｉｅｔｉｃｚ、　　Ｅｕｒ、　Ｊ　。

Ｉ　ｍ＋ｎｕｎｏｌｏｇｙ、上３．８０４（１９８３）１らは血清陽性、巴者か ら得たＭＮＣをＩ　Ｌ−２の存在下で拡張増加（エキスパンション）させること による短期間のポリクローナルＴｈセルラインの生成について報告している。Ｍ ＮＣをオートロガスＨＣＭＶ−感染フイブロブラスト（線維芽細胞）上でコカル チャーするとポリクローナルＴｃ細胞が生成し、それはＨＣＭＶ−感染細胞を溶 解した。

しかしながら、ＨＣＭＶ等のウィルスや他の病原体と関連した抗原に特異的なＴ ｈ細胞およびＴｃ細胞を多数、生成させて維持するための改良法が要求されてい る。さらに、生物学的活性が既知である抗原−特異的Ｔリンパ細胞を哺乳類対象 に投与することからなる免疫療法もまた求められている。

本発明はＨＣＭＶ抗原のようなウィルス性抗原に特異的なホモージニアスヘルパ ーＴ細胞群（Ｔｈ）の効果的な製造を目的とするものである。本発明方法によれ ば最少量の抗原およびリンホカイン支持体を用い、該クローンの抗原特異性およ び機能的活性の両者を維持しながら、クローン化Ｔｈ細胞を生産する有効な方法 の基礎が提供されると考えられる。このような観点から、本発明を最も広範囲に みた場合、本発明方法は （ａ）哺乳類ドナー（供与体）の血液から単核細胞（ＭＮＣ）群を単離し、ここ に、ＭＮＣ群はウィルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞と、オートロガスで非増 殖性の抗原−提示細胞を含有する、（ｂ）単離した該ＭＮＣ群と、その抗原に特 異的なヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに十分な量のウィルス性抗原とを混合 し、（Ｃ）該ヘルパーＴ細胞を、非増殖性のＭＮＣが生存性を消失するのに充分 な期間、増殖させ、そして （ｄ）抗原−特異的ヘルパーＴ細胞を（ｉ）オートロガスＭＮＣ、アロジェネイ ックＭＭＣまたはその混合物；および（ｉｉ）オートロガスリンパ芽球様細胞（ ＬＣＬ）、アロジェネイノクＬＣＬまたはその混合物、の混合物からなる非増殖 性の抗原提供（提示）細胞の一定量；およびクローン化抗原−特異的ヘルパーＴ 細胞を増殖させてホモジーニアスな集団を得るのに有効な量の該ウィルス性抗原 の存在下、ただし、該ＬＣＬはＭＮＣによるヘルパーＴ細胞の増殖速度増大を越 える増大を引き起こすのに有効な量存在するものとする、においてクローン増加 させることからなる。

１−２週間を要するであろう選択的増殖工程（ｅ）の期間中に、工程（ｄ）の前 に、さらにヘルパーＴ細胞を増殖させ、生存可能なウィルス抗原−特異的Ｔｈ細 胞群の生産を促進するために追加量の該ウィルス抗原とオートロガスな非増殖性 ＡＰＣを加えると有効であろう。工程（ｄ）においては、抗原特異的モノクロー ナルＴｈ細胞を限界希釈法、または顕微操作またはフローサイトメトリーによる 単−細胞単離法によって導くことができる。

本発明には抗原−特異的Ｔｈ細胞の増殖が包含されており、従って、本発明はま た、ウィルス抗原に特異的なホモジーニアスヘルパーＴ細胞群を増殖させる方法 であって、該同質ヘルパーＴ細胞群と、ヘルパーＴ細胞群の増殖に有効な量の抗 原および非−増殖性抗原提示細胞（ＡＰＣ）混合物とを混合することかみなる方 法を提供するものである。ここに該ＡＰＣ混合物は（ｉ）オートロガスまたはア ロジェネイックリンバ芽球様細胞（ＬＣＬ）と（ｉｉ）オートロガスまたはアロ 　　・ジェネイソク単核細胞（ＭＮＣ）からなり、ここに、ＬＣＬはＭＮＣによ るヘルパーＴ細胞の増殖速度促進以上に促進するのに有効な量、存在するものと する。好ましくは、ＬＣＬはウィルスによる形質転換、ハイブリドーマ形成法等 によって生産され得る連続的なリンパ芽球様セルラインから導く。ＡＰＣはＸ線 照射、マイトマイシンＣ等の化学物質処理などの当業者既知の方法で非−増殖性 にする。

非−増殖性のＭＮＣおよびＬＣＬはいずれも、それがＴｈ細胞と同じ宿主から導 かれているか、１またはそれ以上のクラス■制限抗原（略語：“ＭＨＣＬＡ−適 合″）を共有する同種のＭＮＣまたはＬＣしてある場合には、Ｔｈ細胞の増殖を 引き起こすことが分かった。

驚くべきことには、ＬＣＬとＭＮＣとの混合物は共働的に抗原をＴｂ細胞に提供 し、このようにして得られる増殖速度は、いずれかの型のＡＰＣを等量、単独使 用した場合にもたらされる増殖速度より大きいことが分かった。

例えば、この効果はＡＰＣとして、ＥＢＶ−形質転換オートロガスＬＣＬおよび オートロガスＭＮＣの混合物を少なくとも１：１０の比率で用いた場合に、ＨＣ ＭＶ抗原のようなウィルス性抗原の例で観察された。Ｔｈ細胞と加えられるＬＣ Ｌとの比率は約１：１−３であって、Ｔｈ細胞のＭＮＣに対する割合は約１：３ −１０であることが好ましい。

しかも、実質的なＴｂクローン拡張の増大を得るには限られた密度のＬＣＬが必 要であるにすぎない。本発明方法のこの特徴は、限られた数のＭＮＣを用いて、 比較的短期間にヒト抗原特異的Ｔｈクローンを多量に増加し得るので、実用性と いう観点から重要である。

例えば、本発明方法によれば、ＡＰＣとして１−２Ｘ１０’ＭＮＣおよび１ｘｌ Ｑ＠ＬＣＬを用い、ＨＣＭＶ−特異的Ｔｈクローンを２週間で１−２Ｘ１０＠細 胞から１０’細胞にまで拡張することができる。

Ｆ”）の存在下で本発明方法の増殖工程（ｃ）および／または（ｄ）を行うこと が極めて好ましいことが分かった。

さらに本発明は初期増殖段階（上記工程ａ−ｃ）またはその後の拡張（増加）段 階（上記の工程（ｄ））を該ウィルス抗原に特異的な一定量のモノクローナル抗 体の存在下で行うことにより、ウィルス抗原−特異的Ｔｈ細胞の増殖速度を増大 することに関する。本発明のこの側面に関する１つの実施態様では、ＨＣＭＶ血 清−陽性哺乳類ドナー（供給体）の血液から単離したＭＮＣと、構造タンパク質 等のＨＣＭＶ遺伝子産物上に存在する抗原に特異的なモノクローナル抗体とを混 合することにより、ＨＣＭＶウィルス抗原に特異的なＴｈ細胞の増殖速度を増大 した。モノクローナル抗体を、（ａ）増殖刺激有効量の該抗原と、（ｂＸｉ　） 非増殖性ＭＮＣ１（ｉｉ）連続的なＬＣＬから誘導された非増殖性ＬＣＬ、およ び（ｉｉｉ　）それらの混合物、例えば、協同的相互作用によりＴｈ細胞の増殖 速度をさらに増大し得る混合物、からなる群から選択されるオートロガス（自己 由来）ＡＰＣの一定量と一緒に用いる。オートロガスな非増殖性抗原提供細胞は Ｘ−照射オートロガスＭＮＣ，Ｘ−照射エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ） −形質転換リンパ芽球様セルライン（ＬＣＬ）およびその混合物からなる群から 選択されることが好ましい。これらは本発明方法の工程（ｂ）において、モノク ローナル抗体および／またはＩ　Ｌ−２を用いて増殖速度を増大するか否かにか かわらず、ＡＰＣとして用いるのに好ましい。

本発明方法はまた、ＨＣＭＶ抗原に特異的なホモジーニアスな細胞毒性細胞群（ Ｔｅ）を得る方法を提供するものである。この側面に関する本発明の態様は、 （ａ’）哺乳類ドナー、好ましくはヒトの血液から単核細胞（ＭＮＣ）群を単離 し、ここに、ＭＮＣ群は該ウィルス抗原に特異的なＴｃ細胞を含有する、 （ｂｌ）単離した該ＭＮＣ群を、それぞれ該抗原に特異的なＴｃ細胞を増殖させ るのに有効な量の、（ｉ）オートロガスで非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、 例えば放射されたＭＮＣ，（ｉｉ）該ＨＣＭＶ抗原、および（ｉｉｉ）インター ロイキン−２（Ｉ　Ｌ−２）と混合し、（ｃｌ）該Ｔｃ細胞を非増殖性のＭＮＣ が生存性を消失するのに有効な期間、増殖させ、そして （ｄｌ）該抗原−特異的Ｔｃ細胞を、それぞれ該クローン化Ｔｃ細胞の増殖に有 効な量の（ｉ）非増殖性のオートロガスな抗原提示細胞、非増殖性のアロジェネ イック抗原提示細胞またはその混合物、（ｉｉ）ＩＬ−２、および（ｉｉｉ）該 ＨＣＭＶ抗原の存在下、クローン増殖（拡張）させて該ホモジーニアス細胞群を 得ることからなる工程を含む。

工程（ｂ’）、（ｃｌ）または（ｄつは該Ｔｃ細胞の増殖速度を増加するよう作 用するＨＣＭＶ抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在下で行うことが好まし い。

抗原−特異的Ｔヘルパーセルラインに関して述べたように、特定のウィルス抗原 に反応性のポリクローナルＴｃラインは所望の抗原を発現している標的細胞に対 して細胞毒性を示すＴｃ芽細胞を連続的に刺激することによって増殖され得る。

単一の子孫Ｔ細胞から導かれたウィルス−特異的Ｔｃクローンのホモジーニアス な集団は工程（ｄｌ）の後、限界希釈法または顕微操作あるいはフローサイトメ トリーによる単一細胞単離によって得ることができる。

このＴｃ細胞増殖法の他の好ましい態様には、（１）細胞−関連ウィルス抗原と して全ＨＣＭＶウィルス抗原を使用するか、またはＨＣＭＶ感染オートロガスま たはアロジエネイックフイブロブラスト、例えばＨＣＭＶ即時型初期タンパ声質 を使用する、（２）工程（Ｃ１）の間に該Ｔｃ細胞の増殖をもたらすためにウィ ルス抗原、■Ｌ−２およびオートロガスで非−増殖性ＡＰＣを追加する、そして （３）工程（ｂｌ）または（ｄｌ）の間にさらに連続的なオートロガスＭＮＣラ インから導かれた非−増殖性ＭＮＣをも含有する抗原提供細胞を、オートロガス な単核抗原−提示細胞によるＴｃ細胞増殖速度の増大以上に増大させるに有効な 量、用いることを含む。この連続的でオートロガスなＭＮＣラインはウィルスで 形質転換されたＬＣＬ即ちＥＢＶで形質転換されたＬＣＬを含むことが好ましい 。

本発明はまた、ウィルス抗原、例えばＨＣＭＶ抗原などの抗原に特異的なホモジ ーニアスＴｃ細胞群を増殖させる方法に関するものである。本発明方法は、該ホ モジージアス細胞毒性Ｔ細胞群を、それぞれ該Ｔｃ細胞群を増殖させるのに有効 な量の該抗原、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）混 合物と混合することを含む。ここに、該ＡＰＣ混合物はアロジェネイックウイル スー形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）およびアロジェネイック単核細胞（Ｍ ＮＣ）を含有する。本発明方法はまた、該Ｔｃ細胞群と該細胞群の増殖速度を増 大するよう作用する、該抗原のモノクローナル抗体の一定量とを混合することを も含む。

