JP2916350B2 - 純粋な乳酸菌カルチャーおよびこれを含む組成物 - Google Patents
純粋な乳酸菌カルチャーおよびこれを含む組成物Info
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Description
純粋なカルチャー、この菌株を含有する組成物およびこ
の菌株の使用に関する。
199,535号(GorbachおよびGoldi
n)明細書は最初の場合Lacto bacillus
(L.) acidophilusであるとして、しか
し次にL.casei suls.ramnosus
(M.Silvaら、in Antimicrobia
l Agents and Chemotherap
y,31,No.8,1231〜1233,1987参
照)に一層類似性を有するとして確認された細菌菌株を
提案した。この菌株は小腸の粘液細胞にすぐれた粘着性
を示し、そして治療適用に有用である。この菌株は「菌
株GG」と命名され、番号53103としてATCC
(American TyheCulture Col
lection)に寄託され、医薬的に許容しうる支持
体と同時に、特に食品、とりわけ例えばヨーグルトタイ
プの酸性乳酸品に使用することができる。
に、類似目的で使用されている。しかし、明らかに同一
視することができ、明白な利点を有し、かつ入手しうる
菌株の範囲を豊かにするこのタイプの特に高性能菌株に
対し要求がある。本発明により提示される問題はこの要
求を充足することであった。
ローラに内移植する場合の親和力、腸細胞に粘着する能
力、腸細胞から病原菌を競争排除する能力および免疫モ
ジュレーションおよび/または糞の酵素活性の減少に対
するその能力により選択した乳酸菌菌株の生物学的に純
粋なカルチャーを供する。
対し、特に制瀉薬としてヒトまたは動物に特に投与する
ためのものである。
えばそのまま、凍結および/または凍結乾燥後投与でき
る。このカルチャーは例えば108〜1010生菌(c
fu,英語技術用語「コロニー形成単位(colony
forming units)」から)/g液体また
は凍結形および109〜1011cfu/g凍結乾燥形
を含むことができる。
体、特に医薬的に許容しうる支持体または例えば酸性
乳、特にヨーグルトまたは乳をベースとする粉末処方の
ような食品を含有する組成物で投与することもできる。
腸フローラを有するマウスまたはラットの消化管に内移
植する親和力に対し選択された乳酸菌菌株のカルチャー
を供する。
から下痢の原因となる病原菌を競争排除するその能力に
対し選択された乳酸菌菌株のカルチャーを供する。
これらの乳を製造するための市販カルチャーから、また
は例えば幼児の糞便から特に選択した菌の各種菌株のう
ち、4種をブダペスト条約に基づき1992年6月30
日にCollectionNationale de
Cultures de Microorganism
es(CNCM),Institut Pasteu
r,28 rue de Dr.Roux,75724
Paris Cedex 15,Franceに例証
として寄託し、それぞれ下記かっこ内に示すCNCM番
号を与えられた。すなわち、Lactobacillu
s acidophilus菌株(CNCM I−12
25),Bifidobacterium breve
菌株(CNCM I−1226),Bifidobac
terium infantis菌株(CNCM I−
1227)およびBifidobacterium l
ongum菌株(CNCM I−1228)。
びD(−)乳酸を産生する − 他の特徴:カタラーゼ(−)、CO2の産生
(−)、アルギニンの加水分解(−)糖の発酵: アミグダリン(+)、アラビノース(−)、セロビオー
ス(+)、エスクリン(+)、フラクトース(+)、ガ
ラクトース(−)、グルコース(+)、ラクトース
(+)、マルトース(+/−)、マンニトール(−)、
マンノース(+)、メリビオース(−)、ラフィノース
(+)、リボース(−)、サリシン(+)、シュクロー
