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JPH0824578B2 - ｔＰＡの精製方法 - Google Patents

ｔＰＡの精製方法

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Publication number
JPH0824578B2
JPH0824578B2 JP63221843A JP22184388A JPH0824578B2 JP H0824578 B2 JPH0824578 B2 JP H0824578B2 JP 63221843 A JP63221843 A JP 63221843A JP 22184388 A JP22184388 A JP 22184388A JP H0824578 B2 JPH0824578 B2 JP H0824578B2
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JP
Japan
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tpa
proteins
impure
range
protein
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JP63221843A
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光義 森井
伸広 川嶋
邦三 森
正治 大岡
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三井東圧化学株式会社
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tP
A）の精製方法に関する。さらに詳しくは、tPAと他の不
純タンパクを含む粗製のtPAを陽イオン交換樹脂と接触
させることにより分子量７万ダルトンのtPAを分離、精
製する方法に関す。
〔従来技術と発明が解決しようとする課題〕
tPAは、高等動物の組織で産生されるものであって、
フィブリンに特有な分解酵素であるプラスミンの前駆物
質であるプラスミノーゲンを賦活化させる蛋白質であ
る。
tPAを医薬品として製造するためには、異種タンパク
質を完全に除去する必要がある。tPAにこのような異種
タンパク質が混入すると、これらの異種タンパク質は人
体投与において抗原性があらわれ、副作用の原因とな
る。
tPAの製造工程で混入する異種タンパク質の種類は細
胞培養法及び精製法により異なる。培養工程において
は、培養液の成分及び細胞の分泌物中に異種タンパク質
が大量に含まれる。
培養方法には胎児牛血清を用いて培養する方法及び無
血清培地で培養する方法がある。
胎児牛血清を用いて培養する場合、胎児牛血清が人に
対して抗原性を有する異種タンパク質群である。胎児牛
血清由来タンパク質は、多種類存在するがそれらタンパ
ク質の等電点はほとんどが４〜６の範囲である。
また、無血清培地を用いて培養する場合、使用する細
胞に合わせて必要な物質を添加して培養を行う。
必要な物質のうち、タンパク質としてはインシュリン
などのホルモン類及びトランスフェリンなどがよく利用
される。インシュリン及びトランスフェリンの等電点は
約５〜６である。
tPAには一本鎖tPAおよび二本鎖tPAが知られている
が、特に一本鎖tPAを取得する際、細胞培養時に培養液
にアプロチニン等のプロテアーゼインヒビターを添加し
tPAを生産することが知られている。
使用するプロテアーゼインヒビターも異種タンパク質
である。アプロチニンは等電点が10〜10.5である。
また、tPAを含む液として上記培養液を部分精製され
た液も含む。
tPAを精製する方法として、アフィニティクロマトグ
ラフィーが使用されている。例えば、コンカナバリンＡ
−セファロース（Rijken,D.C.＆Collen,D.,（1981）J.B
iol.Chem.256,7035−7041）、エリスリナトリプシンイ
ンヒビター（ETI）−セファロース（Heussen,C.,et.al
（1984）J.Biol.Chem.259,11635−11638）、抗ｔ−PA抗
体−セファロース（Ranby,M.,et.al.（1982）FEBS Let
t,146,289−292）、フィブリン−セファロース（特開昭
59−51220）などが挙げられる。これら固定化されたタ
ンパク質は、使用時に少量ではあるが溶離してくるのが
観察される。これらのタンパク質も異種タンパク質であ
る。これらタンパク質の等電点はコンカナバリンA4.4〜
5.5、ETI4.5〜5.5、免疫グロブリンG5.8〜7.3、フィブ
リノーゲン5.5〜5.8である。
本発明者らはtPAを製造するにあたり、考えられるこ
れら異種タンパク質を除去する方法について検討を重ね
た結果、陽イオン交換樹脂を用いる方法が特に優れてい
ることを見出し、本発明を完成した。
tPA精製に陽イオン交換体を使用した例は知られてい
る（特開昭60−174727）が、本発明における方法と異な
りtPA画分を回収するという部分精製の目的で使用され
