JP5969044B2 - アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、新規なアデノウイルス生産細胞株及びその用途に関する。

遺伝子治療は、癌を含めた多様な疾患の治療に当たって、新たに発明された治療法の１つである。このような遺伝子治療は、ターゲット疾患の治療に有用な遺伝子を探すと共に、その遺伝子をどれだけ効率的にターゲット組織に伝達するかによって、その成功が決定されうる。遺伝子を伝達するシステムとしては、多様な方法が存在するが、最近、脚光を浴びている伝達体としては、アデノウイルスベクターが挙げられる。

アデノウイルスが遺伝子伝達体として有用に使われる理由は、大きく３種であって、１）宿主細胞のゲノム内にウイルス遺伝子が挿入されず、２）分裂しない細胞にも容易に感染され、３）インビボでターゲット遺伝子を効率的に伝達することができるためである（非特許文献１）。しかし、このような長所を有したアデノウイルスにも、１つの問題点が存在するが、これは、組換えアデノウイルス生産時に、複製可能アデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＲＣＡ）が生産されるということである。

組換えアデノウイルスベクターは、他のウイルスベクターに比べて、比較的容易に量産可能であるだけではなく、ウイルスゲノムの初期領域１（Ｅ１）を欠失させることによって、簡単に複製能を喪失させ、あらゆるアデノウイルスベクターは、このような形態の複製不能の性質を有したウイルスベクターと言える。通常、このような複製不能の組換えアデノウイルスベクターの製作には、ウイルスゲノムの一部（ヌクレオチド１−４３４４ｂｐ）を有した細胞株であるＨＥＫ２９３を利用するが、これは、Ｅ１がウイルス生産に決定的な役割を果たすので、一時的にこれを供給することができる細胞株を利用することである。望ましくは、複製不能のアデノウイルスを生産する時、純粋に複製不能のウイルスのみが生産されなければならないが、ＨＥＫ２９３細胞内にアデノウイルスＥ１以外のウイルスゲノム部位とベクター内のウイルスゲノム部位との間の相同組替え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって複製可能アデノウイルスが生成される。

組換えアデノウイルス生産時に、ＲＣＡの生産は、次のような問題点を引き起こし得る：１）体内投与されたウイルスの複製程度を調節することができず、２）複製不能アデノウイルスを複製可能アデノウイルスへの切替えが発生し、３）遺伝子治療に必要な量以上のアデノウイルスの生産で組織損傷及び激しい毒性作用が発生する恐れがある（非特許文献２）。したがって、このような問題を解決するために、組換えアデノウイルスベクターを研究する多くの研究者らは、ＨＥＫ２９３細胞を代替して、ＲＣＡ生成可能性を減らしうるアデノウイルス生産細胞株を開発するために努力を傾けてきた。

ＨＥＫ２９３細胞は、アデノウイルスＥ１遺伝子以外にも、非常に多くのアデノウイルスゲノムを含んでいて、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターとの相同組替え可能性が高いので、それを代替する細胞は、ＨＥＫ２９３よりも少ない部位のアデノウイルスゲノムを含む方向に開発された。１９９０年代に最も先に開発されたアデノウイルス生産細胞株は、９１１という細胞であって、ヒト由来のレチノブラストを根幹とした細胞である。この細胞は、アデノウイルスゲノムの一部（ヌクレオチド７９−５７８９ｂｐ）を有した細胞であって、ＨＥＫ２９３細胞と比較して、ウイルス生産能は優れたが、ＲＣＡ生成程度は類似した（非特許文献３）。これと類似した時期にヒト気管支癌細胞であるＡ５４９細胞を利用したアデノウイルス生産細胞株も開発された。この細胞は、より少ない部位のアデノウイルスゲノム（ヌクレオチド５０５−４０３４ｂｐ）を有したことが特徴であったが、アデノウイルス生産能が落ちる短所で商用化されていない（非特許文献４）。商業的に最も広く知られたアデノウイルス生産細胞株であるＰＥＲ．Ｃ６は、前述した９１１細胞と同様に、ヒト由来のレチノブラストを根幹として開発されたアデノウイルス生産細胞株である。この細胞は、前述した細胞株に比べて、少ない部位のアデノウイルスゲノム（ヌクレオチド４５９−３５１０ｂｐ）を有したことが特徴である。ＨＥＫ２９３に比べて、ＲＣＡ生成可能性が非常に減少したが、この細胞株も、量産の場合でＲＣＡが生成されたことが報告されたことがある（非特許文献５）。それ以外にも、ヒトの子宮頸部癌細胞であるＨｅＬａ細胞を用いて細胞株を開発した例もあるが、ＲＣＡ生成可能性を大きく低めることができないか、ウイルス生産能が落ちるなどの理由で商用化されていない（非特許文献６、７）。

前述した従来のアデノウイルス生産細胞株の短所を改善するために、本発明者らは、１）少ない部位のアデノウイルスゲノムを有することによって、ＲＣＡ生成可能性が著しく低下し、２）アデノウイルス生産能がＨＥＫ２９３細胞と比較して、優れているか、あるいは類似したアデノウイルス生産細胞株を開発しようとした。

本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌ，１９９４ Ｌｏｃｋｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｉｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００１

本発明者らは、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）の生産可能性が低く、アデノウイルス生産能に優れる新規なアデノウイルス生産細胞株を開発するために鋭意研究した。その結果、特定の配列を有するＥ１コーディング変形遺伝子配列を有する細胞株を開発した。本発明のアデノウイルス生産細胞株は、アデノウイルス生産に必須的なアデノウイルスＥ１遺伝子（これによって発現されたタンパク質）を安定的に提供して、Ｅ１が欠失された組換えアデノウイルスを交流補充（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）し、相同組替えによるＲＣＡ生成可能性を減少させることができる。これにより、遺伝子治療に適したアデノウイルスの量を調節し、アデノウイルスの過剰生産による組織損傷及び毒性作用を阻止することができる。また、従来のアデノウイルス生産細胞株と比較して、優れたアデノウイルス生産能を表わして、時間−及びコスト−経済的に複製不能アデノウイルスを生産することができることを確認することによって、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、アデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子が導入された新規な細胞株を提供することである。

本発明の他の目的は、組換えアデノウイルス生産用の細胞株を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、組換えアデノウイルス生産用のパッケージングシステムを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、組換えアデノウイルスの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、目的タンパク質の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

Ｉ．細胞株
本発明の一様態によれば、本発明は、（ａ）動物細胞で作動可能であり、アデノウイルスに対して異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ）であるプロモーター、及び（ｂ）前記プロモーターに作動的に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）アデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子配列を含む発現コンストラクトがゲノムＤＮＡに導入された細胞株であって、前記Ｅ１コーディング変形遺伝子配列は、原始（ｎａｔｉｖｅ）Ｅ１遺伝子配列でＥ１ａのＴＡＴＡシグナル及びＥ１ｂのポリアデニル化シグナルが欠け、Ｅ１ａのコーディング配列、Ｅ１ａのポリアデニル化シグナル、Ｅ１ｂのＴＡＴＡシグナル、Ｅ１ｂ１９Ｋのコーディング配列、及びＥ１ｂ５５Ｋのコーディング配列を含むことを特徴とする細胞株を提供する。

本発明者らは、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）の生産可能性が低く、アデノウイルス生産能に優れる新規なアデノウイルス生産細胞株を開発するために鋭意研究した。その結果、特定の配列のＥ１コーディング変形遺伝子を含む細胞株を開発した。本発明のアデノウイルス生産細胞株は、アデノウイルス生産に必須的なアデノウイルスＥ１遺伝子（これによって発現されたタンパク質）を安定的に提供して、Ｅ１が欠失された組換えアデノウイルスを交流補充し、相同組替えによるＲＣＡ生成可能性を減少させることができる。これにより、遺伝子治療に適したアデノウイルスの量を調節し、アデノウイルスの過剰生産による組織損傷及び毒性作用を阻止することができる。また、従来のアデノウイルス生産細胞株と比較して、優れたアデノウイルス生産能を表わして、時間−及びコスト−経済的に複製不能アデノウイルスを生産することができることを確認した。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）の生産可能性が低くなった新規なアデノウイルス生産細胞株に関するものである。
（ｂ）本発明のアデノウイルス生産細胞株は、従来のアデノウイルス生産細胞株と比較して、相同組替えによるＲＣＡの生成可能性が低く、
（ｃ）ＲＣＡ生成可能性が著しく低くなることによって、アデノウイルスを利用した遺伝子治療時に、必要なウイルスの量を調節し、アデノウイルスの過剰生産による組織損傷及び毒性作用を阻止することができる。
（ｄ）また、従来のアデノウイルス生産細胞株であるＨＥＫ２９３細胞と比較して、優れたアデノウイルス生産能を表わして、時間−及びコスト−経済的な複製不能アデノウイルスを生産することができる。
（ｅ）したがって、本発明の細胞株は、複製不能アデノウイルスを効率的に生産して、遺伝子治療時に、安全な有効量のアデノウイルスを提供することができる。