本明細書において、ウィルスまたは感染細胞など、病理学的標的に関して、“抗 原”という語句はポリペプチド、ポリペプチド複合体、グリコプロティン、核酸 等、免疫応答を惹起する物質を指す。病理学的標的抗原はウィルスのエンベロー プグリフプロティンのような病理学的標的そのものの一部であってもよく、また は新生物組織またはウィルス感染細胞等の病んだ組織が発現する抗原であっても よい。“抗原−特異的”Ｔリンパ細胞は抗原提供（提示）細胞（ＡＰＣ）により 、−個の抗原が、抗原提供細胞が産生ずる白血球抗原（Ｌ　Ａ）と−緒に提供さ れると、該抗原の存在下で活性化される。抗原−特異的Ｔｈ細胞は、それが特異 性を有する抗原が、Ｔｈ細胞が特異性を有する白血球抗原を産生ずるＡＰＣによ ってＴｈ細胞に提供されると、その抗原の存在下、適当な培地中で増殖するであ ろう。上記したように、ヒトヘルパーＴ細胞の場合、特異的な白血球抗原はヒト ＭＨＣクラス■抗原であり、ヒト細胞毒性Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩ抗原に特異的 である。

Ｃ，ＨＣＭＶ抗原−特異的Ｔセルライン本発明の好ましい態様は、ホモジーニア スＴｃおよびＴ　ｈ細胞Ｒ１およびその製造方法に関する。ここに、ある細胞群 はＨＣＭＶ抗原に特異的である。

Ｔ細胞またはＴ細胞クローンが抗原−特異的であるという場合、抗原を含有する 組成物は特定されるかもしれないが、抗原性組成物のエピトープ、または特定の 抗原性部位は必ずしも明らかでない。

例えば、３個の異なるホモジーニアスなＴヘルパーリンパ細胞群が一個の特定の ＨＣＭＶ構造タンパク質またはグリコプロティンに特異的であることもある。こ れらはいずれも同一の抗原に応答し、従って同じ抗原特異性を有するが、分子下 （サブモレキニラー）レベルで　・は別々の抗原領域またはエピトープと反応す るという意味で異なる特異性を有するかもしれない。この文脈から、異なるＨＣ ＭＶ−特異的Ｔリンパ細胞は、それらが同じＨＣＭＶ関連抗原の同じエピトープ を認識する限り、同一の分子下−特異性を有するものである。

しかしながら、抗原が、ＡＰＣが様々な場合に提示されるように複数のエピトー プを有するとすれば、それらは、同一の抗原に特異的であり得る。

例えば、ＨＣＭＶのＤＮＡゲノムは後の初期遺伝子の発現に必要な調節タンパク 質をコードする即時−初期遺伝子の制限的転写で開始される、一連の順番で転写 される。主な即時−初期遺伝子（Ｉ−Ｅｌ）は感染細胞の細胞表面で、感染後６ −２４時間後に発現される６８＋Ｉ）の調節タンパク質をコードしている。ＨＣ ＭＶ−特異的細胞毒性Ｔ細胞はその免疫監視における役割の一つとして、潜在的 ＨＣＭＶの再活性化を防ぐために、この即時−初期タンパク質を優先的に認識す ると考えられている。

ＤＮＡ合成の開始に先立って初期遺伝子が転写される。初期遺伝子の産物にはＤ ＮＡの転写に必要なウィルス−特異的ポリメラーゼおよびキナーゼが含まれる。

これらの酵素は免疫応答には重要な役割を演じていないと思われる。

しかしながら、後期ＨＣＭＶ遺伝子は様々な免疫原性構造タンパク質およびグリ コプロティンをコードしている。これらには、ウィルスの核カプシドと外部エン ベロープとを結合する、ジスルフィド−架橋エンベロープグリコベブチド複合体 、非グリコシリル化エンベロープタンパク質、外被グリコプロティン：およびウ ィルスの内部カプシド構造を形成するマトリクスタンパク質が含まれる。

米国特許第９３３，７８９号（１９８６年１１月２４日出願）には多くの免疫原 性構造グリコペプチド複合体およびＨＣＭＶエンベロープフラクションから還元 されたグリコペプチドの精製および特性化が、それに特異的なモノクローナル抗 体（ＭｏＡｂ）と共に、完全に開示されている。この特許出願に記載されている 主なグリコペプチドおよびグリコペプチド複合体、並びにＭｏＡｂを以下の表１ に示す。

第１表 ＭｏＡｂによって免疫沈澱されたＨＣＭＶ表面グリコペプチド複合体およびグリ コペプチド＊これらの物質を精製全ウィルス製品（″全ＨＣＭＶ抗原”と命名、 以下の実施例１参照）から得るために用いた洗浄剤抽出、ＨＰＬＣ１還元、免疫 沈降および電気泳動からなる方法はすべてカリらによって報告されたものである ［Ｂ、Ｋａｒｉ、　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＋　　６０゜３４５（１９８６）コ 。

＋これらのＭｏＡｂを産生ずるハイブリドーマはインビトロ・インターナショナ ル、Ｌｉｎｔｈｉｃｕ＋ｍ　　ＭＤに、下記アクセスコードの下で寄託されてい る：Ｈｂ２−２９−９８７（”９Ｂ７”）＝ＩＶＩ−１０１１７；Ｈｂ２−１５ −９Ｅ１０（“９Ｅ１０”）＝ＩＶＩ−１０１１８；Ｈｂｌ−４８−４１Ｃ２（ “４１Ｃ２）＝ＩＶＩ−１０１１９゜ ÷＋ｇｐＡ、＊＊ｇｐＢ、＊＊＊ｇｐＣ表１記載の免疫原性グリコペプチド複表 体記載びグリコペプチドはＨＣＭＶ血清陽性ドナーから得た血液から導かれたＴ ｂ細胞の増殖を選択的に刺激するのに有用である。同様に、既知の結合特異性を 有するモノクローナル抗体、例えば９Ｅ１０．４１Ｃ２および９Ｂ７等はウィル ス抗原の精製に有用である。これらのモノクローナル抗体を用いてＴｈ細胞クロ ーンの抗原認識を増大し、そのことによって限られたウィルス抗原の存在下での 増加を促進することができる。

Ｉｌ、　Ｔセルラインによる免疫治療 Ｔ細胞の種々のＨＣＭＶタンパク質に対する認識はＴセルラインを用いる適当な 免疫治療コースの計画に重要である。本明細書に例示したＴｈ細胞は主としてＨ ＣＭ　Ｖの構造タンパク質を認識する。

従って、それらは、細胞不含ウィルス（即ち、急性ウィルス血症の場合）の認識 に重要と思われる。マウスおよびヒトでのデータは、ある種の細胞毒性Ｔ細胞が 感染細胞の表面で発現される即時−初期タンパク質を認識することを示している 。これらのタンパク質はウィルス遺伝子が宿主細胞によって発現された後にのみ 、産生されるので、そのようなＴｃ細胞は潜在性ＨＣＭＶの再活性化の阻止に重 要であり、予防および特異的ＨＣＭＶ治療の両方法での投与が示唆好ましいＴセ ルラインはヒトＬＡ産物と一緒になってウィルス抗原を認識する。従って、治療 用Ｔ細胞はオートロガスであるか患者によって発現される制限的特異性の１また はそれ以上が共通するものでなければならない。治療のために単離したＴ細胞を 個体に移すという関係から、アロジェ不イソク細胞は受容体と同じ種のドナー個 体から得られた細胞であって、受容体が発現する抗原の適当なヒト白血球抗原（ ＨＬＡ）クラスに適合する主要組織適合複合体である（略語、“ＬＡ−適合ＭＨ Ｃ”。従って、慢性ＨＣＭＶ疾患のような病理学的感染症患者を治療する際には 、後にＴ細胞を再投与して治療するためにオートロガス抗原−特異的Ｔセルライ ンをインビトロで増殖させることができる。または生命にかかわる急性感染症の 治療のためにＴ細胞クローン製剤を迅速に得ることが重要である場合には増殖さ せた既知のウィルス抗原−特異的および／またはＨＬＡ型の治療用アロジェネイ ックＴ細胞を予備−増殖させ、複数回投与することができる。この方法は免疫抑 制下の患者の治療において特に重要である。

従って、本発明はまた、１９２８球（Ｔ細胞）を用いてＨＣＭＶ感染症など、ウ ィルス感染症に罹患しているヒト患者等、哺乳類を治療する方法を提供するもの である。本発明方法は、該感染症哺乳類を、ウィルス感染に対する増大した免疫 反応を引き出すのに有効な量のホモジーニアスな、クローン増殖したウィルス抗 原−特異的Ｔ細胞群で治療することからなる。ここに、該Ｔ細胞群は（ａ）少な くとも一個の該哺乳類の抗原提供細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に存在する白血球抗 原（Ｌ　Ａ）、および（ｂ）該ウィルス抗原に特異的である。

好ましくは、該クローン増殖したＴ細胞群は基本的にＴｈ細胞とＴｃ細胞からな る。上記のごとく、（ａ）種々の感染段階で発現される抗原を認識する免疫系を 促進し、かつ／または（ｂ）有効な数の全Ｔ細胞群が受容体にとってＭＨＣ−適 合することを保証するために、ホモジーニアスな、クローン−増殖したウィルス 抗原−特異的Ｔ細胞群を複数（または“バンク″）投与することがしばしば好ま しい。

従って、本発明のＴ細胞免疫療法は、Ｔ細胞群を複数投与することからなり、こ こに、Ｔ細胞群は（ａ）該ウィルスの種々の複数抗原、および（ｂ）該哺乳類の ＡＰＣの表面に存在する少なくとも一個のＬＡに特異性を有する。さらに、本発 明方法は、Ｔ細胞群を複数投与することを含んでいてもよく、各投与は（ａ）該 ウィルスの少なくとも一個の抗原、および（ｂ）該哺乳類の単一種の様々なアロ タイプのＡＰＣ表面に存在する複数の異なるＬＡ、ここに少な（とも−個のＬＡ は該哺乳数とＬＡ−制限−適合である、に特異性を有するＴ細胞を含むものであ る。

Ｔ細胞クローンと同様、ポリクローナルラインは有意な治療可能性を有するかも しれない。抗原−特異的ポリクローナルＴセルラインはＴ細胞供与体によって発 現される全ての制限ＭＨＣＬＡ全全部一緒に標的ウィルス抗原を認識することが できるＴｈおよび／またはＴｅ細胞を含有するという点で特に有利である。単一 のプロジェンターＴ細胞から導かれたウィルス−特異的ＴｈおよびＴｃクローン の利点は、それらが既知の抗原−特異性、機能活性、およびＭＨＣＬＡ−制限特 異性を有するホモジーニアスな細胞群であるという点にある。従って、一群の細 胞すべてが同じ機能活性を表すので、それらは最大の治療効果を発揮すると思わ れる。実際的な観点からは、モノクローナルＴ細胞を用いるなるば、独立したＴ 細胞群から導かれた、より大きい“バンク”が必要である。

本発明方法によれば治療有効量のＴｈ細胞および／またはＴｃ細胞を投与するこ とができるので、罹患している吐乳類を同時に異種のリンホカイン類、例えばＩ Ｌ−２（ＴＣＧＦ）で治療することができ′る（必ずしも必要ではないが）。Ｉ 　Ｌ−２の大量投与は患者によっては副作用を伴うので、Ｉ　Ｌ−２を用いずに 免疫応答を促進し得ることはＴ細胞療法の効果の実質的な進歩をもたらすもので ある。

本発明方法によって生産され、上記のＴ細胞“バンク”の製造に用い得る代表的 な集団である抗原−特異的Ｔセルラインの例を以下の表２に示す。

ｂ）ポリクローナル Ｃ）即時−初期タンパク質（６８ｋＤ）、ｄ）　Ｄｒａｆｔ　Ｐａｔｅｎｔ　ａ ｎｄ　Ｔｒａｄｅｍａｒｋ　０ｆｆｉｃｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔ　Ｐｏ１ｉｃｙｆｏ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、　ＢＮＡ　ＰＣＴＪ、　３２ ．　９０（１９８６）に基づいて、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ、　　Ｌｉｔｈｉｃｕ＋ｎ。

ＭＤに寄託 本発明は、主に、ウィルス抗原に対して特異的であるＴｈおよびＴｃ細胞の製造 、およびこれらＴ細胞の均質（ホモジニアス）な個体群によるウィルス感染症の 治療について説明している。しかし、種々の病理学的標的（病理的標本）におけ る抗原に対して特異的であるＴｈおよびＴｃ細胞のホモジニアスな個体群は本発 明方法を用いて製造することができ、これらの個体群は種々の病原体または病理 的標的に対する免疫応答を増大または刺激するのに効果的であると思われる。