ている。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、陽イオン交換体によるtPAの精製法に
ついて鋭意検討した結果、次のことを見出した。tPAは
その荷電以外の要因が加わり、陽イオン交換体により強
い相互作用を示し、その作用は不溶性担体の種類により
異なる。これらのことを利用してtPAを他の混入異種タ
ンパク質と分離する方法を考案した。
つまりtPAと他の不純タンパク質を含む液をtPAが吸着
するpH領域で陽イオン交換体に接触させてtPAを吸着さ
せる。中性から弱酸性のpH範囲が使用されうる。例えば
pH3〜７の範囲、好ましくはpH3.5〜6.0の範囲、より好
ましくはpH4.0〜5.0の範囲である。
次いでtPAの等電点同等乃至低い等電点を有する不純
タンパク質を除去できるpH領域で洗浄することによりこ
れら不純タンパク質を除去する。
例えば、pH4.5〜７の範囲、好ましくはpH5.5〜７の範
囲、より好ましくはpH5.2〜6.5の範囲が使用できる。
次いでtPAの等電点同等乃至高い等電点を有する不純
タンパク質を陽イオン交換基のpKaより低いpHで洗浄す
ることによりこれら不純タンパク質を除去する。
例えば、pH2.5〜4.0の範囲、好ましくはpH2.8〜3.5の
範囲が使用できる。
この後、tPAが安定であるpH領域でtPAを溶離する。例
えば、pH2〜10の範囲が使用でき、必要量の塩を加えて
溶解できる。pH2〜３の範囲では低塩濃度で高濃度のtPA
が回収できる。
本発明において使用できる陽イオン交換基としてはカ
ルボキシメチル基であり、水不溶性担体質としては多糖
類、アクリルアミドなどが挙げられる。
本発明の方法は、バッチ法及びカラム法のどちらでも
使用できる。
〔効果〕
本発明の方法によると異種タンパク質のみならず発熱
性物質パイロジェンを除去できる。また濃縮されたｔ−
PAを溶離できるため、濃縮操作、脱塩操作を用いること
なくそのまま医薬品として使用可能である。
〔実施例〕
以下本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞（ATCC CRLI424G36
1）を10％熱不活性（56℃、30分間）胎児牛血清を補充
したRPMI−1640組織培養媒体中で培養後、培養物を一度
洗い、40KIV/mlのアプロチニンを含む血清を含まない培
体中で24時間培養後、培体を集め収穫液とした。収穫液
に終濃度で1Mになるように食塩を添加し、1M食塩を含む
50mMリン酸緩衝液pH7.5で平衡化した抗ヒトtPA抗体−セ
ファロース（10mg抗体/ml樹脂）カラム50mlに通した。
平衡化緩衝液でカラムを洗浄後、2Mチオシアン酸アンモ
ニウムを含むグリシン−塩酸緩衝液pH3.5でtPAを溶出し
た。溶出されたtPA活性の回収率は88％であった。この
液に硫酸アンモニウムを300g/l割合で加え、４℃で一晩
攪拌した。この液を遠心分離して沈澱を回収し、0.05M
リン酸２水素１ナトリウム溶液（pH4.5）に対して透析
した。透析後の溶液を陽イオン交換樹脂カラムにかける
ための試料とした。この試料中にはtPA以外の培養液由
来の不純タンパク質及び抗ヒトtPA抗体450μｇが含まれ
ていた。培養液由来の不純タンパク質の含有量は胎児牛
血清由来タンパク質及びアプロチニンを指標とし、それ
らの抗体を用いた酵素免疫測定（EIA）により求めた。
その結果、胎児牛血清由来タンパク質は45μｇ、アプロ
チニンは70mgであった。
この試料を0.05Mリン酸２水素１ナトリウム溶液pH4.5
で平衡化したCM−トリスアクリルＭ（LKB）5mlに通し
た。通過液を集めプラスミノーゲン依存フィブリン溶液
活性を測定したが、活性は検出されなかった。
この後、tPAの等電点と同等乃至低い等電点を有する
不純タンパク質を除去する目的で0.05Mリン酸緩衝液pH
5.8 100ml、続いてtPAの等電点と同等乃至高い等電点を
有する不純タンパク質を除去する目的で0.05Mグリシン
−塩酸緩衝液pH3.2 100mlでカラムを洗った。これら洗
浄液中のtPA活性はカラムにかけた活性の約５％であっ
た。最後にtPAを0.1Mリン酸２水素１ナトリウム−リン
酸緩衝液pH2.5、50mlで溶出した。溶出されたtPA活性の
回収はカラムにかけた活性の約90％であった。
この溶出画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
後の染色で調べたところ、分子量約70,000ダルトンのバ
ンドのみが確認された。不純タンパク質の混入量はtPAm
g当たり胎児牛血清は約40ng、アプロチニンは約5ng、抗
ヒトtPA抗体は120ngであった。
実施例３ 陽イオン交換樹脂にかける試料は以下の方法で調製し
た。ヒトtPA遺伝子を組み込んだマウス線維芽細胞（Mou
se c127I ATCC CRL1616）培養液（インシュリン、トラ
ンスフェリン及び40KIE/mlのアプロチニンを含む）2lを
0.15M食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液pH7.5で平衡化した