アデノウイルスタイプ５のＥ１遺伝子をＰＣＲ法で確保し、これをｐＧｅｍＴベクターに結紮して、ｐＧｅｍＴ−Ｅ１ベクターの製造過程を示す模式図である。 マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）由来のレトロウイルスベクターからｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子が完全に除去されて、ウイルスコーディング塩基配列が全然なく、従来のレトロウイルスベクターの問題点であった相同組替えの危険性が排除されたベクターであるｐＭＴレトロウイルスベクターの構造を示す模式図である（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。 前記ｐＭＴレトロウイルスベクターにＩＲＥＳ／Ｎｅｏ^Ｒカセットが挿入されたｐＭＩＮレトロウイルスベクターの構造を示す模式図である（米国登録特許第ＵＳ６，４５１，５９５号）。 前記ｐＭＩＮレトロウイルスベクターにｐＧｅｍＴ−Ｅ１からＭｌｕ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉ制限酵素処理で得られたＥ１遺伝子切片を挿入することによって、ｐＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターを製造する過程を示す模式図である。 ｐＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターの構造を評価するための制限酵素マッピングを実施した結果である。 ３種の細胞株を対象にして４種の他のエンベロープを有するＧＦＰ発現レトロウイルスを伝達後、伝達効率を確認した結果を示すものであって、最適の伝達効率を見せるエンベロープを選別するための結果を示す図である。 アデノウイルスＥ１遺伝子を発現する３種の細胞株のウイルス生産能を評価した結果を示すものであって、各細胞株から生産されたＧＦＰ発現組換えアデノウイルスを再びＨｅＬａ細胞で形質感染を誘導して、伝達効率を確認することによって、ウイルス含量を評価した結果である。 前記の結果で最も優れたウイルス生産能を見せたアデノウイルスＥ１遺伝子発現ＨｅＬａ細胞のクローンを製造して、そのうち、最も優れたクローンを選別した結果を示す図である。 前記の結果から選別されたクローン（１６番、Ｈ２Ｃ１６と名付ける）の染色体上に挿入されたレトロウイルスの構造を評価するためのＰＣＲ分析結果を示す図である。 前記の結果から選別されたクローン（１６番、Ｈ２Ｃ１６と名付ける）の染色体上に挿入されたレトロウイルスの構造を評価するためのＰＣＲ分析結果を示す図である。 Ｈ２Ｃ１６の染色体上に挿入されたレトロウイルスベクターの位置を分析するための線形増幅媒介−重合酵素連鎖反応（Ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＬＡＭ−ＰＣＲ）分析結果を示すものであって、レーン（Ｌａｎｅ）１、２、５は、陰性反応結果であり、レーン３、４は、Ｈ２Ｃ１６クローンの濃度別の結果であり、ブラストデータは、レーン３、４で見せたあらゆるバンドを分離して、塩基配列を分析した結果を示す図である。 Ｈ２Ｃ１６の染色体上に挿入されたレトロウイルスベクターの位置を分析するための線形増幅媒介−重合酵素連鎖反応（Ｌｉｎｅａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＬＡＭ−ＰＣＲ）分析結果を示すものであって、レーン（Ｌａｎｅ）１、２、５は、陰性反応結果であり、レーン３、４は、Ｈ２Ｃ１６クローンの濃度別の結果であり、ブラストデータは、レーン３、４で見せたあらゆるバンドを分離して、塩基配列を分析した結果を示す図である。 Ｈ２Ｃ１６クローンからＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ発現を確認した結果であって、Ｅ１Ａは、ウェスタンブロットを通じてタンパク質発現を確認、Ｅ１Ｂ１９ＫとＥ１Ｂ５５Ｋは、ＲＴ−ＰＣＲを通じてＲＮＡ発現を確認した結果を示す図である。 Ｈ２Ｃ１６クローンの母細胞であるＨｅＬａ細胞と１０１日間継代培養し、細胞成長率を比較した結果、大きな差がないことを示す図である。 Ｈ２Ｃ１６クローンとＨＥＫ２９３細胞との組換えアデノウイルス生産能を比較した結果を示すものであって、小さな規模のウイルス生産を総３種の感染条件で進行して、２つの細胞株間の生産能を比較した結果である。 前記の生産条件よりも大きな規模のウイルス生産を進行し、ウイルス精製過程まで経た後、２つの細胞株から生産されたウイルスを定量して、細胞株間の生産能を比較した結果を示す図である。 Ｈ２Ｃ１６クローンとＧＨ３２９細胞とのアデノウイルス生産能を比較した結果を示すものであって、小さな規模のウイルス生産を総３種の感染条件で進行して、２つの細胞株間の生産能を比較した結果である。 Ｈ２Ｃ１６クローンで複製不能アデノウイルスを生産時に、ＲＣＡ生成可能性を評価した結果を示すものであって、ＨＥＫ２９３細胞と共に連続してウイルス生産及び増幅過程を経て、ＨＥＫ２９３に比べて、ＲＣＡ生成可能性が低いことを示すものであって、陰性群（Ｎｅｇ Ｃｏｎ．）及びＨｅｌａレーンは、陰性結果、ｐＭＩＮ−Ｅ１レーンは、陽性結果、ＨＥＫ２９３ １７^ｔｈ、ＨＥＫ２９３ １８^ｔｈ、Ｈ２Ｃ１６ １７^ｔｈ、及びＨ２Ｃ１６ １８^ｔｈレーンは、各細胞で収穫した１７番目、１８番目のアデノウイルスの結果を示す図である。 Ｈ２Ｃ１６クローンで複製不能アデノウイルスを生産時に、ＲＣＡ生成可能性を評価した結果を示すものであって、ＨＥＫ２９３細胞と共に連続してウイルス生産及び増幅、精製過程を経て、ＨＥＫ２９３に比べて、ＲＣＡ生成可能性が低いことを示す図である。陰性対照群（Ｎｅｇ Ｃｏｎ．）及びＨｅＬａレーンは、陰性結果、陽性対照群（Ｐｏｓ Ｃｏｎ．）レーンは、陽性結果、Ｈ２Ｃ１６ １ｔｈ、２ｎｄ、３ｒｄ、４ｔｈ、及びＨＥＫ２９３ １ｔｈ、２ｎｄ、３ｒｄ、４ｔｈレーンは、各細胞で収穫して精製した１番目、２番目、３番目、４番目のアデノウイルスの結果を示す図である。 Ｈ２Ｃ１６クローンとＨｅＬａ細胞での３Ｅ８抗体生産能を比較したものであって、形質感染後、それぞれの細胞株で収穫した上澄み液の３Ｅ８抗体含量をＥＬＩＳＡを用いて測定した結果である。

本発明の細胞株は、（ａ）動物細胞で作動可能であり、アデノウイルスに対して異種性であるプロモーター、及び（ｂ）前記プロモーターに作動的に結合されたアデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子配列を含む発現コンストラクトがゲノムＤＮＡに導入されている。

原始Ｅ１遺伝子配列は、変形（例えば、ヌクレオチドの欠失または突然変異）のない遺伝子配列であって、前記原始Ｅ１遺伝子配列は、Ｅ１ａのＴＡＴＡシグナルとポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル、Ｅ１ｂのＴＡＴＡシグナルとｐｏｌｙＡシグナルとを含んでいる。本発明のＥ１コーディング変形遺伝子配列は、前記Ｅ１ａのＴＡＴＡシグナル及びＥ１ｂのｐｏｌｙＡシグナルが欠けている。また、本発明のＥ１コーディング変形遺伝子配列は、Ｅ１ａをコーディングするヌクレオチド配列とＥ１ａのｐｏｌｙＡシグナルとを含み、Ｅ１ｂのＴＡＴＡシグナル、Ｅ１ｂ１９Ｋをコーディングするヌクレオチド配列及びＥ１ｂ５５Ｋをコーディングするヌクレオチド配列を含む。

本発明の特徴の１つは、Ｅ１コーディング変形遺伝子配列を使うことであり、望ましくは、アデノウイルスタイプ５遺伝子から由来されたＥ１コーディング変形遺伝子配列を使い、より望ましくは、アデノウイルスタイプ５遺伝子から由来された配列リスト第１配列のＥ１コーディング変形遺伝子配列を使う。配列リスト第１配列は、ヒトアデノウイルス血清型５（ＮＣＢＩアセンションナンバー：ＡＹ３３９８６５）のＥ１遺伝子コーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）であって、前記配列リスト第１配列は、ヒトアデノウイルス血清型５全体ゲノム配列のうち、５６０番目のヌクレオチドから３５０９番目のヌクレオチドまでの配列である。

本発明のＥ１コーディング変形遺伝子配列は、機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）Ｅ１タンパク質を生産し、後続で利用される組換えアデノウイルスベクターとの相同性組替えが最小化されるように、天然的（ｎａｔｕｒａｌ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）Ｅ１遺伝子が変形されたものである。本発明で使うＥ１コーディング変形遺伝子配列は、前記配列リスト第１配列に対して実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または実質的な類似性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を表わす遺伝子配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記本発明のＥ１コーディング変形遺伝子配列と任意の他の配列とを最大限対応してアラインし、当業者で通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、より望ましくは、９０％の相同性、最も望ましくは、９５％の相同性を表わす遺伝子配列を意味する。前記の実質的な類似性は、１つ以上の塩基の欠損または挿入のようなＥ１コーディング変形遺伝子配列の変化が組換えアデノウイルスベクターとの相同性組替えを最小化する本発明の目的に影響を及ぼさない変化を総称する。したがって、本発明のＥ１コーディング変形遺伝子配列は、例示された配列リスト第１配列に限定されず、本発明が目的する最終生成物の活性に実質的に影響を与えない限り、本発明の権利範囲に含まれると解釈される。

本発明で利用される発現コンストラクトは、動物細胞、望ましくは、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーターを含む。本発明に適したプロモーターは、哺乳動物ウイルスから由来されたプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノムから由来されたプロモーターを含み、例えば、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス初期プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。最も望ましくは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターである。

本発明で利用される発現コンストラクトでＥ１コーディング変形遺伝子は、プロモーターに作動的に連結されている。本明細書で、用語“作動的に結合された”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／または解毒を調節する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記発現コンストラクトは、選択標識−コーディングヌクレオチド配列をさらに含む。本発明で利用される発現コンストラクトは、選択標識として抗生剤耐性遺伝子及びレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ及びβ−グルクロニダーゼ）をさらに含みうる。前記抗生剤耐性遺伝子は、当業者で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子があり、望ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子である。前記の選択標識は、別途のプロモーターまたはＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）によって連結された発現システムによっても発現され、本発明で利用されるＩＲＥＳは、何種のウイルス及び細胞のＲＮＡｓから発見される調節配列である（ＭｃＢｒａｔｎｅｙ ｅｔ．ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：９６１（１９９３））。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明で利用される発現コンストラクトは、５’→３’方向にＭＬＶの５’−ＬＴＲ、配列リスト第１配列のＥ１コーディング変形遺伝子配列、選択標識−コーディングヌクレオチド配列、及びＭＬＶの３’−ＬＴＲ”構造を有する。より望ましくは、本発明で利用される発現コンストラクトは、５’→３’方向にＭＬＶの５’−ＬＴＲ、配列リスト第１配列のＥ１コーディング変形遺伝子配列、ＩＲＥＳ、抗生剤耐性遺伝子、及びＭＬＶの３’−ＬＴＲ”構造を有する。

前記発現コンストラクトが導入される細胞は、多様な細胞を含み、望ましくは、Ａ５４９（Ｃａｒｃｉｎｏｍｉｃ Ｈｕｍａｎ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｂａｓａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ）、ＨＥＲ（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔ）、ＨｅＬａ（Ｈｕｍａｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌ）、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｌｌ）、アフリカ緑猿の腎臓細胞、コッカースパニエルの腎臓細胞、３Ｔ３（Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌ）、ミエローマ、ＰＣ１２（Ｒａｔ Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ Ｃｅｌｌ）、ヒト羊膜細胞（Ｈｕｍａｎ Ａｍｎｉｏｃｙｔｅ）、ＷＳ１（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ＭＲＣ５（Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、またはＷＩ３８（Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌ）である。最も望ましくは、本発明で利用される細胞は、ＨｅＬａ細胞である。

前記細胞株には、１個または複数個の発現コンストラクトがゲノムＤＮＡに導入され、望ましくは、前記細胞株には、前記発現コンストラクト１個コピー（ｃｏｐｙ）がゲノムＤＮＡに導入される。

ヒトアデノウイルスは、６０−９０ｎｍサイズの外膜のない２０面体粒子である。今まで、５１個の血清型が同定され、これらは、血球凝集特性及び配列相同関係を基準に６個のサブグループ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ）に分類される（Ｆｒａｎｃｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９１、ヨーロッパ特許第９７８５６６号）。そのうち、サブグループＣに属するアデノウイルスタイプ５が、本発明のアデノウイルスベクターを得るための最も望ましい出発物質であり、アデノウイルスタイプ５に対する生化学的及び遺伝的情報は、よく知られている。望ましくは、本発明でヒト由来のアデノウイルスタイプ５の初期領域（Ｅａｒｌｙ ｒｅｇｉｏｎ）−１（Ｅ１）遺伝子が利用される。

