JPH08511808A - 多発性硬化症を伴う細胞毒性因子及びその検出並びにその定量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト及び動物のアストログリアに対して、それらの中間線維のネットワークの細胞形態学的解体及び／またはそれらの中間線維のタンパク質の分解及び／または特に枯死による細胞死をもたらす毒性活性を持つことを特徴とする単離したまたは精製したグリア毒性因子。

Description

【発明の詳細な説明】 多発性硬化症を伴う細胞毒性因子及びその検出並びにその定量 本発明は、グリア細胞、特にアストログリアに対する細胞毒性活性に特徴を持 つ多発性硬化症を伴う細胞毒性因子に関し、また、特に多発性硬化症にかかった 患者の生物学的液体中で、この疾患を検出及びモニターする生物学的試験におい て、この細胞毒活性を発現させることに関する。 グリア細胞（アストログリア、オリゴデンドログリア、小グリア細胞）は、神 経系の種々の疾患における病理学的過程の第１又は第２の標的である。それらの 疾患は、特にヒトの白質脳炎、白質萎縮症、脳障害のいくつかの形態、ニューロ ンの複雑化を伴うアストログリア性グリオシスを付随した筋萎縮性外側硬化症、 そして最後に、多発性硬化症やシルダー病(Schilder's disease)といった炎症性 の疾患である。 多発性硬化症（ＭＳ）は、ヒトの中枢神経系の慢性的疾患であり、緩解及び再 燃の相を繰り返して、あるいは安定した進行に従って進展し、その解剖病理学的 特徴は、脳及び脊髄の白質に明確に境界された脱随の斑が形成されることである （１）。組織学的レベルでは、これらの斑は、病変過程の初期段階において、こ の髄鞘形成を負うべきグリア細胞、オリゴデンドログリアの複雑化を伴う軸索周 囲のミエリンの分解を表す（２）。小グリア細胞（中枢神経系に内在する組織マ クロファージ）及び、おそらく、浸潤した血液単球を含む炎症性マクロファージ の活性化は、この脱髄過程に伴うものであり、髄鞘形成層の分解に貢献する（３ ）。脱髄斑の中心部においては、グリア細胞の相対的涸渇が見られるが、周辺部 においては、アストログリアの増殖、即ちアストログリア性グリオシスが進行し 、後の段階では、脱髄された斑を侵食して、古い病変部位に見られるような繊維 状のまたはグリア性(gliotic)斑を形成することができる（１）。これらの硬化 性構造が、疾患に与えられた多発性”硬化症”という名称の由来である（４）。 これらの斑の他の特徴は、ほとんどの場合、それらが周囲に現れて進行する血 管要素を伴うことである（５、１）。組織学的レベルでは、毛細管内皮からなる 血液−脳障壁（ＢＢＢ）の有害な変化が通常その中に観察される（６）。実際に は、毛細管構造の血管内皮は、中枢神経系において通常は衝頭接合で結合される が、脈絡叢を伴う有窓毛細管、脳脊髄液を提供する脳室周囲構造は例外である（ ７）。このＢＢＢの変化は、内皮細胞の分割、及び、血漿流体及び血液起源の細 胞の神経グリア実質内への制御できない流入によって現れるが、これらの変化は 、試験患者へのガドリニウム溶液の静脈注射を伴った磁気共鳴画像法（ＭＲＩ） における”活性な”斑として可視化できる。ガドリニウムは、血漿流体で得られ る磁気共鳴信号のコントラストを明瞭にし、血漿の神経実質への異常な流入とそ れに伴う水腫を検出することを可能にする。斑の病変−誘発活性と同じレベルの この水腫との相関関係、及び、この水腫の発現及び吸収と疾患の慢性的増悪の後 退との相関関係を示すことが可能とされている（８）。 大脳の毛細管内皮の衝頭接合構造の維持における、従って、ＢＢＢの内皮にお ける決定的な因子は、アストログリアの足として知られたアストログリアにおけ る細胞質プロセスが根本的に存在することである（６）。おそらく、これらのア ストロサイトの足が、ＢＢＢの材料表現である毛細管内皮障壁の凝集力を与える （閉鎖帯タイプの）漏れのない接合構造の形成を促し、維持することを可能にす る。現在、多くの病理学的モデルが、アストログリアの足の涸渇を伴うＢＢＢに おける逆変化を報告している（９、１０）。 さらに、ＭＳの増悪過程において、ＢＢＢの逆変化は、血液循環から生ずるリ ンパ系細胞の集注を通して、それに伴う”自由”にされた炎症性の反応を増幅す るのに貢献する（１１）。 免疫細胞を伴う炎症の貢献は、ＭＳにおいてはかなりのものであり、特にリン パ球及び自己反応性免疫を通して病変過程に参加する（１２、１３）。しかし、 実験的アレルギー脳脊髄炎の自己免疫動物モデルとは逆に、循環血液のリンパ系 細胞によるＢＢＢの複雑化及び神経実質の浸潤が、神経的病変過程を開始させ（ １４）、ＭＳにおいては、神経実質における局所的マクロファージ反応を伴う初 期の病変過程が、循環血液のリンパ系細胞による組織の浸潤に先行するように見 える（１５、３）。よって、リンパ系細胞、特にリンパ球は、新しい斑にプレポ ゲイチブ(prerogative)でないことが明らかになった（１６）。さらに、リンパ 系の浸潤の密度は、脈管周囲の領域及び脱髄の活性斑の周囲において最も特別に プロナウンス(pronounce)される。 ＭＳの発生における最初の刺激は、ＭＳの病因学に関する議論の中心をなす（ １７）。また、ウイルス（１８）、細菌（１９、２０）、自己免疫（２１、１３ ）、毒素（２２）、または遺伝子（２３、２４）の仮説について議論が進められ てきた。実際に、遺伝子的な前処理を主要な病原試薬の作用に結合することは、 デバステーチング(devastating)炎症及び自己免疫過程の先鞭をつけることがわ かった（２５）。 この疾患に関して蓄積されたバラバラのデータの大多数に首尾一貫した説明を 開始し与えることのできる決定的要因を同定することをデート(date)することが 可能でなくても、結果の異なった連続が、脱髄及びＭＳにおける機能的なニュー ロンの複雑化を説明する。 細菌、ウイルス、または内因性のレトロウイルスを起源とするいくつかの分子 が、いわゆる超抗原性(superantigenic properties)を持つことが知られている （２６、２７）。ある種の”Ｔ”レセプターのＶβ領域に結合させることによる 、異なった抗原に特異的な、Ｔリンパ球の直接刺激のこれらの特別な性質は、そ のような分子が、ＭＳの病因病理学的過程と親密に関連していることを示唆して いる。今、これらの超抗原のＴ細胞に対する特徴的な影響は、ある条件下におけ るプログラムされた細胞死または枯死の早熟の誘発である（２９）。超抗原は、 抗原を表現している細胞表面においてＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するという性 質も有する（２７）。よって、アストログリアが、特に、ガンマ−インターフェ ロンや腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）といったある種の炎症前サイ トカインに応答して、それらの血漿膜においてＨＬＡクラスＩＩ抗原を表現する 能力を持つことを再考することができる。 さらに、例えば、神経系の発達と結びついた通常の枯死過程（３１）とは反対 に、多くの”間の悪い(untimely)”枯死過程が、ウイルス感染の状況（３２）ま たはセル・レセプター刺激の状況（３３）において、超抗原無しで起こりうる。 枯死が、ＴＮＦ−アルファ膜レセプターのインビトロでの剌激によって誘発され ることは興味深いことであるが、そのような現象が神経系で、そしてアストログ リアのフォーチオリ(fortiori)で研究されたことはない。 従って、いくつかのサイトカインが病理学的過程をトリガーし、特にマクロフ ァージによって生成され、それらはオリゴデンドログリアに対して細胞毒性を有 する（３４）。ＴＮＦ−アルファ、及び、インターロイキン−１−アルファ、イ ンターロイキン−１−ベータ、インターロイキン−２、インターロイキン−６、 及びガンマインターフェロンは、原理的にはアストログリアに対する細胞毒性を 持たず、むしろアストログリアの増殖を誘発することに注意しなければならない （３５）。しかし、アストログリア自身は、ＴＮＦ−アルファの分泌に最初にお いて剌激を受けることができる。これは、例えば、リポポリサッカライド細胞毒 素やカルシウム・イオノホアに対する応答に観察することができる（３６）。よ って、オリゴデンドログリアの複雑化、即ちミエリン層の破壊は、アストログリ アによって生成されたＴＮＦ−アルファを介して間接的に起こりうる。アストロ グリアによるそのようなサイトカインの生成を誘発するすべての分子は、その後 者（増殖、分化または細胞病理学的効果）への特異的な影響に関わらず、脱髄す る能力を有している。ＴＮＦ−アルファは、オリゴデンドログリアの細胞毒性メ カニズムを誘発するが、その最初の影響はミエリン構造の膨潤として現れ、イオ ンチャンネルに媒介される活動を示唆している（３４）。さらに、相関関係は、 インビボでのＴＮＦ−アルファの生成とＭＳの悪化(exacerbation)との間に存在 するように見える。しかし、ＭＳに罹患した患者でのそのようなＴＮＦ−アルフ ァの生成におけるアストログリアの役割は知られていない（３７）。 ともかく、アストログリアはＴＮＦ−アルファを生成でき、標的抗原と免疫応 答性細胞細胞に対するＨＬＡクラスＩＩ抗原とを共存させることができるが、そ れらは、それら自身が細胞障害及び／または炎症過程によって補充され、それら は、実際に、ＭＳを特徴づける脱髄病変過程において観察されるような免疫病理 学的相互作用の中枢点にある。 脱髄斑の形成、そしてアストログリアのグリオーシスを促す病理学的過程の一 部を演ずることのできる他のタイプの分子は、いわゆる熱ショックタンパク質（ ＨＳＰ）即ちストレスタンパク質からなる。これらのタンパク質は、比較的保守 的な系統分類上の族に属し、原核生物及びより高等な脊椎動物の両方に見いだ せる（３８）。それらの合成は、真核生物の細胞において、種々のストレス、特 に感染または熱ストレスによって誘発される。また、それらの種間の抗原類似性 が、ヒトにおいて、ミコバクテリア結核のようなＨＳＰを有する感染性細菌によ って誘発することができる（３９）。 超抗原性を持つことができるか、熱ショックタンパク質であることのできる細 菌性抗原は、ＭＳの悪化の誘発に巻き込まれるが、それらが病原論的または病因 学的薬剤のチャンス(chance)補因子であるか、あるいは、同じ病原性の原因とな る共通の性質を持つ病原体であるかをデートすることを明確に確立していない（ ４０、４２）。 このタイプのメカニズムは、一方では、免疫応答性細胞が敏感化される外因性 ＨＳＰ（例えば細菌性ＨＳＰ）の存在を含み、他方では、ＨＬＡクラスＩＩ抗原 を表現する細胞表面における（感染体の）内因性ＨＳＰの表現を含んでいる。細 胞ＨＳＰが外因性ＨＳＰと共通のエピトープを持つ場合、それらは、敏感化され たリンパ球によって”感染性”と認識される。ＭＳにおけるそれらの役割は既に 述べた（４２）。そのような分子の”グリア毒性(gliotoxicity)”は、免疫反応 を介して、そしておそらく、アストログリア細胞または小グリア細胞（特異的な 抗原を提供する他のマクロファージグリア細胞）を介して進行するが、この分野 において多くの研究がなされていないことから見ると、グリア細胞に対するいく つかのＨＳＰの際だった細胞障害的影響はわかっていない。 実施されたいくつかの実験が、ＭＳのウイルス病因学のための議論を提供した （特に、４３、４４、４５及びＷＯ−９３／２０１８８、これらの内容を参考文 献として取り入れる）。 上述した実験に従って、本発明者らは、脱髄斑の典型的な形成及びアストログ リアのグリオーシスにおいて病原性の過程を終わらせる効果器となるひとつまた はそれ以上の因子の探求に導かれた。 多発性硬化症の血液単球／マクロファージの培養は、上述の実験を通してウイ ルス仮説の支持に貢献したが、ウイルス薬を含むことを必須としないこの疾患の 病原学におけるマクロファージ細胞の役割の他の態様も考慮しなければならない 。この関係において仮説は発展し実証されたが、それに従うと、マクログリア細 胞 （アストログリア、オリゴデンドログリア）に毒性を持つひとつまたはそれ以上 の因子が、ＭＳに罹患した患者の単球によって生成される。 問題の分子状因子は知られていないが、免疫または炎症性細胞から、あるいは ウイルスまたは細菌薬から発生する毒性因子、さもなくば、周囲の細胞において これら後者から誘発される毒性因子は、急性または慢性的炎症性反応において終 結する過程を開始させることができる。 可能なレトロウイルス起源のＭＳ（４６）について、及び、その病原性に対す る細菌薬の可能な貢献（４０、４７）についての二重の不明確性が、研究者によ って、ＭＳに罹患した患者のマクログリア細胞に対して毒性を持つ因子の彼らの 実験において確信された。実際には、グリア細胞は、ＭＳの神経病理学的過程の 主要な標的を構成するものである。 Ａ．Ｎ．