広く定義すると、病理的標的とは、哺乳動物宿主の健康と幸福をおびやかす疾病 の原因または結果である、哺乳動物体内に存在するもの（独立体）である。この 標的はウィルス、バクテリア、真菌のように宿主に対して外来性の独立体であっ てもよく、またはウィルス感染細胞、腫瘍細胞のような疾病または病理的症状の 産物であってもよい。本発明の治療の詳細な具体例において、治療の病理的標的 は、しばしば、２次感染であり、この２次感染は、第１の疾病が２次感染に対し て免疫的に応答し得る受容体の能力を弱めるので、意図された受容体にとってさ らに危険である。第１の疾病の多くの態様は、意図された受容体の２次感染に対 する免疫応答を弱めるので、治療は受容体の免疫系の態様を抑制するように作用 する。このような治療としては、放射線治療法、化学療法などが挙げられるが、 これに限定されるものではない。

主に、本発明の治療法では、ＭＨＣＬＡ−適合性である同一種の個体から得たア ロジェネイックな（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）　Ｔ細胞を用いることができる。こ れによって、医師および薬剤師は、患者を処置するためにアロジェネイックなＴ 細胞の予め製剤化された投与形態（投与剤）を単に用いることができる。適合し ないＴ細胞は単に患者を助ける効果がないだけであるので、投与は、適合して患 者を助けるものもあれば、適合せずに患者を助けないものもある、多くの細胞を 含んでいてよい。

このように、アロジェネイックな治療細胞によって発現した１またはそれ以上の ＬＡを有する多くの患者を治療するために単一の投与剤を用いることができる。

さらに、投与剤は、異なるＭＨＣクラス制限を有するＴｃおよびＴｈの両細胞を 含有することができる。明らかに、このような治療法は、−件一件に基づいて投 与剤を調製する必要がない。このことは、スケールの効果を考慮してＴ細胞を大 きい培養培地中で増殖させ得ることを意味している。さらに、細胞は、個別回収 、白血球除去（１ｅｕｋａｐｈｅｒｅｓ　ｉｓ）および培養を必要とせずに、す ぐに入手することができる。

しかしながら、前述の長所にもかかわらず、本発明の新規な免疫療法における最 も有望な特徴は、各投与が抗原特異性Ｔ細胞を含有しているであろうという予想 である。これは、細胞毒性細胞の非特異的増強のみをもたらすローゼンバーグ等 （Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、）（７）方法を越えた実質的な進歩性を意 味する。本発明方法においては、投与形態は、個々の病原体の全てと関連する種 々の抗原に対して特異的であるアロジェネイックなＴｈおよびＴｃ細胞を含有す る投与剤を提供することができる。すなわち、単位投与剤は、個々に培養されて 混合された多くのＴｈおよびＴｃ細胞クローンを含み得る。投与形態は予め選択 された多くのＬＡ制限および予め選択された多くの抗原特異性を有するＴｈおよ びＴｃ細胞を含有することができる。特定の病原体が、種々の抗原において１０ または２０の既知のエビ）　−プを発現することが構造的にまたは他の点で知ら れている場合、投与剤は各々に対して特異性を有する適当なＴ細胞を含有するこ とが中、治療上有効量のオートロガスなまたはアロジェ不イックなＴ細胞を非経 口投与することを含んでいる。このようなプロトコルは、投薬あたり投与される 細胞の数量外は、ローゼンバーグ等［Ｓ、　Ａ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１３．１４８５　（ １９８５）］によって提供されるものであり、臨床医によって決定された因子、 治療に基づく病理学、患者の体型および身体的な状態ならびに他の因子によって 投与される投薬の量は幅広く変わるであろう。しかし、本発明の増強された増殖 性効果によって、ローゼンバーグ等（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔ　ａｌ、）の方法 によって必要とされるものと比べて、実質的に患者からＭＮＣをあまり多く取り 出さず、また実質的に患者にさらに多くのオートロガスな抗原特異性Ｔ細胞を戻 すことができる。

発明の詳細な説明 以下に詳細な実施例を挙げて、本発明をさらに説明する。

寒鬼ガニ １、ヱヱ土五込亙Ω里曙 １０％ウシ胎児血清を加えたダルベツコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｅｃｏ’ 　ｓ　ＭｏｄＨｉｅｄ　ｅａｇｌｅ’　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｎ　 ）において増殖されたヒト１次フィブロブラスト培養物を、１〜５の感染多重度 （Ｍｏｌ）でタウン（Ｔｏ％ｎｅ）菌株ＨＣＭＶによって感染させた。以下に記 載の実験のある種のものについては、感染後３〜４日目に、マーカーとして［３ Ｈ］グルコサミン［５μＣｉ／好、２２Ｃｉ／ｉＭ、アマ−ジャム（Ａｉｅｒｓ ｈａｍ）、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｅｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ］または［３ＩＩＳコ メチオニン［５μｃｉ／ｚＱ、１０９　Ｃｉ／ｘＭ、デュポン／　ＮＥＷ（Ｄｕ Ｐｏｎｔ／ＮＥＮ）、ＢｏｓｔｏｎｓＭＡコを以後の精製中に加えた。

７５００ｘｇで２０分間低速遠心分離して、培地から細胞および細胞残骸（Ｃｅ ｌｌｕｒａ　ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。４８．２００ｘｙで１時間遠心分離し て、上澄み液からウィルスを集めた。トリス（Ｔｒｉｓ）　ＮａＣｒｌｆｌ＆？ １’ｔｉ＆　（５０ｘＭ　トリスヒドロキシメチルアミノ　メタン−ＨＣ１２゜ ｐＨ７，４、および１５０　ｘＭ　Ｎ　ａＣ□中に、ウィルスノヘレットを再懸 濁させ、同一の緩衝液で調製された２０〜６０％スクロース勾配液（シ１糖勾配 液）で積層させた。１３１．３００Ｘ９で１時間、速度沈降を行った。勾配液を 回収し、２８０ｎｍでの光学密度を監視した。４３％スクロースでバンドされた 光学密度の主要ピークを集めた。これらの分画をＴｒｉｓ　ＮａＣＱ緩衝液で希 釈し、１３１，３００×９で２時間遠心分離してウィルスを回収した。この精製 された全ウィルス調製物を「全ＨＣＭＶ抗原（Ｗｈｏｌｅ　ＨＣＭＶ　Ａｎｔｉ ｇｅｎ）Ｊと命名した。

膜成分を可溶化するために、全ＨＣＭＶ抗原調製物を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　 　１００（ＴＸ−１００）を含有するＴＮ緩衝液［Ｔ　ｒｉｓ−Ｎ　ａＣ（１緩 衝液（５０ｘＭ　Ｔｒｉｓ塩酸塩、ｐＨ７，５、ｌＱｚＭ　ＮａＣｐ、２ｉＭフ ェニルメチルスルホニルフルオライド）１２〜４１（ｌに懸濁させた。

室温で６０分間インキュベートした後、この溶液を１２０，０００りで６０分間 、速度帯状（ｒａｔｅ　ｚｏｎａｌ）遠心分離にかけて２０〜６０％スクロース 勾配液で積層した。ＴＸ−１００可溶化物質は勾配液の頂上に残存し、一方、Ｈ ＣＭＶヌクレオカプシドは速度沈降によってバンドされた。また、１．０％ノニ デノト（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０［Ｎ　Ｐ−４０１ジクｖ−ケミカル・カ ンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）コを用いて、タウ ン菌株ＨＣＭＶの洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）抽出物を調製した。この方法で 、１％ＮＰ−４０を含有するＴＮ緩衝液３〜５ｉｆｆに、精製した全ＨＣＭ　Ｖ 抗原１０〜１５１９を懸濁した。洗浄剤−ウィルス懸濁液を室温で１時間撹拌し た。１時間高速遠心分離にかけることによって、抽出したプロティンを不溶性プ ロティンと分離した。これらの方法のいずれかによって得られた抽出物をｒＨｃ ＭＶ洗浄剤抽出物」と命名した。

ＨＣＭＶ特異性ヘルパーＴ細胞は、全ＨＣＭ　Ｖ抗原調製物内に含有されるＨＣ ＭＶプロティンおよびグリコプロティンを認識すると思われるが、ＨＣＭＶＩ％ 異性細胞毒性Ｔ細胞は、主に、感染した細胞の表面に発現された、ＨＣＭＶをコ ードするプロティンを認識する。特に、感染から６〜２４時間以内に細胞膜上に 発現する主要な即時−初期（１−Ｅ　］）プロティンは、ＨＣＭＶ特異性細胞毒 性丁細胞の増殖において重要であると思われる。

したがって、Ｔ細胞ドナーによって認識されるｌまたはそれ以上のクラスＩ白血 球抗原を有するオートロガスなフィブロブラストまたはアロジェネイックなフィ ブロブラストを、感染多重度５〜１０で３時間、タウン菌株ＨＣＭＶで感染させ た。場合によっては、細胞をシクロへキサミド（５０μｇ／ｘ（１”）の存在下 で感染させた。シクロへキサミドの除去後、アクチノマイシンＤ（５μ９／峠） を添加して、ＤＮＡ転写をさらに予防し、それによって、ＨＣＭＶのＩ−Ｅ遺伝 子の選択的発現を許す。シクロへキサミドおよびアクチノマイシンＤで処理しな かった感染されたフィブロブラストは、ＨＣＭＶの！−Ｅおよび後期遺伝子産物 の両者を発現した。これらの調製物を「細胞関連ウィルス抗原（ｃｅｌｌ−ａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ）Ｊと命名した。　ゲールツ等 ［Ｒ，Ｃ，Ｇｅｈｒｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　２．８４４　（１９ ７７）ｌによる開示に従って、単純ヘルペスウィルスｌ型（ＨＳＶ−７）を部分 的に精製し、５６°Ｃで１時間熱不活化させてｒＨ５Ｖ抗原」を得た。

ＨＳ）を補充したＲＰＭＩ　　１６４０培地中に懸濁させた熱不活化全ＨＣＭＶ 抗原（５６℃、１時間）１０μｇで１×ｌＯ＠ＭＮＣ／Ｍ１２の濃度の単核細胞 （ＭＮＣ）１０Ｘ　１０・を刺激することによりて２５ｃＨｅの直立細胞培養フ ラスコ中でＨＣＭＶ特異性Ｔ細胞ブラストを調製した。７〜１０日後に、５％ｃ ｏ、雰囲気下、３７℃でＨＣＭＶ特異性ブラストをざらにバルク培養中で増殖す るか、または、供給細胞としてのＸ線照射（５，ＯＯＯＲ）されたオートロガス なＭＮＣ（ＭＮ　Ｃ１−１）、１　μｇ　／ｇｆｆ（Ｔ　ｈ細胞膜：対し　７） ノ濃１ｔ＋７）全ＨＣＭ　Ｖ抗原、または１：２０のフィブロブラスト：ＭＮＣ 割合（Ｔｃ細胞に対して）の細胞関連抗原、および１０〜２０％インターロイキ ン−２（Ｉ　Ｌ−２）［ＴＣＧＦ、ビオテスト（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、Ｆｒａｎｋ ｆｕｒｔ、　Ｇｅｒｍａｎｙ］の存在下、０．３細胞／ウエルで、９６ウ工ルＵ 字底組織培養プレートにおける限界希釈によってクローン化した。その後、３〜 ４日毎、新鮮なＩＬ−２含有培地で細胞を再培養した。７〜１４日毎、この培増 殖細胞を増殖し、９６ウエル平底細胞培養プレートに移した。

次いで、さらに増殖させるために増殖細胞を２４ウエルプレートに移し、次に大 規模に生産するために２５０１細胞培養フラスコに再度接種した。増殖したクロ ーンは第２限界希釈によってサブクローン化し、確実にクローン化した。４つの 異なるＨＣＭＶ血清反応陽性（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）ドナーからクローン を増殖させ、１００以上の個々のＴセルラインを得た。

２、ＨＣＭＶ−ＴｈおよびＴｃセルラインおよびクローンの特性付は以下の実施 例において用いるＴｈおよびＴｅラインおよびクローンの全てを、表現型、増殖 性応答、ＩＬ−２産生および細胞毒性活性について以下のように特性付けた。