フィブリン−セファロース（20mgフィブリン/ml樹脂）2
0mlに通した。吸着したタンパク質を含む樹脂は、1M食
塩を含む0.05M リン酸緩衝液pH7.5 400mlで洗浄した。
この後、0.5Mリジンを含む0.05Mリン酸１水素２ナト
リウム−水酸化ナトリウム pH10.0 200mlでタンパク質
を溶出した。溶出画分のプラスミノーゲン依存フィブリ
ン溶液活性を測定するとカラムにかけた活性の約90％が
回収された。溶出画分を50mMリン酸２水素１ナトリウム
pH4.5に対し透析し、これを試料として50mMリン酸２水
素１ナトリウムpH4.5で平衡化したCM−トリスアクリルM
20mlに通した。吸着したタンパク質を含む樹脂は、tPA
の等電点と同等乃至低い等電点を有する不純タンパク質
を除去する目的で25mMリン酸緩衝液pH6.0 400ml、続い
てtPAの等電点と同等乃至高い等電点を有する不純タン
パク質を除去する目的で0.05Mグリシン−塩酸緩衝液pH
3.2 400mlで洗浄後、50mM食塩を含む50mMリン酸２水１
ナトリウム−リン酸緩衝液pH2.5 100mlでｔ−PAを溶出
した。
tPAの回収は約90％であり、SDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動後の染色で調べたところ、分子量約70,000ダ
ルトンのバンドのみが確認された。また抗インシュリン
抗体、抗トランスフェリン抗体、抗フィブリノーゲン抗
体及び抗アプロチニン抗体を用い、ｔ−PA中のこれら抗
原物質の残存量を酵素免疫法で調べたところ、ｔ−PAmg
当たりインシュリンは5ng以下、トランスフェリンは10n
g以下、フィブリノーゲンは約30ng、アプロチニンは約2
ngであった。
実施例４ ヒト胎児肺細胞（ATCC MRC 5 CCL171）〔10％熱不活
性（56℃、30分間）胎児牛血清及び20KIE/mlアプロチニ
ンを含む〕10lをエリスリナトリプシンインヒビター（E
TI）を固定化したETI−セファロース（5mgETI/ml樹脂）
10mlに通した。
2M食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液pH7.5 200mlで洗浄
後、0.05M食塩を含む0.05Mクエン酸緩衝液pH4.7 50mlで
タンパク質を溶出した。溶出画分の活性の回収は約40％
であった。
この溶出画分を試料とし50mM食塩を含む0.05Mクエン
酸緩衝液pH4.7で平衡化したCM−セファロース10mlに通
した。吸着したタンパク質を含む樹脂は、その後tPAの
等電点と同等乃至低い等電点を有する不純タンパク質を
除去する目的で50mM食塩を含む0.05Mリン酸緩衝液pH6.0
200mlで洗浄後、続いてtPAの等電点と同等乃至高い等
電点を有する不純タンパク質を除去する目的で50mM食塩
を含む0.05Mクエン酸緩衝液pH2.8 200mlで洗浄した。こ
の後50mM食塩を含む0.05Mリン酸２水素１ナトリウム−
リン酸緩衝液pH2.0 50mlでtPAを溶出した。
カラムにかけた活性の約90％が回収され、SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動後の染色により分子量約70,0
00ダルトンの単一バンドが確認された。
抗胎児牛血清抗体、抗ETI抗体及び抗アプロチニン抗
体を用い、ｔ−PA中のこれら抗原物質の残存量を酵素免
疫測定法で調べたところ、tPAmg当たり胎児牛血清は約3
0ng、ETIは約5ng、アプロチニンは1ng以下であった。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の工程よりなるtPAの精製方法 a.tPAとその他に異種タンパク質を不純タンパク質とし
    て含む粗tPAを陽イオン交換体と密接に接触させ、tPAと
    不純タンパク質を陽イオン交換体に吸着させる工程、 b.tPAと同等乃至は低い等電点を有する不純タンパク質
    を除去でき、pH5.8〜6.2の範囲のpHを有する緩衝液で上
    記陽イオン交換体を洗浄する工程、 c.tPAと同等乃至は高い等電点を有する不純タンパク質
    を除去でき、pH2.8〜3.2の範囲のpHを有する緩衝液で上
    記陽イオン交換体を洗浄する工程、 d.上記陽イオン交換体からtPAを溶離して、選択的に分
    子量約７万ダルトンのtPAを取得する工程。
  2. 【請求項２】陽イオン交換体がカルボキシメチル基を有
    することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  3. 【請求項３】pH4.0〜4.7の範囲のpHを有する粗tPAを使
    用することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
JP63221843A 1988-09-05 1988-09-05 ｔＰＡの精製方法 Expired - Lifetime JPH0824578B2 (ja)

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