デイビソン(Davison)等（４８）は、ミエリン合成に含まれる細胞で あるオリゴデンドログリアの活性、特に、ミエリン合成阻害剤として参加できる 因子を研究した。しかしこれらの実験は、排他的にオリゴデンドログリアに限定 され、上記した病原学的過程を説明するように発展されなかった。 よって、本発明の主題は、単離または精製した状態のグリア毒性因子(gliotox ic factor)であり、それはヒト及び動物のアストログリア細胞に対して毒性活性 を持ち、その活性は、それらの中間線維(intermediate filaments)のネットワー クの細胞形態学的解体及び／またはそれらの中間線維のタンパク質の分解及び／ または特に枯死による細胞死をもたらす。 グリア毒性因子は、特別な分子、またはグリア細胞に対する細胞毒性効果によ って表すことのできる生物学的活性を示すと定義されることのできる分子の組に よって表現される因子を意味すると理解される。 本発明者らは、上記の因子の毒性活性が、少なくともひとつのグロブラー・グ リコプロテイン(globular glycoprotein)を伴うことを明らかにした。 本発明では、グリコプロテインとは、共有結合で結合した少なくともひとつの 炭化水素基を持つタンパク質を意味すると理解される。 さらに本発明では、それらは、イオン交換樹脂上に次いで、除去により分離す るためのカラム上で連続的に処理した後、主に約１７ｋＤの見かけの分子量を中 心とする軽いフラクションと、より少ない約２１ｋＤの見かけの分子量を中心と する重いフラクションとからなり、少なくとも前記軽いフラクションが、非変性 条件下において、プロナーゼ、トリプシンまたはプロテイナーゼＫの加水分解作 用に対して耐性があり、前記２つのフラクションの各々が、レクチン、特にコン カナバリンＡに対して強い親和性を示すことを証明するグリア毒性因子によって 特徴づけられる。 本発明のグリア毒性因子は、診断のみならず、ＭＳの予防及び治療においても 多く用いられる。 本発明によれば、グリア毒性因子は以下の過程からなる方法を用いて得ること ができる。 ・例えば、臨床的に活性な多発性硬化症の患者からの生物学的サンプルを出発 材料とし、 ・前記サンプルをイオン交換樹脂に次いで、除去により分離するためのカラム で連続的に処理することにより、主に約１７ｋＤの見かけの分子量を中心とする 軽いフラクションと、より少ない約２１ｋＤの見かけの分子量を中心とする重い フラクションとからなり、前記フラクションの各々が、グリア毒性活性を有し、 さらに、上述した耐性及び／または親和性を持つ。 本発明での生物学的サンプルは、特に、流体サンプル、組織または組織フラグ メント、粘膜、器官または器官フラグメントタイプ、または上記のサンプルのひ とつを用いて得られる上澄みを意味するものと解される。 本発明の他の主題は、生物学的サンプル中における本発明で定義されるグリア 毒性因子の存在及び／またはその量を検出することからなる多発性硬化症等の活 性を検出及び／またはモニターする方法及び／または病理学を予知する方法であ る。 好ましくは、このグリア毒性因子を含む生物学的サンプルは、前処理を施し、 本発明のグリア毒性因子の偽性で非特異的な細胞毒性活性を生じがちな不純物を 取り除く。前記サンプルの前処理では、以下の処理の少なくともひとつが実施さ れる。 ・前記サンプルをプロテインＡに接触させる。 ・前記サンプルをイオン交換樹脂に接触させる。 ・前記サンプルをレクチン、特にコンカナバリンＡに接触させる。 本発明は、前記生物学的サンプルを、アストログリア、特に不朽化したアスト ログリアを含む適当な培養媒質中でインキュベートして、それらを培養可能とし 、死亡したアストログリア及び／または生きているアストログリアを検出及び／ または定量することからなる生物学的サンプル中での上記のグリア毒性因子の毒 性活性を検出及び／または定量する方法にも関する。 死亡したアストログリア及び／または生きているアストログリアを検出及び／ または定量するために、異なる検定技術、特に以下のものを採用することができ る。 ＊各々、カルセイン−ＡＭ(calcein-AM)及びエチジウム・ホモダイマー(ethid ium homodimer)を用いた比色検定法。 ＊メチルテトラゾリウム・ブロミド(methyltetrazolium bromide)を用いた比 色検定法。 ＊⁵¹Ｃｒを用いた放射活性検定法。 本発明による生物学的サンプル中でのグリア毒性因子の毒性活性を検出及び／ または定量する他の方法は、前記生物学的サンプルを、アストログリア、特に不 朽化したアストログリアを含む適当な培養媒質中でインキュベートして、それら を培養可能とする過程、及び、アストログリアのＤＮＡの切断及び／または中間 線維のネットワークの細胞形態学的解体及び／または前記中間線維のタンパク質 の分解を検出及び／または定量する過程からなる。 本発明の生物学的サンプル中でのグリア毒性因子の存在を検知する方法におい て、後者の性質は、前記因子を、レクチン、特にコンカナバリンＡで捕捉する過 程、及び／または前記因子の前記レクチンに対する親和性に基づいた検出過程を 行うことによって利用される。 また、本発明の最後の主題は、天然または合成のまたは遺伝子工学で得た本発 明のグリア毒性因子の一部または全部、及び／または前記因子に特異的なリガン ドからなる診断及び／または治療及び／または予防用組成物である。 より一般的には、本発明は、例えば、本発明の因子と結合することのできる支 持体または基質を持つＥＬＩＳＡ技術を用いた生物学的試験を実施するための装 置に応用できる。 試験、実施例、表及び添付図面を通して、ＭＳの診断と述べたときは、ポーサ ー(Poser)（４９）の基準によって定義された明確なＭＳの診断であると理解さ れる。 添付した図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むことにより、本発明のよ りよい理解が進むであろう。 図１は、位相差光顕微鏡で観察したラットの胚の脳外植片の培養における細胞 毒性効果を示す。 図２及び３は、間接的免疫蛍光検査法を用いフルオレセインでラベルした二次 的抗体によって放出される信号を検出するために好適な波長での蛍光顕微鏡を用 いた免疫細胞学的分析により、胚の外植片の培地に存在する異なるタイプの細胞 に対して観察された細胞毒性効果を示す。 図４は、多発性硬化症の単球／マクロファージの少数の培養において逆トラン スクリプターゼと細胞毒の活性が一致することを示す。逆トランスクリプターゼ の活性は、培養の日数の関数としてｄｐｍ（１分当たりの崩壊数）で与えた。破 線でプロットした曲線は、強い進行性の慢性ＭＳの病態を呈する患者からの単球 ／マクロファージ培養を表し、黒色菱形記号を付した実線は、軽減しつつあるＭ Ｓの病態を呈する患者の急性悪化における患者からの単球／マクロファージ培養 を表し、白丸記号を付した実線は、軽減しつつあるＭＳの病体を呈する患者の軽 減状態での患者からの単球／マクロファージ培養を表す。毒性活性は、１から４ までのプラス記号の数（非常に弱いから非常に強いまでの範囲の正の細胞毒性効 果）またはマイナス記号（細胞毒性無し）で表され、それに対して、曲線状にプ ロットされた点は、対応する上澄みにおける逆トランスクリプターゼ活性を表し ている。 図５は、ＭＳに罹患した患者及び対照を起源とする培養上澄み液からの、細胞 毒性活性の発現の速度論(kinetics)を、培養日数の関数として示している。グラ フにおいて、実線または破線の３本の線は、ＭＳの３つの異なるケースからの単 球／マクロファージの培養上澄み液におけるグリア毒性の速度論を表し、横軸上 に並んだ点（黒三角、白菱形、及び白長方形）は、他の神経疾患に罹患している ３つの対照からの単球／マクロファージの培養の負の速度論である。 図６は、生きているまたは死んだアストログリア細胞の光学系での可視化を示 している。 図７は、アストログリアに対する細胞毒性に結合した細胞学的効果を示してい る。 図８は、異なる希釈において単球／マクロファージ培養上澄み液と混合した後 の死んだ（図８Ａ）または生きている（図８Ｂ）アストログリア細胞の平均数を 示す。計数した死んだまたは生きている細胞の平均数は、グリア毒性サンプルの 希釈度の関数として、各々のグラフに黒四角で表示した。各平均に対応する信頼 間隔(confidence interval)は、２つの標準偏差による上限及び下限で表した。 図９Ａ及び９Ｂは、多発性硬化症に罹患した患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）のイン ビボ濾過に用いたフィルターから得たグリア毒性フラクションの、各々１次元及 び２次元のアクリルアミドゲル電気泳動を示している。電気泳動に先立って、フ ィルターに吸着した分子を溶離し、イオン交換樹脂を通した。 図１０Ａ及び１０Ｂは、スペローゼ(Superose)１２分離カラム上のｐＨ６．８ の５０ｍＭトリス−塩酸バッファーを用いた、ＤＥＡＥ−セファロース(Sepharo se)樹脂を通した後に得たグリア毒性フラクションの溶離を表している。これら のサンプルは、ＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液から、図１０ＡではＤ６ 、Ｄ９、Ｄ１２及びＤ１６に採取したもの、図１０ＢではＤ６、Ｄ９、Ｄ１３及 びＤ１６に採取したものの混合物である。実線は、２８０ｎｍにおいて感度係数 Ｒ＝１．２でのタンパク質成分の吸収を示し、破線は、後の説明で述べるプロト コールに従う一連のフラクションに対して測定したグリア毒性活性を示す。グリ ア毒性のピークの溶離容量（Ｖｅ）に対応する見かけの分子量は、これらのピー クの頂点に記載した。 図１０Ａでは、溶離は尿素無しで行い、図１０Ｂでは、８Ｍの尿素の存在下で 行った。 図１１は、連続ウエル(well)での１次元のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳 動ゲルを示しており、グリア毒性因子の精製は、原料のＭＳ単球／マクロファー ジ培養上澄み液から始まり、ＤＥＡＥ次いでコンカナバリンＡのカラムを通した 後、事実上サンプルのすべての活性を有している１７と２１ＫＤのタンパク質帯 (band)を単離することで終了する。 図１２及び１３は、予め、ＣｏｎＡ−セファロースカラムからのｐＨ３グリシ ンバッファー中の溶離液中に得られたフラクションの、８Ｍ尿素を含むｐＨ６． ８の５０ｍＭトリス−塩酸を含むバッファー中、スペローズ１２カラムでの溶離 を示す。これらの溶離液は、スペローズ１２で溶離する前に、プロテイナーゼＫ の存在下でインキュベートした。 図１２は、ＭＳグリア毒性培養上澄み液または単球から生じたフラクションを 示す。図１３は、非グリア毒性の対照の培養上澄み液から生じたフラクションを 示す。 各々の場合で、曲線は、検出感度Ｒ＝０．０２を持つペプチド成分の２８０ｎ ｍでの吸収を示している。 １７−ＫＤの標準タンパク質の溶離のレベルを矢印で示した。 図１４は、７２時間のインキュベーションの後の、⁵¹Ｃｒ細胞毒性試験におけ る投薬(dose)−応答効果を示す。ＭＳ単球培養上澄み液から得られた値に対応す るのは点線であり、同じ培養上澄み液からＣｏｎＡで精製したフラクションから 得られた値に対応するのは実線である。 図１５は、７２時間のインキュベーションの後の、メチルテトラゾリウム細胞 毒性試験における投薬−応答効果を示す。ＭＳ単球培養上澄み液に対する３つの 測定から得られた値に対応するのは点線であり、同じ培養上澄み液からＣｏｎＡ で精製したフラクションから得られた値に対応するのは実線である。 第１の実験では、分析すべき生物学的流体として、ＭＳに罹患した患者または 健康な対照または他の神経疾患に罹患した者からの、単球／マクロファージのイ ンビトロ培養上澄み液を採用し、細胞毒性を検出するための基質として、ラット の胚の大脳皮質の外植片のインビトロ培養を採用した。 実施例１：血液単球／マクロファージの培養 培養媒質は、ＰＲＭＩ１６４０（ボエリンガー(Boehringer)）、ペニシリン− ストレプトマイシン（ビオメリオ）、Ｌ−グルタミン（ビオメリオ）、ピルビン 酸ナトリウム（ボエリンガー）、１００×非必須アミノ酸（ボエリンガー）、及 び、周知の血液誘導体によって伝播されうるすべてのウイルスに対してセロネガ ティブな健常ドナーから取ったＡＢヒト血清からなる。 リンパ系細胞は、フィコール(Ficoll)（リンフォプレップ(Lymphoprep)（登録 商標）、フロー(Flow)）勾配での遠心分離によって、血漿及び他の生成された血 液成分から分離した後、７５-ｃｍ²のプリマリア(Primaria)培養フラスコ（ファ ルコン(Falcon)）内で培養した。これらのリンパ系細胞を得るために、５０ｍｌ の血液を静脈穿刺からヘパリン化した滅菌管（ヘパリン・リチウム）に採取した 。血液を採取したら即座に血液とヘパリンとを混合した。また、血液は、ＥＤＴ Ａを含む管に採取してもよい。