Ａ９塁勇里公訴 モノクローナル抗体０ＫＴ３（全Ｔ細胞）、０ＫＴ４（ヘルパー／インデニーサ ーＴ細胞）、および０ＫＴ８（細胞毒性／サプレッサーＴ細胞）［オルソ・ファ ーマシューティヵルズ・インコーホレーテッド（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅ ｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、）、Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ３を用いて、間接免疫蛍 光測定法によってＣＤ表現型決定因子の発現についてＴセルラインを分析した。

ザイス（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡検査法またはＥＰＩＣ３５ ｐｃｅｌｌ　５４１［コールタ−・コーポレイション（Ｃｏｕｎｔｅｒ　Ｃｏｒ ｐ、）、Ｈｉａｌｅａｈ、　ＦＬ３を用いた流量血球計算法（ｆｌＯｗｅｙｔｏ ｍｅｔｒｙ）によって蛍光を検出した。ポリクローナルＴｈラインは優先的にＣ Ｄ３＋４÷８−であり、Ｔｈクローンの全てはＣＤ３−）−４−８−表現型を表 した。Ｔｃラインは優先的にＣＤ３＋４−８−！−であり、ＴｃクローンはＣＤ ３＋４−８＋であった。

Ｂ、リンパ球増殖性 ＴＣＧＦの非存在下、−晩、Ｔセルラインおよびクローンを組織培養培地中に静 置し、次いで全ＨＣＭＶ抗原またはＨＳＶ抗原のいずれかで７２時間再刺激して Ｔｈクローンの増殖性応答の特異性を決定した。Ｔｈラインおよびクローンの全 てがＨＣＭＶに対して陽性の増殖性応答を示したが、ＨＳＶに対する応答は組織 培養培地バックグランド対照と同じであった。すなわち、Ｔｈラインおよびクロ ーンの全てはＨＣＭＶ特異性であった。Ｔｃ細胞クローンはＩＬ−２の非存在下 でＨＣＭＶ抗原に対してあまり増殖しなかった。

Ｃ，インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生全ＨＣＭＶ抗原でＴｈクローンを刺 激し、上澄み液を２４時時間和集め、ネズミのＣＴＬＬ−２０（Ｉ　Ｌ−２依存 性）セルラインを用いてＩＬ−２活性について検査した。ＣＴＬＬ−２０の生存 および増殖によって示されるように、Ｔｂクローンの全てがＴ　Ｌ−２を産生ず ることがわかった。ＴｃクローンはＩＬ−２生産に関して試験しなかった。

Ｄ、細胞毒性活性 ＮＫＩ的セルライン、Ｋ５６２、標的細胞としてのオートロガスな未感染のフィ ブロブラストならびにＣＭＶ−および）ｉｓｖ−ｇ染フィブロブラストに対する 細胞毒性活性について、Ｔｈクローンの全てを試験した。ＮＫまたはウィルス特 異性細胞毒性活性は、いかなるＴｈクローンを用いても観察されなかった。

ＮＫ標的セルライン、Ｋ５６２、標的細胞としてのオートロガスな未感染フィブ ロブラストおよび不適合または部分適合アロジェネイックな未感染フィブロブラ ストならびにＨＣＭＶ−１Ｈ５Ｖ−１およびインフルエンザ−感染フィブロブラ ストに対する細胞毒性活性について、Ｔｃクローンの全てを試験した。抗ＮＫ活 性はいかなるＴｃクローンでも観察されなかった。ＨＣＭＶ特異性Ｔｃクローン の全てがオートロガスなおよびＭＨＣＬＡ−適合ＨＣＭＶ感染フィブロブラスト に対して細胞毒性活性を示したが、アロジェネイックな不適合ＨＣＭＶ感染フ感 染フィブロブラストては細胞毒性活性を示さなかった。ＨＳＶまたはインフルエ ンザウィルスで感染されたいかなる標的細胞についても、細胞毒性活性は観察さ れなかった。すなわち、本明細書に記載のＴｃクローンはＭＨＣクラスｌ抗原に よつて制限されたＨＣＭＶ特異性細胞毒性活性を示し、したがって、ウィルス特 異性細胞毒性Ｔ細胞の特性を示す。

実施例ｍ ＨＣＭＶ抗原に対するＨＣＭＶ特異性Ｔｈクローンの増殖性応答ドナーＷＲＣか ら得た１７のＨＣＭＶ−Ｔｈクローンを、表現型、増殖性応答、ＩＬ−２産生お よび細胞毒性活性について広範囲に特性付けた。クローン全てがＣＤ３÷４÷８ −であり、ＨＣＭＶに対して増殖性であるがＨＳＶに対して増殖性でなく（上記 実施例■（２）に記載したとおり）、ＨＳＶではなくＨＣＭＶで刺激すると全て がＩ　Ｌ−２を産生じ、細胞毒性活性を示さなかった。全てのクローンも、抗ク ラスｎモノクローナル抗体でブロックすることによって決定されたクラスＩＩＭ ＨＣ制限特異性、およびＤＲ，ＤＱまたはＤＰと関連して発現した適切なり警制 限決定因子を有する細胞を提供するオートロガスなまたはアロジエネイックな抗 原によって提供された全ＨＣＭＶ抗原に対して活性を示した。

精製されたＨＣＭＶ抗原に対するＴ細胞反応性の研究に関して、３日目の再刺激 培養に、抗原提供細胞供給源として、Ｘ線照射されたオートロガスな単核細胞を 加えた。培養の最後の１６時間に、ウェルあたり１μＣｉのトリチウム標識チミ ジンを加えた。培養をガラス繊維フィルターで回収し、液体シンチレーション分 光計で計数した。これらの検査の結果を下記第３表に示す。

第３表 全ＨＣＭＶ抗原、ＨＣＭＶ洗浄剤抽出物（エンベロープグリコプロティン）、洗 浄剤抽出物からの沈澱物（内部プロティン）、およびＨＰＬＣ精製したＨＣＭＶ グリコグリコプロティンるＨＣＭＶ特異性Ｔｈクローンの反応性ＨＣＭＶ−Ｔｈ クローンの増殖性応答［１分あたりの計数（ＣＰＭ）コクローン＋ＭＮＣ””　 ＋　ＣＭＶ抗原クトり　　　　　ＢＣＭＶ　　タウン クローン　　クローン　　十　全）ＩＣＭＶ　　洗浄剤カプシド　Ｉ’１ＰＬＣ ＩＩＰＬＣＨＰＬＣＷＲＣ−Ｔ２：６９　９８　　１１７　７３，２ｇ２　４， ８５５　６．１８６　　１７８　　１４２　　１６１ＶＲＣ−Ｔ３：３　　６７ 　１．０１１　５５，０８０　９．３１１　３，３５５　１．１９４　１９，７ ０６　２５，３８７ＷＲＣ−Ｔ３：４　１１１　　４７５　５１．１８５　１５ ．６３２　１，５８０　　１６３　　３６５　　１５５ＩＲＣ−７３ｇ１６　８ ７　　１４２１２１，０３０　４．５５３　　１５４　　１４２　　３０８　　 １５５Ｗｌ’ＩＣ−Ｌ６　　１１４　　１４２６３，８６７　５．６６９　４． ４３３　　２１３　　１１８　　４２７ＶＲＣ−Ｌ７　　　　　２４１　　１． ０フ９　　７０，４８４　　２９．１３１　　　７．４３９　　　２．３３ｇ　 　　　　　５８５　@　　　５２０ ＷＲＣ−Ｌ８　　１２４　　１５０３３，９７７１０，１２０　２．７４２　　 ８００　　１８９　　２０４ＷＩｌｔＣ−ＬＩＯ３２５９８１７０，７７３３２ ，５６９１０，３０７１０，３２１７４，９０２３１，０６３１１１Ｃ−Ｌｉ２ 　　２１７　　３１５　６８，５５ｇ　　３９，８０５　３，１５８　　３８９ 　１，０７３　　２７７ＷＲＣ−Ｌ２５　　３９９　　６４ｇ９．８４７３Ｂ、 １４９　７．９９４　　６１４　　６７８　　３３０ＷＲＣ−Ｌ４３　　１ｇ１ 　　６７０１０２．７＋１１７　１６．７２２　１６．３ｇ９　　４０４　　４ ９６　１，４９５ＷＲＣ−Ｔｌ：８　　４Ｂ　　１，８３４　２０，２９７　３ ３，７３６　１５，６４１　　２２９　　１７２　　２９９Ｉｃ−Ｔ２＃４１　 １０３　　４８０　６，２００　３．８＋３０　　　　　　２６２　１．３４６ 　４，２１５ＹＲＣ−Ｌ３１　　１２２　　２６ｇ３１．４９７４５．７６６２ ６，９２７　　２７６　　１１４　　２０６ＷＲＣ−Ｌ３４　　５２　　３１９ １２，４７７１５．０７７　　ｇ、７６２　　１９６　　１８７　　２５３ＷＲ Ｃ−Ｌ３５　　４９　　１３４　５．６５ｇ２２，９６５　２．６８２　　１４ ８　　１２０　　２１１１１ＲＣ−Ｌｉ２　　９４　　１３１　４，１０８　１ ．６３９　　　　　　　９８　　１６３　　１４０富第１表に示したＨＰＬＣビ ーク２（２ＵＲ）、３（３ｔＪＲ）および４（４ＵＲ）から誘導された、精製さ れ、還元されていないグリコペプチド複合物。ＨＰＬＣ−２ＵＲ，４ＵＲは主と してｇｐＢ３を含有しており、ＭｏＡｂ　９　Ｅ　１０と反応性であり、２ＵＲ は免疫学的に異なるｇｐｃを含有し、ｇｐＡまたはｇｐＢと反応性であるＭｏＡ ｂ’ｓと非反応性である。ＨＰＬＣ−３ＵＲは主としてＭｏＡｂ　４１　Ｃ２と 反応性であるｇｐＡを含有している。

第３表に示したデーターは、１７のクローン全てが全タウンＨＣＭＶ抗原に対し て反応性があることを示しており、４１０８個／分〜１２１．０３０個／分を示 している。これらの結果、これらのＨＣＭＶ−Ｔｈクローンによって認識された 免疫優性決定因子がヴイリオンから得られた構造プロティンおよび／またはグリ コプロティンによって発現されるということを示している。

クローンの全てがタウンＨＣＭＶのトリトンＸ−１００抽出物に対して非常に反 応するが、全タウンウィルス性粒子に対するよりも狭い範囲である。すなわち、 Ｔｈクローンの大多数は、主に、ウィルスのエンベロープ内に含まれるプロティ ンもしくはグリコプロティン、または洗浄剤抽出物において見いだされるべきウ ィルスエンベロープと充分に結合しているプロティンを認識すると思われる。

全タウン抗原と比較して低い応答は残渣洗浄剤の抑制効果をもたらすか、または 抽出工程から得られた構造的変化によって免疫原性の損失をもたらす。

重要なこととして、Ｔｈクローンの全てが、洗浄剤抽出後、ウィルス抗原の沈澱 物に対して低いが重要な増殖性応答を示した。いくつかの残渣エンベロープグリ コプロティンおよび外皮プロティンが沈澱層内に含まれていると思われるが、お そらく沈澱物中の優性プロティンからなっているヌクレオカプシドプロティンが ヘルパーＴ細胞によって認識された抗原決定基を発現することも可能である。

次にＴ細胞クローンは、全ＨＣＭＶ抗原の非還元洗浄剤抽出物を陰イオン交換Ｈ ＰＬＣ分別によって得られた精製グリコプロティン複合物によって刺激された（ 実施例１（１）祭照）。

カリ等ＣＢ、Ｋａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＪｉｒｏｌｏｇｙ、　６０．３４５ 　（１９８６）コおよび前記第１表に記載されているように、ピーク２ＵＲおよ びＪＵＲ内に含有されるグリコプロティン複合物は、モノクローナル抗体（９Ｅ １０）によって認識されたグリコプロティン複合物を含んでいる。

この抗体は２．３の他のウィルスと交差反応し、補体の非存在下でＨＣＭＶを中 和することができる。これに対して、グリコプロティン複合物の分離および区別 したグループは、ピーク３ｔ、ＩＲ中で高純度に分離され、ＨＣＭＶと特別に反 応するモノクローナル抗体の分離クラスによって認識され、複合物の存在下のみ でＨＣＭＶを効果的に中和する。