ス(+)、トレハロース(+)B.Breve CNCM I−1226,B.inf
antis CNCMI−1227およびB.long
um I−1228 形態: − グラム陽性微生物、非運動性、非胞子産生性 − 円形端および「V」または「Y」分技を有する小棒
状代謝: − 好気性微生物、ヘテロ発酵代謝により主として乳酸
および酢酸を生成する − 他の特徴:カタラーゼ(−)、CO2の産生
(−)、アルギニンの加水分解(−)糖の発酵: これらの種の糖発酵プロフィルは非常に不安定かつ非再
現性であるが、ほんの少数の糖のみ、特にD−リボー
ス、ラクトースおよびラフィノースは常に発酵する。
記する:腸フローラ中に内移植 有菌の(gnotoxenic)マウス 2群の無菌マウス(腸フローラを含まないマウス)はそ
れぞれ異る供与体(有菌のマウス)のヒトのフローラと
関連する。数日の馴化後、マウスの腸フローラは機能
的、定性的および定量的見地からヒトの供与体のものと
全く対比できる。本発明に従って、多数の菌株はヒトの
フローラを有するこれらのマウスの消化管をコロニー化
するその能力、すなわち、この腸フローラに内移植する
その親和力に対し試験が行なわれた。大部分の菌株は数
回の連続接種後でさえこれらの動物をコロニー化できな
いが、例えば、L.acidophilus菌株CNC
M I−1225は1回の接種後でさえ2群のマウスの
腸フローラに増殖およひ内移植しうることが分かった。
このコロニー化または内移植により菌株は106cfu
/g以上の量で糞便に存在できる。糞便中の生菌菌株の
この含量は宿主のものを改変しうる菌株の代謝に対し必
要および/または十分であると見なすことができる。動
物の環境が乱されない限りこの内移植は永続することも
分かった。
の酵素の産生に見せかけるため健康な供与体のヒトの腸
フローラの単離菌株(Bactersidesthet
aiotamicron FI 1,Centre d
e Recherche Nestec SA,CH−
1000,Lausanne,Switzerlan
d)と関連(有菌ラット)する。この関連によりこれら
のラットの腸のコロニー化が豊富化し、その結果細菌は
約108cfu/gの量で糞に含まれる。このフローラ
の例えばL.acidophilus菌株CNCM I
−1225の内移植試験では良好な共−コロニー化が得
られ、その結果菌株は約108cfu/gの量で糞便に
含まれる。
ilusの市販カルチャーにより牛乳を発酵して製造し
た伝統的ヨーグルトを摂食した健康なヒトボランティア
の糞便に現れるL.bulgaricusの生菌数は比
較のため測定した。ボランティアは第2の3週中ヨーグ
ルトを摂食したことを除いて各3週の3連続期間中発酵
乳製品を摂食しなかった。彼らがヨーグルトを摂食した
3週では、彼らは約3回の120gヨーグルト/日に相
当する約1010L.bulgaricus/日を摂取
するような方法で摂食した。ヨーグルトの消費期間中、
ボランティアの糞便は約105cfu/gのL.bul
garicus/gを含有することが分かった。
オで行ったが、ヨーグルトは例えば同じオーダーの濃度
のL.acidophilus菌株CNCM I−12
25を補充したS.thermophilusおよび
B.bifidusの市販カルチャーにより乳を発酵さ
せて製造した。ボランティアの糞便中のlactoba
cillusの総生菌数はヨーグルトの消費期間前、中
および後に測定した。消費期間前の値は105〜106
cfu/g、消費期間中の値は107cfu/g以上
で、消費期間後の値は106cfu/gであることが分
かった。従って、ヨーグルトの消費期間中糞便中のla
ctobacillusの総数は増加することが分かっ
た。CNCM I−1225菌株はボランティアに有意
な量で、生菌で見出された。対照的に、ボランティアが
ヨーグルトの摂食を中止した数日後に除去された。
を上記有菌ラットについて行った試験で測定した。これ
は酵素アゾリダクターゼおよびニトロリダクターゼは発