そのときは、管を即座に実験室に運んで＋４℃の 維持することが重要であり、そこでは、無菌条件下の”バイオハザード(biohaza rd)”の層状のフロー培養フード下で取り扱われる。採取した各サンプルに対し て、１００−１５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０媒質、ペニシリンとストレプトマイ シンとの混合物、４％のＬ−グルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の ボエリンガー（１００×）非必須アミノ酸からなる”ＲＰＭＩ”媒質を調製し、 また、上記”ＲＰＭＩ”媒質を１０ｍｌを含む３本の滅菌した５０-ｍｌのコニ カル底管（ファルコン）、及び、底に２０ｍｌのフィコールを有する４本の滅菌 した５０-ｍｌ管を用意した。これらのヘパリン化した管は、血液をピペットす るために、媒質を含む管内に沈着させるために、及び上記の媒質と徐々に混合す るために開口されている。５ｍｌの”ＲＰＭＩ”媒質を取り、ヘパリン化した管 の壁面をリンスした。このリンスは、管の壁面に積極的に接着した細胞を剥がし 、”ＲＰＭＩ”媒質で希釈された血液を含む管内に沈着させるためにプラスチッ クピペットの末端で軽くこすりながら行い、吸引／排出を繰り返して含有物を混 合させながら行う必要がある。これらの操作は、ヘパリン化した管が清浄になる まで繰り返す。”ＲＰＭＩ”媒質で希釈された血液は、５０-ｍｌ管中のフィコ ール表面に極めて緩やかに（障害なしに）沈着させねばならず、次いで、”ＲＰ ＭＩ”媒質は、上述のように残存した希釈血液をリンスして回収し、フィコール を含む管の表面に注意深く沈着させねばならない。その後、フィコールを撹拌す ることなく、管 を遠心分離器に設置し、水で満たした管でバランスをとって、＋１５℃で２０分 間、１８００ｒｐｍで、遅い減速モードで遠心分離を行った。遠心分離の後、管 を回収し、ピペットを”フィコール／血漿”の上界面の深さまで徐々に挿入し、 壁面から螺旋を描くように、次いで、フィコール表面の一方の側から他方の側へ ”ジグザグ”を描くようにしながら、フィコールの上に位置する白色層を緩やか に吸引した。吸引した媒質を５０-ｍｌ管に入れ、少なくとも３倍容のＲＰＭＩ 媒質で希釈し、管を転倒させることによって緩やかに混合した。これは、無菌条 件下でのストッパーである。次いで、管を＋１５℃で１０分間、１８００ｒｐｍ で、遅い減速モードで遠心分離した。遠心分離後、白色の細胞ペレットが剥がれ ないように注意しながら、これらの管の上澄みを徐々にしかも一様に流すことに よって廃棄した。このペレットを、１０ｍｌの”ＲＰＭＩ”媒質中に、吸引／排 出を繰り返すことによって再懸濁し、その懸濁液を、＋１５℃で１０分間、１８ ００ｒｐｍで、遅い減速モードで遠心分離した。各サンプルに、即ち採取した５ ０ｍｌの血液各々に対して、２つの小型７５-ｃｍ²のエレクトロポジティブ(ele ctro positive)プラスチック培養フラスコ（ファルコン、”ＰＲＩＭＡＲＩＡ” ）、及び、１５％の上述した”ＡＢ”ヒト血清（ＨＳ）を添加した”ＲＰＭＩ” 媒質１０ｍｌを用意した。遠心分離後、上澄みを上記のように取り除き、ペレッ トを、１５％のＨＳを含む”ＲＰＭＩ”媒質５ｍｌ中に緩やかに再懸濁させた。 再懸濁した細胞は、平らでほとんど膨らんでいないフラスコに分配した。この懸 濁液は、各フラスコを平面上で動かすことにより即座に分散させた。遠心分離管 は、１５％のＨＳを含む５ｍｌの”ＲＰＭＩ”媒質でリンスし、その懸濁液も上 述のように２つのフラスコに添加して分散させた。好ましくは、この工程で使用 するすべての媒質は（ウォーターバスで暖めて）３７℃とする。フラスコを閉鎖 し、５％のＣＯ₂を有する３７℃の加湿インキュベータ内に、次の朝まで平らに 保った。翌朝、懸濁液中の細胞を含むすべての上澄みを吸引し、フラスコを４ｍ ｌのＲＰＭＩのみでリンスしたが、非接着の細胞を取り除くために、残った媒質 すべてを吸引する前にフラスコを各洗浄で５分間”浸漬”して放置した。次いで 、フラスコを１５％のＨＳを含む４ｍｌのＲＰＭＩ媒質で満たし、インキュベー ターに戻して、４時間妨害がはいらないように注意した。この工程から先は、接 着過程にあ り、次いで細胞病原学的影響を受けうる細胞が剥がれるのを防止するため、垂直 に配置されたフラスコは、上壁へ向けたジェットによってみたされていなければ ならない。培養を開始してから２４時間後に回収された細胞懸濁液は、＋１５℃ で１０分間、１８００ｒｐｍで、遅い減速モードで遠心分離した。好ましくは、 細胞ペレットは、１０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む仔ウシ血清 中に取り込み、−８０℃即ち液体窒素中で、発育性細胞の保存方法に従って冷凍 する。対応する上澄み液は、細胞の破片を取り除くために３０００ｒｐｍで３０ 分間遠心分離し、上澄み液は、２４時間培養のサンプルとして挙げた部分標本、 即ちＤ１として分類し、冷凍機で８０℃に保存した。インキュベーターで４８時 間おいた後、フラスコを取り出し、上記のように注意深く上澄みを吸引し、細胞 破片を取り除くために３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上澄み液は、３ 日培養のサンプルとして挙げた部分標本、即ちＤ３として分類し、冷凍機で８０ ℃に保存した。フラスコは、即座に５％ＨＳを含むＲＰＭＩ媒質で満たし、イン キュベーターに戻した。この点から先では、培養媒体は５％のＨＳのみを含んで おり、この比率はすべての媒質の再生に用いられる。フラスコ中の媒質は取り出 され、細胞破片無しの媒質の部分標本として、上記のように−８０℃で保存した 。これらは、顕微鏡観察での屈折を起こすフラスコ中の細胞接着が起こらなくな るまで、３または４日おきに５％のＨＳを含む”ＲＰＭＩ”媒質によってと置換 した。 実施例２：ラットの胚の大脳皮質の外植片、及びラットの胚の脊髄の外植片の培 養に対する細胞毒性試験 ラット胚の大脳皮質の外植片の培養は、妊娠したラットから胚の１４日齢で取 り出したラット胚の脳から得た。解剖の後、脳は、”ダルベッコ-ホスフェート バッファー塩水(Dulbecco-Phosphate Buffer Saline)［ラクーナ(lacuna)］”（ Ｄ−ＰＢＳ：ＫＨ₂ＰＯ₄ 0.2g/l,Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1.15g/l,ＮａＣｌ 8g/ l,ＫＣｌ 0.2g/l）で３回、続いてＦ１２媒質（ボエリンガー）でリンスした。 注意深く髄膜を取り除いた後、皮質を単離し、それをハサミを用いてＦ１２媒質 中で粉砕した。引き続き、脊髄外植片を同様の概念に従って調製して培養した。 次い で、容積を３０ｍｌの７．５％の仔ウシ血清及び７．５％のウマ血清を追加した Ｆ１２媒質に調整した。１０分間沈降させた後、上澄みを４０００ｒｐｍで５分 間遠心分離した。得られたペレットを１０ｍｌの完全媒質中で懸濁させた。細胞 は、直径３５ｍｍの滅菌皿（ファルコン）当たり１０⁶細胞の密度で覆い、７． ５％のＣＯ₂下、９５％の湿度で、３７℃に維持した。また、必要な時間におい て培養を固定した後、特に免疫組織化学的研究に、ラブレック(Labtek、登録商 標)タイプの培養キャビティを持つスライドを用いてもよい。培養媒質は３日ご とに換えた。通常は３から７日後に、グリア及び軟髄膜細胞（使用した大脳組織 のサンプルに付着した僅かな軟膜）の基礎をなすローン(lawn)の均衡のとれた構 築を伴って、皮質性ニューロンの良好な分化が得られたとき、培養は、中枢神経 系の細胞に対する細胞毒性試験に用いられる。 試験サンプルは、補体タンパク質及び取り巻くことのあるウイルスを不活性化 するために５６℃で３０分間加熱し、次いで１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離 した。好ましくは、回収した上澄み液は、４０℃で２０容量のＤ−ＰＢＳバッフ ァーで２回透析するが、１回目は２時間で２回目は終夜とする。この試験サンプ ルを部分標本とし、−２０℃で保存した。細胞毒性試験を行うために部分標本を 解かし、設定した希釈度に従って標的細胞の培養媒質と混合し、この混合物をイ ンキュベータに戻した。この例では、標的細胞は、大脳組織の外植片の培地に存 在するすべての細胞とした。 上記の外植片の培養媒質で１／４に希釈し、急性悪化のＭＳに罹患した患者か らの血液単球の培養の３日目から１０日目の間にサンプリングした上澄み液につ いて、これらの条件下で、かなりの細胞毒性効果が観察された。この効果は、希 釈したサンプルを培養媒質に導入してから６時間後から、培地の細胞を検査する のに用いられる光顕微鏡下で観察できる。この効果は、第１にグリア細胞で重大 であり、培地の日常の観察において、それらの全く典型的な形態によって同定さ れる。オリゴデンドログリアが膨潤して丸くなることによって、培養支持体から 剥離してしまうのが観察され、アストログリアにおける細胞質過程のかなりの退 行を伴う空泡形成も見られた。この段階で、培地に存在するニューロンは、比較 的良好に保存され、重大な悪化は示さなかった。また、これらの条件で２４時間 経過後、グリアローンは完全に破壊され、ニューロンは変性し、それらの曲がり 角において培地から剥離した。これらの条件下で４８時間経過後、Ｄ３からＤ１ ２の範囲で上澄みに接触させた培養ウエルには、もはや発育可能な細胞はほとん ど残っていなかった。一方、急性悪化のＭＳからの単球の同じ培地の上澄みの効 果は、Ｄ１、Ｄ１８またはＤ２１でサンプリングしたが、少しの効果しかしめさ ないか、もしくは全く効果を示さなかった。ＭＳに罹患していない僅かな対照か らの血液単球／マクロファージの培養上澄み液は、同じ条件であっても、いかな る細胞毒性も同時に誘発示しなかった。 実施例３：ラット胚の脳の外植片の培養に対する細胞毒性試験 急性悪化のＭＳまたは健常な対照からの単球／マクロファージの培養上澄み液 を、ニューロンの分化の段階まで進行したラット胚の脳外植片の培養媒質で１／ ４に希釈し、次いで上述のように３７℃でインキュベートした。胚の外植片の培 地において、光顕微鏡で観察される上記の細胞毒性効果の一例を図１に示す。写 真Ａは、健常な対照を起源とし、Ｄ６において取り出したサンプルの、４８時間 インキュベートした脳細胞培養を示す。写真Ｂ及びＣは、急性悪化のＭＳからの 単球／マクロファージの同一培地を起源とし、各々Ｄ１８及びＤ６において取り 出したサンプルの２４時間培養した２つの脳細胞培養を示す。写真Ｄは、写真Ｃ と同一の急性悪化のＭＳからの単球／マクロファージの培地を起源とし、Ｄ６に おいて取り出したサンプルの４８時間培養した脳細胞培養を示す。 さらに、胚の外植片の培地に存在する異なる細胞タイプに観察される影響の例 に対する蛍光顕微鏡を用いた免疫細胞学的分析を、添付した図２及び３に示す。 この例では、 急性悪化のＭＳまたは健常な対照からの単球／マクロファージの培養上澄み液 を、ラット胚の脳または脊髄の外植片の培養媒質で１／４に希釈し、上述のよう にラブテック(Labtek)（登録商標）スライド上で培養した。このスライドを必要 な時間に固定し、ＰＢＳで２回洗浄後、アセトンとメタノールの等容量混合物中 で−２０℃において１０分間インキュベートし、次いで、ラベルすべき細胞タイ プに対して特異的な第一の抗体、即ち、ニューロンに対する抗−神経繊維抗体 （ボエリンガー抗−ＮＦ抗体）、アストログリアに対する抗−グリア原線維の酸 タンパク質抗体（ボエリンガー抗−ＧＦＡＰ抗体）、及びオリゴデンドログリア に対する抗−ミエリン塩基性タンパク質抗体（ボエリンガー抗−ＭＢＰ抗体）の 適当な希釈液とともに、＋４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＳ中で１０分間 ２回洗浄し、蒸留水で５分間洗浄した後、スライドを室温で１時間、第１の抗体 を生成するのに用いられる種のイムノグロブリンに特異的な第２の抗体の適当な 希釈液中でインキュベートし、蛍光色素を結合させた。上記のようにスライドを 洗浄した後、適当な波長における蛍光顕微鏡での検査のために装着した。図２に おいて、写真Ａ及びＢは、４０倍に拡大したものであるが、Ｄ９で取り出し、急 性悪化のＭＳからの単球／マクロファージの培養上澄み液と、各々１２及び４８ 時間インキュベートした脊髄外植片の抗−神経繊維抗体でのラベル化を示す。図 ２において、写真Ｃ及びＤは、４０倍に拡大したものであるが、Ｄ９で取り出し た、急性悪化のＭＳからの単球／マクロファージの培養上澄み液と２４時間イン キュベートした脊髄外植片の、各々、抗−神経繊維抗体及び抗−ＧＦＡＰ抗体で ラベル化したものを示す。