アデノウイルス感染サイクルでウイルス遺伝子は、２段階に発現されるが、第１段階は、感染からウイルスＤＮＡ複製までの期間であり、第２段階は、ウイルス複製開始時点と一致する。第１段階では、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４によってコードされる初期遺伝子生成物のみが発現されるが、これらは、ウイルスの構造タンパク質合成のための必須的な機能を行う（Ｂｅｒｋ，１９８６）。第２段階では、初期遺伝子生成物以外に後期遺伝子生成物が発現され、この際、宿主細胞のＤＮＡ合成及びタンパク質合成は中断される（Ｔｏｏｚｅ，１９８１）。アデノウイルスＥ１遺伝子は、細胞感染後、最も先に発現される遺伝子であって、２つの転写単位、すなわち、Ｅ１ＡとＥ１Ｂ遺伝子で構成されている。Ｅ１Ａ遺伝子から発現されるタンパク質の主要作用は、１）停止された細胞のサイクルを再び戻るようにして、細胞ＤＮＡ合成を再開することであり、２）Ｅ１Ｂ遺伝子とそれ以外の初期遺伝子（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）との転写を活性化することである。Ｅ１Ｂ遺伝子から発現されるタンパク質は、宿主タンパク質合成を抑制し、ウイルス遺伝子の発現を促進することによって、Ｅ１Ａを助けてウイルスを複製する。前述したように、アデノウイルスＥ１遺伝子は、ウイルス複製に重要な役割を担当しており、これを欠失させる場合、複製能を喪失する。したがって、遺伝子治療に使われる一般的な組換えアデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が欠失されている。

本発明の具体的な実施例によれば、アデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子を得るために、適したプライマーを用いて重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を実施して、配列リスト第１配列のＥ１コーディング変形遺伝子を得る。

遺伝子治療に使われるＥ１遺伝子−欠失組換えアデノウイルスを交流補充することができるＥ１−含む細胞株を得るために、前記収得したＥ１コーディング変形遺伝子が含まれたレトロウイルスベクターを製作する。レトロウイルスベクターは、宿主細胞の染色体内に伝達遺伝子を挿入させることができて、安定かつ持続的な伝達遺伝子の発現を誘導し、遺伝子伝達に度々使われる脂質系を使うトランスフェクション方法に比べて、染色体内への挿入効率に優れている（Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

下記の実施例に、本発明で使われたレトロウイルスベクターの具体的な例が記載されている。本発明に適したレトロウイルスベクターは、ＭＬＶ−由来ベクターであって、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子が完全に除去されて、ウイルスコーディング塩基配列が全然なく、従来のレトロウイルスベクターの問題点であった相同組替えの危険性が排除されたベクターである。本発明者らは、前記のレトロウイルスベクターを自体開発して、既に多くの研究を通じて優れた遺伝子伝達効率と安定性とを検証し、このような結果を多くの国際学術誌に出版した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

Ｅ１コーディング変形遺伝子配列を含むレトロウイルスベクターを構築するために、Ｅ１コーディング変形遺伝子配列をレトロウイルスゲノムに挿入させれば、前記配列を含んだレトロウイルスが生産される。また、ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）を生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖをコーディングするベクターを共に導入させて、レトロウイルスパッケージング細胞株を構築することができる。アデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子、ＬＴＲ及びΨ配列を含む組換えプラスミドを前記細胞株に導入すれば、Ψ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体の生産を可能にし、この転写体は、ウイルスでパッケージングされ、ウイルスは、培地に排出される（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ“Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．），Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４−５１３（１９８８））。前記組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、濃縮して遺伝子伝達システムとして利用できる。

一方、前記レトロウイルスは、対象細胞への効率的な形質感染を誘導するために、適切なエンベロープを有しうる。前記エンベロープは、多様なウイルスのエンベロープであり、水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープ、テナガザル白血病ウイルス（Ｇｉｂｂｏｎ Ａｐｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ、ＧａＬＶ）エンベロープ、猫白血病ウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ、ＦｅＬＶ）エンベロープ、またはモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）エンベロープを含む。望ましくは、水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質エンベロープである。

前記のように生産されたレトロウイルスを適した細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）に感染させて、Ｅ１コーディング変形遺伝子配列がゲノムに挿入された本発明の細胞株を収得する。

本発明の最も望ましい具現例によれば、本発明の細胞株は、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７１に寄託されたＨ２Ｃ１６細胞株である。Ｈ２Ｃ１６細胞株は、ＨｅＬａ細胞由来細胞株であって、そのゲノムに配列リスト第１配列のＥ１コーディング変形遺伝子配列１コピーが挿入されたものである。

本発明の細胞株は、アデノウイルスの生産において、組換えアデノウイルスベクターとの相同組替えが抑制されて、複製可能アデノウイルス（ＲＣＡ）の生産可能性を最小化するだけではなく、アデノウイルスＥ１遺伝子（これによって発現されたタンパク質）を安定的に提供して、Ｅ１が欠失された組換えアデノウイルスを交流補充することができて、効率的に複製不能アデノウイルスを生産可能にする。

ＩＩ．組換えアデノウイルス生産用の細胞株
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、前記本発明の細胞株にアデノウイルスベクターが含まれている組換えアデノウイルス生産用の細胞株を提供する。

本発明の組換えアデノウイルス生産用の細胞株は、前述した本発明の細胞株にさらにアデノウイルスベクターが導入されたものであって、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本発明の組換えアデノウイルス生産用の細胞株に導入されるアデノウイルスベクターは、当業者に公知の如何なるアデノウイルスベクターも含む。望ましくは、本発明で利用されるアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の配列が一部または全部欠失されて、Ｅ１タンパク質を形成することができないか、または不活性の（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｅ１タンパク質を形成するベクターである。

本発明に利用されるアデノウイルスベクターは、１００−２００ｂｐのＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含み、これは、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必須的なシスエレメントである。本発明に利用されるアデノウイルスベクターは、Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコーディングする。本発明に利用されるアデノウイルスベクターは、Ｅ３領域を含むか、または含まない。Ｅ３領域が除去されたアデノウイルスベクターを利用する場合、この欠失部位は、外来遺伝子が挿入される位置を提供する（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３−５５１（１９８２）；及びＲｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０６６−１０７３（１９８９））。また、外来遺伝子は、欠失されたＥ１領域に挿入され、欠失されたＥ４領域に挿入されることもある。外来遺伝子が欠失されたＥ１領域に挿入される場合、Ｅ１領域のアップストリームには、適したプロモーター（前述された）が位置して、欠失Ｅ１領域に挿入された外来遺伝子の発現を調節する。本明細書で、ウイルスゲノム配列と関連して使われる用語、“欠失”は、当該配列が完全に欠失されたものだけではなく、部分的に欠失されたものも含む意味を有する。

また、アデノウイルスベクターによって形成されるアデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッキングすることができるために、約２ｋｂをさらにパッケージングすることができる（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，６：１７３３−１７３９（１９８７））。したがって、アデノウイルスベクターに挿入される外来配列をアデノウイルスのゲノムにさらに結合させることもできる。アデノウイルスベクターによって運ばれる外来遺伝子は、エピソームと同じ方式で複製され、これにより、宿主細胞に対して遺伝的毒性が非常に低い。

本発明の細胞株によって生産される組換えアデノウイルスは、一部または全部が複製不能である。望ましくは、本発明の細胞株によって生産される組換えアデノウイルスは、全部が複製不能である。本明細書で、組換えアデノウイルスを言及しながら使われる用語“全部不能”は、実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）全部不能を意味する。例えば、本発明の細胞株の培養上澄み液に存在するアデノウイルスのゲノムをＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）で増幅して、Ｅ１領域があるか否かを分析した場合、ＰＣＲの敏感度レベルでＥ１領域がないと決定されるレベルが“全部不能”に該当する。

最終的に製造される組換えアデノウイルスの治療学的効能を高めるために、本発明で利用されるアデノウイルスベクターは、さらに治療遺伝子を含みうる。例えば、アデノウイルスベクターにさらに含まれる治療遺伝子は、癌細胞の死滅を誘導し、究極的に腫瘍を退化させる癌治療遺伝子であって、腫瘍抑制遺伝子、免疫調節遺伝子［例：サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子、及び共刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ：Ｂ７．１とＢ７．２のようなＴ細胞活性に必要な補助分子）］、抗原性遺伝子、自殺遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親−細胞死滅遺伝子、抗−新生血管生成遺伝子、及びアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）が含まれ、これらに限定されるものではない。

自殺遺伝子は、細胞が外部因子によって殺傷されやすいように誘導する物質を発現するか、細胞に毒性条件を誘発する核酸配列である。このような自殺遺伝子としてよく知られたものは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である（米国特許第５，６３１，２３６号及び第５，６０１，８１８号）。ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）の投与によって選択的な死滅に敏感である。腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍の形成を抑制するポリペプチドを暗号化する遺伝子を示す。腫瘍抑制遺伝子は、哺乳動物で天然発生遺伝子であり、この遺伝子の欠失または不活性化は、腫瘍発生に必須前提であると信じられている。腫瘍抑制遺伝子の例としては、ＡＰＣ、ＤＰＣ４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＭＴＳ１、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＶＨＬ、ｐ５３、Ｒｂ、ＭＭＡＣ−１、ＭＭＳＣ−２、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２９：６４２（１９８７））、腺腫様ポリープ症長タンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎ；米国特許第５，７８３，６６６号）、染色体３ｐ２１．３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：３０４２−３０４７（１９９８））、欠損された結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＴＳ１、ＣＤＫ４、ＶＨＬ、ｐ１１０Ｒｂ、ｐ１６、及びｐ２１を含んだ腫瘍抑制遺伝子のＩＮＫ４系の一員及びその治療学的に有効な断片（例、ｐ５６Ｒｂ、ｐ９４Ｒｂなど）が含まれる。当業者は、前記例示された遺伝子以外に、その他の知られた抗腫瘍遺伝子いずれもが本発明に使われるということを理解できる。

用語“抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ）”は、標的細胞内で発現されて、免疫システムで認識することができる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）及びＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＡＦＰ（α−Ｆｅｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐ５３（ＷＯ９４／０２１６７）が含まれる。免疫システムを容易に認識させるために、前記抗原性遺伝子をＭＨＣ第Ｉ型抗原に結合させることができる。

用語“細胞毒性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｅｎｅ）”は、細胞内で発現されて、毒性効果を表わすヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコーディングするヌクレオチド配列が含まれる。

用語“細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ｇｅｎｅ）”は、細胞内で発現されて、細胞周期途中で細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン−従属性キナーゼ抑制因子をコーディングする遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８、及びｐ１９）、成長中止特異性ホメオボックス（ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｅｏｂｏｘ、ＧＡＸ）遺伝子（ＷＯ９７／１６４５９及びＷＯ９６／３０３８５）などがあり、これらに限定されるものではない。