癌物質の産生に関与するからである。高濃度のこれらの
酵素は結腸癌の危険性の増大に関連する。Bacter
oidesを有する有菌ラットの糞便の酵素活性はアゾ
リダクターゼに対し2.5μg/h/mgタン白に、お
よびニトロリダクターゼに対し4.2μg/h/mgタ
ン白に上昇したが、例えばCNCM I−1225を内
移植したフローラにBacteroidesを有する有
菌ラットではこの酵素活性ではアゾリダクターゼに対し
1.8μg/h/mgタン白に、ニトロリダクターゼに
対し3.5μg/h/mgタン白に下がった。さらに、
CNCM I−1225菌株のみから形成される腸フロ
ーラを有する有菌ラットは糞便のアゾリダクターゼまた
はニトロリダクターゼ活性を示さないことが分かった。
換言すれば、有菌ラットのフローラにCNCM I−1
225菌株が存在すると、これらの動物のある好ましく
ない酵素の産生が減少する、すなわち宿主の代謝に有利
な改変を生ずる。
いて行った上記試験で測定した。この活性は例えば、C
NCM I−1225菌株により製造したヨーグルトの
消費期間前の最終日およびこれに続く最初の数日に測定
した。この活性はヨーグルトの消費期間中8.2から
4.9μg/h/mgタン白に変化し、この期間後約1
週間このレベルに留まり、次いで徐徐に増加することが
分かった。
プログラムにより摂食する製品は除いた:3週間乳、次
の3週間例えば市販S.thermophilusおよ
びL.acidophilus CNCM I−122
5混合カルチャーにより乳を発酵させて製造したヨーグ
ルト、次に6週間乳。ボランティアの末梢血液の白血球
の食作用力をこれらの各期間の初めおよび終りに測定し
た。
細菌と接触させることを含む。蛍光細菌を食した白血球
の発する蛍光はフラックスで血球計算分析により測定し
た(Facsanの商品名で入手しうるタイプの装置を
使用する)。食作用活性を示す白血球%、すなわち上記
食作用力はこれから推論した。末梢血液の白血球の食作
用力は乳消費の最初の期間の初めで36.5%、その期
間の終り、従ってヨーグルト消費期間の初めに32.7
%、ヨーグルトの消費期間の終りに51.8%およびそ
の後6週、すなわち乳消費の2番目で最後の期間の終り
に51.4%であることを観察した。白血球の食作用力
のこの増加は有意であることを概算した誤差の確率は
0.1%より小さい(p値)。
プログラムに従った:2週(週1および2)では発酵製
品を除いた通常食、次の3週(週3、4および5)では
1日当り3回の125mlヨーグルトを有する混合食、
このヨーグルトはL.acidophilus菌株CN
CM I−1225(このヨーグルトに含まれる)を1
07〜108cfu/mlの量で添加したS.ther
mophilusおよびBifido bacteri
um bifidusの市販カルチャーにより乳を発酵
させて製造した、および別の2週(6週および7)では
発酵製品を除いた通常食。14人の健康なボランティア
(対照群)は同時に発酵製品を除いた通常食から成る食
事プログラムに従った。
ン(Salmonella typhi Ty21a)
を製造者の教示に従って週4の1,3および5日に2群
のボランティアに投与した。血液試料は週3の初まり後
の3日および週5の終り後の1日および10日にすべて
のボランティアから採取した。Salmonella
typhiの抗原リポポリサッカライド(LPS)に免
疫応答する特異IgAの濃度の測定はエリザ方法により
行った。ワクチン投与前9日に観察した濃度に対しワク
チン投与後15日に観察した特異IgAの濃度の増加は
2群で有意である(P値>0.001)ことが分かっ
た。しかし、増加率の範囲<2、>2および<3、>3
および<4、>4を考慮する場合、それぞれの分布は、
対照群では8,3,0および3ボランティアに対し試験
群では1,6,3および6ボランティアのこれらの範囲
で観察される。換言すれば、増加率は対照群におけるよ
り試験群で有意に高い(p値=0.04)。
養のCaCO−2ヒトの上皮腸細胞(M.Pinto