図３において、写真Ａ及びＢは、４０倍に拡大したも のであるが、Ｄ６で取り出した、急性悪化のＭＳからの単球／マクロファージの 培養上澄み液と２４時間インキュベートした脊髄外植片の、各々、抗−ＭＢＰ抗 体及び抗−ＧＦＡＰ抗体でラベル化したものを示す。 従って、中枢神経系の細胞のこれらの一次的培養における最も早く最も大きな 細胞毒性効果は、明らかにマクログリア細胞、即ちアストログリア及びオリゴデ ンドログリアに関係している。 実施例４：細胞毒性及び逆トランスクリプターゼ活性 最初はＭＳにおけるレトロウイルス的表現の研究のために発展してきた単球／ マクロファージ培養のプロトコール(protocol)（４５）、即ち、ペロン Ｈ．(Pe rron H.)の実験（４４）の主題を構成する研究のために既に定義されている条件 に従って、いくつかの上澄み液における逆トランスクリプターゼ活性が、上記の 外植片として培養された脳細胞に対する細胞毒活性とともに試験された。Ｄ１か らＤ２２にサンプリングされたＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液のいくつ かにおいて、培養上澄み液中で生じる最大のグリア毒性活性と、逆トランスクリ プターゼ活性のピークとの相対的一致が観察された。しかし、５６℃における３ ０分の加熱、冷凍／溶解に２サイクル、及び、１００，０００ｇでの２時間の超 遠心分離によって沈降させたペレットの除去は、分析される細胞毒性を損なわな いので、ＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液に存在するレトロウイルスによ る体外移植された細胞に感染による直接的影響はありそうもない。 いくつかのＭＳ単球／マクロファージ培養における逆トランスクリプターゼと 細胞毒性活性との相対的一致を図４に示した。ＭＳ単球／マクロファージ培養上 澄み液を、脳外植片の培養媒質で１／４に希釈し、細胞涸渇の顕微鏡による定量 化により細胞毒性効果を見積もる前に、上記のプロトコールに従って２４時間イ ンキュベートした。これらの結果は、逆トランスクリプターゼ活性と観察された 細胞毒性活性との相対的一致を示している。 実施例５：細胞毒性／グリア毒性試験 上記の結果から、観察された細胞毒性効果を研究し定量化するための規格化さ れた系が求められる。いくつかの評価の後、免疫化したアストログリアの連続的 培養（５０）が、純粋で均一なグリア細胞に対して、上述したような細胞毒性を 検出し定量する適当な材料をなすことがわかった。 よって、連続的アストログリア列を、７．５％ＣＯ₂、３７℃、湿度９５％の インキュベータ内の、１０％のＦＣＳ（仔ウシ血清）を加えたＤＭＥＭ−Ｆ１２ （１：１）媒質中に保持した。細胞は、予めＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの濃度のポ リ−Ｌ−リジン（lysine）で被覆した培養プレートまたはフラスコ内で培養した 。継体密度は、一般的には２×１０³細胞／ｃｍ²である。これらの条件下で、細 胞を、細胞毒性試験に用いる前に、２日間または均一な単層の細胞ローンが観察 されるまで培養した。それらは、２４−ウエルの培養プレートで培養するのが好 ましく、それによって、多くの試験を連続した作業として実施することが可能に なる。スライド上の一連の研究のために、それらはラブテック（登録商標）タイ プのキャビティ培養スライド上で培養してもよい。一般的に言えば、試験すべき 生物学的流体を起源とするサンプルは、補体タンパク質及び包囲しうるウイルス を 不活性化するために５６℃で３０分間加熱し、次いで１５００ｒｐｍで１０分間 遠心分離し、上澄みを回収する。 次に、各サンプルを、上述のアストログリアの１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ− Ｆ１２（１：１）媒質で必要なだけ希釈し、ピペッティングまたは緩い撹拌によ って均一化したその媒質を、維持媒質に換えて培養フラスコまたはウエルに沈着 させる。これらの細胞を、上述の条件下でインキュベータに入れる。アストログ リアで代表されるグリア細胞に対する細胞毒性効果をグリア毒性活性として評価 する。 試験サンプルの希釈液のグリア毒性効果は、３つの異なる技術によって測定さ れるが、それらは合致することがわかる。 第１の技術は、”Ｌ／Ｄ試験”（生きている細胞／死んだ細胞試験）として知 られるが、速く、半定量的な比色検定法であり、生きている及び死んだ細胞を即 座に決定することができる。生きている細胞は、細胞内エステラーゼ活性の存在 によって明確化される。エステラーゼ活性は、基質であるカルセイン−ＡＭの酵 素的加水分解によって生成される緑色蛍光により検出される。死んだ細胞は、核 酸をエチジウム・ホモダイマーでラベルし、核膜が破壊された細胞の核のみが蛍 光赤色を発することにより明確化される。３７℃で７２時間インキュベートした 後、細胞はＤ−ＰＢＳバッファー中でリンスし、２μＭのカルセイン−ＡＭ及び ４μＭのエチジウム・ホモダイマーを含む２００μｌのＰＢＳの存在下で、室温 で１５分間インキュベートして光から保護する。そのすぐ後に、培地を蛍光顕微 鏡で観察する。観察の同一視野において、緑色（生きている）及び赤色（死んで いる）細胞を同時に数える。いくつかの視野（少なくとも３つ）を観察し、生き ている細胞及び死んだ細胞の数の平均を結果として採用する。グリア毒性（より 一般には、細胞毒性）活性は、以下の式によって表される。 細胞毒性％＝（死んだ平均細胞数／生きている平均細胞数）×１００ 第２の技術は、メチルテトラゾリウムを用いた生きている細胞の比色検定法で ある。メチルテトラゾリウムブロミド(methyltetrazolium bromide)（ＭＴＴ） は、定量的比色検定法（５１）に用いられる塩である。ＭＴＴは、代謝活性細胞 における還元の後、着色生成物ホルマゾン（紫色）を与えるミトコンドリアのデ ヒド ロゲナーゼに対する基質である。よって、生きている細胞をラベルすることを可 能にする。細胞（２×１０³細胞／ｃｍ²）を、精製したフラクションの異なる希 釈液（試験すべき各希釈液について、３ウエルまたは皿）に７２時間晒した。次 いでＤ−ＰＢＳバッファーで洗浄し、その後、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）中の ０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＴＴ溶液３ｍｌ中で、３７℃で３時間インキュベー トした。上澄みを取り除き、ホルマゾン結晶を可溶化するために、細胞に酸イソ プロパノール（４×１０^-2ＭのＨＣｌ）を適用した。得られた溶解産物を、６５ ００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞破片を取り除いた。次いで、工学密度読解 は、５７０−６３０ｎｍで行った。 第３の技術は、死んだ細胞の定量化を可能にする⁵¹Ｃｒを用いた放射活性検定 を採用する。⁵¹Ｃｒは放射活性元素であり、生きている細胞に入ることができ、 細胞が死んだときにのみ細胞外媒質中に放出される。⁵¹Ｃｒを含む媒質に接触さ せて洗浄した後の取り込まれた放射活性の測定と、細胞から媒質に放出された放 射活性の測定とにより、生きている及び死んだ細胞の定量化が可能になる。アス トログリア（２×１０³細胞／ｃｍ²）を、２０μＣｉの⁵¹Ｃｒを含むＤＭＥＭ− Ｆ１２（１：１）媒質中、３７℃で２時間インキュベートした。細胞を、ＤＭＥ Ｍ−Ｆ１２媒質で３回リンスし、精製したフラクションの異なる希釈液（試験す べき各希釈液について、３ウエルまたは皿）に晒し、３７℃で７２時間インキュ ベートした。上澄みを回収し、細胞を１ＭのＮａＣｌ溶液に溶解した。上澄み液 及び溶解産物中に存在する放射活性の計数（ガンマ・カウンター）を、１分間当 たりの数（ｃｐｍ）で行った。細胞毒性パーセントを、以下の式で定義し、計算 した。細胞毒性％＝（上澄み液ｃｐｍ−自然ｃｐｍ）／（全ｃｐｍ−自然ｃｐｍ ）×１００。自然放射活性は、同一だがグリア毒性でない流体（ＣＳＦ、血清ま たは単球／マクロファージ培養上澄み液）及び⁵¹Ｃｒと、試験サンプルと同じ条 件下でインキュベートした培地からのサンプルに対して、カウンターで測定され たバックグラウンドをｃｐｍで表したものに相当する。 実験の再現性及び信頼性のために、同じグリア毒性サンプルの同じ希釈液を数 個のウエルでインキュベートし、得られた標準偏差を、一連の分析での結果の重 要性に考慮した。このタイプの正当化は、アストログリア細胞バッチを換えたと き（新たなアンプルの溶解）または培養媒質のバッチ（特にＦＣＳのバッチ）を 換えたときに行った。ここで述べた実験において、５％を越える死んだ細胞の比 率は、通常の培養条件では見られない細胞毒性効果を示すことがわかった。 実施例６：細胞毒活性の速度論 胚の脳外植片の一次培養に細胞毒性であるＭＳ単球／マクロファージ培養上澄 み液、及び、非細胞毒性の対照上澄み液につき、上述のアストログリア列の培養 に対して試験した。アストログリアによって検出され、”Ｌ／Ｄ試験”によって 可視化されるグリア毒性活性の存在は、一次培養に対して既に細胞毒性である上 澄み中には見い出され、このような性質を持たない上澄み中には見い出されない はずである。よって、培地中に単球／マクロファージを保持している間、ＭＳに 罹患した患者または対照を起源とする培養上澄み液におけるグリア毒性の発現の 速度論を研究することが可能である。また、この活性は、健常な対照を起源とす る培地からはいかなるときも検出されないこと、及び、その強度が、ＭＳに罹患 した患者を起源とする”ポジティブな”培地では、時間によって変動することを 実証することができる。実際は、いくつかの場合において活性のピークを観察す ることができる。これらのピークは、一般に、培養の６日目から９日目の間、次 に１５日目と１８日目の間（Ｄ６からＤ９及びＤ１５からＤ１８）にあり、培地 における活性合成を示しているが、上澄みは培養媒質の変化から２週間で、完全 に取り除かれるからである。 発展した生物学的試験を用いて行ったこのような観察の一例を図５に示す。子 の例では、ＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液は、上記のアストログリア列 に対する上述の細胞毒性／マクロファージ試験のように、培養媒質での１／１０ の希釈液で処理されて用いられ、”Ｌ／Ｄ試験”法によるグリア毒性効果の測定 についての上記のプロトコールに従って７２時間インキュベートされた。 実施例７：ＭＳに罹患した患者の生物学的流体におけるグリア毒性活性の表現 次に、この生物学的試験は、脳脊髄液（ＣＦＳ）及び血清中で起こりうるグリ ア毒性活性の試験に用いられた。即ち、本発明者等はＭＳにかかった患者のＣＦ Ｓにおいてグリア毒性活性は重大であるが、例えば、正常圧水頭症（ＮＰＨ）に 罹患した対照のＣＦＳでは重大でないことを示すことができた。同様の発見は、 ＣＦＳにおけるグリア毒性活性よりは低いが、血清、アルベイト(albeit)にも見 い出され、従って、この活性を持つ因子が鞘内で生成されるという見方が支持さ れた。 培養媒質と混合したサンプルにおけるグリア毒性因子のアストログリアを標的 とする検出を可視化するために、”Ｌ／Ｄ試験”を用いた例を図６に示す。この 例では、軽減化している悪化ＭＳからのＣＦＳを培養媒質で１／１０に希釈し、 ７２時間インキュベートして蛍光顕微鏡で検査した。全行程は、”Ｌ／Ｄ試験” について上述したプロトコールに従った。写真Ａは、フルオレセインからの光放 出に対して、適当な光学系によって生きている細胞を可視化したものを示す（バ ーは２５マイクロメートルを表す）。写真Ｂは、適当な光学系を用いた死んだ細 胞の可視化を示し、バーは２５マイクロメートルを表す。写真Ｃは、 ２つの蛍光物質（４８５−５００ｎｍ）からの光放出に対して、適当な光学系を 用いた生きている細胞と死んだ細胞を同時に可視化したものを示し、バーは２５ マイクロメートルを表す。 この定量化試験が発展させて、本発明者等は、ファーム・ポール(firm Pall) が調製したフィルターを分析し、ＭＳに罹患した患者の治療的試みに用いた（５ ２）。これらの試みは、脳脊髄液を、特にグリコプロテインとの親和性を持ち、 ポール社(company PALL)によって選択されたフィルターを通して濾過することか らなる。フィルターは、ＭＳのいくつかの場合からのＣＦＳを濾過した後に得ら れ、そのフィルターに吸着されたタンパク質を１％のＳＤＳを含む溶液を用いて 再溶解させた。サンプルを生理学的条件においた後、アストログリア列に対する 本発明の生物学的試験によって見積もった強力なグリア毒性活性が、これらのフ ィルターに残ったタンパク質と結びついていることが示された。 特にＭＳに罹患した患者のＣＦＳといった生物学的流体のグリア毒性活性を検 出し定量化するための生物学的試験の用いた例を、添付の表１に与えた。表１で は、ポール社から供給されたフィルターを通したＣＦＳの濾過の影響が示されて いる。 