また、各種疾患の治療に有用に使われる多くの他の治療遺伝子も、組換えアデノウイルスベクターによって運ばれる。例えば、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、サイトカイン（例、インターフェロン−α、−β、−δ、及び−γ）、インターロイキン（例、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１９、及びＩＬ−２０）、及びコロニー刺激因子（例、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ）を暗号化する遺伝子、ケモカイングループ（単核球化学走性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単核球化学走性タンパク質２（ＭＣＰ−２）、単核球化学走性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、単核球化学走性タンパク質４（ＭＣＰ−４）、大食球炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、大食球炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）、大食球炎症性タンパク質１γ（ＭＩＰ−１γ）、大食球炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ−３α）、大食球炎症性タンパク質３β（ＭＩＰ−３β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、大食球炎症性タンパク質４（ＭＩＰ−４）、大食球炎症性タンパク質５（ＭＩＰ−５）、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−イプシロン（ｐ５００）、胸腺活性化−調節されるケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒトタンパク質ＨＣＣ−１／ＮＣＣ−２、ヒトタンパク質ＨＣＣ−３、マウスタンパク質Ｃ１０など）を暗号化する遺伝子も含まれる。また、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼを発現する遺伝子及び持続的な血栓効果を提供して、コレステロール過多血症を予防するＬＡＬ生成遺伝子が含まれる。また、嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症及びＡＩＤＳのようなウイルス、悪性及び炎症疾患及び状態を治療するための多くのポリヌクレオチドが知られている。

本明細書で、用語“親−細胞死滅遺伝子（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｇｅｎｅ）”は、発現されて、プログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親−細胞死滅遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５から由来）またはアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ（Ａｄから由来）、アデノウイルスＥ４遺伝子、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコーディングする遺伝子が含まれる。

本発明の明細書で、用語“抗−新生血管生成遺伝子（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｇｅｎｅ）”は、発現されて、抗−新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗−新生血管生成因子には、アンギオスタチン、Ｔｉｅ２（ＰＮＡＳ，１９９８，９５，８７９５−８００）のような血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。

ＩＩＩ．組換えアデノウイルス生産用のパッケージングシステム
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、（ａ）前記細胞株と、（ｂ）アデノウイルスベクターを含む組換えアデノウイルス生産用のパッケージングシステムと、を提供する。

本発明の組換えアデノウイルス生産用のパッケージングシステムは、前述した本発明の細胞株にさらにアデノウイルスベクターが含まれたものであって、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

一方、本発明の組換えアデノウイルス生産用のパッケージングシステムは、前述した組換えアデノウイルス生産用の細胞株についての詳細な説明を参照して説明される。但し、パッケージングシステムは、アデノウイルスベクターが細胞内ではない細胞外にあるものが組換えアデノウイルス生産用の細胞株と異なる。

ＩＶ．組換えアデノウイルスの生産方法
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含む組換えアデノウイルスの生産方法を提供する：
（ａ）（ｉ）動物細胞で作動可能であり、アデノウイルスに対して異種性であるプロモーター、及び前記プロモーターに作動的に結合されたアデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子配列を含む発現コンストラクトを含むベクターであって、前記Ｅ１コーディング変形遺伝子配列は、原始Ｅ１遺伝子配列でＥ１ａのＴＡＴＡシグナル及びＥ１ｂのポリアデニル化シグナルが欠け、Ｅ１ａのコーディング配列、Ｅ１ａのポリアデニル化シグナル、Ｅ１ｂのＴＡＴＡシグナル、Ｅ１ｂ１９Ｋのコーディング配列、及びＥ１ｂ５５Ｋのコーディング配列を含むことを特徴とするベクター；（ｉｉ）レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子配列を含むベクター；（ｉｉｉ）レトロウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子配列を含むベクターが導入された細胞でレトロウイルスを収穫する段階と、（ｂ）前記段階（ａ）のレトロウイルスを細胞に感染させて、アデノウイルス生産細胞株を準備する段階と、（ｃ）前記段階（ｂ）のアデノウイルス生産細胞株にＥ１領域の配列が欠失されたアデノウイルスベクターを感染させる段階と、（ｄ）前記段階（ｂ）の細胞株を培養液で培養する段階と、（ｅ）前記培養液からアデノウイルスを収穫する段階。

本発明の方法は、前記発現コンストラクトを利用するために、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。本発明の方法をそれぞれの段階別に詳しく説明すれば、次の通りである：

段階（ａ）：レトロウイルスの収獲
まず、適したベクターが導入された細胞でレトロウイルスを収穫する。

本発明の方法によれば、前記ベクターは、（ｉ）動物細胞で作動可能であり、アデノウイルスに対して異種性であるプロモーター、及び前記プロモーターに作動的に結合されたアデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子配列を含む発現コンストラクトを含むベクターであって、前記Ｅ１コーディング変形遺伝子配列は、原始Ｅ１遺伝子配列でＥ１ａのＴＡＴＡシグナル及びＥ１ｂのポリアデニル化シグナルが欠け、Ｅ１ａのコーディング配列、Ｅ１ａのポリアデニル化シグナル、Ｅ１ｂのＴＡＴＡシグナル、Ｅ１ｂ１９Ｋのコーディング配列、及びＥ１ｂ５５Ｋのコーディング配列を含むことを特徴とするベクター；（ｉｉ）レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子配列を含むベクター；（ｉｉｉ）レトロウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子配列を含むベクターである。

前記ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の多様な方法を通じて実施することができる。例えば、微小注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０）；及びＨａｒｌａｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０１：１０９４−１０９９（１９８５））、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）；及びＣｈｅｎとＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２（１９８７））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１：８４１（１９８２）；及びＴｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８（１９８６））、リポソーム−媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０）；Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０（１９８２）；及びＮｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６（１９８７））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））方法によってベクターを細胞内に移入させることができる。望ましくは、リン酸カルシウム沈澱法を用いて形質転換を実施する。

前記のベクターが形質導入された細胞は、アデノウイルスＥ１遺伝子と選別マーカー（例えば、ネオマイシン抵抗遺伝子）とを同時に発現する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記段階（ａ）のｅｎｖ遺伝子配列は、水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープ、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）エンベロープ、猫白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープ、またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープをコーディングする遺伝子配列であり、より望ましくは、ＶＳＶ−Ｇ、ＦｅＬＶ、またはＭＬＶエンベロープをコーディングする遺伝子配列であり、さらに望ましくは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープをコーディングする遺伝子配列である。

段階（ｂ）：レトロウイルスを利用したアデノウイルス生産細胞株の準備
引き続き、段階（ａ）のレトロウイルスを適した細胞（例えば、動物細胞）に感染させて、組換えアデノウイルス生産細胞株を準備する。

レトロウイルスの感染後、形質感染された細胞が群落を形成するまで一定時間培養して、細胞株クローンを選別する。クローンの選別は、レトロウイルスが導入された細胞株を培養して、培地内の選別物質（例えば、抗生剤）を添加した後、抵抗性がある細胞を集合プール（ｐｏｏｌ）で集めて選別するか、それぞれのクローンで選別する方法いずれもを利用できる。

本発明の望ましい具現例によれば、前記段階（ａ）のレトロウイルスをＨｅＬａ細胞に感染させ、ネオマイシン含む培地に培養して、ネオマイシン耐性細胞株を生産する。形質感染の効率を高めるために、レトロウイルス添加時に、選択的にポリブレンを添加することができる。

本発明の望ましい一実施例によれば、Ｅ１遺伝子導入のために伝達されたレトロウイルスベクターは、細胞の染色体上に正しい構造を保持したまま挿入される。

段階（ｃ）：Ｅ１領域の配列が欠失されたアデノウイルスベクターの感染
前記細胞株を準備した後、Ｅ１領域の配列が欠失されたアデノウイルスベクターを導入させる。

利用されるアデノウイルスベクターは、前述した通りである。望ましくは、前記アデノウイルスベクターは、適したレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ遺伝子）を含む。前記Ｅ１コーディング変形遺伝子配列が導入された細胞株にＧＦＰ発現アデノウイルスベクターを導入して、ＧＦＰ発現量を測定し、これを通じて、アデノウイルス生産能に優れる細胞株を選別することができる。アデノウイルスの生産能の評価は、蛍光顕微鏡、免疫ブロッキング（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）、蛍光活性細胞分離（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、重合酵素連鎖反応、または柔細胞分析器（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）がいずれも利用可能であり、これらに限定されるものではない。本発明の一実施例によれば、本発明の形質転換された細胞株でアデノウイルス生産量とＧＦＰの発現量とが相関関係があることを柔細胞分析器を通じて確認することによって、組換えアデノウイルス生産能に優れる細胞株を容易に選別することができる。

段階（ｄ）：組換えアデノウイルス生産細胞株の培養
前記段階（ｃ）の細胞株を組換えアデノウイルスのアセンブリー及び生産が発生するように許容される条件下で培養する。

前記細胞株は、前記組換えアデノウイルスのアセンブリー及び生産を許容するあらゆる必要な要素を含む。組換えアデノウイルスベクターのアセンブリー及び生産に必須的な要素は、当業者によく知られている（米国特許第５，９９４，１２８号）。前記細胞株でＥ１欠失された組換えアデノウイルスの生産がなされ、前記細胞株は、パッケージング細胞、いわゆる補充細胞と言う。このような細胞は、組換えアデノウイルスの生産に必須的な欠損された−アデノウイルスの遺伝情報を提供する。

パッケージング細胞は、組換えアデノウイルスベクターにＥ１遺伝子の欠失以外に機能的な欠乏がある時、例えば、Ｅ２、Ｅ４のようなアデノウイルス機能を補充するためのアデノウイルス配列を含みうる。パッケージング細胞の補完的な遺伝子情報は、ゲノムに統合されているか、またはプラスミド、コスミドなどの非染色体コピーに存在することができる。

段階（ｅ）：アデノウイルスの収獲
前記培養液及び細胞でアデノウイルスを収穫する。

該収穫したアデノウイルスは、臨床適用のための精製過程をさらに経ることができる。ウイルスの精製は、分別遠心分離法、密度勾配遠心分離法（Ｃｒｏｙｌｅ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ ３：３６５−３７２（１９９８））、カラムクロマトグラフィー（Ｂｌａｎｃｈｅ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７：１０５５−１０６２（２０００）、Ｈｕｙｇｈｅ ＢＧ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：１４０３−１４１６（１９９５））、エキスパンデッドクロマトグラフィー（Ｐｅｉｘｏｔｏ Ｃ ｅｔ ａｌ，，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２：１２１−１２６（２００６））、ウイルス沈澱法、汚染物変性法、及び酵素を利用した細胞成分破壊法などを利用できる。

精製過程を経た本発明のアデノウイルスは、遺伝子治療または腫瘍ワクチン化と抗−ウイルスワクチン化とを含み、予防及び／または治療ワクチンのようなさまざまな状況に使われる。

Ｖ．目的タンパク質の製造方法
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含む目的タンパク質の製造方法を提供する：
（ａ）前述した本発明の細胞株に目的タンパク質−コーディングヌクレオチド配列を含むベクターを導入して、形質転換された細胞株を収得する段階と、（ｂ）前記段階（ａ）によって製造された形質転換された細胞株を培養する段階と、（ｃ）前記形質転換された細胞株から生産された目的タンパク質を分離及び精製する段階。