還元後、３ＵＲから誘導された主要なグリコプロティンは１３０゜０００．９０ ．０００および５０．０００〜５２．０ＯＯｋＤの分子量Ｕ　Ｒ／４　Ｕ　Ｒ複 合物から誘導された２つのグリコプロティンは９３゜０００および５０．　ＯＯ Ｏ〜５２，０００ｋＤの分子量を有している。

第３のグリコプロティンは、９Ｅ１０モノクロ一ナル抗体によって認識されたこ れらグリコプロティンと区別されるピーク２ＵＲにおいて示される。したがって 、ＨＣＭＶウィルスエンベロープ内の全グリコプロティンの９５％以上において 取り込まれるとして定義されているＨＣＭＶのエンベロープ内に含まれる少なく とも３つの主要グリコプロティン複合物がある。これらＨＰＬＣ法によって、純 度９５％以上のグリコプロティン複合物が得られるので、これら個々のグリコプ ロティン複合物に対するＴｈ反応性のノでターンを示すことが重要である。

第３表に示したように、ＨＰＣＬ精製グ精製グリコプロティン複合層応性に関し て試験した１７のＴｂクローンのうち、２つがピーク２ＵＲではなく、ピーク３ ＵＲおよび４ＵＲに応答した。第３のＴｈクローンは３つのＨＰＬＣビークの全 てに応答した。これらのクローンは主として、ピーク３ＵＲ中に主に分離されて いるグリコプロティン複合物を検出するモノクローナル抗体によって認識されて いる主要なグリコプロティン複合物に応答している。ピーク３ＵＲのピーク４Ｕ Ｒへのテーリングが明白な交差反応性の原因となっていると思われる。この特異 性は、ＴｈクローンＷＲＣ−Ｔ３：’３、ＷＲＣ−Ｔ　２　＃　４１およびＷＲ Ｃ−Ｌｌｏについて確２．　サレ、インヒドロでのｇｌ）Ａ遺伝子の１−ＲＮＡ 翻訳によって産生されるグリコペプチドｇＰＡに特異的に増殖する（データーは 示していない）。

特に重要なこととして、クローンの大多数（１４／１７）は、物質２Ｌ″Ｒ１３ ＵＲおよび４ＵＲによって表される大部分のエンベロープグリコプロティン複合 物において発現された決定因子を認識しない。すなわち、これらクローン化ヘル パーＴ細胞によって認識された免疫優性ＨＣＭＶ抗原決定因子は、非グリコジル 化膜プロティンまたは内部プロティンのいずれかに残ることができる。もしそう であるならば、これは、インフルエンザウィルスと同じであり、抗体認識は、主 に表面グリコプロティン（すなわち、ヘマグルチニン）を含むが、細胞毒性１９ ７１球は主に内部ヌクレオカプシドプロティンを認識することがわかる。

第４表に、個々のＨＣＭＶ（グリコ）プロティンと反応性のあるＨＣＭＶ特異性 Ｔｈクローンの特異性に関するデーターを示す。全ＨＣＭＶ抗原を有する血清陽 性ドナーから、ＭＮＣｓの初期刺激によってクローンを発生させ、構造プロティ ンおよびＨＣＭＶのグリコプロティンとのＴｈ反応性について選択した。

第４表 個々のＨＣＭＶ（グリコ）プロティンと反応性のあるＨＣＭＶ特異性クローン− ＭＮＣＩ＋抗原１ クローン ＷＲＣクローン　　＋　　全ＢＣＭＶ　　　　　　ＢＰＬＣ精製ａ、増殖性応答 を、ＣＰＭにおける３Ｈ−チミジンの摂取量として測定した；以下の抗原を用い た： （ｉ）全ＣＭＶウィルス：スクロース勾配液における細胞培養上澄み液から精製 したタウン菌株ＣＭＶウィルス。

（１１）エンベロープグリコプロティンｇｐＡ：タウンＣＭＶの洗浄性抽出物の 陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製したピーク３ｔＪＲ。

（ｉｉｉ）６４ｋＤマトリックスプロティン：逆相／ゲル濾過ＨＰＬＣによる部 分精製物。

（ｉｖ）ＨＳｖ、アデノ：感染した細胞培養の上澄み液から精製した全ウィルス 。

ｂ、全タウンウィルスを用いた初期刺激にょるＥＲＣＴｈり；−ン；Ｔｂクロー ンの１８％がｇｐＡ＊異性であった：Ｔｈクローンの３３％がＨＰＬＣ精製した ６４ｋＤプロテインに対して特異的であった。

ｃ、ＭＮＣ”　＝　ＡＰＣのような放射線照射されたオートロガスなＭＮＣ。

ｄ、　Ｎ、Ｄ、　＝測定していない 実施例１．１に詳述したように試験されたＴｈクローンの１８％は、ｇｐＡに対 して特異的である。代表的な例としては、ＷＲＣＴ：３’３ンの３３％は、全ウ ィルスおよび分子ｊｉ６４，０００ダルトンの部分精製したマトリックスプロテ ィンと反応性があることがわかった。

このプロティンは、クラークｒＢ、Ｒ，ｃＩａｒｋ、　ＪＪｉｒｏｌ、、　４９ ．２７９　（１！］１ｌ１４）コの方法の変形に従って逆相ＨＰＬＣおよびゲル 濾過によって得られる。ＨＣＭＶ感染フィブロブラストの上澄み液の遠心分離に よって得られた全タウンＨＣＭＶを、６Ｍ塩化グアニジン中に溶解し、Ｃ−１８ カラムで逆相ＨＰＬＣにかけた。カラムに付着したプロティンをアセトニトリル で溶離し、２１４ナノメーターのカラム流出量を監視することによって検出した 。回収したピークを集めて、６４ｋＤプロテインを５ＤＳ−ＰＡＧＥによって同 定した。

さらに、直列に配置されたＴＳＫ　　４０００およびＴＳＫ　　３０００　　Ｓ ＥＣカラムを用いて、サイズ選別クロマトグラフィーによって、相互溶離された プロティンから６４ｋＤプロテインを精製した。

この方法を用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する場合、６４ｋＤプロテイン の凝集形を単離した。

クローンＷＲＣ−Ｔ２／８８およびＷＲＣ−Ｔ２／１３１は、６４ｋＤマトリツ クスプロテインに応答して増殖するＨＣＭＶ特異性Ｔｈクローンの代表例である 。重要なこととして、多くのクローン（すなわち、ＷＲＣ−Ｌ３３およびＷＲＣ −Ｌ４２）Ｉｔ、主要エンベロープグリコプロティン、ｇｌ）Ａ、または豊富な ６４ｋＤ内部マトリックスプロティンと非反応性であった。すなわち、ＨＣＭＶ 特異性ヘルパーＴ細胞が種々の構造ＨＣＭＶプロティンに存在すると思われる。

実施例■ ＮＫ標的細胞、Ｋ５６２、ならびにＨｃＭＶ、Ｈ８Ｖ＊たはインフルエンザウィ ルスに感染したオートロガスなまたはアロジェネイックなフィブロブラストに対 する細胞毒性について、ポリクローナルおよびモノクローナルＴｃ細胞を検査し た。以下に詳述する方法を成人ドナーの皮膚生検および新生包皮からヒトデイブ ロイド皮膚フィブロブラスト（Ｓ　Ｆ）を入手した。細胞を少なくとも６回継代 し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１０％０％ジメチルスルホキシドＭＳ Ｏ）を含有するダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１℃／分で凍結し 、液体窒素中で保存した。使用前に、細胞を３７℃温浴中で解凍し、培地で洗浄 し、２５ｃ１組織培養フラスコに接種した。ＳＦを全面成長させ、感染多重度０ ．２のＨＣＭＶで感染し、単層７０−９０％の細胞病理学的効果を示すまでイン キユベートした。次いで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃において細胞をＮａｔＣ ｒＯｔ　（培地２ｚ１２中３７５μＣｉ）で−晩標識した。細胞を３回洗浄し、 １０％ＦＣＳのＲＰＭＩ中に再懸濁した。対照として、非感染の”Ｃｒ標識化Ｓ Ｆを使用した。

２．８ＳＶ−およびインフルエンザ−感染皮膚フィブロブラスト２５Ｃ１フラス コ中のＳＦ単層をＨＳＶまたはインフルエンザで感染多重度５−１０で感染し、 −晩インキユベートした。得られた細胞をＨＣＭＶ−感染フィブロブラストの場 合と同じ方法で標識した。

３、に５６２ 赤白血痰セルラインに５６２を標的細胞の供給源として使用し、ＮＫ活性を測定 した。Ｋ５６２細胞（ＩＸＩＯ＠）を培地１１１Ｉ２に想濁し、２５ｃｘ”フラ スコ中、５％ＣＯ８雰囲気下、３７℃において細胞を３７５μＣ４のＮ　ａ　ｔ 　Ｃｒ　Ｏ４で一晩標識した。３回洗浄した後、１０％ＦＣ３を加えたＲＰＭＩ 中に再懸濁した。

サイクロへキサミド（１５μｇ／ｘＯの存在下にＳＦを感染多重度５−１０のＨ ＣＭＶで３時間感染させた。サイクロヘキサミドを除去した後、アクチノマイシ ンＤ　（５ｔｔ　ｇ／ｘ（１）およびＮａ、Ｃｒ０−（３７５μＣｉ）をその培 養物に加えた。次いで、得られた細胞を３回洗浄し、標的細胞として１０％ＦＣ Ｓ中ＲＰＭＩ中再懸濁した。

ＤＮＡ転写を妨害するアクチノマイシンＤの存在下に細胞毒性検定を行った。サ イクロへキサミドおよびアクチノマイシンＤで同様に処置した非感染ＳＦを対照 として使用した。

Ｂ、細胞毒性検定 １００μｇ中、３０００個の標的細胞をＶ−底マイクロタイタープレートの各ウ ェルに入れた。次いで、１００μｇ中のエフェクター細胞の連続希釈物をその標 的細胞に加え、エフェクター細胞二律的細胞の比率５０：１．２５：１および１ ２：１とした。このプレートを、１０時間ｖ　％　ＣＯを雰囲気下に、３７℃、 ５分間、５０９で遠心した。得られた上清１００μｇを採取し、ガンマ−カウン ター［ベックマンガン？　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｇａａｎａ）　９０００　］でカ タウンした。

標的細胞にそれぞれ培地中トリトン−Ｘ−１００を１００μｇ加えることによっ て、最大の細胞溶解を構成する対照、および自発放出を得た。計算は、以下の計 算式にしたがって行う：実測値ＣＰＭ−自発放出ＣＰＭ ％”Ｃｒ放出＝□ 最大ＣＰＭ−自発放出ＣＰＭ １分当たりの実験カウントによって、エフェクター細胞を含むウェル由来の細胞 が示された。

比放出（ＳＲ）＝　［％”Ｃｒ放出ＨＣＭＶ感染標的］−［％”Ｃｒ放出非感染 標的］ 得られた結果を３つまたは４つのウェルから得られた値の平均値として表した。

感染および非感染ＳＦ標的細胞から得られる自発放出は共に４０％よりも低かっ た。

１、タウン（Ｔｏｖｎｅ）　ＨＣＭ　Ｖ−感染オートロガス皮膚フィブロブラス ト（Ｓ　Ｆ）によって刺激されたＨＣＭＶ−特異的ポリクローナルＴｃセルライ ンの細胞毒性活性 血清反応陽性のドナー５Ｐ−ＣＮ由来の単核細胞を、タウンＨＣＭＶで２０時間 感染させたオートロガス皮膚フィブロブラスト（ＳＦ）を含むバルク培養物中で ７日−１０日間刺激した。ＨＣＭＶ−感染フィブロブラスト、供給細胞としての オートロガス照射ＭＭＣ。

およびＩＬ−２を用いてＴ細胞ブラストを１週間、再度器（刺激した。得られた ポリクローナルＣＤ８＋　Ｔセルラインを、非感染およびＨＣＭＶ−ｇ染オート ロガスフイブロブラスト、およびＮＫ標的セルラインに５６２に対する細胞毒性 活性について評価した。この試験の結果を以下の第５表に示す。