この表において、ＣＳＦは、インビボの治療的試みで用いられる濾過媒体と同 じタイプを持つポールのフィルターを通して濾過された。各濾過物のグリア毒性 活性が、アストログリアに対する生物学的試験に従って測定され、結果は、濾過 しない元のＣＦＳのグリア毒性活性と比較した。一連の１０回の異なる測定によ って統計学的な意義が与えられている。この例では、上記の”Ｌ／Ｄ試験”のプ ロトコールに従って、培養媒質で１／１０に希釈し、７２時間インキュベートし た。各サンプルにつき、同一のサンプルで同時にインキュベートした２つのウエ ルについて任意に選択した５つの視野から、死んだ細胞の比率の平均値を得た。 ＭＳのＣＦＳと濾過後の濾過物との間には、統計学的に有意な差が存在する。Ｍ Ｓの透析は、特に述べない限り、ポサー(Poser)の基準に従う明確なＭＳの透析 である（４９）。 この例は、ＭＳまたは前記グリア毒性因子もしくはグリア毒性活性がインビボ で検出されるような疾患に罹患した患者の生物学的流体から、前記グリア毒性因 子の少なくとも一部を取り除く物理化学的方法が存在することを示している。こ れらの結果は、前記グリア毒性活性の分子的実体、及び、本発明の主題である検 出及び検定技術の重要性をも確信させる。 本発明者等によって発展された、特にＭＳに罹患した患者のＣＦＳ等の生物学 的流体におけるグリア毒性活性を検出し定量化するために生物学的試験を用いた 他の例を表２に与えた。この例では、上述の比色ＭＴＴ試験のプロトコールに従 って、ＣＦＳを培養媒質で１／２０に希釈し、９６時間インキュベートした。各 結果は、各々が５つの独立したウエルの列を示している２つの別の実験の平均値 を示し、即ち、試験した各ＣＦＳについて１０の値の平均値を示している。 軽減化している状態のＭＳに罹患している患者を起源とするＣＦＳサンプルは 、臨床的悪化の時点で取り出した。軽減化対進行性というＭＳの２つのサブポピ ュレーション(subpopulation)の間の平均細胞毒性値の差は、統計学的に有意で あり、原則的に、ＣＦＳのグリア毒性活性の定量化が、疾患の臨床的活性と相関 させることができることを示している。ＭＳの透析は、特に述べない限り、ポサ ーの基準に従う明確なＭＳの透析である（４９）。 表１及び２に与えた結果及び他の類似した結果から、本発明者等は、ＭＳに罹 患した患者のＣＦＳには、非常に重大なグリア毒性活性が存在し、その強度は、 臨床的段階及び／または進行の仕方に従って変化することを示すことができた。 これらの結果から、そのような細胞毒性、特にグリア毒性活性が検出できる病理 学の明確な予防及び／または治療的モニタリング、あるいはＭＳのような疾患の 診断の研究において、例えば、上記の３つの技術（”Ｌ／Ｄ試験”、ＭＴＴ比色 検定法、及び⁵¹Ｃｒ放出検定）のうちのひとつといった定量化技術と組み合わせ たアストログリア列に対して発展した生物学的試験の重要性が確信された。 実施例８：他の細胞タイプで観察される細胞毒性活性 さらに、他の多くの細胞タイプの培養につき、観察された細胞毒性活性も評価 し、”Ｌ／Ｄ試験”によって定量化した。グリア細胞に対して細胞毒性であるこ とが既に示されたサンプルを用い、ラット胚の脳外植片またはアストログリア列 の培養において、線維芽細胞、筋芽細胞、及びラットの足筋細胞に対して、そし て内皮細胞に対して直接的な細胞毒性は検出されなかった。坐骨神経シュヴァン (Schwann)細胞に対して、上述のアストログリアに対するものの約１０％という 非常に低い細胞毒性が観察された。ここで興味深いことは、シュヴァン細胞は、 ちょうど中枢神経系における通常の髄鞘形成に対してオリゴデンドログリアがな すのと同じように、末梢神経の髄鞘形成をなすものであることである。胚の脳外 植片の培養において、直接的に影響されないいくつかの軟髄膜細胞が存在するが 、同じことをニューロンに当てはめると、グリア細胞の栄養ローンのかなりな修 飾の後にのみ影響を受けることがわかった。培地にセットアップされ、培養支持 体に接着した後にマクロファージに分化した血液単球は、いずれも影響されない 。それは、それらが、マクロファージ培養中に上澄みに放出されるグリア毒性活 性の連続的なピークが存在しても培地に固執するからである（図５参照）。リン パ球について、ＣＤ４抗原を表現する細胞の培地で、反対の結果が得られた。即 ち、同じ非グリア毒性対照サンプルに比較して、同じグリア毒性サンプルでは、 いくつかの培地において細胞死が増加したが、他のリンパ球−ドナー個々からの 培地においては細胞増殖が観察された。 リンパ球に対するこれらの観察は、超抗原性を持つ分子に対して述べた効果と 類似性がある（２６、２７）。 実施例９：細胞毒性効果の細胞学的キャラクタリゼーション リンパ球について得られたこれらのデータによって、本発明者等は、グリア毒 性の生物学的試験に用いられたアストログリアに対する細胞毒性に結びついた細 胞学的影響を明確にすることができた。上記のアストログリアの中間線維の研究 は、グリア毒性試験についての上述のプロトコールに従って細胞をインキュベー トした後、アストログリアの細胞骨格の構成に対してグリア毒性流体がかなりの 影響を与えることを明らかにした。実際には、同時に試験した非グリア毒性対照 流体では何の変化も観察されなかったが、ＭＳに罹患した患者からの生物学的流 体（単球／マクロファージ培養液またはＣＦＳ）を起源とする重大なグリア毒性 活性に接触させたアストログリアの培地では、ビメンチン及びＧＦＡＰ線維の徹 底的な破壊が観察された。この現象は、アストログリアが抗−ＧＦＡＰ抗体で特 異的にラベルされた胚の神経系外植片の一次培地でも観察された。 ＭＳに罹患した患者を起源とするグリア毒性流体に接触させた培地のアストロ グリアのビメンチン及びＧＦＡＰ中間線維のこの破壊の一例を図７に与える。こ の例では、ＧＦＡＰの検出はラブテック（登録商標）タイプのスライド上で培養 された細胞の一次培地で行なった。グリア毒性ＭＳ単球／マクロファージ培養上 澄みの１／２０希釈液を含む培養媒質で１時間及び２４時間インキュベートした 後、スライド上の接着細胞をＰＢＳで２回リンスし、次いで、４％のパラホルム アルデヒド中、３７℃で２０分間固定した。ＰＢＳで２回リンスした後、ＰＢＳ ／１％ミルク・ブロッキング溶液(milk blocking solution)中で２回、５分間の インキュベーションを行った。第１の抗体はポリクローナル(polyclonal)であり 、ラビットからレイズ(raise)された。この抗体をブロッキング溶液で１／５０ に希釈した。インキュベーションは、３７℃で１時間継続した。第１のインキュ ベーションの後、結合していない抗体を取り除くために、ＰＢＳ中の５分間の洗 浄とブロッキング溶液での洗浄を繰り返した。可視化システムとしては、フルオ レセインを結合させた抗−ラビット・イムノグロブリンをブロッキング溶液で１ ／１００に希釈したものを採用した。インキュベーションは３７℃で１時間継続 した。 プレパラートの実装は、観察時の蛍光の現象を避けるためにモビオール(moviol) を用いて行った。スライドは４℃で暗所に保存した。観察は蛍光顕微鏡を用いて 行った。ビメンチンの検出は、ラブテック（登録商標）タイプのスライド上で培 養したアストログリア列に対して、グリア毒性ＭＳ単球／マクロファージ培養上 澄みの１／５０希釈液または通常の培養媒質を用いて２４時間インキュベートし た後に実施した。２４時間のインキュベーションの後、細胞（１×１０³細胞／ ｃｍ²）は、ＰＢＳで２回リンスし、アセトンを用いて−２０℃で１０分間固定 した。ＰＢＳで３回リンスした後、それらをＰＢＳ／５％ＦＣＳブロッキング溶 液中、室温で５分間のインキュベーションを３回行った。第１の抗体はポリクロ ーナルであり、ヤギでレイズされた。この抗体を、ブロッキング溶液で１／５０ に希釈した。インキュベーションは３７℃で２時間であった。ＰＢＳでの５分間 のリンス及びブロッキング溶液でのリンスを３回行った後、細胞を、フルオレセ インに結合し、ブロッキング溶液で１／２００に希釈したヤギＩｇＧに対する第 ２の抗体を用いて３７℃で１時間インキュベートした。写真Ａ及びＢは、各々、 １時間及び２４時間の希釈したグリア毒性サンプルの存在下でのインキュベーシ ョン後のＧＦＡＰのラベル化を示している。写真Ｃ及びＤは、各々、通常の媒質 及び希釈したグリア毒性サンプルを含む媒質を用いて２４時間インキュベートし たアストログリア列のビメンチンのラベル化を示している。 さらに、本発明者等は、通常の媒質で培養し、ＭＳを起源とするグリア毒性サ ンプルの存在下で時間を増加させながら培養したアストログリアの培地から抽出 した細胞性ＤＮＡの表現を研究した。そして、グリア毒性活性を受けた培地を起 源とするＤＮＡは、細胞性ＤＮＡの切断が見られ、その強さは細胞のインキュベ ーション時間に伴って増大するが、グリア毒性活性を持たない媒質中でインキュ ベートした細胞のＤＮＡは、非常に高い分子量での均一性を保っていることがわ かった。 これらの観察は、特にリンパ系細胞に対して、超抗原によって誘発されるよう な枯死過程に匹敵するものである。 実施例１０：投与量−応答効果 次に、この検出されたグリア毒性活性が、試験された流体中に存在する分子に よって、または、その分子表現がより複雑となる因子によって生ずる可能性を見 積もるために、まず本発明者等は、上述の発展した生物学的試験を用い、参照用 サンプルによって誘発された細胞毒性に対する投与量−応答効果の現実性を評価 した。希釈に対する細胞死の直接比例性、及び高濃度でのアストログリア検出シ ステムの飽和の影響に匹敵する投与量−応答効果は、”Ｌ／Ｄ試験”によって効 果を可視化した後に観察した。 グリア毒性流体で観察されたこの投与量−応答効果の一例を図８に与えた。こ の例では、ＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液を、上述の”Ｌ／Ｄ試験”の プロトコールに従うアストログリアの培養媒質と、連続的希釈度で混合した。 この方法において、本発明者等は、ＭＳに罹患した患者の血液単球／マクロフ ァージ、ＣＦＳ及び血清における細胞毒性、特にグリア毒性の活性を特性化し、 同時に、ラット胚の脳及び脊髄外植片の一次培地に対する前記細胞毒性、及び培 地のアストログリア列に対するグリア毒性の検出方法を発展させ、同様に培地の アストログリアの検出方法に結合させたグリア毒性の定量化方法を発展させた。 これらの第１の目的は、ＭＳに罹患した患者のインビボでのグリア毒性活性を 示すこと、及びその系統的で標準化された検定方法を示すことであったが、本発 明者等は、次に、この活性を、試験した流体中の特別な分子、または定義された 分子の組によって表現される因子と結びつけることに注意を向けた。 実施例１１：細胞毒性／グリア毒性因子のキャラクタリゼーション 本発明者等は、上述の方法によってグリア毒性活性として定義された生物学的 活性が、５６℃のウォーター・バスに３０分間配置したグリア毒性サンプルでは いじされるが、１００℃の温度で１５分間おいたときは消失すること、及び、サ ンプルを−８０℃で凍結した後に３７℃で溶解したときは維持されることを、ま ず見い出した。１００，０００ｇで２時間遠心分離し、沈降した物質のペレット を取り出した後、本発明に記載した方法に従って予めグリア毒性と認められたサ ンプルの活性は、上澄み液中に保持されており、従って、非粒子性の可溶性因子 に類似している。同様に、全タンパク質量を予めブラッドフォード(Bradford)の 技術（５３）によって決定したグリア毒性サンプルを、トリプシン、プロナーゼ 、プロテイナーゼＫまたはＮ−グリコシナーゼＦとノイラミニダーゼとの混合物 の存在下で、サンプル中に存在するペプチド結合またはＮ−グリコシレーション を完全に酵素的加水分解するのに十分な条件でインキュベートしても、それらの 上記のグリア毒性活性は消失しなかった。 次に、本発明者等は、本発明の方法によって予めグリア毒性を持つことがわか っているサンプルから、異なる化合物を分離し分別することを行った。これらの 実験すべてについて、サンプルは予め５６℃で３０分間加熱し、１５００ｒｐｍ で１０分間遠心分離して、上澄みを回収した。また、必要に応じて、４℃におい て、２０倍容量のＤ−ＰＢＳバッファーで２回透析したが、１回目は２時間で、 ２回目は終夜とした。回収した上澄み液を、異なる操作を施すサンプルとした。 さらに、その分子成分が異なる方法で分離されたサンプルを起源とするフラクシ ョンを、使用した方法によって収集された媒質に導入されうる毒性分子を取り除 くように、また、本発明に記載したようなグリア毒性生物学的活性を検出し定量 化する方法に匹敵する生理学的条件下で、有機分子を再溶解させるように処理し た。最後に、サンプルは親油性とし、２．５ｍｌの無菌蒸留水中に再懸濁し、予 め１０倍容量のＤ−ＰＢＳバッファーで洗浄したＮＡＰ−２５タイプのクロマト グラフィ・カラム（ファーマシア(Pharmacia)）にかけ、３．