段階（ａ）：目的タンパク質−コーディングヌクレオチド配列を含むベクターの導入
まず、前記アデノウイルスＥ１欠失遺伝子が導入された細胞株に目的タンパク質−コーディングヌクレオチド配列を含むベクターを導入させる。

目的タンパク質−コーディングヌクレオチド配列を含むベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターについての説明は、前述した内容を参照することができる。目的タンパク質−コーディングヌクレオチド配列は、アデノウイルスベクターの多様な部位、例えば、欠失されたＥ１、Ｅ３またはＥ４領域に挿入されうる。

本発明の目的タンパク質−コーディングヌクレオチド配列を含むベクターは、“プロモーター−目的タンパク質コーディングヌクレオチド配列−ポリＡ配列”の発現コンストラクト構造を有し、前記“プロモーター−目的タンパク質ヌクレオチド配列−ポリＡ配列”は、望ましくは、アデノウイルスの欠失されたＥ１またはＥ３領域に挿入されたものである。

前記目的タンパク質は、公知の多様なタンパク質を含み、一般的に生理活性ポリペプチドを含む概念であって、例えば、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質、共刺激因子のような多様なタンパク質、及びこれらの誘導体及び類似体を含む。より詳細には、ゴナドトロピン放出ホルモン（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＧｎＲＨ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、及びこれらの受容体、腫瘍壊死因子受容体、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４）、インターロイキン−１類型ＩＩ受容体、ＦＭＳ−類似チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ３）リガンド、ＣＤ４０、ＣＤ３９、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ１３４、ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ）、ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ）、ＴＲＡＩＬ（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）、ＴＲＡＩＬ受容体、組織プラスミノゲン活性剤、因子（Ｆａｃｔｏｒ）ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポ脂肪タンパク質Ｅ、アポ脂肪タンパク質Ａ−Ｉ、インターロイキン−２拮抗剤、α−１アンチトリプシン、カルシトニン、成長ホルモン、インシュリン、インシュリノトロピン、パラチロイドホルモン、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、スーパーオキシドジスムターゼ、グルカン、エリスロポエチン、腫瘍−特異糖タンパク質−７２（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−７２、ＴＡＧ−７２）に対する抗体、グルコセレブロシダーゼ、Ｆｃ−融合タンパク質、グロビン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン−類似成長因子（ＩＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨由来成長因子（ＢＤＦ）、集落刺激因子（Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０Ｌ、Ｏｘ４０、４．１．ＢＢなどを含み、これらに制限されるものではない。望ましくは、前記目的タンパク質は、腫瘍−特異糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）に対する抗体であり、より望ましくは、ＴＡＧ−７２に特異的なヒト化抗体である。

段階（ｂ）：形質転換された細胞株の培養
引き続き、前記形質転換された細胞株を適した培地に培養する。

本発明の目的タンパク質コーディング遺伝子が形質転換された動物細胞の培養は、当業者に公知の多様な方法をプロトコルを用いて実施することができる。本発明で利用される培地は、動物細胞の培養に通常利用される如何なる培地も可能であり、例えば、Ｅａｇｌｅｓ’ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｅａｇｌｅ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２（１９５９））、α−ＭＥＭ（Ｓｔａｎｎｅｒ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．２３０：５２（１９７１））、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２（Ｈａｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭ及びＦ１２の混合物（Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０））、Ｗａｙ−ｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２２：１００３（１９５９））、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（ＭｃＣｏｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１００：１１５（１９５９））、ＭＣＤＢシリーズ（Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １４：１１（１９７８））、ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が利用される。動物細胞培養及び培地についての説明は、Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに詳しく記載されている。

前記動物細胞の培養液は、一般的にタンパク質、糖類、脂肪など多様な成分（不純物）からなっているために、これを除去するための前処理過程をさらに含みうる。本明細書で、用語‘前処理’は、本発明による精製方法の精製効率を高めるために、前記カラムクロマトグラフィーを行う前に不純物を除去する工程を意味する。このような前処理段階によって、目的タンパク質が含まれた動物細胞培養液の体積を減らし、培養液内に存在する多様な不純物を除去して、クロマトグラフィーのカラムにかかる負荷を減らしうる。

段階（ｃ）：形質転換された細胞株から生産された目的タンパク質の分離及び精製
前記細胞培養後、前記細胞株から生産された目的タンパク質を分離して精製する。

タンパク質の分離及び精製は、公知の多様な方法を利用し、望ましくは、クロマトグラフィー法を利用する。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー、及び吸着クロマトグラフィーを用いて実施することができる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

実施例１：Ｅ１遺伝子発現レトロウイルスベクターの製造
１−１．ｐＧｅｍＴ−Ｅ１ベクターの製造
本発明で、アデノウイルスＥ１遺伝子配列の供給は、野生型アデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）のＤＮＡのうち、Ｅ１遺伝子部位である５６０−３５０９塩基配列をプライマー配列番号１（Ｅ１−Ｆプライマー、表１）と配列番号２（Ｅ１−Ｒプライマー、表１）とを用いてＰＣＲ方法で増幅して使った。この際、野生型Ａｄ５ ＤＮＡの５’部位に結合するプライマーには、Ｍｌｕ Ｉ制限酵素塩基配列を有し、３’部位に結合するプライマーには、ＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を有して、増幅されたＰＣＲ生成物は、Ｍｌｕ Ｉ−Ｅ１−ＢａｍＨ Ｉ塩基配列を有する。増幅したＰＣＲ生成物は、配列分析を通じて原本と同じであることを確認した後、以後、製造過程に使った。ＰＣＲ生成物は、直線型ＤＮＡの両端に多重Ｔ配列を有するｐＧｅｍＴ ｅａｓｙベクター（ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に結紮して、構造物ｐＧｅｍＴ−Ｅ１を獲得した（図１）。

１−２．ｐＭＴレトロウイルスベクターの製造
レトロウイルスベクターＭＴは、次のような過程を通じて製造された。マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）由来のレトロウイルス遺伝情報を有しているプラスミドｐＭＬＶ（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ ＴＭ ｅｔ ａｌ．，１９８１）からプライマー配列番号３（ＨＨＩＲプライマー、表１）と配列番号４（５ＬＴＲ３プライマー、表１）とを用いてレトロウイルスベクターの構造で必要な塩基配列を増幅して使った。増幅した塩基配列は、配列分析を通じて原本と同じであることを確認した後、以後、製造過程に使った。増幅された塩基配列は、ＭＬＶの５’長い末端反復配列（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔｓ、ＬＴＲ）部位とパッケージングシグナルを含む５’非暗号化部位とを含む。このように増幅されたＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ切片をｐＵＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）ベクターに移して、ｐ５ＬＴＲプラスミドベクターを製作した。３’ＬＴＲも、ｐＭＬＶからプライマー配列番号５（３ＬＴＲ５プライマー、表１）と配列番号６（３ＬＴＲ３プライマー、表１）とを用いて増幅し、該増幅された塩基配列は、ＭＬＶのｅｎｖ遺伝子の翻訳終結コドン（ｃｏｄｏｎ）下位のポリプリン部位を含む３’非翻訳部位と３’ＬＴＲとを含む。このようなＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ切片をｐ５’ＬＴＲに移して、レトロウイルスベクターｐＭＴを作った。ｐＭＴの詳しい情報及びその性能は、国際学術誌に出版した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０００、図２）。

１−３．ｐＭＩＮレトロウイルスベクターの製造
ｐＣＢＩＮ（大韓民国特許出願第１９９７−００４８０９５号）ベクターをＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理して、ＩＲＥＳ／Ｎｅｏ^Ｒカセットを獲得した。該獲得したＤＮＡ切片をあらかじめＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素処理した前記のｐＭＴレトロウイルスベクターと結紮して、ｐＭＩＮレトロウイルスベクター（米国登録特許第ＵＳ６，４５１，５９５号）を製作した。ＩＲＥＳ／Ｎｅｏ^Ｒの５’側にＥ１遺伝子を挿入する場合、ＭＬＶの５’ＬＴＲ、Ｅ１遺伝子、ＩＲＥＳ／Ｎｅｏ^Ｒカセット、及びＭＬＶの３’ＬＴＲの順に構成され、これを細胞内に伝達した時に（ウイルスベクター形態で製造して、細胞に伝達して、細胞のゲノムＤＮＡ上に挿入される場合も同様に）、レトロウイルス内の唯一のプロモーターである５’ＬＴＲ内のプロモーターからただ１個のｍＲＮＡが転写され、このｍＲＮＡからＥ１タンパク質が作られ、ＩＲＥＳによってＮｅｏ^Ｒタンパク質が他の翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）によって作られる（図３）。

１−４．ｐＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターの製造
ｐＧｅｍＴ−Ｅ１ベクターにＳｃａ Ｉ制限酵素処理後、得られたＤＮＡ切片を再びＭｌｕ ＩとＢａｍＨ Ｉ制限酵素で処理して、ＤＮＡ切片を獲得した。該獲得したＤＮＡ切片は、あらかじめＭｌｕ ＩとＢａｍＨ Ｉ制限酵素処理されたＭＩＮレトロウイルスベクターに結紮して、ＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターを製作した。このように製造されたＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターは、ＭＬＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でアデノウイルスＥ１（ヌクレオチド５６０−３５０９部分）とＮｅｏ^Ｒをコーディングする配列とを含む。また、このベクターの構造は、制限酵素マッピングによって正しい構造であることを評価し、さらにＰＣＲ分析によって得られた構造物の部分を配列分析によって確認した。ヌクレオチド配列において、何の変化も発見されていない（図４及び図５）。

１−５．ＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスの生産
Ｅ１遺伝子の形質感染のためのレトロウイルスは、プラスミドＤＮＡ形質感染法を用いて生産した（Ｓｏｎｅｏｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。形質感染は、Ｃｅｌｌｐｈｅｃｔカルシウムリン酸塩形質感染システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を利用し、製造者のプロトコルによって行った。前日、１×１０^６個で播種した２９３Ｔ細胞株にＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクター、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター、及びｅｎｖ発現ベクターを形質感染させた後、細胞を約４８時間培養した。培養完了後、細胞培養液をいずれも収穫して、０．４５μｍフィルターを利用、濾過した。生産されたＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスは、使用前まで−８０℃に冷凍保管した。

１−６．ＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスのエンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ）選択
対象細胞で効率的な形質感染を誘導するために、各４種の他のエンベロープを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レトロウイルスを生産して比較した。前記記述したプラスミドＤＮＡ形質感染法を用いて水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープ、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）エンベロープ、猫白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープ、またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エンベロープの４種のエンベロープを有するＧＦＰレトロウイルスを生産して、対象細胞株にＭＯＩ１の濃度で形質感染を誘導した。感染効率を高めるために、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を添加した。３種の対象細胞株で、いずれもＶＳＶ−Ｇエンベロープを有したＧＦＰレトロウイルスの形質感染の効率が最も高いと確認された（図６）。