第５表 タウンＨＣＭＶｇ染オートロガス皮膚フィブロブラスト（ＳＦ）によって刺激さ れた５Ｐ−ＣＮセルラインの細胞毒性活性ｂ）　４つのウェルから得られた比” ｃｒ放出の平均値上記第５表におけるデータから理解されるように、即時型の初 期および後期ウィルスタンパクを発現する、オートロガスＨＣＭＶ２０時間感染 フィブロブラストに対し、ならびに前もってサイクロヘキサミド（ＣＨ）および アクチノマイシンＤ　（ａｃｔ、Ｄ）で処置してＨＣＭＶの即時型の初期タンパ クを選択的に発現する、ＣＭＶ感染オートロガスフイブロブラストに対し、両セ ルラインは細胞毒性活性を現した。さらにこれらセルラインは、ＮＫ一様細胞毒 性活性をも顕著なレベルで表した。

ＭＮＣをシヨ糖勾配精製タウンＨＣＭＶウィルス粒子で初期刺激シタ後、ＨＣＭ Ｖウィルス粒子、供給細胞としてのオートロガス照射ＭＮＣ５およびＩ　Ｌ−２ での刺激を繰り返すことによって、血清クローンを入手した。以下の第６表に示 すように、３つのＣＤｇ＋ラインおよびＣＤ８＋５Ｐ−ＲＫクローン＃３は、Ｈ ＣＭＶ−感染オートロガスフイブロブラストを細胞溶解するが、アロジェネイッ ク（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）な非適合性ＨＣＭＶ−感染フイブロブラスト、また はＨ５Ｖもしくはインフルエンザウィルスで感染されたオートロガスフイブロブ ラストは細胞溶解しなかった。

第６表 シジ糖勾配精製タウンＨＣＭＶウィルス粒子によって刺激された５Ｐ−ＲＫ　Ｔ セルラインおよびクローンの細胞毒性活性これらのセルラインは、Ｋ５６２ＮＫ 標的細胞に対しては細胞毒性活性を少ししか示さなかった。従って、これらのＴ セルラインおよびクローンの特徴は、ウィルス抗原全体（即ち、構造タンパク質 ）によって発現される抗原（群）を認識する、ＨＣＭＶ−特異的な、ＭＮＣクラ スＩＬＡ−制限されたＴ−細胞毒性細胞であることである。

リスボンダー細胞（応答細胞）の供給源としてＨＣＭＶ−ＴｈクローンＷＲＣ− Ｔ３＃３をウェル毎に１．５Ｘ１０’個細胞の濃度で使用した。オートロガスな Ｘ−線照射ＭＮＣ（１０’）を抗原−提示細胞の供給源として加えた。最適な希 Ｆｉの全ＨＣＭＶ抗原または０、１ｔｔｇ／ｘＱ　ＨＰＬＣ精製３ＵＲをＨＣＭ Ｖ−特異的抗原性側１物の供給源として加えた。免疫優勢なグリコプロティンＡ 　（ｇｐＡ　）を認識するモノクローナル抗体４１Ｃ２、またはプロティンＤと 称されるグリコジル化されていないタンパク質を認識する対照のモノクローナル 抗体３５Ｆ１０の連続希釈物を、各ウェルについて濃度ｌ０から０．０１ｇｇ／ ｚ（ｌまでで加えた。この実験によって得られた結果を以下の第７表に示す。

第７表 ＨＣＭ　ＶグリコプロティンＡ　（ｇｐＡ　）に指向するモノクローナル抗体（ ＭｏＡｂ）は、ｇＰＡ特異的ＴｂクローンｗＲｃ−Ｔ：３：３の増殖応答性を増 大させるｂ）希釈度１：１０００で使用した全ＨＣＭＶ　ウィルス抗原（株ＡＤ １６９）上記第７表で表されるデータは、モノクローナル抗体４１Ｃ２が、３Ｌ ］Ｒまたは全ＨＣＭＶ抗原を抗原刺激物として使用した場合、Ｔｈクローンの増 殖応答性を顕著に増大させることを示している。これとは対照的に、プロティン Ｄ指向性のモノクローナル抗体では、３ＵＲまたは全ＨＣＭＶ抗原のいずれを使 用しても顕著な増大は認められなかった。

このように、個々のＴｈクローンを顕著に刺激する、免疫原性グリコプロティン 複合体抗原に指向したモノクローナル抗体は、増殖応答性を増大させるようであ る。

次に、全ＨＣＭＶ抗原と反応することが証明された６つのＨＣＭＶ−Ｔｈクロー ンを、全ＨＣＭＶ抗原÷モノクローナル抗体４１Ｃ２（対ｇｐＡ）またはモノク ローナル抗体３５Ｆ１０（対プロティンＤ）のいずれかの連続希釈物を用いて刺 激した。血清反応陽性の、および血清反応陰性の全血清をも同条件で試験した。

得られた結果を以下の第８表に示す。

第８表 ＨＣＭＶグリコプロティンＡ（ｇｐＡ）と反応するＭｏＡｂは、ＨＣＭＶ特異的 ’ｒｈりｏ−：／の、全ＨＣＭＶ抗原に対する増殖応答性を増大させる １０ｇｇ／ｚ（１２５，９１３６，９４ｇ　　　　９，５６５　　１６．１２８ 　　２５．２９２３μｇ／ｉｉ２　　　２６．２７５　　８．６２７　　１Ｌ３ ２１　　１７．２２４　　１９．３７０１ｇｇ／ｘＩ２２２．０７３　　７，８ １５　　　９，５７７　　１７，１８３　　２０，５９９０．３μｇ／収　　２ １．５５ｇ　　　６．８６７　　　８．０１０　　１４．８０７　　２０．４８ ９０．１μｓ／ｘ（１１６，６７７４，１００５，２１０１１，４５６２１，４ ８２０，０３ｇｇ／ｘＱ　　　１７，０２６　　４，２０２　　　６．２１１１ ３　　１１．０６３　　１６，８０２０．０１ｇｇ／ｘ（１１６，３１５３，２ ９４５，４０３７，６７０１８，０６９ＭｏＡｂ　３５Ｆ　１０（抗−ｐＤ） １０ｇｇ／好　　　　１８．５８７　　　６．７３７　　　４，６８３　　　７ ．５８４　　１＋１ｔ、８４０３ｇｇ／村　　　　１９．１００　　　５．０６ １　　　６．６１６　　　９．４８８　　１８．９６７１ｇｇ／ｌ、（１２０， ４７１５，９０３６，３８２７，３７６１７，７９９０，３μｇ／ｚ（ｌ　　　 　［，９１６ｇ、００１　　　４，８２６　　　８．３４２　　１８．６０５０ ．１ｇｇ／ｘ（１１ｇ、８４２　　　３，５４２　　　５．４０４　　　７，５ ７０　　１８．５１８０．０３ｇｇ／ｚＱ　　　１７，４３９　　　３，５５０ 　　　６，３２１　　　９，２２６　　１８，９９３ｏ、０１μｓ／Ｋｃ　　　 Ｉｇ、２４ｇ　　　　２，９６４　　　５，９７１　　　７，２６２　　２２． ５１１血清反応陽性の全血清（ドナーＣＲ） ３．３ラムダ／Ｉｆｆ　　５１．０６ｇ　　　１１，４１２　　１７，６１６　 　１６．３４５　　２４．９１８血清反応陰性の全血清（ドナー５Ｆ） ３．３ラムダ／ｖＱ　　２７，５０６　　６．７８４　　　　ｇ、１０３　　１ ５，４６４　　２０，４４５ａ）　１．５Ｘ］０’　Ｔｈ／ウェル　÷　１０５ オートロガスＩｄＮＣ”″／ウェル　÷　全ＨＣｉ抗原ｂ）カウント７分 驚くべきことに、抗体の不存在下では、６個のＴｈクローンのうちの３個しかＨ ＰＬＣ精製ｇｐＡと反応しなかったにも拘わらず（第７表参照）　、ｇｐＡ指向 性のモノクローナル抗体４１Ｃ２は、６個すべてのＴｈクローンの、全ＨＣＭＶ 抗原に対する応答性を増大させた。プロティンＤ指向性モノクローナル抗体は、 試験したいずれのクローンの応答も増大させなかった。血清反応陽性ドナー由来 の全血清はすべてのクローンの応答を増大させたが、血清反応陰性ドナー由来の 全血清は増大させなかった。これらのデータが示す事項は、増大の機序は、抗体 と、特異的ウィルスタンパク質またはＴｈクローンに認識されるグリコプロティ ンとの直接的な相互作用には本質的に関連していない、ということである。

Σ茹！ハツ ＭＮＣ，ＬＣＬ、またはそれらの混合物によるヘルパーＴ細胞クロ血清反応陽性 ドナー５Ｐ−ＣＮ由来のオートロガスＬＣＬ（ＳＰ−ＣＮ　ＬＣＬ）を、スーダ ンら（Ｓｕｇｄｅｎ　ａｎｄ　Ｍａｒｋ）らの方法［Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 　２３．５０３　（１９７７）］によって樹立させ、１０％熱−不活化ウシ胎仔 血清（Ｆｅ２）を加えたＲＰＭ１１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）、　二＋Ｌ−ヨーク）に増殖させた。ＡＭＧ　ＬＣ Ｌ　（ＤＲ２，２／Ｄｗ　２．２）およびＮＨＳ　　ＬＣＬ　（ＤＲ３，８）　 ｌ；ｆ：、Ｆ、パフ博士ＥＦ、　Ｂａｃｈ、　ＪＲＣ，ミネソタ大学、ミニアポ リス、ＭＮＮコムら提供を受けた。

２、ＨＣＭＶ−特異的Ｔ細胞クローンの調製ＨＣＭＶ−特異的Ｔ特異的Ｔｈクロ ーン反応陽性ドナー（ＳＰ−ＣＮ）から調製した。手短に言えば、１５％熱不活 化ＨＣＭＶ−血清反応陰性ヒト血清（ＰＨＳ）および１Ｈｇ／ｚＱ全ＨＣＭＶ抗 原を加えたＲＰＭ１１６４０培地において、単核細胞（ＭＮＣ）を１０６細胞／ 村テ培養した。７−１０ＥＩ後、ｌｏ、ｏｏｏｔ−ト。

ガスなＸ−線照射（５，○ＯＯＲ）ＭＮＣ，１μｇ／ｚＱ全ＨＣＭＶ−抗原（タ ウン株）、および１５％Ｉ　Ｌ−２［ＴＣＧＦ、Ｂｉｏｔｏｓｔ。

フランクフルト、西ドイッコを加えたＲＰＭＩ−１５％ＰＨＳ培地０．２３！（ を入れた丸底ウェル中で希釈度を０．３細胞／ウエルに限定することによって、 Ｔ細胞ブラストを単離、クローンした。平板効率２％−１２％が認められた。得 られたクローンを１０−２０％ＩＬ−２を含有する培養培地で増殖させ、オー） ｏガスなＸ線−照射ＭＮＣ／ＬＣＬ混合物およびｌμｇ／ｒ１２全ＨＣＭＶ抗原 を用いて１−２週間毎に再度刺激した。

３、増殖検定 クローンされたＨＣＭＶ−特異的Ｔｈ細胞を再刺激の７−１４日後に検定した。

１０’個ＨＣＭＶ−特異的Ｔｈ細胞、各種１度のＸ線−照射オートロガスＭＮＣ および／またはＬＣＬ、ならびに全ＨＣＭＶ抗原（タウン株）またはＨＳＶ抗原 を全ＩＩＱ、２Ｘｆｆ／ウェルで加えた丸底プレート［Ｆｌｏｖ　Ｌａｂ、　、 　Ｉｎｃ、　、　ＶＡＪにマイクロカルチャーを準備した。その培養物を３日間 インキニベートし、培養の終わり１６−２４時間に、ＩμＣｉ／ウェルの３Ｈ− チミジンＩＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、ＭＡ］を各ウ ェルに加えた。自動細胞捕集機によってウェルを採取し、細胞をガラスファイバ ー濾紙に採り、そしてベックマン５８０１液体シンチレーション分光測定器によ って放射活性を測定した。