ら、Biol.Cell.47,323,1983)お
よびヒトの粘液−分泌性腸細胞HT29−MTX(Le
suffleurら、Cancer Res.50,6
334〜6343)に対し乳酸菌の各種菌株の粘着性の
研究を行った。このため、細胞は細胞系を維持するため
25cm2のプラスチック瓶(コーニング)および粘着
試験に対し6−カップトレイ(コーニング)に入れた脱
脂滅菌ガラススリップ(22×22mm)上で培養し
た。
養するために、培地は再播種後2日から毎日交換しなけ
ればならなかった。培地はDulbecco(DME
M)により修飾したイーグルの最少必須培地から調製し
た。乳酸菌は凍結ストックからMRS培地で嫌気培養し
た。細菌は第2継代培養からのものを使用した。細胞上
のインキュベーションに対する混合培地は抗生物質を含
まない50%のDMEM培地と細菌が生育した50%M
RS培地(この培地は108lactobacillu
sまたはbifido菌を含有する)(Chauvie
re G.ら、FEMS Microbiol.Let
t.91,213〜218,1992参照)を混合して
調製した。
合培地は腸細胞上に置き、1時間好気培養した。複数−
カップトレイは20回の円形攪拌により5回洗浄して非
粘着性細菌を有効に排除した。次に細胞層は70%メタ
ノールで10分、95%で10分および100%で15
分、連続浴で固定し、グラムまたはギームザ染色により
染色した。粘着量は顕微鏡で粘着細菌を計数して測定し
た。
に対し例として寄託した4種の菌株は、CaCO−2細
胞系についてこれらの粘着試験により測定されたように
腸細胞に対し良好な粘着性を示した。こうして、L.a
cidophilus菌株CNCM I−1225は1
00個のCaCO−2細胞について約100+23個の
細菌細胞のレベルにCaCO−2細胞に粘着した。この
結果に+++++の点数を与えるとすれば、B.bre
ve CNCM I−1226の粘着性は+++++
で、B.infantis CNCM I−1227で
は++++およびB.longum CNCMI−12
28では++++の点数が得られる。例えばHT29−
MTX細胞に対するL.acidophilus菌株C
NCM I−1225の粘着性を測定する試験では尚一
層著しい結果を得た。
ちのいくつかの菌株の粘着性はそれ自体の培地(例えは
MRSまたは乳)に分泌する要素によるものであること
も分かった。上記インキュベーション方法をCaCO−
2に対し1時間、菌株L.acidophilus C
NCM I−1225、B.breve CNCMI−
1226またはB.longum CNCM I−12
28によりその細菌培地を使用せずに行った場合、粘着
性が有意に減少したことを認めた。さらに、このインキ
ュベーション方法をこれらの菌株および予めトリプシン
で処理したその培地よりCaCO−2に対し行った場
合、再び粘着性が有意に減少したことを認めた。このこ
とはこれらの菌株により培地に分泌される粘着要素はタ
ン白であることを証明するものと思われる。
を腸細胞から競争排除するその能力に対し各種乳酸菌菌
株の研究を行った。特に、発病性を帯び、病原性となり
うる、すなわち、腸毒産生性E.coli(ETE
C)、腸粘着性E.coli(DAEC)および腸病原
性E.coli(EPEC)、のE.coliのある腐
生菌株およびSalmonella typhi−mu
rium菌株をヒトおよび動物の消化管から排除する研
究を行った。
た: − ETECに対し、菌株H10407,CFA/lを
表わす(Collection of Profess
eur Joly,Laboratoirede Mi
crobiologie,Faculte de Me
decine et de Pharmacie,Un
iversite de Clermont−Ferr
and 1,6303 Clermont−Ferra
nd,France) − DAECに対し、菌株C1845(Collect
ion of Dr.S.Bilge,Departm