実施例２：アデノウイルスＥ１遺伝子発現アデノウイルス生産細胞株の製造
２−１．細胞株及び細胞培養
本発明に使われた細胞株は、総３種であって、ヒト由来のＡ５４９気管支癌細胞（ＣＣＬ−１８５；ＡＴＣＣ，ＭＤ，ＵＳＡ）、ヒト由来のレチノブラスト（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔ、ＣＲＬ−２３０２；ＡＴＣＣ，ＭＤ，ＵＳＡ）、ヒト由来のＨｅＬａ子宮頸部癌細胞（ＣＣＬ−２；ＡＴＣＣ，ＭＤ，ＵＳＡ）である。この細胞は、いずれも３７℃、５％ＣＯ_２条件で１０％ウシ胎児血清及び抗生物質が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で培養した。細胞培養媒質、試薬及び血清は、Ｇｉｂｃｏ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）で購入し、培養プラスチック類は、いずれもＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）の製品を購入して使った。

２−２．細胞株別組換えアデノウイルス生産能の比較を通じる生産細胞株の選別
３種の候補細胞株のうち、最も優れた組換えアデノウイルス生産能を見せる細胞株を選択するために、３種の細胞株いずれもアデノウイルスＥ１遺伝子発現細胞株を製造した。ＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルス形質感染前日、６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートにウェル当たり１×１０^５個の細胞をそれぞれ播種した。形質感染当日、ＭＯＩ１．５の濃度でレトロウイルスを添加し、形質感染の効率を高めるために、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を添加した。２４時間細胞を培養した後、トリプシン処理して、細胞をいずれも回収した。該回収した細胞は、再び１００ｍｍ培養皿に播種して、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を添加後、１４日間培養して、Ｇ４１８耐性細胞株を製造した。このように製造された３種のアデノウイルスＥ１発現細胞株の組換えアデノウイルス生産能を比較するために、Ｅ１欠失アデノウイルスベクター（ヌクレオチド５６０−３３２８ｂｐ、米国登録特許第ＵＳ５，７３１，１７２号）を感染して、生産能を評価した。感染一日前、前記Ｇ４１８耐性細胞を１×１０^５個で２４ウェルプレートに播種した後、感染当日、ＧＦＰ発現アデノウイルスベクターをＭＯＩ１００の濃度で感染した。３日間培養後、細胞をいずれもトリプシン処理して収穫した。該収穫した細胞は、超音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）後、遠心分離して上澄み液のみを取った。この上澄み液中のアデノウイルス含量を評価するために、一日前、２４ウェルプレートに０．６×１０^５個で播種したＨｅＬａ細胞に、各細胞株から獲得した上澄み液５μｌを添加した。２日間培養後、ＧＦＰ発現を柔細胞分析器で確認した結果、ＨｅＬａ細胞株で製造したアデノウイルスＥ１発現細胞株で最も高いウイルス含量が確認されて、組換えアデノウイルス生産能が最も優れていると確認された（図７）。

２−３．アデノウイルスＥ１遺伝子発現ＨｅＬａ細胞株クローンの製造
ＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルス形質感染前日、６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５個のＨｅＬａ細胞を播種した。形質感染当日、ＭＯＩ１．５の濃度でレトロウイルスを添加し、形質感染の効率を高めるために、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を添加した。４８時間細胞を培養した後、トリプシン処理して、細胞をいずれも回収した。該回収した細胞は、再び１００ｍｍ培養皿に播種して、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を添加、群落を形成するまで培養した。１個の細胞群落がほぼ直径５ｍｍに育つならば、クローニングシリンダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてクローンを選別した。その結果、５３個のＧ４１８抵抗クローンを獲得した。選別された５３個のクローンは、９６ウェルプレートで培養し、全部育つならば、２４ウェルプレート、６ウェルプレートに次第に拡張培養し、６ウェルプレートで全部育つならば、１００ｍｍ培養皿で培養して、それぞれの細胞ストックを製造した。

２−４．組換えアデノウイルス生産能に優れるクローンの選別
細胞クローンのうち、最も優れたウイルス生産能を見せるクローンを選別するために、冷凍状態の５３個の細胞クローンストックをいずれも解凍して、３日間培養した。感染一日前、前記解凍させたクローンの細胞を１×１０^５個で２４ウェルプレートに播種した後、感染当日、ＧＦＰ発現アデノウイルスベクターをＭＯＩ１００の濃度で感染した。３日間培養後、細胞をいずれもトリプシン処理して収穫した。該収穫した細胞は、超音波処理後、遠心分離して上澄み液のみを取った。この上澄み液のうち、アデノウイルス含量を評価するために、一日前、２４ウェルプレートに０．６×１０^５個で播種したＨｅＬａ細胞に、各細胞クローンから獲得した上澄み液５μｌを添加した。２日間培養後、ＧＦＰ発現を柔細胞分析器で確認した結果、１６番クローンで最も高いウイルス含量が確認されて、組換えアデノウイルス生産能が最も優れていると結論し、このクローンをＨ２Ｃ１６と名付けた（図８）。

実施例３：Ｈ２Ｃ１６クローンの特性分析
３−１．Ｈ２Ｃ１６クローンのＰＣＲ分析
レトロウイルスベクターを用いて遺伝子を伝達する場合、遺伝子を含むレトロウイルスベクターが導入細胞のゲノムＤＮＡ上に挿入される。Ｈ２Ｃ１６クローンの製造のために使われたレトロウイルスベクターとＡｄ−Ｅ１遺伝子とが細胞のゲノムＤＮＡ上に正しい構造で挿入されたか否かを確認するために、ＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクター特異的なプライマー配列番号７−２０（ＭＩＮ−Ｅ１ ＃１−７プライマー、表１）をデザインして、ＰＣＲ方法でバンドを増幅し、これを塩基配列分析を通じて構造を評価した。まず、ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＨ２Ｃ１６クローンからゲノムＤＮＡを抽出した。以後、これを鋳型とし、それぞれ特異的なプライマーセットを組み合わせてＰＣＲ反応を誘導した。ゲル上で増幅されたバンドのサイズを予想バンドサイズと比較して、一致することを確認し、また、塩基配列分析を通じてＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターが正しい構造でＨ２Ｃ１６ゲノムＤＮＡ上に挿入されていることを確認した（図９）。

３−２．Ｈ２Ｃ１６クローンの線形増幅媒介−重合酵素連鎖反応（ＬＡＭ−ＰＣＲ）の分析
伝達されたＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターが、Ｈ２Ｃ１６クローンゲノムＤＮＡ上の挿入された位置を確認し、また、何コピーで挿入されたか否かを確認するために、ＬＡＭ−ＰＣＲを行った。まず、Ｈ２Ｃ１６クローンからゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使って、ゲノムＤＮＡを抽出した。該抽出したゲノムＤＮＡ１０ｎｇを鋳型として、プライマー配列番号２１（ＬＴＲプライマー、表１）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃１分、６０℃４５秒、７２℃９０秒で５０サイクルで進行した後、Ｔａｑポリメラーゼを添加して、同じ条件で５０サイクルさらに進行した（（１）線形増幅過程）。ＰＣＲ反応後、生成物にＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ＤＮＡ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｂｉｎｄｅｒ ｋｉｔ：Ｄｙｎａｌ，ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）とバインディング溶液（ＤＮＡ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｂｉｎｄｅｒ ｋｉｔ：Ｄｙｎａｌ，ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）とを添加した後、常温で１２時間以上反応して、ＤＮＡ−ｂｅａｄ結合体形成を誘導した。磁性粒子集中器（ＤＹＮＡＬ ＭＰＣ−９６００：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＤＮＡ−ｂｅａｄ結合体を分離した（（２）磁性捕獲過程）。ＤＮＡ−ｂｅａｄ結合体にヘキサヌクレオチド混合物（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＮ，ＵＳＡ）、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、クレノウポリメラーゼを添加した後、３７℃で１時間反応して、二重鎖ＤＮＡ合成を誘導した（（３）ヘキサヌクレオチド−プライマーリング過程）。以後、合成反応物にＴｓｐ５０９１Ｉ制限酵素を添加した後、６５℃で１時間反応した（（４）Ｔｓｐ５０９１Ｉ切断過程）。リンカーカセット（Ｌｉｎｋｅｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ）、ライゲーションバッファ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ（Ｒ）ＤＮＡリガーゼ（Ｆａｓｔ−ｌｉｎｋ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ｋｉｔ：Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＷＩ，ＵＳＡ）を添加した後、常温で５分間反応して、切断された部位にリンカーを付着した（（５）リンカーライゲーション過程）。０．１Ｎ ＮａＯＨを添加し、常温で１０分間反応して、ＤＮＡ−ｂｅａｄ結合体からＤＮＡを分離した（（６）変性過程）。分離したＤＮＡ２μｌを鋳型として、プライマー配列番号２２（ＬＣ Ｉプライマー、表１）と配列番号２３（ＬＴＲ ＩＩプライマー、表１）とを用いて最初（１ｓｔ）のＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃１分、６０℃４５秒、７２℃９０秒で３０サイクルで進行した。

以後、１ｓｔ ＰＣＲ生成物１μｌを鋳型として、プライマー配列番号２４（ＬＣ ＩＩプライマー、表１）と配列番号２５（ＬＴＲ ＩＩＩプライマー、表１）とを用いて２ｎｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、１ｓｔ ＰＣＲと同様に行った（（７）エクスポネンシャルＰＣＲ過程）。

２ｎｄ ＰＣＲ後、２．５％アガロースゲル上でバンドを確認し、これをキアゲンＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分離し、ｐＧｅｍ−Ｔ Ｅａｓｙベクターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）に挿入した後、塩基配列を分析した。Ｈ２Ｃ１６クローンから確認されたあらゆるバンドを分離して、塩基配列分析を行った結果、あらゆるバンドの塩基配列が一致し、染色体１番のＢＴＧ２（Ｂ−ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ２）に位置するものであることを確認した。この結果を通じて、Ｅ１遺伝子導入のために伝達されたＭＩＮ−Ｅ１レトロウイルスベクターは、Ｈ２Ｃ１６クローンの１番の染色体上にただ１つのコピーのみ挿入されたことを確認した（図１０）。

３−３．Ｈ２Ｃ１６クローンのＥ１発現の分析
Ｈ２Ｃ１６クローンからＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ発現を確認した。Ｅ１Ａは、ウェスタンブロットを通じてタンパク質発現を確認し、Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ５５Ｋは、ＲＴ−ＰＣＲを通じてＲＮＡ発現を確認した。まず、Ｅ１Ａタンパク質発現を確認するために、Ｈ２Ｃ１６クローンとＨｅＬａ細胞各１×１０^６個をトリプシン処理して収穫した後、ＰＢＳで遠心洗浄した。レポーターリシスバッファ（ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）１００μｌを加えて、常温で５分間放置後、−７０℃で５分反応と３７℃で５分反応とを３回繰り返した。遠心分離後、上澄み液でタンパク質濃度をブラッドフォード（Ｂｉｏ−ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）法で定量した。５０μｇのタンパク質を４−１２％ビス−トリスゲル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にローディングして、９０分間１２０ボルトで電気泳動した後、ゲル上にメンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を載せ、再び２０分間１２ボルトで電気泳動した。ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、１３７ｍＭ Ｎａｃｌ、ｐＨ７．６）溶液で一回洗浄したメンブレンをブロッキング溶液（ＴＢＳＴ；ＴＢＳ＋０．５％ｔｗｅｅｎ２０に溶かされた５％脱脂乳）に入れ、１０μｇの１次抗体（マウスアンチ−アデノウイルスタイプ５Ｅ１Ａ、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加して、４℃で一日間反応した。メンブレンをＴＢＳＴで３回洗浄後、ブロッキング溶液に入れ、１／２０００倍希釈された２次抗体（ゴットアンチ−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ，ＵＳＡ）を添加して、常温で２時間反応した。再びメンブレンをＴＢＳＴで洗浄後、ディベロップ溶液（ｓａｎｔａｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加えてバンドを確認した。