５ｍｌのＤ−ＰＢ Ｓバッファーで溶離して、グリア毒性試験に使用した。 上記で決定したグリア毒性因子のイオン性電荷を研究するために、上記の規定 に従うとグリア毒性であり、ＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液及びＣＦＳ を起源とするサンプルを、バッファーＡ（５０ｎＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８ ）で平衡させたＤＥＡＥ−セファローセＣＬ−６Ｂ（ファーマシア）タイプのＦ ＰＬＣクロマトグラフィ・カラムに、６０ｍｌ／時間の流速で通した。これらの 条件下で、元のサンプルの中に存在するグリア毒性活性を持つフラクションは、 バッファーＡ中の０．１２Ｍから０．２ＭのＮａＣｌのイオン強度で溶離された 。 ブルー−セファロース（ファーマシア）タイプの液体クロマトグラフィ支持体 に強い親和性を持つある種のセリンプロテアーゼとの可能な物理化学的類推を研 究するために、上記の規定によるとグリア毒性であり、ＭＳ単球／マクロファー ジ培養上澄み液及びＣＦＳを起源とし、予め４℃で２０倍容量のバッファーＢ（ ５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２）で２回透析した１ｍｌ当たりに５ｍｇのタンパク 質を含むサンプルを、ブルー−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファーマシア）タイプ のＦＰＬＣカラムにかけた。バッファーＢ中の０．１ＭのＫＣｌで溶離した後、 溶離液中にはグリア毒性活性は見い出されなかったが、バッファーＢ中の１．５ ＭのＫＣｌで溶離することにより、約７０％の活性収率で、グリア毒性活性を持 つフラクションが回収された。分析によって、この同じフラクションに、血清ア ルブミンも溶離されたことがわかった。しかし、溶離液のプロテアーゼ活性を、 Ｄ−ＰＢＳバッファー中の”アゾカゼイン(azocazein)”（シグマ）または”ア ゾコール(azocoll)”（シグマ）で、ｐＨ７．５で３７℃において２時間インキ ュベートすることによって試験したところ、そのように調製し溶離したサンプル のタンパク質分解活性を示すことは不可能であった。 そのようなグリア毒性因子のＩｇＧタイプのイムノグロブリンを用いた可能な 結びつきを研究するために、上記の規定に従うとグリア毒性であり、ＭＳ単球／ マクロファージ培養上澄み液及びＣＦＳを起源とするサンプルを、予め５倍容量 のＤ−ＰＢＳで洗浄したプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ファーマシア ）タイプのＦＰＬＣカラムにかけた。膨潤したゲルのプロテインＡ含有量は２ｍ ｇ／ｍｌであり、ヒトＩｇＧと結合する容量は、ゲル１ｍｌ当たり２０ｍｇのＩ ｇＧのオーダーであった（ゲル容量は１．５ｍｌ）。ＩｇＧを欠くフラクション はＤ−ＰＢＳでの溶離で回収され、グリア毒性活性を持つが、ＩｇＧの豊富なフ ラクションは、５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌバッファー、ｐＨ３．０で溶離され 、サンプルがＣＦＳまたは上記の条件下で行われた単球／マクロファージの培養 上澄み液を起源とするものであるときは、上記の定義のグリア毒性活性を持たな い。サンプルが、ヒト血清を起源とする場合は、ＩｇＧの豊富なフラクションに も低いグリア毒性活性が見られ、これは、悪化ＭＳから、グリア毒性とわかって いるＣＦＳと同時に採取した血清の場合も、例えば正常圧水頭症（ＮＰＨ）に罹 患し、同時に採取したＣＦＳがグリア毒性活性を示さない対照からの血清の場合 にも見られた。しかし、ＮＰＨまたは健常な対照の血清は、Ｄ−ＰＢＳで溶離さ れるＩｇＧを欠くフラクションにおいてグリア毒性活性を示さず、悪化ＭＳに罹 患した 患者からの血清からのかなりのグリア毒性活性ほとんど全部は、Ｄ−ＰＢＳで溶 離されるＩｇＧを欠いたこのフラクションに見い出される。このことは、健常な 個体の血清には、ひとつまたはそれ以上のグリア毒性成分があり、それらは、本 発明で発明者等が示したグリア毒性因子とは異なり、上記の条件下でプロテイン Ａ−セファロース・カラムを通した後、ＩｇＧの豊富なフラクションの溶離液中 に見いだせることを示唆している。これは、既に報告されているように（５４） 、血清中の活性タンパク質に結合した非特異的なグリア毒性に類似している。し かし、単球／マクロファージ培地に存在するＡＢポジティブな血液グループを持 つ健常なドナーを起源とする少量のヒト血清は、これらの条件下で、ＩｇＧの溶 離を用いたこの方法で回収されるこの付加的なグリア毒性を生じない。これは、 希釈効果によるものかもしれず、結果的にこの成分の活性を低下させ、我々の方 法では検出できなくする。さもなくば、上述の条件下での単球／マクロファージ の培養の最中のこの成分を不活性にする効果によるものかもしれない。この事実 に加えて、ＮＰＨに罹患した対照のＣＦＳを起源とするサンプルまたは健常な個 体からの単球／マクロファージの培養上澄み液を起源とするサンプルのひとつま たは同様な分析の後、これらの条件下で検出可能なグリア毒性がないならば、こ れらの結果は、明らかに健常な個体の生物学的流体における病理学的過程なしに 起こりうるグリア毒性活性に対して、グリア毒性活性及びそれによって結びつけ られたグリア毒性因子の新規な性質を確信させ、これは本発明のひとつの主題を なすものである。 前記グリア毒性因子の分子量を研究するために、本発明者等は、上記の規定に 従うとグリア毒性であり、単球／マクロファージ培養上澄み液、ＭＳ患者のＣＦ Ｓをインビボで濾過するのに用いたＰＡＬＬフィルター、及びＭＳのＣＦＳを起 源とするサンプルを、スペローゼ１２（ファーマシア）タイプのＦＰＬＣカラム 及びＳＤＳ存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で 付随的かつ連続的に分析した。スペローゼ１２カラムでの分析の後、標準グロブ ラー(globular)タンパク質の溶離容量の参照用曲線に合わせることにより、約１ ７ＫＤの分子量に対応する容量を溶離させた後にグリア毒性活性を有するフラク ションを溶離した。より正確には、この溶離ゾーンに近いフラクションを回収し たところ、約２１ＫＤ及び約１６．８ＫＤの分子量に対応する溶離容量において 、グリア毒性の２つの分離したピークが観察された。８Ｍの尿素を添加したバッ ファーでの同じサンプルの類似した溶離でも同様の結果が得られ、生理学的条件 下で溶離される成分の、マルチメトリック(multimetric)な結びつきが無いこと を示している。 １次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の後、ゲルから溶離して生理学的条件に戻 した後、ゲルの約１７ＫＤの分子量に対応する部分に、グリア毒性活性を有する タンパク質バンド(band)が見い出された。分析及び分析される生物学的物質の含 有量のある条件下では、さらに約２１ＫＤの部分でも見い出された。同時に、他 のタンパク質バンド及びタンパク質無しのゲルの異なる領域も試験したが、そこ では、重要なグリア毒性活性は検出されなかった。１７ＫＤ付近のゲルから抽出 したグリア毒性タンパク質バンドの２次元分析は、１７ＫＤにおいて、約ｐＨ６ からｐＨ７の間に異なる等電点を示す２つの主要なスポットがあり、１８ＫＤに おいてｐＨ約７を越えて僅かにより塩基性の等電点を持つ小さなスポットがある ことを示した。 ＤＥＡＥカラムを通した後に得られたグリア毒性フラクションのタンパク質成 分の１次元及び２次元ゲル電気泳動分析の一例を図９Ａ及び９Ｂに与えた。図９ Ａにおいて、ＭＳに罹患した一連の患者のＣＦＳをインビボで濾過するのに用い た数十のＰＡＬＬフィルターから溶離したグリア毒性サンプルの混合物を起源と するクマシーブルーで染色した１次元アクリルアミドゲルの写真が見られる。こ れらのフィルターは、機械的に開かれ、１％ＳＤＳの存在下で洗浄され、その溶 離液は、特に上記のＮＡＰ−２５カラムを通すことにより生理学的バッファーに 戻された。このように処理した濾過物は、部分標本に対してグリア毒性活性を試 験し、混合物としてＤＥＡＥ−セファロースカラムを通した。グリア毒性活性を 有するフラクションは、ＮＡＰ−２５カラムで脱塩し、蒸発によって濃縮した後 、２つの部分に分け、一方には１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図９Ａ）、他方に は２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを適用した。その２次元ゲルの写真を図９Ｂに与 えた。１次元において、明らかに１７ＫＤの分子量を持つ可視化されたバンドは 、図９Ａに見られるゲル上でグリア毒性活性を持つ可視化されたタンパク質バ ンドのみであることがわかる。また、２次元ゲル（９Ｂ）では、約１７ＫＤのこ のバンドは、異なる等電点をもつ３つのスポットに分離し、右側の第３のスポッ トは、左側の２つのスポットより明らかに僅かに高い分子量を有していることが わかる。 スペローゼ１２ＦＰＬＳＣカラムでの分析の一例を図１０Ａ及び１０Ｂに与え る。この例では、まず、ＭＳ患者の単球／マクロファージの培養上澄み液で、培 養の６日目から１６日目の間に採取し、２０ｍｌの容量で１４０ｍｇのタンパク 質を持つものを、バッファーＡ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８）で平衡 したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファーマシア）タイプのＦＰＬＣカラ ムクロマトグラフィーカラムに、６０ｍｌ／時間の流速で通した。付随的に、ス ペローゼ１２カラムを、バッファーＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８で 平衡させ、同じバッファーＣ中の分子量既知のグロブラータンパク質の混合物を 溶離することによって校正した。元のサンプル中に存在する理論的にグリア毒性 活性を有するフラクションを、バッファーＡ中０．１２Ｍから０．２ＭＮａＣｌ のイオン強度で、ＤＥＡＥ−セファロースカラムから、３９ｍｇのタンパク質を 含む１５ｍｌの容量で溶離させた。１３ｍｇのタンパク質を有するこのフラクシ ョンの１／３を、尿素を含まないバッファー中でスペローゼ１２からむをに適用 し（図１０Ａ）、他の１／３を、８Ｍの尿素を含むバッファー中で同様のカラム に適用した（図１０Ｂ）。バッファーＣでの溶離の間、４０のフラクションが回 収され、溶離液中のタンパク質を検査するための２８０ｎｍでの吸収の連続測定 を、高い検出感度（Ｒ＝１．２）で記録した。回収した異なるフラクションのグ リア毒性活性を、アストログリア列に対する我々の生物学的試験法に従って試験 し、７２時間のインキュベーションの後、”Ｌ／Ｄ試験”によって定量化した。 最後に、フラクションを親油性化し、２．５ｍｌの無菌蒸留水中に再懸濁して、 予め１０倍容量のＤ−ＰＢＳバッファーで洗浄したＮＡＰ−２５（ファーマシア ）タイプのクロマトグラフィーカラムに適用して３．５ｍｌのＤ−ＰＢＳバッフ ァーで溶離し、グリア毒性活性試験と同様に使用した。図１０Ａ及び１０Ｂにお いて、連続した実線は、２８０ｎｍにおける光学密度を表し、破線はグリア毒性 活性を表す。溶離容量（Ｖｅ）と見かけの分子量との一致は、予め行った参照用 タ ンパク質での校正に従って計算し、グリア毒性活性のピークの頂点に記載した。 約１１０ＫＤの分子量に相当するフラクションに僅かなグリア毒性活性が見られ ることに注目すべきである。しかし、８Ｍの尿素が有る場合と無い場合の溶離形 状が類似していることから、因子のモノマー成分がこれらの異なる分子量で溶離 されたという見方が支持される。従って、この例では、見かけの分子量が約２１ ＫＤ及び約１７ＫＤである因子に特異的なグリア毒性活性が示され、個々の因子 に合致している。 スペローゼ１２カラムでのＦＰＬＣクロマトグラフィー及び電気泳動分析によ って得られた結果から、グリア毒性因子は、少なくとも、分子量１７ＫＤのタン パク質または結びついた分子、及び分子量２１ＫＤのタンパク質または結びつい た分子からなることが示された。グリア毒性活性を示す見かけの分子量が両方の タイプの技術（ＦＰＬＣ及び電気泳動）で一致するという事実は、問題の因子が グロブラータンパク質であることを示唆している。さらに、β−メルカプトエタ ノール有無におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの比較研究が、同様の泳動形状を与え たので、これらのタンパク質は、おそらくホモマー(homomer)である。