ent of Microbiology,Schoo
l of Medicine,G 3111 Heal
th Sciences Building,Univ
ersity of Washington,Seat
tle,Washington 98195,USA) − EPECに対し、菌株JPN 15 pMAR7,
EAFおよびealを表わす(Collection
of Prof.J.KaPer,Center fo
r Vaccine Development,Uni
versity of Maryland,Schoo
l of Medicine,10 South Pi
ne Street,Baltimore,Maryl
and 21201,USA) − Sa1monella typhi−murium
に対し、菌株SL 1344(Dr.B.Stocke
r.Stanford University,Sch
ool of Medicine,Departmen
t ofMicrobiology and Tmmu
nology,Sherman Sairchild
Science Building,D 333Sta
nford,California 94305−54
02,USA)
次のように測定した: 要約すれば、CaCO−2細胞の単層を食塩リン酸塩緩
衝液(PBS)で2回洗浄した。14C−標識E.Co
liまたは35S−標識Salmonellaを108
cfu/mlの量で培地に懸濁し、細胞カルチャーを有
するスリップを含む各カップに2mlの懸濁液を添加し
た。 E.coliに対しては、インキュベーションはすべて
1%D−マンノースの存在で行った。排除率またはレベ
ル、すなわち入れ代る乳酸菌によりCaCO−2細胞に
対する粘着を妨害された病原菌の割合を測定するため
に、1mlの108cfu/ml標識病原菌株を含有す
る懸濁液および/mlの108または109cfu/m
lの試験乳酸菌菌株を含有する懸濁液を細胞カルチャー
を有するスリップを含む各カップに添加した。プレート
は37℃で1時間、10%CO2および90%空気の雰
囲気でインキュベートした。細胞の単層は無菌PBSで
5回洗浄する。粘着細菌および腸細胞は0.2N Na
OH溶液に溶解した。標識粘着菌数は液体シンチレーシ
ョン計数法により求める。
はその能力に対しこのように試験した乳酸菌の各種菌株
のうち、本発明の目的に対し選択し、寄託した菌株は下
表に示すように著しい結果を示した。表はこれらの試験
で使用した各種病原菌菌株のぎせいで試験菌株により達
成された排除量%を示す。
Claims (7)
- 【請求項1】 腸フローラに内移殖するための親和力、
腸細胞に粘着する能力、病原菌を腸細胞から競争排除す
る能力および免疫モジュレーションの能力を有する乳酸
菌の生物学的に純粋なカルチャーであって、この乳酸菌
はラクトバチルス・ジョンソニ株CNCM I−122
5またはビフィドバクテリウム・ブレブ、ビフィドバク
テリウム・インファンテイスおよびビフィドバクテリウ
ム・ロンガムからなる群から選択されたものである、乳
酸菌の純粋なカルチャー。 - 【請求項2】 ビフィドバクテリウムはビフィドバクテ
リウム・ブレブ CNCM I−1226、ビフィドバ
クテリウム・インファンテイス CNCMI−122
7、ビフィドバクテリウム・ロンガム I−1228で
ある、請求項1記載の生物学的に純粋なカルチャー。 - 【請求項3】 請求項1又は2に記載の生物学的に純粋
なカルチャーおよび摂取可能な支持体を含有する、下痢
止めの医薬組成物。 - 【請求項4】 請求項1又は2に記載の生物学的に純粋
なカルチャー及び摂取可能な支持体を含有する、食品組
成物。 - 【請求項5】 支持体は食品である、請求項4記載の食
品組成物。 - 【請求項6】 食品は酸乳である、請求項5記載の食品
組成物。 - 【請求項7】 酸乳はヨーグルトまたは乳主体の粉末製
剤である、請求項6記載の食品組成物。
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