Ｅ１Ｂ１９ＫとＥ１Ｂ５５Ｋ ＲＮＡ発現を確認するために、Ｈ２Ｃ１６クローンとＨｅＬａ細胞各１×１０^６個をトリプシン処理して収穫した後、ＰＢＳで遠心洗浄した。トリゾール（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を処理して、細胞からＲＮＡを抽出した。該抽出したＲＮＡを鋳型でｃＤＮＡ合成した。Ｅ１Ｂ１９Ｋ ＲＮＡ発現を確認するために、プライマー配列番号２６（Ｂ１９−Ｆプライマー、表１）と配列番号２７（Ｂ１９−Ｒプライマー、表１）とを用いてＰＣＲを行い、Ｅ１Ｂ５５Ｋ ＲＮＡ発現を確認するために、プライマー配列番号２８（Ｂ５５−Ｆプライマー、表１）と配列番号２９（Ｂ５５−Ｒプライマー、表１）とを用いてＰＣＲを行った。以後、ゲル上でＰＣＲ増幅産物の有無及びサイズを確認することによって、Ｅ１Ｂ１９ＫとＥ１Ｂ５５Ｋ ＲＮＡ発現を確認した（図１１）。

３−４．Ｈ２Ｃ１６クローンの細胞成長率曲線
Ｈ２Ｃ１６クローンとその母細胞であるＨｅＬａ細胞とをそれぞれ１０１日間継代培養し、細胞成長率を比較した結果、大差なくよく成長することを確認した（図１２）。

実施例４：Ｈ２Ｃ１６クローンとＨＥＫ２９３細胞との組換えアデノウイルス生産能の比較
４−１．小さな規模の組換えアデノウイルス生産能の確認
Ｈ２Ｃ１６クローンの組換えアデノウイルス生産能を確認するために、Ｔ２５ｃｍ^２フラスコ（ＩＷＡＫＩ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を利用した小さな規模の組換えアデノウイルス生産を行った。この際、ＨＥＫ２９３細胞でも、同じ方法で組換えアデノウイルスを生産することによって、生産能を比較した。まず、小さな規模の組換えアデノウイルス生産能を確認するために、感染前日、２．５×１０^６個のＨＥＫ２９３細胞と１×１０^６個のＨ２Ｃ１６クローンとをＴ２５ｃｍ^２フラスコに播種した。感染当日、培地をいずれも除去した後、アデノウイルス（Ａｄ）−ＧＦＰ組換えアデノウイルスを５００μｌの５％ウシ胎児血清含む培地にＭＯＩ２、１０、及び２０でそれぞれのフラスコに添加した後、２０分間隔で１時間振って感染を誘導した。以後、５％ウシ胎児血清含む培地を４．５ｍｌ添加して３日間培養した。３日後、細胞をいずれも回収して、液体窒素で急速冷凍させた後、３７℃で再び完全に解凍する過程を３回繰り返した。前記細胞を４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を収穫して、−８０℃で保管した。

収穫した上澄み液内に組換えアデノウイルス含量を評価するために、前日、２４ウェルプレートに０．６×１０^５個で播種したＨｅＬａ細胞にＨＥＫ２９３細胞とＨ２Ｃ１６クローンから収穫した上澄み液のそれぞれを５μｌ添加した後、２日間培養した。以後、柔細胞分析器を用いてＧＦＰ発現細胞の比率を確認することによって、組換えアデノウイルス含量を確認した。その結果、３種のＭＯＩ条件でいずれも優れた生産能が確認され、そのレベルは、ＨＥＫ２９３で生産したウイルスと類似した。しかし、Ｈ２Ｃ１６の場合、播種細胞数がＨＥＫ２９３に比べて、２．５倍少ないので、細胞当たりウイルス生産量は、ＨＥＫ２９３に比べて、約２．５倍高いと言える（図１３）。

４−２．大きな規模の組換えアデノウイルス生産能の確認
Ｈ２Ｃ１６クローンの大きな規模の組換えアデノウイルス生産で生産能を比較するために、感染前日、２．２５×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞と０．９×１０^７個のＨ２Ｃ１６クローンとをＴ２２５ｃｍ^２フラスコに播種した。感染当日、培地を５％ウシ胎児血清含む培地に交換した後、Ａｄ−ＧＦＰ組換えアデノウイルスをＭＯＩ１５として、それぞれのフラスコに添加した後、３日間培養した。３日後、細胞をいずれも回収して、液体窒素で急速冷凍させた後、３７℃で再び完全に解凍する過程を３回繰り返した。前記細胞を４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を収穫して、−８０℃で保管した。正確な組換えアデノウイルス力価を測定するために、塩化セシウムを用いてウイルスを精製した。組換えアデノウイルスパーティクルは、ＵＶ測定法を用いて測定し、これを通じて、組換えアデノウイルス生産量を見積った。その結果、ＨＥＫ２９３細胞で生産した組換えアデノウイルスの量は、１．５１×１０^１２ウイルスパーティクル／ｍｌであり、Ｈ２Ｃ１６クローンの場合、１．１８×１０^１２ウイルスパーティクル／ｍｌであり、これを細胞当たり生産量に換算すれば、Ｈ２Ｃ１６がＨＥＫ２９３よりも１．９５倍ほど生産能に優れることが確認された（図１４）。感染可能ウイルスパーティクルのレベルを５０％組織培養感染容量（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄｏｓｅ、ＴＣＩＤ５０）法で分析した結果、２つのウイルスいずれもｒａｔｉｏ：１３レベルでウイルス品質は、同一であることを確認した。

実施例５．Ｈ２Ｃ１６クローンとＧＨ３２９細胞との組換えアデノウイルス生産能の比較
ＨｅＬａ細胞を根幹として開発されたＧＨ３２９細胞は、野生型アデノウイルスタイプ５ＤＮＡのうち、５１１−３９２４ｂｐ部位を含み、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターで調節されるプラスミドが形質注入されたアデノウイルス生産細胞株である。Ｈ２Ｃ１６クローンとＧＨ３２９細胞とのアデノウイルス生産能を比較するために、Ｔ２５ｃｍ^２フラスコ（ＩＷＡＫＩ）を利用した小さな規模で組換えアデノウイルス生産を行った。感染前日、１×１０^６個のＨ２Ｃ１６クローンとＧＨ３２９細胞とをＴ２５ｃｍ^２フラスコに播種した。感染当日、培地をいずれも除去した後、Ａｄ−ＧＦＰ組換えアデノウイルスを５００μｌの５％ウシ胎児血清含む培地にＭＯＩ０．５、１、５にして、それぞれのフラスコに添加した後、２０分間隔で１時間振って感染を誘導した。以後、５％ウシ胎児血清含む培地を４．５ｍｌ添加して、３日間培養した。３日後、細胞をいずれも回収して、液体窒素で急速冷凍させた後、３７℃で再び完全に解凍する過程を３回繰り返した。前記細胞を４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を収穫して、−８０℃で保管した。収穫した上澄み液内に含まれた組換えアデノウイルス含量を評価するために、前日、２４ウェルプレートに０．６×１０^５個で播種したＨｅＬａ細胞にＨ２Ｃ１６クローンとＧＨ３２９細胞とから収穫した上澄み液のそれぞれを１μｌ添加した後、２日間培養した。以後、柔細胞分析器を用いてＧＦＰ発現細胞の比率を確認することによって、組換えアデノウイルス含量を確認した。その結果、３種のＭＯＩ条件でいずれもＧＨ３２９細胞に比べて、Ｈ２Ｃ１６細胞の優れた生産能が確認され、特に、最も低い０．５ＭＯＩでＧＨ３９２細胞に比べて、約２．７倍高い生産能が確認された（図１５）。

実施例６．Ｈ２Ｃ１６クローンのＲＣＡ（Ｒｅｐｌｉｃａｔａｉｏｎ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）生成有無の確認
６−１．未精製アデノウイルスを利用したＲＣＡ生成の確認
Ｈ２Ｃ１６クローンで複製不能アデノウイルスを生産時に、ＲＣＡ生成可能性を評価した。感染前日、４．５×１０^６個のＨ２Ｃ１６クローンをＴ７５ｃｍ^２フラスコ（ｆａｌｃｏｎ）に播種し、対照群として９×１０^６個のＨＥＫ２９３細胞をＴ７５ｃｍ^２フラスコ（ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。感染当日、培地をいずれも除去した後、複製不能組換えアデノウイルスを５％ウシ胎児血清含む培地にＭＯＩ１０でそれぞれのフラスコに添加し、３日間培養した。３日後、細胞をいずれも回収して、超音波処理器で１０分間３０秒作動、１分止めを繰り返し、超音波処理し、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を収穫して、−８０℃で保管した。一方、Ｈ２Ｃ１６クローンとＨＥＫ２９３細胞とを前記と同様にＴ７５ｃｍ^２フラスコに播種して準備した後、前記凍らせた各細胞から収穫した上澄み液を解凍して、それぞれの細胞に感染した。前記のアデノウイルス生産過程をＲＣＡが確認されるまで繰り返した。収穫した上澄み液内の組換えアデノウイルスのうち、ＲＣＡの存否は、重合酵素連鎖反応で評価した。前日、２４ウェルプレートに３×１０^５個で播種したＨｅＬａ細胞に、Ｈ２Ｃ１６クローンとＨＥＫ２９３細胞とから収穫した上澄み液のそれぞれを５０μｌ添加した後、２日間培養した。以後、ＨｅＬａ細胞でゲノムＤＮＡを分離し、アデノウイルスタイプ５ＤＮＡのうち、Ｅ１遺伝子内部である５６０−８００ｂｐ塩基配列を増幅するプライマー配列番号３０（ＲＣＡ−Ｆプライマー、表１）と配列番号３１（ＲＣＡ−Ｒプライマー、表１）とを用いてＰＣＲ方法で増幅産物の有無を確認した。その結果、Ｈ２Ｃ１６クローンで数回反復生産されたウイルスでは、ＲＣＡが確認されていないが、ＨＥＫ２９３細胞で数回反復生産されたウイルスのうちには、ＲＣＡが存在することを確認した（図１６Ａ）。