すべての クロマトグラフィーフラクション及び分析したゲルのすべてのタンパク質の中で 、グリア毒性活性が、約１７ＫＤと約２１ＫＤという２つの異なる分子量におい て見いだせるという事実は、重要な相同性を持たない２つの分子によって、同じ タンパク質基質でのグリコシレーションまたは異なる翻訳後変形(post-translat ional modification)の存在によって、さもなくば、約２１ＫＤのタンパク質の 開裂後に約１７ＫＤのタンパク質を生成するある種のプロペプチド(propeptide) またはペプチド部分の存在によって説明できる。 よって、前記因子の可能なグリコシレーションを研究するために、上記の規定 によるとグリア毒性であり、ＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液、血清及び ＣＦＳを起源とする、及び、ＭＳ患者のＣＦＳのインビボ濾過に用いたフィルタ ーを起源とするサンプルを、コンカナバリンＡ−セファロース（ＣｏｎＡ−セフ ァロース、ファーマシア）タイプのＦＰＬＣカラムで分析した。この研究のため に、グリア毒性の生物学的な例を予めＤＥＡＥ−セファロースタイプまたはプロ テインＡ−セファロースタイプのＦＰＬＣカラムに通した。グリア毒性を有する フラクション、即ち各々、約０．２ＭＮａＣｌで溶離したフラクション及びＤ− ＰＢＳで溶離したフラクションを、ＣｏｎＡ−セファロースタイプのカラムでの ＦＰＬＣクロマトグラフィーに用いた。これらの条件下で、ＣｏｎＡ−セファロ ースカラムから、５００ｍＭまでのＮａＣｌを含むＤ−ＰＢＳで、またはその後 ＣｏｎＡに匹敵する親和性を示すＤ−グルコピラノシド２００ｍＭで溶離したフ ラクションは、いかなるグリア毒性も示さなかった。元のサンプル中に存在する グリア毒性活性は、上記の２種の溶離の後、１ｍＭのＣａ⁺⁺及び１ｍＭのＭｎ⁺⁺ を含むｐＨ３．０の５０ｍｍＭグリシン−ＨＣｌバッファーで溶離したフラクシ ョンに濃縮されていることがわかった。このフラクションは、ＣｏｎＡに高い親 和性を持つ分子に相当し、それは一般に、強度にグリコシレーションされた分子 である。このフラクションの１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析は、グリア毒性活 性が、各々、１７ＫＤ及び２１ＫＤの２つのタンパク質バンドと結びついて見い 出されることを示した。 ＤＥＡＥ−セファロースＣｏｎＡ−セファロースタイプのＦＰＬＣカラムを用 いた１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの分析の一例を図１１に与えた。この例では 、ＭＳ罹患患者からの単球／マクロファージ培地からの、１００ｍｇのタンパク 質を含む２７ｍｌの上澄み液を、ＤＥＡＥ−セファロースカラムに通した。０． １２から０．２０ＭＮａＣｌのイオン強度で得られた溶離液を、３２ｍｇのタン パク質を含む１０ｍｌの容量で回収した。次いで、このフラクションをＣｏｎＡ −セファロースタイプのカラムに通した。第１の溶離は、５００ｍＭのＤ＝ＰＢ Ｓで行い、第２の溶離は、２００ｍＭのＤ−グルコピラノシドを含むＤ−ＰＢＳ で行い、第３の溶離は、１ｍＭのＣａ⁺⁺及び１ｍＭのＭｎ⁺⁺を含むｐＨ３．０の ５０ｍｍＭグリシン−ＨＣｌバッファーで行い、０．１７ｍｇのタンパク質を含 む６．４ｍｌの溶離液を回収した。 この一連の精製操作で、すべての中間的サンプルのグリア毒性を検査したが、 元の上澄み液のグリア毒性の７９％が、ＣｏｎＡ−セファロースカラムからｐＨ ３のグリシンバッファーで溶離した中に見い出され、タンパク質精製収率は４６ ５倍であった。 １０％のアクリルアミドを含むＳＤＳゲルで、各段階からのサンプルを、Ｃｏ ｎＡ−セファロースで溶離された第３のフラクションに対応する２．２ｍｇのタ ンパク質量で、平行なウエルに連続的に適用した。ＭＳ患者のＣＦＳに同じ工程 を用いれば、さらに良好な収率が得られることを特に記しておく。 さらに、ＣｏｎＡ−セファロースでの第３のフラクションから出発して、予備 的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を平行して行い、クマシーブルーで染色した参照 用ウエルのすべてのタンパク質バンドに対応する位置で染色していないゲルを切 り出し、同様に、タンパク質を含まない領域も切り出した。そのように切り出し た各バンドのグリア毒性を研究するために、ゲルの破片を砕き、０．２％のＳＤ Ｓを含むＤ−ＰＢＳ中で均一化し、３７℃で３０分間インキュベートした後１０ ０，０００ｇで６分間遠心分離した。この操作を２回繰り返し、遠心分離の２つ の上澄み液を混合してＤＥＡＥ−セファロースカラムに通した。Ｄ−ＰＢＳ２０ ０ｍＭＮａＣｌバッファーで溶離して得た溶離液を回収し、グリア毒性試験に用 いた。これらの条件下で、ＳＤＳはカラム上に保持され、溶離液は細胞媒質と生 理学的にコンパチブルとなる。これらの電気泳動ゲル抽出物において、約１７Ｋ Ｄ及び２１ＫＤの分子量領域を切り出したバンドにのみ重大なグリア毒性活性が 見い出された。これらの２つの抽出物のタンパク質プロファイルを明らかにする ために、それらを上記のクロマトグラフィーフラクションと平行して分析ゲルに 適用した。図１１は、左から出発して電気泳動したタンパク質を可視化した結果 を示しているが、最も左側に記載した第１列は、分子量既知の一連の参照用タン パク質を示し、”Ｓ”の符号を付した第２列は、出発上澄み液、”Ｉ”の符号を 付した第３列は、ＤＥＡＥ−セファロースで０．１２から０．２０ＭＮａＣｌの 間で溶離したフラクションを示し、”ＩＩ”の符号を付した第４、第５及び第６ 列は、ＣｏｎＡ−セファロースカラムで行った３つの連続的な溶離を示し、上記 の順番通りに各々１、２及び３の番号を付した。最後の２つの列は、予備的ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥゲルから分離し抽出した２つのグリア毒性バンドに対応する。 これらの結果から、スペローゼ１２カラムでＭＳ生物学的流体に及びＭＳのＣ ＦＳのインビボ濾過に用いたフィルターの溶離液を出発とする１次元のＳＤＳ− ＰＡＧＥ分析を実施したとき、グリア毒性活性は、見かけの分子量が約１７ＫＤ 及び２１ＫＤタンパク質と結びついているが、２１ＫＤ分子の濃度はかなり低い ことが明らかになった。しかし、以前の観察とは逆に、同条件でＣｏｎＡ−セフ ァロースカラムを通した非グリア毒性の対照サンプルは、グリシン−ＨＣｌバッ ファー中に溶離されたフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の１７ＫＤ及び２ １ＫＤにおいてこれらのバンドを示した。しかし、上述の条件下での対照サンプ ルのグリア毒性活性の評価は、精製のいかなる段階でも重大な細胞毒性効果を表 さず、約１７ＫＤ及び約２１ＫＤのタンパク質バンドでも表さなかった。さらに 、上記のｐＨ３のグリシン−ＨＣｌバッファーでのＣｏｎＡ−セファロースカラ ムの”ブランク”溶離液は、同様の非グリア毒性バンドを可視化することができ た。クロマトグラフィー支持体からｐＨ３のグリシンバッファーによってＣｏｎ Ａのタンパク質サブユニットまたはフラグメントを脱着する可能性が証明された 。しかし、上記の条件下でＣｏｎＡ−セファロースで溶離したＭＳサンプルを起 源とする約１７及び２１ＫＤのバンドで生ずるグリア毒性活性を持つ新規な分子 のコマイグレーション(comigration)の現実性を証明するために、本発明者等は 、グリア毒性サンプルを起源とするフラクション、及びＣｏｎＡ−セファロース でグリシン−ＨＣｌバッファーを用いて同条件で溶離した非グリア毒性対照サン プルのプロテイナーゼＫによる、適当な条件での消化を実施した。２つの消化生 成物は、上述の条件下で、スペローゼ１２ＦＰＬＣカラムで平行して溶離した。 これらの分析は、”ＭＳ”サンプルを起源とする溶離液中に、グリア毒性活性と 結びつき、プロテアーゼ活性とは独立した未消化のタンパク質ピークが常に存在 するが、すべてのタンパク質物質は、既に１７及び２１ＫＤのタンパク質を有す る非グリア毒性の対照サンプルを起源とするフラクション中で分解されることを 示すことを可能にする。 この分析の一例を、図１２及び１３に与える。この例では、かなりのグリア毒 性活性を示し、３ｇのタンパク質を含むＭＳ単球／マクロファージの上澄み液と 、重大なグリア毒性活性を持たない対照培地を起源とする等価なサンプルとの混 合物を、平行してＤＥＡＥ−スペローゼＦＰＬＣカラムを通し、０．１２から０ ．２ＭＮａＣｌの間で溶離したフラクションを回収し、各サンプルで２ｍｇのタ ンパク質という等量をＣｏｎＡ−セファロースＦＰＬＣカラムを通した。１ｍＭ のＣａ⁺⁺及び１ｍＭのＭｎ⁺⁺を含むｐＨ３．０の５０ｍｍＭグリシン−ＨＣｌバ ッ ファーで溶離したフラクションを、まず適当なバッファーに再溶解した。最後に 、サンプルを親油性化し、２．５ｍｌの無菌蒸留水中に再懸濁させて、予め１０ 倍容量の２０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０、１ｍＭＣａ⁺⁺、０． １％ＳＤＳで洗浄したＮＡＰ−２５（ファーマシア）タイプのクロマトグラフィ ーカラムに適用し、同じバッファーで溶離して、プロテイナーゼＫとのインキュ ベートに用いた。用いた酵素は固定化されたもの（プロテイナーゼＫ−アクリル ビーズ、シグマ参照番号Ｐ０８０３）であり、２０ｍＵ／５０−１００μｇタン パク質の比率で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０、１ｍＭＣａ⁺⁺ 、０．１％ＳＤＳ中で用いた。消化すべきサンプルを３７℃で少なくとも１６ 時間インキュベートした。遠心分離してプロテイナーゼＫを結合したビーズを沈 降させた後、回収した上澄み液を、上記の条件下でスペローゼ１２ＦＰＬＣカラ ムを通し、特にマルチメリックタンパク質を分離するために、８Ｍの尿素を含む ｐＨ６．８の５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファーで溶離した。図１２は、プロテ イナーゼＫで処理した後の、ＭＳを起源とするグリア毒性サンプルのスペローゼ １２での溶離液を示す。図１３は、プロテイナーゼＫで処理した後の、ＭＳに罹 患していない対照を起源とする非グリア毒性サンプルのスペローゼ１２での溶離 を示す。連続した実線で示す曲線は、感度Ｒ＝０．０２の光学密度測定での２８ ０ｎｍにおける溶離液の吸収を示し、相対的なタンパク質濃度を表している。約 １７ＫＤのグロブラータンパク質の溶離に対応する曲線上の点に、矢印を付して 表示した。約１７ＫＤのタンパク質のピークは図１２のみに見られ、７２時間の インキュベーション及びＬ／Ｄ試験による相対的に死んだ細胞の定量化の後、本 発明に従う生物学的試験により、１／１０ｎ希釈したサンプルにおいて７５％細 胞毒性と見積もられたグリア毒性をもっていた。さらに、僅かな不純物のプロテ イナーゼＫを検出するために、アゾコール(azocoll)（シグマ、参照番号Ａ９４ ０９）に対するプロテアーゼ活性試験を行ったところ、このレベルでは、いかな る不純物プロ手尾ナーゼＫも検出されなかった。それに対して、２８０ｎｍにお ける類似のピークが、両方のサンプルについて５ＫＤより下に検出されたが、そ れらはプロテイナーゼＫによる消化性タンパク質の分解生成物に対応する。 図１２及び１３に例示した実施例において与えられた結果は、特異的なグリア 毒性因子が、ＭＳ罹患患者を起源とする生物学的流体中に、新規な方法で確かに 存在することを示しており、この因子は、１つまたは２つのポリペプチド分子と 結びついており、その少なくとも１つ（または２つ）は、プロテイナーゼＫによ って消化されない１７ＫＤ領域にある。しかし、ＣｏｎＡ−セファロースカラム を用いた精製方法は、グリア毒性因子のコンカナバリンＡに対する非常に強い親 和性を発揮させるが、前記グリア毒性因子を溶離するのに必要とされる溶離条件 下で、カラムから生ずるコンカナバリンＡのの成分による汚染の結果、引き続く ペプチド分析に適当なサンプルを得ることが不可能になる。これらの条件下で、 ＤＥＡＥ−セファロースカラム及びスペローゼ１２カラムを連続的に組み合わせ るのが、本発明で特性化した特異的なグリア毒性活性を持つ分子の精製の方法に 最も適していると思われる。 異なるＦＰＬＣカラムを用いた精製収率の分析の例を表３に示した。 この例においては、細胞毒性は、５９％の細胞死に必要とされるタンパク質の 量（ｍｇ）で表した。これは、試験サンプルを培養媒質で１／１０に希釈し、３ ７℃で７２時間インキュベートした後の、メチルテトラゾリウム比色検定法によ る定量化に基づいている。各カラムタイプについて試験したフラクションは、グ リア毒性活性を有するものに対して前記した条件下で溶離したものである。収率 は以下の式で計算した。 