抗原の提示 Ｘ線−照射オートロガスＭＮＣ（１０’／ウエル）またはＸ線−照射オートロガ スＬＣＬ　（１０’−３Ｘ１０’／ウエル）のいずれかをＡＰＣとして使用し、 血清反応陽性ドナー（ＳＰ−ＣＮ）か４生成されたＨＣＭＶ−特異的Ｔｈクロー ンのパネルを）（ＣＭＶ−特異的な増殖活性について試験した。ＨＳＶ抗原を特 異性の対照としてインキ１ベートした。第９表に、７つのクローンを使用して得 られた結果を示す。

第９表 照射オートロガスＭＮＣまたはＬＣＬのいずれかを使用したＨＣＭＶ特異的Ｔｈ 細胞クローンの増殖活性ａ）放射オートロガスＭＮＣ（５，０００ｒａｄｓ）を １０’　ＭＮＣ／ウェルで加えた。

ｂ）放射オートロガスＭＮＣ（＋！、　０００ｒａｄｓ）をｔｏ’　３ｘｌＯ’ ／ウエルで加えた。

Ｃ）熱不活化（５６℃／１時間）全ＨＣＭＶ抗原（タウン）またはＨＳＶ抗原を ２μｇ抗原／ウェルで加えた。

ｄ）データは、３つのウェルから得られたＣＰＭ（平均±１３．Ｄ、）として表 す。

第９表に挙げたＴｈクローンはすべて、ＭＮＣを培養物にＡＰＣとして加えた場 合、ＨＣＭＶ抗原に対して十分に増殖したが、ＨＳＶ抗原に対しては増殖しなか った。増殖の規模は、８１１４から６８．３０７ｃｐｍの範囲であった。これら クローンの殆どは、ＬＣＬを１．０２０から２１．３７０の範囲でＡＰＣとして 使用した場合にも、ＨＣＭＶ抗原特異的増殖応答を示Ｃた。クローン５Ｐ−ＣＮ ／Ｔ２−１３１および５Ｐ−ＣＮ／７．５−４３は、ＨＣＭ　Ｖに対し、放射オ ートロガスＭＮＣの存在下で良好に増殖したが、放射オートロガスＬＣＬの存在 下では貧弱な増殖であった。

他方、クローン５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−１６および５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−９は、放射オ ートロガスＬＣＬの存在下にＨＣＭＶに対して良好に増殖したが、もっとも放射 ＭＮＣの存在下におけるＨ　ＣＭ　Ｖに対するこれらの増殖は、他の５つのクロ ーンよりも良好でなかった。

このように、ＡＰＣとしてＭＮＣを使用した場合の）（ＣＭＶに対する増殖とＡ ＰＣとしてＬＣＬを使用した場合の増殖とは明確な相関関係はない。

抗原特異的ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）が、ＡＰＣの表面上のクラスＩ［ＭＨＣ産物 に関連した抗原を認識することは周知である［エルグ（Ｐ、　Ｅｒｂ）らのＪ、 　Ｅｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、　、　１４２．４６０（１９７５）コ。本発明者らは 、ＡＰＣとしてＬＣＬを使用し、これらＴｈクローンのいくつかのＭＨＣ制限作 用を調査し、すべての試験したり９−ンがクラス■制限されることを見いだした 。他のＭＨＣクラス■適合ドナー由来のＬＣＬも、２つの高い応答クローン（Ｓ Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−１６および５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−９）に対して良好にＨＣＭＶ抗 原を提示したが、５つの低い応答クローンに対しては貧弱であった。例えば、５ Ｐ−ＣＮ　　ＬＣＬ　（オートロガス、ＤＲ２，４／ＤＷ２．４）およびＡＭＧ 　ＬＣＬ　（ＤＲ２，２／ＤＷ２．２）は、クローンＳ　Ｐ　−ＣＮ　／　Ｔ３ −９に対してＨＣＭＶ抗原を提示シタ力、他方、ＮＨＢ　ＬＣＬ（ＤＲ３，８） は、この同じクローンに対してＨＣＭＶを提示しなＨＣＭＶ−特異的Ｔｈ細胞を 刺激するためには、Ａ　Ｐ　Ｃとしてのオートロガス？ｖＬＮＣの供給が限定さ れており、またオートロガスＬＣＬを単独で使用した場合には不十分な提示であ ったために、Ｔｈクローンの再活性化に、ＭＮＣとＬＣＬとを組み合わせてＡＰ Ｃおよび供給細胞として使用した。驚くべきことに、ＬＣＬおよびＭＮＣの組み 合わせによって、増殖応答に対する相乗作用が認められた。

この結果を以下の第１０表に示す。

第１０表 オートロガスＷＲＣＭＮＣおよび／またはＬＣＬをＡＰＣとして使用したヘルパ ーＴ細胞クローンＳ　Ｐ−ＣＮ／Ｔ５−４３の増殖応答 ５）１０’Ｔ細胞／ウエル、１０′″−１０’ＭＮ　Ｃ１Ｒ”および／またはＬ ＣＬ１１１１１／ウェルならびに２μｇ／ウェル全タウンＨＣＭＶ抗尿を使用し て増殖検定を行った。

クローンＳ　Ｐ−ＣＮ／Ｔ　５−４３および５Ｐ−ＣＮ　ＬＣＬ”（１０’−１ ０’／ウエル）の３Ｈ−チミジン取り込みは５９〜９２の範囲であった。

ＬＣＬ濃度１０′／ウェル、３Ｘ１０’／ウエルおよび１０Ｓ／ウエルのクロー ンＳ　Ｐ−ＣＮ／Ｔ　５−４３および５Ｐ−ＣＮ　ＬＣＬ””の”Ｈ−チミジン 取り込みは、それぞれ６２９、ｌ、２７９、および２．４６６であった。

ＩＱ’ＬｃＬ／ウェルから１０’ＬＣＬ／ウエルの範囲のＬＣＬをＡＰＣとして 単独で使用した場合には、バックグラウンド以上に、全ＨＣＭＶ抗原に対する顕 著なＴ細胞増殖応答を刺激することはなかった。しかし、１０’ＬＣＬ／ウエル および３Ｘ　１０’ＬＣＬ／ウエルのＬＣＬを追加した場合には、ＭＮＣおよび 全ＨＣＭＶに対するＴｈ細胞の３日間の増殖応答は実質的に増大したが、１０５ ＬＣＬ／ウエルでは、増大応答が抑制されたようであった。このことはおそらく 培養物中の細胞密度が過剰になったことに由来するものと思われる。

この同じ培養物を、１５％Ｉ　Ｌ−２の存在下に１２日間増殖させ、培養を始め た後７日目および１２２日目細胞をカウント（計数）した。

これらの実験の結果を以下の第１１表に示す。

第１１表 ＡＰＣとしてオートロガスＭＮＣおよび／またはＬＣＬを存在させてＨＣＭＶ抗 原で再刺激した後における増殖した５Ｐ−ＣＮ／Ｔ５−４３細胞の数１）ａ）培 養は第６表における条件下で行った。同条件の３つのウェルから得られた細胞を ３日目にまとめ、Ｉ　Ｌ−２の存在下に１２日間増殖させた。

ｂ）分析せず。

第１１表から分かるように、ＭＮＣが存在しない場合は、Ｔｈ細胞は、ＬＣＬお よび全ＨＣＭＶ抗原の両者を培養物に加えた場合でさえ増殖しなかった。ＭＮＣ および全ＨＣＭＶ抗原を組み合わせることで、関与したＭＮＣの量に応じて、培 養１２日間でＴ細胞の数が３−から４３−倍増加する。ＬＣＬをＭＮＣおよびＨ ＣＭＶ抗原と共に加えた場合、同じ期間、同じ組織培養条件下で２９−から６２ ０−倍のＴ細胞の数の増加が観察されたが、このことは、明らかにＬＣＬが活性 化Ｔｈ細胞の増殖を増大させたことを示すものである。

これらの培養物の一部標本を、３つの９６−ウェル平底マイクロタイタープレー トに、７日間、０．２ｘ（１／ウエルでプレートした。

−晩経過後、［３Ｈ］−チミジンを適用し、取り込まれた［”Ｈ：］−チチミン を測定して細胞増殖に対するＬＣＬの作用が同様に増大したことを観察した。こ の結果を以下の第１２表に示す。

第１２表 ＡＰＣとしてオートロガスＭＮＣおよび／またはＬＣＬを存在させてＨＣＭＶ抗 原で再刺激した後における培養７日月の［′Ｈ］−チミジン取す込み１】ａ）第 ７表に示すように７日目に培養物から細胞を採取し、それを３つの平底ウェルに ０．２ｘＱ／ウエルで加えた。採取前に得られた培養物を［’Ｈ］−チミジンで １８時間標識した。

これら得られた結果により、Ｔｈクローンを活性化し、増殖する上で、供給細胞 としてＭＮＣおよびＬＣＬを共に抗原と一緒に使用する実行可能性が確認された 。Ｔｈ細胞の増殖程度は、１０４がらＩＱ’ＭＮｃ／ウェルの範囲でＭ　Ｎ　Ｃ ｆｆ１ｍの濃度に比例するが、ＬＣｌ、２１１″の濃度とは比例しない。ＬＣＬ とクローン化Ｔｈ細胞との最適の比率は、約１：１から３：１の範囲である。

抗原提示セルライン５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−４３　［アクセスコード：ＩＶＩ−１０ １２２コ、および５Ｐ−ＣＮ／Ｔ５−４３　［アクセスコード：　ＩＶＩ−１０ １２３コの試料は、ドラフトＰＴＯデポジット・ポリシー・フォー・バイオロジ カル・マテリアルズ（Ｄｒａｆｔ　ＰＴＯＤｅｐｏｓｉｔ　Ｐｏ１ｉｃｙ　ｆｏ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）に基づいてイン・ビトロ・イ ンターナショナル（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ＋、リンチカ ム。

ＭＤ）にも寄託されている［Ｂ１１Ａ　ＰＴＣＪ、　３２．９０（１９８６ル。

これらの寄託されたセルラインの培養物は、本出願に基づく特許が発行された時 点で一般に入手可能となる。寄託物の入手が、米国特許局で許可された特許権の 毀損となる、本発明を実施する実施許諾の権能を有するものでないことは理解さ れるであろう。

本発明を説明するために、ある特定の代表的な態様を説明してきたが、当業者に はこれらの変法が本発明の要旨および範囲を逸脱しない限り可能であることは理 解されるであろう。

本発明者らは、ここに、本研究についてｐチルドレンズ・ホスピタル（Ｃｈｉ］ ｄｒｅｎ’　ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、セント・ボール、ミネソタ）の惜しみない ご支援と激励に心から感謝するものである。