６−２．精製アデノウイルスを利用したＲＣＡ生成の確認
Ｈ２Ｃ１６クローンで複製不能アデノウイルスを生産時に、ＲＣＡ生成可能性を評価した。感染前日、１．３５×１０^７個のＨ２Ｃ１６クローンをＴ２２５ｃｍ^２フラスコ（ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、対照群として２．７×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞をＴ２２５ｃｍ^２フラスコ（ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。感染当日、培地をいずれも除去した後、複製不能組換えアデノウイルスを５％ウシ胎児血清含む培地にＭＯＩ２０でそれぞれのフラスコに添加し、３日間培養した。３日後、細胞をいずれも回収して、超音波処理器で１０分間３０秒作動、１分止めを繰り返し、超音波処理し、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を収穫して、−８０℃で保管した。一方、Ｈ２Ｃ１６クローンとＨＥＫ２９３細胞とを前記と同様にＴ２２５ｃｍ^２フラスコに播種して準備した後、前記凍らせた各細胞から収穫した上澄み液を解凍して、それぞれの細胞に感染した。残りの上澄み液は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）方法を用いて精製して濃縮した。前記の精製アデノウイルス生産過程をＲＣＡが確認されるまで繰り返した。精製した組換えアデノウイルスのうち、ＲＣＡの存否は、重合酵素連鎖反応で評価した。前日、Ｔ２５ｃｍ^２フラスコ（ｉｗａｋｉ）に１×１０^６個で播種したＨｅＬａ細胞に、Ｈ２Ｃ１６クローンとＨＥＫ２９３細胞とから収穫した精製ウイルスのそれぞれを細胞当たり１０００個のウイルスパーティクル（ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を添加した後、１４日間培養した。以後、ＨｅＬａ細胞でゲノムＤＮＡを分離し、アデノウイルスタイプ５ＤＮＡのうち、Ｅ１遺伝子内部である５６０−８００ｂｐ塩基配列を増幅するプライマー配列番号３０（ＲＣＡ−Ｆプライマー、表１）と配列番号３１（ＲＣＡ−Ｒプライマー、表１）とを用いてＰＣＲ方法で増幅産物の有無を確認した。その結果、Ｈ２Ｃ１６クローンで数回反復生産されたウイルスでは、ＲＣＡが確認されていないが、ＨＥＫ２９３細胞で数回反復生産されたウイルスのうちには、ＲＣＡが存在することを確認した（図１６Ｂ）。

実施例７．Ｈ２Ｃ１６クローンとＨｅＬａ細胞での目的タンパク質（３Ｅ８抗体）の生産能の比較
７−１．ｐＭＴ−重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）及びｐＭＴ−軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）レトロウイルスの製造
Ｈ２Ｃ１６クローンとこれの母細胞であるＨｅＬａ細胞での目的タンパク質の生産能を比較するために、３Ｅ８抗体を利用した。生産能の比較実験に先立って、３Ｅ８抗体を発現するレトロウイルスを製造した。３Ｅ８抗体は、ＴＡＧ−７２抗原に対するヒト化抗体であって、米国公開特許ＵＳ２００８／０２７９８４７に記載されている。３Ｅ８抗体の重鎖と軽鎖遺伝子配列は、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターから下記の表２のプライマーを用いてＰＣＲ方法で増幅して使った。この際、ｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−３Ｅ８ベクターの重鎖と軽鎖との５‘部位に結合するそれぞれのプライマーは、ＢａｍＨ Ｉ制限酵素塩基配列を含み、３’部位に結合するそれぞれのプライマーは、Ｘｈｏ Ｉ制限酵素塩基配列を含むので、増幅されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨ Ｉ−重鎖−Ｘｈｏ ＩまたはＢａｍＨ Ｉ−軽鎖−Ｘｈｏ Ｉ塩基配列を有する。獲得したそれぞれのＤＮＡは、あらかじめＢａｍＨ ＩとＸｈｏ Ｉ制限酵素が処理されたＭＴレトロウイルスベクターに結紮して、ＭＴ−重鎖とＭＴ−軽鎖レトロウイルスベクターを製作した。

重鎖と軽鎖遺伝子の形質感染のためのレトロウイルスは、プラスミドＤＮＡ形質感染法を用いて生産した（Ｓｏｎｅｏｋａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。形質感染は、Ｃｅｌｌｐｈｅｃｔカルシウムリン酸塩形質感染システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を利用し、製造者のプロトコルによって行った。前日、１× １０^６個で播種した２９３Ｔ細胞株にＭＴ−重鎖またはＭＴ−軽鎖レトロウイルスベクター、ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター、及びＶＳＶ−Ｇ ｅｎｖ発現ベクターを形質感染させた後、細胞を約４８時間培養した。該培養完了後、細胞培養液をいずれも収穫して、０．４５μｍフィルターを用いて濾過した。生産されたＭＴ−重鎖またはＭＴ−軽鎖レトロウイルスは、使用前まで−８０℃に冷凍保管した。

７−２．Ｈ２Ｃ１６クローンとＨｅＬａ細胞での３Ｅ８抗体の生産能の比較
Ｈ２Ｃ１６クローンでの３Ｅ８抗体の生産能を確認するために、ＭＴ−重鎖レトロウイルスを３回、ＭＴ−軽鎖レトロウイルスを２回形質感染した。この際、ＨｅＬａ細胞でも、同じ方法で形質感染した。ＭＴ−重鎖レトロウイルス形質感染前日、Ｈ２Ｃ１６クローンを６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５個で播種した。形質感染当日、ＭＯＩ５の濃度でレトロウイルスを添加し、形質感染の効率を高めるために、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を添加し、３２℃、２８００ｒｐｍで９０分間遠心分離した。該遠心分離後、３７℃、５％ＣＯ_２条件で２時間細胞を培養した後、上澄み液を除去し、新たな培地に取り替えた。１日間培養後、前日と同じ方法で二番目の形質感染を進行した。新たな培地に取り替え後、３７℃、５％ＣＯ_２条件で６時間細胞を培養した後、細胞をいずれもトリプシン処理して収穫した。該収穫した細胞を新たな６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５個で播種した。１日間培養後、同じ方法で三番目の形質感染を進行した。新たな培地に取り替え後、３７℃、５％ＣＯ_２条件で培養した。２日間培養後、細胞をいずれもトリプシン処理して収穫し、新たな６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５個で播種した。３７℃、５％ＣＯ_２条件で２日間培養後、ＭＴ−軽鎖レトロウイルス形質感染のために、細胞をいずれもトリプシン処理して収穫し、新たな６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５個で播種した。３７℃、５％ＣＯ_２条件で１日間培養後、ＭＴ−軽鎖レトロウイルスをＭＯＩ５の濃度で添加し、形質感染の効率を高めるために、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を添加し、３２℃、２８００ｒｐｍで９０分間遠心分離した。該遠心分離した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件で２時間細胞を培養した後、上澄み液を除去し、新たな培地に取り替えた。１日間培養後、前日と同じ方法で二番目の形質感染を進行した。新たな培地に取り替え後、３７℃、５％ＣＯ_２条件で細胞を培養した。２日間培養後、細胞をいずれもトリプシン処理して収穫した。

該収穫した細胞を６ウェルプレートにウェル当たり４×１０^５個で播種した。３７℃、５％ＣＯ_２条件で２日間培養後、上澄み液を除去し、新たな培地３ｍＬを添加した。３７℃、５％ＣＯ_２条件で１日間培養後、上澄み液を収穫した。該収穫した上澄み液内に３Ｅ８抗体含量を評価するために、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）方法を利用した。その結果、２つの細胞いずれも抗体生産が確認されたが、Ｈ２Ｃ１６クローンが、ＨｅＬａ細胞に比べて、抗体生産量が２倍以上高いことを確認した（図１７）。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したので、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。

本発明は、アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途に関連する分野に適用されうる。

参照文献
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Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅ，Ｃ．Ｃ．，Ｐａｒｕｚｙｎｓｋｉ，Ａ．，Ａｒｅｎｓ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｙｕ，Ｓ．Ｓ．，Ｈｏｎｇ，Ｙ．，Ｊｏｏ，ＣＷ．，Ｙｏｏｎ，ＮＫ．，Ｒｈｉｍ，ＪＷ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｇ．，Ｖｏｎ Ｋａｌｌｅ，Ｃ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｓ．ａｎｄ Ａｈｎ Ｈ．Ｓ．（２０１１）．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ Ｔｒｉａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：２０９２−２１０１。
Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．（１９８１）．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２９３：５４３−５４８。

Claims (13)

1. 寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７１で寄託されたことを特徴とする細胞株。
2. 請求項１に記載の細胞株にアデノウイルスベクターが含まれている組換えアデノウイルス生産用の細胞株。
3. 前記アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の配列が一部または全部欠失されたことを特徴とする請求項２に記載の細胞株。
4. 前記組換えアデノウイルスは、一部または全部が複製不能であることを特徴とする請求項２に記載の細胞株。
5. （ａ）請求項１に記載の細胞株と、
   （ｂ）アデノウイルスベクターと、
   を含む組換えアデノウイルス生産用のパッケージングシステム。
6. 前記アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の配列が一部または全部欠失されたことを特徴とする請求項５に記載のパッケージングシステム。
7. 前記組換えアデノウイルスは、一部または全部が複製不能であることを特徴とする請求項５に記載のパッケージングシステム。
8. 次の段階を含む組換えアデノウイルスの生産方法：
   （ａ）（ｉ）動物細胞で作動可能であり、アデノウイルスに対して異種性であるプロモーター、及び前記プロモーターに作動的に結合されたアデノウイルスＥ１コーディング変形遺伝子配列を含む発現コンストラクトを含むベクターであって、前記Ｅ１コーディング変形遺伝子配列は、原始Ｅ１遺伝子配列のＥ１ａのＴＡＴＡシグナル及びＥ１ｂのポリアデニル化シグナルが欠け、Ｅ１ａのコーディング配列、Ｅ１ａのポリアデニル化シグナル、Ｅ１ｂのＴＡＴＡシグナル、Ｅ１ｂ１９Ｋのコーディング配列、及びＥ１ｂ５５Ｋのコーディング配列を含むことを特徴とするベクター；（ｉｉ）レトロウイルスのｅｎｖ遺伝子配列を含むベクター；（ｉｉｉ）レトロウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子配列を含むベクターが導入された細胞からレトロウイルスを収穫する段階と、
   （ｂ）前記段階（ａ）のレトロウイルスを細胞に感染させて、寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２７１で寄託されたアデノウイルス生産細胞株を準備する段階と、
   （ｃ）前記段階（ｂ）のアデノウイルス生産細胞株にＥ１領域の配列が欠失されたアデノウイルスベクターを感染させる段階と、
   （ｄ）前記段階（ｃ）の細胞株を培養液で培養する段階と、
   （ｅ）前記培養液からアデノウイルスを収穫する段階。
9. 前記段階（ｃ）のアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の配列が一部または全部欠失されたことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記組換えアデノウイルスは、一部または全部が複製不能であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. 次の段階を含む目的タンパク質の製造方法：
    （ａ）前記請求項１に記載の細胞株に目的タンパク質−コーディングヌクレオチド配列を含むベクターを導入して、形質転換された細胞株を得る段階と、
    （ｂ）前記段階（ａ）によって製造された形質転換された細胞株を培養する段階と、
    （ｃ）前記形質転換された細胞株から生産された目的タンパク質を分離及び精製する段階。
12. 前記目的タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質、受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質、共刺激因子、並びにこれらの誘導体及び類似体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記抗体は、腫瘍−特異糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）に対する抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。