ｂｐ：精製前、ａｐ：精製後。 この例は、グリア毒性因子の精製方法において、ＣｏｎＡ−セファロースカラ ムを除く他の分離法に先立って、プロテインＡ−セファロースカラムを故意に使 用できることが明らかになった。 最後に、ＭＳ罹患患者を起源とする生物学的流体中で発揮されるグリア毒性活 性を伴う分子フラクションの精製及び調製のたの技術を検討した後、本発明者等 は、本発明を管理する研究において、グリア毒性活性の分子ベースを構成する分 子の精製は、それが部分的ではあっても、既に試験した元の流体に対するより明 確に定義可能な投与量−応答効果を生じることを実証し、これは、特に、前記グ リア毒性因子の精製の生物薬理学的現実性を実証するために行われる。 以下の２つの実施例は、分子精製と平行して行われた生物薬理学的活性の精製 の現実性を例示している。 図１４に例示した実施例では、表４に与えたデータをプロットした曲線を示し ており、そのデータは、ＭＳ患者（ＭＳ１）からの単球／マクロファージ培養上 澄み液をＰＢＳバッファーで連続して希釈したものに対するもので、その希釈液 は、上記のアストログリア列を起源とするアストログリア細胞のモノレイヤー(m onolayer)からなるウエルの培養媒質で、最終的に１／２０から１／５０００の 範囲で希釈して７２時間インキュベートした。ＣｏｎＡ−セファロースカラムを 通してグリア毒性フラクションを精製して得た同じＭＳ単球培地上澄み液のフラ クションを、同じプロトコールに従って希釈しインキュベートした。アストログ リアは、グリオ毒性希釈液を導入する直前にクロム−５１とインキュベートし、 生きている細胞に取り込まれなかった放射性同位元素を取り除くために洗浄した 。２通りの希釈サンプルと７２時間インキュベートした後、上澄み中に放出され た放射活性をガンマカウンターで計数し、ウエルの底の培地に残った細胞での測 定値と比較した。既に説明した毒性比率は、上澄み中に放出された放射活性の割 合が死んだ細胞によって表される。図１４には、サンプルの希釈度の関数として 、測定された細胞毒性が徐々に減少するという投与量−応答効果があることがわ かる。しかし、精製した因子では、同じ希釈間隔に渡って、曲線の傾きが大いに 増大していることに注意すべきである。このことは、我々のグリア毒性試験によ って測定される生物学的活性を伴う因子の精製及び分子濃縮の実現性を確信させ る。 図１５に例示した実施例では、表５に与えたデータをプロットした曲線を示し ており、そのデータは、ＭＳ患者（ＭＳ１）からの単球／マクロファージ培養上 澄み液をＰＢＳバッファーで連続して希釈したものに対するもので、その希釈液 は、上記のアストログリア列を起源とするアストログリア細胞のモノレイヤーか らなるウエルの培養媒質で、最終的に１／２０から１／５０００の範囲で希釈し て７２時間インキュベートした。ＣｏｎＡ−セファロースカラムを通してグリア 毒性フラクションを精製して得た同じＭＳ単球培地上澄み液のフラクションを、 同じプロトコールに従って希釈しインキュベートした。２通りの希釈サンプルと ７２時間インキュベートした後、培養ウエル中に生存可能に残っている細胞を上 述のメチルテトラゾリウム（ＭＴＴ）試験で検出し、これらの細胞の機能的ミト コンドリア酵素によって生成された着色物質を、上澄み液の光学密度を５７０か ら６３０ｎｍで測定することによって検査した。上で説明した光学密度は、培養 ウエルの底のサバイバル媒質中にある融合性のモノレイヤに残っているのと同数 の細胞を接種した各ウエルに残っている生きた細胞の量を表している。よって、 図１５には、サンプルの希釈度の増加につれて細胞の生き残りが徐々に増加する という投与量−応答効果が確かに存在することがわかる。しかし、精製した因子 では、同じ希釈間隔に渡って、曲線の傾きが大いに増大していることに注意すべ きである。このことは、この生きている細胞を定量化する技術によって、我々の グリア毒性試験によって測定される生物学的活性を伴う因子の精製及び分子濃縮 の実現性をさらに確信させる。 図１４及び１５に例示した最後の２実施例では、細胞の生き残りと細胞の枯死 という反対のパラメータを測定する技術が、完全に一致する結果を達成し、発揮 されるべきグリア毒性因子と同時に検出されるグリア毒性活性の生成の実現性を 可能にするが、著者の実験によって特性化されたグリア毒性因子とともに、本発 明の主題を形成する生物学的試験の識別能力及び信頼性を明確に示している。 よって、ＭＳに罹患した個体のインビボで発揮されうる細胞毒性、及びグリア 細胞の選択的標的化の発見に基づいて、細胞毒性、特にグリア毒性活性、この因 子に組み合わされた活性を検出し定量化する方法が発明され、発展し、異なる使 用条件でも確認された。さらに、前記方法は、このグリア毒性活性の分子ベース を、特にＭＳ患者を起源とする生物学的流体中の、約１７ＫＤ及び約２１ＫＤの ２種類の見かけの分子量を持つタンパク質フラクションの形に研究し特性化する ことを可能にした。非−変性条件下で、プロテイナーゼＫによって消化されない 部分があり、それはスペローゼ１２ＦＰＬＣカラムでの溶離によって１７ＫＤで のグリア毒性に結びついていることが見い出されたという事実は、（例えばプロ ペプチド等の）消化可能なペプチドを加えることにより、２１−ＫＤ形態を１７ −ＫＤ形態に分化させることを示唆する事ができる。これら２つの因子は、明ら かにタンパク質タイプであり、約１７ＫＤ及び約２１ＫＤでおそらくグロブラー であり、独立したペプチド鎖を結合するジスルフィド架橋を持たず、いくぶｎ親 水性であり、中性ｐＨにおいて負に帯電し、明らかにグリコシレーションされて いるが、事実は、Ｎ−グリコシダーゼＦ及びノイラミニダーゼ存在下でのインキ ュベーションでは、そのグリア毒性活性を消失させることはない。さらに、それ らは少なくともひとつのレクチン、コンカナバリンＡ即ちＣｏｎＡに対して非常 に高い親和性を示した。これらのタンパク質因子は、５６℃での３０分間のイン キュベーションには耐えるが、１００℃での１５分間の加熱では消失する生物学 的活性を有している。１７−ＫＤ形態と思われるこの生物学的活性は、プロナー ゼ、トリプシン及びプロテイナーゼＫといったプロテアーゼの作用に耐える。 上述の詳細な説明は、結局のところ、以下の特徴を独立に有するグリア毒性因 子を表現している。 ・グリア細胞に対する細胞毒性活性を持つ。 ・グリア細胞に対するこの細胞毒性は、少なくとも１つのグロブラ−グリコプ ロテインと結びついている。 ・その活性は、各々が１７ＫＤ及び２１ＫＤの分子量と結びついたまたは持っ た少なくとも２つのタンパク質フラクションと結合し、これらのフラクションの 各々はグリア毒性活性を持ち、１７−ＫＤフラクションは、プロナーゼ、トリプ シンまたはプロテイナーゼＫによって消化されず、これら２つのフラクションの 各々はコンカナバリンＡのようなレクチンに強い親和性を示す。 ・サンプル中に存在する因子のグリア毒性活性は、５６℃で３０分間の熱処理 、または−８０℃での冷凍とそれに続く＋３７℃での溶解では保持される。 ・因子は水溶性であり、粒子形ではない。 ・サンプル中に存在する因子のグリア毒性活性は、サンプルを非変性条件下で 、トリプシン、またはプロナーゼまたはプロテイナーゼＫで、あるいはＮ−グリ コシダーゼＦ及びノイラミニダーゼの混合物で処理した後でも保持される。 ・１次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特性化された因子 は、１７ＫＤ及び２１ＫＤの２つのバンドを示す。 ・グリア毒性因子は、レクチン支持体に対する強い親和性を保持している。 ・因子は、ＤＥＡＥ樹脂での１００ｍＭのＮａＣｌのｐＨ７．５の緩衝液で溶 離される。 ・支持体に結合したプロテインＡによって維持されず、よって、ＩｇＧから分 化される。 ・ＭＳ単球／マクロファージ培養上澄み液、及びＭＳのＣＦＳ及び血清中に見 い出される。 ・培地のアストログリアに対して定量化できる細胞毒性効果を生じ、それは、 早期における効果は中間線維のネットワークの破壊によって特徴づけられ、通常 は細胞死につながる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マンドラン，ベルナール フランス国 69100 ヴィリュバン リュ ドゥ ラ ドワ 21

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト及び動物のアストログリアに対して、それらの中間線維のネットワーク の細胞形態学的解体及び／またはそれらの中間線維のタンパク質の分解及び／ま たは特に枯死による細胞死をもたらす毒性活性を持つことを特徴とする単離した または精製したグリア毒性因子。 ２．その活性が、少なくとも１つのグロブラー・グリコプロテインを伴うことを 特徴とする請求項１記載の因子。 ３．グリア毒性因子において、イオン交換樹脂上に次いで、除去により分離する ための樹脂上で連続的に処理した後、前記グリア毒性因子が、約１７ｋＤの見か けの分子量を中心とする主要な軽いフラクションと、約２１ｋＤの見かけの分子 量を中心とするより少ない重いフラクションとからなり、少なくとも前記軽いフ ラクションが、非変性条件下において、プロナーゼ、トリプシンまたはプロテイ ナーゼＫの加水分解作用に対して耐性があり、前記２つのフラクションの各々が 、レクチン、特にコンカナバリンＡに対して強い親和性を示すことを特徴とする 因子。 ４．グリア毒性因子において、例えば、臨床的に活性な多発性硬化症の患者から の生物学的サンプルを出発材料とし、前記サンプルをイオン交換樹脂に次いで、 除去により分離するためのカラムで連続的に処理することにより、約１７ｋＤの 見かけの分子量を中心とする主要な軽いフラクションと、約２１ｋＤの見かけの 分子量を中心とするより少ない重いフラクションとからなり、少なくとも前記軽 いフラクションが、非変性条件下において、プロナーゼ、トリプシンまたはプロ テイナーゼＫの加水分解作用に対して耐性があり、前記２つのフラクションの各 々が、レクチン、特にコンカナバリンＡに対して強い親和性を示すグリア毒性因 子を得ることからなる方法を用いて得ることができることを特徴とする因子。 ５．生物学的サンプル中における請求項１から４のいずれかのグリア毒性因子の 存在及び／またはその量を検出することを特徴とする、多発性硬化症等の病理学 的活性を検出及び／またはモニター及び／または予知する方法。 ６．請求項１から４のいずれかのグリア毒性因子を含む生物学的サンプルの前処 理方法において、 前記サンプルをプロテインＡに接触させる、 前記サンプルをイオン交換樹脂に接触させる、 前記サンプルをレクチン、特にコンカナバリンＡに接触させる、 の少なくとも１つの処理で前記サンプルの処理を行うことを特徴とする方法。 ７．生物学的サンプル中で、請求項１から４のいずれかのグリア毒性因子の毒性 活性を検出及び／または定量する方法において、 前記生物学的サンプルを、アストログリア、特に不朽化したアストログリアを 含む適当な培養媒質中でインキュベートして、それらを培養可能とし、死亡した アストログリア及び／または生きているアストログリアを検出及び／または定量 することを特徴とする方法。 ８．死亡したアストログリア及び／または生きているアストログリアを検出及び ／または定量するために、各々、カルセイン−ＡＭ及びエチジウム・ホモダイマ ーを用いた比色検定法を用いることを特徴とする請求項７記載の方法。 ９．生きているアストログリアを検出及び／または定量するために、メチルテト ラゾリウム・ブロミドを用いた比色検定法を用いることを特徴とする請求項７記 載の方法。 １０．死亡したアストログリアを検出及び／または定量するために、⁵¹Ｃｒを用 いた放射活性検定法を用いることを特徴とする請求項７記載の方法。 １１．生物学的サンプル中で、請求項１から４のいずれかのグリア毒性因子の毒 性活性を検出及び／または定量する方法において、 前記生物学的サンプルを、アストログリア、特に不朽化したアストログリアを 含む適当な培養媒質中でインキュベートして、それらを培養可能とし、アストロ グリアのＤＮＡの切断及び／または中間線維のネットワークの細胞形態学的解体 及び／または前記中間線維のタンパク質の分解を検出及び／または定量すること を特徴とする方法。 １２．生物学的サンプル中で、請求項１から４のいずれかのグリア毒性因子の毒 性活性を検出及び／または定量する方法において、 前記因子を、レクチン、特にコンカナバリンＡで捕捉する過程及び／または前 記因子の前記レクチンに対する親和性に基づいた検出過程が行われることを特徴 とする方法。 １３．天然または合成のまたは遺伝子工学で得た請求項１から４のいずれかの因 子の一部または全部からなることを特徴とする診断及び／または治療及び／また は予防用組成物。 １４．リガンド、特に請求項１から４のいずれかの因子に特異的な抗体からなる ことを特徴とする診断及び／または治療及び／または予防用組成物。