国際調査報告 ｍ−枠−１静−―−ｍ、　ｐ（：’：　７ｇ５８Ｂ１０Ｏ３Ｂ３

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の製造方法であって、 （ａ）ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞、およびオートロガスな非増殖性 の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集団をドナー哺乳動物 の血液から単離する工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、該抗原に特異的なヘル パーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な量の該ウイルス抗原と混合する工程；（ ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ細胞を増殖 させる工程；および （ｄ）クローンした抗原特異的なヘルパーＴ細胞の増殖に有効な量の、該ウイル ス抗原、並びに（ｉ）オートロガスなＭＮＣ、アロジェネイックなＭＮＣまたは これらの混合物、および（ｉｌ）オートロガスなリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）、 アロジェネイックなＬＣＬまたはこれらの混合物の混合物からなる非増殖性の抗 原提示細胞の存在下に、該抗原特異的なヘルパーＴ細胞をクローン増殖させて均 質な集団を得る工程：ここで、ＬＣＬはＭＮＣと協同してヘルパーＴ細胞の増殖 速度を増加させるに有効な量で存在する；を包含することを特徴とする方法。
2. ２．ヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な追加量のウイルス抗原およびオ ートロガスな非増殖性のＡＰＣを工程（ｃ）の期間中に加えて該ヘルパーＴ細胞 の増殖性をさらに高める請求項１記載の方法。
3. ３．工程（ｄ）において非増殖性ＡＰＣが、抗原特異的なヘルパーＴ細胞の増殖 に有効な（ｉ）オートロガスなＭＮＣ；および（ｉｉ）オートロガスなＬＣＬの 混合物からなり、該ＬＣＬが、ＭＮＣと協同してヘルパーＴ細胞の増殖速度を増 加させるに有効な量で存在している請求項１記載の方法。
4. ４．ＬＣＬがウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインから導かれるもの である請求項１記載の方法。
5. ５．ウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインがエプスタイン−バーウイ ルス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様セルラインである請求項４記載の方 法。
6. ６．ウイルス抗原がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原である請求項１ 記載の方法。
7. ７．ＨＣＭＶ抗原がウイルスの構造タンパクである請求項６記載の方法。
8. ８．ＨＣＭＶ抗原がウイルスのエンベロープ分画中に存在するものである請求項 ７記載の方法。
9. ９．ＨＣＭＶ抗原がウイルス表面に存在するグリコペプチド複合体、またはそれ から導かれるウイルス性グリコペプチドからなる請求項７記載の方法。
10. １０．ＨＣＭＶ抗原がウイルスの表面に存在する約９３ＫＤの免疫原性グリコペ プチドまたは約５０−５２ＫＤの免疫原性グリコペプチドである請求項９記載の 方法。
11. １１．ＨＣＭＶ抗原が約６４ｋＤのマトリックスタンパク質である請求項６記載 の方法。
12. １２．工程（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が、ヘルパーＴ細胞の増殖速度を増加さ せるに有効な量の、ウイルス抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在下で行わ れる請求項１記載の方法。
13. １３．モノクローナル抗体がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異 的なものである請求項１２記載の方法。
14. １４．モノクローナル抗体がウイルスの表面に存在する分子量約９３ｋＤの免疫 原性グリコペプチドまたは分子量約５０−５２ｋＤの免疫原性グリコペプチドに 特異的なものである請求項１３記載の方法。
15. １５．モノクローナル抗体がハイプリドーマＩＶＩ−１０１１７、ＩＶＩ−１０ １１８またはＩＶＩ−１０１１９から産生されるものである請求項１４記載の方 法。
16. １６．工程（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が有効量のインターロイキン−２（ＩＬ −２）の存在下で行われる請求項１記載の方法。
17. １７．ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の製造方法であって 、 （ａ）ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞およびオートロガスな非増殖性の 抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集団をドナー哺乳動物の 血液から単離する工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、該抗原に特異的なヘルパ ーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な量の、該ウイルス抗原および該ウイルス抗 原に特異的なモノクローナル抗体と混合する工程；（ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存 性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ細胞を増殖させる工程；および （ｄ）クローンした抗原特異的なヘルパーＴ細胞の増殖に有効な量の、非増殖性 のオートロガスな抗原提示細胞、非増殖性のアロジェネイックな抗原提示細胞ま たはこれらの混合物；ウイルス抗原；および該ウイルス抗原に特異的なモノクロ ーナル抗体の存在下に、該抗原特異的なヘルパーＴ細胞をクローン増殖させて均 質な集団を得る工程； を包含することを特徴とする方法。
18. １８．ウイルス抗原がＨＣＭＶ抗原である請求項１７記載の方法。
19. １９．工程（ｄ）においてオートロガスな非増殖性ＡＰＣが非増殖性のＭＮＣを 含有している請求項１７記載の方法。
20. ２０．工程（ｄ）においてオートロガスなＡＰＣまたはアロジェネイックなＡＰ Ｃが、非増殖性ＭＮＣによって引き起こされる以上にヘルパーＴ細胞の増殖速度 を増加させるに有効な量で非増殖性ＬＣＬをさらに含有している請求項１９記載 の方法。
21. ２１．ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の構造タンパク質に存在する抗原 に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の製造方法であって、 （ａ）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異性を有するヘルパーＴ 細胞および非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集 団をドナー哺乳動物の血液から単離する工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、該 ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の増殖を 引き起こすに有効な量の該ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原と混合す る工程；（ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ 細胞を増殖させる工程：および （ｄ）増殖に有効な量の該ＨＣＭＶ抗原、該ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭ Ｖ）抗原に特異的なモノクローナル抗体、並びにＸ線照射したオートロガスなＭ ＮＣ、Ｘ線照射したエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換のリンパ芽 球様セルライン（ＬＣＬ）およびこれらの混合物からなる群から選ばれるオート ロガスな抗原提示細胞の存在下に、該抗原特異的なヘルパーＴ細胞をクローン増 殖させて均質な集団を得る工程； を包含することを特徴とする方法。
22. ２２．ヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な追加量のウイルス抗原、該ウ イルス抗原に特異的なモノクローナル抗体、およびオートロガスな非増殖性のＡ ＰＣを工程（ｃ）の期間中に加えて該ヘルパーＴ細胞の増殖性をさらに高める請 求項２１記載の方法。
23. ２３．工程（ｂ）、（ｏ）または（ｄ）が有効量のインターロイキン−２（ＩＬ −２）の存在下で行われる請求項２１記載の方法。
24. ２４．ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の増殖方法であって 、ヘルパーＴ細胞の均質な集団を、該ヘルパーＴ細胞集団の増殖を引き起こすに 有効な量の、ウイルス抗原、並びに（ｉ）オートロガスまたはアロジェネイック なウイルス−形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）および（ｉｉ）オートロ ガスまたはアロジェネイックな単核細胞（ＭＮＣ）を含有している非増殖性の抗 原提示細胞（ＡＰＣ）の混合物と混合すること、およびＬＣＬがＭＮＣと協同し てヘルパーＴ細胞の増殖速度を増加させるに有効な量で存在していることを特徴 とする方法。
25. ２５．ＬＣＬとＭＮＣの比が少なくとも約１：１−１０である請求項２４記載の 方法。
26. ２６．ウイルス抗原がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原である請求項 ２５記載の方法。
27. ２７．ヘルパーＴ細胞集団を、該ヘルパーＴ細胞集団の増殖速度を増加させるに 有効な量の、抗原に特異的なモノクローナル抗体と混合することをさらに包含す る請求項２４記載の方法。
28. ２８．ヘルパーＴ細胞集団を、該ヘルパーＴ細胞集団の増殖速度を増加させるに 有効な量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）と混合することをさらに包含する 請求項２４記載の方法。
29. ２９．ヘルパーＴ細胞とＬＣしの比が約１：１−３である請求項２４記載の方法 。
30. ３０．ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異的なＴ細胞毒性細胞の 均質な集団の製造方法であって、（ａ）ＨＣＭＶウイルス抗原に特異的なＴ細胞 毒性細胞を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集団をドナー哺乳動物の血液から単離す る工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、（ｉ）オートロガスな非増殖性の抗原提 示細胞（ＡＰＣ）、（ｉｉ）ＨＣＭＶ感染させたオートロガスなフィブロプラス トまたは全ＨＣＭＶ抗原、および（ｉｉｉ）インターロイキン−２（ＩＬ−２） の、該ＡＰＣによって発現されるＨＣＭＶ抗原に特異的なＴ細胞毒性細胞の増殖 を引き起こすに有効な量と混合する工程； （ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ細胞を増 殖させる工程；および （ｄ）クローンした抗原特異的なＴ細胞毒性細胞の増殖に有効な量の、（ｉ）Ｈ ＣＭＶ感染させた非増殖性のオートロガスな抗原提示細胞、ＨＣＭＶ感染させた 非増殖性のアロジェネイックな抗原提示細胞またはこれらの混合物、（ｉｉ）Ｉ Ｌ−２、および（ｉｉｉ）オートロガスなＨＣＭＶ感染させたフィブロプラスト または全ＨＣＭＶウイルス抗原の存在下に、該抗原特異的なＴ細胞毒性細胞をク ローン増殖させて均質な集団を得る工程； を包含することを特徴とする方法。
31. ３１．ドナー哺乳動物がヒトである請求項３０記載の方法。
32. ３２．Ｔ細胞毒性細胞の増殖を引き起こすに有効な追加量の、ウイルス抗原、Ｉ Ｌ−２およびオートロガスな非増殖性のＡＰＣを工程（ｃ）の期間中に加えて該 Ｔ細胞毒性細胞の増殖をさらに高める請求項３０記載の方法。
33. ３３．工程（ｂ）においてＭＮＣ集団がＨＣＭＶ感染させたオートロガスなフィ ブロプラストと混合される請求項３１記載の方法。
34. ３４．工程（ｄ）において抗原提示細胞が、オートロガスな単核の抗原提示細胞 と協同してＴ細胞毒性細胞の増殖速度を増加させるに有効な量で、連続オートロ ガスＭＮＣラインから導かれる非増殖性ＭＮＣをさらに含有している請求項３３ 記載の方法。
35. ３５．ＭＮＣラインがウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインからなる 請求項３４記載の方法。
36. ３６．ウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインがエプスタイン−バーウ イルス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様セルラインからなる請求項３５記 載の方法。
37. ３７．工程（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が、Ｔ細胞毒性細胞の増殖速度を増加さ せるに有効な量の、ＨＣＭＶ抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在下で行わ れる請求項３０記載の方法。
38. ３８．病原体関連抗原に特異的なＴ細胞毒性細胞の均質な集団の増殖方法であっ て、Ｔ細胞毒性細胞の均質な集団を、該Ｔ細胞毒性細胞集団の増殖を引き起こす に有効な量の、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および非増殖性の抗原提示細 胞（ＡＰＣ）の混合物と混合すること、およびＡＰＣの混合物が該抗原を発現す るアロジェネイックな単核細胞（ＭＮＣ）およびアロジェネイックなウイルス− 形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を含有していることを特徴とする方法 。
39. ３９．抗原がウイルス抗原である請求項３８記載の方法。
40. ４０．ウイルス抗原がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原である請求項 ３９記載の方法。
41. ４１．Ｔ細胞毒性細胞集団を、該細胞集団の増殖速度を増加させるに有効な量の 、該抗原に特異的なモノクローナル抗体と混合することをさらに包含する請求項 ３８記載の方法。
42. ４２．非経口投与したときに病理学的標的抗原に対する被投与哺乳動物の免疫応 答を増加させるに有効な量の、Ｔｈ細胞またはＴｃ細胞を含む該病理学的標的抗 原に対して抗原特異的なＴリンパ球の、被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ− 適合化した均質な集団を含有する薬学的単位投与剤。
43. ４３．抗原特異的なＴリンパ球の複数の均質な集団の混合物を含有している薬学 的単位投与剤であって；該混合物がＴｈ細胞、Ｔｃ細胞またはこれらの混合物か らなり；それぞれの集団が病理学的標的抗原に対して特異的であり；複数のＴリ ンパ球集団の少なくとも１つが被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ−適合化さ れており；そして、非経口投与したときに混合物が、少なくとも１つの病理学的 標的抗原に対する被投与哺乳動物の免疫応答を増加させるに有効である投与剤。
44. ４４．複数の別々に包装した、Ｔｈ細胞またはＴｃ細胞を含む抗原特異的なＴリ ンパ球の均質な集団からなる薬学的単位投与剤であって、それぞれの集団が病理 学的標的抗原に特異的なＴリンパ球を含有しており；Ｔリンパ球集団の非経口投 与時にそれぞれの集団が、病理学的標的抗原に対するＭＨＣ−適合化した被投与 哺乳動物の免疫応答を増加させるに有効であり；そして、集団の少なくとも１つ が被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ−適合化されている投与剤。
45. ４５．非経口投与したときに少なくとも１つの病理学的標的抗原に対する被投与 哺乳動物の免疫応答を増加させるに有効な量の、Ｔｈ細胞、Ｔｃ細胞またはこれ らの混合物を含む抗原特異的なＴリンパ球の不均質な集団を含有する薬学的単位 投与剤であって、該Ｔリンパ球集団の少なくとも一部が被投与哺乳動物について ＭＨＣ　ＬＡ−適合化されている投与剤。
46. ４６．それぞれのＴリンパ球集団が病理学的標的抗原に対して抗原特異的であり 、少なくとも１つのＴリンパ球集団が被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ−適 合化されている、Ｔｈ細胞またはＴｃ細胞を含む抗原特異的なＴリンパ球の複数 の均質な集団を、薬学的に許容しうる液体の担体と混合することからなる方法に よって製造される薬学的単位投与剤。
47. ４７．複数のＴリンパ球集団が、特定の病理学的標的に関連する複数の抗原に対 して抗原特異性を含有している請求項４４、４５または４６のいずれかに記載の 薬学的単位投与剤。 ４８，複数のＴリンパ球集団が、複数のＨＣＭＶ関連抗原に対して抗原特異性を 含有している請求項４４、４５または４６のいずれかに記載の薬学的単位投与剤 。